抗癌剤としての自己集合性の両親媒性ポリマー
本発明は、親水性骨格およびペンダント疎水性基を有する、両親媒性生体適合性コポリマーを提供する。該ポリマーは、水性環境においてナノスケール分子凝集体を形成し、これは、疎水性内部を有し、ここに抗癌薬を可溶化できる。該ポリマーは、任意に、薬剤運搬凝集体の標的癌細胞への付着を媒介する結合した抗体、受容体リガンド、および他の標的部分を特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、両親媒性高分子、具体的には、生体適合性のミセル形成くし型ポリマーの分野に関する。本発明はまた、標的薬剤の送達および抗癌剤の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
疎水性ブロックおよび親水性ブロックを含む両親媒性ブロックコポリマーは、周囲の溶媒を変更する場合、種々のナノ構造への自己集合能力のため、近年十分に研究されている。Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．／Ｒｅｖ．Ｃａｎ．Ｃｈｉｍ．７７：１３１１−１３２６（１９９９）を参照されたい。水溶液中において、両親媒性高分子の疎水性分画は、水との接触を避け、系の自由界面エネルギーを最小化するために、自己集合する傾向がある。同時に、親水性ブロックは、水性環境において、水和した「コロナ」を形成するため、該凝集体は、熱力学的に安定な構造を保持する。その結果は、疎水性コアおよび親水性コロナを有するポリマー凝集体粒子の安定した、ラテックスのようなコロイド懸濁液である。
【０００３】
くし型両親媒性コポリマーは、骨格が概して疎水性または親水性であるという点において、ブロックコポリマーとは異なり、異極のポリマー鎖が、それに組み込まれているのではなく、骨格からペンダント状になっている。くし型コポリマーは、疎水性骨格および親水性分岐鎖で調製され（Ｍａｙｅｓら、米国特許第６，３９９，７００号）、また、親水性骨格および疎水性分岐鎖でも調製されてきた（Ｗａｔｔｅｒｓｏｎら、米国特許第６，５２１，７３６号、Ｕｃｈｅｇｂｕら、米国出願公開第２００６／０１４８９８２号）。前者は細胞表面受容体に多価提示を提供するために使用し、後者は薬物を可溶化し、細胞に導入するために使用した。
【０００４】
両親媒性ポリマー凝集体は、不溶性薬剤、標的薬剤送達ビヒクル、およびｓｉＲＮＡまたは遺伝子の送達系を可溶化するための担体として研究されてきた。それらは、鎖エンタングルメントおよび／または内部疎水性領域の結晶化度のため、従来の低分子量のミセルよりもさらに安定した構造を有する。該ビヒクルのポリマー特性により、凝集体は、臨界ミセル濃度未満に希釈する際、通常のリポゾームが受ける分解に比較的影響されなくなる。２分子膜が存在しないことによって、凝集体は細胞膜とさらに容易に融合し、細胞に直接ペイロードを送達することが可能である。また、該凝集体の両親媒性特性は、界面活性剤のような活性をもたらし、適切に標的化された凝集体は、ウイルス外被タンパク質と融合し、分離させることが可能であると考えられる。
【０００５】
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の卓越した生体適合性、および細網内皮系を避けるＰＥＧでコーティングされた「ステルス」粒子の明らかな能力のために、ＰＥＧを組み込むミセル、リポゾーム、およびポリマーが、広範囲にわたって、薬物導入システムのための物質と見なされている。（リポゾームおよびミセルを形成する）ＰＥＧ脂質の親水性成分としてのＰＥＧの使用については多くの報告がある。例えば、Ｋｒｉｓｈｎａｄａｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０：２９７−３０２（２００３）を参照されたい。より強固な「ポリマーソーム」に自己集合する、自己集合性の両親媒性ブロックコポリマーはまた、薬剤の可溶化および送達のためのビヒクルとして研究されてきた。例えば、Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｌｅｒｏｕｘ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．４８：１０１−１１１（１９９９）；Ｐｈｏｔｏｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，９０：３２３−３３４（２００３）、Ｋａｔａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．４７：１１３−１３１（２００１）、およびＴｏｒｃｈｊｌｉｎ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ＲｅＩ．７３：１３７−１７２（２００１）を参照されたい。
【０００６】
また、Ｇｒｅｆ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｍａｔｅｒ．２０：１３１ （１９９３）、Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，９：９４５（１９９３）、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２２：１４１（１９９２）、Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，６３：２７５（２０００）、Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，５１：２２１（１９９８）、Ｙｕ ａｎｄ Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２９：６３５９（１９９６）、Ｄｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：１１３（１９９９）、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第６，３２２，８０５号、Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ，米国特許第６，６１６，９４１号および第７，２１７，７７０号、Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ，欧州特許第ＥＰ０５８３９５５も参照されたい。この能力におけるポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）の使用もまた、オリゴヌクレオチドの送達に焦点を当てて報告されている（Ｎａｍ ｅｔ ａｌ，米国特許第６，５６９，５２８号、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第２００４０２４８８４２号）。同様に、Ｌｕｏらは、ポリヌクレオチドの送達に好適なＰＥＧ共役ポリアミドアミン（「ＰＡＭＡＭ」）デンドリマーをＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３５：３４５６（２００２）で説明している。
【０００７】
薬物を可溶化、分配、および送達する必要性に加えて、標的細胞タイプ、組織、腫瘍、または臓器に特に的を搾る標的薬物送達の必要性がある。これは、通常、標的部位の細胞壁に対する特異的親和性を有する抗体または他のリガンドの結合により達成される。しかしながら、ＰＥＧは、ポリマー鎖の末端を除いて官能基を欠き、ブロックコポリマーにおいては、末端基の大部分は、必然的に、他のブロックコポリマー成分への結合に取り込まれる。この理由により、ＰＥＧブロックコポリマーへの抗体または細胞接着分子等の標的部分の結合は、一般に非ＰＥＧブロックに限定され、これはあいにく、自己集合した凝集体のコロナに通常曝露する、コポリマーの一部ではない。
【０００８】
ポリマー凝集体へのブロックコポリマーの自己集合をもたらす相分離現象は、容易に元に戻すことができ、疎水性コアに架橋結合することにより、凝集体の安定性を増加させる取り組みが行われている（欧州特許第ＥＰ０５５２８０２号を参照されたい）。またブロックコポリマーの疎水性成分へ薬物を共有結合させる取り組みも行われている（ＰａｒｋおよびＹｏｏ、米国特許第６，６２３，７２９号、欧州特許第ＥＰ０３９７３０７号）。
【０００９】
樹枝状ポリマーは、容易に標的部分に共役し、また、生体内の特定の細胞を標的化する（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０：１８４５）、ならびにウイルス性および細菌性の病原の生体基質への付着を阻止する可能性も有する。複合シアル酸に共役するくし型分枝ポリマーおよびデンドリグラフトポリマーは、ウイルス血球凝集を阻害し、生体外哺乳類細胞の感染を阻止する能力について評価されている（Ｒｅｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：２７１）。最も効果的なウイルス阻害剤は、くし型分枝およびデンドリグラフト高分子であり、これらのウイルスに対して５０，０００倍の増加活性を示した。
【００１０】
近年、製薬会社のＳｔａｒｐｈａｒｍａは、ウイルスの表面上で受容体を結合することにより、ＨＩＶ感染を予防するデンドリマーに基づくバイオサイド（ＶｉｖａＧｅｌ（商標））についての開発の成功を報告した（Ｈａｌｆｏｒｄ（２００５）Ｃｈｅｍ．＆ Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ ８３（２４）：３０）。Ｃｈｅｎら（２０００）（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．１：４７３）は、第４級アンモニウムで官能化したポリ（プロピレンイミン）デンドリマーが非常に強力なバイオサイドであることを報告した。
【００１１】
患者のほぼ同一の健康な細胞に損傷を与えることなく癌細胞を殺滅することは、特に困難な事柄である。最も成功した化学療法薬剤でさえも、癌細胞に対する機構に基づく選択的毒性は、部分的にしか成し遂げられない。この理由により、癌治療薬は、標的送達が特に望ましい薬剤類であり、多大な努力が、癌特異的細胞表面マーカーのためのリガンドの開発に注がれた。（Ｄｅｌｇａｄｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０００）
【００１２】
例えば、葉酸の細胞表面受容体は、しばしば卵巣、腎臓、肺、乳房、脳、および子宮内膜の癌、ならびに造血源の骨髄細胞で上昇する。該葉酸受容体は、通常、正常な細胞において潜在性であるが、癌細胞の表面に現れるので、受容体特異的癌治療のための標的として頻繁に用いられてきた（Ｌｕ ａｎｄ Ｌｏｗ，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．９１：１７−２９（２００３））。葉酸の、抗腫瘍薬、抗体（米国特許第５，５４７，６６８）、リポソーム（Ｌｉｕ ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｏｎｌｉｎｅ，２：５４７−５５２（２００５））、および他のナノ粒子薬物送達コンストラクト（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．５８：１５３２−１５５５（２００６））との直接共役体も報告された適用の１つである。葉酸共役両親媒性ブロックコポリマーから形成されるミセルは、選択的にパクリタキセルを腫瘍細胞に送達することが示されている（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０９：１５８−１６８（２００５））。
【００１３】
同様に、上皮細胞増殖因子受容体（ＥｒｂＢ１、ＥＧＦＲ）は、乳癌、頭頸部癌、胃癌、直腸結腸癌、食道癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、および卵巣癌、ならびに非小細胞肺癌を含む、上皮性起源の幅広いヒト腫瘍に発現する。これらの所見は、受容体介在性送達系に対する別の重要の標的としてのＥＧＦＲを確立した。ＥＧＦ自体は、強度の細胞分裂および血管形成活性を呈し、これは、それを標的部分としては好適ではないものにするが、ＥＧＦＲに対する種々の非アゴニストリガンドがこの目的のために開発されている。
【００１４】
細胞特異的または腫瘍特異的エピトープに対する抗体は、単独で（患者の補体系を活性化するため）、または放射性同位体もしくは毒素を送達するために、標的治療薬として成功裏に使用されている。例えば、ＣＤ２０ Ｂ−リンパ球抗原に対するマウスＩｇＧ2aラムダモノクローナル抗体である、トシツモマブを、放射性ヨウ化し得、ヨード１３１を選択的にリンパ腫細胞に送達するために使用できる。これは、非ホジキンリンパ腫の治療として、診療所において功を奏するものであることを証明し、この適応のために、商標名Ｂｅｘｘａｒ（商標）で市販されている。同様に、別の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である、イブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ（商標））は、非ホジキンリンパ腫の放射免疫療法のためのイットリウム９０を送達するために使用されている。
【００１５】
他の臨床的に功を奏する癌標的抗体としては、慢性リンパ球性白血病のためのアレムツズマブ（抗ＣＤ５２、Ｃａｍｐａｔｈ（商標））、結腸癌および肺癌のためのベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ、Ａｖａｓｔｉｎ（商標））、結腸、頭頸部癌のためのセツキシマブ（抗ＥＧＦＲ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標））およびパニツムマブ（抗ＥＧＦＲ、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標））、急性骨髄性白血病のためのゲムツズマブ（抗ＣＤ３３、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標））、非ホジキンリンパ腫のためのリツキシマブ（抗ＣＤ２０、Ｒｉｔｕｘａｎ（商標））およびエプラツズマブ（抗ＣＤ２２、Ｌｙｍｐｈｏｃｉｄｅ（商標））、ならびに乳癌のためのトラスツズマブ（抗ＨＥＲ−２、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））が挙げられる。免疫毒素Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）は特殊な関連性があり、ここでは、抗ＣＤ３３抗体が、細胞毒性抗腫瘍薬物である、カリケアマイシンに共役する。
【００１６】
安定した、生体適合性のある、種々の標的部分の結合に適しており、かつ相当な薬物のペイロードを所望の腫瘍細胞標的に送達するのに効率的な薬物送達系に対する必要性が依然として存在する。同様に安定した、効率的、かつ生体適合性のある標的抗癌剤に対する必要性もまた存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、分枝点部分を有する親水性骨格、およびこれらの分枝点部分で結合する疎水性分岐を含む、生体適合性のある，くし型ポリマー分子を提供する。分岐点部分は、腫瘍細胞に対して特異的な標的部分が結合する、反応性官能基の形態の結合点をさらに提供する。本発明は、かかるポリマーから形成されるポリマー凝集体の水性懸濁液を提供し、また、かかる薬剤をポリマー凝集体の疎水性コアに封入することによって、抗腫瘍薬剤を可溶化するための方法を提供する。薬物を封入するための方法は、基本的に、水性または混合水性溶媒中で、薬物種を本発明のポリマーと接触させるステップを含む。得られる薬物ペイロードは、水性環境に懸濁される際、くし型ポリマーによって形成される高分子ポリマー凝集体の疎水性コア内で、可溶化した状態に維持される。好ましい実施形態においては、ポリマー凝集体を、その封入された薬物ペイロードを伴って、選択的に、標的部分によって標的癌細胞へ送達する。
【００１８】
本発明はまた、癌細胞を殺滅またはその増殖もしくは再生を阻害する方法、または哺乳類の癌治療のための方法を提供し、該癌細胞に接触するステップ、または該哺乳類に、本質的に以下の構造からなるくし型ポリマー内に封入された抗癌薬を投与するステップを含む。
【００１９】
【化１】
【００２０】
該構造は、交互分岐点部分Ｂ、および親水性の水溶性ポリマーブロックＡから形成される骨格を含む。疎水性側鎖Ｃ、および任意に標的部分Ｚは、分岐点部分に結合する。該ポリマー鎖は、末端基、典型的には末端Ｂ部分にＨまたはポリマーブロックＡ、および典型的には末端ＡポリマーブロックにＯＨを有するが、本発明はすべての好的な鎖停止を包含することを理解されよう。好ましくは、該側鎖Ｃは、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換される直鎖もしくは分岐鎖炭化水素、または１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素である。側鎖Ｃはまた、疎水性アミノ酸、ペプチド、またはポリマーであり得る。側鎖Ｃに好適な親水性置換基は、ヒドロキシル基、カルボニル基、およびアミノ基、ならびにアミド基、スルホンアミド基、スルホキシド基、およびスルホン基である。好ましい親水性置換基は、第３アミド、スルホキシド、およびスルホン等の非プロトン性極性基である。
【００２１】
任意の標的部分Ｚは、癌細胞の表面に対して特異的な結合親和性を有するリガンドまたは抗体である。本発明のある実施形態において、２つもしくはそれ以上の異なる部分Ｚは、複数の細胞表面受容体および抗原を、特異性を増加する手段として標的化することができるように、所与の分岐点またはポリマー分子上に存在する。「特異的結合親和性」とは、リガンドまたは抗体が、治療を受けている哺乳類の体内で見られる多くの他の細胞表面および高分子の存在下で、生体内の癌細胞の表面に結合することができることを意味する。該親和性は、癌細胞のみに、または患者における癌性である細胞の種類に特異的であり得る。例えば、Ｂ細胞リンパ腫において、該リガンドは、すべてのＢ細胞に存在するＣＤ−２０受容体に対する抗体であり得る。特異性の度合いは、極端に高い必要はないが、可溶化薬物ペイロードのみよりもさらに効果的に癌を治療するのに十分でなければならない。「ｓ」で表される部分は、結合またはスペーサ部分であり、ｓがスペーサであるとき、各ｓは、１から４つの基のＺを担持し得る。ｎの値は、１から約１００の範囲であり、ｐの平均値は、１から２であり、ある実施形態において、ｒはゼロであり得る。ｒがゼロではない実施形態において、ｒの平均値は１から４の範囲である。
【００２２】
分岐点部分Ｂは、２つのポリマーブロックＡへの結合、１〜２つの側鎖Ｃ（平均）への結合、ならびに、ｒがゼロではないとき、スペーサ「ｓ」および／またはリガンドＺへの１つもしくは複数の結合を有する多価部分である。特定の実施形態において、Ｂならびにｓおよび／またはＺへの結合は、複数の反応性官能基を介して確立し、これは、結合点として機能することができる。特に好ましい実施形態において、標的部分は、本発明のポリマーの分岐点部分に共有結合し、薬物は、凝集体のコアに組み込ませ、標的薬剤複合体を形成する。他の実施形態において、標的部分が、細胞表面受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである場合、標的ポリマーまたはポリマー凝集体は、封入された抗癌薬が存在しない場合でさえ、薬物のような効果を呈し得る。
【００２３】
本発明は、本明細書に記載のくし型ポリマー、凝集体、および標的ポリマー凝集体および薬物複合体の調製方法をさらに提供する。本発明のポリマーは、生体内で薬物を効率的に可溶化、分配、および送達するポリマー凝集体に自己集合し、非毒性で、生体適合性であり、かつ安定しており、さらに、それらの外部表面に複数の細胞標的部分を担持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ａ５４９腫瘍細胞の培地の細胞増殖アッセイにおける、本発明の例示的な組成物の活性を示す図である。
【図２】Ｈ４４１腫瘍細胞の培地の細胞増殖アッセイにおける、本発明の例示的な組成物の活性を示す図である。
【図３】Ｓｋｂｒ３腫瘍細胞の培地の細胞増殖アッセイにおける、本発明の例示的な組成物の活性を示す図である。
【図４】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞の培地の細胞増殖アッセイにおける、本発明の例示的な組成物の活性を示す図である。
【図５】ＢＴ４７４腫瘍細胞の培地の細胞増殖アッセイにおける、本発明の例示的な組成物の活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書において「πポリマー」と称される、本発明のポリマーの例は、２００６年１月１９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／０１８２０号（その明細書は、参照することにより、その全体として本明細書に組み込む）に説明されている。それらは、式１に示されるとおり、交互分岐点部分Ｂおよび親水性の水溶性ポリマーブロックＡから形成され、各分岐点部分に結合する複数の疎水性側鎖Ｃを有する骨格を有する、くし型構造を有する。該側鎖Ｃは、比較的短い疎水性部分であり、これは、脂肪族または不飽和分子、鎖もしくはオリゴマーであり得る。ｐの値は、理想的には、２、３、または４のいずれかの整数である。実際は、該側鎖を、しばしば、完全に効率的ではない化学反応により導入させるが、結果的に、意図した整数ではない、全体としてのポリマー調製物のｐの平均値をもたらす。非整数平均値はまた、以下に述べるとおり、意図的に取得することができる。したがって、本発明のポリマーのｐの平均値は１よりも大きく、４ほど大きくてもよい（１＜ｐ＜４）。好ましい実施形態において、ｐは約２から４、最も好ましくは１．５＜ｐ＜２の範囲である。以下に整数値に言及するとき、その整数は理想的なものであって、考察するポリマーの物理的試料に実際に見出される平均値に言及するものではないことを理解されたい。
【００２６】
骨格ポリマーブロックＡは、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（エチレンイミン）、ポリビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、多糖等を含むが、これらに限定されない、親水性および／もしくは水溶性ポリマー鎖より選択する。好ましくは、ポリマー単位Ａは、式−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−のポリ（エチレングリコール）鎖であって、ｍは１から１０，０００、好ましくは３から３，０００である。
【００２７】
種々のグレードのポリ（エチレングリコール）の製造において、分子量の範囲を比較的狭く維持すると同時に、ポリマーの分子量を実質的に２倍にする、２つのポリ（エチレングリコール）鎖へ２価リンカー部分（例、ビスフェノールＡジグリシジルエーテル）を連結することは、当業界では既知である。得られる「ポリ（エチレングリコール）」分子は、ポリマー鎖の中間で、非グリコールリンカー部分（例えば、ポリ（エチレングリコール）−ビスフェノールＡジグリシジルエーテル不可物（ＣＡＳ登録番号３７２２５−２６−６を参照されたい）によって、結果的に遮断される。高オリゴマー、すなわち、２つのビスフェノールＡジグリシジルエーテル部分によって分離される３つのＰＥＧ鎖を有するものもまた既知であり、例えば、国際特許出願ＷＯ ００／２４００８を参照されたい。したがって、本明細書において使用する「ポリ（エチレングリコール））および「ポリ（プロピレングリコール））という用語は、ビスフェノールＡジグリシジルエーテル、ビスフェノールＢジグリシジルエーテル、ビスフェノールＳジグリシジルエーテル、ハイドロキノンジグリシジルエーテル等を含むがこれらに限定されない、非グリコールリンカー単位を組み込む、ポリ（エチレングリコール）およびポリ（プロピレングリコール）ポリマー鎖を包含する。本明細書の目的上、いかなるこのようなリンカー部分も「モノマー単位」と見なさない。
【００２８】
ポリマーブロックＡは、最も好ましくは、２０から５０のモノマー単位の平均長を有する。ポリエチレングリコール鎖は、一端もしくは両端を、アミノ、メルカプト、アクリレート、アクリルアミド、マレイン酸塩、マレイミド等を含むが、これらに限定されない、他の部分へのリンカーとしての使用に好適な官能基で末端置換させることが可能である。ｎの値は、１から１０００、好ましくは３から１００の範囲である。πポリマーの全体分子量は、１０００から１００，０００ダルトン以上であり、好ましくは２，０００ダルトン超、より好ましくは７，０００ダルトン超の範囲であり得る。
【００２９】
疎水性部分Ｃは、同一または異なり得、モノマー単位によって異なり得、例えば、直鎖炭化水素（１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換される）、多環式炭化水素（１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換される）、疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーであり得る。好適な親水性置換基としては、ヒドロキシル、エーテル、シアノ、およびアミド官能基が挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、ωヒドロキシ、ωシアノ、ωアミド、もしくはωアルコキシ置換基を担持するＣ8〜Ｃ20アルキル基が想定される。このような状況において、「置換基」という用語は、部分Ｃの炭化水素鎖もしくは環系の炭素原子に関して、Ｏ、Ｎ、またはＳ等のヘテロ原子の置換を含む。したがって、エーテルおよびアミド結合、ならびに複素環を、部分Ｃに組み込ませることが可能である。
【００３０】
疎水性部分Ｃは、好ましくは、比較的短鎖（Ｃ8−Ｃ20）脂肪酸であるが、短鎖オリゴマーであってもよい。好適なオリゴマーとしては、オリゴヒドロキシ酸、例えば、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ＤＬ乳酸）、ポリ（Ｌ乳酸）、ならびにポリ（グリコール酸）およびポリ（乳酸）ヒドロキシ酸のコポリマー、ならびにポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、およびポリ（リン酸エステル）、ポリラクトン、例えば、ポリ（エプシロン−カプロラクトン）、ポリ（デルタ−バレロラクトン）、ポリ（ガンマ−ブチロラクトン）、およびポリ（ベータ−ヒドロキシ酪酸塩）が挙げられる。Ｃ部分はまた、コレステロール、コール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、および関連物質等の疎水性分子、プロスタグランジン様物質、ステロイド物質（例えば、デキサメタゾン）、レチノイン酸、レチノールおよび関連するレチノイド物質、疎水性ペプチド等から選択できる。各部分Ｃの分子量は、４０を上回り、好ましくは５０から１，０００、最も好ましくは１００から５００である。分子Ｃ−ＨのｌｏｇＰ値（オクタノール−水）は、約１．４を上回り、好ましくは約２．０を上回り、最も好ましくは約２．５を上回る。一般に、分子Ｃ−Ｈが、水中で実質的に不溶性である場合、いかなる部分Ｃも、本発明の使用に好適であると考えられる。「実質的に不溶性」とは、液体Ｃ−Ｈが、水と混合した際、分離相を形成することを意味する。
【００３１】
側鎖Ｃがポリマー鎖に沿って規則的に均一に分布していないが、クラスタ［Ｃ］pに生じることは、本発明のくし型ポリマーの際立った特徴である。これらのクラスタは、ポリマー単位Ａの単分散度に応じて、ポリマー鎖に沿ってほぼ規則的に離間する。したがって、共通の分岐部分Ｂに結合する２つの側鎖Ｃ間の距離は、ポリマーブロックＡによって分離される、異なる分岐部分に結合する２つの側鎖間の距離とは異なる。
【００３２】
標的送達に特に好適な本発明の一実施形態において、分岐点部分Ｂは、式２に示す１つもしくは複数の反応性官能基Ｘをさらに含み、これは、標的部分の結合に好適である。
【００３３】
【化２】
【００３４】
式２において、個別の反応基Ｘは、同一であっても、互いに異なっていてもよく、ポリマー２の集合中に必要であり得るように、任意にブロックまたは保護されてもよい。ｒの平均値は、０（ＸまたはＺ基がない実施形態において）から約８の範囲である。一般的には、反応基を、分子種間の共有結合を形成するのに有用であることが当該技術分野で既知の官能基より選択する。ある実施形態において、単一の結合点Ｘが存在し得る。他の実施形態において、３または４つの異なる種類の反応基が存在し得る。好適な反応基Ｘとしては、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＮＨＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＮＨ2、ハロアシル、アセトアセチル、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ等、ビニル、アクリル、アリル、マレイン、桂皮等の反応二重結合、ならびにアセチレンカルボキシおよびアセチレンカルボキサミド（マイケル付加、ディールス・アルダー反応、およびフリーラジカル添加反応に好適）等の反応三重結合を有する基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
例示的な細胞標的部分としては、特異的細胞表面受容体に結合する受容体特異的リガンド、抗体、アプタマーもしくはペプチド、ならびに他の標的部分、例えば、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）アミノ酸配列もしくはチロシン−イソロイシン−セリン−アルギニン−グリシン（ＹＩＳＲＧ）モチーフを有するペプチド；上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子および線維芽細胞増殖因子を含む増殖因子；葉酸、メトトレキサート、プテロイン酸、エストラジオール、エストラトリオール、テストステノン、および他のホルモン等の細胞受容体リガンド；マンノース−６−リン酸、糖、ビタミン、トリプトファン等が挙げられるが、これらに限定されない。受容体アゴニストおよび受容体アンタゴニストは、競合的またはアロステリックに関わらず、使用することが可能である。
【００３６】
アプタマーは、当該技術分野で既知の方法を使用した受容体への結合のために選択することができる。受容体に結合することができるペプチドは、ハイスループット・マイクロプレートスクリーニング、ファージ提示法、ピンおのび平面アレイ等の標準方法を使用して選択することができる。抗体は、好ましくは、細胞特異的表面抗原に対するモノクローナル抗体であり、好適な標的部分としては、完全抗体のみでなく、Ｆａｂ’２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、もしくは鎖ペプチド（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）ペプチド）等の活性抗原結合配列を含有する抗体フラグメント、またはかかる抗体の活性抗原結合配列の類似体が挙げられる。好適な抗体としては、ＮＣＡ９０、ＮＣＡ９５、ＣＥＡ、ＣＤ１５、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＶＧＥＦ、およびＥＧＦＲ等の腫瘍抗原に対する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、好ましくはモノクローナルであり、任意にヒト化抗体、キメラ抗体、または完全ヒト抗体であり得、ＰＥＧ化あるいは他の方法で修飾することが可能である。しかしポリクローナル抗体は、それらの多重抗原結合能により、ある状況において有利に採用することが可能である。
【００３７】
特に好適な抗体としては、トシツモマブ、イブリツモマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、エプラツズマブ、トシツモマブ、およびトラスツズマブ、ならびにその結合ドメインを含む抗体フラグメントまたはペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
代替の実施形態において、ビオチンは、官能基Ｘを介してπポリマーに結合し、アビジンおよびストレプトアビジン連結タンパク質、ペプチド、抗体、成長ホルモン、ならびに他の標的部分に対する非共有結合手段として使用できる。
【００３９】
本発明のある実施形態においては、分岐点部分Ｂの一部の分画を、ポリマー鎖のどこか他の分岐点部分に連結させ、架橋ヒドロゲル構造を形成させる。かかる架橋は、ポリマーを、同種官能基または異種二官能基（これらのうちの少なくとも１つは、Ｘ、または第１の分岐点部分に位置するＣの反応基と反応し、これらのうちの少なくとも１つは、Ｘ、または同一のポリマー分子内の第２の分岐点部分のＣに存在する反応性官能基と反応する）を含有する多官能部分と反応させることによって達成できる。架橋はまた、ポリマー鎖Ａ上の末端官能基への結合によっても行える。本発明の直鎖くし型ポリマーと同様に、かかる架橋ポリマーは、任意に標的部分を担持し得る。
【００４０】
分岐点部分Ｂは、典型的には、複数の反応基（これらのうちの２つは、親水性ポリマー単位Ａへの結合に好適であり、これらのうちの少なくとも２つは、疎水性部分Ｃへの結合に好適である）を有する多官能分子から派生する。部分Ｂは、任意に、上記で説明した１つもしくは複数の追加の反応基Ｘを有し得る。
【００４１】
特に好ましい分岐点部分は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、または２，３−ジアミノブタン−ｌ，４−ジチオールと、マレイン酸の２つの分子との共役体である。分枝点部分と、部分Ａとしてのポリエチレングリコールとの組み合わせは、式３および３ａのポリマー骨格を生成する。
【００４２】
【化３】
【００４３】
式中、ＹおよびＹ’は、同一または異なってよく、好ましくは、ＯＨ、ＮＨ2、ＯＮＨ2、ＮＨＯＨ、およびＮＨＮＨ2から選択する。好ましい実施形態において、ジチオールのヒドロキシルまたはアミノ基は、反応基Ｘであり、標的または薬物部分の結合点としての役割を果たすが、官能基ＹおよびＹ’は、Ｃ部分の結合点としての役割を果たす。代替として、基ＹおよびＹ’は、標的部分の結合点としての役割を果たすが、ヒドロキシルまたはアミノ基は、Ｃ部分に結合するために使用する。
【００４４】
式３および３ａは、各硫黄原子が独立して、ＰＥＧエステルカルボニル基にαまたはβを結合させることができることを意味することを意図する。本発明は、単一異性組成物、ならびに１つまたは双方のＣ−Ｓ結合で、位置異性体の混合物を包含する。さらに、式１の４つの不斉炭素により、本発明は、すべてのキラル、メソ、およびジアステレオ異性体、ならびにその混合物を包含する。
【００４５】
アセチレンジカルボキシル酸およびフランのディールス・アルダー付加物も、好適な分枝点部分としての役割を果たし得る。例えば、ＰＥＧおよびアセチレンジカルボン酸から派生するポリエステル４は、フランとのディールス・アルダー反応を受けることが既知である（Ｍ．Ｄｅｌｅｒｂａ ｅｔ ａｌ，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．１８（８）：７２３−７２８（１９９７））。
【００４６】
【化４】
【００４７】
したがって、３，４−二置換フランとのディールス・アルダー反応を受けて、５等の種を生成でき、ポリマー５は、ヒドロキシル化またはエポキシ化によって修飾し、反応基を形成することができる（例えば、スキーム１のＸおよびＸ’）。
【００４８】
同様に、ＰＥＧの、エチレンジアミン四酢酸二無水物との反応は、その後の縮合により式６のポリエステルを形成する。
【００４９】
【化５】
【００５０】
他の好適な分岐点部分は、酒石酸、アセチレンジカルボン酸、ニトリロ三酢酸、３，４，３’，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボン酸二無水物、３，４，３’，４’−ジフェニルエーテルテトラカルボン酸二無水物、ピロメリト酸二無水物、１，２−エタンジチオールおよび１，４−ブタンジチオール等のアルカンジチオール、ビス（２−メルカプトエチル）エーテル、２−メルカプトエチルスルフィド、ジメルカプトプロパノール、ジメルカプトプリン、ジメルカプトチアジアゾール、ジメルカプトコハク酸、ベンゼンジメタンチオール、ベンゼンジチオール、ジハロゲン化ベンゼンジメタンチオール、ジハロゲン化４，４’−チオビスベンゼンチオール等から派生させることができる。
【００５１】
ＹおよびＹ’はＯＨである場合、疎水性基Ｃを、カルボキシル酸基のアミド化またはエステル化によりポリマーに結合させることができる。該疎水性基Ｃは、好ましくは、比較的小さい（Ｃ8−Ｃ20）および主に炭化水素部分であり、直鎖または分枝であり得、または１つもしくは複数の環を含み得る。例としては、Ｃ−Ｈ分子のｎ−オクタノール、ｎ−デカノール、ｎ−ドデシルアミン、ｎ−ペンタデシルアミン、コレステロール、デオキシコール酸、コール酸、レチノール、ビタミンＡ、ならびに種々のｃｉｓおよびｔｒａｎｓレチノイン酸異性体、種々のトコフェロール、およびアラキドン酸から派生する共有結合部分が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリマーは、便宜上、多くとも２つの異なる疎水性側鎖を有するのものとして表すが、ポリマー凝集体の内部溶媒特性は、種々の疎水性側鎖を特定のポリマーに導入するように、２つまたはそれ以上の疎水性化合物の混合物を採用することによって、改質または「調整」できることを理解されたい。例えば、水素結合および双極子間相互作用から生じる溶媒効果に加え、液晶相および相転移温度等の物理化学特性は修正することができる。かかる効果は、例えば、膜二重層の研究から、公知である。
【００５２】
具体的な一例として、式２のポリマー（式中、Ｘ＝ＯＨであり、ｒ＝２である）は、ポリエチレングリコールを無水マレイン酸と反応させて、ポリエステル７を形成し、その後、ジチオスレイトールとの反応により、８を形成することによって調製した。その後、酸７をｎ−オクタデシルアミンでアミド化して、所望のくし型ポリマー９（スキーム２）を形成した。式９によって表されるＤＴＴ由来のアミドくし型ポリマーは、本明細書において、「πポリマーＡ」と称し、スキーム２の具体的なポリマー９は、「Ｃ18−πポリマーＡ」で示す。
【００５３】
【化６】
【００５４】
ジチオスレイトールの代わりに２，３−ビス（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブタン−ｌ，４−ジチオールを使用することによって（１０ａ、ＤｕＰｒｉｅｓｔ ｅｔ ａｌ，米国特許第４，７５５，５２８号）、脱保護後、対応するアミノ官能基化πポリマー９ｂ（スキーム３）をもたらす。
【００５５】
【化７】
【００５６】
同様に、ブタンジチオール１０ｃを使用することによって、標的部分の後の結合のためにスペーサ基Ｌが適所にある、一般構造９ｃのポリマーをもたらす（スキーム４）。該スペーサ基Ｌは、Ｃ2〜Ｃ20アルキレンおよび１から１０の−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−単位を有するオリゴ（エチレングリコール）スペーサを含むが、これらに限定されない、リガンドまたは標識を基質分子に結合させる際の使用に関して、当該技術分野で既知のスペーサ基のうちのいずれであってもよい。
【００５７】
【化８】
【００５８】
他の実施形態において、末端アミノ基を有するＰＥＧポリマーは、構造１０〜１４に示すように、ＡとＢとの単位間のアミド結合を有する例を調製するために使用できる。これらのポリアミドの各々は、ＰＥＧジアミンＨ２Ｎ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）mＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ2の、適切な環状無水物との反応により得ることができる。
【００５９】
【化９】
【００６０】
【化１０】
【００６１】
穏和な条件下では、上記のアミド酸は、予想された生成物である。加熱すると、イミドを形成できることが期待され、少数の反応基を有するポリマーをもたらすが、依然として疎水性Ｃ部分の結合に好適である。望ましくないイミド形成は、低温および／または水性条件下で、反応を行うことによって、低減または回避することができる。あるいは、ペンダント側鎖ＣをポリマーＡブロックの末端に添加することができ、重合時に、分枝点部分が生じる可能性がある（スキーム５）。
【００６２】
１，３−ジアミノプロパン等の単一ジアミンに加えて、スキーム５に示すように、（任意にマスクされた）反応官能基Ｘを有するジアミンを使用してもよく、標的部分の結合に適するポリマー１５をもたらす（スキーム６）。以下の式において、ｐは、０〜４の範囲であり得、各Ｘは独立して、存在し得るいかなる他の基Ｘとも同一または異なる。反応基Ｘは、ペンダントである必要はないが、例えば、モノマーＨ2Ｎ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ2等の場合、ジアミンを構成する原子の鎖内のＮＨ基であり得る。
【００６３】
【化１１】
【００６４】
【化１２】
【００６５】
上記のとおり調製したπポリマーのうちの一部は、さらなる誘導体化に好適な反応基Ｘを有し、標的部分に結合し、二官能性または多官能架橋剤によるポリマー鎖の架橋を行う。特定の実施形態において、ポリマー鎖上の反応基の部分的な誘導体化は、種々の異なる反応基を有するπポリマーを生成するように行い、これは、種々の標的部分の、単一ポリマー鎖への結合を可能にする。したがって、準化学量論的な量の塩化アクリロイル（または無水マレイン酸）の、実施例１のπポリマーへの添加によって、アクリロイル（またはマレイル）基および残留ヒドロキシル基の両方を有するポリマーが生成する。準化学量論的な量のメルカプト−カルボン酸、例えば、ＨＳ−（ＣＨ2）3−ＣＯＯＨのその後のマイケル付加により、ヒドロキシル、アクリロイル、およびカルボキシル基を有するポリマーが生成する。準化学量論的な量の試薬により後に残されるいずれの残留反応基に加えて、システインの添加により、アミノおよびカルボキシル基が導入される。
【００６６】
多官能性πポリマーへの別の手法には、疎水性鎖Ｃの分画の慎重な省略を含む。実施例１のπポリマーは、例えば、アミド化ステップにおけるペンダント形成アルキルアミンの量を制限する単純な方法によって、未反応カルボン酸基で調製することができる。さらに別の手法は、アミン混合物によるアミド化であり、この分画は、反応基Ｘを含有する。また、適切な条件下（ステップＡでは過剰な無水マレイン酸、ステップＢでは過剰なＤＴＴ）では、所望の数の遊離チオール基を有するポリマー調製物を生成できる。
【００６７】
実施例１のπポリマーは、意図的に、骨格中のＤＴＴ部分から派生したヒドロキシル基を含有し、これは、反応基Ｘとしての役割を果たす。炭酸塩／重炭酸塩緩衝液の存在下で、これらの基の、水性媒体中の塩化アクリロイルまたは塩化メタクリロイルによるエステル化は、該−ＯＨ基上にアクリロイル置換をもたらす。該アクリレートポリマーは、容易にラジカル重合（アクリル酸化合物等のラジカルモノマー、またはビスアクリル酸化合物等の架橋剤の添加を伴う、または伴わない）に供することができ、制御した薬物導入、および局所適用（皮膚用パッチ剤または軟膏等）に適するヒドロゲル（ポリマー貯蔵または蓄積の役割を果たす）を得る。該アクリロイル基はまた、特に、タンパク質、酵素、ペプチド、抗体、Ｆａｂ’２フラグメントもしくはＦａｂ’フラグメントのシステイン残基、または他の標的部分等のチオールによって、マイケル付加に供することができる（スキーム７）。
【００６８】
【化１３】
【００６９】
反応ヒドロキシル基を有するπポリマーは、乾燥後、無水マレイン酸でエステル化して、マレイン酸塩基である、マイケル受容体に結合させ、同時に遊離カルボキシル基を生成することができる。得られるポリマーにおいて、マレイン二重結合は、特に、タンパク質、酵素、ペプチド、抗体、Ｆａｂ’２フラグメントまたはＦａｂ’フラグメント、もしくは他の標的部分内のシステイン残基等のチオールとによるマイケル付加に利用可能であり（スキーム８）、カルボキシル基が、タンパク質およびペプチド内のリシン残基等の、標的部分におけるアミノ基への連結に利用可能である。
【００７０】
異なる部分は、アミド化を行い、新規に導入した（または従来利用可能な）カルボン酸基にさらに結合することができる。したがって、少なくとも２つの異なる標的部分は、飽和反応状態下でさえ、結合することができる（すなわち、結合部分は、過剰な化学量で存在する）。
【００７１】
【化１４】
【００７２】
代替の調製には、スキーム９に示すとおり、ジマレイン酸ＰＥＧのアミド化を含み、その後ジチオールとの反応を行う。アミド化は、活性エステルの使用、またはＮＨＳ、ＨＯＢＴ、ＤＭＡＰ、ピリジン、もしくはＴＭＥＤ等のさらなる触媒を伴う、または伴わない、ＥＤＣ、ＤＩＰＣ、ＤＣＣ等を用いる方法を含むが、これに限定されない、多くの既知のカルボン酸活性化プロセスのうちのいずれかによって行える。次いで、アミド化したジマレイン酸ＰＥＧをＤＴＴまたは別のジチオールと反応させて、二重結合へのマイケル様添加を達成し、これによって、所望のポリマーを生成する。このプロセスの利点は、潜在的に非常に幅広い、予め形成したジマレイン酸ＰＥＧから、ポリマーに組み込みたい正確なモノマー（およびその比率）を、選択できることである。
【００７３】
【化１５】
【００７４】
ペンダントカルボキシレート基を有するポリマーは、典型的な結合条件下で、アミンでアミド化することができ、Ｃｕｒｔｉｕｓ転位を行い、イソシアネート基に変換し、その後、尿素およびカルバメートをそれぞれ形成するように、アミンまたはアルコールと結合させることもできる。かかる反応は、疎水性基Ｃを導入、または標的部分に結合するために使用することができる。
【００７５】
遊離アミンは、ジアミンと反応基の１つを少なくとも部分的に反応させることにより、ポリマー内に導入することができる。反応条件下で、アミン基の１つを保護するか、または反応しないように、ジアミンを選択しなければならない。２つのアミノ基のｐＫａが大幅に異なるため、後者は、多くの場合、約７．５のｐＨで、エチレンジアミンを使用することによって達成することができる。好ましくは、本アミド化は、疎水性ペンダント基の導入後、分離工程として実行する。カルボン酸基を有するペプチドまたは別の分子は、その後、この遊離アミンのアミド化により結合することができる。
【００７６】
したがって、飽和条件下でさえ、３つと多くの異なる標的部分を、πポリマーに結合させることができる（１つはチオールによって、１つはアミンまたはヒドロキシルによって、１つはカルボン酸基によって）。標的部分に加え、造影剤を本発明のポリマーに組み込むこともでき、それによって体内でのポリマーの分布の可視化が可能になる。198Ａｕ、32Ｐ、125Ｉ、131Ｉ、90Ｙ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、67Ｃｕ、211Ａｔ、213Ｂｉ、224Ａｃ等の放射線治療薬、およびカリケアマイシン、細菌内毒素、ゲロニン、アブリン、リシン等の細胞毒素は同様に、ポリマーに結合することができる。
【００７７】
ヒドロキシル基およびチオール基も、既知の方法（例えば、ミツノブ反応）によってアミンに変換、またはアジリジンもしくはハロアルキルアミン（ブロモエチルアミンもしくはクロロエチルアミン等）との反応によって１級アミンに変換することができる。システアミンによるアミド化によって、ジスルフィドを導入し、これは、ペプチドもしくは抗体のシステインによって直接反応して、ペプチドもしくは抗体に結合するか、あるいは、ペプチドもしくは抗体とのさらなる反応のために、例えば、アミノエタンチオールもしくはＤＴＴで最初に還元することができる。
【００７８】
部分的な反応を行うことによって、以下のものを含むが、これらに限定されない、追加の反応性官能基を、本発明のポリマーに導入することができる。（１）アクリル酸またはマレイン酸誘導体等のチオール反応基、（２）アミノまたはヒドロキシル等のカルボン酸反応基、（３）カルボキシル等のアミン反応基、および（４）メルカプト等のジスルフィド反応基。ポリマー分子あたりのこのような追加官能基数は、１／ｒから最大ｒの数倍であり得、使用した試薬および使用した量により異なる。
【００７９】
代替として、２つまたはそれ以上の特異的標的部分を、癌細胞表面への結合特異性を改善するように結合させることができる。２つまたはそれ以上の特異的部分はまた、異なる標的間の相互作用を生じさせるように使用することができ、例えば、ある部分は、ポリマーを癌細胞に標的化し、別の部分は、補体因子の結合、および補体経路の活性化を容易にし得る。
【００８０】
本発明のポリマーの繰り返し単位への標的部分の結合は、ポリマー鎖およびナノ粒子表面上の部分の多価提示をもたらす。多価提示は、多くの場合、標的への親和性の大幅な増加をもたらす。例えば、多価抗体は、正常の２価抗体よりも標的の除去により効果的である。炭水化物結合タンパク質および炭水化物は、本来は多価であり、１価である場合、効果がないことは既知である。同様に、多価ペプチドおよび炭水化物標的部分は、モノマー単独よりもさらにより効果的であろう。
【００８１】
本発明のポリマー鎖への、標的部分の結合のさらなる利点は、分子量の有意な増加であり、これは、ペプチドおよび他のリガンドの腎クリアランス率の低下をたらす。さらに、ＰＥＧ骨格は、免疫学的監視の回避等の、タンパク質ＰＥＧ化と同様の利点を与える。
【００８２】
本発明のくし型ポリマーは、水性溶媒系において、水溶性および難溶性抗癌薬を、封入するのに有用である。水性溶媒に物質を封入する方法は、該物質およびポリマーの水溶性複合体を形成するように、水の存在下で、薬物を、本発明のくし型ポリマーに接触させるステップを含む。代替として、封入するポリマーおよび物質は、２相の水溶性−有機エマルションにおいて組み合わせ、蒸発によって有機溶媒を除去することができる。例示的なプロセスは、米国特許第６，８３８，０８９号に説明され、参照することにより本明細書に組み込まれる。ほとんどの場合、ポリマーは、粒子のコアで癒合する疎水性Ｃ鎖間で溶解した薬物を有する、ミセル様ナノ粒子に自己集合し、一方Ａブロックは、界面自由エネルギーを有意に低下させ、粒子の水性懸濁液が安定なままであることを可能にする、親水性コロナを形成すると考えられる。
【００８３】
一部の例では、難溶性薬物は、コアで完全に溶解することができないが、粒子のコアで、Ｃ鎖で包囲および浮遊している固体ナノ粒子またはナノ結晶として存在し得る。本発明の実践は、Ｃ鎖と難溶性物質との混合のいかなる度合いにも依存しない。該薬物は、一部の例において、Ｃ鎖の分子レベルで溶解し得るが、他の例においては、Ｃ鎖環境からの相分離のいかなる度合いをも呈し得る。一部の例において、該系は、ｐＨ、温度、もしくはせん断率等の外部条件に応じて、ある状態から他へ移行することが予測できる。例えば、血流におけるせん断率は、極めて高いことが可能であるが、リンパ系においては一般的に低い。かかる環境誘発性の状態変化を用いて、粒子コアからの薬物放出を制御することができる。
【００８４】
疎水性Ｃ部分を修正することにより、ポリマー粒子の疎水性コアの溶媒力を修正することができる。好適な修正としては、疎水性コアの極性および／または分極率を増加させるための、ヒドロキシル、エーテル、アミド、スルホキシド等の、１つもしくは複数の双極性および／または親水性置換基、ならびにシアノ官能基の導入が挙げられるが、これに限定されない。
【００８５】
これらのポリマーによって、封入および送達することができる抗癌薬としては、ドキソルビシン、カンプトセシン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、イリノテカン、イマチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、アクシチニブ、パゾパニブ、エトポシド、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、クラドリビン、クラドリビン、スタウロスポリン、シタラビン、メルファラン、ロイロシン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＤ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、シスプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、レチノイン酸、コルヒチン、デキサメタゾン、およびタモキシフェン、ならびにこれらの薬物の誘導体および類似体、さらに光線力学的薬剤、核酸、核酸類似体、および核酸複合体が挙げられるが、これらに限定されない。核酸類似体としては、チオリン酸、ホスホロアミド酸、およびペプチド核酸等の種が挙げられる。核酸複合体は、オリゴ核酸のイオン複合体、または実質的に電荷中和量のカチオンまたはポリカチオン種を有するその類似体である。
【００８６】
本発明のポリマーの抗癌薬を封入する能力の結果、本発明はまた、医薬組成物も提供し、これは、治療有効量の１つもしくは複数の薬学的に活性な抗癌剤、および医薬として許容される担体または賦形剤と組み合わせて、本発明の１つもしくは複数のπポリマーを含む。好適な担体および賦形剤としては、水および生理食塩水、ならびに緩衝剤等の固体添加剤、塩、糖、セルロース等の多糖、およびその誘導体、ならびに当該技術分野で既知の種々の湿潤剤、滑剤、防腐剤、結合剤および分散剤が挙げられる。本発明のポリマーは、従来技術において、本来、無効量の抗癌剤であったものを、効果的なものにする。したがって、本開示の目的上、「治療有効量」は、組成物全体を効果的なものにする薬剤の量である。
【００８７】
本明細書に記載のすべての特許、特許出願、および出版物は、参照することにより本明細書にすべて組み込まれる。
【実施例】
【００８８】
１．一般手順
本発明はまた、本発明のくし型ポリマーの調製のためのプロセスを提供する。これらのポリマーの合成は、下に記載の手順に従い、有機合成に携わる当業者が、容易に実施する。主要な出発材料は、ポリエチレングリコールであり、好ましくは、これを使用前に乾燥および脱ガスする。これは、気泡の形成が停止するまで、高温で、融解したＰＥＧを真空下で撹拌することにより、便宜的に実施する。これは、ＰＥＧの質により異なるが、８〜１２時間かかる場合がある。乾燥した時点で、ＰＥＧは、アルゴン下で永久保存することができる。市販の工業および研究等級のＰＥＧを、本発明のポリマーの作製に用いることができる（例えば、１４３０〜１５７０の分子量分布を有する、商業用の多分散「ＰＥＧ １５００」）。かかる材料は、ビスフェノールＡジグリシジルエーテルを組み込んでいる場合があり、これは、ＰＥＧ鎖の中心で２級ヒドロキシル基を導入する。本発明のポリマーが最も再生可能で均一な品質を有することを確証するために、該ＰＥＧは、ビスフェノールＡを含まず、低分散性でないことが好ましい。Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（旧Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ ＡＬ， ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｕｒｅ ＡＳ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）から市販されるもの等の、＞９５％単分散のＰＥＧポリマーが最も好ましい。特に好ましいＰＥＧの例は、Ｐｏｌｙｐｕｒｅの「ＰＥＧ−２８」であり、これは、＞９５％ＨＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）2SＨ、分子量は１２５２である。
【００８９】
すべての反応は、磁気または好ましくは、機械的撹拌を使用し、窒素またはアルゴン等の不活性雰囲気下で実施する。
【００９０】
ステップＡにおいて、無水ＰＥＧを融解し、無水マレイン酸（ＰＥＧモルあたり２モル）を撹拌しながら添加する。無水マレイン酸の量は、ＰＥＧ末端のヒドロキシル基の数にできるだけ一致させるべきである。無水マレイン酸の不足は、ヒドロキシル末端ポリマー鎖をもたらす一方で、無水マレイン酸の過剰は、次のステップにおいてチオール基を消費し、早期の連鎖停止および末端カルボキシル基をもたらす。反応温度は臨界温度ではなく、該プロセスは、４５℃〜１００℃の温度で簡便に行うことができる。好ましい反応温度は、６５℃〜９０℃である。高温を用いる場合、無水マレイン酸は、昇華する傾向があり、諸ステップは、無水マレイン酸が溶液に残存していることを確認して行わなければならない。ヘッドスペースを最小化し、反応容器を油浴の反応槽に浸すことが、効果的な方法である。
【００９１】
選択した温度によっては、該反応は２時間以内に完了する、もしくは終夜実施することができる。該反応はシリカゲルプレート上のＴＬＣで監視することができ、該反応は、無水マレイン酸が消失した後まで継続する。視覚コントラスト、ＵＶ、およびヨード染色はすべて、該ＴＬＣプレートを試験するために使用することができる。
【００９２】
ステップＢにおいて、ステップＡで生成した粗ＰＥＧビス−マレイン酸塩エステルを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）（流動性に関して必要な場合は、水を添加）に合わせ、混合液を７０℃で撹拌する。該反応は、粘度の急増によって示されるように、３０分以内に完了する。ＤＴＴを最適量よりも多く、または少なく使用する場合、生成物の分子量は減少する。該生成物の分子量はまた、所望に応じて、ＴＥＭＥＤをＴＥＡなどの効果の弱い第３アミン塩基で置換することにより、減少させることができる。
【００９３】
ステップＣにおいて、十分な水を反応混合物に添加し、粘度を低下させ、ポリマー中にカルボキシル酸基の１モルあたり０．１モルのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１．０５モルのヘキサデシルアミンを添加する。（この量のＮＨＳは、副反応の範囲を最適に最小化すると考えられる。）次いで、過剰なＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）（カルボン酸基１モルあたり１．４モルのＥＤＣ）を少しずつ添加し、必要に応じて、追加の水を添加し、撹拌を維持する。該反応混合液のｐＨは、７以上、好ましくは、９〜１１に維持し、アルキルアミンンの反応性を最適化する。ドデシルアミンでは、この反応は、約４０〜４５℃で行うことができるが、オクタデシルアミンでは、温度は約５５℃〜５７℃である。該反応の後、一定レベルの残留アルキルアミンを認める（典型的には、終夜実行した後）まで、ＴＬＣを行う。
【００９４】
反応混合液を、ｐＨ約３．０から約４．５に酸性化し、室温で最大約２４時間撹拌して、未反応のＥＤＣを破壊し、その後、１Ｎ ＮａＯＨおよび／またはＴＥＭＥＤを使用して、ｐＨ７．０まで滴定する。該最終反応混合液を約８００ｘｇで１〜３時間、遠心分離機で分離し、固体混入物質および副生成物を除去する。
【００９５】
遠心分離後、上清は、ＧＰＣカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）、Ｂｉｏｇｅｌ（商標）等）でクロマトグラフィを行うことができる。πポリマーは両親媒性材料であるが、一部のＧＰＣカラム充填剤に親和性を呈し、これは、混入物質の除去を複雑にする。代替として、該ポリマーは、大孔疎水性相互作用カラム（例えば、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）Ｐｈｅｎｙｌ ６５Ｃ、Ｔｏｓｈｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）でクロマトグラフィを行い、水中のメタノールの勾配で溶出できる。好ましくは、酸性の水および中性の水を何回か交換することによって、該反応混合液を透析し、低分子量の出発材料および反応副生成物を除去する。
【００９６】
反応混合液はまた、ブタノン、イソプロパノール、ブタノールまたは他の極性有機溶媒で抽出し、有機不純物を除去することができるが、相当量の両親媒性高分子が、抽出溶媒に放出される。好ましくは、反応混合物は、限外濾過を行い、好適な細胞膜を使用して、使用する濾過膜の分画に応じて、５ｋＤａ〜１０ｋＤａ、１０ｋＤａ〜３０ｋＤａ、３０ｋＤａ〜５０ｋＤａ等の分子量に生成物を分画する。該ポリマーの水溶液は、濾過膜または培地の選択に応じて、滅菌溶液またはウイルス遊離溶液を生成するために全量濾過に供することができる。
【００９７】
２．πポリマーの合成
実施例１：ＰＥＧ−ジ（アルキルアミドスクシニル）ジチオエーテル中間分子量ポリマー（Ｃ１６−πポリマーＡ）
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−１５００、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を、気泡の形成が停止するまで、８０℃で真空下で乾燥させた（８〜１２時間、該ＰＥＧの質による）。乾燥させたＰＥＧは、アルゴン下で乾燥させ永久保存することができる。
【００９８】
乾燥させた該ＰＥＧを油浴でアルゴン下で融解し、無水マレイン酸（ＰＥＧ１モルあたり２モル、純度に対して補正）を撹拌しながら徐々に添加した。該混合液をアルゴン下で９０℃で撹拌した。無水マレイン酸は、昇華する傾向があるので、ヘッドスペースを最小化し、全反応容器を反応温度に維持した。容器壁上のいかなる濃縮した無水マレイン酸をも擦り取り、反応混合液に戻した。該反応の進行は、別々に溶媒として、エタノールおよびヘキサンを使用して、ＵＶ視覚化およびヨード染色を用いて、シリカゲルプレート上のＴＬＣで監視した。該反応を無水マレイン酸の消失後１時間継続した。
【００９９】
該粗ＰＥＧジマレイン酸エステルを２容積の水で希釈した。次いで、水（ＴＥＭＥＤの容積あたり２容積の水）中のジチオスレイトール（ＤＴＴ、当量のＰＥＧあたり１．０１当量）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−エチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ、１．０２当量）の溶液を、撹拌しながら反応混合液に添加した。該反応溶液を７０℃でアルゴン下で２．５時間撹拌し、終夜室温に放置し、その後、再び７０℃で２時間撹拌した。該反応溶液をＴＬＣで監視し、ＤＴＴが完全消失したら完了したと判断した。
【０１００】
該混合液を撹拌できるまで（約２５％の固体）、水を上記の反応混合液に添加し、粘度を減少させ、該混合液を６５℃でアルゴン下で撹拌し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ジマレイン酸ＰＥＧ−ＤＴＴポリマー中カルボン酸基１モルあたり０．１モル）を添加し、その後、ヘキサデシルアミン（ポリマー中カルボン酸基１モルあたり１．０５モル）およびＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ、ポリマー中カルボン酸基１モルあたり０．５６モル）を添加した。該混合液をアルゴン下で１時間撹拌し、ＥＤＣの第２の部分（ポリマー中カルボキシル酸基の１モルあたり０．５６モル）を添加した。１時間後、ＥＤＣの第３の部分（１モルのカルボキシル酸あたり総量の１．４モルのＥＤＣに対して、ポリマーにおいてカルボキシル酸基の１モルあたり０．２８モル）をさらに添加し、加水分解のＥＤＣの消失の原因となった。追加の固体により懸濁液を撹拌しづらくなる場合、必要に応じて追加の水を添加し、流動性を維持し、必要に応じて、１Ｎ ＮａＯＨまたは１Ｎ ＨＣｌを添加することによって、ｐＨを３．５〜７．５（好ましくは４．５〜６．５）に維持した。該混合液を６５℃でアルゴン下で終夜撹拌し、アルキルアミンが安定した濃度に到達したと考えられるまで、ＴＬＣ（シリカゲル、エタノールで展開）で監視し、その後、さらに４時間撹拌した（ドデシルアミンで、この反応を約４０〜４５℃で行なって、一方オクタデシルアミンで、温度は好ましくは５５〜５７℃であった。）次いで、該反応混合液を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ約４．０〜４．５に酸性化し、２４時間撹拌して、未反応のＥＤＣを破壊し、１Ｎ ＮａＯＨの滴下添加によって、ｐＨ７．０に調節した。
【０１０１】
該混合液を遠心瓶に移し、約８００ｘｇで２時間卓上遠心分離機で回転させ、残留固体を分離した。遠心分離後、該反応混合液をイソプロパノールで抽出し、有機不純物を除去した。イソプロパノール抽出の代替物としては限外濾過が好ましい。
【０１０２】
本方法により、以下のアミノ化合物をポリマーに共役する。
実施例１ａ：ウンデシルアミン
実施例１ｂ：オクタデシルアミン
実施例１ｃ：４−ノニルベンジルアミン
実施例１ｄ：３−［（４−フェノキシ）フェニル］プロピルアミン
【０１０３】
実施例１ｅ：ＰＥＧ−ジ（アルキルアミドスクシニル）ジチオエーテル（スキーム９代替経路によるＣ１６−π−ポリマーＡ）
実施例１に説明するとおり、ＰＥＧ（１．５ｋＤ、上記に説明するとおり脱ガスおよび乾燥）を、過剰な無水マレイン酸（ＰＥＧ１モルあたり２．２モル当量超）と、溶融条件下で反応させ、反応生成物を水に溶解し、１ｋＤ分画膜を使用して、水に対して透析した。残留物をほぼ乾燥するまで蒸発させて、アミド化に好適なジマレイン酸ＰＥＧを得た。
【０１０４】
最小容積の水（ジマレイン酸ＰＥＧ２部あたり水約１部）に溶解したジマレイン酸ＰＥＧを、反応瓶中、アルゴン下で７０〜８０℃に加熱した。ｐＨはＴＥＭＥＤで５．０〜５．５に調節した。この溶液に、７０〜８０℃の、ジマレイン酸ＰＥＧ繰り返し単位のモルあたり、２モル当量のヘキサデシルアミンを添加した。次いで、最小容積の水中、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ジマレイン酸ＰＥＧ１モルあたり２モル当量）の溶液を添加し、その後、ゆっくりとＥＤＣ−ＨＣｌ（ジマレイン酸ＰＥＧ１モルあたり３モル当量）の水溶液を添加した。ＴＬＣ（シリカゲル、展開用にＥｔＯＨ）が反応の完了を示すまで（ヘキサデシルアミンのスポットが無変化または存在しない）、該混合液を７０〜８０℃で撹拌した。該反応混合液を冷却し、過剰なカルボジイミドを、ｐＨが２．５〜３．０で安定するまで、酢酸を添加することによって、破壊した。生成物を、最初に水性ＥｔＯＨ、次に水に対して、透析すること、あるいは、イソプロパノールで沈殿することによって精製した。
【０１０５】
このように形成されたＰＥＧジアミドを水に溶解し、該反応混合液のｐＨをＴＥＭＥＤで６．５〜９に調節し、温度を６０〜７０℃に上げた。ＤＴＴ（ＰＥＧジアミド１モルあたり１．２モル当量）の溶液を添加し、該反応混合液を終夜撹拌した。過剰なチオールを、化学量論的当量のクロロアセトアミドおよびＴＥＭＥＤで反応停止し、負のエルマン試験を行った。次いで、該生成物を水に対して透析することによって精製し、残留物を蒸発することによって濃縮した。
【０１０６】
実施例２；ＰＥＧ−ジ（アルキルアミドスクシニル）ジチオエーテル高分子量ポリマー
無水マレイン酸１モルのあたり０．５５モルのＤＴＴおよび０．５５モルのＴＥＭＥＤを使用したことを除いては、実施例１に概略した手順に従った。粘度が急速に増加する場合、激しい撹拌が必要であった。反応のほとんどは、５〜１０分内に完了し、その後、温度が５５℃から８０℃に上昇するにつれて、次の４時間でゆっくりと完了するようであった。
【０１０７】
実施例３：ＰＥＧ−ジ（アルキルアミドスクシニル）ジチオエーテルポリマー
ポリマー中、カルボキシル酸基１モルあたり１．５モルのドデシルアミンを使用することを除いては、実施例１に概略した手順に従った。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、カルボン酸基１モルあたり１．０モル）および１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、カルボン酸基１モルあたり３．０モル）を添加し、反応物を８０℃で４時間撹拌し、上記のとおり調製した。
【０１０８】
本方法により、以下のアミノ化合物をポリマーに共役する。
実施例３ａ：ウンデシルアミン
実施例３ｂ：テトラデシルアミン
実施例３ｃ：オクタデシルアミン
実施例３ｄ：デヒドロアビエチルアミン
実施例３ｅ：コレステロール２−アミノエチルエーテル
実施例３ｆ：１０−フェノキシデシルアミン
実施例３ｇ：セバシン酸ヒドラジド
実施例３ｈ：オレイン酸ヒドラジド
実施例３ｉ：デヒドロアビエチン酸ヒドラジド
実施例３ｊ：コール酸ヒドラジド
実施例３ｋ：パルミチン酸ヒドラジド
【０１０９】
実施例４：ＰＥＧ−コ−（アルキルコハク酸アミド）ポリマー
無水ジエチルエーテル（１０ｍｌ）中、ＰＥＧ（６．６６ミリモル）およびトリエチルアミン（２．３２ｍｌ、１６．６５ミリモル）の溶液をアルゴン下で０℃に冷却し、塩化メタンスルホニル（１．０３ｍｌ、１３．３２ミリモル）で滴下処理した。撹拌は、０℃で１時間、次いで室温で２時間継続する。エーテルを蒸発させ、無水アセトン（１５ｍｌ）を残渣に添加し、トリエチルアミン塩酸塩を沈殿させ、これを溶液から濾過する。濾液を臭化リチウム（２．３１ｇ、２６．６４ミリモル）で処理し、加熱して、２０時間還流させた。次いで、該混合液をヘキサンで希釈し、Ｃｅｌｉｔｅ（商標）（０．５ｃｍ）で被覆したシリカのショートカラム（３ｃｍ）で濾過し、ヘキサンで溶出する。該濾液を乾燥させ、濾過し、蒸発させて、油としてα，ω−ジブロモ−ＰＥＧを得た。
【０１１０】
α，ω−ジブロモ−ＰＥＧを、Ｇｏｄｊｏｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３７：４３３−６（１９９６）の方法によって、１当量の２，２−ジブチル−４，５−ビス（メトキシカルボニル）−ｌ，３，２−ジオキサスタンノランと反応させる。得られる酒石酸ジメチル−ＰＥＧポリエーテルをメタノールのＫＯＨで鹸化し、その後、上記の実施例１および３に記載のとおり、ドデシルアミンまたはヘキサデシルアミン、または実施例３ａ〜３ｋのアミンでアミド化する。
【０１１１】
実施例５：ＥＤＴＡ二無水物とのＰＥＧ共重合
実施例１に説明する方法で、無水ＰＥＧをエチレンジアミンテトラ酢酸二無水物と反応させ、その後、実施例１に説明するドデシルアミンと、または実施例３に説明するヘキサデシルと、または実施例３ａ〜３ｋに説明するアミンでアミド化する。
【０１１２】
同様に、以下の二無水物をＰＥＧと共重合させ、その後アミド化する。
実施例５ａ：ナフタレンテトラカルボン二無水物
実施例５ｂ：ペリレンテトラカルボン二無水物
実施例５ｃ：ベンゾフェノンテトラカルボン二無水物
実施例５ｄ：４，４’−（ヘクサフルオロイソプロピリジン）ジフタル酸無水物
実施例５ｅ：ブタンテトラカルボン酸二無水物
実施例５ｆ：ビシクロ（２，２，２）オクト−７−エン−２，３，５，６−テトラカルボン二無水物
実施例５ｇ：ジエチレンテトラミンペンタ酢酸二無水物
実施例５ｈ：３，４，３’，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボン酸二無水物
実施例５ｉ：３，４，３’，４−ジフェニルエーテルテトラカルボン酸二無水物
実施例５ｊ：ピロメリト酸二無水物
【０１１３】
実施例６Ａ：ペンダントチオエーテルとのＰＥＧ−ジアミンコポリマー
実施例１のとおりに調製したＰＥＧジマレイン酸エステルを実施例１のＤＴＴに使用した同様の手順を使用して、ドデカンチオール（ＰＥＧジマレイン酸エステル１当量あたり２当量）と反応させる。ＴＥＭＥＤ触媒を添加してから、チオールを添加する。ＴＬＣを使用して、出発材料の消失後、反応を行う。蒸発によるアルキルチオールの損失が著しくなるポイントまでの温度を用いることができる（最大約１００℃）。わずかな過剰アルキルチオールを、マレイン基を完全に飽和するために使用してもよい。臭気またはＴＬＣで何も検出されなくなるまで、過剰なアルキルチオールを窒素またはアルゴンで散布および／または真空下で加熱することにより、反応終了時に除去する。
【０１１４】
本方法により、以下のチオールをＰＥＧジマレイン酸エステルに共役することができる。
実施例６Ａａ：メルカプトコハク酸ジ−ｔ−ブチルエステル
実施例６Ａｂ：テトラデカンチオール
実施例６Ａｃ：ヘクサデカンチオール
実施例６Ａｄ：２−メルカプトエタンスルホン酸
実施例６Ａｅ：３−メルカプトプロパンスルホン酸
実施例６Ａｆ：６−メルカプトヘキサン酸ｔ−ブチルエステル
実施例６Ａｇ：４−メルカプト安息香酸ｔ−ブチルエステル
実施例６Ａｈ：メルカプト酢酸ｔ−ブチルエステル
実施例６Ａｉ：４−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブタンチオール
実施例６Ａｊ：３−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ベンジルメルカプタン
実施例６Ａｋ：４−デシルベンジルメルカプタン
【０１１５】
反応官能基を有するチオールは、Ｃ鎖の結合に好適である、および／または反応官能基は、標的部分に対する結合点（Ｘ）としての役割を果たすことができる。
【０１１６】
実施例６Ｂ：ペンダントチオエーテルとのＰＥＧ−ジアミンコポリマー
【０１１７】
【化１６】
【０１１８】
実施例６Ａで得られたチオール付加物を、実施例１のドデシルアミンに使用した同一の手順を使用して、１，４−ジアミノブタン（２つのＣＯＯＨ基あたり１当量のジアミン）でアミド化し、反応混合液の流動性の維持に必要な場合、水によって希釈する。ＥＤＣの追加の一定分量を必要に応じて添加し、完全重合を確保する。本方法により、実施例６Ａおよび６Ａａ〜６Ａｋのチオール付加物をＰＥＧ−ジアミノブタンポリアミドに変換する。
【０１１９】
本方法により、以下のジアミンを、ＰＥＧポリアミドに変換することができる（ＢＯＣ＝ｔ−ブトキシカルボニル）。
実施例６Ｂａ：２−（Ｏ−ＢＯＣ）−１，３−ジアミノ−２−プロパノール
実施例６Ｂｂ：Ｎ’，Ｎ’’−ジ（ＢＯＣ）ヘクサエチレンテトラアミン
実施例６Ｂｃ：Ｎ’，Ｎ’’−ジ（ＢＯＣ）スペルミン
実施例６Ｂｄ：Ｎ’−ＢＯＣスペルミジン
実施例６Ｂｅ：Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−トリ（ＢＯＣ）ペンタエチレンヘキサミン
実施例６Ｂｆ：アグマチン
実施例６Ｂｇ：リシンｔ−ブチルエステル
実施例６Ｂｈ：１，６−ジアミノヘキサン
実施例６Ｂｉ：１，４−フェニレンジアミン
実施例６Ｂｊ：１，３−フェニレンジアミン
実施例６Ｂｋ：１，４−ジアミノブタン−２，３−ジオールアセトニド
【０１２０】
実施例７：ＰＥＧ−ジ（アルキルコハク酸）ジチオエーテル
【０１２１】
【化１７】
【０１２２】
ＤＴＴの２，３−ビス−Ｏ−ヘキサデシルエーテル（メソ−２，３−ビス（ヘキサデシルオキシ）ブタン−１，４−ジチオール）を、Ｓ．Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３３（１０）：４２４７−４２６６（１９８５）の手順を修正して調製する。これを実施例１の方法によってジマレイン酸ＰＥＧに添加する。
【０１２３】
本方法により、以下のエーテルジチオールをＰＥＧポリマーに共役する。
実施例７ａ：メソ−２，３−ビス（ｎ−ブトキシ）ブタン−１，４−ジチオール
実施例７ｂ：メソ−２，３−ビス（４−ノニルフェニルメトキシ）ブタン−１，４−ジチオール
実施例７ｃ：メソ−２，３−ビス（ビフェニル−４−メトキシ）ブタン−１，４−ジチオール
実施例７ｄ：４，６−ビス（デシルオキシ）ベンゼン−１，３−ジメタンチオール
実施例７ｅ：４，５−ビス（デシルオキシ）ベンゼン−１，２−ジメタンチオール
実施例７ｆ：３，４−ビス（デシルオキシ）チオフェン−２，５−ジメタンチオール
【０１２４】
実施例８Ａ：置換コハク酸ＰＥＧ
２−ドデセン−１−イル無水コハク酸を無水マレイン酸の代わりに使用することを除いては、実施例１の方法に従う。ドデセニル置換基は、最終ポリマーにおいてペンダントＣ鎖を提供する。
【０１２５】
本方法により、以下の置換無水コハク酸をＰＥＧでエステル化する。
実施例８Ａａ：無水イソブテニルコハク酸
実施例８Ａｂ：２−オクテン−ｌ−イル無水コハク酸
実施例８Ａｃ：無水オクタデセニルコハク酸
実施例８Ａｄ：３−オキサビシクロ−ヘキサン−２，４−ジオン
実施例８Ａｅ：無水シクロヘキサンジカルボン酸
実施例８Ａｆ：無水フタル酸
実施例８Ａｇ：４−デシル無水フタル酸
実施例８Ａｈ：ヘクサヒドロメチル無水フタル酸
実施例８Ａｉ：テトラヒドロ無水フタル酸
実施例８Ａｊ：無水ノルボルネンジカルボン酸
実施例８Ａｋ：カンタリジン
実施例８Ａｌ：無水ビシクロオクテンジカルボン酸
実施例８Ａｍ：エキソ−３，６−エポキシ−１，２，３，６−無水テトラヒドロフタル酸
実施例８Ａｎ：Ｓ−無水アセチルメルカプトコハク酸
【０１２６】
実施例８Ｂ：ペンダントアルキル基を有するＰＥＧ−ジ（アルキルアミドスクシニル）ジチオエーテル
実施例１の方法により、実施例８Ａおよび８Ａａ〜８Ａｎに説明するとおり得た置換コハク酸ＰＥＧをＤＴＴと反応させる。
【０１２７】
本方法により、以下のジチオールを実施例８Ａおよび８Ａａから８Ａｎに説明するとおりに得た置換ＰＥＧコハク酸エステルのいずれかと反応させる。
実施例８Ｂａ：エタン−１，２−ジチオール
実施例８Ｂｂ：プロパン−１，３−ジチオール
実施例８Ｂｃ：ブタン−１，４−ジチオール
実施例８Ｂｄ：ペンタン−１，５−ジチオール
実施例８Ｂｅ：ヘキサン−１，６−ジチオール
実施例８Ｂｆ：１，４−ベンゼンジチオール
実施例８Ｂｇ：１，３−ベンゼンジチオール
実施例８Ｂｈ：１，４−ベンゼンジメタンチオール
実施例８Ｂｉ：１，３−ベンゼンジメタンチオール
実施例８Ｂｊ：１，２−ベンゼンジメタンチオール
【０１２８】
実施例８Ｃ：ペンダントアルキル基を有するＰＥＧ−ジアミンコポリマー
実施例６Ｂの方法により、実施例８Ａに説明するとおり得た置換コハク酸ＰＥＧを、１，４−ジアミノブタンで共重合する。
【０１２９】
本方法により、以下のジアミンを実施例８Ａおよび８Ａａから８Ａｎのうちの置換ＰＥＧコハク酸エステルのいずれかと共重合させる。
実施例８Ｃａ：２Ｏ−ＢＯＣ１，３−ジアミノ−２−プロパノール
実施例８Ｃｂ：Ｎ’，Ｎ’’−ジ（ＢＯＣ）ヘクサエチレンテトラアミン
実施例８Ｃｃ：Ｎ’，Ｎ’’−ジ（ＢＯＣ）スペルミン
実施例８Ｃｄ：Ｎ’−ＢＯＣスペルミジン
実施例８Ｃｅ：Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−トリ（ＢＯＣ）ペンタエチレンヘキサミン
実施例８Ｃｆ：アグマチン
実施例８Ｃｇ：リシンｔ−ブチルエステル
実施例８Ｃｈ：１，６−ジアミノヘキサン
実施例８Ｃｉ：１，４−フェニレンジアミン
実施例８Ｃｊ：１，３−フェニレンジアミン
実施例８Ｃｋ：１，４−ジアミノブタン−２，３−ジオールアセトニド
【０１３０】
実施例９：置換酸を使用したＰＥＧ Ｔｒａｎｓ−エステル化
ＰＥＧジトシレート：１モルのＰＥＧ（ＤＭＦに溶解またはそのまま融解）に、アルゴン下で撹拌しながら、２．１モルの塩化トシル（５％モル過剰）を添加した。この反応混合物に、２．２モルのテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を添加した。次いで、反応物を４５℃で２時間インキュベートした。ＴＬＣを使用して、ＴＬＣ溶媒として、エチルアセテート、トルエン、またはエタノールを用いて、生成物を分離した。ＰＥＧトシル酸をトルエンとの反応混合液から抽出することができる。トルンスルホニルクロリドの代わりに、メシルクロリド（実施例４を参照）、トリフリック酸無水物、またはトレシルクロリドなどの他のスルホニル剤をまた使用することもできる（米国特許出願第１０／３９７３３２号、米国特許第２００４０００６０５１号を参照）。
【０１３１】
ＰＥＧジトシレートのポリエステル化：１モルの融解ＰＥＧ−ジトシレートに、アルゴン下で撹拌しながら、１モルのＳ，Ｓ’−ジデシル−メソ−２，３−ジメルカプトコハク酸、および２モルのＴＥＭＥＤを添加する。流動性を維持する必要がある場合、ＤＭＦを添加する。反応混合液を８０℃に加熱し、２４時間、またはＴＬＣにより反応が完了するまで、撹拌する。
【０１３２】
実施例１０：ＰＥＧ−ジ（スクシニル）−ジ−（Ｏ−アシル化）チオエーテル中分子量ポリマー（Ｃ１６−πポリマーＢ）
【０１３３】
【化１８】
【０１３４】
実施例１のとおりに調製したジマレイン酸ＰＥＧ（１０．２４ｇ、６．１ミリモル）を、乾燥した１２５ｍｌフラスコに入れ、アルゴン下で７０℃に加熱し、ジマレイン酸ＰＥＧを融解した。この融解した材料に、撹拌しながら、水（１０ｍＬ）、ならびに水（３ｍＬ）中ＤＴＴ（０．９６１ｇ、６．１６８ミリモル）およびＴＥＭＥＤ（０．７２３ｇ、６．１６６ミリモル）の溶液を添加した。この溶液を７０℃で約４時間撹拌した。真空下で水を除去することにより、収率約９０％で固体ポリマーを得た。
【０１３５】
乾燥させたポリマー（５ｇ、２．７ミリモル）を７０〜９０℃にアルゴン下で加熱し、融解して、ＴＥＭＥＤ（０．６３５ｇ、５．５ミリモル）を添加した。塩化パルミトイル（１．６８９ｇ、５．５ミリモル）を撹拌しながら添加し、混合液をアルゴン下で終夜撹拌した。（塩化アシルに対するポリマーの比率は、０〜１００％の化学量の置換度を得るように変化し得る。）水を反応混合液に添加し、「Ｃ１６−πポリマーＢ」を単離した。
【０１３６】
本方法により、以下の酸を、ジ（スクシニル）ＰＥＧ−ＤＴＴコポリマーのヒドロキシル基でエステル化する。
実施例１０ａ：オレイン酸
実施例１０ｂ：コハク酸コレステリル
実施例１０ｃ：ビフェニル−４−カルボン酸
実施例１０ｄ：４−オクチルフェニル酢酸
実施例１０ｅ：ヘクサデス−６−イン酸
【０１３７】
酸ハロゲン化物の使用の代替として、πポリマーのＤＴＴ由来ヒドロキシル基を、１，３−ビス（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イルメチル）カルボジイミド（ＢＤＤＣ）で活性化し、カルボン酸と直接結合させることできる。Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｅｄ．Ｄａｖｉｄ Ｃｒｉｃｈ，Ｗｉｌｅｙ，２００５ ｐ１０７−１０８、およびその中の参考文献を参照されたい。）。
【０１３８】
実施例１１：Ｃ１６−πポリマーＡのカルボキシル置換エステル
カルボン酸置換ポリマーは、標準的なペプチド結合形成方法（例えば、カルボジイミド試薬により）を使用して、反応アミノ基を有するリガンドに結合し、アミノ基をポリマーのカルボン酸官能基に結合させるために使用する。これらの材料は、環状無水物によるπポリマーヒドロキシル基のエステル化により用意に得られる。例えば、ジマレイン酸Ｃ１６−πポリマーＡは、以下のとおりに、無水マレイン酸をＣ１６−πポリマーＡヒドロキシル基と反応させることにより調製した。
【０１３９】
Ｃ１６−πポリマーＡ（２ｇ）および無水マレイン酸（０．８５ｇ）を乾燥乳鉢ですりつぶし、５０ｍＬ丸底フラスコに移した。該フラスコを、９０℃でアルゴン下で２〜３時間、撹拌しながら加熱した。その後、固体反応混合物を細かくし、水でスラリにし、混合物を透析袋（３．５ｋＤａ分画）に移した。混合物を水に対して透析して、過剰なマレイン酸および低分子量の副生成物を除去し、残留物を透析袋から除去し、６０℃で一定量になるまで乾燥して、ジマレイン酸Ｃ１６−πポリマーＡ（１．７９ｇ）を得た。ポリマーと無水マレイン酸の割合は、０〜１００％の完全化学量のエステル化の置換を得るために変更することが可能である。
【０１４０】
実施例１１ａ：Ｃ１６−πポリマーＡジグリコール塩酸
Ｃ１６−πポリマーＡ（２ｇ）および無水ジグリコール酸（１．０ｇ）を上記実施例１１の方法によって反応させ、Ｃ１６−πポリマーＡジグリコール塩酸を得た。無水マレイン酸と同様に、ポリマーＡと無水物の比率は、０〜１００％の完全化学量のエステル化の置換を得るように変化させることができる。
【０１４１】
実施例１１ｂ：Ｃ１６−π−ポリマーＡビス（アコニット酸）
Ｃ１６−πポリマーＡ（２ｇ）および無水アコニット酸（１．３５ｇ）を、上記実施例１１の方法によって反応させ、Ｃ１６−πポリマーＡビス（アコニット酸）を得た。
【０１４２】
同様に、以下の無水物をＣ１６−πポリマーＡに結合させる。低可溶性の無水物を使用する際、ｐＨは精製の補助として、透析の前に４．５〜６．５に調節することができる。０．１Ｎ ＨＣｌに対する第２の透析により、所望に応じて、ポリマーの酸形態が生成する。
実施例１１ｃ：無水コハク酸
実施例１１ｄ：無水グルタル酸
実施例１１ｅ：無水フタル酸
【０１４３】
無水マレイン酸またはｃｉｓ−無水アコニット酸とのエステル化により導入した反応二重結合はまた、以下の実施例１２に説明するとおり、チオール含有リガンドをポリマーに添加するために使用することができる。
【０１４４】
実施例１２：ジマレイン酸Ｃ１６−πポリマーＡのシステイン付加物：
粉末化したジマレイン酸Ｃ１６−πポリマーＡ（実施例１１）（２５３ｍｇ）を水（５ｍＬ）に添加し、混合液を激しく撹拌した。システイン（２４ｍｇ）およびＴＥＭＥＤ（３０．５ｕｌ）を反応混合液に添加し、該混合液を室温でアルゴン雰囲気下で撹拌した。ニンヒドリンによる検出とともに、該反応の進行をＴＬＣ（シリカゲルプレート、ｎ−ブタノール−酢酸−水、３：１：１）で監視した。該反応混合液は、ポリマーとともに移動するニンヒドリン陽性スポットを示した。システインはまた、ニンヒドリン陽性スポットを示したが、出発ポリマーは、ニンヒドリンでいずれの色も示さなかった。
【０１４５】
上記に説明する方法は、多重カルボキシル置換基を有するチオールを使用して、結合点としての使用のために、追加のカルボキシル基を導入するために使用した。例えば、メルカプトコハク酸を以下のＣ１６−πポリマーＡジエステルに添加した。
実施例１２ａ：ジマレイン酸Ｃ１６−πポリマーＡ
実施例１２ｂ：ジアクリル酸Ｃ１６−πポリマーＡ
実施例１２ｃ：アコニット酸Ｃ１６−πポリマーＡ（ビス）
【０１４６】
【化１９】
【０１４７】
実施例１２ｃ
同様に、３−メルカプトグルタル酸を以下のＣ１６−πポリマーＡジエステルに添加した。
実施例１２ｄ：ジマレイン酸Ｃ１６−πポリマーＡ
実施例１２ｅ：ジアクリル酸Ｃ１６−πポリマーＡ
実施例１２ｆ：アコニット酸Ｃ１６−πポリマーＡ（ビス）
【０１４８】
３．πポリマーへの標的部分の結合
実施例１：Ｃ１６−πポリマーＡへの葉酸の結合
葉酸（２ミリモル）を無水ＤＭＳＯ中で溶解し、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）と大気温度で反応させ、内部無水物を形成させた。次いで、この反応混合液に、等モル量のシステアミンＨＣｌおよびＴＥＭＥＤを添加し、ＴＬＣによって反応を監視しながら、反応混合液を大気温度で２４時間、アルゴン下で撹拌した。反応が完了した後、反応混合液を真空下で濾過し、反応副生成物を除去した。濾液をメタノールで希釈して、橙黄色の生成物を沈殿させた。沈殿物をメタノールでスラリにし、濾過して、残留するジシクロヘキシル尿素およびＤＭＳＯを除去した。葉酸−システアミン共役体（Ｓ．Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（３０）：２７９３０−２７９３５）に、Ｅｌｌｍａｎ試薬を用いた試験を行なった結果、遊離スルフヒドリル基の存在は陽性と出、ＴＬＣはシステアミンの存在を示さなかった。
【０１４９】
次いで、該葉酸−システアミン共役体を、アルゴン下で、Ｃ１６−πポリマーＡのジマレイン酸エステル（実施例１１、分子量約１５００を有するＰＥＧより調製）と反応させた。ポリマー凝集体の親水性を維持するために、５０％の利用可能なマレイン酸塩基のみを消費するのに十分な葉酸−システアミン共役体の量を、ポリマーに添加した。反応混合液のｐＨを、ＴＥＭＥＤで６．５〜７．５に調節し、該混合液をアルゴン雰囲気下で終夜撹拌した。次いで、該反応混合液を３．５ｋＤ分画膜で水に対して透析し、いかなる低分子量の副生成物および不純物をも除去した。保持液を除去し、以下に説明する薬物封入および細胞培養アッセイのために使用した。
【０１５０】
実施例２：Ｃ１６−πポリマーＡへの上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）の結合
上皮細胞増殖因子（Ｓｉｇｍａ）を、ｐＨ７．４のＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液中２当量の２−イミノチオラン（Ｓｉｇｍａ）でチオール化し、チオール化ＥＧＦを、実施例１に説明する方法によって、Ｃｌ６−πポリマーＡのジマレイン酸エステルに結合させた。該ＥＧＦ共役ポリマーを限外濾過によって濾過し、ＰＢＳで洗浄し、保持液を使用して、標的封入ポリマーを調製した。
【０１５１】
実施例３：Ｃ１６−πポリマーＡへの抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体の結合
腹水としてマウス抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を、製造元の指示により、ＡｆｆｉｎｉｔｙＰａｋ（商標）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｐｉｅｒｃｅ）カラムで、クロマトグラフィにより精製した。精製した抗体をチオール化し、実施例１に説明する方法によって、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液でＣ１６−πポリマーＡのジマレイン酸エステルに共役し、限外濾過によって濾過した。
【０１５２】
４．抗癌化合物の封入
実施例１：Ｃ１６−π−ポリマーＡへのカンプトセシンの封入：
カンプトセシン（１０ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）をＤＭＳＯ中で溶解し、ＤＭＳＯ中Ｃ１６−πポリマーＡ（１００ｍｇ、ＰＥＧ １．５ｋＤから派生）の溶液と混合した。ゲル状混合液を約１０〜３０分間超音波分解し、水で希釈し、遠心分離して、いかなる固体をも除去した。封入したカンプトセシンの存在について、透明な上清をＴＬＣで調べた結果陽性と出た。
【０１５３】
実施例２：Ｃ１６−πポリマーＡへのドキソルビシンの封入：
ドキソルビシンＨＣｌ（５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）を水で溶解し、当量のＴＥＭＥＤで処理して、塩酸塩を遊離アミン形態に変換した。次いで、得られた遊離アミン形態に、ＤＭＳＯ中Ｃ１６−πポリマーＡ（１００ｍｇ、ＰＥＧ １．５ｋＤ由来）の溶液を添加し、上記実施例１に説明するとおり、混合物を処理および試験した。
【０１５４】
実施例３：葉酸共役Ｃ１６−πポリマーＡへのカンプトセシンの封入：
ＤＭＳＯに溶解して、上記で合成した、葉酸πポリマーＡ共役体に、ＤＭＳＯ中のカンプトセシンの溶液を添加した。カンプトセシンとポリマーの重量で１：１０の比率をこの調製で使用した。得た混合物を上記実施例１のとおりに処理し、カンプトセシン封入についてアッセイは陽性と出た。
【０１５５】
実施例４：ＥＧＦ共役Ｃ１６−πポリマーＡへのカンプトセシンの封入：
上記実施例１および３に説明するものと同様に、ＥＧＦ共役Ｃ１６−πポリマーＡを使用して、カンプトセシンを封入した。
【０１５６】
実施例５：抗ＥＧＦＲ共役Ｃ１６−πポリマーＡへのカンプトセシンの封入：
上記実施例１および３に説明するものと同様に、マウス抗ＥＧＦＲ抗体に共役させたＣ１６−πポリマーＡを使用して、カンプトセシンを封入した。
【０１５７】
５．細胞増殖アッセイ
腫瘍細胞増殖アッセイで評価する前に、上記で調製した実施例を、以下に記載の組成物を有する初期濃度まで希釈した。
【０１５８】
ＣＰＴ＋πＰ
組成物： πポリマーと複合体を形成したカンプトセシン
繰り返し単位ｍｗ： ２２７８
リガンド： −
リガンドｍｗ： −
封入した薬物： カンプトセシン
薬物ｍｗ： ３４８
ポリマー濃度： ０．０３５ｍｇ／ｍｌ
繰り返し単位内１５．４μＭ
リガンド濃度： −
−
薬物濃度： ３．４８ｍｇ／ｍｌ
１０．０μＭ
【０１５９】
ＣＰＴ
組成物： カンプトセシン（対照）
繰り返し単位ｍｗ： −
リガンド： −
リガンドｍｗ： −
封入した薬物： カンプトセシン
薬物ｍｗ： ３４８
ポリマー濃度： −
リガンド濃度： −
薬物濃度： ３．４８μｇ／ｍｌ
１０．０μＭ
【０１６０】
ＤＯＸ＋πＰ
組成物： πポリマーと複合体を形成したドキソルビシン
繰り返し単位ｍｗ： ２２７８
リガンド： −
リガンドｍｗ： −
封入した薬物： ドキソルビシン
薬物ｍｗ： ５４４
ポリマー濃度： ０．０５４ｍｇ／ｍｌ
繰り返し単位中２３．７μｍ
リガンド濃度： −
−
薬物濃度： ５．４４μｇ／ｍｌ
１０．０μＭ
【０１６１】
ＤＯＸ
組成物： ドキソルビシン（対照）
繰り返し単位ｍｗ： −
リガンド： −
リガンドｍｗ： −
封入した薬物： ドキソルビシン
薬物ｍｗ： ５４４
ポリマー濃度： −
リガンド濃度： −
−
薬物濃度： ５．４４μｇ／ｍｌ
１０．０μＭ
【０１６２】
πＰ
組成物： πポリマー（対照）
繰り返し単位ｍｗ： ２２７８
リガンド： −
リガンドｍｗ： −
封入した薬物： −
薬物ｍｗ： −
ポリマー濃度： ０．０３５ｍｇ／ｍｌ
繰り返し単位中１５．４μｍ
リガンド濃度： −
−
薬物濃度： −
−
【０１６３】
ＣＰＴ＋ＦＡ−πＰ
組成物： 葉酸共役πポリマーと複合体を形成したカンプトセシン
繰り返し単位ｍｗ： ５３３８
リガンド： 葉酸
リガンドｍｗ： ４４１
封入した薬物： カンプトセシン
薬物ｍｗ： ３４８
ポリマー濃度： ０．０３１ｍｇ／ｍｌ
繰り返し単位中５．８１μＭ
リガンド濃度： ２．５６μｇ／ｍｌ
５．８１μＭ
薬物濃度： ３．４８μｇ／ｍｌ
１０．０μＭ
【０１６４】
ＦＡ−πＰ
組成物： 葉酸共役πポリマー（対照）
繰り返し単位ｍｗ： ５３３８
リガンド： 葉酸
リガンドｍｗ： ４４１
封入した薬物： −
薬物ｍｗ： −
ポリマー濃度： ０．０３１ｍｇ／ｍｌ
繰り返し単位中５．８１μｍ
リガンド濃度： ２．５６μｇ／ｍｌ
５．８１μＭ
薬物濃度： −
【０１６５】
ＦＡ
組成物： 葉酸（対照）
繰り返し単位ｍｗ： −
リガンド： 葉酸
リガンドｍｗ： ４４１
封入した薬物： −
薬物ｍｗ： −
ポリマー濃度： −
−
リガンド濃度： ４．４１μｇ／ｍｌ
１０．０μＭ
薬物濃度： −
−
【０１６６】
ＣＰＴ＋ＥＧＦ−πＰ
組成物： ＥＧＦ共役πポリマーと複合体を形成したカンプトセシン
繰り返し単位ｍｗ： ５３３８
リガンド： ＥＧＦ
リガンドｍｗ： ６０５２
封入した薬物： カンプトセシン
薬物ｍｗ： ３４８
ポリマー濃度： ０．０８６８ｍｇ／ｍｌ
繰り返し単位中１６．３μｍ
リガンド濃度： ９１０μｇ／ｍｌ
１５０μＭ
薬物濃度：９．０５μｇ／ｍｌ
２６．０μＭ
【０１６７】
ＥＧＦＲ Ａｂ−πＰ
組成物： 抗ＥＧＦＲ抗体共役πポリマー（対照）
繰り返し単位ｍｗ： ５３３８
リガンド： 抗ＥＧＦＲ抗体
リガンドｍｗ： １５０，０００
封入した薬物： −
薬物ｍｗ： −
ポリマー濃度： ０．１０６ｍｇ／ｍｌ
繰り返し単位中１９．９μｍ
リガンド濃度： ３，０００μｇ／ｍｌ
２０．０μＭ
薬物濃度： −
−
【０１６８】
ＣＰＴ＋ＥＧＦＲ Ａｂ−πＰ
組成物： 抗ＥＧＦＲ抗体共役πポリマーと複合体を形成したカンプトセシン
繰り返し単位ｍｗ： ５３３８
リガンド： 抗ＥＧＦＲ抗体
リガンドｍｗ： １５０，０００
封入した薬物： カンプトセシン
薬物ｍｗ： ３４８
ポリマー濃度： ０．１０６ｍｇ／ｍｌ
繰り返し単位中１９．９μｍ
リガンド濃度： ３，０００μｇ／ｍｌ
２０．０μＭ
薬物濃度： １１．０μｇ／ｍｌ
３１．６μＭ
【０１６９】
ＥＧＦ
組成物： ＥＧＦペプチド（対照）
繰り返し単位ｍｗ： −
リガンド： ＥＧＦ
リガンドｍｗ： ６０５２
封入した薬物： −
薬物ｍｗ： −
ポリマー濃度： −
−
リガンド濃度： ２００μｇ／ｍｌ
３３．０μＭ
薬物濃度： −
【０１７０】
指定した増殖培地とともに、以下の細胞株を用いた。Ａ５４９（Ｆ１２倍地）、ＭＤＡＭＢ２３１（Ｌｅｂｏｖｉｔｚ培地）、Ｈ４４１、ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３（ＲＰＭＩ培地）。腫瘍細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含む完全培地に、３０００細胞／ウェルで、９６ウェルプレートにプレートし、２４時間、３７℃でインキュベートした。プレートしてから２４時間後に、試験化合物を、３倍連続希釈して（上記に説明する原液の１０倍希釈で開始）ウェルに添加した。したがって、原液の被験希釈液は、１０：１、３０：１、および９０：１であり、相対濃度はそれぞれ１．００、０．３３、および０．１１であった。６つの試験材料が供給不足であったため、これらは、直接３０：１に希釈し、１０：１で試験は行わなかった。細胞を、試験化合物の添加後、完全増殖培地で、３７℃で７２時間インキュベートした。４日目に、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ（登録商標）アッセイキットを使用して、該細胞を溶解し、１００マイクロリットルの基質／緩衝液の混合液を各ウェルに添加し、混合し、室温で１５分間インキュベートした。該試料を照度計で読み取り、各ウェルから細胞溶解物に存在するＡＴＰの量を測定したが、これは、そのウェルの生存細胞数に対応する。
【０１７１】
各細胞株の結果を図１〜５に示す。１．００の相対濃度は、上記に説明する原液の１０倍希釈を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、両親媒性高分子、具体的には、生体適合性のミセル形成くし型ポリマーの分野に関する。本発明はまた、標的薬剤の送達および抗癌剤の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
疎水性ブロックおよび親水性ブロックを含む両親媒性ブロックコポリマーは、周囲の溶媒を変更する場合、種々のナノ構造への自己集合能力のため、近年十分に研究されている。Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．／Ｒｅｖ．Ｃａｎ．Ｃｈｉｍ．７７：１３１１−１３２６（１９９９）を参照されたい。水溶液中において、両親媒性高分子の疎水性分画は、水との接触を避け、系の自由界面エネルギーを最小化するために、自己集合する傾向がある。同時に、親水性ブロックは、水性環境において、水和した「コロナ」を形成するため、該凝集体は、熱力学的に安定な構造を保持する。その結果は、疎水性コアおよび親水性コロナを有するポリマー凝集体粒子の安定した、ラテックスのようなコロイド懸濁液である。
【０００３】
くし型両親媒性コポリマーは、骨格が概して疎水性または親水性であるという点において、ブロックコポリマーとは異なり、異極のポリマー鎖が、それに組み込まれているのではなく、骨格からペンダント状になっている。くし型コポリマーは、疎水性骨格および親水性分岐鎖で調製され（Ｍａｙｅｓら、米国特許第６，３９９，７００号）、また、親水性骨格および疎水性分岐鎖でも調製されてきた（Ｗａｔｔｅｒｓｏｎら、米国特許第６，５２１，７３６号、Ｕｃｈｅｇｂｕら、米国出願公開第２００６／０１４８９８２号）。前者は細胞表面受容体に多価提示を提供するために使用し、後者は薬物を可溶化し、細胞に導入するために使用した。
【０００４】
両親媒性ポリマー凝集体は、不溶性薬剤、標的薬剤送達ビヒクル、およびｓｉＲＮＡまたは遺伝子の送達系を可溶化するための担体として研究されてきた。それらは、鎖エンタングルメントおよび／または内部疎水性領域の結晶化度のため、従来の低分子量のミセルよりもさらに安定した構造を有する。該ビヒクルのポリマー特性により、凝集体は、臨界ミセル濃度未満に希釈する際、通常のリポゾームが受ける分解に比較的影響されなくなる。２分子膜が存在しないことによって、凝集体は細胞膜とさらに容易に融合し、細胞に直接ペイロードを送達することが可能である。また、該凝集体の両親媒性特性は、界面活性剤のような活性をもたらし、適切に標的化された凝集体は、ウイルス外被タンパク質と融合し、分離させることが可能であると考えられる。
【０００５】
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の卓越した生体適合性、および細網内皮系を避けるＰＥＧでコーティングされた「ステルス」粒子の明らかな能力のために、ＰＥＧを組み込むミセル、リポゾーム、およびポリマーが、広範囲にわたって、薬物導入システムのための物質と見なされている。（リポゾームおよびミセルを形成する）ＰＥＧ脂質の親水性成分としてのＰＥＧの使用については多くの報告がある。例えば、Ｋｒｉｓｈｎａｄａｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０：２９７−３０２（２００３）を参照されたい。より強固な「ポリマーソーム」に自己集合する、自己集合性の両親媒性ブロックコポリマーはまた、薬剤の可溶化および送達のためのビヒクルとして研究されてきた。例えば、Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｌｅｒｏｕｘ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．４８：１０１−１１１（１９９９）；Ｐｈｏｔｏｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，９０：３２３−３３４（２００３）、Ｋａｔａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．４７：１１３−１３１（２００１）、およびＴｏｒｃｈｊｌｉｎ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ＲｅＩ．７３：１３７−１７２（２００１）を参照されたい。
【０００６】
また、Ｇｒｅｆ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｍａｔｅｒ．２０：１３１ （１９９３）、Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，９：９４５（１９９３）、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２２：１４１（１９９２）、Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，６３：２７５（２０００）、Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，５１：２２１（１９９８）、Ｙｕ ａｎｄ Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２９：６３５９（１９９６）、Ｄｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：１１３（１９９９）、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第６，３２２，８０５号、Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ，米国特許第６，６１６，９４１号および第７，２１７，７７０号、Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ，欧州特許第ＥＰ０５８３９５５も参照されたい。この能力におけるポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）の使用もまた、オリゴヌクレオチドの送達に焦点を当てて報告されている（Ｎａｍ ｅｔ ａｌ，米国特許第６，５６９，５２８号、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ，米国特許出願公開第２００４０２４８８４２号）。同様に、Ｌｕｏらは、ポリヌクレオチドの送達に好適なＰＥＧ共役ポリアミドアミン（「ＰＡＭＡＭ」）デンドリマーをＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３５：３４５６（２００２）で説明している。
【０００７】
薬物を可溶化、分配、および送達する必要性に加えて、標的細胞タイプ、組織、腫瘍、または臓器に特に的を搾る標的薬物送達の必要性がある。これは、通常、標的部位の細胞壁に対する特異的親和性を有する抗体または他のリガンドの結合により達成される。しかしながら、ＰＥＧは、ポリマー鎖の末端を除いて官能基を欠き、ブロックコポリマーにおいては、末端基の大部分は、必然的に、他のブロックコポリマー成分への結合に取り込まれる。この理由により、ＰＥＧブロックコポリマーへの抗体または細胞接着分子等の標的部分の結合は、一般に非ＰＥＧブロックに限定され、これはあいにく、自己集合した凝集体のコロナに通常曝露する、コポリマーの一部ではない。
【０００８】
ポリマー凝集体へのブロックコポリマーの自己集合をもたらす相分離現象は、容易に元に戻すことができ、疎水性コアに架橋結合することにより、凝集体の安定性を増加させる取り組みが行われている（欧州特許第ＥＰ０５５２８０２号を参照されたい）。またブロックコポリマーの疎水性成分へ薬物を共有結合させる取り組みも行われている（ＰａｒｋおよびＹｏｏ、米国特許第６，６２３，７２９号、欧州特許第ＥＰ０３９７３０７号）。
【０００９】
樹枝状ポリマーは、容易に標的部分に共役し、また、生体内の特定の細胞を標的化する（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０：１８４５）、ならびにウイルス性および細菌性の病原の生体基質への付着を阻止する可能性も有する。複合シアル酸に共役するくし型分枝ポリマーおよびデンドリグラフトポリマーは、ウイルス血球凝集を阻害し、生体外哺乳類細胞の感染を阻止する能力について評価されている（Ｒｅｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：２７１）。最も効果的なウイルス阻害剤は、くし型分枝およびデンドリグラフト高分子であり、これらのウイルスに対して５０，０００倍の増加活性を示した。
【００１０】
近年、製薬会社のＳｔａｒｐｈａｒｍａは、ウイルスの表面上で受容体を結合することにより、ＨＩＶ感染を予防するデンドリマーに基づくバイオサイド（ＶｉｖａＧｅｌ（商標））についての開発の成功を報告した（Ｈａｌｆｏｒｄ（２００５）Ｃｈｅｍ．＆ Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ ８３（２４）：３０）。Ｃｈｅｎら（２０００）（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．１：４７３）は、第４級アンモニウムで官能化したポリ（プロピレンイミン）デンドリマーが非常に強力なバイオサイドであることを報告した。
【００１１】
患者のほぼ同一の健康な細胞に損傷を与えることなく癌細胞を殺滅することは、特に困難な事柄である。最も成功した化学療法薬剤でさえも、癌細胞に対する機構に基づく選択的毒性は、部分的にしか成し遂げられない。この理由により、癌治療薬は、標的送達が特に望ましい薬剤類であり、多大な努力が、癌特異的細胞表面マーカーのためのリガンドの開発に注がれた。（Ｄｅｌｇａｄｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０００）
【００１２】
例えば、葉酸の細胞表面受容体は、しばしば卵巣、腎臓、肺、乳房、脳、および子宮内膜の癌、ならびに造血源の骨髄細胞で上昇する。該葉酸受容体は、通常、正常な細胞において潜在性であるが、癌細胞の表面に現れるので、受容体特異的癌治療のための標的として頻繁に用いられてきた（Ｌｕ ａｎｄ Ｌｏｗ，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．９１：１７−２９（２００３））。葉酸の、抗腫瘍薬、抗体（米国特許第５，５４７，６６８）、リポソーム（Ｌｉｕ ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｏｎｌｉｎｅ，２：５４７−５５２（２００５））、および他のナノ粒子薬物送達コンストラクト（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．５８：１５３２−１５５５（２００６））との直接共役体も報告された適用の１つである。葉酸共役両親媒性ブロックコポリマーから形成されるミセルは、選択的にパクリタキセルを腫瘍細胞に送達することが示されている（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０９：１５８−１６８（２００５））。
【００１３】
同様に、上皮細胞増殖因子受容体（ＥｒｂＢ１、ＥＧＦＲ）は、乳癌、頭頸部癌、胃癌、直腸結腸癌、食道癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、および卵巣癌、ならびに非小細胞肺癌を含む、上皮性起源の幅広いヒト腫瘍に発現する。これらの所見は、受容体介在性送達系に対する別の重要の標的としてのＥＧＦＲを確立した。ＥＧＦ自体は、強度の細胞分裂および血管形成活性を呈し、これは、それを標的部分としては好適ではないものにするが、ＥＧＦＲに対する種々の非アゴニストリガンドがこの目的のために開発されている。
【００１４】
細胞特異的または腫瘍特異的エピトープに対する抗体は、単独で（患者の補体系を活性化するため）、または放射性同位体もしくは毒素を送達するために、標的治療薬として成功裏に使用されている。例えば、ＣＤ２０ Ｂ−リンパ球抗原に対するマウスＩｇＧ2aラムダモノクローナル抗体である、トシツモマブを、放射性ヨウ化し得、ヨード１３１を選択的にリンパ腫細胞に送達するために使用できる。これは、非ホジキンリンパ腫の治療として、診療所において功を奏するものであることを証明し、この適応のために、商標名Ｂｅｘｘａｒ（商標）で市販されている。同様に、別の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である、イブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ（商標））は、非ホジキンリンパ腫の放射免疫療法のためのイットリウム９０を送達するために使用されている。
【００１５】
他の臨床的に功を奏する癌標的抗体としては、慢性リンパ球性白血病のためのアレムツズマブ（抗ＣＤ５２、Ｃａｍｐａｔｈ（商標））、結腸癌および肺癌のためのベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ、Ａｖａｓｔｉｎ（商標））、結腸、頭頸部癌のためのセツキシマブ（抗ＥＧＦＲ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標））およびパニツムマブ（抗ＥＧＦＲ、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標））、急性骨髄性白血病のためのゲムツズマブ（抗ＣＤ３３、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標））、非ホジキンリンパ腫のためのリツキシマブ（抗ＣＤ２０、Ｒｉｔｕｘａｎ（商標））およびエプラツズマブ（抗ＣＤ２２、Ｌｙｍｐｈｏｃｉｄｅ（商標））、ならびに乳癌のためのトラスツズマブ（抗ＨＥＲ−２、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））が挙げられる。免疫毒素Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）は特殊な関連性があり、ここでは、抗ＣＤ３３抗体が、細胞毒性抗腫瘍薬物である、カリケアマイシンに共役する。
【００１６】
安定した、生体適合性のある、種々の標的部分の結合に適しており、かつ相当な薬物のペイロードを所望の腫瘍細胞標的に送達するのに効率的な薬物送達系に対する必要性が依然として存在する。同様に安定した、効率的、かつ生体適合性のある標的抗癌剤に対する必要性もまた存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、分枝点部分を有する親水性骨格、およびこれらの分枝点部分で結合する疎水性分岐を含む、生体適合性のある，くし型ポリマー分子を提供する。分岐点部分は、腫瘍細胞に対して特異的な標的部分が結合する、反応性官能基の形態の結合点をさらに提供する。本発明は、かかるポリマーから形成されるポリマー凝集体の水性懸濁液を提供し、また、かかる薬剤をポリマー凝集体の疎水性コアに封入することによって、抗腫瘍薬剤を可溶化するための方法を提供する。薬物を封入するための方法は、基本的に、水性または混合水性溶媒中で、薬物種を本発明のポリマーと接触させるステップを含む。得られる薬物ペイロードは、水性環境に懸濁される際、くし型ポリマーによって形成される高分子ポリマー凝集体の疎水性コア内で、可溶化した状態に維持される。好ましい実施形態においては、ポリマー凝集体を、その封入された薬物ペイロードを伴って、選択的に、標的部分によって標的癌細胞へ送達する。
【００１８】
本発明はまた、癌細胞を殺滅またはその増殖もしくは再生を阻害する方法、または哺乳類の癌治療のための方法を提供し、該癌細胞に接触するステップ、または該哺乳類に、本質的に以下の構造からなるくし型ポリマー内に封入された抗癌薬を投与するステップを含む。
【００１９】
【化１】
【００２０】
該構造は、交互分岐点部分Ｂ、および親水性の水溶性ポリマーブロックＡから形成される骨格を含む。疎水性側鎖Ｃ、および任意に標的部分Ｚは、分岐点部分に結合する。該ポリマー鎖は、末端基、典型的には末端Ｂ部分にＨまたはポリマーブロックＡ、および典型的には末端ＡポリマーブロックにＯＨを有するが、本発明はすべての好的な鎖停止を包含することを理解されよう。好ましくは、該側鎖Ｃは、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換される直鎖もしくは分岐鎖炭化水素、または１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素である。側鎖Ｃはまた、疎水性アミノ酸、ペプチド、またはポリマーであり得る。側鎖Ｃに好適な親水性置換基は、ヒドロキシル基、カルボニル基、およびアミノ基、ならびにアミド基、スルホンアミド基、スルホキシド基、およびスルホン基である。好ましい親水性置換基は、第３アミド、スルホキシド、およびスルホン等の非プロトン性極性基である。
【００２１】
任意の標的部分Ｚは、癌細胞の表面に対して特異的な結合親和性を有するリガンドまたは抗体である。本発明のある実施形態において、２つもしくはそれ以上の異なる部分Ｚは、複数の細胞表面受容体および抗原を、特異性を増加する手段として標的化することができるように、所与の分岐点またはポリマー分子上に存在する。「特異的結合親和性」とは、リガンドまたは抗体が、治療を受けている哺乳類の体内で見られる多くの他の細胞表面および高分子の存在下で、生体内の癌細胞の表面に結合することができることを意味する。該親和性は、癌細胞のみに、または患者における癌性である細胞の種類に特異的であり得る。例えば、Ｂ細胞リンパ腫において、該リガンドは、すべてのＢ細胞に存在するＣＤ−２０受容体に対する抗体であり得る。特異性の度合いは、極端に高い必要はないが、可溶化薬物ペイロードのみよりもさらに効果的に癌を治療するのに十分でなければならない。「ｓ」で表される部分は、結合またはスペーサ部分であり、ｓがスペーサであるとき、各ｓは、１から４つの基のＺを担持し得る。ｎの値は、１から約１００の範囲であり、ｐの平均値は、１から２であり、ある実施形態において、ｒはゼロであり得る。ｒがゼロではない実施形態において、ｒの平均値は１から４の範囲である。
【００２２】
分岐点部分Ｂは、２つのポリマーブロックＡへの結合、１〜２つの側鎖Ｃ（平均）への結合、ならびに、ｒがゼロではないとき、スペーサ「ｓ」および／またはリガンドＺへの１つもしくは複数の結合を有する多価部分である。特定の実施形態において、Ｂならびにｓおよび／またはＺへの結合は、複数の反応性官能基を介して確立し、これは、結合点として機能することができる。特に好ましい実施形態において、標的部分は、本発明のポリマーの分岐点部分に共有結合し、薬物は、凝集体のコアに組み込ませ、標的薬剤複合体を形成する。他の実施形態において、標的部分が、細胞表面受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである場合、標的ポリマーまたはポリマー凝集体は、封入された抗癌薬が存在しない場合でさえ、薬物のような効果を呈し得る。
【００２３】
本発明は、本明細書に記載のくし型ポリマー、凝集体、および標的ポリマー凝集体および薬物複合体の調製方法をさらに提供する。本発明のポリマーは、生体内で薬物を効率的に可溶化、分配、および送達するポリマー凝集体に自己集合し、非毒性で、生体適合性であり、かつ安定しており、さらに、それらの外部表面に複数の細胞標的部分を担持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ａ５４９腫瘍細胞の培地の細胞増殖アッセイにおける、本発明の例示的な組成物の活性を示す図である。
【図２】Ｈ４４１腫瘍細胞の培地の細胞増殖アッセイにおける、本発明の例示的な組成物の活性を示す図である。
【図３】Ｓｋｂｒ３腫瘍細胞の培地の細胞増殖アッセイにおける、本発明の例示的な組成物の活性を示す図である。
【図４】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞の培地の細胞増殖アッセイにおける、本発明の例示的な組成物の活性を示す図である。
【図５】ＢＴ４７４腫瘍細胞の培地の細胞増殖アッセイにおける、本発明の例示的な組成物の活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書において「πポリマー」と称される、本発明のポリマーの例は、２００６年１月１９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／０１８２０号（その明細書は、参照することにより、その全体として本明細書に組み込む）に説明されている。それらは、式１に示されるとおり、交互分岐点部分Ｂおよび親水性の水溶性ポリマーブロックＡから形成され、各分岐点部分に結合する複数の疎水性側鎖Ｃを有する骨格を有する、くし型構造を有する。該側鎖Ｃは、比較的短い疎水性部分であり、これは、脂肪族または不飽和分子、鎖もしくはオリゴマーであり得る。ｐの値は、理想的には、２、３、または４のいずれかの整数である。実際は、該側鎖を、しばしば、完全に効率的ではない化学反応により導入させるが、結果的に、意図した整数ではない、全体としてのポリマー調製物のｐの平均値をもたらす。非整数平均値はまた、以下に述べるとおり、意図的に取得することができる。したがって、本発明のポリマーのｐの平均値は１よりも大きく、４ほど大きくてもよい（１＜ｐ＜４）。好ましい実施形態において、ｐは約２から４、最も好ましくは１．５＜ｐ＜２の範囲である。以下に整数値に言及するとき、その整数は理想的なものであって、考察するポリマーの物理的試料に実際に見出される平均値に言及するものではないことを理解されたい。
【００２６】
骨格ポリマーブロックＡは、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（エチレンイミン）、ポリビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、多糖等を含むが、これらに限定されない、親水性および／もしくは水溶性ポリマー鎖より選択する。好ましくは、ポリマー単位Ａは、式−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−のポリ（エチレングリコール）鎖であって、ｍは１から１０，０００、好ましくは３から３，０００である。
【００２７】
種々のグレードのポリ（エチレングリコール）の製造において、分子量の範囲を比較的狭く維持すると同時に、ポリマーの分子量を実質的に２倍にする、２つのポリ（エチレングリコール）鎖へ２価リンカー部分（例、ビスフェノールＡジグリシジルエーテル）を連結することは、当業界では既知である。得られる「ポリ（エチレングリコール）」分子は、ポリマー鎖の中間で、非グリコールリンカー部分（例えば、ポリ（エチレングリコール）−ビスフェノールＡジグリシジルエーテル不可物（ＣＡＳ登録番号３７２２５−２６−６を参照されたい）によって、結果的に遮断される。高オリゴマー、すなわち、２つのビスフェノールＡジグリシジルエーテル部分によって分離される３つのＰＥＧ鎖を有するものもまた既知であり、例えば、国際特許出願ＷＯ ００／２４００８を参照されたい。したがって、本明細書において使用する「ポリ（エチレングリコール））および「ポリ（プロピレングリコール））という用語は、ビスフェノールＡジグリシジルエーテル、ビスフェノールＢジグリシジルエーテル、ビスフェノールＳジグリシジルエーテル、ハイドロキノンジグリシジルエーテル等を含むがこれらに限定されない、非グリコールリンカー単位を組み込む、ポリ（エチレングリコール）およびポリ（プロピレングリコール）ポリマー鎖を包含する。本明細書の目的上、いかなるこのようなリンカー部分も「モノマー単位」と見なさない。
【００２８】
ポリマーブロックＡは、最も好ましくは、２０から５０のモノマー単位の平均長を有する。ポリエチレングリコール鎖は、一端もしくは両端を、アミノ、メルカプト、アクリレート、アクリルアミド、マレイン酸塩、マレイミド等を含むが、これらに限定されない、他の部分へのリンカーとしての使用に好適な官能基で末端置換させることが可能である。ｎの値は、１から１０００、好ましくは３から１００の範囲である。πポリマーの全体分子量は、１０００から１００，０００ダルトン以上であり、好ましくは２，０００ダルトン超、より好ましくは７，０００ダルトン超の範囲であり得る。
【００２９】
疎水性部分Ｃは、同一または異なり得、モノマー単位によって異なり得、例えば、直鎖炭化水素（１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換される）、多環式炭化水素（１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換される）、疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーであり得る。好適な親水性置換基としては、ヒドロキシル、エーテル、シアノ、およびアミド官能基が挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、ωヒドロキシ、ωシアノ、ωアミド、もしくはωアルコキシ置換基を担持するＣ8〜Ｃ20アルキル基が想定される。このような状況において、「置換基」という用語は、部分Ｃの炭化水素鎖もしくは環系の炭素原子に関して、Ｏ、Ｎ、またはＳ等のヘテロ原子の置換を含む。したがって、エーテルおよびアミド結合、ならびに複素環を、部分Ｃに組み込ませることが可能である。
【００３０】
疎水性部分Ｃは、好ましくは、比較的短鎖（Ｃ8−Ｃ20）脂肪酸であるが、短鎖オリゴマーであってもよい。好適なオリゴマーとしては、オリゴヒドロキシ酸、例えば、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ＤＬ乳酸）、ポリ（Ｌ乳酸）、ならびにポリ（グリコール酸）およびポリ（乳酸）ヒドロキシ酸のコポリマー、ならびにポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、およびポリ（リン酸エステル）、ポリラクトン、例えば、ポリ（エプシロン−カプロラクトン）、ポリ（デルタ−バレロラクトン）、ポリ（ガンマ−ブチロラクトン）、およびポリ（ベータ−ヒドロキシ酪酸塩）が挙げられる。Ｃ部分はまた、コレステロール、コール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、および関連物質等の疎水性分子、プロスタグランジン様物質、ステロイド物質（例えば、デキサメタゾン）、レチノイン酸、レチノールおよび関連するレチノイド物質、疎水性ペプチド等から選択できる。各部分Ｃの分子量は、４０を上回り、好ましくは５０から１，０００、最も好ましくは１００から５００である。分子Ｃ−ＨのｌｏｇＰ値（オクタノール−水）は、約１．４を上回り、好ましくは約２．０を上回り、最も好ましくは約２．５を上回る。一般に、分子Ｃ−Ｈが、水中で実質的に不溶性である場合、いかなる部分Ｃも、本発明の使用に好適であると考えられる。「実質的に不溶性」とは、液体Ｃ−Ｈが、水と混合した際、分離相を形成することを意味する。
【００３１】
側鎖Ｃがポリマー鎖に沿って規則的に均一に分布していないが、クラスタ［Ｃ］pに生じることは、本発明のくし型ポリマーの際立った特徴である。これらのクラスタは、ポリマー単位Ａの単分散度に応じて、ポリマー鎖に沿ってほぼ規則的に離間する。したがって、共通の分岐部分Ｂに結合する２つの側鎖Ｃ間の距離は、ポリマーブロックＡによって分離される、異なる分岐部分に結合する２つの側鎖間の距離とは異なる。
【００３２】
標的送達に特に好適な本発明の一実施形態において、分岐点部分Ｂは、式２に示す１つもしくは複数の反応性官能基Ｘをさらに含み、これは、標的部分の結合に好適である。
【００３３】
【化２】
【００３４】
式２において、個別の反応基Ｘは、同一であっても、互いに異なっていてもよく、ポリマー２の集合中に必要であり得るように、任意にブロックまたは保護されてもよい。ｒの平均値は、０（ＸまたはＺ基がない実施形態において）から約８の範囲である。一般的には、反応基を、分子種間の共有結合を形成するのに有用であることが当該技術分野で既知の官能基より選択する。ある実施形態において、単一の結合点Ｘが存在し得る。他の実施形態において、３または４つの異なる種類の反応基が存在し得る。好適な反応基Ｘとしては、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＮＨＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＮＨ2、ハロアシル、アセトアセチル、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ等、ビニル、アクリル、アリル、マレイン、桂皮等の反応二重結合、ならびにアセチレンカルボキシおよびアセチレンカルボキサミド（マイケル付加、ディールス・アルダー反応、およびフリーラジカル添加反応に好適）等の反応三重結合を有する基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
例示的な細胞標的部分としては、特異的細胞表面受容体に結合する受容体特異的リガンド、抗体、アプタマーもしくはペプチド、ならびに他の標的部分、例えば、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）アミノ酸配列もしくはチロシン−イソロイシン−セリン−アルギニン−グリシン（ＹＩＳＲＧ）モチーフを有するペプチド；上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子および線維芽細胞増殖因子を含む増殖因子；葉酸、メトトレキサート、プテロイン酸、エストラジオール、エストラトリオール、テストステノン、および他のホルモン等の細胞受容体リガンド；マンノース−６−リン酸、糖、ビタミン、トリプトファン等が挙げられるが、これらに限定されない。受容体アゴニストおよび受容体アンタゴニストは、競合的またはアロステリックに関わらず、使用することが可能である。
【００３６】
アプタマーは、当該技術分野で既知の方法を使用した受容体への結合のために選択することができる。受容体に結合することができるペプチドは、ハイスループット・マイクロプレートスクリーニング、ファージ提示法、ピンおのび平面アレイ等の標準方法を使用して選択することができる。抗体は、好ましくは、細胞特異的表面抗原に対するモノクローナル抗体であり、好適な標的部分としては、完全抗体のみでなく、Ｆａｂ’２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、もしくは鎖ペプチド（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）ペプチド）等の活性抗原結合配列を含有する抗体フラグメント、またはかかる抗体の活性抗原結合配列の類似体が挙げられる。好適な抗体としては、ＮＣＡ９０、ＮＣＡ９５、ＣＥＡ、ＣＤ１５、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＶＧＥＦ、およびＥＧＦＲ等の腫瘍抗原に対する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、好ましくはモノクローナルであり、任意にヒト化抗体、キメラ抗体、または完全ヒト抗体であり得、ＰＥＧ化あるいは他の方法で修飾することが可能である。しかしポリクローナル抗体は、それらの多重抗原結合能により、ある状況において有利に採用することが可能である。
【００３７】
特に好適な抗体としては、トシツモマブ、イブリツモマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、エプラツズマブ、トシツモマブ、およびトラスツズマブ、ならびにその結合ドメインを含む抗体フラグメントまたはペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
代替の実施形態において、ビオチンは、官能基Ｘを介してπポリマーに結合し、アビジンおよびストレプトアビジン連結タンパク質、ペプチド、抗体、成長ホルモン、ならびに他の標的部分に対する非共有結合手段として使用できる。
【００３９】
本発明のある実施形態においては、分岐点部分Ｂの一部の分画を、ポリマー鎖のどこか他の分岐点部分に連結させ、架橋ヒドロゲル構造を形成させる。かかる架橋は、ポリマーを、同種官能基または異種二官能基（これらのうちの少なくとも１つは、Ｘ、または第１の分岐点部分に位置するＣの反応基と反応し、これらのうちの少なくとも１つは、Ｘ、または同一のポリマー分子内の第２の分岐点部分のＣに存在する反応性官能基と反応する）を含有する多官能部分と反応させることによって達成できる。架橋はまた、ポリマー鎖Ａ上の末端官能基への結合によっても行える。本発明の直鎖くし型ポリマーと同様に、かかる架橋ポリマーは、任意に標的部分を担持し得る。
【００４０】
分岐点部分Ｂは、典型的には、複数の反応基（これらのうちの２つは、親水性ポリマー単位Ａへの結合に好適であり、これらのうちの少なくとも２つは、疎水性部分Ｃへの結合に好適である）を有する多官能分子から派生する。部分Ｂは、任意に、上記で説明した１つもしくは複数の追加の反応基Ｘを有し得る。
【００４１】
特に好ましい分岐点部分は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、または２，３−ジアミノブタン−ｌ，４−ジチオールと、マレイン酸の２つの分子との共役体である。分枝点部分と、部分Ａとしてのポリエチレングリコールとの組み合わせは、式３および３ａのポリマー骨格を生成する。
【００４２】
【化３】
【００４３】
式中、ＹおよびＹ’は、同一または異なってよく、好ましくは、ＯＨ、ＮＨ2、ＯＮＨ2、ＮＨＯＨ、およびＮＨＮＨ2から選択する。好ましい実施形態において、ジチオールのヒドロキシルまたはアミノ基は、反応基Ｘであり、標的または薬物部分の結合点としての役割を果たすが、官能基ＹおよびＹ’は、Ｃ部分の結合点としての役割を果たす。代替として、基ＹおよびＹ’は、標的部分の結合点としての役割を果たすが、ヒドロキシルまたはアミノ基は、Ｃ部分に結合するために使用する。
【００４４】
式３および３ａは、各硫黄原子が独立して、ＰＥＧエステルカルボニル基にαまたはβを結合させることができることを意味することを意図する。本発明は、単一異性組成物、ならびに１つまたは双方のＣ−Ｓ結合で、位置異性体の混合物を包含する。さらに、式１の４つの不斉炭素により、本発明は、すべてのキラル、メソ、およびジアステレオ異性体、ならびにその混合物を包含する。
【００４５】
アセチレンジカルボキシル酸およびフランのディールス・アルダー付加物も、好適な分枝点部分としての役割を果たし得る。例えば、ＰＥＧおよびアセチレンジカルボン酸から派生するポリエステル４は、フランとのディールス・アルダー反応を受けることが既知である（Ｍ．Ｄｅｌｅｒｂａ ｅｔ ａｌ，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．１８（８）：７２３−７２８（１９９７））。
【００４６】
【化４】
【００４７】
したがって、３，４−二置換フランとのディールス・アルダー反応を受けて、５等の種を生成でき、ポリマー５は、ヒドロキシル化またはエポキシ化によって修飾し、反応基を形成することができる（例えば、スキーム１のＸおよびＸ’）。
【００４８】
同様に、ＰＥＧの、エチレンジアミン四酢酸二無水物との反応は、その後の縮合により式６のポリエステルを形成する。
【００４９】
【化５】
【００５０】
他の好適な分岐点部分は、酒石酸、アセチレンジカルボン酸、ニトリロ三酢酸、３，４，３’，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボン酸二無水物、３，４，３’，４’−ジフェニルエーテルテトラカルボン酸二無水物、ピロメリト酸二無水物、１，２−エタンジチオールおよび１，４−ブタンジチオール等のアルカンジチオール、ビス（２−メルカプトエチル）エーテル、２−メルカプトエチルスルフィド、ジメルカプトプロパノール、ジメルカプトプリン、ジメルカプトチアジアゾール、ジメルカプトコハク酸、ベンゼンジメタンチオール、ベンゼンジチオール、ジハロゲン化ベンゼンジメタンチオール、ジハロゲン化４，４’−チオビスベンゼンチオール等から派生させることができる。
【００５１】
ＹおよびＹ’はＯＨである場合、疎水性基Ｃを、カルボキシル酸基のアミド化またはエステル化によりポリマーに結合させることができる。該疎水性基Ｃは、好ましくは、比較的小さい（Ｃ8−Ｃ20）および主に炭化水素部分であり、直鎖または分枝であり得、または１つもしくは複数の環を含み得る。例としては、Ｃ−Ｈ分子のｎ−オクタノール、ｎ−デカノール、ｎ−ドデシルアミン、ｎ−ペンタデシルアミン、コレステロール、デオキシコール酸、コール酸、レチノール、ビタミンＡ、ならびに種々のｃｉｓおよびｔｒａｎｓレチノイン酸異性体、種々のトコフェロール、およびアラキドン酸から派生する共有結合部分が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリマーは、便宜上、多くとも２つの異なる疎水性側鎖を有するのものとして表すが、ポリマー凝集体の内部溶媒特性は、種々の疎水性側鎖を特定のポリマーに導入するように、２つまたはそれ以上の疎水性化合物の混合物を採用することによって、改質または「調整」できることを理解されたい。例えば、水素結合および双極子間相互作用から生じる溶媒効果に加え、液晶相および相転移温度等の物理化学特性は修正することができる。かかる効果は、例えば、膜二重層の研究から、公知である。
【００５２】
具体的な一例として、式２のポリマー（式中、Ｘ＝ＯＨであり、ｒ＝２である）は、ポリエチレングリコールを無水マレイン酸と反応させて、ポリエステル７を形成し、その後、ジチオスレイトールとの反応により、８を形成することによって調製した。その後、酸７をｎ−オクタデシルアミンでアミド化して、所望のくし型ポリマー９（スキーム２）を形成した。式９によって表されるＤＴＴ由来のアミドくし型ポリマーは、本明細書において、「πポリマーＡ」と称し、スキーム２の具体的なポリマー９は、「Ｃ18−πポリマーＡ」で示す。
【００５３】
【化６】
【００５４】
ジチオスレイトールの代わりに２，３−ビス（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブタン−ｌ，４−ジチオールを使用することによって（１０ａ、ＤｕＰｒｉｅｓｔ ｅｔ ａｌ，米国特許第４，７５５，５２８号）、脱保護後、対応するアミノ官能基化πポリマー９ｂ（スキーム３）をもたらす。
【００５５】
【化７】
【００５６】
同様に、ブタンジチオール１０ｃを使用することによって、標的部分の後の結合のためにスペーサ基Ｌが適所にある、一般構造９ｃのポリマーをもたらす（スキーム４）。該スペーサ基Ｌは、Ｃ2〜Ｃ20アルキレンおよび１から１０の−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−単位を有するオリゴ（エチレングリコール）スペーサを含むが、これらに限定されない、リガンドまたは標識を基質分子に結合させる際の使用に関して、当該技術分野で既知のスペーサ基のうちのいずれであってもよい。
【００５７】
【化８】
【００５８】
他の実施形態において、末端アミノ基を有するＰＥＧポリマーは、構造１０〜１４に示すように、ＡとＢとの単位間のアミド結合を有する例を調製するために使用できる。これらのポリアミドの各々は、ＰＥＧジアミンＨ２Ｎ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）mＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ2の、適切な環状無水物との反応により得ることができる。
【００５９】
【化９】
【００６０】
【化１０】
【００６１】
穏和な条件下では、上記のアミド酸は、予想された生成物である。加熱すると、イミドを形成できることが期待され、少数の反応基を有するポリマーをもたらすが、依然として疎水性Ｃ部分の結合に好適である。望ましくないイミド形成は、低温および／または水性条件下で、反応を行うことによって、低減または回避することができる。あるいは、ペンダント側鎖ＣをポリマーＡブロックの末端に添加することができ、重合時に、分枝点部分が生じる可能性がある（スキーム５）。
【００６２】
１，３−ジアミノプロパン等の単一ジアミンに加えて、スキーム５に示すように、（任意にマスクされた）反応官能基Ｘを有するジアミンを使用してもよく、標的部分の結合に適するポリマー１５をもたらす（スキーム６）。以下の式において、ｐは、０〜４の範囲であり得、各Ｘは独立して、存在し得るいかなる他の基Ｘとも同一または異なる。反応基Ｘは、ペンダントである必要はないが、例えば、モノマーＨ2Ｎ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ2等の場合、ジアミンを構成する原子の鎖内のＮＨ基であり得る。
【００６３】
【化１１】
【００６４】
【化１２】
【００６５】
上記のとおり調製したπポリマーのうちの一部は、さらなる誘導体化に好適な反応基Ｘを有し、標的部分に結合し、二官能性または多官能架橋剤によるポリマー鎖の架橋を行う。特定の実施形態において、ポリマー鎖上の反応基の部分的な誘導体化は、種々の異なる反応基を有するπポリマーを生成するように行い、これは、種々の標的部分の、単一ポリマー鎖への結合を可能にする。したがって、準化学量論的な量の塩化アクリロイル（または無水マレイン酸）の、実施例１のπポリマーへの添加によって、アクリロイル（またはマレイル）基および残留ヒドロキシル基の両方を有するポリマーが生成する。準化学量論的な量のメルカプト−カルボン酸、例えば、ＨＳ−（ＣＨ2）3−ＣＯＯＨのその後のマイケル付加により、ヒドロキシル、アクリロイル、およびカルボキシル基を有するポリマーが生成する。準化学量論的な量の試薬により後に残されるいずれの残留反応基に加えて、システインの添加により、アミノおよびカルボキシル基が導入される。
【００６６】
多官能性πポリマーへの別の手法には、疎水性鎖Ｃの分画の慎重な省略を含む。実施例１のπポリマーは、例えば、アミド化ステップにおけるペンダント形成アルキルアミンの量を制限する単純な方法によって、未反応カルボン酸基で調製することができる。さらに別の手法は、アミン混合物によるアミド化であり、この分画は、反応基Ｘを含有する。また、適切な条件下（ステップＡでは過剰な無水マレイン酸、ステップＢでは過剰なＤＴＴ）では、所望の数の遊離チオール基を有するポリマー調製物を生成できる。
【００６７】
実施例１のπポリマーは、意図的に、骨格中のＤＴＴ部分から派生したヒドロキシル基を含有し、これは、反応基Ｘとしての役割を果たす。炭酸塩／重炭酸塩緩衝液の存在下で、これらの基の、水性媒体中の塩化アクリロイルまたは塩化メタクリロイルによるエステル化は、該−ＯＨ基上にアクリロイル置換をもたらす。該アクリレートポリマーは、容易にラジカル重合（アクリル酸化合物等のラジカルモノマー、またはビスアクリル酸化合物等の架橋剤の添加を伴う、または伴わない）に供することができ、制御した薬物導入、および局所適用（皮膚用パッチ剤または軟膏等）に適するヒドロゲル（ポリマー貯蔵または蓄積の役割を果たす）を得る。該アクリロイル基はまた、特に、タンパク質、酵素、ペプチド、抗体、Ｆａｂ’２フラグメントもしくはＦａｂ’フラグメントのシステイン残基、または他の標的部分等のチオールによって、マイケル付加に供することができる（スキーム７）。
【００６８】
【化１３】
【００６９】
反応ヒドロキシル基を有するπポリマーは、乾燥後、無水マレイン酸でエステル化して、マレイン酸塩基である、マイケル受容体に結合させ、同時に遊離カルボキシル基を生成することができる。得られるポリマーにおいて、マレイン二重結合は、特に、タンパク質、酵素、ペプチド、抗体、Ｆａｂ’２フラグメントまたはＦａｂ’フラグメント、もしくは他の標的部分内のシステイン残基等のチオールとによるマイケル付加に利用可能であり（スキーム８）、カルボキシル基が、タンパク質およびペプチド内のリシン残基等の、標的部分におけるアミノ基への連結に利用可能である。
【００７０】
異なる部分は、アミド化を行い、新規に導入した（または従来利用可能な）カルボン酸基にさらに結合することができる。したがって、少なくとも２つの異なる標的部分は、飽和反応状態下でさえ、結合することができる（すなわち、結合部分は、過剰な化学量で存在する）。
【００７１】
【化１４】
【００７２】
代替の調製には、スキーム９に示すとおり、ジマレイン酸ＰＥＧのアミド化を含み、その後ジチオールとの反応を行う。アミド化は、活性エステルの使用、またはＮＨＳ、ＨＯＢＴ、ＤＭＡＰ、ピリジン、もしくはＴＭＥＤ等のさらなる触媒を伴う、または伴わない、ＥＤＣ、ＤＩＰＣ、ＤＣＣ等を用いる方法を含むが、これに限定されない、多くの既知のカルボン酸活性化プロセスのうちのいずれかによって行える。次いで、アミド化したジマレイン酸ＰＥＧをＤＴＴまたは別のジチオールと反応させて、二重結合へのマイケル様添加を達成し、これによって、所望のポリマーを生成する。このプロセスの利点は、潜在的に非常に幅広い、予め形成したジマレイン酸ＰＥＧから、ポリマーに組み込みたい正確なモノマー（およびその比率）を、選択できることである。
【００７３】
【化１５】
【００７４】
ペンダントカルボキシレート基を有するポリマーは、典型的な結合条件下で、アミンでアミド化することができ、Ｃｕｒｔｉｕｓ転位を行い、イソシアネート基に変換し、その後、尿素およびカルバメートをそれぞれ形成するように、アミンまたはアルコールと結合させることもできる。かかる反応は、疎水性基Ｃを導入、または標的部分に結合するために使用することができる。
【００７５】
遊離アミンは、ジアミンと反応基の１つを少なくとも部分的に反応させることにより、ポリマー内に導入することができる。反応条件下で、アミン基の１つを保護するか、または反応しないように、ジアミンを選択しなければならない。２つのアミノ基のｐＫａが大幅に異なるため、後者は、多くの場合、約７．５のｐＨで、エチレンジアミンを使用することによって達成することができる。好ましくは、本アミド化は、疎水性ペンダント基の導入後、分離工程として実行する。カルボン酸基を有するペプチドまたは別の分子は、その後、この遊離アミンのアミド化により結合することができる。
【００７６】
したがって、飽和条件下でさえ、３つと多くの異なる標的部分を、πポリマーに結合させることができる（１つはチオールによって、１つはアミンまたはヒドロキシルによって、１つはカルボン酸基によって）。標的部分に加え、造影剤を本発明のポリマーに組み込むこともでき、それによって体内でのポリマーの分布の可視化が可能になる。198Ａｕ、32Ｐ、125Ｉ、131Ｉ、90Ｙ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、67Ｃｕ、211Ａｔ、213Ｂｉ、224Ａｃ等の放射線治療薬、およびカリケアマイシン、細菌内毒素、ゲロニン、アブリン、リシン等の細胞毒素は同様に、ポリマーに結合することができる。
【００７７】
ヒドロキシル基およびチオール基も、既知の方法（例えば、ミツノブ反応）によってアミンに変換、またはアジリジンもしくはハロアルキルアミン（ブロモエチルアミンもしくはクロロエチルアミン等）との反応によって１級アミンに変換することができる。システアミンによるアミド化によって、ジスルフィドを導入し、これは、ペプチドもしくは抗体のシステインによって直接反応して、ペプチドもしくは抗体に結合するか、あるいは、ペプチドもしくは抗体とのさらなる反応のために、例えば、アミノエタンチオールもしくはＤＴＴで最初に還元することができる。
【００７８】
部分的な反応を行うことによって、以下のものを含むが、これらに限定されない、追加の反応性官能基を、本発明のポリマーに導入することができる。（１）アクリル酸またはマレイン酸誘導体等のチオール反応基、（２）アミノまたはヒドロキシル等のカルボン酸反応基、（３）カルボキシル等のアミン反応基、および（４）メルカプト等のジスルフィド反応基。ポリマー分子あたりのこのような追加官能基数は、１／ｒから最大ｒの数倍であり得、使用した試薬および使用した量により異なる。
【００７９】
代替として、２つまたはそれ以上の特異的標的部分を、癌細胞表面への結合特異性を改善するように結合させることができる。２つまたはそれ以上の特異的部分はまた、異なる標的間の相互作用を生じさせるように使用することができ、例えば、ある部分は、ポリマーを癌細胞に標的化し、別の部分は、補体因子の結合、および補体経路の活性化を容易にし得る。
【００８０】
本発明のポリマーの繰り返し単位への標的部分の結合は、ポリマー鎖およびナノ粒子表面上の部分の多価提示をもたらす。多価提示は、多くの場合、標的への親和性の大幅な増加をもたらす。例えば、多価抗体は、正常の２価抗体よりも標的の除去により効果的である。炭水化物結合タンパク質および炭水化物は、本来は多価であり、１価である場合、効果がないことは既知である。同様に、多価ペプチドおよび炭水化物標的部分は、モノマー単独よりもさらにより効果的であろう。
【００８１】
本発明のポリマー鎖への、標的部分の結合のさらなる利点は、分子量の有意な増加であり、これは、ペプチドおよび他のリガンドの腎クリアランス率の低下をたらす。さらに、ＰＥＧ骨格は、免疫学的監視の回避等の、タンパク質ＰＥＧ化と同様の利点を与える。
【００８２】
本発明のくし型ポリマーは、水性溶媒系において、水溶性および難溶性抗癌薬を、封入するのに有用である。水性溶媒に物質を封入する方法は、該物質およびポリマーの水溶性複合体を形成するように、水の存在下で、薬物を、本発明のくし型ポリマーに接触させるステップを含む。代替として、封入するポリマーおよび物質は、２相の水溶性−有機エマルションにおいて組み合わせ、蒸発によって有機溶媒を除去することができる。例示的なプロセスは、米国特許第６，８３８，０８９号に説明され、参照することにより本明細書に組み込まれる。ほとんどの場合、ポリマーは、粒子のコアで癒合する疎水性Ｃ鎖間で溶解した薬物を有する、ミセル様ナノ粒子に自己集合し、一方Ａブロックは、界面自由エネルギーを有意に低下させ、粒子の水性懸濁液が安定なままであることを可能にする、親水性コロナを形成すると考えられる。
【００８３】
一部の例では、難溶性薬物は、コアで完全に溶解することができないが、粒子のコアで、Ｃ鎖で包囲および浮遊している固体ナノ粒子またはナノ結晶として存在し得る。本発明の実践は、Ｃ鎖と難溶性物質との混合のいかなる度合いにも依存しない。該薬物は、一部の例において、Ｃ鎖の分子レベルで溶解し得るが、他の例においては、Ｃ鎖環境からの相分離のいかなる度合いをも呈し得る。一部の例において、該系は、ｐＨ、温度、もしくはせん断率等の外部条件に応じて、ある状態から他へ移行することが予測できる。例えば、血流におけるせん断率は、極めて高いことが可能であるが、リンパ系においては一般的に低い。かかる環境誘発性の状態変化を用いて、粒子コアからの薬物放出を制御することができる。
【００８４】
疎水性Ｃ部分を修正することにより、ポリマー粒子の疎水性コアの溶媒力を修正することができる。好適な修正としては、疎水性コアの極性および／または分極率を増加させるための、ヒドロキシル、エーテル、アミド、スルホキシド等の、１つもしくは複数の双極性および／または親水性置換基、ならびにシアノ官能基の導入が挙げられるが、これに限定されない。
【００８５】
これらのポリマーによって、封入および送達することができる抗癌薬としては、ドキソルビシン、カンプトセシン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、イリノテカン、イマチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、アクシチニブ、パゾパニブ、エトポシド、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、クラドリビン、クラドリビン、スタウロスポリン、シタラビン、メルファラン、ロイロシン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＤ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、シスプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、レチノイン酸、コルヒチン、デキサメタゾン、およびタモキシフェン、ならびにこれらの薬物の誘導体および類似体、さらに光線力学的薬剤、核酸、核酸類似体、および核酸複合体が挙げられるが、これらに限定されない。核酸類似体としては、チオリン酸、ホスホロアミド酸、およびペプチド核酸等の種が挙げられる。核酸複合体は、オリゴ核酸のイオン複合体、または実質的に電荷中和量のカチオンまたはポリカチオン種を有するその類似体である。
【００８６】
本発明のポリマーの抗癌薬を封入する能力の結果、本発明はまた、医薬組成物も提供し、これは、治療有効量の１つもしくは複数の薬学的に活性な抗癌剤、および医薬として許容される担体または賦形剤と組み合わせて、本発明の１つもしくは複数のπポリマーを含む。好適な担体および賦形剤としては、水および生理食塩水、ならびに緩衝剤等の固体添加剤、塩、糖、セルロース等の多糖、およびその誘導体、ならびに当該技術分野で既知の種々の湿潤剤、滑剤、防腐剤、結合剤および分散剤が挙げられる。本発明のポリマーは、従来技術において、本来、無効量の抗癌剤であったものを、効果的なものにする。したがって、本開示の目的上、「治療有効量」は、組成物全体を効果的なものにする薬剤の量である。
【００８７】
本明細書に記載のすべての特許、特許出願、および出版物は、参照することにより本明細書にすべて組み込まれる。
【実施例】
【００８８】
１．一般手順
本発明はまた、本発明のくし型ポリマーの調製のためのプロセスを提供する。これらのポリマーの合成は、下に記載の手順に従い、有機合成に携わる当業者が、容易に実施する。主要な出発材料は、ポリエチレングリコールであり、好ましくは、これを使用前に乾燥および脱ガスする。これは、気泡の形成が停止するまで、高温で、融解したＰＥＧを真空下で撹拌することにより、便宜的に実施する。これは、ＰＥＧの質により異なるが、８〜１２時間かかる場合がある。乾燥した時点で、ＰＥＧは、アルゴン下で永久保存することができる。市販の工業および研究等級のＰＥＧを、本発明のポリマーの作製に用いることができる（例えば、１４３０〜１５７０の分子量分布を有する、商業用の多分散「ＰＥＧ １５００」）。かかる材料は、ビスフェノールＡジグリシジルエーテルを組み込んでいる場合があり、これは、ＰＥＧ鎖の中心で２級ヒドロキシル基を導入する。本発明のポリマーが最も再生可能で均一な品質を有することを確証するために、該ＰＥＧは、ビスフェノールＡを含まず、低分散性でないことが好ましい。Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（旧Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ ＡＬ， ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｕｒｅ ＡＳ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）から市販されるもの等の、＞９５％単分散のＰＥＧポリマーが最も好ましい。特に好ましいＰＥＧの例は、Ｐｏｌｙｐｕｒｅの「ＰＥＧ−２８」であり、これは、＞９５％ＨＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）2SＨ、分子量は１２５２である。
【００８９】
すべての反応は、磁気または好ましくは、機械的撹拌を使用し、窒素またはアルゴン等の不活性雰囲気下で実施する。
【００９０】
ステップＡにおいて、無水ＰＥＧを融解し、無水マレイン酸（ＰＥＧモルあたり２モル）を撹拌しながら添加する。無水マレイン酸の量は、ＰＥＧ末端のヒドロキシル基の数にできるだけ一致させるべきである。無水マレイン酸の不足は、ヒドロキシル末端ポリマー鎖をもたらす一方で、無水マレイン酸の過剰は、次のステップにおいてチオール基を消費し、早期の連鎖停止および末端カルボキシル基をもたらす。反応温度は臨界温度ではなく、該プロセスは、４５℃〜１００℃の温度で簡便に行うことができる。好ましい反応温度は、６５℃〜９０℃である。高温を用いる場合、無水マレイン酸は、昇華する傾向があり、諸ステップは、無水マレイン酸が溶液に残存していることを確認して行わなければならない。ヘッドスペースを最小化し、反応容器を油浴の反応槽に浸すことが、効果的な方法である。
【００９１】
選択した温度によっては、該反応は２時間以内に完了する、もしくは終夜実施することができる。該反応はシリカゲルプレート上のＴＬＣで監視することができ、該反応は、無水マレイン酸が消失した後まで継続する。視覚コントラスト、ＵＶ、およびヨード染色はすべて、該ＴＬＣプレートを試験するために使用することができる。
【００９２】
ステップＢにおいて、ステップＡで生成した粗ＰＥＧビス−マレイン酸塩エステルを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）（流動性に関して必要な場合は、水を添加）に合わせ、混合液を７０℃で撹拌する。該反応は、粘度の急増によって示されるように、３０分以内に完了する。ＤＴＴを最適量よりも多く、または少なく使用する場合、生成物の分子量は減少する。該生成物の分子量はまた、所望に応じて、ＴＥＭＥＤをＴＥＡなどの効果の弱い第３アミン塩基で置換することにより、減少させることができる。
【００９３】
ステップＣにおいて、十分な水を反応混合物に添加し、粘度を低下させ、ポリマー中にカルボキシル酸基の１モルあたり０．１モルのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１．０５モルのヘキサデシルアミンを添加する。（この量のＮＨＳは、副反応の範囲を最適に最小化すると考えられる。）次いで、過剰なＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）（カルボン酸基１モルあたり１．４モルのＥＤＣ）を少しずつ添加し、必要に応じて、追加の水を添加し、撹拌を維持する。該反応混合液のｐＨは、７以上、好ましくは、９〜１１に維持し、アルキルアミンンの反応性を最適化する。ドデシルアミンでは、この反応は、約４０〜４５℃で行うことができるが、オクタデシルアミンでは、温度は約５５℃〜５７℃である。該反応の後、一定レベルの残留アルキルアミンを認める（典型的には、終夜実行した後）まで、ＴＬＣを行う。
【００９４】
反応混合液を、ｐＨ約３．０から約４．５に酸性化し、室温で最大約２４時間撹拌して、未反応のＥＤＣを破壊し、その後、１Ｎ ＮａＯＨおよび／またはＴＥＭＥＤを使用して、ｐＨ７．０まで滴定する。該最終反応混合液を約８００ｘｇで１〜３時間、遠心分離機で分離し、固体混入物質および副生成物を除去する。
【００９５】
遠心分離後、上清は、ＧＰＣカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）、Ｂｉｏｇｅｌ（商標）等）でクロマトグラフィを行うことができる。πポリマーは両親媒性材料であるが、一部のＧＰＣカラム充填剤に親和性を呈し、これは、混入物質の除去を複雑にする。代替として、該ポリマーは、大孔疎水性相互作用カラム（例えば、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）Ｐｈｅｎｙｌ ６５Ｃ、Ｔｏｓｈｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）でクロマトグラフィを行い、水中のメタノールの勾配で溶出できる。好ましくは、酸性の水および中性の水を何回か交換することによって、該反応混合液を透析し、低分子量の出発材料および反応副生成物を除去する。
【００９６】
反応混合液はまた、ブタノン、イソプロパノール、ブタノールまたは他の極性有機溶媒で抽出し、有機不純物を除去することができるが、相当量の両親媒性高分子が、抽出溶媒に放出される。好ましくは、反応混合物は、限外濾過を行い、好適な細胞膜を使用して、使用する濾過膜の分画に応じて、５ｋＤａ〜１０ｋＤａ、１０ｋＤａ〜３０ｋＤａ、３０ｋＤａ〜５０ｋＤａ等の分子量に生成物を分画する。該ポリマーの水溶液は、濾過膜または培地の選択に応じて、滅菌溶液またはウイルス遊離溶液を生成するために全量濾過に供することができる。
【００９７】
２．πポリマーの合成
実施例１：ＰＥＧ−ジ（アルキルアミドスクシニル）ジチオエーテル中間分子量ポリマー（Ｃ１６−πポリマーＡ）
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−１５００、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を、気泡の形成が停止するまで、８０℃で真空下で乾燥させた（８〜１２時間、該ＰＥＧの質による）。乾燥させたＰＥＧは、アルゴン下で乾燥させ永久保存することができる。
【００９８】
乾燥させた該ＰＥＧを油浴でアルゴン下で融解し、無水マレイン酸（ＰＥＧ１モルあたり２モル、純度に対して補正）を撹拌しながら徐々に添加した。該混合液をアルゴン下で９０℃で撹拌した。無水マレイン酸は、昇華する傾向があるので、ヘッドスペースを最小化し、全反応容器を反応温度に維持した。容器壁上のいかなる濃縮した無水マレイン酸をも擦り取り、反応混合液に戻した。該反応の進行は、別々に溶媒として、エタノールおよびヘキサンを使用して、ＵＶ視覚化およびヨード染色を用いて、シリカゲルプレート上のＴＬＣで監視した。該反応を無水マレイン酸の消失後１時間継続した。
【００９９】
該粗ＰＥＧジマレイン酸エステルを２容積の水で希釈した。次いで、水（ＴＥＭＥＤの容積あたり２容積の水）中のジチオスレイトール（ＤＴＴ、当量のＰＥＧあたり１．０１当量）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−エチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ、１．０２当量）の溶液を、撹拌しながら反応混合液に添加した。該反応溶液を７０℃でアルゴン下で２．５時間撹拌し、終夜室温に放置し、その後、再び７０℃で２時間撹拌した。該反応溶液をＴＬＣで監視し、ＤＴＴが完全消失したら完了したと判断した。
【０１００】
該混合液を撹拌できるまで（約２５％の固体）、水を上記の反応混合液に添加し、粘度を減少させ、該混合液を６５℃でアルゴン下で撹拌し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ジマレイン酸ＰＥＧ−ＤＴＴポリマー中カルボン酸基１モルあたり０．１モル）を添加し、その後、ヘキサデシルアミン（ポリマー中カルボン酸基１モルあたり１．０５モル）およびＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ、ポリマー中カルボン酸基１モルあたり０．５６モル）を添加した。該混合液をアルゴン下で１時間撹拌し、ＥＤＣの第２の部分（ポリマー中カルボキシル酸基の１モルあたり０．５６モル）を添加した。１時間後、ＥＤＣの第３の部分（１モルのカルボキシル酸あたり総量の１．４モルのＥＤＣに対して、ポリマーにおいてカルボキシル酸基の１モルあたり０．２８モル）をさらに添加し、加水分解のＥＤＣの消失の原因となった。追加の固体により懸濁液を撹拌しづらくなる場合、必要に応じて追加の水を添加し、流動性を維持し、必要に応じて、１Ｎ ＮａＯＨまたは１Ｎ ＨＣｌを添加することによって、ｐＨを３．５〜７．５（好ましくは４．５〜６．５）に維持した。該混合液を６５℃でアルゴン下で終夜撹拌し、アルキルアミンが安定した濃度に到達したと考えられるまで、ＴＬＣ（シリカゲル、エタノールで展開）で監視し、その後、さらに４時間撹拌した（ドデシルアミンで、この反応を約４０〜４５℃で行なって、一方オクタデシルアミンで、温度は好ましくは５５〜５７℃であった。）次いで、該反応混合液を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ約４．０〜４．５に酸性化し、２４時間撹拌して、未反応のＥＤＣを破壊し、１Ｎ ＮａＯＨの滴下添加によって、ｐＨ７．０に調節した。
【０１０１】
該混合液を遠心瓶に移し、約８００ｘｇで２時間卓上遠心分離機で回転させ、残留固体を分離した。遠心分離後、該反応混合液をイソプロパノールで抽出し、有機不純物を除去した。イソプロパノール抽出の代替物としては限外濾過が好ましい。
【０１０２】
本方法により、以下のアミノ化合物をポリマーに共役する。
実施例１ａ：ウンデシルアミン
実施例１ｂ：オクタデシルアミン
実施例１ｃ：４−ノニルベンジルアミン
実施例１ｄ：３−［（４−フェノキシ）フェニル］プロピルアミン
【０１０３】
実施例１ｅ：ＰＥＧ−ジ（アルキルアミドスクシニル）ジチオエーテル（スキーム９代替経路によるＣ１６−π−ポリマーＡ）
実施例１に説明するとおり、ＰＥＧ（１．５ｋＤ、上記に説明するとおり脱ガスおよび乾燥）を、過剰な無水マレイン酸（ＰＥＧ１モルあたり２．２モル当量超）と、溶融条件下で反応させ、反応生成物を水に溶解し、１ｋＤ分画膜を使用して、水に対して透析した。残留物をほぼ乾燥するまで蒸発させて、アミド化に好適なジマレイン酸ＰＥＧを得た。
【０１０４】
最小容積の水（ジマレイン酸ＰＥＧ２部あたり水約１部）に溶解したジマレイン酸ＰＥＧを、反応瓶中、アルゴン下で７０〜８０℃に加熱した。ｐＨはＴＥＭＥＤで５．０〜５．５に調節した。この溶液に、７０〜８０℃の、ジマレイン酸ＰＥＧ繰り返し単位のモルあたり、２モル当量のヘキサデシルアミンを添加した。次いで、最小容積の水中、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ジマレイン酸ＰＥＧ１モルあたり２モル当量）の溶液を添加し、その後、ゆっくりとＥＤＣ−ＨＣｌ（ジマレイン酸ＰＥＧ１モルあたり３モル当量）の水溶液を添加した。ＴＬＣ（シリカゲル、展開用にＥｔＯＨ）が反応の完了を示すまで（ヘキサデシルアミンのスポットが無変化または存在しない）、該混合液を７０〜８０℃で撹拌した。該反応混合液を冷却し、過剰なカルボジイミドを、ｐＨが２．５〜３．０で安定するまで、酢酸を添加することによって、破壊した。生成物を、最初に水性ＥｔＯＨ、次に水に対して、透析すること、あるいは、イソプロパノールで沈殿することによって精製した。
【０１０５】
このように形成されたＰＥＧジアミドを水に溶解し、該反応混合液のｐＨをＴＥＭＥＤで６．５〜９に調節し、温度を６０〜７０℃に上げた。ＤＴＴ（ＰＥＧジアミド１モルあたり１．２モル当量）の溶液を添加し、該反応混合液を終夜撹拌した。過剰なチオールを、化学量論的当量のクロロアセトアミドおよびＴＥＭＥＤで反応停止し、負のエルマン試験を行った。次いで、該生成物を水に対して透析することによって精製し、残留物を蒸発することによって濃縮した。
【０１０６】
実施例２；ＰＥＧ−ジ（アルキルアミドスクシニル）ジチオエーテル高分子量ポリマー
無水マレイン酸１モルのあたり０．５５モルのＤＴＴおよび０．５５モルのＴＥＭＥＤを使用したことを除いては、実施例１に概略した手順に従った。粘度が急速に増加する場合、激しい撹拌が必要であった。反応のほとんどは、５〜１０分内に完了し、その後、温度が５５℃から８０℃に上昇するにつれて、次の４時間でゆっくりと完了するようであった。
【０１０７】
実施例３：ＰＥＧ−ジ（アルキルアミドスクシニル）ジチオエーテルポリマー
ポリマー中、カルボキシル酸基１モルあたり１．５モルのドデシルアミンを使用することを除いては、実施例１に概略した手順に従った。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、カルボン酸基１モルあたり１．０モル）および１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、カルボン酸基１モルあたり３．０モル）を添加し、反応物を８０℃で４時間撹拌し、上記のとおり調製した。
【０１０８】
本方法により、以下のアミノ化合物をポリマーに共役する。
実施例３ａ：ウンデシルアミン
実施例３ｂ：テトラデシルアミン
実施例３ｃ：オクタデシルアミン
実施例３ｄ：デヒドロアビエチルアミン
実施例３ｅ：コレステロール２−アミノエチルエーテル
実施例３ｆ：１０−フェノキシデシルアミン
実施例３ｇ：セバシン酸ヒドラジド
実施例３ｈ：オレイン酸ヒドラジド
実施例３ｉ：デヒドロアビエチン酸ヒドラジド
実施例３ｊ：コール酸ヒドラジド
実施例３ｋ：パルミチン酸ヒドラジド
【０１０９】
実施例４：ＰＥＧ−コ−（アルキルコハク酸アミド）ポリマー
無水ジエチルエーテル（１０ｍｌ）中、ＰＥＧ（６．６６ミリモル）およびトリエチルアミン（２．３２ｍｌ、１６．６５ミリモル）の溶液をアルゴン下で０℃に冷却し、塩化メタンスルホニル（１．０３ｍｌ、１３．３２ミリモル）で滴下処理した。撹拌は、０℃で１時間、次いで室温で２時間継続する。エーテルを蒸発させ、無水アセトン（１５ｍｌ）を残渣に添加し、トリエチルアミン塩酸塩を沈殿させ、これを溶液から濾過する。濾液を臭化リチウム（２．３１ｇ、２６．６４ミリモル）で処理し、加熱して、２０時間還流させた。次いで、該混合液をヘキサンで希釈し、Ｃｅｌｉｔｅ（商標）（０．５ｃｍ）で被覆したシリカのショートカラム（３ｃｍ）で濾過し、ヘキサンで溶出する。該濾液を乾燥させ、濾過し、蒸発させて、油としてα，ω−ジブロモ−ＰＥＧを得た。
【０１１０】
α，ω−ジブロモ−ＰＥＧを、Ｇｏｄｊｏｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３７：４３３−６（１９９６）の方法によって、１当量の２，２−ジブチル−４，５−ビス（メトキシカルボニル）−ｌ，３，２−ジオキサスタンノランと反応させる。得られる酒石酸ジメチル−ＰＥＧポリエーテルをメタノールのＫＯＨで鹸化し、その後、上記の実施例１および３に記載のとおり、ドデシルアミンまたはヘキサデシルアミン、または実施例３ａ〜３ｋのアミンでアミド化する。
【０１１１】
実施例５：ＥＤＴＡ二無水物とのＰＥＧ共重合
実施例１に説明する方法で、無水ＰＥＧをエチレンジアミンテトラ酢酸二無水物と反応させ、その後、実施例１に説明するドデシルアミンと、または実施例３に説明するヘキサデシルと、または実施例３ａ〜３ｋに説明するアミンでアミド化する。
【０１１２】
同様に、以下の二無水物をＰＥＧと共重合させ、その後アミド化する。
実施例５ａ：ナフタレンテトラカルボン二無水物
実施例５ｂ：ペリレンテトラカルボン二無水物
実施例５ｃ：ベンゾフェノンテトラカルボン二無水物
実施例５ｄ：４，４’−（ヘクサフルオロイソプロピリジン）ジフタル酸無水物
実施例５ｅ：ブタンテトラカルボン酸二無水物
実施例５ｆ：ビシクロ（２，２，２）オクト−７−エン−２，３，５，６−テトラカルボン二無水物
実施例５ｇ：ジエチレンテトラミンペンタ酢酸二無水物
実施例５ｈ：３，４，３’，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボン酸二無水物
実施例５ｉ：３，４，３’，４−ジフェニルエーテルテトラカルボン酸二無水物
実施例５ｊ：ピロメリト酸二無水物
【０１１３】
実施例６Ａ：ペンダントチオエーテルとのＰＥＧ−ジアミンコポリマー
実施例１のとおりに調製したＰＥＧジマレイン酸エステルを実施例１のＤＴＴに使用した同様の手順を使用して、ドデカンチオール（ＰＥＧジマレイン酸エステル１当量あたり２当量）と反応させる。ＴＥＭＥＤ触媒を添加してから、チオールを添加する。ＴＬＣを使用して、出発材料の消失後、反応を行う。蒸発によるアルキルチオールの損失が著しくなるポイントまでの温度を用いることができる（最大約１００℃）。わずかな過剰アルキルチオールを、マレイン基を完全に飽和するために使用してもよい。臭気またはＴＬＣで何も検出されなくなるまで、過剰なアルキルチオールを窒素またはアルゴンで散布および／または真空下で加熱することにより、反応終了時に除去する。
【０１１４】
本方法により、以下のチオールをＰＥＧジマレイン酸エステルに共役することができる。
実施例６Ａａ：メルカプトコハク酸ジ−ｔ−ブチルエステル
実施例６Ａｂ：テトラデカンチオール
実施例６Ａｃ：ヘクサデカンチオール
実施例６Ａｄ：２−メルカプトエタンスルホン酸
実施例６Ａｅ：３−メルカプトプロパンスルホン酸
実施例６Ａｆ：６−メルカプトヘキサン酸ｔ−ブチルエステル
実施例６Ａｇ：４−メルカプト安息香酸ｔ−ブチルエステル
実施例６Ａｈ：メルカプト酢酸ｔ−ブチルエステル
実施例６Ａｉ：４−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブタンチオール
実施例６Ａｊ：３−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ベンジルメルカプタン
実施例６Ａｋ：４−デシルベンジルメルカプタン
【０１１５】
反応官能基を有するチオールは、Ｃ鎖の結合に好適である、および／または反応官能基は、標的部分に対する結合点（Ｘ）としての役割を果たすことができる。
【０１１６】
実施例６Ｂ：ペンダントチオエーテルとのＰＥＧ−ジアミンコポリマー
【０１１７】
【化１６】
【０１１８】
実施例６Ａで得られたチオール付加物を、実施例１のドデシルアミンに使用した同一の手順を使用して、１，４−ジアミノブタン（２つのＣＯＯＨ基あたり１当量のジアミン）でアミド化し、反応混合液の流動性の維持に必要な場合、水によって希釈する。ＥＤＣの追加の一定分量を必要に応じて添加し、完全重合を確保する。本方法により、実施例６Ａおよび６Ａａ〜６Ａｋのチオール付加物をＰＥＧ−ジアミノブタンポリアミドに変換する。
【０１１９】
本方法により、以下のジアミンを、ＰＥＧポリアミドに変換することができる（ＢＯＣ＝ｔ−ブトキシカルボニル）。
実施例６Ｂａ：２−（Ｏ−ＢＯＣ）−１，３−ジアミノ−２−プロパノール
実施例６Ｂｂ：Ｎ’，Ｎ’’−ジ（ＢＯＣ）ヘクサエチレンテトラアミン
実施例６Ｂｃ：Ｎ’，Ｎ’’−ジ（ＢＯＣ）スペルミン
実施例６Ｂｄ：Ｎ’−ＢＯＣスペルミジン
実施例６Ｂｅ：Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−トリ（ＢＯＣ）ペンタエチレンヘキサミン
実施例６Ｂｆ：アグマチン
実施例６Ｂｇ：リシンｔ−ブチルエステル
実施例６Ｂｈ：１，６−ジアミノヘキサン
実施例６Ｂｉ：１，４−フェニレンジアミン
実施例６Ｂｊ：１，３−フェニレンジアミン
実施例６Ｂｋ：１，４−ジアミノブタン−２，３−ジオールアセトニド
【０１２０】
実施例７：ＰＥＧ−ジ（アルキルコハク酸）ジチオエーテル
【０１２１】
【化１７】
【０１２２】
ＤＴＴの２，３−ビス−Ｏ−ヘキサデシルエーテル（メソ−２，３−ビス（ヘキサデシルオキシ）ブタン−１，４−ジチオール）を、Ｓ．Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３３（１０）：４２４７−４２６６（１９８５）の手順を修正して調製する。これを実施例１の方法によってジマレイン酸ＰＥＧに添加する。
【０１２３】
本方法により、以下のエーテルジチオールをＰＥＧポリマーに共役する。
実施例７ａ：メソ−２，３−ビス（ｎ−ブトキシ）ブタン−１，４−ジチオール
実施例７ｂ：メソ−２，３−ビス（４−ノニルフェニルメトキシ）ブタン−１，４−ジチオール
実施例７ｃ：メソ−２，３−ビス（ビフェニル−４−メトキシ）ブタン−１，４−ジチオール
実施例７ｄ：４，６−ビス（デシルオキシ）ベンゼン−１，３−ジメタンチオール
実施例７ｅ：４，５−ビス（デシルオキシ）ベンゼン−１，２−ジメタンチオール
実施例７ｆ：３，４−ビス（デシルオキシ）チオフェン−２，５−ジメタンチオール
【０１２４】
実施例８Ａ：置換コハク酸ＰＥＧ
２−ドデセン−１−イル無水コハク酸を無水マレイン酸の代わりに使用することを除いては、実施例１の方法に従う。ドデセニル置換基は、最終ポリマーにおいてペンダントＣ鎖を提供する。
【０１２５】
本方法により、以下の置換無水コハク酸をＰＥＧでエステル化する。
実施例８Ａａ：無水イソブテニルコハク酸
実施例８Ａｂ：２−オクテン−ｌ−イル無水コハク酸
実施例８Ａｃ：無水オクタデセニルコハク酸
実施例８Ａｄ：３−オキサビシクロ−ヘキサン−２，４−ジオン
実施例８Ａｅ：無水シクロヘキサンジカルボン酸
実施例８Ａｆ：無水フタル酸
実施例８Ａｇ：４−デシル無水フタル酸
実施例８Ａｈ：ヘクサヒドロメチル無水フタル酸
実施例８Ａｉ：テトラヒドロ無水フタル酸
実施例８Ａｊ：無水ノルボルネンジカルボン酸
実施例８Ａｋ：カンタリジン
実施例８Ａｌ：無水ビシクロオクテンジカルボン酸
実施例８Ａｍ：エキソ−３，６−エポキシ−１，２，３，６−無水テトラヒドロフタル酸
実施例８Ａｎ：Ｓ−無水アセチルメルカプトコハク酸
【０１２６】
実施例８Ｂ：ペンダントアルキル基を有するＰＥＧ−ジ（アルキルアミドスクシニル）ジチオエーテル
実施例１の方法により、実施例８Ａおよび８Ａａ〜８Ａｎに説明するとおり得た置換コハク酸ＰＥＧをＤＴＴと反応させる。
【０１２７】
本方法により、以下のジチオールを実施例８Ａおよび８Ａａから８Ａｎに説明するとおりに得た置換ＰＥＧコハク酸エステルのいずれかと反応させる。
実施例８Ｂａ：エタン−１，２−ジチオール
実施例８Ｂｂ：プロパン−１，３−ジチオール
実施例８Ｂｃ：ブタン−１，４−ジチオール
実施例８Ｂｄ：ペンタン−１，５−ジチオール
実施例８Ｂｅ：ヘキサン−１，６−ジチオール
実施例８Ｂｆ：１，４−ベンゼンジチオール
実施例８Ｂｇ：１，３−ベンゼンジチオール
実施例８Ｂｈ：１，４−ベンゼンジメタンチオール
実施例８Ｂｉ：１，３−ベンゼンジメタンチオール
実施例８Ｂｊ：１，２−ベンゼンジメタンチオール
【０１２８】
実施例８Ｃ：ペンダントアルキル基を有するＰＥＧ−ジアミンコポリマー
実施例６Ｂの方法により、実施例８Ａに説明するとおり得た置換コハク酸ＰＥＧを、１，４−ジアミノブタンで共重合する。
【０１２９】
本方法により、以下のジアミンを実施例８Ａおよび８Ａａから８Ａｎのうちの置換ＰＥＧコハク酸エステルのいずれかと共重合させる。
実施例８Ｃａ：２Ｏ−ＢＯＣ１，３−ジアミノ−２−プロパノール
実施例８Ｃｂ：Ｎ’，Ｎ’’−ジ（ＢＯＣ）ヘクサエチレンテトラアミン
実施例８Ｃｃ：Ｎ’，Ｎ’’−ジ（ＢＯＣ）スペルミン
実施例８Ｃｄ：Ｎ’−ＢＯＣスペルミジン
実施例８Ｃｅ：Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−トリ（ＢＯＣ）ペンタエチレンヘキサミン
実施例８Ｃｆ：アグマチン
実施例８Ｃｇ：リシンｔ−ブチルエステル
実施例８Ｃｈ：１，６−ジアミノヘキサン
実施例８Ｃｉ：１，４−フェニレンジアミン
実施例８Ｃｊ：１，３−フェニレンジアミン
実施例８Ｃｋ：１，４−ジアミノブタン−２，３−ジオールアセトニド
【０１３０】
実施例９：置換酸を使用したＰＥＧ Ｔｒａｎｓ−エステル化
ＰＥＧジトシレート：１モルのＰＥＧ（ＤＭＦに溶解またはそのまま融解）に、アルゴン下で撹拌しながら、２．１モルの塩化トシル（５％モル過剰）を添加した。この反応混合物に、２．２モルのテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を添加した。次いで、反応物を４５℃で２時間インキュベートした。ＴＬＣを使用して、ＴＬＣ溶媒として、エチルアセテート、トルエン、またはエタノールを用いて、生成物を分離した。ＰＥＧトシル酸をトルエンとの反応混合液から抽出することができる。トルンスルホニルクロリドの代わりに、メシルクロリド（実施例４を参照）、トリフリック酸無水物、またはトレシルクロリドなどの他のスルホニル剤をまた使用することもできる（米国特許出願第１０／３９７３３２号、米国特許第２００４０００６０５１号を参照）。
【０１３１】
ＰＥＧジトシレートのポリエステル化：１モルの融解ＰＥＧ−ジトシレートに、アルゴン下で撹拌しながら、１モルのＳ，Ｓ’−ジデシル−メソ−２，３−ジメルカプトコハク酸、および２モルのＴＥＭＥＤを添加する。流動性を維持する必要がある場合、ＤＭＦを添加する。反応混合液を８０℃に加熱し、２４時間、またはＴＬＣにより反応が完了するまで、撹拌する。
【０１３２】
実施例１０：ＰＥＧ−ジ（スクシニル）−ジ−（Ｏ−アシル化）チオエーテル中分子量ポリマー（Ｃ１６−πポリマーＢ）
【０１３３】
【化１８】
【０１３４】
実施例１のとおりに調製したジマレイン酸ＰＥＧ（１０．２４ｇ、６．１ミリモル）を、乾燥した１２５ｍｌフラスコに入れ、アルゴン下で７０℃に加熱し、ジマレイン酸ＰＥＧを融解した。この融解した材料に、撹拌しながら、水（１０ｍＬ）、ならびに水（３ｍＬ）中ＤＴＴ（０．９６１ｇ、６．１６８ミリモル）およびＴＥＭＥＤ（０．７２３ｇ、６．１６６ミリモル）の溶液を添加した。この溶液を７０℃で約４時間撹拌した。真空下で水を除去することにより、収率約９０％で固体ポリマーを得た。
【０１３５】
乾燥させたポリマー（５ｇ、２．７ミリモル）を７０〜９０℃にアルゴン下で加熱し、融解して、ＴＥＭＥＤ（０．６３５ｇ、５．５ミリモル）を添加した。塩化パルミトイル（１．６８９ｇ、５．５ミリモル）を撹拌しながら添加し、混合液をアルゴン下で終夜撹拌した。（塩化アシルに対するポリマーの比率は、０〜１００％の化学量の置換度を得るように変化し得る。）水を反応混合液に添加し、「Ｃ１６−πポリマーＢ」を単離した。
【０１３６】
本方法により、以下の酸を、ジ（スクシニル）ＰＥＧ−ＤＴＴコポリマーのヒドロキシル基でエステル化する。
実施例１０ａ：オレイン酸
実施例１０ｂ：コハク酸コレステリル
実施例１０ｃ：ビフェニル−４−カルボン酸
実施例１０ｄ：４−オクチルフェニル酢酸
実施例１０ｅ：ヘクサデス−６−イン酸
【０１３７】
酸ハロゲン化物の使用の代替として、πポリマーのＤＴＴ由来ヒドロキシル基を、１，３−ビス（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イルメチル）カルボジイミド（ＢＤＤＣ）で活性化し、カルボン酸と直接結合させることできる。Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｅｄ．Ｄａｖｉｄ Ｃｒｉｃｈ，Ｗｉｌｅｙ，２００５ ｐ１０７−１０８、およびその中の参考文献を参照されたい。）。
【０１３８】
実施例１１：Ｃ１６−πポリマーＡのカルボキシル置換エステル
カルボン酸置換ポリマーは、標準的なペプチド結合形成方法（例えば、カルボジイミド試薬により）を使用して、反応アミノ基を有するリガンドに結合し、アミノ基をポリマーのカルボン酸官能基に結合させるために使用する。これらの材料は、環状無水物によるπポリマーヒドロキシル基のエステル化により用意に得られる。例えば、ジマレイン酸Ｃ１６−πポリマーＡは、以下のとおりに、無水マレイン酸をＣ１６−πポリマーＡヒドロキシル基と反応させることにより調製した。
【０１３９】
Ｃ１６−πポリマーＡ（２ｇ）および無水マレイン酸（０．８５ｇ）を乾燥乳鉢ですりつぶし、５０ｍＬ丸底フラスコに移した。該フラスコを、９０℃でアルゴン下で２〜３時間、撹拌しながら加熱した。その後、固体反応混合物を細かくし、水でスラリにし、混合物を透析袋（３．５ｋＤａ分画）に移した。混合物を水に対して透析して、過剰なマレイン酸および低分子量の副生成物を除去し、残留物を透析袋から除去し、６０℃で一定量になるまで乾燥して、ジマレイン酸Ｃ１６−πポリマーＡ（１．７９ｇ）を得た。ポリマーと無水マレイン酸の割合は、０〜１００％の完全化学量のエステル化の置換を得るために変更することが可能である。
【０１４０】
実施例１１ａ：Ｃ１６−πポリマーＡジグリコール塩酸
Ｃ１６−πポリマーＡ（２ｇ）および無水ジグリコール酸（１．０ｇ）を上記実施例１１の方法によって反応させ、Ｃ１６−πポリマーＡジグリコール塩酸を得た。無水マレイン酸と同様に、ポリマーＡと無水物の比率は、０〜１００％の完全化学量のエステル化の置換を得るように変化させることができる。
【０１４１】
実施例１１ｂ：Ｃ１６−π−ポリマーＡビス（アコニット酸）
Ｃ１６−πポリマーＡ（２ｇ）および無水アコニット酸（１．３５ｇ）を、上記実施例１１の方法によって反応させ、Ｃ１６−πポリマーＡビス（アコニット酸）を得た。
【０１４２】
同様に、以下の無水物をＣ１６−πポリマーＡに結合させる。低可溶性の無水物を使用する際、ｐＨは精製の補助として、透析の前に４．５〜６．５に調節することができる。０．１Ｎ ＨＣｌに対する第２の透析により、所望に応じて、ポリマーの酸形態が生成する。
実施例１１ｃ：無水コハク酸
実施例１１ｄ：無水グルタル酸
実施例１１ｅ：無水フタル酸
【０１４３】
無水マレイン酸またはｃｉｓ−無水アコニット酸とのエステル化により導入した反応二重結合はまた、以下の実施例１２に説明するとおり、チオール含有リガンドをポリマーに添加するために使用することができる。
【０１４４】
実施例１２：ジマレイン酸Ｃ１６−πポリマーＡのシステイン付加物：
粉末化したジマレイン酸Ｃ１６−πポリマーＡ（実施例１１）（２５３ｍｇ）を水（５ｍＬ）に添加し、混合液を激しく撹拌した。システイン（２４ｍｇ）およびＴＥＭＥＤ（３０．５ｕｌ）を反応混合液に添加し、該混合液を室温でアルゴン雰囲気下で撹拌した。ニンヒドリンによる検出とともに、該反応の進行をＴＬＣ（シリカゲルプレート、ｎ−ブタノール−酢酸−水、３：１：１）で監視した。該反応混合液は、ポリマーとともに移動するニンヒドリン陽性スポットを示した。システインはまた、ニンヒドリン陽性スポットを示したが、出発ポリマーは、ニンヒドリンでいずれの色も示さなかった。
【０１４５】
上記に説明する方法は、多重カルボキシル置換基を有するチオールを使用して、結合点としての使用のために、追加のカルボキシル基を導入するために使用した。例えば、メルカプトコハク酸を以下のＣ１６−πポリマーＡジエステルに添加した。
実施例１２ａ：ジマレイン酸Ｃ１６−πポリマーＡ
実施例１２ｂ：ジアクリル酸Ｃ１６−πポリマーＡ
実施例１２ｃ：アコニット酸Ｃ１６−πポリマーＡ（ビス）
【０１４６】
【化１９】
【０１４７】
実施例１２ｃ
同様に、３−メルカプトグルタル酸を以下のＣ１６−πポリマーＡジエステルに添加した。
実施例１２ｄ：ジマレイン酸Ｃ１６−πポリマーＡ
実施例１２ｅ：ジアクリル酸Ｃ１６−πポリマーＡ
実施例１２ｆ：アコニット酸Ｃ１６−πポリマーＡ（ビス）
【０１４８】
３．πポリマーへの標的部分の結合
実施例１：Ｃ１６−πポリマーＡへの葉酸の結合
葉酸（２ミリモル）を無水ＤＭＳＯ中で溶解し、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）と大気温度で反応させ、内部無水物を形成させた。次いで、この反応混合液に、等モル量のシステアミンＨＣｌおよびＴＥＭＥＤを添加し、ＴＬＣによって反応を監視しながら、反応混合液を大気温度で２４時間、アルゴン下で撹拌した。反応が完了した後、反応混合液を真空下で濾過し、反応副生成物を除去した。濾液をメタノールで希釈して、橙黄色の生成物を沈殿させた。沈殿物をメタノールでスラリにし、濾過して、残留するジシクロヘキシル尿素およびＤＭＳＯを除去した。葉酸−システアミン共役体（Ｓ．Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（３０）：２７９３０−２７９３５）に、Ｅｌｌｍａｎ試薬を用いた試験を行なった結果、遊離スルフヒドリル基の存在は陽性と出、ＴＬＣはシステアミンの存在を示さなかった。
【０１４９】
次いで、該葉酸−システアミン共役体を、アルゴン下で、Ｃ１６−πポリマーＡのジマレイン酸エステル（実施例１１、分子量約１５００を有するＰＥＧより調製）と反応させた。ポリマー凝集体の親水性を維持するために、５０％の利用可能なマレイン酸塩基のみを消費するのに十分な葉酸−システアミン共役体の量を、ポリマーに添加した。反応混合液のｐＨを、ＴＥＭＥＤで６．５〜７．５に調節し、該混合液をアルゴン雰囲気下で終夜撹拌した。次いで、該反応混合液を３．５ｋＤ分画膜で水に対して透析し、いかなる低分子量の副生成物および不純物をも除去した。保持液を除去し、以下に説明する薬物封入および細胞培養アッセイのために使用した。
【０１５０】
実施例２：Ｃ１６−πポリマーＡへの上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）の結合
上皮細胞増殖因子（Ｓｉｇｍａ）を、ｐＨ７．４のＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液中２当量の２−イミノチオラン（Ｓｉｇｍａ）でチオール化し、チオール化ＥＧＦを、実施例１に説明する方法によって、Ｃｌ６−πポリマーＡのジマレイン酸エステルに結合させた。該ＥＧＦ共役ポリマーを限外濾過によって濾過し、ＰＢＳで洗浄し、保持液を使用して、標的封入ポリマーを調製した。
【０１５１】
実施例３：Ｃ１６−πポリマーＡへの抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体の結合
腹水としてマウス抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を、製造元の指示により、ＡｆｆｉｎｉｔｙＰａｋ（商標）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｐｉｅｒｃｅ）カラムで、クロマトグラフィにより精製した。精製した抗体をチオール化し、実施例１に説明する方法によって、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液でＣ１６−πポリマーＡのジマレイン酸エステルに共役し、限外濾過によって濾過した。
【０１５２】
４．抗癌化合物の封入
実施例１：Ｃ１６−π−ポリマーＡへのカンプトセシンの封入：
カンプトセシン（１０ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）をＤＭＳＯ中で溶解し、ＤＭＳＯ中Ｃ１６−πポリマーＡ（１００ｍｇ、ＰＥＧ １．５ｋＤから派生）の溶液と混合した。ゲル状混合液を約１０〜３０分間超音波分解し、水で希釈し、遠心分離して、いかなる固体をも除去した。封入したカンプトセシンの存在について、透明な上清をＴＬＣで調べた結果陽性と出た。
【０１５３】
実施例２：Ｃ１６−πポリマーＡへのドキソルビシンの封入：
ドキソルビシンＨＣｌ（５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）を水で溶解し、当量のＴＥＭＥＤで処理して、塩酸塩を遊離アミン形態に変換した。次いで、得られた遊離アミン形態に、ＤＭＳＯ中Ｃ１６−πポリマーＡ（１００ｍｇ、ＰＥＧ １．５ｋＤ由来）の溶液を添加し、上記実施例１に説明するとおり、混合物を処理および試験した。
【０１５４】
実施例３：葉酸共役Ｃ１６−πポリマーＡへのカンプトセシンの封入：
ＤＭＳＯに溶解して、上記で合成した、葉酸πポリマーＡ共役体に、ＤＭＳＯ中のカンプトセシンの溶液を添加した。カンプトセシンとポリマーの重量で１：１０の比率をこの調製で使用した。得た混合物を上記実施例１のとおりに処理し、カンプトセシン封入についてアッセイは陽性と出た。
【０１５５】
実施例４：ＥＧＦ共役Ｃ１６−πポリマーＡへのカンプトセシンの封入：
上記実施例１および３に説明するものと同様に、ＥＧＦ共役Ｃ１６−πポリマーＡを使用して、カンプトセシンを封入した。
【０１５６】
実施例５：抗ＥＧＦＲ共役Ｃ１６−πポリマーＡへのカンプトセシンの封入：
上記実施例１および３に説明するものと同様に、マウス抗ＥＧＦＲ抗体に共役させたＣ１６−πポリマーＡを使用して、カンプトセシンを封入した。
【０１５７】
５．細胞増殖アッセイ
腫瘍細胞増殖アッセイで評価する前に、上記で調製した実施例を、以下に記載の組成物を有する初期濃度まで希釈した。
【０１５８】
ＣＰＴ＋πＰ
組成物： πポリマーと複合体を形成したカンプトセシン
繰り返し単位ｍｗ： ２２７８
リガンド： −
リガンドｍｗ： −
封入した薬物： カンプトセシン
薬物ｍｗ： ３４８
ポリマー濃度： ０．０３５ｍｇ／ｍｌ
繰り返し単位内１５．４μＭ
リガンド濃度： −
−
薬物濃度： ３．４８ｍｇ／ｍｌ
１０．０μＭ
【０１５９】
ＣＰＴ
組成物： カンプトセシン（対照）
繰り返し単位ｍｗ： −
リガンド： −
リガンドｍｗ： −
封入した薬物： カンプトセシン
薬物ｍｗ： ３４８
ポリマー濃度： −
リガンド濃度： −
薬物濃度： ３．４８μｇ／ｍｌ
１０．０μＭ
【０１６０】
ＤＯＸ＋πＰ
組成物： πポリマーと複合体を形成したドキソルビシン
繰り返し単位ｍｗ： ２２７８
リガンド： −
リガンドｍｗ： −
封入した薬物： ドキソルビシン
薬物ｍｗ： ５４４
ポリマー濃度： ０．０５４ｍｇ／ｍｌ
繰り返し単位中２３．７μｍ
リガンド濃度： −
−
薬物濃度： ５．４４μｇ／ｍｌ
１０．０μＭ
【０１６１】
ＤＯＸ
組成物： ドキソルビシン（対照）
繰り返し単位ｍｗ： −
リガンド： −
リガンドｍｗ： −
封入した薬物： ドキソルビシン
薬物ｍｗ： ５４４
ポリマー濃度： −
リガンド濃度： −
−
薬物濃度： ５．４４μｇ／ｍｌ
１０．０μＭ
【０１６２】
πＰ
組成物： πポリマー（対照）
繰り返し単位ｍｗ： ２２７８
リガンド： −
リガンドｍｗ： −
封入した薬物： −
薬物ｍｗ： −
ポリマー濃度： ０．０３５ｍｇ／ｍｌ
繰り返し単位中１５．４μｍ
リガンド濃度： −
−
薬物濃度： −
−
【０１６３】
ＣＰＴ＋ＦＡ−πＰ
組成物： 葉酸共役πポリマーと複合体を形成したカンプトセシン
繰り返し単位ｍｗ： ５３３８
リガンド： 葉酸
リガンドｍｗ： ４４１
封入した薬物： カンプトセシン
薬物ｍｗ： ３４８
ポリマー濃度： ０．０３１ｍｇ／ｍｌ
繰り返し単位中５．８１μＭ
リガンド濃度： ２．５６μｇ／ｍｌ
５．８１μＭ
薬物濃度： ３．４８μｇ／ｍｌ
１０．０μＭ
【０１６４】
ＦＡ−πＰ
組成物： 葉酸共役πポリマー（対照）
繰り返し単位ｍｗ： ５３３８
リガンド： 葉酸
リガンドｍｗ： ４４１
封入した薬物： −
薬物ｍｗ： −
ポリマー濃度： ０．０３１ｍｇ／ｍｌ
繰り返し単位中５．８１μｍ
リガンド濃度： ２．５６μｇ／ｍｌ
５．８１μＭ
薬物濃度： −
【０１６５】
ＦＡ
組成物： 葉酸（対照）
繰り返し単位ｍｗ： −
リガンド： 葉酸
リガンドｍｗ： ４４１
封入した薬物： −
薬物ｍｗ： −
ポリマー濃度： −
−
リガンド濃度： ４．４１μｇ／ｍｌ
１０．０μＭ
薬物濃度： −
−
【０１６６】
ＣＰＴ＋ＥＧＦ−πＰ
組成物： ＥＧＦ共役πポリマーと複合体を形成したカンプトセシン
繰り返し単位ｍｗ： ５３３８
リガンド： ＥＧＦ
リガンドｍｗ： ６０５２
封入した薬物： カンプトセシン
薬物ｍｗ： ３４８
ポリマー濃度： ０．０８６８ｍｇ／ｍｌ
繰り返し単位中１６．３μｍ
リガンド濃度： ９１０μｇ／ｍｌ
１５０μＭ
薬物濃度：９．０５μｇ／ｍｌ
２６．０μＭ
【０１６７】
ＥＧＦＲ Ａｂ−πＰ
組成物： 抗ＥＧＦＲ抗体共役πポリマー（対照）
繰り返し単位ｍｗ： ５３３８
リガンド： 抗ＥＧＦＲ抗体
リガンドｍｗ： １５０，０００
封入した薬物： −
薬物ｍｗ： −
ポリマー濃度： ０．１０６ｍｇ／ｍｌ
繰り返し単位中１９．９μｍ
リガンド濃度： ３，０００μｇ／ｍｌ
２０．０μＭ
薬物濃度： −
−
【０１６８】
ＣＰＴ＋ＥＧＦＲ Ａｂ−πＰ
組成物： 抗ＥＧＦＲ抗体共役πポリマーと複合体を形成したカンプトセシン
繰り返し単位ｍｗ： ５３３８
リガンド： 抗ＥＧＦＲ抗体
リガンドｍｗ： １５０，０００
封入した薬物： カンプトセシン
薬物ｍｗ： ３４８
ポリマー濃度： ０．１０６ｍｇ／ｍｌ
繰り返し単位中１９．９μｍ
リガンド濃度： ３，０００μｇ／ｍｌ
２０．０μＭ
薬物濃度： １１．０μｇ／ｍｌ
３１．６μＭ
【０１６９】
ＥＧＦ
組成物： ＥＧＦペプチド（対照）
繰り返し単位ｍｗ： −
リガンド： ＥＧＦ
リガンドｍｗ： ６０５２
封入した薬物： −
薬物ｍｗ： −
ポリマー濃度： −
−
リガンド濃度： ２００μｇ／ｍｌ
３３．０μＭ
薬物濃度： −
【０１７０】
指定した増殖培地とともに、以下の細胞株を用いた。Ａ５４９（Ｆ１２倍地）、ＭＤＡＭＢ２３１（Ｌｅｂｏｖｉｔｚ培地）、Ｈ４４１、ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３（ＲＰＭＩ培地）。腫瘍細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含む完全培地に、３０００細胞／ウェルで、９６ウェルプレートにプレートし、２４時間、３７℃でインキュベートした。プレートしてから２４時間後に、試験化合物を、３倍連続希釈して（上記に説明する原液の１０倍希釈で開始）ウェルに添加した。したがって、原液の被験希釈液は、１０：１、３０：１、および９０：１であり、相対濃度はそれぞれ１．００、０．３３、および０．１１であった。６つの試験材料が供給不足であったため、これらは、直接３０：１に希釈し、１０：１で試験は行わなかった。細胞を、試験化合物の添加後、完全増殖培地で、３７℃で７２時間インキュベートした。４日目に、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ（登録商標）アッセイキットを使用して、該細胞を溶解し、１００マイクロリットルの基質／緩衝液の混合液を各ウェルに添加し、混合し、室温で１５分間インキュベートした。該試料を照度計で読み取り、各ウェルから細胞溶解物に存在するＡＴＰの量を測定したが、これは、そのウェルの生存細胞数に対応する。
【０１７１】
各細胞株の結果を図１〜５に示す。１．００の相対濃度は、上記に説明する原液の１０倍希釈を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌薬を癌細胞に投与するための方法であって、前記癌細胞をくし型ポリマー内に封入した前記抗癌薬と接触させるステップを含み、前記くし型ポリマーは、本質的に以下の構造：
【化１】
からなり、骨格が交互する分岐点部分Ｂと親水性水溶性ポリマーブロックＡから形成され、前記分岐点部分に結合する疎水性側鎖Ｃおよび標的部分Ｚを有する骨格を含み、式中、
各疎水性側鎖Ｃは、独立して、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30直鎖もしくは分岐鎖炭化水素、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素、ならびに疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーから選択され、
各標的部分Ｚは、独立して、前記癌細胞の表面に対する特異的結合親和性を有するリガンドであり、
ｓは結合またはスペーサ部分であり、
ｎの値は、１から約１００の範囲であり、
ｐの平均値は、１より大きく４までの範囲であり、
ｒの平均値は、０から８の範囲である、方法。
【請求項２】
ｎは２から約１００の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの標的部分は、受容体特異的リガンド、抗体、抗体フラグメント、および増殖因子からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの標的部分は、受容体特異的リガンド、抗体、抗体フラグメント、および増殖因子からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記リガンドは、上皮細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、葉酸、メトトレキサート、プテロイン酸、エストラジオール、エストラトリオール、テストステノン、マンノース−６−リン酸、ならびにＮＣＡ９０、ＮＣＡ９５、ＣＥＡ、ＣＤ１５、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＶＧＥＦ、またはＥＧＦＲに対する抗体および抗体フラグメントからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドは、上皮細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、葉酸、メトトレキサート、プテロイン酸、エストラジオール、エストラトリオール、テストステノン、マンノース−６−リン酸、ならびにＮＣＡ９０、ＮＣＡ９５、ＣＥＡ、ＣＤ１５、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＶＧＥＦ、またはＥＧＦＲに対する抗体および抗体フラグメントからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記抗癌薬は、ドキソルビシン、カンプトセシン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、イリノテカン、イマチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、アクシチニブ、パゾパニブ、エトポシド、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、スタウロスポリン、シタラビン、メルファラン、ロイロシン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＤ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、シスプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、レチノイン酸、およびタモキシフェンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗癌薬は、ドキソルビシン、カンプトセシン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、イリノテカン、イマチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、アクシチニブ、パゾパニブ、エトポシド、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、スタウロスポリン、シタラビン、メルファラン、ロイロシン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＤ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、シスプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、レチノイン酸、およびタモキシフェンからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリマーブロックＡは、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、およびこれらのコポリマーからなる群より選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマーブロックＡは、４から７００モノマー単位の平均長を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリマーは、以下の構造：
【化２】
（式中、ｍは４〜７００であり、ＹおよびＹ’は、独立して、Ｒ、ＯＲ、ＣＯＯＲ、ＳＲ、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＯＮＨＲ、ＮＨＯＲ、ＮＲＮＨ2、ＮＨＮＨＲ、ＮＲＮＨＲ’、およびＮＨＮＲＲ’からなる群より選択され、ＲおよびＲ’は、独立して、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30分岐鎖もしくは直鎖炭化水素、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素、ならびに疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーからなる群より選択される）
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリマーは以下の構造：
【化３】
（式中、ｍは４〜７００であり、ＷはＯまたはＮＨであり、ＹおよびＹ’は、独立して、Ｒ、ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、ＣＯＮＨＯＲ、ＣＯＮＲＮＨ2、ＣＯＮＨＮＨＲ、ＣＯＮＲＮＨＲ’、およびＣＯＮＨＮＲＲ’からなる群より選択され、ＲおよびＲ’は、独立して、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30分岐鎖もしくは直鎖炭化水素、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素、ならびに疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーからなる群より選択される）
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリマーは、以下の構造：
【化４】
｛式中、部分Ｄは、以下の一般構造：
【化５】
（式中、各Ｘは独立して、反応性官能基であり、ｐは０〜４である）
を有するジアミンに由来し、ｍは４〜７００であり、ＲおよびＲ’は、独立して、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30分岐鎖もしくは直鎖炭化水素、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素、ならびに疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーからなる群より選択される｝
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリマーは、以下の構造：
【化６】
（式中、ｍは４〜７００であり、ＷはＯまたはＮＨであり、ＲおよびＲ’は独立して、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30分岐鎖もしくは直鎖炭化水素、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素、ならびに疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーからなる群より選択される）
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリマーは、以下の構造：
【化７】
（式中、ｍは４〜７００であり、Ｌは、フェニレン、Ｃ2−Ｃ6アルキレン、またはベンゼンジメチレンであり、ＷはＯまたはＮＨであり、ＲおよびＲ’は、独立して、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30分岐鎖もしくは直鎖炭化水素、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素、ならびに疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーからなる群より選択される）
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
１つもしくは複数の医薬として許容される担体または賦形剤、およびくし型ポリマー内に封入した抗癌薬を含む医薬組成物であって、前記くし型ポリマーは、本質的に以下の構造：
【化８】
からなり、骨格は交互する分岐点部分Ｂと親水性水溶性ポリマーブロックＡから形成され、前記分岐点部分に結合した疎水性側鎖Ｃおよび標的部分Ｚを有する骨格を含み、式中、
各側鎖Ｃは独立して、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30直鎖もしくは分岐鎖炭化水素、１つもしくは複数の親水性置換基、および疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーで任意に置換されるＣ6−Ｃ30環式または多環式炭化水素からなる群より選択され、
各標的部分Ｚは、独立して、前記癌細胞の表面に対して特異的結合親和性を有するリガンドであり、
ｓは結合またはスペーサ部分であり、
ｎの値は、１から約１００の範囲であり、
ｐの平均値は、１より大きく４までの範囲であり、
ｒの平均値は、０から８の範囲である、医薬組成物。
【請求項１】
抗癌薬を癌細胞に投与するための方法であって、前記癌細胞をくし型ポリマー内に封入した前記抗癌薬と接触させるステップを含み、前記くし型ポリマーは、本質的に以下の構造：
【化１】
からなり、骨格が交互する分岐点部分Ｂと親水性水溶性ポリマーブロックＡから形成され、前記分岐点部分に結合する疎水性側鎖Ｃおよび標的部分Ｚを有する骨格を含み、式中、
各疎水性側鎖Ｃは、独立して、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30直鎖もしくは分岐鎖炭化水素、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素、ならびに疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーから選択され、
各標的部分Ｚは、独立して、前記癌細胞の表面に対する特異的結合親和性を有するリガンドであり、
ｓは結合またはスペーサ部分であり、
ｎの値は、１から約１００の範囲であり、
ｐの平均値は、１より大きく４までの範囲であり、
ｒの平均値は、０から８の範囲である、方法。
【請求項２】
ｎは２から約１００の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの標的部分は、受容体特異的リガンド、抗体、抗体フラグメント、および増殖因子からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの標的部分は、受容体特異的リガンド、抗体、抗体フラグメント、および増殖因子からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記リガンドは、上皮細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、葉酸、メトトレキサート、プテロイン酸、エストラジオール、エストラトリオール、テストステノン、マンノース−６−リン酸、ならびにＮＣＡ９０、ＮＣＡ９５、ＣＥＡ、ＣＤ１５、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＶＧＥＦ、またはＥＧＦＲに対する抗体および抗体フラグメントからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドは、上皮細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、葉酸、メトトレキサート、プテロイン酸、エストラジオール、エストラトリオール、テストステノン、マンノース−６−リン酸、ならびにＮＣＡ９０、ＮＣＡ９５、ＣＥＡ、ＣＤ１５、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＶＧＥＦ、またはＥＧＦＲに対する抗体および抗体フラグメントからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記抗癌薬は、ドキソルビシン、カンプトセシン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、イリノテカン、イマチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、アクシチニブ、パゾパニブ、エトポシド、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、スタウロスポリン、シタラビン、メルファラン、ロイロシン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＤ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、シスプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、レチノイン酸、およびタモキシフェンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗癌薬は、ドキソルビシン、カンプトセシン、ドセタキセル、パクリタキセル、トポテカン、イリノテカン、イマチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、アクシチニブ、パゾパニブ、エトポシド、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、スタウロスポリン、シタラビン、メルファラン、ロイロシン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＤ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、シスプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、レチノイン酸、およびタモキシフェンからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリマーブロックＡは、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、およびこれらのコポリマーからなる群より選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマーブロックＡは、４から７００モノマー単位の平均長を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリマーは、以下の構造：
【化２】
（式中、ｍは４〜７００であり、ＹおよびＹ’は、独立して、Ｒ、ＯＲ、ＣＯＯＲ、ＳＲ、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＯＮＨＲ、ＮＨＯＲ、ＮＲＮＨ2、ＮＨＮＨＲ、ＮＲＮＨＲ’、およびＮＨＮＲＲ’からなる群より選択され、ＲおよびＲ’は、独立して、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30分岐鎖もしくは直鎖炭化水素、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素、ならびに疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーからなる群より選択される）
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリマーは以下の構造：
【化３】
（式中、ｍは４〜７００であり、ＷはＯまたはＮＨであり、ＹおよびＹ’は、独立して、Ｒ、ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲＲ’、ＣＯＮＨＯＲ、ＣＯＮＲＮＨ2、ＣＯＮＨＮＨＲ、ＣＯＮＲＮＨＲ’、およびＣＯＮＨＮＲＲ’からなる群より選択され、ＲおよびＲ’は、独立して、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30分岐鎖もしくは直鎖炭化水素、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素、ならびに疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーからなる群より選択される）
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリマーは、以下の構造：
【化４】
｛式中、部分Ｄは、以下の一般構造：
【化５】
（式中、各Ｘは独立して、反応性官能基であり、ｐは０〜４である）
を有するジアミンに由来し、ｍは４〜７００であり、ＲおよびＲ’は、独立して、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30分岐鎖もしくは直鎖炭化水素、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素、ならびに疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーからなる群より選択される｝
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリマーは、以下の構造：
【化６】
（式中、ｍは４〜７００であり、ＷはＯまたはＮＨであり、ＲおよびＲ’は独立して、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30分岐鎖もしくは直鎖炭化水素、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素、ならびに疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーからなる群より選択される）
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリマーは、以下の構造：
【化７】
（式中、ｍは４〜７００であり、Ｌは、フェニレン、Ｃ2−Ｃ6アルキレン、またはベンゼンジメチレンであり、ＷはＯまたはＮＨであり、ＲおよびＲ’は、独立して、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30分岐鎖もしくは直鎖炭化水素、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30環式もしくは多環式炭化水素、ならびに疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーからなる群より選択される）
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
１つもしくは複数の医薬として許容される担体または賦形剤、およびくし型ポリマー内に封入した抗癌薬を含む医薬組成物であって、前記くし型ポリマーは、本質的に以下の構造：
【化８】
からなり、骨格は交互する分岐点部分Ｂと親水性水溶性ポリマーブロックＡから形成され、前記分岐点部分に結合した疎水性側鎖Ｃおよび標的部分Ｚを有する骨格を含み、式中、
各側鎖Ｃは独立して、１つもしくは複数の親水性置換基で任意に置換されるＣ6−Ｃ30直鎖もしくは分岐鎖炭化水素、１つもしくは複数の親水性置換基、および疎水性アミノ酸、ペプチドおよびポリマーで任意に置換されるＣ6−Ｃ30環式または多環式炭化水素からなる群より選択され、
各標的部分Ｚは、独立して、前記癌細胞の表面に対して特異的結合親和性を有するリガンドであり、
ｓは結合またはスペーサ部分であり、
ｎの値は、１から約１００の範囲であり、
ｐの平均値は、１より大きく４までの範囲であり、
ｒの平均値は、０から８の範囲である、医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５３３７１０（Ｐ２０１０−５３３７１０Ａ）
【公表日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１６９６３（Ｐ２０１０−５１６９６３）
【出願日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７３８８０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１１７０２
【国際公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【出願人】（５１００１６２０９）オールエクセル，インコーポレイティド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７３８８０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１１７０２
【国際公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【出願人】（５１００１６２０９）オールエクセル，インコーポレイティド (1)
【Ｆターム（参考）】
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