改変されたＮ−グリカンを下等真核生物において産生するためのコンビナトリアルＤＮＡライブラリー
【課題】哺乳動物（例えば、ヒト）の治療用糖タンパク質の生成のための、グリコシル化に関与する任意の所望の遺伝子を発現および標的化するために使用され得る、操作された真核生物宿主細胞を提供する。
【解決手段】グリコシルトランスフェラーゼ、糖トランスポーターおよびマンノシダーゼのセットの異種発現によって改変されたオリゴ糖を有する非ヒト真核生物宿主細胞において、ヒト様糖タンパク質を産生する方法、および真核生物宿主における細胞内区画のグリコシル化に関与する哺乳動物酵素活性を標的化し発現するために使用され得る、核酸分子およびコンビナトリアルライブラリー。
【解決手段】グリコシルトランスフェラーゼ、糖トランスポーターおよびマンノシダーゼのセットの異種発現によって改変されたオリゴ糖を有する非ヒト真核生物宿主細胞において、ヒト様糖タンパク質を産生する方法、および真核生物宿主における細胞内区画のグリコシル化に関与する哺乳動物酵素活性を標的化し発現するために使用され得る、核酸分子およびコンビナトリアルライブラリー。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖タンパク質上のＮ−グリカンに対する１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を示さ
ない非ヒト真核生物宿主細胞において、ヒト様糖タンパク質を産生する方法であって、該
方法は、該宿主細胞に、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２炭水化物構造の産生のための１種以上の
酵素を導入する工程を包含し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、少なくとも３０モル％の収率
で、該宿主細胞中で産生される、方法。
【請求項２】
前記宿主細胞中で産生されるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のうちの少なくとも１０％が、イン
ビボでのＧｎＴＩのための産生基質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素の少なくとも１種が、前記炭水化物構造が産生される前記宿主細胞中の位置のｐ
Ｈにおいて、最適な活性を有するように選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素の少なくとも１種が、該酵素が局在する細胞小器官中の他の代表的な酵素に最適
な平均ｐＨの約１．４ｐＨ単位内の最適ｐＨを有するように選択される、請求項２に記載
の方法。
【請求項５】
前記酵素の少なくとも１種が、該酵素が最適な活性を有する前記宿主細胞下の非細胞内位
置に標的化される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素が、該酵素に通常は会合しない細胞標的化シグナルペプチドを含有するキメラタ
ンパク質によって標的化される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１種の誘導される酵素が、前記宿主細胞の小胞体、初期ゴルジネットワー
ク、中期ゴルジネットワーク、後期ゴルジネットワーク、またはトランスゴルジネットワ
ークに標的化される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素の少なくとも１種が、マンノシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、および
グリコシダーゼからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素が、ゴルジ装置または小胞体内に優先的に局在するマンノシダーゼである、請求
項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記糖タンパク質が、Ｎ−グリカンを含み、該Ｎ−グリカンの３０モル％より多くが、６
個以下のマンノース残基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記糖タンパク質が、Ｎ−グリカンを含み、該Ｎ−グリカンの３０モル％より多くが、３
個以下のマンノース残基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記糖タンパク質が、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、シアル酸、およびフコースからなる
群より選択される１種以上の糖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記糖タンパク質が、構造ＮｅｕＮＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎを含む少なくと
も１つのオリゴ糖分枝を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記宿主が、植物、藻類、昆虫、真菌、酵母細胞からなる群より選択される、請求項１に
記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主が、下等真核生物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ
、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃ
ｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃ
ｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃ
ｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔ
ｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓ
ｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖ
ｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒ
ｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａ
ｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃ
ｒａｓｓａよりなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主が、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼ
からなる群より選択される１種以上の酵素の活性を欠損している、請求項１に記載の方法
。
【請求項１８】
前記宿主が、１，６マンノシルトランスフェラーゼ；１，３マンノシルトランスフェラー
ゼ；および１，２マンノシルトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素を発現し
ない、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記宿主が、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのｏｃｈ１変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主が、ＧｎＴＩトランスポーター活性およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポータ
ー活性を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記宿主が、ＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性またはＧＤＰ特異的ジホスファターゼ活
性を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記宿主から前記糖タンパク質を単離する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法
。
【請求項２３】
前記単離された糖タンパク質を、前記宿主からの単離に引き続いて、インビトロでの少な
くとも１つのさらなるグリコシル化反応に供する工程をさらに包含する、請求項２２に記
載の方法。
【請求項２４】
前記宿主細胞にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２炭水化物構造の産生のための１種以上の酵素を導
入する工程が、核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記宿主細胞に、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からのＭａｎ５
ＧｌｃＮＡｃ２の産生に関与する１種以上のマンノシダーゼ活性をコードする核酸分子を
導入する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記コードされるマンノシダーゼ活性の少なくとも１つが、該マンノシダーゼ活性が局在
する細胞小器官における他の代表的な酵素の最適な平均ｐＨの約１．４ｐＨ単位以内の最
適ｐＨを有するか、または約５．１と約８．０との間のｐＨで最適な活性を有する、請求
項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記マンノシダーゼが、約５．５と約７．５との間のｐＨで最適な活性を有する、請求項
２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記マンノシダーゼ活性が、マウス、ヒト、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄ
．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ、またはＸ．ｌａｅｖｉｓ由来のα
−１，２−マンノシダーゼである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１種の酵素が、該酵素の触媒ドメインと、細胞標的化シグナルペプチドと
を含む融合タンパク質を形成することによって局在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記融合タンパク質が、酵素活性を有する触媒ドメインをコードするＤＮＡフラグメント
を有する細胞標的化シグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメントのインフレームラ
イゲーションによって形成された少なくとも１種の遺伝子構築物によってコードされる、
請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記コードされた標的化シグナルペプチドが、ＥＲまたはゴルジの膜結合タンパク質、修
正シグナル、ＩＩ型膜タンパク質、Ｉ型膜タンパク質、膜貫通ヌクレオチド糖トランスポ
ーター、マンノシダーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、グルコシダーゼ、マンノシルト
ランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼからなる群より選択される
メンバー由来である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記触媒ドメインが、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、Ｇ
ｎＴＶＩ、ＧａｌＴ、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼか
らなる群より選択されるメンバー由来のグリコシダーゼ活性、マンノシダーゼ活性、また
はグリコシルトランスフェラーゼ活性をコードし、そして該触媒ドメインが、前記酵素が
局在する細胞小器官中の他の代表的な酵素の最適な平均ｐＨの１．４ｐＨ単位以内で最適
なｐＨを有するか、または５．１と８．０との間のｐＨで最適な活性を有する、請求項２
４に記載の方法。
【請求項３３】
前記触媒ドメインが、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＡ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマン
ノシダーゼＩＢ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＡ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎ
ｓマンノシダーゼＩＢ、Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍマンノシダーゼＩ、マウスマンノシダーゼ
ＩＡ、マウスマンノシダーゼＩＢ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＡ、Ａ．ｎｉ
ｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＣ、マウスマ
ンノシダーゼＩＩ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノ
シダーゼＩＩ、およびマンノシダーゼＩＩＩからなる群より選択されるマンノシダーゼを
コードする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸分子が、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼ、ＧＤＰ−フコシルトランスフェラーゼ、ＣＭＰ−シアリルトランスフェ
ラーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポータ
ー、ＧＤＰ−フコーストランスポーター、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター、およびヌ
クレオチドジホスファターゼからなる群より選択される１種以上の酵素をコードする、請
求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記宿主が、ＧｎＴＩトランスポーター活性およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポータ
ー活性を発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記宿主が、ＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性またはＧＤＰ特異的ジホスファターゼ活
性を発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも２つの異なる遺伝子構築物を含む核酸ライブラリーであって、少なくとも１つ
の遺伝子構築物が、グリコシル化酵素と通常は会合しない細胞標的化シグナルペプチドを
コードする核酸フラグメントとインフレームでライゲーションされたグリコシル化酵素を
コードする核酸フラグメントを含む、核酸ライブラリー。
【請求項３８】
融合構築物のＤＮＡライブラリーであって：
（ａ）細胞標的化シグナルペプチドをコードする少なくとも２つのヌクレオチド配列、
ならびにマンノシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼからなる
群より選択される触媒ドメイン領域をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列；ま
たは
（ｂ）細胞標的化シグナルペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、
ならびにマンノシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼからなる
群より選択される触媒ドメイン領域をコードする少なくとも２つのヌクレオチド配列、
を含み、
触媒ドメイン領域をコードする少なくとも１つの核酸配列が、細胞標的化シグナルペプ
チドをコードするヌクレオチド配列にインフレームでライゲーションされている、ＤＮＡ
ライブラリー。
【請求項３９】
グリコシル化酵素をコードする天然に存在する配列を含む、少なくとも１つの核酸を含む
、請求項３７に記載のＤＮＡライブラリー。
【請求項４０】
遺伝子シャッフリング、インビトロ変異誘発、および誤りやすいポリメラーゼ連鎖反応の
列挙から選択される技術に先に供された少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項３７に
記載のＤＮＡライブラリー。
【請求項４１】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、マンノシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃト
ランスフェラーゼ、ホスホ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフ
ェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼからなる群よ
り選択される、請求項３７に記載のＤＮＡライブラリー。
【請求項４２】
触媒ドメイン領域をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列が、マウス、ヒト、Ｃ
．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｘ．ｌａｅ
ｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、またはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ由来である、請求項３
７に記載のＤＮＡライブラリー。
【請求項４３】
前記マンノシダーゼ触媒ドメインが、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＡ、Ｃ．ｅｌ
ｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＡ、Ｈ
．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍマンノシダーゼＩ、マウス
マンノシダーゼＩＡ、マウスマンノシダーゼＩＢ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼ
ＩＡ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼ
ＩＣ、マウスマンノシダーゼＩＩ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ、Ｈ．ｓａｐ
ｉｅｎｓマンノシダーゼＩＩ、およびマンノシダーゼＩＩＩからなる群より選択される、
請求項３７に記載のＤＮＡライブラリー。
【請求項４４】
細胞標的化シグナルペプチドをコードする前記核酸フラグメントが、ＥＲまたはゴルジの
膜結合タンパク質、修正シグナル、ＩＩ型膜タンパク質、Ｉ型膜タンパク質、膜貫通ヌク
レオチド糖トランスポーター、マンノシダーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、グルコシ
ダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼから
なる群より選択される、請求項３７に記載のＤＮＡライブラリー。
【請求項４５】
細胞標的化ペプチドをコードする前記核酸フラグメントが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ＧＬＳ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｓ
ＥＣ１２、Ｐｉｃｈｉａ ＳＥＣ、Ｐｉｃｈｉａ ＯＣＨ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ＭＮＮ９、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ＡＮＰ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＨＯＣ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮ
Ｎ１０、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮ
Ｔ１、Ｐｉｃｈｉａ Ｄ２、Ｐｉｃｈｉａ Ｄ９、Ｐｉｃｈｉａ Ｊ３、Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ＫＴＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＫＴＲ２、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓ ＧｎＴＩ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ２、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ＭＮＮ５、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＹＵＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ＭＮＮ１、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ６からなる群より選択される、
請求項３７に記載のＤＮＡライブラリー。
【請求項４６】
発現制御配列に作動可能に連結された、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載のＤＮＡ
ライブラリー由来の融合構築物を含むベクターであって、該細胞標的化シグナルペプチド
が、ＥＲ、ゴルジまたはトランスゴルジネットワークに標的化される、ベクター。
【請求項４７】
宿主細胞中にて発現される際に、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のインビボでの産生に関与する
マンノシダーゼ活性をコードする、請求項４６に記載のベクター。
【請求項４８】
宿主細胞中にて発現される際に、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のインビボでの産
生に関与するグリコシルトランスフェラーゼ活性をコードする、請求項４６に記載のベク
ター。
【請求項４９】
請求項４６に記載のベクターを少なくとも１つ含む、真核生物宿主細胞。
【請求項５０】
単細胞真菌および多細胞真菌からなる群より選択される、請求項４９に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ
ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍ
ｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅ
ｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅ
ｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈ
ｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐ
ｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉ
ｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙ
ｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃ
ｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａより
なる群から選択される、請求項４９に記載の宿主細胞。
【請求項５２】
ヒト様糖タンパク質を非ヒト細胞中で産生するための方法であって、少なくとも１つの請
求項４６に記載のベクターを含む真核生物宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項５３】
前記宿主が、単細胞真菌細胞または多細胞真菌細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記宿主細胞が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃ
ａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐ
ｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎ
ｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙ
ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏ
ｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒ
ａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ
ｃｒａｓｓａよりなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
ヒト様糖タンパク質を非ヒト宿主細胞において産生するための方法であって、該宿主細胞
を、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載のＤＮＡライブラリーで形質転換して、遺伝
的に混合された細胞集団を産生する工程を包含し、該細胞集団が、該ライブラリー由来の
少なくとも１種のグリコシル化酵素を発現する、方法。
【請求項５６】
前記混合された細胞集団から、所望のヒト様グリコシル化表現型を産生する細胞を選択す
る工程をさらに包含する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記選択が、グリコシル化タンパク質または単離されたＮ−グリカンを、（ａ）質量分析
；（ｂ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ；（ｃ）液体クロマトグラフィー；（ｄ）蛍光活性化細胞選
別器、分光光度計、蛍光分析計、またはシンチレーションカウンターを使用して細胞を特
徴付けること；（ｅ）宿主細胞を、レクチンまたは所望のオリゴ糖部分に対する特異的親
和性を有する抗体に曝露すること；ならびに（ｆ）細胞を、糖、抗体およびレクチンから
なる群より選択される細胞傷害性分子または放射活性分子に曝露することからなる群より
選択される１つ以上の方法によって分析する工程を包含する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記触媒ドメインをコードするＤＮＡフラグメントが、マンノシダーゼ活性、ＵＤＰ−Ｇ
ｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性、お
よびＣＭＰ−シアリルトランスフェラーゼ活性からなる群より選択される活性を有し、そ
して前記細胞標的化シグナルペプチドが、小胞体、シスゴルジ、ゴルジ中間嚢、およびト
ランスゴルジからなる群より選択される宿主細胞の細胞小器官内に、酵素を優先的に局在
させる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記宿主細胞が、目的の標的糖タンパク質をさらに含み、該糖タンパク質上で、Ｍａｎ５
ＧｌｃＮＡｃ２がインビボで産生される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記インビボで産生されるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が、前記標的糖タンパク質上で優勢な
Ｎ−グリカンである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記宿主細胞が、目的の標的糖タンパク質をさらに含み、該糖タンパク質上で、ＧｌｃＮ
ＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２がインビボで産生される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
前記インビボで産生されるＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が、前記標的糖タンパク
質上で優勢なＮ−グリカンである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
請求項１、２４または５５のいずれかの方法によって産生された、宿主細胞。
【請求項６４】
請求項１、２４または５５のいずれかの方法によって産生された、ヒト様糖タンパク質。
【請求項６５】
真核生物細胞のグリコシル化パターンを変化させるための方法であって、該宿主細胞を、
請求項３７〜４５のいずれか１項に記載のＤＮＡライブラリーで形質転換して、該ライブ
ラリー由来の少なくとも１つのグリコシル化酵素を発現する、遺伝的に混合された細胞集
団を産生する工程を包含する、方法。
【請求項６６】
単離された核酸分子であって：（ａ）配列番号４１の少なくとも４５個の連続するヌクレ
オチド残基；（ｂ）（ａ）のホモログ、改変体および誘導体；ならびに（ｃ）ストリンジ
ェントな条件下で（ａ）にハイブリダイズする核酸配列からなる群より選択されるが、Ｓ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＣＨ１遺伝子をコードする配列を除く、核酸配列を含むか、
または該核酸配列からなる、単離された核酸分子。
【請求項６７】
配列番号４２のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項６８】
宿主細胞中での発現の際にＯＣＨ１活性をコードする、請求項６６に記載の単離された核
酸分子。
【請求項６９】
Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＯＣＨ１遺伝子をコードする、請求項６６に記載の単離された核酸分
子。
【請求項７０】
単離された核酸分子であって：（ａ）配列番号４３の少なくとも４５個の連続するヌクレ
オチド残基；（ｂ）（ａ）のホモログ、改変体および誘導体；ならびに（ｃ）ストリンジ
ェントな条件下で（ａ）にハイブリダイズする核酸配列からなる群より選択されるが、Ｓ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ１遺伝子をコードする配列を除く、核酸配列を含むか、
または該核酸配列からなる、単離された核酸分子。
【請求項７１】
配列番号４４のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項７２】
ＭＮＮ１遺伝子をコードする、請求項７０に記載の単離された核酸分子。
【請求項７３】
前記配列が、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ１遺伝子をコードする、請求項７０に記載の単離
された核酸分子。
【請求項７４】
配列番号４１の欠失または変異を含む宿主細胞であって、該宿主細胞は、該欠失も変異も
有さない宿主細胞と比較して、配列番号４１の低下した発現レベルを有することによって
特徴付けられる、宿主細胞。
【請求項７５】
配列番号４３の欠失または変異を含む宿主細胞であって、該宿主細胞は、該欠失も変異も
有さない宿主細胞と比較して、配列番号４３の低下した発現レベルを有することによって
特徴付けられる、宿主細胞。
【請求項７６】
植物グリコシル化を改変する方法であって、宿主中に、細胞標的化シグナルペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列にインフレームでライゲーションされた触媒ドメイン領域をコ
ードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を導入する工程を包含する、方法。
【請求項１】
糖タンパク質上のＮ−グリカンに対する１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を示さ
ない非ヒト真核生物宿主細胞において、ヒト様糖タンパク質を産生する方法であって、該
方法は、該宿主細胞に、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２炭水化物構造の産生のための１種以上の
酵素を導入する工程を包含し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、少なくとも３０モル％の収率
で、該宿主細胞中で産生される、方法。
【請求項２】
前記宿主細胞中で産生されるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のうちの少なくとも１０％が、イン
ビボでのＧｎＴＩのための産生基質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素の少なくとも１種が、前記炭水化物構造が産生される前記宿主細胞中の位置のｐ
Ｈにおいて、最適な活性を有するように選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素の少なくとも１種が、該酵素が局在する細胞小器官中の他の代表的な酵素に最適
な平均ｐＨの約１．４ｐＨ単位内の最適ｐＨを有するように選択される、請求項２に記載
の方法。
【請求項５】
前記酵素の少なくとも１種が、該酵素が最適な活性を有する前記宿主細胞下の非細胞内位
置に標的化される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素が、該酵素に通常は会合しない細胞標的化シグナルペプチドを含有するキメラタ
ンパク質によって標的化される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１種の誘導される酵素が、前記宿主細胞の小胞体、初期ゴルジネットワー
ク、中期ゴルジネットワーク、後期ゴルジネットワーク、またはトランスゴルジネットワ
ークに標的化される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素の少なくとも１種が、マンノシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、および
グリコシダーゼからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素が、ゴルジ装置または小胞体内に優先的に局在するマンノシダーゼである、請求
項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記糖タンパク質が、Ｎ−グリカンを含み、該Ｎ−グリカンの３０モル％より多くが、６
個以下のマンノース残基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記糖タンパク質が、Ｎ−グリカンを含み、該Ｎ−グリカンの３０モル％より多くが、３
個以下のマンノース残基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記糖タンパク質が、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、シアル酸、およびフコースからなる
群より選択される１種以上の糖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記糖タンパク質が、構造ＮｅｕＮＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎを含む少なくと
も１つのオリゴ糖分枝を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記宿主が、植物、藻類、昆虫、真菌、酵母細胞からなる群より選択される、請求項１に
記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主が、下等真核生物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ
、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃ
ｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃ
ｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃ
ｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔ
ｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓ
ｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖ
ｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒ
ｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａ
ｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃ
ｒａｓｓａよりなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主が、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼ
からなる群より選択される１種以上の酵素の活性を欠損している、請求項１に記載の方法
。
【請求項１８】
前記宿主が、１，６マンノシルトランスフェラーゼ；１，３マンノシルトランスフェラー
ゼ；および１，２マンノシルトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素を発現し
ない、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記宿主が、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのｏｃｈ１変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主が、ＧｎＴＩトランスポーター活性およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポータ
ー活性を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記宿主が、ＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性またはＧＤＰ特異的ジホスファターゼ活
性を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記宿主から前記糖タンパク質を単離する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法
。
【請求項２３】
前記単離された糖タンパク質を、前記宿主からの単離に引き続いて、インビトロでの少な
くとも１つのさらなるグリコシル化反応に供する工程をさらに包含する、請求項２２に記
載の方法。
【請求項２４】
前記宿主細胞にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２炭水化物構造の産生のための１種以上の酵素を導
入する工程が、核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記宿主細胞に、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からのＭａｎ５
ＧｌｃＮＡｃ２の産生に関与する１種以上のマンノシダーゼ活性をコードする核酸分子を
導入する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記コードされるマンノシダーゼ活性の少なくとも１つが、該マンノシダーゼ活性が局在
する細胞小器官における他の代表的な酵素の最適な平均ｐＨの約１．４ｐＨ単位以内の最
適ｐＨを有するか、または約５．１と約８．０との間のｐＨで最適な活性を有する、請求
項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記マンノシダーゼが、約５．５と約７．５との間のｐＨで最適な活性を有する、請求項
２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記マンノシダーゼ活性が、マウス、ヒト、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄ
．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ、またはＸ．ｌａｅｖｉｓ由来のα
−１，２−マンノシダーゼである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１種の酵素が、該酵素の触媒ドメインと、細胞標的化シグナルペプチドと
を含む融合タンパク質を形成することによって局在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記融合タンパク質が、酵素活性を有する触媒ドメインをコードするＤＮＡフラグメント
を有する細胞標的化シグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメントのインフレームラ
イゲーションによって形成された少なくとも１種の遺伝子構築物によってコードされる、
請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記コードされた標的化シグナルペプチドが、ＥＲまたはゴルジの膜結合タンパク質、修
正シグナル、ＩＩ型膜タンパク質、Ｉ型膜タンパク質、膜貫通ヌクレオチド糖トランスポ
ーター、マンノシダーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、グルコシダーゼ、マンノシルト
ランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼからなる群より選択される
メンバー由来である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記触媒ドメインが、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、Ｇ
ｎＴＶＩ、ＧａｌＴ、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼか
らなる群より選択されるメンバー由来のグリコシダーゼ活性、マンノシダーゼ活性、また
はグリコシルトランスフェラーゼ活性をコードし、そして該触媒ドメインが、前記酵素が
局在する細胞小器官中の他の代表的な酵素の最適な平均ｐＨの１．４ｐＨ単位以内で最適
なｐＨを有するか、または５．１と８．０との間のｐＨで最適な活性を有する、請求項２
４に記載の方法。
【請求項３３】
前記触媒ドメインが、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＡ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマン
ノシダーゼＩＢ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＡ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎ
ｓマンノシダーゼＩＢ、Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍマンノシダーゼＩ、マウスマンノシダーゼ
ＩＡ、マウスマンノシダーゼＩＢ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＡ、Ａ．ｎｉ
ｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＣ、マウスマ
ンノシダーゼＩＩ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓマンノ
シダーゼＩＩ、およびマンノシダーゼＩＩＩからなる群より選択されるマンノシダーゼを
コードする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸分子が、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼ、ＧＤＰ−フコシルトランスフェラーゼ、ＣＭＰ−シアリルトランスフェ
ラーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポータ
ー、ＧＤＰ−フコーストランスポーター、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター、およびヌ
クレオチドジホスファターゼからなる群より選択される１種以上の酵素をコードする、請
求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記宿主が、ＧｎＴＩトランスポーター活性およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポータ
ー活性を発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記宿主が、ＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性またはＧＤＰ特異的ジホスファターゼ活
性を発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも２つの異なる遺伝子構築物を含む核酸ライブラリーであって、少なくとも１つ
の遺伝子構築物が、グリコシル化酵素と通常は会合しない細胞標的化シグナルペプチドを
コードする核酸フラグメントとインフレームでライゲーションされたグリコシル化酵素を
コードする核酸フラグメントを含む、核酸ライブラリー。
【請求項３８】
融合構築物のＤＮＡライブラリーであって：
（ａ）細胞標的化シグナルペプチドをコードする少なくとも２つのヌクレオチド配列、
ならびにマンノシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼからなる
群より選択される触媒ドメイン領域をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列；ま
たは
（ｂ）細胞標的化シグナルペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、
ならびにマンノシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼからなる
群より選択される触媒ドメイン領域をコードする少なくとも２つのヌクレオチド配列、
を含み、
触媒ドメイン領域をコードする少なくとも１つの核酸配列が、細胞標的化シグナルペプ
チドをコードするヌクレオチド配列にインフレームでライゲーションされている、ＤＮＡ
ライブラリー。
【請求項３９】
グリコシル化酵素をコードする天然に存在する配列を含む、少なくとも１つの核酸を含む
、請求項３７に記載のＤＮＡライブラリー。
【請求項４０】
遺伝子シャッフリング、インビトロ変異誘発、および誤りやすいポリメラーゼ連鎖反応の
列挙から選択される技術に先に供された少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項３７に
記載のＤＮＡライブラリー。
【請求項４１】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、マンノシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃト
ランスフェラーゼ、ホスホ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフ
ェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼからなる群よ
り選択される、請求項３７に記載のＤＮＡライブラリー。
【請求項４２】
触媒ドメイン領域をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列が、マウス、ヒト、Ｃ
．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｘ．ｌａｅ
ｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、またはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ由来である、請求項３
７に記載のＤＮＡライブラリー。
【請求項４３】
前記マンノシダーゼ触媒ドメインが、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＡ、Ｃ．ｅｌ
ｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒマンノシダーゼＩＡ、Ｈ
．ｓａｐｉｅｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍマンノシダーゼＩ、マウス
マンノシダーゼＩＡ、マウスマンノシダーゼＩＢ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼ
ＩＡ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼＩＢ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓマンノシダーゼ
ＩＣ、マウスマンノシダーゼＩＩ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓマンノシダーゼＩＩ、Ｈ．ｓａｐ
ｉｅｎｓマンノシダーゼＩＩ、およびマンノシダーゼＩＩＩからなる群より選択される、
請求項３７に記載のＤＮＡライブラリー。
【請求項４４】
細胞標的化シグナルペプチドをコードする前記核酸フラグメントが、ＥＲまたはゴルジの
膜結合タンパク質、修正シグナル、ＩＩ型膜タンパク質、Ｉ型膜タンパク質、膜貫通ヌク
レオチド糖トランスポーター、マンノシダーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、グルコシ
ダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼおよびホスホマンノシルトランスフェラーゼから
なる群より選択される、請求項３７に記載のＤＮＡライブラリー。
【請求項４５】
細胞標的化ペプチドをコードする前記核酸フラグメントが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ＧＬＳ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＳ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｓ
ＥＣ１２、Ｐｉｃｈｉａ ＳＥＣ、Ｐｉｃｈｉａ ＯＣＨ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ＭＮＮ９、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＶＡＮ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ＡＮＰ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＨＯＣ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮ
Ｎ１０、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ１１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮ
Ｔ１、Ｐｉｃｈｉａ Ｄ２、Ｐｉｃｈｉａ Ｄ９、Ｐｉｃｈｉａ Ｊ３、Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ＫＴＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＫＴＲ２、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓ ＧｎＴＩ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ２、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ＭＮＮ５、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＹＵＲ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ＭＮＮ１、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＭＮＮ６からなる群より選択される、
請求項３７に記載のＤＮＡライブラリー。
【請求項４６】
発現制御配列に作動可能に連結された、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載のＤＮＡ
ライブラリー由来の融合構築物を含むベクターであって、該細胞標的化シグナルペプチド
が、ＥＲ、ゴルジまたはトランスゴルジネットワークに標的化される、ベクター。
【請求項４７】
宿主細胞中にて発現される際に、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のインビボでの産生に関与する
マンノシダーゼ活性をコードする、請求項４６に記載のベクター。
【請求項４８】
宿主細胞中にて発現される際に、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のインビボでの産
生に関与するグリコシルトランスフェラーゼ活性をコードする、請求項４６に記載のベク
ター。
【請求項４９】
請求項４６に記載のベクターを少なくとも１つ含む、真核生物宿主細胞。
【請求項５０】
単細胞真菌および多細胞真菌からなる群より選択される、請求項４９に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ
ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍ
ｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅ
ｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅ
ｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈ
ｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐ
ｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉ
ｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙ
ｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃ
ｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａより
なる群から選択される、請求項４９に記載の宿主細胞。
【請求項５２】
ヒト様糖タンパク質を非ヒト細胞中で産生するための方法であって、少なくとも１つの請
求項４６に記載のベクターを含む真核生物宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項５３】
前記宿主が、単細胞真菌細胞または多細胞真菌細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記宿主細胞が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃ
ａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐ
ｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎ
ｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙ
ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏ
ｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒ
ａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ
ｃｒａｓｓａよりなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
ヒト様糖タンパク質を非ヒト宿主細胞において産生するための方法であって、該宿主細胞
を、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載のＤＮＡライブラリーで形質転換して、遺伝
的に混合された細胞集団を産生する工程を包含し、該細胞集団が、該ライブラリー由来の
少なくとも１種のグリコシル化酵素を発現する、方法。
【請求項５６】
前記混合された細胞集団から、所望のヒト様グリコシル化表現型を産生する細胞を選択す
る工程をさらに包含する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記選択が、グリコシル化タンパク質または単離されたＮ−グリカンを、（ａ）質量分析
；（ｂ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ；（ｃ）液体クロマトグラフィー；（ｄ）蛍光活性化細胞選
別器、分光光度計、蛍光分析計、またはシンチレーションカウンターを使用して細胞を特
徴付けること；（ｅ）宿主細胞を、レクチンまたは所望のオリゴ糖部分に対する特異的親
和性を有する抗体に曝露すること；ならびに（ｆ）細胞を、糖、抗体およびレクチンから
なる群より選択される細胞傷害性分子または放射活性分子に曝露することからなる群より
選択される１つ以上の方法によって分析する工程を包含する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記触媒ドメインをコードするＤＮＡフラグメントが、マンノシダーゼ活性、ＵＤＰ−Ｇ
ｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ活性、ＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性、お
よびＣＭＰ−シアリルトランスフェラーゼ活性からなる群より選択される活性を有し、そ
して前記細胞標的化シグナルペプチドが、小胞体、シスゴルジ、ゴルジ中間嚢、およびト
ランスゴルジからなる群より選択される宿主細胞の細胞小器官内に、酵素を優先的に局在
させる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記宿主細胞が、目的の標的糖タンパク質をさらに含み、該糖タンパク質上で、Ｍａｎ５
ＧｌｃＮＡｃ２がインビボで産生される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記インビボで産生されるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が、前記標的糖タンパク質上で優勢な
Ｎ−グリカンである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記宿主細胞が、目的の標的糖タンパク質をさらに含み、該糖タンパク質上で、ＧｌｃＮ
ＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２がインビボで産生される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
前記インビボで産生されるＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が、前記標的糖タンパク
質上で優勢なＮ−グリカンである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
請求項１、２４または５５のいずれかの方法によって産生された、宿主細胞。
【請求項６４】
請求項１、２４または５５のいずれかの方法によって産生された、ヒト様糖タンパク質。
【請求項６５】
真核生物細胞のグリコシル化パターンを変化させるための方法であって、該宿主細胞を、
請求項３７〜４５のいずれか１項に記載のＤＮＡライブラリーで形質転換して、該ライブ
ラリー由来の少なくとも１つのグリコシル化酵素を発現する、遺伝的に混合された細胞集
団を産生する工程を包含する、方法。
【請求項６６】
単離された核酸分子であって：（ａ）配列番号４１の少なくとも４５個の連続するヌクレ
オチド残基；（ｂ）（ａ）のホモログ、改変体および誘導体；ならびに（ｃ）ストリンジ
ェントな条件下で（ａ）にハイブリダイズする核酸配列からなる群より選択されるが、Ｓ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＣＨ１遺伝子をコードする配列を除く、核酸配列を含むか、
または該核酸配列からなる、単離された核酸分子。
【請求項６７】
配列番号４２のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項６８】
宿主細胞中での発現の際にＯＣＨ１活性をコードする、請求項６６に記載の単離された核
酸分子。
【請求項６９】
Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＯＣＨ１遺伝子をコードする、請求項６６に記載の単離された核酸分
子。
【請求項７０】
単離された核酸分子であって：（ａ）配列番号４３の少なくとも４５個の連続するヌクレ
オチド残基；（ｂ）（ａ）のホモログ、改変体および誘導体；ならびに（ｃ）ストリンジ
ェントな条件下で（ａ）にハイブリダイズする核酸配列からなる群より選択されるが、Ｓ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＮＮ１遺伝子をコードする配列を除く、核酸配列を含むか、
または該核酸配列からなる、単離された核酸分子。
【請求項７１】
配列番号４４のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項７２】
ＭＮＮ１遺伝子をコードする、請求項７０に記載の単離された核酸分子。
【請求項７３】
前記配列が、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＮＮ１遺伝子をコードする、請求項７０に記載の単離
された核酸分子。
【請求項７４】
配列番号４１の欠失または変異を含む宿主細胞であって、該宿主細胞は、該欠失も変異も
有さない宿主細胞と比較して、配列番号４１の低下した発現レベルを有することによって
特徴付けられる、宿主細胞。
【請求項７５】
配列番号４３の欠失または変異を含む宿主細胞であって、該宿主細胞は、該欠失も変異も
有さない宿主細胞と比較して、配列番号４３の低下した発現レベルを有することによって
特徴付けられる、宿主細胞。
【請求項７６】
植物グリコシル化を改変する方法であって、宿主中に、細胞標的化シグナルペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列にインフレームでライゲーションされた触媒ドメイン領域をコ
ードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を導入する工程を包含する、方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１０−２０７２３５（Ｐ２０１０−２０７２３５Ａ）
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０４５１８（Ｐ２０１０−１０４５１８）
【出願日】平成２２年４月２８日（２０１０．４．２８）
【分割の表示】特願２００６−５０３７８８（Ｐ２００６−５０３７８８）の分割
【原出願日】平成１６年２月２０日（２００４．２．２０）
【出願人】（５０３００７２８７）グライコフィ， インコーポレイテッド (37)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２８日（２０１０．４．２８）
【分割の表示】特願２００６−５０３７８８（Ｐ２００６−５０３７８８）の分割
【原出願日】平成１６年２月２０日（２００４．２．２０）
【出願人】（５０３００７２８７）グライコフィ， インコーポレイテッド (37)
【Ｆターム（参考）】
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