抗血液凝固組成物
【課題】
現在さまざまな医薬品が血栓の生成予防に使用されてはいるものの、血栓除去にあまり著しい効果を現わすことが無く、深刻な副作用を誘発するため、最近では、医薬品による治療よりは食生活を通じて病気を予防し、体質を調節又は活性化させる機能を持った成分又は食品成分に対する研究も注目されるようになってきている。本発明は、幅広い飲食品に使用可能な抗血液凝固組成物及びそれを含有する飲食品、医薬部外品及び医薬品を提供することを目的とする。
【解決手段】 ハイビスカスの果実、果汁、葉又はそれらの抽出物を含有することにより上記課題を解決する。
現在さまざまな医薬品が血栓の生成予防に使用されてはいるものの、血栓除去にあまり著しい効果を現わすことが無く、深刻な副作用を誘発するため、最近では、医薬品による治療よりは食生活を通じて病気を予防し、体質を調節又は活性化させる機能を持った成分又は食品成分に対する研究も注目されるようになってきている。本発明は、幅広い飲食品に使用可能な抗血液凝固組成物及びそれを含有する飲食品、医薬部外品及び医薬品を提供することを目的とする。
【解決手段】 ハイビスカスの果実、果汁、葉又はそれらの抽出物を含有することにより上記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物を含有する抗血液凝固組成物及びそれを含有する飲食品、医薬部外品及び医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
血栓は、フィブリノーゲンというタンパク質が活性化され、フィブリンに転換されながら、血小板、白血球等と共に、不溶性の重合体となって血管の内壁に固まってできる。身体が正常なときには、この血栓のもととなるフィブリンを溶かす働きをする線溶酵素が抗血液凝固をして、線溶酵素が不足するとフィブリンを溶解できなくなり、血栓ができるようになる。
形成された血栓は血管に沈着し、血管の断面積を減少させ、血液の循環を阻害し、その結果、血液が細胞及び組職で栄養分と酸素を正常に供給することができず、また、細胞及び組織の老廃物を排出できなくなり、毒性が蓄積される等の問題点が発生するようになる。
血管の中で、血栓といわれる血液の固まりが引き起こす症状を広義の血栓症（以下、単に「血栓症」と記載した場合は、広義の血栓症をいう）と呼び、血栓が原因になって起こる病態は狭義の血栓症と塞栓症に分けられる。狭義の血栓症は血栓が形成個所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することによる症状で、塞栓症は血栓が形成個所から剥がれて血流によって移動し、他の個所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することによって起こる病態のことを指す。
このような血栓症は血栓が生じた血管の部位によって多様な疾病を誘発するようになる。その中でも特に脳血管や心臓血管に生じた場合には脳卒中、脳出血、脳梗塞、心不全症、心筋梗塞、心臓麻痺等深刻な症状が発生し、半身不随を引き起こし、ひどい場合には死亡することもある。
【０００３】
現在、血栓症を解決するために、血栓の生成を抑制する抗血栓剤及び血栓形成予防剤と、生成された血栓を溶解させる血栓溶解剤の研究開発が主に行われている。
抗血栓剤又は血栓形成予防剤としては、血管壁への血小板の付着を阻害することで血液の凝固を阻害するアスピリンと、体内の内因性血液凝固経路を遮断するヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ）、クマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ）等が現在臨床で使われている。また最近はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、プロスタサイクリン（Ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎｅ；ＰＧ１２）誘導体等が商品化されている。しかし、これら薬剤は特異性がないため、生体内においては血栓以外の部分にも影響を及ぼし、生体内に残存した場合、出血等を引き起こす可能性がある。その他に、ヒルジン（ｈｉｒｕｄｉｎ）、合成抗トロンビン（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ）、チクロピジン（Ｔｉｃｌｏｐｉｄｉｎ）等の抗血栓活性も報告されているが、まだ実用化には至っていない。
血栓溶解剤としては、ストレプトキナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）、ウロキナーゼ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）のようなプラスミノゲンアクチベーター（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）を血栓が生成された患者に静脈注射して、体内の血栓溶解系を活性化する治療法が一般的に使われている。これらが血栓を溶解させる効果は、幾多の臨床実験で立証されたが、抗血栓剤又は血栓形成予防剤と同様、血栓に対する特異性が無く、血栓を治療する間に全身出血する等の副作用がある。また組職型プラスミノゲンアクチベーター（ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔＰＡ）は血栓に対する選択性が高く、理想的な血栓溶解剤と考えられたが、実際に臨床治療に適用した結果、程度の差はあるが相変らず全身出血等の副作用があった。また血液内での半減期が非常に短く、薬効の持続時間が短いため、体内で薬効を維持するためには投与量が多くなければならず、そのため治療費用が従来の血栓溶解剤に比べ非常に高いという問題点がある。
【０００４】
このような医薬品が血栓の生成予防に使用されてはいるものの、血栓除去にあまり著しい効果を現わすことが無く、深刻な副作用を誘発するため、最近では、医薬品による治療よりは食生活を通じて病気を予防し、体質を調節又は活性化させる機能を持った成分又は食品成分に対する研究も注目されるようになってきている。
食品成分としては、ナットウキナーゼや多価不飽和脂肪酸、グルコサミン、タマネギの薄皮（例えば、特許文献１参照。）等の素材が知られているが、風味や性状等に問題があり、幅広く食品に応用できなかった。最近では、キウイフルーツ抽出物（例えば、特許文献２参照。）についての特許が公開されたが、中性域での活性が弱いという欠点がある。
また、ハイビスカスについては血漿中のコレステロール値またはトリグリセリド値の減少、低比重リポプロテインの酸化の抑制（例えば、特許文献３参照。）や皮膚線維芽細胞のコラーゲン産生を促進（例えば、特許文献４参照。）は報告されているが、抗血液凝固効果については報告がない。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−１７１９３４号公報（第２頁）
【特許文献２】特開２００３−１７１２９４号公報（第２頁−５頁）
【特許文献３】特開２００３−１９２６０１号公報（第１頁−３頁）
【特許文献４】特開２００４−６７５５２号公報（第１頁−３頁）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、幅広い飲食品に使用可能な抗血液凝固組成物及びそれを含有する飲食品、医薬部外品及び医薬品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは様々な天然植物を利用して抗凝固成分を捜す目的で、多角的に研究検討した結果、ハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物に優れた抗血液凝固効果があることを見出し、本発明を完成させた。
【発明の効果】
【０００８】
本発明で得られたハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物を含有する抗血液凝固組成物は、活性化部分トロンボプラスチン時間（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐａｒｔｉａｌ Ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ Ｔｉｍｅ；ＡＰＴＴ）を測定した結果から、内因性経路に関与する因子を不活性化して、フィブリン形成を阻害し、血管内の血栓生成を抑制する効果が高いことがわかった。
本発明はハイビスカス又はその抽出物を含有する抗血液凝固組成物を各種飲食品及び医薬品等に利用して、血栓の生成を抑制することで脳出血、脳梗塞、心筋梗塞、動脈硬化及び冠状動脈症のような心血関係疾患を予防することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本願発明に用いるハイビスカスとは、学名：ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ）といい、和名ではブッソウゲ（仏桑華）と呼ばれている。ハイビスカスは、アオイ科フヨウ属に属する常緑低木で、語源は古代エジプトの美の女神ヒビスに由来している。原産地は、中国南部中国南部・インド東部・南太平洋諸島・熱帯アフリカである。ハイビスカスはさわやかな酸味があり、最近では、フランス料理やイタリア料理のソースとしても使われており、ハーブとして用いられる食用ハイビスカスは、学名・ハイビスカスサブダリファ／（英）ロゼール・（米）フロリダクランベリーと呼ばれている種類で、ジャマイカ、スーダン、エジプト、タイ、中国、スリナム、マレーシア等の国で裁培されている。
【００１０】
本発明において、ハイビスカスの部位としては、果実、果汁、葉又はその抽出物が用いられ、好ましくは萼及び花に由来する果実弁または葉部の分が用いられる。その形態は、特に限定するものではなく、生果実、乾燥果実、果実粉末、生葉、乾燥葉、乾燥葉粉末等のいずれでも良い。
果汁又は果汁粉末の場合は、そのままでも使用できるが、生果実、乾燥果実、生葉又は乾燥葉等、水不溶性成分を含んでいるので、抽出により、水不溶性成分が除去されていることが好ましい。
抽出の際、生果実、乾燥果実、生葉又は乾燥葉を使用する場合は、抽出効率を高めるためにミキサー等により破砕、均質化したものを用いることが好ましい。
乾燥果実又は乾燥葉を使用する場合は、抽出効率を高めるために４０メッシュ以下の粒度になるように粉砕されていることが好ましい。
【００１１】
抽出方法は、抽出溶媒、抽出温度等、特に限定されるものではなく、抽出溶媒としては、水、塩基、酸、親水性溶媒、アセトンを使うことができる。親水性溶媒はメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコールの低級アルコール群より選ばれる１種類以上が操作性、抽出効率の点から好ましい。特に好ましくは、水、塩基、酸のいずれかである。
酸又は塩基を抽出溶媒に使用する場合、抽出物を中和させることが好ましい。中和反応によって生成された塩は、透析法やゲル濾過等、公知の方法により、取り除くことができる。水を抽出溶媒として用いた場合には、上記のような中和反応は必要なく、生成された塩を取り除く必要もないため、水を用いることが更に好ましい。
この時使用する酸としては、特に限定するものではなく、大部分の酸を使うことができるが、入手のしやすさの点及び操作性の点により塩酸、硫酸より選ばれる１種又は両者の併用が好ましい。
また、塩基としては、特に限定するものではなく、大部分の塩基を使うことができるが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムより選ばれる１種又は両者の併用が好ましい。
抽出に使用される酸又は塩基の濃度は、抽出物を酵素処理する前であっても後であっても特に限定するものではなく、酸又は塩基の強さによって変化するが、操作性及び抽出効率の点より、０．０１〜０．５モルの濃度を使用することが好ましい。
【００１２】
上記の抽出において、ペクチナーゼ、プロテアーゼ、タンナーゼまたは、セルラーゼ等の酵素を１種類又は２種類以上を組み合わせて併用することも可能である。
更に、上記の抽出において、抽出残渣に対して再度抽出工程を１回又はそれ以上繰り返すことで、抽出効率が向上し、収率が向上するので、好ましい。この場合の抽出に用いる溶媒は、同じでも良いし、別の溶媒を用いても良い。
【００１３】
上記の抽出物は、そのままでも使用できるが、濾過、遠心分離及び分留により、不溶性物質及び溶媒を取り除くことにより、抗血液凝固効果が高くなり、応用範囲も広がるので好ましい。
不溶性物質及び溶媒を取り除いた後、果汁又は抽出液をそのまま又は濃縮した後に有機溶媒を用いて分配を行い、それぞれの溶媒可溶画分を得る。これら溶媒可溶画分は、更に抗血液凝固効果が高くなるので好ましい。有機溶媒としてはメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコールの低級アルコールや酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルエーテル、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、アセトン又はクロロホルムが使用できる。また可溶画分の純度を上げる為には、他の疎水性溶媒による分配を組み合わせることもできるが、エチルアルコール好ましい。これら溶媒の濃度としては、特に限定するものではないが、収率及び効果の点より、終濃度として２０〜８０％が好ましく、２０〜６０％が更に好ましい。
さらに純度を高める為に、フェノール系、スチレン系、アクリル酸系、エポキシアミン系、ピリジン系、メタクリル系などを母体とした疎水性樹脂を用いることも可能である。その場合、樹脂吸着後の溶離液としては、メチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコールなどの低級アルコール及びアセトンを単独又は水溶液として使用できる。
抽出物及び画分はそのままでの使用も可能だが、必要であれば噴霧乾燥や凍結乾燥等の手段により乾燥粉末化させて使用することも可能である。
【００１４】
本願発明において抗血液凝固効果は、例えば、内因性血液凝固システムに対する抗血液凝固活性を測定する方法である活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を測定することにより確認することができる。
【００１５】
本願発明の抗血液凝固組成物は、飲食品、医薬品、飼料等に応用でき、好ましくは、人が手軽に摂食できる飲食品又は医薬品が好ましい。
本願発明における飲食品とは溶液、懸濁物、粉末、固体成形物等経口摂取可能な形態であれば良く特に限定するものではない。より具体的には、即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品等の即席食品類、清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、栄養飲料、アルコール飲料等の飲料類、パン、パスタ、麺、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等の小麦粉製品、飴、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、デザート菓子等の菓子類、ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、たれ類、ドレッシング類、つゆ類、カレー・シチューの素等の調味料、加工油脂、バター、マーガリン、マヨネーズ等の油脂類、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、アイスクリーム類、クリーム類等の乳製品、冷凍食品、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品等の水産加工品、畜肉ハム・ソーセージ等の畜産加工品、農産缶詰、ジャム・マーマレード類、漬け物、煮豆、シリアル等の農産加工品、栄養食品、錠剤、カプセル等が例示される。
【００１６】
本願発明の抗血液凝固組成物の飲食品としての摂取量は、本発明の病気の状態、病人の体重、年齢、体質、体調等によって調整されるべきであるが、一般に１日あたり、抗血液凝固組成物として０．０５ｇ〜２０ｇ、好ましくは０．１ｇ〜５ｇの範囲で適宜選択することができる。これを病気の状態や食品等の形態によって１日１ないし数回にわけて摂取することができる。
【００１７】
本願発明において、抗血液凝固組成物又は、それを含有する飲食品等に加工する際に、各種栄養成分を強化することができる。
強化できる栄養成分としては、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ナイアシン（ニコチン酸）、パントテン酸、葉酸等のビタミン類、リジン、スレオニン、トリプトファン等の必須アミノ酸類や、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅等のミネラル類及び、例えば、α−リノレン酸、ＥＰＡ、ＤＨＡ、月見草油、オクタコサノール、カゼインホスホペプチド（ＣＰＰ）、カゼインカルシウムペプチド（ＣＣＰ）、水溶性食物繊維、不溶性食物繊維、オリゴ糖等の人の健康に寄与する物質類、その他の食品や食品添加物として認可されている有用物質の１種又は２種以上が使用できる。
【００１８】
本願発明における医薬部外品及び医薬品とは、経口または非経口投与に適した賦形剤、その他の添加剤を用いて、常法に従って、経口製剤または注射剤として調製することができる。好ましいのは、経口製剤であり、最も好ましいのは、容易に服用でき且つ保存、持ち運びに便利な経口固形製剤である。
経口固形製剤としては、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤等が用いられる。このような固形製剤においては、適宜の薬理学的に許容され得る坦体、賦形剤（例えばデンプン、乳糖、白糖、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムなど）、結合剤（例えばデンプン、アラビアガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドンなど）、滑沢剤（例えばステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムなど）、崩壊剤（例えばカルボキシメチルセルロース、タルクなど）、などと混合し、常法により錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤等を調整することが出来る。経口液状製剤は、製薬学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エチルアルコールを含む。この組成物は不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
非経口投与しての注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エチルアルコールのようなアルコール類、ポリソルベート８０等がある。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えばラクトース）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）のような補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保管フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。
本願発明の抗血液凝固組成物の医薬品としての投与量は、投与ルート、疾患の症状、投与対象の年齢、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定されるが、通常、成人１人当たり有効成分約５０ｍｇ〜２ｇ／日、好ましくは１００〜５００ｍｇ／日である。
【００１９】
以下本発明を、実施例にて詳細に説明するが、次の実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００２０】
（実施例１）抗血液凝固組成物の調製１
ハイビスカスの乾燥した萼及び花弁を４０メッシュ以下に粉砕し、その粉末１５０ｇに、蒸留水３Ｌを加え、１００℃で３時間抽出した。その後、遠心分離（８５００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清を濾過し、抽出物と残渣を分離した。その濾液を減圧濃縮し、その後、凍結乾燥し、本願発明の抗血液凝固組成物Ａ２９．８ｇ（収率１９．９％）を得た。
【００２１】
（実施例２）抗血液凝固組成物の調製２
ハイビスカスの乾燥した葉を２０メッシュ以下に粉砕し、その粉末１００ｇに、蒸留水２Ｌを加え、１００℃で３時間抽出した。その後、遠心分離（８５００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清を濾過し、抽出物と残渣を分離した。その濾液を減圧濃縮し、その後、凍結乾燥し、本願発明の抗血液凝固組成物Ｂ１３．４ｇ（収率１３．４％）を得た。
【００２２】
（試験例１）ヘパリン様活性
反応キュベットに、０．０５、０．１、０．２及び０．４Ｕ／ｍＬに調整したヘパリン１０μＬと人間の血液から分離した乏血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｐｏｏｒ Ｐｌａｓｍａ：ＰＰＰ）４０μＬを加え、３７℃で１分間反応させた。その後ＡＰＴＴ試薬５０μＬを加えて、さらに３７℃で２分間反応させた後、２５ｍＭ塩化カルシウム５０μＬを加えて、血漿が凝固されるまでの時間（ＡＰＴＴ）を血液凝固測定計（Ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ）で測定し、本願発明の抗血液凝固組成物の抗血液凝固効果を評価する為にこのヘパリンの濃度とヘパリンのＡＰＴＴと関係からヘパリン様活性値（Ｕ／ｍｇ）の計算式を求めた。その結果を、下記表１に示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】
表１の結果により、ヘパリン様活性値を求める関係式は下記の通りであった。
ヘパリン様活性値（Ｕ／ｍｇ）＝（０．２３０１×Ｌｏｇ（試料のＡＰＴＴ）−０．８０５３）／試料濃度（ｍｇ／ｍＬ）
【００２５】
（試験例２）抗血液凝固効果の確認１
反応キュベットに、実施例１で得られた抗血液凝固組成物Ａ及び実施例２で得られた抗血液凝固組成物Ｂをそれぞれ固形分濃度として、０、０．１、０．３、０．５、１．０ｍｇ／ｍＬと調整した試料１０μＬとＰＰＰ４０μＬを加え、３７℃で１分間反応させた。その後ＡＰＴＴ試薬５０μＬを加えて、さらに３７℃で２分間反応させた後、２５ｍＭ塩化カルシウム５０μＬを加えて、ＡＰＴＴを測定し、試験例１で求めたヘパリン様活性値の関係式より、ヘパリン様活性値を求めた。また、下記の計算式によって抗血液凝固活性（％）を計算した。
その結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】
表２の結果より、本願発明の抗血液凝固組成物Ａ及びＢは、抗血液凝固組成物の濃度を増加と共にＡＰＴＴは増加し、抗血液凝固剤として使用されているヘパリンに換算したヘパリン様活性値はそれぞれ平均０．２２Ｕ／ｍｇ及び０．１０Ｕ／ｍｇを示し、特には果実部分に高い抗血液凝固効果を示すことが確認できた。
【００２８】
（実施例３）抗血液凝固組成物の調製３
ハイビスカスの乾燥した萼及び花弁を４０メッシュ以下に粉砕し、その粉末１５０ｇに、蒸留水３Ｌを加え、１００℃で３時間抽出した。その後、遠心分離（８５００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清を濾過し、抽出物と残渣を分離した。その濾液を減圧濃縮し、４００ｍＬとした。この濃縮液にエチルアルコールを加え、５００ｍＬになるように調製（最終エチルアルコール濃度２０％）した後、室温で２４時間静置して、不溶性成分を沈殿させた。遠心分離（８５００ｒｐｍ、１０分間）で沈澱物を分離し、上清を減圧濃縮後、蒸留水１Ｌを加え再溶解した。そして濾過して不溶性成分除去し、濾液を減圧濃縮後、凍結乾燥して本発明の血小板凝集予防組成物Ｃ１２．４ｇ（収率８．３％）を得た。また、同様にして得た濃縮液にエチルアルコールを加え、最終エチルアルコール濃度を６０％、８０％とした時の不溶性成分を沈殿させ、同様の操作をしてそれぞれ本発明の血小板凝集予防組成物Ｄ９．８ｇ（収率６．５％）、Ｅ６．７ｇ（収率４．５％）を得た。
【００２９】
（試験例３）抗血液凝固効果の確認２
実施例３で得られた抗血液凝固組成物Ｃ、Ｄ及びＥについて、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度でＡＰＴＴを測定した。その結果、ＡＰＴＴはそれぞれ、５５．６ｓｅｃ、６３．７ｓｅｃ及び６５．１ｓｅｃであり、ヘパリン様活性値は、０．２４Ｕ／ｍｇ、０．３０Ｕ／ｍｇ及び、０．３１Ｕ／ｍｇとエチルアルコール分画することによって、より高い抗血液凝固効果を示すことが確認できた。
尚、実施例３において最終エチルアルコール濃度２０％での沈殿成分についても同様にしてＡＰＴＴを測定した結果、ＡＰＴＴは、３８．１ｓｅｃであり、ヘパリン様活性値は、０．０６Ｕ／ｍｇであり、抗血液凝固画分はエチルアルコール可溶殿画分に含まれることがわかった。
【００３０】
（実施例４）抗血液凝固組成物含有食品（錠菓）の調製
実施例１で得られた抗血液凝固組成物Ａ５ｇ、乳糖３０ｇ、ＤＨＡ含有粉末油脂（サンコートＤＹ−５；太陽化学株式会社製）１２ｇ、ショ糖脂肪酸エステル４ｇ、ヨーグルト香料４ｇを混合し、この混合物をロータリー式打錠機を用いて加圧成形して１錠が３００ｍｇの本願発明の抗血液凝固組成物含有飲食品（錠菓）を得た。
【００３１】
（実施例５）抗血液凝固組成物含有飲料の調製
実施例２で得られた抗血液凝固組成物Ｂ５ｇ及び、１／５濃縮グレープフルーツ透明果汁２．１ｇ、エリスリトール３０ｇ、クエン酸結晶２．５ｇ、クエン酸三ナトリウム０．５ｇ、Ｌ−アスコルビン酸０．５ｇ、乳酸カルシウム１．９３ｇ、ＣＣＰ０．１５ｇ、グレープフルーツ香料１．０を水に混合溶解して、全量を１０００ｍＬとし、それを１００ｍＬの瓶に充填し、キャップで密栓した後、９０℃、３０分間加熱殺菌をして、本願発明の抗血液凝固組成物含有飲食品を得た。
【００３２】
（実施例６）抗血液凝固組成物含有飲料（野菜果汁混合飲料）の調製
実施例２で得られた抗血液凝固組成物Ａ０．２ｇ及び、グアーガム分解物（サンファイバーＲ；太陽化学株式会社製）３ｇを市販の野菜果汁混合飲料１００ｍＬに添加混合溶解して、本願発明の抗血液凝固組成物含有飲食品（野菜果汁混合飲料）を得た。
【００３３】
（実施例７）抗血液凝固組成物含有クッキーの調製
実施例２で得られた抗血液凝固組成物Ｂ４ｇ及び、市販のケーキミックス粉２００ｇを容器に入れた後、バター３５ｇを入れ、木杓子で混ぜ合わせた。それに溶き卵２５ｇを加えて、なめらかな生地になるまで良く練った。小麦粉を振った台の上に生地を取り出し、さらに小麦粉を振って麺棒で５ｍｍの厚さに伸ばし、丸型で抜き、それを１７０℃のオーブンで１０分間焼いて、１個約５ｇの本願発明の抗血液凝固組成物含有クッキーを得た。
【００３４】
（実施例８）抗血液凝固組成物含有ヨーグルトの調製
実施例１で得られた抗血液凝固組成物Ａ１ｇ、市販の脱脂乳（明治乳業社製。蛋白質含量３４％）９５ｇ、及び市販の無塩バター（雪印乳業社製）３５ｇを温水０．８Ｌに溶解し、均質化し、全量を１Ｌに調整した。次いで、９０℃で１５分間加熱殺菌し、冷却し、市販の乳酸菌スターター（ハンゼン社製）３ｇ（ストレプトコッカス・サーモフィラス２ｇ及びラクトバシラス・ブルガリクス１ｇ）を接種し、均一に混合し、１００ｍＬの容器に分注，充填し、密封し、３７℃で２０時間発酵させた後、冷却し、本願発明の抗血液凝固組成物含有ヨーグルトを得た。
【００３５】
（実施例９）抗血液凝固組成物含有経口流動食の調製
カゼインナトリウム（ＤＭＶ社製）５０ｇ、卵白酵素分解物（太陽化学社製）４２．５ｇ、デキストリン（松谷化学社製）１００ｇ水１Ｌに溶解し、水相をタンク内に調製した。これとは別に、ＭＣＴ（花王社製）４５ｇ、パーム油（不二製油社製）１７．５ｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）３５ｇ、レシチン（太陽化学社製）０．７ｇ、消泡剤（太陽化学社製）１ｇを混合溶解し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合した後、７０℃に加温し、更に、ホモゲナイザーにより１４．７ＭＰａの圧力で均質化した。次いで、９０℃で１０分間殺菌した後、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約２６０ｇを調製した。この中間製品粉末２００ｇに実施例１で得られた抗血液凝固組成物Ａ４ｇ、デキストリン（松谷化学社製）１５６ｇ、グアーガム分解物（サンファイバーＲ；太陽化学株式会社製）１８ｇ、少量のビタミンとミネラルおよび粉末香料を添加し、均一に混合して、抗血液凝固組成物を含有する経口流動食約３８０ｇを得た。
【００３６】
（実施例１０）抗血液凝固組成物含有錠剤の調製
実施例１で得られた抗血液凝固組成物Ａ１０ｇ、結晶セルロース５ｇ、トウモロコシデンプン１３．８ｇ、乳糖３２．５ｇ、ヒドロキシプロピルセルロース３．３ｇを混合し、顆粒化した。この顆粒化物にステアリン酸マグネシウム１．０ｇを加え、均一に混合し、この混合物をロータリー式打錠機を用いて加圧成形して一錠が１３０ｍｇの本願発明の抗血液凝固組成物含有錠剤を得た。
【００３７】
本発明の実施態様ならびに目的生成物を挙げれば以下の通りである。
（１） ハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物を含有することを特徴とする抗血液凝固組成物。
（２） ハイビスカスの果実、果汁又は葉の抽出物が、ハイビスカスの果実、果汁又は葉から水、塩基、酸、親水性溶媒により抽出されていることをより抽出されていることを特徴とする前記（１）記載の抗血液凝固組成物。
（３） ハイビスカスの果実、果汁又は葉の抽出物が、ハイビスカスの果実、果汁又は葉から水により抽出されていることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の抗血液凝固組成物。
（４） 親水性溶媒がメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコールの群より選ばれる少なくとも１種類以上の低級アルコールであることを特徴とする前記（１）又は（２）の抗血液凝固組成物。
（５） ハイビスカスの果実、果汁又は葉の抽出物から有機溶媒のいずれか１種類又は２種類以上により分画されていることを特徴とする前記（１）〜（４）いずれか記載の抗血液凝固組成物。
（６） 有機溶媒がメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルエーテル、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、又はクロロホルムからなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする前記（５）記載の抗血液凝固組成物。
（７） ハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物がエチルアルコールにより分画されていることを特徴とする前記（１）〜（４）いずれか記載の抗血液凝固組成物。
（８） ハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物が、エチルアルコールにより沈殿成分として分画されていることを特徴とする前記（１）〜（４）いずれか記載の抗血液凝固組成物。
（９） ハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物が、エチルアルコールで分画する際のエチルアルコール濃度が、２０〜８０％であり、そのエチルアルコール可溶画分であることを特徴とする前記（８）記載の抗血液凝固組成物。
（１０） ハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物が、エチルアルコールで分画する際のエチルアルコール濃度が、２０〜６０％であり、そのエチルアルコール可溶画分であることを特徴とする前記（８）記載の抗血液凝固組成物。
（１１） ハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物が、疎水性樹脂を用いたクロマトグラフィーやカラムにより純度を高めることを特徴とする前記（１）〜（１０）いずれか記載の抗血液凝固組成物。
（１２） 疎水性樹脂が、フェノール系、スチレン系、アクリル酸系、エポキシアミン系、ピリジン系、メタクリル系などを母体とすることを特徴とする前記（１１）記載の抗血液凝固組成物。
（１３） 前記（１）〜（１２）いずれか記載の抗血液凝固組成物を含有することを特徴とする飲食品。
（１４） 前記（１）〜（１２）いずれか記載の抗血液凝固組成物を含有することを特徴とする医薬品。
（１５） 前記（１）〜（１２）いずれか記載の抗血液凝固組成物を含有することを特徴とする医薬品。
（１６） 前記（１）〜（１２）いずれか記載の抗血液凝固組成物を含有することを特徴とする飼料。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明で得られたハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物を含有するの抗血液凝固組成物は、血液凝固体系の内因性経路に関与する多くの因子または最終段階であるフィブリンの形成を阻害し、血栓の生成を抑制する抗血液凝固効果が高く、各種飲食品及び医薬品等に利用して、血栓の生成を抑制することで脳出血、脳梗塞、心筋梗塞、動脈硬化及び冠状動脈症のような心血関係疾患を予防することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物を含有する抗血液凝固組成物及びそれを含有する飲食品、医薬部外品及び医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
血栓は、フィブリノーゲンというタンパク質が活性化され、フィブリンに転換されながら、血小板、白血球等と共に、不溶性の重合体となって血管の内壁に固まってできる。身体が正常なときには、この血栓のもととなるフィブリンを溶かす働きをする線溶酵素が抗血液凝固をして、線溶酵素が不足するとフィブリンを溶解できなくなり、血栓ができるようになる。
形成された血栓は血管に沈着し、血管の断面積を減少させ、血液の循環を阻害し、その結果、血液が細胞及び組職で栄養分と酸素を正常に供給することができず、また、細胞及び組織の老廃物を排出できなくなり、毒性が蓄積される等の問題点が発生するようになる。
血管の中で、血栓といわれる血液の固まりが引き起こす症状を広義の血栓症（以下、単に「血栓症」と記載した場合は、広義の血栓症をいう）と呼び、血栓が原因になって起こる病態は狭義の血栓症と塞栓症に分けられる。狭義の血栓症は血栓が形成個所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することによる症状で、塞栓症は血栓が形成個所から剥がれて血流によって移動し、他の個所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することによって起こる病態のことを指す。
このような血栓症は血栓が生じた血管の部位によって多様な疾病を誘発するようになる。その中でも特に脳血管や心臓血管に生じた場合には脳卒中、脳出血、脳梗塞、心不全症、心筋梗塞、心臓麻痺等深刻な症状が発生し、半身不随を引き起こし、ひどい場合には死亡することもある。
【０００３】
現在、血栓症を解決するために、血栓の生成を抑制する抗血栓剤及び血栓形成予防剤と、生成された血栓を溶解させる血栓溶解剤の研究開発が主に行われている。
抗血栓剤又は血栓形成予防剤としては、血管壁への血小板の付着を阻害することで血液の凝固を阻害するアスピリンと、体内の内因性血液凝固経路を遮断するヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ）、クマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ）等が現在臨床で使われている。また最近はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、プロスタサイクリン（Ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎｅ；ＰＧ１２）誘導体等が商品化されている。しかし、これら薬剤は特異性がないため、生体内においては血栓以外の部分にも影響を及ぼし、生体内に残存した場合、出血等を引き起こす可能性がある。その他に、ヒルジン（ｈｉｒｕｄｉｎ）、合成抗トロンビン（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ）、チクロピジン（Ｔｉｃｌｏｐｉｄｉｎ）等の抗血栓活性も報告されているが、まだ実用化には至っていない。
血栓溶解剤としては、ストレプトキナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）、ウロキナーゼ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）のようなプラスミノゲンアクチベーター（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）を血栓が生成された患者に静脈注射して、体内の血栓溶解系を活性化する治療法が一般的に使われている。これらが血栓を溶解させる効果は、幾多の臨床実験で立証されたが、抗血栓剤又は血栓形成予防剤と同様、血栓に対する特異性が無く、血栓を治療する間に全身出血する等の副作用がある。また組職型プラスミノゲンアクチベーター（ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔＰＡ）は血栓に対する選択性が高く、理想的な血栓溶解剤と考えられたが、実際に臨床治療に適用した結果、程度の差はあるが相変らず全身出血等の副作用があった。また血液内での半減期が非常に短く、薬効の持続時間が短いため、体内で薬効を維持するためには投与量が多くなければならず、そのため治療費用が従来の血栓溶解剤に比べ非常に高いという問題点がある。
【０００４】
このような医薬品が血栓の生成予防に使用されてはいるものの、血栓除去にあまり著しい効果を現わすことが無く、深刻な副作用を誘発するため、最近では、医薬品による治療よりは食生活を通じて病気を予防し、体質を調節又は活性化させる機能を持った成分又は食品成分に対する研究も注目されるようになってきている。
食品成分としては、ナットウキナーゼや多価不飽和脂肪酸、グルコサミン、タマネギの薄皮（例えば、特許文献１参照。）等の素材が知られているが、風味や性状等に問題があり、幅広く食品に応用できなかった。最近では、キウイフルーツ抽出物（例えば、特許文献２参照。）についての特許が公開されたが、中性域での活性が弱いという欠点がある。
また、ハイビスカスについては血漿中のコレステロール値またはトリグリセリド値の減少、低比重リポプロテインの酸化の抑制（例えば、特許文献３参照。）や皮膚線維芽細胞のコラーゲン産生を促進（例えば、特許文献４参照。）は報告されているが、抗血液凝固効果については報告がない。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−１７１９３４号公報（第２頁）
【特許文献２】特開２００３−１７１２９４号公報（第２頁−５頁）
【特許文献３】特開２００３−１９２６０１号公報（第１頁−３頁）
【特許文献４】特開２００４−６７５５２号公報（第１頁−３頁）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、幅広い飲食品に使用可能な抗血液凝固組成物及びそれを含有する飲食品、医薬部外品及び医薬品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは様々な天然植物を利用して抗凝固成分を捜す目的で、多角的に研究検討した結果、ハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物に優れた抗血液凝固効果があることを見出し、本発明を完成させた。
【発明の効果】
【０００８】
本発明で得られたハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物を含有する抗血液凝固組成物は、活性化部分トロンボプラスチン時間（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐａｒｔｉａｌ Ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ Ｔｉｍｅ；ＡＰＴＴ）を測定した結果から、内因性経路に関与する因子を不活性化して、フィブリン形成を阻害し、血管内の血栓生成を抑制する効果が高いことがわかった。
本発明はハイビスカス又はその抽出物を含有する抗血液凝固組成物を各種飲食品及び医薬品等に利用して、血栓の生成を抑制することで脳出血、脳梗塞、心筋梗塞、動脈硬化及び冠状動脈症のような心血関係疾患を予防することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本願発明に用いるハイビスカスとは、学名：ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ）といい、和名ではブッソウゲ（仏桑華）と呼ばれている。ハイビスカスは、アオイ科フヨウ属に属する常緑低木で、語源は古代エジプトの美の女神ヒビスに由来している。原産地は、中国南部中国南部・インド東部・南太平洋諸島・熱帯アフリカである。ハイビスカスはさわやかな酸味があり、最近では、フランス料理やイタリア料理のソースとしても使われており、ハーブとして用いられる食用ハイビスカスは、学名・ハイビスカスサブダリファ／（英）ロゼール・（米）フロリダクランベリーと呼ばれている種類で、ジャマイカ、スーダン、エジプト、タイ、中国、スリナム、マレーシア等の国で裁培されている。
【００１０】
本発明において、ハイビスカスの部位としては、果実、果汁、葉又はその抽出物が用いられ、好ましくは萼及び花に由来する果実弁または葉部の分が用いられる。その形態は、特に限定するものではなく、生果実、乾燥果実、果実粉末、生葉、乾燥葉、乾燥葉粉末等のいずれでも良い。
果汁又は果汁粉末の場合は、そのままでも使用できるが、生果実、乾燥果実、生葉又は乾燥葉等、水不溶性成分を含んでいるので、抽出により、水不溶性成分が除去されていることが好ましい。
抽出の際、生果実、乾燥果実、生葉又は乾燥葉を使用する場合は、抽出効率を高めるためにミキサー等により破砕、均質化したものを用いることが好ましい。
乾燥果実又は乾燥葉を使用する場合は、抽出効率を高めるために４０メッシュ以下の粒度になるように粉砕されていることが好ましい。
【００１１】
抽出方法は、抽出溶媒、抽出温度等、特に限定されるものではなく、抽出溶媒としては、水、塩基、酸、親水性溶媒、アセトンを使うことができる。親水性溶媒はメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコールの低級アルコール群より選ばれる１種類以上が操作性、抽出効率の点から好ましい。特に好ましくは、水、塩基、酸のいずれかである。
酸又は塩基を抽出溶媒に使用する場合、抽出物を中和させることが好ましい。中和反応によって生成された塩は、透析法やゲル濾過等、公知の方法により、取り除くことができる。水を抽出溶媒として用いた場合には、上記のような中和反応は必要なく、生成された塩を取り除く必要もないため、水を用いることが更に好ましい。
この時使用する酸としては、特に限定するものではなく、大部分の酸を使うことができるが、入手のしやすさの点及び操作性の点により塩酸、硫酸より選ばれる１種又は両者の併用が好ましい。
また、塩基としては、特に限定するものではなく、大部分の塩基を使うことができるが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムより選ばれる１種又は両者の併用が好ましい。
抽出に使用される酸又は塩基の濃度は、抽出物を酵素処理する前であっても後であっても特に限定するものではなく、酸又は塩基の強さによって変化するが、操作性及び抽出効率の点より、０．０１〜０．５モルの濃度を使用することが好ましい。
【００１２】
上記の抽出において、ペクチナーゼ、プロテアーゼ、タンナーゼまたは、セルラーゼ等の酵素を１種類又は２種類以上を組み合わせて併用することも可能である。
更に、上記の抽出において、抽出残渣に対して再度抽出工程を１回又はそれ以上繰り返すことで、抽出効率が向上し、収率が向上するので、好ましい。この場合の抽出に用いる溶媒は、同じでも良いし、別の溶媒を用いても良い。
【００１３】
上記の抽出物は、そのままでも使用できるが、濾過、遠心分離及び分留により、不溶性物質及び溶媒を取り除くことにより、抗血液凝固効果が高くなり、応用範囲も広がるので好ましい。
不溶性物質及び溶媒を取り除いた後、果汁又は抽出液をそのまま又は濃縮した後に有機溶媒を用いて分配を行い、それぞれの溶媒可溶画分を得る。これら溶媒可溶画分は、更に抗血液凝固効果が高くなるので好ましい。有機溶媒としてはメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコールの低級アルコールや酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルエーテル、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、アセトン又はクロロホルムが使用できる。また可溶画分の純度を上げる為には、他の疎水性溶媒による分配を組み合わせることもできるが、エチルアルコール好ましい。これら溶媒の濃度としては、特に限定するものではないが、収率及び効果の点より、終濃度として２０〜８０％が好ましく、２０〜６０％が更に好ましい。
さらに純度を高める為に、フェノール系、スチレン系、アクリル酸系、エポキシアミン系、ピリジン系、メタクリル系などを母体とした疎水性樹脂を用いることも可能である。その場合、樹脂吸着後の溶離液としては、メチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコールなどの低級アルコール及びアセトンを単独又は水溶液として使用できる。
抽出物及び画分はそのままでの使用も可能だが、必要であれば噴霧乾燥や凍結乾燥等の手段により乾燥粉末化させて使用することも可能である。
【００１４】
本願発明において抗血液凝固効果は、例えば、内因性血液凝固システムに対する抗血液凝固活性を測定する方法である活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を測定することにより確認することができる。
【００１５】
本願発明の抗血液凝固組成物は、飲食品、医薬品、飼料等に応用でき、好ましくは、人が手軽に摂食できる飲食品又は医薬品が好ましい。
本願発明における飲食品とは溶液、懸濁物、粉末、固体成形物等経口摂取可能な形態であれば良く特に限定するものではない。より具体的には、即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品等の即席食品類、清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、栄養飲料、アルコール飲料等の飲料類、パン、パスタ、麺、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等の小麦粉製品、飴、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、デザート菓子等の菓子類、ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、たれ類、ドレッシング類、つゆ類、カレー・シチューの素等の調味料、加工油脂、バター、マーガリン、マヨネーズ等の油脂類、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、アイスクリーム類、クリーム類等の乳製品、冷凍食品、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品等の水産加工品、畜肉ハム・ソーセージ等の畜産加工品、農産缶詰、ジャム・マーマレード類、漬け物、煮豆、シリアル等の農産加工品、栄養食品、錠剤、カプセル等が例示される。
【００１６】
本願発明の抗血液凝固組成物の飲食品としての摂取量は、本発明の病気の状態、病人の体重、年齢、体質、体調等によって調整されるべきであるが、一般に１日あたり、抗血液凝固組成物として０．０５ｇ〜２０ｇ、好ましくは０．１ｇ〜５ｇの範囲で適宜選択することができる。これを病気の状態や食品等の形態によって１日１ないし数回にわけて摂取することができる。
【００１７】
本願発明において、抗血液凝固組成物又は、それを含有する飲食品等に加工する際に、各種栄養成分を強化することができる。
強化できる栄養成分としては、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ナイアシン（ニコチン酸）、パントテン酸、葉酸等のビタミン類、リジン、スレオニン、トリプトファン等の必須アミノ酸類や、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅等のミネラル類及び、例えば、α−リノレン酸、ＥＰＡ、ＤＨＡ、月見草油、オクタコサノール、カゼインホスホペプチド（ＣＰＰ）、カゼインカルシウムペプチド（ＣＣＰ）、水溶性食物繊維、不溶性食物繊維、オリゴ糖等の人の健康に寄与する物質類、その他の食品や食品添加物として認可されている有用物質の１種又は２種以上が使用できる。
【００１８】
本願発明における医薬部外品及び医薬品とは、経口または非経口投与に適した賦形剤、その他の添加剤を用いて、常法に従って、経口製剤または注射剤として調製することができる。好ましいのは、経口製剤であり、最も好ましいのは、容易に服用でき且つ保存、持ち運びに便利な経口固形製剤である。
経口固形製剤としては、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤等が用いられる。このような固形製剤においては、適宜の薬理学的に許容され得る坦体、賦形剤（例えばデンプン、乳糖、白糖、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムなど）、結合剤（例えばデンプン、アラビアガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドンなど）、滑沢剤（例えばステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムなど）、崩壊剤（例えばカルボキシメチルセルロース、タルクなど）、などと混合し、常法により錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤等を調整することが出来る。経口液状製剤は、製薬学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エチルアルコールを含む。この組成物は不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
非経口投与しての注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エチルアルコールのようなアルコール類、ポリソルベート８０等がある。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えばラクトース）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）のような補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保管フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。
本願発明の抗血液凝固組成物の医薬品としての投与量は、投与ルート、疾患の症状、投与対象の年齢、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定されるが、通常、成人１人当たり有効成分約５０ｍｇ〜２ｇ／日、好ましくは１００〜５００ｍｇ／日である。
【００１９】
以下本発明を、実施例にて詳細に説明するが、次の実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００２０】
（実施例１）抗血液凝固組成物の調製１
ハイビスカスの乾燥した萼及び花弁を４０メッシュ以下に粉砕し、その粉末１５０ｇに、蒸留水３Ｌを加え、１００℃で３時間抽出した。その後、遠心分離（８５００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清を濾過し、抽出物と残渣を分離した。その濾液を減圧濃縮し、その後、凍結乾燥し、本願発明の抗血液凝固組成物Ａ２９．８ｇ（収率１９．９％）を得た。
【００２１】
（実施例２）抗血液凝固組成物の調製２
ハイビスカスの乾燥した葉を２０メッシュ以下に粉砕し、その粉末１００ｇに、蒸留水２Ｌを加え、１００℃で３時間抽出した。その後、遠心分離（８５００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清を濾過し、抽出物と残渣を分離した。その濾液を減圧濃縮し、その後、凍結乾燥し、本願発明の抗血液凝固組成物Ｂ１３．４ｇ（収率１３．４％）を得た。
【００２２】
（試験例１）ヘパリン様活性
反応キュベットに、０．０５、０．１、０．２及び０．４Ｕ／ｍＬに調整したヘパリン１０μＬと人間の血液から分離した乏血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｐｏｏｒ Ｐｌａｓｍａ：ＰＰＰ）４０μＬを加え、３７℃で１分間反応させた。その後ＡＰＴＴ試薬５０μＬを加えて、さらに３７℃で２分間反応させた後、２５ｍＭ塩化カルシウム５０μＬを加えて、血漿が凝固されるまでの時間（ＡＰＴＴ）を血液凝固測定計（Ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ）で測定し、本願発明の抗血液凝固組成物の抗血液凝固効果を評価する為にこのヘパリンの濃度とヘパリンのＡＰＴＴと関係からヘパリン様活性値（Ｕ／ｍｇ）の計算式を求めた。その結果を、下記表１に示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】
表１の結果により、ヘパリン様活性値を求める関係式は下記の通りであった。
ヘパリン様活性値（Ｕ／ｍｇ）＝（０．２３０１×Ｌｏｇ（試料のＡＰＴＴ）−０．８０５３）／試料濃度（ｍｇ／ｍＬ）
【００２５】
（試験例２）抗血液凝固効果の確認１
反応キュベットに、実施例１で得られた抗血液凝固組成物Ａ及び実施例２で得られた抗血液凝固組成物Ｂをそれぞれ固形分濃度として、０、０．１、０．３、０．５、１．０ｍｇ／ｍＬと調整した試料１０μＬとＰＰＰ４０μＬを加え、３７℃で１分間反応させた。その後ＡＰＴＴ試薬５０μＬを加えて、さらに３７℃で２分間反応させた後、２５ｍＭ塩化カルシウム５０μＬを加えて、ＡＰＴＴを測定し、試験例１で求めたヘパリン様活性値の関係式より、ヘパリン様活性値を求めた。また、下記の計算式によって抗血液凝固活性（％）を計算した。
その結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】
表２の結果より、本願発明の抗血液凝固組成物Ａ及びＢは、抗血液凝固組成物の濃度を増加と共にＡＰＴＴは増加し、抗血液凝固剤として使用されているヘパリンに換算したヘパリン様活性値はそれぞれ平均０．２２Ｕ／ｍｇ及び０．１０Ｕ／ｍｇを示し、特には果実部分に高い抗血液凝固効果を示すことが確認できた。
【００２８】
（実施例３）抗血液凝固組成物の調製３
ハイビスカスの乾燥した萼及び花弁を４０メッシュ以下に粉砕し、その粉末１５０ｇに、蒸留水３Ｌを加え、１００℃で３時間抽出した。その後、遠心分離（８５００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清を濾過し、抽出物と残渣を分離した。その濾液を減圧濃縮し、４００ｍＬとした。この濃縮液にエチルアルコールを加え、５００ｍＬになるように調製（最終エチルアルコール濃度２０％）した後、室温で２４時間静置して、不溶性成分を沈殿させた。遠心分離（８５００ｒｐｍ、１０分間）で沈澱物を分離し、上清を減圧濃縮後、蒸留水１Ｌを加え再溶解した。そして濾過して不溶性成分除去し、濾液を減圧濃縮後、凍結乾燥して本発明の血小板凝集予防組成物Ｃ１２．４ｇ（収率８．３％）を得た。また、同様にして得た濃縮液にエチルアルコールを加え、最終エチルアルコール濃度を６０％、８０％とした時の不溶性成分を沈殿させ、同様の操作をしてそれぞれ本発明の血小板凝集予防組成物Ｄ９．８ｇ（収率６．５％）、Ｅ６．７ｇ（収率４．５％）を得た。
【００２９】
（試験例３）抗血液凝固効果の確認２
実施例３で得られた抗血液凝固組成物Ｃ、Ｄ及びＥについて、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度でＡＰＴＴを測定した。その結果、ＡＰＴＴはそれぞれ、５５．６ｓｅｃ、６３．７ｓｅｃ及び６５．１ｓｅｃであり、ヘパリン様活性値は、０．２４Ｕ／ｍｇ、０．３０Ｕ／ｍｇ及び、０．３１Ｕ／ｍｇとエチルアルコール分画することによって、より高い抗血液凝固効果を示すことが確認できた。
尚、実施例３において最終エチルアルコール濃度２０％での沈殿成分についても同様にしてＡＰＴＴを測定した結果、ＡＰＴＴは、３８．１ｓｅｃであり、ヘパリン様活性値は、０．０６Ｕ／ｍｇであり、抗血液凝固画分はエチルアルコール可溶殿画分に含まれることがわかった。
【００３０】
（実施例４）抗血液凝固組成物含有食品（錠菓）の調製
実施例１で得られた抗血液凝固組成物Ａ５ｇ、乳糖３０ｇ、ＤＨＡ含有粉末油脂（サンコートＤＹ−５；太陽化学株式会社製）１２ｇ、ショ糖脂肪酸エステル４ｇ、ヨーグルト香料４ｇを混合し、この混合物をロータリー式打錠機を用いて加圧成形して１錠が３００ｍｇの本願発明の抗血液凝固組成物含有飲食品（錠菓）を得た。
【００３１】
（実施例５）抗血液凝固組成物含有飲料の調製
実施例２で得られた抗血液凝固組成物Ｂ５ｇ及び、１／５濃縮グレープフルーツ透明果汁２．１ｇ、エリスリトール３０ｇ、クエン酸結晶２．５ｇ、クエン酸三ナトリウム０．５ｇ、Ｌ−アスコルビン酸０．５ｇ、乳酸カルシウム１．９３ｇ、ＣＣＰ０．１５ｇ、グレープフルーツ香料１．０を水に混合溶解して、全量を１０００ｍＬとし、それを１００ｍＬの瓶に充填し、キャップで密栓した後、９０℃、３０分間加熱殺菌をして、本願発明の抗血液凝固組成物含有飲食品を得た。
【００３２】
（実施例６）抗血液凝固組成物含有飲料（野菜果汁混合飲料）の調製
実施例２で得られた抗血液凝固組成物Ａ０．２ｇ及び、グアーガム分解物（サンファイバーＲ；太陽化学株式会社製）３ｇを市販の野菜果汁混合飲料１００ｍＬに添加混合溶解して、本願発明の抗血液凝固組成物含有飲食品（野菜果汁混合飲料）を得た。
【００３３】
（実施例７）抗血液凝固組成物含有クッキーの調製
実施例２で得られた抗血液凝固組成物Ｂ４ｇ及び、市販のケーキミックス粉２００ｇを容器に入れた後、バター３５ｇを入れ、木杓子で混ぜ合わせた。それに溶き卵２５ｇを加えて、なめらかな生地になるまで良く練った。小麦粉を振った台の上に生地を取り出し、さらに小麦粉を振って麺棒で５ｍｍの厚さに伸ばし、丸型で抜き、それを１７０℃のオーブンで１０分間焼いて、１個約５ｇの本願発明の抗血液凝固組成物含有クッキーを得た。
【００３４】
（実施例８）抗血液凝固組成物含有ヨーグルトの調製
実施例１で得られた抗血液凝固組成物Ａ１ｇ、市販の脱脂乳（明治乳業社製。蛋白質含量３４％）９５ｇ、及び市販の無塩バター（雪印乳業社製）３５ｇを温水０．８Ｌに溶解し、均質化し、全量を１Ｌに調整した。次いで、９０℃で１５分間加熱殺菌し、冷却し、市販の乳酸菌スターター（ハンゼン社製）３ｇ（ストレプトコッカス・サーモフィラス２ｇ及びラクトバシラス・ブルガリクス１ｇ）を接種し、均一に混合し、１００ｍＬの容器に分注，充填し、密封し、３７℃で２０時間発酵させた後、冷却し、本願発明の抗血液凝固組成物含有ヨーグルトを得た。
【００３５】
（実施例９）抗血液凝固組成物含有経口流動食の調製
カゼインナトリウム（ＤＭＶ社製）５０ｇ、卵白酵素分解物（太陽化学社製）４２．５ｇ、デキストリン（松谷化学社製）１００ｇ水１Ｌに溶解し、水相をタンク内に調製した。これとは別に、ＭＣＴ（花王社製）４５ｇ、パーム油（不二製油社製）１７．５ｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）３５ｇ、レシチン（太陽化学社製）０．７ｇ、消泡剤（太陽化学社製）１ｇを混合溶解し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合した後、７０℃に加温し、更に、ホモゲナイザーにより１４．７ＭＰａの圧力で均質化した。次いで、９０℃で１０分間殺菌した後、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約２６０ｇを調製した。この中間製品粉末２００ｇに実施例１で得られた抗血液凝固組成物Ａ４ｇ、デキストリン（松谷化学社製）１５６ｇ、グアーガム分解物（サンファイバーＲ；太陽化学株式会社製）１８ｇ、少量のビタミンとミネラルおよび粉末香料を添加し、均一に混合して、抗血液凝固組成物を含有する経口流動食約３８０ｇを得た。
【００３６】
（実施例１０）抗血液凝固組成物含有錠剤の調製
実施例１で得られた抗血液凝固組成物Ａ１０ｇ、結晶セルロース５ｇ、トウモロコシデンプン１３．８ｇ、乳糖３２．５ｇ、ヒドロキシプロピルセルロース３．３ｇを混合し、顆粒化した。この顆粒化物にステアリン酸マグネシウム１．０ｇを加え、均一に混合し、この混合物をロータリー式打錠機を用いて加圧成形して一錠が１３０ｍｇの本願発明の抗血液凝固組成物含有錠剤を得た。
【００３７】
本発明の実施態様ならびに目的生成物を挙げれば以下の通りである。
（１） ハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物を含有することを特徴とする抗血液凝固組成物。
（２） ハイビスカスの果実、果汁又は葉の抽出物が、ハイビスカスの果実、果汁又は葉から水、塩基、酸、親水性溶媒により抽出されていることをより抽出されていることを特徴とする前記（１）記載の抗血液凝固組成物。
（３） ハイビスカスの果実、果汁又は葉の抽出物が、ハイビスカスの果実、果汁又は葉から水により抽出されていることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の抗血液凝固組成物。
（４） 親水性溶媒がメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコールの群より選ばれる少なくとも１種類以上の低級アルコールであることを特徴とする前記（１）又は（２）の抗血液凝固組成物。
（５） ハイビスカスの果実、果汁又は葉の抽出物から有機溶媒のいずれか１種類又は２種類以上により分画されていることを特徴とする前記（１）〜（４）いずれか記載の抗血液凝固組成物。
（６） 有機溶媒がメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルエーテル、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、又はクロロホルムからなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする前記（５）記載の抗血液凝固組成物。
（７） ハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物がエチルアルコールにより分画されていることを特徴とする前記（１）〜（４）いずれか記載の抗血液凝固組成物。
（８） ハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物が、エチルアルコールにより沈殿成分として分画されていることを特徴とする前記（１）〜（４）いずれか記載の抗血液凝固組成物。
（９） ハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物が、エチルアルコールで分画する際のエチルアルコール濃度が、２０〜８０％であり、そのエチルアルコール可溶画分であることを特徴とする前記（８）記載の抗血液凝固組成物。
（１０） ハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物が、エチルアルコールで分画する際のエチルアルコール濃度が、２０〜６０％であり、そのエチルアルコール可溶画分であることを特徴とする前記（８）記載の抗血液凝固組成物。
（１１） ハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物が、疎水性樹脂を用いたクロマトグラフィーやカラムにより純度を高めることを特徴とする前記（１）〜（１０）いずれか記載の抗血液凝固組成物。
（１２） 疎水性樹脂が、フェノール系、スチレン系、アクリル酸系、エポキシアミン系、ピリジン系、メタクリル系などを母体とすることを特徴とする前記（１１）記載の抗血液凝固組成物。
（１３） 前記（１）〜（１２）いずれか記載の抗血液凝固組成物を含有することを特徴とする飲食品。
（１４） 前記（１）〜（１２）いずれか記載の抗血液凝固組成物を含有することを特徴とする医薬品。
（１５） 前記（１）〜（１２）いずれか記載の抗血液凝固組成物を含有することを特徴とする医薬品。
（１６） 前記（１）〜（１２）いずれか記載の抗血液凝固組成物を含有することを特徴とする飼料。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明で得られたハイビスカスの果実、果汁、葉又はその抽出物を含有するの抗血液凝固組成物は、血液凝固体系の内因性経路に関与する多くの因子または最終段階であるフィブリンの形成を阻害し、血栓の生成を抑制する抗血液凝固効果が高く、各種飲食品及び医薬品等に利用して、血栓の生成を抑制することで脳出血、脳梗塞、心筋梗塞、動脈硬化及び冠状動脈症のような心血関係疾患を予防することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイビスカスの果実、果汁、葉又はそれらの抽出物を含有することを特徴とする抗血液凝固組成物。
【請求項２】
ハイビスカスの果実、果汁又は葉の抽出物が、ハイビスカスの果実、果汁又は葉から水、塩基、酸、親水性溶媒、アセトンからなる群より選ばれる少なくとも１種により抽出されていることを特徴とする請求項１記載の抗血液凝固組成物。
【請求項３】
ハイビスカスの果実、果汁又は葉の抽出物の有機溶媒による分画物を含有することを特徴とする請求項１又は２記載の抗血液凝固組成物。
【請求項４】
有機溶媒がメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルエーテル、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、又はクロロホルムからなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項３記載の血栓予防組成物。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか記載の抗血液凝固組成物を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項６】
請求項１〜４いずれか記載の抗血液凝固組成物を含有することを特徴とする医薬部外品。
【請求項７】
請求項１〜４いずれか記載の抗血液凝固組成物を含有することを特徴とする医薬品。
【請求項１】
ハイビスカスの果実、果汁、葉又はそれらの抽出物を含有することを特徴とする抗血液凝固組成物。
【請求項２】
ハイビスカスの果実、果汁又は葉の抽出物が、ハイビスカスの果実、果汁又は葉から水、塩基、酸、親水性溶媒、アセトンからなる群より選ばれる少なくとも１種により抽出されていることを特徴とする請求項１記載の抗血液凝固組成物。
【請求項３】
ハイビスカスの果実、果汁又は葉の抽出物の有機溶媒による分画物を含有することを特徴とする請求項１又は２記載の抗血液凝固組成物。
【請求項４】
有機溶媒がメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルエーテル、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、又はクロロホルムからなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項３記載の血栓予防組成物。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか記載の抗血液凝固組成物を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項６】
請求項１〜４いずれか記載の抗血液凝固組成物を含有することを特徴とする医薬部外品。
【請求項７】
請求項１〜４いずれか記載の抗血液凝固組成物を含有することを特徴とする医薬品。
【公開番号】特開２００６−１３７６９６（Ｐ２００６−１３７６９６Ａ）
【公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３２８５２２（Ｐ２００４−３２８５２２）
【出願日】平成１６年１１月１２日（２００４．１１．１２）
【出願人】（０００２０４１８１）太陽化学株式会社 (244)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月１２日（２００４．１１．１２）
【出願人】（０００２０４１８１）太陽化学株式会社 (244)
【Ｆターム（参考）】
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