抗肝炎剤
【課題】本発明は、抗肝線維症や抗肝硬変などの肝炎を予防または治療するための抗肝炎剤であって、安全で恒常的な服用も可能であり得るもの、および当該抗肝炎剤を含む健康食品を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明に係る抗肝炎剤は、活性成分としてキサントン誘導体を含むことを特徴とする。
【解決手段】本発明に係る抗肝炎剤は、活性成分としてキサントン誘導体を含むことを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全で恒常的な服用も可能であり得る抗肝炎剤、および当該抗肝炎剤を含む健康食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肝炎は、肝細胞の損傷を伴う炎症をいい、通常、ろ過性病毒、アルコール、薬物などにより引き起こされる。よく見られる肝炎は病毒により起きる病毒性肝炎で、病毒種類によってＡ型からＤ型に分類される。
【０００３】
病毒が人体に進入して肝細胞に様々な程度の損傷を与える疾患は急性肝炎と称される。急性肝炎は、通常、１ヶ月から２ヶ月ほどで治癒するが、完全に治癒しないまま症状が６ヵ月以上続いた場合には慢性肝炎に変わる。慢性肝炎には、肝線維症や肝硬変などが含まれる。
【０００４】
肝線維症とは、肝臓の繊維性結締組織の異常増生のことをいい、肝臓組織の修復時、肝細胞死亡（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）と肝臓再生の間のバランスに異常が生じ、コラーゲンなどの細胞外基質が過度に沈積する結果だと考えられている。肝細胞を死亡させる原因としては、例えば、病毒やアルコールなどの外在要因や、例えば、自体免疫異常などの内在要因がある。肝細胞の疾病と死亡の際には、クッパー細胞（Ｋｕｐｆｆｅｒ’ｓ ｃｅｌｌ）や内皮細胞などが活性化され、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＰＤＧＦなどのサイトカインが放出される。これらのサイトカインは、さらに肝星細胞（ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ）を活性化し、細胞生長とコラーゲンの合成が生じて、肝線維症になると考えられる。
【０００５】
肝線維症は、慢性的な一種の持続性病理変化であり、肝硬変の初期に見出される。肝線維症の初期段階は一定の可逆性を示し、病因となる刺激の停止後、増生したコラーゲン繊維は徐々に再吸収されて、肝臓構造部分が正常に回復する。しかし、病因となる要素が存在し続ける場合、肝臓結締組織が肝線維化し、肝臓の正常構造が破壊されてやがては肝硬変に至る。よって、肝線維症の治療上、早期発見と早期治療は非常に高い復元効果をもたらす。また、肝線維症の発生や発展を抑制または制御できる場合、同様に、肝硬変を予防や治療することが可能である。
【０００６】
特許文献１には、活性成分としてヒスチジンおよび／またはシステインを含む臓器肝線維症の抑制剤を開示している。当該抑制剤におけるシステインとヒスチジンの比率は１：０．１〜１０である。
【０００７】
また、特許文献２には肝線維症の治療方法が記載されている。当該方法は、哺乳類動物に有効成分であるｚｖｅｇｆ−３拮抗薬を投与するステップを含む。かかるｚｖｅｇｆ−３拮抗薬には、ｚｖｅｇｆ−３二次元タンパク質へ特異的に連接する単株抗体である抗−ｚｖｅｇｆ−３抗体や、ｚｖｅｇｆ−３変異体ポリペプチドと結合する受容体などが含まれる。
【０００８】
さらに特許文献３は、肝線維症と肝硬変を治療または予防する医薬組成物を開示している。当該医薬組成物は、重量比で５：１〜１：５の５−（２−ピラジニル）−４−メチル−１，２−ジチオール−３−チオン（ｏｌｔｉｐｒａｚ）とジメチル−４，４’−ジメトキシ−５，６，５’，６’−ジメチレンジオキシビフェニル−２，２’−ジカルボキシレート（ＤＤＢ）を主要成分とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第７，０９４，７９７号明細書
【特許文献２】米国特許第７，０５４，４３７号明細書
【特許文献３】米国特許第７，０７８，０４５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、抗肝線維症や抗肝硬変などの肝炎を予防または治療するための抗肝炎剤であって、安全で恒常的な服用も可能であり得るもの、および当該抗肝炎剤を含む健康食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、様々な天然植物から抽出し、肝炎の予防および治療効果を有する化合物を探索した。その結果、食品としても用いられるマンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ）の果実などに含まれるキサントン誘導体が優れた抗肝炎作用を有することを見出して、本発明を完成した。
【００１２】
本発明に係る抗肝炎剤は、活性成分としてキサントン誘導体を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明の抗肝炎剤としては、上記キサントン誘導体が、下記式（Ｉ）で表されるｍａｎｇｏｓｔｉｎ誘導体であるものが好ましい。
【００１４】
【化１】
［式中、Ｒ1とＲ2は同一であっても異なっていてもよく、それぞれＨかＣ1-6アルキル基を示す］
【００１５】
本発明においてＣ1-6アルキル基とは、炭素数が１以上、６以下の直鎖状、分枝鎖状または環状の一価炭化水素基をいう。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、シクロブチル基、ｎ−ペンチル基、シクロプロピル基、ｎ−ヘキシレン基、シクロヘキシル基を挙げることができ、Ｃ1-4アルキル基が好ましく、Ｃ1-2アルキル基がより好ましく、メチル基がさらに好ましい。
【００１６】
上記ｍａｎｇｏｓｔｉｎ誘導体としては、α−ｍａｎｇｏｓｔｉｎ、β−ｍａｎｇｏｓｔｉｎ、γ−ｍａｎｇｏｓｔｉｎ、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。
【００１７】
本発明に係る抗肝炎剤で予防または治療すべき肝炎としては、急性肝炎および慢性肝炎を挙げることができる。より具体的には、急性肝炎として病毒性肝炎、アルコール性肝炎および薬物性肝炎を挙げることができ、また、慢性肝炎として肝線維症および肝硬変を挙げることができる。
【００１８】
本発明に係る健康食品は、本発明に係る上記抗肝炎剤を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る抗肝炎剤の活性成分であるキサントン誘導体は、食品としても用いられるマンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ）の果実などに含まれるものであるため安全であり、毎日の服用も可能である。また、本発明に係る抗肝炎剤は、肝線維症や肝硬変などの肝炎の予防効果と治療効果に極めて優れるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、四塩化炭素で肝線維症を誘発した動物モデルに対して各被検薬投与した後における血清中のＡＳＴ値を示すグラフである。
【図２】図２は、四塩化炭素で肝線維症を誘発した動物モデルに対して各被検薬投与した後における血清中のＡＬＴ値を示すグラフである。
【図３】図３は、四塩化炭素で肝線維症を誘発した動物モデルに対して各被検薬投与した後における血清中のＡＳＴ値とＡＬＴ値の比率（ＡＳＴ／ＡＬＴ）を示すグラフである。
【図４】図４は、四塩化炭素で肝線維症を誘発した動物モデルに対して各被検薬投与した後における肝線維症の程度（スコア）を示すグラフである。
【図５】図５は、チオアセトアミドで急性肝炎を誘発した動物モデルに対して、水のみ、またはｍａｎｇｏｓｔｉｎを投与した後における血清中のＡＳＴ値を示すグラフである。
【図６】図６は、チオアセトアミドで急性肝炎を誘発した動物モデルに対して、水のみ、またはｍａｎｇｏｓｔｉｎを投与した後における血清中のＡＬＴ値を示すグラフである。
【図７】図７は、チオアセトアミドで急性肝炎を誘発した動物モデルに対して、水のみ、またはｍａｎｇｏｓｔｉｎを投与した後における血清中のＡＳＴ値とＡＬＴ値の比率（ＡＳＴ／ＡＬＴ）を示すグラフである。
【図８】図８は、チオアセトアミドで急性肝炎を誘発した動物モデルに対して、水のみ、またはｍａｎｇｏｓｔｉｎを投与した後における血清中のＡＳＴ増加倍数を示すグラフである。
【図９】図９は、チオアセトアミドで急性肝炎を誘発した動物モデルに対して、水のみ、またはｍａｎｇｏｓｔｉｎを投与した後における血清中のＡＬＴ増加倍数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明に係る抗肝炎剤の活性成分であるキサントン誘導体は、下記構造を有するキサントン（Ｃ13Ｈ8Ｏ2）を主構造とする化合物であり、２以上の水酸基またはアルコキシ基を有するポリフェノール化合物である。
【００２２】
【化２】
【００２３】
本発明に係るキサントン誘導体は、塩類やエステルなどであってもよい。かかる塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩などを挙げることができる。エステルとしては、例えば、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、酪酸エステル、イソ酪酸エステルなどを挙げることができる。
【００２４】
上記キサントン誘導体としては、例えば、下記式（Ｉ）で表されるｍａｎｇｏｓｔｉｎ誘導体を挙げることができる。
【００２５】
【化３】
［式中、Ｒ1とＲ2は同一であっても異なっていてもよく、それぞれＨ（水素原子）かＣ1-6アルキル基を示す］
【００２６】
上記化合物（Ｉ）中、Ｒ1がメチル基であり且つＲ2がＨの場合、α−マンゴスチンを示し；Ｒ1とＲ2がいずれもメチル基の場合、β−マンゴスチンを示し、；Ｒ1とＲ2がいずれもＨの時、γ−マンゴスチンを示す。
【００２７】
上記のようなｍａｎｇｏｓｔｉｎ誘導体は、従来、乳がんの予防と治療（Moongkarndi P.ら，Antiproliferation，antioxidation and induction of apoptosis by Garcinia mangostana (mangosteen) on SKBR3 human breast cancer cell line，J．Ethnopharmacol．，2004，90(1)，pp.161-6）、抗アレルギー薬物（Nakatani K.ら，Inhibitions of histamine release and prostaglandin E2 synthesis by mangosteen，a Thai medicinal plant，Bio Pharm Bull，2002，(9)，pp.1137-41）、および筋肉に相関する疾病（国際公開第２００７／１２８４６５号パンフレット）などの領域で研究応用され、また、日常生活の栄養補助剤（国際公開第２００６／０６０５７８号パンフレット）や化粧品（国際公開第２００７／００２６６６号パンフレット）などとしても開発されている。
【００２８】
現在、自然界には２５０種類を超えるキサントン誘導体が存在しているといわれている。一般的な果実や野菜にもキサントン誘導体が含まれていることがあるが、８種類を超えるキサントン誘導体を含むものはない。一方、マンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ；学名：Ｇａｒｃｉｎｉａ Ｍａｎｇｏｓｔａｎａ Ｌ．）の果実からは、４０種類を超えるキサントン誘導体が見出されている。
【００２９】
近年、マンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ）の果皮抽出物を、アトピー性皮膚炎の予防と治療に用いる研究（中華民国特許申請公開案第２０１０００１１３号）や、マンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ）の果実や植株抽出物を保健組成物とし、健康を改善する（米国特許出願公開第２００９／００６２３７８号明細書）レポートがある。
【００３０】
松本健司博士等も、マンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ）の果皮中から、α−マンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｉｎ）、β−マンゴスチン、γ−マンゴスチンおよびメチル−β−マンゴスチンを単離することを研究すると共に、この化合物の細胞周期の各階段に対する抑制作用を研究し、この化合物は、抗細胞増殖効果と抗腫瘤効果（Matsumoto K.ら，Xanthones induce cell-cycle arrest and apoptosis in human colon cancer DLD-1 cells，Bioorg．Med．Chem．，2005，13，pp.6064-6069）を有することを示した。
【００３１】
本発明の活性成分であるキサントン誘導体は、マンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ）の果実、特に果皮など、キサントン誘導体を含む植物体などから抽出することができる。これら植物体は、乾燥物や粉砕物などであってもよく、そのまま用いてもよい。
【００３２】
抽出に用いられる溶媒は、適宜選択すればよいが、有機溶媒を用いることが好ましい。かかる有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、２−ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノールなどのＣ1-12アルコール類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類を挙げることができる。有機溶媒の中では、水混和性有機溶媒を用いることが好ましい。本発明の一実施例では、有機溶媒水溶液、特にエタノール水溶液を使用して抽出する。有機溶媒水溶液、特にエタノール水溶液の濃度は、通常、１０〜９０％とすることができ、２０〜８０％が好ましく、５０〜７５％がより好ましい。
【００３３】
抽出温度や抽出時間は適宜調整することができ、具体的には予備実験などで活性が高いキサントン誘導体が効率良く抽出できる条件を決定すればよい。例えば、マンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ）の乾燥物からエタノール水溶液を用いて抽出する場合、抽出温度は約８０〜８５℃とすることが好ましい。
【００３４】
原料としてマンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ）の乾燥物を用いる場合には、まず、等重量の熱水で処理することにより、マンゴスチン中に含まれる着色、粘性、吸湿等の原因となる不純物質を除去することが好ましい。かかる熱水の温度としては約９０℃以上とすることができ、９５℃〜１００℃が好ましい。次いで、熱水処理したマンゴスチンを乾燥した後、上記溶媒を用いて抽出し、抽出溶液から粗結晶を得る。抽出は数回繰り返してもよい。
【００３５】
得られた抽出溶液から、キサントン誘導体を精製すればよい。精製手段は特に限定されないが、例えば、シリカゲルクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのクロマトグラフィー、再結晶を挙げることができる。
【００３６】
本発明に係る抗肝炎剤は、肝炎に対して優れた予防効果と治療効果を示す。
【００３７】
本発明における肝炎は、病毒や、アルコールなどの薬物などにより生じる肝細胞損傷を意味し、急性肝炎と慢性肝炎が含まれる。急性肝炎は、病毒性肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎）、アルコール性肝炎および薬物性肝炎を含み、慢性肝炎は、肝線維症と肝硬変を含むが、これらに限定されない。本発明における肝炎、急性肝炎および慢性肝炎は、全ての医学上の定義に符合する肝炎、急性肝炎および慢性肝炎の疾病を含む。
【００３８】
本発明に係る抗肝炎剤は、上記キサントン誘導体以外の成分を含むものであってもよい。かかる添加成分は、医薬上または食品上許容可能なものであることが好ましく、例えば、医薬または食品で許容される賦形剤および添加剤を挙げることができる。より具体的には、例えば、澱粉、コーンスターチ、ゼラチン、アラビアゴム、食用色素、香料、調味剤、防腐剤などを挙げることができる。
【００３９】
本発明に係る抗肝炎剤の投与量は、適宜調整すればよい。例えば、患者の年齢、体重、健康状態、疾病の種類、疾病の進行、患部などに基づき、医療スタッフが、本発明に係る技術分野における共通知識に基づいて決定することができる。より具体的には、現在、キサントン誘導体の投与量について、毒性や応用制限を示す報告はないが、本発明では、例えば、投予対象の体重１キロ毎に１０ｍｇ〜１０００ｍｇで投与することができ、好ましくは５０ｍｇ〜１５０ｍｇ、より好ましくは約１００ｍｇとすることができる。但し、これらに限定されない。
【００４０】
本発明に係る抗肝炎剤は、単独で投与しても、その他の薬剤と一緒に投与してもよく、投与療程は、医師や医療関係者などにより、薬学上の通常方法により実施される。
【００４１】
投与経路は、内服、皮膚投与、腹腔内投与、靜脈内投与、経鼻投与または眼部投与などで、好ましくは、内服方式である。
【００４２】
本発明に係る抗肝炎剤は、特に肝炎の発症を予防する健康食品としても利用可能である。設定されるグループに対し、適当な活性成分含量を調整し、好ましくは毎日内服できる含量に調整する。パッケージは、使用量、特定グループ（例えば、妊婦、腎病患者）の使用基準と条件、その他の食品や医薬品との同時内服の注意事項などを表示して、購買者が、医師や薬剤師等の指示や指導がなくても、安心して各自で内服することができるようにすることが好ましい。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００４４】
なお、抗肝炎効果の評価において、本発明では、公知の肝炎動物モデルや肝線維症動物モデルを採用し、血清中のアラニン・アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）含量、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）含量、およびＡＳＴ／ＡＬＴの比率を測定して評価すると共に、実験動物の肝臓に対して切片観察を実行し、肝線維症等級により評価する。
【００４５】
ＡＳＴは、アスパラギン酸塩のアミノ基をα−ケトグルタル酸に転移する酵素で、主に肝臓の実質細胞（ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌ）、部分的に心臓、腎臓、肌肉などの組織に存在し、これも肝機能を検出する指標の一つである。肝臓が損傷を受けた場合、ＡＳＴは血液中に放出され、血液中のＡＳＴ値が高くなる。
【００４６】
ＡＬＴは、アラニンのアミノ基をα−ケトグルタル酸に転移する酵素で、主に、肝臓、少数は心臓、肌肉などの組織に存在し、肝機能検出の指標の一つである。肝臓が損傷を受けた場合、ＡＬＴは血液中に放出され、血液中のＡＬＴ値が高くなる。
【００４７】
肝臓疾病中、血液中のＡＬＴ値の上昇値はＡＳＴ値の上昇値より高い。よって、ＡＳＴ／ＡＬＴ比率について、ＡＳＴ／ＡＬＴ＜１の場合は肝臓が炎症状態にあることを示し、ＡＳＴ／ＡＬＴが１に接近する時、肝臓は既に肝炎や肝硬変などの症状があることを示す。
【００４８】
しかし、血清中のＡＬＴ値、ＡＳＴ値も、その他の臓器（例えば、心臓）の受損により高くなる。よって、本発明は、Boigketら，1997；Ruwartら，1989に記載されているＭｅｔａｖｉｒ ｓｃｏｒｅに基づき、実験動物の肝臓切片を肝線維症程度に基づいてＦ０からＦ４の五等級、即ち、「Ｆ０：肝線維症が観察されない」、から、「Ｆ４：肝硬変現象がある」まで分け、本発明の抗肝炎剤が具備する抗肝炎の効果を確認した。
【００４９】
実施例１ 四塩化炭素誘発性慢性肝線維症モデル動物実験
（１） 投与
８週齢の雄性ＳＤラット（ＢｉｏＬＡＳＣＯ社）２４匹を任意に８匹ずつ３群に分けた。また、四塩化炭素を２４容量％の割合でオリーブオイルへ溶解した。１週間ごとに２回、各ラットへ１．６７ｍＬ／ｋｇの当該溶液（四塩化炭素換算で０．４ｍＬ／ｋｇ）を腹腔内注射することにより、慢性肝線維症を誘発した。また、毎日、栄養チューブを用い、以下の試験物質を投与した。なお、シリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）はマリアアザミ由来の抽出物であり、肝機能の向上効果が期待されている公知化合物である。実験期間は計８週とした。
溶剤対照群：オリーブオイルを１０ｍＬ／ｋｇ
シリマリン投与群：２０ｍｇ／ｍＬのシリマリン−オリーブオイル溶液を１０ｍＬ／ｋｇ
ｍａｎｇｏｓｔｉｎ投与群：１０ｍｇ／ｍＬのｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ抽出物−オリーブオイル溶液を１０ｍＬ／ｋｇ
なお、上記ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ抽出物は、α−ｍａｎｇｏｓｔｉｎを８５％、β−ｍａｎｇｏｓｔｉｎを１０％含むものであった。
【００５０】
別途、８週齢の雄性ＳＤラット（ＢｉｏＬＡＳＣＯ社）３匹に対して上記処理を施さず、空白対照群とした。
【００５１】
（２） 血液分析
上記各ラットから、四塩化炭素を腹腔内注射する前（ＷＯ）、および第２，４，６，８週目に、尾部から約０．３ｍＬの血液を採取した。得られた血液サンプルを室温下で１時間静置した後、凝結させた。次いで、遠心機を使って２５℃、６０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心し、血清を得た。乾燥血液生化学分析装置（ＫＯＤＡＫ ＥＫＴＡＣＨＥＭ ＤＴ６０ＩＩ）を用い、肝障害の指標となるＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）とＡＬＴ（アラニン・アミノトランスフェラーゼ）の血清中濃度（単位：Ｕ／Ｌ）を測定した。ＡＳＴの測定結果を表１と図１に、ＡＬＴの測定結果を表２と図２に示す。また、ＡＳＴとＡＬＴの比率（ＡＳＴ／ＡＬＴ）を算出し、表３と図３に示す。結果は、平均値（ｍｅａｎ）±標準差（Ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ；Ｓ．Ｅ．）で表示する。また、ｔ−ｔｅｓｔで検定し、溶剤対照群と各群との間に有意な差異があるか否か比較した。ｐ値が０．０５より小さい場合、溶剤対照群と各群との間は、統計上、有意な差異があることを示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】
【表２】
【００５４】
【表３】
【００５５】
（３） 組織包埋切片の作成とコラーゲン染色（Ｓｉｒｉｕｓ＆Ｆａｓｔ ｇｒｅｅｎ染色法）
上記の動物試験終了時、全てのラットを屠殺し、肝臓左葉を約１センチの立方体の組織ブロック状に切り取り、１０％の中性ホルマリン中に入れて組織形態と構造を固定した。続いて、異なる濃度のエタノール（３０、５０、７０、９５、９９．５％）とキシレンにより脱水と透明化を行った。次いで、熱した石ロウ溶液でキシレンを置換した後、組織を石ロウ溶液と共に包埋した。完成した石ロウ標本は、切片機を利用して厚さ５μｍの石ロウ切片とした。得られた切片を清潔なスライド上に粘着し、３７℃で乾燥した。
【００５６】
上記肝臓組織切片をキシレンに３分間浸漬することにより脱ロウした。かかる操作を３回繰り返した。次いで、順に１００％、１００％、９０％、７０％および５０％のエタノールで、各３分間、復水を行った。続いて、ＴＢＳＴ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４）に３分間浸漬した後、０．１％のＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄと０．１％のＦａｓｔ ｇｒｅｅｎを使って１時間染色した。その後、脱水工程を行った。次いで、順に、５０％、７０％、９０％、１００％および１００％のアルコール中に１０秒間ずつ浸漬した後、キシレンを使った透明化を３回行った。最後に、搭載媒体でシールした。
【００５７】
染色された肝臓組織切片を、顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＴ７０−ＢＸ５１）により、肝線維症の程度評価と写真記録を行った。肝線維症程度評価は、Ｍｅｔａｖｉｒ ｓｃｏｒｅ（Ｂｏｉｇｋｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｒｕｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８９）に基づいて、以下の５段階レベルに評価した。
Ｆ０：肝線維症が観察されない
Ｆ１：門脈肝線維症（ｐｏｒｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）が観察される
Ｆ２：少量の線維隔膜（ｓｅｐｔａ）が観察される
Ｆ３：多くの線維隔膜が観察される
Ｆ４：肝硬変が観察される
結果を表４と図４に示す。
【００５８】
【表４】
【００５９】
実施例２ チオアセトアミド誘発性急性肝炎モデル動物実験
８週齢の雄性ＳＤラット（ＢｉｏＬＡＳＣＯ社）１２匹を任意に６匹ずつ２群に分けた。対照群には逆浸透圧水（ＲＯ水）を１０ｍＬ／ｋｇ、ｍａｎｇｏｓｔｉｎ投与群には実施例１と同様のｍａｎｇｏｓｔｉｎを１００ｍｇ／ｋｇ与えた。別途、チオアセトアミド（以下、「ＴＡＡ」と略記する）を生理食塩水に溶解した。各投与から１時間後、チオアセトアミド溶液をＴＡＡ換算で３００ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した。
【００６０】
ＴＡＡ注射直前（０時間）、およびＴＡＡ注射から２４時間後と４８時間後に、約０．５ｍｌ採血した。得られた血液サンプルを室温下で１時間静置した後、凝結させた。次いで、遠心機を使って２５℃、６０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心し、血清を得た。上記実施例１と同様にして、ＡＳＴとＡＬＴの血清中濃度を測定した。ＡＳＴの測定結果を表５と図５に、ＡＬＴの測定結果を表６と図６に示す。また、ＡＳＴとＡＬＴの比率（ＡＳＴ／ＡＬＴ）を算出し、表７と図７に示す。さらに、血清中におけるＡＳＴとＡＬＴの増加倍数を算出し、それぞれ表８と図８および表９と図９に示す。
【００６１】
【表５】
【００６２】
【表６】
【００６３】
【表７】
【００６４】
【表８】
【００６５】
【表９】
【００６６】
結果の考察
表１、表２、図１および図２で示されるように、ｍａｎｇｏｓｔｉｎ投与群の第６週時の血清ＡＳＴ値とＡＬＴ値は、共に顕著に低下した。反対に、シリマリン投与群の第４週時の血清ＡＳＴ値とＡＬＴ値は明らかに増加した。
【００６７】
また、表３および図３で示されるように、シリマリン投与組の第４週時のＡＳＴ／ＡＬＴ比率は明らかに低下し、ｍａｎｇｏｓｔｉｎ投与組の第４週時と６週時のＡＳＴ／ＡＬＴ比率は有意に増加した。
【００６８】
さらに、表４および図４で示される肝線維症程度に基づくと、ｍａｎｇｏｓｔｉｎは、慢性肝疾患である肝線維症を顕著に減少させる肝臓保護効果を有することが実証された。
【００６９】
次に、表５〜６、表８〜９、図５、図６、図８および図９で示されるように、ｍａｎｇｏｓｔｉｎを投与した急性肝炎モデルラットの血清中のＡＳＴ値とＡＬＴ値は何れも低下の傾向が見られた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全で恒常的な服用も可能であり得る抗肝炎剤、および当該抗肝炎剤を含む健康食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肝炎は、肝細胞の損傷を伴う炎症をいい、通常、ろ過性病毒、アルコール、薬物などにより引き起こされる。よく見られる肝炎は病毒により起きる病毒性肝炎で、病毒種類によってＡ型からＤ型に分類される。
【０００３】
病毒が人体に進入して肝細胞に様々な程度の損傷を与える疾患は急性肝炎と称される。急性肝炎は、通常、１ヶ月から２ヶ月ほどで治癒するが、完全に治癒しないまま症状が６ヵ月以上続いた場合には慢性肝炎に変わる。慢性肝炎には、肝線維症や肝硬変などが含まれる。
【０００４】
肝線維症とは、肝臓の繊維性結締組織の異常増生のことをいい、肝臓組織の修復時、肝細胞死亡（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）と肝臓再生の間のバランスに異常が生じ、コラーゲンなどの細胞外基質が過度に沈積する結果だと考えられている。肝細胞を死亡させる原因としては、例えば、病毒やアルコールなどの外在要因や、例えば、自体免疫異常などの内在要因がある。肝細胞の疾病と死亡の際には、クッパー細胞（Ｋｕｐｆｆｅｒ’ｓ ｃｅｌｌ）や内皮細胞などが活性化され、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＰＤＧＦなどのサイトカインが放出される。これらのサイトカインは、さらに肝星細胞（ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ）を活性化し、細胞生長とコラーゲンの合成が生じて、肝線維症になると考えられる。
【０００５】
肝線維症は、慢性的な一種の持続性病理変化であり、肝硬変の初期に見出される。肝線維症の初期段階は一定の可逆性を示し、病因となる刺激の停止後、増生したコラーゲン繊維は徐々に再吸収されて、肝臓構造部分が正常に回復する。しかし、病因となる要素が存在し続ける場合、肝臓結締組織が肝線維化し、肝臓の正常構造が破壊されてやがては肝硬変に至る。よって、肝線維症の治療上、早期発見と早期治療は非常に高い復元効果をもたらす。また、肝線維症の発生や発展を抑制または制御できる場合、同様に、肝硬変を予防や治療することが可能である。
【０００６】
特許文献１には、活性成分としてヒスチジンおよび／またはシステインを含む臓器肝線維症の抑制剤を開示している。当該抑制剤におけるシステインとヒスチジンの比率は１：０．１〜１０である。
【０００７】
また、特許文献２には肝線維症の治療方法が記載されている。当該方法は、哺乳類動物に有効成分であるｚｖｅｇｆ−３拮抗薬を投与するステップを含む。かかるｚｖｅｇｆ−３拮抗薬には、ｚｖｅｇｆ−３二次元タンパク質へ特異的に連接する単株抗体である抗−ｚｖｅｇｆ−３抗体や、ｚｖｅｇｆ−３変異体ポリペプチドと結合する受容体などが含まれる。
【０００８】
さらに特許文献３は、肝線維症と肝硬変を治療または予防する医薬組成物を開示している。当該医薬組成物は、重量比で５：１〜１：５の５−（２−ピラジニル）−４−メチル−１，２−ジチオール−３−チオン（ｏｌｔｉｐｒａｚ）とジメチル−４，４’−ジメトキシ−５，６，５’，６’−ジメチレンジオキシビフェニル−２，２’−ジカルボキシレート（ＤＤＢ）を主要成分とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第７，０９４，７９７号明細書
【特許文献２】米国特許第７，０５４，４３７号明細書
【特許文献３】米国特許第７，０７８，０４５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、抗肝線維症や抗肝硬変などの肝炎を予防または治療するための抗肝炎剤であって、安全で恒常的な服用も可能であり得るもの、および当該抗肝炎剤を含む健康食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、様々な天然植物から抽出し、肝炎の予防および治療効果を有する化合物を探索した。その結果、食品としても用いられるマンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ）の果実などに含まれるキサントン誘導体が優れた抗肝炎作用を有することを見出して、本発明を完成した。
【００１２】
本発明に係る抗肝炎剤は、活性成分としてキサントン誘導体を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明の抗肝炎剤としては、上記キサントン誘導体が、下記式（Ｉ）で表されるｍａｎｇｏｓｔｉｎ誘導体であるものが好ましい。
【００１４】
【化１】
［式中、Ｒ1とＲ2は同一であっても異なっていてもよく、それぞれＨかＣ1-6アルキル基を示す］
【００１５】
本発明においてＣ1-6アルキル基とは、炭素数が１以上、６以下の直鎖状、分枝鎖状または環状の一価炭化水素基をいう。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、シクロブチル基、ｎ−ペンチル基、シクロプロピル基、ｎ−ヘキシレン基、シクロヘキシル基を挙げることができ、Ｃ1-4アルキル基が好ましく、Ｃ1-2アルキル基がより好ましく、メチル基がさらに好ましい。
【００１６】
上記ｍａｎｇｏｓｔｉｎ誘導体としては、α−ｍａｎｇｏｓｔｉｎ、β−ｍａｎｇｏｓｔｉｎ、γ−ｍａｎｇｏｓｔｉｎ、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。
【００１７】
本発明に係る抗肝炎剤で予防または治療すべき肝炎としては、急性肝炎および慢性肝炎を挙げることができる。より具体的には、急性肝炎として病毒性肝炎、アルコール性肝炎および薬物性肝炎を挙げることができ、また、慢性肝炎として肝線維症および肝硬変を挙げることができる。
【００１８】
本発明に係る健康食品は、本発明に係る上記抗肝炎剤を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る抗肝炎剤の活性成分であるキサントン誘導体は、食品としても用いられるマンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ）の果実などに含まれるものであるため安全であり、毎日の服用も可能である。また、本発明に係る抗肝炎剤は、肝線維症や肝硬変などの肝炎の予防効果と治療効果に極めて優れるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、四塩化炭素で肝線維症を誘発した動物モデルに対して各被検薬投与した後における血清中のＡＳＴ値を示すグラフである。
【図２】図２は、四塩化炭素で肝線維症を誘発した動物モデルに対して各被検薬投与した後における血清中のＡＬＴ値を示すグラフである。
【図３】図３は、四塩化炭素で肝線維症を誘発した動物モデルに対して各被検薬投与した後における血清中のＡＳＴ値とＡＬＴ値の比率（ＡＳＴ／ＡＬＴ）を示すグラフである。
【図４】図４は、四塩化炭素で肝線維症を誘発した動物モデルに対して各被検薬投与した後における肝線維症の程度（スコア）を示すグラフである。
【図５】図５は、チオアセトアミドで急性肝炎を誘発した動物モデルに対して、水のみ、またはｍａｎｇｏｓｔｉｎを投与した後における血清中のＡＳＴ値を示すグラフである。
【図６】図６は、チオアセトアミドで急性肝炎を誘発した動物モデルに対して、水のみ、またはｍａｎｇｏｓｔｉｎを投与した後における血清中のＡＬＴ値を示すグラフである。
【図７】図７は、チオアセトアミドで急性肝炎を誘発した動物モデルに対して、水のみ、またはｍａｎｇｏｓｔｉｎを投与した後における血清中のＡＳＴ値とＡＬＴ値の比率（ＡＳＴ／ＡＬＴ）を示すグラフである。
【図８】図８は、チオアセトアミドで急性肝炎を誘発した動物モデルに対して、水のみ、またはｍａｎｇｏｓｔｉｎを投与した後における血清中のＡＳＴ増加倍数を示すグラフである。
【図９】図９は、チオアセトアミドで急性肝炎を誘発した動物モデルに対して、水のみ、またはｍａｎｇｏｓｔｉｎを投与した後における血清中のＡＬＴ増加倍数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明に係る抗肝炎剤の活性成分であるキサントン誘導体は、下記構造を有するキサントン（Ｃ13Ｈ8Ｏ2）を主構造とする化合物であり、２以上の水酸基またはアルコキシ基を有するポリフェノール化合物である。
【００２２】
【化２】
【００２３】
本発明に係るキサントン誘導体は、塩類やエステルなどであってもよい。かかる塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩などを挙げることができる。エステルとしては、例えば、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、酪酸エステル、イソ酪酸エステルなどを挙げることができる。
【００２４】
上記キサントン誘導体としては、例えば、下記式（Ｉ）で表されるｍａｎｇｏｓｔｉｎ誘導体を挙げることができる。
【００２５】
【化３】
［式中、Ｒ1とＲ2は同一であっても異なっていてもよく、それぞれＨ（水素原子）かＣ1-6アルキル基を示す］
【００２６】
上記化合物（Ｉ）中、Ｒ1がメチル基であり且つＲ2がＨの場合、α−マンゴスチンを示し；Ｒ1とＲ2がいずれもメチル基の場合、β−マンゴスチンを示し、；Ｒ1とＲ2がいずれもＨの時、γ−マンゴスチンを示す。
【００２７】
上記のようなｍａｎｇｏｓｔｉｎ誘導体は、従来、乳がんの予防と治療（Moongkarndi P.ら，Antiproliferation，antioxidation and induction of apoptosis by Garcinia mangostana (mangosteen) on SKBR3 human breast cancer cell line，J．Ethnopharmacol．，2004，90(1)，pp.161-6）、抗アレルギー薬物（Nakatani K.ら，Inhibitions of histamine release and prostaglandin E2 synthesis by mangosteen，a Thai medicinal plant，Bio Pharm Bull，2002，(9)，pp.1137-41）、および筋肉に相関する疾病（国際公開第２００７／１２８４６５号パンフレット）などの領域で研究応用され、また、日常生活の栄養補助剤（国際公開第２００６／０６０５７８号パンフレット）や化粧品（国際公開第２００７／００２６６６号パンフレット）などとしても開発されている。
【００２８】
現在、自然界には２５０種類を超えるキサントン誘導体が存在しているといわれている。一般的な果実や野菜にもキサントン誘導体が含まれていることがあるが、８種類を超えるキサントン誘導体を含むものはない。一方、マンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ；学名：Ｇａｒｃｉｎｉａ Ｍａｎｇｏｓｔａｎａ Ｌ．）の果実からは、４０種類を超えるキサントン誘導体が見出されている。
【００２９】
近年、マンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ）の果皮抽出物を、アトピー性皮膚炎の予防と治療に用いる研究（中華民国特許申請公開案第２０１０００１１３号）や、マンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ）の果実や植株抽出物を保健組成物とし、健康を改善する（米国特許出願公開第２００９／００６２３７８号明細書）レポートがある。
【００３０】
松本健司博士等も、マンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ）の果皮中から、α−マンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｉｎ）、β−マンゴスチン、γ−マンゴスチンおよびメチル−β−マンゴスチンを単離することを研究すると共に、この化合物の細胞周期の各階段に対する抑制作用を研究し、この化合物は、抗細胞増殖効果と抗腫瘤効果（Matsumoto K.ら，Xanthones induce cell-cycle arrest and apoptosis in human colon cancer DLD-1 cells，Bioorg．Med．Chem．，2005，13，pp.6064-6069）を有することを示した。
【００３１】
本発明の活性成分であるキサントン誘導体は、マンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ）の果実、特に果皮など、キサントン誘導体を含む植物体などから抽出することができる。これら植物体は、乾燥物や粉砕物などであってもよく、そのまま用いてもよい。
【００３２】
抽出に用いられる溶媒は、適宜選択すればよいが、有機溶媒を用いることが好ましい。かかる有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、２−ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノールなどのＣ1-12アルコール類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類を挙げることができる。有機溶媒の中では、水混和性有機溶媒を用いることが好ましい。本発明の一実施例では、有機溶媒水溶液、特にエタノール水溶液を使用して抽出する。有機溶媒水溶液、特にエタノール水溶液の濃度は、通常、１０〜９０％とすることができ、２０〜８０％が好ましく、５０〜７５％がより好ましい。
【００３３】
抽出温度や抽出時間は適宜調整することができ、具体的には予備実験などで活性が高いキサントン誘導体が効率良く抽出できる条件を決定すればよい。例えば、マンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ）の乾燥物からエタノール水溶液を用いて抽出する場合、抽出温度は約８０〜８５℃とすることが好ましい。
【００３４】
原料としてマンゴスチン（ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ）の乾燥物を用いる場合には、まず、等重量の熱水で処理することにより、マンゴスチン中に含まれる着色、粘性、吸湿等の原因となる不純物質を除去することが好ましい。かかる熱水の温度としては約９０℃以上とすることができ、９５℃〜１００℃が好ましい。次いで、熱水処理したマンゴスチンを乾燥した後、上記溶媒を用いて抽出し、抽出溶液から粗結晶を得る。抽出は数回繰り返してもよい。
【００３５】
得られた抽出溶液から、キサントン誘導体を精製すればよい。精製手段は特に限定されないが、例えば、シリカゲルクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのクロマトグラフィー、再結晶を挙げることができる。
【００３６】
本発明に係る抗肝炎剤は、肝炎に対して優れた予防効果と治療効果を示す。
【００３７】
本発明における肝炎は、病毒や、アルコールなどの薬物などにより生じる肝細胞損傷を意味し、急性肝炎と慢性肝炎が含まれる。急性肝炎は、病毒性肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎）、アルコール性肝炎および薬物性肝炎を含み、慢性肝炎は、肝線維症と肝硬変を含むが、これらに限定されない。本発明における肝炎、急性肝炎および慢性肝炎は、全ての医学上の定義に符合する肝炎、急性肝炎および慢性肝炎の疾病を含む。
【００３８】
本発明に係る抗肝炎剤は、上記キサントン誘導体以外の成分を含むものであってもよい。かかる添加成分は、医薬上または食品上許容可能なものであることが好ましく、例えば、医薬または食品で許容される賦形剤および添加剤を挙げることができる。より具体的には、例えば、澱粉、コーンスターチ、ゼラチン、アラビアゴム、食用色素、香料、調味剤、防腐剤などを挙げることができる。
【００３９】
本発明に係る抗肝炎剤の投与量は、適宜調整すればよい。例えば、患者の年齢、体重、健康状態、疾病の種類、疾病の進行、患部などに基づき、医療スタッフが、本発明に係る技術分野における共通知識に基づいて決定することができる。より具体的には、現在、キサントン誘導体の投与量について、毒性や応用制限を示す報告はないが、本発明では、例えば、投予対象の体重１キロ毎に１０ｍｇ〜１０００ｍｇで投与することができ、好ましくは５０ｍｇ〜１５０ｍｇ、より好ましくは約１００ｍｇとすることができる。但し、これらに限定されない。
【００４０】
本発明に係る抗肝炎剤は、単独で投与しても、その他の薬剤と一緒に投与してもよく、投与療程は、医師や医療関係者などにより、薬学上の通常方法により実施される。
【００４１】
投与経路は、内服、皮膚投与、腹腔内投与、靜脈内投与、経鼻投与または眼部投与などで、好ましくは、内服方式である。
【００４２】
本発明に係る抗肝炎剤は、特に肝炎の発症を予防する健康食品としても利用可能である。設定されるグループに対し、適当な活性成分含量を調整し、好ましくは毎日内服できる含量に調整する。パッケージは、使用量、特定グループ（例えば、妊婦、腎病患者）の使用基準と条件、その他の食品や医薬品との同時内服の注意事項などを表示して、購買者が、医師や薬剤師等の指示や指導がなくても、安心して各自で内服することができるようにすることが好ましい。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００４４】
なお、抗肝炎効果の評価において、本発明では、公知の肝炎動物モデルや肝線維症動物モデルを採用し、血清中のアラニン・アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）含量、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）含量、およびＡＳＴ／ＡＬＴの比率を測定して評価すると共に、実験動物の肝臓に対して切片観察を実行し、肝線維症等級により評価する。
【００４５】
ＡＳＴは、アスパラギン酸塩のアミノ基をα−ケトグルタル酸に転移する酵素で、主に肝臓の実質細胞（ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌ）、部分的に心臓、腎臓、肌肉などの組織に存在し、これも肝機能を検出する指標の一つである。肝臓が損傷を受けた場合、ＡＳＴは血液中に放出され、血液中のＡＳＴ値が高くなる。
【００４６】
ＡＬＴは、アラニンのアミノ基をα−ケトグルタル酸に転移する酵素で、主に、肝臓、少数は心臓、肌肉などの組織に存在し、肝機能検出の指標の一つである。肝臓が損傷を受けた場合、ＡＬＴは血液中に放出され、血液中のＡＬＴ値が高くなる。
【００４７】
肝臓疾病中、血液中のＡＬＴ値の上昇値はＡＳＴ値の上昇値より高い。よって、ＡＳＴ／ＡＬＴ比率について、ＡＳＴ／ＡＬＴ＜１の場合は肝臓が炎症状態にあることを示し、ＡＳＴ／ＡＬＴが１に接近する時、肝臓は既に肝炎や肝硬変などの症状があることを示す。
【００４８】
しかし、血清中のＡＬＴ値、ＡＳＴ値も、その他の臓器（例えば、心臓）の受損により高くなる。よって、本発明は、Boigketら，1997；Ruwartら，1989に記載されているＭｅｔａｖｉｒ ｓｃｏｒｅに基づき、実験動物の肝臓切片を肝線維症程度に基づいてＦ０からＦ４の五等級、即ち、「Ｆ０：肝線維症が観察されない」、から、「Ｆ４：肝硬変現象がある」まで分け、本発明の抗肝炎剤が具備する抗肝炎の効果を確認した。
【００４９】
実施例１ 四塩化炭素誘発性慢性肝線維症モデル動物実験
（１） 投与
８週齢の雄性ＳＤラット（ＢｉｏＬＡＳＣＯ社）２４匹を任意に８匹ずつ３群に分けた。また、四塩化炭素を２４容量％の割合でオリーブオイルへ溶解した。１週間ごとに２回、各ラットへ１．６７ｍＬ／ｋｇの当該溶液（四塩化炭素換算で０．４ｍＬ／ｋｇ）を腹腔内注射することにより、慢性肝線維症を誘発した。また、毎日、栄養チューブを用い、以下の試験物質を投与した。なお、シリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）はマリアアザミ由来の抽出物であり、肝機能の向上効果が期待されている公知化合物である。実験期間は計８週とした。
溶剤対照群：オリーブオイルを１０ｍＬ／ｋｇ
シリマリン投与群：２０ｍｇ／ｍＬのシリマリン−オリーブオイル溶液を１０ｍＬ／ｋｇ
ｍａｎｇｏｓｔｉｎ投与群：１０ｍｇ／ｍＬのｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ抽出物−オリーブオイル溶液を１０ｍＬ／ｋｇ
なお、上記ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ抽出物は、α−ｍａｎｇｏｓｔｉｎを８５％、β−ｍａｎｇｏｓｔｉｎを１０％含むものであった。
【００５０】
別途、８週齢の雄性ＳＤラット（ＢｉｏＬＡＳＣＯ社）３匹に対して上記処理を施さず、空白対照群とした。
【００５１】
（２） 血液分析
上記各ラットから、四塩化炭素を腹腔内注射する前（ＷＯ）、および第２，４，６，８週目に、尾部から約０．３ｍＬの血液を採取した。得られた血液サンプルを室温下で１時間静置した後、凝結させた。次いで、遠心機を使って２５℃、６０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心し、血清を得た。乾燥血液生化学分析装置（ＫＯＤＡＫ ＥＫＴＡＣＨＥＭ ＤＴ６０ＩＩ）を用い、肝障害の指標となるＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）とＡＬＴ（アラニン・アミノトランスフェラーゼ）の血清中濃度（単位：Ｕ／Ｌ）を測定した。ＡＳＴの測定結果を表１と図１に、ＡＬＴの測定結果を表２と図２に示す。また、ＡＳＴとＡＬＴの比率（ＡＳＴ／ＡＬＴ）を算出し、表３と図３に示す。結果は、平均値（ｍｅａｎ）±標準差（Ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ；Ｓ．Ｅ．）で表示する。また、ｔ−ｔｅｓｔで検定し、溶剤対照群と各群との間に有意な差異があるか否か比較した。ｐ値が０．０５より小さい場合、溶剤対照群と各群との間は、統計上、有意な差異があることを示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】
【表２】
【００５４】
【表３】
【００５５】
（３） 組織包埋切片の作成とコラーゲン染色（Ｓｉｒｉｕｓ＆Ｆａｓｔ ｇｒｅｅｎ染色法）
上記の動物試験終了時、全てのラットを屠殺し、肝臓左葉を約１センチの立方体の組織ブロック状に切り取り、１０％の中性ホルマリン中に入れて組織形態と構造を固定した。続いて、異なる濃度のエタノール（３０、５０、７０、９５、９９．５％）とキシレンにより脱水と透明化を行った。次いで、熱した石ロウ溶液でキシレンを置換した後、組織を石ロウ溶液と共に包埋した。完成した石ロウ標本は、切片機を利用して厚さ５μｍの石ロウ切片とした。得られた切片を清潔なスライド上に粘着し、３７℃で乾燥した。
【００５６】
上記肝臓組織切片をキシレンに３分間浸漬することにより脱ロウした。かかる操作を３回繰り返した。次いで、順に１００％、１００％、９０％、７０％および５０％のエタノールで、各３分間、復水を行った。続いて、ＴＢＳＴ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４）に３分間浸漬した後、０．１％のＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄと０．１％のＦａｓｔ ｇｒｅｅｎを使って１時間染色した。その後、脱水工程を行った。次いで、順に、５０％、７０％、９０％、１００％および１００％のアルコール中に１０秒間ずつ浸漬した後、キシレンを使った透明化を３回行った。最後に、搭載媒体でシールした。
【００５７】
染色された肝臓組織切片を、顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＴ７０−ＢＸ５１）により、肝線維症の程度評価と写真記録を行った。肝線維症程度評価は、Ｍｅｔａｖｉｒ ｓｃｏｒｅ（Ｂｏｉｇｋｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｒｕｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８９）に基づいて、以下の５段階レベルに評価した。
Ｆ０：肝線維症が観察されない
Ｆ１：門脈肝線維症（ｐｏｒｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）が観察される
Ｆ２：少量の線維隔膜（ｓｅｐｔａ）が観察される
Ｆ３：多くの線維隔膜が観察される
Ｆ４：肝硬変が観察される
結果を表４と図４に示す。
【００５８】
【表４】
【００５９】
実施例２ チオアセトアミド誘発性急性肝炎モデル動物実験
８週齢の雄性ＳＤラット（ＢｉｏＬＡＳＣＯ社）１２匹を任意に６匹ずつ２群に分けた。対照群には逆浸透圧水（ＲＯ水）を１０ｍＬ／ｋｇ、ｍａｎｇｏｓｔｉｎ投与群には実施例１と同様のｍａｎｇｏｓｔｉｎを１００ｍｇ／ｋｇ与えた。別途、チオアセトアミド（以下、「ＴＡＡ」と略記する）を生理食塩水に溶解した。各投与から１時間後、チオアセトアミド溶液をＴＡＡ換算で３００ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した。
【００６０】
ＴＡＡ注射直前（０時間）、およびＴＡＡ注射から２４時間後と４８時間後に、約０．５ｍｌ採血した。得られた血液サンプルを室温下で１時間静置した後、凝結させた。次いで、遠心機を使って２５℃、６０００ｒｐｍ／分で１０分間遠心し、血清を得た。上記実施例１と同様にして、ＡＳＴとＡＬＴの血清中濃度を測定した。ＡＳＴの測定結果を表５と図５に、ＡＬＴの測定結果を表６と図６に示す。また、ＡＳＴとＡＬＴの比率（ＡＳＴ／ＡＬＴ）を算出し、表７と図７に示す。さらに、血清中におけるＡＳＴとＡＬＴの増加倍数を算出し、それぞれ表８と図８および表９と図９に示す。
【００６１】
【表５】
【００６２】
【表６】
【００６３】
【表７】
【００６４】
【表８】
【００６５】
【表９】
【００６６】
結果の考察
表１、表２、図１および図２で示されるように、ｍａｎｇｏｓｔｉｎ投与群の第６週時の血清ＡＳＴ値とＡＬＴ値は、共に顕著に低下した。反対に、シリマリン投与群の第４週時の血清ＡＳＴ値とＡＬＴ値は明らかに増加した。
【００６７】
また、表３および図３で示されるように、シリマリン投与組の第４週時のＡＳＴ／ＡＬＴ比率は明らかに低下し、ｍａｎｇｏｓｔｉｎ投与組の第４週時と６週時のＡＳＴ／ＡＬＴ比率は有意に増加した。
【００６８】
さらに、表４および図４で示される肝線維症程度に基づくと、ｍａｎｇｏｓｔｉｎは、慢性肝疾患である肝線維症を顕著に減少させる肝臓保護効果を有することが実証された。
【００６９】
次に、表５〜６、表８〜９、図５、図６、図８および図９で示されるように、ｍａｎｇｏｓｔｉｎを投与した急性肝炎モデルラットの血清中のＡＳＴ値とＡＬＴ値は何れも低下の傾向が見られた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分としてキサントン誘導体を含むことを特徴とする抗肝炎剤。
【請求項２】
キサントン誘導体が、下記式（Ｉ）で表されるｍａｎｇｏｓｔｉｎ誘導体である請求項１に記載の抗肝炎剤。
【化１】
［式中、Ｒ1とＲ2は同一であっても異なっていてもよく、それぞれＨかＣ1-6アルキル基を示す］
【請求項３】
ｍａｎｇｏｓｔｉｎ誘導体がα−ｍａｎｇｏｓｔｉｎ、β−ｍａｎｇｏｓｔｉｎ、γ−ｍａｎｇｏｓｔｉｎ、またはそれらの組み合わせである請求項２に記載の抗肝炎剤。
【請求項４】
肝炎が急性肝炎または慢性肝炎である請求項１〜３のいずれかに記載の抗肝炎剤。
【請求項５】
急性肝炎が病毒性肝炎、アルコール性肝炎または薬物性肝炎である請求項４に記載の抗肝炎剤。
【請求項６】
慢性肝炎が肝線維症である請求項４に記載の抗肝炎剤。
【請求項７】
慢性肝炎が肝硬変である請求項４に記載の抗肝炎剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の抗肝炎剤を含むことを特徴とする健康食品。
【請求項１】
活性成分としてキサントン誘導体を含むことを特徴とする抗肝炎剤。
【請求項２】
キサントン誘導体が、下記式（Ｉ）で表されるｍａｎｇｏｓｔｉｎ誘導体である請求項１に記載の抗肝炎剤。
【化１】
［式中、Ｒ1とＲ2は同一であっても異なっていてもよく、それぞれＨかＣ1-6アルキル基を示す］
【請求項３】
ｍａｎｇｏｓｔｉｎ誘導体がα−ｍａｎｇｏｓｔｉｎ、β−ｍａｎｇｏｓｔｉｎ、γ−ｍａｎｇｏｓｔｉｎ、またはそれらの組み合わせである請求項２に記載の抗肝炎剤。
【請求項４】
肝炎が急性肝炎または慢性肝炎である請求項１〜３のいずれかに記載の抗肝炎剤。
【請求項５】
急性肝炎が病毒性肝炎、アルコール性肝炎または薬物性肝炎である請求項４に記載の抗肝炎剤。
【請求項６】
慢性肝炎が肝線維症である請求項４に記載の抗肝炎剤。
【請求項７】
慢性肝炎が肝硬変である請求項４に記載の抗肝炎剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の抗肝炎剤を含むことを特徴とする健康食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−１３１７８９（Ｐ２０１２−１３１７８９Ａ）
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２７３８２７（Ｐ２０１１−２７３８２７）
【出願日】平成２３年１２月１４日（２０１１．１２．１４）
【出願人】（３９００２３５８２）財団法人工業技術研究院 (524)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
【住所又は居所原語表記】１９５ Ｃｈｕｎｇ Ｈｓｉｎｇ Ｒｄ．，Ｓｅｃ．４，Ｃｈｕｔｕｎｇ，Ｈｓｉｎ−Ｃｈｕ，Ｔａｉｗａｎ Ｒ．Ｏ．Ｃ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１２月１４日（２０１１．１２．１４）
【出願人】（３９００２３５８２）財団法人工業技術研究院 (524)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
【住所又は居所原語表記】１９５ Ｃｈｕｎｇ Ｈｓｉｎｇ Ｒｄ．，Ｓｅｃ．４，Ｃｈｕｔｕｎｇ，Ｈｓｉｎ−Ｃｈｕ，Ｔａｉｗａｎ Ｒ．Ｏ．Ｃ
【Ｆターム（参考）】
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