【解決手段】本発明は、抗原提示細胞の適切な指示と組み合わせて、ＩｇＧバックボーン内のペプチドによるＭＨＣＩの予想外のローディングを利用するＴｃ１エフェクターに対するクラスＩ免疫の効果的な再指向をもたらす、新規な組成物に関する。このような組成物は、一見無効な治療法を効果の高い治療法へと転換することができ、クラスＩ拘束性細胞溶解性細胞及びＩＦＮ−γやＩＬ−２を産生するＴ細胞の発生に関連し、更に、高毒性微生物に対する防御や悪性腫瘍プロセスからの回復に関連する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は２００２年９月２０日出願の米国特許出願第６０／４１２，２１９号及び２００３年３月１４日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／０７９９５号に基づく優先権を主張するものであり、これら出願それぞれの全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
本発明は一般に、免疫応答を生じさせるための方法及び組成物に関する。より詳細には、本発明は、抗原提示細胞にロードし、目的とするＴ細胞応答の発生に適した状況において、輸送されたエピトープをＭＨＣクラスＩ分子上に提示するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃガンマレセプター（ＦｃγＲ）による抗原の輸送が効果的な抗腫瘍応答或いは抗感染応答を引き起こすという直接的な証拠は未だ示されていない。例えば、イムノグロブリンつまりＩｇＧバックボーン内でのウィルスＮＰ（核タンパク質）由来エピトープの輸送によっては、検出可能な細胞障害性免疫は誘導されないことが先に示されている（Zaghouani et al.、Eur J Immunol.１９９３年１１月；２３（１１）：２７４６〜５０）。一方、ＮＰ発現細胞（トランスフェクトーマ）の場合には、同じエピトープの輸送により顕著な細胞溶解活性が生じた。従って当時は、「ＡＰＣ（抗原提示細胞）は、同じ状況（１マイクロＭ Ｉｇ−ＮＰ）からインフルエンザ核タンパク質［ＮＰ］ペプチドをＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞に提示することはできず」、よって、「担体タンパク質を同一とする状況でＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ拘束性ペプチドを提示された場合、エンドサイトーシスコンパートメントはクラスＩＩ拘束性ペプチドによる提示の方を好む確立の方が少なくとも１０００倍高い」という結論に至っていた。
【０００３】
ＭＨＣクラスＩ提示経路へのＮＰエピトープのアクセスは輸送戦略に依存しているため、ＦｃγＲインターナリゼーションのために厳しく制限されると考えられていた。最近になって、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＦｃγＲの架橋或いは同時結合によって、シグナル伝達が大幅に最適化されることにより、クロスプライミング及びＡＰＣが刺激され、その結果、ＭＨＣクラスＩ分子の効果的なローディングが達成され得ることが提唱された（Regnault et al.、J Exp Med.１９９９年１月 １８；１８９（２）：３７１〜８０）。これは免疫複合体（多価抗原−抗体非共有結合複合体）を用いることにより可能となると考えられるが、Ｃ（補体）仲介疾患が生じる可能性があるため、この複合体はex vivoでＡＰＣに投与されただけであった（Naama et al.、J Clin Lab Immunol.１９８５年６月；１７（２）：５９〜６７； Rafiq et al.、J Clin Invest.２００２年７月；１１０（１）：７１〜９）。また、ＡＰＣ上のレセプターを指向する（Ｆａｂ）２−抗原組換え融合構築物によって、レセプター架橋インターナリゼーション、及びＭＨＣクラスＩＩ分子に関連した提示が起こり得る（Lunde et al.、Biochem Soc Trans ２００２年；３０（４）：５００〜６）。しかし、抗原の挿入によりイムノグロブリン（Ｉｇ）の定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）のＦｃ部分が修飾される。このことは、このセグメントの完全性と密接に関連している２つのパラメータである半減期及び薬物動態に対して重大で予測不能な影響を及ぼす可能性がある（Spiegelberg HL、J Clin Invest １９７５年９月；５６（３）：５８８〜９４）。最後に、上述の戦略のいずれか一方をin vivoで適用した場合、特定のサイトカイン（ＩＦＮ−γ等）を産生する最適なＭＨＣクラスＩ及びＩＩ拘束性Ｔ細胞の発生に関連すると考えられる、防御的或いは治療的な抗腫瘍免疫或いは抗菌免疫が誘導される、という決定的証拠はこれまでのところ得られていない。ex vivoで適用した場合でも、ＩＴＡＭ＋とＩＴＩＭ＋ＦｃγＲの活性のバランスのため、免疫複合体戦略によって示される有効性は限られている（Kalergis and Ravetch、J Exp Med ２００２年６月 １７；１９５（１２）：１６５３〜９）。このように、Ｆｃγレセプターの一価結合（monovalent ligation）により抗原をＡＰＣへin vivo輸送することによって、効果的な抗腫瘍免疫或いは抗ウィルス免疫を誘導することが可能かどうかは、未だわかっていない。
【０００４】
２００２年３月１４日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／０７９９５号及び２００２年４月３０日出願の米国特許出願第６０／３６４，４９０号を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。また、Geneva BioInformaticsより入手可能なSwiss-Protein/Trembl Protein Knowledgebase（商標）（ＣＤ−ＲＯＭ版）の全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
予想に反して、本発明では、Ｆｃ部分を修飾することなくＩｇＧバックボーンに共有結合したペプチドエピトープを用いて、ＦｃγＲの一価結合（monovalent engagement）によってＡＰＣをin vivo及びex vivoでロードすることによって、このエピトープがＭＨＣ Ｉプロセシング及び提示経路にアクセスすることができ、ＭＨＣクラスＩ分子を効果的にロードすることができることを実証するものである。意外にも、この結果、ＩＬ−２やＩＦＮ−γではなくＩＬ−４を産生しＩｇＧバックボーン内でこのエピトープを認識するＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞により特徴付けられる強いＴｃ２応答が発生する。
【０００６】
また、この「逸脱した」応答の発生は、腫瘍増殖に関連する病理的プロセスの制御には効果的ではなく、細胞溶解性Ｔ細胞の顕著なプライミングとも関連していなかった。このことは、先に同様の状況において免疫誘導が検出できなかったことの主な説明となり、また意外にも、ＡＰＣ上のＦｃγＲの架橋や多価結合（免疫複合体やＦａｂ２−抗原化合物の場合等）がＭＨＣクラスＩ分子へのペプチドの効果的なローディングの必須条件ではないことを示している。このことが重要であるのは、この概念が（免疫複合体とは対照的に）in vivoに応用することができるためであり、またＦｃ部分の完全性、よってＰＫプロファイルを維持することができる（Ｆａｂ２−抗原組換え分子とは対照的に）ためである。ＭＨＣクラスＩ分子の効果的なローディングにもかかわらず、ＡＰＣは、ＩｇＧバックボーン内でペプチドエピトープによりin vivoでロードされた場合に、防御的抗腫瘍免疫や抗菌免疫を引き起こすことができなかった。
【０００７】
更に、本願は、ＩｇＧバックボーン内でのペプチドによるＭＨＣ Ｉの予想外のローディングを利用するＴｃ１エフェクターに対するクラスＩ免疫の効果的な再指向（redirection）をもたらす、新規な組成物を開示する。このような組成物は、一見無効なＭＨＣクラスＩＩ及びクラスＩ拘束性ペプチドを効果の高いペプチドへと転換することができる。新規な合成ポリヌクレオチドによるＡＰＣの刺激に関連するＦｃγＲによるＡＰＣのロードは、クラスＩ拘束性細胞溶解性細胞及びＩＦＮ−γやＩＬ−２を産生するＴ細胞の発生をもたらし、更に、高毒性微生物に対する防御や悪性腫瘍プロセスからの回復に関連する。また、本技術の変法・変形例は、誤って或いは先に提示されたように適用すると、ウィルスや腫瘍に対する防御的免疫（特にＭＨＣクラスＩ拘束性）の発生において最適ではないことも示される。本願は、過去の失敗の理由を示すと共に、最適な効果を得るために本技術の各構成要素を獲得し適用する方法について教示する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は次の実施態様を含む。
１．Ｉｇ、Ｉｇバックボーンバックボーン或いはその一部に結合した少なくとも一種のペプチドエピトープを用いて抗原提示細胞にロードし、抗原或いはペプチドエピトープに対するＴ細胞応答を発生させることによりＩｇ−ペプチド分子／複合体或いはその一部を形成する方法であって、in vivo或いはex vivoで患者に投与すると、該エピトープは抗原提示細胞のＭＨＣ Ｉ経路により効果的にプロセシングされて提示され、その結果、抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩ分子が効果的にロードされ、ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体が生じる、方法。
２．Ｉｇ−ペプチド分子／複合体或いはその一部がＲＮＡ鎖と共に投与される、パラグラフ１に記載の方法。
３．ＲＮＡがｄｓＲＮＡ鎖でありｐＡ：ｐＵである、パラグラフ２に記載の方法。
【０００９】
る、パラグラフ３に記載の方法。
５．ＩｇバックボーンがヒトＩｇ由来である、パラグラフ１、２、３又は４に記載の方法。
６．ＩｇバックボーンがヒトＩｇＧ由来である、パラグラフ１、２、３又は４に記載の方法。
７．Ｉｇバックボーンはヒト化Ｉｇである、パラグラフ１、２、３又は４に記載の方法。
８．抗原提示細胞はＦｃγＲの一価結合（monovalent engagement）によってロードされる、パラグラフ１に記載の方法。
９．抗原提示細胞はｉｎ ｖｉｖｏ或いはｅｘ ｖｉｖｏでロードすることができる、パラグラフ１に記載の方法。
１０．ペプチドエピトープはＩｇバックボーンに共有結合している、パラグラフ１に記載の方法。
１１．ペプチドエピトープはＩｇのＦｃ部分の修飾無しでＩｇバックボーンに結合している、パラグラフ１に記載の方法。
１２．ペプチドエピトープはイムノグロブリン分子のＣＤＲ領域内に挿入されている、パラグラフ１に記載の方法。
１３．ペプチドエピトープはイムノグロブリン分子のＣＤＲ領域内に挿入或いは欠失（insertion or deletion）により挿入されている、パラグラフ１、２、３又は４に記載の方法。
１４．ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体によって、ＩＬ−２産生やＩＦＮ−γ産生ではなくＩＬ−４産生により特徴付けられる強いＴｃ２応答が発生する、パラグラフ１、２、３又は４に記載の方法。
１５．ペプチドエピトープは、インフルエンザウィルスＭ１或いはＭ２；Ｃ型肝炎ウィルスＮＳ３；Ｂ型肝炎ウィルスコア抗原；ヒトパピローマウィルスＨＰＶ１８−Ｅ７、ＨＰＶ１６−Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ６;メラノーマ−ｇｐ１００；ＭＡＲＴ−１；ＴＲＰ−２；癌胎児抗原前駆体；Ｈｅｒ−２；破傷風毒素ユニバーサルＴヘルパーエピトープ；ＨＩＶ−１：逆転写酵素；ＨＩＶ１：ｇａｇ；インスリン前駆体−ヒト；ヒトＧａｄ６５；前立腺腫瘍抗原；ムチン１；単純ヘルペス抗原；及び呼吸器合胞体ウィルス抗原から成る群から選択される、 パラグラフ１に記載の方法。
１６．血清の負の影響が回避される、パラグラフ１に記載の方法。
１７．Ｉｇペプチド分子及びｄｓＲＮＡは皮下注射或いは腹腔内注射によって投与される、パラグラフ１、２、３又は４に記載の方法。
１８．抗原提示細胞は、樹状細胞、単球、マクロファージ及びＢ細胞から成る群から選択される、パラグラフ１に記載の方法。
１９．抗原提示細胞は、ＣＤ１１ｃ＋ＡＰＣ及びＣＤ１１ｂ＋ＡＰＣから成る群から選択される、パラグラフ１に記載の方法。
２０．ｉｎ ｖｉｖｏ輸送によって形成されるＭＨＣ−ペプチド複合体は最大１〜２週間発現される、パラグラフ１に記載の方法。
２１．ＭＨＣ−ペプチド複合体によってＴ細胞が活性化する、パラグラフ１、２、３又は４に記載の方法。
２２．Ｔ細胞応答は、ＡＰＣ上のＩＴＡＭ＋及びＩＴＩＭ＋Ｆｃγレセプターによって決まる、パラグラフ２１に記載の方法。
２３．ＩＴＡＭ＋ＦｃγＲアイソフォームのγ鎖の発現がＴ細胞応答を誘導し、ＩＴＩＭ＋ＦｃγＲＩＩがＴ細胞応答を制限する、パラグラフ２１に記載の方法。
２４．単球がＴｈ２及びＴｒ１細胞を誘導し、樹状細胞及び単球の双方がＴｈ３細胞を誘導し、Ｔ細胞エピトープのＩｇＧ仲介輸送に引き続く調節応答を引き起こす上で樹状細胞よりもＣＤ１１ｂ＋単球の方が強力である、パラグラフ１８又は１９に記載の方法。
２５．ｉｎ ｖｉｖｏでＩｇバックボーン内で輸送されたペプチドによるＡＰＣのローディングによってＴｈ２免疫が誘導される、パラグラフ１、２、３又は４に記載の方法。
２６．ｉｎ ｖｉｖｏでＩｇバックボーン内で輸送されたペプチドによるＡＰＣのローディングによってＴｈ３及びＴｒ１免疫が誘導される、パラグラフ１、２、３又は４に記載の方法。
２７．Ｔ細胞応答は、抗ＣＤ４０ｍＡｂ、組換えＩＬ−１２及び合成ｄｓＲＮＡから成る群から選択される一種と共に同時刺激することによって増強される、パラグラフ１に記載の方法。
２８．ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４は用量依存的にダウンレギュレートされ、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βは用量依存的にアップレギュレートされる、パラグラフ１、２、３又は４に記載の方法。
２９．ペプチドエピトープはｒｅｃＮＰであり、ＩＬ−４産生Ｔｃ２細胞から成るＮＰ特異的ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞免疫を誘導する、パラグラフ１、２、３又は４に記載の方法。
３０．ＲＮＡモチーフを用いて免疫応答を修飾する（modified）ことを更に含む、パラグラフ１に記載の方法。
３１．ＲＮＡモチーフはｄｓＲＮＡである、パラグラフ３０に記載の方法。
３２．ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体応答は増強され、増強されたＴｈ１及びＴｈ２応答と関連する、パラグラフ２７に記載の方法。
３３．ｄｓＲＮＡは、ｐＡ：ｐＵ、ｐＩ：ｐＣ及びｐＣ：ｐＧから成る群から選択される、パラグラフ２、２７又は３０に記載の方法。
３４．ｄｓＲＮＡはｐＡ：ｐＵであり、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔｃ１細胞を誘導してＩＦＮ−γを産生する、パラグラフ２７又は３０に記載の方法。
３５．ｄｓＲＮＡは１０〜５０Ｋｄである、パラグラフ３３又は３４に記載の方法。
３６．ＲＮＡモチーフは、ｐ（Ａ）、ｐ（Ｃ）、ｐ（Ｇ）、ｐ（Ｉ）及びｐ（Ｕ）から成る群から選択されるｓｓＲＮＡである、パラグラフ２又は３０に記載の方法。
３７．ペプチド−エピトープはＮＰであり、ｄｓＲＮＡモチーフを同時投与することによりＩＬ−２及びＩＦＮ−γを効果的に誘導することを更に含む、パラグラフ１に記載の方法。
３８．ＡＰＣはｅｘ ｖｉｖｏでロードされてＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体を形成し、Ｔｃ応答を発生させる、パラグラフ１に記載の方法。
３９．ＡＰＣは養子移入によって患者に投与される、パラグラフ３８に記載の方法。
４０．ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体の形成によって、ＩＬ−４を産生するがＩＦＮ−γは産生しないＴｃ２細胞の分化が生じる、パラグラフ３８に記載の方法。
４１．ＲＮＡモチーフを投与して、ＩＦＮ−γ産生Ｔｃ１細胞を含むようにＴ細胞プロファイルを広げる工程を更に含む、パラグラフ３８に記載の方法。
【００１０】
４２．患者の免疫方法であって、Ｉｇバックボーン或いはその一部に結合した抗原の少なくとも一種のペプチドエピトープを用いて抗原提示細胞にロードすることによりＩｇ−ペプチド分子を形成し、ｄｓＲＮＡモチーフと共にＩｇ−ペプチド分子をｉｎ ｖｉｖｏで患者に投与することを含み、エピトープがＭＨＣ Ｉ経路により効果的にプロセシングされて提示され、その結果、ＭＨＣクラスＩ分子が効果的にロードされ、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗原への曝露に続くＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞の効果的二次増殖をもたらす、方法。
４３．抗原はウィルスである、パラグラフ４２に記載の方法。
４４．ウィルスはインフルエンザウィルスである、パラグラフ４３に記載の方法。
４５．ペプチド−エピトープはｒｅｃＩｇＧ−ＮＰ（Ｋｄ）である、パラグラフ４２に記載の方法。
４６．ｄｓＲＮＡはｐＡ：ｐＵである、パラグラフ４２に記載の方法。
４７．Ｔ細胞は細胞障害性Ｔリンパ球である、パラグラフ４２に記載の方法。
４８．ｉｎ ｖｉｖｏでの抗原への曝露に続くＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞の二次増殖は、組換え抗原を無菌生理食塩水にいれて投与しただけの場合よりも大きい、パラグラフ４２に記載の方法。
【００１１】
４９．ＩｇＧバックボーン或いはその一部に結合した少なくとも一種の腫瘍関連Ｔ細胞エピトープを用いて抗原提示細胞にロードすることによってＩｇＧ−ペプチド分子を形成し、ｄｓＲＮＡと共にＩｇ−ペプチド分子をｉｎ ｖｉｖｏで投与することによる、臨床診断後の腫瘍の制御及び処置方法。
５０．ＭＨＣ Ｉ経路により腫瘍関連Ｔ細胞エピトープが効果的にプロセシングされて提示され、その結果、抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩ分子が効果的にロードされ、ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体が生じる、パラグラフ４９に記載の方法。
５１．腫瘍関連Ｔ細胞エピトープに対する免疫応答と腫瘍拒絶を生じさせる、パラグラフ４９に記載の方法。
５２．ｄｓＲＮＡがｐＡ：ｐＵである、パラグラフ４９、５０又は５１に記載の方法。
５３．ＩｇＧ−ペプチド複合体及びｄｓＲＮＡは抗腫瘍治療として繰り返し投与される、パラグラフ４９に記載の方法。
５４．腫瘍拒絶に際し、Ｔｃ１免疫が腫瘍関連エピトープに対して生じる、パラグラフ４９に記載の方法。
５５．ＩｇＧ−ペプチド及びｄｓＲＮＡの投与に際し、Ｔｃ２免疫が腫瘍関連エピトープに対して生じる、パラグラフ４９に記載の方法。
５６．同種の腫瘍関連エピトープに対する有効な記憶応答を更に誘導する、パラグラフ４９に記載の方法。
５７．腫瘍細胞変異体に対する継続的な免疫（continued immunity）を生じさせる、パラグラフ４９に記載の方法。
５８．腫瘍関連Ｔ細胞エピトープは、メラノーマ−ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、ＴＲＰ−２、癌胎児抗原前駆体ＸＰ０６４８４５／ＮＣＢ１、Ｈｅｒ−２、前立腺腫瘍抗原及びＭＵＣ１から成る群から選択される、パラグラフ４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６又は５７に記載の方法。
【００１２】
５９．ＣＨ₂領域に隣接するＣＨ₃領域を含み、ヒンジ領域により抗原がＣＨ₂領域に結合し、抗原はヒンジ領域に結合したオリゴ−グリシンリンカーを有する、ＡＰＣのＦｃγＲに結合可能な組換えヒトＩｇ分子或いはその一部。
６０．抗原は、そこから延長しリーダーへと続くフランキング配列を有する、パラグラフ５９に記載の組換えヒトＩｇ分子。
６１．ヒトＩｇ分子はＩｇＧ分子である、パラグラフ５９に記載の組換えヒトＩｇ分子。
６２．抗原はウィルス抗原或いは腫瘍抗原である、パラグラフ５９に記載の組換えヒトＩｇ分子。
６３．ＣＨ₃領域のアミノ酸配列は、ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ及びその保存的に修飾された変異体［配列番号１］である、パラグラフ５９に記載の組換えヒトＩｇ分子。
６４．ＣＨ₂領域のアミノ酸配列は、ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＦＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ及びその保存的に修飾された変異体［配列番号２］である、パラグラフ５９に記載の組換えヒトＩｇ分子。
６５．ヒンジ領域のアミノ酸配列は、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ及びその保存的に修飾された変異体［配列番号３］である、パラグラフ５９に記載の組換えヒトＩｇ分子。
６６．フランキング領域のアミノ酸配列は、ＱＶＱＬＱ及びその保存的に修飾された変異体［配列番号４］である、パラグラフ５３に記載の組換えヒトＩｇ分子。
【００１３】
６７．抗原に対する免疫応答を増強するための組成物であって、この組成物はポリヌクレオチドであり、このポリヌクレオチドは、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン及びイノシンから成る群から選択される化合物で構成されている、組成物。
６８．上記ポリヌクレオチドはｄｓＲＮＡである、パラグラフ６７に記載の組成物。
６９．上記ｄｓＲＮＡは、ｐＡ：ｐＵ及びｐＩ：ｐＣから成る群から選択される、パラグラフ６８に記載の組成物。
７０．ｄｓＲＮＡはｐＡ：ｐＵであり、アデニン及びウラシルの一部は、ポリヌクレオチド鎖に沿ってグアニン、シトシン或いはイノシンによって置換されることもある、パラグラフ６９に記載の組成物。
７１．抗原はウィルスである、パラグラフ６９に記載の組成物。
７２．抗原はイムノグロブリン或いはその一部に結合しており、ｉｎ ｖｉｖｏで投与される、パラグラフ６９に記載の組成物。
７３．抗原はタンパク質或いはペプチドである、パラグラフ７２に記載の組成物。
７４．抗原は腫瘍関連エピトープである、パラグラフ６７、６８、６９又は７０に記載の組成物。
７５．抗原はＴ細胞エピトープである、パラグラフ７４に記載の組成物。
７６．ｄｓＲＮＡは前記抗原と共に投与される、パラグラフ６７、６８、６９又は７０に記載の組成物。
７７．ポリヌクレオチドはｄｓＲＮＡであり、抗原と同時投与される、パラグラフ６７に記載の組成物。
７８．抗原は既に体内に存在している、パラグラフ６７に記載の組成物。
７９．抗原は医薬的に許容し得る担体に添加されて投与される、パラグラフ６７に記載の組成物。
【００１４】
８０．患者の抗原に対する免疫応答を増強させるための医薬の製造におけるｄｓＲＮＡの使用であって、前記ｄｓＲＮＡを前記抗原と共に患者に投与することを含む使用。
８１．前記抗原のエピトープはイムノグロブリン或いはその一部で患者に輸送される、パラグラフ８０に記載の使用。
８２．ｄｓＲＮＡはｐＡ：ｐＵを含む、パラグラフ８０又は８１に記載の使用。
８３．ｄｓＲＮＡはｐＩ：ｐＣを含む、パラグラフ８０又は８１に記載の使用。
８４．ｄｓＲＮＡは、アデニン、シトシン、ウラシル、グアニン及びイノシンから成る群から選択される塩基から成る、パラグラフ８１に記載の使用。
８５．抗原に対するＴｈ１及び／又はＴｃ１応答が増強される、パラグラフ８１、８２又は８３に記載の使用。
８６．抗原に対するＴｃ１細胞応答が誘導される、パラグラフ８１、８２又は８３に記載の使用。
８７．免疫応答は増強されたＢ細胞応答を含む、パラグラフ８１、８２又は８３に記載の使用。
８８．前記抗原は別の抗原と共に投与される、パラグラフ８１、８２又は８３に記載の使用。
８９．ＣＸＣ及びＣＣケモカインの発現を誘導する、パラグラフ８１、８２又は８３に記載の使用。
９０．ｄｓＲＮＡの投与によりＣＤ１１ｂ＋単球が増加及び活性化して、Ｔ細胞応答或いはＢ細胞応答、又はＴ細胞応答及びＢ細胞応答の両方が増強される、パラグラフ８１、８２又は８３に記載の使用。
９１．ｄｓＲＮＡの投与により樹状細胞が増加及び活性化して、Ｔ細胞応答或いはＢ細胞応答、又はＴ細胞応答及びＢ細胞応答の両方が増強される、パラグラフ８１、８２又は８３に記載の使用。
９２．ｄｓＲＮＡ組成物により抗原提示細胞が増加して免疫応答が増強される、パラグラフ８１、８２又は８３に記載の使用。
９３．抗原提示細胞はプロフェッショナル抗原提示細胞である、パラグラフ９２に記載の使用。
９４．抗原提示細胞はナイーブ抗原提示細胞である、パラグラフ９２に記載の使用。
９５．抗原は非感染性抗原であり、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞はｄｓＲＮＡによりクロスプライミングされる、パラグラフ８１、８２又は８３に記載の使用。
９６．組成物及び抗原は、粘膜投与、呼吸器投与、静脈内投与、皮下投与及び筋肉内投与から成る群から選択される一によって投与される、パラグラフ８１、８２又は８３に記載の使用。
９７．抗原はイムノグロブリン或いはその一部、或いはイムノグロブリンバックボーンで投与される、パラグラフ８１に記載の使用。
９８．抗原はペプチドエピトープである、パラグラフ９７に記載の使用。
【００１５】
９９．患者における抗原に対する高域寛容を阻止する方法であって、前記抗原をｄｓＲＮＡ組成物と共に投与することを含み、ｄｓＲＮＡ組成物は、ポリアデニン、ポリウラシル、ポリグアニン、ポリシトシン及びポリイノシンから成る群から選択される少なくとも一種の化合物を含む、方法。
１００．抗原は非感染性である、パラグラフ９９に記載の方法。
１０１．抗原は高用量で投与されるか、或いは既に体内に存在している、パラグラフ９９に記載の方法。
１０２．ｄｓＲＮＡは、ｐＡ：ｐＵ及びｐＩ：ｐＣから成る群から選択される、パラグラフ９９、１００又は１０１に記載の方法。
１０３．Ｂ細胞の不応答が阻止される、パラグラフ９９、１００、１０１又は１０２に記載の方法。
【００１６】
１０４．患者にｄｓＲＮＡを投与することを含む、病原体に曝露された患者において免疫系を増強する方法。
１０５．ｄｓＲＮＡはｐＡ：ｐＵ及びｐＩ：ｐＣから成る群から選択される、パラグラフ１０４に記載の方法。
１０６．ｄｓＲＮＡは１００μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で患者に投与される、パラグラフ１０４又は１０５に記載の方法。
１０７．病原体は未知である、パラグラフ１０４、１０５又は１０６に記載の方法。
１０８．ｄｓＲＮＡは医薬的に許容し得る担体に添加されて投与される、パラグラフ１０４、１０５、１０６又は１０７に記載の方法。
１０９．病原体に対するＴ細胞応答が増強される、パラグラフ１０４に記載の方法。
【００１７】
１１０．患者における免疫応答の増強方法であって、Ｉｇバックボーンに結合した抗原の少なくとも一種のペプチドエピトープを用いて抗原提示細胞にロードすることによりＩｇ−ペプチド複合体或いは分子を形成し、ｄｓＲＮＡモチーフと共にＩｇ−ペプチド複合体或いは分子をｉｎ ｖｉｖｏで投与することを含み、エピトープが抗原提示細胞のＭＨＣ経路により効果的にプロセシングされて提示され、その結果、ＭＨＣ分子が効果的にロードされ、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗原への曝露に続くＭＨＣ分子の効果的二次増殖をもたらす、方法。
１１１．ＭＨＣ経路はＭＨＣ Ｉ経路である、パラグラフ１１０に記載の方法。
１１２．ＭＨＣ経路はＭＨＣ ＩＩ経路である、パラグラフ１１０に記載の方法。
１１３．抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の効果的なローディングをもたらす、パラグラフ１１１に記載の方法。
１１４．抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子の効果的なローディングをもたらす、パラグラフ１１２に記載の方法。
１１５．ｄｓＲＮＡはｐＡ：ｐＵである、パラグラフ１１０、１１１又は１１２に記載の方法。
１１６．ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞の二次増殖をもたらす、パラグラフ１１０、１１１又は１１３に記載の方法。
１１７．抗原はウィルスである、パラグラフ１１５に記載の方法。
１１８．ウィルスはインフルエンザウィルスである、パラグラフ１１７に記載の方法。
１１９．抗原は腫瘍関連エピトープである、パラグラフ１１５に記載の方法。
１２０．Ｔ細胞は細胞障害性Ｔリンパ球である、パラグラフ１１５に記載の方法。
【００１８】
１２１．患者において抗原に対して免疫応答を発生させる方法であって、患者にイムノグロブリン或いはその一部を投与することを含み、前記イムノグロブリンは、前記イムノグロブリン或いはその一部に結合した前記抗原の少なくとも一種のペプチドエピトープを有し、前記イムノグロブリン或いはその一部はｄｓＲＮＡセグメントと共に投与される、方法。
１２２．イムノグロブリン或いはその一部と前記ｄｓＲＮＡセグメントとは一緒に投与される、パラグラフ１２１に記載の方法。
１２３．イムノグロブリン或いはその一部と前記ｄｓＲＮＡセグメントとは別々に投与される、パラグラフ１２１に記載の方法。
１２４．前記患者はヒトである、パラグラフ１２１に記載の方法。
１２５．前記患者への前記イムノグロブリン或いはその一部の投与に際して、イムノグロブリン或いはその一部は、抗原提示細胞のＦｃγＲとの結合により抗原提示細胞をロードし、前記ペプチドエピトープが抗原提示細胞のＭＨＣ Ｉ経路により効果的にプロセシングされて提示され、その結果、ＭＨＣクラスＩ分子が効果的にロードされる、パラグラフ１２１に記載の方法。
１２６．ペプチドエピトープは、イムノグロブリン或いはその一部のＣＤＲ領域内で結合している、パラグラフ１２１に記載の方法。
１２７．免疫応答によって、抗原に対する効果的なＴ細胞応答が発生する、パラグラフ１２１に記載の方法。
１２８．Ｔ細胞は細胞障害性Ｔリンパ球である、パラグラフ１２１に記載の方法。
１２９．ｄｓＲＮＡセグメントはｐＡ：ｐＵ及びｐＩ：ｐＣから成る群から選択される、パラグラフ１２１に記載の方法。
１３０．ペプチドエピトープはＴ細胞エピトープである、パラグラフ１２１に記載の方法。
１３１．ペプチドエピトープは、インフルエンザウィルスＭ１或いはＭ２；Ｃ型肝炎ウィルスＮＳ３；Ｂ型肝炎ウィルスコア抗原；ヒトパピローマウィルスＨＰＶ１８−Ｅ７、ＨＰＶ１６−Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ６;メラノーマ−ｇｐ１００；ＭＡＲＴ−１；ＴＲＰ−２；癌胎児抗原前駆体；Ｈｅｒ−２；破傷風毒素ユニバーサルＴヘルパーエピトープ；ＨＩＶ−１：逆転写酵素；ＨＩＶ１：ｇａｇ；インスリン前駆体−ヒト；ヒトＧａｄ６５；前立腺腫瘍抗原；ムチン１；単純ヘルペス抗原；及び呼吸器合胞体ウィルス抗原から成る群から選択される、 パラグラフ１２１に記載の方法。
１３２．イムノグロブリン或いはその一部とｄｓＲＮＡセグメントは、静脈内投与及び大量瞬時投与から成る群から選択される一方法によって投与される、パラグラフ１２１に記載の方法。
１３３．イムノグロブリン或いはその一部とｄｓＲＮＡは医薬的に許容し得る担体に添加されて投与される、パラグラフ１２１に記載の方法。
１３４．ペプチドエピトープに対する有効な記憶応答を誘導する、パラグラフ１２１に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
定義：
次の定義は指針としての役割を意図したものであり、本明細書を通して現れる用語を何ら限定するものではない。
アジュバント−抗原に対する免疫応答の適応力（adaptive arm）を増強する物質。
養子移入−同種ハプロタイプの一動物から他動物への細胞集団の移入。
抗原−免疫系の適応要素（Ｂ細胞、Ｔ細胞、或いはその両方）によって特異的に認識され得る分子。
抗原提示細胞−高効率な免疫賦活能力を有する白血球異質集団。
ＢＡＬＢ／Ｃマウス−広く流通しており、最もよく用いられる近交系マウス。
Ｂ細胞−骨髄で発生するリンパ球の一種。Ｂ細胞の各々は、特定の抗原に特異的な表面レセプターをコードする。特定の抗原を認識する際、Ｂ細胞は増殖して多量の抗体を産生し、一方、産生した抗体はＢ細胞を活性化する抗原へ結合する。
Ｂ細胞不応答−Ｂ細胞による抗原特異的応答の欠如。
ＣＤＲ−相補性決定領域：イムノグロブリンにおける抗原結合部位を生じる超可変領域。３種類のＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）がある。
ケモカイン−少なくとも２５種類の小さなサイトカインからなる群であり、これらサイトカインは全てヘパリンに結合する。
完全フロイントアジュバント−ミコバクテリア細胞壁成分を含む水中油型エマルジョン。
クロスプライム−抗原提示細胞が感染組織から抗原を獲得した後、その抗原を同属Ｔ細胞に提示すること。
樹状細胞−抗原提示細胞のサブタイプの１種（即ち、ＣＤ１１ｃ＋）。
ダウンレギュレーション−特定の化合物や作用の発現や活性を減少させること。
エピトープ−抗体或いはＴ細胞レセプターの抗原結合部位に接触する抗原の部分。
ＦｃγＲ−細胞表面上のＩｇレセプターであり、３種類の認識群（ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））がある。
ヘテロ二量体−２種類のタンパク質配列から成る二量体タンパク質。
高域寛容−特定の抗原に特異的な不応答状態であり、高濃度の前記抗原によるチャレンジの際に誘導される。
ＩＬ−２−インターロイキン２を意味する。
ＩＬ−４−インターロイキン４を意味する。
イムノグロブリン−全ての哺乳類の血清及び組織液に存在する糖タンパク質の群であり、Ｂ細胞の表面に位置し、血液やリンパ液中で自由に抗体として作用する。次の５種類のイムノグロブリンクラスが存在する。ＩｇＧ（７０〜７５％）、ＩｇＭ（１０％）、ＩｇＡ（１５〜２０％）、ＩｇＤ（＞１％）、及びＩｇＥ（全ての個体の好塩基球及びマスト細胞上に存在する）。ＩｇＧには４種類のヒトサブクラスがある（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）。
イムノグロブリンバックボーン−イムノグロブリン分子或いはその一部を意味し、少なくとも１個のＣＤＲ領域は挿入されたペプチドエピトープを受け取ることができる。
イムノグロブリンアイソタイプスイッチング−Ｂ細胞を刺激して、一イムノグロブリンアイソタイプから他イムノグロブリンアイソタイプへと産生を切り換えること。
不完全フロイントアジュバント−ミコバクテリア細胞壁成分を含まない水中油型エマルジョン。
自然免疫−自然免疫系は、抗原特異性を欠くが後天性免疫をガイドする能力を有する、広範で比較的に非特異的な宿主防御を提供する。自然免疫に関与する細胞種としては、樹状細胞やマクロファージがある。
腹腔内に−腹膜腔（peritoneal cavity）内に
静脈内に−脈管構造（vasculature）内に
アイソフォーム−タンパク質のグリコシル化やリン酸化、脱アミド、或いは他の翻訳後修飾による各種分子形。
ＩＴＡＭ−イムノレセプターチロシンベースの活性化モチーフ。
ＩＴＩＭ−イムノレセプターチロシンベースの抑制モチーフ。
マクロファージ−骨髄の単球幹細胞由来の単核活性食細胞。
ＭＨＣ−主要組織適合性複合体を意味する。
修飾された免疫応答−増強或いは減少された免疫応答。
単球−リンパ節、脾臓、骨髄及び疎性結合組織に存在する単核白血球。
ナイーブ−非分化不活性化細胞。
ペプチド−ペプチド結合により互いに結合した２種以上のアミノ酸から成る化合物。
ポリヌクレオチド−ヌクレオチドのポリマー
プロフェッショナル抗原提示細胞−成熟しており、抗原エピトープを提示できる。
増加（recruitment）−細胞集団を炎症部位へ誘引すること。
二次増殖−特定の抗原への２回目以降の接触に引き続く免疫応答
自己抗原−宿主由来の抗原
皮下に−皮膚の下に
Ｔｃ１免疫−細胞障害性Ｔ細胞タイプ１、ＣＤ８＋。
Ｔｈ１細胞−細胞仲介炎症反応に関与するＴヘルパー１細胞であり、ＩＦＮγ、ＴＮＦβ及びＩＬ−２の産生により同定される。
Ｔｈ２細胞−抗体の産生を促進するＴヘルパー２細胞であり、ＩＬ−４及びＩＬ−５の産生により同定される。
Ｔｈ３細胞−Ｔヘルパー調節細胞であり、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βを産生することで知られる。
ＴＲ１細胞−Ｔ調節細胞であり、インターロイキン１０を産生することで知られる。
アップレギュレーション−特定の化合物や作用の発現や活性を増強させること。
【００２０】
材料及び方法
抗原提示細胞サブセットの選択的ｉｎ ｖｉｖｏローディング用に、図１Ａで概略的に示した化合物を用いた。（Ａ）は天然ＩｇＧ（Ｌ鎖−Ｈ鎖ヘテロ二量体）、（Ｂ）は抗原（Ａｇ）由来ペプチドをＣＤＲ３、ＣＤＲ２、ＣＤＲ１或いは枠組み領域に挿入したもの、（Ｃ）はＶＨセグメントを抗原或いは断片で置換したもの、（Ｄ）はＶＨセグメントとＣＨ１セグメントを抗原或いは抗原断片で置換したものを示す。この種の分子は、当該技術分野で知られた方法を用い、次に記載したように設計される。
【００２１】
モデル組換えＩｇＧの構築
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）突然変異誘発を用いて、ＶＨ鎖のＣＤＲ３領域を上述のエピトープで置換した。即ち、マウス抗アルソネート抗体（９１Ａ３）のＶＨ遺伝子を保有する５．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を宿したｐＵＣ１９プラスミドを２種類のＰＣＲにおいて鋳型ＤＮＡとして用い、相補性決定領域３’（ＣＤＲ３）ループの多様性セグメント（Ｄ）を除去し、各種抗原エピトープをコードするＤＮＡ断片を挿入した。次いで、ＥｃｏＲＩダンシル（ｄｎｓ）接合ＶＨ遺伝子を切り出したプラスミドｐＳＶ２ΔＨｇｐｔＤＮＳＶＨ-ｈＣγ１内で、これらキメラＶＨ遺伝子と野生型ＶＨ遺伝子とをＩｇγ１のＨ鎖定常領域に結合した。ＶＨ及び挿入エプト−プの配列はＤＮＡ配列決定によって確認した。これらキメラＩｇＧをマウス９１Ａ３ＶＨ−ヒトＣγ１Ｈ鎖遺伝子及びマウス−ヒトキメラｋＬ鎖遺伝子と共に発現させるために、マウス９１Ａ３κＬ鎖遺伝子全体をコードする８ｋｂのＢａｍＨＩ断片をｐＵＣ１９プラスミドのＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。次いで、κＬ鎖プロモーターとＶκ領域コード配列とを有するＨｉｎｄＩＩＩ断片をこのプラスミドから切り出し、ｄｎｓ接合Ｖｋ（ｄｎｓＶｋ）を切除したヒトｋＬ鎖Ｃ領域（Ｃｋ）をコードする遺伝子のｐＳＶ１８４ΔＨｎｅｏＤＮＳＶｋ−ｈＣｋ上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングした。マウス９１Ａ３Ｖｋ−ヒトＣｋＬ鎖をコードするこのプラスミドを「ｐＳＶ１８４Δｈｎｅｏ９１Ａ３Ｖｋ−ｈＣｋ」と称する。
【００２２】
ヒト組換えＩｇＧの構築
ヒトＩｇＧバックボーンは、ＲＴ−ＰＣＲによってＩｇＧＡ１骨髄腫細胞株から得た。上述のエピトープを挿入することによって組換えヒトＩｇＧをクローニングし、ヒトＩｇＧ１バックボーンのＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を置換した。即ち、ＰＣＲ突然変異誘発によってＴ細胞エピトープを産生し、ＣＤＲ２／ＣＤＲ３領域にサブクローニングした。次いで、組換えＨ鎖をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ部位によってｐＭＧベクター（インヴィヴォゲン社（Invivogen）、カリフォルニア州サンディエゴ）にサブクローニングした。Ｈ鎖の発現はｈＣＭＶプロモーターによって制御した。これと平行して、ヒトκＬ鎖をＳｔｕＩ及びＮｈｅＩ部位によってｐＭＧベクターにサブクローニングした。Ｌ鎖の発現はＥＦ−１α及びＨＴＬＶ−１ ＬＴＲハイブリッドプロモーターによって制御した。次いで、組換えＨ鎖とＬ鎖の両方を保有する二重発現ベクターを発現細胞株にトランスフェクトした。
【００２３】
Ｆｃ−ペプチドは、ＶＨ及びＣＨ１断片を切断し、上述のウィルス抗原或いは腫瘍抗原（８〜１５０Ａａｓ）で置換することによって構築した。即ち、ヒトＩｇＧ１Ｈ鎖をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位によってｐＣＤＮＡ３ベクターにサブクローニングした。次いで、ＰＣＲ突然変異誘発によって、ＩｇＧ１のリーダー配列とヒンジ領域との間に上述の抗原を挿入した。融合抗原の柔軟性（flexibility）を上げるために、オリゴ−グリシンリンカー（５グリシン）を抗原挿入後に添加した。ヒトＩｇＧ組換え分子の発現は、図１Ｂに示した戦略のいずれか一方を用いて行うことができる。
【００２４】
ヒトＩｇＧバックボーンは、ＦｃγＲへ結合する能力や各種状態における補体及びサイトカイン活性化に基づいて合理的に選択される。選択されたヒトＩｇＧバックボーンの特性を図１Ｃに示し、Ｈ鎖の定常領域の配列及び予定構築物（prospective construct）の概略を図１Ｄに示す。
【００２５】
モデル組換えＩｇＧに用いたエピトープを図１Ｅに示す（マウスＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＨＡエピトープ及びマウスＭＨＣクラスＩ拘束性ＮＰエピトープ）。組換え構築物の名称はｒｅｃＩｇＧ−エピトープ（ＨＡ或いはＮＰ）−拘束エレメント（Ｉ−Ｅｄ或いはＫｄ）である。即ち、ＩｇＨＡ或いはＩｇＮＰと称することができる。所定のマウス自己エピトープ（ＭＢＰ或いはＰＬＰ由来）を含むモデル分子を同様に構築した。バックボーンとして用いた抗アルソネート抗体のＨ鎖の可変領域の配列を図１Ｅに示す。この構築技法は当該技術分野ではよく知られており（ザグホウアニ（Zaghouani）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３年１月 ８；２５９（５０９２）：２２４〜７）、この文献の内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【００２６】
図１Ｅ〜１Ｍには、バックボーンに挿入し得る（一以上のエピトープにまたがる最大１５０ＡＡの大きな部分）或いは結合し得る抗原やエピトープ（ボールド体で示す）の例を示す。図示の抗原／エピトープを含むこのような構築物は、感染性疾患や腫瘍性疾患に対する医薬として用いることができる。図１Ｉには、ＨＬＡ−Ａ２アンカーモチーフを示す。このモチーフによって、潜在的に治療的な細胞障害性エピトープのタンパク質内での位置を予測することが可能となり、組換えイムノグロブリンに用いる抗原断片の選択が容易になる。
【００２７】
図１Ｊには、「ユニバーサル」Ｔヘルパーエピトープ（クマー（Kumar）ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２年３月 １；１４８（５）：１４９９〜５０５）の例を示す。このエピトープは、ＭＨＣ拘束性の観点から優性且つ乱交雑（promiscuous）であり、ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープに対する免疫を誘導或いは増強する目的で、［抗原断片］−［ユニバーサルＴｈエピトープ］−Ｆｃ（ＩｇＧ）等の化合物を利用して複合分子を構築するために用いることができる。
【００２８】
このような構築物の例を図１Ｋ（下段）に概略的に示す。
【００２９】
図１Ｋの上段には、ボールド体で示すエピトープを有するヒト自己抗原の例を示す。この自己抗原は、自己免疫／炎症性障害に対する組換えＩｇＧ分子を発生させるために用いることができる。
【００３０】
図１Ｌ及び１Ｍには、上述のイムノグロブリン構築物の構築に用いることのできる他の抗原配列を示す。所望の抗原断片は、ＭＨＣクラスＩエピトープを予測する方法（リム（Lim）ら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６年２月；３３［２］：２２１〜３０）を用いて規定することができる。
【００３１】
組換えＩｇＧの産生
ＳＰ２／０細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を用いて、本特許出願に記載の組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）全てを産生する。安定な発現細胞株（即ち、トランスフェクトーマ）は、抗ヒ酸塩マウスＩｇＧのＨ鎖及びＬ鎖をコードするプラスミドを用いた二重トランスフェクションプロトコルを用いて産生した。各トランスフェクトーマはＨ鎖のＣＤＲ３領域の配列のみが異なっている。細胞株の増殖方法、及び本願に記載の実験に用いる各種精製ｒＩｇＧの産生方法は全てのケースで同じである。
【００３２】
ＳＰ２／０トランスフェクトーマは、先ず、５％（ｖ／ｖ）の熱不活化ウシ胎児血清、０．５ｍｇ／ｍＭのゲンタマイシン及び２．５μｇ／ｍＬのＦｕｇｉｚｏｎｅを添加したＱｕａｎｔｕｍ Ｙｉｅｌｄ 培地（ＢＤバイオサイエンス社）で増殖した。培養は加湿ＣＯ２インキュベータ内で３７℃に維持して行った。各細胞株を市販の各種無血清培地（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ ２（クローンティクス社（Clonetics）；Ｃｅｌｌ ＭＡｂ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ（ＢＤバイオサイエンス社；及びＡｎｉｍａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｆｒｅｅ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉａ（ＢＤバイオサイエンス社））での増殖に適応させるよう努力した。各無血清培地を上述の抗生物質を添加した。分泌されたＩｇＧを含む培養液を上述の各培地から産生した。この実験中（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量解析（後述する）、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、及びマウスにおける免疫応答）、各培地で産生したＩｇＧ間に違いは見られなかった。
【００３３】
分泌されたｒＩｇＧ量はＥＬＩＳＡを用いて測定した。捕獲抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ（シグマ社）、二次抗体として抗マウスＩｇＧ ＨＲＰコンジュゲート（シグマ社）を用いた。精製マウスＩｇＧ（シグマ社）を標準品として用いた。
【００３４】
４種類の方法（フラスコ、撹拌容器、パックド・ベッド・バイオリアクター（ニュー・ブルンスウィック・セラゲン社（New Brunswick Cellagen）、ＣＥＬＬｉｎｅフラスコ（ＢＤバイオサイエンス社））を用いて、各種ｒＩｇＧを含む培地（即ち、条件培地「ＣＭ」）を産生した。フラスコに産生したＣＭの場合、週に２回、細胞をフィード及び／又は回収し、生存度を少なくとも５０％に維持したが、生存度は通常７０％よりも高かった。回収した培地をろ過し４℃で維持した。撹拌容器（１Ｌ）の場合、２００ｍＬの開始量（starting volume）に１０⁶個／ｍＬの細胞を播種した。トータル量が８００ｍＬに達するまで細胞数を１０⁷個〜１０⁶個／ｍＬに維持するように培地を毎週添加した。この時点で細胞生存度を求め（通常８０％より高かった）、生存度が５０％より低くなるまで実験を継続した。次いで、培地を回収し、滅菌ろ過して細胞を除去し４℃で維持した。パックド・ベッド・バイオリアクターの場合、各ユニットにおいて４００ｍＬの培地に約１０⁸個の細胞を播種し、常に撹拌しながらＣＯ₂インキュベーター内で３７℃で維持し、培地を３〜４日毎に変えてＣＭを上述のようにろ過し、ＣＭ中のｒＩｇＧの産生をＥＬＩＳＡでモニターした。バイオリアクター実験は、ｒＩｇＧの産生が低下し始めるか、或いは容器が汚染されるまで継続した。１ＬのＣＥＬＬｉｎｅフラスコは製造者の指示に従って用いた。各フラスコにおいて、細胞区画（cell compartment）ではトータル量４０ｍＬに１０⁷〜１０⁸個の細胞を播種し、１Ｌの培地をフィード区画（feed compartment）に添加し、２〜３週間後、或いは細胞の生存度が２０％より低くなった時点で細胞区画からＣＭを回収した。
【００３５】
ｒＩｇＧの精製
上述の方法で産生したｒＩｇＧは２種類の方法の一方で精製した。ＦＢＳを含むＣＭの場合、抗マウスＩｇＧ免疫親和性樹脂を用いた。この免疫親和性樹脂は次のプロトコルを用いて合成した。１０ｍＬの臭化シアン活性化セファロース４Ｂ（シグマ社）を製造者の指示に従って１ｍＭのＨＣｌで洗浄し、１０〜２０ｍｇのヤギ抗マウスＩｇＧ（シグマ社）をカップリング緩衝液（０．１Ｍ 炭酸ナトリウム［ｐＨ８．４］／０．５Ｍ ＮａＣｌ）に２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、このＩｇＧ溶液を洗浄した樹脂に添加し、得られたスラリーを室温で回転させながら（end-over-end）混合し、カップリングの程度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いてモニターし、残存する可溶性ＩｇＧの量を求め、可溶性ＩｇＧの量が開始濃度の１０％未満になった時点（約４５分）でエタノールアミンを最終濃度が１０ｍＭとなるように添加することによりカップリングを終了させた。次いで、免疫親和性樹脂を次の緩衝液（ＰＢＳ、１０ｍＭ グリシン（ｐＨ２．４）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）、ＰＢＳ）で洗浄した。得られた樹脂をＰＢＳ中に４℃で保存した。ｒＩｇＧをこの樹脂で精製するためのプロトコルは、ＣＭをカラムに１〜２ｍＬ／分で通過させることによって開始した。次いで、この樹脂を非結合タンパク質が存在しなくなるように次のプロトコル（１００ｍＬのＰＢＳ／０．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄後、５０ｍＬの１ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）で洗浄）を用いて洗浄した。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて各画分のタンパク質をモニターした。特異的に結合したｒＩｇＧを低ｐＨ緩衝液（５ｍＭ グリシン（ｐＨ２．４）／０．５Ｍ ＮａＣｌ）で溶出させた。溶出したタンパク質を回収し、４℃で維持して更なる処理（後述する）に備えた。
【００３６】
無血清培地で産生したｒＩｇＧはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。通常、５ｍＬのｒプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦ、アマシャムファルマシアバイオテック社）をＰＢＳで平衡化し、ＦＰＬＣユニット（ファルマシア社）を用いてサンプルをカラムに２ｍＬ／分で通過させた。樹脂を非特異的結合タンパク質が存在しなくなるようにＰＢＳで洗浄した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）／１Ｍ ＮａＣｌで洗浄し、次いで水で洗浄した。特異的に結合したｒＩｇＧを１ｍＭ グリシン（ｐＨ２．４）で溶出させた。溶出したピークを回収し、４℃で維持して更なる処理に備えた。
【００３７】
一般に、各ｒＩｇＧ画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ限外ろ過ユニット（アミコン社）を用いて最終濃度が１〜４ｍｇ／ｍＬ（標準品としてＩｇＧを用いたＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによる）となるまで濃縮した。次いで、濃縮した画分を１ｍＭ グリシン（ｐＨ２．４）に透析し、１ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ溶液に対し吸光係数１．４を用いたＡ₂₈₀によって最終濃度を求め、１００μＬの画分に等分し、−８０℃のフリーザーで保存した。精製したｒＩｇＧは、構造的完全性及び純度についてＳＤＳゲル電気泳動により解析した。ゲルはクーマシーブルー（ピアースケミカル社（Pierce Chemical））で染色した。全ての場合において、上述の実験で用いたｒＩｇＧは、タンパク質標準品や対照ＩｇＧと比べて予想される分子量（分子量の低下及び非低下）を示した。一般に、精製したｒＩｇＧの純度は９５％より高かったが、この純度は、染色されたバンドを目視検査し、同じゲル上で電気泳動させた濃度既知の対照ＩｇＧのバンドと比較することにより求めた。
【００３８】
ＲＮＡセグメント
本発明の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）或いは一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）セグメントは、次の方法に従って作成することができる（また、市販されている）。１）ｓｓＲＮＡ：ポリヌクレオチド（ポリＡ、ポリＵ）は、ヌクレオチドとポリヌクレオチド−ホスホリラーゼを用い酵素的に調製されるが、調製プロセスには動物由来の材料は入らない。２）ｄｓＲＮＡ：ポリアデニル酸（ポリＡ、即ちｐＡ）をポリウリジル酸（ポリＵ、即ちｐＵ）と共にアニールする。
【００３９】
一般に、本発明のｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡはホモポリマーであり、ｄｓＲＮＡの場合は、単一の塩基或いはヌクレオチド（例えば、アデニン）が一本の鎖を一貫して形成し、その補体が他の鎖を一貫して形成する。ｓｓＲＮＡの場合、一本鎖は同一のヌクレオチドで一貫して形成される。しかし、混合ヌクレオチド（ｄｓＲＮＡの場合はその補体と共に或いは補体無しで）で構成されたｄｓＲＮＡ或いはｓｓＲＮＡ組成物を使用することは、本発明の範囲内である。例えば、非相補的ヌクレオチド（グアニンやシトシン、イノシン等）によって置換されることもあるポリＡ：ポリＵ ｄｓＲＮＡセグメント。本発明のｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡ組成物は、塩基／ヌクレオチドであるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、及びイノシン（Ｉ）を含み、また、ＤＮＡ塩基であるチミン（Ｔ）を数パーセント含むこともある。表Ｉ及び図８ＡのＲＮＡ組成物は、実施例で用いられる各種ＲＮＡ組成物を説明するものである。本発明のＲＮＡ組成物は、実施例３０において調製され精製された。
【００４０】
本発明で用いる各種ＲＮＡ鎖は、一般に長さが１００〜２０００の塩基対であるが、１〜２０、２０〜４０、４０〜６０、６０〜８０、８０〜１００、１〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、８００〜９００、１０００〜１１００、１１００〜１２００、１２００〜１３００、１３００〜１４００、１４００〜１５００、１５００〜１６００、１６００〜１７００、１７００〜１８００、１８００〜１９００、１９００〜２０００、２０００〜２１００、２１００〜２２００、２３００〜２４００、２４００〜２５００、２５００〜３０００、３０００〜４０００、４０００〜５０００、５０００〜１００００の塩基対であってもよく、また長さが１００００より長い塩基対及び／又はそれらの混合物であってもよい。
【実施例】
【００４１】
実施例１では、Ｔ細胞エピトープを含むペプチドの活性を制限する重要な因子は、ＡＰＣのｉｎ ｖｉｖｏローディングの減少をもたらす不十分な薬物動態（poor pharmacokinetics）であることを示す。
ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス一個体の脾臓組織から抗原提示細胞（ＡＰＣ）を得た。洗浄後、３００万個のＡＰＣを１３．５ｎＭのＨＡ１１０−１２０ペプチドと共に１ｍＬのＨＬ−１培地中で３７℃で３時間インキュベートした。得られた細胞を洗浄し、細胞接種物（inoculi）を３等分し、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス三個体に注射投与した（半分は皮下投与で、もう半分は腹腔内投与）。２週間後、マウスを殺し、ＨＡ１１０−１２０ペプチドに対する免疫応答を次の通りＥＬＩＳＰＯＴ分析により測定した。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、フランス、モールスハイム）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に溶解した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ２及び抗ＩＬ４に対しては４μｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮγに対しては８μｇ／ｍＬ、ＢＤファーミンジェン社製）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地により３７℃で１時間ブロッキングした。脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、５×１０⁵個／ウェルで２０μｇ／ｍＬのＨＡ１１０−１２０ペプチドと共にインキュベートし、或いは培地のみでインキュベートしてバックグラウンドを評価した。
【００４２】
プレートは３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、ビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（２μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％−ＦＢＳ ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）に溶解したもの（１００μＬ／ウェル）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）によって開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次いで、プレートを室温で２４時間乾燥させた。データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリング）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）を用いて得た。これと並行して、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス３個体の各々に、無菌ＰＢＳに溶解したＨＡペプチド（４．５ｎＭ）を注射投与した（半分は皮下投与で、もう半分は腹腔内投与）。２週間後、マウスを殺し、ＥＬＩＳＰＯＴ分析によってＴ細胞応答を上述のように特徴付けた。
【００４３】
図２（Ａ）には実験プロトコルを示す。図２（Ｂ）には、実験結果を、バックグラウンドを差し引いた後の脾臓１個当りのＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＩＬ−４スポット形成コロニー数として示した（平均±ＳＥＭ）。「ＨＡ−ＡＰＣ」は養子移入前にｅｘ ｖｉｖｏでロードした抗原提示細胞（樹状細胞）を示す。また、「ＨＡ」はマウスに直接注射投与したペプチドを示す。
【００４４】
図２Ａ〜２Ｂに示した結果から、生理食塩水に溶解したペプチドエピトープの注射投与は免疫原性ではなかったが、ＡＰＣのｅｘ ｖｉｖｏローディングに用いたペプチドの同様の投与によって、養子移入の際、相当の免疫応答が効果的に引き起こされたことが分かった。この結果は、ペプチドを直接注射投与した場合、ＡＰＣ（即ち、免疫応答を効果的に誘導するための必須条件）にはペプチドが効果的に到達しないことを示す。
【００４５】
実施例２では、ＩｇＧ内のペプチドエピトープの組み込み（incorporation）によってその薬物動態プロファイルが改善されたことを示す。
ＢＡＬＢ／ｃ Ｓｃｉｄマウス（３匹／群）に６０ｎＭのＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥ（ＨＡ）［配列番号５］ペプチド或いは２．４ｎＭのｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧ（「Ｉｇ−ＨＡ」）を静脈内注射投与し、様々な間隔で血液を回収した。血清を即座に分離し、−７０℃で急速に冷凍した。その後、血清サンプルを、２×１０⁴細胞／ウェル／５０μＬのＨＡ特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ（ＴｃＨ）及び１×１０⁴細胞／ウェル／５０μＬのＭ１２Ｂ細胞リンパ腫ＡＰＣと共に、無血清ＨＬ−１培地中、３７℃、５％ＣＯ₂で２４時間インキュベートした。翌日、プレートを１５分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した後、上清をはじき飛ばし（flicked）、新しく作成した冷固定液（１×ＰＢＳにホルムアルデヒド２％とグルタルアルデヒド０．２％を溶解したもの）で細胞を固定し、プレートを再度、３分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した。固定液をプレートからはじき飛ばし（flicked off）、細胞をＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で１回洗浄し、プレートを３分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した。ＰＢＳをプレートからはじき飛ばし（flicked off）、細胞を、次の通り新しく調製したＸ−ｇａｌ基質（Ｘ−ｇａｌをＤＭＳＯに溶解（４０ｍｇ／ｍＬ）して得たＸ−ｇａｌ保存液（２００μＬ）を１０ｍＬの基質緩衝液（１×ＰＢＳに５ｍＭのフォロシアン化カリウム、５ｍＭのフェリシアン化カリウム、及び２ｍＭのＭｇＣｌ２を溶解して調製）に溶解して調製）（２００μＬ／ウェル）と共に３７℃で一晩インキュベートした。青色の活性化したＴｃＨを顕微鏡を用いて視覚的に記録した。
【００４６】
ＴｃＨの活性化は注射投与後時間の関数として表わした。エピトープは、ｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧを注射投与したマウスの場合にのみ、約１日の間隔で血液中に検出された。これに対し、ＨＡペプチドをそのまま注射投与した場合、大過剰モル濃度（２５倍）で用いたにも拘らず、末梢では検出されなかった。
【００４７】
このように、図３に示す結果から、Ｉｇバックボーン内でのエピトープの輸送は、体循環でのその安定性を非常に好むことが分かる。
【００４８】
実施例３では、Ｔ細胞エピトープを含むペプチドは、血清の存在下でＡＰＣによって特定のＴ細胞に効果的に提示されないこと、また、この現象がＩｇＧバックボーン内のペプチドエピトープの組み込みによって矯正されることを示す。
図４（Ａ）は、血清がＴ細胞エピトープペプチドの提示に及ぼす悪影響について示したものである。Ｍ１２ Ｂ細胞リンパ腫ＡＰＣを、無血清ＨＬ−１培地（「ＨＡ＋ＨＬ−１」）或いはＢＡＬＢ／ｃ ｓｃｉｄマウス由来のマウス血清２０％を添加したＨＬ−１培地（「ＨＡ＋血清」）中で、様々な量のＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥ（ＨＡ）ペプチドの存在下、ＴｃＨと共にインキュベートした。インキュベートした細胞の数は、血清添加ＨＬ−１培地或いは血清添加無しのＨＬ−１培地１００μＬ当り２×１０⁴Ｍ１２及び１×１０⁴ＴｃＨであった。翌日、プレートを１５分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した後、上清をはじき飛ばし（flicked）、新しく作成した冷固定液（１×ＰＢＳにホルムアルデヒド２％とグルタルアルデヒド０．２％を溶解したもの）で細胞を固定し、プレートを再度、３分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した。固定液をプレートからはじき飛ばし（flicked off）、細胞をＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で１回洗浄し、プレートを３分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した。ＰＢＳをプレートからはじき飛ばし（flicked off）、細胞を、次の通り新しく調製したＸ−ｇａｌ基質（Ｘ−ｇａｌをＤＭＳＯに溶解（４０ｍｇ／ｍＬ）して得たＸ−ｇａｌ保存液（２００μＬ）を１０ｍＬの基質緩衝液（１×ＰＢＳに５ｍＭのフォロシアン化カリウム、５ｍＭのフェリシアン化カリウム、及び２ｍＭのＭｇＣｌ２を溶解して調製）に溶解して調製）（２００μＬ／ウェル）と共に３７℃で一晩インキュベートした。青色の活性化したＴｃＨを顕微鏡を用いて視覚的に記録した。
【００４９】
血清は、免疫原性ＭＨＣ−ペプチド複合体の形成及び／又は提示に対し負の干渉を示した。
【００５０】
図４Ｂ：血清は、免疫原性ＭＨＣ−ペプチド複合体の形成及び／又は提示に対し負の干渉を示した。
【００５１】
この現象は、先ず、ペプチド（ＨＡペプチド）或いはｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧ（「ＩｇＨＡ」）をＡＰＣ或いは血清と共に逐次的にインキュベートし、１時間後に、ＴｃＨと血清、或いはＡＰＣとＴｃＨを添加することによって更に検討した。血清を添加せずに抗原と共にインキュベートした細胞を対照とする（Ｃｔｒｌ）。インキュベートした細胞の数は、血清添加ＨＬ−１培地或いは血清添加無しのＨＬ−１培地１００μＬ当り２×１０⁴Ｍ１２及び１×１０⁴ＴｃＨであった。翌日、プレートを１５分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した後、上清をはじき飛ばし（flicked）、新しく作成した冷固定液（１×ＰＢＳにホルムアルデヒド２％とグルタルアルデヒド０．２％を溶解したもの）で細胞を固定し、プレートを再度、３分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した。固定液をプレートからはじき飛ばし（flicked off）、細胞をＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で１回洗浄し、プレートを３分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した。ＰＢＳをプレートからはじき飛ばし（flicked off）、細胞を、次の通り新しく調製したＸ−ｇａｌ基質（Ｘ−ｇａｌをＤＭＳＯに溶解（４０ｍｇ／ｍＬ）して得たＸ−ｇａｌ保存液（２００μＬ）を１０ｍＬの基質緩衝液（１×ＰＢＳに５ｍＭのフォロシアン化カリウム、５ｍＭのフェリシアン化カリウム、及び２ｍＭのＭｇＣｌ２を溶解して調製）に溶解して調製）（２００μＬ／ウェル）と共に３７℃で一晩インキュベートした。青色の活性化したＴｃＨを顕微鏡を用いて視覚的に記録した。
【００５２】
結果は、ｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅ^d）−ＩｇＧ（「ＩｇＨＡ」）（２μｇ／ｍＬ）或いはＨＡペプチド（４０μｇ／ｍＬ）（組換えＩｇに対して１０００モル過剰）の濃度における活性化Ｔ細胞（β−ｇａｌ⁺ＴｃＨ）／ウェルの百分率で示した。
【００５３】
図４に示した結果から、ペプチドを血清と共にプリインキュベートすることによってＴｃＨ活性化が低下することが分かる。ＡＰＣパルシング後の血清の添加はＴｃＨ活性化に影響を及ぼさなかった。一方、ＭＨＣ−ペプチド複合体の形成は、ペプチドを単独で用いる代わりにペプチドを保有する組換えイムノグロブリンを用いた場合、血清によって妨害されなかった。
【００５４】
実施例４では、ＩｇＧバックボーン内のＴ細胞ペプチドエピトープの組み込みによってＡＰＣによるエピトープの特定のＴ細胞への提示が改善され、その割合はＡＰＣの特性に依存することを示す。
図５Ａに示すように、脾臓由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）上でのＭＨＣ−ペプチド複合体のｅｘ ｖｉｖｏ形成は次の通りに測定した。抗ＭＨＣＩＩ抗体を用いた磁気選別（magnetic sorting）により脾臓ＡＰＣを単離した。抗ＭＨＣＩＩ抗体に結合した磁気ビーズを用いた分離は、磁気細胞セパレータ及びミルテニイバイオテック社（ドイツ）から入手した試薬を用い、次の通り行った。脾臓を処理して単一細胞浮遊液を調製し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、ＭＡＣＳ緩衝液（２ｍＭのＥＤＴＡと０．５％のＢＳＡを添加したＰＢＳ）に再懸濁した。磁気標識された細胞を、ＭＡＣＳセパレータの磁場に設置した分離カラムに通した。磁気標識されたポジティブ画分はカラム内に保持されるが、ネガティブ画分はカラムを通過する。カラムを磁場から移動させた後、磁気的に保持されたポジティブ細胞をカラムから溶出させ、細胞を洗浄、計数後、ＨＬ１完全培地に再懸濁し、様々な量のＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥ（ＨＡ）ペプチド或いはｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧ（「ＩｇＨＡ」）の存在下、Ｉ−Ｅ^d＋ＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥを認識する特定のＴ細胞ハイブリドーマと共に、一晩インキュベートした。ウェル１個当り、２×１０⁴個のＡＰＣを１×１０⁴個のＴｃＨと共にインキュベートした。翌日、プレートを１５分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した後、上清をはじき飛ばし（flicked）、新しく作成した冷固定液（１×ＰＢＳにホルムアルデヒド２％とグルタルアルデヒド０．２％を溶解したもの）で細胞を固定し、プレートを再度、３分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した。固定液をプレートからはじき飛ばし（flicked off）、細胞をＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で１回洗浄し、プレートを３分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した。ＰＢＳをプレートからはじき飛ばし（flicked off）、細胞を、次の通り新しく調製したＸ−ｇａｌ基質（Ｘ−ｇａｌをＤＭＳＯに溶解（４０ｍｇ／ｍＬ）して得たＸ−ｇａｌ保存液（２００μＬ）を１０ｍＬの基質緩衝液（１×ＰＢＳに５ｍＭのフォロシアン化カリウム、５ｍＭのフェリシアン化カリウム、及び２ｍＭのＭｇＣｌ２を溶解して調製）に溶解して調製）（２００μＬ／ウェル）と共に３７℃で一晩インキュベートした。青色の活性化したＴｃＨを顕微鏡を用いて視覚的に記録した。活性化したＴｃＨの数を測定し、結果をエピトープのモル量に対する活性化として示した。
【００５５】
（Ｂ）上述同様のプロトコルをＭ１２Ｂ細胞リンパ腫ＡＰＣに適用した。
図５Ｂに示す結果から、ＭＨＣ−ペプチド複合体形成の相対効率は、抗原及びＡＰＣの性質によって大幅に変化することが分かる。モル基準で見ると、ＩｇＧバックボーン内のペプチドエピトープは、遊離ペプチド自身と比べて、リンパ器官由来のＭＨＣＩＩ＋ＡＰＣによって１０倍効果的に処理され、形質転換Ｂ細胞リンパ腫細胞によって１０００倍効果的に処理される。このように、エピトープの細胞ハンドリングとＩｇＧ内輸送に引き続くＭＨＣ−ペプチド複合体の形成とは、ＡＰＣの性質によって大幅に変化する。
【００５６】
実施例５では、Ｔ細胞エピトープ含有ペプチドのＦｃγＲ仲介輸送によって、より効果的な細胞ハンドリングと含有プロフェッショナルＡＰＣ数が少ない細胞集団（末梢白血球）による提示とがもたらされることを示す。
（Ａ）ＡＰＣを定量化するため、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール勾配遠沈によりＢＡＬＢ／ｃマウスから分離し、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ及びＢ２２０発現用ＦＡＣＳ分析を行った。結果を、血液中及びプロトタイプ二次リンパ器官（脾臓）内のＡＰＣとＴ細胞の百分率として図６Ａに示す。プロフェッショナルＡＰＣ（ＣＤ１１ｃ＋細胞等）の数は、脾臓と比べて血液中では大幅に（２ｌｏｇ）減少している。Ｂ２２０＋細胞及びＣＤ１１ｂ＋細胞も同様に（１桁（1 order of magnitude））減少した。次の材料及び方法を用いた。
【００５７】
材料：
フィコール：フィコール−ハイパーク（Ficoll-hypaque）（１．０７７、アマシャム社、カタログ番号１７−１４４０−０２）
抗体：ＣＤ１１ｂ（カタログ番号０１７１５Ａ）、ＣＤ１１ｃ（カタログ番号５５７４０１）、Ｂ２２０（カタログ番号０１１２５Ａ）、全てＰＥコンジュゲート（ＢＤファーミンジェン社）
フローサイトメータ：ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）
ＦＡＣＳ緩衝液：ＰＢＳ、１％ＦＣＳ、０．１％アジ化ナトリウム
【００５８】
方法：
１．動物の血液を回収し、単核細胞をフィコール勾配遠沈により分離した。
２．細胞を懸濁させ、蛍光タグ化抗マウスＣＤ−１１ｃ、ＣＤ１１ｂ或いはＢ２２０（２μｇ／ｍＬ）で２０分間、氷上で標識した。
３．細胞を１回洗浄し、３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。
４．フローサイトメトリー分析を行い、各特定抗体で標識した全細胞集団の画分を測定した。
【００５９】
（Ｂ）ＰＢＭＣをＡＰＣとしてＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥ（ＨＡ）特異的ＴｃＨと共に、同族ペプチド或いはｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧの存在下で用いた。細胞を２４時間同時インキュベートした（２×１０⁴個のＡＰＣ＋１×１０⁴個のＴｃＨ）。翌日、プレートを１５分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した後、上清をはじき飛ばし（flicked）、新しく作成した冷固定液（１×ＰＢＳにホルムアルデヒド２％とグルタルアルデヒド０．２％を溶解したもの）で細胞を固定し、プレートを再度、３分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した。固定液をプレートからはじき飛ばし（flicked off）、細胞をＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で１回洗浄し、プレートを３分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した。ＰＢＳをプレートからはじき飛ばし（flicked off）、細胞を、次の通り新しく調製したＸ−ｇａｌ基質（Ｘ−ｇａｌをＤＭＳＯに溶解（４０ｍｇ／ｍＬ）して得たＸ−ｇａｌ保存液（２００μＬ）を１０ｍＬの基質緩衝液（１×ＰＢＳに５ｍＭのフォロシアン化カリウム、５ｍＭのフェリシアン化カリウム、及び２ｍＭのＭｇＣｌ２を溶解して調製）に溶解して調製）（２００μＬ／ウェル）と共に３７℃で一晩インキュベートした。青色の活性化したＴｃＨを顕微鏡を用いて視覚的に記録した。結果は、様々なモル濃度のエピトープにおける、ウェル１個当りの活性化したＴｃＨ数として示す。
【００６０】
図６Ａ〜６Ｂに示す結果から、血液由来ＡＰＣによる処理の際にＴｃＨ活性化を誘導する上で、ＩｇＧバックボーン内のペプチドエピトープは、ペプチド単独よりもモル基準で（１桁）効果的であったことが分かるが、この結果から、プロフェッショナルＡＰＣの数が制限された次善最適条件（suboptimal conditions）下では、ＩｇバックボーンがＭＨＣ−ペプチド複合体の形成を大幅に促進することが示唆される。
【００６１】
実施例６では、ＩｇＧバックボーン内でのＴ細胞エピトープ輸送は、中枢リンパ器官内ではなく二次リンパ器官（流入リンパ節及び脾臓）内でのＡＰＣによるエピトープのローディング及び提示を劇的に改善することを示す。ペプチドエピトープのＩＦＡへの乳化或いは用量を１００倍増加させることによっては、同程度のローディングを再現することができなかった。このように、ＩｇＧバックボーン内へのエピトープ挿入によって、用量増加或いは蓄積効果（depot effect）によって補償できないような、ペプチドベース戦略に関連する限定因子が排除される。
ＭＨＣ−ペプチド複合体のｉｎ ｖｉｖｏでの形成の評価、及び生理食塩水或いは標準水中油型エマルジョン内でのペプチドとの比較は、Ｉ−Ｅｄ⁺ＢＡＬＢ／ｃマウスにて行った。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧ、生理食塩水に溶解したペプチド、或いは不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）に乳化したペプチドを皮下注射及び腹腔内注射投与（用量は図７Ｂに示す）することによって処理した。投与２４時間後、局所（腸間膜）リンパ節（ＬＮ）、脾臓及び胸腺を回収し、単一細胞浮遊液を作成し、脾臓、ＬＮ及び胸腺から溶解した赤血球をコラゲナーゼ消化した。全ての細胞を洗浄、計数後、Ｉ−Ｅｄ＋ＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥ（ＭＨＣクラスＩＩ−ＨＡ）複合体を認識するＴｃＨと共にインキュベートした。ＴｃＨの数は１×１０⁴個／ウェルであった。このようなＭＨＣ−ペプチド複合体の形成は、一定数のＴｃＨでＡＰＣの数を滴定し、インキュベーションを一晩行った後にＴｃＨ活性化を測定することによって評価した。翌日、プレートを１５分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した後、上清をはじき飛ばし（flicked）、新しく作成した冷固定液（１×ＰＢＳにホルムアルデヒド２％とグルタルアルデヒド０．２％を溶解したもの）で細胞を固定し、プレートを再度、３分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した。固定液をプレートからはじき飛ばし（flicked off）、細胞をＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で１回洗浄し、プレートを３分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した。ＰＢＳをプレートからはじき飛ばし（flicked off）、細胞を、次の通り新しく調製したＸ−ｇａｌ基質（Ｘ−ｇａｌをＤＭＳＯに溶解（４０ｍｇ／ｍＬ）して得たＸ−ｇａｌ保存液（２００μＬ）を１０ｍＬの基質緩衝液（１×ＰＢＳに５ｍＭのフォロシアン化カリウム、５ｍＭのフェリシアン化カリウム、及び２ｍＭのＭｇＣｌ２を溶解して調製）に溶解して調製）（２００μＬ／ウェル）と共に３７℃で一晩インキュベートした。青色の活性化したＴｃＨを顕微鏡を用いて視覚的に記録した。
【００６２】
データは、実施例５及び６で上述するように得たｉｎ ｖｉｔｒｏ標準曲線に基づき、ＡＰＣ数に対するＴｃＨ活性化として示し（図７Ａ）、また、ＭＨＣ−ペプチド複合体を発現するＡＰＣの推定百分率として示す（図７Ｂ）。
【００６３】
図７Ａ〜７Ｂに示すデータから、水中油型アジュバント（ＩＦＡ）を用いることにより、脾臓や胸腺ではなくリンパ節のＡＰＣ上でのＭＨＣ−ペプチド複合体のｉｎ ｖｉｖｏ形成が適度に増強されたことが分かる。生理食塩水或いはエマルジョンに溶解したペプチドの実質的な用量増加は、ロードされたＡＰＣ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでＡＰＣ上に生成するＭＨＣ−ペプチド複合体の増加とは比例しない。一方、Ｉｇバックボーン内でペプチドを用いることにより、二次リンパ器官（リンパ節や脾臓等）由来のＡＰＣ上でのＭＨＣ−ペプチド複合体の形成は大幅に増強する。胸腺由来のＡＰＣ上でのＭＨＣＩＩ−ペプチド複合体の形成は制限されたままであり、これは、ペプチドを単独で用いた場合と同様である。ペプチドをＩｇＧ内に組み込むことによって得られる増強因子は予想外に高かった（約２〜３桁）が、これは、細胞ハンドリング（例えば、上述の薬物動態や防御作用）以外の他の因子が関与したことを示す。ペプチドを単独で生理食塩水やＩＦＡに溶解して用いた場合、用量を１００倍に増加させても、ＩｇＧバックボーン内のペプチドによる上述のＡＰＣのｉｎ ｖｉｖｏローディングを回復させることができなかった。
【００６４】
実施例７では、ＦｃγＲを発現する３種類の主要ＡＰＣサブセット（ＤＣ、単球／マクロファージ、及びＢ細胞）の内、Ｂ細胞ではなく、ＣＤ１１ｃ＋（ＤＣ）とＣＤ１１ｂ＋（大部分が単球）とが、ＩｇＧバックボーンによるｉｎ ｖｉｖｏ輸送後のペプチドエピトープの提示において細胞１個基準で最も強力であることを示す。ＡＰＣローディングとその結果もたらされる提示の効率は、遊離ペプチドの輸送によってもたらされる効率より実質的に高い。
ＡＰＣ上でのＭＨＣ−ペプチド複合体のｉｎ ｖｉｖｏ形成の評価は、ＩｇＧバックボーン内のペプチドエピトープの投与に引き続き、各種ＡＰＣサブセットを分離した後に行った。
【００６５】
（Ａ）抗ＭＨＣＩＩ ｍＡｂ或いは抗ＣＤ１１ｃ ｍＡｂと結合した磁気ビーズを用いた分離は、磁気細胞セパレータ及びミルテニイバイオテック社（ドイツ）から入手した試薬を用い、次の通り行った。脾臓を処理して単一細胞浮遊液を調製し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、ＭＡＣＳ緩衝液（２ｍＭのＥＤＴＡと０．５％のＢＳＡを添加したＰＢＳ）に再懸濁した。磁気標識された細胞を、ＭＡＣＳセパレータの磁場に設置した分離カラムに通した。磁気標識されたポジティブ画分はカラム内に保持されるが、ネガティブ画分はカラムを通過する。カラムを磁場から移動させた後、磁気的に保持されたポジティブ細胞をカラムから溶出させ、細胞を洗浄、計数後、ＨＬ１完全培地に再懸濁し、ＥＬＩＳＰＯＴプレート内でインキュベートした。通常、ＢＡＬＢ／ｃマウス一個体から分離される総数約９０００万個の脾細胞の内、約２０００万個の脾細胞が抗ＭＨＣＩＩ抗体に結合した磁気ビーズと結合し、３００万個の脾細胞が抗ＣＤ１１ｃ ｍＡｂと相互作用する。このように、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性エピトープを提示することのできる脾細胞は２０パーセント未満であり、約２〜３パーセントは樹状細胞である（図８Ａ参照）。これらの数値は特定の抗体を用いたＦＡＣＳ分析によって確認した。
【００６６】
（Ｂ）ＡＰＣのｉｎ ｖｉｖｏローディングとＭＨＣＩＩ＋脾細胞上でのＭＨＣＩＩ−ペプチド複合体の形成は、０．７２μＭのｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧ（「ＩｇＨＡ」）或いは１８μＭのＨＡペプチドを静脈内注射投与したＢａｌｂ／ｃマウスにおいて比較的に評価した。投与２４時間後、上述のようなＭＡＣＳにより脾臓からＭＨＣクラスＩＩ＋ＡＰＣを単離し、ペプチド特異的ＴｃＨ（１×１０⁴個／ウェル）と共に、用量反応的にインキュベートした。翌日、プレートを１５分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した後、上清をはじき飛ばし（flicked）、新しく作成した冷固定液（１×ＰＢＳにホルムアルデヒド２％とグルタルアルデヒド０．２％を溶解したもの）で細胞を固定し、プレートを再度、３分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した。固定液をプレートからはじき飛ばし（flicked off）、細胞をＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で１回洗浄し、プレートを３分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した。ＰＢＳをプレートからはじき飛ばし（flicked off）、細胞を、次の通り新しく調製したＸ−ｇａｌ基質（Ｘ−ｇａｌをＤＭＳＯに溶解（４０ｍｇ／ｍＬ）して得たＸ−ｇａｌ保存液（２００μＬ）を１０ｍＬの基質緩衝液（１×ＰＢＳに５ｍＭのフォロシアン化カリウム、５ｍＭのフェリシアン化カリウム、及び２ｍＭのＭｇＣｌ２を溶解して調製）に溶解して調製）（２００μＬ／ウェル）と共に３７℃で一晩インキュベートした。青色の活性化したＴｃＨを顕微鏡を用いて視覚的に記録した。
【００６７】
結果は、ウェル１個当りの活性化ＴｃＨの数として図８Ｂに示す。対照として、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＭＨＣＩＩ＋ＡＰＣをｉｎ ｖｉｔｒｏで一晩、最適濃度のＨＡペプチド（５０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、何度も洗浄し、細胞個数を変えて上述のようにＴｃＨと共にインキュベートした。得られた結果から、エピトープをＩｇＧバックボーン内で輸送すると、脾臓ＡＰＣ上でのＭＨＣＩＩ−ペプチド複合体の形成が少なくとも２桁、より効果的になることが分かる。
【００６８】
（Ｃ）ｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧ投与後の各種ＡＰＣサブセットのｉｎ ｖｉｖｏローディングの比較的評価は、ミルテニイバイオテック社から入手したＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１９マイクロビーズを用いた、上述同様のプロトコルによるＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１９＋ＡＰＣの磁気分離によって行った。組換えイムノグロブリン（０．７２μＭ）の静脈内投与２４時間後、ＡＰＣを単離し、一定数のペプチド特異的ＴｃＨと共に用量作用的に（in a dose effect manner）インキュベートした。更に２４時間後、上述のようにアッセイを行い、結果はウェル１個当りの活性化ＴｃＨ数として表した。図８Ｃに示す結果から、細胞１個基準で見ると、ＩｇＧバックボーン内でペプチドを用いることによって、ＣＤ１１ｃ＋ＡＰＣ（樹状細胞）上での免疫原性ＭＨＣＩＩ−ペプチド複合体の顕著な形成と、それに続くＣＤ１１ｂ＋単球上での複合体形成がもたらされるが、ＣＤ１９＋Ｂ細胞上での複合体形成への効果は非常に低いことが分かる。
【００６９】
（Ｄ）ペプチド輸送後のＣＤ１１ｃ＋ＡＰＣ上でのＭＨＣＩＩ−ペプチド複合体のｉｎ ｖｉｖｏ形成効率と組換えＩｇ輸送後のその効率との比較を、セクションＢで上述したようにマウスを処置した後に行った。ＣＤ１１ｃ＋脾臓ＤＣを、ＣＤ１１ｃマイクロビーズを用いたＭＡＣＳにより単離し、細胞個数を変えて１×１０⁴ＴｃＨ／ウェルと共にインキュベートした。活性化したＴｃＨは上述のように定量化し、結果はウェル１個当りのＸ−ｇａｌ＋Ｔ細胞の数で表した。対照として、ペプチドによりｅｘ ｖｉｖｏでロードしたナイーブマウス由来のＣＤ１１ｃ＋ＡＰＣをセクションＢに示したように用いた。図８Ｄに示す結果から、ペプチドエピトープをＩｇＧバックボーン内で輸送すると、ＭＨＣＩＩ−ペプチド複合体の形成が少なくとも３桁、より効果的になったことが分かる。
【００７０】
結論として、ＩｇＧバックボーン内でのペプチドエピトープの輸送によって、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ上でのより効果的なＭＨＣＩＩ−ペプチド複合体の形成がもたらされた。また、ＡＰＣローディング及びＭＨＣＩＩ−ペプチド複合体形成の効率は、ペプチドをＩｇＧバックボーン内で輸送した場合、実質的に高かった。図８Ａ〜８Ｄに示す結果から、ペプチドのＦｃｇＲ仲介輸送を用いることによって、ＣＤ１１ｃ＋ＡＰＣ及びＣＤ１１ｂ＋ＡＰＣ上での免疫原性ＭＨＣＩＩ−ペプチド複合体の優先的な形成がもたらされることが分かる。
【００７１】
実施例８では、ＩｇＧバックボーンによる投与後、ＡＰＣ（ＤＣ及び単球）上でＭＨＣ−ペプチド複合体がｉｎ ｖｉｖｏで長期間存続することを示す。
特定のＡＰＣサブセット上でのＭＨＣＩＩ−ペプチド複合体の存続は、２μＭのｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧを静脈内注射投与後、様々な間隔でＣＤ１１ｃ＋ＤＣ及びＣＤ１１ｂ＋単球を磁気分離することによって測定した。即ち、磁気分離は、磁気細胞セパレータ及びミルテニイバイオテック社（ドイツ）から入手した試薬を用い、次の通り行った。脾臓を処理して単一細胞浮遊液を調製し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、ＭＡＣＳ緩衝液（２ｍＭのＥＤＴＡと０．５％のＢＳＡを添加したＰＢＳ）に再懸濁した。磁気標識された細胞を、ＭＡＣＳセパレータの磁場に設置した分離カラムに通した。磁気標識されたポジティブ画分はカラム内に保持されるが、ネガティブ画分はカラムを通過する。カラムを磁場から移動させた後、磁気的に保持されたポジティブ細胞をカラムから溶出させ、細胞を洗浄、計数後、ＨＬ１完全培地に再懸濁し、インキュベートした。様々な個数の分離ＡＰＣ（Ａ−ＣＤ１１ｂ＋単球、Ｂ−ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞、Ｃ−全脾細胞集団）を、ＨＡペプチドに特異的なＴｃＨ（１×１０⁴個）と共に一晩インキュベートした。
【００７２】
対照（ｃｔｒｌ）として、ナイーブマウス由来のＡＰＣを用いたが、このＡＰＣは最適量のＨＡペプチド（５０μｇ／ｍＬ）によりｉｎ ｖｉｔｒｏで一晩ロードし、洗浄した後にインキュベートした。翌日、プレートを１５分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した後、上清をはじき飛ばし（flicked）、新しく作成した冷固定液（１×ＰＢＳにホルムアルデヒド２％とグルタルアルデヒド０．２％を溶解したもの）で細胞を固定し、プレートを再度、３分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した。固定液をプレートからはじき飛ばし（flicked off）、細胞をＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で１回洗浄し、プレートを３分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した。ＰＢＳをプレートからはじき飛ばし（flicked off）、細胞を、次の通り新しく調製したＸ−ｇａｌ基質（Ｘ−ｇａｌをＤＭＳＯに溶解（４０ｍｇ／ｍＬ）して得たＸ−ｇａｌ保存液（２００μＬ）を１０ｍＬの基質緩衝液（１×ＰＢＳに５ｍＭのフォロシアン化カリウム、５ｍＭのフェリシアン化カリウム、及び２ｍＭのＭｇＣｌ２を溶解して調製）に溶解して調製）（２００μＬ／ウェル）と共に３７℃で一晩インキュベートした。青色の活性化したＴｃＨを顕微鏡を用いて視覚的に記録し、処置後様々な間隔で回収したＡＰＣの数に対し、ウェル１個当りの活性化ＴｃＨの数をプロットした。
【００７３】
得られた結果から、ＤＣ及び単球上で、内因性ＭＨＣＩＩへのペプチドの発現が長時間持続することが分かる。上述の複合体は、このアッセイ（ＡＰＣ分離の戦略及びＭＨＣＩＩ−ペプチドの検出）に用いた条件下、これら２種類のＡＰＣサブセット上で１〜２週間存続した。
【００７４】
図９Ａ〜９Ｃに示す結果から、Ｉｇによるエピトープのｉｎ ｖｉｖｏ輸送後に、選択されたＡＰＣ上に形成されたＭＨＣ−ペプチド複合体は、寿命が長いことが分かる。
【００７５】
実施例９では、Ｆｃレセプター（Ｉ及びＩＩＩ）のγ鎖は、ＤＣ及び単球によるＩｇＧバックボーン内に輸送されたＴ細胞エピトープの効果的なｉｎ ｖｉｖｏローディング及び提示に必須であることを示す。
ＡＰＣローディングのＦｃγＲとの相互作用に対する依存性については、機能性ＦｃＲγ遺伝子を欠いたＢＡＬＢ／ｃマウスに２μＭのｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧを投与することによって検討した。静脈内処置１日後、ＭＡＣＳによって脾臓からＣＤ１１ｃ＋ＡＰＣ及びＣＤ１１ｂ＋ＡＰＣを分離した。抗ＣＤ１１ｃ抗体及び抗ＣＤ１１ｂ抗体と結合した磁気ビーズを用いた分離は、磁気細胞セパレータ及びミルテニイバイオテック社（ドイツ）から入手した試薬を用い、次の通り行った。脾臓を処理して単一細胞浮遊液を調製し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、ＭＡＣＳ緩衝液（２ｍＭのＥＤＴＡと０．５％のＢＳＡを添加したＰＢＳ）に再懸濁した。磁気標識された細胞を、ＭＡＣＳセパレータの磁場に設置した分離カラムに通した。磁気標識されたポジティブ画分はカラム内に保持されるが、ネガティブ画分はカラムを通過する。カラムを磁場から移動させた後、磁気的に保持されたポジティブ細胞をカラムから溶出させ、細胞を洗浄、計数後、ＨＬ１完全培地に再懸濁し、様々な個数の細胞を、ＨＡペプチドに特異的なＴｃＨ（１×１０⁴個）と共に一晩インキュベートした。対照として、ＦｃＲγ適格性ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＡＰＣを用いた。翌日、プレートを１５分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した後、上清をはじき飛ばし（flicked）、新しく作成した冷固定液（１×ＰＢＳにホルムアルデヒド２％とグルタルアルデヒド０．２％を溶解したもの）で細胞を固定し、プレートを再度、３分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した。固定液をプレートからはじき飛ばし（flicked off）、細胞をＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で１回洗浄し、プレートを３分／４℃／１５００ＲＰＭの条件で遠沈した。ＰＢＳをプレートからはじき飛ばし（flicked off）、細胞を、次の通り新しく調製したＸ−ｇａｌ基質（Ｘ−ｇａｌをＤＭＳＯに溶解（４０ｍｇ／ｍＬ）して得たＸ−ｇａｌ保存液（２００μＬ）を１０ｍＬの基質緩衝液（１×ＰＢＳに５ｍＭのフォロシアン化カリウム、５ｍＭのフェリシアン化カリウム、及び２ｍＭのＭｇＣｌ２を溶解して調製）に溶解して調製）（２００μＬ／ウェル）と共に３７℃で一晩インキュベートした。青色の活性化したＴｃＨを顕微鏡を用いて視覚的に記録した。結果は、各種ＡＰＣサブセット（ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ（Ａ）或いはＣＤ１１ｂ＋単球（Ｂ））或いは対照（全脾細胞集団（Ｃ））に対する、ウェル１個当りの活性化ＴｃＨの数として表す。
【００７６】
図１０に示す結果から明らかなように、ペプチドエピトープのＩｇＧ仲介輸送後のＤＣや単球上でのＭＨＣＩＩ−ペプチド複合体の形成は、γ鎖を含むＩＴＡＭ＋ＦｃｇＲに大きく依存している。また、その点で、γ鎖陰性ＦｃＲアイソフォームは、γ鎖＋ＦｃＲアイソフォームの欠如を補償できない。
【００７７】
実施例１０では、ＩｇＧバックボーン内で輸送されたペプチドによるＴ細胞活性化の効率は、ＡＰＣ上での（活性を促進する）γ鎖＋ＦｃγＲ及び（活性を制限する）ＦｃγＲＩＩＢの発現に依存することを示す。また、本実験では、ＩＴＩＭ保有ＦｃγＲＩＩＢが、ＩｇＧバックボーン内で輸送されたペプチドに対する免疫応答を抑制する（keeps in check）ことを示す。
ＩｇＧバックボーン内でペプチドエピトープによって引き起こされる免疫応答に対するＦｃＲγ＋アイソフォームとＦｃＲγ−アイソフォームの役割の差について、ＡＰＣのｅｘ ｖｉｖｏローディングとそれに引き続く養子移入とによって検討した。野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＦｃＲγ−ＢＡＬＢ／ｃマウス、或いはＦｃＲＩＩＢ−ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾細胞を次の通り３７０℃で３時間インキュベートした。１０００万個の細胞／１ｍＬの無血清ＨＬ−１培地を、５０μｇ／ｍＬのＨＡ１１０−１２０ペプチド或いは１０μｇ／ｍＬのｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧと混合した。次に、細胞を洗浄し、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに養子移入した（１００万個の細胞を２００μＬの無血清ＨＬ−１に懸濁させ、接種物を２等分し、皮下投与及び腹腔内投与を行った）。２週間後、レシピエントマウスを殺し、脾臓を回収し、ＨＡ１１０−１２０ペプチドに対するＴ細胞応答を次の通りＥＬＩＳＰＯＴ分析により測定した。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、フランス、モールスハイム）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に溶解した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ２及び抗ＩＬ４に対しては４μｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮγに対しては８μｇ／ｍＬ、ＢＤファーミンジェン社製）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地により３７℃で１時間ブロッキングした。脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、５×１０⁵個／ウェルで５０μｇ／ｍＬのＨＡ１１０−１２０ペプチドと共にインキュベートし、或いは培地のみでインキュベートしてバックグラウンドを評価した。
【００７８】
プレートは３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、ビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（２μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％−ＦＢＳ ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）に溶解したもの（１００μＬ／ウェル）と共に４℃で一晩インキュベートした。
【００７９】
翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）によって開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次に、プレートを室温で２４時間乾燥させた。データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリング）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）により得た。結果は、培地のみでインキュベート、或いはＨＡ１１０−１２０ペプチド（１０μｇ／ｍＬ）を添加した培地と共にインキュベートして得たサイトカイン産生（Ａ：ＩＬ−２、Ｂ：ＩＬ−４、及びＣ：ＩＦＮ−γ）スポット形成コロニーの頻度として、図１１に示す（三連のデータの平均＋ＳＥＭ、３マウス／群に相当）。
【００８０】
図１１に示す結果から、ＩＴＡＭ＋ＦｃｇＲアイソフォームのγ鎖の発現は、ＩｇＧバックボーン内でペプチドによりロードされたＡＰＣに対するＴ細胞応答の誘導に必要であることが分かる。しかし、この発現は、ペプチドでパルシングされたＡＰＣの免疫原性作用には必要なかった。逆に、ＩＴＩＭ＋ＦｃｇＲＩＩの欠如によって、ＨＡペプチドではなく組換えＩｇＧによってパルシングされたＡＰＣに対するＴ細胞応答の著しい増強がもたらされる。総合すると、これらのデータから、ペプチドエピトープを保有する組換えＩｇＧに対するＴ細胞応答は、ＡＰＣ上のＩＴＡＭ＋ＦｃγレセプターとＩＴＩＭ＋Ｆｃγレセプターとの複雑な相互作用によって決まることが分かる。
【００８１】
実施例１１では、意外にも、ＩｇＧバックボーン内に挿入されたエピトープでｉｎ ｖｉｖｏロードしたＡＰＣの各サブセットは、それぞれ別個の調節サブセットを誘導すること、即ち、単球がＴｈ２及びＴｒ１細胞をより効果的に誘導する一方、樹状細胞と単球の双方はＴｈ３細胞を誘導することを示す。また、細胞集団レベルでは、ＣＤ１１ｂ＋単球は、Ｔ細胞エピトープのＩｇＧ仲介輸送後の調節応答を引き起こす上で樹状細胞よりも強力である。
ＢＡＬＢ／ｃマウス４個体に対し、２μＭのｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧを静脈内注射投与した。１日後、脾臓を回収し、磁気ビーズに結合した抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ１１ｂ或いは抗ＣＤ１９モノクローナル抗体を用いたＭＡＣＳによってＡＰＣを単離した。抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１１ｃ或いは抗ＣＤ１９ｍＡｂに結合した磁気ビーズを用いた分離は、磁気細胞セパレータ及びミルテニイバイオテック社（ドイツ）から入手した試薬を用い、次の通り行った。脾臓を処理して単一細胞浮遊液を調製し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、ＭＡＣＳ緩衝液（２ｍＭのＥＤＴＡと０．５％のＢＳＡを添加したＰＢＳ）に再懸濁した。磁気標識された細胞を、ＭＡＣＳセパレータの磁場に設置した分離カラムに通した。磁気標識されたポジティブ画分はカラム内に保持されるが、ネガティブ画分はカラムを通過する。カラムを磁場から移動させた後、磁気的に保持されたポジティブ細胞をカラムから溶出させ、細胞を洗浄、計数後、無血清ＨＬ−１培地に次のように再懸濁した（３×１０⁶／ｍＬのＣＤ１１ｃ⁺ＤＣ、２８×１０⁶／ｍＬのＣＤ１１ｂ⁺、或いは８４×１０⁶／ｍＬのＣＤ１９⁺Ｂ細胞）。この数値分布は、脾臓組織から単離した各ＡＰＣサブセットの比率と関係する。細胞を皮下注射及び腹腔内注射投与によってナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに移入した（１００＋１００μＬ／マウス、ｎ＝２マウス／群）。養子移入２週間後、マウスを殺し、Ｔ細胞応答をＥＬＩＳＰＯＴ（ＩＬ−４及びＩＦＮ−γ）で測定し、或いは、細胞培養上清中のサイトカイン産生をＥＬＩＳＡ ＴＧＦ−β１キット（Ｒ＆Ｄシステム社、カタログ番号ＤＹ２４０）及びＩＬ−１０キット（バイオソースインターナショナル社、カタログ番号ＫＭＣ０１０４）によって測定した。
【００８２】
結果は、再刺激に用いたＨＡペプチドの様々な濃度における、脾臓１個当りのスポット形成コロニー数（二連のデータの平均；パネルＡ、Ｂ）として、或いは上清中で測定したサイトカイン量（ｐｇ／ｍＬ、二連のデータの平均；パネルＣ、Ｄ）として図１２に示す。
【００８３】
得られた結果（図１２、パネルＡ〜Ｄ）から明らかなように、予想外に、且つ効力／細胞基準（実施例８）とは対照的に、生体レベルにおいては、ＣＤ１１ｂ⁺単球の場合、ＩｇＧバックボーン内で輸送されたペプチドエピトープに対する免疫応答への影響が最も強い。このように、ＣＤ１１ｂ⁺ＡＰＣサブセットはＴｈ２、Ｔｒ１及びＴｈ３細胞を誘導した。一方、ＣＤ１１ｃ⁺ＤＣはＴｈ３細胞を誘導したが、Ｔｈ２応答をより減少させた。最後に、ＣＤ１９⁺Ｂ細胞の場合、その数がかなり多かったにも拘らず、ＩｇＧバックボーン内でのペプチドエピトープに対するＴ細胞免疫を十分に誘導することができなかった。試験した各ＡＰＣサブセットのいずれによっても明確なＴｈ１応答は誘導されなかった。
【００８４】
実施例１２では、ＩｇＧバックボーン内で輸送されたペプチドによるｉｎ ｖｉｖｏでのＡＰＣローディングによって、Ｔｈ２免疫は誘導されるが、Ｔｈ１免疫は誘導されないことを示す。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対し、１００μｇのｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧ（「ＩｇＨＡ」）或いはモル当量のＨＡペプチドエピトープ（２μｇ）を皮下注射投与して免疫感作し、 ２週間後に殺した。免疫応答は、処置マウス由来の脾細胞をレスポンダーとして用い、ナイーブマウス由来の脾細胞をマイトマイシンで処置したものをスティミュレーターとして用いたＥＬＩＳＰＯＴ分析によって次の通りに測定した。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、フランス、モールスハイム）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に溶解した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ２及び抗ＩＬ４に対しては４μｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮγに対しては８μｇ／ｍＬ、ＢＤファーミンジェン社製）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地により３７℃で１時間ブロッキングした。脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、５×１０⁵個／ウェルで２０μｇ／ｍＬのＨＡ１１０−１２０ペプチドと共にインキュベートし、或いは培地のみでインキュベートしてバックグラウンドを評価した。
【００８５】
スティミュレーター細胞は、次の通りにナイーブマウスから調製した。脾臓から単一細胞浮遊液を調製し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄し、ＨＬ１完全培地に再懸濁し、マイトマイシンで３０分間処置した。その後、細胞を３回洗浄し、計数後、無血清ＨＬ１培地に再懸濁した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、ビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（２μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％−ＦＢＳ ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）に溶解したもの（１００μＬ／ウェル）と共に４℃で一晩インキュベートした。
【００８６】
翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）によって開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次に、プレートを室温で２４時間乾燥させた。データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリング）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）により得た。
【００８７】
結果は、１０μｇ／ｍＬのＨＡペプチド或いは細胞培養培地のみで脾細胞を再刺激した場合の、脾臓１個当りのＩＬ−４産生Ｔ細胞コロニー数（Ａ）或いはＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞コロニー数（Ｂ）して図１３に示す（三連のデータの平均±ＳＥＭ）。このように、本実施例から、組換えＩｇバックボーン内でのＦｃｇＲ仲介Ｔ細胞エピトープ輸送によって、Ｔｈ１応答ではなくＴｈ２応答がもたらされることが分かる。
【００８８】
実施例１３では、ＩｇＧバックボーン内で輸送されたペプチドによるｉｎ ｖｉｖｏでのＡＰＣの反復ローディングによって、Ｔｈ３免疫及びＴｒ１免疫が誘導されることを示す。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対し、４０μｇの熱凝集（６３℃、１５分間）したｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧ（「ＩｇＨＡ」）を経鼻注入で投与して免疫感作し、２週間後、組換えイムノグロブリンを生理食塩水に溶解したもの（１００μｇ）を皮下注射投与して追加免疫を行った。対照として、熱凝集ＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照でプライミングしたマウスを用いた。更に２週間後、マウスを殺し、ＨＡペプチドで脾細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ再刺激し、ＥＬＩＳＰＯＴ分析を次の通りに行うことによってＴ細胞応答を評価した。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、フランス、モールスハイム）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に溶解した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ２及び抗ＩＬ４に対しては４μｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮγに対しては８μｇ／ｍＬ、ＢＤファーミンジェン社製）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地により３７℃で１時間ブロッキングした。
【００８９】
脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、５×１０⁵個／ウェルで２０μｇ／ｍＬのＨＡ１１０−１２０ペプチドと共にインキュベートし、或いは培地のみでインキュベートしてバックグラウンドを評価した。プレートは３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、ビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（２μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％−ＦＢＳ ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）に溶解したもの（１００μＬ／ウェル）と共に４℃で一晩インキュベートした。
【００９０】
翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）によって開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次に、プレートを室温で２４時間乾燥させた。
【００９１】
データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリング）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）により得た。ＴＧＦ−β及びＩＬ−１０の産生は、ＥＬＩＳＡ ＴＧＦ−β１キット（Ｒ＆Ｄシステム社、カタログ番号ＤＹ２４０）及びＩＬ−１０キット（バイオソースインターナショナル社、カタログ番号ＫＭＣ０１０４）によって測定した。結果は、バッククラウンドを差し引いた後のサイトカイン濃度（三連のデータの平均）として示す。
【００９２】
図１４に示すデータから、組換えイムノグロブリンを保有するエピトープによる粘膜プライミングによってＴｈ３細胞及びＴｒ１細胞が分化し、次いで全身追加免疫によってこれら細胞が増殖したことが分かる。
【００９３】
実施例１４では、ＩｇＧバックボーン内に挿入されたペプチドエピトープに対する有意なＴｈ１応答を引き起こすことができるのは、従来のアジュバントＣＦＡではなく、ウィルスのみであったことを示す。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対し、１００μｇのｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧを生理食塩水に溶解、或いは完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に乳化したもの、或いはＨＡエピトープを有する１０５ ＴＣＩＤ５０のインフルエンザウィルス株ＷＳＮを腹腔内投与して免疫感作した。免疫感作２週間後、マウス（ｎ＝３／群）を殺し、ＨＡペプチドに対するＴ細胞応答をＥＬＩＳＰＯＴ分析により次の通りに測定した。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、フランス、モールスハイム）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に溶解した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ２及び抗ＩＬ４に対しては４μｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮγに対しては８μｇ／ｍＬ、ＢＤファーミンジェン社製）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地により３７℃で１時間ブロッキングした。脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、５×１０⁵個／ウェルで２０μｇ／ｍＬのＨＡ１１０−１２０ペプチドと共にインキュベートし、或いは培地のみでインキュベートしてバックグラウンドを評価した。
【００９４】
プレートは３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、ビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（２μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％−ＦＢＳ ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）に溶解したもの（１００μＬ／ウェル）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）によって開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次に、プレートを室温で２４時間乾燥させた。
【００９５】
データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリング）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）により得た。結果は、脾臓内のサイトカイン産生コロニーの頻度の平均±ＳＥＭとして示す。
【００９６】
図１５に示す結果から、ＩｇＧバックボーン内のペプチドエピトープは、従来のアジュバント（ＣＦＡ）によって増強されるがスイッチングされないＴｈ２プロファイルの細胞応答を引き起こすことが分かる。一方、生ウィルス免疫（live virus immunization）によって得られるこのプロファイルはＴｈ１バイアスであった。
【００９７】
実施例１５では、ＩｇＧ仲介輸送後のペプチドエピトープの提示によってＴ細胞応答がもたらされ、このＴ細胞応答は、抗ＣＤ４０ｍＡｂ、組換えＩＬ−１２或いは合成ｄｓＲＮＡによる同時刺激を増強させることによって更にマニピュレートし得ることを示す。
ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス由来の樹状細胞を、ＭＡＣＳにより脾臓細胞浮遊液から次のように回収した。抗ＣＤ１１ｃに結合した磁気ビーズを用いた分離は、磁気細胞セパレータ及びミルテニイバイオテック社（ドイツ）から入手した試薬を用い、次の通り行った。脾臓を処理して単一細胞浮遊液を調製し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、ＭＡＣＳ緩衝液（２ｍＭのＥＤＴＡと０．５％のＢＳＡを添加したＰＢＳ）に再懸濁した。磁気標識された細胞を、ＭＡＣＳセパレータの磁場に設置した分離カラムに通した。磁気標識されたポジティブ画分はカラム内に保持されるが、ネガティブ画分はカラムを通過する。カラムを磁場から移動させた後、磁気的に保持されたポジティブ細胞をカラムから溶出させ、細胞を洗浄、計数後、ＨＬ１完全培地に再懸濁し、ｅｘ ｖｉｖｏパルシングを無血清ＨＬ−１培地中（濃度：３００万個／ｍＬ）で２時間行ったが、その際、５０μｇ／ｍＬのｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧのみ、或いは５ｎｇ／ｍＬのｒｅｃＩＬ−１２、５０μｇ／ｍＬの二本鎖ＲＮＡ（ｐＡ：ｐＵ或いはｐＩ：ｐＣ）を添加したものを用いた。或いは、細胞を、組換えＩｇと１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ４０ｍＡｂでプレコートしたウェルとを用いてインキュベートした。細胞を回収し、洗浄した後、無血清ＨＬ−１培地に溶解し（in serum free HL-1 medium）、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに養子移入した（３０万個の細胞の内、半分を皮下投与し、もう半分を腹腔内投与した）。
【００９８】
２週間後、マウスを殺し、ＨＡに対するＴ細胞応答をＥＬＩＳＰＯＴ分析により次の通りに測定した。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、フランス、モールスハイム）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に溶解した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ２及び抗ＩＬ４に対しては４μｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮγに対しては８μｇ／ｍＬ、ＢＤファーミンジェン社製）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地により３７℃で１時間ブロッキングした。
【００９９】
脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、５×１０⁵個／ウェルで５０μｇ／ｍＬのＨＡ１１０−１２０ペプチドと共にインキュベートし、或いは培地のみでインキュベートしてバックグラウンドを評価した。プレートは３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、ビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（２μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％−ＦＢＳ ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）に溶解したもの（１００μＬ／ウェル）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）によって開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次いで、プレートを室温で２４時間乾燥させた。
【０１００】
データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリング）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）を用いて得た。結果は、各ｅｘ ｖｉｖｏ刺激組合せについて、バックグラウンドを差し引いた後のＩＬ−２或いはＩＬ−４産生に対するスポット形成コロニーの頻度の平均＋ＳＥＭ（ｎ＝３）として示す。
【０１０１】
図１６に示す結果から、ＡＰＣによるペプチド提示は、輸送プラットフォームとして組換えＩｇＧを用いた抗原によるローディングの後、同時刺激を制限した場合に（in context of）生じることが分かる。ＩＬ−１２、抗ＣＤ４０或いは合成ｄｓＲＮＡがあると、ＦｃｇＲにより抗原でロードしたＡＰＣによって、ＩＬ−２をプライミングすることができ、且つ、同族（ＨＡ）ペプチドに対するＴ細胞免疫をもたらすＩＬ−４を増強することができる。
【０１０２】
実施例１６：ＩｇＧ−ペプチドによるＡＰＣのｉｎ ｖｉｖｏローディングによって引き起こされる、長寿命ＩＬ−４産生Ｔｈ２細胞の活性は、内因性ＡＰＣとの継続的相互作用に依存し、コンピテントＣＤ４を必要とする。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対し１００μｇのｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧ或いはＨＡペプチドを皮下投与して免疫感作し、２週間後に殺し、Ｔ細胞応答をＥＬＩＳＰＯＴ分析によって次の通りに測定した。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、フランス、モールスハイム）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に溶解した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ４に対して４μｇ／ｍＬ、ＢＤファーミンジェン社製）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地により３７℃で１時間ブロッキングした。
【０１０３】
脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、５×１０⁵個／ウェルで２０μｇ／ｍＬのＨＡ１１０−１２０ペプチドと共にインキュベートし、或いは培地のみでインキュベートしてバックグラウンドを評価した。プレートは３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、ビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（２μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％−ＦＢＳ ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）に溶解したもの（１００μＬ／ウェル）と共に４℃で一晩インキュベートした。
【０１０４】
翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）によって開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次いで、プレートを室温で２４時間乾燥させた。データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリング）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）を用いて得た。
【０１０５】
（Ａ）ＨＡ刺激時には、ブロッキング抗ＣＤ４或いは抗ＣＤ８ｍＡｂを選択したウェルに１０μｇ／ｍＬで添加した。結果は、バックグラウンドを差し引いた後の脾臓１個当りのＨＡ刺激ＩＬ−４産生コロニー数の平均＋ＳＥＭとして図１７Ａに示す（ｎ＝３マウス／群）。
【０１０６】
（Ｂ）上述のように組換えＩｇで免疫感作したマウス由来の脾細胞をそのままＥＬＩＳＰＯＴプレートでインキュベートし、或いは、内因性ＭＨＣＩＩ＋ＡＰＣの磁気ディプリーション（magnetic depletion）後、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＭＨＣＩＩ＋と共に、培地のみと共に、或いは１０μｇ／ｍＬのＨＡペプチドの存在下でインキュベートした。抗ＭＨＣＩＩに結合した磁気ビーズを用いた分離は、磁気細胞セパレータ及びミルテニイバイオテック社（ドイツ）から入手した試薬を用い、次の通り行った。脾臓を処理して単一細胞浮遊液を調製し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、ＭＡＣＳ緩衝液（２ｍＭのＥＤＴＡと０．５％のＢＳＡを添加したＰＢＳ）に再懸濁した。磁気標識された細胞を、ＭＡＣＳセパレータの磁場に設置した分離カラムに通した。磁気標識されたポジティブ画分はカラム内に保持されるが、ネガティブ画分はカラムを通過する。カラムを磁場から移動させた後、磁気的に保持されたポジティブ細胞をカラムから溶出させ、細胞を洗浄、計数後、ＨＬ１完全培地に再懸濁し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによりインキュベートした（プロトコルは次の通り）。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、フランス、モールスハイム）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に溶解した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ２及び抗ＩＬ４に対しては４μｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮγに対しては８μｇ／ｍＬ、ＢＤファーミンジェン社製）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地により３７℃で１時間ブロッキングした。脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、５×１０⁵個／ウェルで５０μｇ／ｍＬのＨＡ１１０−１２０ペプチドと共にインキュベートし、或いは培地のみでインキュベートしてバックグラウンドを評価した。
【０１０７】
プレートは３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、ビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（２μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％−ＦＢＳ ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）に溶解したもの（１００μＬ／ウェル）と共に４℃で一晩インキュベートした。
【０１０８】
翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）によって開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次いで、プレートを室温で２４時間乾燥させた。
【０１０９】
データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリング）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）を用いて得た。結果は、ＩＬ−４産生Ｔ細胞の頻度の平均±ＳＥＭとして示す。図１７Ａ〜１７Ｂに示す結果から、ｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧの投与によって引き起こされるＨＡ特異的ＩＬ−４産生Ｔ細胞の活性は、ＣＤ８ではなくＣＤ４に依存していることが分かる。また、プライミングされたＴ細胞による長寿命ＩＬ−４の産生は、内因性ＡＰＣとの安定な相互作用に依存している。
【０１１０】
実施例１７では、Ｔ細胞エピトープのＦｃγＲ仲介輸送は、活性化した特定のＴ細胞のフェノタイプに差別的に影響を及ぼす上で、ペプチドよりも効果的であることを示す（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の用量依存的ダウンレギュレーションとＩＬ−１０及びＴＧＦ−βのアップレギュレーション）
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１００μｇのＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥペプチドをＣＦＡに溶解したもので免疫感作し、２週間後、活性化したＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥ特異的Ｔ細胞をマウスから分離した。得られた細胞を、様々な量のｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧ或いは対応するペプチドの存在下、マイトマイシン処置脾細胞と共にインキュベートした。細胞増殖及びサイトカイン産生（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−２）についてはＥＬＩＳＰＯＴ分析により次の通り評価した。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、フランス、モールスハイム）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に溶解した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ２及び抗ＩＬ４に対しては４μｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮγに対しては８μｇ／ｍＬ、ＢＤファーミンジェン社製）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地により３７℃で１時間ブロッキングした。脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、５×１０⁵個／ウェルで２０μｇ／ｍＬのＨＡ１１０−１２０ペプチドと共にインキュベートし、或いは培地のみでインキュベートしてバックグラウンドを評価した。
【０１１１】
プレートは３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、ビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（２μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％−ＦＢＳ ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）に溶解したもの（１００μＬ／ウェル）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）によって開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次に、プレートを室温で２４時間乾燥させた。
【０１１２】
データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリング）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）を用いて得た。また、ＴＧＦ−β及びＩＬ−１０の産生については、インキュベーション４８時間後、ＴＧＦ−β１キット（Ｒ＆Ｄシステム社、カタログ番号ＤＹ２４０）及びＩＬ−１０キット（バイオソースインターナショナル社、カタログ番号ＫＭＣ０１０４）を用いたＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、スポット形成細胞（ＳＦＣ）の頻度、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで添加した抗原量に対するサイトカイン濃度として示す。
【０１１３】
図１８に示す結果から、Ｔ細胞エピトープのＩｇＧ仲介輸送は、活性化したＴ細胞によるサイトカイン産生や増殖に対し著しく差別的な（differential）影響を及ぼすことが分かる（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、そして、驚くべきことにＩＬ−４も用量関連的にダウンレギュレートされた）。Ｉｇ−ペプチドは、ペプチド自身と比べて、サイトカイン産生を調節する上で実質的により効果的であった。一方、Ｉｇ−ペプチドのみでも、用量依存的にＩＬ−１０とＴＧＦ−βの産生を効果的に開始させた（turned on）。このように、Ｉｇバックボーン内のＴ細胞エピトープは、活性化した細胞の機能を独立的ではなく差別的に調節した。
【０１１４】
実施例１８では、驚くべきことに、免疫複合体でもレセプター架橋抗体でもないＩｇＧバックボーン内で輸送されたペプチドによって、クラスＩ拘束性免疫応答が誘導されることを示す。この応答のプロファイルは、生ウィルス（ＩＦＮ−γ産生ではなくＩＬ−４に存在するＴｃ２タイプ）によって引き起こされるプロファイルとは異なった。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対し、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドＴＹＴＱＴＲＡＬＶ（配列番号６）を含むｒｅｃＮＰ（Ｋｄ）−ＩｇＧ（５０μｇ）を皮下注射投与した。２週間後、マウスを殺し、ペプチド特異的サイトカインの産生をＥＬＩＳＰＯＴ分析により次の通りに測定した。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、フランス、モールスハイム）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に溶解した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ２及び抗ＩＬ４に対しては４μｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮγに対しては８μｇ／ｍＬ、ＢＤファーミンジェン社製）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地により３７℃で１時間ブロッキングした。
【０１１５】
脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、５×１０⁵個／ウェルで様々な濃度のＮＰペプチドと共にインキュベートした。プレートは３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、ビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（２μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％−ＦＢＳ ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）に溶解したもの（１００μＬ／ウェル）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）によって開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次に、プレートを室温で２４時間乾燥させた。
【０１１６】
データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリング）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）を用いて得た。結果は、脾臓１個当りのスポット形成コロニー（ＳＦＣ）の総数（ｎ＝３の平均）として図１９Ａに示す。対照として、ナイーブマウス、或いは１０⁵ＴＣＩＤ₅₀の生ＷＳＮインフルエンザウィルスを腹腔内注射投与したマウスを用いた。
【０１１７】
図１９Ａ〜１９Ｂに示す結果から、同族ペプチドを有するインフルエンザウィルス株によるウィルス免疫感作とは対照的に、Ｉｇ仲介ペプチド輸送は、ＩＦＮ−γ産生Ｔｃ１細胞を引き起こす上で効果的ではなかったことが分かる。しかし、Ｉｇ−ペプチドの投与によって、ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体の形成がもたらされ、ＩＬ−４産生Ｔｃ２細胞に存在する、顕著なＮＰ特異的ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞免疫が誘導された。
【０１１８】
実施例１９では、選択されたＡＰＣを疾患関連エピトープでｉｎ ｖｉｖｏローディングすることにより、エピトープ特異的自己反応性Ｔを除去するのではなく増殖することによって自己免疫の悪化状態が抑えられたことを示す。
ＳＪＬマウスに対し、完全フロイントアジュバントに乳化したラット脳ホモジネート（２００μＬ）を皮下注射投与し、６時間後及び２日後に、５０ｎｇの百日咳毒素で追加免疫を行った。マウスは、麻痺性疾患の悪化、進行性状態を示した。マウスの半数には、ＭＢＰエピトープを有する組換えイムノグロブリン（ｒｅｃＭＢＰ（Ｉ−Ａｓ）−ＩｇＧ）とＰＬＰエピトープを有する組換えイムノグロブリン（ｒｅｃＰＬＰ（Ｉ−Ａｓ）−ＩｇＧ）との組合せを、皮下注射投与した（疾患誘発後、８日目、１２日目、１８日目に１５０μｇ／分子を投与）。パネルＡには、処置マウス及び未処置マウスそれぞれの平均臨床スコアを示す（ｎ＝８）。
【０１１９】
７０日間の観察後、マウスを殺し、脾臓を回収し、ＥＬＩＳＰＯＴ分析を次の通り行った。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、フランス、モールスハイム）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に溶解した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ４に対しては４μｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮγに対しては８μｇ／ｍＬ、ＢＤファーミンジェン社製）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地により３７℃で１時間ブロッキングした。脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、１×１０⁶個／ウェルで２０μｇ／ｍＬのペプチド（ＰＬＰ或いはＭＢＰ）と共にインキュベートし、或いは培地のみでインキュベートしてバックグラウンドを評価した。
【０１２０】
プレートは３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、ビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（２μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％−ＦＢＳ ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）に溶解したもの（１００μＬ／ウェル）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）によって開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次に、プレートを室温で２４時間乾燥させた。
【０１２１】
データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリング）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）を用いて得た。結果（図２０Ｂ）は、ペプチド刺激条件下でのＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞の頻度に対してプロットした、添加ＰＬＰペプチド非存在下でのＩＬ−４産生Ｔ細胞コロニーの頻度として示した。完全四肢麻痺が進行しているマウス（１．５以上のスコア）は黒印で示した。四肢麻痺が進行していないマウスは白印で示した。図２０Ｃにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激条件下での脾臓１個当りのＩＬ−４スポット形成コロニー総数（平均±ＳＥＭ）はｎｉｌ、ＭＢＰ或いはＰＬＰペプチドで示した。ＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照で処置したマウス由来の脾細胞から成る追加対照（additional control）を用いた。これと並行して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養を中和抗ＩＬ−４ｍＡｂ（４０μｇ／ｍＬ）の存在下で行い、ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞の数をパネルＤに示した。
【０１２２】
図２０Ａ〜Ｄに示す結果から、組換えＩｇＧを用いたＭＢＰエピトープとＰＬＰエピトープの同時投与によって、疾患の慢性進行が有意に抑制されたことが分かる。麻痺が進行しなかったマウスは、意外にも、自己エピトープであるＭＢＰとＰＬＰに対する反応性の向上を示したが、これはそれぞれ、ベースライン及びペプチド刺激ＩＬ−４産生或いはベースライン及びペプチド刺激ＩＦＮ−γ産生の増強によって明白に示されている。最後に、ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞の反応性はＩＬ−４によって抑制されるが、これは、ＩｇＧ仲介エピトープ輸送によって引き起こされる複雑な免疫調節メカニズムを示唆している。
【０１２３】
実施例２０では、実施例１〜１９で提供されたデータに基づき、ＩｇＧ／ＦｃγＲ仲介によるエピトープ輸送がＴ細胞応答に及ぼす影響について要約する。
先ず、ＡＰＣのローディング（the loading of APC）、ＩｇＧ仲介によるＴ細胞エピトープ輸送に対するＴ細胞応答は、機能的に対抗する２種類のレセプター、即ち、ＡＰＣ上のＩＴＩＭＦｃ（γ⁺）保有レセプターとＩＴＡＭＦｃ（γ⁺）保有レセプターによって制御される。ＩＴＩＭ⁺ＦｃγＲＩＩＢはＴ細胞の活性化の度合いを制限し、γ⁺ＦｃＲは、エピトープがＩｇＧバックボーン経由で輸送される際に、ＭＨＣ−ペプチド複合体の効果的な形成に必要である。このようなエピトープのｉｎ ｖｉｖｏ輸送によって、胸腺ＡＰＣ上ではなく、末梢ＣＤ１１ｃ⁺ＡＰＣ及びＣＤ１１ｂ⁺ＡＰＣ上でのＭＨＣ−ペプチド複合体の効果的な形成がもたらされる。しかし、ＩＴＩＭ⁺ＦｃγＲとＩＴＡＭ⁺ＦｃγＲとの相互作用によって、得られるＴ細胞応答の性質や大きさを実験を行わずに予測することは困難となる。
【０１２４】
図２１に示すデータから、ＩｇＧ仲介によるペプチドエピトープ輸送によって、同時刺激が制限された場合に（in context of）、ペプチドでロードしたＡＰＣへのＴ細胞の曝露がもたらされ、ナイーブＴ細胞と活性化したＴ細胞への作用が差別的になる（即ち、１）Ｔｈ２細胞、Ｔｃ２細胞、Ｔｈ３細胞及びＴｒ１細胞の新しい誘導、及び２）活性化したＴｒ１細胞及びＴｈ３細胞の刺激による活性化したＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞のダウンレギュレーション）ことが分かる。全体的な作用は、（Ｔｈ１及びＴｃ１免疫に関連する）炎症誘発性ではなく、免疫調節性である。
【０１２５】
実施例２１．天然のｄｓＲＮＡは、自然免疫応答と適応免疫応答を橋渡しする。実施例２１では、インフルエンザウィルス感染により産生された天然の非感染性二本鎖ＲＮＡが、タンパク質抗原に対する特定の免疫応答に関し、大きな影響を及ぼすことを示す。
許容ＭＤＣＫ細胞をＷＳＮインフルエンザウィルス（１０⁸ＴＣＩＤ₅₀／１×１０⁹細胞）に感染させ、２４時間後、細胞を回収して洗浄し、ＲＮＡ分離キット（キアゲン社、カリフォルニア州バレンシア）で全ＲＮＡを抽出した。更に、ＲＮＡｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮＡｓｅＩ（ストラタジーン社、カリフォルニア州サンディエゴ）でＲＮＡを更に精製した。次に、Ｓ１ヌクレアーゼ（アンビオン社（Ambion, Inc.）、テキサス州オースチン）（５Ｕ／ＲＮＡμｇ）と共に３７℃で３０分間インキュベートし、サンプル中の一本鎖ＲＮＡを除去した。分解前後に、ゲル電気泳動によりＲＮＡを分析した。精製ｄｓＲＮＡには感染性がないことを、標準的なインフルエンザウィルス滴定により確認した。対照として、１０⁹個の非感染ＭＤＣＫ細胞から同様に精製し処理した材料を用いた。核酸濃度は分光測定法（Ａ_260mm）により測定し、エンドトキシンがないことはリムルスアッセイにより確認した。精製ｄｓＲＮＡ及び対照のＲＮＡは、単独で、或いはｇｐ１４０組換え抗原（２５μｇのＲＮＡと２μｇの抗原を２５ｍＬの無菌ＰＢＳに溶解したもの）との混合物として用いた。
【０１２６】
感染性のないことを確認した後、４０μｇのｄｓＲＮＡ或いは対照ＲＮＡを４０μｇの組換えトランケート抗原（ＨＩＶエンベロープのｇｐ１４０）と混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに経鼻注入（ｎ＝３／群）により投与した。付加的な対照として、４０μｇのｇｐ１４０タンパク質を生理食塩水に溶解したもので免疫感作した動物（ｎ＝３／群）を用いた。マウスへの追加免疫をプライミング２週間後に一度行った。追加免疫の２週間後、血液を採取し、血清を調製し、ｇｐ１４０に対する抗体反応をＥＬＩＳＡにより測定した。即ち、ウェルを抗原（２μｇ／ｍＬのｇｐ１４０）でコーティングし、ＳｅａＢｌｏｃｋ（ピアース社、イリノイ州ロックフォード、カタログ番号３７５２７）でブロッキングした。血清と気管支肺胞洗浄液の段階希釈液は、室温で少なくとも２時間インキュベートした。洗浄後、アルカリホスファターゼ（シグマ社、カタログ番号Ａ７４３４）結合抗マウスＩｇＧ抗体を用いたアッセイを行った後、基質（ｐＮＰＰ、シグマ社、カタログ番号Ｎ２７６５）を添加し、ＳｏｆｔＭａｘソフトウェアを備えた自動マイクロタイタープレートリーダー（モレキュラーデバイス社、ＴｈｅｒｍｏＭａｘ）で測定した。
【０１２７】
図２２Ａは実験の一般原理を示す。図２２Ｂは、全ＩｇＧを用いた場合の各血清希釈液のアッセイ実施後の吸収を示す。図２２Ｂは、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１抗体アイソタイプを用いた場合の１／５０血清希釈液の吸収を示す。
【０１２８】
全体としては、図２２Ａ〜Ｂのデータから、インフルエンザウィルスに感染したＭＤＣＫ細胞からの天然の非感染性ｄｓＲＮＡは、プロトタイプ抗原に対する適応応答を増強する効果が予想外に高いことが分かる。ＩｇＧ１抗体反応及びＩｇＧ２ａ抗体反応も亢進したことから、強いＴヘルパー１及びＴヘルパー２反応が誘導されたことが分かる。
【０１２９】
実施例２２．自然免疫応答に対する選択したＲＮＡモチーフの作用：異種モチーフ。この実施例は、各種合成ＲＮＡモチーフが、意外にも、タンパク質抗原に対する適応特異的免疫応答に別個の作用を有することを示す。
図２３Ａは、合成ＲＮＡモチーフを広く含むライブラリーを示し、合成ＲＮＡモチーフは複数のプールにグループ分けされて次の２段階のタイタースクリーニング工程に用いられる。
（Ａ）マウスを各ＲＮＡプールで気管内免疫感作し、経鼻注入による追加免疫を２週間毎に２回行った。抗体反応はＥＬＩＳＡにより測定し（図２３Ｂ）、結果はＩｇＧエンドポイントタイターの平均±ＳＥＭとして示した（ｎ＝４／群）。対照として、ＯＶＡを無菌ＰＢＳに溶解したもの、ＯＶＡをコレラ毒サブユニットＢ（ＣＴＢ）と一緒に用いたもの、及びＰＢＳのみをそれぞれ用量を合わせて用いた。即ち、ウェルを抗原（１０μｇ／ｍＬのＯＶＡ）でコーティングし、ＳｅａＢｌｏｃｋ（ピアース社、イリノイ州ロックフォード、カタログ番号３７５２７）でブロッキングした。血清と気管支肺胞洗浄液の段階希釈液は、室温で少なくとも２時間インキュベートした。洗浄後、アルカリホスファターゼ（シグマ社、カタログ番号Ａ７４３４）結合抗マウスＩｇＧ抗体を用いたアッセイを行った後、基質（ｐＮＰＰ、シグマ社、カタログ番号Ｎ２７６５）を添加し、ＳｏｆｔＭａｘソフトウェアを備えた自動マイクロタイタープレートリーダー（モルキュラーデバイス社、ＴｈｅｒｍｏＭａｘ）で測定した。
【０１３０】
（Ｂ）ＯＶＡに対する抗体反応の誘導に与える各種ｄｓＲＮＡモチーフの影響：結果を図２３Ｃに示す。データは独立した２種類の実験結果である。ＩＮＳＥＴ：ＯＶＡに対する平均ＩｇＧ２ａタイターとＩｇＧ１タイターの比。この実験のために、ビオチンコンジュゲート抗マウスＩｇＧ１抗体及びＩｇＧ２ａ抗体を用い、ストレプトアビジン−ＡＫＰコンジュゲートと共にインキュベートした。左右の順序は図２３Ｃのメインパネルと同様である：ＰＢＳ ＯＶＡ、ＣＴＢ ＯＶＡ、ｐＣ：ｐＧ ＯＶＡ、ｐＩ：ｐＣ ＯＶＡ及びｐＡ：ｐＵ ＯＶＡ。
【０１３１】
（Ｃ）雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、ＯＶＡ及び各種ｄｓＲＮＡモチーフにより誘導されたＴ細胞応答の大きさ及びプロフィル。細胞応答の測定のために、脾臓を７０ミクロンナイロンファルコンストレーナ（ベクトンディッキンソン社、カタログ番号３５２３５０）に付し、次いで赤血球溶解緩衝液（シグマ社、カタログ番号Ｒ７７５７）によって赤血球を溶解することにより脾臓細胞浮遊液を得た。肺組織をコラゲナーゼ（シグマ社、カタログ番号Ｃ９８９１）で消化し、次いでフィコールパーク（アマシャムファルマシア社、カタログ番号１７−１４４０−０２）勾配遠沈によって、肺関連脂質組織からリンパ球を単離した。Ｔ細胞応答はＥＬＩＳＰＯＴ分析によって次のように測定した。９６ウェルの４５ミクロン混合セルロースエステルプレート（ミリポア社、カタログ番号ＭＡＨＡ Ｓ４５１０）を、４μｇ／ｍＬのラット抗マウス抗ＩＦＮγ、抗ＩＬ−２或いは抗ＩＬ−４モノクロナール抗体（ＢＤファーミンジェン社、カタログ番号５５４４３０、カタログ番号１８１６１Ｄ、カタログ番号５５４３８７）でコーティングした。１０％ＦＣＳを含む無菌生理食塩水により３７℃で１時間ブロッキングした後、脾臓細胞浮遊液を抗原／ペプチドと共に、或いは抗原／ペプチド無しで、５×１０⁵細胞／ウェルで添加した。刺激のために、段階的に量を変えた抗原（ＯＶＡ）を用いた。刺激から７２時間後、ビオチン化ラット抗マウスサイトカイン抗体（ＢＤファーミンジェン社）、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ（バイオソース社、カリフォルニア州カマリロ）と不溶性ＡＥＣ基質を用いたアッセイを行った。結果は多重パラメータ解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ、メディアサイバネティックス社）を備えた自動イメージングシステム（Ｎａｖｉｔａｒ／Ｍｉｃｒｏｍａｔｅ）を用い測定した。結果を、脾臓１個当りのＩＦＮ−γ及びＩＬ−４スポット形成コロニー（ＳＦＣ）の数の平均±ＳＥＭとして図２３Ｄに示す（ｎ＝４／群）。結果は独立した２種類の実験結果である。
【０１３２】
図２３Ｂ〜Ｄに示す結果から、各合成ＲＮＡは、プロトタイプのタンパク質抗原に対するＢ細胞応答及びＴ細胞応答に対し増強作用を有することがわかる。更に、各モチーフは、特定のヌクレオチドの組合せを含むが、Ｔ１対Ｔ２誘導及びその後のイムノグロブリンアイソタイプスイッチングに関し、モチーフによって異なる特定の効果を有する。
【０１３３】
実施例２３．選択された合成ＲＮＡモチーフを用いることにより、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔｃ１細胞の誘導が促進され、ＩＦＮ−γが産生される。
（Ａ）ｄｓＲＮＡモチーフにより刺激されるクロスプライミングをＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて検討した。マウスは、１０μｇの人工的に組み換えたＨＩＶ ｇｐ１４０抗原とｐＡ：ｐＵとで処理（プライミング＋２回の追加免疫）して用いた。応答は、実施例２２に記載したように、Ｖ３ドメイン由来のＭＨＣクラスＩ拘束性コグネイトペプチドＲ１０Ｋによるｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激を用いたＥＬＩＳＰＯＴ分析により測定した。対照として、用量を合わせたｇｐ１４０抗原を用いた。結果を、脾臓１個当りのＩＦＮ−γ及びＩＬ−４ ＳＦＣの数（ｎ＝４／群）の平均±ＳＥＭとして図２４Ａに示す。
【０１３４】
（Ｂ）ｄｓＲＮＡモチーフにより刺激されるクロスプライミングを、１００μｇの全ＯＶＡとｐＡ：ｐＵとで処理したＣ５７ＢＬ／６マウスを用いて検討した。検討は、実施例２２に記載したように、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ［配列番号 ］によるｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激を用いたＥＬＩＳＰＯＴ分析により測定した。対照として、用量を合わせた、生理食塩水或いは無菌ＰＢＳに溶解したＯＶＡ抗原を用いた。結果を、脾臓１個当りのＩＦＮ−γ及びＩＬ−４ ＳＦＣの数（ｎ＝４／群）の平均±ＳＥＭとして図２４Ｂに示す。
【０１３５】
図２４Ａ〜Ｂに示す結果から、大きな抗原（ポリペプチド）に含まれる各種ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドに対し、選択された合成ＲＮＡモチーフがＴ細胞免疫の亢進を促進できたことがわかる。この免疫応答は、ＩＦＮ−γを産生するＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞に含まれるＴｃ１成分を含む。
【０１３６】
実施例２４では、予想外ではあるが、合成ＲＮＡモチーフはそれぞれ異なるレセプターに結合すること、即ち、ＲＮＡモチーフを区別する複数のレセプターが存在することを示す。
ＣＤ１１ｂ⁺ ＡＰＣへの蛍光タグ化ｐＡ：ｐＵのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける結合をＦＡＣＳ分析により測定した。ＭＡＣＳ分離ＡＰＣを４℃で３０分間、１０μｇ／ｍＬのタグ化ｐＡ：ｐＵ（［ＰＡ：ｐＵ］−Ｆ）と共にインキュベートし、洗浄して分析した。これとは別に、ＡＰＣをそれぞれ２０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬの非タグ化ｐＡ：ｐＵ、ｐＡ或いはｐＩ：ｐＣと共に１０分間プレインキュベートし、タグ化ｐＡ：ｐＵで染色してＦＡＣＳ分析を行った。染色された細胞（白い領域）、染色されていない細胞（黒い領域）のプロファイルと、染色程度の高いＡＰＣの百分率とを各パネルに示す（ｘ軸は対数）。データは、独立した２種類の測定結果を示し、各サンプルに対し１００００回測定したものである。
【０１３７】
材料：
１．マウスＣＤ１１ｂ及びＣＤ１１ｃ磁気分離ビーズ：ミルテニイバイオテック社、それぞれカタログ番号１３０−０４９−６０１及びカタログ番号１３０−０５２−００１；
２．ＵＬＹＳＩＳ核酸標識キット：Ａｌｅｘａ４８８、モレキュラープローブス社、カタログ番号Ｕ２１６５０；
３．ＲＮＡモチーフ：
・ｐＡ：ｐＵ、（シグマ社、ロット番号２２Ｋ４０６８）；
・ｐＩ：ｐＣ、（シグマ社、ロット番号５２Ｋ４０４７）；
・ｐＡ、（シグマ社、ロット番号２２Ｋ４０２２）；
４．ＦＡＣＳ緩衝液：ＰＢＳ、１％ ＦＣＳ、０．１％アジ化ナトリウム；
５．ＭＡＣｓ緩衝液：ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＢＳＡ；
６．コラゲナーゼ緩衝液：０．２２５ｍｇ ＢＳＡ及び０．００６２ｍｇ コラゲナーゼを５０ｍＬ ＲＰＭＩに溶解したもの；
７．７０μｍ細胞ストレーナ：（ファルコン／ベクトンディッキンソン社、カタログ番号３５２３５０）
【０１３８】
方法：
Ｉ．ＲＮＡモチーフの標識：
１．次のプロトコルにより、各ＲＮＡモチーフをＵＬＹＳＩＳ Ａｌｅｘａ４８８標識でタグ化した。
ＩＩ．脾臓細胞の調製：
１．Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌性、４匹）から脾臓細胞及び肺細胞を単離；
・肺細胞は、脾臓細胞とは異なり、切り刻んだ後、コラゲナーゼ緩衝液中３７℃で３０分間インキュベートしてから、次のステップに進むことを要する；
・７０μｍファルコン細胞ストレーナを通す；
・洗浄後、再度ＭＡＣＳ緩衝液に懸濁させる：
２．推奨プロトコルに従い、ＣＤ１１ｂ特異的或いはＣＤ１１ｃ特異的ＭＡＣＳビーズで標識する；
３．次いで細胞に次の処理を行った：
・非タグ化ｐＡ、ｐＡ：ｐＵ、或いはｐＩ：ｐＣ（２０或いは１００μｇ／ｍＬ）、室温、１０分間；
・各モチーフの染料：ｄｓＲＮＡ比に合うように、ＵＬＹＳＩＳタグ化ｐＡ及びｐＡ：ｐＵ（それぞれ１．５μｇ／チューブ及び１０μｇ／チューブ）を添加した。
４．混合、氷上で３０分間インキュベート。
５．洗浄（１回）し、ＦＡＣＳ緩衝液に再度懸濁。
ＩＩＩ．フローサイトメトリー：
フローサイトメトリー分析を行い、タグ化ＲＮＡモチーフと非タグ化ＲＮＡモチーフの競合阻害及び細胞レセプターの結合を測定／比較する。
【０１３９】
図２５に示す結果から、ｐＡ：ｐＵ及びｐＩ：ｐＣは、異なる細胞レセプターに結合することが分かる。ｐＩ：ｐＣはＴＬＲ３に結合するため、ＴＬＲ３とは異なる別のレセプターがＲＮＡ認識免疫機能に関与していることが分かる。
【０１４０】
実施例２５では、選択された合成ＲＮＡモチーフが、免疫学的活性に重要な、ケモカイン遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏでの発現を引き起こすことを示す。
ｄｓＲＮＡモチーフによるケモカイン遺伝子発現の局所的なアップレギュレーションを、経気道投与１日後に抽出した肺組織からのＲＮＡを用いたＤＮＡアレイ技法により測定した。全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社、カリフォルニア州バレンシア）を用いて肺から単離した。このＲＮＡをＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅＩ（ストラタジーン社、カリフォルニア州サンディエゴ）で処理し更に精製した。ＤＮＡアレイはスーパーアレイ社（メリーランド州ベセスダ）のＮｏｎｒａｄ−ＧＥＡｒｒａｙキットを用い行った。即ち、ｃＤＮＡプローブをビオチン−１６−ｄＵＴＰを含有するｄＮＴＰｍｉｘと共にＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて合成した。ＧＥＡｒｒａｙ膜を６８℃で１〜２時間プリハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションは、ビオチン標識ｃＤＮＡと共に膜をインキュベートすることにより行った。ハイブリダイズした膜を、２×ＳＳＣ−１％ＳＤＳで２回、０．１×ＳＳＣ−０．５％ＳＤＳで２回洗浄した。膜をアルカリホスファターゼ抱合型ストレプトアビジン（バイオソース社、カリフォルニア州カマリロ）と共に更にインキュベートし、最終的に、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ化学発光基質を用い現像した。シグナルの強度は、Ｇｅｌ−Ｐｒｏソフトウェアを備えたＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ解析システム（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリングス）によって測定した。
【０１４１】
結果は、非処理マウスの肺組織で測定された発現レベルに対する遺伝子発現の増加倍率で示す。ｄｓＲＮＡ（５０μｇのｐＡ：ｐＵ及びｐＩ：ｐＣ）により引き起こされたケモカインの発現パターンを、１μｇのＬＰＳにより誘導されたパターンと比較した。Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞上のレセプターと選択的に結合したケモカインを、それぞれ実線及び破線で囲った。
【０１４２】
図２６に示す結果から、ｐＡ：ｐＵ及びｐＩ：ｐＣは広範な種類のケモカインの発現を引き起こし、その発現パターンはモチーフに依存し且つＬＰＳ（エンドトキシン）のパターンとは異なることが分かる。
【０１４３】
実施例２６では、選択された合成ＲＮＡモチーフは、肺ウィルスによる感染を制御できる免疫防御を高めることを示す。
各ｄｓＲＮＡモチーフは、インフルエンザウィルス感染に対する免疫防御を高める能力が異なる。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスを、亜致死量のインフルエンザウィルスによる肺感染の１日前及び後に、経呼吸器ルートで５０μｇのｐＩ：ｐＣ、ｐＡ：ｐＵ或いは５０μＬの生理食塩水で処理した。ウィルスチャレンジのために、Ｃ５７ＢＬ／６及びＴＬＲ４−／−Ｃ₃Ｈ／ＨｅＪマウスを、メトファン麻酔下で亜致死量（ＴＣＩＤ₅₀：１０⁴組織培養感染量５０％）の生ＷＳＮウィルスに経鼻感染させた。感染５日後、マウスを殺し肺を摘出し、ホモジネートして−７０℃で保存した。ウィルスタイターは、許容ＭＤＣＫ細胞による試料の段階希釈液を４８時間インキュベートし、次いでニワトリ赤血球細胞（アニマルテクノロジー社から入手）による標準血球凝集反応により測定した。エンドポイントタイターは３回の測定の補間によって評価し、ＴＣＩＤ₅₀／器官として表した（平均±ＳＥＭ；ｎ＝６／群；結果はＣ₃Ｈ／ＨｅＪ ＴＬＲ−４−／−マウス及びコンピテントマウスにおける独立した２種類の試験の結果である）。ＴＬＲ４コンピテントのＣ５７ＢＬ／６マウスでも同様の結果が得られた。
【０１４４】
図２７に示す結果から、選択された合成ＲＮＡモチーフを用いることによりインフルエンザウィルスの複製を制御できることが分かる（ｄｓＲＮＡ１はｐＡ：ｐＵであり、ｄｓＲＮＡ２はｐＩ：ｐＣである）。
【０１４５】
実施例２７では、選択された複数の合成ＲＮＡモチーフを同時投与することにより、高用量の標準抗原に対する免疫寛容が破壊されることを示す。
ｄｓＲＮＡモチーフは、ヒトＩｇＧを注射投与したマウスにおいて高域寛容を阻止する。先ず、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を寛容原性用量である２００μｇのｈＩｇＧのみ（黒印）、又はこれと１００μｇのｐＩ：ｐＣ或いはｐＡ：ｐＵを一緒に（白印）静脈内注射し、免疫原性用量である１００μｇのｈＩｇＧのＣＦＡ乳化物を皮下注射し追加免疫を行った。ｈＩｇＧに対する抗体のタイターをＥＬＩＳＡにより（コーティングに１０μｇ／ｍＬのｈＩｇＧを用いた以外は実施例２３と同様に）測定した。測定は、最初の注射後、各時間に行った。対照として、１００μｇのｈＩｇＧのＣＦＡ乳化物で免疫感作したマウスを用いて得た最大タイターをグラフに示す（破線）。
【０１４６】
結果は、エンドポイントタイターの平均±ＳＥＭとして図２８に示す（ｎ＝５／群）。ＴＬＲ４欠損（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ）マウス及びＬＰＳ−応答性Ｃ３Ｈ／ＳｎＪマウスでも同様の結果が得られた。このように、図２８に示す結果から、選択された合成ＲＮＡモチーフであるｐＩ：ｐＣ及びｐＡ：ｐＵは、大量の精製タンパク質投与に通常伴う高域寛容を著しく阻害することが分かる。
【０１４７】
実施例２８では、選択されたＲＮＡモチーフが、ヒトＡＰＣによる各種サイトカインの産生を誘導することを示す。
分化後のヒトＴＨＰ−１単球細胞を各種濃度の合成ＲＮＡ（ｐＡ：ｐＵ、ｐＩ：ｐＣ或いはｐＡ）と共に２４時間インキュベートし、細胞上清を回収した。ＩＬ−１２及びＴＮＦ−αの濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、各培養条件に対する各サイトカインのｐｇ／ｍＬ（濃度）として図２９に示す。
【０１４８】
材料：
１．ＴＨＰ−１ヒト単球細胞系：ＡＴＣＣ、カタログ番号ＴＩＢ−２０２；
２．ＩＬ−１２サイトカイン：ヒトＥＬＩＳＡ、ＩＬ−１２超感受性（ＵＳ）カタログ番号ＫＨＣ０１２３；
３．ＴＮＦαサイトカイン：ヒトＥＬＩＳＡ、ＴＮＦα カタログ番号ＫＨＣ３０１２；
４．ＲＮＡモチーフ：
・ｐＡ：ｐＵ、（シグマ社、ロット番号２２Ｋ４０６８）;
・ｐＩ：ｐＣ、（シグマ社、ロット番号５２Ｋ４０４７）;
・ｐＡ、（シグマ社、ロット番号２２Ｋ４０２２）
【０１４９】
方法：
１．ＴＨＰ−１細胞に、１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡを加え、１０％ＦＣＳを含有する培地において分化させた。
２．細胞を穏やかに洗浄し、ＦＣＳを含まない培地（ＨＬ−１）を加え、処理物（ＲＮＡモチーフ及び対照）（濃度：３〜１００μｇ／ｍＬ）を付着性ＴＨＰ−１細胞に添加した。
３．２４時間インキュベートした後、細胞上清を回収し、ＩＬ−１２及びＴＮＦαの濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１５０】
図２９に示す結果から、選択された合成ＲＮＡモチーフはヒト単球細胞に作用し、この作用はモチーフ（ヌクレオチド組成物）の化学構造によって不均一であることがわかる。合成ＲＮＡモチーフ全てではないが、選択された合成ＲＮＡモチーフは、ヒト単球細胞による、重要なＴ１調節サイトカインであるＩＬ−１２の産生を引き起こすことができる。
【０１５１】
実施例２９では、２種類の別個の合成ＲＮＡモチーフがヒトＴＨＰ−１単球細胞に結合するときに、互いに異なるレセプターと相互作用を示すことを示す。
ＴＨＰ−１細胞を、様々な量の非標識合成ＲＮＡと共に室温で１５分間インキュベートした。次に、タグ化したｐＡ：ｐＵを４℃で３０分間添加し、細胞を洗浄し、蛍光をＦＡＣＳ分析により定量した。結果を図３０Ａ及び３０Ｂに棒グラフとして示す。図３０Ａは大型細胞のサブセットを示し、図３０Ｂは全細胞集団を示す。染色された細胞の百分率を各図に示した。
【０１５２】
材料：
１．ＵＬＹＳＩＳ：核酸蛍光標識（モレキュラープローブス社、カタログ番号Ｕ−２１６５０）
２．ＲＮＡモチーフ：
・ｐＡ：ｐＵ、（シグマ社、ロット番号２２Ｋ４０６８）;
・ｐＩ：ｐＣ、（シグマ社、ロット番号５２Ｋ４０４７）；
３．Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌカラム：（ピアース社、カタログ番号２０３４４）
【０１５３】
方法：
ポリアデニル−ポリウリジル酸（ｐＡ：ｐＵ）の標識：
１．Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌカラムを用いてエンドトキシンを除去した後、ｐＡ：ｐＵの標識を、ＵＬＹＳＩＳ核酸標識システムを用いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８蛍光染料により行った。
２．概略：
・酢酸ナトリウム及びエタノールを用いて−７０℃でｐＡ：ｐＵを沈澱させた。
・ｐＡ：ｐＵを熱変性させ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８試薬により９０℃で標識した。
・反応を停止させ、標識されたｐＡ：ｐＵをエタノール沈澱させた。
【０１５４】
細胞の処理：
１．ＴＨＰ−１細胞を２×１０⁶細胞／ｍＬの濃度で懸濁させた。
２．この懸濁液（５０μＬ、５×１０⁴細胞）を１２×７５ｍｍチューブに入れた。
３．非タグ化ｐＡ：ｐＵ或いはｐＩ：ｐＣを２０或いは１００μｇ／ｍＬの濃度でＴＨＰ−１細胞に添加し、１５分間インキュベートした。
ＵＬＹＳＩＳ標識されたｐＡ：ｐＵを１００μｇ／ｍＬの濃度で３０分間、氷上で添加した。
４．ＴＨＰ−１細胞を１回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に懸濁させた後、フローサイトメトリー分析を行って、異なる処理を施した集団間の蛍光の相対差を測定した。
【０１５５】
図３０Ａ〜３０Ｂに示す結果から、非タグ化ｐＡ：ｐＵは、大型細胞のサブセット及び全細胞集団の両方のレベルにおいてタグ化ｐＡ：ｐＵのヒトＴＨＰ−１単球細胞への結合に対して競合（compete out）できるが、非タグ化ｐＩ：ｐＣは競合できないことがわかる。
【０１５６】
実施例３０では、アジュバント合成ＲＮＡを、最も有効な形式で使用するために事前にどのように調製・精製するかを示す。
バルク合成ＲＮＡ材料を標準的な有機合成法により得る。その後、エンドトキシンを含まない無菌生理食塩水にこの材料を溶解し、ＬＰＳ濃度が０．００５ＥＵ／μｇを下回るようになるまでエンドトキシン除去カラムに通す。ＬＰＳの測定は標準的なリムルスアッセイにより行う。その後、材料を一連の遠沈工程に付し、有孔率が規定されたフィルタを通して分画する（図３１参照）。
【０１５７】
有用な画分は、サイズが２０ｂｐ未満から最大１００ｂｐの合成ＲＮＡを含むが、より大きいＲＮＡ断片を用いてもよい。精製後、材料を標準的な各種アッセイ、即ち分光測光（ＯＤ２６０ｎｍ）；ゲル電気泳動；リムルスアッセイによるエンドトキシンの定量；ヒトＴＨＰ−１細胞に対する生物学的活性（実施例２８と同様）により測定し評価する。
【０１５８】
実施例３１では、選択された合成ＲＮＡ化合物の各画分は、意外にも、ＲＮＡのサイズによって生物学的活性が異なることを示す。
分化したヒトＴＨＰ−１単球細胞を、異なる濃度の合成ＲＮＡ（ｐＡ：ｐＵ、実施例３０に記載したように分画した）と共に２４時間インキュベートし上清を回収した。ＴＮＦ−αの濃度をバイオソースインターナショナル社（カリフォルニア州カマリロ）のキットを用いてＥＬＩＳＡにより測定した。結果を、図３２に培養条件毎にｐｇ／ｍＬ（濃度）として示す。
【０１５９】
図３２に示す結果から、選択された合成ＲＮＡ化合物の分子量が小さい程、その画分は、ヒト単球ＴＨＰ−１細胞によるサイトカイン産生に関する生物学的活性が高いことが分かる。
【０１６０】
実施例３２．選択された合成ＲＮＡモチーフは、意外にも、モチーフによって抗ＲＮＡ抗体の産生に関する免疫プロファイルが異なる。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、腹腔内及び皮下経由で５０μｇ＋５０μｇのｈＩｇＧ及び合成ＲＮＡ（ｐＩ：ｐＣ或いはｐＡ：ｐＵ）で免疫感作し、１週間後血清サンプルを調製した。対照として、生理食塩水に溶解したｈＩｇＧを注射投与したマウスを用いた。ｐＡ：ｐＵ、ｐＩ：ｐＣ、ｐＡ及びｈＩｇＧに対する抗ｈＩｇＧ及びｄｓＲＮＡ ＩｇＧ抗体タイターをＥＬＩＳＡにより測定した。即ち、ウェルを抗原（１０μｇ／ｍＬのｈＩｇＧ或いは合成ＲＮＡ）でコーティングし、ＳｅａＢｌｏｃｋ（ピアース社、イリノイ州ロックフォード、カタログ番号３７５２７）でブロッキングした。血清と気管支肺胞洗浄液の段階希釈液は、室温で少なくとも２時間インキュベートした。洗浄後、アルカリホスファターゼ（シグマ社、カタログ番号Ａ７４３４）結合抗マウスＩｇＧ抗体を用いたアッセイを行った後、基質（ｐＮＰＰ、シグマ社、カタログ番号Ｎ２７６５）を添加し、ＳｏｆｔＭａｘソフトウェアを備えた自動マイクロタイタープレートリーダー（モルキュラーデバイス社、ＴｈｅｒｍｏＭａｘ）で測定した。
【０１６１】
結果を、エンドポイントタイターの平均±ＳＥＭ（ｎ＝３／群）として図３３に示す。図３３に示す結果から、ｐＩ：ｐＣは、ｐＡ：ｐＵと異なり、それ自身に対する抗体反応を誘導し、別のＲＮＡモチーフに対する交叉反応性成分を有することが分かる。
【０１６２】
実施例３３．組換えＩｇＧをＡＰＣにｉｎ ｖｉｖｏでローディングすると、付加的な条件を満たした場合のみ、Ｔｃ１型のＭＨＣクラスＩ応答が発生する。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、５０μｇの選択された合成ＲＮＡ（ｐＡ：ｐＵ或いはｐＩ：ｐＣ）と混合した５０μｇのｒｅｃＩｇＧ−ＮＰ（Ｋｄ）で皮下免疫感作した。対照として、ナイーブマウス或いは組換えＩｇＧのみで免疫感作したマウスを用いた。免疫感作３週間後、Ｔ細胞応答を次の通りＥＬＩＳＰＯＴ分析により測定した。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、フランス、モールスハイム）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に溶解した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ４に対しては４μｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮγに対しては８μｇ／ｍＬ、ＢＤファーミンジェン社製）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地により３７℃で１時間ブロッキングした。脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、５×１０⁵個／ウェルでＮＰ１４７−１５５ペプチドと共にインキュベートし、或いは培地のみでインキュベートしてバックグラウンドを評価した。プレートは３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、ビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（２μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％−ＦＢＳ ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）に溶解したもの（１００μＬ／ウェル）と共に４℃で一晩インキュベートした。
【０１６３】
翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）によって開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次に、プレートを室温で２４時間乾燥させた。
【０１６４】
データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリング）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）により得た。サイトカイン産生Ｔ細胞がＮＰペプチドと反応する頻度を測定し、刺激に使用されたペプチドの量に対して示した。結果を三連のデータの平均＋ＳＥＭ（ｎ＝３マウス／群）として示す。
【０１６５】
先に図１９で示したように、ＮＰ ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを有する組換えＩｇＧの投与によって、Ｔｃ２免疫は発生するがＴｃ１応答は発生しないが、これは、特定の同時刺激プロファイルを有するクラスＩペプチド複合体がｉｎ ｖｉｖｏで形成されたことを示唆している。図３４Ａ及び３４Ｂに示す結果から、選択された複数の合成ＲＮＡを同時に使用することにより、ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープのＩｇＧ仲介による輸送に続き、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γの効果的な誘導が促進されることが分かる（ｄｓＲＮＡ１はｐＡ：ｐＵであり、ｄｓＲＮＡ２はｐＩ：ｐＣである）。
【０１６６】
実施例３４：ＦｃγＲによるＡＰＣローディングとＲＮＡレセプターによる活性化の同時操作による、ＭＨＣクラスＩペプチドの効果的形成とその結果のＴ細胞応答の指示
脾臓ＡＰＣをナイーブＢＡＬＢｃマウスから単離し、１μｇのＮＰペプチド、或いは５０μｇのｒｅｃＩｇＧ−ＮＰ（Ｋｄ）を単独で或いは５０μｇ／ｍＬの選択された合成ｄｓＲＮＡ（ｐＡ：ｐＵ）を組合せたもので、ｅｘ ｖｉｖｏでのパルシングを一晩行った。細胞を洗浄し、５×１０⁶個の細胞をナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスにｓ．ｃ．及びｉ．ｐ．で等量投与した。３週間後、応答を次の通りＥＬＩＳＰＯＴ分析により測定した：ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、フランス、モールスハイム）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に溶解した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ４に対しては４μｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮγに対しては８μｇ／ｍＬ、ＢＤファーミンジェン社製）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地により３７℃で１時間ブロッキングした。脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、５×１０⁵個／ウェルで３０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ或いは３μｇ／ｍＬのＮＰペプチドと共にインキュベートし、或いは培地のみでインキュベートしてバックグラウンドを評価した。プレートは３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、ビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（２μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％−ＦＢＳ ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）に溶解したもの（１００μＬ／ウェル）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）によって開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次に、プレートを室温で２４時間乾燥させた。
【０１６７】
データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリング）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）により得た。結果は、ｅｘ ｖｉｖｏ刺激に用いたペプチド濃度に対するサイトカイン産生スポット形成コロニーの頻度（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３マウス／群）として図３５に示す。更に、刺激に用いたペプチド濃度に対するエリア／コロニーの平均をＩＦＮ−γ及びＩＬ−４に対してプロットした（任意単位）。
【０１６８】
図３５に示す結果から、組換えＩｇＧによるＡＰＣのｅｘ ｖｉｖｏローディングは、ペプチド自体を使用する場合に比べ、ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体を形成し、Ｔｃ応答を発生させる上で顕著により効果的であることが分かる。更に、ＩｇＧ／ＦｃγＲによるエピトープの輸送後、ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体が単に形成された場合は、ＩＬ−４は産生するがＩＦＮ−γは産生しないＴｃ２細胞の分化が引き起こされる。選択された合成ＲＮＡでＡＰＣを同時に処理することにより、Ｔ細胞プロファイルがＩＦＮ−γ産生Ｔｃ１細胞にまで拡大される。
【０１６９】
実施例３５では、ＩｇＧ−ペプチドと選択された共刺激モチーフとを同時プライミングすることにより、ウィルス感染後にＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞のより効果的な二次増殖が起こることを示す。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ｒｅｃＩｇＧ−ＮＰ（Ｋｄ）とｐＡ：ｐＵとを別々に、或いはこれらを組み合わせて注射投与した（５０μｇ／注射）。対照として、ナイーブマウスを用いた。処理３週間後、マウスにＡ／ＷＳＮ／３２ Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルスの１０４ＴＣＩＤ５０を気道経由で感染させた。感染４日後、ＮＰペプチド刺激をｅｘ ｖｉｖｏで行った後、脾臓のＴ細胞プロファイルをＥＬＩＳＰＯＴ分析により次の通りに測定した。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、フランス、モールスハイム）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に溶解した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ２及び抗ＩＬ４に対しては４μｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮγに対しては８μｇ／ｍＬ、ＢＤファーミンジェン社製）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地により３７℃で１時間ブロッキングした。脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計数後、２０μｇ／ｍＬのＮＰペプチドと共に、或いは培地のみで５×１０⁵個／ウェルでインキュベートし、バックグラウンドを評価した。プレートは３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、ビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（２μｇ／ｍＬ）をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％−ＦＢＳ ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）に溶解したもの（１００μＬ／ウェル）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）によって開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次に、プレートを室温で２４時間乾燥させた。
【０１７０】
データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリング）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）により得た。結果は、サイトカイン産生コロニーを形成するＮＰ特異的ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞の頻度（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４マウス／群）として図３６に示す。
【０１７１】
図３６に示す結果から、選択された合成ＲＮＡの同時投与を実施すると、クラスＩ拘束性エピトープのＩｇＧ仲介輸送がクラスＩ拘束性Ｔｃ１応答のプライミングに最も効果的であることがわかる。このようなプライミングされた前駆体は、インフルエンザウィルス感染後、急速に増殖した。
【０１７２】
実施例３６では、ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを認識する細胞障害性リンパ球の最も効果的なプライミングは、ＩｇＧバックボーン内に挿入されたペプチドエピトープを選択されたＲＮＡモチーフと共に同時投与することにより生じることを示す。
上述の実施例と同様に、ＢＡＬＢｃマウスに対しｒｅｃＩｇＧ−ＮＰ（Ｋｄ）による免疫感作及びチャレンジを行い、インフルエンザウィルス感染４日後に殺した。脾臓細胞を調製し、ＨＬ−１培地に５００万個／ｍＬで懸濁し、５Ｕ／ｍＬの組換えＩＬ−２の存在下、１０μｇ／ｍＬのＮＰ１４７−１５５ペプチドと共に５日間同時インキュベートした。４マウス／群からの脾臓細胞をプールし、フラスコ中でインキュベートした。
【０１７３】
増殖後、生存細胞をフィコール勾配遠沈により回収し、洗浄後、種々の細胞数に分けてＶ底プレート中で５時間インキュベートした。インキュベーションは、固定数のｓｐ２０ターゲット細胞を添加し、ＮＰペプチド（２０μｇ／ｍＬ）の存在下或いは非存在下で行った。プレートの遠沈後、上清を回収し、ＬＤＨの濃度を、Ｐｒｏｍｅｇａキット（カタログ番号Ｇ１７８０）を用いて測定した。結果は、各Ｅ：Ｔ比（エフェクター対ターゲットの比）における比溶解（％）として示す。
【０１７４】
図３７に示す結果から、抗ウィルス細胞障害性Ｔ細胞の効果的なプライミングには、ＩｇＧにより輸送されたクラスＩ拘束性エピトープのｉｎ ｖｉｖｏでのＡＰＣへの効果的なローディングと、選択された合成ＲＮＡモチーフ（即ちｐＡ：ｐＵ）による適切な指示との両方が必要であることが分かる。
【０１７５】
実施例３７では、ウィルス性ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを有するＩｇＧと、選択された合成ＲＮＡモチーフとを一緒にワクチン投与することにより、プロトタイプウィルスによる感染チャレンジに対する防御が提供されることを示す。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５０μｇのｒｅｃＩｇＧ−ＮＰ（Ｋｄ）及び５０μｇの選択された合成ＲＮＡ（ｐＡ：ｐＵ）を皮下注射して免疫感作を行った。免疫感作３週間後、マウスに対し１０⁴ＴＣＩＤ５０の感染性ＷＳＮインフルエンザウィルスによりチャレンジを行い、５日後に殺した。次の標準ＭＤＣＫ血球凝集アッセイにより肺ウィルスを肺ホモジネートに滴定した：１日目、ＭＤＣＫ細胞を９６ウェルプレートに添加し（２×１０⁴個／ウェル／２００μＬ）、３７℃、５％ＣＯ₂で２４時間インキュベートした。翌日、肺ホモジネートのＤＭＥＭ培地１０倍希釈液（２５μＬ）をトリプシン処理ＭＤＣＫプレート中、３連で短時間（１分間）インキュベートした後、３７℃でインキュベートした。１時間後、１７５μＬの完全ＤＭＥＭ培地を添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ₂で４８時間インキュベートした。２日後、ＭＤＣＫプレートから得た細胞培養上清と共に室温で３０分間インキュベートしたニワトリ赤血球を用いて、血球凝集阻止を行った。結果は、全肺ウィルスの平均±ＳＥＭとして示す（ｎ＝４マウス／群）。対照として、免疫感作を行っていないマウスを用いた。
【０１７６】
図３８に示す結果から、ウィルス性クラスＩ拘束性エピトープを有する組換えＩｇＧと一緒に、選択された合成ｄｓＲＮＡ（ｐＡ：ｐＵ）によって免疫感作を行うことにより、感染チャレンジ後のウィルス複製を制限できる免疫応答がプライミングされることが分かる。
【０１７７】
実施例３８．図３９に、Ｉｇ−ペプチドベースの分子の効力をテストするために用いた腫瘍モデルを示す。
Ｂａｌｂ−ｃマウス（Ｋ^d拘束性)を用い腫瘍モデルを確立した。通常、腫瘍細胞（１００μＬ中に１００万〜１５００万個）はマウスの側腹部に注射した（図３９の上部写真中の矢印参照）。原発腫瘍（注射部位の腫瘍）は、先ずその領域を触診することにより検出し、次いでカリパスで腫瘍サイズを測定することにより定量化した（図３９参照）。一連の実験において、トランスフェクトしていない細胞、或いは安定にトランスフェクトされ異種タンパク質（Ｈ鎖のＣＤＲ３領域に異なるエピトープペプチドを発現する組換えＩｇＧ、或いは完全なＮＰタンパク質）を発現する細胞のいずれかであるマウス骨髄腫細胞系（ＳＰ２／０）を用い、マウスに腫瘍を誘導した。ＳＰ２／０細胞内の異種タンパク質の発現は、免疫適格マウスにおける各種抗腫瘍戦略のテストのための特異的腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を提供した。典型的には、未処置マウスには、注射後１週間で触知可能な固形原発腫瘍が発生し、次の４週間に亘り病的状態や死をもたらした。注射したマウスの死後剖検により、転移病変が明らかになった（図３９参照）。Ｓｐ２／０細胞は、原発腫瘍組織から培養し、更に、腫瘍を有するマウスから採取した脾臓からも培養した（データは示さず）。ＳＰ２／０細胞には、ＭＨＣＩ拘束性ＮＰエピトープ（アミノ酸１４７〜１５５、図３９参照）等のＨ鎖のＣＤＲ３領域に導入された特定のエピトープ配列以外は全てが同一である組換えＩｇＧ発現プラスミドが安定的にトランスフェクトされた。また、ＳＰ２／０細胞には、ＣＭＶプロモーターの制御下、ＷＳＮウィルスのＮＰタンパク質全体のためのコード配列を含むプラスミドも安定的にトランスフェクトされた。全てのトランスフェクト細胞系は、野生型ＳＰ２／０細胞の場合と同一のフレームに原発腫瘍を引き起こした。
【０１７８】
本腫瘍モデルは、Ｂａｌｂ−ｃマウスに転移腫瘍を誘導することが先に示された腺癌細胞系（４Ｔ１、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２５３９、Ｋ^d拘束性）を含むように拡張された。４Ｔ−１細胞系は、ＳＰ／０系に関する上述のものと類似していた。Ｂａｌｂ−ｃマウス側腹部への１００万〜１５００万個の４Ｔ−１細胞の注射投与は、触診可能な原発腫瘍をＳＰ２／０細胞の注射投与の場合と同様の時間フレームで生じさせ、最終的には死をもたらした。各種器官からの組織の死後採取は原発腫瘍のみならず、脾臓、肺からも４Ｔ−１が回収できることを示した（図示せず）。４Ｔ−１細胞に、上述のＮＰ−発現プラスミドを安定的にトランスフェクトした。ＳＰ２／０の場合のように、４Ｔ−１細胞へのトランスフェクトは、腫瘍の増殖過程や疾患の致死率に影響を与えなかった。
【０１７９】
実施例３９は、選択された共刺激ＲＮＡモチーフと共に組換えＩｇＧ内の腫瘍関連Ｔ細胞エピトープを用いた、臨床診断後の腫瘍のコントロールと処置の成功例を示す。
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、Ｈ鎖（ＩｇＮＰ）のＣＤＲ３領域内にＭＨＣＩ（Ｋｄ）ＮＰエピトープペプチドを有する組換えＩｇＧを安定的に発現するＳＰ２／０細胞を注射投与した（１００μＬ中１５００万個）。投与後第７日、全てのマウスは触診可能な腫瘍を有し、それらのマウスを無作為に３群（共刺激モチーフ（ポリマーｐＡｐＵを含むｄｓＲＮＡ）単独、精製ＩｇＴＡＡタンパク質（ＩｇＮＰ）、及びｄｓＲＮＡ ｐＡ：ｐＵと精製ＩｇＴＡＡタンパク質の両者）に振り分けた。処置時間は図４０中、矢印で示し、各注射投与では図示の化合物を５０μｇ含ませた。図中、転移疾患を発現し死亡したマウスを「Ｄ」で表す。
【０１８０】
これらのデータから、治療開始時に原発腫瘍を有する全てのマウスにおいて、ｄｓＲＮＡ（共刺激モチーフ）とＩｇＴＡＡ（ＩｇＮＰ）の組合せが劇的な防御応答を生じることが分かる。ｄｓＲＮＡ化合物或いはＩｇＴＡＡ化合物のいずれか一方で処置したマウスの全ては、疾患により死亡したが、これら両者を用いて処置したマウスの１００％は、処置開始後３週間後でも生存していた。これらのマウスは、Ｔ細胞応答の測定のために殺された時にも良好な臨床状態であった。これらのデータは、ＡＰＣへのＴＡＡのｉｎ ｖｉｖｏローディング（ＡＰＣのＦｃレセプターを介したＩｇＮＰの摂取によって達成される）は、強い抗腫瘍応答に対して十分ではないことを示す。ＩｇＮＰとｐＡｐＵ ｄｓＲＮＡとの組み合わせで処置したマウスにおいて示される腫瘍の拒絶と生存は、腫瘍関連抗原による腫瘍の処置が共刺激に関して重要な役割を果たすことを示している。
【０１８１】
結論として、図４０に示す結果から、腫瘍関連抗原のＡＰＣへの効果的なｉｎ ｖｉｖｏローディングと、選択された合成ＲＮＡモチーフによる同時活性化との両者を共に行うことが、腫瘍成長の効果的な制御と腫瘍拒絶の誘導のために必要且つ十分であることが分かる。
【０１８２】
実施例４０．本実施例は、腫瘍細胞を亜致死量接種した場合に、腫瘍抗原に対する最適未満の応答を、ＩｇＧバックボーン内のペプチドエピトープを共刺激モチーフと共に用いる治療によって修正できることを示す。
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、Ｈ鎖のＣＤＲ３内にＷＳＮウィルス核タンパク質のＭＨＣＩ（Ｋ^d）エピトープ（アミノ酸１４７〜１５５）を含む組換えＩｇＧ（ＩｇＮＰ）を安定的に発現するＳＰ２／０細胞を注射投与した。細胞接種物は、マウス当たり１００万個の細胞（１００μＬ中）であった。マウスを、注射部位に触診可能な腫瘍が検出されるまで観察した。この時点で腫瘍を測定し、マウス８個体には処置を施さず（対照）、６個体には精製ＩｇＴＡＡ（即ち、精製ＩｇＮＰ、２ｍｇ／ｋｇ）とｄｓＲＮＡ（ｐＡｐＵ、４ｍｇ／ｋｇ）を一週間毎に腫瘍内注射した。腫瘍は一週間毎に測定した。
【０１８３】
図４１のパネルＡは、８匹の対照マウスの内の６匹は、誘導された腫瘍が進行し最終的に死に到ったが、これらのマウスの内の２匹は、自発的に腫瘍を完全に拒絶したことを示す。図４１のパネルＢは、ＩｇＮＰ／ｄｓＲＮＡによる３回の一週間毎の処置（矢印で示す）が、６匹のマウスの内の４匹において腫瘍の完全な拒絶を刺激し、他のマウスでは腫瘍の大幅な軽減を刺激したことを示す。
【０１８４】
図４１に示す結果から、腫瘍関連抗原のＡＰＣへの効果的なｉｎ ｖｉｖｏローディングと、選択された合成ＲＮＡによる同時活性化の両者を行うことによって、腫瘍関連抗原に対する効果的な免疫応答を引き起こすことができることが分かる。
【０１８５】
実施例４１では、ＩｇＧバックボーン内の腫瘍エピトープと共刺激合成ｄｓＲＮＡとを共に用いた腫瘍を有するマウスの治療は、腫瘍浸透リンパ球の活性状態へと回復可能であることを示す。
ＢＡＬＢ／ｃマウス二個体に、１０００万個のＮＰ−Ｋ^dエピトープ発現ｓｐ２０トランスフェクトーマを注射投与した。腫瘍の発生後、マウス一個体に、５０μｇの選択されたｄｓＲＮＡモチーフ（ｐＡｐＵ）と５０μｇの「ＩｇＮＰ」−ｒｅｃＩｇＧ−ＮＰ（Ｋ^d）とを生理食塩水に溶解したものを腫瘍内に注射した。２４時間後にマウスを殺し、腫瘍を摘出し、コラゲナーゼで消化し、７０μｍのフィルタで濾過し、次いで生存細胞をフィルコール勾配で単離した。細胞をＴＣＲβ、ＣＤ２５、或いはアイソタイプ対照に対してｍＡｂｓで染色し、ＦＡＣＳ分析で評価した。結果を、染色された細胞の百分率と共に、ヒストグラムで示した。
【０１８６】
材料：
１．ＳＰ２０細胞系（ＡＴＣＣ）；
２ ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎｄ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）；
２．ファルコン７０ミクロンフィルタ（ベクトンディッキンソン社、カタログ番号３５２３５０）；
３．コラゲナーゼ（シグマ社、カタログ番号Ｃ−９８９１）;
４．ＢＳＡ、ｆｒａｃｔｉｏｎＶ（シグマ社、カタログ番号Ａ−４５０３）；
５．コラゲナーゼ緩衝液：０．２２５ｇｍ ＢＳＡ＋０．００６２５ｇｍ（５０ｍＬのＲＰＭＩ中）；
６．フィコール−ハイパーク（１．０７７、アマシャム社、カタログ番号１７−１４４０−０２）；
７．ＦＡＣＳ緩衝液：１％ウシ胎児血清＋０．１％アジド（ＰＢＳ中）；
８．抗体：全てＢＤファーミンジェン社から入手；
９．フローサイトメータ：ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）。
【０１８７】
方法：腫瘍細胞単離及びＦＡＣＳ分析：
１．６週間前に腫瘍を上述のように誘導した。
２．ＢＡＬＢ／ｃマウスから腫瘍を単離した。
３．殺菌ハサミで腫瘍を切り刻み、コラゲナーゼ緩衝液１０ｍＬを添加した。
４．３７℃で４０分間インキュベート。
５．腫瘍を、ＲＰＭＩで洗浄しながら３ｍＬの注射器プランジャを用い７０μｍのファルコンフィルタを通し５０ｍＬチューブに濾過。
６．１回洗浄し４ｍＬの温ＲＰＭＩ緩衝液に再懸濁。
７．等量の細胞浮遊液を用いフィコール上で層とし、室温、２０００ＲＰＭで１５分間遠沈。
８．層を単離し、ＨＬ−１緩衝液で１回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に２×１０⁶／ｍＬで再懸濁し、フローサイトメトリー分析を実施。
９．残存細胞はＥＬＩＳＰＯＴ分析に用いた。
１０．細胞を１２×７５ｍｍのチューブに入れ（５０μＬ／チューブ）、ＦＩＴＣ標識抗マウス抗体（２μｇ／チューブ）とマウス血清（１μＬ／チューブ）で染色した。
・アイソタイプ対照
・抗ＣＤ４０
・抗ＣＤ８
・抗ＣＤ４
・抗ＣＤ２５
・抗ＴＣＲγδ
・抗ＴＣＲβ
１１．氷上で３０分間インキュベート。
１２．ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁。
【０１８８】
図４２に示す結果から、腫瘍関連エピトープを有する組換えイムノグロブリンと選択された合成ｄｓＲＮＡモチーフとを共に用いて処置をすると、Ｔ細胞レセプターマーカーＴＣＲβを提示する腫瘍浸透リンパ球が、活性マーカーＣＤ２５の発現を獲得したことが分かる。
【０１８９】
実施例４２では、ＩｇＧバックボーン内のペプチドエピトープと選択された共刺激分子とを共に用いた腫瘍を有するマウスの治療の成功は、Ｔｃ２に加えＴｃ１を含むＴｃの特定の分化パターンに関連することを示す。
腫瘍関連エピトープを有する組換えＩｇと選択された合成ｄｓＲＮＡモチーフとを共に用いる、実施例４０に記載の処置により腫瘍の拒絶に成功したマウスを殺し、腫瘍関連エピトープに対するＴ細胞応答をＥＬＩＳＰＯＴ分析によって測定した。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、モレシェイム、フランス）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）に溶解した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ２と抗ＩＬ４に対しては４μｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮγに対しては８μｇ／ｍＬ、ＢＤファーミンジェン社製）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地により３７°Ｃで１時間ブロッキングした。
【０１９０】
脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計測後、各種濃度のＮＰペプチドと共に５×１０⁵個／ウェルでインキュベートした。プレートは３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、１００μＬ／ウェルのビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％−ＦＢＳ ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）中に２μｇ／ｍＬ）と共に、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）によって開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次に、プレートを室温で２４時間乾燥させた。
【０１９１】
データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリング）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）により得た。結果は、ＩＬ−４、ＩＬ−２、及びＩＦＮ−γに対応するコロニーを形成するスポットの数（平均±ＳＥＭ）として表した。対照として、腫瘍を拒絶できなかった非処置マウスを用いた（ｎ＝４／群）。
【０１９２】
図４３に示す結果から、腫瘍の拒絶に成功した処置マウスは、治療性Ｉｇ上に腫瘍関連エピトープに対するＴｃ１応答を発現し、それと共にＴｃ２免疫を発現したことが分かる。対照的に、腫瘍を拒絶できなかったマウスはＴｃ２免疫のみを示した。
【０１９３】
実施例４３では、ＩｇＧバックボーン内のＴ細胞エピトープと選択された共刺激モチーフとを共に用いた腫瘍を有するマウスの特定の処置後の効果的記憶応答の誘導を示す。
ＮＰ−Ｋ^dＴＡＡ発現ｓｐ２／０腫瘍を有するマウスを、実施例４０に記載したように、ＴＡＡを有する組換えＩｇと選択された合成ＲＮＡモチーフとを共に注射投与することにより処置した。腫瘍の拒絶後、マウスを１５００万個のＮＰ−Ｋｄエピトープ発現ＳＰ２／０細胞を対側投与する皮下注射によってチャレンジした。これと並行して、４匹の対照ナイーブマウスに、腫瘍形成／致死量の同タイプ細胞を同様に注射した。腫瘍の発生とサイズをモニタし、直径（ｍｍ）をチャレンジからの時間に対して示した。
【０１９４】
図４４に示す結果から、図示の処置により有効な腫瘍の拒絶が誘導されると、その後は同種の腫瘍をチャレンジしてもこれに対し効果的な防御が行われ、効果的な免疫記憶が発現することが分かる。
【０１９５】
実施例４４では、驚くべきことに、ＴＡＡを有するＩｇＧと共刺激物ｄｓＲＮＡモチーフとを共に用いることによる腫瘍拒絶の誘導は、ＴＡＡを欠いた或いはＴＡＡの変異体を示す多数の腫瘍細胞変異体に対する交叉保護をもたらすことを示す。
実施例４３に記載したような相同チャレンジに対して保護されたマウスに、１５００万個の腫瘍細胞（ＴＡＡを欠いた（抗原変異体なし）同種の腫瘍細胞、或いはＮＰ−Ｋ^dエピトープを欠いたＴＡＡの変異体を有する同種の腫瘍細胞）を用いて引き続きチャレンジを行った。更に、マウスに、図４５Ａに添付の表に示される異なる型の腫瘍細胞系（４Ｔ−１腺癌）を対照として用いチャレンジを行った。いずれの場合にもナイーブ対照が含まれる。
【０１９６】
腫瘍変異体による多重チャレンジに対して保護されたマウスのＴ細胞免疫の状態は、ＴＡＡ（ＮＰ−Ｋｄペプチド）、ＨＡ（ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチド）、或いは細胞溶解物から抽出したタンパク質で刺激した脾臓細胞浮遊液を用いたＥＬＩＳＰＯＴ分析で評価した。ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア社、フランス、モールスハイム）を、無菌ＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）溶解した精製抗サイトカインＡｂｓ（抗ＩＬ２と抗ＩＬ４に対しては４μｇ／ｍＬ、抗ＩＦＮγに対しては８μｇ／ｍＬ、ＢＤファーミンジェン社製）と共に、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＦＢＳを含む２００μＬ／ウェルの完全ＤＭＥＭ培地により３７℃で１時間ブロッキングした。
【０１９７】
脾臓から単一細胞浮遊液を作成し、赤血球を溶解し、細胞を洗浄、計測後、各種濃度の抗体と共に５×１０⁵個／ウェルでインキュベートした。プレートは３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。３日後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％（洗浄緩衝液）で５回洗浄し、１００μＬ／ウェルのビオチン化抗サイトカインＡｂｓ（ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％−ＦＢＳ ０．１％（ＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液）中に２μｇ／ｍＬ）と共に、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰのＥＬＩＳＰＯＴ緩衝液希釈液（１：１０００）と共に１時間インキュベートした。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）によって開始させ、水道水でプレートを２回洗浄することにより停止させた。次に、プレートを室温で２４時間乾燥させた。
【０１９８】
データは、ＩｍａｇｅＰｒｏ−Ｐｌｕｓ）ソフトウェア（メディアサイバネティックス社、メリーランド州シルバースプリングス）を備えた自動化システム（ナビター社、ニューヨーク州ロチェスター）により得た。結果は、ＩＬ−４、ＩＬ−２、及びＩＦＮ−γに対応するコロニーを形成するスポットの数（平均±ＳＥＭ）として表した。対照として、腫瘍を拒絶できなかった非処置マウスを用いた（ｎ＝４／群）。対照としてはナイーブマウスが含まれる。データは、器官当たりのサイトカイン産生細胞数（平均±ＳＥＭ）として表す（ｎ＝３／群）。
【０１９９】
図４５Ａ〜４５Ｂ（図４５Ａの表を含む）に示す結果から、腫瘍の拒絶を生じる図示の処置の結果として出現した免疫は、抗原変異体非存在下でのチャレンジに対する防御となり、サイトカイン産生細胞の全体に亘る増殖に関係付けられることが分かる。このことは、提案に係る投薬計画によって増強される抗腫瘍リンパ球の、免疫療法分子によって担われているのではない腫瘍関連抗原に対するレパートリーの広がりを示す。
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１Ａ】（Ａ）は天然ＩｇＧ（Ｌ鎖−Ｈ鎖ヘテロ二量体）、（Ｂ）は抗原（Ａｇ）由来ペプチドをＣＤＲ（相補性決定領域）３、２、１或いは枠組み領域に挿入したもの、（Ｃ）はＶＨ（Ｈ鎖、可変領域）セグメントを抗原或いは断片で置換したもの、（Ｄ）はＶＨセグメントとＣＨ１セグメントを抗原或いは抗原断片で置換したものを示す。
【図１Ｂ】ＩｇＧペプチド及びＦｃペプチドを概略的に示す。
【図１Ｃ】選択されたヒトＩｇＧバックボーンの特性を示す。
【図１Ｄ】Ｈ鎖の定常領域の配列と予定構築物（prospective construct）の概略図を示す。
【図１Ｅ】イムノグロブリンに挿入し得る、本願に記載の各種抗原及びエピトープの配列を示す［配列は、インターネットでｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ（正しいアドレスプレフィックス、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．を付けること）にアクセスし、提供された受託番号を用いて「タンパク質」セクションをサーチして得ることができる。このデータベースの全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する］。
【図１Ｆ】イムノグロブリンに挿入し得る、本願に記載の各種抗原及びエピトープの配列を示す［配列は、インターネットでｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ（正しいアドレスプレフィックス、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．を付けること）にアクセスし、提供された受託番号を用いて「タンパク質」セクションをサーチして得ることができる。このデータベースの全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する］。
【図１Ｇ】イムノグロブリンに挿入し得る、本願に記載の各種抗原及びエピトープの配列を示す［配列は、インターネットでｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ（正しいアドレスプレフィックス、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．を付けること）にアクセスし、提供された受託番号を用いて「タンパク質」セクションをサーチして得ることができる。このデータベースの全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する］。
【図１Ｈ】イムノグロブリンに挿入し得る、本願に記載の各種抗原及びエピトープの配列を示す［配列は、インターネットでｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ（正しいアドレスプレフィックス、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．を付けること）にアクセスし、提供された受託番号を用いて「タンパク質」セクションをサーチして得ることができる。このデータベースの全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する］。
【図１Ｉ】イムノグロブリンに挿入し得る、本願に記載の各種抗原及びエピトープの配列を示す［配列は、インターネットでｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ（正しいアドレスプレフィックス、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．を付けること）にアクセスし、提供された受託番号を用いて「タンパク質」セクションをサーチして得ることができる。このデータベースの全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する］。
【図１Ｊ】イムノグロブリンに挿入し得る、本願に記載の各種抗原及びエピトープの配列を示す［配列は、インターネットでｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ（正しいアドレスプレフィックス、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．を付けること）にアクセスし、提供された受託番号を用いて「タンパク質」セクションをサーチして得ることができる。このデータベースの全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する］。
【図１Ｋ】イムノグロブリンに挿入し得る、本願に記載の各種抗原及びエピトープの配列を示す［配列は、インターネットでｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ（正しいアドレスプレフィックス、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．を付けること）にアクセスし、提供された受託番号を用いて「タンパク質」セクションをサーチして得ることができる。このデータベースの全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する］。
【図１Ｌ】イムノグロブリンに挿入し得る、本願に記載の各種抗原及びエピトープの配列を示す［配列は、インターネットでｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ（正しいアドレスプレフィックス、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．を付けること）にアクセスし、提供された受託番号を用いて「タンパク質」セクションをサーチして得ることができる。このデータベースの全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する］。
【図１Ｍ】イムノグロブリンに挿入し得る、本願に記載の各種抗原及びエピトープの配Ｍを示す［配列は、インターネットでｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ（正しいアドレスプレフィックス、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．を付けること）にアクセスし、提供された受託番号を用いて「タンパク質」セクションをサーチして得ることができる。このデータベースの全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する］。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、生理食塩水に溶解したペプチドエピトープの注射投与は免疫原性ではなかったが、ＡＰＣのｅｘ ｖｉｖｏローディングに用いたペプチドの同様の投与によって、養子移入の際、実質的な免疫応答が効果的に引き起こされたことを示す。
【図３】Ｉｇバックボーン内でのエピトープの輸送は、全身体循環でのその安定性を非常に好むことを示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、ペプチドを血清と共にプリインキュベートすることによってＴｃＨ活性化が低下することを示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、ＭＨＣ−ペプチド複合体形成の相対効率は、抗原及びＡＰＣの性質によって大幅に異なることを示す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｂは、血液由来ＡＰＣによる処理の際にＴｃＨ活性化を誘導する上で、ＩｇＧバックボーン内のペプチドエピトープは、ペプチド単独よりもモル基準で（１桁）効果的であったことを示す。
【図７Ａ】水中油型アジュバント（不完全フロイントアジュバント、ＩＦＡ）を用いることにより、ＡＰＣ上でのＭＨＣ−ペプチド複合体のｉｎ ｖｉｖｏ形成がリンパ節ではほんの少し向上した一方、脾臓や胸腺では向上しなかったことを示す。
【図７Ｂ】水中油型アジュバント（不完全フロイントアジュバント、ＩＦＡ）を用いることにより、ＡＰＣ上でのＭＨＣ−ペプチド複合体のｉｎ ｖｉｖｏ形成がリンパ節ではほんの少し向上した一方、脾臓や胸腺では向上しなかったことを示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、ペプチドのＦｃγＲ仲介輸送を用いることによって、ＣＤ１１ｃ＋及びＣＤ１１ｂ＋ＡＰＣ上での免疫原性ＭＨＣＩＩ−ペプチド複合体の優先的な形成がもたらされることを示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、ＤＣ（樹状細胞）及び単球上で、内因性ＭＨＣＩＩへのペプチドの発現が長時間持続することを示す。
【図１０】ペプチドエピトープのＩｇＧ仲介輸送後の樹状細胞や単球上でのＭＨＣＩＩ−ペプチド複合体の形成は、γ鎖を含むＩＴＡＭ＋ＦｃγＲに大きく依存していることを示す。
【図１１】ＩＴＡＭ＋ＦｃγＲアイソフォームのγ鎖の発現は、ＩｇＧバックボーン内でペプチドによりロードされたＡＰＣに対するＴ細胞応答の誘導に必要であることを示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄは、予想外に、且つ効力／細胞基準（実施例８）とは対照的に、生体レベルにおいては、ＣＤ１１ｂ⁺単球の場合、ＩｇＧバックボーン内で輸送されたペプチドエピトープに対する免疫応答への影響が最も強いことを示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂは、組換えＩｇバックボーン内でのＦｃγＲ仲介Ｔ細胞エピトープ輸送によって、Ｔｈ１応答ではなくＴｈ２応答がもたらされることを示す。
【図１４】組換えＩｇバックボーン内でのＦｃγＲ仲介Ｔ細胞エピトープ輸送によって、Ｔｈ１応答ではなくＴｈ２応答がもたらされることを示す。
【図１５】ＩｇＧバックボーン内のペプチドエピトープは、従来のアジュバント（ＣＦＡ）によって増強されるがスイッチングされないＴｈ２プロファイルの細胞応答を引き起こすことを示す。
【図１６】ＡＰＣによるペプチド提示は、輸送プラットフォームとして組換えＩｇＧを用いた抗原によるローディングの後、同時刺激を制限した場合に（in context of）生じることを示す。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｂは、ｒｅｃＨＡ（Ｉ−Ｅｄ）−ＩｇＧの投与によって引き起こされるＨＡ（１１０−１２０赤血球凝集素ペプチド）特異的ＩＬ−４産生Ｔ細胞の活性は、ＣＤ８ではなくＣＤ４に依存していることを示す。
【図１８】Ｔ細胞エピトープのＩｇＧ仲介輸送は、活性化したＴ細胞によるサイトカイン産生や増殖に対し著しく示差的な（profound and differential）影響を及ぼす（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、そして、驚くべきことにＩＬ−４も用量関連的にダウンレギュレートされた）ことを示す。
【図１９Ａ】同族ペプチドを有するインフルエンザウィルス株によるウィルス免疫感作とは対照的に、Ｉｇ仲介ペプチド輸送は、細胞障害性応答を引き起こす上で効果的ではなかったことを示す。
【図１９Ｂ】同族ペプチドを有するインフルエンザウィルス株によるウィルス免疫感作とは対照的に、Ｉｇ仲介ペプチド輸送は、細胞障害性応答を引き起こす上で効果的ではなかったことを示す。
【図２０Ａ】図２０Ａ〜２０Ｂは、組換えＩｇＧを用いたＭＢＰエピトープとＰＬＰエピトープの同時投与によって、疾患の慢性進行が抑制されたことを示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｃ〜２０Ｄは、組換えＩｇＧを用いたＭＢＰエピトープとＰＬＰエピトープの同時投与によって、疾患の慢性進行が抑制されたことを示す。
【図２１】実施例２〜２０で提供されたデータに基づき、ＩｇＧ／ＦｃγＲ仲介によるエピトープ輸送がＴ細胞応答に及ぼす影響について要約する。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｂは、インフルエンザウィルス感染中に産生された天然の非感染性二本鎖ＲＮＡが、タンパク質抗原に対する特異的免疫応答に大きな効果を有することを示す。
【図２３Ａ】図２３Ａは、合成ＲＮＡモチーフの広範なライブラリーを示す。
【図２３Ｂ】図２３Ｂ〜２３Ｄは、各種合成ＲＮＡが、プロトタイプタンパク質抗原に対するＢ細胞応答及びＴ細胞応答を増強する効果を有することを示す。
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｂは、自然免疫応答に対する選択されたＲＮＡモチーフの作用を示す。
【図２５】別個のＲＮＡモチーフが抗原提示細胞上の異なるレセプターに結合することを示す。
【図２６】別個のＲＮＡモチーフがケモカインの様々なアップレギュレーションを誘導することを示す。
【図２７】選択された合成ＲＮＡモチーフを用いることにより、インフルエンザウィルスの複製が制御できることを示す。
【図２８】選択された合成ＲＮＡモチーフであるｐＩ：ｐＣ及びｐＡ：ｐＵは、精製タンパク質の多量投与に通常伴う高域寛容を著しく阻害することを示す。
【図２９】選択された合成ＲＮＡモチーフはヒト単球細胞に作用することを示す。
【図３０Ａ】非タグ化ｐＡ：ｐＵは、タグ化ｐＡ：ｐＵのヒトＴＨＰ−１単球細胞への結合に対し競合（compete out）できるが、非タグ化ｐＩ：ｐＣは競合できないことを示す。
【図３０Ｂ】非タグ化ｐＡ：ｐＵは、タグ化ｐＡ：ｐＵのヒトＴＨＰ−１単球細胞への結合に対し競合（compete out）できるが、非タグ化ｐＩ：ｐＣは競合できないことを示す。
【図３１】ｄｓＲＮＡの精製工程及び分画工程を示す。
【図３２】選択された合成ＲＮＡ化合物の低分子量画分は、様々な生物学的活性を有することを示す。
【図３３】ｐＩ：ｐＣは、ｐＡ：ｐＵと異なり、それ自身に対する抗体反応を誘導し、別のＲＮＡモチーフに対する交叉反応性成分を有することを示す。
【図３４】図３４Ａ〜３４Ｂは、選択された複数の合成ＲＮＡを同時に使用することにより、ＩｇＧ仲介によるＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープの輸送に続き、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γの効果的な誘導が促進されることを示す。
【図３５】組換えＩｇＧによるＡＰＣのｅｘ ｖｉｖｏローディングは、遊離ペプチド自体を使用する場合に比べ、ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体を形成し、Ｔｃ応答を発生させる上でより効果的であることを示す。
【図３６】選択された合成ＲＮＡの同時投与を実施すると、クラスＩ拘束性エピトープのＩｇＧ仲介輸送がクラスＩ拘束性Ｔｃ１応答のプライミングに最も効果的であることを示す。
【図３７】抗ウィルス細胞障害性Ｔ細胞の効果的なプライミングには、ＩｇＧにより輸送されたクラスＩ拘束性エピトープのｉｎ ｖｉｖｏでのＡＰＣへの効果的なローディングと、選択された合成ＲＮＡモチーフによる適切な指示との両方が必要であることを示す。
【図３８】ウィルス性クラスＩ拘束性エピトープを有する組換えＩｇＧと一緒に、選択された合成ｄｓＲＮＡによって免疫感作を行うことにより、感染チャレンジ後のウィルス複製を制限できる免疫応答がプライミングされることを示す。
【図３９】Ｉｇ−ペプチドベースの分子の効力をテストするために用いた腫瘍モデルを示す。
【図４０】腫瘍関連抗原のＡＰＣへの効果的なｉｎ ｖｉｖｏローディングと、選択された合成ＲＮＡモチーフによる同時活性化との両者を共に行うことが、腫瘍成長の効果的な制御と腫瘍拒絶の誘導のために必要且つ十分であることを示す。
【図４１】腫瘍関連抗原のＡＰＣへの効果的なｉｎ ｖｉｖｏローディングと、選択された合成ＲＮＡによる同時活性化の両者を行うことによって、腫瘍関連抗原に対する効果的な免疫応答を引き起こすことができることを示す。
【図４２】腫瘍関連エピトープを有する組換えイムノグロブリンと選択された合成ｄｓＲＮＡモチーフとを共に用いて処置をすると、Ｔ細胞レセプターマーカーＴＣＲβを提示する腫瘍浸透リンパ球が、活性マーカーＣＤ２５の発現を獲得したことを示す。
【図４３】腫瘍の拒絶に成功した処置マウスは、治療性Ｉｇ上に腫瘍関連エピトープに対するＴｃ１応答を発現し、それと共にＴｃ２免疫を発現したことを示す。
【図４４】図示の処置により有効な腫瘍の拒絶が誘導されると、その後は同種の腫瘍をチャレンジしてもこれに対し効果的な防御が行われ、効果的な免疫記憶が発現することを示す。
【図４５Ａ】腫瘍の拒絶を生じる図示の処置の結果として出現した免疫は、抗原変異体非存在下でのチャレンジに対する防御となり、サイトカイン産生細胞の全体に亘る増殖に関係付けられることを示す。
【図４５Ｂ】腫瘍の拒絶を生じる図示の処置の結果として出現した免疫は、抗原変異体非存在下でのチャレンジに対する防御となり、サイトカイン産生細胞の全体に亘る増殖に関係付けられることを示す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において抗原に対して免疫応答を発生させる方法であって、患者にイムノグロブリン或いはその一部を投与することを含み、前記イムノグロブリンは、前記イムノグロブリン或いはその一部に結合した前記抗原の少なくとも一種のペプチドエピトープを有し、前記イムノグロブリン或いはその一部はＲＮＡセグメントと共に投与される、方法。
【請求項２】
イムノグロブリン或いはその一部と前記ＲＮＡセグメントとは一緒に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イムノグロブリン或いはその一部と前記ＲＮＡセグメントとは別々に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記患者はヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記患者への前記イムノグロブリン或いはその一部の投与に際して、イムノグロブリン或いはその一部は、抗原提示細胞のＦｃγＲとの結合により抗原提示細胞をロードし、前記ペプチドエピトープが抗原提示細胞のＭＨＣＩ経路により効果的にプロセシングされて提示され、その結果、ＭＨＣクラスＩ分子が効果的にロードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ペプチドエピトープは、イムノグロブリン或いはその一部のＣＤＲ領域内で結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
免疫応答によって、抗原に対する効果的なＴ細胞応答が発生する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｔ細胞は細胞障害性Ｔリンパ球である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＲＮＡセグメントはｄｓＲＮＡであり、ｐＡ：ｐＵ及びｐＩ：ｐＣから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドエピトープはＴ細胞エピトープである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ペプチドエピトープは、インフルエンザウィルスＭ１或いはＭ２；Ｃ型肝炎ウィルスＮＳ３；Ｂ型肝炎ウィルスコア抗原；ヒトパピローマウィルスＨＰＶ１８−Ｅ７、ＨＰＶ１６−Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ６;メラノーマ−ｇｐ１００；ＭＡＲＴ−１；ＴＲＰ−２；癌胎児抗原前駆体；Ｈｅｒ−２；破傷風毒素ユニバーサルＴヘルパーエピトープ；ＨＩＶ−１：逆転写酵素；ＨＩＶ１：ｇａｇ；インスリン前駆体−ヒト；ヒトＧａｄ６５；前立腺腫瘍抗原；ムチン１；単純ヘルペス抗原；及び呼吸器合胞体ウィルス抗原から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
イムノグロブリン或いはその一部とＲＮＡセグメントは、静脈内投与及び大量瞬時投与から成る群から選択される一方法によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
イムノグロブリン或いはその一部とＲＮＡは医薬的に許容し得る担体に添加されて投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ペプチドエピトープに対する有効な記憶応答を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
Ｉｇバックボーン或いはその一部に結合した少なくとも一種のペプチドエピトープを用いて抗原提示細胞にロードし、Ｔ細胞応答を発生させることによりＩｇ−ペプチド分子を形成する方法であって、ｉｎ ｖｉｖｏで投与される際に、該エピトープはＭＨＣＩ経路により効果的にプロセシングされて提示され、その結果、ＭＨＣクラスＩ分子が効果的にロードされ、ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体が生じる、方法。
【請求項１６】
ＩｇバックボーンはＩｇＧバックボーンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＡＰＣはＦｃγＲの一価結合（monovalent engagement）によってロードされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ＡＰＣはｉｎ ｖｉｖｏ或いはｅｘ ｖｉｖｏでロードすることができる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ペプチドエピトープはＩｇＧバックボーンに共有結合している、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
ペプチドエピトープはＩｇＧのＦｃ部分の修飾無しでＩｇＧバックボーンに結合している、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体によって、ＩＬ−２産生やＩＦＮ−γ産生ではなくＩＬ−４産生により特徴付けられる強いＴｃ２応答が発生する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
ペプチドエピトープは、インフルエンザウィルスＭ１或いはＭ２；Ｃ型肝炎ウィルスＮＳ３；Ｂ型肝炎ウィルスコア抗原；ヒトパピローマウィルスＨＰＶ１８−Ｅ７、ＨＰＶ１６−Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ６;メラノーマ−ｇｐ１００；ＭＡＲＴ−１；ＴＲＰ−２；癌胎児抗原前駆体；Ｈｅｒ−２；破傷風毒素ユニバーサルＴヘルパーエピトープ；ＨＩＶ−１：逆転写酵素；ＨＩＶ１：ｇａｇ；インスリン前駆体−ヒト；ヒトＧａｄ６５；前立腺腫瘍抗原；ムチン１；単純ヘルペス抗原；及び呼吸器合胞体ウィルス抗原から成る群から選択される、 請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
血清の負の影響が回避される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
ＭＨＣ−ペプチド複合体の形成がもたらされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
ＩｇＧペプチド分子は皮下注射或いは腹腔内注射によって投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
抗原提示細胞は、樹状細胞、単球、マクロファージ及びＢ細胞から成る群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
抗原提示細胞は、ＣＤ１１ｃ＋ＡＰＣ及びＣＤ１１ｂ＋ＡＰＣから成る群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
ｉｎ ｖｉｖｏ輸送によって形成されるＭＨＣ−ペプチド複合体は最大１〜２週間発現される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
ＭＨＣ−ペプチド複合体によってＴ細胞が活性化する、請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
Ｔ細胞応答は、ＡＰＣ上のＩＴＡＭ＋及びＩＴＩＭ＋Ｆｃγレセプターによって決まる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＩＴＡＭ＋ＦｃγＲアイソフォームのγ鎖の発現がＴ細胞応答を誘導し、ＩＴＩＭ＋ＦｃγＲＩＩがＴ細胞応答を制限する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＡＰＣがｉｎ ｖｉｖｏでロードされる場合、ＡＰＣは別個の調節サブセットを誘導する、請求項１５に記載の方法。
【請求項３３】
単球がＴｈ２及びＴｒ１細胞を誘導し、樹状細胞及び単球の双方がＴｈ３細胞を誘導し、Ｔ細胞エピトープのＩｇＧ仲介輸送に引き続く調節応答を引き起こす上で、樹状細胞よりもＣＤ１１ｂ＋単球の方が強力である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
ｉｎ ｖｉｖｏでＩｇＧバックボーン内で輸送されたペプチドによるＡＰＣのローディングによってＴｈ２免疫が誘導される、請求項１５に記載の方法。
【請求項３５】
ｉｎ ｖｉｖｏでＩｇＧバックボーン内で輸送されたペプチドによるＡＰＣのローディングによってＴｈ３及びＴｒ１免疫が誘導される、請求項１５に記載の方法。
【請求項３６】
Ｔ細胞応答は、抗ＣＤ４０ｍＡｂ、組換えＩＬ−１２及び合成ｄｓＲＮＡから成る群から選択される一種と共に同時刺激することによって増強される、請求項１５に記載の方法。
【請求項３７】
ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４は用量依存的にダウンレギュレートされ、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βは用量依存的にアップレギュレートされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項３８】
ペプチドエピトープはｒｅｃＮＰであり、ＩＬ−４産生Ｔｃ２細胞から成るＮＰ特異的ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞免疫を誘導する、請求項１５に記載の方法。
【請求項３９】
ＲＮＡモチーフを用いて免疫応答を増強させることを更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項４０】
ＲＮＡモチーフはｄｓＲＮＡである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体応答は増強され、増強されたＴｈ１及びＴｈ２応答と関連する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
ｄｓＲＮＡは、ｐＡ：ｐＵ、ｐＩ：ｐＣ及びｐＣ：ｐＧから成る群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
ｄｓＲＮＡはｐＡ：ｐＵであり、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔｃ１細胞を誘導してＩＦＮ−γを産生する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
ｄｓＲＮＡは１０〜５０Ｋｄである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
ＲＮＡモチーフは、ｐ（Ａ）、ｐ（Ｃ）、ｐ（Ｇ）、ｐ（Ｉ）及びｐ（Ｕ）から成る群から選択されるｓｓＲＮＡである、請求項３９に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において抗原に対して免疫応答を発生させる方法であって、患者にイムノグロブリン或いはその一部を投与することを含み、前記イムノグロブリン或いはその一部は、前記イムノグロブリン或いはその一部に結合した前記抗原の少なくとも一種のペプチドエピトープを有し、前記イムノグロブリン或いはその一部はＲＮＡセグメントと共に投与される、方法。
【請求項２】
イムノグロブリン或いはその一部と前記ＲＮＡセグメントとは一緒に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イムノグロブリン或いはその一部と前記ＲＮＡセグメントとは別々に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記患者はヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記患者への前記イムノグロブリン或いはその一部の投与に際して、イムノグロブリン或いはその一部は、抗原提示細胞のＦｃγＲとの結合により抗原提示細胞をロードし、前記ペプチドエピトープが抗原提示細胞のＭＨＣＩ経路により効果的にプロセシングされて提示され、その結果、ＭＨＣクラスＩ分子が効果的にロードされ、該ペプチドに対して特異的なＴ細胞が活性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ペプチドエピトープは、イムノグロブリン或いはその一部のＣＤＲ領域内で結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記患者に前記医務のグロブリン或いはその一部を投与すると、イムノグロブリン或いはその一部は、抗原提示細胞のＦｃγＲとの結合により抗原提示細胞をロードし、前記ペプチドエピトープが抗原提示細胞のＭＨＣＩＩ経路により効果的にプロセシングされて提示され、その結果、ＭＨＣクラスＩＩ分子が効果的にロードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｔ細胞は細胞障害性Ｔリンパ球である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＲＮＡセグメントはｄｓＲＮＡであり、ｐＡ：ｐＵ、ｐＩ：ｐＣ、ｐＣ：ｐＧ，および混合ヌクレオチドのｄｓＲＮＡセグメントから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドエピトープはＴ細胞エピトープである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ペプチドエピトープは、インフルエンザウィルスＭ１或いはＭ２；Ｃ型肝炎ウィルスＮＳ３；Ｂ型肝炎ウィルスコア抗原；ヒトパピローマウィルスＨＰＶ１８−Ｅ７、ＨＰＶ１６−Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ６;メラノーマ−ｇｐ１００；ＭＡＲＴ−１；ＴＲＰ−２；癌胎児抗原前駆体；Ｈｅｒ−２；破傷風毒素ユニバーサルＴヘルパーエピトープ；ＨＩＶ−１：逆転写酵素；ＨＩＶ１：ｇａｇ；インスリン前駆体−ヒト；ヒトＧａｄ６５；前立腺腫瘍抗原；ムチン１；単純ヘルペス抗原；及び呼吸器合胞体ウィルス抗原から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドエピトープに対する有効な記憶応答を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
イムノグロブリン或いはその一部に結合した少なくとも一種のペプチドエピトープを用いて、Ｉｇペプチド複合体を形成することにより、抗原提示細胞をロードし、患者において抗原に対する免疫応答を発生させる方法であって、患者にｉｎ ｖｉｖｏでｄｓＲＮＡと組合わせてＩｇペプチド複合体を投与すると、該エピトープはＭＨＣＩ経路により効果的にプロセシングされて抗原提示細胞によって提示され、その結果、ＭＨＣクラスＩ分子が効果的にロードされ、ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体が生じ、該搬送された抗原に対するＴ細胞の強化された応答が発生する、方法。
【請求項１４】
前記イムノグロブリンがヒトＩｇＧである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗原提示細胞が、抗原提示材棒のＦｃγＲの一価結合によってロードされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチドエピトープがイムノグロブリンに二価結合によって結合している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ペプチドエピトープは、ＩｇのＦｃ部分を変更することなくイムノグロブリンに結合している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体によって、ＩＬ−２産生やＩＦＮ−γ産生ではなくＩＬ−４産生により特徴付けられる強いＴｃ２応答が発生する請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
ペプチドエピトープは、インフルエンザウィルスＭ１或いはＭ２；Ｃ型肝炎ウィルスＮＳ３；Ｂ型肝炎ウィルスコア抗原；ヒトパピローマウィルスＨＰＶ１８−Ｅ７、ＨＰＶ１６−Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ６;メラノーマ−ｇｐ１００；ＭＡＲＴ−１；ＴＲＰ−２；癌胎児抗原前駆体；Ｈｅｒ−２；破傷風毒素ユニバーサルＴヘルパーエピトープ；ＨＩＶ−１：逆転写酵素；ＨＩＶ１：ｇａｇ；インスリン前駆体−ヒト；ヒトＧａｄ６５；前立腺腫瘍抗原；ムチン１；単純ヘルペス抗原；及び呼吸器合胞体ウィルス抗原から成る群から選択される、 請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
ＩｇＧペプチド分子は皮下注射或いは腹腔内注射によって投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
抗原提示細胞は、樹状細胞、単球、マクロファージ及びＢ細胞から成る群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
ｉｎ ｖｉｖｏ輸送によって形成されるＭＨＣ−ペプチド複合体は最大１〜２週間発現される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
ＭＨＣ−ペプチド分子をロードすることにより、該ペプチドに特異的なＴ細胞が活性化する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
イムノグロブリン内で搬送されたペプチドにより抗原提示細胞をロードすることによって、Ｔｈ２免疫が誘導させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４は用量依存的にダウンレギュレートされ、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βは用量依存的にアップレギュレートされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２６】
ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体応答は増強され、増強されたＴｈ１及びＴｈ２応答と関連する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２７】
ｄｓＲＮＡは、ｐＡ：ｐＵ、ｐＩ：ｐＣ及びｐＣ：ｐＧから成る群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２８】
ｄｓＲＮＡはｐＡ：ｐＵであり、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔｃ１細胞を誘導してＩＦＮ−γを産生する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２９】
ｄｓＲＮＡは１０〜５０Ｋｄである、請求項１３に記載の方法。
【請求項３０】
抗原に対する免疫応答の強化を必要とする患者において免疫応答を強化する方法であって、
イムノグロブリン或いはその一部に結合した該抗原の少なくとも一種のペプチドエピトープを患者に投与し、Ｉｇペプチド複合体を形成し、該Ｉｇペプチド複合体をｄｓＲＮＡと共にin vivoで患者に投与し、Ｉｇペプチド複合体は、Ｆｃレセプターを有する細胞によって取り込まれることができ、エピトープが、ＭＨＣ経路により効果的にプロセシングされて提示され、その結果、ＭＨＣクラスＩ分子が効果的にロードされ、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗原への曝露に続くＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞の効果的二次増殖をもたらす、方法。
【請求項３１】
前記細胞が抗原提示細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
イムノグロブリンがヒトＩｇＧである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＭＨＣ経路がＭＨＣ Ｉ経路である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
強化されたＴ細胞応答が、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、及び細胞障害性Ｔ細胞からなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
ｄｓＲＮＡは、ｐＡ：ｐＵ、ｐＩ：ｐＣ、ｐＣ：ｐＧ、および混合ヌクレオチドのｄｓＲＮＡセグメントから成る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
ペプチドエピトープは、インフルエンザウィルスＭ１或いはＭ２；Ｃ型肝炎ウィルスＮＳ３；Ｂ型肝炎ウィルスコア抗原；ヒトパピローマウィルスＨＰＶ１８−Ｅ７、ＨＰＶ１６−Ｅ７、ＨＰＶ１８Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ６;メラノーマ−ｇｐ１００；ＭＡＲＴ−１；ＴＲＰ−２；癌胎児抗原前駆体；Ｈｅｒ−２；破傷風毒素ユニバーサルＴヘルパーエピトープ；ＨＩＶ−１：逆転写酵素；ＨＩＶ１：ｇａｇ；インスリン前駆体−ヒト；ヒトＧａｄ６５；前立腺腫瘍抗原；ムチン１；単純ヘルペス抗原；及び呼吸器合胞体ウィルス抗原から成る群から選択される、 請求項３０に記載の方法。

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図１Ｄ】

【図１Ｅ】

【図１Ｆ】

【図１Ｇ】

【図１Ｈ】

【図１Ｉ】

【図１Ｊ】

【図１Ｋ】

【図１Ｌ】

【図１Ｍ】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９Ａ】

【図１９Ｂ】

【図２０Ａ】

【図２０Ｂ】

【図２１】

【図２２】

【図２３Ａ】

【図２３Ｂ】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０Ａ】

【図３０Ｂ】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５Ａ】

【図４５Ｂ】

【公表番号】特表２００６−５１４９２０（Ｐ２００６−５１４９２０Ａ）
【公表日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３８４９１（Ｐ２００４−５３８４９１）
【出願日】平成１５年９月１８日（２００３．９．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３０１８８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２７０４９
【国際公開日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【出願人】（５０５４３０７９１）マルチセル・イミュノセラピューティクス，インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】