抗凝固剤およびその使用
本発明は、対象への抗凝固剤の投与の際に第二の成分が第一の成分を活性化血小板へ向かわせる、凝固を阻害する能力のある第一の成分、および活性化血小板をターゲッティングする能力のある第二の成分を含む抗凝固剤を提供する。（ａ）活性化血小板をターゲッティングする能力がある結合成分および（ｂ）標識を含む、血管異常を検出するためのプローブもまた提供される。出願者は、活性化血小板を指向する薬剤およびプローブは、凝固障害の診断および治療に有用であることを示している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液学の分野および特に止血の下位分野に関する．より具体的には、本発明は、１）哺乳類血液中の凝固を阻害する物質、および脳卒中、心筋梗塞、および深部静脈血栓症といった疾患の治療および予防におけるこれらの物質の用途、および２）血栓症、血栓性塞栓および不安定プラークといった臨床環境における診断および活性化血小板の特定を可能にするプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
血管傷害後の血流を調節する身体の能力は生存継続に決定的である。血液凝固 および 次いで傷害された組織の修復に続くその後の凝固の溶解の過程を止血という。止血は血管の完全性の喪失後に集合として起こるいくつかの現象から成る。
【０００３】
その過程の最初の段階は血管収縮である。これは傷害の範囲への血液の流れを制限する。次に、血小板がトロンビンによって活性化され、および傷害の部位で凝集して、一時的な緩い血小板栓を形成する。タンパク質フィブリノーゲンが、血小板凝集を刺激する主な原因である。血小板は血管の内皮裏打ちの破壊後に露出されるコラーゲンへの結合によって凝集する。活性化に際して、血小板は、アデノシン−５'−二リン酸、ＡＤＰおよびＴＸＡ２（他の血小板を活性化する）、セロトニン、リン脂質、リポタンパク質、および凝固カスケードに重要なその他のタンパク質を放出する。誘導された分泌に加えて、活性化血小板は栓の形成に対応するため形を変化させる。
【０００４】
最初は緩い 血小板栓の安定性を確実にするため、フィブリン網 （凝固ともいう） が形成されおよび栓を捕捉する。最後に、凝固 は組織修復後に正常な血流のために溶解されなければならない。凝固の溶解はプラスミンの作用を通じて起こる。
【０００５】
二つの経路すなわち内因性および外因性経路が、フィブリン血餅の形成に繋がる。それらは異なる機構によって開始されるが、その二つは、凝固形成に繋がる共通の経路に集束する。組織傷害の非存在下での異常血管壁に応答した赤色血栓または凝固の形成は、内因性経路の結果である。組織傷害に応答したフィブリン血餅形成は、外因性経路の結果である。両方の経路は複雑でありおよび凝固因子と呼ばれる多数の異なるタンパク質が関与する。
【０００６】
血小板活性化およびフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）。
止血が起こるためには、血小板は、露出されたコラーゲンに接着し、顆粒の内容を放出し、および凝集しなければならない。内皮細胞表面上に露出されたコラーゲンへの血小板の接着は、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）によって媒介される。ｖＷＦの機能は、血小板の表面上の特定の糖タンパク質（ＧＰＩｂ／ＩＸ）およびコラーゲン原線維の間の架橋として作用することである。血小板および内皮表面上の露出したコラーゲンの間の架橋としての役割に加えて、ｖＷＦは凝固第ＶＩＩＩ因子に結合しおよびそれを安定化する。第ＶＩＩＩ因子のｖＷＦによる結合は、循環中の第ＶＩＩＩ因子の正常な残存に必要である。
【０００７】
フォンウィルブランド因子は、血小板によって産生されおよび血小板内に貯蔵される複雑な多量体糖タンパク質である。それはまた巨核球によっても合成され、および内皮下結合組織に結合しても見出される。血小板の最初の活性化は、血小板の表面上の特異的受容体へのトロンビン結合によって誘導され、それによってシグナル伝達カスケードを開始する。トロンビン受容体はＧタンパク質と結合し、Ｇタンパク質は今度はホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）を活性化する。ＰＬＣ−γはホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）を加水分解し、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）およびジア知るグリセロール（ＤＡＧ）の形成に繋がる。ＩＰ３は細胞内貯蔵Ｃａ２＋の放出を誘導し、およびＤＡＧはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化する。
【０００８】
血小板が接着するコラーゲンおよび細胞内Ｃａ２＋の放出は、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）の活性化に繋がり、ＰＬＡ２は次いで膜リン脂質を加水分解し、アラキドン酸の遊離に繋がる。アラキドン酸放出は、トロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）の産生および続いての放出の増大に繋がる。これはＰＬＣ−γ経路を通じて機能するもう一つの血小板活性化因子である。放出された細胞内貯蔵Ｃａ２＋によって活性化されるもう一つの酵素が、ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）である。活性化ＭＬＣＫはミオシンの軽鎖をリン酸化し、それは次いでアクチンと相互作用し、結果として血小板の形態および運動性を変化させる。
【０００９】
ＰＫＣの多数の作用のうちの一つが、特異的な４７，０００ダルトン血小板タンパク質のリン酸化および活性化である。この活性化されたタンパク質は、血小板顆粒内容物の放出を誘導し、内容物の一つがＡＤＰである。ＡＤＰはさらに血小板を刺激し、活性化カスケード全体を増大させ、また血小板表面にフィブリノーゲンが接着するように血小板膜を変化させ、その結果として、フィブリノーゲンに誘導される血小板凝集が起こる。
【００１０】
血小板の活性化は、その結果としての血小板の血小板栓への凝集に必要である。しかし、等しく重要なのは、活性化された血小板表面リン脂質の、凝固カスケードの活性化における役割である。
【００１１】
内因性凝固カスケードは、血液および露出された内皮細胞表面の間に接触が行われる際に開始される。外因性および内因性経路は、第Ｘ因子が活性化されて第Ｘａ因子になる点で集束する。第Ｘａ因子は、第ＶＩＩ因子の第ＶＩＩａ因子へのさらなる活性化に関与する。活性な第Ｘａ因子はまた、プロトロンビンをトロンビンへ加水分解および活性化する。トロンビンは次いで、第ＸＩ、第ＶＩＩＩおよび第Ｖ因子を活性化でき、カスケードを進行させる。最終的にトロンビンの役割は、フィブリノーゲンをフィブリンへ変換すること、および第ＸＩＩＩ因子を第ＸＩＩＩａ因子へ活性化することである。第ＸＩＩＩａ因子（トランスグルタミナーゼともいう）は、フィブリンポリマーを架橋して、凝固を固化する。
【００１２】
内因性経路は、凝固第ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、およびＸＩＩ因子を必要とする。タンパク質のプレカリクレインおよび高分子量キニノーゲン、および血小板から分泌されるカルシウムイオンおよびリン脂質もまた必要である。これらの経路成分それぞれが、第Ｘ因子（不活性）から第Ｘａ因子（活性）への変換に繋がる。内因性経路の開始は、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン、第ＸＩ因子および第ＸＩＩ因子が負に荷電した表面に曝露される際に起こる。これは接触期と呼ばれる。血管表面へのコラーゲンの露出は、接触期の一次刺激である。
【００１３】
接触期成分の集合は、プレカリクレインからカリクレインへの変換を結果として生じ、それは今度は第ＸＩＩ因子を第ＸＩＩａ因子へ活性化する。第ＸＩＩａ因子は次いで、より多くのプレカリクレインをカリクレインへ変換でき、相互活性化カスケードを樹立する。第ＸＩＩａ因子はまた、第ＸＩ因子を第ＸＩａ因子へ活性化し、および強力な血管拡張剤であるブラジキニンの、高分子量キニノーゲンからの放出に繋がる。
【００１４】
Ｃａ２＋の存在下で、第Ｘｉａ因子は第ＩＸ因子を第ＩＸａ因子へ活性化する。第ＩＸ因子はビタミンＫ依存性γ−カルボキシグルタミン酸（ｇｌａ）残基を含む酵素前駆体であり、そのセリンプロテアーゼ活性はこれらのｇｌａ残基へのＣａ２＋結合後に活性化される。カスケードのいくつかのセリンプロテアーゼ（ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、およびＸ）はｇｌａを含む酵素前駆体である。活性第ＩＸａ因子は第Ｘ因子を内部ａｒｇ−ｉｌｅ結合で切断し、その第Ｘａ因子への活性化に繋がる。
【００１５】
第Ｘａ因子の活性化は、テナーゼ複合体（Ｃａ２＋および第ＶＩＩＩａ、第ＩＸａおよび第Ｘ因子）の、活性化血小板の表面上での集合を必要とする。活性化に対する血小板の応答の一つが、表面上のホスファチジルセリンおよびホスファチジルイノシトールの提示である。これらのリン脂質の露出は、テナーゼ複合体の形成を可能にする。この過程における第ＶＩＩＩ因子の役割は、第ＶＩＩＩａ因子の形で、第ＩＸａ因子および第Ｘ因子に対する受容体として作用することである。第ＶＩＩＩａ因子は凝固カスケードにおける補助因子と呼ばれる。第ＶＩＩＩ因子の第ＶＩＩＩａ因子（実際の受容体）への活性化は、微量のトロンビンの存在下で起こる。トロンビンの濃度が上昇するにつれ、第ＶＩＩＩａ因子は最終的にトロンビンによって切断されおよび不活性化される。トロンビンの第ＶＩＩＩ因子に対するこの二重作用は、テナーゼ複合体形成の程度およびそれによって凝固カスケードの程度を制限するように働く。
【００１６】
上記で考察される通り、活性化第Ｘａ因子は内因性および外因性凝固カスケードが集束する位置である。外因性経路は傷害の部位にて、組織因子（第ＩＩＩ因子）の放出に反応して開始される。組織因子は、第ＶＩＩａ因子に触媒される第Ｘ因子の活性化における補助因子である。第ＶＩＩａ因子は、ｇｌａ残基を含むセリンプロテアーゼであり、内因性経路の第ＩＸａ因子と同一の方法で、第Ｘ因子を切断して第Ｘａ因子にする。第ＶＩＩ因子の活性化は、トロンビンまたは第Ｘａ因子の活性化を通じて起こる。第Ｘａ因子が第ＶＩＩ因子を活性化する能力は、内因性経路および外因性経路の間の連結を生じる。二つの経路間の別の連結は、組織因子および第ＶＩＩａ因子が第ＩＸ因子を活性化する能力によって存在する。いくらかの不明瞭が存在する一方、第ＶＩＩａ因子および組織因子の間の複合体の形成は、凝固カスケード全体における主要な段階と考えられているように見える。外因性経路の阻害のための主な機構は、組織因子−−第ＶＩＩａ因子−−Ｃａ２＋−−Ｘａ複合体に存在する。タンパク質、リポタンパク質が随伴する凝固阻害剤であるＬＡＣＩは、この複合体に特異的に結合する。ＬＡＣＩはまた外因性経路阻害剤、ＥＰＩまたは組織因子経路阻害剤、ＴＦＰＩとも呼ばれ、および以前はアンチコンバーチンといった。ＬＡＣＩは３つのタンデムプロテアーゼ阻害剤ドメインから構成される。ドメイン１は第Ｘａ因子に結合し、およびドメイン２は第Ｘａ因子の存在下に限って第ＶＩＩａ因子に結合する。
【００１７】
プロトロンビンのトロンビンへの活性化
外因性経路および内因性経路の両方における共通点は、第Ｘ因子の第Ｘａ因子への活性化である。第Ｘａ因子はプロトロンビン（第ＩＩ因子）をトロンビン（第ＩＩａ因子）へ活性化する。トロンビンは今度は、フィブリノーゲンをフィブリンへ変換する。トロンビンの活性化は、活性化血小板の表面上で起こり、およびプロトロンビナーゼ複合体の形成を必要とする。この複合体は、血小板リン脂質、ホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルセリン、Ｃａ２＋、第Ｖａ因子および第Ｘａ因子、およびプロトロンビンから構成される。第Ｖ因子は、プロトロンビナーゼ複合体の形成における補助因子であり、テナーゼ複合体形成における第ＶＩＩＩ因子の役割と同様である。第ＶＩＩＩ因子活性化のように、第Ｖ因子は微量のトロンビンによって活性化されて第Ｖａ因子となり、およびトロンビンのレベル上昇によって不活性化される。第Ｖａ因子は、活性化血小板上の特異的受容体と結合し、およびプロトロンビンおよび第Ｘａ因子と複合体を形成する。
【００１８】
プロトロンビンは、Ｎ末端領域に１０個のｇｌａ残基を含む、７２，０００ダルトンの一本鎖タンパク質である。プロトロンビナーゼ複合体内で、プロトロンビンは第Ｘａ因子によって２ヶ所で切断される。この切断は、一つのジスルフィド結合によって結び合わされているＡ鎖およびＢ鎖を含む、２鎖の活性トロンビン分子を生じる。
【００１９】
フィブリン血餅形成の活性化における役割に加えて、トロンビンは凝固において重要な調節機能を果たす。トロンビンは内皮細胞表面に存在するトロンボモジュリンと結合して、Ｃタンパク質をＣａタンパク質へ変換する複合体を形成する。補助因子Ｓタンパク質およびＣａタンパク質は、第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子を分解し、それによって凝固カスケードにおけるこれら二つの因子の活性を制限する。
【００２０】
トロンビンはまた、Ｇタンパク質結合プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）、具体的にはＰＡＲ−１、−３および−４に結合しおよびその放出に繋がる。これらのタンパク質の放出は、多数のシグナル伝達カスケードの活性化に繋がり、カスケードは今度はインターロイキンＩＬ、ＩＬ−１およびＩＬ−６の放出を増大させ、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）および血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）の分泌を増大させる。トロンビンに誘導されるシグナル伝達はまた、血小板活性化および白血球接着の増大に繋がる。トロンビンはまた、トロンビン活性化線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）を活性化し、それによって線溶（フィブリン血餅の分解）を調節する。ＴＡＦＩはまた、カルボキシペプチダーゼＵ（ＣＰＵ）としても知られ、その活性は、部分分解されたフィブリンからのＣ末端リジンの除去に繋がる。これは、プラスミノーゲン活性化の障害に繋がり、それによってフィブリン血餅溶解（すなわち線溶）の速度を低下させる。
【００２１】
トロンビンレベルの調節
活性トロンビンの循環レベルを身体が調節できないことは、深刻な結果に繋がりうる。トロンビン活性が調節される二つの主な機構が存在する。循環中のトロンビンの主な形は、不活性プロトロンビンであり、その活性化は、凝固カスケードについて上述の、酵素前駆体活性化の経路を必要とする。カスケード中の各段階にて、フィードバック機構が活性酵素および不活性酵素の間のバランスを調節する。
【００２２】
トロンビンの活性化はまた、四種類の特異的トロンビン阻害剤によっても調節される。アンチトロンビンＩＩＩは、第ＩＸａ、第Ｘａ、第ＸＩａおよび第ＸＩＩａ因子の活性も阻害できるため、最も重要である。アンチトロンビンＩＩＩの活性は、ヘパリンの存在下で下記の手段によって増強されうる：ヘパリンはアンチトロンビンＩＩＩ上の特異的部位に結合し、当該タンパク質の立体構造変化を生じ、および新しい立体構造はトロンビンおよびその他の基質に対してより高い親和性を有する。ヘパリンのこの作用は、抗凝固剤としてのその臨床用途の原理である。アンチトロンビンＩＩＩの天然に存在するヘパリン活性化因子は、血管内皮細胞の表面上に、ヘパリンおよびヘパリン硫酸として存在する。内因性凝固カスケードの活性化を調節するのがこの性質である。
【００２３】
しかし、トロンビン活性はまた、α２−マクログロブリン、ヘパリン補助因子ＩＩおよびα１−アンチトリプシンによっても阻害される。トロンビン調節における役割は小さいが、α１−アンチトリプシンはヒト血清の主なセリンプロテアーゼ阻害剤である。その生理学的意義は、このタンパク質の欠如が肺気腫の発症において原因的役割を果たすという事実によって実証される。
【００２４】
フィブリノーゲンのフィブリンへの活性化
フィブリノーゲン（第Ｉ因子）は、３対のポリペプチド（[Ａ−α］[Ｂ−β］[γ］）2から成る。６つの鎖はＮ末端付近でジスルフィド結合によって共有結合している。Ａ−αおよびＢ−β鎖のＡおよびＢ部分は、それぞれフィブリノペプチドＡおよびＢを構成する。フィブリノーゲンのフィブリノペプチド領域は、いくつかのグルタミン酸およびアスパラギン酸残基を含み、この領域に高い陰電荷を与えおよび血漿中のフィブリノーゲンの溶解性に補助を与える。活性トロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリノペプチドと当該タンパク質のａおよびｂ部分との間の四つのａｒｇ−ｇｌｙ結合で加水分解するセリンプロテアーゼである。
【００２５】
フィブリノペプチドの、トロンビンに媒介される放出は、サブユニット構造（α−β−γ）2．を有するフィブリンモノマーを生じる。これらのモノマーは規則的配列へ自発的に凝集し、いくらか弱いフィブリン血餅を形成する。フィブリン活性化に加えて、トロンビンは第ＸＩＩＩ因子を、フィブリンモノマー中のグルタミンのアミド窒素とリジンのｅ−アミノ基との間の共有結合から成る架橋を導入する高度に特異的なトランスグルタミナーゼである第ＸＩＩＩａ因子へ変換する。
【００２６】
フィブリン血餅の溶解
フィブリン血餅の分解はプラスミンの機能であり、プラスミンは不活性酵素前駆体であるプラスミノーゲンとして循環するセリンプロテアーゼである。遊離の循環プラスミンがあれば、α２−アンチプラスミンによって迅速に阻害される。プラスミノーゲンはフィブリノーゲンおよびフィブリンの両方と結合し、それによって、凝固が形成される際に凝固に組み込まれる。組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）および、より小さい程度で、ウロキナーゼは、プラスミノーゲンをプラスミンへ変換するセリンプロテアーゼである。不活性ｔＰＡは傷害後に血管内皮細胞から放出され、フィブリンと結合しおよび結果として活性化される。ウロキナーゼは、排出管を裏打ちする上皮細胞によって、前駆体であるプロウロキナーゼとして産生される。ウロキナーゼの役割は、これらの管内に沈着しうるフィブリン血餅の溶解を活性化することである。
【００２７】
活性ｔＰＡはプラスミノーゲンを切断してプラスミンにし、プラスミンは次いでフィブリンを消化し、結果はプラスミンもプラスミノーゲンも結合できない可溶性分解産物である。プラスミノーゲンおよびプラスミンの放出後、それらはそれぞれの阻害剤によって迅速に不活性化される。ｔＰＡ活性の阻害は、特異的阻害タンパク質への結合の結果として生じる。少なくとも四種類の異なる阻害剤が同定されており、そのうち２−プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１型（ＰＡＩ−１）および２型（ＰＡＩ−２）は生理的意義が非常に大きい。
【００２８】
このように、上記から凝固に関与する生理的機構は非常に複雑であることが判り、および、凝固における多数の相互に関係する経路を安全に調節できる物質を設計または同定するには大きな困難があることがわかる。血液凝固系の多層カスケードは、その開始シグナルの非常に大きな増幅を可能にする。外因性経路を下ると、たとえば、プロコンバーチン（ＶＩＩ）、スチュアート因子（Ｘ）、プロトロンビン、およびフィブリノーゲンはそれぞれ血漿中に＜１、８、１５０、および~４０００ｍｇ．ｍＬ−1の濃度で存在する。このように、小さなシグナルが非常に速やかに増幅され、効果的な止血調節を実現する。
【００２９】
一つの不適切な凝固さえ致命的な結果を生じうるため、凝固は非常に厳密に調節されなければならない。実際に、血液凝固は、ヒトの死の二つの主因である脳卒中および心臓発作の主要な原因である。このように、凝固の調節は主要な医学的関心である。抗凝固作用の異なる機構を用いていくつかの阻害剤が開発されている。これらは、ヘパリン、クマリン、および１，３−インダンジオンを含む。
【００３０】
ヘパリンは６，０００ないし４０，０００Ｄａの範囲の分子量を有するムコ多糖である。大部分の市販のヘパリン調製物の平均分子量は１２，０００〜１５，０００の範囲にある。そのポリマー鎖は相互グリコシド結合によって結合したＤ−グルコサミンおよびウロン酸の反復二糖単位から成る。ウロン酸残基はＤ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸のどちらかでありうる。これらの各単糖残基上の少数の水酸基が、硫酸化される可能性があり、高度に負に荷電したポリマーを生じる。各糖残基の平均負電荷は約２．３である。
【００３１】
ヘパリンの重要な構造単位は、独特の五糖配列である。この配列は、三個のＤ−グルコサミンおよび二個のウロン酸残基から成る。中央のＤ−グルコサミン残基は、この配列の他では稀である、独特な３−Ｏ−硫酸部分を含む。
【００３２】
ヘパリンは、アンチトロンビンと後進和製複合体を形成する。アンチトロンビン−ヘパリン複合体の形成は、二つの主な凝血促進プロテアーゼである第Ｘａ因子およびトロンビンの阻害率を大幅に高める。これら両方の酵素のアンチトロンビン単独による阻害の通常は低い速度（〜１０3−１０4Ｍ−１ｓ−１）は、ヘパリンによって約１，０００倍上昇する。プロテアーゼの両方の活性形の活性化における加速は、凝固形成に決定的である、以降のフィブリノーゲンのフィブリンへの変換を妨げる。
【００３３】
ヘパリンは相対的に無毒性であるが、しかしヘパリンの過剰投与または過敏性は、過剰な出血を結果として生じうる。プロタミンは、過剰出血合併症の解毒剤として使用される。
【００３４】
クマリンおよびその誘導体は、主な経口抗凝固剤である。ワーファリンは、ＲおよびＳ異性体のラセミ混合物として市販されているクマリン誘導体である。
【００３５】
クマリンは作用が遅く、ｉｎ ｖｉｖｏ で１２ から４時間の潜伏期後に初めて作用を発揮し、およびその作用は１．５から５日間続く。観察された遅い開始は、投薬前プロトロンビン血中レベルを低下させるのに必要な時間が原因である可能性があり、一方でワーファリンについて観察された作用の長い持続時間は、肝臓がプロトロンビンを投薬前血中レベルへ再合成するのに必要な遅延時間が原因である可能性がある。
【００３６】
クマリンおよび１，３−インダンジオン（下記参照）は、ある種の薬物と相互作用するというさらなる短所を有する。たとえば、経口抗凝固剤の作用は、フェニルブタゾンおよびサリチル酸といった薬物によって促進されうる一方バルビツール酸およびビタミンＫによって拮抗されうる。クマリンは、プロトロンビンの生合成においてビタミンＫの競合阻害剤である。
【００３７】
凝固カスケードは、非常に重要な段階におけるプロトロンビンのトロンビンへの変換に依存する。しかし、この変換は、プロトロンビンのＮ末端の１０個のｇ−カルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）残基の存在に依存する。複数のＧｌａ残基はＣａ2+のための結合部位を形成する。通常の環境下では、プロトロンビンの１０個のグルタミン酸（Ｇｌｕ）残基は、翻訳後修飾によってＧｌａ残基へ変換される。
【００３８】
この翻訳後修飾は、酵素ビタミンＫレダクターゼおよびビタミンＫエポキシドレダクターゼによって触媒される。ビタミンＫはこの変換反応における補助因子である。このように、ビタミンＫは還元形およびエポキシド形の間を循環する。ビタミンＫとの構造的類似性のため、クマリンは酵素ビタミンＫレダクターゼおよびビタミンＫエポキシドレダクターゼと、プロトロンビンのＧｌｕ残基のＧｌａへの変換を促進することなく結合すると考えられる。このように、プロトロンビンは第Ｘａ因子によって作用を受けることができない。
【００３９】
１，３−インダンジオンは、１９４０年代から抗凝固剤であることが本分野で知られている。アニシンジオンの作用の開始および持続時間は、クマリンのものと同様である。インダンジオンの主な短所は、その副作用である。一部の患者はインダンジオンに過敏性であり、および発疹、発熱、および白血球減少症を発症する。
【００４０】
達成された全体的利益にもかかわらず、現在使用されている治療用抗凝固剤はまた、効力の限界によっておよびさらに多くは出血合併症によって引き起こされる死亡および罹患の大きな原因でもある。これらの問題を克服するための努力において、いくつかの新規の薬剤が開発されている。しかし、治療用抗凝固剤は不可避的に、効力の増大は出血合併症の増加によってのみ達成されるという内在的な問題を伴うように見える。抗凝固剤の凝固へのターゲッティングは、この致命的な繋がりを断つ手段に相当しうる。凝固特異的エピトープに向けられた抗体との抗凝固剤の融合は、凝固での抗凝固剤の濃縮を可能にし、一方で循環血中の抗凝固剤の濃度は低レベルに維持されうる。
【００４１】
凝固 ターゲッティングの成功は、ターゲットとして選択されたエピトープの量および 特異性に依存する。フィブリンが凝固 ターゲッティングに使用されうることは以前に示されている。しかし フィブリン または フィブリン 分解産物は血液中に循環する可能性があり、循環中の抗凝固剤の間違ったターゲッティングに繋がりうる。
【００４２】
本分野の別の問題は、凝固障害の診断に関連する。多数の凝固障害は、防がれうるかまたは少なくともより重度の問題へ進行することが防がれうることが定説である。したがって、早期の凝固障害の指標があることが臨床医にとって望ましい。
【００４３】
本発明の一態様は、有効であり、なお凝固時間の延長を結果として生じない抗凝固剤を提供することによって先行技術の問題を克服または緩和することである。本発明はさらに、凝固関連障害を診断するための方法および試薬を提供する。
【００４４】
文書、作用、材料、用具、物品などは、本発明の背景を提供する目的でのみ本明細書に含まれる。本出願の各請求項の優先日以前に存在したためにこれらの事物のいずれかまたはすべてが先行技術の基礎の一部を成したかまたは本発明に関連する分野の共通一般知識であったことは示唆または意味されない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４５】
一態様では、本発明は、対象への抗凝固剤の投与の際に第二の成分が第一の成分を活性化血小板へ向かわせる、凝固を阻害する能力のある第一の成分、および活性化血小板をターゲッティングする能力のある第二の成分を含む抗凝固剤を提供する。出願者らは、抗凝固剤の活性化血小板へのターゲッティングは、過剰な出血の危険無しに、凝固を阻害する手段を提供することを実証している。本発明の一形態では、第二の成分は、凝固上で大量におよび特異的に発現される凝固特異的ターゲットに相当する活性化フィブリノーゲン／フィブリン結合ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ上のリガンド誘導性結合部位（ＬＩＢＳ）に対してターゲッティングされる。凝固ターゲッティングのために、抗ＬＩＢＳ一本鎖抗体（ｓｃＦｖanti-LIBS）が作成された。第一の成分として、非常に強力な直接的な第Ｘａ因子（ｆＸａ）阻害剤であるダニ抗凝固ペプチド（ＴＡＰ）が用いられた。融合分子ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰの特異的抗体結合はフローサイトメトリーで証明され、および抗ｆＸａ活性は発色検定で実証された。Ｉｎ ｖｉｖｏ抗凝固効率は、マウスでの頸動脈の塩化第二鉄誘導性血栓症モデルにおいてドップラーフロー測定によって閉塞時間（ＯＴ）として測定された。ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰはＯＴをエノキサパリンと同等に延長し、および、組み換えＴＡＰおよび標的でない変異ｓｃＦｖ−ＴＡＰの等モル用量は、後者が調節する低用量でさえ、抗血栓作用を示さなかった。試験したその他の抗凝固剤とは対照的に、尾切断によって測定された出血時間は、ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰによって延長されなかった。
【００４６】
本発明はまた、凝固障害を治療または予防するための医薬組成物および方法を提供し、前記方法は必要とする哺乳類に有効量のここに記載の組成物を投与する段階を含む。抗凝固剤として有用な化合物をスクリーニングするための診断方法、および血栓症、血栓性塞栓、不安定プラークなどの存在を、活性化血小板を指向するプローブを用いて同定するための方法もまた含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
第一の態様では、 本発明は、対象への抗凝固剤の投与の際に第二の成分が第一の成分を活性化血小板へ向かわせる、凝固を阻害する能力のある第一の成分、および活性化血小板をターゲッティングする能力のある第二の成分を含む抗凝固剤を提供する。出願者らは、抗凝固剤を活性化血小板へターゲッティングすることによって、抗凝固効力の増大と出血合併症との間の連結が断たれ、それによって本分野における重大な問題を克服することを見出している。出願者らは、活性化された血小板は効率的な凝固ターゲッティングのための有効な標的として使用されうることを見出している。心筋梗塞におけるアテローム性動脈硬化に誘導される血栓でのように、血小板は動脈系内の血栓に特に豊富である。活性化血小板は凝固に高度に特異的であり、および典型的には循環中に見出されない。このように、効率的な凝固ターゲッティング、豊富さおよび特異性についての両方の必要条件が満たされる。これらの好ましい性質の他に、凝固ターゲッティングのためのエピトープとしての活性化血小板の使用は、血小板活性化はフィブリン形成に先行しうるため、フィブリンと比較してさらに有利でありうる。
【００４８】
抗凝固剤は、二つの成分が上記の必要な機能を実行する能力を有する限り、任意の形を取りうる。
【００４９】
抗凝固成分は、本剤が凝固の部位に有効に局在化できる限り、任意のサイズでありうる。しかし、抗凝固成分は好ましくは低分子であり、なぜならこれは血栓接近可能性および透過を改善しうるためである。本発明の一つの好ましい形では、第一の成分は約７，０００Ｄａ以下の分子量を有する。先行技術はいくつかの低分子抗凝固剤を開示する一方、抗凝固剤は中心的なおよび重要な凝固因子を強力に阻害することが好ましい。本発明の一形態では、第一の成分は、宿主からの吸血を円滑にする抗第Ｘａ因子阻害剤を用いるヒメダニ（オルニソドロス・モウバタ（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ ｍｏｕｂａｔａ））に由来するペプチド抗凝固剤である。この抗凝固剤は、１９９０年（ワクスマン（Ｗａｘｍａｎ）他 Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０； ２４８： ２４７３）に最初に記載され、およびＴＡＰ（ダニ抗凝固ペプチド）と命名された。組み換えＴＡＰは、凝固カスケードにおける第Ｘａ因子の中心的な上流のおよび速度決定位置のために、効果的な抗凝固を可能にする選択的第Ｘａ因子阻害剤として記載されている（ネーパー（Ｎｅｅｐｅｒ）他．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９０； ２６５： １７７４６）。 ＴＡＰは自然界で発見された最も強力な抗凝固剤の一つであり、およびアミノ酸６０個だけの低分子である。適当なＴＡＰの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースから登録番号Ｍ６０４８０として入手可能である。
【００５０】
第一の成分は、外因性または内因性凝固経路のどちらかの任意の成分に作用しうる。本発明の好ましい一形態では、第一の成分は酵素第Ｘａ因子に作用する。第Ｘａ因子の直接阻害は、たとえばヘパリンに媒介される間接的なアンチトロンビン−ＩＩＩ媒介阻害と比較して有利であることが提案されており、何故なら凝固に結合した第Ｘａ因子およびプロトロンビナーゼ随伴第Ｘａ因子は、直接的な第Ｘａ因子阻害剤によって顕著によりよく阻害されるように見えるからである。抗血栓効力および再閉塞の予防を調べる比較試験において、ＴＡＰは、間接的第Ｘａ因子阻害剤よりも、およびトロンビン阻害剤よりも有利であることが示されている。これらの長所にかかわらず、ヒトでの治療用途についてはヒルジンと同様に高い出血速度が予測され、およびヒト薬剤の開発は先行していない。理論によって限定されることは望まず、発生中の凝固へのＴＡＰのターゲッティングは、全身の抗凝固剤を、およびそれによって出血合併症を低減でき、および凝固における抗第Ｘａ因子活性の安定な固定による長期間続く抗凝固作用が達成可能でありうる。このように、ＴＡＰは低分子であり、補助因子の必要無しの直接阻害を実証し、および凝固経路の初期の中心をターゲッティングすることがターゲッティングの好ましい候補である。
【００５１】
ＴＡＰが本発明の一実施形態で用いられる一方、ヒルジンのような凝固因子の他の阻害剤を含む、多数の他の抗凝固剤が適当となる。また、線溶剤のターゲッティングは、出血合併症がより少ない高度に効率的な血栓溶解の見込みがある。
【００５２】
ここでは、「凝固を阻害する」の語は、完全な阻害だけでなく、凝固形成の部分的な阻害も意味することが意図される。理論によって限定されることを望まず、完全阻害は調節されない出血に繋がりうるために部分的阻害が好ましいと考えられる。
【００５３】
第二の成分の機能は、第一の成分を活性化血小板の物理的近傍へ運ぶことである。これは、活性化血小板に結合するかまたは活性化血小板に随伴する分子に結合する能力を有する第二の成分によって達成されうる。典型的には、これは、活性化血小板上のマーカーと結合できる第二の成分によって達成される。可能な最高の特異性を本剤に与えるために、マーカーは活性化血小板の表面上だけで発現されるものであるべきである。しかしそのような絶対的要件は厳密には必要でなく、および第二の成分が活性化血小板を主にターゲッティングする能力がある限り、本発明はここに開示される長所を提供すると理解される。
【００５４】
活性化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを含め、活性化血小板上に主に存在するいくつかのマーカーがある。マーカーは、凝固系の他の成分と比較して、一方の形が活性化血小板上で優勢であることが見出されるような、不活性形および活性形を取るものでありうる。血小板表面上で最も豊富に発現される分子のうちの一つが、糖タンパク質受容体（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＣＤ４１／ＣＤ６１）である。この受容体はインテグリン接着分子ファミリーに属し、およびαIIbβ3ともいう。インテグリンは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａリガンドであるフィブリノーゲンの結合に関して低親和性から高親和性受容体へ立体構造変化を受ける、二個の非共有的に結合したサブユニットから成る。リガンド結合ポケットの露出の他に、この立体構造変化はまた、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ上のいわゆるリガンド誘導性結合部位（ＬＩＢＳ）の露出を誘導する。これらの結合部位は、活性化および／またはリガンド結合ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に特異的である。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａは非常に豊富であり、各血小板の表面上に約６００００個から８００００個の分子がある。
【００５５】
この受容体は、血小板活性化に際して不活性状態から活性状態へ変化し、その機構は新しいエピトープが露出されるような受容体の立体構造変化である。このように、本発明の一形態では、第二の成分は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体の活性化に際して形成される新しいエピトープと結合する能力がある。
【００５６】
当業者は、第一の成分および第二の成分が物理的に結合していることは厳密には必要でないことを理解する。たとえば第一の成分および第二の成分は、物理的分離していて、第一の成分が第二の成分との結合の手段を含んでいることが可能である。この案では、第一の成分を最初に対象へ投与でき、および新しい凝固へ移動して活性化血小板へ結合しうる。第二の成分はその後に投与でき、および第一の成分へ結合しうる。このように、二つの成分は、活性化血小板の部位で機能性抗凝固剤が完成するまで物理的に分離している。
【００５７】
本発明の好ましい一形態では、抗凝固剤は単一分子、および典型的には単一タンパク質分子の形である。二つの成分を単一分子中で実現するための便利な手段は、一本鎖抗体分子の骨格に両方の成分を含めることによる。これらの分子は、可変領域を含めるならば、エピトープを特異的にターゲッティングするのに特に適している。可変領域は、標的エピトープへの親和性を有するように設計される。一本鎖抗体は、組み換え治療剤の設計に有望な形式である。一本鎖抗体は、単一ペプチド鎖上の短いリンカー分子を介して互いに融合された抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のみから成る。このように、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、完全な抗体結合部位を含む最小の断片を構成する。サイズは免疫原性の決定因子であるため、ｓｃＦｖはもし免疫原性であるとしても最小限であると予測される。
【００５８】
一本鎖抗体の別の長所は、 第一および第二の 成分の結合が、成分の生物学的機能の損失がほとんど無いことに繋がる点である。しかし化学結合は 典型的には抗体 結合機能の、および結合されたエフェクター分子の活性の相当な損失を結果として生じることが認識されるが、 ｓｃＦｖ は分子生物学的方法を用いて機能的損失無しに結合されうる。最後に、 ｓｃＦｖは細菌において大量に、短時間で、低コストで産生でき、および それらはアフィニティクロマトグラフィーによって高度に精製されうる。一本鎖 抗体を産生するための手段は当業者によく知られており、その主題についての総説は『組み換え抗体』（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（ブライトリング（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ）およびデューベル（Ｄｕｅｂｅｌ），１９９９，出版社：ワイリー・アンド・サンズ社（Ｗｉｌｅｙ ＆ ｓｏｎｓ），ＩＳＢＮ ０４７１１７８４７０）に見ることができ、その内容は参照により本開示に含まれる。
【００５９】
好ましくは、抗ＬＩＢＳ一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のクローニングはＩｇＧ抗ＬＩＢＳ１４５を発現するハイブリドーマ細胞株に基づく。ＬＩＢＳ（リガンド誘導性結合部位）エピトープに対する抗体が、ターゲッティングｏｆ抗凝固剤の凝固へのターゲッティング用に選択された。以前に示された通り、ｍＡｂ抗ＬＩＢＳ１４５（ＩｇＧanti-LIBS）はＲＧＤ−ペプチド、アブシキマブ、チロフィバンおよびエプチフィバチドとの血小板のインキュベート後のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへのリガンド誘導性結合を示す（シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）他．ＪＰＥＴ ２００４，３０８： １００２）。さらに、ＩｇＧanti-LIBSは、ＡＤＰ活性化血小板への強い結合をフィブリノーゲンの存在下で示す（図２）。このように、この抗体は、非常に豊富でおよび特異的なターゲッティング性質を提供する。
【００６０】
ｍＡｂ抗ＬＩＢＳ１４５を発現するハイブリドーマ細胞株が、抗ＬＩＢＳ一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のクローニングのための基礎として使用された。このハイブリドーマ細胞株のｍＲＮＡが調製され、およびオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写された。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域が、可変領域の５'および３'末端の保存領域とアニーリングするプライマーを用いたＰＣＲによって増幅された（詳細については本文書に別に記載する方法を参照）。ＰＣＲ産物は、細菌において高レベル発現を可能にするｐＨＯＧ２１発現ベクターへクローニングされた。ＴＧ１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換後、各クローンはＬＩＢＳに典型的なＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合について評価された。元のＩｇＧ抗ＬＩＢＳ１４５ｍＡｂとフローサイトメトリーで比較してより強い結合を示した一つのクローン（図２）が以降の使用のために選択された。このクローンは配列決定され、およびそれは一本鎖抗体のすべての典型的な性質を示した（図１）。さらに、ウェスタンブロット分析は、正確なサイズの約３２ｋＤａを明らかにした（図３）。
【００６１】
好ましくは、一本鎖抗体はｓｃＦｖ融合タンパク質として発現される。ＴＡＰは機能的な損失無しに融合されうることを示す以前の結果に基づき（ＴＨ）、この非常に強力な直接的な第Ｘａ因子阻害剤が、そのクローニングされた一本鎖抗体と結合させるために選択された。ＴＡＰは公表された配列情報（Ｇｅｎｂａｎｋデータベース登録番号Ｍ６０４８０として）にしたがって最初に合成され、およびｐＨＯＧ２１発現ベクターへ、軽鎖の可変領域のＣ末端に直接クローニングされた（図１Ａ、Ｂ参照）。ｐＨＯＧ２１は、封入体によって精製を円滑にするｐｅｌＢリーダー配列、およびＮｉ2+精製および検出のためのＨｉｓ（６）タグを含む（図１Ａ、Ｂ）。精製ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰの収量は細菌培養１Ｌから約０．４〜０．８ｍｇであった。発現および精製後、一本鎖抗体構造のサイズがウェスタンブロット分析によって評価された（図３）。ｓｃＦｖanti-LIBS単独の分子量は~３２ｋＤａであり、未変化の融合タンパク質ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰの分子量は~３９ｋＤａであり、および非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰの分子量は~４２ｋＤａであった（図３）。
【００６２】
本発明の非常に好ましい一つの形では、一本鎖抗体は本質的に図１に示す通りである。当業者は、遺伝コードの縮重、およびアミノ酸を他の類似のアミノ酸と置換する能力は図１によって特定される分子の誘導体および同等物が容易に作製されうることを意味することを理解する。これらの誘導体および同等物は、本発明の出願の範囲に含まれる。
【００６３】
別の一態様では、本発明は、ここに記載の抗凝固剤を含む医薬組成物を提供する。当業者は、通常の方法によってここに記載の抗凝固剤を与えるのに適した組成物を作製できるようになる。抗凝固剤がタンパク質である場合、組成物は単にＮａＣｌを等張濃度で含みうる。キャリヤータンパク質、安定剤、緩衝剤、非水系溶媒、塩類、保存料などを加えることが必要でありうる。
【００６４】
別の一態様では、本発明は、ここに記載の組成物の有効量を必要とする哺乳類に投与する段階を含む、凝固障害を治療または予防する方法を提供する。典型的には、組成物は経静脈または動脈内注射または輸液によって全身的に投与される。用量に関して、抗凝固剤がタンパク質である場合、用量は約３０ｍｇ／ｋｇないし約３００ｍｇ／ｋｇである。任意の所与の対象、または任意の所与の凝固障害について目的の臨床効果を達成するために用量を漸増または漸減することは十分に臨床医の能力内である。
【００６５】
凝固障害は、凝固の阻害を必要とする任意の障害でありうる。そのような障害は、冠動脈疾患、心筋梗塞を含む急性冠動脈症候群、脳卒中、頸動脈または大動脈のアテローム性動脈硬化、深部静脈血栓症、肺塞栓症、および臓器のアテローム性動脈硬化または血栓症といった、血栓症を伴うすべての臨床状況を含む。
【００６６】
好ましい二機能性融合分子ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰは出願者によって評価されている。融合分子ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰの一本鎖抗体部分の機能は、フローサイトメトリーによって評価された。ＳｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰおよびｓｃＦｖanti-LIBSは、フィブリノーゲン結合した活性化血小板と同様の結合特性を示した（図２）。このように、遺伝子融合はその一本鎖抗体の結合特性を顕著に変化させなかった。当該融合構造の第Ｘａ因子阻害活性は、発色検定によって評価された。第Ｘａ因子は、ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰ、非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰ、ｓｃＦｖanti-LIBSおよび組み換えＴＡＰの存在下で特異的発色基質とインキュベートされた（図４）。ｒＴＡＰと比較して、ＴＡＰ活性は融合構造においてわずかに低下したが、しかし明らかに存在した（図４）。このように、抗体結合および第Ｘａ因子阻害の両方の機能が保持された。
【００６７】
活性化血小板上のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのＬＩＢＳエピトープへの抗凝固剤のターゲッティングの、抗凝固剤の従来の非ターゲッティング使用と比較した有意性を示すために、よく確立されたマウス血栓症モデルが選択された（ファレイ（Ｆａｒｒｅｈｉ）他．１９９８； ９７：１００２）。しかし、抗ＬＩＢＳ抗体はフィブリノーゲンと結合した活性化マウス血小板へのターゲッティングに使用されうることが最初に示された。出願者らはマウス血液を入手し、および元のＩｇＧanti-LIBS、ｓｃＦｖanti-LIBS、および融合構造ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰの、マウス血小板への結合をフローサイトメトリー．によって評価した。ヒト血小板での結果と同様に、ＩｇＧanti-LIBSの特異的結合が見られたが、しかしｓｃＦｖanti-LIBS抗体単独についてより強い特異的結合が見られ、およびその融合タンパク質ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰの、フィブリノーゲン結合した活性化マウス血小板との結合が見られた（図５）。このようにマウス血小板のターゲッティングが、作製された抗ＬＩＢＳ 融合 構造を用いてうまくいくことが示された。
【００６８】
血栓がマウスの頸動脈において塩化第二鉄を用いて誘導された。ナノフロープローブによって測定された血流の停止が、血管内の閉塞性血栓の指標として用いられた。塩化ナトリウム溶液および一本鎖抗体抗ＬＩＢＳが陰性対照として用いられ、およびエノキサパリンが現行の臨床標準に相当する陽性対照として用いられた。エノキサパリンは閉塞時間をほぼ倍増させた（図８）。等モル量の組み換えＴＡＰ、非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰおよびｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰは、エノキサパリンの作用に近い、閉塞時間の顕著な延長を引き起こした。元の投与された用量の１／１０への減量（０．０３μｇ／ｇ体重）は、ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰについて閉塞時間の有意な延長をまだ生じた（ｐ＝０．００２）一方で、同一用量で非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰは閉塞時間の有意な延長を生じなかった。このように、ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰは、直接対照の非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰが有意な抗凝固を生じない用量でさえ、強い抗凝固作用を与える。
【００６９】
活性化血小板をターゲッティングする抗凝固剤の主な長所は、出血合併症の低減である。出血時間は、マウスにおける標準化された外科的尾切断によって測定された。予想通り、生理食塩水およびｓｃＦｖanti-LIBSは出血時間延長を生じなかったが、一方でエノキサパリン、および特に組み換えＴＡＰは相当な延長を生じた。非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰおよびｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰの両方が強い抗凝固作用を示す用量０．３μｇ／ｇ体重にて（図６）、非標的ｍｕｔｓｃＦｖ−ＴＡＰだけが出血時間において高度に有意な延長を生じた（ｐ＜０．００１、図７）。凝固にターゲッティングされたｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰは出血時間の延長を全く生じなかった。また、より低用量のｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰは、マウスの頸動脈で明らかな抗凝固作用をまだ示したが、出血時間延長を示さなかった。このように、抗ＬＩＢＳ一本鎖抗体へのＴＡＰの新しく作製された融合によって、出血時間の延長無しに、非常に効果的な抗凝固作用が達成できた。
【００７０】
出血時間の延長の回避は本発明の長所である一方、ここに記載の抗凝固剤は一部の実施形態では出血時間を延長しうることが理解される。
【００７１】
別の一態様では、本発明は、ここに記載の抗凝固剤の、凝固障害の予防または治療のための薬剤の調製における使用を提供する。
【００７２】
別の一態様では、本発明は、候補化合物を提供、化合物を活性化血小板および凝固の少なくとも一つの他の成分に曝露、化合物が活性化血小板と結合するかどうか評価、および化合物が凝固の少なくとも一つの他の成分と結合するかどうか評価する段階を含み、少なくとも凝固の他の成分と比較して活性化血小板に対してより高い親和性結合の能力を有するならばその化合物は有用である、抗凝固剤を凝固へターゲッティングするのに有用な化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
【００７３】
このように、活性化血小板は抗凝固治療のための有利な標的であるという出願者の知見に基づき本発明に関連する第二の成分として有用である化合物を同定することが可能になる。当業者は、免疫吸着法、クロマトグラフィー法、表面プラズモン共鳴法などを含む、ある分子の別の分子との結合を測定するのに有用ないくつかの方法に詳しくなる。
【００７４】
別の一態様では、本発明はここに記載のスクリーニング法によって同定される化合物を提供する。
【００７５】
本発明の別の一態様は、対象の血管における活性化血小板の検出を含む、対象における凝固障害の診断または予測の方法を提供する。
【００７６】
出願者の知る限り、先行技術は活性化血小板の診断または予測のための使用を開示しない。活性化血小板の検出は、いくつかの医療用途に有用な関連するマーカーを臨床医に提供する。一つの用途は、破裂冠動脈プラークまたは破裂する傾向にあるプラークに見出される活性化血小板を画像化することである。これは、可能性のある関連病変へのステントの予防的埋め込み後の心筋梗塞症候群といったものの早期非侵襲的診断を可能にする。これは、冠動脈血管造影（先行技術で記載される通り）は血管腔についての情報を提供するだけであり、血管壁自体の形態についての情報を与えないため、特に医療上興味深い。このように、おそらく破裂したかまたは破裂傾向にあるプラークは冠動脈血管造影では検出されない。
【００７７】
診断マーカーとしての活性化血書板の有用性を考慮して、本発明はまた、（ａ）活性化血小板をターゲッティングする能力がある結合成分および（ｂ）標識を含む、血管異常を検出するためのプローブを提供する。当業者は、本発明に関連して有用であるプローブは、典型的には水系組成物として提供され、および診断法の前または途中に、動脈または静脈に注射されることを理解する。プローブは次いで身体の目的部位へ血液によって輸送され、および活性化血小板があれば結合する。結合したプローブは次いでＭＲＩといった適当な手段によって検出される。
【００７８】
結合成分は、活性化血小板の表面上のマーカーと結合する能力を有しうる。適当なマーカーの非限定的な一例は、活性化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体分子である。ＰＡＣ−１およびＣＤ６２−Ｐといった他のマーカーもまた考慮される。本発明の一つの形では、結合成分および標識は、一本鎖抗体分子の骨格中にある。
【００７９】
ここに記載のプローブおよび当該プローブを用いる方法は、活性化血小板の、たとえば肺塞栓症または末梢塞栓症、または末梢動脈または中心動脈における破裂アテローム硬化性プラークでの、何らかの蓄積を検出するのに使用されうる。これらの病変は、疾患過程の早期に検出および選択的に治療されうる。
【００８０】
当業者は、ここに記載のプローブ および 方法 が、凝固障害の臨床的に認識可能な徴候または症状を必ずしも実証することなく、 凝固 障害の素因を有する個人を特定するのに有用でありうることを理解する。
【００８１】
本方法の好ましい一つの形では、活性化血小板を検出する段階に用いられるプローブは、ここに記載の一本鎖抗体である。好ましくは、一本鎖抗体はここに記載の抗ＬＩＢＳ抗体と同一かまたは類似である。診断目的には、一本鎖抗体は抗凝固成分を含む必要が無いことが理解される。実際、当業者は、断片が活性化血小板への結合を担う部位を含む限り、一本鎖抗体の断片を使用することが可能であることを理解する。理論によって限定されることを望まず、一本鎖抗体の小型のサイズは、この用途において特に有利であると考えられる。抗体は、血栓の表面を越えて、より多数の活性化血小板が存在する部位へ透過する能力があることが提案されている。これは、結合した抗体のより効果的な検出、およびしたがってより高感度の造影を可能にする。抗体プローブはまた、活性化血小板が沈着している血管の表面へも接着しうる。
【００８２】
本方法は、血栓（たとえば深部静脈血栓症）、血栓性塞栓（たとえば肺塞栓症）および活性化血小板の沈着（たとえば不安定アテローム硬化性プラークの部位での）を診断および同定するために使用されうる。早期検出は、凝固溶解剤および／または抗凝固療法の投与および／または介入手順を可能にし非常に有利である。
【００８３】
当業者は、診断法および予測法に用いられるプローブは本分野で公知である任意の方法によって標識されうることを理解する。粒子の官能化に応じて、この目的のためにさまざまな戦略が使用されうる。一つの方法は、カルボキシ官能化ＳＰＩＯおよび一本鎖抗体の遊離アミノ基の間にペプチド結合を作ることである。当業者は、この化学的架橋手法に使用されうるさまざまな市販のカップリング剤およびキットに詳しい。別の方法は、市販のコバルト官能化１μｍＳＰＩＯ−ビーズとの複合体化のために抗体のヒスチジンタグを使用し、それによって一本鎖抗体／ビーズ複合体がコバルトへのヒスチジンの結合により維持されることとなる。要約すると、この方法では一本鎖抗体およびＳＰＩＯビーズは室温にて１０分間インキュベートされ、その後、その懸濁液は磁石によって分離され、および数回洗浄される。適当な対照が、同一手順を用いて無関係な一本鎖抗体をＳＰＩＯと複合体化することによって作製される。
【００８４】
当業者は、Ｘ線造影法に有用である任意の標識が、プローブに組み込まれうることを理解する。本方法の非限定的な一例として、活性化血小板にターゲッティングされるプローブと常磁性標識がカップリングされうる。プローブの投与に際して、常磁性標識は凝固、塞栓または不安定アテローム硬化性プラークの部位に局在化し、それは次いで磁気共鳴造影法によって視覚化されうる。
【００８５】
代替的に、プローブは放射性標識化（たとえばテクネチウム−９９ｍ、ルビジウム−８２、タリウム２０１、Ｆ−１８、ガリウム−６７、またはインジウム−１１１を用いて）でき、活性化血小板はガンマカメラを用いて視覚化される。また、コンピューター断層撮影法および超音波法（たとえばマイクロバブルのターゲッティング）を用いる活性化血小板の標識化が、記載の抗体について有用であると考えられる。
【００８６】
出願者は、活性化血小板をターゲッティングしおよびｉｎ ｖｉｖｏ環境においてＭＲＩを用いるコントラスト結合の定量を可能にするプローブの使用をここで開示する。本発明の一つの形では、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａの活性立体構造だけを認識する一本鎖抗体が用いられ、その抗体はマイクロメートルサイズの常磁性酸化鉄粒子とカップリングされている。血管内構造は、本分野で典型的に用いられる酸化鉄ナノ粒子よりも数桁大きいミクロンサイズの粒子が接近可能である。出願者の知る限り、一本鎖抗体を用いる活性化血小板の機能的造影はここで初めて記載される。
【００８７】
活性化血小板にターゲッティングされる標識化プローブのｉｎ ｖｉｖｏ環境での使用を実証するため、マウスにおける大腿ワイヤ傷害モデルが使用され（ロケ（Ｒｏｑｕｅ），Ｍ．，他．，管腔表面上の接着分子の迅速な蓄積および好中球の動員を伴う大腿動脈裸出傷害のマウスモデル（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｆｅｍｏｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｄｅｎｕｄａｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｌｕｍｉｎａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ．） Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，２０００．２０（２）： ｐ．３３５−４２）、それは傷害の２４時間後の血小板の単層に繋がる。マウスにおける大腿ワイヤ傷害後の細胞現象の時間的経過はよく記載されており、および図１５Ｃに示される通り、２４時間後裸出した内皮上の集密な血小板沈着を一貫して示す。これは活性化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体上のリガンド誘導性結合部位に対する一本鎖抗体を用いた活性化血小板をターゲッティングするための基礎として用いられた。この抗体の結合はフィブリノーゲンまたはそのアナログの存在に依存するため、この抗体は機能的特異性を与える。これらの性質は、血小板血栓の造影を媒介するための、ＭＰＩＯに対するリガンドとしてこの抗体を魅力的にする。１１．７ Ｔ ＭＲＩおよびＴ２＊強調ＭＲＩを用いて、強いビーズ結合の範囲にシグナル空白が検出された。血管壁に結合したＭＰＩＯの組織学的に確認された量は、Ｔ2＊強調ＭＲＩでＭＰＩＯによって生じたシグナル消失の程度と有意に相関した。このＭＲＩ法は、直径わずか２００μｍの小血管を造影するのに十分な分解能を有する。ＭＰＩＯ誘導性シグナル空白は、シグナル空白を検出するのに十分な感度であり、Ｔ2＊強調ＭＲＩにおいて動脈壁によって生じる内因性ネガティブコントラストを拡大さえした。
【００８８】
以前のコントラスト剤ターゲッティング法は、インテグリンと複合体化されたガドリニウムに富むペルフルオロカーボンナノ粒子、ペプチド複合体化された酸化鉄ナノ粒子、およびガドリニウムで標識化されたフィブリン特異的環状ペプチド標識を含んでいる。しかし、送ることのできるコントラスト剤の量、およびしたがって達成されるコントラスト作用の強度は、特に量の少ない標的については相対的に限定されている。
【００８９】
出願者らは、ＭＰＩＯが、容易に分散せずおよびＭＲＩ上で目立つ、高ペイロードのコントラストを有することを見出しており、および分子造影のためのＭＰＩＯの使用を提案する。この手法の多用途性は、異なる受容体立体構造についてさえ、血管受容体の一般的な血管内造影を可能にする。低密度のエピトープを、ここで示される通りＭＰＩＯによって、リガンド自身と比較したそのサイズにもかかわらず、効率的にターゲッティングでき、同時に高い鉄ペイロードは、ＭＰＩＯサイズに応じて、各ビーズおよびしたがって各受容体の検出さえ可能にする。さらに、ここに記載のファージディスプレイ法は、低密度なまたは機能性のエピトープに対する選択的リガンドを構築する可能性を提供し、したがってさまざまな疾患における病態生理的過程への深い洞察を可能にする。他の重要な問題は、一本鎖抗体が可変領域だけから成るための最小の免疫原性、および内密なエピトープへの接近を円滑にするサイズである。
【００９０】
ここに記載のプローブは、血管での活性化血小板の検出によって対象における血管異常を造影するための方法に使用されうることが理解される。本方法の一つの形では、検出は、ここに記載のプローブの使用を含む。プローブは標準的な心臓カテーテル法検査室で見られるＸ線およびＣＴ装置に有用であると考えられる。６４スライスＣＴまたは１２８スライスＣＴがここに記載の造影法に適していると提案されている。プローブはまた、プローブを導入するためにカテーテルを用いることによって、近赤外スペクトル造影（サーモグラフィー）に関して有用であると提案されている。
【００９１】
検出されうる異常は、破裂したアテローム硬化性プラークまたは破裂傾向にあるアテローム硬化性プラーク、血栓、塞栓、および活性化血小板の蓄積を含む。
【００９２】
本発明はここで下記の非限定的な実施例を参照することによってさらに説明される。
【実施例】
【００９３】
実施例１：一本鎖抗体ｓｃＦｖanti-LIBSおよび融合構造ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰの作製
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ上のＬＩＢＳエピトープに対するモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株の作製、およびその機能的特徴づけは、以前に記載されている（シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）他．ＪＰＥＴ ２００４； ３０８： １００２）。要約すると、ＲＧＤペプチドを用いて精製および溶出されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａが、ハイブリドーマ作製のための免疫原として用いられた。クローンは、活性化血小板を用いて、およびＲＧＤペプチドで飽和した固定化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを用いてスクリーニングされた。これらのクローンのうちの一つであるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）クローン１４５は、ＡＤＰ活性化血小板に対して、およびＲＧＤペプチド（ＧＲＧＤＳＰ，バイオモル・リサーチ・ラボラトリーズ社（ＢＩＯＭＯＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ペンシルバニア州プリマスミーティング（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ））、エプチフィバチド（インテグリリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｌｉｎ）（登録商標），エセックスファーマ社（Ｅｓｓｅｘ Ｐｈａｒｍａ），ドイツ、ミュンヘン）、チロフィバン（アグラスタット（Ａｇｇｒａｓｔａｔ）（登録商標），ＭＳＤ，ニュージャージー州ホワイトハウスステーション（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ））、および アブシキマブ（レオプロ（ＲｅｏＰｒｏ）（登録商標），イーライリリー社（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ），インディアナ州インディアナポリス）と予めインキュベートした血小板に対して結合の増加を示した。ハイブリドーマはＲＰＭＩ、１０％ウシ胎仔血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０μＭメルカプトエタノール、ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００ｇ／ｍｌ（すべてギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））、および１ｘＨＡＴサプリメント（Ｈ０２６２、シグマ社（Ｓｉｇｍａ））中で維持された。ＩｇＧanti-LIBSｍＡｂは、イムノピュア（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ）（登録商標）ＩｇＧプロテインＧ精製（ピアース社（Ｐｉｅｒｃｅ），米国イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ））を用いたハイブリドーマ上清のアフィニティ精製によって調製された。
【００９４】
一本鎖抗体クローニングのために、ハイブリドーマのｃＤＮＡが、ｍＲＮＡ精製カラム（オリゴｄＴ）およびＭ−ＭｕＬＶ（共にアマシャム・ファルマシア社（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ），ドイツ、フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ））を用いて調製された。抗体可変領域の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＰｆｕ（登録商標）ポリメラーゼ（ストラトジーン社（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ），米国カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ））を用いて達成された。重鎖（ＶH）および軽鎖（ＶL）の可変領域の保存領域（ウェルショフ（Ｗｅｌｓｃｈｏｆ）他．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９５； １７９： ２０３） に由来する配列に基づいた下記のプライマーが用いられた： ＶH センス： ５'− ＣＣＧ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＣＧ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＡＧ −３'，ＶH アンチセンス： ５'− ＣＣ ＡＧＧ ＧＧＣ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＴＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＧＧ ＴＧＴ ＣＧＴ ＴＴＴ −３'，ＶL センス： ５'− ＡＡ ＴＴＴ ＴＣＡ ＧＡＡ ＧＣＡ ＣＧＣ ＧＴＡ ＧＡＴ ＡＴＣ G／TＴＧ A／CＴG／C ＡＣＣ ＣＡＡ T／AＣＴ ＣＣ，ＶL アンチセンス： ５'− ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＧＣ ＡＴＣ ＡＧＣ −３'。ＰＣＲ構造はｐＨＯＧ２１ベクター系（キプリヤノフ（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ）他．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７； ２００： ６９，シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）他．ＦＡＳＥＢ Ｊ ２００４： １８： １７０４）へ、ＶHについて制限部位 Ｎｃｏ Ｉ および Ｈｉｎｄ ＩＩＩを、およびＶLについて制限部位 Ｍｌｕ Ｉ および Ｎｏｔ Ｉを用いてクローニングされた。結果として生じた一本鎖抗体をｓｃＦｖanti-LIBSと称した。ＴＡＰは以前にクローニングされており（ハーゲマイヤー（Ｈａｇｅｍｅｙｅｒ）他．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．２００４； ９２： ４７）、およびｓｃＦｖanti-LIBSを既に含むｐＨＯＧ２１へ、制限部位 Ｎｏｔ Ｉ および Ｘｂａ Ｉを用いて導入し、それによってｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰ（図１Ａ）を作製した。ｓｃＦｖ部分の結合機能を持たない対照として、一本鎖抗体を含む非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰが作製され、その一本鎖抗体は元はＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへ結合したが、しかしその重鎖ＣＤＲ３（相補性決定領域）が変異され（ＲＮＤからＡＮＤへ）およびそれによってその結合性質が失われた。すべての構造は配列決定された（図１Ｂ）。
【００９５】
実施例２：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｓｃＦｖ構造の発現および精製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＴＧ１）細胞が上記のｐＨＯＧ２１プラスミドを用いて形質転換され、および新しく画線された寒天プレートからの各コロニーを、アンピシリン１００μｇ／ｍＬおよび１００ｍＭグルコースを含むＬＢ培地中で３７℃にて５００ｍＬフラスコで培養した。培養は２００ｒｐｍにて約４〜６時間、ＯＤ（６００ｎｍ）~０．８に達するまで振とうした。細菌は５０００ｒｐｍにて１０分間４℃での遠心分離によって沈澱され、およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌおよび０．４Ｍショ糖を含むＬＢ培地に再懸濁された。ｓｃＦｖ産生の誘導のためにＩＰＴＧが終濃度０．２５ｍＭとなるように添加され、および室温にて（２２〜２４℃）２００ｒｐｍで１６〜２０時間インキュベートされた。全細胞抽出物からの可溶性タンパク質の精製のために、細菌を５０００ｒｐｍにて１０分間４℃での遠心分離によって採集した。沈澱した細菌は１Ｘバグバスター（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ）（登録商標）（ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ），米国マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））５ｍＬ溶液／沈澱ｇに再懸濁し、および１５分間室温にて緩やかに振とうしてインキュベートした。１５０００ｒｐｍにて２０分間４℃での追加の遠心分離段階後、可溶性タンパク質を含む上清は氷上に保持され、および１：５０希釈されたプロテアーゼ阻害剤（コンプリート（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）（登録商標）ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ），スイス、バーゼル）が添加された。可溶性タンパク質抽出物を含む上清は、５００ μＬのＮｉ2+−アガロース （キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ），ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））と混合され、および１時間４℃にて、１５０ｒｐｍで一定に振とうしながらインキュベートされた。Ｎｉ2+−アガロースは、ここでＨｉｓ（６）タグ化タンパク質を結合しているが、緩衝液（５０ ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、３００ ｍＭ ＮａＣｌ、２０ ｍＭ イミダゾール、ｐＨ ８）で洗浄する前に３０分間静置された。このバッチ洗浄手順を二回反復した。最後に、ｓｃＦｖ融合タンパク質は高イミダゾール濃度（２５０ｍＭ）にて溶出され、および続いて還元条件下でグラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングによって分析された。タンパク質はイムノブロッティングのためにイモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）Ｐ膜（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），米国ベドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ））に転写された。０．２％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０および１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−ツイーン）で膜を一夜ブロッキング後、ＨＲＰ標識化抗Ｈｉｓ（６）抗体 （ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ），ドイツ、マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ））が添加され（１：５００希釈）および２時間室温にてインキュベートされた。膜はＰＢＳ−ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）緩衝液で数回洗浄され、その後スーパーシグナル（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ）（登録商標）化学発光基質（ピアース社（Ｐｉｅｒｃｅ）、米国ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ））の添加によりケミドック（ＣｈｅｍｉＤｏｃ）ＸＲＳ（登録商標） （バイオラッド社（ＢｉｏＲａｄ），オーストラリア、ニューサウスウェールズ州リージェンツパーク（Ｒｅｇｅｎｔｓ Ｐａｒｋ）でペルオキシダーゼ活性が視覚化された。サイズマーカーおよびＨｉｓ（６）タグ陽性対照として、６ｘＨｉｓプロテインラダー（登録商標）（キアゲン社）が用いられた。
【００９６】
実施例３：ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰのＩｎ Ｖｉｔｒｏ機能特徴づけ
血液調製
ヒト血液は２１ゲージバラフライ針を用いて静脈穿刺によって健常者から採取され、 およびクエン酸で抗凝固処理された。濃厚血小板血漿が１００ ｘ ｇでの遠心分離（ＧＳ−６Ｒ遠心分離機、ベックマン・コールター社（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、オーストラリア、ニューサウスウェールズ州グレイズビル（Ｇｌａｄｅｓｖｉｌｌｅ））によってプラスチック試験管で室温にて遠心分離機内に１０分間で得られた。
【００９７】
マウス血液は２７ゲージ針を用いた心臓内穿刺によってＣ５７ＢＬ／６マウスから採取され、および未分画ヘパリン（２０Ｕ／ｍＬ）を用いて抗凝固処理された。５０μｌ量が１ｍＬの改変タイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液（１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ ｍＭ ＫＣｌ、１．２ ｍＭ ＮａＨＣＯ3、２ ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ ｍＭ ＣａＣｌ2、０．１ ％ ＢＳＡ、０．１ ％グルコース）に再懸濁され、および１３００ｘｇにて５分間遠心分離された。上清は廃棄され、および沈澱は１ｍＬの改変タイロード緩衝液に再懸濁された。
【００９８】
フローサイトメトリー
ヒトクエン酸加全血は改変タイロード緩衝液で１／５０希釈され、２０μＭＡＤＰの添加によって活性化されたか、または活性化されずに、および次いで１０分間、１０μｇ／ｍＬのＩｇＧanti-LIBS、ｓｃＦｖanti-LIBS、およびｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰと予備インキュベートされた。ＳｃＦｖｓは、ｓｃＦｖのヒスチジン（６）タグに対する二次抗体（ペンタＨｉｓアレクサフロー（Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）４８８コンジュゲート （登録商標）、キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ））によって検出された。ＩｇＧanti-LIBSはＤＴＡＦ複合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（ジャクソン・イムノリサーチ社（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、米国ペンシルバニア州ウエストグローブ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ））によって検出された。
【００９９】
マウス血小板は、０．１Ｕ／ｍＬトロンビン（エンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ社（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），米国インディアナ州サウスベンド（Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ）） の添加によって活性化されたかまたは活性化されずに、 および 次いで１０ 分間、 １０ μｇ／ｍＬのＩｇＧanti-LIBS，ｓｃＦｖanti-LIBS，および ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰとインキュベートされた。蛍光検出は上記の通り実施された。試料は ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），米国カリフォルニア州サンホセ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ））で、ＣｅｌｌＦＩＸ（登録商標）（ベクトン・ディッキンソン社）を用いた固定後に測定された。
【０１００】
実施例４：抗第Ｘａ因子 活性 検定
第Ｘａ因子の阻害は、発色基質スペクトロザイムｆＸａ＃２２２（アメリカン・ダイアグノスティカ社（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ．），米国コネチカット州グリニッチ（Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ））の分解によって測定された。プローブは改変タイロード緩衝液（１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ ｍＭ ＫＣｌ、１２ ｍＭ ＮａＨＣＯ3、２ ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ ７．４）に対して透析され、および１００ｎＭのｓｃＦｖanti-LIBS、ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰおよび非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰ、または遊離組み換えＴＡＰを終容量１６５μｌ中に得るように調整された。１０μｌの０．１％ヒトアルブミンを添加後、プローブは１０μＬの５００ｐＭ第Ｘａ因子（ヘモクロム（Ｈａｅｍｏｃｈｒｏｍ）、エンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ社（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））と混合され、および陽性対照としての第Ｘａ因子単独と比較された。室温にて１０分間インキュベート後、１５μＬの発色基質溶液（５ｍＭ）が添加され、およびプレートは１５分間室温にてインキュベートされた。最後に、反応は停止溶液５０μｌを添加することによって停止され、および吸収は４０５ｎｍにてＥＬＩＳＡリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ3（登録商標）、パーキンエルマー社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、オーストラリア、メルボルン）で測定された。
【０１０１】
実施例５： マウスモデルにおける抗血栓効力および出血からの保護のＩｎ Ｖｉｖｏ機能評価
体重２２〜３８ｇのＣ５７ＢＬ／６マウス（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ社（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），米国マサチューセッツ州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ））が本試験に用いられた。実験動物の飼育および使用は国のガイドラインに従い、およびフライブルク大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）およびベーカー心臓研究所（Ｂａｋｅｒ Ｈｅａｒｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の施設内動物飼育および倫理委員会に承認された。マウスはエクシケーターを用いてイソフルランで数秒間、およびケタミン（ケタネスト（Ｋｅｔａｎｅｓｔ）（登録商標）１００ｍｇ／ｋｇ体重）およびキシラジン（ロンプン（Ｒｏｍｐｕｎ）（登録商標）５ｍｇ／ｋｇ体重）の皮下注射で麻酔し、および解剖顕微鏡下に置いた。反射の消失後、右 総頸動脈 領域の直接上に皮膚切開を行った。筋膜は平滑に切開され、および右総頸動脈の一部が露出された。次いでナノドップラーフロープローブ（モデル０．５ＶＢ、トランソニック・システムズ社（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、米国ニューヨーク州イサカ（Ｉｔｈａｃａ））が動脈上に配置され、および頸動脈血流がフローメーター（モデルＴ１０６、トランソニック・システムズ社、米国ニューヨーク州イサカ）によって測定された。血栓症は、塩化第二鉄（１０％溶液）（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、米国ミズーリ州セントルイス）で飽和したろ紙（ゲルブロット紙、ＧＢ００３、シュライヒャー・アンド・シュール社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ），米国ニューハンプシャー州キーン（Ｋｅｅｎｅ））の一片（１ｘ２ ｍｍ）を右頸動脈下に付けおよび３ 分後に除去することによって誘導された。血栓性閉塞は、製造元の規格による本システムの精度に相当する範囲である、０．０±０．２ｍＬ／分間に低下した際に生じると考えられた。
【０１０２】
塩化第二鉄処理の１分前に，マウスは尾 静脈を通じて、 生理食塩水 （陰性対照） （０．９％ 塩化ナトリウム） １００ μｌ，１ ｍｇ／ｋｇ体重を生理食塩水で容量１００ μｌに希釈したエノキサパリン（陽性対照）（クレキサン（Ｃｌｅｘａｎｅ）（登録商標）サノフィ・アベンティス社（ＳａｎｏｆｉＡｖｅｎｔｉｓ）、フランス、パリ）、およびさまざまな用量の精製組み換えｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰ、ｓｃＦｖanti-LIBS、非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰ、およびｒＴＡＰを輸液した。使用したｓｃＦｖｓおよびｒＴＡＰのすべての用量は、溶解して容量１００μｌとされた。すべての薬剤がマウスに輸液されたことを確実にするため、口を生理食塩水１００μｌで洗浄した。
【０１０３】
マウス出血時間は、シンカン（Ｘｉｎｋａｎｇ）によって以前に記載された通り測定された。麻酔されたマウスを解剖顕微鏡下に置いた。マウス尾の先端から約１〜２ｍｍ（直径約１ｍｍ）に、使い捨て外科用ナイフを用いて切断を行った。尾が最初に３０秒より長く出血が止まった時間を秒で記録した。
【０１０４】
統計分析
データは表示数（Ｎ）マウスのマウスについて平均値±標準偏差として示す。統計的比較は分散分析（ニューマン・クールズ検定後にＡＮＯＶＡ）によって行われ、および差はｐ＜０．０５で有意と考えられた。
【０１０５】
実施例６： 診断用造影のための標識化一本鎖抗体の使用
実施例１に記載の一本鎖抗体抗ＬＩＢＳを、Ｈｉｓタグを含むタンパク質と相互作用するように官能化された超常磁性酸化鉄粒子（ＳＰＩＯ）と混合した（ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（登録商標）タロン（ＴＡＬＯＮ）（商標）；ダイナル・バイオテク社（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ））。抗体を常磁性ビーズへカップリングするための他の方法（たとえば化学カップリング）もまた使用されうる。活性化血小板（血栓および塞栓の主要なおよび必須な成分である）へのコントラスト剤の結合は、接着検定によって実証された。検定に使用される血小板の活性化は蛍光顕微鏡によって観察され、血小板表面上のＰ−セレクチン発現のアップレギュレーション、および蛍光検出によって細胞内Ｃａ2+レベルの上昇を示した。検定は、血小板を３０分間３７℃にてインキュベートすることによる、フィブリノーゲン被覆カバーグラス上への活性化血小板の固定を含んだ。カバーグラスを洗浄後、フィブリノーゲン−血小板マトリクスはコントラスト剤に３０分間曝露された。非特異的結合を除外 およびコントラスト剤の血小板だけとの結合を実証するため、血小板の同時染色が、Ｐ−セレクチン抗体およびフルオレセイン−アビジンでの二次染色を用いて実施された（図９）。共焦点顕微鏡法を用いて、赤色に見える自己蛍光コントラスト剤の血小板への結合が、Ｐ−セレクチン染色血小板の同時の緑色蛍光によって実証された。共焦点顕微鏡法からのＺスタックを用いた３Ｄ−再構成を図１０に示す。
【０１０６】
さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの本造影法の適切性を評価するため、血栓表面上の活性化血小板への一本鎖抗体の結合を示すための磁気共鳴実験が実施された。これらの実験のために、アクチン、アデノシン二リン酸および塩化カルシウムをヒト濃厚血小板血漿に添加し、および混合物を１５〜３０分間３７℃でインキュベートすることによってヒト血栓が人工的に作製された。血栓はさまざまな濃度のコントラスト剤に曝露され、およびさらに３０分間３７℃にてインキュベートされた。最後に、血栓はＰＢＳ緩衝液で２回洗浄され、および４％パラホルムアルデヒドで固定された。４時間の固定後、血栓は２４ウェル細胞培養プレートのウェルに、ガドリニウム添加２％アガロースに囲まれて包埋された。磁気共鳴造影（ＭＲＩ）は３テスラ医療用スキャナーで標準のリストコイルを用いて実施された。ＴＥ／ＴＲ ９．３ｍｓ／７００ｍｓの３ＤＦＬＡＳＨ配列が分解能１３０ｘ１３０ｘ２００μｍで実施され、および画像は一夜の分析で凝固の縦軸に垂直に再構成された。ＳＰＩＯｉｎＴ２＊強調ＭＲＩによって生じるネガティブコントラストは、ＬＩＢＳターゲッティング抗体とインキュベートされた血栓の周りに黒色の輪として用量依存性に観察された（図１１）。さらに、ビーズ結合は、パラフィン包埋切片において抗Ｐ−セレクチン抗体を用いた免疫組織化学、およびノヴァレッドでの染色を用いて確認された：図４は、血小板の範囲へのビーズ（黄色）の結合を伴う血小板（茶色）の集塊を示す。これらの結果は、設計されたコントラスト剤の活性化血小板への ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合成功を示し、ＭＲＩによって臨床使用フィールド強度を用いて検出されうる。
【０１０７】
実施例７：マウスモデルにおける診断用造影のための標識化一本鎖抗体の使用．
一本鎖抗体作製および１μｍ酸化鉄微粒子への複合体化
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ上のＬＩＢＳエピトープは、活性化血小板についての豊富なおよび高度に特異的な標的に相当する。ｍＡｂ抗ＬＩＢＳ１４５は、活性立体構造でのみＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと結合し、およびそれはフィブリノーゲンの存在下でＡＤＰ活性化血小板への強い結合を示す（シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ＪＰＥＴ ２００４）。ｍＡｂ抗ＬＩＢＳ１４５を発現するハイブリドーマ細胞株が、抗ＬＩＢＳ一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のクローニングのための基礎として使用された。このハイブリドーマ細胞株のｍＲＮＡが調製され、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写された。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域が、可変領域の５'および３'末端にある保存領域とアニーリングするプライマーを用いてＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲ産物はｐＨＯＧ２１ベクターにクローニングされ、ＴＧ１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）が形質転換され、およびＬＩＢＳに典型的なＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合について評価され、活性化血小板を用いてフローサイトメトリーで試験された。最後に、最も良く結合するｓｃＦｖLIBSが、アンピシリン１００μｇ／ｍＬおよび１００ｍＭグルコースを含むＬＢ培地中で、３７℃にて５００ｍＬフラスコで産生された。培養は２００ｒｐｍにて約４〜６時間、ＯＤ（６００ｎｍ）~０．８に達するまで振とうされた。細菌は５０００ｒｐｍにて１０分間４℃での遠心分離によって沈澱され、およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌおよび０．４Ｍショ糖を含むＬＢ培地に再懸濁された。ｓｃＦｖ産生の誘導のためにＩＰＴＧが終濃度０．２５ｍＭとなるように添加され、および室温にて（２２〜２４℃）２００ｒｐｍで１６〜２０時間インキュベートされた。細菌を５０００ｒｐｍにて１０分間４℃での遠心分離によって採集し，沈澱した細菌は１Ｘバグバスター（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ）（登録商標）（ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）） ５ｍＬ溶液／沈澱ｇに再懸濁し、および１５分間室温にて緩やかに振とうしてインキュベートした。１５０００ｒｐｍにて２０分間４℃での追加の遠心分離段階後、可溶性タンパク質を含む上清は氷上に保持され、および１：５０希釈されたプロテアーゼ阻害剤（コンプリート（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）（登録商標）ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））が添加された。上清は ｗａｓ ｍｉｘｅｄ ｗｉｔｈ ５００ μＬのＮｉ2+−アガロース （キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）） と混合され、および１時間４℃にて、１５０ｒｐｍで一定に振とうしながらインキュベートされた。Ｎｉ2+−アガロースは、ここでＨｉｓ（６）タグ化タンパク質を結合しているが、緩衝液（５０ ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、３００ ｍＭ ＮａＣｌ、２０ ｍＭ イミダゾール、ｐＨ ８）で洗浄する前に３０分間静置された。このバッチ洗浄手順を二回反復した。最後に、ｓｃＦｖは高イミダゾール濃度（２５０ｍＭ）にて溶出されおよび透析された。ｓｃＦｖ調製物の機能性はフローサイトメトリーで評価された。
【０１０８】
自己蛍光 コバルト官能化ＭＰＩＯ （１μｍ）が、取扱説明書に従って（ダイナル・バイオテク社（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ），ノルウェー、オスロ）、ＬＩＢＳ一本鎖抗体のヒスチジンタグと複合体化された。要約すると、洗浄後１ｍｇ のビーズ がＬＩＢＳ 抗体と１０ 分間 室温にて （ＲＴ） インキュベートされ、約１０μｇ の ヒスチジンタグ化抗体を結合した。懸濁液を入れた試験管を次いで、ビーズが試験管の側面に移動してしまうまで磁石の上に置き、および上清を廃棄した。この洗浄を、５０ｍＭ ＮａＰ （ｐＨ ８）、３００ｍＭ ＮａＣｌ および０．０１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０．を含む結合および洗浄緩衝液を用いて４回反復した。
【０１０９】
活性化血小板へのＬＩＢＳ−ＭＰＩＯ結合
活性化血小板へのＬＩＢＳ−ＭＰＩＯの結合を実証するために、接着検定が実施された。 薬剤を摂取していない健常者由来の血液をクエン酸で抗凝固処理し、および１０００ ｒｐｍ にて １０ 分間遠心分離した。結果として得られる濃厚血小板血漿をＰＢＳで希釈し （１：１０）、 および １００ μｌを、２０μｇ／ｍｌ フィブリノーゲンと１ 時間３８℃予備インキュベートされおよび１％ ＢＳＡで １ 時間 室温にてブロッキングされているフィブリノーゲン被覆カバーグラス上に加えた。３８℃にて３０分間インキュベート後、カバーグラスをＰＢＳで洗浄し、および連続回転下で０．５μｇのＬＩＢＳ−ＭＰＩＯ（ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯ）または等価の複合体化された無関係の一本鎖抗体対照（対照ＭＰＩＯ）のどちらかと、さらに３０分間３８℃にてインキュベートした。カバーグラスを次いで５分間ＰＢＳで２回洗浄し、および１０％ヤギ血清（ベクター社（Ｖｅｃｔｏｒ）、米国カリフォルニア州バーリンガム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ））で１時間室温にてブロッキングした。コントラスト剤の特異的結合を実証するため、血小板を、Ｐ−セレクチンについてモノクローナルマウス抗ヒトＣＤ６２抗体（１：１００、Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、英国アビンドン（Ａｂｉｎｇｄｏｎ））を用いて、二次抗体として作用するビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（ベクター社、米国カリフォルニア州バーリンガム） と同時染色した。最後に、１：２００希釈フルオレセインアビジン Ｄ （ベクター社、米国カリフォルニア州バーリンガム）を添加し、１時間および室温にてインキュベートした。カバーグラスはセルフィックス（ＣｅｌｌＦｉｘ）（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ドイツ、ハイデルベルク）を用いて固定し、および共焦点顕微鏡法によって評価した。
【０１１０】
マウス
ワイヤ傷害は平均１０±０．８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ジャクソン・ラボラトリーズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），英国）で実施した。マウスは水および標準飼料を自由摂取した。すべての手順は英国内務省動物（科学的処置）法１９８６に準拠して実施された。
【０１１１】
大腿ワイヤ傷害、ビーズ灌流および試料調製
片側大腿ワイヤ傷害は全身麻酔下で、同時投与されたヒプノルム（Ｈｙｐｎｏｒｍ）（２５ｍｇ／ｋｇ、バイエル社（Ｂａｙｅｒ）、ドイツ）およびヒプノバル（Ｈｙｐｎｏｖａｌ）（２５ｍｇ／ｋｇ、バイエル社、ドイツ）の組み合わせを用いて、以前に記載された通り実施した（ロケ（Ｒｏｑｕｅ），Ｍ．，他．，管腔表面上の接着分子の迅速な蓄積および好中球の動員を伴う大腿動脈裸出傷害のマウスモデル（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｆｅｍｏｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｄｅｎｕｄａｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｌｕｍｉｎａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，２０００．２０（２）： ｐ．３３５−４２）。外科用顕微鏡下で、鼠径部切開を行った。大腿動脈が露出され、および動脈切開が腹壁分岐の遠位側で３０Ｇ注射カニューレ（ＢＤ社，ベルギー、エーレムボードヘム（Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ））を用いて行われた。０．０１０インチガイドワイヤ（ボストン・サイエンティフィク社（Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、米国ナティック（Ｎａｔｉｃｋ））が挿入され、大動脈分岐へ進められ、および引き戻された。ワイヤの除去後、動脈切開部位は結合され、および皮膚は絹縫合糸を用いて閉じた。２４時間後、マウスはイソフルランの吸入によって薬殺された。開胸術によって胸部を開き、心臓を露出しおよび右心房を切断した。３０Ｇ針を左心室の尖部を通じて挿入し、および動物をＰＢＳ１０ｍｌで灌流して血液を排出した。灌流を、ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯまたは対照ＭＰＩＯ（それぞれ１．５ｘ１０8ビーズ／ｍｌ）のどちらかを含むＰＢＳ５ｍＬを用いて続けた。３０分後、マウスを再び生理圧下でＰＢＳ１０ｍＬで、次いで２ｍＭガドテリドール（プロハンス（Ｐｒｏｈａｎｃｅ）、ブラッコ社（Ｂｒａｃｃｏ）、英国）を含む４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）５ｍＬで灌流した。皮膚を除去し、傷害部のある肢を切断し、４％ＰＦＡ／２ｍＭガドテリドール中に２４時間保持し、および次いで２％高グレード低融点アガロース（キャンブレックス社（Ｃａｍｂｒｅｘ）、米国メイン州ロックランド（Ｒｏｃｋｌａｎｄ））の入ったガラスＭＲ管に包埋した。
【０１１２】
Ｅｘ ｖｉｖｏ ＭＲＩ
Ｅｘ ｖｉｖｏ ＭＲＩを１１．７ Ｔにて１３ ｍｍ 1Ｈバードケージラジオ波コイル （ラピッドバイオメディカル社（ＲＡＰＩＤ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ），ドイツ、ヴュルツブルク（Ｗuｒｚｂｕｒｇ））を用いて実施した。３Ｄグラジエントエコーシーケンス （ＴＥ ＝ ４ ｍｓ ／ ＴＲ＝ ９０ ｍｓ、視野１３(１３(１９．５ｍｍ、マトリクスサイズ２５６(２５６(３８４、２平均、造影時間~７ｈ／配列）を無人一夜運転に使用した。データ再構成はオフラインで最終等方性分解能２５μｍ3を用いて実施した。
【０１１３】
傷害大腿動脈におけるＭＰＩＯ 結合の組織学 および 定量
ＭＲＩ後、標本を１０％ギ酸中で一夜脱灰し、段階的エタノール溶液およびネオクリア（Ｎｅｏ−ｃｌｅａｒ）（ＶＭＲ社、英国）を経て脱水し、パラフィン包埋しおよび連続切片を作製した（８μｍ厚）。標本は鉄について（アキュスティン（Ａｃｃｕｓｔａｉｎ）、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、ドイツ）取扱説明書に従って染色した。傷害された管腔血管壁へ結合した複合体化ＭＰＩＯの数を、光学顕微鏡を用いて傷害血管部位から動物当たり２０〜２５切片で定量しおよび平均した。
【０１１４】
免疫組織化学を用いた血小板可視化については、脱パラフィンおよび再水和した切片を１％Ｈ2Ｏ2中で２０分間飽和し、沸騰用クエン酸緩衝液に加え、および４分間圧力鍋で抗原回収のために沸騰させた。標本をＰＢＳツイーン（Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、タンパク質ブロック溶液（ダコ・サイトメーション社（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、ドイツ、ハンブルク）と４時間インキュベートし、および４℃にてラット抗マウスＣＤ６１抗体（１：８０００、インターセル・テクノロジーズ社（ＩｎｔｅｒＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），米国Ｆｌ）と一夜インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、ビオチン化ヤギ抗ハムスターＩｇＧ（１：２００、ベクター社（Ｖｅｃｔｏｒ）、米国カリフォルニア州バーリンガム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ））二次抗体。スライドをＰＢＳで洗浄し、およびペルオキシダーゼ反応を、ベクタステインＲＴＵエリート（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＲＴＵ Ｅｌｉｔｅ）ＡＢＣ試薬 および ベクター・ノヴァレッド（ＮｏｖａＲｅｄ）（共に ベクター社、米国カリフォルニア州バーリンガム）を用いて実施した。最後に、切片を脱水し、パーマウント（Ｐｅｒｍｏｕｎｔ）（バイオメダ社（Ｂｉｏｍｅｄａ）、米国カリフォルニア州フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）を用いてマウントし、および血小板へ結合したビーズを光学顕微鏡で評価した。
【０１１５】
ｅｘ ｖｉｖｏ ＭＲＩによる大腿動脈におけるＭＰＩＯ結合
ＭＰＩＯ結合の定量を盲検で実施した。抗体複合体化ＭＰＩＯ結合は、２以上の連続した切片での大腿動脈の管腔表面上の明瞭な円形シグナル空白として定義された。複数の切片に現れるＭＰＩＯは、１回だけ計数された。断片化された画像は、大腿動脈全体にわたるＭＰＩＯ結合の分布を可視化するため、３Ｄコンストラクターまたはイメージプロ・プラス（ＩｍａｇｅＰｒｏ Ｐｌｕｓ）用プラグインを用いて三次元で再構成された
【０１１６】
統計的手法
データは平均値±標準偏差として表される。パラメトリックデータはｔ検定を用いて比較された。統計的有意性はＰ ＜０．０５に与えられた。
【０１１７】
結果
ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯは血小板上の活性化糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体を検出する
図１３で、抗Ｐ−セレクチン抗体で標識されたヒト血小板血栓は鮮緑色の蛍光を発する。血小板血栓に重なっているのは、自己蛍光ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯに対応する赤色領域である（図Ａ）。ＭＰＩＯは非特異的バックグラウンド保持無しに、血小板血栓に限定される。対照的に、図Ｂでは、無関係な一本鎖抗体と複合体化された対照ＭＰＩＯの結合が全く存在しない。共焦点顕微鏡法での３次元ｚスタック再構成は、Ｐ−セレクチン染色血小板（緑）へのＬＩＢＳ−ＭＰＩＯ結合（赤）を示し、それらの相対サイズおよび空間的関係を強調している。
【０１１８】
ｅｘ ｖｉｖｏ ＭＲＩによって検出された壁接着血小板と結合したＬＩＢＳ−ＭＰＩＯ
片側性大腿動脈ワイヤ傷害がマウス１３個体で合併症無しに実施された。マウス７個体がＬＩＢＳ−ＭＰＩＯで、および６個体が対照ＭＰＩＯで、左心室経由で灌流された。観察者２名間でＭＰＩＯの定量に顕著な変動があった対照動物１個体が定量分析から除外された。
【０１１９】
傷害動脈断片のＥｘ ｖｉｖｏ Ｔ２＊強調ＭＲＩはしばしば、動脈壁内に内因性低シグナル部分を示した（図１４Ｂ）。これとは異なったのは、血管腔内であるが血管壁と隣接した、円形シグナル空白の出現であった。この性質は、ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯを注射されたすべてのマウスのワイヤ傷害動脈で観察された（図１４Ａ）。定量分析では、ＭＰＩＯ蓄積を示唆する低シグナルの管腔部分は、ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯを注射された動物において、対照ＭＰＩＯ灌流動物よりも有意に高かった（２３．７２対６．２；Ｐ＜０．０１、図１４Ｃ）。
【０１２０】
ＭＰＩＯ結合は組織学において確認され（図１５）、ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯを注射された動物でＭＰＩＯ結合が有意に高かった（切片当たり９．９８対０．５ビーズ、Ｐ＜０．０１；図１５Ｄ）。ＭＰＩＯおよび動脈壁への血小板接着の同時局在化は、免疫組織化学によって確認された。図１５Ｃでは、ＭＰＩＯは血小板マーカーＣＤ６１についての免疫染色陽性に随伴して存在することが実証される。
【０１２１】
組織学におけるビーズ定量の分析は、ｅｘ ｖｉｖｏ ＭＲＩによる定量と比較して、強い相関を示した（Ｒ2＝０．７２１９、Ｐ＜０．００１；図１７）。したがって、ＭＲＩによって測定されたＭＰＩＯシグナル量は、傷害血管壁へ結合するＭＰＩＯの量を直接に反映した。
【０１２２】
最後に、ここに概要を示した通りの本発明の精神を離れることなく、さまざまな他の改変および／または変化を行いうることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１はＳｃＦｖ−抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰを示す。細菌ペクチン酸リアーゼ（ｐｅｌＢ）の細菌シグナルペプチド配列は４０位から１０５位までのヌクレオチドを含み、重鎖の可変領域は１０６位から４８３位までのヌクレオチドを含み、リンカー（ＹＯＬエピトープ）は４８４位から５１０位までのヌクレオチドを含み；軽鎖の可変領域は５１１位から８６１位までのヌクレオチドを含み；ＴＡＰ領域は８６２位から１０４１位までのヌクレオチドを含み、およびＨｉｓ６−タグは１０６９位で開始しおよび１０８６位で終了する。
【図２】図２はｐＨＯＧ２１−ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰのマップを示す。ＲＡＭＰ：アンピシリン耐性遺伝子；ＣｏｌＥ１ＯＲＩ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製開始点；ｆ１ＩＧ、線維状遺伝子間領域；ｐｅｌＢ：ペクチン酸リアーゼｐｅｌＢのリーダーペプチド配列；ＶＨ／ＶＬ：重鎖／軽鎖；ＴＡＰ：ダニ抗凝固ペプチド；Ｈｉｓ６：ヒスチジン６個の反復。
【図３】図３は、ＩｇＧ抗ＬＩＢＳ、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ、およびｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰの、非活性化でなく活性化ヒト血小板に対する特異的結合のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ＡＤＰ活性化血小板の結合は白ヒストグラムで示される；非活性化血小板への結合は網掛けヒストグラムで示される。ＩｇＧ抗体の結合はＤＴＡＦ複合体化ヤギ抗マウス抗体によって検出され、ｓｃＦｖｓの結合はアレクサフロー（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）４８８複合体化抗Ｈｉｓタグ抗体によって検出される。
【図４】図４は、Ｎｉ２＋−生成ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰ、および非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰのウェスタンブロット分析を示す。ＭＷ：分子量マーカー（６ｘＨｉｓタンパク質ラダー）、１：ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ、２：ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰ、３：非標的ｓｃＦｖ−ＴＡＰ。
【図５】図５は、第Ｘａ因子活性の、ｒＴＡＰ、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰ、および非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰによるが、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳによらない阻害を示す。発色基質（スペクトロザイムＦＸａ＃２２２）の第Ｘａ因子（５００ｐＭ）による切断が、４０５ｎｍにて測定された。棒グラフは光学密度（ＯＤ）を、 代表的な実験の三連測定の平均値および標準偏差として示す。
【図６】図６は、ＩｇＧ抗ＬＩＢＳ、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ、およびｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰの、非活性化でなく活性化マウス血小板への特異的結合のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。トロンビン活性化血小板の結合は白ヒストグラムで示される；非活性化血小板への結合は網掛けヒストグラムで示される。ＩｇＧ抗体の結合はＤＴＡＦ複合体化ヤギ抗マウス抗体によって検出され、ｓｃＦｖｓの結合はアレクサフロー（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）４８８複合体化抗Ｈｉｓタグ抗体によって検出される。
【図７】図７は、塩化第二鉄誘導性血栓症を有するマウスモデルでの頸動脈における、高用量および低用量でのｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰの抗血栓作用を示す。血栓発生は頸動脈でのナノドップラーフロープローブを用いたフロー測定によって測定された、閉塞時間測定によって評価された。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）および一本鎖抗体ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳが陰性対照として用いられる。臨床に使用される薬剤としてエノキサパリンが陽性対照として用いられる。ｒＴＡＰ、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰ、および非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰが高い等モル用量で用いられ、およびｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰおよび非標的ｓｃＦｖ−ＴＡＰが低い等モル用量で用いられた。各群４個体のマウスの平均値および標準偏差（ＳＤ）が示される。
【図８】図８は、凝固標的化抗凝固ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰが、コントラストｔｏエノキサパリン、ｒＴＡＰ、および非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰとは対照的に出血時間延長を引き起こさないことを示す。マウスにおける出血時間は、尾切断によって測定した。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）および一本鎖抗体ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳが陰性対照として用いられた。ｒＴＡＰおよび非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰは、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰとは対照的に出血時間の相当な延長を示した。各群４個体のマウスの平均値および標準偏差（ＳＤ）が示される。
【図９】図９は、血栓接着検定の概要を示す。フィブリノーゲン上に固定化された血小板が、抗ＬＩＢＳビーズコントラスト剤を用いて活性化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体を介してターゲッティングされた。血小板の同時染色が、コントラスト剤の血小板だけとの選択的結合を実証するため、Ｐ−セレクチン抗体およびフルオレセイン−アビジンを用いて実施された。
【図１０】図１０左図：接着検定の共焦点顕微鏡像。Ｐ−セレクチンおよびフルオレセインアビジン染色血小板は緑色の集塊として現れ、抗ＬＩＢＳビーズコントラスト剤の赤色の蛍光ビーズで囲まれている。右図：共焦点顕微鏡像６０枚からのＺスタックの３Ｄ再構成。
【図１１】図１１は、縦軸に垂直に再構成されたヒト血栓のＭＲＩの３Ｄ ＦＬＡＳＨ像を示す。異なる濃度の抗ＬＩＢＳビーズコントラスト剤に曝露された血栓は、ＳＰＩＯビーズによって生じたＴ２＊（血栓周囲の黒い輪）のネガティブコントラストを示す。ビーズ上の無関係の抗体に曝露された血栓は、このネガティブコントラストを示さない。
【図１２】図１２は、マウス 抗ヒト Ｐ−セレクチン および ノヴァレッド （茶色）を用いた血小板の免疫組織化学を示す。 抗ＬＩＢＳ ビーズ コントラスト 剤は黄色に見え、 および血栓表面上の血小板凝集の範囲だけに存在する。
【図１３】図１３は、アビジン−フルオレセインについてＣＤ６２Ｐ抗体を用いて染色された、フィブリノーゲンで固定されたヒト血小板の免疫蛍光を示す。（Ａ）赤色自己蛍光ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯコントラスト剤とインキュベートされた血小板は、緑色のアビジン−フルオレセイン誘導シグナルで表される血小板との特異的結合を示し、一方、対照ＭＰＩＯコントラスト剤との血小板のインキュベートは結合を示さない（Ｂ）。（Ｃ）はＬＩＢＳ−ＭＰＩＯとインキュベートされおよびＰ−セレクチンについて染色された血小板からのＺスタックの３Ｄ再構成を表し、活性化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対するＬＩＢＳのターゲッティングの原理を示す。
【図１４】図１４は、３Ｄグラジエントエコーシーケンス（ＴＥ＝４ｍｓ／ＴＲ＝９０ｍｓ、視野１３(１３(１９．５ｍｍ、マトリクスサイズ２５６(２５６(３８４）、等方性分解能２５μｍ3の１１．７Ｔ ｅｘ ｖｉｖｏ ＭＲＩを示す。（Ａ）はＬＩＢＳ−ＭＰＩＯ灌流マウスにおける傷害大腿動脈を示す。黒色の内因性血管壁シグナルが、ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯマウスおよび対照ＭＰＩＯマウスで観察でき（Ｂ）、しかし大腿動脈の管腔側に接してシグナル空白がＬＩＢＳ−ＭＰＩＯマウスにおけるＭＰＩＯ結合の指標として観察されうる（Ａ、矢印）。ＭＰＩＯに誘導されるＭＲＩシグナル空白の定量は、ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯおよび対照ＭＰＩＯ灌流マウスの間の有意差を明らかにする（ｐ＜０．０５）。
【図１５】図１５は、代表的な傷害大腿動脈断片の組織学を示す。（Ａ）はＬＩＢＳ−ＭＰＩＯを用いた灌流後の傷害壁への複数のビーズ結合を示し（矢印）、一方、対照ＭＰＩＯ灌流後には結合は観察できない（Ｂ）。（Ａ）および（Ｂ）の組織は鉄染色されたが、ビーズのポリスチレンコーティングは鉄コアの典型的な青色染色を可能にする。しかし、鉄コアの青色の内因性シグナルは、顕微鏡の焦点に依存して観察できた。（Ｃ）ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯコントラスト剤の血小板への結合は、ＣＤ６１についての免疫組織化学およびノヴァレッド染色を用いて確認された。（ａ）は壁に接着した血小板を表し、および（ｂ）ＭＰＩＯは血小板へ直接結合した。（Ｄ）ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯおよび対照ＭＰＩＯ灌流マウスにおいて代表的な組織切片ごとに結合したＭＰＩＯの定量、ＬＩＢＳを標的とするコントラスト剤の高度に特異的な結合を示す（ｐ＜０．０１）。
【図１６】図１６は、ＭＲＩでの傷害肢についてのＭＰＩＯシグナルおよび組織学での切片についての結合したＭＰＩＯの間の相関分析を示し、有意な相関を示す（Ｒ2＝０．７２）
【図１７】図１７は、イメージプロ・プラス（ＩｍａｇｅＰｒｏ Ｐｌｕｓ）用３Ｄコンストラクター・プラグインを用いるＬＩＢＳ−ＭＰＩＯ動物の大腿動脈の三次元再構成を示す。（Ａ）は緑色の管として現れる大腿動脈管腔を示す。（Ｂ）は赤色のＭＰＩＯシグナル単独を示し、および（Ｃ）では解剖学的像についての融合した情報が示される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液学の分野および特に止血の下位分野に関する．より具体的には、本発明は、１）哺乳類血液中の凝固を阻害する物質、および脳卒中、心筋梗塞、および深部静脈血栓症といった疾患の治療および予防におけるこれらの物質の用途、および２）血栓症、血栓性塞栓および不安定プラークといった臨床環境における診断および活性化血小板の特定を可能にするプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
血管傷害後の血流を調節する身体の能力は生存継続に決定的である。血液凝固 および 次いで傷害された組織の修復に続くその後の凝固の溶解の過程を止血という。止血は血管の完全性の喪失後に集合として起こるいくつかの現象から成る。
【０００３】
その過程の最初の段階は血管収縮である。これは傷害の範囲への血液の流れを制限する。次に、血小板がトロンビンによって活性化され、および傷害の部位で凝集して、一時的な緩い血小板栓を形成する。タンパク質フィブリノーゲンが、血小板凝集を刺激する主な原因である。血小板は血管の内皮裏打ちの破壊後に露出されるコラーゲンへの結合によって凝集する。活性化に際して、血小板は、アデノシン−５'−二リン酸、ＡＤＰおよびＴＸＡ２（他の血小板を活性化する）、セロトニン、リン脂質、リポタンパク質、および凝固カスケードに重要なその他のタンパク質を放出する。誘導された分泌に加えて、活性化血小板は栓の形成に対応するため形を変化させる。
【０００４】
最初は緩い 血小板栓の安定性を確実にするため、フィブリン網 （凝固ともいう） が形成されおよび栓を捕捉する。最後に、凝固 は組織修復後に正常な血流のために溶解されなければならない。凝固の溶解はプラスミンの作用を通じて起こる。
【０００５】
二つの経路すなわち内因性および外因性経路が、フィブリン血餅の形成に繋がる。それらは異なる機構によって開始されるが、その二つは、凝固形成に繋がる共通の経路に集束する。組織傷害の非存在下での異常血管壁に応答した赤色血栓または凝固の形成は、内因性経路の結果である。組織傷害に応答したフィブリン血餅形成は、外因性経路の結果である。両方の経路は複雑でありおよび凝固因子と呼ばれる多数の異なるタンパク質が関与する。
【０００６】
血小板活性化およびフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）。
止血が起こるためには、血小板は、露出されたコラーゲンに接着し、顆粒の内容を放出し、および凝集しなければならない。内皮細胞表面上に露出されたコラーゲンへの血小板の接着は、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）によって媒介される。ｖＷＦの機能は、血小板の表面上の特定の糖タンパク質（ＧＰＩｂ／ＩＸ）およびコラーゲン原線維の間の架橋として作用することである。血小板および内皮表面上の露出したコラーゲンの間の架橋としての役割に加えて、ｖＷＦは凝固第ＶＩＩＩ因子に結合しおよびそれを安定化する。第ＶＩＩＩ因子のｖＷＦによる結合は、循環中の第ＶＩＩＩ因子の正常な残存に必要である。
【０００７】
フォンウィルブランド因子は、血小板によって産生されおよび血小板内に貯蔵される複雑な多量体糖タンパク質である。それはまた巨核球によっても合成され、および内皮下結合組織に結合しても見出される。血小板の最初の活性化は、血小板の表面上の特異的受容体へのトロンビン結合によって誘導され、それによってシグナル伝達カスケードを開始する。トロンビン受容体はＧタンパク質と結合し、Ｇタンパク質は今度はホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）を活性化する。ＰＬＣ−γはホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）を加水分解し、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）およびジア知るグリセロール（ＤＡＧ）の形成に繋がる。ＩＰ３は細胞内貯蔵Ｃａ２＋の放出を誘導し、およびＤＡＧはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化する。
【０００８】
血小板が接着するコラーゲンおよび細胞内Ｃａ２＋の放出は、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）の活性化に繋がり、ＰＬＡ２は次いで膜リン脂質を加水分解し、アラキドン酸の遊離に繋がる。アラキドン酸放出は、トロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）の産生および続いての放出の増大に繋がる。これはＰＬＣ−γ経路を通じて機能するもう一つの血小板活性化因子である。放出された細胞内貯蔵Ｃａ２＋によって活性化されるもう一つの酵素が、ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）である。活性化ＭＬＣＫはミオシンの軽鎖をリン酸化し、それは次いでアクチンと相互作用し、結果として血小板の形態および運動性を変化させる。
【０００９】
ＰＫＣの多数の作用のうちの一つが、特異的な４７，０００ダルトン血小板タンパク質のリン酸化および活性化である。この活性化されたタンパク質は、血小板顆粒内容物の放出を誘導し、内容物の一つがＡＤＰである。ＡＤＰはさらに血小板を刺激し、活性化カスケード全体を増大させ、また血小板表面にフィブリノーゲンが接着するように血小板膜を変化させ、その結果として、フィブリノーゲンに誘導される血小板凝集が起こる。
【００１０】
血小板の活性化は、その結果としての血小板の血小板栓への凝集に必要である。しかし、等しく重要なのは、活性化された血小板表面リン脂質の、凝固カスケードの活性化における役割である。
【００１１】
内因性凝固カスケードは、血液および露出された内皮細胞表面の間に接触が行われる際に開始される。外因性および内因性経路は、第Ｘ因子が活性化されて第Ｘａ因子になる点で集束する。第Ｘａ因子は、第ＶＩＩ因子の第ＶＩＩａ因子へのさらなる活性化に関与する。活性な第Ｘａ因子はまた、プロトロンビンをトロンビンへ加水分解および活性化する。トロンビンは次いで、第ＸＩ、第ＶＩＩＩおよび第Ｖ因子を活性化でき、カスケードを進行させる。最終的にトロンビンの役割は、フィブリノーゲンをフィブリンへ変換すること、および第ＸＩＩＩ因子を第ＸＩＩＩａ因子へ活性化することである。第ＸＩＩＩａ因子（トランスグルタミナーゼともいう）は、フィブリンポリマーを架橋して、凝固を固化する。
【００１２】
内因性経路は、凝固第ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、およびＸＩＩ因子を必要とする。タンパク質のプレカリクレインおよび高分子量キニノーゲン、および血小板から分泌されるカルシウムイオンおよびリン脂質もまた必要である。これらの経路成分それぞれが、第Ｘ因子（不活性）から第Ｘａ因子（活性）への変換に繋がる。内因性経路の開始は、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン、第ＸＩ因子および第ＸＩＩ因子が負に荷電した表面に曝露される際に起こる。これは接触期と呼ばれる。血管表面へのコラーゲンの露出は、接触期の一次刺激である。
【００１３】
接触期成分の集合は、プレカリクレインからカリクレインへの変換を結果として生じ、それは今度は第ＸＩＩ因子を第ＸＩＩａ因子へ活性化する。第ＸＩＩａ因子は次いで、より多くのプレカリクレインをカリクレインへ変換でき、相互活性化カスケードを樹立する。第ＸＩＩａ因子はまた、第ＸＩ因子を第ＸＩａ因子へ活性化し、および強力な血管拡張剤であるブラジキニンの、高分子量キニノーゲンからの放出に繋がる。
【００１４】
Ｃａ２＋の存在下で、第Ｘｉａ因子は第ＩＸ因子を第ＩＸａ因子へ活性化する。第ＩＸ因子はビタミンＫ依存性γ−カルボキシグルタミン酸（ｇｌａ）残基を含む酵素前駆体であり、そのセリンプロテアーゼ活性はこれらのｇｌａ残基へのＣａ２＋結合後に活性化される。カスケードのいくつかのセリンプロテアーゼ（ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、およびＸ）はｇｌａを含む酵素前駆体である。活性第ＩＸａ因子は第Ｘ因子を内部ａｒｇ−ｉｌｅ結合で切断し、その第Ｘａ因子への活性化に繋がる。
【００１５】
第Ｘａ因子の活性化は、テナーゼ複合体（Ｃａ２＋および第ＶＩＩＩａ、第ＩＸａおよび第Ｘ因子）の、活性化血小板の表面上での集合を必要とする。活性化に対する血小板の応答の一つが、表面上のホスファチジルセリンおよびホスファチジルイノシトールの提示である。これらのリン脂質の露出は、テナーゼ複合体の形成を可能にする。この過程における第ＶＩＩＩ因子の役割は、第ＶＩＩＩａ因子の形で、第ＩＸａ因子および第Ｘ因子に対する受容体として作用することである。第ＶＩＩＩａ因子は凝固カスケードにおける補助因子と呼ばれる。第ＶＩＩＩ因子の第ＶＩＩＩａ因子（実際の受容体）への活性化は、微量のトロンビンの存在下で起こる。トロンビンの濃度が上昇するにつれ、第ＶＩＩＩａ因子は最終的にトロンビンによって切断されおよび不活性化される。トロンビンの第ＶＩＩＩ因子に対するこの二重作用は、テナーゼ複合体形成の程度およびそれによって凝固カスケードの程度を制限するように働く。
【００１６】
上記で考察される通り、活性化第Ｘａ因子は内因性および外因性凝固カスケードが集束する位置である。外因性経路は傷害の部位にて、組織因子（第ＩＩＩ因子）の放出に反応して開始される。組織因子は、第ＶＩＩａ因子に触媒される第Ｘ因子の活性化における補助因子である。第ＶＩＩａ因子は、ｇｌａ残基を含むセリンプロテアーゼであり、内因性経路の第ＩＸａ因子と同一の方法で、第Ｘ因子を切断して第Ｘａ因子にする。第ＶＩＩ因子の活性化は、トロンビンまたは第Ｘａ因子の活性化を通じて起こる。第Ｘａ因子が第ＶＩＩ因子を活性化する能力は、内因性経路および外因性経路の間の連結を生じる。二つの経路間の別の連結は、組織因子および第ＶＩＩａ因子が第ＩＸ因子を活性化する能力によって存在する。いくらかの不明瞭が存在する一方、第ＶＩＩａ因子および組織因子の間の複合体の形成は、凝固カスケード全体における主要な段階と考えられているように見える。外因性経路の阻害のための主な機構は、組織因子−−第ＶＩＩａ因子−−Ｃａ２＋−−Ｘａ複合体に存在する。タンパク質、リポタンパク質が随伴する凝固阻害剤であるＬＡＣＩは、この複合体に特異的に結合する。ＬＡＣＩはまた外因性経路阻害剤、ＥＰＩまたは組織因子経路阻害剤、ＴＦＰＩとも呼ばれ、および以前はアンチコンバーチンといった。ＬＡＣＩは３つのタンデムプロテアーゼ阻害剤ドメインから構成される。ドメイン１は第Ｘａ因子に結合し、およびドメイン２は第Ｘａ因子の存在下に限って第ＶＩＩａ因子に結合する。
【００１７】
プロトロンビンのトロンビンへの活性化
外因性経路および内因性経路の両方における共通点は、第Ｘ因子の第Ｘａ因子への活性化である。第Ｘａ因子はプロトロンビン（第ＩＩ因子）をトロンビン（第ＩＩａ因子）へ活性化する。トロンビンは今度は、フィブリノーゲンをフィブリンへ変換する。トロンビンの活性化は、活性化血小板の表面上で起こり、およびプロトロンビナーゼ複合体の形成を必要とする。この複合体は、血小板リン脂質、ホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルセリン、Ｃａ２＋、第Ｖａ因子および第Ｘａ因子、およびプロトロンビンから構成される。第Ｖ因子は、プロトロンビナーゼ複合体の形成における補助因子であり、テナーゼ複合体形成における第ＶＩＩＩ因子の役割と同様である。第ＶＩＩＩ因子活性化のように、第Ｖ因子は微量のトロンビンによって活性化されて第Ｖａ因子となり、およびトロンビンのレベル上昇によって不活性化される。第Ｖａ因子は、活性化血小板上の特異的受容体と結合し、およびプロトロンビンおよび第Ｘａ因子と複合体を形成する。
【００１８】
プロトロンビンは、Ｎ末端領域に１０個のｇｌａ残基を含む、７２，０００ダルトンの一本鎖タンパク質である。プロトロンビナーゼ複合体内で、プロトロンビンは第Ｘａ因子によって２ヶ所で切断される。この切断は、一つのジスルフィド結合によって結び合わされているＡ鎖およびＢ鎖を含む、２鎖の活性トロンビン分子を生じる。
【００１９】
フィブリン血餅形成の活性化における役割に加えて、トロンビンは凝固において重要な調節機能を果たす。トロンビンは内皮細胞表面に存在するトロンボモジュリンと結合して、Ｃタンパク質をＣａタンパク質へ変換する複合体を形成する。補助因子Ｓタンパク質およびＣａタンパク質は、第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子を分解し、それによって凝固カスケードにおけるこれら二つの因子の活性を制限する。
【００２０】
トロンビンはまた、Ｇタンパク質結合プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）、具体的にはＰＡＲ−１、−３および−４に結合しおよびその放出に繋がる。これらのタンパク質の放出は、多数のシグナル伝達カスケードの活性化に繋がり、カスケードは今度はインターロイキンＩＬ、ＩＬ−１およびＩＬ−６の放出を増大させ、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）および血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）の分泌を増大させる。トロンビンに誘導されるシグナル伝達はまた、血小板活性化および白血球接着の増大に繋がる。トロンビンはまた、トロンビン活性化線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）を活性化し、それによって線溶（フィブリン血餅の分解）を調節する。ＴＡＦＩはまた、カルボキシペプチダーゼＵ（ＣＰＵ）としても知られ、その活性は、部分分解されたフィブリンからのＣ末端リジンの除去に繋がる。これは、プラスミノーゲン活性化の障害に繋がり、それによってフィブリン血餅溶解（すなわち線溶）の速度を低下させる。
【００２１】
トロンビンレベルの調節
活性トロンビンの循環レベルを身体が調節できないことは、深刻な結果に繋がりうる。トロンビン活性が調節される二つの主な機構が存在する。循環中のトロンビンの主な形は、不活性プロトロンビンであり、その活性化は、凝固カスケードについて上述の、酵素前駆体活性化の経路を必要とする。カスケード中の各段階にて、フィードバック機構が活性酵素および不活性酵素の間のバランスを調節する。
【００２２】
トロンビンの活性化はまた、四種類の特異的トロンビン阻害剤によっても調節される。アンチトロンビンＩＩＩは、第ＩＸａ、第Ｘａ、第ＸＩａおよび第ＸＩＩａ因子の活性も阻害できるため、最も重要である。アンチトロンビンＩＩＩの活性は、ヘパリンの存在下で下記の手段によって増強されうる：ヘパリンはアンチトロンビンＩＩＩ上の特異的部位に結合し、当該タンパク質の立体構造変化を生じ、および新しい立体構造はトロンビンおよびその他の基質に対してより高い親和性を有する。ヘパリンのこの作用は、抗凝固剤としてのその臨床用途の原理である。アンチトロンビンＩＩＩの天然に存在するヘパリン活性化因子は、血管内皮細胞の表面上に、ヘパリンおよびヘパリン硫酸として存在する。内因性凝固カスケードの活性化を調節するのがこの性質である。
【００２３】
しかし、トロンビン活性はまた、α２−マクログロブリン、ヘパリン補助因子ＩＩおよびα１−アンチトリプシンによっても阻害される。トロンビン調節における役割は小さいが、α１−アンチトリプシンはヒト血清の主なセリンプロテアーゼ阻害剤である。その生理学的意義は、このタンパク質の欠如が肺気腫の発症において原因的役割を果たすという事実によって実証される。
【００２４】
フィブリノーゲンのフィブリンへの活性化
フィブリノーゲン（第Ｉ因子）は、３対のポリペプチド（[Ａ−α］[Ｂ−β］[γ］）2から成る。６つの鎖はＮ末端付近でジスルフィド結合によって共有結合している。Ａ−αおよびＢ−β鎖のＡおよびＢ部分は、それぞれフィブリノペプチドＡおよびＢを構成する。フィブリノーゲンのフィブリノペプチド領域は、いくつかのグルタミン酸およびアスパラギン酸残基を含み、この領域に高い陰電荷を与えおよび血漿中のフィブリノーゲンの溶解性に補助を与える。活性トロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリノペプチドと当該タンパク質のａおよびｂ部分との間の四つのａｒｇ−ｇｌｙ結合で加水分解するセリンプロテアーゼである。
【００２５】
フィブリノペプチドの、トロンビンに媒介される放出は、サブユニット構造（α−β−γ）2．を有するフィブリンモノマーを生じる。これらのモノマーは規則的配列へ自発的に凝集し、いくらか弱いフィブリン血餅を形成する。フィブリン活性化に加えて、トロンビンは第ＸＩＩＩ因子を、フィブリンモノマー中のグルタミンのアミド窒素とリジンのｅ−アミノ基との間の共有結合から成る架橋を導入する高度に特異的なトランスグルタミナーゼである第ＸＩＩＩａ因子へ変換する。
【００２６】
フィブリン血餅の溶解
フィブリン血餅の分解はプラスミンの機能であり、プラスミンは不活性酵素前駆体であるプラスミノーゲンとして循環するセリンプロテアーゼである。遊離の循環プラスミンがあれば、α２−アンチプラスミンによって迅速に阻害される。プラスミノーゲンはフィブリノーゲンおよびフィブリンの両方と結合し、それによって、凝固が形成される際に凝固に組み込まれる。組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）および、より小さい程度で、ウロキナーゼは、プラスミノーゲンをプラスミンへ変換するセリンプロテアーゼである。不活性ｔＰＡは傷害後に血管内皮細胞から放出され、フィブリンと結合しおよび結果として活性化される。ウロキナーゼは、排出管を裏打ちする上皮細胞によって、前駆体であるプロウロキナーゼとして産生される。ウロキナーゼの役割は、これらの管内に沈着しうるフィブリン血餅の溶解を活性化することである。
【００２７】
活性ｔＰＡはプラスミノーゲンを切断してプラスミンにし、プラスミンは次いでフィブリンを消化し、結果はプラスミンもプラスミノーゲンも結合できない可溶性分解産物である。プラスミノーゲンおよびプラスミンの放出後、それらはそれぞれの阻害剤によって迅速に不活性化される。ｔＰＡ活性の阻害は、特異的阻害タンパク質への結合の結果として生じる。少なくとも四種類の異なる阻害剤が同定されており、そのうち２−プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１型（ＰＡＩ−１）および２型（ＰＡＩ−２）は生理的意義が非常に大きい。
【００２８】
このように、上記から凝固に関与する生理的機構は非常に複雑であることが判り、および、凝固における多数の相互に関係する経路を安全に調節できる物質を設計または同定するには大きな困難があることがわかる。血液凝固系の多層カスケードは、その開始シグナルの非常に大きな増幅を可能にする。外因性経路を下ると、たとえば、プロコンバーチン（ＶＩＩ）、スチュアート因子（Ｘ）、プロトロンビン、およびフィブリノーゲンはそれぞれ血漿中に＜１、８、１５０、および~４０００ｍｇ．ｍＬ−1の濃度で存在する。このように、小さなシグナルが非常に速やかに増幅され、効果的な止血調節を実現する。
【００２９】
一つの不適切な凝固さえ致命的な結果を生じうるため、凝固は非常に厳密に調節されなければならない。実際に、血液凝固は、ヒトの死の二つの主因である脳卒中および心臓発作の主要な原因である。このように、凝固の調節は主要な医学的関心である。抗凝固作用の異なる機構を用いていくつかの阻害剤が開発されている。これらは、ヘパリン、クマリン、および１，３−インダンジオンを含む。
【００３０】
ヘパリンは６，０００ないし４０，０００Ｄａの範囲の分子量を有するムコ多糖である。大部分の市販のヘパリン調製物の平均分子量は１２，０００〜１５，０００の範囲にある。そのポリマー鎖は相互グリコシド結合によって結合したＤ−グルコサミンおよびウロン酸の反復二糖単位から成る。ウロン酸残基はＤ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸のどちらかでありうる。これらの各単糖残基上の少数の水酸基が、硫酸化される可能性があり、高度に負に荷電したポリマーを生じる。各糖残基の平均負電荷は約２．３である。
【００３１】
ヘパリンの重要な構造単位は、独特の五糖配列である。この配列は、三個のＤ−グルコサミンおよび二個のウロン酸残基から成る。中央のＤ−グルコサミン残基は、この配列の他では稀である、独特な３−Ｏ−硫酸部分を含む。
【００３２】
ヘパリンは、アンチトロンビンと後進和製複合体を形成する。アンチトロンビン−ヘパリン複合体の形成は、二つの主な凝血促進プロテアーゼである第Ｘａ因子およびトロンビンの阻害率を大幅に高める。これら両方の酵素のアンチトロンビン単独による阻害の通常は低い速度（〜１０3−１０4Ｍ−１ｓ−１）は、ヘパリンによって約１，０００倍上昇する。プロテアーゼの両方の活性形の活性化における加速は、凝固形成に決定的である、以降のフィブリノーゲンのフィブリンへの変換を妨げる。
【００３３】
ヘパリンは相対的に無毒性であるが、しかしヘパリンの過剰投与または過敏性は、過剰な出血を結果として生じうる。プロタミンは、過剰出血合併症の解毒剤として使用される。
【００３４】
クマリンおよびその誘導体は、主な経口抗凝固剤である。ワーファリンは、ＲおよびＳ異性体のラセミ混合物として市販されているクマリン誘導体である。
【００３５】
クマリンは作用が遅く、ｉｎ ｖｉｖｏ で１２ から４時間の潜伏期後に初めて作用を発揮し、およびその作用は１．５から５日間続く。観察された遅い開始は、投薬前プロトロンビン血中レベルを低下させるのに必要な時間が原因である可能性があり、一方でワーファリンについて観察された作用の長い持続時間は、肝臓がプロトロンビンを投薬前血中レベルへ再合成するのに必要な遅延時間が原因である可能性がある。
【００３６】
クマリンおよび１，３−インダンジオン（下記参照）は、ある種の薬物と相互作用するというさらなる短所を有する。たとえば、経口抗凝固剤の作用は、フェニルブタゾンおよびサリチル酸といった薬物によって促進されうる一方バルビツール酸およびビタミンＫによって拮抗されうる。クマリンは、プロトロンビンの生合成においてビタミンＫの競合阻害剤である。
【００３７】
凝固カスケードは、非常に重要な段階におけるプロトロンビンのトロンビンへの変換に依存する。しかし、この変換は、プロトロンビンのＮ末端の１０個のｇ−カルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）残基の存在に依存する。複数のＧｌａ残基はＣａ2+のための結合部位を形成する。通常の環境下では、プロトロンビンの１０個のグルタミン酸（Ｇｌｕ）残基は、翻訳後修飾によってＧｌａ残基へ変換される。
【００３８】
この翻訳後修飾は、酵素ビタミンＫレダクターゼおよびビタミンＫエポキシドレダクターゼによって触媒される。ビタミンＫはこの変換反応における補助因子である。このように、ビタミンＫは還元形およびエポキシド形の間を循環する。ビタミンＫとの構造的類似性のため、クマリンは酵素ビタミンＫレダクターゼおよびビタミンＫエポキシドレダクターゼと、プロトロンビンのＧｌｕ残基のＧｌａへの変換を促進することなく結合すると考えられる。このように、プロトロンビンは第Ｘａ因子によって作用を受けることができない。
【００３９】
１，３−インダンジオンは、１９４０年代から抗凝固剤であることが本分野で知られている。アニシンジオンの作用の開始および持続時間は、クマリンのものと同様である。インダンジオンの主な短所は、その副作用である。一部の患者はインダンジオンに過敏性であり、および発疹、発熱、および白血球減少症を発症する。
【００４０】
達成された全体的利益にもかかわらず、現在使用されている治療用抗凝固剤はまた、効力の限界によっておよびさらに多くは出血合併症によって引き起こされる死亡および罹患の大きな原因でもある。これらの問題を克服するための努力において、いくつかの新規の薬剤が開発されている。しかし、治療用抗凝固剤は不可避的に、効力の増大は出血合併症の増加によってのみ達成されるという内在的な問題を伴うように見える。抗凝固剤の凝固へのターゲッティングは、この致命的な繋がりを断つ手段に相当しうる。凝固特異的エピトープに向けられた抗体との抗凝固剤の融合は、凝固での抗凝固剤の濃縮を可能にし、一方で循環血中の抗凝固剤の濃度は低レベルに維持されうる。
【００４１】
凝固 ターゲッティングの成功は、ターゲットとして選択されたエピトープの量および 特異性に依存する。フィブリンが凝固 ターゲッティングに使用されうることは以前に示されている。しかし フィブリン または フィブリン 分解産物は血液中に循環する可能性があり、循環中の抗凝固剤の間違ったターゲッティングに繋がりうる。
【００４２】
本分野の別の問題は、凝固障害の診断に関連する。多数の凝固障害は、防がれうるかまたは少なくともより重度の問題へ進行することが防がれうることが定説である。したがって、早期の凝固障害の指標があることが臨床医にとって望ましい。
【００４３】
本発明の一態様は、有効であり、なお凝固時間の延長を結果として生じない抗凝固剤を提供することによって先行技術の問題を克服または緩和することである。本発明はさらに、凝固関連障害を診断するための方法および試薬を提供する。
【００４４】
文書、作用、材料、用具、物品などは、本発明の背景を提供する目的でのみ本明細書に含まれる。本出願の各請求項の優先日以前に存在したためにこれらの事物のいずれかまたはすべてが先行技術の基礎の一部を成したかまたは本発明に関連する分野の共通一般知識であったことは示唆または意味されない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４５】
一態様では、本発明は、対象への抗凝固剤の投与の際に第二の成分が第一の成分を活性化血小板へ向かわせる、凝固を阻害する能力のある第一の成分、および活性化血小板をターゲッティングする能力のある第二の成分を含む抗凝固剤を提供する。出願者らは、抗凝固剤の活性化血小板へのターゲッティングは、過剰な出血の危険無しに、凝固を阻害する手段を提供することを実証している。本発明の一形態では、第二の成分は、凝固上で大量におよび特異的に発現される凝固特異的ターゲットに相当する活性化フィブリノーゲン／フィブリン結合ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ上のリガンド誘導性結合部位（ＬＩＢＳ）に対してターゲッティングされる。凝固ターゲッティングのために、抗ＬＩＢＳ一本鎖抗体（ｓｃＦｖanti-LIBS）が作成された。第一の成分として、非常に強力な直接的な第Ｘａ因子（ｆＸａ）阻害剤であるダニ抗凝固ペプチド（ＴＡＰ）が用いられた。融合分子ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰの特異的抗体結合はフローサイトメトリーで証明され、および抗ｆＸａ活性は発色検定で実証された。Ｉｎ ｖｉｖｏ抗凝固効率は、マウスでの頸動脈の塩化第二鉄誘導性血栓症モデルにおいてドップラーフロー測定によって閉塞時間（ＯＴ）として測定された。ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰはＯＴをエノキサパリンと同等に延長し、および、組み換えＴＡＰおよび標的でない変異ｓｃＦｖ−ＴＡＰの等モル用量は、後者が調節する低用量でさえ、抗血栓作用を示さなかった。試験したその他の抗凝固剤とは対照的に、尾切断によって測定された出血時間は、ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰによって延長されなかった。
【００４６】
本発明はまた、凝固障害を治療または予防するための医薬組成物および方法を提供し、前記方法は必要とする哺乳類に有効量のここに記載の組成物を投与する段階を含む。抗凝固剤として有用な化合物をスクリーニングするための診断方法、および血栓症、血栓性塞栓、不安定プラークなどの存在を、活性化血小板を指向するプローブを用いて同定するための方法もまた含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
第一の態様では、 本発明は、対象への抗凝固剤の投与の際に第二の成分が第一の成分を活性化血小板へ向かわせる、凝固を阻害する能力のある第一の成分、および活性化血小板をターゲッティングする能力のある第二の成分を含む抗凝固剤を提供する。出願者らは、抗凝固剤を活性化血小板へターゲッティングすることによって、抗凝固効力の増大と出血合併症との間の連結が断たれ、それによって本分野における重大な問題を克服することを見出している。出願者らは、活性化された血小板は効率的な凝固ターゲッティングのための有効な標的として使用されうることを見出している。心筋梗塞におけるアテローム性動脈硬化に誘導される血栓でのように、血小板は動脈系内の血栓に特に豊富である。活性化血小板は凝固に高度に特異的であり、および典型的には循環中に見出されない。このように、効率的な凝固ターゲッティング、豊富さおよび特異性についての両方の必要条件が満たされる。これらの好ましい性質の他に、凝固ターゲッティングのためのエピトープとしての活性化血小板の使用は、血小板活性化はフィブリン形成に先行しうるため、フィブリンと比較してさらに有利でありうる。
【００４８】
抗凝固剤は、二つの成分が上記の必要な機能を実行する能力を有する限り、任意の形を取りうる。
【００４９】
抗凝固成分は、本剤が凝固の部位に有効に局在化できる限り、任意のサイズでありうる。しかし、抗凝固成分は好ましくは低分子であり、なぜならこれは血栓接近可能性および透過を改善しうるためである。本発明の一つの好ましい形では、第一の成分は約７，０００Ｄａ以下の分子量を有する。先行技術はいくつかの低分子抗凝固剤を開示する一方、抗凝固剤は中心的なおよび重要な凝固因子を強力に阻害することが好ましい。本発明の一形態では、第一の成分は、宿主からの吸血を円滑にする抗第Ｘａ因子阻害剤を用いるヒメダニ（オルニソドロス・モウバタ（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ ｍｏｕｂａｔａ））に由来するペプチド抗凝固剤である。この抗凝固剤は、１９９０年（ワクスマン（Ｗａｘｍａｎ）他 Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０； ２４８： ２４７３）に最初に記載され、およびＴＡＰ（ダニ抗凝固ペプチド）と命名された。組み換えＴＡＰは、凝固カスケードにおける第Ｘａ因子の中心的な上流のおよび速度決定位置のために、効果的な抗凝固を可能にする選択的第Ｘａ因子阻害剤として記載されている（ネーパー（Ｎｅｅｐｅｒ）他．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９０； ２６５： １７７４６）。 ＴＡＰは自然界で発見された最も強力な抗凝固剤の一つであり、およびアミノ酸６０個だけの低分子である。適当なＴＡＰの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースから登録番号Ｍ６０４８０として入手可能である。
【００５０】
第一の成分は、外因性または内因性凝固経路のどちらかの任意の成分に作用しうる。本発明の好ましい一形態では、第一の成分は酵素第Ｘａ因子に作用する。第Ｘａ因子の直接阻害は、たとえばヘパリンに媒介される間接的なアンチトロンビン−ＩＩＩ媒介阻害と比較して有利であることが提案されており、何故なら凝固に結合した第Ｘａ因子およびプロトロンビナーゼ随伴第Ｘａ因子は、直接的な第Ｘａ因子阻害剤によって顕著によりよく阻害されるように見えるからである。抗血栓効力および再閉塞の予防を調べる比較試験において、ＴＡＰは、間接的第Ｘａ因子阻害剤よりも、およびトロンビン阻害剤よりも有利であることが示されている。これらの長所にかかわらず、ヒトでの治療用途についてはヒルジンと同様に高い出血速度が予測され、およびヒト薬剤の開発は先行していない。理論によって限定されることは望まず、発生中の凝固へのＴＡＰのターゲッティングは、全身の抗凝固剤を、およびそれによって出血合併症を低減でき、および凝固における抗第Ｘａ因子活性の安定な固定による長期間続く抗凝固作用が達成可能でありうる。このように、ＴＡＰは低分子であり、補助因子の必要無しの直接阻害を実証し、および凝固経路の初期の中心をターゲッティングすることがターゲッティングの好ましい候補である。
【００５１】
ＴＡＰが本発明の一実施形態で用いられる一方、ヒルジンのような凝固因子の他の阻害剤を含む、多数の他の抗凝固剤が適当となる。また、線溶剤のターゲッティングは、出血合併症がより少ない高度に効率的な血栓溶解の見込みがある。
【００５２】
ここでは、「凝固を阻害する」の語は、完全な阻害だけでなく、凝固形成の部分的な阻害も意味することが意図される。理論によって限定されることを望まず、完全阻害は調節されない出血に繋がりうるために部分的阻害が好ましいと考えられる。
【００５３】
第二の成分の機能は、第一の成分を活性化血小板の物理的近傍へ運ぶことである。これは、活性化血小板に結合するかまたは活性化血小板に随伴する分子に結合する能力を有する第二の成分によって達成されうる。典型的には、これは、活性化血小板上のマーカーと結合できる第二の成分によって達成される。可能な最高の特異性を本剤に与えるために、マーカーは活性化血小板の表面上だけで発現されるものであるべきである。しかしそのような絶対的要件は厳密には必要でなく、および第二の成分が活性化血小板を主にターゲッティングする能力がある限り、本発明はここに開示される長所を提供すると理解される。
【００５４】
活性化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを含め、活性化血小板上に主に存在するいくつかのマーカーがある。マーカーは、凝固系の他の成分と比較して、一方の形が活性化血小板上で優勢であることが見出されるような、不活性形および活性形を取るものでありうる。血小板表面上で最も豊富に発現される分子のうちの一つが、糖タンパク質受容体（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＣＤ４１／ＣＤ６１）である。この受容体はインテグリン接着分子ファミリーに属し、およびαIIbβ3ともいう。インテグリンは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａリガンドであるフィブリノーゲンの結合に関して低親和性から高親和性受容体へ立体構造変化を受ける、二個の非共有的に結合したサブユニットから成る。リガンド結合ポケットの露出の他に、この立体構造変化はまた、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ上のいわゆるリガンド誘導性結合部位（ＬＩＢＳ）の露出を誘導する。これらの結合部位は、活性化および／またはリガンド結合ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に特異的である。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａは非常に豊富であり、各血小板の表面上に約６００００個から８００００個の分子がある。
【００５５】
この受容体は、血小板活性化に際して不活性状態から活性状態へ変化し、その機構は新しいエピトープが露出されるような受容体の立体構造変化である。このように、本発明の一形態では、第二の成分は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体の活性化に際して形成される新しいエピトープと結合する能力がある。
【００５６】
当業者は、第一の成分および第二の成分が物理的に結合していることは厳密には必要でないことを理解する。たとえば第一の成分および第二の成分は、物理的分離していて、第一の成分が第二の成分との結合の手段を含んでいることが可能である。この案では、第一の成分を最初に対象へ投与でき、および新しい凝固へ移動して活性化血小板へ結合しうる。第二の成分はその後に投与でき、および第一の成分へ結合しうる。このように、二つの成分は、活性化血小板の部位で機能性抗凝固剤が完成するまで物理的に分離している。
【００５７】
本発明の好ましい一形態では、抗凝固剤は単一分子、および典型的には単一タンパク質分子の形である。二つの成分を単一分子中で実現するための便利な手段は、一本鎖抗体分子の骨格に両方の成分を含めることによる。これらの分子は、可変領域を含めるならば、エピトープを特異的にターゲッティングするのに特に適している。可変領域は、標的エピトープへの親和性を有するように設計される。一本鎖抗体は、組み換え治療剤の設計に有望な形式である。一本鎖抗体は、単一ペプチド鎖上の短いリンカー分子を介して互いに融合された抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のみから成る。このように、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、完全な抗体結合部位を含む最小の断片を構成する。サイズは免疫原性の決定因子であるため、ｓｃＦｖはもし免疫原性であるとしても最小限であると予測される。
【００５８】
一本鎖抗体の別の長所は、 第一および第二の 成分の結合が、成分の生物学的機能の損失がほとんど無いことに繋がる点である。しかし化学結合は 典型的には抗体 結合機能の、および結合されたエフェクター分子の活性の相当な損失を結果として生じることが認識されるが、 ｓｃＦｖ は分子生物学的方法を用いて機能的損失無しに結合されうる。最後に、 ｓｃＦｖは細菌において大量に、短時間で、低コストで産生でき、および それらはアフィニティクロマトグラフィーによって高度に精製されうる。一本鎖 抗体を産生するための手段は当業者によく知られており、その主題についての総説は『組み換え抗体』（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（ブライトリング（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ）およびデューベル（Ｄｕｅｂｅｌ），１９９９，出版社：ワイリー・アンド・サンズ社（Ｗｉｌｅｙ ＆ ｓｏｎｓ），ＩＳＢＮ ０４７１１７８４７０）に見ることができ、その内容は参照により本開示に含まれる。
【００５９】
好ましくは、抗ＬＩＢＳ一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のクローニングはＩｇＧ抗ＬＩＢＳ１４５を発現するハイブリドーマ細胞株に基づく。ＬＩＢＳ（リガンド誘導性結合部位）エピトープに対する抗体が、ターゲッティングｏｆ抗凝固剤の凝固へのターゲッティング用に選択された。以前に示された通り、ｍＡｂ抗ＬＩＢＳ１４５（ＩｇＧanti-LIBS）はＲＧＤ−ペプチド、アブシキマブ、チロフィバンおよびエプチフィバチドとの血小板のインキュベート後のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへのリガンド誘導性結合を示す（シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）他．ＪＰＥＴ ２００４，３０８： １００２）。さらに、ＩｇＧanti-LIBSは、ＡＤＰ活性化血小板への強い結合をフィブリノーゲンの存在下で示す（図２）。このように、この抗体は、非常に豊富でおよび特異的なターゲッティング性質を提供する。
【００６０】
ｍＡｂ抗ＬＩＢＳ１４５を発現するハイブリドーマ細胞株が、抗ＬＩＢＳ一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のクローニングのための基礎として使用された。このハイブリドーマ細胞株のｍＲＮＡが調製され、およびオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写された。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域が、可変領域の５'および３'末端の保存領域とアニーリングするプライマーを用いたＰＣＲによって増幅された（詳細については本文書に別に記載する方法を参照）。ＰＣＲ産物は、細菌において高レベル発現を可能にするｐＨＯＧ２１発現ベクターへクローニングされた。ＴＧ１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換後、各クローンはＬＩＢＳに典型的なＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合について評価された。元のＩｇＧ抗ＬＩＢＳ１４５ｍＡｂとフローサイトメトリーで比較してより強い結合を示した一つのクローン（図２）が以降の使用のために選択された。このクローンは配列決定され、およびそれは一本鎖抗体のすべての典型的な性質を示した（図１）。さらに、ウェスタンブロット分析は、正確なサイズの約３２ｋＤａを明らかにした（図３）。
【００６１】
好ましくは、一本鎖抗体はｓｃＦｖ融合タンパク質として発現される。ＴＡＰは機能的な損失無しに融合されうることを示す以前の結果に基づき（ＴＨ）、この非常に強力な直接的な第Ｘａ因子阻害剤が、そのクローニングされた一本鎖抗体と結合させるために選択された。ＴＡＰは公表された配列情報（Ｇｅｎｂａｎｋデータベース登録番号Ｍ６０４８０として）にしたがって最初に合成され、およびｐＨＯＧ２１発現ベクターへ、軽鎖の可変領域のＣ末端に直接クローニングされた（図１Ａ、Ｂ参照）。ｐＨＯＧ２１は、封入体によって精製を円滑にするｐｅｌＢリーダー配列、およびＮｉ2+精製および検出のためのＨｉｓ（６）タグを含む（図１Ａ、Ｂ）。精製ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰの収量は細菌培養１Ｌから約０．４〜０．８ｍｇであった。発現および精製後、一本鎖抗体構造のサイズがウェスタンブロット分析によって評価された（図３）。ｓｃＦｖanti-LIBS単独の分子量は~３２ｋＤａであり、未変化の融合タンパク質ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰの分子量は~３９ｋＤａであり、および非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰの分子量は~４２ｋＤａであった（図３）。
【００６２】
本発明の非常に好ましい一つの形では、一本鎖抗体は本質的に図１に示す通りである。当業者は、遺伝コードの縮重、およびアミノ酸を他の類似のアミノ酸と置換する能力は図１によって特定される分子の誘導体および同等物が容易に作製されうることを意味することを理解する。これらの誘導体および同等物は、本発明の出願の範囲に含まれる。
【００６３】
別の一態様では、本発明は、ここに記載の抗凝固剤を含む医薬組成物を提供する。当業者は、通常の方法によってここに記載の抗凝固剤を与えるのに適した組成物を作製できるようになる。抗凝固剤がタンパク質である場合、組成物は単にＮａＣｌを等張濃度で含みうる。キャリヤータンパク質、安定剤、緩衝剤、非水系溶媒、塩類、保存料などを加えることが必要でありうる。
【００６４】
別の一態様では、本発明は、ここに記載の組成物の有効量を必要とする哺乳類に投与する段階を含む、凝固障害を治療または予防する方法を提供する。典型的には、組成物は経静脈または動脈内注射または輸液によって全身的に投与される。用量に関して、抗凝固剤がタンパク質である場合、用量は約３０ｍｇ／ｋｇないし約３００ｍｇ／ｋｇである。任意の所与の対象、または任意の所与の凝固障害について目的の臨床効果を達成するために用量を漸増または漸減することは十分に臨床医の能力内である。
【００６５】
凝固障害は、凝固の阻害を必要とする任意の障害でありうる。そのような障害は、冠動脈疾患、心筋梗塞を含む急性冠動脈症候群、脳卒中、頸動脈または大動脈のアテローム性動脈硬化、深部静脈血栓症、肺塞栓症、および臓器のアテローム性動脈硬化または血栓症といった、血栓症を伴うすべての臨床状況を含む。
【００６６】
好ましい二機能性融合分子ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰは出願者によって評価されている。融合分子ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰの一本鎖抗体部分の機能は、フローサイトメトリーによって評価された。ＳｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰおよびｓｃＦｖanti-LIBSは、フィブリノーゲン結合した活性化血小板と同様の結合特性を示した（図２）。このように、遺伝子融合はその一本鎖抗体の結合特性を顕著に変化させなかった。当該融合構造の第Ｘａ因子阻害活性は、発色検定によって評価された。第Ｘａ因子は、ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰ、非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰ、ｓｃＦｖanti-LIBSおよび組み換えＴＡＰの存在下で特異的発色基質とインキュベートされた（図４）。ｒＴＡＰと比較して、ＴＡＰ活性は融合構造においてわずかに低下したが、しかし明らかに存在した（図４）。このように、抗体結合および第Ｘａ因子阻害の両方の機能が保持された。
【００６７】
活性化血小板上のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのＬＩＢＳエピトープへの抗凝固剤のターゲッティングの、抗凝固剤の従来の非ターゲッティング使用と比較した有意性を示すために、よく確立されたマウス血栓症モデルが選択された（ファレイ（Ｆａｒｒｅｈｉ）他．１９９８； ９７：１００２）。しかし、抗ＬＩＢＳ抗体はフィブリノーゲンと結合した活性化マウス血小板へのターゲッティングに使用されうることが最初に示された。出願者らはマウス血液を入手し、および元のＩｇＧanti-LIBS、ｓｃＦｖanti-LIBS、および融合構造ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰの、マウス血小板への結合をフローサイトメトリー．によって評価した。ヒト血小板での結果と同様に、ＩｇＧanti-LIBSの特異的結合が見られたが、しかしｓｃＦｖanti-LIBS抗体単独についてより強い特異的結合が見られ、およびその融合タンパク質ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰの、フィブリノーゲン結合した活性化マウス血小板との結合が見られた（図５）。このようにマウス血小板のターゲッティングが、作製された抗ＬＩＢＳ 融合 構造を用いてうまくいくことが示された。
【００６８】
血栓がマウスの頸動脈において塩化第二鉄を用いて誘導された。ナノフロープローブによって測定された血流の停止が、血管内の閉塞性血栓の指標として用いられた。塩化ナトリウム溶液および一本鎖抗体抗ＬＩＢＳが陰性対照として用いられ、およびエノキサパリンが現行の臨床標準に相当する陽性対照として用いられた。エノキサパリンは閉塞時間をほぼ倍増させた（図８）。等モル量の組み換えＴＡＰ、非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰおよびｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰは、エノキサパリンの作用に近い、閉塞時間の顕著な延長を引き起こした。元の投与された用量の１／１０への減量（０．０３μｇ／ｇ体重）は、ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰについて閉塞時間の有意な延長をまだ生じた（ｐ＝０．００２）一方で、同一用量で非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰは閉塞時間の有意な延長を生じなかった。このように、ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰは、直接対照の非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰが有意な抗凝固を生じない用量でさえ、強い抗凝固作用を与える。
【００６９】
活性化血小板をターゲッティングする抗凝固剤の主な長所は、出血合併症の低減である。出血時間は、マウスにおける標準化された外科的尾切断によって測定された。予想通り、生理食塩水およびｓｃＦｖanti-LIBSは出血時間延長を生じなかったが、一方でエノキサパリン、および特に組み換えＴＡＰは相当な延長を生じた。非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰおよびｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰの両方が強い抗凝固作用を示す用量０．３μｇ／ｇ体重にて（図６）、非標的ｍｕｔｓｃＦｖ−ＴＡＰだけが出血時間において高度に有意な延長を生じた（ｐ＜０．００１、図７）。凝固にターゲッティングされたｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰは出血時間の延長を全く生じなかった。また、より低用量のｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰは、マウスの頸動脈で明らかな抗凝固作用をまだ示したが、出血時間延長を示さなかった。このように、抗ＬＩＢＳ一本鎖抗体へのＴＡＰの新しく作製された融合によって、出血時間の延長無しに、非常に効果的な抗凝固作用が達成できた。
【００７０】
出血時間の延長の回避は本発明の長所である一方、ここに記載の抗凝固剤は一部の実施形態では出血時間を延長しうることが理解される。
【００７１】
別の一態様では、本発明は、ここに記載の抗凝固剤の、凝固障害の予防または治療のための薬剤の調製における使用を提供する。
【００７２】
別の一態様では、本発明は、候補化合物を提供、化合物を活性化血小板および凝固の少なくとも一つの他の成分に曝露、化合物が活性化血小板と結合するかどうか評価、および化合物が凝固の少なくとも一つの他の成分と結合するかどうか評価する段階を含み、少なくとも凝固の他の成分と比較して活性化血小板に対してより高い親和性結合の能力を有するならばその化合物は有用である、抗凝固剤を凝固へターゲッティングするのに有用な化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
【００７３】
このように、活性化血小板は抗凝固治療のための有利な標的であるという出願者の知見に基づき本発明に関連する第二の成分として有用である化合物を同定することが可能になる。当業者は、免疫吸着法、クロマトグラフィー法、表面プラズモン共鳴法などを含む、ある分子の別の分子との結合を測定するのに有用ないくつかの方法に詳しくなる。
【００７４】
別の一態様では、本発明はここに記載のスクリーニング法によって同定される化合物を提供する。
【００７５】
本発明の別の一態様は、対象の血管における活性化血小板の検出を含む、対象における凝固障害の診断または予測の方法を提供する。
【００７６】
出願者の知る限り、先行技術は活性化血小板の診断または予測のための使用を開示しない。活性化血小板の検出は、いくつかの医療用途に有用な関連するマーカーを臨床医に提供する。一つの用途は、破裂冠動脈プラークまたは破裂する傾向にあるプラークに見出される活性化血小板を画像化することである。これは、可能性のある関連病変へのステントの予防的埋め込み後の心筋梗塞症候群といったものの早期非侵襲的診断を可能にする。これは、冠動脈血管造影（先行技術で記載される通り）は血管腔についての情報を提供するだけであり、血管壁自体の形態についての情報を与えないため、特に医療上興味深い。このように、おそらく破裂したかまたは破裂傾向にあるプラークは冠動脈血管造影では検出されない。
【００７７】
診断マーカーとしての活性化血書板の有用性を考慮して、本発明はまた、（ａ）活性化血小板をターゲッティングする能力がある結合成分および（ｂ）標識を含む、血管異常を検出するためのプローブを提供する。当業者は、本発明に関連して有用であるプローブは、典型的には水系組成物として提供され、および診断法の前または途中に、動脈または静脈に注射されることを理解する。プローブは次いで身体の目的部位へ血液によって輸送され、および活性化血小板があれば結合する。結合したプローブは次いでＭＲＩといった適当な手段によって検出される。
【００７８】
結合成分は、活性化血小板の表面上のマーカーと結合する能力を有しうる。適当なマーカーの非限定的な一例は、活性化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体分子である。ＰＡＣ−１およびＣＤ６２−Ｐといった他のマーカーもまた考慮される。本発明の一つの形では、結合成分および標識は、一本鎖抗体分子の骨格中にある。
【００７９】
ここに記載のプローブおよび当該プローブを用いる方法は、活性化血小板の、たとえば肺塞栓症または末梢塞栓症、または末梢動脈または中心動脈における破裂アテローム硬化性プラークでの、何らかの蓄積を検出するのに使用されうる。これらの病変は、疾患過程の早期に検出および選択的に治療されうる。
【００８０】
当業者は、ここに記載のプローブ および 方法 が、凝固障害の臨床的に認識可能な徴候または症状を必ずしも実証することなく、 凝固 障害の素因を有する個人を特定するのに有用でありうることを理解する。
【００８１】
本方法の好ましい一つの形では、活性化血小板を検出する段階に用いられるプローブは、ここに記載の一本鎖抗体である。好ましくは、一本鎖抗体はここに記載の抗ＬＩＢＳ抗体と同一かまたは類似である。診断目的には、一本鎖抗体は抗凝固成分を含む必要が無いことが理解される。実際、当業者は、断片が活性化血小板への結合を担う部位を含む限り、一本鎖抗体の断片を使用することが可能であることを理解する。理論によって限定されることを望まず、一本鎖抗体の小型のサイズは、この用途において特に有利であると考えられる。抗体は、血栓の表面を越えて、より多数の活性化血小板が存在する部位へ透過する能力があることが提案されている。これは、結合した抗体のより効果的な検出、およびしたがってより高感度の造影を可能にする。抗体プローブはまた、活性化血小板が沈着している血管の表面へも接着しうる。
【００８２】
本方法は、血栓（たとえば深部静脈血栓症）、血栓性塞栓（たとえば肺塞栓症）および活性化血小板の沈着（たとえば不安定アテローム硬化性プラークの部位での）を診断および同定するために使用されうる。早期検出は、凝固溶解剤および／または抗凝固療法の投与および／または介入手順を可能にし非常に有利である。
【００８３】
当業者は、診断法および予測法に用いられるプローブは本分野で公知である任意の方法によって標識されうることを理解する。粒子の官能化に応じて、この目的のためにさまざまな戦略が使用されうる。一つの方法は、カルボキシ官能化ＳＰＩＯおよび一本鎖抗体の遊離アミノ基の間にペプチド結合を作ることである。当業者は、この化学的架橋手法に使用されうるさまざまな市販のカップリング剤およびキットに詳しい。別の方法は、市販のコバルト官能化１μｍＳＰＩＯ−ビーズとの複合体化のために抗体のヒスチジンタグを使用し、それによって一本鎖抗体／ビーズ複合体がコバルトへのヒスチジンの結合により維持されることとなる。要約すると、この方法では一本鎖抗体およびＳＰＩＯビーズは室温にて１０分間インキュベートされ、その後、その懸濁液は磁石によって分離され、および数回洗浄される。適当な対照が、同一手順を用いて無関係な一本鎖抗体をＳＰＩＯと複合体化することによって作製される。
【００８４】
当業者は、Ｘ線造影法に有用である任意の標識が、プローブに組み込まれうることを理解する。本方法の非限定的な一例として、活性化血小板にターゲッティングされるプローブと常磁性標識がカップリングされうる。プローブの投与に際して、常磁性標識は凝固、塞栓または不安定アテローム硬化性プラークの部位に局在化し、それは次いで磁気共鳴造影法によって視覚化されうる。
【００８５】
代替的に、プローブは放射性標識化（たとえばテクネチウム−９９ｍ、ルビジウム−８２、タリウム２０１、Ｆ−１８、ガリウム−６７、またはインジウム−１１１を用いて）でき、活性化血小板はガンマカメラを用いて視覚化される。また、コンピューター断層撮影法および超音波法（たとえばマイクロバブルのターゲッティング）を用いる活性化血小板の標識化が、記載の抗体について有用であると考えられる。
【００８６】
出願者は、活性化血小板をターゲッティングしおよびｉｎ ｖｉｖｏ環境においてＭＲＩを用いるコントラスト結合の定量を可能にするプローブの使用をここで開示する。本発明の一つの形では、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａの活性立体構造だけを認識する一本鎖抗体が用いられ、その抗体はマイクロメートルサイズの常磁性酸化鉄粒子とカップリングされている。血管内構造は、本分野で典型的に用いられる酸化鉄ナノ粒子よりも数桁大きいミクロンサイズの粒子が接近可能である。出願者の知る限り、一本鎖抗体を用いる活性化血小板の機能的造影はここで初めて記載される。
【００８７】
活性化血小板にターゲッティングされる標識化プローブのｉｎ ｖｉｖｏ環境での使用を実証するため、マウスにおける大腿ワイヤ傷害モデルが使用され（ロケ（Ｒｏｑｕｅ），Ｍ．，他．，管腔表面上の接着分子の迅速な蓄積および好中球の動員を伴う大腿動脈裸出傷害のマウスモデル（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｆｅｍｏｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｄｅｎｕｄａｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｌｕｍｉｎａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ．） Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，２０００．２０（２）： ｐ．３３５−４２）、それは傷害の２４時間後の血小板の単層に繋がる。マウスにおける大腿ワイヤ傷害後の細胞現象の時間的経過はよく記載されており、および図１５Ｃに示される通り、２４時間後裸出した内皮上の集密な血小板沈着を一貫して示す。これは活性化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体上のリガンド誘導性結合部位に対する一本鎖抗体を用いた活性化血小板をターゲッティングするための基礎として用いられた。この抗体の結合はフィブリノーゲンまたはそのアナログの存在に依存するため、この抗体は機能的特異性を与える。これらの性質は、血小板血栓の造影を媒介するための、ＭＰＩＯに対するリガンドとしてこの抗体を魅力的にする。１１．７ Ｔ ＭＲＩおよびＴ２＊強調ＭＲＩを用いて、強いビーズ結合の範囲にシグナル空白が検出された。血管壁に結合したＭＰＩＯの組織学的に確認された量は、Ｔ2＊強調ＭＲＩでＭＰＩＯによって生じたシグナル消失の程度と有意に相関した。このＭＲＩ法は、直径わずか２００μｍの小血管を造影するのに十分な分解能を有する。ＭＰＩＯ誘導性シグナル空白は、シグナル空白を検出するのに十分な感度であり、Ｔ2＊強調ＭＲＩにおいて動脈壁によって生じる内因性ネガティブコントラストを拡大さえした。
【００８８】
以前のコントラスト剤ターゲッティング法は、インテグリンと複合体化されたガドリニウムに富むペルフルオロカーボンナノ粒子、ペプチド複合体化された酸化鉄ナノ粒子、およびガドリニウムで標識化されたフィブリン特異的環状ペプチド標識を含んでいる。しかし、送ることのできるコントラスト剤の量、およびしたがって達成されるコントラスト作用の強度は、特に量の少ない標的については相対的に限定されている。
【００８９】
出願者らは、ＭＰＩＯが、容易に分散せずおよびＭＲＩ上で目立つ、高ペイロードのコントラストを有することを見出しており、および分子造影のためのＭＰＩＯの使用を提案する。この手法の多用途性は、異なる受容体立体構造についてさえ、血管受容体の一般的な血管内造影を可能にする。低密度のエピトープを、ここで示される通りＭＰＩＯによって、リガンド自身と比較したそのサイズにもかかわらず、効率的にターゲッティングでき、同時に高い鉄ペイロードは、ＭＰＩＯサイズに応じて、各ビーズおよびしたがって各受容体の検出さえ可能にする。さらに、ここに記載のファージディスプレイ法は、低密度なまたは機能性のエピトープに対する選択的リガンドを構築する可能性を提供し、したがってさまざまな疾患における病態生理的過程への深い洞察を可能にする。他の重要な問題は、一本鎖抗体が可変領域だけから成るための最小の免疫原性、および内密なエピトープへの接近を円滑にするサイズである。
【００９０】
ここに記載のプローブは、血管での活性化血小板の検出によって対象における血管異常を造影するための方法に使用されうることが理解される。本方法の一つの形では、検出は、ここに記載のプローブの使用を含む。プローブは標準的な心臓カテーテル法検査室で見られるＸ線およびＣＴ装置に有用であると考えられる。６４スライスＣＴまたは１２８スライスＣＴがここに記載の造影法に適していると提案されている。プローブはまた、プローブを導入するためにカテーテルを用いることによって、近赤外スペクトル造影（サーモグラフィー）に関して有用であると提案されている。
【００９１】
検出されうる異常は、破裂したアテローム硬化性プラークまたは破裂傾向にあるアテローム硬化性プラーク、血栓、塞栓、および活性化血小板の蓄積を含む。
【００９２】
本発明はここで下記の非限定的な実施例を参照することによってさらに説明される。
【実施例】
【００９３】
実施例１：一本鎖抗体ｓｃＦｖanti-LIBSおよび融合構造ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰの作製
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ上のＬＩＢＳエピトープに対するモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株の作製、およびその機能的特徴づけは、以前に記載されている（シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）他．ＪＰＥＴ ２００４； ３０８： １００２）。要約すると、ＲＧＤペプチドを用いて精製および溶出されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａが、ハイブリドーマ作製のための免疫原として用いられた。クローンは、活性化血小板を用いて、およびＲＧＤペプチドで飽和した固定化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを用いてスクリーニングされた。これらのクローンのうちの一つであるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）クローン１４５は、ＡＤＰ活性化血小板に対して、およびＲＧＤペプチド（ＧＲＧＤＳＰ，バイオモル・リサーチ・ラボラトリーズ社（ＢＩＯＭＯＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ペンシルバニア州プリマスミーティング（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ））、エプチフィバチド（インテグリリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｌｉｎ）（登録商標），エセックスファーマ社（Ｅｓｓｅｘ Ｐｈａｒｍａ），ドイツ、ミュンヘン）、チロフィバン（アグラスタット（Ａｇｇｒａｓｔａｔ）（登録商標），ＭＳＤ，ニュージャージー州ホワイトハウスステーション（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ））、および アブシキマブ（レオプロ（ＲｅｏＰｒｏ）（登録商標），イーライリリー社（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ），インディアナ州インディアナポリス）と予めインキュベートした血小板に対して結合の増加を示した。ハイブリドーマはＲＰＭＩ、１０％ウシ胎仔血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０μＭメルカプトエタノール、ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００ｇ／ｍｌ（すべてギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））、および１ｘＨＡＴサプリメント（Ｈ０２６２、シグマ社（Ｓｉｇｍａ））中で維持された。ＩｇＧanti-LIBSｍＡｂは、イムノピュア（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ）（登録商標）ＩｇＧプロテインＧ精製（ピアース社（Ｐｉｅｒｃｅ），米国イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ））を用いたハイブリドーマ上清のアフィニティ精製によって調製された。
【００９４】
一本鎖抗体クローニングのために、ハイブリドーマのｃＤＮＡが、ｍＲＮＡ精製カラム（オリゴｄＴ）およびＭ−ＭｕＬＶ（共にアマシャム・ファルマシア社（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ），ドイツ、フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ））を用いて調製された。抗体可変領域の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＰｆｕ（登録商標）ポリメラーゼ（ストラトジーン社（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ），米国カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ））を用いて達成された。重鎖（ＶH）および軽鎖（ＶL）の可変領域の保存領域（ウェルショフ（Ｗｅｌｓｃｈｏｆ）他．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９５； １７９： ２０３） に由来する配列に基づいた下記のプライマーが用いられた： ＶH センス： ５'− ＣＣＧ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＣＧ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＡＧ −３'，ＶH アンチセンス： ５'− ＣＣ ＡＧＧ ＧＧＣ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＴＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＧＧ ＴＧＴ ＣＧＴ ＴＴＴ −３'，ＶL センス： ５'− ＡＡ ＴＴＴ ＴＣＡ ＧＡＡ ＧＣＡ ＣＧＣ ＧＴＡ ＧＡＴ ＡＴＣ G／TＴＧ A／CＴG／C ＡＣＣ ＣＡＡ T／AＣＴ ＣＣ，ＶL アンチセンス： ５'− ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＧＣ ＡＴＣ ＡＧＣ −３'。ＰＣＲ構造はｐＨＯＧ２１ベクター系（キプリヤノフ（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ）他．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７； ２００： ６９，シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）他．ＦＡＳＥＢ Ｊ ２００４： １８： １７０４）へ、ＶHについて制限部位 Ｎｃｏ Ｉ および Ｈｉｎｄ ＩＩＩを、およびＶLについて制限部位 Ｍｌｕ Ｉ および Ｎｏｔ Ｉを用いてクローニングされた。結果として生じた一本鎖抗体をｓｃＦｖanti-LIBSと称した。ＴＡＰは以前にクローニングされており（ハーゲマイヤー（Ｈａｇｅｍｅｙｅｒ）他．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．２００４； ９２： ４７）、およびｓｃＦｖanti-LIBSを既に含むｐＨＯＧ２１へ、制限部位 Ｎｏｔ Ｉ および Ｘｂａ Ｉを用いて導入し、それによってｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰ（図１Ａ）を作製した。ｓｃＦｖ部分の結合機能を持たない対照として、一本鎖抗体を含む非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰが作製され、その一本鎖抗体は元はＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへ結合したが、しかしその重鎖ＣＤＲ３（相補性決定領域）が変異され（ＲＮＤからＡＮＤへ）およびそれによってその結合性質が失われた。すべての構造は配列決定された（図１Ｂ）。
【００９５】
実施例２：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｓｃＦｖ構造の発現および精製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＴＧ１）細胞が上記のｐＨＯＧ２１プラスミドを用いて形質転換され、および新しく画線された寒天プレートからの各コロニーを、アンピシリン１００μｇ／ｍＬおよび１００ｍＭグルコースを含むＬＢ培地中で３７℃にて５００ｍＬフラスコで培養した。培養は２００ｒｐｍにて約４〜６時間、ＯＤ（６００ｎｍ）~０．８に達するまで振とうした。細菌は５０００ｒｐｍにて１０分間４℃での遠心分離によって沈澱され、およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌおよび０．４Ｍショ糖を含むＬＢ培地に再懸濁された。ｓｃＦｖ産生の誘導のためにＩＰＴＧが終濃度０．２５ｍＭとなるように添加され、および室温にて（２２〜２４℃）２００ｒｐｍで１６〜２０時間インキュベートされた。全細胞抽出物からの可溶性タンパク質の精製のために、細菌を５０００ｒｐｍにて１０分間４℃での遠心分離によって採集した。沈澱した細菌は１Ｘバグバスター（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ）（登録商標）（ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ），米国マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））５ｍＬ溶液／沈澱ｇに再懸濁し、および１５分間室温にて緩やかに振とうしてインキュベートした。１５０００ｒｐｍにて２０分間４℃での追加の遠心分離段階後、可溶性タンパク質を含む上清は氷上に保持され、および１：５０希釈されたプロテアーゼ阻害剤（コンプリート（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）（登録商標）ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ），スイス、バーゼル）が添加された。可溶性タンパク質抽出物を含む上清は、５００ μＬのＮｉ2+−アガロース （キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ），ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））と混合され、および１時間４℃にて、１５０ｒｐｍで一定に振とうしながらインキュベートされた。Ｎｉ2+−アガロースは、ここでＨｉｓ（６）タグ化タンパク質を結合しているが、緩衝液（５０ ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、３００ ｍＭ ＮａＣｌ、２０ ｍＭ イミダゾール、ｐＨ ８）で洗浄する前に３０分間静置された。このバッチ洗浄手順を二回反復した。最後に、ｓｃＦｖ融合タンパク質は高イミダゾール濃度（２５０ｍＭ）にて溶出され、および続いて還元条件下でグラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングによって分析された。タンパク質はイムノブロッティングのためにイモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）Ｐ膜（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），米国ベドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ））に転写された。０．２％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０および１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−ツイーン）で膜を一夜ブロッキング後、ＨＲＰ標識化抗Ｈｉｓ（６）抗体 （ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ），ドイツ、マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ））が添加され（１：５００希釈）および２時間室温にてインキュベートされた。膜はＰＢＳ−ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）緩衝液で数回洗浄され、その後スーパーシグナル（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ）（登録商標）化学発光基質（ピアース社（Ｐｉｅｒｃｅ）、米国ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ））の添加によりケミドック（ＣｈｅｍｉＤｏｃ）ＸＲＳ（登録商標） （バイオラッド社（ＢｉｏＲａｄ），オーストラリア、ニューサウスウェールズ州リージェンツパーク（Ｒｅｇｅｎｔｓ Ｐａｒｋ）でペルオキシダーゼ活性が視覚化された。サイズマーカーおよびＨｉｓ（６）タグ陽性対照として、６ｘＨｉｓプロテインラダー（登録商標）（キアゲン社）が用いられた。
【００９６】
実施例３：ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰのＩｎ Ｖｉｔｒｏ機能特徴づけ
血液調製
ヒト血液は２１ゲージバラフライ針を用いて静脈穿刺によって健常者から採取され、 およびクエン酸で抗凝固処理された。濃厚血小板血漿が１００ ｘ ｇでの遠心分離（ＧＳ−６Ｒ遠心分離機、ベックマン・コールター社（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、オーストラリア、ニューサウスウェールズ州グレイズビル（Ｇｌａｄｅｓｖｉｌｌｅ））によってプラスチック試験管で室温にて遠心分離機内に１０分間で得られた。
【００９７】
マウス血液は２７ゲージ針を用いた心臓内穿刺によってＣ５７ＢＬ／６マウスから採取され、および未分画ヘパリン（２０Ｕ／ｍＬ）を用いて抗凝固処理された。５０μｌ量が１ｍＬの改変タイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液（１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ ｍＭ ＫＣｌ、１．２ ｍＭ ＮａＨＣＯ3、２ ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ ｍＭ ＣａＣｌ2、０．１ ％ ＢＳＡ、０．１ ％グルコース）に再懸濁され、および１３００ｘｇにて５分間遠心分離された。上清は廃棄され、および沈澱は１ｍＬの改変タイロード緩衝液に再懸濁された。
【００９８】
フローサイトメトリー
ヒトクエン酸加全血は改変タイロード緩衝液で１／５０希釈され、２０μＭＡＤＰの添加によって活性化されたか、または活性化されずに、および次いで１０分間、１０μｇ／ｍＬのＩｇＧanti-LIBS、ｓｃＦｖanti-LIBS、およびｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰと予備インキュベートされた。ＳｃＦｖｓは、ｓｃＦｖのヒスチジン（６）タグに対する二次抗体（ペンタＨｉｓアレクサフロー（Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）４８８コンジュゲート （登録商標）、キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ））によって検出された。ＩｇＧanti-LIBSはＤＴＡＦ複合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（ジャクソン・イムノリサーチ社（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、米国ペンシルバニア州ウエストグローブ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ））によって検出された。
【００９９】
マウス血小板は、０．１Ｕ／ｍＬトロンビン（エンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ社（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），米国インディアナ州サウスベンド（Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ）） の添加によって活性化されたかまたは活性化されずに、 および 次いで１０ 分間、 １０ μｇ／ｍＬのＩｇＧanti-LIBS，ｓｃＦｖanti-LIBS，および ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰとインキュベートされた。蛍光検出は上記の通り実施された。試料は ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），米国カリフォルニア州サンホセ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ））で、ＣｅｌｌＦＩＸ（登録商標）（ベクトン・ディッキンソン社）を用いた固定後に測定された。
【０１００】
実施例４：抗第Ｘａ因子 活性 検定
第Ｘａ因子の阻害は、発色基質スペクトロザイムｆＸａ＃２２２（アメリカン・ダイアグノスティカ社（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ．），米国コネチカット州グリニッチ（Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ））の分解によって測定された。プローブは改変タイロード緩衝液（１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ ｍＭ ＫＣｌ、１２ ｍＭ ＮａＨＣＯ3、２ ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ ７．４）に対して透析され、および１００ｎＭのｓｃＦｖanti-LIBS、ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰおよび非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰ、または遊離組み換えＴＡＰを終容量１６５μｌ中に得るように調整された。１０μｌの０．１％ヒトアルブミンを添加後、プローブは１０μＬの５００ｐＭ第Ｘａ因子（ヘモクロム（Ｈａｅｍｏｃｈｒｏｍ）、エンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ社（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））と混合され、および陽性対照としての第Ｘａ因子単独と比較された。室温にて１０分間インキュベート後、１５μＬの発色基質溶液（５ｍＭ）が添加され、およびプレートは１５分間室温にてインキュベートされた。最後に、反応は停止溶液５０μｌを添加することによって停止され、および吸収は４０５ｎｍにてＥＬＩＳＡリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ3（登録商標）、パーキンエルマー社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、オーストラリア、メルボルン）で測定された。
【０１０１】
実施例５： マウスモデルにおける抗血栓効力および出血からの保護のＩｎ Ｖｉｖｏ機能評価
体重２２〜３８ｇのＣ５７ＢＬ／６マウス（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ社（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），米国マサチューセッツ州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ））が本試験に用いられた。実験動物の飼育および使用は国のガイドラインに従い、およびフライブルク大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）およびベーカー心臓研究所（Ｂａｋｅｒ Ｈｅａｒｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の施設内動物飼育および倫理委員会に承認された。マウスはエクシケーターを用いてイソフルランで数秒間、およびケタミン（ケタネスト（Ｋｅｔａｎｅｓｔ）（登録商標）１００ｍｇ／ｋｇ体重）およびキシラジン（ロンプン（Ｒｏｍｐｕｎ）（登録商標）５ｍｇ／ｋｇ体重）の皮下注射で麻酔し、および解剖顕微鏡下に置いた。反射の消失後、右 総頸動脈 領域の直接上に皮膚切開を行った。筋膜は平滑に切開され、および右総頸動脈の一部が露出された。次いでナノドップラーフロープローブ（モデル０．５ＶＢ、トランソニック・システムズ社（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、米国ニューヨーク州イサカ（Ｉｔｈａｃａ））が動脈上に配置され、および頸動脈血流がフローメーター（モデルＴ１０６、トランソニック・システムズ社、米国ニューヨーク州イサカ）によって測定された。血栓症は、塩化第二鉄（１０％溶液）（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、米国ミズーリ州セントルイス）で飽和したろ紙（ゲルブロット紙、ＧＢ００３、シュライヒャー・アンド・シュール社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ），米国ニューハンプシャー州キーン（Ｋｅｅｎｅ））の一片（１ｘ２ ｍｍ）を右頸動脈下に付けおよび３ 分後に除去することによって誘導された。血栓性閉塞は、製造元の規格による本システムの精度に相当する範囲である、０．０±０．２ｍＬ／分間に低下した際に生じると考えられた。
【０１０２】
塩化第二鉄処理の１分前に，マウスは尾 静脈を通じて、 生理食塩水 （陰性対照） （０．９％ 塩化ナトリウム） １００ μｌ，１ ｍｇ／ｋｇ体重を生理食塩水で容量１００ μｌに希釈したエノキサパリン（陽性対照）（クレキサン（Ｃｌｅｘａｎｅ）（登録商標）サノフィ・アベンティス社（ＳａｎｏｆｉＡｖｅｎｔｉｓ）、フランス、パリ）、およびさまざまな用量の精製組み換えｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰ、ｓｃＦｖanti-LIBS、非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰ、およびｒＴＡＰを輸液した。使用したｓｃＦｖｓおよびｒＴＡＰのすべての用量は、溶解して容量１００μｌとされた。すべての薬剤がマウスに輸液されたことを確実にするため、口を生理食塩水１００μｌで洗浄した。
【０１０３】
マウス出血時間は、シンカン（Ｘｉｎｋａｎｇ）によって以前に記載された通り測定された。麻酔されたマウスを解剖顕微鏡下に置いた。マウス尾の先端から約１〜２ｍｍ（直径約１ｍｍ）に、使い捨て外科用ナイフを用いて切断を行った。尾が最初に３０秒より長く出血が止まった時間を秒で記録した。
【０１０４】
統計分析
データは表示数（Ｎ）マウスのマウスについて平均値±標準偏差として示す。統計的比較は分散分析（ニューマン・クールズ検定後にＡＮＯＶＡ）によって行われ、および差はｐ＜０．０５で有意と考えられた。
【０１０５】
実施例６： 診断用造影のための標識化一本鎖抗体の使用
実施例１に記載の一本鎖抗体抗ＬＩＢＳを、Ｈｉｓタグを含むタンパク質と相互作用するように官能化された超常磁性酸化鉄粒子（ＳＰＩＯ）と混合した（ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（登録商標）タロン（ＴＡＬＯＮ）（商標）；ダイナル・バイオテク社（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ））。抗体を常磁性ビーズへカップリングするための他の方法（たとえば化学カップリング）もまた使用されうる。活性化血小板（血栓および塞栓の主要なおよび必須な成分である）へのコントラスト剤の結合は、接着検定によって実証された。検定に使用される血小板の活性化は蛍光顕微鏡によって観察され、血小板表面上のＰ−セレクチン発現のアップレギュレーション、および蛍光検出によって細胞内Ｃａ2+レベルの上昇を示した。検定は、血小板を３０分間３７℃にてインキュベートすることによる、フィブリノーゲン被覆カバーグラス上への活性化血小板の固定を含んだ。カバーグラスを洗浄後、フィブリノーゲン−血小板マトリクスはコントラスト剤に３０分間曝露された。非特異的結合を除外 およびコントラスト剤の血小板だけとの結合を実証するため、血小板の同時染色が、Ｐ−セレクチン抗体およびフルオレセイン−アビジンでの二次染色を用いて実施された（図９）。共焦点顕微鏡法を用いて、赤色に見える自己蛍光コントラスト剤の血小板への結合が、Ｐ−セレクチン染色血小板の同時の緑色蛍光によって実証された。共焦点顕微鏡法からのＺスタックを用いた３Ｄ−再構成を図１０に示す。
【０１０６】
さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの本造影法の適切性を評価するため、血栓表面上の活性化血小板への一本鎖抗体の結合を示すための磁気共鳴実験が実施された。これらの実験のために、アクチン、アデノシン二リン酸および塩化カルシウムをヒト濃厚血小板血漿に添加し、および混合物を１５〜３０分間３７℃でインキュベートすることによってヒト血栓が人工的に作製された。血栓はさまざまな濃度のコントラスト剤に曝露され、およびさらに３０分間３７℃にてインキュベートされた。最後に、血栓はＰＢＳ緩衝液で２回洗浄され、および４％パラホルムアルデヒドで固定された。４時間の固定後、血栓は２４ウェル細胞培養プレートのウェルに、ガドリニウム添加２％アガロースに囲まれて包埋された。磁気共鳴造影（ＭＲＩ）は３テスラ医療用スキャナーで標準のリストコイルを用いて実施された。ＴＥ／ＴＲ ９．３ｍｓ／７００ｍｓの３ＤＦＬＡＳＨ配列が分解能１３０ｘ１３０ｘ２００μｍで実施され、および画像は一夜の分析で凝固の縦軸に垂直に再構成された。ＳＰＩＯｉｎＴ２＊強調ＭＲＩによって生じるネガティブコントラストは、ＬＩＢＳターゲッティング抗体とインキュベートされた血栓の周りに黒色の輪として用量依存性に観察された（図１１）。さらに、ビーズ結合は、パラフィン包埋切片において抗Ｐ−セレクチン抗体を用いた免疫組織化学、およびノヴァレッドでの染色を用いて確認された：図４は、血小板の範囲へのビーズ（黄色）の結合を伴う血小板（茶色）の集塊を示す。これらの結果は、設計されたコントラスト剤の活性化血小板への ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合成功を示し、ＭＲＩによって臨床使用フィールド強度を用いて検出されうる。
【０１０７】
実施例７：マウスモデルにおける診断用造影のための標識化一本鎖抗体の使用．
一本鎖抗体作製および１μｍ酸化鉄微粒子への複合体化
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ上のＬＩＢＳエピトープは、活性化血小板についての豊富なおよび高度に特異的な標的に相当する。ｍＡｂ抗ＬＩＢＳ１４５は、活性立体構造でのみＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと結合し、およびそれはフィブリノーゲンの存在下でＡＤＰ活性化血小板への強い結合を示す（シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ＪＰＥＴ ２００４）。ｍＡｂ抗ＬＩＢＳ１４５を発現するハイブリドーマ細胞株が、抗ＬＩＢＳ一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のクローニングのための基礎として使用された。このハイブリドーマ細胞株のｍＲＮＡが調製され、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写された。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域が、可変領域の５'および３'末端にある保存領域とアニーリングするプライマーを用いてＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲ産物はｐＨＯＧ２１ベクターにクローニングされ、ＴＧ１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）が形質転換され、およびＬＩＢＳに典型的なＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合について評価され、活性化血小板を用いてフローサイトメトリーで試験された。最後に、最も良く結合するｓｃＦｖLIBSが、アンピシリン１００μｇ／ｍＬおよび１００ｍＭグルコースを含むＬＢ培地中で、３７℃にて５００ｍＬフラスコで産生された。培養は２００ｒｐｍにて約４〜６時間、ＯＤ（６００ｎｍ）~０．８に達するまで振とうされた。細菌は５０００ｒｐｍにて１０分間４℃での遠心分離によって沈澱され、およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌおよび０．４Ｍショ糖を含むＬＢ培地に再懸濁された。ｓｃＦｖ産生の誘導のためにＩＰＴＧが終濃度０．２５ｍＭとなるように添加され、および室温にて（２２〜２４℃）２００ｒｐｍで１６〜２０時間インキュベートされた。細菌を５０００ｒｐｍにて１０分間４℃での遠心分離によって採集し，沈澱した細菌は１Ｘバグバスター（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ）（登録商標）（ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）） ５ｍＬ溶液／沈澱ｇに再懸濁し、および１５分間室温にて緩やかに振とうしてインキュベートした。１５０００ｒｐｍにて２０分間４℃での追加の遠心分離段階後、可溶性タンパク質を含む上清は氷上に保持され、および１：５０希釈されたプロテアーゼ阻害剤（コンプリート（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）（登録商標）ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））が添加された。上清は ｗａｓ ｍｉｘｅｄ ｗｉｔｈ ５００ μＬのＮｉ2+−アガロース （キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）） と混合され、および１時間４℃にて、１５０ｒｐｍで一定に振とうしながらインキュベートされた。Ｎｉ2+−アガロースは、ここでＨｉｓ（６）タグ化タンパク質を結合しているが、緩衝液（５０ ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、３００ ｍＭ ＮａＣｌ、２０ ｍＭ イミダゾール、ｐＨ ８）で洗浄する前に３０分間静置された。このバッチ洗浄手順を二回反復した。最後に、ｓｃＦｖは高イミダゾール濃度（２５０ｍＭ）にて溶出されおよび透析された。ｓｃＦｖ調製物の機能性はフローサイトメトリーで評価された。
【０１０８】
自己蛍光 コバルト官能化ＭＰＩＯ （１μｍ）が、取扱説明書に従って（ダイナル・バイオテク社（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ），ノルウェー、オスロ）、ＬＩＢＳ一本鎖抗体のヒスチジンタグと複合体化された。要約すると、洗浄後１ｍｇ のビーズ がＬＩＢＳ 抗体と１０ 分間 室温にて （ＲＴ） インキュベートされ、約１０μｇ の ヒスチジンタグ化抗体を結合した。懸濁液を入れた試験管を次いで、ビーズが試験管の側面に移動してしまうまで磁石の上に置き、および上清を廃棄した。この洗浄を、５０ｍＭ ＮａＰ （ｐＨ ８）、３００ｍＭ ＮａＣｌ および０．０１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０．を含む結合および洗浄緩衝液を用いて４回反復した。
【０１０９】
活性化血小板へのＬＩＢＳ−ＭＰＩＯ結合
活性化血小板へのＬＩＢＳ−ＭＰＩＯの結合を実証するために、接着検定が実施された。 薬剤を摂取していない健常者由来の血液をクエン酸で抗凝固処理し、および１０００ ｒｐｍ にて １０ 分間遠心分離した。結果として得られる濃厚血小板血漿をＰＢＳで希釈し （１：１０）、 および １００ μｌを、２０μｇ／ｍｌ フィブリノーゲンと１ 時間３８℃予備インキュベートされおよび１％ ＢＳＡで １ 時間 室温にてブロッキングされているフィブリノーゲン被覆カバーグラス上に加えた。３８℃にて３０分間インキュベート後、カバーグラスをＰＢＳで洗浄し、および連続回転下で０．５μｇのＬＩＢＳ−ＭＰＩＯ（ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯ）または等価の複合体化された無関係の一本鎖抗体対照（対照ＭＰＩＯ）のどちらかと、さらに３０分間３８℃にてインキュベートした。カバーグラスを次いで５分間ＰＢＳで２回洗浄し、および１０％ヤギ血清（ベクター社（Ｖｅｃｔｏｒ）、米国カリフォルニア州バーリンガム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ））で１時間室温にてブロッキングした。コントラスト剤の特異的結合を実証するため、血小板を、Ｐ−セレクチンについてモノクローナルマウス抗ヒトＣＤ６２抗体（１：１００、Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、英国アビンドン（Ａｂｉｎｇｄｏｎ））を用いて、二次抗体として作用するビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（ベクター社、米国カリフォルニア州バーリンガム） と同時染色した。最後に、１：２００希釈フルオレセインアビジン Ｄ （ベクター社、米国カリフォルニア州バーリンガム）を添加し、１時間および室温にてインキュベートした。カバーグラスはセルフィックス（ＣｅｌｌＦｉｘ）（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ドイツ、ハイデルベルク）を用いて固定し、および共焦点顕微鏡法によって評価した。
【０１１０】
マウス
ワイヤ傷害は平均１０±０．８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ジャクソン・ラボラトリーズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），英国）で実施した。マウスは水および標準飼料を自由摂取した。すべての手順は英国内務省動物（科学的処置）法１９８６に準拠して実施された。
【０１１１】
大腿ワイヤ傷害、ビーズ灌流および試料調製
片側大腿ワイヤ傷害は全身麻酔下で、同時投与されたヒプノルム（Ｈｙｐｎｏｒｍ）（２５ｍｇ／ｋｇ、バイエル社（Ｂａｙｅｒ）、ドイツ）およびヒプノバル（Ｈｙｐｎｏｖａｌ）（２５ｍｇ／ｋｇ、バイエル社、ドイツ）の組み合わせを用いて、以前に記載された通り実施した（ロケ（Ｒｏｑｕｅ），Ｍ．，他．，管腔表面上の接着分子の迅速な蓄積および好中球の動員を伴う大腿動脈裸出傷害のマウスモデル（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｆｅｍｏｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｄｅｎｕｄａｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｌｕｍｉｎａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ．）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，２０００．２０（２）： ｐ．３３５−４２）。外科用顕微鏡下で、鼠径部切開を行った。大腿動脈が露出され、および動脈切開が腹壁分岐の遠位側で３０Ｇ注射カニューレ（ＢＤ社，ベルギー、エーレムボードヘム（Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ））を用いて行われた。０．０１０インチガイドワイヤ（ボストン・サイエンティフィク社（Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、米国ナティック（Ｎａｔｉｃｋ））が挿入され、大動脈分岐へ進められ、および引き戻された。ワイヤの除去後、動脈切開部位は結合され、および皮膚は絹縫合糸を用いて閉じた。２４時間後、マウスはイソフルランの吸入によって薬殺された。開胸術によって胸部を開き、心臓を露出しおよび右心房を切断した。３０Ｇ針を左心室の尖部を通じて挿入し、および動物をＰＢＳ１０ｍｌで灌流して血液を排出した。灌流を、ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯまたは対照ＭＰＩＯ（それぞれ１．５ｘ１０8ビーズ／ｍｌ）のどちらかを含むＰＢＳ５ｍＬを用いて続けた。３０分後、マウスを再び生理圧下でＰＢＳ１０ｍＬで、次いで２ｍＭガドテリドール（プロハンス（Ｐｒｏｈａｎｃｅ）、ブラッコ社（Ｂｒａｃｃｏ）、英国）を含む４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）５ｍＬで灌流した。皮膚を除去し、傷害部のある肢を切断し、４％ＰＦＡ／２ｍＭガドテリドール中に２４時間保持し、および次いで２％高グレード低融点アガロース（キャンブレックス社（Ｃａｍｂｒｅｘ）、米国メイン州ロックランド（Ｒｏｃｋｌａｎｄ））の入ったガラスＭＲ管に包埋した。
【０１１２】
Ｅｘ ｖｉｖｏ ＭＲＩ
Ｅｘ ｖｉｖｏ ＭＲＩを１１．７ Ｔにて１３ ｍｍ 1Ｈバードケージラジオ波コイル （ラピッドバイオメディカル社（ＲＡＰＩＤ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ），ドイツ、ヴュルツブルク（Ｗuｒｚｂｕｒｇ））を用いて実施した。３Ｄグラジエントエコーシーケンス （ＴＥ ＝ ４ ｍｓ ／ ＴＲ＝ ９０ ｍｓ、視野１３(１３(１９．５ｍｍ、マトリクスサイズ２５６(２５６(３８４、２平均、造影時間~７ｈ／配列）を無人一夜運転に使用した。データ再構成はオフラインで最終等方性分解能２５μｍ3を用いて実施した。
【０１１３】
傷害大腿動脈におけるＭＰＩＯ 結合の組織学 および 定量
ＭＲＩ後、標本を１０％ギ酸中で一夜脱灰し、段階的エタノール溶液およびネオクリア（Ｎｅｏ−ｃｌｅａｒ）（ＶＭＲ社、英国）を経て脱水し、パラフィン包埋しおよび連続切片を作製した（８μｍ厚）。標本は鉄について（アキュスティン（Ａｃｃｕｓｔａｉｎ）、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、ドイツ）取扱説明書に従って染色した。傷害された管腔血管壁へ結合した複合体化ＭＰＩＯの数を、光学顕微鏡を用いて傷害血管部位から動物当たり２０〜２５切片で定量しおよび平均した。
【０１１４】
免疫組織化学を用いた血小板可視化については、脱パラフィンおよび再水和した切片を１％Ｈ2Ｏ2中で２０分間飽和し、沸騰用クエン酸緩衝液に加え、および４分間圧力鍋で抗原回収のために沸騰させた。標本をＰＢＳツイーン（Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、タンパク質ブロック溶液（ダコ・サイトメーション社（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、ドイツ、ハンブルク）と４時間インキュベートし、および４℃にてラット抗マウスＣＤ６１抗体（１：８０００、インターセル・テクノロジーズ社（ＩｎｔｅｒＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），米国Ｆｌ）と一夜インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、ビオチン化ヤギ抗ハムスターＩｇＧ（１：２００、ベクター社（Ｖｅｃｔｏｒ）、米国カリフォルニア州バーリンガム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ））二次抗体。スライドをＰＢＳで洗浄し、およびペルオキシダーゼ反応を、ベクタステインＲＴＵエリート（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＲＴＵ Ｅｌｉｔｅ）ＡＢＣ試薬 および ベクター・ノヴァレッド（ＮｏｖａＲｅｄ）（共に ベクター社、米国カリフォルニア州バーリンガム）を用いて実施した。最後に、切片を脱水し、パーマウント（Ｐｅｒｍｏｕｎｔ）（バイオメダ社（Ｂｉｏｍｅｄａ）、米国カリフォルニア州フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）を用いてマウントし、および血小板へ結合したビーズを光学顕微鏡で評価した。
【０１１５】
ｅｘ ｖｉｖｏ ＭＲＩによる大腿動脈におけるＭＰＩＯ結合
ＭＰＩＯ結合の定量を盲検で実施した。抗体複合体化ＭＰＩＯ結合は、２以上の連続した切片での大腿動脈の管腔表面上の明瞭な円形シグナル空白として定義された。複数の切片に現れるＭＰＩＯは、１回だけ計数された。断片化された画像は、大腿動脈全体にわたるＭＰＩＯ結合の分布を可視化するため、３Ｄコンストラクターまたはイメージプロ・プラス（ＩｍａｇｅＰｒｏ Ｐｌｕｓ）用プラグインを用いて三次元で再構成された
【０１１６】
統計的手法
データは平均値±標準偏差として表される。パラメトリックデータはｔ検定を用いて比較された。統計的有意性はＰ ＜０．０５に与えられた。
【０１１７】
結果
ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯは血小板上の活性化糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体を検出する
図１３で、抗Ｐ−セレクチン抗体で標識されたヒト血小板血栓は鮮緑色の蛍光を発する。血小板血栓に重なっているのは、自己蛍光ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯに対応する赤色領域である（図Ａ）。ＭＰＩＯは非特異的バックグラウンド保持無しに、血小板血栓に限定される。対照的に、図Ｂでは、無関係な一本鎖抗体と複合体化された対照ＭＰＩＯの結合が全く存在しない。共焦点顕微鏡法での３次元ｚスタック再構成は、Ｐ−セレクチン染色血小板（緑）へのＬＩＢＳ−ＭＰＩＯ結合（赤）を示し、それらの相対サイズおよび空間的関係を強調している。
【０１１８】
ｅｘ ｖｉｖｏ ＭＲＩによって検出された壁接着血小板と結合したＬＩＢＳ−ＭＰＩＯ
片側性大腿動脈ワイヤ傷害がマウス１３個体で合併症無しに実施された。マウス７個体がＬＩＢＳ−ＭＰＩＯで、および６個体が対照ＭＰＩＯで、左心室経由で灌流された。観察者２名間でＭＰＩＯの定量に顕著な変動があった対照動物１個体が定量分析から除外された。
【０１１９】
傷害動脈断片のＥｘ ｖｉｖｏ Ｔ２＊強調ＭＲＩはしばしば、動脈壁内に内因性低シグナル部分を示した（図１４Ｂ）。これとは異なったのは、血管腔内であるが血管壁と隣接した、円形シグナル空白の出現であった。この性質は、ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯを注射されたすべてのマウスのワイヤ傷害動脈で観察された（図１４Ａ）。定量分析では、ＭＰＩＯ蓄積を示唆する低シグナルの管腔部分は、ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯを注射された動物において、対照ＭＰＩＯ灌流動物よりも有意に高かった（２３．７２対６．２；Ｐ＜０．０１、図１４Ｃ）。
【０１２０】
ＭＰＩＯ結合は組織学において確認され（図１５）、ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯを注射された動物でＭＰＩＯ結合が有意に高かった（切片当たり９．９８対０．５ビーズ、Ｐ＜０．０１；図１５Ｄ）。ＭＰＩＯおよび動脈壁への血小板接着の同時局在化は、免疫組織化学によって確認された。図１５Ｃでは、ＭＰＩＯは血小板マーカーＣＤ６１についての免疫染色陽性に随伴して存在することが実証される。
【０１２１】
組織学におけるビーズ定量の分析は、ｅｘ ｖｉｖｏ ＭＲＩによる定量と比較して、強い相関を示した（Ｒ2＝０．７２１９、Ｐ＜０．００１；図１７）。したがって、ＭＲＩによって測定されたＭＰＩＯシグナル量は、傷害血管壁へ結合するＭＰＩＯの量を直接に反映した。
【０１２２】
最後に、ここに概要を示した通りの本発明の精神を離れることなく、さまざまな他の改変および／または変化を行いうることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１はＳｃＦｖ−抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰを示す。細菌ペクチン酸リアーゼ（ｐｅｌＢ）の細菌シグナルペプチド配列は４０位から１０５位までのヌクレオチドを含み、重鎖の可変領域は１０６位から４８３位までのヌクレオチドを含み、リンカー（ＹＯＬエピトープ）は４８４位から５１０位までのヌクレオチドを含み；軽鎖の可変領域は５１１位から８６１位までのヌクレオチドを含み；ＴＡＰ領域は８６２位から１０４１位までのヌクレオチドを含み、およびＨｉｓ６−タグは１０６９位で開始しおよび１０８６位で終了する。
【図２】図２はｐＨＯＧ２１−ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰのマップを示す。ＲＡＭＰ：アンピシリン耐性遺伝子；ＣｏｌＥ１ＯＲＩ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製開始点；ｆ１ＩＧ、線維状遺伝子間領域；ｐｅｌＢ：ペクチン酸リアーゼｐｅｌＢのリーダーペプチド配列；ＶＨ／ＶＬ：重鎖／軽鎖；ＴＡＰ：ダニ抗凝固ペプチド；Ｈｉｓ６：ヒスチジン６個の反復。
【図３】図３は、ＩｇＧ抗ＬＩＢＳ、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ、およびｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰの、非活性化でなく活性化ヒト血小板に対する特異的結合のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ＡＤＰ活性化血小板の結合は白ヒストグラムで示される；非活性化血小板への結合は網掛けヒストグラムで示される。ＩｇＧ抗体の結合はＤＴＡＦ複合体化ヤギ抗マウス抗体によって検出され、ｓｃＦｖｓの結合はアレクサフロー（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）４８８複合体化抗Ｈｉｓタグ抗体によって検出される。
【図４】図４は、Ｎｉ２＋−生成ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰ、および非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰのウェスタンブロット分析を示す。ＭＷ：分子量マーカー（６ｘＨｉｓタンパク質ラダー）、１：ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ、２：ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰ、３：非標的ｓｃＦｖ−ＴＡＰ。
【図５】図５は、第Ｘａ因子活性の、ｒＴＡＰ、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰ、および非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰによるが、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳによらない阻害を示す。発色基質（スペクトロザイムＦＸａ＃２２２）の第Ｘａ因子（５００ｐＭ）による切断が、４０５ｎｍにて測定された。棒グラフは光学密度（ＯＤ）を、 代表的な実験の三連測定の平均値および標準偏差として示す。
【図６】図６は、ＩｇＧ抗ＬＩＢＳ、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ、およびｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰの、非活性化でなく活性化マウス血小板への特異的結合のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。トロンビン活性化血小板の結合は白ヒストグラムで示される；非活性化血小板への結合は網掛けヒストグラムで示される。ＩｇＧ抗体の結合はＤＴＡＦ複合体化ヤギ抗マウス抗体によって検出され、ｓｃＦｖｓの結合はアレクサフロー（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）４８８複合体化抗Ｈｉｓタグ抗体によって検出される。
【図７】図７は、塩化第二鉄誘導性血栓症を有するマウスモデルでの頸動脈における、高用量および低用量でのｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰの抗血栓作用を示す。血栓発生は頸動脈でのナノドップラーフロープローブを用いたフロー測定によって測定された、閉塞時間測定によって評価された。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）および一本鎖抗体ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳが陰性対照として用いられる。臨床に使用される薬剤としてエノキサパリンが陽性対照として用いられる。ｒＴＡＰ、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰ、および非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰが高い等モル用量で用いられ、およびｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰおよび非標的ｓｃＦｖ−ＴＡＰが低い等モル用量で用いられた。各群４個体のマウスの平均値および標準偏差（ＳＤ）が示される。
【図８】図８は、凝固標的化抗凝固ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰが、コントラストｔｏエノキサパリン、ｒＴＡＰ、および非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰとは対照的に出血時間延長を引き起こさないことを示す。マウスにおける出血時間は、尾切断によって測定した。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）および一本鎖抗体ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳが陰性対照として用いられた。ｒＴＡＰおよび非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰは、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰとは対照的に出血時間の相当な延長を示した。各群４個体のマウスの平均値および標準偏差（ＳＤ）が示される。
【図９】図９は、血栓接着検定の概要を示す。フィブリノーゲン上に固定化された血小板が、抗ＬＩＢＳビーズコントラスト剤を用いて活性化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体を介してターゲッティングされた。血小板の同時染色が、コントラスト剤の血小板だけとの選択的結合を実証するため、Ｐ−セレクチン抗体およびフルオレセイン−アビジンを用いて実施された。
【図１０】図１０左図：接着検定の共焦点顕微鏡像。Ｐ−セレクチンおよびフルオレセインアビジン染色血小板は緑色の集塊として現れ、抗ＬＩＢＳビーズコントラスト剤の赤色の蛍光ビーズで囲まれている。右図：共焦点顕微鏡像６０枚からのＺスタックの３Ｄ再構成。
【図１１】図１１は、縦軸に垂直に再構成されたヒト血栓のＭＲＩの３Ｄ ＦＬＡＳＨ像を示す。異なる濃度の抗ＬＩＢＳビーズコントラスト剤に曝露された血栓は、ＳＰＩＯビーズによって生じたＴ２＊（血栓周囲の黒い輪）のネガティブコントラストを示す。ビーズ上の無関係の抗体に曝露された血栓は、このネガティブコントラストを示さない。
【図１２】図１２は、マウス 抗ヒト Ｐ−セレクチン および ノヴァレッド （茶色）を用いた血小板の免疫組織化学を示す。 抗ＬＩＢＳ ビーズ コントラスト 剤は黄色に見え、 および血栓表面上の血小板凝集の範囲だけに存在する。
【図１３】図１３は、アビジン−フルオレセインについてＣＤ６２Ｐ抗体を用いて染色された、フィブリノーゲンで固定されたヒト血小板の免疫蛍光を示す。（Ａ）赤色自己蛍光ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯコントラスト剤とインキュベートされた血小板は、緑色のアビジン−フルオレセイン誘導シグナルで表される血小板との特異的結合を示し、一方、対照ＭＰＩＯコントラスト剤との血小板のインキュベートは結合を示さない（Ｂ）。（Ｃ）はＬＩＢＳ−ＭＰＩＯとインキュベートされおよびＰ−セレクチンについて染色された血小板からのＺスタックの３Ｄ再構成を表し、活性化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対するＬＩＢＳのターゲッティングの原理を示す。
【図１４】図１４は、３Ｄグラジエントエコーシーケンス（ＴＥ＝４ｍｓ／ＴＲ＝９０ｍｓ、視野１３(１３(１９．５ｍｍ、マトリクスサイズ２５６(２５６(３８４）、等方性分解能２５μｍ3の１１．７Ｔ ｅｘ ｖｉｖｏ ＭＲＩを示す。（Ａ）はＬＩＢＳ−ＭＰＩＯ灌流マウスにおける傷害大腿動脈を示す。黒色の内因性血管壁シグナルが、ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯマウスおよび対照ＭＰＩＯマウスで観察でき（Ｂ）、しかし大腿動脈の管腔側に接してシグナル空白がＬＩＢＳ−ＭＰＩＯマウスにおけるＭＰＩＯ結合の指標として観察されうる（Ａ、矢印）。ＭＰＩＯに誘導されるＭＲＩシグナル空白の定量は、ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯおよび対照ＭＰＩＯ灌流マウスの間の有意差を明らかにする（ｐ＜０．０５）。
【図１５】図１５は、代表的な傷害大腿動脈断片の組織学を示す。（Ａ）はＬＩＢＳ−ＭＰＩＯを用いた灌流後の傷害壁への複数のビーズ結合を示し（矢印）、一方、対照ＭＰＩＯ灌流後には結合は観察できない（Ｂ）。（Ａ）および（Ｂ）の組織は鉄染色されたが、ビーズのポリスチレンコーティングは鉄コアの典型的な青色染色を可能にする。しかし、鉄コアの青色の内因性シグナルは、顕微鏡の焦点に依存して観察できた。（Ｃ）ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯコントラスト剤の血小板への結合は、ＣＤ６１についての免疫組織化学およびノヴァレッド染色を用いて確認された。（ａ）は壁に接着した血小板を表し、および（ｂ）ＭＰＩＯは血小板へ直接結合した。（Ｄ）ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯおよび対照ＭＰＩＯ灌流マウスにおいて代表的な組織切片ごとに結合したＭＰＩＯの定量、ＬＩＢＳを標的とするコントラスト剤の高度に特異的な結合を示す（ｐ＜０．０１）。
【図１６】図１６は、ＭＲＩでの傷害肢についてのＭＰＩＯシグナルおよび組織学での切片についての結合したＭＰＩＯの間の相関分析を示し、有意な相関を示す（Ｒ2＝０．７２）
【図１７】図１７は、イメージプロ・プラス（ＩｍａｇｅＰｒｏ Ｐｌｕｓ）用３Ｄコンストラクター・プラグインを用いるＬＩＢＳ−ＭＰＩＯ動物の大腿動脈の三次元再構成を示す。（Ａ）は緑色の管として現れる大腿動脈管腔を示す。（Ｂ）は赤色のＭＰＩＯシグナル単独を示し、および（Ｃ）では解剖学的像についての融合した情報が示される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象への抗凝固剤の投与の際に第二の成分が第一の成分を活性化血小板へ向かわせる、凝固を阻害する能力を有する第一の成分および活性化血小板をターゲッティングする能力を有する第二の成分を含む抗凝固剤。
【請求項２】
第二の成分が、活性化血小板の表面上のマーカーに結合する能力を有する、請求項１に記載の抗凝固剤。
【請求項３】
マーカーが活性化血小板の表面上のみで発現されているかまたは主に活性化血小板の表面上で発現されている、請求項２に記載の抗凝固剤。
【請求項４】
マーカーがリガンド誘導性結合部位（ＬＩＢＳ）である、請求項２または請求項３に記載の抗凝固剤。
【請求項５】
マーカーがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａである、請求項２から４のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項６】
マーカーがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの活性化形である、請求項２から５のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項７】
約６００００から８００００個のマーカー分子が各血小板の表面上に見出される、請求項２から６のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項８】
第二の 成分 が、 ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ 受容体の活性化に際して形成された新しいエピトープと結合する能力がある、請求項１から７のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項９】
対象に投与される際に出血時間を顕著に増大させないか、または対象において出血合併症を結果として生じる、請求項１から８のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項１０】
出血時間がマウスにおける外科的尾切断によって測定される、請求項９に記載の抗凝固剤。
【請求項１１】
対象に投与される際に対象において閉塞時間を延長する、請求項１から１０のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項１２】
閉塞時間がマウス血栓症モデルを用いて測定される、請求項１１に記載の抗凝固剤。
【請求項１３】
対象に投与される際に閉塞時間が陰性対照の投与と比較して少なくとも約２倍になる、請求項１１または請求項１２に記載の抗凝固剤。
【請求項１４】
閉塞時間の延長が、エノキサパリンについての閉塞時間と同様かまたはそれを上回る、請求項１１から１３のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項１５】
第一の成分が活性化血小板の部位へ効果的に局在化する能力を有するように第一の成分が低分子量である、請求項１から１１のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項１６】
第一の成分が約７，０００ダルトン以下の分子量を有する、請求項１５に記載の抗凝固剤。
【請求項１７】
第一の成分がペプチド抗凝固剤である、請求項１から１６のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項１８】
ペプチド抗凝固剤が約６０アミノ酸残基以下から成る、請求項１７に記載の抗凝固剤。
【請求項１９】
ペプチド抗凝固剤がダニ由来である、請求項１７または請求項１８に記載の抗凝固剤。
【請求項２０】
ダニがオルニソドロス・モウバタ（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ ｍｏｕｂａｔａ）である、請求項１９に記載の抗凝固剤。
【請求項２１】
第一の成分が酵素第Ｘａ因子に作用する、請求項１から２０のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項２２】
第一の成分が補助因子の非存在下で直接に第Ｘａ因子を阻害する、請求項２１に記載の抗凝固剤。
【請求項２３】
第一および第二の成分が物理的に連結して単一分子の形である、請求項１から２２のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項２４】
単一分子がタンパク質分子である、請求項２３に記載の抗凝固剤。
【請求項２５】
第一および第二の成分が一本鎖抗体分子の骨格中にある、請求項１から２４のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項２６】
一本鎖抗体が本質的に本明細書の図１に示す通りまたはその誘導体または同等物である、請求項２５に記載の抗凝固剤。
【請求項２７】
請求項１から２６のいずれか一つに記載の抗凝固剤、および医薬として許容されるその塩を含む医薬組成物。
【請求項２８】
請求項２７に記載の組成物の有効量を必要とする哺乳類へ投与する段階を含む、凝固障害を治療または予防するための方法。
【請求項２９】
組成物が経静脈経路または動脈内ボーラスまたは輸液によって投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
抗凝固剤がタンパク質である場合、約３０ｍｇ／ｋｇないし約３００ｍｇ／ｋｇの用量が投与される、請求項２８または請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
凝固障害が、冠動脈疾患、心筋梗塞を含む急性冠動脈症候群、脳卒中、頸動脈または大動脈のアテローム性動脈硬化、深部静脈血栓症、肺塞栓症、および臓器のアテローム性動脈硬化または血栓症から成る群から選択される、請求項２８から３０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３２】
凝固障害の予防または治療のための薬剤の調製における、請求項１から２６のいずれか一つに記載の抗凝固剤の使用。
【請求項３３】
凝固障害が、冠動脈疾患、心筋梗塞を含む急性冠動脈症候群、脳卒中、頸動脈または大動脈のアテローム性動脈硬化、深部静脈血栓症、肺塞栓症、および臓器のアテローム性動脈硬化または血栓症から成る群から選択される、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
（ａ）活性化血小板をターゲッティングする能力がある結合成分および（ｂ）標識を含む、血管異常を検出するためのプローブ。
【請求項３５】
結合成分が活性化血小板の表面上のマーカーへ結合する能力を有する、請求項３４に記載のプローブ。
【請求項３６】
マーカーが活性化血小板の表面上だけに、または主に活性化血小板の表面上に発現される、請求項３５に記載のプローブ。
【請求項３７】
約６００００から８００００個のマーカー分子が各血小板の表面上に見出される、請求項３５から３６のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項３８】
結合成分が血小板上のリガンド誘導性結合部位（ＬＩＢＳ）を指向する、請求項３４から３７のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項３９】
マーカーがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａである、請求項３５または請求項３６に記載のプローブ。
【請求項４０】
マーカーがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの活性化形である、請求項３７から４０のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項４１】
結合成分が、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体の活性化に際して形成される新しいエピトープと結合する能力を有する、請求項３４から４０のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項４２】
結合成分および標識が一本鎖抗体分子の骨格内にある、請求項３４から４１のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項４３】
標識が常磁性、放射性、またはＸ線造影法で検出可能である、請求項３４から４２のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項４４】
標識がテクネチウム−９９ｍ、ルビジウム−８２、タリウム２０１、Ｆ−１８、ガリウム−６７、またはインジウム−１１１を含む、請求項４３または請求項４４に記載のプローブ。
【請求項４５】
標識が超常磁性酸化鉄またはガドリニウムを含む、請求項３４から４４のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項４６】
標識がミクロンサイズの常磁性酸化鉄を含む、請求項３４から４５のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項４７】
プローブが血管異常の表面を越えて透過および／または血管の表面に接着する能力を有する、請求項３４から４６のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項４８】
対象の血管における 活性化 血小板の検出を含む、対象において血管異常を造影する方法。
【請求項４９】
対象の血管を、請求項３４から４７のいずれか一つに記載のプローブに曝露する段階を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
異常が破裂アテローム硬化性プラークまたは破裂する傾向にあるアテローム硬化性プラーク、血栓、塞栓、および活性化血小板の蓄積から成る群から選択される、請求項４８または請求項４９に記載の方法。
【請求項１】
対象への抗凝固剤の投与の際に第二の成分が第一の成分を活性化血小板へ向かわせる、凝固を阻害する能力を有する第一の成分および活性化血小板をターゲッティングする能力を有する第二の成分を含む抗凝固剤。
【請求項２】
第二の成分が、活性化血小板の表面上のマーカーに結合する能力を有する、請求項１に記載の抗凝固剤。
【請求項３】
マーカーが活性化血小板の表面上のみで発現されているかまたは主に活性化血小板の表面上で発現されている、請求項２に記載の抗凝固剤。
【請求項４】
マーカーがリガンド誘導性結合部位（ＬＩＢＳ）である、請求項２または請求項３に記載の抗凝固剤。
【請求項５】
マーカーがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａである、請求項２から４のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項６】
マーカーがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの活性化形である、請求項２から５のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項７】
約６００００から８００００個のマーカー分子が各血小板の表面上に見出される、請求項２から６のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項８】
第二の 成分 が、 ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ 受容体の活性化に際して形成された新しいエピトープと結合する能力がある、請求項１から７のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項９】
対象に投与される際に出血時間を顕著に増大させないか、または対象において出血合併症を結果として生じる、請求項１から８のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項１０】
出血時間がマウスにおける外科的尾切断によって測定される、請求項９に記載の抗凝固剤。
【請求項１１】
対象に投与される際に対象において閉塞時間を延長する、請求項１から１０のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項１２】
閉塞時間がマウス血栓症モデルを用いて測定される、請求項１１に記載の抗凝固剤。
【請求項１３】
対象に投与される際に閉塞時間が陰性対照の投与と比較して少なくとも約２倍になる、請求項１１または請求項１２に記載の抗凝固剤。
【請求項１４】
閉塞時間の延長が、エノキサパリンについての閉塞時間と同様かまたはそれを上回る、請求項１１から１３のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項１５】
第一の成分が活性化血小板の部位へ効果的に局在化する能力を有するように第一の成分が低分子量である、請求項１から１１のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項１６】
第一の成分が約７，０００ダルトン以下の分子量を有する、請求項１５に記載の抗凝固剤。
【請求項１７】
第一の成分がペプチド抗凝固剤である、請求項１から１６のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項１８】
ペプチド抗凝固剤が約６０アミノ酸残基以下から成る、請求項１７に記載の抗凝固剤。
【請求項１９】
ペプチド抗凝固剤がダニ由来である、請求項１７または請求項１８に記載の抗凝固剤。
【請求項２０】
ダニがオルニソドロス・モウバタ（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ ｍｏｕｂａｔａ）である、請求項１９に記載の抗凝固剤。
【請求項２１】
第一の成分が酵素第Ｘａ因子に作用する、請求項１から２０のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項２２】
第一の成分が補助因子の非存在下で直接に第Ｘａ因子を阻害する、請求項２１に記載の抗凝固剤。
【請求項２３】
第一および第二の成分が物理的に連結して単一分子の形である、請求項１から２２のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項２４】
単一分子がタンパク質分子である、請求項２３に記載の抗凝固剤。
【請求項２５】
第一および第二の成分が一本鎖抗体分子の骨格中にある、請求項１から２４のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項２６】
一本鎖抗体が本質的に本明細書の図１に示す通りまたはその誘導体または同等物である、請求項２５に記載の抗凝固剤。
【請求項２７】
請求項１から２６のいずれか一つに記載の抗凝固剤、および医薬として許容されるその塩を含む医薬組成物。
【請求項２８】
請求項２７に記載の組成物の有効量を必要とする哺乳類へ投与する段階を含む、凝固障害を治療または予防するための方法。
【請求項２９】
組成物が経静脈経路または動脈内ボーラスまたは輸液によって投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
抗凝固剤がタンパク質である場合、約３０ｍｇ／ｋｇないし約３００ｍｇ／ｋｇの用量が投与される、請求項２８または請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
凝固障害が、冠動脈疾患、心筋梗塞を含む急性冠動脈症候群、脳卒中、頸動脈または大動脈のアテローム性動脈硬化、深部静脈血栓症、肺塞栓症、および臓器のアテローム性動脈硬化または血栓症から成る群から選択される、請求項２８から３０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３２】
凝固障害の予防または治療のための薬剤の調製における、請求項１から２６のいずれか一つに記載の抗凝固剤の使用。
【請求項３３】
凝固障害が、冠動脈疾患、心筋梗塞を含む急性冠動脈症候群、脳卒中、頸動脈または大動脈のアテローム性動脈硬化、深部静脈血栓症、肺塞栓症、および臓器のアテローム性動脈硬化または血栓症から成る群から選択される、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
（ａ）活性化血小板をターゲッティングする能力がある結合成分および（ｂ）標識を含む、血管異常を検出するためのプローブ。
【請求項３５】
結合成分が活性化血小板の表面上のマーカーへ結合する能力を有する、請求項３４に記載のプローブ。
【請求項３６】
マーカーが活性化血小板の表面上だけに、または主に活性化血小板の表面上に発現される、請求項３５に記載のプローブ。
【請求項３７】
約６００００から８００００個のマーカー分子が各血小板の表面上に見出される、請求項３５から３６のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項３８】
結合成分が血小板上のリガンド誘導性結合部位（ＬＩＢＳ）を指向する、請求項３４から３７のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項３９】
マーカーがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａである、請求項３５または請求項３６に記載のプローブ。
【請求項４０】
マーカーがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの活性化形である、請求項３７から４０のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項４１】
結合成分が、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体の活性化に際して形成される新しいエピトープと結合する能力を有する、請求項３４から４０のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項４２】
結合成分および標識が一本鎖抗体分子の骨格内にある、請求項３４から４１のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項４３】
標識が常磁性、放射性、またはＸ線造影法で検出可能である、請求項３４から４２のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項４４】
標識がテクネチウム−９９ｍ、ルビジウム−８２、タリウム２０１、Ｆ−１８、ガリウム−６７、またはインジウム−１１１を含む、請求項４３または請求項４４に記載のプローブ。
【請求項４５】
標識が超常磁性酸化鉄またはガドリニウムを含む、請求項３４から４４のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項４６】
標識がミクロンサイズの常磁性酸化鉄を含む、請求項３４から４５のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項４７】
プローブが血管異常の表面を越えて透過および／または血管の表面に接着する能力を有する、請求項３４から４６のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項４８】
対象の血管における 活性化 血小板の検出を含む、対象において血管異常を造影する方法。
【請求項４９】
対象の血管を、請求項３４から４７のいずれか一つに記載のプローブに曝露する段階を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
異常が破裂アテローム硬化性プラークまたは破裂する傾向にあるアテローム硬化性プラーク、血栓、塞栓、および活性化血小板の蓄積から成る群から選択される、請求項４８または請求項４９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２００９−５００２９９（Ｐ２００９−５００２９９Ａ）
【公表日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１８５７２（Ｐ２００８−５１８５７２）
【出願日】平成１８年７月５日（２００６．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００６／０００９４３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００３０１０
【国際公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【出願人】（５０８００３７３４）ベイカー メディカル リサーチ インスティテュート (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月５日（２００６．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００６／０００９４３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００３０１０
【国際公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【出願人】（５０８００３７３４）ベイカー メディカル リサーチ インスティテュート (1)
【Ｆターム（参考）】
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