抗菌性植物組成物
【課題】新規で有効な抗マイコバクテリア剤の提供。
【解決手段】本発明は、医薬担体ならびにコバルトセン−オクタメチル及びスチグマスタン−３，５−ジエンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、有機溶媒中に植物物質を抽出し、抽出した物質をクロマトグラフカラムに接触させ、極性移動相を用いてクロマトグラフカラムから溶出して組成物を得ることを含む、抗微生物活性を有する組成物を調製する方法も提供する。植物物質は、マミーアップル、ゼニゴケ、またはハナマキ由来である。本発明はまた、担体ならびにコバルトセン−オクタメチル及びスチグマスタン−３，５−ジエンの中から選択される少なくとも１種の化合物を含む組成物を投与することを含む、マイコバクテリウムの増殖を抑制する方法も提供する。
【解決手段】本発明は、医薬担体ならびにコバルトセン−オクタメチル及びスチグマスタン−３，５−ジエンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、有機溶媒中に植物物質を抽出し、抽出した物質をクロマトグラフカラムに接触させ、極性移動相を用いてクロマトグラフカラムから溶出して組成物を得ることを含む、抗微生物活性を有する組成物を調製する方法も提供する。植物物質は、マミーアップル、ゼニゴケ、またはハナマキ由来である。本発明はまた、担体ならびにコバルトセン−オクタメチル及びスチグマスタン−３，５−ジエンの中から選択される少なくとも１種の化合物を含む組成物を投与することを含む、マイコバクテリウムの増殖を抑制する方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抽出し精製した、抗微生物および抗マイコバクテリア活性を有する植物化合物の単離ならびに使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコバクテリウム属には、ヒト、他の哺乳動物、および鳥類で病気を引き起こす多くの細菌種が含まれている。例えば、ヒト型結核菌は、現在世界で最も一般的な感染症である結核の原因物質である。世界保健機関（ＷＨＯ）は、１７億人（もしくは世界の人口の約３分の１）が、ヒト型結核菌に感染しているまたは彼らの生涯のある時点で感染していたことを報告している（非特許文献１参照。）。米国では、１千万から１千５百万人が潜伏感染していると推定されている（非特許文献２参照。）。１年当り８百万の新しい臨床的な結核の症例が世界的に生じ、毎年約３百万人が死亡すると計算されている（非特許文献３参照）。
【０００３】
鳥型結核菌群（ＭＡＣ ｃｏｍｐｌｅｘ）（主に鳥型結核菌およびバテー杆菌）のマイコバクテリアは、ＡＩＤＳ患者の日和見病原体である。病気がかなり進行した段階のＡＩＤＳ患者の約４３％が、ＭＡＣ症を患っている（非特許文献４参照。）。ＡＩＤＳ関連感染症の他に、鳥型結核菌の亜種であるパラ結核菌が、腸の炎症性疾患であるクーロン病に関連していると考えられている（非特許文献５参照。）。
【０００４】
ヒト病原体と考えられている別のマイコバクテリアには、らい菌、Ｍ．カンサシ、Ｍ．マリヌム、Ｍ．フォーチュイタム菌群、ウシ型結核菌、Ｍ．スクロフラセウム、およびＭ．ウルセランスがある（非特許文献６、非特許文献７参照。）。世界的にらい菌感染症が推定５５０万症例ある（非特許文献８参照。）。
【０００５】
パラ結核菌も反芻動物で腸の炎症を引き起こし、これはより一般的にはヨーネ病として知られている（非特許文献９参照）。パラ結核菌の試験で陽性のウシは殺して処分する。全国的な群れの間の発生率は、通常３％〜１８％である（非特許文献１０参照）。この病気の酪農業界への経済的な影響は、毎年１５億ドルを超える（非特許文献１１参照）。ウシ型結核菌は、獣医学で重要な別のマイコバクテリアである。Ｍ．フォーチュイタムは、動物およびヒトの病巣から単離された土壌細菌である。鳥型結核菌は、ニワトリに病気を引き起こし、養鶏業界にとって重大な関心事である。Ｍ．マリヌムは、冷血動物および魚類に感染し、これもヒトの四肢の表層の肉芽種から単離されたものである。
【０００６】
抗癌、抗微生物、抗菌、および時には抗マイコバクテリア活性を求めて、これまで数百の植物種由来の抽出物が試験されてきた。全抽出物、または時には葉、幹、および根におよぶ植物組織由来の油には、様々な活性レベルがあることが示されている。ほとんどの場合、物質の化学組成は記載されていない。その概説については、非特許文献１２を参照できる。非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９、および非特許文献２０も参照できる。したがって、純粋で有効な抗マイコバクテリア化合物を同定する必要性が残っている。抗マイコバクテリア活性をもつ植物からの鉛抽出物の同定に関しての結果は、一般的に期待はずれであった（上掲の非特許文献１２を参照できる。しかし、非特許文献２１、非特許文献２２、および上掲の非特許文献１９も参照できる。）。
【０００７】
マイコバクテリア細胞壁の脂質性は、乾燥および酸またはアルカリ条件に対する耐性を与えることによって、マイコバクテリアの生存に寄与するように思われる。例えば、マイコバクテリアは、酸またはアルカリ条件および限られた期間の加熱滅菌に耐える。マイコバクテリウムは、強靭で、制御するのが困難な細菌であることが証明されている。数カ月後には、古い培養物または汚染された表面から新しい感染性マイコバクテリアを回収することができる。マイコバクテリア汚染を制御できる新しい薬剤が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４，２３５，８７１号明細書
【特許文献２】米国特許第４，５０１，７２８号明細書
【特許文献３】米国特許第４，８３７，０２８号明細書
【特許文献４】米国特許第５，０１９，３６９号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Kochi, A. Tubercle 72: 1-6 (1991)
【非特許文献２】Morbidity and Mortality Weekly Report 39 (RR-8): 9-12 (1990)
【非特許文献３】Morbidity and Mortality Weekly Report 42 (49): 961-964 (1993)
【非特許文献４】Nightingale et al., J. Infect. Dis. 165: 1082-1085 (1992)
【非特許文献５】Chiodini, R. J. Clin. Micro. Rev. 2: 90-117 (1989)
【非特許文献６】Baron, S., editor, MEDICAL MICROBIOLOGY, Second Edition, pages 562-564 Addison-Wesley Pub. Co., Menlo Park, CA (1996)
【非特許文献７】Wayne, L. G. et al., Clin. Micro. Rev. 5: 1-25 (1992)
【非特許文献８】Nordeen, S. K. et al., Int. J. Lepr. 63: 282-287 (1993)
【非特許文献９】Thoen, C. O. et al., Rev. Infect. Dis. 3: 960-972 (1981)
【非特許文献１０】Merkal, R. S. et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 190: 676-680 (1987)
【非特許文献１１】Whitlock, R. PROCEED. OF THE THIRD INTERNAT. COLL0Q. PARATUBERCUL., pp. 514-522 (1991)
【非特許文献１２】Newton et al., Phytother. Res., 14: 303-322 (2000)
【非特許文献１３】Soliman et al., Flavour and Fragrance Journal, 9 (1): 29-33 (1994)
【非特許文献１４】Hebda, Dissertation Abstracts International, 53 (4-C): 737 (1991)
【非特許文献１５】Robbs, Dissertation Abstracts International, 58 (6-B): 3009 (1997)
【非特許文献１６】Kurtulik, Dissertation Abstracts International, 43 (4-B): 1050 (1982)
【非特許文献１７】Oguntimein, Dissertation Abstracts International, 42 (02-B): 577 (1981)
【非特許文献１８】Frame et al., P. R. Health Sci. J., 17: 243-252 (1998)
【非特許文献１９】Lall et al., J Ethnopharmacol, 66: 347-354 (1999)
【非特許文献２０】Rastogi et al., FEMS Immuno. Med. Microblol. 20: 267-273 (1998)
【非特許文献２１】Rejab et al., Phytotherapy Research, 14: 303-322 (2000)
【非特許文献２２】George et al., Phytotherapy Research, 14: 303-322 (2000)
【非特許文献２３】Gordon et al., Phytotherapy Research 14: 303-322 (1996)
【非特許文献２４】Chung et al., Phytotherapy Research 14: 303-322 (1995)
【非特許文献２５】Gomez-Florex et al. J. Clin. Microbiol. 33: 1842-1846 (1995)
【非特許文献２６】Yajko et al., J. Clin. Microbiol. 33: 2324-2327 (1995)
【非特許文献２７】Crowle and May, Antimicrob. Agents Chemother. 34: 2217-2222 (1990)
【非特許文献２８】Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982)
【非特許文献２９】ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986)
【非特許文献３０】Remington's Pharmaceutical Science (17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985)
【非特許文献３１】Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9, 467 (1980)
【非特許文献３２】Bauer et al., Amer. J. Clin. Path., 21: 941-946 (1985)
【非特許文献３３】Siddiqi, Bactec TB system: Product and Procedure Manual, Becton Dickinson Diagnostic Instrument System, Towson, MD (1989)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
アメリカ合衆国における、ヒト型結核菌（ＭＴＢ）の多剤耐性株の発生についての報告によって、結核に対する新しい恐怖が生じている。これらの菌株は、少なくとも最も重要な抗結核剤であるイソニアシドおよびリファンピシンに耐性がある。アメリカ合衆国における多剤耐性結核の発生頻度は３〜７％、ニューヨークでは約１９％であると報告されている。したがって、現在使用されているものに代わる、またはそれに追加するための、新規で有効な抗マイコバクテリア剤が緊急に必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様として、本発明は、医薬担体ならびにコバルトセン−オクタメチルおよびスチグマスタン−３，５−ジエンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む医薬組成物を提供する。好ましい実施形態によれば、この組成物は、コバルトセン−オクタメチル、スチグマスタン−３，５−ジエン、およびフリーデリンを含む。別の好ましい実施形態によれば、この組成物は、α−カリオフィレン、β−カリオフィレン、カリオフィレンオキサイド、シクロドデカン、酢酸、およびテルペンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物をさらに含む。
【００１２】
医薬担体ならびにガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む医薬組成物も提供する。好ましい実施形態によれば、この医薬組成物は、ガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンを含む。別の好ましい実施形態によれば、この医薬組成物はさらに、３−シクロヘキサン−１−メタノール、カンフェン、１，４−シクロプロパ−アズレン、およびフィトールからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む。この医薬組成物は、これらの成分を単離または精製した形態で含む。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、有機溶媒中に植物物質を抽出し、抽出した物質をクロマトグラフ分離システムに接触させ、極性移動相を用いてクロマトグラフ分離システムから溶出して組成物を得ることを含む、抗微生物活性を有する組成物を調製する方法を提供する。植物物質は、マミーアップル、ゼニゴケ、またはハナマキから得たものであり、その組成物は抗微生物活性を有する。
【００１４】
本発明のさらに別の態様によれば、担体ならびにコバルトセン−オクタメチル、スチグマスタン−３，５−ジエン、ガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンの中から選択される少なくとも１種の化合物を含む組成物を投与することを含む、マイコバクテリウムの増殖を抑制する方法を提供する。マイコバクテリアは、鳥結核菌、ウシ型結核菌、バテー杆菌、Ｍ．カンサシ、らい菌、Ｍ．マリヌム、チモテ菌、Ｍ．スクロフラセウム、スメグマ菌、Ｍ．フォーチュイタム、ヒト型結核菌、またはＭ．ウルセランスである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】マミーアップルの活性画分のガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）分析の図である。この物質は、ＨＰＬＣを組み合わせて４回実行し、１滴まで濃縮し、それにメタノール約０．３ｍｌを加えることによって調製した。１０μｌをＧＣ／ＭＳで分析した。ピークを同定した。１３分におけるピークはコバルトセン−１，１’，２，２’，３，３’，４，４’−オクタメチルであり、３０分の直後のピークはスチグマスタン−３，５−ジエンであり、３６分の直後のピークはフリーデリンである。
【図２】ゼニゴケの活性画分のガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）分析の図である。この物質は、ＨＰＬＣを組み合わせて８回実行し、１滴まで濃縮し、それにメタノール約０．３ｍｌを加えることによって調製した。１０μｌをＧＣ／ＭＳで分析した。ピークを同定した。１３分におけるピークはコバルトセン−１，１’，２，２’，３，３’，４，４’−オクタメチルである。
【図３】ハナマキの活性画分のガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）分析の図である。この物質は、ＨＰＬＣを組み合わせて４回実行し、１滴まで濃縮し、それにメタノール約０．３ｍｌを加えることによって調製した。１０μｌをＧＣ／ＭＳで分析した。ピークを同定した。２０分の直前のピークはガロキソリドであり、それにサリチル酸ベンジルを含むピークが続いている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、抗微生物活性があると示されている精製植物画分および化合物の同定ならびに単離によって可能になった。本発明の一態様によれば、抗微生物活性を有する組成物を調製する方法を提供する。この方法は、有機溶媒中に植物物質を抽出し、抽出した物質をクロマトグラフ分離システムに接触させ、極性移動相を用いてクロマトグラフ分離システムから溶出して抗微生物活性を有する組成物を得ることを含む。植物物質は、マミーアップル、ゼニゴケ、またはハナマキ由来である。
【００１７】
植物のどんな部分も抽出手順にかけることができる。例えば、種子、幹、葉、花、または植物液汁が、有機溶媒を用いて抽出する植物物質であってよい。好ましい実施形態によれば、植物物質は葉である。
【００１８】
有機溶媒は、極性溶媒を含むことが好ましい。有機溶媒は、１種の溶媒を含むことができ、または溶媒の混合物とすることもできる。当業者によく知られている方法で緩衝液または塩を加えてもよい。一実施形態によれば、溶媒は水素結合しているものである。水素結合性溶媒は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、またはアミン含有溶媒とすることができる。溶媒にアルコールが含まれていると好ましい。より好ましい実施形態によれば、溶媒はエタノールであり、別の好ましい実施形態によれば、溶媒は塩化メチレンである。実際の抽出手順は当技術分野でよく知られている。例えば、溶媒中での振盪、または植物組織上への溶媒の滴下を使用することができる。
【００１９】
クロマトグラフ分離システムは、どんな適当なタイプにすることもできる。極性移動相の使用を可能にするどんな分離システムも、本発明で使用することができる。クロマトグラフ分離システムに、可能な限りの植物物質の分離に十分な容量があると好ましい。例えば、分離は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、セファデックスもしくはセファロースカラム、ＤＥＡＥ−セルロース、または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムであってよい。好ましい実施形態では、クロマトグラフ分離はＨＰＬＣシステムである。一実施形態によれば、アミド系カラムを使用する。
【００２０】
任意の極性移動相を使用して、単離した純粋な化合物または１組の化合物を得ることができる。一般に、より極性が弱い移動相よりも、より極性が強い移動相が好ましい。好ましくは、溶媒は、極性溶媒およびＮａＣｌなどの塩、またはリン酸を含むことができる。極性移動相は、水素結合溶媒を含むことができる。水素結合溶媒は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、またはアミン系溶媒となろう。一実施形態では、移動相の溶媒はアルコールを含む。好ましい実施形態によれば、移動相の溶媒はメタノールであり、より好ましい実施形態によれば、極性移動相はメタノールとリン酸の混合物を含む。好ましい実施形態によれば、メタノール−リン酸移動相は、１ｍＭから少なくとも約２０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭのリン酸を含む。極性移動相は、定組成、すなわち一濃度とすることができ、または１％から９９％の勾配とすることもできる。
【００２１】
任意の適当な分析技術、例えば時間の関数として溶出した物質の紫外可視化によって、またはＴＬＣの使用によって画分を回収し分析する。次に、抗微生物活性を有する画分を同定する。１組の条件がわかると、次いで、それが活性画分または化合物の回収に関する標準になり得る。例えば、１組の条件下におけるカラムの保持時間は、同じ植物からの精製した活性画分または化合物のさらなる単離の指針である。
【００２２】
単離した画分、ならびにこれらの画分から単離および精製した化合物を、抗微生物活性について試験する。抗微生物活性を有する画分および化合物は、以下に時々「活性」であると称する。
【００２３】
例えば、抗微生物活性は、抽出した物質、精製および単離した画分、または単離および精製した化合物、またはその組成物を微生物と接触させ、その微生物の感受性を調べることによって実証することができる。微生物は、任意の微生物、例えば細菌、真菌、または原生動物とすることができる。好ましくは、微生物は細菌である。より好ましくは、エシェリキア属またはマイコバクテリウム属由来である。さらにより好ましくは、マイコバクテリウム属が病原細菌、すなわちヒト、動物または鳥類に対して病原性である。最も好ましくは、細菌がヒト型結核菌である。
【００２４】
当業者は、当技術分野で周知の標準アッセイにより、どのようにして感受性を調べるかを知っているはずである。当業者は、適切な負および正の対照を含めて、どのようにしてアッセイを実施して、アッセイの結果を確実に意味があるものにするか知っているはずである。選択するアッセイは、感受性について試験する生物によって決まる可能性がある。マイコバクテリアアッセイ（これは他の微生物を試験するために、当業者によって容易に変えることができる）の例として、上掲の非特許文献１２を参照できる。例えば、最も一般に、使用する試験方法は、ディスク拡散法および液体希釈法である。ディスク拡散法の場合、試験中の抽出物を含浸させた紙のディスクを、マイコバクテリアを播種した半固体（寒天系）培地上に置く。培養後、ディスク周囲の細菌増殖が抑制された領域を測定する。液体希釈法の場合、播種した液体培地中に抽出物の希釈系列を含む一連のチューブを用いて、細菌増殖を抑制するのに必要な最小濃度（最小阻止濃度、ＭＩＣ）を決定する。
【００２５】
高スループットのスクリーニングには、自動化できる迅速な方法が知られている。非特許文献２３にその総説がある。例えば、14Ｃ−パルミチン酸を含む培地中で培養したヒト型結核菌からの14ＣＯ2の発生を測定することにより、ＢＡＣＴＥシステム（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ、英国）の基準が形成された。ＢＡＣＴＥシステムは、臨床分離菌の感受性試験に使用されており、従来の方法では３〜４週間かかるのと比べて、数日で結果を得ることができる。非特許文献２４では、Ｍ．アウルム中への放射標識したウラシルの吸収を測定することに基づいたアッセイが開発されている。
【００２６】
マイコバクテリア生存度を細菌またはホタルルシフェラーゼのいずれかを用いて決定するアッセイが開発された。細菌酵素は、還元型フラビン（生きたマイコバクテリアによって生成される）を用いて加えられたアルデヒド基質（デカナール）を酸化し、それは４９０ｎｍにおける光の生成を伴う。ホタルルシフェラーゼは、マイコバクテリアによって生成されるＡＴＰに依存してルシフェリンを脱炭酸し、その結果５６２ｎｍにおける光が生成される。光の生成は、高スループットシステムのルミノメータを用いて容易に測定することができる。ヒト型結核菌を含む数種のマイコバクテリアが、バクテリアルシフェラーゼの産生に関する遺伝子を挿入することにより遺伝子操作されている。デカナールを加えたときに生きた桿菌だけが光を放出し、増殖に対する要求条件はなく、したがって感受性試験を迅速に行うことができる。同様に、ホタルルシフェラーゼに関する遺伝子は、Ｍ．アウルム．Ｉｄ．を含むいくつかのマイコバクテリア種に組み込まれている。
【００２７】
比色法は、マイクロタイタープレートで使用するのに適しており、分光光度計を用いて結果を容易に得ることができる。生きた細菌のジメチルチアゾールジフェニルテトラゾリウムをホルマザンに還元する能力に依存する、鳥型結核菌群に対する試験のアッセイとして報告されている（非特許文献２５参照。）。別の類似の方法では、生きたヒト型結核菌が存在すると色が青からピンクに変化する酸化還元染色液アラマーブルーを利用している（非特許文献２６参照。）。
【００２８】
ヒト大食細胞内でヒト型結核菌を抑制するのに、植物化合物の能力を評価することは役立つかもしれない。これは、非特許文献２７の方法によって行うことができる。
【００２９】
当業者には、「単離した純粋な」画分、１種または複数の化合物は、ある種の他の物質を常に伴うことが理解されよう。本明細書では、「単離した純粋な」画分、１種または複数の化合物は、出発物質（本明細書では植物組織）中のその重量、または体積、または重量／体積に対して、重量、または体積、または重量／体積で少なくとも１００、好ましくは１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、もしくは１００００倍以上豊富な画分、１種または複数の化合物を意味する。あるいは、当業者は、「単離した純粋な」を純度の点から表してもよい。もしそうならば、本発明の活性画分、１種または複数の化合物は、出発物質（本明細書では植物組織）に対して、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、あるいはそれ以上純粋である。
【００３０】
最初に、エタノールを用いてマミーアップル、ゼニゴケ、およびハナマキ組織を別々に抽出し、抽出物には、大腸菌およびスメグマ菌に対して活性があることが判明した。ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）による分析ならびに得られたプロフィールと既知の化合物のプロフィールとの比較によって、抽出物中の大きな組の化合物が明らかになった。例えば、既知の化合物は、そのプロフィールをデータベース中の既知のプロフィールと比較することにより、この方法によって同定することができる。１つの好ましいこのようなデータベースは、米国ワシントンにある国立標準技術研究所（National Institute of Standards and Technology）から入手可能な１２９Ｋ ＮＩＳＴ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ Ｌｉｂｒａｒｙと称される分子クラッキングパターンのライブラリである。同じ組の抽出物および分析（抗微生物活性およびＧＣ／ＭＳ）を追加の植物物質で行い、ただし抽出溶媒を塩化メチレンとした場合、抗微生物活性抽出物中で同定された化合物の数は少なかった（それぞれがしたがってより純粋である）。最も興味深いことには、活性化合物が両方の抽出物中に存在していたにもかかわらず、エタノールおよび塩化メチレン抽出物中の化合物の間でほとんど重複していなかったことである（またいくつかの植物ではまったく重複していなかった）。これについては、表２〜４を参照できる。これは、各植物においてたった１種または極少数の化合物が抗微生物活性を引き起こしいること、および２種以上の化合物の場合、２つの異なる抽出システムで同時精製していることから、活性化合物の溶解性が非常によく似ていることを示すものであった。
【００３１】
マミーアップル、ゼニゴケ、またはハナマキ由来の塩素メチレン抽出物をＨＰＬＣシステムで分離した。活性画分を同定した。次に活性化合物を同定した。マミーアップル由来の化合物には、コバルトセン−オクタメチル、スチグマスタン−３，５−ジエン、およびフリーデリンが含まれる。さらに、分画前の抽出物中の化合物の化学的性質を考慮すると、１種または複数のα−カリオフィレン、β−カリオフィレン、カリオフィレンオキシド、シクロドデカン、酢酸、およびテルペンも極微量（すなわち、本明細書に記載の条件下でのＧＣ／ＭＳでは検出不可能）存在するかもしれないことが示唆される。
【００３２】
ゼニゴケ由来の化合物には、酢酸、コバルトセン−オクタメチル、およびβ−ミルセンが含まれる。さらに、分画前の抽出物中の化合物の化学的性質を考慮すると、ヘキサデカン酸も極微量存在するかもしれないことが示唆される。
【００３３】
ハナマキ由来の化合物には、ガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンが含まれる。さらに、分画前の抽出物中の化合物の化学的性質を考慮すると、１種もしくは複数の３−シクロヘキサン−１−メタノール、カンフェン、１，４−シクロプロパ−アズレン、またはフィトールも極微量存在するかもしれないことが示唆される。
【００３４】
本発明の別の態様によれば、医薬担体およびコバルトセン−オクタメチルまたはスチグマスタン−３，５−ジエンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む医薬組成物を提供する。好ましい実施形態によれば、この医薬組成物は、コバルトセン−オクタメチル、スチグマスタン−３，５−ジエン、およびフリーデリンを含む。この医薬組成物はさらに、α−カリオフィレン、β−カリオフィレン、カリオフィレンオキシド、フリーデリン、シクロドデカン、酢酸、およびテルペンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含むことができる。
【００３５】
本発明の別の態様によれば、医薬担体ならびにガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む医薬組成物を提供する。好ましい実施形態によれば、この組成物は、ガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンを含む。この医薬組成物はさらに、３−シクロヘキサン−１−メタノール、カンフェン、１，４−シクロプロパ−アズレン、およびフィトールからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含むことができる。
【００３６】
医薬組成物には、医薬として許容される塩および担体を含んでいてよい。 医薬として許容される塩の例には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸および硫酸などの鉱酸、ならびに酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、およびアリールスルホン酸などの有機酸から誘導されたものがある。アリールスルホン酸の例は、ｐ−トルエンスルホン酸である。例えば、化合物または画分のカルボキシル基は、当業者に既知の塩、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウムまたはカリウム）塩、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム）塩、またはアンモニウム塩に変換することができる。本発明はさらに、上記の化合物（または化合物もしくは画分）および医薬として許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００３７】
一般に、上記のような本発明の化合物または画分は、医薬組成物として、病原微生物、例えばマイコバクテリウムに感染している、または感染していると疑われている個体に投与することになる。化学療法を受けている、または受けようとしている人は、化合物もしくは画分を用いて個別に、または適宜他の治療と併せて治療することができる。治療適用する場合、病原微生物の増殖の限界を引き出すのに十分な量で組成物を患者に投与する。これを達成するのに十分な量は、「治療有効投与量」と定義する。治療または予防的使用に有効な量は、例えば、治療している疾患の段階および重症度、患者の年齢、体重、および一般的な容態、ならびに処方する医師の判断によって決まることになる。投与サイズも、選択する化合物または画分、投与方法、投与のタイミングおよび頻度ならびに特定の化合物または画分の投与に伴う可能性のある任意の副作用の存在、性質、および程度ならびに所望の生理学的効果によって決定されることになる。様々な疾患状態は、おそらくはそれぞれまたは種々の投与ラウンドで、本発明の一連の異なる化合物または画分を用いて、複数回投与を伴う長期治療を必要とするかもしれないことが当業者には理解されよう。
【００３８】
適当な投与量および投与計画は、当業者に既知の従来の範囲検出技術によって決定することができる。一般に、治療は、化合物または画分の最適投与量よりも少ない、より少ない投与量で開始する。その後、その状況下における最適の効果に達するまで、小さな増分で投与量を増大する。本発明の方法は、個体の体重１ｋｇ当り１種または複数の化合物または画分について約０．１μｇから約５０ｍｇの投与を含んでいてよい。７０ｋｇの患者では、病原体の増殖制限または抑制を測定することによって決定されるような患者の生理学的応答に応じて、化合物または画分について約１０μｇから約２００ｍｇの投与量がより一般に使用されるであろう。
【００３９】
本発明の化合物または画分および組成物は、生死にかかわる、または生死にかかわる可能性がある状況を含む多くの疾患状態で使用できることを留意しておく必要がある。多少の、もしくは実質的に過剰な化合物または画分を投与することが可能であり、また治療している医師にとって望ましく感じられるかもしれない。化合物もしくは画分の１回または複数回投与は、治療している医師によって選択される投与レベルおよびパターンで行うことができる。
【００４０】
治療用の医薬組成物は、非経口、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、経口または部分（ｌｏｃａｌ）投与を目的としており、一般に医薬として許容される担体および病原微生物の増殖を抑制するのに十分な量の有効成分を含む。担体は、従来使用されているもののどれでもよく、溶解性および化合物または画分との反応性の欠如など物理化学的検討材料、ならびに投与ルートによってのみ制限される。
【００４１】
医薬として許容される担体（または賦形剤）は、化合物、画分または活性化合物に対して化学的に不活性なもの、および使用条件下で有害な副作用または毒性がないものであることが好ましい。こうした医薬として許容される担体は、生理食塩水（例えば、生理食塩水０．９％）、クレモホールＥＬ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓから入手可能なヒマシ油およびエチレンオキシドの誘導体である）（例えば、クレモホールＥＬ５％／エタノール５％／生理食塩水９０％、クレモホールＥＬ１０％／生理食塩水９０％、またはクレモホールＥＬ５０％／エタノール５０％）、プロピレングリコール（例えば、プロピレングリコール４０％／エタノール１０％／水５０％）、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００ ４０％／生理食塩水６０％）、およびアルコール（例えば、ｔ−ブタノール４０％／水６０％）を含むことが好ましい。好ましい医薬担体は、ＰＥＧ ４００などのポリエチレングリコール、特にＰＥＧ ４００ ４０％および水または生理食塩水６０％を含む組成物である。担体の選択は、選択する特定の化合物または画分、ならびに組成物を投与するのに使用する特定の方法によってある程度決定されるはずである。したがって、本発明の医薬組成物の適当な製剤は多種多様にある。
【００４２】
以下の経口、エアロゾル、非経口、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、直腸、および膣投与用の製剤は、単に例示的なものに過ぎず、決して限定するものではない。医薬組成物は、非経口的に、例えば静脈内、動脈内、皮下、皮内、または筋肉内に投与することができる。したがって、本発明は、水性および非水性、等張性無菌注射液を含めた、非経口投与に適した許容される担体中に溶解または懸濁させた化合物もしくは画分の液剤を含む非経口投与用の組成物を提供する。
【００４３】
概して、非経口組成物用の有効な医薬担体に対する要求は、当業者によく知られている。これについては、非特許文献２８および非特許文献２９を参照できる。こうした組成物は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を対象とするレシピエントの血液と等張にする溶質を含有する液剤；ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含むことができる水性および非水性の無菌懸濁剤を含む。該化合物または画分は、医薬的に受け入れることのできる石鹸または洗浄剤などの界面活性剤、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、もしくはカルボキシメチルセルロースなどの懸濁化剤、または乳濁化剤および他の医薬補助剤を加えて、あるいは加えずに、無菌の液体または液体の混合物などの医薬担体中の生理学的に許容される希釈剤に溶かして投与することができ、該希釈剤としては、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖液、エタノール、イソプロパノール、もしくはヘキサデシルアルコールなどのアルコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコール、ジメチルスルホキシド、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノールなどのグリセロールケタール、ポリ（エチレングリコール）４００などのエーテル、油剤、脂肪酸、脂肪酸エステルもしくはグリセリド、またはアセチル化脂肪酸グリセリドを含む。
【００４４】
非経口製剤に有用な油剤には、石油、動物油、植物脂、および合成油がある。こうした製剤に有用な油剤の具体的な例には、ピーナッツ油、大豆油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ワセリン、および鉱油がある。非経口製剤に使用する適当な脂肪酸には、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸がある。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、適当な脂肪酸エステルの例である。
【００４５】
非経口製剤に使用する適当な石鹸には、脂肪アルカリ金属塩、アンモニウム塩、およびトリエタノールアミン塩があり、適当な清浄剤には、（ａ）例えばジアルキルジメチルアンモニウムハロゲン化物、およびアルキルピリジニウムハロゲン化物などの陽イオン性清浄剤、（ｂ）例えばアルキル、アリール、およびオレフィンスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル、およびモノグリセリド硫酸塩、ならびにスルホコハク酸塩などの陰イオン性清浄剤、（ｃ）例えば脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、およびポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマーなどの非イオン性清浄剤、（ｄ）例えばアルキル−β−アミノプロピオン酸塩、および２−アルキル−イミダゾリン第四級アンモニウム塩などの両性清浄剤、ならびに（ｅ）それらの混合物がある。
【００４６】
非経口製剤は通常、溶液中に有効成分または化合物もしくは画分を、約０．５重量％以下の値から約２５重量％以上の値までの範囲で含むはずである。防腐剤および緩衝剤を使用してもよい。注射部位で刺激を最小化または排除するために、こうした組成物は、１種または複数の親水性−新油性バランス（ＨＬＢ）が約１２から約１７の非イオン性界面活性剤を含んでいてよい。こうした製剤中の界面活性剤の量は典型的には、約５重量％から約１５重量％であろう。適切な界面活性剤には、モノオレイン酸ソルビタンなどのポリエチレンソルビタン脂肪酸エステルおよびプロピレンオキシドとプロピレングリコールの縮合によって形成した疎水性基剤を含んだエチレンオキシドの高分子量付加物が含まれる。非経口製剤は、アンプル剤、バイアルなどの１回分または多数回分の密封容器で提供することができ、注射するのに、使用直前に無菌の液状賦形剤、例えば水の添加しか必要としないフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵することができる。即時注射液および懸濁剤は、無菌の散剤、顆粒剤、および錠剤から調製することができる。
【００４７】
経皮薬物放出に有用なものを含む局所製剤は、当業者によく知られており、本発明において皮膚に適用するのに適している。
【００４８】
経口投与に適した製剤は、（ａ）水、生理食塩水、もしくはオレンジジュースなどの希釈剤中に溶解させた有効量の化合物または画分などの溶液、（ｂ）、それぞれが所定量の化合物または画分を固体または顆粒として含むカプセル剤、サッシェ、錠剤、トローチ剤（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）、および口内錠（ｔｒｏｃｈｅｓ）、（ｃ）散剤、（ｄ）適切な液体中の懸濁剤、および（ｅ）適当な乳剤で構成することができる。液体製剤は、医薬として許容される界面活性剤、懸濁化剤、もしくは乳濁化剤を追加して、または追加しないで、水ならびにアルコール、例えばエタノール、ベンジルアルコール、およびポリエチレンアルコールなどの希釈剤を含んでもよい。カプセル剤形態は、例えば界面活性剤、滑剤、ならびにラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、およびコーンスターチなどの不活性充填剤を含む、通常の硬殻または軟殻ゼラチンタイプとすることができる。錠剤形態は、１種または複数のラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、微結晶性セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、防腐剤、着香料、および薬理学的に適合する賦形剤を含むことができる。トローチ剤形態は、香料、通常スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴム中に有効成分を含むことができ、同様にゼラチンおよびグリセリンなどの不活性基剤、またはスクロースおよびアラビアゴム、乳剤、ゲル剤などの中に化合物または画分を含み、化合物または画分に加えて、当技術分野で既知の賦形剤を含んだ香錠とすることもできる。
【００４９】
本発明の化合物もしくは画分は、単独でまたは他の適当な成分と併せて、エアロゾル製剤にして吸入によって投与することができる。化合物または画分は、界面活性剤および噴射剤と共に微粉砕した形態で供給することが好ましい。活性化合物または画分の典型的なパーセント値は、約０．０１重量％から約２０重量％、好ましくは約１重量％から約１０重量％であってよい。界面活性剤は、もちろん、非毒性であるべきであり、噴射剤中に溶解することが好ましい。こうした界面活性剤を代表するものは、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）およびオレイン酸などの６から２２個の炭素原子を含む脂肪酸と、脂肪族多価アルコールまたはその環状酸無水物によって得られるエステルまたは部分エステルである。混合グリセリドまたは天然グリセリドなどの混合エステルを使用してもよい。界面活性剤は、組成物の約０．１％から約２０重量％、好ましくは約０．２５％から約５％を構成してもよい。組成物の残りは通常、噴射剤である。所望のように、担体、例えば鼻腔内送達用のレシチンを含めることもできる。これらのエアロゾル製剤は、ジクロロフルオロメタン、プロパン、窒素などの許容される加圧噴射剤中に入れることができる。これらはまた、ネビュライザーまたはアトマイザー中などの非加圧製剤用の医薬として調製してもよい。こうしたスプレー製剤は、粘膜に噴霧するのに使用してもよい。
【００５０】
さらに、化合物もしくは画分は、乳化性基剤または水溶性基剤などの様々な基剤と一緒に混合することによって坐剤にすることができる。膣投与に適した製剤は、有効成分に加えて、当技術分野で適切だということで知られている担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、パスタ剤、発泡体、またはスプレー剤として提供することができる。
【００５１】
製剤中の本発明の化合物または画分の濃度は、例えば、重量で約１％未満、通常または少なくとも約１０％から、２０％から５０％あるいはそれ以上まで変動してもよく、選択する特定の投与方法によって、主に流体体積、および粘度によって選択してもよい。
【００５２】
したがって、静脈内注入のための典型的な医薬組成物は、無菌リンゲル液２５０ｍｌ、および化合物または画分１００ｍｇを含有するように構成することができる。非経口的に投与可能な化合物または画分を調製する実際の方法は、当業者に既知または明らかであり非特許文献３０参照に、より詳細に記載されている。
【００５３】
上記の医薬組成物に加えて、本発明の方法の化合物または画分は、シクロデキストリン包接錯体などの包接錯体、またはリポソームとして調製できることが当業者によって理解されよう。リポソームは、標的であるリンパ組織または癌性肝細胞などの特定の組織に化合物もしくは画分を送る働きをすることができる。リポソームは、化合物または画分の半減期を増大させるのに使用することもできる。リポソームを調製するために、たとえば、非特許文献３１および特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４に記載されているような多くの方法が利用できる。
【００５４】
本発明の別の態様によれば、担体ならびにコバルトセン−オクタメチル、スチグマスタン−３，５−ジエン、ガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンの中から選択される少なくとも１種の化合物を含む組成物を投与することを含む、マイコバクテリウムの増殖を抑制する方法を提供する。本組成物は、貯蔵用に適切に調製され、清浄剤として使用することになっている。したがって、本組成物は、上記に挙げた化学物質の化学活性を妨害しない清浄剤をさらに含んでもよい。このような清浄液の調製および一般的な清浄剤の包含は、理論化学的考慮事項を与えられた当業者によって容易に行うことができ、該液剤の安定性および有効性は、当業者によって容易に試験することができる。この試験は、抗微生物アッセイなどの生物学的アッセイを含むだろう。このような清浄液の調製および組成もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００５５】
清浄液は、少なくともマイコバクテリアまたは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して活性である。以下は、活性化合物、活性画分、ならびに本発明の方法によって抑制されるマイコバクテリアおよび亜群の一覧である。マイコバクテリウム群もしくはマイコバクテリウム菌群またはマイコバクテリウム種、最も好ましくはヒト型結核菌（ＭＴＢ）群、鳥型結核菌群、ＭＡＩＳ菌群およびＭ．フォーチュイタム菌群などのマイコバクテリウム菌群、ならびに特定および不特定の光発色菌、非光発色菌、暗発色菌、特にＭ．アフリカヌム、Ｍ．アジアティクム、鳥型結核菌、ウシ型結核菌、ウシ型結核菌（ＢＣＧ）、Ｍ．ブチリクム、Ｍ．ケローネ、Ｍ．デュバリ、Ｍ．フラベッセンス、Ｍ．フォーチュイタム、Ｍ．ガストリ、Ｍ．ゴルドネ、Ｍ．ヘモフィルム、バテー杆菌、Ｍ．カンサシ、らい菌、鼠らい菌、Ｍ．リンダ、Ｍ．ルフ、Ｍ．マリヌム、Ｍ．マルモエンセ、Ｍ．ミクロティ、Ｍ．ムコスクム、Ｍ．ノンクロモジェニカム、パラ結核菌、Ｍ．ペレグリヌム、チモテ菌、Ｍ．ロドクラウス、Ｍ．スクロフラセウム、Ｍ．シモイデイ、Ｍ．シミエ、スメグマ菌、Ｍ．シュルガイ、Ｍ．テラエ、Ｍ．サーモレジスタブル、Ｍ．トリビアーレ、ヒト型結核菌、Ｍ．ウルセランス、Ｍ．バッカエ、Ｍ．ゼノピ、およびその血清型を含む、迅速発育および遅発育（すなわち、標準な実験室条件での平均発生時間が６０分未満）マイコバクテリアが抑制される。Ｍ．カンサシ、Ｍ．マリヌム、Ｍ．シミエおよびＭ．アジアティクムは、光発色菌の例である。Ｍ．スクロフラセウム、Ｍ．シュルガイ、Ｍ．ゼノピ、Ｍ．ゴルドネおよびＭ．フラベッセンスは、暗発色菌の例である。鳥型結核菌、バテー杆菌、Ｍ．ガストリ、Ｍ．マルモエンセ、Ｍ．テラエおよびＭ．トリビアーレは、すべて非光発色菌の例である。Ｍ．アフリカヌム、鳥型結核菌、ウシ型結核菌、Ｍ．ヘモフィルム、バテー杆菌、Ｍ．カンサシ、Ｍ．マルモエンセ、Ｍ．マリヌム、Ｍ．ミクロティ、パラ結核菌、Ｍ．スクロフラセウム、Ｍ．シミエ、Ｍ．シュルガイ、ヒト型結核菌、およびＭ．ゼノピは、すべて遅発育（７日より多く要する）マイコバクテリア種の例である。Ｍ．ケロネイ、Ｍ．フラベッセンス、Ｍ．フォーチュイタム、Ｍ．ゴルドネ、らい菌、チモテ菌、スメグマ菌、Ｍ．テラエ、Ｍ．ウルセランスは、すべて迅速発育（プレート上でコロニー発生に７日未満を要する）マイコバクテリア種の例である。ヒト型結核菌、Ｍ．アフリカヌム、ウシ型結核菌、ウシ型結核菌（ＢＣＧ）、およびＭ．ミクロティは、ＭＴＢ菌群に属している。鳥型結核菌およびバテー杆菌は、鳥型結核菌群に属している。鳥型結核菌には少なくとも３種の異なる血清群があり、バテー杆菌には２５種以上の血清型がある。
【００５６】
このように全般的に説明した本発明は、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されよう。これらの実施例は、例示する目的で提供されており、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００５７】
この実施例は、マミーアップル、ハナマキ、およびゼニゴケのエタノール性植物抽出物は著しい抗マイコバクテリア活性を有するが、エビに対して制限された毒性を有し、また哺乳動物に対して検出可能な毒性を有していないことを示す。
【００５８】
５０の植物種由来の植物の葉約３ポンド（１．４ｋｇ）を４２℃でオーブン乾燥し、混合機で粉砕した。粉砕した物質３０グラムを無水エタノール（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国カリフォルニア州Ｇａｒｄｅｎ）３００ｍｌ中で室温で２４〜３６時間振盪することによって抽出した。次いで液体を、ワットマン紙＃４、次いで＃２（ＶＲＷ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国オハイオ州Ｗｉｌｌａｒｄ）でろ過し、Ｂｕｃｈｉ／Ｂｅｃｋｍａｎロータリーエバポレータ（ＶＲＷ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国オハイオ州Ｗｉｌｌａｒｄ）で４０℃で蒸発させた。試験用に、物質を所望の濃度でメタノール中に再懸濁した。
【００５９】
各抽出物の活性をスメグマ菌６０７（ＡＴＣＣ、米国メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）について試験した。寒天−ディスク拡散アッセイを、他の植物由来の抽出物、ならびに対照としてのストレプトマイシン１０μｇ、水およびメタノールのアッセイと並行して行った（非特許文献３２参照）。各抽出物濃縮物および対照の複数平板培養を行い、抑制結果の領域を表にし平均をとった。試験した他の植物抽出物の中で、マミーアップル、ハナマキ、およびゼニゴケはスメグマ菌に対して、再懸濁させた抽出物をそれぞれ少なくとも２５μｇ、２５μｇ、および５０μｇ試験したとき、測定可能で再現可能な抑制領域を示し、最も活性であることが判明した（上掲の非特許文献１８参照）。
【００６０】
ＢＡＣＴＥＣ−４６０法によって、抽出物の活性をヒト型結核菌２７２９４（ストレプトマイシン感受性株、ＡＴＣＣ、米国メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）についても試験した。この方法では、試験バイアルから吸引した14ＣＯ2の測定によって、試験物質または対照の存在下で液体培養で増殖させた培養物の増殖の抑制をモニターする。この結果を、負の対照培養物（培地に添加された水）に対する試験培養物の増殖速度または増殖指数（ＧＩ）の毎日の変化として示す（上掲の非特許文献１８および非特許文献３３参照）。培養物約４．１ｍｌを１２日目まで増殖させ、ＧＩを４日目から始めて毎日調べた。この場合も追加の植物抽出物、およびストレプトマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）、水、未処理の試料、およびメタノール（４．１ｍｌの体積中に２５μｌおよび５０μｌ）を対照として使用し、各増殖培養を３〜６回繰り返した結果の平均をとった。植物抽出物の影響は、一過性の性質をもち、すなわち、数日後、処理への耐性が再び現れた。これは、マミーアップル、ハナマキ、およびゼニゴケ抽出物は、静菌（殺菌ではなく）モードの作用をもつことを示唆している。このアッセイによって、ヒト型結核菌は、マミーアップル、ハナマキおよびゼニゴケに対してそれぞれ抽出物５０μｇ、５０μｇ、および１００μｇで感受性を示した。マミーアップル植物抽出物に対するスメグマ菌の感受性は、ストレプトマイシンに対する感受性とほぼ同等であった。表１を参照すれば、各抽出物濃度についての３〜６回の読みの結果を表にし、負の対照の増殖指数指標（ΔＧＩ）が＞３０であったことがわかる。
【００６１】
【表１】
【００６２】
したがって、２種の異なるアッセイシステムにより、マミーアップル、ハナマキ、およびゼニゴケ由来の植物抽出物はそれぞれ、２種の異なるマイコバクテリア種に対して著しい活性を有することを示した。
【実施例２】
【００６３】
マミーアップル、ハナマキ、またはゼニゴケの植物抽出物に関連する哺乳動物への著しい毒性がないことを示す。
【００６４】
ＣＦ−１非近交系マウス（５０日齢のオス、平均重量３０グラム）ＳＡＳＣＯ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国マサチューセッツ州Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）７匹のグループを、１５日間にわたって、毎日１００μｌの注射として、メタノール中に再懸濁させた植物抽出物５００μｇを各グループに腹膜投与することにより試験した。試験した植物抽出物には、マミーアップル、ハナマキ、およびゼニゴケが含まれていた。生理食塩水（１００μｌ）または生理食塩水とメタノールの混合物（それぞれ５０μｌ）を与えたマウスの２つのグループを対照として使用した。
【００６５】
マウスを１カ月間観察したままにし、以下のパラメーター、すなわち活性の変化、糞の硬さ、毛の状態、皮膚の損傷、眼の変化、食欲（水および食物の摂取）、体重減少、温度変化および死亡率を毎日測定した。
【００６６】
一般に、本研究に含まれている植物に由来する６種すべての抽出物は、マウス毒性試験でよく許容された。ゼニゴケ抽出物を接種した１匹のマウスは、接種中の腸の穿孔によって引き起こされた敗血症が原因で１３日目に死亡した。ハナマキを注射した別のマウスは、３日連続して食欲不振および体重減少を経験した後、１５日目に死亡した。このマウスが死んでいるのを発見した翌日に行った検死の結果、不審死であることがわかった。
【００６７】
体重１グラム当り植物抽出物約１６．７μｇに曝露したマウスは、植物抽出物の毒作用を示さなかったと結論付けられる。
【実施例３】
【００６８】
この実施例は、抗マイコバクテリア抽出物を代替抽出溶媒によって得ることができ、塩化メチレン抽出がより純粋な活性画分をもたらすことを示す。
【００６９】
マミーアップル、ゼニゴケ、およびハナマキから活性化合物を精製する可能性を示唆するかもしれない予備段階で、代替有機溶媒を用いた抽出を始めた。代替有機溶媒を用いた抽出によって抗マイコバクテリア活性をもつ抽出物を得ることができるならば、活性成分が純粋な画分として単離できる単一化合物または化合物の極小のグループである可能性が増大するだろう。試験した代替溶媒は、塩化メチレンである。
【００７０】
粉末の葉組織約５グラムを室温で４時間無水塩化メチレン１００ｍｌ中で振盪することによって抽出した。一般にエタノール抽出物を用いた試験について前述したように、寒天拡散アッセイによって抽出した物質を試験した。塩化メチレン抽出物は、スメグマ菌６０７（ＡＴＣＣ）に対して測定可能で再現可能な抗マイコバクテリア活性を示した。
【００７１】
表２、３、および４はそれぞれ、ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）分析によって決定したマミーアップル、ゼニゴケ、およびハナマキのエタノール抽出物と塩化メチレン抽出物中の主成分を並べて示す。エタノール抽出は、抽出した物質の重量によって示された可溶物質の保持についてより有効であった。出発物質の重量のパーセント値で、エタノール抽出では、マミーアップル、ゼニゴケ、およびハナマキがそれぞれ１８．７％、１．６％、および２４．２％得られたが、塩化メチレンでは、１．４６％、０．２６％、および０．７３％得られた。さらに、表２〜４でＧＣ／ＭＳによって同定した化合物を並べて記載したことから観察できるように、塩化メチレン抽出物では化合物がより少ない。したがって、活性化合物は、塩化メチレン抽出によって単離した場合により純粋であると思われる。
【００７２】
【表２】
【００７３】
【表３】
【００７４】
【表４】
【実施例４】
【００７５】
この実施例は、マミーアップル、ゼニゴケ、およびハナマキ植物抽出物が増大した抗マイコバクテリア活性を有する画分に精製できることを示す。
【００７６】
表２〜４から、エタノールおよび塩化メチレン画分は共通の化合物をほとんど含まないことが注目に値する。これは、活性化合物は、抽出物の少数の成分であり、全ＧＣ／ＭＳを行う場合、容易に識別できないかもしれないことを示唆している。抗マイコバクテリア化合物をさらに少ない成分を含む画分に分離できる場合、新たなＧＣ／ＭＳ分析にかけて本発明の各植物の活性化合物を同定することになるより大量の活性画分の単離が可能かもしれない。
【００７７】
活性画分のＨＰＬＣ分離および単離を試みた。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、長さ１５ｃｍ、幅４．６ｍｍのＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＲＰ−アミドＣ−１６カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ、米国ペンシルベニア州Ｂｅｌｌｅｆｏｒｔ）を用いて行った。定組成、すなわち定常濃度の極性溶媒相を使用した。溶媒相は、希リン酸のメタノール溶液からなっていた。流量は２ｍｌ／分であった。したがって、流出は分子量（より大きい分子量がより遅く流出する）および極性に依存する。化合物の極性がより強いと、溶媒中により早く溶解するが、より極性の強い化合物を保持するカラムの固定相中により長く保持される。画分をＵＶによって波長２５４ｎｍでモニターした。示された時間に、植物抽出物当り１から３種の画分を回収した。表５に示すように、大腸菌およびスメグマ菌に対して強い活性を有する個々の画分が同定され、ＧＣ／ＭＳ分析ではこれらの画分中に存在する化合物を同定した。例えば、図１〜３を参照できる。全塩化メチレン抽出物中のそれぞれの植物に関して同定した化合物の相対極性および分子量の検討に基づき、表５の最も右側の列の化合物「追加の化合物」は、それぞれの植物の抽出物の活性画分では観察されないが、活性画分中により少ない量（「微量」）で存在している可能性が高く、抗マイコバクテリア活性に寄与するかもしれない化合物を記載している。
【００７８】
今回、マイコバクテリア活性を有する植物抽出物の活性化合物として、活性な精製した画分および個々の化合物を単離、同定できることを示した。
【００７９】
【表５】
【００８０】
本明細書で引用した刊行物、特許出願、および特許を含めたすべての参考文献は、各参考文献が参照によって組み込まれるように単独で具体的に指示され、また本明細書にその全体が記載されている場合と同様の範囲まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８１】
本発明の説明において（特に以下の特許請求の範囲において）、「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および類似の対象の用語の使用は、特に本明細書に指示されていないまたは明らかに前後関係と矛盾しない限り、単数と複数の両方を包含すると解釈すべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、特に本明細書に指示されていない限り、また本明細書で個々に記載された場合と同様にそれぞれ別個の値が明細書に組み込まれない限り、単に範囲内に入るそれぞれ別個の値を個々に参照する略記法となるものである。数値を伴う場合の「約（ａｂｏｕｔ）」という表現は、表示した数値から１０％以下の偏差を示すものと受け取るべきである。本明細書に記載したすべての方法は、特に本明細書に指示されていない、または明らかに前後関係と矛盾しない限り、任意の適当な順序で行うことができる。本明細書に含まれるありとあらゆる例、または例示的な用語（例えば、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、特に特許請求しない限り、単に本発明をより明らかにするものであり、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の用語は、特許請求していない任意の構成単語を本発明の実施に必須であると示すものとみなすべきでない。
【００８２】
本発明の好ましい実施形態は、本明細書に記載されており、発明者らが知っている本発明を実施するための最良の態様が含まれている。もちろん、これらの好ましい実施形態の変形形態は、以上の説明を読み込んだ後、当業者に明らかになるであろう。発明者らは、当業者がこうした変形形態を適宜使用することを期待し、発明者らは、特に本明細書に記載以外の方法で本発明が実施されることも意図している。したがって、本発明は、準拠法によって許可されような、ここに追加されている特許請求の範囲に記載の主題のすべての変更形態および同等の形態を含む。さらに、そのすべての可能な変形形態の上記要素の任意の組合せは、特に本明細書に指示されていない限り、または明らかに前後関係と矛盾しない限り、本発明によって包含される。
本明細書に記載の発明につき列記する。
１．
医薬担体と、コバルトセン−オクタメチルおよびスチグマスタン−３，５−ジエンからなる群から選択される少なくとも１種の単離または精製した形態の化合物を含むことを特徴とする医薬組成物。
２．
前記化合物が、コバルトセン−オクタメチルであることを特徴とする１．に記載の医薬組成物。
３．
前記化合物が、スチグマスタン−３，５−ジエンであることを特徴とする１．に記載の医薬組成物。
４．
コバルトセン−オクタメチル、スチグマスタン−３，５−ジエン、およびフリーデリンを含むことを特徴とする１．に記載の医薬組成物。
５．
α−カリオフィレン、β−カリオフィレン、カリオフィレンオキシド、フリーデリン、シクロドデカン、酢酸、およびテルペンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物をさらに含むことを特徴とする１．に記載の医薬組成物。
６．
テルペンまたは酢酸をさらに含むことを特徴とする２．に記載の医薬組成物。
７．
前記テルペンが、β−ミルセンであることを特徴とする６．に記載の医薬組成物。
８．
ヘキサデカン酸をさらに含むことを特徴とする６．に記載の医薬組成物。
９．
医薬担体と、ガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物とを含むことを特徴とする医薬組成物。
１０．
ガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンを含むことを特徴とする９．に記載の医薬組成物。
１１．
３−シクロヘキサン−１−メタノール、カンフェン、１，４−シクロプロパ−アズレン、およびフィトールからなる群から選択される少なくとも１種の化合物をさらに含むことを特徴とする９．に記載の医薬組成物。
１２．
前記化合物が、ガロキソリドであることを特徴とする９．に記載の医薬組成物。
１３．
前記化合物が、サリチル酸ベンジルであることを特徴とする９．に記載の医薬組成物。
１４．
前記化合物が、α−ピネンであることを特徴とする９．に記載の医薬組成物。
１５．
前記化合物が、ユーカリプトールであることを特徴とする９．に記載の医薬組成物。
１６．
抗微生物活性を有する組成物を調製する方法であって、
有機溶媒中に植物物質を抽出すること、
抽出した物質をクロマトグラフ分離システムに接触させること、および
極性移動相を用いてクロマトグラフ分離システムから溶出して組成物を得ることを含み、
前記植物物質はマミーアップル、ゼニゴケ、またはハナマキ由来であり、前記組成物は抗微生物活性を有することを特徴とする方法。
１７．
前記植物が、マミーアップルであることを特徴とする１６．に記載の方法。
１８．
前記植物が、ゼニゴケであることを特徴とする１６．に記載の方法。
１９．
前記植物が、ハナマキであることを特徴とする１６．に記載の方法。
２０．
前記組成物は、コバルトセン−オクタメチル、またはスチグマスタン−３，５−ジエンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含むことを特徴とする１７．に記載の方法。
２１．
前記組成物が、α−カリオフィレン、β−カリオフィレン、およびカリオフィレンオキシドを含むことを特徴とする１８．に記載の方法。
２２．
前記組成物が、ガロキソリド、サリチル酸ベンジル、またはα−ピネンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含むことを特徴とする１９．に記載の方法。
２３．
前記有機溶媒が、塩化メチレンであることを特徴とする１６．に記載の方法。
２４．
前記抗微生物活性が、マイコバクテリウムに対するものであることを特徴とする
１６．に記載の方法。
２５．
前記マイコバクテリウムが、鳥型結核菌、ウシ型結核菌、バテー杆菌、Ｍ．カンサシ、らい菌、Ｍ．マリヌム、チモテ菌、Ｍ．スクロフラセウム、スメグマ菌、Ｍ．フォーチュイタム、ヒト型結核菌、またはＭ．ウルセランスであることを特徴とする２４．に記載の方法。
２６．
マイコバクテリウムの増殖を抑制する方法であって、担体と、コバルトセン−オクタメチル、スチグマスタン−３，５−ジエン、ガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンの中から選択される少なくとも１種の化合物とを含む組成物を投与することを含むことを特徴とする方法。
２７．
前記マイコバクテリウムが、鳥型結核菌、ウシ型結核菌、バテー杆菌、Ｍ．カンサシ、らい菌、Ｍ．マリヌム、チモテ菌、Ｍ．スクロフラセウム、スメグマ菌、Ｍ．フォーチュイタム、ヒト型結核菌、またはＭ．ウルセランスであることを特徴とする２６．に記載の方法。
２８．
前記マイコバクテリウムは哺乳動物中に存在し、前記哺乳動物はヒトまたはウシであることを特徴とする２６．に記載の方法。
２９．
前記組成物が、経口投与されることを特徴とする２８．に記載の方法。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抽出し精製した、抗微生物および抗マイコバクテリア活性を有する植物化合物の単離ならびに使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコバクテリウム属には、ヒト、他の哺乳動物、および鳥類で病気を引き起こす多くの細菌種が含まれている。例えば、ヒト型結核菌は、現在世界で最も一般的な感染症である結核の原因物質である。世界保健機関（ＷＨＯ）は、１７億人（もしくは世界の人口の約３分の１）が、ヒト型結核菌に感染しているまたは彼らの生涯のある時点で感染していたことを報告している（非特許文献１参照。）。米国では、１千万から１千５百万人が潜伏感染していると推定されている（非特許文献２参照。）。１年当り８百万の新しい臨床的な結核の症例が世界的に生じ、毎年約３百万人が死亡すると計算されている（非特許文献３参照）。
【０００３】
鳥型結核菌群（ＭＡＣ ｃｏｍｐｌｅｘ）（主に鳥型結核菌およびバテー杆菌）のマイコバクテリアは、ＡＩＤＳ患者の日和見病原体である。病気がかなり進行した段階のＡＩＤＳ患者の約４３％が、ＭＡＣ症を患っている（非特許文献４参照。）。ＡＩＤＳ関連感染症の他に、鳥型結核菌の亜種であるパラ結核菌が、腸の炎症性疾患であるクーロン病に関連していると考えられている（非特許文献５参照。）。
【０００４】
ヒト病原体と考えられている別のマイコバクテリアには、らい菌、Ｍ．カンサシ、Ｍ．マリヌム、Ｍ．フォーチュイタム菌群、ウシ型結核菌、Ｍ．スクロフラセウム、およびＭ．ウルセランスがある（非特許文献６、非特許文献７参照。）。世界的にらい菌感染症が推定５５０万症例ある（非特許文献８参照。）。
【０００５】
パラ結核菌も反芻動物で腸の炎症を引き起こし、これはより一般的にはヨーネ病として知られている（非特許文献９参照）。パラ結核菌の試験で陽性のウシは殺して処分する。全国的な群れの間の発生率は、通常３％〜１８％である（非特許文献１０参照）。この病気の酪農業界への経済的な影響は、毎年１５億ドルを超える（非特許文献１１参照）。ウシ型結核菌は、獣医学で重要な別のマイコバクテリアである。Ｍ．フォーチュイタムは、動物およびヒトの病巣から単離された土壌細菌である。鳥型結核菌は、ニワトリに病気を引き起こし、養鶏業界にとって重大な関心事である。Ｍ．マリヌムは、冷血動物および魚類に感染し、これもヒトの四肢の表層の肉芽種から単離されたものである。
【０００６】
抗癌、抗微生物、抗菌、および時には抗マイコバクテリア活性を求めて、これまで数百の植物種由来の抽出物が試験されてきた。全抽出物、または時には葉、幹、および根におよぶ植物組織由来の油には、様々な活性レベルがあることが示されている。ほとんどの場合、物質の化学組成は記載されていない。その概説については、非特許文献１２を参照できる。非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９、および非特許文献２０も参照できる。したがって、純粋で有効な抗マイコバクテリア化合物を同定する必要性が残っている。抗マイコバクテリア活性をもつ植物からの鉛抽出物の同定に関しての結果は、一般的に期待はずれであった（上掲の非特許文献１２を参照できる。しかし、非特許文献２１、非特許文献２２、および上掲の非特許文献１９も参照できる。）。
【０００７】
マイコバクテリア細胞壁の脂質性は、乾燥および酸またはアルカリ条件に対する耐性を与えることによって、マイコバクテリアの生存に寄与するように思われる。例えば、マイコバクテリアは、酸またはアルカリ条件および限られた期間の加熱滅菌に耐える。マイコバクテリウムは、強靭で、制御するのが困難な細菌であることが証明されている。数カ月後には、古い培養物または汚染された表面から新しい感染性マイコバクテリアを回収することができる。マイコバクテリア汚染を制御できる新しい薬剤が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４，２３５，８７１号明細書
【特許文献２】米国特許第４，５０１，７２８号明細書
【特許文献３】米国特許第４，８３７，０２８号明細書
【特許文献４】米国特許第５，０１９，３６９号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Kochi, A. Tubercle 72: 1-6 (1991)
【非特許文献２】Morbidity and Mortality Weekly Report 39 (RR-8): 9-12 (1990)
【非特許文献３】Morbidity and Mortality Weekly Report 42 (49): 961-964 (1993)
【非特許文献４】Nightingale et al., J. Infect. Dis. 165: 1082-1085 (1992)
【非特許文献５】Chiodini, R. J. Clin. Micro. Rev. 2: 90-117 (1989)
【非特許文献６】Baron, S., editor, MEDICAL MICROBIOLOGY, Second Edition, pages 562-564 Addison-Wesley Pub. Co., Menlo Park, CA (1996)
【非特許文献７】Wayne, L. G. et al., Clin. Micro. Rev. 5: 1-25 (1992)
【非特許文献８】Nordeen, S. K. et al., Int. J. Lepr. 63: 282-287 (1993)
【非特許文献９】Thoen, C. O. et al., Rev. Infect. Dis. 3: 960-972 (1981)
【非特許文献１０】Merkal, R. S. et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 190: 676-680 (1987)
【非特許文献１１】Whitlock, R. PROCEED. OF THE THIRD INTERNAT. COLL0Q. PARATUBERCUL., pp. 514-522 (1991)
【非特許文献１２】Newton et al., Phytother. Res., 14: 303-322 (2000)
【非特許文献１３】Soliman et al., Flavour and Fragrance Journal, 9 (1): 29-33 (1994)
【非特許文献１４】Hebda, Dissertation Abstracts International, 53 (4-C): 737 (1991)
【非特許文献１５】Robbs, Dissertation Abstracts International, 58 (6-B): 3009 (1997)
【非特許文献１６】Kurtulik, Dissertation Abstracts International, 43 (4-B): 1050 (1982)
【非特許文献１７】Oguntimein, Dissertation Abstracts International, 42 (02-B): 577 (1981)
【非特許文献１８】Frame et al., P. R. Health Sci. J., 17: 243-252 (1998)
【非特許文献１９】Lall et al., J Ethnopharmacol, 66: 347-354 (1999)
【非特許文献２０】Rastogi et al., FEMS Immuno. Med. Microblol. 20: 267-273 (1998)
【非特許文献２１】Rejab et al., Phytotherapy Research, 14: 303-322 (2000)
【非特許文献２２】George et al., Phytotherapy Research, 14: 303-322 (2000)
【非特許文献２３】Gordon et al., Phytotherapy Research 14: 303-322 (1996)
【非特許文献２４】Chung et al., Phytotherapy Research 14: 303-322 (1995)
【非特許文献２５】Gomez-Florex et al. J. Clin. Microbiol. 33: 1842-1846 (1995)
【非特許文献２６】Yajko et al., J. Clin. Microbiol. 33: 2324-2327 (1995)
【非特許文献２７】Crowle and May, Antimicrob. Agents Chemother. 34: 2217-2222 (1990)
【非特許文献２８】Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982)
【非特許文献２９】ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986)
【非特許文献３０】Remington's Pharmaceutical Science (17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985)
【非特許文献３１】Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9, 467 (1980)
【非特許文献３２】Bauer et al., Amer. J. Clin. Path., 21: 941-946 (1985)
【非特許文献３３】Siddiqi, Bactec TB system: Product and Procedure Manual, Becton Dickinson Diagnostic Instrument System, Towson, MD (1989)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
アメリカ合衆国における、ヒト型結核菌（ＭＴＢ）の多剤耐性株の発生についての報告によって、結核に対する新しい恐怖が生じている。これらの菌株は、少なくとも最も重要な抗結核剤であるイソニアシドおよびリファンピシンに耐性がある。アメリカ合衆国における多剤耐性結核の発生頻度は３〜７％、ニューヨークでは約１９％であると報告されている。したがって、現在使用されているものに代わる、またはそれに追加するための、新規で有効な抗マイコバクテリア剤が緊急に必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様として、本発明は、医薬担体ならびにコバルトセン−オクタメチルおよびスチグマスタン−３，５−ジエンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む医薬組成物を提供する。好ましい実施形態によれば、この組成物は、コバルトセン−オクタメチル、スチグマスタン−３，５−ジエン、およびフリーデリンを含む。別の好ましい実施形態によれば、この組成物は、α−カリオフィレン、β−カリオフィレン、カリオフィレンオキサイド、シクロドデカン、酢酸、およびテルペンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物をさらに含む。
【００１２】
医薬担体ならびにガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む医薬組成物も提供する。好ましい実施形態によれば、この医薬組成物は、ガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンを含む。別の好ましい実施形態によれば、この医薬組成物はさらに、３−シクロヘキサン−１−メタノール、カンフェン、１，４−シクロプロパ−アズレン、およびフィトールからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む。この医薬組成物は、これらの成分を単離または精製した形態で含む。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、有機溶媒中に植物物質を抽出し、抽出した物質をクロマトグラフ分離システムに接触させ、極性移動相を用いてクロマトグラフ分離システムから溶出して組成物を得ることを含む、抗微生物活性を有する組成物を調製する方法を提供する。植物物質は、マミーアップル、ゼニゴケ、またはハナマキから得たものであり、その組成物は抗微生物活性を有する。
【００１４】
本発明のさらに別の態様によれば、担体ならびにコバルトセン−オクタメチル、スチグマスタン−３，５−ジエン、ガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンの中から選択される少なくとも１種の化合物を含む組成物を投与することを含む、マイコバクテリウムの増殖を抑制する方法を提供する。マイコバクテリアは、鳥結核菌、ウシ型結核菌、バテー杆菌、Ｍ．カンサシ、らい菌、Ｍ．マリヌム、チモテ菌、Ｍ．スクロフラセウム、スメグマ菌、Ｍ．フォーチュイタム、ヒト型結核菌、またはＭ．ウルセランスである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】マミーアップルの活性画分のガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）分析の図である。この物質は、ＨＰＬＣを組み合わせて４回実行し、１滴まで濃縮し、それにメタノール約０．３ｍｌを加えることによって調製した。１０μｌをＧＣ／ＭＳで分析した。ピークを同定した。１３分におけるピークはコバルトセン−１，１’，２，２’，３，３’，４，４’−オクタメチルであり、３０分の直後のピークはスチグマスタン−３，５−ジエンであり、３６分の直後のピークはフリーデリンである。
【図２】ゼニゴケの活性画分のガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）分析の図である。この物質は、ＨＰＬＣを組み合わせて８回実行し、１滴まで濃縮し、それにメタノール約０．３ｍｌを加えることによって調製した。１０μｌをＧＣ／ＭＳで分析した。ピークを同定した。１３分におけるピークはコバルトセン−１，１’，２，２’，３，３’，４，４’−オクタメチルである。
【図３】ハナマキの活性画分のガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）分析の図である。この物質は、ＨＰＬＣを組み合わせて４回実行し、１滴まで濃縮し、それにメタノール約０．３ｍｌを加えることによって調製した。１０μｌをＧＣ／ＭＳで分析した。ピークを同定した。２０分の直前のピークはガロキソリドであり、それにサリチル酸ベンジルを含むピークが続いている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、抗微生物活性があると示されている精製植物画分および化合物の同定ならびに単離によって可能になった。本発明の一態様によれば、抗微生物活性を有する組成物を調製する方法を提供する。この方法は、有機溶媒中に植物物質を抽出し、抽出した物質をクロマトグラフ分離システムに接触させ、極性移動相を用いてクロマトグラフ分離システムから溶出して抗微生物活性を有する組成物を得ることを含む。植物物質は、マミーアップル、ゼニゴケ、またはハナマキ由来である。
【００１７】
植物のどんな部分も抽出手順にかけることができる。例えば、種子、幹、葉、花、または植物液汁が、有機溶媒を用いて抽出する植物物質であってよい。好ましい実施形態によれば、植物物質は葉である。
【００１８】
有機溶媒は、極性溶媒を含むことが好ましい。有機溶媒は、１種の溶媒を含むことができ、または溶媒の混合物とすることもできる。当業者によく知られている方法で緩衝液または塩を加えてもよい。一実施形態によれば、溶媒は水素結合しているものである。水素結合性溶媒は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、またはアミン含有溶媒とすることができる。溶媒にアルコールが含まれていると好ましい。より好ましい実施形態によれば、溶媒はエタノールであり、別の好ましい実施形態によれば、溶媒は塩化メチレンである。実際の抽出手順は当技術分野でよく知られている。例えば、溶媒中での振盪、または植物組織上への溶媒の滴下を使用することができる。
【００１９】
クロマトグラフ分離システムは、どんな適当なタイプにすることもできる。極性移動相の使用を可能にするどんな分離システムも、本発明で使用することができる。クロマトグラフ分離システムに、可能な限りの植物物質の分離に十分な容量があると好ましい。例えば、分離は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、セファデックスもしくはセファロースカラム、ＤＥＡＥ−セルロース、または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムであってよい。好ましい実施形態では、クロマトグラフ分離はＨＰＬＣシステムである。一実施形態によれば、アミド系カラムを使用する。
【００２０】
任意の極性移動相を使用して、単離した純粋な化合物または１組の化合物を得ることができる。一般に、より極性が弱い移動相よりも、より極性が強い移動相が好ましい。好ましくは、溶媒は、極性溶媒およびＮａＣｌなどの塩、またはリン酸を含むことができる。極性移動相は、水素結合溶媒を含むことができる。水素結合溶媒は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、またはアミン系溶媒となろう。一実施形態では、移動相の溶媒はアルコールを含む。好ましい実施形態によれば、移動相の溶媒はメタノールであり、より好ましい実施形態によれば、極性移動相はメタノールとリン酸の混合物を含む。好ましい実施形態によれば、メタノール−リン酸移動相は、１ｍＭから少なくとも約２０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭのリン酸を含む。極性移動相は、定組成、すなわち一濃度とすることができ、または１％から９９％の勾配とすることもできる。
【００２１】
任意の適当な分析技術、例えば時間の関数として溶出した物質の紫外可視化によって、またはＴＬＣの使用によって画分を回収し分析する。次に、抗微生物活性を有する画分を同定する。１組の条件がわかると、次いで、それが活性画分または化合物の回収に関する標準になり得る。例えば、１組の条件下におけるカラムの保持時間は、同じ植物からの精製した活性画分または化合物のさらなる単離の指針である。
【００２２】
単離した画分、ならびにこれらの画分から単離および精製した化合物を、抗微生物活性について試験する。抗微生物活性を有する画分および化合物は、以下に時々「活性」であると称する。
【００２３】
例えば、抗微生物活性は、抽出した物質、精製および単離した画分、または単離および精製した化合物、またはその組成物を微生物と接触させ、その微生物の感受性を調べることによって実証することができる。微生物は、任意の微生物、例えば細菌、真菌、または原生動物とすることができる。好ましくは、微生物は細菌である。より好ましくは、エシェリキア属またはマイコバクテリウム属由来である。さらにより好ましくは、マイコバクテリウム属が病原細菌、すなわちヒト、動物または鳥類に対して病原性である。最も好ましくは、細菌がヒト型結核菌である。
【００２４】
当業者は、当技術分野で周知の標準アッセイにより、どのようにして感受性を調べるかを知っているはずである。当業者は、適切な負および正の対照を含めて、どのようにしてアッセイを実施して、アッセイの結果を確実に意味があるものにするか知っているはずである。選択するアッセイは、感受性について試験する生物によって決まる可能性がある。マイコバクテリアアッセイ（これは他の微生物を試験するために、当業者によって容易に変えることができる）の例として、上掲の非特許文献１２を参照できる。例えば、最も一般に、使用する試験方法は、ディスク拡散法および液体希釈法である。ディスク拡散法の場合、試験中の抽出物を含浸させた紙のディスクを、マイコバクテリアを播種した半固体（寒天系）培地上に置く。培養後、ディスク周囲の細菌増殖が抑制された領域を測定する。液体希釈法の場合、播種した液体培地中に抽出物の希釈系列を含む一連のチューブを用いて、細菌増殖を抑制するのに必要な最小濃度（最小阻止濃度、ＭＩＣ）を決定する。
【００２５】
高スループットのスクリーニングには、自動化できる迅速な方法が知られている。非特許文献２３にその総説がある。例えば、14Ｃ−パルミチン酸を含む培地中で培養したヒト型結核菌からの14ＣＯ2の発生を測定することにより、ＢＡＣＴＥシステム（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ、英国）の基準が形成された。ＢＡＣＴＥシステムは、臨床分離菌の感受性試験に使用されており、従来の方法では３〜４週間かかるのと比べて、数日で結果を得ることができる。非特許文献２４では、Ｍ．アウルム中への放射標識したウラシルの吸収を測定することに基づいたアッセイが開発されている。
【００２６】
マイコバクテリア生存度を細菌またはホタルルシフェラーゼのいずれかを用いて決定するアッセイが開発された。細菌酵素は、還元型フラビン（生きたマイコバクテリアによって生成される）を用いて加えられたアルデヒド基質（デカナール）を酸化し、それは４９０ｎｍにおける光の生成を伴う。ホタルルシフェラーゼは、マイコバクテリアによって生成されるＡＴＰに依存してルシフェリンを脱炭酸し、その結果５６２ｎｍにおける光が生成される。光の生成は、高スループットシステムのルミノメータを用いて容易に測定することができる。ヒト型結核菌を含む数種のマイコバクテリアが、バクテリアルシフェラーゼの産生に関する遺伝子を挿入することにより遺伝子操作されている。デカナールを加えたときに生きた桿菌だけが光を放出し、増殖に対する要求条件はなく、したがって感受性試験を迅速に行うことができる。同様に、ホタルルシフェラーゼに関する遺伝子は、Ｍ．アウルム．Ｉｄ．を含むいくつかのマイコバクテリア種に組み込まれている。
【００２７】
比色法は、マイクロタイタープレートで使用するのに適しており、分光光度計を用いて結果を容易に得ることができる。生きた細菌のジメチルチアゾールジフェニルテトラゾリウムをホルマザンに還元する能力に依存する、鳥型結核菌群に対する試験のアッセイとして報告されている（非特許文献２５参照。）。別の類似の方法では、生きたヒト型結核菌が存在すると色が青からピンクに変化する酸化還元染色液アラマーブルーを利用している（非特許文献２６参照。）。
【００２８】
ヒト大食細胞内でヒト型結核菌を抑制するのに、植物化合物の能力を評価することは役立つかもしれない。これは、非特許文献２７の方法によって行うことができる。
【００２９】
当業者には、「単離した純粋な」画分、１種または複数の化合物は、ある種の他の物質を常に伴うことが理解されよう。本明細書では、「単離した純粋な」画分、１種または複数の化合物は、出発物質（本明細書では植物組織）中のその重量、または体積、または重量／体積に対して、重量、または体積、または重量／体積で少なくとも１００、好ましくは１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、もしくは１００００倍以上豊富な画分、１種または複数の化合物を意味する。あるいは、当業者は、「単離した純粋な」を純度の点から表してもよい。もしそうならば、本発明の活性画分、１種または複数の化合物は、出発物質（本明細書では植物組織）に対して、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、あるいはそれ以上純粋である。
【００３０】
最初に、エタノールを用いてマミーアップル、ゼニゴケ、およびハナマキ組織を別々に抽出し、抽出物には、大腸菌およびスメグマ菌に対して活性があることが判明した。ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）による分析ならびに得られたプロフィールと既知の化合物のプロフィールとの比較によって、抽出物中の大きな組の化合物が明らかになった。例えば、既知の化合物は、そのプロフィールをデータベース中の既知のプロフィールと比較することにより、この方法によって同定することができる。１つの好ましいこのようなデータベースは、米国ワシントンにある国立標準技術研究所（National Institute of Standards and Technology）から入手可能な１２９Ｋ ＮＩＳＴ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ Ｌｉｂｒａｒｙと称される分子クラッキングパターンのライブラリである。同じ組の抽出物および分析（抗微生物活性およびＧＣ／ＭＳ）を追加の植物物質で行い、ただし抽出溶媒を塩化メチレンとした場合、抗微生物活性抽出物中で同定された化合物の数は少なかった（それぞれがしたがってより純粋である）。最も興味深いことには、活性化合物が両方の抽出物中に存在していたにもかかわらず、エタノールおよび塩化メチレン抽出物中の化合物の間でほとんど重複していなかったことである（またいくつかの植物ではまったく重複していなかった）。これについては、表２〜４を参照できる。これは、各植物においてたった１種または極少数の化合物が抗微生物活性を引き起こしいること、および２種以上の化合物の場合、２つの異なる抽出システムで同時精製していることから、活性化合物の溶解性が非常によく似ていることを示すものであった。
【００３１】
マミーアップル、ゼニゴケ、またはハナマキ由来の塩素メチレン抽出物をＨＰＬＣシステムで分離した。活性画分を同定した。次に活性化合物を同定した。マミーアップル由来の化合物には、コバルトセン−オクタメチル、スチグマスタン−３，５−ジエン、およびフリーデリンが含まれる。さらに、分画前の抽出物中の化合物の化学的性質を考慮すると、１種または複数のα−カリオフィレン、β−カリオフィレン、カリオフィレンオキシド、シクロドデカン、酢酸、およびテルペンも極微量（すなわち、本明細書に記載の条件下でのＧＣ／ＭＳでは検出不可能）存在するかもしれないことが示唆される。
【００３２】
ゼニゴケ由来の化合物には、酢酸、コバルトセン−オクタメチル、およびβ−ミルセンが含まれる。さらに、分画前の抽出物中の化合物の化学的性質を考慮すると、ヘキサデカン酸も極微量存在するかもしれないことが示唆される。
【００３３】
ハナマキ由来の化合物には、ガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンが含まれる。さらに、分画前の抽出物中の化合物の化学的性質を考慮すると、１種もしくは複数の３−シクロヘキサン−１−メタノール、カンフェン、１，４−シクロプロパ−アズレン、またはフィトールも極微量存在するかもしれないことが示唆される。
【００３４】
本発明の別の態様によれば、医薬担体およびコバルトセン−オクタメチルまたはスチグマスタン−３，５−ジエンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む医薬組成物を提供する。好ましい実施形態によれば、この医薬組成物は、コバルトセン−オクタメチル、スチグマスタン−３，５−ジエン、およびフリーデリンを含む。この医薬組成物はさらに、α−カリオフィレン、β−カリオフィレン、カリオフィレンオキシド、フリーデリン、シクロドデカン、酢酸、およびテルペンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含むことができる。
【００３５】
本発明の別の態様によれば、医薬担体ならびにガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む医薬組成物を提供する。好ましい実施形態によれば、この組成物は、ガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンを含む。この医薬組成物はさらに、３−シクロヘキサン−１−メタノール、カンフェン、１，４−シクロプロパ−アズレン、およびフィトールからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含むことができる。
【００３６】
医薬組成物には、医薬として許容される塩および担体を含んでいてよい。 医薬として許容される塩の例には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸および硫酸などの鉱酸、ならびに酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、およびアリールスルホン酸などの有機酸から誘導されたものがある。アリールスルホン酸の例は、ｐ−トルエンスルホン酸である。例えば、化合物または画分のカルボキシル基は、当業者に既知の塩、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウムまたはカリウム）塩、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム）塩、またはアンモニウム塩に変換することができる。本発明はさらに、上記の化合物（または化合物もしくは画分）および医薬として許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００３７】
一般に、上記のような本発明の化合物または画分は、医薬組成物として、病原微生物、例えばマイコバクテリウムに感染している、または感染していると疑われている個体に投与することになる。化学療法を受けている、または受けようとしている人は、化合物もしくは画分を用いて個別に、または適宜他の治療と併せて治療することができる。治療適用する場合、病原微生物の増殖の限界を引き出すのに十分な量で組成物を患者に投与する。これを達成するのに十分な量は、「治療有効投与量」と定義する。治療または予防的使用に有効な量は、例えば、治療している疾患の段階および重症度、患者の年齢、体重、および一般的な容態、ならびに処方する医師の判断によって決まることになる。投与サイズも、選択する化合物または画分、投与方法、投与のタイミングおよび頻度ならびに特定の化合物または画分の投与に伴う可能性のある任意の副作用の存在、性質、および程度ならびに所望の生理学的効果によって決定されることになる。様々な疾患状態は、おそらくはそれぞれまたは種々の投与ラウンドで、本発明の一連の異なる化合物または画分を用いて、複数回投与を伴う長期治療を必要とするかもしれないことが当業者には理解されよう。
【００３８】
適当な投与量および投与計画は、当業者に既知の従来の範囲検出技術によって決定することができる。一般に、治療は、化合物または画分の最適投与量よりも少ない、より少ない投与量で開始する。その後、その状況下における最適の効果に達するまで、小さな増分で投与量を増大する。本発明の方法は、個体の体重１ｋｇ当り１種または複数の化合物または画分について約０．１μｇから約５０ｍｇの投与を含んでいてよい。７０ｋｇの患者では、病原体の増殖制限または抑制を測定することによって決定されるような患者の生理学的応答に応じて、化合物または画分について約１０μｇから約２００ｍｇの投与量がより一般に使用されるであろう。
【００３９】
本発明の化合物または画分および組成物は、生死にかかわる、または生死にかかわる可能性がある状況を含む多くの疾患状態で使用できることを留意しておく必要がある。多少の、もしくは実質的に過剰な化合物または画分を投与することが可能であり、また治療している医師にとって望ましく感じられるかもしれない。化合物もしくは画分の１回または複数回投与は、治療している医師によって選択される投与レベルおよびパターンで行うことができる。
【００４０】
治療用の医薬組成物は、非経口、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、経口または部分（ｌｏｃａｌ）投与を目的としており、一般に医薬として許容される担体および病原微生物の増殖を抑制するのに十分な量の有効成分を含む。担体は、従来使用されているもののどれでもよく、溶解性および化合物または画分との反応性の欠如など物理化学的検討材料、ならびに投与ルートによってのみ制限される。
【００４１】
医薬として許容される担体（または賦形剤）は、化合物、画分または活性化合物に対して化学的に不活性なもの、および使用条件下で有害な副作用または毒性がないものであることが好ましい。こうした医薬として許容される担体は、生理食塩水（例えば、生理食塩水０．９％）、クレモホールＥＬ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓから入手可能なヒマシ油およびエチレンオキシドの誘導体である）（例えば、クレモホールＥＬ５％／エタノール５％／生理食塩水９０％、クレモホールＥＬ１０％／生理食塩水９０％、またはクレモホールＥＬ５０％／エタノール５０％）、プロピレングリコール（例えば、プロピレングリコール４０％／エタノール１０％／水５０％）、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００ ４０％／生理食塩水６０％）、およびアルコール（例えば、ｔ−ブタノール４０％／水６０％）を含むことが好ましい。好ましい医薬担体は、ＰＥＧ ４００などのポリエチレングリコール、特にＰＥＧ ４００ ４０％および水または生理食塩水６０％を含む組成物である。担体の選択は、選択する特定の化合物または画分、ならびに組成物を投与するのに使用する特定の方法によってある程度決定されるはずである。したがって、本発明の医薬組成物の適当な製剤は多種多様にある。
【００４２】
以下の経口、エアロゾル、非経口、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、直腸、および膣投与用の製剤は、単に例示的なものに過ぎず、決して限定するものではない。医薬組成物は、非経口的に、例えば静脈内、動脈内、皮下、皮内、または筋肉内に投与することができる。したがって、本発明は、水性および非水性、等張性無菌注射液を含めた、非経口投与に適した許容される担体中に溶解または懸濁させた化合物もしくは画分の液剤を含む非経口投与用の組成物を提供する。
【００４３】
概して、非経口組成物用の有効な医薬担体に対する要求は、当業者によく知られている。これについては、非特許文献２８および非特許文献２９を参照できる。こうした組成物は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を対象とするレシピエントの血液と等張にする溶質を含有する液剤；ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含むことができる水性および非水性の無菌懸濁剤を含む。該化合物または画分は、医薬的に受け入れることのできる石鹸または洗浄剤などの界面活性剤、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、もしくはカルボキシメチルセルロースなどの懸濁化剤、または乳濁化剤および他の医薬補助剤を加えて、あるいは加えずに、無菌の液体または液体の混合物などの医薬担体中の生理学的に許容される希釈剤に溶かして投与することができ、該希釈剤としては、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖液、エタノール、イソプロパノール、もしくはヘキサデシルアルコールなどのアルコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコール、ジメチルスルホキシド、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノールなどのグリセロールケタール、ポリ（エチレングリコール）４００などのエーテル、油剤、脂肪酸、脂肪酸エステルもしくはグリセリド、またはアセチル化脂肪酸グリセリドを含む。
【００４４】
非経口製剤に有用な油剤には、石油、動物油、植物脂、および合成油がある。こうした製剤に有用な油剤の具体的な例には、ピーナッツ油、大豆油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ワセリン、および鉱油がある。非経口製剤に使用する適当な脂肪酸には、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸がある。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、適当な脂肪酸エステルの例である。
【００４５】
非経口製剤に使用する適当な石鹸には、脂肪アルカリ金属塩、アンモニウム塩、およびトリエタノールアミン塩があり、適当な清浄剤には、（ａ）例えばジアルキルジメチルアンモニウムハロゲン化物、およびアルキルピリジニウムハロゲン化物などの陽イオン性清浄剤、（ｂ）例えばアルキル、アリール、およびオレフィンスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル、およびモノグリセリド硫酸塩、ならびにスルホコハク酸塩などの陰イオン性清浄剤、（ｃ）例えば脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、およびポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマーなどの非イオン性清浄剤、（ｄ）例えばアルキル−β−アミノプロピオン酸塩、および２−アルキル−イミダゾリン第四級アンモニウム塩などの両性清浄剤、ならびに（ｅ）それらの混合物がある。
【００４６】
非経口製剤は通常、溶液中に有効成分または化合物もしくは画分を、約０．５重量％以下の値から約２５重量％以上の値までの範囲で含むはずである。防腐剤および緩衝剤を使用してもよい。注射部位で刺激を最小化または排除するために、こうした組成物は、１種または複数の親水性−新油性バランス（ＨＬＢ）が約１２から約１７の非イオン性界面活性剤を含んでいてよい。こうした製剤中の界面活性剤の量は典型的には、約５重量％から約１５重量％であろう。適切な界面活性剤には、モノオレイン酸ソルビタンなどのポリエチレンソルビタン脂肪酸エステルおよびプロピレンオキシドとプロピレングリコールの縮合によって形成した疎水性基剤を含んだエチレンオキシドの高分子量付加物が含まれる。非経口製剤は、アンプル剤、バイアルなどの１回分または多数回分の密封容器で提供することができ、注射するのに、使用直前に無菌の液状賦形剤、例えば水の添加しか必要としないフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵することができる。即時注射液および懸濁剤は、無菌の散剤、顆粒剤、および錠剤から調製することができる。
【００４７】
経皮薬物放出に有用なものを含む局所製剤は、当業者によく知られており、本発明において皮膚に適用するのに適している。
【００４８】
経口投与に適した製剤は、（ａ）水、生理食塩水、もしくはオレンジジュースなどの希釈剤中に溶解させた有効量の化合物または画分などの溶液、（ｂ）、それぞれが所定量の化合物または画分を固体または顆粒として含むカプセル剤、サッシェ、錠剤、トローチ剤（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）、および口内錠（ｔｒｏｃｈｅｓ）、（ｃ）散剤、（ｄ）適切な液体中の懸濁剤、および（ｅ）適当な乳剤で構成することができる。液体製剤は、医薬として許容される界面活性剤、懸濁化剤、もしくは乳濁化剤を追加して、または追加しないで、水ならびにアルコール、例えばエタノール、ベンジルアルコール、およびポリエチレンアルコールなどの希釈剤を含んでもよい。カプセル剤形態は、例えば界面活性剤、滑剤、ならびにラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、およびコーンスターチなどの不活性充填剤を含む、通常の硬殻または軟殻ゼラチンタイプとすることができる。錠剤形態は、１種または複数のラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、微結晶性セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、防腐剤、着香料、および薬理学的に適合する賦形剤を含むことができる。トローチ剤形態は、香料、通常スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴム中に有効成分を含むことができ、同様にゼラチンおよびグリセリンなどの不活性基剤、またはスクロースおよびアラビアゴム、乳剤、ゲル剤などの中に化合物または画分を含み、化合物または画分に加えて、当技術分野で既知の賦形剤を含んだ香錠とすることもできる。
【００４９】
本発明の化合物もしくは画分は、単独でまたは他の適当な成分と併せて、エアロゾル製剤にして吸入によって投与することができる。化合物または画分は、界面活性剤および噴射剤と共に微粉砕した形態で供給することが好ましい。活性化合物または画分の典型的なパーセント値は、約０．０１重量％から約２０重量％、好ましくは約１重量％から約１０重量％であってよい。界面活性剤は、もちろん、非毒性であるべきであり、噴射剤中に溶解することが好ましい。こうした界面活性剤を代表するものは、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）およびオレイン酸などの６から２２個の炭素原子を含む脂肪酸と、脂肪族多価アルコールまたはその環状酸無水物によって得られるエステルまたは部分エステルである。混合グリセリドまたは天然グリセリドなどの混合エステルを使用してもよい。界面活性剤は、組成物の約０．１％から約２０重量％、好ましくは約０．２５％から約５％を構成してもよい。組成物の残りは通常、噴射剤である。所望のように、担体、例えば鼻腔内送達用のレシチンを含めることもできる。これらのエアロゾル製剤は、ジクロロフルオロメタン、プロパン、窒素などの許容される加圧噴射剤中に入れることができる。これらはまた、ネビュライザーまたはアトマイザー中などの非加圧製剤用の医薬として調製してもよい。こうしたスプレー製剤は、粘膜に噴霧するのに使用してもよい。
【００５０】
さらに、化合物もしくは画分は、乳化性基剤または水溶性基剤などの様々な基剤と一緒に混合することによって坐剤にすることができる。膣投与に適した製剤は、有効成分に加えて、当技術分野で適切だということで知られている担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、パスタ剤、発泡体、またはスプレー剤として提供することができる。
【００５１】
製剤中の本発明の化合物または画分の濃度は、例えば、重量で約１％未満、通常または少なくとも約１０％から、２０％から５０％あるいはそれ以上まで変動してもよく、選択する特定の投与方法によって、主に流体体積、および粘度によって選択してもよい。
【００５２】
したがって、静脈内注入のための典型的な医薬組成物は、無菌リンゲル液２５０ｍｌ、および化合物または画分１００ｍｇを含有するように構成することができる。非経口的に投与可能な化合物または画分を調製する実際の方法は、当業者に既知または明らかであり非特許文献３０参照に、より詳細に記載されている。
【００５３】
上記の医薬組成物に加えて、本発明の方法の化合物または画分は、シクロデキストリン包接錯体などの包接錯体、またはリポソームとして調製できることが当業者によって理解されよう。リポソームは、標的であるリンパ組織または癌性肝細胞などの特定の組織に化合物もしくは画分を送る働きをすることができる。リポソームは、化合物または画分の半減期を増大させるのに使用することもできる。リポソームを調製するために、たとえば、非特許文献３１および特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４に記載されているような多くの方法が利用できる。
【００５４】
本発明の別の態様によれば、担体ならびにコバルトセン−オクタメチル、スチグマスタン−３，５−ジエン、ガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンの中から選択される少なくとも１種の化合物を含む組成物を投与することを含む、マイコバクテリウムの増殖を抑制する方法を提供する。本組成物は、貯蔵用に適切に調製され、清浄剤として使用することになっている。したがって、本組成物は、上記に挙げた化学物質の化学活性を妨害しない清浄剤をさらに含んでもよい。このような清浄液の調製および一般的な清浄剤の包含は、理論化学的考慮事項を与えられた当業者によって容易に行うことができ、該液剤の安定性および有効性は、当業者によって容易に試験することができる。この試験は、抗微生物アッセイなどの生物学的アッセイを含むだろう。このような清浄液の調製および組成もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００５５】
清浄液は、少なくともマイコバクテリアまたは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して活性である。以下は、活性化合物、活性画分、ならびに本発明の方法によって抑制されるマイコバクテリアおよび亜群の一覧である。マイコバクテリウム群もしくはマイコバクテリウム菌群またはマイコバクテリウム種、最も好ましくはヒト型結核菌（ＭＴＢ）群、鳥型結核菌群、ＭＡＩＳ菌群およびＭ．フォーチュイタム菌群などのマイコバクテリウム菌群、ならびに特定および不特定の光発色菌、非光発色菌、暗発色菌、特にＭ．アフリカヌム、Ｍ．アジアティクム、鳥型結核菌、ウシ型結核菌、ウシ型結核菌（ＢＣＧ）、Ｍ．ブチリクム、Ｍ．ケローネ、Ｍ．デュバリ、Ｍ．フラベッセンス、Ｍ．フォーチュイタム、Ｍ．ガストリ、Ｍ．ゴルドネ、Ｍ．ヘモフィルム、バテー杆菌、Ｍ．カンサシ、らい菌、鼠らい菌、Ｍ．リンダ、Ｍ．ルフ、Ｍ．マリヌム、Ｍ．マルモエンセ、Ｍ．ミクロティ、Ｍ．ムコスクム、Ｍ．ノンクロモジェニカム、パラ結核菌、Ｍ．ペレグリヌム、チモテ菌、Ｍ．ロドクラウス、Ｍ．スクロフラセウム、Ｍ．シモイデイ、Ｍ．シミエ、スメグマ菌、Ｍ．シュルガイ、Ｍ．テラエ、Ｍ．サーモレジスタブル、Ｍ．トリビアーレ、ヒト型結核菌、Ｍ．ウルセランス、Ｍ．バッカエ、Ｍ．ゼノピ、およびその血清型を含む、迅速発育および遅発育（すなわち、標準な実験室条件での平均発生時間が６０分未満）マイコバクテリアが抑制される。Ｍ．カンサシ、Ｍ．マリヌム、Ｍ．シミエおよびＭ．アジアティクムは、光発色菌の例である。Ｍ．スクロフラセウム、Ｍ．シュルガイ、Ｍ．ゼノピ、Ｍ．ゴルドネおよびＭ．フラベッセンスは、暗発色菌の例である。鳥型結核菌、バテー杆菌、Ｍ．ガストリ、Ｍ．マルモエンセ、Ｍ．テラエおよびＭ．トリビアーレは、すべて非光発色菌の例である。Ｍ．アフリカヌム、鳥型結核菌、ウシ型結核菌、Ｍ．ヘモフィルム、バテー杆菌、Ｍ．カンサシ、Ｍ．マルモエンセ、Ｍ．マリヌム、Ｍ．ミクロティ、パラ結核菌、Ｍ．スクロフラセウム、Ｍ．シミエ、Ｍ．シュルガイ、ヒト型結核菌、およびＭ．ゼノピは、すべて遅発育（７日より多く要する）マイコバクテリア種の例である。Ｍ．ケロネイ、Ｍ．フラベッセンス、Ｍ．フォーチュイタム、Ｍ．ゴルドネ、らい菌、チモテ菌、スメグマ菌、Ｍ．テラエ、Ｍ．ウルセランスは、すべて迅速発育（プレート上でコロニー発生に７日未満を要する）マイコバクテリア種の例である。ヒト型結核菌、Ｍ．アフリカヌム、ウシ型結核菌、ウシ型結核菌（ＢＣＧ）、およびＭ．ミクロティは、ＭＴＢ菌群に属している。鳥型結核菌およびバテー杆菌は、鳥型結核菌群に属している。鳥型結核菌には少なくとも３種の異なる血清群があり、バテー杆菌には２５種以上の血清型がある。
【００５６】
このように全般的に説明した本発明は、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されよう。これらの実施例は、例示する目的で提供されており、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００５７】
この実施例は、マミーアップル、ハナマキ、およびゼニゴケのエタノール性植物抽出物は著しい抗マイコバクテリア活性を有するが、エビに対して制限された毒性を有し、また哺乳動物に対して検出可能な毒性を有していないことを示す。
【００５８】
５０の植物種由来の植物の葉約３ポンド（１．４ｋｇ）を４２℃でオーブン乾燥し、混合機で粉砕した。粉砕した物質３０グラムを無水エタノール（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国カリフォルニア州Ｇａｒｄｅｎ）３００ｍｌ中で室温で２４〜３６時間振盪することによって抽出した。次いで液体を、ワットマン紙＃４、次いで＃２（ＶＲＷ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国オハイオ州Ｗｉｌｌａｒｄ）でろ過し、Ｂｕｃｈｉ／Ｂｅｃｋｍａｎロータリーエバポレータ（ＶＲＷ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国オハイオ州Ｗｉｌｌａｒｄ）で４０℃で蒸発させた。試験用に、物質を所望の濃度でメタノール中に再懸濁した。
【００５９】
各抽出物の活性をスメグマ菌６０７（ＡＴＣＣ、米国メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）について試験した。寒天−ディスク拡散アッセイを、他の植物由来の抽出物、ならびに対照としてのストレプトマイシン１０μｇ、水およびメタノールのアッセイと並行して行った（非特許文献３２参照）。各抽出物濃縮物および対照の複数平板培養を行い、抑制結果の領域を表にし平均をとった。試験した他の植物抽出物の中で、マミーアップル、ハナマキ、およびゼニゴケはスメグマ菌に対して、再懸濁させた抽出物をそれぞれ少なくとも２５μｇ、２５μｇ、および５０μｇ試験したとき、測定可能で再現可能な抑制領域を示し、最も活性であることが判明した（上掲の非特許文献１８参照）。
【００６０】
ＢＡＣＴＥＣ−４６０法によって、抽出物の活性をヒト型結核菌２７２９４（ストレプトマイシン感受性株、ＡＴＣＣ、米国メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）についても試験した。この方法では、試験バイアルから吸引した14ＣＯ2の測定によって、試験物質または対照の存在下で液体培養で増殖させた培養物の増殖の抑制をモニターする。この結果を、負の対照培養物（培地に添加された水）に対する試験培養物の増殖速度または増殖指数（ＧＩ）の毎日の変化として示す（上掲の非特許文献１８および非特許文献３３参照）。培養物約４．１ｍｌを１２日目まで増殖させ、ＧＩを４日目から始めて毎日調べた。この場合も追加の植物抽出物、およびストレプトマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）、水、未処理の試料、およびメタノール（４．１ｍｌの体積中に２５μｌおよび５０μｌ）を対照として使用し、各増殖培養を３〜６回繰り返した結果の平均をとった。植物抽出物の影響は、一過性の性質をもち、すなわち、数日後、処理への耐性が再び現れた。これは、マミーアップル、ハナマキ、およびゼニゴケ抽出物は、静菌（殺菌ではなく）モードの作用をもつことを示唆している。このアッセイによって、ヒト型結核菌は、マミーアップル、ハナマキおよびゼニゴケに対してそれぞれ抽出物５０μｇ、５０μｇ、および１００μｇで感受性を示した。マミーアップル植物抽出物に対するスメグマ菌の感受性は、ストレプトマイシンに対する感受性とほぼ同等であった。表１を参照すれば、各抽出物濃度についての３〜６回の読みの結果を表にし、負の対照の増殖指数指標（ΔＧＩ）が＞３０であったことがわかる。
【００６１】
【表１】
【００６２】
したがって、２種の異なるアッセイシステムにより、マミーアップル、ハナマキ、およびゼニゴケ由来の植物抽出物はそれぞれ、２種の異なるマイコバクテリア種に対して著しい活性を有することを示した。
【実施例２】
【００６３】
マミーアップル、ハナマキ、またはゼニゴケの植物抽出物に関連する哺乳動物への著しい毒性がないことを示す。
【００６４】
ＣＦ−１非近交系マウス（５０日齢のオス、平均重量３０グラム）ＳＡＳＣＯ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国マサチューセッツ州Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）７匹のグループを、１５日間にわたって、毎日１００μｌの注射として、メタノール中に再懸濁させた植物抽出物５００μｇを各グループに腹膜投与することにより試験した。試験した植物抽出物には、マミーアップル、ハナマキ、およびゼニゴケが含まれていた。生理食塩水（１００μｌ）または生理食塩水とメタノールの混合物（それぞれ５０μｌ）を与えたマウスの２つのグループを対照として使用した。
【００６５】
マウスを１カ月間観察したままにし、以下のパラメーター、すなわち活性の変化、糞の硬さ、毛の状態、皮膚の損傷、眼の変化、食欲（水および食物の摂取）、体重減少、温度変化および死亡率を毎日測定した。
【００６６】
一般に、本研究に含まれている植物に由来する６種すべての抽出物は、マウス毒性試験でよく許容された。ゼニゴケ抽出物を接種した１匹のマウスは、接種中の腸の穿孔によって引き起こされた敗血症が原因で１３日目に死亡した。ハナマキを注射した別のマウスは、３日連続して食欲不振および体重減少を経験した後、１５日目に死亡した。このマウスが死んでいるのを発見した翌日に行った検死の結果、不審死であることがわかった。
【００６７】
体重１グラム当り植物抽出物約１６．７μｇに曝露したマウスは、植物抽出物の毒作用を示さなかったと結論付けられる。
【実施例３】
【００６８】
この実施例は、抗マイコバクテリア抽出物を代替抽出溶媒によって得ることができ、塩化メチレン抽出がより純粋な活性画分をもたらすことを示す。
【００６９】
マミーアップル、ゼニゴケ、およびハナマキから活性化合物を精製する可能性を示唆するかもしれない予備段階で、代替有機溶媒を用いた抽出を始めた。代替有機溶媒を用いた抽出によって抗マイコバクテリア活性をもつ抽出物を得ることができるならば、活性成分が純粋な画分として単離できる単一化合物または化合物の極小のグループである可能性が増大するだろう。試験した代替溶媒は、塩化メチレンである。
【００７０】
粉末の葉組織約５グラムを室温で４時間無水塩化メチレン１００ｍｌ中で振盪することによって抽出した。一般にエタノール抽出物を用いた試験について前述したように、寒天拡散アッセイによって抽出した物質を試験した。塩化メチレン抽出物は、スメグマ菌６０７（ＡＴＣＣ）に対して測定可能で再現可能な抗マイコバクテリア活性を示した。
【００７１】
表２、３、および４はそれぞれ、ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）分析によって決定したマミーアップル、ゼニゴケ、およびハナマキのエタノール抽出物と塩化メチレン抽出物中の主成分を並べて示す。エタノール抽出は、抽出した物質の重量によって示された可溶物質の保持についてより有効であった。出発物質の重量のパーセント値で、エタノール抽出では、マミーアップル、ゼニゴケ、およびハナマキがそれぞれ１８．７％、１．６％、および２４．２％得られたが、塩化メチレンでは、１．４６％、０．２６％、および０．７３％得られた。さらに、表２〜４でＧＣ／ＭＳによって同定した化合物を並べて記載したことから観察できるように、塩化メチレン抽出物では化合物がより少ない。したがって、活性化合物は、塩化メチレン抽出によって単離した場合により純粋であると思われる。
【００７２】
【表２】
【００７３】
【表３】
【００７４】
【表４】
【実施例４】
【００７５】
この実施例は、マミーアップル、ゼニゴケ、およびハナマキ植物抽出物が増大した抗マイコバクテリア活性を有する画分に精製できることを示す。
【００７６】
表２〜４から、エタノールおよび塩化メチレン画分は共通の化合物をほとんど含まないことが注目に値する。これは、活性化合物は、抽出物の少数の成分であり、全ＧＣ／ＭＳを行う場合、容易に識別できないかもしれないことを示唆している。抗マイコバクテリア化合物をさらに少ない成分を含む画分に分離できる場合、新たなＧＣ／ＭＳ分析にかけて本発明の各植物の活性化合物を同定することになるより大量の活性画分の単離が可能かもしれない。
【００７７】
活性画分のＨＰＬＣ分離および単離を試みた。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、長さ１５ｃｍ、幅４．６ｍｍのＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＲＰ−アミドＣ−１６カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ、米国ペンシルベニア州Ｂｅｌｌｅｆｏｒｔ）を用いて行った。定組成、すなわち定常濃度の極性溶媒相を使用した。溶媒相は、希リン酸のメタノール溶液からなっていた。流量は２ｍｌ／分であった。したがって、流出は分子量（より大きい分子量がより遅く流出する）および極性に依存する。化合物の極性がより強いと、溶媒中により早く溶解するが、より極性の強い化合物を保持するカラムの固定相中により長く保持される。画分をＵＶによって波長２５４ｎｍでモニターした。示された時間に、植物抽出物当り１から３種の画分を回収した。表５に示すように、大腸菌およびスメグマ菌に対して強い活性を有する個々の画分が同定され、ＧＣ／ＭＳ分析ではこれらの画分中に存在する化合物を同定した。例えば、図１〜３を参照できる。全塩化メチレン抽出物中のそれぞれの植物に関して同定した化合物の相対極性および分子量の検討に基づき、表５の最も右側の列の化合物「追加の化合物」は、それぞれの植物の抽出物の活性画分では観察されないが、活性画分中により少ない量（「微量」）で存在している可能性が高く、抗マイコバクテリア活性に寄与するかもしれない化合物を記載している。
【００７８】
今回、マイコバクテリア活性を有する植物抽出物の活性化合物として、活性な精製した画分および個々の化合物を単離、同定できることを示した。
【００７９】
【表５】
【００８０】
本明細書で引用した刊行物、特許出願、および特許を含めたすべての参考文献は、各参考文献が参照によって組み込まれるように単独で具体的に指示され、また本明細書にその全体が記載されている場合と同様の範囲まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８１】
本発明の説明において（特に以下の特許請求の範囲において）、「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および類似の対象の用語の使用は、特に本明細書に指示されていないまたは明らかに前後関係と矛盾しない限り、単数と複数の両方を包含すると解釈すべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、特に本明細書に指示されていない限り、また本明細書で個々に記載された場合と同様にそれぞれ別個の値が明細書に組み込まれない限り、単に範囲内に入るそれぞれ別個の値を個々に参照する略記法となるものである。数値を伴う場合の「約（ａｂｏｕｔ）」という表現は、表示した数値から１０％以下の偏差を示すものと受け取るべきである。本明細書に記載したすべての方法は、特に本明細書に指示されていない、または明らかに前後関係と矛盾しない限り、任意の適当な順序で行うことができる。本明細書に含まれるありとあらゆる例、または例示的な用語（例えば、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、特に特許請求しない限り、単に本発明をより明らかにするものであり、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の用語は、特許請求していない任意の構成単語を本発明の実施に必須であると示すものとみなすべきでない。
【００８２】
本発明の好ましい実施形態は、本明細書に記載されており、発明者らが知っている本発明を実施するための最良の態様が含まれている。もちろん、これらの好ましい実施形態の変形形態は、以上の説明を読み込んだ後、当業者に明らかになるであろう。発明者らは、当業者がこうした変形形態を適宜使用することを期待し、発明者らは、特に本明細書に記載以外の方法で本発明が実施されることも意図している。したがって、本発明は、準拠法によって許可されような、ここに追加されている特許請求の範囲に記載の主題のすべての変更形態および同等の形態を含む。さらに、そのすべての可能な変形形態の上記要素の任意の組合せは、特に本明細書に指示されていない限り、または明らかに前後関係と矛盾しない限り、本発明によって包含される。
本明細書に記載の発明につき列記する。
１．
医薬担体と、コバルトセン−オクタメチルおよびスチグマスタン−３，５−ジエンからなる群から選択される少なくとも１種の単離または精製した形態の化合物を含むことを特徴とする医薬組成物。
２．
前記化合物が、コバルトセン−オクタメチルであることを特徴とする１．に記載の医薬組成物。
３．
前記化合物が、スチグマスタン−３，５−ジエンであることを特徴とする１．に記載の医薬組成物。
４．
コバルトセン−オクタメチル、スチグマスタン−３，５−ジエン、およびフリーデリンを含むことを特徴とする１．に記載の医薬組成物。
５．
α−カリオフィレン、β−カリオフィレン、カリオフィレンオキシド、フリーデリン、シクロドデカン、酢酸、およびテルペンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物をさらに含むことを特徴とする１．に記載の医薬組成物。
６．
テルペンまたは酢酸をさらに含むことを特徴とする２．に記載の医薬組成物。
７．
前記テルペンが、β−ミルセンであることを特徴とする６．に記載の医薬組成物。
８．
ヘキサデカン酸をさらに含むことを特徴とする６．に記載の医薬組成物。
９．
医薬担体と、ガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物とを含むことを特徴とする医薬組成物。
１０．
ガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンを含むことを特徴とする９．に記載の医薬組成物。
１１．
３−シクロヘキサン−１−メタノール、カンフェン、１，４−シクロプロパ−アズレン、およびフィトールからなる群から選択される少なくとも１種の化合物をさらに含むことを特徴とする９．に記載の医薬組成物。
１２．
前記化合物が、ガロキソリドであることを特徴とする９．に記載の医薬組成物。
１３．
前記化合物が、サリチル酸ベンジルであることを特徴とする９．に記載の医薬組成物。
１４．
前記化合物が、α−ピネンであることを特徴とする９．に記載の医薬組成物。
１５．
前記化合物が、ユーカリプトールであることを特徴とする９．に記載の医薬組成物。
１６．
抗微生物活性を有する組成物を調製する方法であって、
有機溶媒中に植物物質を抽出すること、
抽出した物質をクロマトグラフ分離システムに接触させること、および
極性移動相を用いてクロマトグラフ分離システムから溶出して組成物を得ることを含み、
前記植物物質はマミーアップル、ゼニゴケ、またはハナマキ由来であり、前記組成物は抗微生物活性を有することを特徴とする方法。
１７．
前記植物が、マミーアップルであることを特徴とする１６．に記載の方法。
１８．
前記植物が、ゼニゴケであることを特徴とする１６．に記載の方法。
１９．
前記植物が、ハナマキであることを特徴とする１６．に記載の方法。
２０．
前記組成物は、コバルトセン−オクタメチル、またはスチグマスタン−３，５−ジエンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含むことを特徴とする１７．に記載の方法。
２１．
前記組成物が、α−カリオフィレン、β−カリオフィレン、およびカリオフィレンオキシドを含むことを特徴とする１８．に記載の方法。
２２．
前記組成物が、ガロキソリド、サリチル酸ベンジル、またはα−ピネンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含むことを特徴とする１９．に記載の方法。
２３．
前記有機溶媒が、塩化メチレンであることを特徴とする１６．に記載の方法。
２４．
前記抗微生物活性が、マイコバクテリウムに対するものであることを特徴とする
１６．に記載の方法。
２５．
前記マイコバクテリウムが、鳥型結核菌、ウシ型結核菌、バテー杆菌、Ｍ．カンサシ、らい菌、Ｍ．マリヌム、チモテ菌、Ｍ．スクロフラセウム、スメグマ菌、Ｍ．フォーチュイタム、ヒト型結核菌、またはＭ．ウルセランスであることを特徴とする２４．に記載の方法。
２６．
マイコバクテリウムの増殖を抑制する方法であって、担体と、コバルトセン−オクタメチル、スチグマスタン−３，５−ジエン、ガロキソリド、サリチル酸ベンジル、ユーカリプトール、およびα−ピネンの中から選択される少なくとも１種の化合物とを含む組成物を投与することを含むことを特徴とする方法。
２７．
前記マイコバクテリウムが、鳥型結核菌、ウシ型結核菌、バテー杆菌、Ｍ．カンサシ、らい菌、Ｍ．マリヌム、チモテ菌、Ｍ．スクロフラセウム、スメグマ菌、Ｍ．フォーチュイタム、ヒト型結核菌、またはＭ．ウルセランスであることを特徴とする２６．に記載の方法。
２８．
前記マイコバクテリウムは哺乳動物中に存在し、前記哺乳動物はヒトまたはウシであることを特徴とする２６．に記載の方法。
２９．
前記組成物が、経口投与されることを特徴とする２８．に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬担体と、コバルトセン−オクタメチルおよびスチグマスタン−３，５−ジエンからなる群から選択される少なくとも１種の単離または精製した形態の化合物とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記化合物が、コバルトセン−オクタメチルであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記化合物が、スチグマスタン−３，５−ジエンであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
コバルトセン−オクタメチル、スチグマスタン−３，５−ジエン、およびフリーデリンを含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
α−カリオフィレン、β−カリオフィレン、カリオフィレンオキシド、フリーデリン、シクロドデカンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ヘキサデカン酸およびβ−ミルセンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物をさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ヘキサデカン酸およびβ−ミルセンをさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の組成物を含むことを特徴とする抗菌剤。
【請求項９】
前記コバルトセン−オクタメチルが、コバルトセン１，１'，２，２'，３，３'，４，４'−オクタメチルであることを特徴とする請求項１，２または４に記載の組成物。
【請求項１】
医薬担体と、コバルトセン−オクタメチルおよびスチグマスタン−３，５−ジエンからなる群から選択される少なくとも１種の単離または精製した形態の化合物とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記化合物が、コバルトセン−オクタメチルであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記化合物が、スチグマスタン−３，５−ジエンであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
コバルトセン−オクタメチル、スチグマスタン−３，５−ジエン、およびフリーデリンを含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
α−カリオフィレン、β−カリオフィレン、カリオフィレンオキシド、フリーデリン、シクロドデカンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ヘキサデカン酸およびβ−ミルセンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物をさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ヘキサデカン酸およびβ−ミルセンをさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の組成物を含むことを特徴とする抗菌剤。
【請求項９】
前記コバルトセン−オクタメチルが、コバルトセン１，１'，２，２'，３，３'，４，４'−オクタメチルであることを特徴とする請求項１，２または４に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−２８０６１９（Ｐ２００９−２８０６１９Ａ）
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２０１９４０（Ｐ２００９−２０１９４０）
【出願日】平成２１年９月１日（２００９．９．１）
【分割の表示】特願２００３−５５９５３２（Ｐ２００３−５５９５３２）の分割
【原出願日】平成１３年１２月２８日（２００１．１２．２８）
【出願人】（５０４２４８７２４）インターアメリカン ユニヴァーシティ オブ プエルト リコ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１日（２００９．９．１）
【分割の表示】特願２００３−５５９５３２（Ｐ２００３−５５９５３２）の分割
【原出願日】平成１３年１２月２８日（２００１．１２．２８）
【出願人】（５０４２４８７２４）インターアメリカン ユニヴァーシティ オブ プエルト リコ (1)
【Ｆターム（参考）】
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