改善された免疫療法
本発明は、標的細胞に対する免疫応答を誘導する改善された方法を提供する。標的細胞種を殺す手段として毒素またはプロドラッグ変換酵素およびストレス応答タンパク質（特に、ヒートショックタンパク質）の両方を発現するために遺伝子治療を使用すると、このような細胞に対するその後の免疫応答を増強する。本発明の方法は、標的細胞に対する免疫応答の誘導に特に適用可能である。このような方法に使用するためのポリヌクレオチド、産物およびベクターも提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は免疫療法の分野に関し、特に抗腫瘍免疫応答の増強に関する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
癌を治療する１つの方法は、比較的低毒性のプロドラッグを強力な細胞傷害薬に変換することができる酵素をコードする遺伝子を腫瘍細胞に導入することである。プロドラッグはプロドラッグ変換酵素を発現する細胞によって腫瘍内で局所的に毒性の誘導体に変換されるので、プロドラッグの全身投与は耐容される。この方法は遺伝子運搬酵素プロドラッグ療法（ＧＤＥＰＴ:gene-directed enzyme prodrug therapy）、または遺伝子が組換えウイルスベクターによって送達される場合には、ウイルス運搬プロドラッグ療法（ＶＤＥＰＴ:virus-directed prodrug therapy）として知られている（McNeishら、1997年）。
【０００３】
この方法に使用されるプロドラッグおよびプロドラッグ変換酵素の例には、ガンシクロビルとＨＳＶチミジンキナーゼ、５−フルオロシトシンとシトシンデアミナーゼ、シクロホスファミドまたはパラセタモールとチトクロームＰ４５０および本発明に特に関連のあるアジリジニルプロドラッグＣＢ１９５４（５−（アジリジン−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミドとニトロレダクターゼが挙げられる（Konoxら1988年）。Walkerラット癌細胞系統がＣＢ１９５４に特に感受性であったという観察により、これはラットニトロレダクターゼＤＨジアフォラーゼの発現によるものであることが示された。しかし、ＣＢ１９５４はヒト型のこの酵素のすぐれた基質ではないので、ヒト腫瘍細胞はＣＢ１９５４に対する感受性がかなり低い。ＧＤＥＰＴは、標的細胞を敏感にするために、好ましくはＣＢ１９５４に対する活性が大きい好適なニトロレダクターゼを導入する方法と考えられた。ＮＦＳＢ遺伝子（またはＮＦＮＢ、ＮＦＳＩもしくはＤＰＲＡとして知られている）によってコードされる大腸菌ニトロレダクターゼ（EC1.6.99.7、または酸素非感受性ＮＡＤ（Ｐ）Ｈニトロレダクターゼもしくはジヒドロプテリジンレダクターゼとして知られており、ＮＴＲと略されることが多い）はこの目的のために広範に使用されている（Groveら、1999年に総説が示されている）。ＮＦＳＢにコードされるニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）は、２つのフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）補因子分子に結合するホモダイマーである。電子ドナーとしてのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨおよび還元型中間体としての結合型ＦＭＮを使用して、ＮＴＲはＣＢ１９５４の２つのニトロ基の一方または他方を還元して、毒性の高い４−ヒドロキシルアミン誘導体または比較的無毒性の２−ヒドロキシルアミンを生ずる。細胞内では、５−（アジリジン−１−イル）−４−ヒドロキシルアミノ−２−ニトロベンズアミドは、おそらくさらに別の毒性代謝物を介して、非常に遺伝毒性となる（Knoxら、1991年）。生じる障害の正確な性質は明らかではないが、他の薬剤によって生じるものとは異なる。特に高い割合のストランド間の架橋が生じ、損傷は修復が不良であると思われ、その結果としてＣＢ１９５４は格別に影響力のある抗腫瘍剤である（Friedlosら、1992年）。このシステムは、ヌードマウスに異種移植したヒト腫瘍を含む数多くのモデルシステムにおいて有用な抗腫瘍応答を生ずる際に有効であることが示されている（Djehaら、2000年）。
【０００４】
とは言うものの、酵素−プロドラッグ方法に免疫治療法を組み合わせることによって、このような酵素−プロドラッグ方法の殺腫瘍性作用を増強する試みがなされている。根本的な根拠は、腫瘍部位および転移部位に残存する細胞が（主に）細胞傷害性Ｔ細胞応答によって殺されることを期待して、細胞傷害剤で殺される細胞における腫瘍特異的抗原に対する抗腫瘍免疫応答を形成しようとすることである。このような応答を刺激する助けとするために、数多くの免疫賦活分子(immunostimulatory molecule)を使用する遺伝子治療がＧＤＥＰＴ／ＶＤＥＰＴと併用して試みられている。他よりすぐれた候補の１つはＧＭ−ＣＳＦであると思われ、チミジンキナーゼ（Jonesら）と併用しておよびシトシンデアミナーゼ（Caoら）と併用して使用されている。一方または両方と併用して試みられる他の候補には、ＩＬ−２、Ｉｌ−６、Ｂ７−１（Felzmanら）、ＩＦＮ−γ（Santodonatoら）およびＭＣＰ−１（Sakaiら）が挙げられる。
【０００５】
しかし、一般に、結果はばらついており、信頼できる治療の改善に至っていない。癌の免疫治療を改善する明白な必要性が存在している。
【０００６】
細胞のストレスに応答して、遺伝子のサブセットが誘導されて、ストレス応答タンパク質が発現される。これらのタンパク質は多様な機能を有し、ＮＦκＢおよび高移動度群Ｂ１（ＨＭＧＢ１、Bustin、2002年）などの細胞内メッセンジャーおよび転写因子並びにＩＬ−１β、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５などのサイトカインを含む。しかし、最も重要なものには、ヒートショックタンパク質として知られるタンパク質グループが挙げられる。
【０００７】
ヒートショックタンパク質は、偏在的な細胞内タンパク質で、進化の過程中高度に保存されており、タンパク質の折り畳み、アンフォールディングおよび変性並びに多サブユニットタンパク質複合体の集合などの基本的な細胞過程に関与することが知られている。それらの発現は細胞ストレス（熱、毒素、飢餓、低酸素）によって厳しくアップレギュレーションされており、それらは細胞ストレス中に生じるタンパク質損傷を修復および改善する際に役割を果たす（ParsellおよびLindquist、1993年に総説が示されている）。ヒートショックタンパク質の発現は、ヒートショックタンパク質プロモーターのエレメントに結合している数多くの上流ファクターによって制御される。これらには、ＨＳＦ−１（ヒートショックファクター−１、Balerら、1993年）、ＨＳＦ−２（Mathewら、2001年）およびＨＳＦ−３（NakaiおよびMorimoto、1993年）並びにＩＲＦ−１および２を含むインターフェロン反応ファクター（Taniguchiら、2001年およびMamaneら、1999年）が挙げられる。
【０００８】
さらに最近、それらはまた、細胞内タンパク質由来のペプチドの処理および発現並びに抗原提示細胞へのこれらの送達に役割を果たすことが明らかになった。特に、ヒートショックタンパク質Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０およびカルレチクリン(calreticulin)は極めて大きな親和性で自己ペプチドに結合し、細胞の溶解によって細胞から放出されると、Ｈｓｐ受容体ＣＤ９１を発現している抗原提示細胞にそれらを送達する（Basuら、2001年）。細胞溶解前の細胞ストレスはヒートショックタンパク質のレベルを増加するので、この作用を増強する。細胞内抗原に対する免疫応答の刺激は、アポトーシス細胞死またはプログラムされた細胞死ではなく壊死性細胞死に関連することおよびこれは、少なくとも部分的には、抗原提示細胞レベルで制御されることが提唱されている（Matzinger、1994年)。抗腫瘍応答に具体的に適用すると、腫瘍細胞の非アポトーシス（すなわち、壊死性）細胞死は高レベルのＨｓｐ７０を誘導し、免疫原性の増加、炎症細胞内容物の放出、炎症誘発性Ｔｈ１型サイトカインの分泌増加およびマクロファージ活性化に関連することが示されている（Goughら、2001年）。一方、一般に細胞外環境に接触する前に細胞内高分子が分解され、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０およびカルレチクリンがあまり大量に放出されない（Basuら、2000年）アポトーシス細胞死は炎症および免疫応答を開始しない。壊死性細胞溶解液は、樹状細胞、免疫応答の開始時において未処理のＴ細胞を活性化するための主要な抗原提示細胞の成熟を生じるが、アポトーシス細胞溶解液は生じない（Galucciら、1999年；Sauterら、2000年。Ｈｓｐ７０そのものが樹状細胞の成熟因子であることが示されている（Kuppnerら、2001年；Gastparら、欧州特許出願EP1209226号）。また、アポトーシス細胞は、例えば、ホスファチジルセリン受容体により、抗−炎症および免疫抑制シグナルを抗原提示細胞に直接送達することができる（Fadokら、2000年）。
【発明の開示】
【０００９】
［発明の概要］
ニトロレダクターゼ／ＣＢ１９５４酵素／プロドラッグシステムの使用は、溶解した細胞から放出される活性型ＣＢ１９５４の毒性産物に接触した標的腫瘍細胞およびバイスタンダー細胞を死滅する以外に、同じ種類の腫瘍細胞による後の攻撃に対する大きな保護作用も生じたことを本発明者らは見出した。早期の研究はこのような死滅作用はアポトーシス機序によるものであると示唆しており（Djehaら、2000年）、アポトーシス細胞死は比較的弱い免疫応答しか生じないと考えられていたので、これは予想しなかった。抗腫瘍作用をさらに増強する目的で、その研究者らは、ニトロレダクターゼおよびＨｓｐ７０の両方を発現することができるポリヌクレオチドをコードするアデノウイルス遺伝子治療ベクターを構築した。根拠は、ベクターが標的として感染し、ＣＢ１９５４の投与によって死滅させられる腫瘍細胞は、腫瘍細胞の死滅によって誘発され、Ｈｓｐ７０の過剰発現によって増強される抗腫瘍免疫応答を開始する作用をするということである。これにより、Ｈｓｐ７０が結合した細胞内ペプチドが、ＣＤ９１を発現する抗原提示細胞に効率的に送達される。このように送達されるペプチドの一部は、腫瘍細胞内の体細胞突然変異によって生じる腫瘍特異的な「非自己」エピトープを含有するので、（主に）ＭＨＣクラスＩ分子に関連するこれらの提示により、ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞抗腫瘍応答が開始される。しかし、Ｈｓｐ送達されるペプチドの一部はＭＨＣクラスII提示経路に進入するので、ＣＤ４+ヘルパーＴ細胞応答が増加する。細胞応答の両方の能力は抗腫瘍免疫において重要である。
【００１０】
抗腫瘍免疫応答を形成する際のこの方法の成功性は、ＧＤＥＰＴ媒介性の死滅が少なくともある割合の細胞においては壊死性であるからであるかどうか、死滅の主要な機序はアポトーシス性であるが、かなりのレベルの二次的な壊死が生じるかどうか、またはアポトーシス細胞死の抗炎症性および非免疫原性はヒートショック因子の過剰発現によってある程度克服されうるかどうかは不明である。しかし、本発明者らは、マウス腫瘍モデルにおいて、原発性腫瘍を、ＮＴＲ遺伝子を送達するベクターと共に注射し、その後ＣＢ１９５４を全身投与すると、腫瘍を死滅させるだけでなく、同じ種類の腫瘍細胞のその後の負荷に対するある程度の保護作用を与えることを実証した。彼らはさらに、この保護作用は、便利なことに同じ遺伝子治療ベクターにおいて、Ｈｓｐ７０の発現を誘導する遺伝子を同時投与することによって大幅に増強されることを実証した。
【００１１】
本発明は、プロドラッグ変換酵素としてのニトロ還元酵素の使用に限定されず、プロドラッグ変換に依存する細胞死滅方法に限定されない。原則として、細胞を死滅させることができる分子をコードするポリヌクレオチドを含む、任意の細胞死滅方法を、内因的アジュバントとして作用し、抗腫瘍応答を促進する際にヒートショックタンパク質様の機能を有する任意の分子と併用使用することができる。コードされ、この方法に使用できると思われる毒素には、リシン、アブリン、ジフテリア毒素およびボツリヌス毒素がある。別の好適なプロドラッグ変換酵素には、チトクロームＰ４５０／アセトアミノフェン酵素／プロドラッグ組み合わせがある。このようなシステムが腫瘍細胞を死滅させる手段として有用であることは既知であり（国際特許出願国際公開公報第00/40272号）、アセトアミノフェンを毒性代謝物Ｎ−アセチルベンゾキノミニン（N-asetylbenzoquinoneimine）（ＮＡＢＱＩ）に活性化することによって生ずる細胞死滅はアポトーシス性であるといういくつかの証拠がある（Baeら、2001年；Boularesら、2002年）。にもかかわらず、治療レベルのアセトアミノフェンの存在下におけるチトクロームＰ４５０とｈｓｐ７０の同時発現は、チトクロームＰ４５０単独で得られるものよりかなり改善された抗腫瘍応答を与えるということを出願人らは見出した。
【００１２】
実際、ヒートショックタンパク質の発現を提供するベクターを送達する開示の方法は、種々の方法のいずれかによって死滅される腫瘍細胞（限定されない）などの細胞に対する免疫応答を増強するために使用することができることが明らかである。従って、化学療法または放射線療法と併用するアジュバント免疫療法としてのヒートショックタンパク質のＤＮＡ送達は有用である可能性がある。
【００１３】
使用することができる好適なアジュバント特性を有する分子には、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１１０、カルレチクリン、ｇｐ９６、ｇｒｐ１７０、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｃ７０、マイコバクテリウム(Mycobacterium)Ｈｓｐ６５、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)Ｈｓｐ６０、大腸菌(Escherichia coli)ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳがある。
【００１４】
さらに、壊死性細胞死を生ずるＧＤＥＰＴに基づいた方法の使用（ＮＴＲ／ＣＢ１９５４併用など）は、関連するＨｓｐ導入遺伝子によって提供されるＨｓｐ発現のアップレギュレーションの別の有用な影響がなくても、大きな免疫原性を示すことが本明細書に開示されているデータから明らかである。
【００１５】
ベクターは細胞にＤＮＡを導入することができる任意のベクターであってもよい。好ましくは、ベクターは組込みベクターまたはエピソームベクターである。
【００１６】
好ましい組込みベクターには、組換えレトロウイルスベクターが挙げられる。組換えレトロウイルスベクターは、その一部が標的細胞に感染することができるレトロウイルスゲノムの少なくとも一部のＤＮＡを含む。「感染」という用語は、ウイルスが遺伝物質を宿主または標的細胞に導入する過程を意味するために使用される。好ましくは、本発明のベクターを構築する際に使用するレトロウイルスも、標的細胞のウイルス複製性を除去するために複製欠損型にされる。このような場合には、複製欠損型ウイルスゲノムは従来の技法によりヘルパーウイルスによってパッケージングされうる。一般に、感染性および機能的遺伝子導入能力に関する上記の基準を満たす任意のレトロウイルスを本発明を実施する際に使用することができる。
【００１７】
好適なレトロウイルスベクターには、当業者に既知のｐＬＪ、ｐＺｉｐ、ｐＷｅおよびｐＥＭが挙げられるが、これらに限定されない。複製欠損型レトロウイルスに好適なパッケージングウイルス系統には、例えば、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２およびΨＡｍが挙げられる。特に好適なレトロウイルスベクターはレンチウイルスベクター、特にＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶである。
【００１８】
本発明に有用な他のベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０ウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＳＶおよびポックスウイルスベクターが挙げられる。好ましいベクターはアデノウイルスである。アデノウイルスベクターは当業者に既知であり、気道上皮、骨格筋、肝臓、脳および皮膚を含む数多くの細胞種（Hittら、1997年；Anderson、1998年）並びに腫瘍（Mountain、2000年）に遺伝子を送達するために使用されている。
【００１９】
さらに別の好ましいベクターはアデノ随伴（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶベクターは当業者に既知であり、遺伝子治療適用のためにヒトＴリンパ球、線維芽細胞、鼻ポリープ、骨格筋、脳、赤血球および造血幹細胞に安定して形質導入するために使用されている（Philipら、1994年；Russelら、Flotteら、1993年；Walshら、1994年；Millerら、1994年；Emerson、1996年）。国際特許出願国際公開公報第91/18088号は具体的なＡＡＶ系ベクターを記載している。
【００２０】
好ましいエピソームベクターには、ＥＢＶ、ヒトパポバウイルス（ＢＫ）およびＢＰＶ−１由来のものなどのウイルスの複製開始点由来の機能を有する一過的な非複製エピソームベクターおよび自己複製エピソームベクターが挙げられる。
【００２１】
このような組込みベクターおよびエピソームベクターは当業者に既知であり、当業者に既知の多数の文献に十分に記載されている。特に、好適なエピソームベクターは国際公開公報第98/07876号に記載されている。
【００２２】
哺乳類人工染色体も本発明においてベクターとして使用することができる。哺乳類人工染色体の使用はCalos(1996年)によって考察されている。
【００２３】
好ましい実施態様において、本発明のベクターはプラスミドである。プラスミドは非複製で、組込まれないプラスミドである。
【００２４】
本明細書において使用する「プラスミド」という用語は、発現可能な遺伝子をコードする任意の核酸をいい、鎖状または環状核酸および２本鎖または１本鎖核酸を含む。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、修飾ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含んでもよく、メチル化、または保護基またはキャップ−もしくはテール構造の導入などの手段によって化学的に修飾してもよい。
【００２５】
非複製で組込まれないプラスミドは、宿主細胞にトランスフェクトされたとき、複製せず、特に宿主細胞のゲノムに組込まない（すなわち、高い頻度で組込まず、特定の部位に組込まない）核酸である。
【００２６】
複製するプラスミドは、Ustavら(1991年)の標準的な複製アッセイを含む標準的なアッセイを使用して同定することができる。
【００２７】
本発明はまた、本発明のベクターをトランスフェクトした宿主細胞を提供する。宿主細胞は任意の哺乳類細胞であってもよい。好ましくは、宿主細胞は齧歯類または哺乳類細胞である。
【００２８】
核酸縮合剤の使用、エレクトロポレーション、アスベストとの複合体形成、ポリブレン、ＤＥＡＥセルロース、デキストラン、リポソーム、陽イオンリポソーム、リポポリアミン、ポリオルニチン、微粒子銃および直接マイクロインジェクション（KucherlapatiおよびSkoultchi(1984年)による総説；Keownら(1990年)を含む、数多くの技法が既知であり、本明細書に記載されているベクターを細胞に送達するために本発明により有用である。
【００２９】
本発明のベクターは、ウイルス性または非ウイルス性送達手段により非特異的または特異的に（すなわち、宿主細胞の指定したサブセットに）宿主細胞に送達することができる。ウイルス起源の好ましい送達方法には、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびパポバウイルスのものなどの、ウイルスのパッケージングシグナルが工作されている本発明のベクターのトランスフェクションレシピエントとしてのウイルス粒子産生パッケージング細胞系統が挙げられる。好ましい非ウイルス系遺伝子送達手段および方法も本発明に使用することができ、裸の核酸の直接注射、核酸縮合ペプチドおよび非ペプチド、陽イオンリポソーム並びにリポソームへの封入化が挙げられる。
【００３０】
組織へのベクターの直接送達が記載されており、いくつかの短期遺伝子発現が達成されている。筋肉（Wolffら、1990年）、甲状腺（Sikesら、1994年）、黒色腫（Vileら、1993年）、皮膚（Henggeら、(1995年)、肝臓（Hickmanら(1994年)へのベクターの直接送達および気道上皮の暴露(Meyerら、1995年)によるベクターの直接送達は従来技術に明白に記載されている。
【００３１】
ウイルスエンベロープタンパク質のアミノ酸配列由来の種々のペプチドが、ポリリジンＤＮＡ複合体と同時投与される場合に遺伝子導入に使用されており（Plankら、1994年；Trubetskoyら、1992年；国際公開公報第91/17773号；国際公開公報第92/19287号およびMackら、1994年）、ポリリジン複合体と陽イオン脂質の共縮合により遺伝子導入効率を改善することができることを示唆している。国際特許出願国際公開公報第95/02698号は、陽イオン脂質による遺伝子導入効率を増加する試みにウイルス成分を使用することを開示している。
【００３２】
本発明に有用な核酸縮合剤には、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびポリリジンなどの、スペルミン、スペルミン誘導体、ヒストン、陽イオンペプチド、陽イオン非ペプチドが挙げられる。「スペルミン誘導体」はスペルミンの類似物および誘導体をいい、国際特許出願国際公開公報第93/18759号（1993年9月30日公開）に記載されている化合物が挙げられる。
【００３３】
ジスルフィド結合は送達媒体のペプチド成分を結合するために使用されている（Cottenら、1992年）。Trubetskoyら（上記）も参照されたい。
【００３４】
ＤＮＡ構築物を細胞に送達するための送達媒体は当技術分野において既知であり、例えば、WuおよびWu(1988年)、Wilsonら(1992年)および米国特許第5,166,320号に記載されている細胞表面受容体に特異的であるＤＮＡ／ポリカチオン複合体が挙げられる。
【００３５】
本発明によるベクターの送達は、核酸縮合ペプチドを使用することが考慮されている。ベクターを縮合し、ベクターを細胞に送達するのに特に有用である核酸縮合ペプチドは国際特許出願国際公開公報第96/41606号に記載されている。国際公開公報第96/41606号に記載されているように、本発明によるベクターの送達に有用なペプチドに官能基を結合することができる。これらの官能基には、モノクローナル抗体、インスリン、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質または糖などの特定の細胞種を標的とするリガンドを挙げることができる。従って、リガンドは、非特異的または細胞種に関して制限される特異的に細胞を標的とすることができる。
【００３６】
官能基はまた、パルミトイル、オレイルもしくはステアロイルなどの脂質；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの中性親水性ポリマー；インフルエンザウイルスのＨＡペプチドなどの膜融合性ペプチド；またはリコンビナーゼもしくはインテグラーゼを含んでもよい。官能基はまた、核局在化配列（ＮＬＳ）などの細胞内輸送タンパク質、膜破壊ペプチドなどのエンドソームエスケープシグナルまたは細胞質に直接タンパク質を誘導するシグナルを含んでもよい。
【００３７】
従って、本発明は以下を提供する：毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチド配列とストレス応答タンパク質またはストレス応答タンパク質発現のインデューサーをコードするポリヌクレオチド配列を含む産物。このようなストレス応答タンパク質には、ＮＦκＢ、高移動度群Ｂ１タンパク質ＨＭＧＢ１、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５などのサイトカイン並びにＨｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１１０、カルレチクリン、ｇｐ９６、ｇｒｐ１７０、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｃ７０、マイコバクテリウムＨｓｐ６５、レジオネラ・ニューモフィラＨｓｐ６０、大腸菌ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳなどのヒートショックタンパク質が挙げられる。ストレスタンパク質発現のインデューサーにはＨＳＦ−１、ＨＳＦ−２、ＨＳＦ−３、ＩＲＦ−１およびＩＲＦ−２が挙げられる。
【００３８】
好ましい一実施態様において、毒素またはプロドラッグ変換酵素は細胞を壊死的に死滅することができることが好ましい。「壊死的」または「壊死性細胞死」という用語は、プログラムされていないまたはアポトーシス性ではない全ての形態の細胞死を含む。
【００３９】
第二の好ましい実施態様において、このような産物は免疫応答、さらに好ましくは抗腫瘍免疫応答を増強する際に使用する。
【００４０】
別の実施態様において、毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチド配列およびストレス応答タンパク質もしくはストレス応答タンパク質発現インデューサーをコードするポリヌクレオチド配列は、１つのポリヌクレオチド分子の両方の要素である。さらに別の実施態様において、このような配列は、同時投与または連続投与することができる別個のポリヌクレオチドに存在する。
【００４１】
好ましくは、毒素またはプロドラッグ変換酵素は、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼである。または、それは、好ましくは哺乳類起源、さらに好ましくはヒト起源のチトクロームＰ４５０酵素である。最も好ましくは、それはヒトＣＹＰ１Ａ２である。または、それはヒトＣＹＰ２Ｅ１またはＣＹＰ３Ａ４である。
【００４２】
別の好ましい実施態様において、コードされる酵素は齧歯類チトクロームＰ４５０であり、好ましくはマウス由来である。最も好ましくは、それはマウスＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｅ１またはＣＹＰ３Ａ４である。
【００４３】
好ましくは、ポリヌクレオチドにコードされるストレス応答タンパク質はヒートショックタンパク質である。さらに好ましくは、ヒートショックタンパク質は、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１１０、カルレチクリン、ｇｐ９６、ｇｒｐ１７０、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｃ７０、マイコバクテリウムＨｓｐ６５、レジオネラ・ニューモフィラＨｓｐ６０、大腸菌ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳからなるリストから選択され、最も好ましくは、それはＨｓｐ７０である。または、ポリヌクレオチドは、ヒートショックタンパク質の発現を誘導するストレスタンパク質発現インデューサーをコードする。好ましくは、それは、ヒートショック因子−１（ＨＳＦ−１）、ヒートショック因子−２（ＨＳＦ−２）、ヒートショック因子−１（ＨＳＦ−３）、インターフェロン応答因子−１（ＩＲＦ−１）またはインターフェロン応答因子−１（ＩＲＦ−２）を含むリストから選択される。
【００４４】
第二の態様において、本発明は、上記に記載する産物を含むＤＮＡワクチンを提供する。「ＤＮＡワクチン」は、免疫原性またはアジュバント特性を有するタンパク質またはペプチドをコードするまたは発現することができる１つ以上のポリヌクレオチドを含む治療的免疫応答を誘導または増強することが意図されている産物を意味する。
【００４５】
第三の態様において、ＤＮＡワクチンは、抗腫瘍免疫応答を増強するための毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチドを含む。好ましくは、毒素またはプロドラッグ変換酵素は、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼである。または、毒素またはプロドラッグ変換酵素はチトクロームＰ４５０である。好ましくは、チトクロームＰ４５０は、ヒトＣＹＰ１Ａ２、ヒトＣＹＰ２Ｅ１、ヒトＣＹＰ３Ａ４、齧歯類ＣＹＰ１Ａ２、齧歯類ＣＹＰ２Ｅ１および齧歯類ＣＹＰ３Ａ４からなるリストから選択される。
【００４６】
好ましくは、毒素またはプロドラッグ変換酵素は壊死性細胞死を誘導することができる。
【００４７】
第四の態様において、本発明は、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼをコードするポリヌクレオチドと、抗腫瘍免疫応答を増強する際に使用するための免疫賦活分子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。「免疫賦活性」という用語には、免疫抑制因子または作用の阻害剤として機能すると思われる（ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βなどの）因子が含まれる。
【００４８】
好ましくは、免疫賦活分子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、Ｂ７−２、ＴＮＦα、γ−ＩＦＮ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＧＦ−β、ＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンド）、ＣＤ１３４リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１３５リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導受容体（ＴＲＡＩＬ、Ａｐｏ−２リガンド）からなるリストから選択される。
【００４９】
本発明の特定の実施態様は、免疫応答を増強する際に使用するための、
ａ）毒素またはプロドラッグ変換酵素と
ｂ）ストレス応答タンパク質と
をコードするベクターである。
【００５０】
好ましくは、免疫応答は抗腫瘍免疫応答である。
【００５１】
ストレス応答タンパク質がヒートショックタンパク質であることも好ましい。さらに好ましくは、ヒートショックタンパク質は、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１１０、カルレチクリン、ｇｐ９６、ｇｒｐ１７０、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｃ７０、マイコバクテリウムＨｓｐ６５、レジオネラ・ニューモフィラＨｓｐ６０、大腸菌ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳからなるリストから選択される。最も好ましくは、それはＨｓｐ７０である。
【００５２】
好ましくは、毒素またはプロドラッグ変換酵素は、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼである。最も好ましくは、ベクターは、図１に示すＣＴＬ１０２／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０である。
【００５３】
または、それは、好ましくは哺乳類起源、さらに好ましくはヒト起源のチトクロームＰ４５０酵素である。最も好ましくは、ヒトＣＹＰ１Ａ２である。または、それはヒトＣＹＰ２Ｅ１またはＣＹＰ３Ａ４である。
【００５４】
別の好ましい実施態様において、コードされる酵素は齧歯類チトクロームＰ４５０であり、好ましくはマウス由来である。最も好ましくは、それはマウスＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｅ１またはＣＹＰ３Ａ４である。
【００５５】
上記のベクターのいずれかが、腫瘍選択的発現を提供する１つ以上のプロモーターに機能的に結合し、一方で毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチド配列および他方でストレス応答タンパク質またはストレス応答タンパク質発現インデューサーをコードするするポリヌクレオチドの一方または両方を有することがさらに好ましい。
【００５６】
本明細書において使用する「機能的に結合する」という用語は、プロモーターの制御下において遺伝子を発現させるｃｉｓ結合をいう。
【００５７】
好ましい腫瘍選択性プロモーターには、ＴＲＰ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、α−フェトプロテイン、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ビリン、膵臓アミラーゼ、チロシナーゼ関連ペプチド、腫瘍拒絶抗原前駆体およびＴ細胞因子（ＴＣＦ）応答プロモーターが挙げられる。好ましくは、プロモーターは１つ以上のＴＣＦ応答要素を含む。
【００５８】
ＴＣＦは、ＤＮＡ結合タンパク質の高移動度群（ＨＭＧ）の転写因子ファミリーである（Loveら、Nature,376,791-795,1995）。ファミリーには、van der Weteringら(EMBO J.10,123-132,1991)、欧州特許出願第0 939 122号およびKorinekら（Science,275,1784-1787,1997）に記載されているＴＣＦ−１、ＴＣＦ−３およびＴＣＦ−４が含まれる。ＴＣＦ−４は、Wnt/Winglessシグナル伝達系に関連する腫瘍形成に関与することが示されている。ＴＣＦおよびＬＥＦ−１（リンパ系増強因子−１）は、β−カテニンと相互作用することによってＷｎｔ信号に対する核応答を媒介すると考えられる。β−カテニンの安定性を増加するＷｎｔシグナル伝達系および他の細胞事象は、β−カテニンと関連したＬＥＦ−１およびＴＣＦタンパク質による遺伝子の転写活性化を生じると考えられる。Ｗｎｔシグナル伝達系が存在しない場合には、ＬＥＦ−１／ＴＣＦタンパク質はGrouchoおよびＣＢＰ（ＣＲＥＢ結合タンパク質）と関連する転写を抑制する。
【００５９】
Ｗｎｔシグナル伝達系が存在しない場合には、β−カテニンは２つの別個の多タンパク質複合体に見られる。細胞膜に位置する一方の複合体はカドヘリン（カルシウム依存的接着分子）とアクチン細胞骨格を結合するが、他方の複合体（タンパク質、腺腫性結腸ポリープタンパク質（ＡＰＣ）、アクシンおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を含有する）は分解のためにβ−カテニンを標的とする。Ｗｎｔシグナル伝達系はＡＰＣ−アクシンＧＳＫ３β複合体と拮抗して、遊離の細胞質内β−カテニンの貯蔵を増加する。遊離の細胞質内β−カテニンは核に転位して、ＬＥＦ−１／ＴＣＦ因子に結合し、Ｗｎｔ標的遺伝子を活性化する。Ｗｎｔおよび他の信号によるＬＥＦ−１／ＴＣＦ因子の調節はEastmanら（Current Opin.Cell Biology,11,233-240,1999）に考察されている。
【００６０】
ＴＣＦは、ヌクレオチド配列ＣＴＴＴＧＮＮ（式中、ＮはＡまたはＴを示す）を有するＴＣＦ結合要素を認識し、結合することが知られている（van der Weteringら、上記）。
【００６１】
ＴＣＦ応答要素は、特に結腸および肝臓腫瘍において機能的に結合した遺伝子の腫瘍選択性の高い発現を提供することが示されている（国際公開公報第01/64739号）。
【００６２】
好ましくは、ベクターはウイルスベクターであり、さらに好ましくはアデノウイルスベクターである。特に好ましい実施態様は、抗腫瘍免疫応答を増強する際に使用するための（ａ）プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼおよび（ｂ）ｈｓｐ７０をコードし、発現を可能にするアデノウイルスベクターである。最も好ましくは、それはＣＴＬ１０２／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０である。
【００６３】
または、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターであり、さらに好ましくはレンチウイルスベクターである。
【００６４】
さらに別の実施態様は、上記ベクターのいずれかを含む宿主細胞である。
【００６５】
本発明の別の態様は、上記の産物または組成物、ベクターまたは宿主細胞を含むワクチンである。
【００６６】
医薬品またはワクチンとして使用するための上記の産物または組成物、ベクターまたは宿主細胞も提供される。
【００６７】
本発明のさらに別の態様は、上記の産物、組成物、ＤＮＡワクチン、ベクターまたは宿主細胞のいずれかと、製薬学的に許容されうる希釈剤、緩衝剤、補助剤または賦形剤を含む製薬学的組成物である。
【００６８】
また、癌を治療するための医薬品を製造するためまたは癌を治療するためのワクチンを製造するための上記産物、組成物、ＤＮＡワクチン、ベクターまたは宿主細胞のいずれかの使用も提供する。
【００６９】
本発明は、毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチドとヒートショックタンパク質またはヒートショックタンパク質発現インデューサーをコードするポリヌクレオチドを含む治療量の産物を投与するステップを含む、免疫応答を増強する方法を提供する。好ましくは、免疫応答は抗腫瘍免疫応答である。
【００７０】
毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチドとヒートショックタンパク質またはヒートショックタンパク質発現インデューサーをコードするポリヌクレオチドを含む治療量の産物を投与するステップを含む、ある形態の癌に罹患している患者を治療する方法も提供される。
【００７１】
好ましい一実施態様において、本発明の方法は、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼをコードするポリヌクレオチドとヒートショックタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む治療量の産物を投与するステップと、産物が腫瘍細胞に進入し、コードされているニトロレダクターゼおよびヒートショックタンパク質が発現される時間をおくステップと、治療量のＣＢ１９５４を投与するステップとを含む。
【００７２】
または、本発明の方法は、チトクロームＰ４５０をコードするポリヌクレオチドおよびヒートショックタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む治療量の産物を投与するステップと、産物が腫瘍細胞に進入し、コードされているチトクロームＰ４５０およびヒートショックタンパク質が発現される時間をおくステップと、治療量のプロドラッグを投与するステップとを含む。好ましくは、プロドラッグはアセトアミノフェンである。
【００７３】
上記方法のいずれにおいても、ヒートショックタンパク質がＨｓｐ７０であることが好ましい。
【００７４】
本発明の別の態様において、治療的な抗腫瘍免疫応答が誘導されるように、ヒートショックタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む治療量の産物と治療量の抗癌細胞傷害薬を投与するステップを含む、ある形態の癌に罹患している患者を治療する方法が提供される。
【００７５】
好ましい実施態様において、抗癌細胞傷害薬は、腫瘍細胞に壊死性細胞死を誘導することができる。
【００７６】
本発明の最後の態様において、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含む治療量の産物を投与するステップと、組成物が腫瘍細胞に進入して、コードされているニトロレダクターゼが発現される時間をおくステップと、治療量のＣＢ１９５４を投与するステップとを含む抗腫瘍免疫応答を誘発する方法が提供される。
【００７７】
本発明の産物、ＤＮＡワクチン、ベクターもしくは宿主細胞または製薬学的組成物は、全身、筋肉内、皮下、皮内、静脈内、エアゾール、経口（固体または液体剤形）、局所、点眼、坐剤、腹腔内および／またはくも膜下腔内および局所的な直接注射を含む経路によって投与することができる。
【００７８】
当然のことながら、正確な用法用量は、個々の患者について個々の医師が決定する必要があり、治療用遺伝子が発現するタンパク質の性質および治療対象の組織の種類によって制御される。
【００７９】
用量はまた、適応症および投与経路に依存する。
【００８０】
本発明による効果的な治療のために送達される核酸構築物またはベクターの量は、好ましくは、約５０μｇ〜１０００μｇのベクターＤＮＡ／体重１ｋｇの範囲内であり、さらに好ましくは約１〜１００μｇベクターＤＮＡ／ｋｇの範囲内である。
【００８１】
インビボにおける細胞への取り込みのために核酸構築物、ベクターまたは宿主細胞を哺乳類に投与することが本発明により好ましいが、細胞を動物から取り出し、核酸構築物またはベクターを形質導入し、次いで動物に再植え込みする半ビボ方法を使用することができる。
【００８２】
［発明の詳細な説明］
本発明は以下の実施例を使用することによって詳細に説明される。これらは例示的にすぎず、限定するものと考えられるべきではない。
【実施例】
【００８３】
［実施例１］
〔材料と方法〕
（細胞培養）
４Ｔ１、マウス乳癌細胞はＡＴＣＣ（ＣＲＬ−２５３９）から入手した。ＥＪ−６−２−Ｂａｍ−６ａはＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１８８８）から入手し、ヒトＥＪ膀胱癌のＤＮＡをＮＩＨ／３Ｔ３にトランスフェクトすることによって作製した。ＰＥＲ．Ｃ６細胞（lit）はIntroGene（Leiden、オランダ）から入手した。９１１細胞はProf.L.Young(CRC Institute for Cancer Studies、University of Birmingham、英国)の親切な提供を受け、１０％ＦＣＳ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2および抗生物質を含有するＤＭＥＭで維持した。４Ｔ１およびＥＪ−６−２−Ｂａｍ−６ａは、供給元が推奨するように培養した。
【００８４】
（プラスミド構築）
ｐＴＸ０３７４は、大腸菌(E. coli)ｎｔｒ遺伝子（ＮＴＲ：ゲノムＤＮＡから増幅した大腸菌(E. coli)Ｂ／ｒニトロレダクターゼ遺伝子）に融合させたヒトＣＭＶプロモーターを含有する１．６ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＳＷ１０７にクローニングすることによって構築した。ｐＲＡＪ４３ＢＰ４は、マウスＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡを含有するｐＵＣ１９プラスミドであり、Prof.L.Young(CRC Institute for Cancer Studies、University of Birmingham、英国)の親切な提供を受けた。ＣＥＴ９０２は、マウスＣＭＶ １Ｅエンハンサー／プロモーターおよび後期ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルを含有するｐＵＣ１９プラスミドである。
【００８５】
ＣＥＴ９０２／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０は、ストレス誘導性マウスＨＳＰ７０タンパク質の発現カセットを含有し、記載するように構築した。先ず、完全長（１．４ｋｂ）のマウスＣＭＶプロモーターをｐＵＣ１９系ベクターにクローニングした。第二に、後期ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルをプロモーターの下流にクローニングした。最後に、マウスＨｓｐ７０をコードするｃＤＮＡを、ＳｍａＩ部位を使用して、プロモーターとポリ（Ａ）シグナルの間にクローニングした。マウスＨＳＰ７０のｃＤＮＡを含有するプラスミドは、Dr.R.Vile(Molecular Medicine Program、Mayo Clinic、200 First Street SW、Rochester、Minnesota、米国)の親切な提供を受け、ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして切断し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、平滑末端化した。
【００８６】
ＣＥＴ９０２／ｍＣＭＶ−ｍＧＭ−ＣＳＦは、ｐＲＡＪ ４３ ＢＰ４をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して、４６５ｂｐのフラグメントを放出することによって作製した。フラグメントを平滑末端化し、ＳｍａＩにライゲーションしてＣＥＴ９０２を作製した。
【００８７】
ｐＰＳ１１２８はDr.P.Searle、CRC Institue of Cancer Studies、University of Birminghamの親切な提供を受けた。ｐＰＳ１１２８は左側ＩＴＲからｎｔ３５９およびｎｔ３５２５から１０，５７９のアデノウイルス配列を含有し、従ってＥ１欠損ベクターである。ｐＰＳ１１２８は、ポリ（Ａ）付加シグナルおよびヒト補体Ｃ２遺伝子の転写停止シグナルを含有する２４０ｂｐのＨｉｎｃＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに結合したヒトβ−グロビン遺伝子の９１７ｂｐフラグメント（エクソン２のＢａｍＨＩ部位からエクソン３のＥｃｏＲＩ部位）をpBluescript（Stratagene）にクローニングすることによって構築した。このプラスミドは２段階で構築した。第１の段階において、ｐＰＳ９７１の左側ＥｃｏＲＩ部位（Weedonら、Int.J.Cancer、印刷中）をＳｗａＩ部位に変換してｐＰＳ１１５を作製した。第２の段階において、２つのオリゴヌクレオチド：
５’−ＣＴＡＧＴＡＴＣＧＡＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＧＣＧＴＧＧＣＣ−３’および
５’−ＴＴＡＡＧＧＣＣＡＣＧＣＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＣＧＡＴＡ−３’
をアニーリングすることによって、ｐＰＳ１１５の３５０ｂｐのＳｐｅ１−ＡｆｌＩＩフラグメントをリンカーと置換した。
【００８８】
ｐＰＳ１０２２は、右側ＥｃｏＲＩ部位をＳｗａＩ部位に変換することによってｐＰＳ９７２から構築した。
【００８９】
ｐＴＸ０３７５、ＣＴＬ１０２を作製するために使用する導入ベクターは、ｐＴＸ０３７４の全発現カセットにわたるＳｐｅＩフラグメント（ｈＣＭＶ−ＮＴＲ−ＩＶＳＩＩ−ｐ（Ａ））をＳｐｅＩ消化したｐＰＳ１１２８にクローニングすることによって構築し、左から右方向にカセットを含有するクローンを同定した。ｐＰＳ１１２８／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０およびｐＴＸ０３７５／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０は、それぞれ、ｐＴＸ０３７５の平滑末端化したｐＰＳ１１２８部位または平滑末端化したＰａｃＩ部位にＣＥＴ９０２／ｍＨＳＰ７０のｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０−ＳＶ４０ｐ（Ａ）発現カセットを導入することによって構築した。ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ−ＳＶ４０ｐ（Ａ）発現カセットは、ＣＥＴ９０２／ｍＨＳＰ７０プラスミドをＸｍｎＩ、ＡｓｃＩおよびＢｓｔＺ１７１で消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化することによって作製した。従って、最終的なカセットは約５００ｂｐのマウスＣＭＶプロモーターを含有し、このピースは活性の大半を提供する。ｐＰＳ１１８／ｍＣＭＶ−ｍＧＭ−ＣＳＦはＣＥＴ９０２／ｍＣＭＶ−ｍＧＭ−ＣＳＦから作製した完全な発現カセット（１．３ｋｂ）（ＢｓｔＺ１７１およびＡｓｃＩ消化し、平滑末端化）をｐＰＳ１１２８にクローニングすることによって構築した。
【００９０】
アデノウイルス「バックボーン」ベクターｐＰＳ１１６０は、ｐＰＳ１１２８をＰａｃＩ鎖状化し、ＸｂａＩ部位を含有するＰａｃＩ−適合性アダプター（オリゴ１：５’−ＴＡＣＡＴＣＴＡＧＡＴＡＡＴ−３’、オリゴ２：５’−ＴＴＡＴＣＴＡＧＡＴＧＴＡ−３’）をライゲーションし、次にＸｂａＩ消化して、Ａｄ５配列３５２４〜１０５８９を含有する約７ｋｂのＸｂａＩフラグメントを遊離することによって構築した。次いで、これをＸｂａＩ鎖状化したｐＰＳ１０２２(Dr.Peter Searle)、ｎｔ１０，５８９から右側ＩＴＲのＡｄ５配列を含有するが、ｎｔ２８，５９２から３０，４７０（Ｅ３領域）を欠損するｐＵＣ１８系プラスミドにクローニングした。
【００９１】
（アデノウイルスベクター構築）
組換えウイルスＣＴＬ１０２（Ａｄ．ｈＣＭＶ−ＮＴＲ）、ＣＴＬ１０２／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０、Ａｄ．ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０およびＡｄ．ｍＣＭＶ−ｍＧＭ−ＣＳＦは、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞における相同組換えによって構築した。これらの細胞に、ｐＴＸ０３７５、ｐＴＸ０３７５／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０、ｐＰＳ１１２８／ｍＣＭＶ−ＨＳＰ７０またはｐＰＳ１１２８／ｍＣＭＶ−ｍＧＭ−ＣＳＦおよびｐＰＳ１１６０の等モル混合物を同時形質移入し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を９０％集密化させた。組換えウイルスは、感染培地（ＤＭＥＭ、１％ＦＣＳ、２ｍＭのＭｇＣｌ2）中で凍結−融解を３サイクル実施することによって約７日後に回収した。感染／回収サイクルを反復することによって、ウイルスを大量に増殖させ、次いで標準的なＣｓＣｌ密度勾配遠心分離によって精製し、過剰量の保存緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．６ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、０．９ｍＭのＣａＣｌ2、０．５ｍＭのＭｇＣｌ2および５％スクロース）で透析し、最後に液体窒素中でスナップ凍結し、−８０℃において保存した。粒子濃度は、BCA Protein Assay Reagent(Perbio Science UK,LTD、Tattenhall、Cheshire、UK)を使用して測定した。プラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）力価は９１１細胞のプラークアッセイによって測定した。
【００９２】
（４Ｔ１のインビトロにおける感染）
４Ｔ１細胞は、感染培地（通常培地であるが、１％ＦＣＳを含有する）中で細胞あたり示したｐ．ｆ．ｕ．（ＭＯＩ）を、細胞密度１×１０7／ｍｌのときに加湿したＣＯ2インキュベーター中で約２．５時間感染させた。感染中、３０分ごとに細胞をゆっくり混合した。次いで、細胞をペレット化（３００×ｇ、５分）し、洗浄してからＰＢＳに再懸濁させた。ワクチン化実験では、使用したＭＯＩは２００〜３００であり、ウイルスの組み合わせを使用する場合には、ベクターの最終用量は、用量依存的な細胞変性作用を回避するために一定にした。
【００９３】
（ウェスタンブロット分析）
３×１０5のＨｅＬａ細胞に、５％ＣＯ2雰囲気下で３７℃において２時間インキュベーションすることによって感染培地中で示したＭＯＩを感染させた。次いで、細胞に完全培地（１０％ＦＣＳ）を供給し、２４時間培養した。次いで、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで６ウェルあたり２００μｌＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０％ＮＰ４０、０．１％ＳＤＳ、０．５％Ｎａ−デスオキシコラット（Desoxycholat）プラス完全プロテアーゼ阻害剤カクテル、Roche）を添加することによって全細胞溶菌液を調製した。細胞を室温において１０分間インキュベーションし、４℃において13,000RPMで遠心分離した。透明な溶菌液を別の試験管に移し、Biorad DC Protein Assayキット(Hercules、CA、米国)を使用してタンパク質濃度を測定した。High Rainbowタンパク質サイズマーカー(Amersham Pharmacia、Piscataway、NJ、米国)を使用して、３０μｇの各溶菌液試料を１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解した。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜(Gelma Sciences、Ann Arbor、MI、米国)に移した。ＴＢＳ（１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／５％粉乳中で室温において１時間膜をブロッキングした。以下のようにブロッキング緩衝液で一次抗体を希釈した：ヒツジ抗ＮＴＲ（ポリクローナル抗体、Dyfed、英国）：１：２０００、マウス抗ＨＳＰ７０（SPA-810、Stressgen Biotechnologies、Victoria BC、カナダ）１：１０００およびヤギ抗ＧＭ−ＣＳＦ（SantaCruz、ＣＡ、米国；ｓｃ−１３２２）：１：１０００。膜は室温において１時間一次抗体と共にインキュベーションし、次いで十分に洗浄し、次いで以下のようにＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％粉乳中で室温において３０分間二次抗体と共にインキュベーションした：ロバ抗ヤギＨＲＰ（1:7,500;Sigma）、抗マウスＨＲＰ（１：１０，０００；Sigma A-9917）および抗ヤギＨＲＰ（Sigma、A-5420）。十分に洗浄後、Pierce「SuperSignal West Pico Chemiluminescence基質」(Perbio Science UK Ltd.、Tattenhall、英国)を使用して高感度化学発光を実施し、Alpha Innotech Imager Model#2.3.1で分析した。
【００９４】
（マウス）
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２d、６〜８週齢）はHarlan（Oxion、米国）から入手し、温度制御し、明暗サイクルを行える部屋で、飼料と水は随時与えて管理した。マウスは１週間休息させてから任意の処理を実施した。注意および全ての実験手法は、UK Home Office規則に遵守して実施した。
【００９５】
（マウス腫瘍モデル）
４Ｔ１は、ＢＡＬＢ／ｃｆＣ3Ｈマウスにおいて自然に発生した乳腺癌から樹立された攻撃性が高く転移性の細胞系統である（Dexterら、1978年）。Ｈ−２dクラスＩを発現するが、クラスII分子を発現しない４Ｔ１細胞系統は、インビトロまたはインビボにおいて同質遺伝子的な抗腫瘍応答を刺激しない非免疫原性腫瘍モデルである。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける１００％腫瘍誘導最小量は５×１０2細胞である。４Ｔ１細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射すると、攻撃的な固形腫瘍を形成し、主に肺に自然転移することがあるが、原発腫瘍もその場で増殖を続ける。線維芽細胞系統である、ＥＪ−６−２−Ｂａｍ−６ａ（Shinら、1981年）を対照腫瘍として使用した。
【００９６】
（ワクチン化プロトコール）
示した数のアデノウイルス−形質導入した４Ｔ１細胞を、合計１００μｌの容量で各未処理のマウスの右横腹に皮下注射した（０日目）。異なる実験群に、ニトロレダクターゼおよび／または同時刺激遺伝子を含有するアデノウイルスの１つの組み合わせまたは異なる組み合わせを注射した。導入遺伝子の最大の発現が生じうることが実証されている２日目まで導入遺伝子の発現をインビボにおいて進行させてから、４００μＭのＣＢ１９５４溶液を総容量５００μｌで腫瘍周囲に注射した。特に記載しない限り、２１日目に全てのマウスに５．０×１０3親４Ｔ１細胞の２回目の対側注射により腫瘍を負荷した。この量は、未処理のマウスにおける最小致死量より１０倍多い。未処理のマウス群にも同じ経過時点にこれらの細胞を注射した。長期抗腫瘍免疫応答の誘導は、ワクチン後８０日目にマウスに腫瘍負荷することによって実証した。任意の１つの実験における全てのマウス群は、同じ細胞調製物を使用して同じ日に腫瘍負荷した。動物は触診によって腫瘍の出現を定期的に調査した；以降は、２〜３回／週ノギスを使用して腫瘍の直交方向の２つの寸法を測定した。腫瘍サイズは個々の腫瘍の２つの径の積として表した。マウスは、窮迫徴候を示し、腫瘍が過剰に壊死的になったときまたは腫瘍サイズが１６０ｍｍ2を越えたとき、人道的な理由により処分した。
【００９７】
〔結果〕
（４Ｔ１のＣＴＬ１０２／ＣＢ１９５４死滅は、４Ｔ１細胞負荷に対する大きな長期的防御を誘導することができる）
インサイチューにおけるＮＴＲ／ＣＢ１９５４腫瘍死滅が特異的な抗腫瘍免疫の形成に寄与する可能性を試験するために、ワクチン化実験を実施した。細胞接種の用量範囲（５．０×１０2〜５．０×１０6ＮＴＲ発現４Ｔ１細胞）および用量を１００から４００μＭの範囲で増加させたＣＢ１９５４によるその後のインビボ処理を試した最適死滅条件を確立するための最適化実験（データは示していない）において、腫瘍を保有しないマウスをワクチン化した。５．０×１０3または５．０×１０4ＮＴＲ発現４Ｔ１細胞でそれぞれワクチン化した２つの群の腫瘍細胞の最初の接種を拒絶したマウスに、細胞接種後２１日目に反対側の横腹に５．０×１０3の未改変の４Ｔ１細胞を負荷した。長期抗腫瘍免疫応答の誘導を評価するために、ワクチン化後８０日目にもマウスへの細胞負荷を実施した。全ての未処理のマウスは、１０日目までに進行的に増殖する腫瘍を発生し、負荷後２５日目までに強制的な犠牲に処した。細胞負荷を拒絶するワクチンの用量依存的な応答は、細胞負荷の時期に関係なく、ＮＴＲ／ＣＢ１９５４死滅細胞でワクチン化したマウスにおいて観察された（図４Ａ）。低用量の５．０×１０3細胞によるワクチン化は、未処理のマウスと比較して低いレベルの防御を与えるが、高ワクチン化用量（５．０×１０4）は４Ｔ１細胞の免疫原性をかなり増強し、マウスの大半を細胞負荷から防御した。
【００９８】
ＮＴＲ／ＣＢ１９５４死菌ワクチンで見られる防御の特異性を評価するために、５．０×１０3または５．０×１０4ＮＴＲ発現４Ｔ１細胞でワクチン化したマウスに、別の同系腫瘍、ＥＪ６、マウス線維肉腫を負荷した。４Ｔ１細胞による免疫化は、ＥＪ６細胞の負荷から全てのマウスを防御しなかった（図４Ｂ）。
【００９９】
（マウスＨＳＰ７０同時刺激分子の発現によるＮＴＲ／ＣＢ１９５４死滅の抗腫瘍免疫の増強）
ワクチン化モデルにおけるＮＴＲ／ＣＢ１９５４死滅の影響が同時刺激分子ＨＳＰ７０の発現によって改善されるかどうかを判定するために、ＮＴＲ遺伝子を保有するシングル組換えウイルスまたはＮＴＲとＨＳＰ７０遺伝子の両方を保有するダブル組換えウイルスを形質導入した４Ｔ１細胞からなる単回免疫化をマウスに実施した。動物にＣＢ１９５４を２日目に腫瘍周囲に注射し、次いで動物の反対側の横腹に５．０×１０3未改変４Ｔ１細胞を負荷した（免疫化プロトコールを参照されたい）。２つの異なるワクチン化用量、５．０×１０4の低用量および５．０×１０5の高用量を使用した。細胞接種後２１日目に全ての動物に５．０×１０3未改変４Ｔ１細胞を負荷し、腫瘍の出現、腫瘍の増殖および生存率について追跡調査した。結果は、ＨＳＰ７０を発現する細胞のＮＴＲ／ＣＢ１９５４死滅作用は、ＮＴＲ／ＣＢ１９５４死滅細胞単独でワクチン化したマウスより、免疫応答を刺激する際により強力であることを示唆している（図５Ａ）。ワクチン化細胞の数が多いことは、４Ｔ１細胞のその後の負荷からマウスを防御する際にすぐれていると思われる。結果として、ＮＴＲ−ＨＳＰ７０を発現する細胞でワクチン化した動物は有意な生存率を示した（図５Ｃ）。一方、ＮＴＲを発現する細胞を与えた動物は、中程度の生存という利点を示しただけで、１匹のマウスが腫瘍を形成しないで３ヶ月より長く生存する。ＨＳＰ７０を発現する細胞単独による免疫化およびＣＢ１９５４による処理は、接種部位における腫瘍の出現からどのマウスも防御せず、接種部位では進行的に増殖する腫瘍が形成され、約３０日で強制的な犠牲の対象となるサイズに達し、マウスは細胞接種後２１日目の免疫化時から間もなく犠牲にしなければならなかった。
【０１００】
（ｍＧＭ−ＣＳＦ同時刺激分子の発現によるＮＴＲ／ＣＢ１９５４死滅の抗腫瘍免疫の増強）
ＮＴＲ／ＣＢ１９５４死滅の免疫活性化特性に対するＧＭ−ＣＳＦ発現の影響を評価するために、４Ｔ１細胞にＮＴＲおよびＧＭ−ＣＳＦを保有するアデノウイルスベクターを同時形質導入し、マウスに注射し（５．０×１０5）、ＣＢ１９５４でインビボにおいて処理した（免疫化プロトコールを参照されたい）。ＧＭ−ＣＳＦ単独は細胞負荷の拒絶に大きな影響を示し、ＮＴＲ／ＣＢ１９５４死滅細胞によるワクチン化よりかなり優れていたが、ＮＴＲ／ＣＢ１９５４死滅時に腫瘍環境にＧＭ−ＣＳＦが存在すると、細胞負荷に対するかなり良好な防御を生じ、マウスの５７％が細胞負荷後３０日目に細胞負荷を拒絶した（図５Ａ）。免疫化しない未処理のマウスは全て、腫瘍負荷後１ヶ月も経過しないうちに腫瘍組織量のために犠牲にしなければならなかった。
【０１０１】
［引用文献］
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）Ｅ１組換えアデノウイルスの構造である。全てのウイルスは、示すようにウイルス領域Ｅ１およびＥ３が欠損している。Ｅ１欠損はＡｄ５ウイルスゲノムのｎｔ３５９〜３５２４を含み、Ｅ３欠損はＡｄ５ウイルスゲノムのｎｔ２８、５９２−３０、４７０を含む。ＨＣＭＶ：ヒトＣＭＶ（サイトメガロウィルス）ＩＥ（前初期）エンハンサー／プロモーター；ＮＴＲ：大腸菌ニトロレダクターゼ遺伝子；ＩＶＳＩＩ：ヒトβ−グロビンイントロンＩＩ配列；ｍＣＭＶ：マウスＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーター；ｍＨＳＰ７０：マウスヒートショックタンパク質７０；ＳＶ４０：後期ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル；ｍＧＭ−ＣＳＦ：マウス顆粒球単球−コロニー刺激因子。
【図２】ＮＴＲ、ｍＨＳＰ７０およびｍＧＭ−ＣＳＦタンパク質発現を分析する、アデノウイルスベクター感染細胞の細胞溶解液のウェスタンブロット分析である。（Ａ）ＣＭＴ９３細胞（内因性ＨＳＰ７０を発現しない）に、ＭＯＩを増加させて、Ａｄ．ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０（レーン３〜５）またはＣＴＬ１０２／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０（レーン８〜１０）を感染させた。ＣＴＬ１０２感染細胞の抽出液をＮＴＲ発現の陽性対照として使用した。Ａｄ．ＣＭＶ−ＬａｃＺ感染細胞の抽出液（レーン２）を陰性対照として使用した。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞にＡｄ．ｍＣＭＶ−ｍＧＭ−ＣＳＦ（レーン２）またはＡｄ．ＣＭＶ−ＬａｃＺ（レーン１；陰性対照）を感染させた。全細胞抽出液を感染の２４時間後に調製した。５０μｇタンパク質溶菌液を使用して、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、材料と方法に記載するようにダウンストリームプロセッシングを実施した。発現されたタンパク質の予想サイズを確認するためにBiorad分子量標準を使用した。
【図３】ワクチン化スキームである。
【図４】５．０×１０3の１回ワクチン化による５．０×１０3親４Ｔ１細胞および５．０×１０4Ａｄ．ｈＣＭＶ−ＮＴＲ−形質導入（ＣＴＬ１０２）４Ｔ１細胞による腫瘍負荷とインビボにおけるＣＢ１９５４処理によるマウスの防御である。ワクチン化の２１日後（白ぬきのバー）または８０日後（黒塗りのバー）にマウスに腫瘍負荷した。Ｂ ５．０×１０3または５．０×１０4ＣＴＬ１０２−形質導入４Ｔ１細胞の単回投与によるワクチン化とインビボにおけるＣＢ１９５４処理の２１日目には、５．０×１０4ＥＪ６細胞、関係のない腫瘍細胞系統の腫瘍負荷に対する防御は見られない。バーは、強制的に犠牲にした時点における未処理のマウスの対照群の平均腫瘍サイズと比較した、処理マウスにおける腫瘍負荷の個々の腫瘍サイズの割合を示す。
【図５】Ａ（ａ）５．０×１０4Ａｄ．ｈＣＭＶ−ＮＴＲ−形質導入（ＣＴＬ１０２）した４Ｔ１細胞でワクチン化し、ＣＢ１９５４で処理したＢＡＬＢ／ｃマウス、（ｂ）５．０×１０4Ａｄ．ｈＣＭＶ−ＮＴＲ／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０−形質導入した４Ｔ１細胞でワクチンし、ＣＢ１９５４で処理したＢＡＬＢ／ｃマウス、（ｃ）５．０×１０5ＣＴＬ１０２−形質導入した４Ｔ１細胞でワクチンし、ＣＢ１９５４で処理したＢＡＬＢ／ｃマウスおよび（ｄ）５．０×１０5Ａｄ．ｈＣＭＶ−ＮＴＲ／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ−形質導入した４Ｔ１細胞でワクチン化し、ＣＢ１９５４で処理したＢＡＬＢ／ｃマウスそれぞれにおける腫瘍負荷後３０日経過時における負荷した腫瘍の腫瘍サイズである。ワクチン化後２１日目に、全てのマウスおよび未処理のマウス群（ｅ）に５．０×１０3親４Ｔ１細胞を負荷した。Ｂ グラフは処理群の平均腫瘍サイズを示す。Ｃ ５．０×１０5ＣＴＬ１０２−形質導入した４Ｔ１細胞でワクチンし、ＣＢ１９５４で処理したマウス、５．０×１０5Ａｄ．ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０−形質導入した４Ｔ１細胞でワクチンし、ＣＢ１９５４で処理したマウスおよび５．０×１０5Ａｄ．ｈＣＭＶ−ＮＴＲ／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ−形質導入した４Ｔ１細胞でワクチン化し、ＣＢ１９５４で処理したマウスの生存率を示す。ワクチン化後２１日目に、全てのマウスおよび未処理のマウス群に５．０×１０3親４Ｔ１細胞を負荷した。
【図６】Ａ （ａ）５．０×１０4Ａｄ．ｈＣＭＶ−ＮＴＲ−形質導入（ＣＴＬ１０２）した４Ｔ１細胞でワクチン化し、ＣＢ１９５４で処理したＢＡＬＢ／ｃマウス、（ｂ）５．０×１０5ＣＴＬ１０２＋Ａｄ．ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０−形質導入した４Ｔ１細胞でワクチンし、ＣＢ１９５４で処理したＢＡＬＢ／ｃマウス、（ｃ）５．０×１０5Ａｄ．ｍＣＭＶ−ｍＧＭ−ＣＳＦ−形質導入した４Ｔ１細胞でワクチンし、ＣＢ１９５４で処理したＢＡＬＢ／ｃマウスおよび（ｄ）５．０×１０5ＣＴＬ１０２＋Ａｄ．ｍＣＭＶ−ｍＧＭ−ＣＳＦ−形質導入した４Ｔ１細胞でワクチンし、ＣＢ１９５４で処理したＢＡＬＢ／ｃマウスそれぞれにおける腫瘍負荷後３０日経過時の負荷した腫瘍の腫瘍サイズである。ワクチン化後２１日目に、全てのマウスおよび未処理のマウス群（ｅ）に５．０×１０3親４Ｔ１細胞を負荷した。Ｂ グラフは処理群の平均腫瘍サイズを示す。
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は免疫療法の分野に関し、特に抗腫瘍免疫応答の増強に関する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
癌を治療する１つの方法は、比較的低毒性のプロドラッグを強力な細胞傷害薬に変換することができる酵素をコードする遺伝子を腫瘍細胞に導入することである。プロドラッグはプロドラッグ変換酵素を発現する細胞によって腫瘍内で局所的に毒性の誘導体に変換されるので、プロドラッグの全身投与は耐容される。この方法は遺伝子運搬酵素プロドラッグ療法（ＧＤＥＰＴ:gene-directed enzyme prodrug therapy）、または遺伝子が組換えウイルスベクターによって送達される場合には、ウイルス運搬プロドラッグ療法（ＶＤＥＰＴ:virus-directed prodrug therapy）として知られている（McNeishら、1997年）。
【０００３】
この方法に使用されるプロドラッグおよびプロドラッグ変換酵素の例には、ガンシクロビルとＨＳＶチミジンキナーゼ、５−フルオロシトシンとシトシンデアミナーゼ、シクロホスファミドまたはパラセタモールとチトクロームＰ４５０および本発明に特に関連のあるアジリジニルプロドラッグＣＢ１９５４（５−（アジリジン−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミドとニトロレダクターゼが挙げられる（Konoxら1988年）。Walkerラット癌細胞系統がＣＢ１９５４に特に感受性であったという観察により、これはラットニトロレダクターゼＤＨジアフォラーゼの発現によるものであることが示された。しかし、ＣＢ１９５４はヒト型のこの酵素のすぐれた基質ではないので、ヒト腫瘍細胞はＣＢ１９５４に対する感受性がかなり低い。ＧＤＥＰＴは、標的細胞を敏感にするために、好ましくはＣＢ１９５４に対する活性が大きい好適なニトロレダクターゼを導入する方法と考えられた。ＮＦＳＢ遺伝子（またはＮＦＮＢ、ＮＦＳＩもしくはＤＰＲＡとして知られている）によってコードされる大腸菌ニトロレダクターゼ（EC1.6.99.7、または酸素非感受性ＮＡＤ（Ｐ）Ｈニトロレダクターゼもしくはジヒドロプテリジンレダクターゼとして知られており、ＮＴＲと略されることが多い）はこの目的のために広範に使用されている（Groveら、1999年に総説が示されている）。ＮＦＳＢにコードされるニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）は、２つのフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）補因子分子に結合するホモダイマーである。電子ドナーとしてのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨおよび還元型中間体としての結合型ＦＭＮを使用して、ＮＴＲはＣＢ１９５４の２つのニトロ基の一方または他方を還元して、毒性の高い４−ヒドロキシルアミン誘導体または比較的無毒性の２−ヒドロキシルアミンを生ずる。細胞内では、５−（アジリジン−１−イル）−４−ヒドロキシルアミノ−２−ニトロベンズアミドは、おそらくさらに別の毒性代謝物を介して、非常に遺伝毒性となる（Knoxら、1991年）。生じる障害の正確な性質は明らかではないが、他の薬剤によって生じるものとは異なる。特に高い割合のストランド間の架橋が生じ、損傷は修復が不良であると思われ、その結果としてＣＢ１９５４は格別に影響力のある抗腫瘍剤である（Friedlosら、1992年）。このシステムは、ヌードマウスに異種移植したヒト腫瘍を含む数多くのモデルシステムにおいて有用な抗腫瘍応答を生ずる際に有効であることが示されている（Djehaら、2000年）。
【０００４】
とは言うものの、酵素−プロドラッグ方法に免疫治療法を組み合わせることによって、このような酵素−プロドラッグ方法の殺腫瘍性作用を増強する試みがなされている。根本的な根拠は、腫瘍部位および転移部位に残存する細胞が（主に）細胞傷害性Ｔ細胞応答によって殺されることを期待して、細胞傷害剤で殺される細胞における腫瘍特異的抗原に対する抗腫瘍免疫応答を形成しようとすることである。このような応答を刺激する助けとするために、数多くの免疫賦活分子(immunostimulatory molecule)を使用する遺伝子治療がＧＤＥＰＴ／ＶＤＥＰＴと併用して試みられている。他よりすぐれた候補の１つはＧＭ−ＣＳＦであると思われ、チミジンキナーゼ（Jonesら）と併用しておよびシトシンデアミナーゼ（Caoら）と併用して使用されている。一方または両方と併用して試みられる他の候補には、ＩＬ−２、Ｉｌ−６、Ｂ７−１（Felzmanら）、ＩＦＮ−γ（Santodonatoら）およびＭＣＰ−１（Sakaiら）が挙げられる。
【０００５】
しかし、一般に、結果はばらついており、信頼できる治療の改善に至っていない。癌の免疫治療を改善する明白な必要性が存在している。
【０００６】
細胞のストレスに応答して、遺伝子のサブセットが誘導されて、ストレス応答タンパク質が発現される。これらのタンパク質は多様な機能を有し、ＮＦκＢおよび高移動度群Ｂ１（ＨＭＧＢ１、Bustin、2002年）などの細胞内メッセンジャーおよび転写因子並びにＩＬ−１β、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５などのサイトカインを含む。しかし、最も重要なものには、ヒートショックタンパク質として知られるタンパク質グループが挙げられる。
【０００７】
ヒートショックタンパク質は、偏在的な細胞内タンパク質で、進化の過程中高度に保存されており、タンパク質の折り畳み、アンフォールディングおよび変性並びに多サブユニットタンパク質複合体の集合などの基本的な細胞過程に関与することが知られている。それらの発現は細胞ストレス（熱、毒素、飢餓、低酸素）によって厳しくアップレギュレーションされており、それらは細胞ストレス中に生じるタンパク質損傷を修復および改善する際に役割を果たす（ParsellおよびLindquist、1993年に総説が示されている）。ヒートショックタンパク質の発現は、ヒートショックタンパク質プロモーターのエレメントに結合している数多くの上流ファクターによって制御される。これらには、ＨＳＦ−１（ヒートショックファクター−１、Balerら、1993年）、ＨＳＦ−２（Mathewら、2001年）およびＨＳＦ−３（NakaiおよびMorimoto、1993年）並びにＩＲＦ−１および２を含むインターフェロン反応ファクター（Taniguchiら、2001年およびMamaneら、1999年）が挙げられる。
【０００８】
さらに最近、それらはまた、細胞内タンパク質由来のペプチドの処理および発現並びに抗原提示細胞へのこれらの送達に役割を果たすことが明らかになった。特に、ヒートショックタンパク質Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０およびカルレチクリン(calreticulin)は極めて大きな親和性で自己ペプチドに結合し、細胞の溶解によって細胞から放出されると、Ｈｓｐ受容体ＣＤ９１を発現している抗原提示細胞にそれらを送達する（Basuら、2001年）。細胞溶解前の細胞ストレスはヒートショックタンパク質のレベルを増加するので、この作用を増強する。細胞内抗原に対する免疫応答の刺激は、アポトーシス細胞死またはプログラムされた細胞死ではなく壊死性細胞死に関連することおよびこれは、少なくとも部分的には、抗原提示細胞レベルで制御されることが提唱されている（Matzinger、1994年)。抗腫瘍応答に具体的に適用すると、腫瘍細胞の非アポトーシス（すなわち、壊死性）細胞死は高レベルのＨｓｐ７０を誘導し、免疫原性の増加、炎症細胞内容物の放出、炎症誘発性Ｔｈ１型サイトカインの分泌増加およびマクロファージ活性化に関連することが示されている（Goughら、2001年）。一方、一般に細胞外環境に接触する前に細胞内高分子が分解され、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０およびカルレチクリンがあまり大量に放出されない（Basuら、2000年）アポトーシス細胞死は炎症および免疫応答を開始しない。壊死性細胞溶解液は、樹状細胞、免疫応答の開始時において未処理のＴ細胞を活性化するための主要な抗原提示細胞の成熟を生じるが、アポトーシス細胞溶解液は生じない（Galucciら、1999年；Sauterら、2000年。Ｈｓｐ７０そのものが樹状細胞の成熟因子であることが示されている（Kuppnerら、2001年；Gastparら、欧州特許出願EP1209226号）。また、アポトーシス細胞は、例えば、ホスファチジルセリン受容体により、抗−炎症および免疫抑制シグナルを抗原提示細胞に直接送達することができる（Fadokら、2000年）。
【発明の開示】
【０００９】
［発明の概要］
ニトロレダクターゼ／ＣＢ１９５４酵素／プロドラッグシステムの使用は、溶解した細胞から放出される活性型ＣＢ１９５４の毒性産物に接触した標的腫瘍細胞およびバイスタンダー細胞を死滅する以外に、同じ種類の腫瘍細胞による後の攻撃に対する大きな保護作用も生じたことを本発明者らは見出した。早期の研究はこのような死滅作用はアポトーシス機序によるものであると示唆しており（Djehaら、2000年）、アポトーシス細胞死は比較的弱い免疫応答しか生じないと考えられていたので、これは予想しなかった。抗腫瘍作用をさらに増強する目的で、その研究者らは、ニトロレダクターゼおよびＨｓｐ７０の両方を発現することができるポリヌクレオチドをコードするアデノウイルス遺伝子治療ベクターを構築した。根拠は、ベクターが標的として感染し、ＣＢ１９５４の投与によって死滅させられる腫瘍細胞は、腫瘍細胞の死滅によって誘発され、Ｈｓｐ７０の過剰発現によって増強される抗腫瘍免疫応答を開始する作用をするということである。これにより、Ｈｓｐ７０が結合した細胞内ペプチドが、ＣＤ９１を発現する抗原提示細胞に効率的に送達される。このように送達されるペプチドの一部は、腫瘍細胞内の体細胞突然変異によって生じる腫瘍特異的な「非自己」エピトープを含有するので、（主に）ＭＨＣクラスＩ分子に関連するこれらの提示により、ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞抗腫瘍応答が開始される。しかし、Ｈｓｐ送達されるペプチドの一部はＭＨＣクラスII提示経路に進入するので、ＣＤ４+ヘルパーＴ細胞応答が増加する。細胞応答の両方の能力は抗腫瘍免疫において重要である。
【００１０】
抗腫瘍免疫応答を形成する際のこの方法の成功性は、ＧＤＥＰＴ媒介性の死滅が少なくともある割合の細胞においては壊死性であるからであるかどうか、死滅の主要な機序はアポトーシス性であるが、かなりのレベルの二次的な壊死が生じるかどうか、またはアポトーシス細胞死の抗炎症性および非免疫原性はヒートショック因子の過剰発現によってある程度克服されうるかどうかは不明である。しかし、本発明者らは、マウス腫瘍モデルにおいて、原発性腫瘍を、ＮＴＲ遺伝子を送達するベクターと共に注射し、その後ＣＢ１９５４を全身投与すると、腫瘍を死滅させるだけでなく、同じ種類の腫瘍細胞のその後の負荷に対するある程度の保護作用を与えることを実証した。彼らはさらに、この保護作用は、便利なことに同じ遺伝子治療ベクターにおいて、Ｈｓｐ７０の発現を誘導する遺伝子を同時投与することによって大幅に増強されることを実証した。
【００１１】
本発明は、プロドラッグ変換酵素としてのニトロ還元酵素の使用に限定されず、プロドラッグ変換に依存する細胞死滅方法に限定されない。原則として、細胞を死滅させることができる分子をコードするポリヌクレオチドを含む、任意の細胞死滅方法を、内因的アジュバントとして作用し、抗腫瘍応答を促進する際にヒートショックタンパク質様の機能を有する任意の分子と併用使用することができる。コードされ、この方法に使用できると思われる毒素には、リシン、アブリン、ジフテリア毒素およびボツリヌス毒素がある。別の好適なプロドラッグ変換酵素には、チトクロームＰ４５０／アセトアミノフェン酵素／プロドラッグ組み合わせがある。このようなシステムが腫瘍細胞を死滅させる手段として有用であることは既知であり（国際特許出願国際公開公報第00/40272号）、アセトアミノフェンを毒性代謝物Ｎ−アセチルベンゾキノミニン（N-asetylbenzoquinoneimine）（ＮＡＢＱＩ）に活性化することによって生ずる細胞死滅はアポトーシス性であるといういくつかの証拠がある（Baeら、2001年；Boularesら、2002年）。にもかかわらず、治療レベルのアセトアミノフェンの存在下におけるチトクロームＰ４５０とｈｓｐ７０の同時発現は、チトクロームＰ４５０単独で得られるものよりかなり改善された抗腫瘍応答を与えるということを出願人らは見出した。
【００１２】
実際、ヒートショックタンパク質の発現を提供するベクターを送達する開示の方法は、種々の方法のいずれかによって死滅される腫瘍細胞（限定されない）などの細胞に対する免疫応答を増強するために使用することができることが明らかである。従って、化学療法または放射線療法と併用するアジュバント免疫療法としてのヒートショックタンパク質のＤＮＡ送達は有用である可能性がある。
【００１３】
使用することができる好適なアジュバント特性を有する分子には、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１１０、カルレチクリン、ｇｐ９６、ｇｒｐ１７０、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｃ７０、マイコバクテリウム(Mycobacterium)Ｈｓｐ６５、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)Ｈｓｐ６０、大腸菌(Escherichia coli)ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳがある。
【００１４】
さらに、壊死性細胞死を生ずるＧＤＥＰＴに基づいた方法の使用（ＮＴＲ／ＣＢ１９５４併用など）は、関連するＨｓｐ導入遺伝子によって提供されるＨｓｐ発現のアップレギュレーションの別の有用な影響がなくても、大きな免疫原性を示すことが本明細書に開示されているデータから明らかである。
【００１５】
ベクターは細胞にＤＮＡを導入することができる任意のベクターであってもよい。好ましくは、ベクターは組込みベクターまたはエピソームベクターである。
【００１６】
好ましい組込みベクターには、組換えレトロウイルスベクターが挙げられる。組換えレトロウイルスベクターは、その一部が標的細胞に感染することができるレトロウイルスゲノムの少なくとも一部のＤＮＡを含む。「感染」という用語は、ウイルスが遺伝物質を宿主または標的細胞に導入する過程を意味するために使用される。好ましくは、本発明のベクターを構築する際に使用するレトロウイルスも、標的細胞のウイルス複製性を除去するために複製欠損型にされる。このような場合には、複製欠損型ウイルスゲノムは従来の技法によりヘルパーウイルスによってパッケージングされうる。一般に、感染性および機能的遺伝子導入能力に関する上記の基準を満たす任意のレトロウイルスを本発明を実施する際に使用することができる。
【００１７】
好適なレトロウイルスベクターには、当業者に既知のｐＬＪ、ｐＺｉｐ、ｐＷｅおよびｐＥＭが挙げられるが、これらに限定されない。複製欠損型レトロウイルスに好適なパッケージングウイルス系統には、例えば、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２およびΨＡｍが挙げられる。特に好適なレトロウイルスベクターはレンチウイルスベクター、特にＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶである。
【００１８】
本発明に有用な他のベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０ウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＳＶおよびポックスウイルスベクターが挙げられる。好ましいベクターはアデノウイルスである。アデノウイルスベクターは当業者に既知であり、気道上皮、骨格筋、肝臓、脳および皮膚を含む数多くの細胞種（Hittら、1997年；Anderson、1998年）並びに腫瘍（Mountain、2000年）に遺伝子を送達するために使用されている。
【００１９】
さらに別の好ましいベクターはアデノ随伴（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶベクターは当業者に既知であり、遺伝子治療適用のためにヒトＴリンパ球、線維芽細胞、鼻ポリープ、骨格筋、脳、赤血球および造血幹細胞に安定して形質導入するために使用されている（Philipら、1994年；Russelら、Flotteら、1993年；Walshら、1994年；Millerら、1994年；Emerson、1996年）。国際特許出願国際公開公報第91/18088号は具体的なＡＡＶ系ベクターを記載している。
【００２０】
好ましいエピソームベクターには、ＥＢＶ、ヒトパポバウイルス（ＢＫ）およびＢＰＶ−１由来のものなどのウイルスの複製開始点由来の機能を有する一過的な非複製エピソームベクターおよび自己複製エピソームベクターが挙げられる。
【００２１】
このような組込みベクターおよびエピソームベクターは当業者に既知であり、当業者に既知の多数の文献に十分に記載されている。特に、好適なエピソームベクターは国際公開公報第98/07876号に記載されている。
【００２２】
哺乳類人工染色体も本発明においてベクターとして使用することができる。哺乳類人工染色体の使用はCalos(1996年)によって考察されている。
【００２３】
好ましい実施態様において、本発明のベクターはプラスミドである。プラスミドは非複製で、組込まれないプラスミドである。
【００２４】
本明細書において使用する「プラスミド」という用語は、発現可能な遺伝子をコードする任意の核酸をいい、鎖状または環状核酸および２本鎖または１本鎖核酸を含む。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、修飾ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含んでもよく、メチル化、または保護基またはキャップ−もしくはテール構造の導入などの手段によって化学的に修飾してもよい。
【００２５】
非複製で組込まれないプラスミドは、宿主細胞にトランスフェクトされたとき、複製せず、特に宿主細胞のゲノムに組込まない（すなわち、高い頻度で組込まず、特定の部位に組込まない）核酸である。
【００２６】
複製するプラスミドは、Ustavら(1991年)の標準的な複製アッセイを含む標準的なアッセイを使用して同定することができる。
【００２７】
本発明はまた、本発明のベクターをトランスフェクトした宿主細胞を提供する。宿主細胞は任意の哺乳類細胞であってもよい。好ましくは、宿主細胞は齧歯類または哺乳類細胞である。
【００２８】
核酸縮合剤の使用、エレクトロポレーション、アスベストとの複合体形成、ポリブレン、ＤＥＡＥセルロース、デキストラン、リポソーム、陽イオンリポソーム、リポポリアミン、ポリオルニチン、微粒子銃および直接マイクロインジェクション（KucherlapatiおよびSkoultchi(1984年)による総説；Keownら(1990年)を含む、数多くの技法が既知であり、本明細書に記載されているベクターを細胞に送達するために本発明により有用である。
【００２９】
本発明のベクターは、ウイルス性または非ウイルス性送達手段により非特異的または特異的に（すなわち、宿主細胞の指定したサブセットに）宿主細胞に送達することができる。ウイルス起源の好ましい送達方法には、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびパポバウイルスのものなどの、ウイルスのパッケージングシグナルが工作されている本発明のベクターのトランスフェクションレシピエントとしてのウイルス粒子産生パッケージング細胞系統が挙げられる。好ましい非ウイルス系遺伝子送達手段および方法も本発明に使用することができ、裸の核酸の直接注射、核酸縮合ペプチドおよび非ペプチド、陽イオンリポソーム並びにリポソームへの封入化が挙げられる。
【００３０】
組織へのベクターの直接送達が記載されており、いくつかの短期遺伝子発現が達成されている。筋肉（Wolffら、1990年）、甲状腺（Sikesら、1994年）、黒色腫（Vileら、1993年）、皮膚（Henggeら、(1995年)、肝臓（Hickmanら(1994年)へのベクターの直接送達および気道上皮の暴露(Meyerら、1995年)によるベクターの直接送達は従来技術に明白に記載されている。
【００３１】
ウイルスエンベロープタンパク質のアミノ酸配列由来の種々のペプチドが、ポリリジンＤＮＡ複合体と同時投与される場合に遺伝子導入に使用されており（Plankら、1994年；Trubetskoyら、1992年；国際公開公報第91/17773号；国際公開公報第92/19287号およびMackら、1994年）、ポリリジン複合体と陽イオン脂質の共縮合により遺伝子導入効率を改善することができることを示唆している。国際特許出願国際公開公報第95/02698号は、陽イオン脂質による遺伝子導入効率を増加する試みにウイルス成分を使用することを開示している。
【００３２】
本発明に有用な核酸縮合剤には、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびポリリジンなどの、スペルミン、スペルミン誘導体、ヒストン、陽イオンペプチド、陽イオン非ペプチドが挙げられる。「スペルミン誘導体」はスペルミンの類似物および誘導体をいい、国際特許出願国際公開公報第93/18759号（1993年9月30日公開）に記載されている化合物が挙げられる。
【００３３】
ジスルフィド結合は送達媒体のペプチド成分を結合するために使用されている（Cottenら、1992年）。Trubetskoyら（上記）も参照されたい。
【００３４】
ＤＮＡ構築物を細胞に送達するための送達媒体は当技術分野において既知であり、例えば、WuおよびWu(1988年)、Wilsonら(1992年)および米国特許第5,166,320号に記載されている細胞表面受容体に特異的であるＤＮＡ／ポリカチオン複合体が挙げられる。
【００３５】
本発明によるベクターの送達は、核酸縮合ペプチドを使用することが考慮されている。ベクターを縮合し、ベクターを細胞に送達するのに特に有用である核酸縮合ペプチドは国際特許出願国際公開公報第96/41606号に記載されている。国際公開公報第96/41606号に記載されているように、本発明によるベクターの送達に有用なペプチドに官能基を結合することができる。これらの官能基には、モノクローナル抗体、インスリン、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質または糖などの特定の細胞種を標的とするリガンドを挙げることができる。従って、リガンドは、非特異的または細胞種に関して制限される特異的に細胞を標的とすることができる。
【００３６】
官能基はまた、パルミトイル、オレイルもしくはステアロイルなどの脂質；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの中性親水性ポリマー；インフルエンザウイルスのＨＡペプチドなどの膜融合性ペプチド；またはリコンビナーゼもしくはインテグラーゼを含んでもよい。官能基はまた、核局在化配列（ＮＬＳ）などの細胞内輸送タンパク質、膜破壊ペプチドなどのエンドソームエスケープシグナルまたは細胞質に直接タンパク質を誘導するシグナルを含んでもよい。
【００３７】
従って、本発明は以下を提供する：毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチド配列とストレス応答タンパク質またはストレス応答タンパク質発現のインデューサーをコードするポリヌクレオチド配列を含む産物。このようなストレス応答タンパク質には、ＮＦκＢ、高移動度群Ｂ１タンパク質ＨＭＧＢ１、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５などのサイトカイン並びにＨｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１１０、カルレチクリン、ｇｐ９６、ｇｒｐ１７０、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｃ７０、マイコバクテリウムＨｓｐ６５、レジオネラ・ニューモフィラＨｓｐ６０、大腸菌ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳなどのヒートショックタンパク質が挙げられる。ストレスタンパク質発現のインデューサーにはＨＳＦ−１、ＨＳＦ−２、ＨＳＦ−３、ＩＲＦ−１およびＩＲＦ−２が挙げられる。
【００３８】
好ましい一実施態様において、毒素またはプロドラッグ変換酵素は細胞を壊死的に死滅することができることが好ましい。「壊死的」または「壊死性細胞死」という用語は、プログラムされていないまたはアポトーシス性ではない全ての形態の細胞死を含む。
【００３９】
第二の好ましい実施態様において、このような産物は免疫応答、さらに好ましくは抗腫瘍免疫応答を増強する際に使用する。
【００４０】
別の実施態様において、毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチド配列およびストレス応答タンパク質もしくはストレス応答タンパク質発現インデューサーをコードするポリヌクレオチド配列は、１つのポリヌクレオチド分子の両方の要素である。さらに別の実施態様において、このような配列は、同時投与または連続投与することができる別個のポリヌクレオチドに存在する。
【００４１】
好ましくは、毒素またはプロドラッグ変換酵素は、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼである。または、それは、好ましくは哺乳類起源、さらに好ましくはヒト起源のチトクロームＰ４５０酵素である。最も好ましくは、それはヒトＣＹＰ１Ａ２である。または、それはヒトＣＹＰ２Ｅ１またはＣＹＰ３Ａ４である。
【００４２】
別の好ましい実施態様において、コードされる酵素は齧歯類チトクロームＰ４５０であり、好ましくはマウス由来である。最も好ましくは、それはマウスＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｅ１またはＣＹＰ３Ａ４である。
【００４３】
好ましくは、ポリヌクレオチドにコードされるストレス応答タンパク質はヒートショックタンパク質である。さらに好ましくは、ヒートショックタンパク質は、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１１０、カルレチクリン、ｇｐ９６、ｇｒｐ１７０、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｃ７０、マイコバクテリウムＨｓｐ６５、レジオネラ・ニューモフィラＨｓｐ６０、大腸菌ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳからなるリストから選択され、最も好ましくは、それはＨｓｐ７０である。または、ポリヌクレオチドは、ヒートショックタンパク質の発現を誘導するストレスタンパク質発現インデューサーをコードする。好ましくは、それは、ヒートショック因子−１（ＨＳＦ−１）、ヒートショック因子−２（ＨＳＦ−２）、ヒートショック因子−１（ＨＳＦ−３）、インターフェロン応答因子−１（ＩＲＦ−１）またはインターフェロン応答因子−１（ＩＲＦ−２）を含むリストから選択される。
【００４４】
第二の態様において、本発明は、上記に記載する産物を含むＤＮＡワクチンを提供する。「ＤＮＡワクチン」は、免疫原性またはアジュバント特性を有するタンパク質またはペプチドをコードするまたは発現することができる１つ以上のポリヌクレオチドを含む治療的免疫応答を誘導または増強することが意図されている産物を意味する。
【００４５】
第三の態様において、ＤＮＡワクチンは、抗腫瘍免疫応答を増強するための毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチドを含む。好ましくは、毒素またはプロドラッグ変換酵素は、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼである。または、毒素またはプロドラッグ変換酵素はチトクロームＰ４５０である。好ましくは、チトクロームＰ４５０は、ヒトＣＹＰ１Ａ２、ヒトＣＹＰ２Ｅ１、ヒトＣＹＰ３Ａ４、齧歯類ＣＹＰ１Ａ２、齧歯類ＣＹＰ２Ｅ１および齧歯類ＣＹＰ３Ａ４からなるリストから選択される。
【００４６】
好ましくは、毒素またはプロドラッグ変換酵素は壊死性細胞死を誘導することができる。
【００４７】
第四の態様において、本発明は、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼをコードするポリヌクレオチドと、抗腫瘍免疫応答を増強する際に使用するための免疫賦活分子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。「免疫賦活性」という用語には、免疫抑制因子または作用の阻害剤として機能すると思われる（ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βなどの）因子が含まれる。
【００４８】
好ましくは、免疫賦活分子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、Ｂ７−２、ＴＮＦα、γ−ＩＦＮ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＧＦ−β、ＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンド）、ＣＤ１３４リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１３５リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導受容体（ＴＲＡＩＬ、Ａｐｏ−２リガンド）からなるリストから選択される。
【００４９】
本発明の特定の実施態様は、免疫応答を増強する際に使用するための、
ａ）毒素またはプロドラッグ変換酵素と
ｂ）ストレス応答タンパク質と
をコードするベクターである。
【００５０】
好ましくは、免疫応答は抗腫瘍免疫応答である。
【００５１】
ストレス応答タンパク質がヒートショックタンパク質であることも好ましい。さらに好ましくは、ヒートショックタンパク質は、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１１０、カルレチクリン、ｇｐ９６、ｇｒｐ１７０、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｃ７０、マイコバクテリウムＨｓｐ６５、レジオネラ・ニューモフィラＨｓｐ６０、大腸菌ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳからなるリストから選択される。最も好ましくは、それはＨｓｐ７０である。
【００５２】
好ましくは、毒素またはプロドラッグ変換酵素は、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼである。最も好ましくは、ベクターは、図１に示すＣＴＬ１０２／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０である。
【００５３】
または、それは、好ましくは哺乳類起源、さらに好ましくはヒト起源のチトクロームＰ４５０酵素である。最も好ましくは、ヒトＣＹＰ１Ａ２である。または、それはヒトＣＹＰ２Ｅ１またはＣＹＰ３Ａ４である。
【００５４】
別の好ましい実施態様において、コードされる酵素は齧歯類チトクロームＰ４５０であり、好ましくはマウス由来である。最も好ましくは、それはマウスＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｅ１またはＣＹＰ３Ａ４である。
【００５５】
上記のベクターのいずれかが、腫瘍選択的発現を提供する１つ以上のプロモーターに機能的に結合し、一方で毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチド配列および他方でストレス応答タンパク質またはストレス応答タンパク質発現インデューサーをコードするするポリヌクレオチドの一方または両方を有することがさらに好ましい。
【００５６】
本明細書において使用する「機能的に結合する」という用語は、プロモーターの制御下において遺伝子を発現させるｃｉｓ結合をいう。
【００５７】
好ましい腫瘍選択性プロモーターには、ＴＲＰ−１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、α−フェトプロテイン、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ビリン、膵臓アミラーゼ、チロシナーゼ関連ペプチド、腫瘍拒絶抗原前駆体およびＴ細胞因子（ＴＣＦ）応答プロモーターが挙げられる。好ましくは、プロモーターは１つ以上のＴＣＦ応答要素を含む。
【００５８】
ＴＣＦは、ＤＮＡ結合タンパク質の高移動度群（ＨＭＧ）の転写因子ファミリーである（Loveら、Nature,376,791-795,1995）。ファミリーには、van der Weteringら(EMBO J.10,123-132,1991)、欧州特許出願第0 939 122号およびKorinekら（Science,275,1784-1787,1997）に記載されているＴＣＦ−１、ＴＣＦ−３およびＴＣＦ−４が含まれる。ＴＣＦ−４は、Wnt/Winglessシグナル伝達系に関連する腫瘍形成に関与することが示されている。ＴＣＦおよびＬＥＦ−１（リンパ系増強因子−１）は、β−カテニンと相互作用することによってＷｎｔ信号に対する核応答を媒介すると考えられる。β−カテニンの安定性を増加するＷｎｔシグナル伝達系および他の細胞事象は、β−カテニンと関連したＬＥＦ−１およびＴＣＦタンパク質による遺伝子の転写活性化を生じると考えられる。Ｗｎｔシグナル伝達系が存在しない場合には、ＬＥＦ−１／ＴＣＦタンパク質はGrouchoおよびＣＢＰ（ＣＲＥＢ結合タンパク質）と関連する転写を抑制する。
【００５９】
Ｗｎｔシグナル伝達系が存在しない場合には、β−カテニンは２つの別個の多タンパク質複合体に見られる。細胞膜に位置する一方の複合体はカドヘリン（カルシウム依存的接着分子）とアクチン細胞骨格を結合するが、他方の複合体（タンパク質、腺腫性結腸ポリープタンパク質（ＡＰＣ）、アクシンおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を含有する）は分解のためにβ−カテニンを標的とする。Ｗｎｔシグナル伝達系はＡＰＣ−アクシンＧＳＫ３β複合体と拮抗して、遊離の細胞質内β−カテニンの貯蔵を増加する。遊離の細胞質内β−カテニンは核に転位して、ＬＥＦ−１／ＴＣＦ因子に結合し、Ｗｎｔ標的遺伝子を活性化する。Ｗｎｔおよび他の信号によるＬＥＦ−１／ＴＣＦ因子の調節はEastmanら（Current Opin.Cell Biology,11,233-240,1999）に考察されている。
【００６０】
ＴＣＦは、ヌクレオチド配列ＣＴＴＴＧＮＮ（式中、ＮはＡまたはＴを示す）を有するＴＣＦ結合要素を認識し、結合することが知られている（van der Weteringら、上記）。
【００６１】
ＴＣＦ応答要素は、特に結腸および肝臓腫瘍において機能的に結合した遺伝子の腫瘍選択性の高い発現を提供することが示されている（国際公開公報第01/64739号）。
【００６２】
好ましくは、ベクターはウイルスベクターであり、さらに好ましくはアデノウイルスベクターである。特に好ましい実施態様は、抗腫瘍免疫応答を増強する際に使用するための（ａ）プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼおよび（ｂ）ｈｓｐ７０をコードし、発現を可能にするアデノウイルスベクターである。最も好ましくは、それはＣＴＬ１０２／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０である。
【００６３】
または、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターであり、さらに好ましくはレンチウイルスベクターである。
【００６４】
さらに別の実施態様は、上記ベクターのいずれかを含む宿主細胞である。
【００６５】
本発明の別の態様は、上記の産物または組成物、ベクターまたは宿主細胞を含むワクチンである。
【００６６】
医薬品またはワクチンとして使用するための上記の産物または組成物、ベクターまたは宿主細胞も提供される。
【００６７】
本発明のさらに別の態様は、上記の産物、組成物、ＤＮＡワクチン、ベクターまたは宿主細胞のいずれかと、製薬学的に許容されうる希釈剤、緩衝剤、補助剤または賦形剤を含む製薬学的組成物である。
【００６８】
また、癌を治療するための医薬品を製造するためまたは癌を治療するためのワクチンを製造するための上記産物、組成物、ＤＮＡワクチン、ベクターまたは宿主細胞のいずれかの使用も提供する。
【００６９】
本発明は、毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチドとヒートショックタンパク質またはヒートショックタンパク質発現インデューサーをコードするポリヌクレオチドを含む治療量の産物を投与するステップを含む、免疫応答を増強する方法を提供する。好ましくは、免疫応答は抗腫瘍免疫応答である。
【００７０】
毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチドとヒートショックタンパク質またはヒートショックタンパク質発現インデューサーをコードするポリヌクレオチドを含む治療量の産物を投与するステップを含む、ある形態の癌に罹患している患者を治療する方法も提供される。
【００７１】
好ましい一実施態様において、本発明の方法は、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼをコードするポリヌクレオチドとヒートショックタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む治療量の産物を投与するステップと、産物が腫瘍細胞に進入し、コードされているニトロレダクターゼおよびヒートショックタンパク質が発現される時間をおくステップと、治療量のＣＢ１９５４を投与するステップとを含む。
【００７２】
または、本発明の方法は、チトクロームＰ４５０をコードするポリヌクレオチドおよびヒートショックタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む治療量の産物を投与するステップと、産物が腫瘍細胞に進入し、コードされているチトクロームＰ４５０およびヒートショックタンパク質が発現される時間をおくステップと、治療量のプロドラッグを投与するステップとを含む。好ましくは、プロドラッグはアセトアミノフェンである。
【００７３】
上記方法のいずれにおいても、ヒートショックタンパク質がＨｓｐ７０であることが好ましい。
【００７４】
本発明の別の態様において、治療的な抗腫瘍免疫応答が誘導されるように、ヒートショックタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む治療量の産物と治療量の抗癌細胞傷害薬を投与するステップを含む、ある形態の癌に罹患している患者を治療する方法が提供される。
【００７５】
好ましい実施態様において、抗癌細胞傷害薬は、腫瘍細胞に壊死性細胞死を誘導することができる。
【００７６】
本発明の最後の態様において、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含む治療量の産物を投与するステップと、組成物が腫瘍細胞に進入して、コードされているニトロレダクターゼが発現される時間をおくステップと、治療量のＣＢ１９５４を投与するステップとを含む抗腫瘍免疫応答を誘発する方法が提供される。
【００７７】
本発明の産物、ＤＮＡワクチン、ベクターもしくは宿主細胞または製薬学的組成物は、全身、筋肉内、皮下、皮内、静脈内、エアゾール、経口（固体または液体剤形）、局所、点眼、坐剤、腹腔内および／またはくも膜下腔内および局所的な直接注射を含む経路によって投与することができる。
【００７８】
当然のことながら、正確な用法用量は、個々の患者について個々の医師が決定する必要があり、治療用遺伝子が発現するタンパク質の性質および治療対象の組織の種類によって制御される。
【００７９】
用量はまた、適応症および投与経路に依存する。
【００８０】
本発明による効果的な治療のために送達される核酸構築物またはベクターの量は、好ましくは、約５０μｇ〜１０００μｇのベクターＤＮＡ／体重１ｋｇの範囲内であり、さらに好ましくは約１〜１００μｇベクターＤＮＡ／ｋｇの範囲内である。
【００８１】
インビボにおける細胞への取り込みのために核酸構築物、ベクターまたは宿主細胞を哺乳類に投与することが本発明により好ましいが、細胞を動物から取り出し、核酸構築物またはベクターを形質導入し、次いで動物に再植え込みする半ビボ方法を使用することができる。
【００８２】
［発明の詳細な説明］
本発明は以下の実施例を使用することによって詳細に説明される。これらは例示的にすぎず、限定するものと考えられるべきではない。
【実施例】
【００８３】
［実施例１］
〔材料と方法〕
（細胞培養）
４Ｔ１、マウス乳癌細胞はＡＴＣＣ（ＣＲＬ−２５３９）から入手した。ＥＪ−６−２−Ｂａｍ−６ａはＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１８８８）から入手し、ヒトＥＪ膀胱癌のＤＮＡをＮＩＨ／３Ｔ３にトランスフェクトすることによって作製した。ＰＥＲ．Ｃ６細胞（lit）はIntroGene（Leiden、オランダ）から入手した。９１１細胞はProf.L.Young(CRC Institute for Cancer Studies、University of Birmingham、英国)の親切な提供を受け、１０％ＦＣＳ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2および抗生物質を含有するＤＭＥＭで維持した。４Ｔ１およびＥＪ−６−２−Ｂａｍ−６ａは、供給元が推奨するように培養した。
【００８４】
（プラスミド構築）
ｐＴＸ０３７４は、大腸菌(E. coli)ｎｔｒ遺伝子（ＮＴＲ：ゲノムＤＮＡから増幅した大腸菌(E. coli)Ｂ／ｒニトロレダクターゼ遺伝子）に融合させたヒトＣＭＶプロモーターを含有する１．６ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＳＷ１０７にクローニングすることによって構築した。ｐＲＡＪ４３ＢＰ４は、マウスＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡを含有するｐＵＣ１９プラスミドであり、Prof.L.Young(CRC Institute for Cancer Studies、University of Birmingham、英国)の親切な提供を受けた。ＣＥＴ９０２は、マウスＣＭＶ １Ｅエンハンサー／プロモーターおよび後期ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルを含有するｐＵＣ１９プラスミドである。
【００８５】
ＣＥＴ９０２／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０は、ストレス誘導性マウスＨＳＰ７０タンパク質の発現カセットを含有し、記載するように構築した。先ず、完全長（１．４ｋｂ）のマウスＣＭＶプロモーターをｐＵＣ１９系ベクターにクローニングした。第二に、後期ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルをプロモーターの下流にクローニングした。最後に、マウスＨｓｐ７０をコードするｃＤＮＡを、ＳｍａＩ部位を使用して、プロモーターとポリ（Ａ）シグナルの間にクローニングした。マウスＨＳＰ７０のｃＤＮＡを含有するプラスミドは、Dr.R.Vile(Molecular Medicine Program、Mayo Clinic、200 First Street SW、Rochester、Minnesota、米国)の親切な提供を受け、ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして切断し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、平滑末端化した。
【００８６】
ＣＥＴ９０２／ｍＣＭＶ−ｍＧＭ−ＣＳＦは、ｐＲＡＪ ４３ ＢＰ４をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して、４６５ｂｐのフラグメントを放出することによって作製した。フラグメントを平滑末端化し、ＳｍａＩにライゲーションしてＣＥＴ９０２を作製した。
【００８７】
ｐＰＳ１１２８はDr.P.Searle、CRC Institue of Cancer Studies、University of Birminghamの親切な提供を受けた。ｐＰＳ１１２８は左側ＩＴＲからｎｔ３５９およびｎｔ３５２５から１０，５７９のアデノウイルス配列を含有し、従ってＥ１欠損ベクターである。ｐＰＳ１１２８は、ポリ（Ａ）付加シグナルおよびヒト補体Ｃ２遺伝子の転写停止シグナルを含有する２４０ｂｐのＨｉｎｃＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに結合したヒトβ−グロビン遺伝子の９１７ｂｐフラグメント（エクソン２のＢａｍＨＩ部位からエクソン３のＥｃｏＲＩ部位）をpBluescript（Stratagene）にクローニングすることによって構築した。このプラスミドは２段階で構築した。第１の段階において、ｐＰＳ９７１の左側ＥｃｏＲＩ部位（Weedonら、Int.J.Cancer、印刷中）をＳｗａＩ部位に変換してｐＰＳ１１５を作製した。第２の段階において、２つのオリゴヌクレオチド：
５’−ＣＴＡＧＴＡＴＣＧＡＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＧＣＧＴＧＧＣＣ−３’および
５’−ＴＴＡＡＧＧＣＣＡＣＧＣＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＣＧＡＴＡ−３’
をアニーリングすることによって、ｐＰＳ１１５の３５０ｂｐのＳｐｅ１−ＡｆｌＩＩフラグメントをリンカーと置換した。
【００８８】
ｐＰＳ１０２２は、右側ＥｃｏＲＩ部位をＳｗａＩ部位に変換することによってｐＰＳ９７２から構築した。
【００８９】
ｐＴＸ０３７５、ＣＴＬ１０２を作製するために使用する導入ベクターは、ｐＴＸ０３７４の全発現カセットにわたるＳｐｅＩフラグメント（ｈＣＭＶ−ＮＴＲ−ＩＶＳＩＩ−ｐ（Ａ））をＳｐｅＩ消化したｐＰＳ１１２８にクローニングすることによって構築し、左から右方向にカセットを含有するクローンを同定した。ｐＰＳ１１２８／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０およびｐＴＸ０３７５／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０は、それぞれ、ｐＴＸ０３７５の平滑末端化したｐＰＳ１１２８部位または平滑末端化したＰａｃＩ部位にＣＥＴ９０２／ｍＨＳＰ７０のｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０−ＳＶ４０ｐ（Ａ）発現カセットを導入することによって構築した。ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ−ＳＶ４０ｐ（Ａ）発現カセットは、ＣＥＴ９０２／ｍＨＳＰ７０プラスミドをＸｍｎＩ、ＡｓｃＩおよびＢｓｔＺ１７１で消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化することによって作製した。従って、最終的なカセットは約５００ｂｐのマウスＣＭＶプロモーターを含有し、このピースは活性の大半を提供する。ｐＰＳ１１８／ｍＣＭＶ−ｍＧＭ−ＣＳＦはＣＥＴ９０２／ｍＣＭＶ−ｍＧＭ−ＣＳＦから作製した完全な発現カセット（１．３ｋｂ）（ＢｓｔＺ１７１およびＡｓｃＩ消化し、平滑末端化）をｐＰＳ１１２８にクローニングすることによって構築した。
【００９０】
アデノウイルス「バックボーン」ベクターｐＰＳ１１６０は、ｐＰＳ１１２８をＰａｃＩ鎖状化し、ＸｂａＩ部位を含有するＰａｃＩ−適合性アダプター（オリゴ１：５’−ＴＡＣＡＴＣＴＡＧＡＴＡＡＴ−３’、オリゴ２：５’−ＴＴＡＴＣＴＡＧＡＴＧＴＡ−３’）をライゲーションし、次にＸｂａＩ消化して、Ａｄ５配列３５２４〜１０５８９を含有する約７ｋｂのＸｂａＩフラグメントを遊離することによって構築した。次いで、これをＸｂａＩ鎖状化したｐＰＳ１０２２(Dr.Peter Searle)、ｎｔ１０，５８９から右側ＩＴＲのＡｄ５配列を含有するが、ｎｔ２８，５９２から３０，４７０（Ｅ３領域）を欠損するｐＵＣ１８系プラスミドにクローニングした。
【００９１】
（アデノウイルスベクター構築）
組換えウイルスＣＴＬ１０２（Ａｄ．ｈＣＭＶ−ＮＴＲ）、ＣＴＬ１０２／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０、Ａｄ．ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０およびＡｄ．ｍＣＭＶ−ｍＧＭ−ＣＳＦは、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞における相同組換えによって構築した。これらの細胞に、ｐＴＸ０３７５、ｐＴＸ０３７５／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０、ｐＰＳ１１２８／ｍＣＭＶ−ＨＳＰ７０またはｐＰＳ１１２８／ｍＣＭＶ−ｍＧＭ−ＣＳＦおよびｐＰＳ１１６０の等モル混合物を同時形質移入し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を９０％集密化させた。組換えウイルスは、感染培地（ＤＭＥＭ、１％ＦＣＳ、２ｍＭのＭｇＣｌ2）中で凍結−融解を３サイクル実施することによって約７日後に回収した。感染／回収サイクルを反復することによって、ウイルスを大量に増殖させ、次いで標準的なＣｓＣｌ密度勾配遠心分離によって精製し、過剰量の保存緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．６ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、０．９ｍＭのＣａＣｌ2、０．５ｍＭのＭｇＣｌ2および５％スクロース）で透析し、最後に液体窒素中でスナップ凍結し、−８０℃において保存した。粒子濃度は、BCA Protein Assay Reagent(Perbio Science UK,LTD、Tattenhall、Cheshire、UK)を使用して測定した。プラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）力価は９１１細胞のプラークアッセイによって測定した。
【００９２】
（４Ｔ１のインビトロにおける感染）
４Ｔ１細胞は、感染培地（通常培地であるが、１％ＦＣＳを含有する）中で細胞あたり示したｐ．ｆ．ｕ．（ＭＯＩ）を、細胞密度１×１０7／ｍｌのときに加湿したＣＯ2インキュベーター中で約２．５時間感染させた。感染中、３０分ごとに細胞をゆっくり混合した。次いで、細胞をペレット化（３００×ｇ、５分）し、洗浄してからＰＢＳに再懸濁させた。ワクチン化実験では、使用したＭＯＩは２００〜３００であり、ウイルスの組み合わせを使用する場合には、ベクターの最終用量は、用量依存的な細胞変性作用を回避するために一定にした。
【００９３】
（ウェスタンブロット分析）
３×１０5のＨｅＬａ細胞に、５％ＣＯ2雰囲気下で３７℃において２時間インキュベーションすることによって感染培地中で示したＭＯＩを感染させた。次いで、細胞に完全培地（１０％ＦＣＳ）を供給し、２４時間培養した。次いで、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで６ウェルあたり２００μｌＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０％ＮＰ４０、０．１％ＳＤＳ、０．５％Ｎａ−デスオキシコラット（Desoxycholat）プラス完全プロテアーゼ阻害剤カクテル、Roche）を添加することによって全細胞溶菌液を調製した。細胞を室温において１０分間インキュベーションし、４℃において13,000RPMで遠心分離した。透明な溶菌液を別の試験管に移し、Biorad DC Protein Assayキット(Hercules、CA、米国)を使用してタンパク質濃度を測定した。High Rainbowタンパク質サイズマーカー(Amersham Pharmacia、Piscataway、NJ、米国)を使用して、３０μｇの各溶菌液試料を１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解した。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜(Gelma Sciences、Ann Arbor、MI、米国)に移した。ＴＢＳ（１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／５％粉乳中で室温において１時間膜をブロッキングした。以下のようにブロッキング緩衝液で一次抗体を希釈した：ヒツジ抗ＮＴＲ（ポリクローナル抗体、Dyfed、英国）：１：２０００、マウス抗ＨＳＰ７０（SPA-810、Stressgen Biotechnologies、Victoria BC、カナダ）１：１０００およびヤギ抗ＧＭ−ＣＳＦ（SantaCruz、ＣＡ、米国；ｓｃ−１３２２）：１：１０００。膜は室温において１時間一次抗体と共にインキュベーションし、次いで十分に洗浄し、次いで以下のようにＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％粉乳中で室温において３０分間二次抗体と共にインキュベーションした：ロバ抗ヤギＨＲＰ（1:7,500;Sigma）、抗マウスＨＲＰ（１：１０，０００；Sigma A-9917）および抗ヤギＨＲＰ（Sigma、A-5420）。十分に洗浄後、Pierce「SuperSignal West Pico Chemiluminescence基質」(Perbio Science UK Ltd.、Tattenhall、英国)を使用して高感度化学発光を実施し、Alpha Innotech Imager Model#2.3.1で分析した。
【００９４】
（マウス）
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２d、６〜８週齢）はHarlan（Oxion、米国）から入手し、温度制御し、明暗サイクルを行える部屋で、飼料と水は随時与えて管理した。マウスは１週間休息させてから任意の処理を実施した。注意および全ての実験手法は、UK Home Office規則に遵守して実施した。
【００９５】
（マウス腫瘍モデル）
４Ｔ１は、ＢＡＬＢ／ｃｆＣ3Ｈマウスにおいて自然に発生した乳腺癌から樹立された攻撃性が高く転移性の細胞系統である（Dexterら、1978年）。Ｈ−２dクラスＩを発現するが、クラスII分子を発現しない４Ｔ１細胞系統は、インビトロまたはインビボにおいて同質遺伝子的な抗腫瘍応答を刺激しない非免疫原性腫瘍モデルである。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける１００％腫瘍誘導最小量は５×１０2細胞である。４Ｔ１細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射すると、攻撃的な固形腫瘍を形成し、主に肺に自然転移することがあるが、原発腫瘍もその場で増殖を続ける。線維芽細胞系統である、ＥＪ−６−２−Ｂａｍ−６ａ（Shinら、1981年）を対照腫瘍として使用した。
【００９６】
（ワクチン化プロトコール）
示した数のアデノウイルス−形質導入した４Ｔ１細胞を、合計１００μｌの容量で各未処理のマウスの右横腹に皮下注射した（０日目）。異なる実験群に、ニトロレダクターゼおよび／または同時刺激遺伝子を含有するアデノウイルスの１つの組み合わせまたは異なる組み合わせを注射した。導入遺伝子の最大の発現が生じうることが実証されている２日目まで導入遺伝子の発現をインビボにおいて進行させてから、４００μＭのＣＢ１９５４溶液を総容量５００μｌで腫瘍周囲に注射した。特に記載しない限り、２１日目に全てのマウスに５．０×１０3親４Ｔ１細胞の２回目の対側注射により腫瘍を負荷した。この量は、未処理のマウスにおける最小致死量より１０倍多い。未処理のマウス群にも同じ経過時点にこれらの細胞を注射した。長期抗腫瘍免疫応答の誘導は、ワクチン後８０日目にマウスに腫瘍負荷することによって実証した。任意の１つの実験における全てのマウス群は、同じ細胞調製物を使用して同じ日に腫瘍負荷した。動物は触診によって腫瘍の出現を定期的に調査した；以降は、２〜３回／週ノギスを使用して腫瘍の直交方向の２つの寸法を測定した。腫瘍サイズは個々の腫瘍の２つの径の積として表した。マウスは、窮迫徴候を示し、腫瘍が過剰に壊死的になったときまたは腫瘍サイズが１６０ｍｍ2を越えたとき、人道的な理由により処分した。
【００９７】
〔結果〕
（４Ｔ１のＣＴＬ１０２／ＣＢ１９５４死滅は、４Ｔ１細胞負荷に対する大きな長期的防御を誘導することができる）
インサイチューにおけるＮＴＲ／ＣＢ１９５４腫瘍死滅が特異的な抗腫瘍免疫の形成に寄与する可能性を試験するために、ワクチン化実験を実施した。細胞接種の用量範囲（５．０×１０2〜５．０×１０6ＮＴＲ発現４Ｔ１細胞）および用量を１００から４００μＭの範囲で増加させたＣＢ１９５４によるその後のインビボ処理を試した最適死滅条件を確立するための最適化実験（データは示していない）において、腫瘍を保有しないマウスをワクチン化した。５．０×１０3または５．０×１０4ＮＴＲ発現４Ｔ１細胞でそれぞれワクチン化した２つの群の腫瘍細胞の最初の接種を拒絶したマウスに、細胞接種後２１日目に反対側の横腹に５．０×１０3の未改変の４Ｔ１細胞を負荷した。長期抗腫瘍免疫応答の誘導を評価するために、ワクチン化後８０日目にもマウスへの細胞負荷を実施した。全ての未処理のマウスは、１０日目までに進行的に増殖する腫瘍を発生し、負荷後２５日目までに強制的な犠牲に処した。細胞負荷を拒絶するワクチンの用量依存的な応答は、細胞負荷の時期に関係なく、ＮＴＲ／ＣＢ１９５４死滅細胞でワクチン化したマウスにおいて観察された（図４Ａ）。低用量の５．０×１０3細胞によるワクチン化は、未処理のマウスと比較して低いレベルの防御を与えるが、高ワクチン化用量（５．０×１０4）は４Ｔ１細胞の免疫原性をかなり増強し、マウスの大半を細胞負荷から防御した。
【００９８】
ＮＴＲ／ＣＢ１９５４死菌ワクチンで見られる防御の特異性を評価するために、５．０×１０3または５．０×１０4ＮＴＲ発現４Ｔ１細胞でワクチン化したマウスに、別の同系腫瘍、ＥＪ６、マウス線維肉腫を負荷した。４Ｔ１細胞による免疫化は、ＥＪ６細胞の負荷から全てのマウスを防御しなかった（図４Ｂ）。
【００９９】
（マウスＨＳＰ７０同時刺激分子の発現によるＮＴＲ／ＣＢ１９５４死滅の抗腫瘍免疫の増強）
ワクチン化モデルにおけるＮＴＲ／ＣＢ１９５４死滅の影響が同時刺激分子ＨＳＰ７０の発現によって改善されるかどうかを判定するために、ＮＴＲ遺伝子を保有するシングル組換えウイルスまたはＮＴＲとＨＳＰ７０遺伝子の両方を保有するダブル組換えウイルスを形質導入した４Ｔ１細胞からなる単回免疫化をマウスに実施した。動物にＣＢ１９５４を２日目に腫瘍周囲に注射し、次いで動物の反対側の横腹に５．０×１０3未改変４Ｔ１細胞を負荷した（免疫化プロトコールを参照されたい）。２つの異なるワクチン化用量、５．０×１０4の低用量および５．０×１０5の高用量を使用した。細胞接種後２１日目に全ての動物に５．０×１０3未改変４Ｔ１細胞を負荷し、腫瘍の出現、腫瘍の増殖および生存率について追跡調査した。結果は、ＨＳＰ７０を発現する細胞のＮＴＲ／ＣＢ１９５４死滅作用は、ＮＴＲ／ＣＢ１９５４死滅細胞単独でワクチン化したマウスより、免疫応答を刺激する際により強力であることを示唆している（図５Ａ）。ワクチン化細胞の数が多いことは、４Ｔ１細胞のその後の負荷からマウスを防御する際にすぐれていると思われる。結果として、ＮＴＲ−ＨＳＰ７０を発現する細胞でワクチン化した動物は有意な生存率を示した（図５Ｃ）。一方、ＮＴＲを発現する細胞を与えた動物は、中程度の生存という利点を示しただけで、１匹のマウスが腫瘍を形成しないで３ヶ月より長く生存する。ＨＳＰ７０を発現する細胞単独による免疫化およびＣＢ１９５４による処理は、接種部位における腫瘍の出現からどのマウスも防御せず、接種部位では進行的に増殖する腫瘍が形成され、約３０日で強制的な犠牲の対象となるサイズに達し、マウスは細胞接種後２１日目の免疫化時から間もなく犠牲にしなければならなかった。
【０１００】
（ｍＧＭ−ＣＳＦ同時刺激分子の発現によるＮＴＲ／ＣＢ１９５４死滅の抗腫瘍免疫の増強）
ＮＴＲ／ＣＢ１９５４死滅の免疫活性化特性に対するＧＭ−ＣＳＦ発現の影響を評価するために、４Ｔ１細胞にＮＴＲおよびＧＭ−ＣＳＦを保有するアデノウイルスベクターを同時形質導入し、マウスに注射し（５．０×１０5）、ＣＢ１９５４でインビボにおいて処理した（免疫化プロトコールを参照されたい）。ＧＭ−ＣＳＦ単独は細胞負荷の拒絶に大きな影響を示し、ＮＴＲ／ＣＢ１９５４死滅細胞によるワクチン化よりかなり優れていたが、ＮＴＲ／ＣＢ１９５４死滅時に腫瘍環境にＧＭ−ＣＳＦが存在すると、細胞負荷に対するかなり良好な防御を生じ、マウスの５７％が細胞負荷後３０日目に細胞負荷を拒絶した（図５Ａ）。免疫化しない未処理のマウスは全て、腫瘍負荷後１ヶ月も経過しないうちに腫瘍組織量のために犠牲にしなければならなかった。
【０１０１】
［引用文献］
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）Ｅ１組換えアデノウイルスの構造である。全てのウイルスは、示すようにウイルス領域Ｅ１およびＥ３が欠損している。Ｅ１欠損はＡｄ５ウイルスゲノムのｎｔ３５９〜３５２４を含み、Ｅ３欠損はＡｄ５ウイルスゲノムのｎｔ２８、５９２−３０、４７０を含む。ＨＣＭＶ：ヒトＣＭＶ（サイトメガロウィルス）ＩＥ（前初期）エンハンサー／プロモーター；ＮＴＲ：大腸菌ニトロレダクターゼ遺伝子；ＩＶＳＩＩ：ヒトβ−グロビンイントロンＩＩ配列；ｍＣＭＶ：マウスＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーター；ｍＨＳＰ７０：マウスヒートショックタンパク質７０；ＳＶ４０：後期ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル；ｍＧＭ−ＣＳＦ：マウス顆粒球単球−コロニー刺激因子。
【図２】ＮＴＲ、ｍＨＳＰ７０およびｍＧＭ−ＣＳＦタンパク質発現を分析する、アデノウイルスベクター感染細胞の細胞溶解液のウェスタンブロット分析である。（Ａ）ＣＭＴ９３細胞（内因性ＨＳＰ７０を発現しない）に、ＭＯＩを増加させて、Ａｄ．ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０（レーン３〜５）またはＣＴＬ１０２／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０（レーン８〜１０）を感染させた。ＣＴＬ１０２感染細胞の抽出液をＮＴＲ発現の陽性対照として使用した。Ａｄ．ＣＭＶ−ＬａｃＺ感染細胞の抽出液（レーン２）を陰性対照として使用した。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞にＡｄ．ｍＣＭＶ−ｍＧＭ−ＣＳＦ（レーン２）またはＡｄ．ＣＭＶ−ＬａｃＺ（レーン１；陰性対照）を感染させた。全細胞抽出液を感染の２４時間後に調製した。５０μｇタンパク質溶菌液を使用して、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、材料と方法に記載するようにダウンストリームプロセッシングを実施した。発現されたタンパク質の予想サイズを確認するためにBiorad分子量標準を使用した。
【図３】ワクチン化スキームである。
【図４】５．０×１０3の１回ワクチン化による５．０×１０3親４Ｔ１細胞および５．０×１０4Ａｄ．ｈＣＭＶ−ＮＴＲ−形質導入（ＣＴＬ１０２）４Ｔ１細胞による腫瘍負荷とインビボにおけるＣＢ１９５４処理によるマウスの防御である。ワクチン化の２１日後（白ぬきのバー）または８０日後（黒塗りのバー）にマウスに腫瘍負荷した。Ｂ ５．０×１０3または５．０×１０4ＣＴＬ１０２−形質導入４Ｔ１細胞の単回投与によるワクチン化とインビボにおけるＣＢ１９５４処理の２１日目には、５．０×１０4ＥＪ６細胞、関係のない腫瘍細胞系統の腫瘍負荷に対する防御は見られない。バーは、強制的に犠牲にした時点における未処理のマウスの対照群の平均腫瘍サイズと比較した、処理マウスにおける腫瘍負荷の個々の腫瘍サイズの割合を示す。
【図５】Ａ（ａ）５．０×１０4Ａｄ．ｈＣＭＶ−ＮＴＲ−形質導入（ＣＴＬ１０２）した４Ｔ１細胞でワクチン化し、ＣＢ１９５４で処理したＢＡＬＢ／ｃマウス、（ｂ）５．０×１０4Ａｄ．ｈＣＭＶ−ＮＴＲ／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０−形質導入した４Ｔ１細胞でワクチンし、ＣＢ１９５４で処理したＢＡＬＢ／ｃマウス、（ｃ）５．０×１０5ＣＴＬ１０２−形質導入した４Ｔ１細胞でワクチンし、ＣＢ１９５４で処理したＢＡＬＢ／ｃマウスおよび（ｄ）５．０×１０5Ａｄ．ｈＣＭＶ−ＮＴＲ／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ−形質導入した４Ｔ１細胞でワクチン化し、ＣＢ１９５４で処理したＢＡＬＢ／ｃマウスそれぞれにおける腫瘍負荷後３０日経過時における負荷した腫瘍の腫瘍サイズである。ワクチン化後２１日目に、全てのマウスおよび未処理のマウス群（ｅ）に５．０×１０3親４Ｔ１細胞を負荷した。Ｂ グラフは処理群の平均腫瘍サイズを示す。Ｃ ５．０×１０5ＣＴＬ１０２−形質導入した４Ｔ１細胞でワクチンし、ＣＢ１９５４で処理したマウス、５．０×１０5Ａｄ．ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０−形質導入した４Ｔ１細胞でワクチンし、ＣＢ１９５４で処理したマウスおよび５．０×１０5Ａｄ．ｈＣＭＶ−ＮＴＲ／ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ−形質導入した４Ｔ１細胞でワクチン化し、ＣＢ１９５４で処理したマウスの生存率を示す。ワクチン化後２１日目に、全てのマウスおよび未処理のマウス群に５．０×１０3親４Ｔ１細胞を負荷した。
【図６】Ａ （ａ）５．０×１０4Ａｄ．ｈＣＭＶ−ＮＴＲ−形質導入（ＣＴＬ１０２）した４Ｔ１細胞でワクチン化し、ＣＢ１９５４で処理したＢＡＬＢ／ｃマウス、（ｂ）５．０×１０5ＣＴＬ１０２＋Ａｄ．ｍＣＭＶ−ｍＨＳＰ７０−形質導入した４Ｔ１細胞でワクチンし、ＣＢ１９５４で処理したＢＡＬＢ／ｃマウス、（ｃ）５．０×１０5Ａｄ．ｍＣＭＶ−ｍＧＭ−ＣＳＦ−形質導入した４Ｔ１細胞でワクチンし、ＣＢ１９５４で処理したＢＡＬＢ／ｃマウスおよび（ｄ）５．０×１０5ＣＴＬ１０２＋Ａｄ．ｍＣＭＶ−ｍＧＭ−ＣＳＦ−形質導入した４Ｔ１細胞でワクチンし、ＣＢ１９５４で処理したＢＡＬＢ／ｃマウスそれぞれにおける腫瘍負荷後３０日経過時の負荷した腫瘍の腫瘍サイズである。ワクチン化後２１日目に、全てのマウスおよび未処理のマウス群（ｅ）に５．０×１０3親４Ｔ１細胞を負荷した。Ｂ グラフは処理群の平均腫瘍サイズを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチド配列と、ストレス応答タンパク質またはストレス応答タンパク質発現インデューサーをコードするポリヌクレオチド配列とを含む産物。
【請求項２】
免疫応答を増強する際に使用するための、請求項１に記載の産物。
【請求項３】
増強される免疫応答が抗腫瘍応答である請求項１または２に記載の産物。
【請求項４】
壊死性細胞死を誘導することができる毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチド配列、およびストレス応答タンパク質またはストレス応答タンパク質発現インデューサーをコードするポリヌクレオチド配列が、１つのポリヌクレオチド分子の要素である請求項１〜３のいずれかに記載の産物。
【請求項５】
毒素またはプロドラッグ変換酵素が、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼである請求項１〜４のいずれかに記載の産物。
【請求項６】
毒素またはプロドラッグ変換酵素がチトクロームＰ４５０である請求項１〜４のいずれかに記載の産物。
【請求項７】
チトクロームＰ４５０が、ヒトＣＹＰ１Ａ２、ヒトＣＹＰ２Ｅ１、ヒトＣＹＰ３Ａ４、齧歯類ＣＹＰ１Ａ２、齧歯類ＣＹＰ２Ｅ１および齧歯類ＣＹＰ３Ａ４からなるリストから選択される請求項５に記載の産物。
【請求項８】
コードされるまたは誘導されるストレス応答タンパク質が、ヒートショックタンパク質である請求項１〜７のいずれかに記載の産物。
【請求項９】
ヒートショックタンパク質が、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１１０、カルレチクリン、ｇｐ９６、ｇｒｐ１７０、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｃ７０、マイコバクテリウムＨｓｐ６５、レジオネラ・ニューモフィラＨｓｐ６０、大腸菌ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳからなるリストから選択される請求項８に記載の産物。
【請求項１０】
ヒートショックタンパク質がＨｓｐ７０である請求項９に記載の産物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の産物を含むＤＮＡワクチン。
【請求項１２】
抗腫瘍免疫応答を増強するための、毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡワクチン。
【請求項１３】
毒素またはプロドラッグ変換酵素が、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼである請求項１２に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１４】
毒素またはプロドラッグ変換酵素がチトクロームＰ４５０である請求項１３に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１５】
チトクロームＰ４５０が、ヒトＣＹＰ１Ａ２、ヒトＣＹＰ２Ｅ１、ヒトＣＹＰ３Ａ４、齧歯類ＣＹＰ１Ａ２、齧歯類ＣＹＰ２Ｅ１および齧歯類ＣＹＰ３Ａ４からなるリストから選択される請求項１４に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１６】
抗腫瘍免疫応答を増強する際に使用するための、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼをコードするポリヌクレオチドと、免疫賦活分子をコードするポリヌクレオチドとを含む産物。
【請求項１７】
抗腫瘍免疫応答を増強する際に使用するための、チトクロームＰ４５０をコードするポリヌクレオチドと、免疫賦活分子をコードするポリヌクレオチドとを含む産物。
【請求項１８】
免疫賦活分子が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、Ｂ７−２、ＴＮＦα、γ−ＩＦＮ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＧＦ−β、ＣＤ１５４、ＣＤ１３４リガンド、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１３５リガンドおよびＴＲＡＩＬからなるリストから選択される請求項１６または１７に記載の産物。
【請求項１９】
免疫応答を増強する際に使用するための、
ａ）毒素またはプロドラッグ変換酵素と
ｂ）ストレス応答タンパク質と
をコードし、これらの発現を可能にするベクター。
【請求項２０】
免疫応答が抗腫瘍応答である請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
ストレス応答タンパク質がヒートショックタンパク質である請求項１９または２０に記載のベクター。
【請求項２２】
ヒートショックタンパク質が、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１１０、カルレチクリン、ｇｐ９６、ｇｒｐ１７０、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｃ７０、マイコバクテリウムＨｓｐ６５、レジオネラ・ニューモフィラＨｓｐ６０、大腸菌ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳからなるリストから選択される請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
ヒートショックタンパク質がｈｓｐ７０である請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
毒素またはプロドラッグ変換酵素が、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼである請求項１９〜２３のいずれかに記載のベクター。
【請求項２５】
毒素またはプロドラッグ変換酵素がチトクロームＰ４５０である請求項１９〜２３のいずれかに記載のベクター。
【請求項２６】
チトクロームＰ４５０が、ヒトＣＹＰ１Ａ２、ヒトＣＹＰ２Ｅ１、ヒトＣＹＰ３Ａ４、齧歯類ＣＹＰ１Ａ２、齧歯類ＣＹＰ２Ｅ１および齧歯類ＣＹＰ３Ａ４からなるリストから選択される請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
一方で毒素またはプロドラッグ変換酵素を、他方でストレス応答タンパク質またはストレスタンパク質のインデューサーをコードするポリヌクレオチドの一方または両方が、腫瘍選択性発現を提供する１つ以上のプロモーターに機能的に結合している請求項１９〜２６のいずれかに記載のベクター。
【請求項２８】
プロモーターが、１つ以上のＴＣＦ応答要素を含む請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
ベクターがウイルスベクターである請求項１９〜２９のいずれかに記載のベクター。
【請求項３０】
ベクターがアデノウイルスベクターである請求項２９に記載のベクター。
【請求項３１】
ベクターがレトロウイルスベクターである請求項２９に記載のベクター。
【請求項３２】
ベクターがレンチウイルスベクターである請求項３１に記載のベクター。
【請求項３３】
抗腫瘍免疫応答を増強する際に使用するための、
ａ）プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼと
ｂ）ｈｓｐ７０と
をコードし、これらの発現を可能にするアデノウイルスベクター。
【請求項３４】
請求項１９〜３３のいずれかに記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３５】
請求項１〜１０もしくは１６〜１８のいずれかに記載の産物、請求項１９〜３３のいずれかに記載のベクターまたは請求項３４に記載の宿主細胞を含むワクチン。
【請求項３６】
医薬品として使用するための、請求項１〜１０もしくは１６〜１８のいずれかに記載の産物、請求項１０〜１５のいずれかに記載のＤＮＡワクチン、請求項１９〜３３のいずれかに記載のベクターまたは請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
ワクチンとして使用するための、請求項１〜１０もしくは１６〜１８のいずれかに記載の産物、請求項１９〜３３のいずれかに記載のベクターまたは請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
請求項１〜１０もしくは１６〜１８のいずれかに記載の組成物、請求項１０〜１５のいずれかに記載のＤＮＡワクチン、請求項１９〜３３のいずれかに記載のベクターまたは請求項３４に記載の宿主細胞と、製薬学的に許容可能な希釈剤、緩衝剤、アジュバントまたは賦形剤とを含む製薬学的組成物。
【請求項３９】
癌を治療するための医薬品を製造するための、請求項１〜１０もしくは１６〜１８のいずれかに記載の産物、請求項１０〜１５のいずれかに記載のＤＮＡワクチン、請求項１９〜３３のいずれかに記載のベクターまたは請求項３４に記載の宿主細胞の使用。
【請求項４０】
癌を治療するためのワクチンを製造するための、請求項１〜１０もしくは１６〜１８のいずれかに記載の産物、請求項１０〜１５のいずれかに記載のＤＮＡワクチン、請求項１９〜３３のいずれかに記載のベクターまたは請求項２３に記載の宿主細胞の使用。
【請求項４１】
毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチドとヒートショックタンパク質またはヒートショックタンパク質発現インデューサーをコードするポリヌクレオチドとを含む治療量の産物を投与するステップを含む、免疫応答を増強する方法。
【請求項４２】
免疫応答が抗腫瘍免疫応答である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチドとヒートショックタンパク質またはヒートショックタンパク質発現インデューサーをコードするポリヌクレオチドとを含む治療量の産物を投与するステップを含む、ある形態の癌に罹患している患者を治療する方法。
【請求項４４】
ａ）プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼをコードするポリヌクレオチドとヒートショックタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む治療量の産物を投与するステップと、
ｂ）産物が腫瘍細胞に進入し、コードされているニトロレダクターゼおよびヒートショックタンパク質が発現される時間をおくステップと、
ｃ）治療量のＣＢ１９５４を投与するステップと
を含む、請求項４１〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
ａ）チトクロームＰ４５０をコードするポリヌクレオチドとヒートショックタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む治療量の産物を投与するステップと、
ｂ）産物が腫瘍細胞に進入し、コードされているチトクロームＰ４５０およびヒートショックタンパク質が発現される時間をおくステップと、
ｃ）治療量のプロドラッグを投与するステップと
を含む、請求項４０〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
プロドラッグがアセトアミノフェンである請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
ヒートショックタンパク質がＨｓｐ７０である請求項４０〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
治療的な抗腫瘍免疫応答が誘導されるように、ヒートショックタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む治療量の産物と治療量の抗癌細胞傷害薬とを投与するステップを含む、ある形態の癌に罹患している患者を治療する方法。
【請求項４９】
ａ）プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含む治療量の産物を投与するステップと、
ｂ）組成物が腫瘍細胞に進入して、コードされているニトロレダクターゼが発現される時間をおくステップと、
ｃ）治療量のＣＢ１９５４を投与するステップと
を含む抗腫瘍免疫応答を誘発する方法。
【請求項１】
毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチド配列と、ストレス応答タンパク質またはストレス応答タンパク質発現インデューサーをコードするポリヌクレオチド配列とを含む産物。
【請求項２】
免疫応答を増強する際に使用するための、請求項１に記載の産物。
【請求項３】
増強される免疫応答が抗腫瘍応答である請求項１または２に記載の産物。
【請求項４】
壊死性細胞死を誘導することができる毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチド配列、およびストレス応答タンパク質またはストレス応答タンパク質発現インデューサーをコードするポリヌクレオチド配列が、１つのポリヌクレオチド分子の要素である請求項１〜３のいずれかに記載の産物。
【請求項５】
毒素またはプロドラッグ変換酵素が、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼである請求項１〜４のいずれかに記載の産物。
【請求項６】
毒素またはプロドラッグ変換酵素がチトクロームＰ４５０である請求項１〜４のいずれかに記載の産物。
【請求項７】
チトクロームＰ４５０が、ヒトＣＹＰ１Ａ２、ヒトＣＹＰ２Ｅ１、ヒトＣＹＰ３Ａ４、齧歯類ＣＹＰ１Ａ２、齧歯類ＣＹＰ２Ｅ１および齧歯類ＣＹＰ３Ａ４からなるリストから選択される請求項５に記載の産物。
【請求項８】
コードされるまたは誘導されるストレス応答タンパク質が、ヒートショックタンパク質である請求項１〜７のいずれかに記載の産物。
【請求項９】
ヒートショックタンパク質が、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１１０、カルレチクリン、ｇｐ９６、ｇｒｐ１７０、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｃ７０、マイコバクテリウムＨｓｐ６５、レジオネラ・ニューモフィラＨｓｐ６０、大腸菌ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳからなるリストから選択される請求項８に記載の産物。
【請求項１０】
ヒートショックタンパク質がＨｓｐ７０である請求項９に記載の産物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の産物を含むＤＮＡワクチン。
【請求項１２】
抗腫瘍免疫応答を増強するための、毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡワクチン。
【請求項１３】
毒素またはプロドラッグ変換酵素が、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼである請求項１２に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１４】
毒素またはプロドラッグ変換酵素がチトクロームＰ４５０である請求項１３に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１５】
チトクロームＰ４５０が、ヒトＣＹＰ１Ａ２、ヒトＣＹＰ２Ｅ１、ヒトＣＹＰ３Ａ４、齧歯類ＣＹＰ１Ａ２、齧歯類ＣＹＰ２Ｅ１および齧歯類ＣＹＰ３Ａ４からなるリストから選択される請求項１４に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１６】
抗腫瘍免疫応答を増強する際に使用するための、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼをコードするポリヌクレオチドと、免疫賦活分子をコードするポリヌクレオチドとを含む産物。
【請求項１７】
抗腫瘍免疫応答を増強する際に使用するための、チトクロームＰ４５０をコードするポリヌクレオチドと、免疫賦活分子をコードするポリヌクレオチドとを含む産物。
【請求項１８】
免疫賦活分子が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、Ｂ７−２、ＴＮＦα、γ−ＩＦＮ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＧＦ−β、ＣＤ１５４、ＣＤ１３４リガンド、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１３５リガンドおよびＴＲＡＩＬからなるリストから選択される請求項１６または１７に記載の産物。
【請求項１９】
免疫応答を増強する際に使用するための、
ａ）毒素またはプロドラッグ変換酵素と
ｂ）ストレス応答タンパク質と
をコードし、これらの発現を可能にするベクター。
【請求項２０】
免疫応答が抗腫瘍応答である請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
ストレス応答タンパク質がヒートショックタンパク質である請求項１９または２０に記載のベクター。
【請求項２２】
ヒートショックタンパク質が、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１１０、カルレチクリン、ｇｐ９６、ｇｒｐ１７０、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｃ７０、マイコバクテリウムＨｓｐ６５、レジオネラ・ニューモフィラＨｓｐ６０、大腸菌ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳからなるリストから選択される請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
ヒートショックタンパク質がｈｓｐ７０である請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
毒素またはプロドラッグ変換酵素が、プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼである請求項１９〜２３のいずれかに記載のベクター。
【請求項２５】
毒素またはプロドラッグ変換酵素がチトクロームＰ４５０である請求項１９〜２３のいずれかに記載のベクター。
【請求項２６】
チトクロームＰ４５０が、ヒトＣＹＰ１Ａ２、ヒトＣＹＰ２Ｅ１、ヒトＣＹＰ３Ａ４、齧歯類ＣＹＰ１Ａ２、齧歯類ＣＹＰ２Ｅ１および齧歯類ＣＹＰ３Ａ４からなるリストから選択される請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
一方で毒素またはプロドラッグ変換酵素を、他方でストレス応答タンパク質またはストレスタンパク質のインデューサーをコードするポリヌクレオチドの一方または両方が、腫瘍選択性発現を提供する１つ以上のプロモーターに機能的に結合している請求項１９〜２６のいずれかに記載のベクター。
【請求項２８】
プロモーターが、１つ以上のＴＣＦ応答要素を含む請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
ベクターがウイルスベクターである請求項１９〜２９のいずれかに記載のベクター。
【請求項３０】
ベクターがアデノウイルスベクターである請求項２９に記載のベクター。
【請求項３１】
ベクターがレトロウイルスベクターである請求項２９に記載のベクター。
【請求項３２】
ベクターがレンチウイルスベクターである請求項３１に記載のベクター。
【請求項３３】
抗腫瘍免疫応答を増強する際に使用するための、
ａ）プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼと
ｂ）ｈｓｐ７０と
をコードし、これらの発現を可能にするアデノウイルスベクター。
【請求項３４】
請求項１９〜３３のいずれかに記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３５】
請求項１〜１０もしくは１６〜１８のいずれかに記載の産物、請求項１９〜３３のいずれかに記載のベクターまたは請求項３４に記載の宿主細胞を含むワクチン。
【請求項３６】
医薬品として使用するための、請求項１〜１０もしくは１６〜１８のいずれかに記載の産物、請求項１０〜１５のいずれかに記載のＤＮＡワクチン、請求項１９〜３３のいずれかに記載のベクターまたは請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
ワクチンとして使用するための、請求項１〜１０もしくは１６〜１８のいずれかに記載の産物、請求項１９〜３３のいずれかに記載のベクターまたは請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
請求項１〜１０もしくは１６〜１８のいずれかに記載の組成物、請求項１０〜１５のいずれかに記載のＤＮＡワクチン、請求項１９〜３３のいずれかに記載のベクターまたは請求項３４に記載の宿主細胞と、製薬学的に許容可能な希釈剤、緩衝剤、アジュバントまたは賦形剤とを含む製薬学的組成物。
【請求項３９】
癌を治療するための医薬品を製造するための、請求項１〜１０もしくは１６〜１８のいずれかに記載の産物、請求項１０〜１５のいずれかに記載のＤＮＡワクチン、請求項１９〜３３のいずれかに記載のベクターまたは請求項３４に記載の宿主細胞の使用。
【請求項４０】
癌を治療するためのワクチンを製造するための、請求項１〜１０もしくは１６〜１８のいずれかに記載の産物、請求項１０〜１５のいずれかに記載のＤＮＡワクチン、請求項１９〜３３のいずれかに記載のベクターまたは請求項２３に記載の宿主細胞の使用。
【請求項４１】
毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチドとヒートショックタンパク質またはヒートショックタンパク質発現インデューサーをコードするポリヌクレオチドとを含む治療量の産物を投与するステップを含む、免疫応答を増強する方法。
【請求項４２】
免疫応答が抗腫瘍免疫応答である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
毒素またはプロドラッグ変換酵素をコードするポリヌクレオチドとヒートショックタンパク質またはヒートショックタンパク質発現インデューサーをコードするポリヌクレオチドとを含む治療量の産物を投与するステップを含む、ある形態の癌に罹患している患者を治療する方法。
【請求項４４】
ａ）プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼをコードするポリヌクレオチドとヒートショックタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む治療量の産物を投与するステップと、
ｂ）産物が腫瘍細胞に進入し、コードされているニトロレダクターゼおよびヒートショックタンパク質が発現される時間をおくステップと、
ｃ）治療量のＣＢ１９５４を投与するステップと
を含む、請求項４１〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
ａ）チトクロームＰ４５０をコードするポリヌクレオチドとヒートショックタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む治療量の産物を投与するステップと、
ｂ）産物が腫瘍細胞に進入し、コードされているチトクロームＰ４５０およびヒートショックタンパク質が発現される時間をおくステップと、
ｃ）治療量のプロドラッグを投与するステップと
を含む、請求項４０〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
プロドラッグがアセトアミノフェンである請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
ヒートショックタンパク質がＨｓｐ７０である請求項４０〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
治療的な抗腫瘍免疫応答が誘導されるように、ヒートショックタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む治療量の産物と治療量の抗癌細胞傷害薬とを投与するステップを含む、ある形態の癌に罹患している患者を治療する方法。
【請求項４９】
ａ）プロドラッグＣＢ１９５４を活性化することができるニトロレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含む治療量の産物を投与するステップと、
ｂ）組成物が腫瘍細胞に進入して、コードされているニトロレダクターゼが発現される時間をおくステップと、
ｃ）治療量のＣＢ１９５４を投与するステップと
を含む抗腫瘍免疫応答を誘発する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ−Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ−Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【公表番号】特表２００６−５０２７２６（Ｐ２００６−５０２７２６Ａ）
【公表日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４４４３６（Ｐ２００４−５４４４３６）
【出願日】平成１５年１０月１０日（２００３．１０．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００４３８８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３５７６９
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【出願人】（５０２０２３２５１）エムエル・ラボラトリーズ・パブリック・リミテッド・カンパニー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月１０日（２００３．１０．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００４３８８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３５７６９
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【出願人】（５０２０２３２５１）エムエル・ラボラトリーズ・パブリック・リミテッド・カンパニー (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]