改良型プロトフィブリル選択的抗体及びその使用
本発明は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病、及び他の類似の疾患の予防、処置及び診断に関する。より具体的には、プロトフィブリル高次構造においてアミロイドβタンパク質（Ａβ）に対し選択性を有し、且つＩｇＧクラス及びＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４サブクラス又はそれらの組み合わせ又はそれらの突然変異体であり、高Ｆｃ受容体結合性及び低Ｃ１（Ｃ１ｑ）結合性を保有し、Ａβプロトフィブリルのクリアランスに有効で、且つ炎症のリスクが低減された高親和性抗体に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病、及び他の類似疾患の予防、処置及び診断に関する。より正確には、プロトフィブリル高次構造においてアミロイドβタンパク質（Ａβ）に対し選択性を有し、且つＩｇＧクラス及びＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４サブクラス又はこれらの組み合わせ又はこれらの突然変異体であり、高Ｆｃ受容体結合性及び低Ｃ１（Ｃ１ｑ）結合性を保有し、Ａβプロトフィブリルのクリアランスに有効で、及び炎症のリスクが低減された、高親和性の１０−７Ｍ、好ましくは１０−８Ｍ、さらには１０−９Ｍ未満又は１０−１０Ｍ若しくは１０−１１Ｍ未満の抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知、記憶及び行動障害を引き起こす進行性で不可逆的な神経変性障害である。ＡＤは高齢者人口における認知症の最も一般的な原因であり、６５歳超の人口のおよそ５％及び８０歳超の２０％が発症している。ＡＤは複数の認知機能における潜行性の発病及び進行性の悪化を特徴とする。神経病理としては、細胞外及び細胞内の双方の好銀性タンパク質沈着を伴う。細胞外の沈着物は老人斑と称され、主に異栄養性神経突起（腫脹し、変形した神経突起）に囲まれるアミロイドβタンパク質（Ａβ）からなる。この細胞外沈着物内のＡβは原線維状であることを特徴とし、βひだ状シート構造を伴う。この沈着物のＡβはある種の色素、例えばコンゴレッドで染色でき、原線維状の超微細構造を呈する。老人斑中の原線維状構造のＡβが備えるこれらの特徴が、一般名称としてのアミロイドの定義である。古典的な細胞内のＡＤ病変は神経原線維変化（ＮＦＴ）であり、これは高リン酸化微小管結合タンパク質τのよじれた鎖で構成されるペアードヘリカルフィラメント（ＰＨＦ）と呼ばれる繊維状構造からなる。脳において頻繁に見られる老人斑及び神経原線維変化の堆積が、死後に行われるＡＤ診断の基準である。ＡＤ脳はまた、肉眼的な脳萎縮、神経細胞損失、局所炎症（ミクログリオーシス及び星状細胞増加症）及びしばしば脳血管壁内に脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）も呈する。
【０００３】
Ａβペプチドの２つの型、Ａβ４０及びＡβ４２がＡＤ老人斑における主な型であるが、ＡＤに関連する脳血管アミロイドにおいてはＡβ４０が顕著な型である。酵素活性によりＡβは、健常及びＡＤ罹患の双方の被験者における全ての体細胞中でアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる大型タンパク質から継続的に形成される。β−及びγ−セクレターゼ活性を通じた２つの主要なＡＰＰ切断イベントによりＡβ産生が可能となる一方、α−セクレターゼと呼ばれる第３の酵素がＡβ配列を内側で切断することによりＡβ生成を妨げる（セルコエ（Ｓｅｌｋｏｅ）、１９９４年；エスター（Ｅｓｔｅｒ）、２００１年；米国特許第５６０４１０２号明細書）。Ａβ４２は４２アミノ酸長のペプチドであり、すなわちＡβ４０と比較してＣ末端で２つのアミノ酸分だけ長い。Ａβ４２は疎水性がより高く、且つＡβ二量体、Ａβ三量体、Ａβ四量体、Ａβオリゴマー、Ａβプロトフィブリル又はＡβフィブリルなどのより大型の構造のＡβペプチドへとより容易に凝集する（ジャレット（Ｊａｒｒｅｔ）、１９９３年）。Ａβフィブリルは疎水性且つ不溶性だが、その他の構造は全て疎水性が低く可溶性である。これらのより高度な分子構造のＡβペプチドは全て、例えば電子顕微鏡法によるそれらの生物物理学的及び構造的外観、及び例えばサイズ排除クロマトグラフィー／ウエスタンブロットでの分析によるそれらの生化学的特徴に基づき、個々に定義される。これらのＡβペプチド、特にＡβ４２は、寿命の間に種々のより高度な分子構造のＡβへと徐々に集合することとなる。ＡＤは年齢に大きく依存する障害であり、この集合プロセスが急速に生じるほど、生涯においてより早期に発症する。これが、ＡＤの主原因はＡＰＰ切断、Ａβ４２のレベル及びこれらのより高度な分子構造への集合であると主張するＡＤの「アミロイドカスケード仮説」の中核をなす。他の全てのＡＤ脳についての神経病理及び認知症などのＡＤの症状が、何らかの形でＡβ又はその集合体により引き起こされている。
【０００４】
Ａβは、種々の長さで、すなわち１−３９、１−４０、１−４２及び１−４３が、並びに種々の断片サイズで、すなわち１−２８及び２５−３５が存在し得る。ペプチドのＮ末端で切断が生じ得る。これらの全てのペプチドは凝集して可溶性中間体及び不溶性フィブリルを形成することができ、各分子型が特有の構造的高次構造及び生物物理学的特性を有する。例えば単量体Ａβ１−４２は４２アミノ酸長の可溶性且つ非毒性ペプチドであり、正常なシナプス機能に関与していることが示唆される。一定の条件下で、Ａβ１−４２は凝集して二量体、三量体、四量体、五量体、最大１２量体及びそれ以上のオリゴマー型となることができ、それぞれの物理化学的特性、例えば分子の大きさ、ＥＭ構造及びＡＦＭ（原子間力顕微鏡法）分子形状などはどれも異なる。より高い分子量の可溶性オリゴマーＡβ型の例がプロトフィブリル（ウォルシュ（Ｗａｌｓｈ）、１９９７年）であり、これは見かけの分子量が１００ｋＤａより大きく、且つ直径４〜１１ｎｍ及び長さ２００ｎｍ未満の曲線線形構造を有する。近年、Ａβプロトフィブリルなどの可溶性オリゴマーＡβペプチドが、海馬における記憶形成を反映すると考えられているシナプス可塑性の尺度である長期増強（ＬＴＰ）を損なうことが実証されている（ウォルシュ（Ｗａｌｓｈ）、２００２年）。さらに、オリゴマーの北極型（Ａｒｃｔｉｃ）Ａβペプチドが脳におけるＬＴＰに対し野生型Ａβより一層深刻な阻害作用を呈し、これはそれらのＡβプロトフィブリルを形成する強力な性質に起因するものと思われる（クリュバン（Ｋｌｙｕｂｉｎ）、２００３年）。
【０００５】
文献には、プロトフィブリルとは明らかに異なる他の可溶性オリゴマー型も記載されている。かかるオリゴマー型の１つがＡＤＤＬ（アミロイド由来拡散性リガンド）である（ランベルト（Ｌａｍｂｅｒｔ）、１９９８年）。ＡＦＭ分析によりＡＤＤＬは、ｚ軸に沿った４．７〜６．２ｎｍの主に小球状の型で、分子量が１７〜４２ｋＤａであることが明らかとなった（スタイン（Ｓｔｉｎｅ）、１９９６年）。別の型はＡＳＰＤ（アミロイドスフェロイド）と呼ばれるものである（ホシ（Ｈｏｓｈｉ）、２００３年）。ＡＳＰＤはＡβ１−４０の球状オリゴマーである。毒性試験から、１０ｎｍより大きい球状ＡＳＰＤは低分子型のものより毒性が高いことが示された（ホシ（Ｈｏｓｈｉ）、２００３年）。この見解は、早期発症型ＡＤを引き起こす北極型（Ｅ６９３）ＡＰＰ突然変異の最近の発見により支持されている（米国特許出願公開第２００２／０１６２１２９Ａ１号明細書；ニルスバース（Ｎｉｌｓｂｅｒｔｈ）ら、２００１年）。この突然変異はＡβペプチド配列の内側に位置する。このため突然変異保因者は、Ａβペプチドの変異体、例えば北極型Ａβ４０及び北極型Ａβ４２を生成することになる。北極型Ａβ４０及び北極型Ａβ４２は双方とも、より高度な分子構造、すなわちプロトフィブリルへとより一層容易に凝集し得る。従って、北極型突然変異の発症機序から、可溶性でより高分子のプロトフィブリルがＡＤを引き起こしているとともに、特異的な固有のエピトープ、すなわち「ＡＤ疾患エピトープ」を含むことが示唆される。
【０００６】
アルツハイマー病（ＡＤ）脳においては一般的に、実質及び血管壁に細胞外アミロイドプラークが所見される。このプラークはアミロイド（Ａβ３８−４３アミノ酸長の疎水性で自己凝集性のペプチドを含み、徐々に重合してプラーク沈着となる。可溶性Ａβオリゴマー種はアミロイドプラークそれ自体より疾患相関性が高いことが提言されている（マクリーン（ＭｃＬｅａｎ）ら、１９９９年；ナスランド（Ｎａｅｓｌｕｎｄ）ら、２０００年）。これらの前フィブリル中間体Ａβ種のなかで、オリゴマー型は試験管内及び生体内の双方において有害な生物学的作用を誘発することが示されており（ウォルシュ（Ｗａｌｓｈ）ら、２００２年）、従って疾患病因の中心的役割を果たすものであり得る。様々な分子サイズのオリゴマーＡβ種がいくつか知られている。重要なことには、Ａβの単量体型、オリゴマー型及びフィブリル型の高次構造は異なり、高次構造選択的な抗体の標的となり得る。主要なＡβ病原体の主体は不明であるものの、一部の証拠からは高分子量Ａβオリゴマーが特に神経毒性を有することを示唆する（ホシ（Ｈｏｓｈｉ）ら、２００３年）。
【０００７】
早期発症型ＡＤを引き起こす、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子における病原性突然変異についても記載されている。そのうちの１つがスウェーデン型ＡＰＰ突然変異（ムーラン（Ｍｕｌｌａｎ）ら、１９９２年）であり、これはＡβレベルの上昇を引き起こす。Ａβドメイン内に位置する他の北極型ＡＰＰ突然変異（Ｅ６９３Ｇ）は大型のＡβオリゴマーであるプロトフィブリルの形成を亢進することが分かっており、これらのＡβ中間体が特に病原性を有することが示唆される（（米国特許出願公開第２００２／０１６２１２９Ａ１号明細書；ニルスバース（Ｎｉｌｓｂｅｒｔｈ）ら、２００１年）。北極型ＡＰＰ突然変異の同定及びＡβプロトフィブリルについての毒性作用の解明では、ＡＤ発病におけるＡβオリゴマーに一層焦点が当てられている。
【０００８】
アルツハイマー病に対する治療方針としての免疫活性化は、（シェンク（Ｓｃｈｅｎｋ）ら、１９９９年）により最初に報告された。免疫化戦略の標的は、アルツハイマープラークにおいて所見されるフィブリル型のＡβであった。フィブリル化したＡβをワクチン（ＡＮ−１７９２）として使用した活性Ａβワクチン接種の最近の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験は、少数の患者における髄膜脳炎の発症により中止せざるを得なかった（ベイヤー（Ｂａｙｅｒ）ら、２００５年）。この研究において見られた副作用は、血管壁の原線維性アミロイドに対し反応する抗Ａβ抗体により引き起こされたものと見られた。ＣＡＡにおける原線維性アミロイドは血液脳関門（ＢＢＢ）にごく近接しており、従って抗原抗体反応によりＢＢＢに傷害が起こり、Ｔリンパ球のＣＮＳへの浸潤に至った可能性がある（フェイファ（Ｐｆｅｉｆｅｒ）ら、２００２年；ラッケ（Ｒａｃｋｅ）ら、２００５年）。そのうえ、参加患者のうちＡβワクチンに対する免疫応答を呈したのは少数のみであった。当該研究は早々に終了されたが、活性Ａβ免疫化はＡＤ患者の一部にしか有益でない可能性を含むように思われる。
【０００９】
ヒトＡβプロトフィブリルに対し選択的なモノクローナル抗体が記載されている（米国特許出願公開第２００２／０１６２１２９Ａ１号明細書）。純度が高く、且つ安定なヒトＡβプロトフィブリルを生成するためのこの方法は、北極型突然変異（Ｇｌｕ２２Ｇｌｙ）を有する合成Ａβ４２ペプチドの使用を伴う。この突然変異により免疫化及びＡβプロトフィブリル選択的抗体のハイブリドーマスクリーニングが促進される。重要なことは、この抗体は野生型Ａβプロトフィブリル及びＡβ−Ａｒｃプロトフィブリルの双方と結合する（ＰＣＴ／ＳＥ２００５／０００９９３号明細書）。
【００１０】
Ａβフィブリル（オヌアライン（Ｏ’Ｎｕａｌｌａｉｎ）、２００２年）、ミセルＡβ（カイエド（Ｋａｙｅｄ）、２００３年）、ＡＤＤＬ（ランベルト（Ｌａｍｂｅｒｔ）、２００１年）などの他のＡβ高次構造に関して選択的な抗体が記載されている。しかしながら、これらはどれもＡβプロトフィブリル選択性ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、改良型抗体、すなわちアルツハイマー病、ダウン症候群又は他の神経変性障害の予防、処置及び診断を改善するための、炎症のリスクが低減された、クラスＩｇＧ及びサブクラスＩｇＧ１又はＩｇＧ４若しくはそれらの組み合わせ又はそれらの突然変異体の高親和性（１０−７Ｍ未満）Ａβプロトフィブリル選択的抗体に関する。前記抗体は、古典的ハイブリドーマ技術及び抗体工学により開発されたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、オリゴマーＡβ型、すなわち「アルツハイマー疾患エピトープ」を構成するＡβプロトフィブリルを選択的に結合する抗体由来のＶＬ鎖及びＶＨ鎖上のＣＤＲ１−３領域の共通アミノ酸配列を開示し、Ｆｃ領域の修飾と組み合わせることで補体因子Ｃ１ｑ結合を低減し、補体の活性化及び炎症のリスクを低減する。
【００１３】
抗体の定常領域は多くの重要な機能を有し、特にＦｃ受容体及び補体因子Ｃ１ｑを結合する機能を有する。このＣ１ｑ結合機能が不活化されることで炎症反応が回避された。
【発明の効果】
【００１４】
要約すれば、この種類の高親和性プロトフィブリル選択的抗体は、他の既知の免疫療法的な治療様式と比較した場合、以下の特徴的な利点を有する。
１）高親和性により、疾患の原因であるＡβプロトフィブリルを標的とする。
２）補体因子Ｃ１ｑとの結合性が低いか、又は全くないことにより、炎症性副作用、すなわち髄膜脳炎のリスクが低減する。
３）高親和性抗体により、有効な処置に必要な臨床用量が低減される。
４）正確な投薬様式を提供する。
５）血管壁におけるＡβフィブリルへの結合、すなわちＣＡＡが少なく、炎症性副作用のリスクが低減する。
６）末梢において結合する抗体が少なく、ひいてはより多くの抗体が血液脳関門を通過し得るとともに脳内でのＡβオリゴマー型の結合及び除去に利用可能となり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の一態様は、ヒト野生型Ａβプロトフィブリルを結合するＣＤＲ領域の抗体共通アミノ酸配列の発見である（実施例１）。この発見は、治療用又は診断用として野生型ヒトＡβプロトフィブリルに対し高親和性及び高選択性を供する結合部位（ＣＤＲ領域）を定義するものである。免疫グロブリン（ＩｇＧ）分子の基本構造は、ジスルフィド架橋により共に結合する２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖を含む（図１）。軽鎖はλ又はκのいずれかであり、それぞれ約１１０アミノ酸残基の可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ）を有する。重鎖の有する可変領域（ＶＨ）は約１１０アミノ酸残基だが、定常領域（ＣＨ）は３００〜４００アミノ酸残基とはるかに大きく、ＣＨγ１、ＣＨγ２及びＣＨγ３領域又はドメインを含む。
【００１６】
定常領域（Ｆｃ）は補体系を活性化するとともに、感染性微生物又は外来／非自己抗原を貪食及び破壊するマクロファージ、ミクログリア及び好中球上でＦｃ受容体と結合する。これは抗体の治療原理の一部、すなわちＦｃ受容体介在性ミクログリア食作用及びＡβプロトフィブリルのクリアランスであることから、この機能は特に重要である。沈降仮説に従えば、他の抗体介在性クリアランス機序、すなわちＡβ抗体の非凝集特性及び末梢におけるＡβプロトフィブリルのクリアランスもまた作動している。重鎖及び軽鎖の可変領域は相補性決定領域又はＣＤＲと呼ばれる３つの超可変領域を含む。ＣＤＲ領域は約１３〜２３アミノ酸長の短い伸長部であり、ＶＬ及びＶＨ領域に位置する。抗体の１本の「腕」上の６つのＣＤＲ領域が、抗原を結合する「ポケット」を形成する。図１は、ＩｇＧ免疫グロブリン及びそのサブドメインの基本構造を示す。
【００１７】
本発明の別の態様は、高親和性のプロトフィブリル選択的抗体に関する。プロトフィブリルに対する１０−７Ｍ、好ましくは１０−８Ｍ、さらには１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、又は１０−１１Ｍ未満の範囲の親和性が記載される（実施例２）。これらの抗体は、親和性が１０−６Ｍの範囲の抗体と比較してより低用量で投与され得る点で有利である。これは、効果を実現するうえで少量の抗体しか必要ないため、注射により投与されるこれらの高親和性抗体が皮下に投与され得る点で有意義な臨床上の利点を有する。投与様式は皮下注射に限定されない。さらには、有効とするために必要な用量が少なくなることから、抗体の製造原価が低減されるであろう。
【００１８】
本発明の別の態様においては、抗体がＩｇＧクラスのものであり、血液脳関門を通過し得るため、治療用途に好適である。脳実質内でのＡβプロトフィブリルのクリアランスは、ミクログリア細胞によるＦｃ受容体介在性食作用により実現される。他の抗Ａβクリアランス機序も同様に作動するものと見られる。可溶性Ａβプロトフィブリルのこのクリアランスが、処置の中心的な機序である。Ａβプロトフィブリルは神経毒性が高く、疾患プロセスを惹起及び駆動すると考えられる。脳におけるＡβプロトフィブリルのクリアランスは有意義な臨床的価値を有する。異なるＡβ凝集型、すなわち二量体、三量体、四量体及びプロトフィブリル及びフィブリルを含むより高分子のオリゴマー型は平衡状態にあるため、Ａβプロトフィブリルの除去を介して、Ａβプロトフィブリルのクリアランスに加え、Ａβフィブリルを含む他のＡβオリゴマー型が間接的に低減されるであろう。Ａβフィブリルを含むプラークの低減の例が、高親和性プロトフィブリル選択的抗体（ｍＡｂ１５８）による処置後７２時間のアルツハイマートランスジェニックマウスモデル（ＡＰＰｓｗｅ）において示されている（実施例３）。従って、前記抗体によるＡβプロトフィブリルのクリアランスは他のＡβ凝集型又はオリゴマー型を間接的に低減するという利点もまた有するであろう。
【００１９】
本発明のさらに別の態様は、サブクラスＩｇＧ１の高親和性ヒトＡβプロトフィブリル選択的抗体であり、これは脳内のミクログリア細胞上に存在するヒトＦｃγＲＩ受容体に対し高親和性を有する。高親和性抗体はＡβプロトフィブリルの効率的なクリアランスをもたらすこととなり、有意義な治療的価値を有するものである。従って、他の免疫療法方針、例えば活性ワクチン接種又は他のＡβ型を標的とするＩｇＧ１サブクラスの他のモノクローナル抗体によるモノクローナル抗体処置などと比較した場合、この抗体はＣＮＳ及び末梢の双方においてＡβプロトフィブリルのクリアランスを示す。重要なことは、この処置はＡβプロトフィブリルなどの毒性の可溶性Ａβ種が高いレベルで存在する疾患過程の初期だけでなく、疾患過程の後期においても効果的であり得る。スウェーデン型及び北極型突然変異ＡＰＰｓｗｅａｒｃを示すトランスジェニックマウスモデルにおいては、高いレベルのオリゴマーＡβ型が記載されている（ロード・Ａ（Ｌｏｒｄ Ａ．）ら、２００６年）。
【００２０】
本発明のさらに別の態様においては、高親和性Ａβプロトフィブリル選択的抗体がＡβ凝集を低減又は阻害し、それにより脳内の可溶性オリゴマーＡβ型のレベルが低下し得る。
【００２１】
さらに、本発明の別の態様においては、高親和性Ａβプロトフィブリル選択的抗体がＡβのオリゴマー型、すなわちＣＮＳ外のＡβプロトフィブリルも同様に結合し、それにより前記Ａβ型の血液脳関門にわたる平衡は、前記Ａβ型のＣＮＳレベルがより低くなるようにシフトし得る（ドレナージ）。
【００２２】
上記で考察されるとおり、アルツハイマー患者を処置するためＡβフィブリルに対し選択的なＡβワクチン（ＡＮ−１７９２）を使用したエラン（Ｅｌａｎ）臨床研究は、結果として症例の６％に副作用、すなわち髄膜脳炎を生じた。脳実質内、また重要なことには血管壁内にも存在するアミロイドプラークの中核となるＡβフィブリルを標的とする方針は、結果として重篤な副作用を生じた。この副作用は、脳の血管壁において抗体がＣＡＡ（脳アミロイド血管症）と結び付き、炎症性のプロセスを開始したことにより引き起こされた可能性が最も高いと見られた。この重大な臨床的課題は、補体活性化活性の低下した改良型高親和性プロトフィブリル選択的抗体により回避される。この抗体は、副作用、すなわち髄膜脳炎のリスクが低減した、高いＡβプロトフィブリルクリアランス効果を保有するであろう。
【００２３】
本発明の別の態様においては、高親和性プロトフィブリル選択的抗体が低Ａβフィブリル結合性を有し（実施例２を参照）、ＣＡＡ中に存在するＡβフィブリルへの結合性が低いため、副作用のリスクが低減する。
【００２４】
本発明のさらに別の態様においては、高親和性Ａβプロトフィブリル選択的ＩｇＧ抗体が改変されることによりＩｇＧ１のＣＨ２ドメインと結合する補体因子Ｃ１ｑが低減するとともに補体活性化及び炎症リスクが低減する。この修飾はいくつかの異なる方法で行われ得る。一つの方法は、ＩｇＧ１定常領域のＣＨγ２ドメインを欠失させて、ＩｇＧ４由来の対応するドメイン又はＣ１ｑ結合を供するドメインの一部に交換したキメラ抗体の作成である。ＩｇＧ４はＣ１ｑを結合せず、従って補体カスケードを活性化しないことが十分に立証されている。これを実現するため、ＩｇＧ１上の高親和性Ｆｃ受容体ドメイン（ＣＨγ３）を、補体因子Ｃ１ｑに対する結合性を有しないＩｇＧ４ドメイン（ＣＨγ２）と組み合わせるような方法で、重鎖（ＣＨ）の定常領域が改変される。キメラ定常重鎖（ＩｇＧ１：ＣＨγ１、ＣＨγ２：ＩｇＧ４、ＣＨγ３：ＩｇＧ１）を含むこの新規抗体は、Ｆｃ受容体介在性食作用を通じたＡβプロトフィブリルの効率的なクリアランス、及び副作用、すなわち髄膜脳炎などの炎症リスク低減の、双方の重要な特性を有することとなる。
【００２５】
炎症リスクを低減するさらに別の方法は、抗体のオリゴ糖構造を変化させることであり、これにより補体因子Ｃ１ｑ結合性及び補体活性化が低減されることとなる。ヒトＩｇＧ１ではＡｓｎ−２９７における二分岐の複合型オリゴ糖の異なる構造が３０種類記載されている。ＣＨ２関連炭水化物の不在が、抗体の「ヒンジ」領域に高次構造上の変化を引き起こし、エフェクター分子との相互作用効果並びに補体活性化機能及びＣ１ｑ結合の減退を低減すると考えられている。
【００２６】
任意の他のアミノ酸に対するＡｓｎ−２９７の部位特異的突然変異誘発による高親和性ヒトＡβプロトフィブリル選択的抗体の修飾は、Ｃ１ｑ結合性の低いＦｃ受容体を保有する抗体を生成し、従って特に血液脳関門における炎症リスクが低減するであろう。抗体上でグリコシル化を修飾する代替例としては、酵素Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素Ｉが不活化された細胞型における抗体の発現がある。これによりＡｓｎ−２９７の炭水化物構造が変化した抗体が得られることとなる。限定はされないが、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の構造が形成される。この炭水化物修飾は、補体因子Ｃ１ｑ結合性を低減するとともに炎症を阻害するものである（ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ら、１９９８年）。あるいは、グリコシル化されたプロトフィブリル選択的抗体は、グリコシル化を阻害するツニカマイシンの存在下で抗体を発現する細胞を培養することにより実現し得る。この抗体は、補体活性化活性が変化していると同時にＦｃ受容体機能も変化しているであろう（レザーバロウ（Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ）ら、１９８５年）。補体活性化が低く、且つＦｃ受容体結合性が高い抗体を発現するクローンのスクリーニングにより、Ａβプロトフィブリルの高Ｆｃ介在性クリアランス及び低Ｃ１ｑ結合性を示すプロトフィブリル選択的抗体が生成されることとなる。
【００２７】
本発明のさらに別の態様は、ＡＤを処置又は予防するための、補体因子Ｃ１ｑの結合を低減又は阻害するような方法で補体因子Ｃ１ｑ結合部位が修飾されている、すなわちＰｒｏ３３１＞Ｓｅｒ３３１（スー（Ｘｕ）ら、１９９４年）の、ＩｇＧ１サブクラスの高親和性ヒトＡβプロトフィブリル選択的抗体である。ヒトＩｇＧ１の第３３１位におけるプロリン残基はまた、スレオニン若しくはグリシン又は任意の他の極性アミノ酸に換えてもよい。この修飾は、部位特異的突然変異誘発又はＤＮＡ欠失などの標準的な分子生物学的技術により実現され得る。
【００２８】
本発明のさらに別の態様は、ヒト組織、特に脳脊髄液、血液、尿又は唾液においてプロトフィブリルレベルを特異的に測定するための、アルツハイマー病の診断ツール又はバイオマーカーとしての高親和性ヒトＡβプロトフィブリル選択的ＩｇＧ抗体の使用である。ＣＳＦ又は血液中のヒトＡβプロトフィブリルのレベルは、アルツハイマー病に罹っていない対応する高齢者対照群と比較した場合、異なると見られる。アルツハイマー病の発症者は、ＣＳＦ又は血液中のＡβプロトフィブリルレベルが上昇していると見られる。従って、ＣＳＦ又は血液中のＡβプロトフィブリルレベルの測定により疾患の早期診断が行われ得る。これは、新規高親和性Ａβプロトフィブリル選択的抗体をサンドイッチＥＬＩＳＡ法と組み合わせることにより実現可能であり（実施例２Ａ）、ここではＡβプロトフィブリルが１０ｐＭレベルに至るまで測定されている。測定における他のＡβ型、例えばＡβフィブリル、Ａβ単量体及びＡβ断片（１−１６；１７−４０）などの干渉は、１０％以下である。
【００２９】
本発明はさらに、ヒト及び動物組織、例えば限定はされないが、脳脊髄液、血液、血清、尿及び脳組織といった組織中のＡβプロトフィブリルを測定するための高親和性プロトフィブリル特異抗体の使用に関し、アルツハイマー病についての可能な診断方法を提供する。これらの組織中並びに細胞培養物中のＡβプロトフィブリルを、抗Ａβプロトフィブリル抗体を使用して測定するための好適な方法は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロッティング又はドットブロッティングなどの免疫測定法である。本方法は、臨床治験における処置効果（プロトフィブリル低減）の追跡に好適であり得るとともにアルツハイマー病又はダウン症候群の診断検査として好適であり得る。
【００３０】
ＣＳＦ及び血液中のＡβプロトフィブリルレベルは非常に低いため、低レベルのＡβプロトフィブリルを計測可能とするために、ＥＬＩＳＡ法に基づく診断検査において高親和性Ａβプロトフィブリル選択的抗体を必要とする。近接連結（実施例４）（グルベルグ（Ｇｕｌｌｂｅｒｇ）、２００４年）若しくは類似の増幅系又はビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）若しくは類似の技術など、他の高感度方法を使用して感度を高めてもよい。近接連結技術は、分析物（この場合タンパク質）上の異なるエピトープに対して産生した抗体が、前記分析物上で互いに近づいて結合し得るという発見に基づく。前記異なる抗体がオリゴヌクレオチドと接合する場合、前記オリゴヌクレオチド間の距離は、連結オリゴヌクレオチドが連結成分を用いてオリゴヌクレオチド間に架橋を形成するうえで十分に短いものであろう。増幅成分もまた付加され、その上でＲＴ−ＰＣＲが実施され得る。この原理により、主体性及び標的タンパク質量を反映する増幅可能なＤＮＡ配列が生成される。この技術により亢進されたシグナル応答が得られ、ひいてはより低濃度の分析物を検出することが可能となる。
【００３１】
本発明者らは意外にも、修正版近接連結技術を同様にこのＡβプロトフィブリル特異抗体に使用することで、Ａβ単量体は検出せずに、低濃度の大型Ａβペプチド構造、すなわちＡβプロトフィブリルを検出し得ることを発見した。本発明者らは、プロトフィブリル高次構造のＡβペプチドが、本発明により、２個の抗体がプロトフィブリル上で互いに十分に近づいて結合可能となる構造（反復単位）を示すことを発見した。前記抗体がオリゴヌクレオチドと接合される場合、前記オリゴヌクレオチドは連結オリゴヌクレオチドを使用して架橋され得る。増幅成分を使用してＰＣＲが実施される。この原理により、主体性及び標的プロトフィブリル量を反映する増幅可能なＤＮＡ配列が、生成される（図４Ａを参照）。
【００３２】
近接連結又はその「ローリングサークル」と呼ばれる種類の技術は、高感度技術であるとともに特に、アルツハイマー病及び他の神経変性障害の診断に使用されるＡβプロトフィブリルなどの反復配列を伴う重合体構造の検出に非常に適している。
【００３３】
本発明はさらに、ヒト及び動物組織中のＡβプロトフィブリルの検出、局在決定及び定量の画像化における高親和性プロトフィブリル特異抗体の使用に関する。抗体は、限定はされないが、Ｉ１３１、Ｃ１４、Ｈ３又はガリウム６８といった放射性同位元素などの検出用放射性リガンドで標識され得るであろう。本方法は、アルツハイマー病又はダウン症候群の診断ツールとして好適であろう。
【００３４】
本発明のさらに別の態様は、獣医学における使用に特化した抗体種の作製である。概説される診断方法もまた、獣医学上の使用に好適である。
【００３５】
本発明の別の態様は、副作用を回避するため、すなわち治療薬又は診断薬として使用する際のヒトにおける前記抗体に対する免疫応答を回避するための、前記抗体のヒト化である。
【００３６】
さらに別の態様は、例えば、限定はされないがＰＢＳなどの、ヒト及び動物への投与に好適な生理緩衝液中の抗体の製剤である。抗体製品は安定性を高めるため凍結乾燥され得る。凍結乾燥製剤は、限定はされないが、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）などの賦形剤を含んで、凍結乾燥後の製品を安定化させ得る。
【００３７】
抗体製品は、抗菌剤を含み得る。
【００３８】
本発明に係る抗体又は断片は、前記ＣＤＲ領域及び／又はそのフレームワーク内にアミノ酸欠失、置換及び挿入を示し得る。挿入又は置換されるアミノ酸はまた、抗体の親和性及び特異性がなお損なわれていないことを条件に、アミノ酸誘導体であってもよい。
【実施例】
【００３９】
以下の実施例は例示のために提供されるが、本発明をこれらの具体例に限定することを意図したものではない。
【００４０】
実施例１
ヒト野生型Ａβプロトフィブリル選択的モノクローナル抗体がクローニング及び配列決定された。重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列が表１に示される。ＣＤＲ領域１〜３の位置には下線が引かれているとともに、これらは表２及び３にも同様に示される。ＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、「アルツハイマー疾患エピトープ」を構成するヒト野生型Ａβプロトフィブリルを結合するための構造基盤を形成する。
【００４１】
高親和性プロトフィブリル特異抗体ＢＡ９／１５８についてのＶＬ鎖及びＶＨ鎖のＣＤＲ領域１〜３のアミノ酸配列が、表１、２及び３に示される。他のプロトフィブリル選択的抗体（ＢＡ２、ＢＡ３、ＢＡ４及びＢＡ７）の配列決定データがＣＤＲ領域の代替的アミノ酸配列を提供するが、これらに限定されない。ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＣＤＲ１−３領域のアミノ酸配列が組み合わされて分子「ポケット」を作り、これが高い親和性及び特異性でヒトＡβ野生型プロトフィブリルを結合する。この「ポケット」が「アルツハイマー病エピトープ」の構造基盤を形成する。ＣＤＲアミノ酸配列長の変動がＶＨ鎖及びＶＬ鎖の双方に観察され、ヒトＡβプロトフィブリルとの結合に適合する（表２及び３）。ＣＤＲ領域が短いほど、提供される抗体の結合ポケットの３次元構造はより限定的となり、長いほど適応性が高くなる。
【００４２】
本願出願人は、限定はされないが、表１、２及び３に示されるとおりのＣＤＲ配列、並びに表４及び５に示されるとおりのプロトフィブリル特異抗体についての、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の「マウスフレームワーク」領域、すなわちＣＤＲ領域外、並びにヒトＶＬ及びＶＨフレームワーク領域のアミノ酸配列を主張する。
【００４３】
高親和性プロトフィブリル特異抗体ＢＡ９／１５８に由来するＶＬ鎖及びＶＨ鎖のＶＬ及びＶＨ領域１〜３のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、表４及び５に示される。
【００４４】
表１、２及び３に示されるもの以外のＣＤＲ領域における他のアミノ酸置換は、ヒト野生型Ａβプロトフィブリルとの高親和性及び高特異性結合を伴うことで適合性を有する。ＣＤＲ領域の特定の位置に極性アミノ酸が存在する場合、当該の特定アミノ酸は、Ａβプロトフィブリルとの高い親和性及び特異性結合が保有又は改良されながら、別の極性アミノ酸に置換され得る。同様に、ある位置に非極性又は負若しくは正に帯電したアミノ酸が存在する場合、当該アミノ酸は同一群由来の類似のアミノ酸に置換され得る。
【００４５】
また、特定の１個又は複数のアミノ酸は、ＣＤＲ領域における任意の位置で、抗体と類似の機能及び構造を供する機能的等価物に交換され得る。
【００４６】
実施例２．ＥＬＩＳＡによる高親和性ヒトＡβ野生型プロトフィブリル（ｐｒｏｆｉｂｒｉｌ）選択的モノクローナル抗体の特性決定
実施例２は、サンドイッチＥＬＩＳＡにより計測した場合、Ａβ単量体との交差反応が２００〜１０００倍低く、且つＡβフィブリルとの交差反応が４０倍未満の高親和性プロトフィブリル選択的抗体を示す（図２Ａ）。競合ＥＬＩＳＡ実験から、抗体はヒトＡβ４２野生型プロトフィブリルに対し強力な親和性を有するが、ＡβペプチドのＮ末端部分及びＡβ単量体に対しては非常に弱い親和性しか有しない。ＡβのＣ末端断片との結合は観察されなかった（図２Ｂ）。さらにこの抗体は、メジン又はトランスサイレチンのような他の種類のアミロイドとは交差反応しない。さらにこの抗体は、Ａβの豊富な前駆体であるヒトＡＰＰを認識しない。
【００４７】
図２ＡにサンドイッチＥＬＩＳＡが示される。抗体１５８がウェル内に被膜され、続いて濃度を上昇させながら異なるＡβ型がウェルに添加された。結合したＡβ型の計測が、ビオチン化ｍＡｂ１５８及びＨＲＰ標識ストレプトアビジンを添加することにより行われた。製造者により推奨される手順に従い発色が計測された。
【００４８】
図２Ｂには、競合ＥＬＩＳＡが示される。ＥＬＩＳＡプレートをヒトＡβプロトフィブリルで被膜した。続いて抗体１５８が異なるＡβ型を増量させながらインキュベートされた（競合法）。インキュベーション混合物をマイクロタイタープレートウェルに添加して、遊離抗体をウェル中の固定プロトフィブリルと結合させた。結合した１５８抗体が標準的手順を使用して第２の抗体により計測された。
【００４９】
実施例３
高親和性Ａβプロトフィブリル選択的抗体の有効性が、アルツハイマートランスジェニックマウスモデル（ＡＰＰｓｗｅ）において急性脳内注射により測定された。有効性評価に使用されるトランスジェニックマウスは、スウェーデン型突然変異（ＡＰＰＳｗｅ）に伴うヒトＡＰＰを発現する。このパラダイムにおいて、抗体は脳実質のプラークリッチ領域に直接注射され、神経病理に対する影響が７２時間後に評価される（ウィルコック（Ｗｉｌｃｏｃｋ）ら、２００３年）。他の研究では、抗Ａβ抗体の直接施用により結果として生体内でアミロイド沈着物の急速なクリアランスが生じることが示されている（バクスカイ（Ｂａｃｓｋａｉ）ら、２００１年；ブレンザ（Ｂｒｅｎｄｚａ）ら、２００５年）。高親和性Ａβプロトフィブリル選択的抗体の注射は、ＡＰＰＳｗｅマウスモデルにおいて有意なプラーク低減をもたらす（図３）。
【００５０】
図３において、トランスジェニックマウスモデル（ＡＰＰｓｗｅ）における高親和性プロトフィブリル選択的抗体の治療有効性が試験された。Ａ：１４月齢のＡＰＰＳｗｅトランスジェニックマウスが頭蓋内にＰＢＳを、及びＢ：高親和性プロトフィブリル選択的抗体（１５８）を１μｇ／μｌ注射され、及び注射後７２時間で検査された。対照側（Ａ；矢印）と比較した場合、注射部位（Ｂ；矢印）の近傍の鉤状回における著しいＡβ負荷のクリアランスが注目される。
【００５１】
実施例４．Ａβプロトフィブリルを計測するための高親和性プロトフィブリル選択的抗体と組み合わせた近接連結
ヒト野生型Ａβプロトフィブリルが１０ｐＭの範囲に至るまで検出された一方、Ａβ単量体調製物は全く検出されなかった。超高感度近接連結法及び高親和性抗体の組み合わせが特に有利であるのは、アルツハイマー病及び他のタンパク質「凝集」疾患、例えばプリオン病、クロイツフェルトヤコブ病、アミロイドーシス及びパーキンソン病などを診断する際に特に好適なオリゴマー型の分析物のみを測定する系を提供するためである。
【００５２】
図４において、ヒトＡβプロトフィブリルが近接連結技術によりｐＭレベルで計測される。近接連結測定法（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）の方法説明を以下に示す（グルベルグ（Ｇｕｌｌｂｅｒｇ）ら、２００４年より）：ステップ１、近接プローブ対との試料のインキュベーション（約１時間）；ステップ２、連結に必要な全成分の添加及び定量的ＰＣＲによる検出（約５分間の連結時間）。測定においては高親和性プロトフィブリル選択的モノクローナル抗体が使用された；ステップ３、定量的ＰＣＲ（約２時間）。合成Ａβ単量体及びＡβプロトフィブリル調製物が希釈され、それらの反応性について上記の近接連結測定法で試験された。
【００５３】
実施例５．ｍＡｂ１５８は一般的なアミロイドエピトープを認識しない。
既に報告されているＡβ高次構造依存性抗体は他のアミロイド形成性タンパク質のオリゴマー及びフィブリルを結合することが示されており、全てのアミロイド凝集について共通のエピトープの存在が示唆される。Ａβ以外のアミロイド形成性タンパク質からプロトフィブリルを生成する技術的困難から、代わりにｍＡｂ１５８が異なるアミロイドフィブリルに対し試験された。これらの実験にはドットブロットアッセイが使用されたが、これは抗体抗原反応が溶液中で生じる場合、阻害ＥＬＩＳＡはフィブリルなどの不溶性抗原に好適でないためである。しかしながら、ドットブロットアッセイは、様々なＡβ型についての抗体特異性を評価する、すなわちプロトフィブリル（ｐｒｏｆｉｂｒｉｌ）及びフィブリルに対する選択性の差異を計測するうえでは好適でない。メジンのフィブリルである膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）及びα−シヌクレインがニトロセルロース膜上に固定され、天然の高次構造が維持された。ｍＡｂ１５８は、Ａβフィブリル以外のどのアミロイドとも反応性を示さなかった（図５Ａ）。ｍＡｂ１５８のＡβフィブリルに対する結合性は、Ａβプロトフィブリルエピトープの一部がＡβフィブリル構造中にも存在することを示唆する。陽性対照としては、抗体６Ｅ１０（Ａβ）、ｐＡｂ１７９（メジン）、ｐＡｂＡ１１０（ＩＡＰＰ）及びｍＡｂ２１１（α−シヌクレイン）が使用された（図５Ｂ）。代表的ブロットは反復実験（ｎ＝３）から示した。
【００５４】
ｍＡｂ１５８はＡＰＰを結合しない
ＡＰＰ及び可溶性ＡＰＰ断片のレベルは一般に、ＣＳＦ及び脳ホモジネートなどの生体試料中でＡβのレベルを上回り、従ってＡβ−抗体のＡＰＰに対する交差反応性はＡＰＰと結合することにより処置を阻害し、結果としてＡβプロトフィブリル及び／又はＡβオリゴマーを結合及び除去するための遊離抗体が少なくなる可能性がある。また、これはＡβのサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイによる生体試料中のＡβプロトフィブリルの計測を妨げ得る。ｍＡｂ１５８が未変性ＡＰＰと結合するかどうかを解明するため、免疫沈降実験が実施された。ＨＥＫ細胞培養培地（偽処理、ＡＰＰＳｗｅ及びＡＰＰＡｒｃ−Ｓｗｅ）及びマウス脳ホモジネート（非トランスジェニック、ＡＰＰＳｗｅ及びＡＰＰＡｒｃ−Ｓｗｅ）をｍＡｂ１５８又は６Ｅ１０で免疫沈降させた後、検出抗体として６Ｅ１０を伴う変性ウエスタンブロットを行った（図５Ｃ）。図５Ｃに見られるとおり、ｍＡｂ１５８は細胞培養培地由来のαＡＰＰ又はマウス脳ホモジネート由来の完全長ＡＰＰを免疫沈降させなかったが、予期されたとおり、６Ｅ１０は免疫沈降させた。対照として使用された合成Ａβプロトフィブリルは双方の抗体により同様に十分に免疫沈降した（図５Ｃ）。代表的なブロットは反復実験（ｎ＝３）から示した。
【００５５】
実施例６．Ａβプロトフィブリル特異的サンドイッチＥＬＩＳＡの確立。
生体試料中のＡβプロトフィブリルの計測を可能にするため、ｍＡｂ１５８を捕捉抗体及び検出抗体の双方として伴うサンドイッチＥＬＩＳＡが確立された。このアッセイは１ｐＭの検出限界及び最高２５０ｐＭの線形範囲でＡβプロトフィブリルを計測する（図６Ａ、線は標準曲線の線形回帰を示す）。標準曲線において使用されるＡβプロトフィブリルのサイズに関しては不確実であるため、濃度１ｐＭは１個のＡβ単量体の分子量（４５１４ｇ／ｍｏｌ）に基づくが、プロトフィブリルの分子量は少なくとも１００ｋＤａと推定されていることから、モルで計算されるＡβプロトフィブリルの検出限界は５０ｆＭという低さであり得る。ＡβＡｒｃプロトフィブリルの標準曲線から得られるシグナルは野生型Ａβプロトフィブリルより少なく、これはおそらくＡβプロトフィブリルのサイズの差に起因する（図６Ａ、６Ｂ）。合成ＬＭＷ−Ａβ（低分子量Ａβ）を滴定した。用語「低分子量Ａβ」は、分子量が約４〜１２ｋＤａのＡβの単量体、二量体及び三量体を意味する。Ａβプロトフィブリル及びＡβ１−１６を使用してＥＬＩＳＡの高次構造特異性が検証され（図６Ｂ）、ここでは凝集しないことを予期して親水性Ａβ１−１６ペプチドが使用された。２つの同一の抗体からなるＥＬＩＳＡでは、シグナルを生成するために少なくとも二量体のタンパク質が必要とされるが、予想通り、Ａβ１−１６はｍＡｂ１５８サンドイッチＥＬＩＳＡではμＭ濃度でさえ検出されなかった（図６Ｂ）。ＬＭＷ−Ａβ及びＡβプロトフィブリルを、凝集したＡβを単量体に解離させることが知られる７０％のギ酸（ＦＡ）で前処置すると、サンドイッチＥＬＩＳＡのシグナルは消失した（データは示さず）。従って、高ｎＭ濃度でのＬＭＷ−Ａβの検出（図６Ｂ）はおそらく、凝集量の少ないペプチド調製物に起因する。
【００５６】
過剰量の単量体Ａβ、ホロＡＰＰ及びＡＰＰ断片は、生体試料中に天然に存在するが、捕捉抗体被膜の結合部位を占有し、ひいてはプロトフィブリルの結合を阻害することによりＡβプロトフィブリル分析を妨げる可能性がある。この問題が、Ａβ１−１６の過剰量を一定濃度のＡβプロトフィブリル（５０ｐＭ、単量体単位としての表現）まで増加させながら添加し、それをｍＡｂ１５８ＥＬＩＳＡ及び６Ｅ１０−６Ｅ１０サンドイッチＥＬＩＳＡの双方で分析することにより調査された（図６Ｃ）。Ａβプロトフィブリルと比較したとき、モルで５００，０００倍の過剰量のＡβ１−１６はｍＡｂ１５８サンドイッチＥＬＩＳＡでの計測を妨害しなかったが、これはＡβ１−１６が捕捉抗体と結合しにくいことから予期されたとおりであった。対照的に、５００倍の過剰量のＡβ１−１６は６Ｅ１０−６Ｅ１０ＥＬＩＳＡにおけるシグナルを減少させるのに十分であったが、ここでＡβ１−１６は高親和性で捕捉抗体と結合した（図６Ｃ）。そのうえ、合成Ａβプロトフィブリルが偽処理のＨＥＫ細胞培養培地又は非トランスジェニックマウス脳ホモジネートに添加されると、９０％のシグナルが回復した（データは示さず）。
【００５７】
実施例７．生体試料中のＡβプロトフィブリルの計測
北極型突然変異を保因する細胞及びマウスモデルにおいてＡβプロトフィブリルの存在が示唆されているが、現在のところ生体試料中のＡβプロトフィブリルを直接測定する方法はない。従ってｍＡｂ１５８サンドイッチＥＬＩＳＡはまず初めに、かかる細胞及びマウスモデルにおいてＡβプロトフィブリルレベルを計測するとともにそれらをこのＡβ内突然変異を有しないモデルと比較する機会を提供する。スウェーデン型突然変異のみを保因する細胞及びマウス由来の試料が野生型Ａβプロトフィブリル標準曲線と比較された一方、北極型突然変異を伴うＡβを発現する細胞及びマウス由来の試料がＡβＡｒｃプロトフィブリル標準曲線（図６Ａ）と比較された。この測定において計測される全てのＡβを確実に溶解状態にするとともに、Ａβフィブリルからの干渉の可能性を一切排除するため、全試料が分析前に５分間、１７，９００×ｇで遠心された。一時的に導入されたＡＰＰＳｗｅ及びＡＰＰＡｒｃ−ＳｗｅＨＥＫ細胞からの細胞培地群が分析され、偽処理のＨＥＫ細胞培養培地と比較された。標準曲線（図６Ａ）からＡβプロトフィブリルレベルが３回の平均値として計算された後ＡＰＰレベルに対し正規化され、導入レベルの差が補正された（ステン（Ｓｔｅｎｈ）ら）。ＡＰＰＡｒｃ−ＳｗｅＨＥＫ細胞培養培地中のＡβプロトフィブリル濃度は２８ｐＭ（±２）であり、ＡＰＰＳｗｅに見られた８．２ｐＭ（±０．３）より有意に高かった（ｐ＜０．０００１）（図７Ａ）。偽処理の培地中ではＡβプロトフィブリルは検出できなかった。Ａβプロトフィブリルのレベルもまた、プラーク及び神経細胞内のＡβ病理の双方を伴う１０月齢のＡＰＰＡｒｃ−Ｓｗｅ及びＡＰＰＳｗｅトランスジェニックマウス由来の脳において計測された（ロード（Ｌｏｒｄ）ら）。脳はＴＢＳ中でホモジナイズされたうえで、分析に先立ち可溶性Ａβ画分を回収するため遠心された。細胞培養培地を使用した分析と同様、ＡβプロトフィブリルレベルはＡＰＰＡｒｃＳｗｅトランスジェニックマウス脳において３９７ｐＭ（±５９）及びＡＰＰＳｗｅトランスジェニックマウス脳において１０８ｐＭ（±１４）と、群間で有意に異なった（ｐ＝０．００５）（図７Ｂ）。
【００５８】
上述の図（図６及び７）における試料数は、偽処理の細胞（ｎ＝３）及びＡＰＰＳｗｅ（ｎ＝８）を一時的に導入したもの及びＡＰＰＡｒｃ−Ｓｗｅを一時的に導入したもの（ｎ＝１１）であった。ＡＰＰＡｒｃ−Ｓｗｅ培地中のＡβプロトフィブリルのレベルはＡＰＰＳｗｅ培地中より約９倍高かった一方、偽処理の培地からはシグナルは得られなかった（Ａ）。非トランスジェニックマウス脳ホモジネート（ｎ＝６）のＴＢＳ可溶性画分中のＡβプロトフィブリルレベルの計測値が、トランスジェニックマウス（ＡＰＰＳｗｅ、ｎ＝３、及びＡＰＰＡｒｃ−Ｓｗｅ、ｎ＝６）と比較された（Ｂ）。細胞培養培地と同様、ＡＰＰＡｒｃ−ＳｗｅマウスのＡβプロトフィブリルレベルはＡＰＰＳｗｅマウスのものより７倍高かった。エラーバーは±ＳＥＭを示す。
【００５９】
実施例８．ｍＡｂ１５８は腹腔内投与後のＡＰＰｓｗｅａｒｃトランスジェニックマウス中のＡβプロトフィブリル及び総Ａβを有意に低下させる
ｍＡｂ１５８（１２ｍｇ／ｋｇ）が９〜１０月齢のＡＰＰｓｗｅａｒｃマウスに対し１８週間にわたり１週間に１回、腹腔内注射された。研究後、脳が単離され、ＴＢＳ中でホモジナイズした後遠心にかけて不溶性物質を沈降させた。不溶性物質はギ酸中で可溶化された。従って、マウス脳からは２つの画分、すなわちＴＢＳ画分及びギ酸画分が得られた。ＴＢＳ画分中のＡβプロトフィブリルレベルがＥＬＩＳＡにより測定された。プラセボ群と比較してｍＡｂ１５８処置群にはＡβプロトフィブリルの有意な低減が見られた（図８）。図８は、ｍＡｂ１５８又はプラセボのいずれかによる処置後４ヶ月のＡＰＰｓｗｅａｒｃトランスジェニックマウス脳ＴＢＳ抽出物中のＡβプロトフィブリルレベルを示す。
【００６０】
ギ酸画分中の総ＡβがＥＬＩＳＡにより測定された（ギ酸を使用して全てのＡβ型が可溶化されたことにより、全てのＡβ型が検出可能となった）。プラセボ群と比較して処置群には総Ａβの有意な低減が観察された（図９）。図９は、ｍＡｂ１５８又はプラセボのいずれかによる処置後４ヶ月のＡＰＰｓｗｅａｒｃトランスジェニックマウス脳ギ酸抽出物中の総Ａβレベルを示す。
【００６１】
実施例９〜１１
【００６２】
【表Ａ】
【００６３】
物質
【００６４】
【表Ｂ】
【００６５】
【表Ｃ】
【００６６】
【表Ｄ】
【００６７】
【表Ｅ】
【００６８】
【表Ｆ】
【００６９】
実施例９−１５８抗体のＤＮＡ配列
９．１−ＲＮＡ調製
マウスハイブリドーマ１５８のスナップ凍結細胞ペレット（ラベル付きバイアル０６０８２４＃１５８ ５×１０６細胞）が、２００６年１０月３日にＴＡＧに入れられた。これらの細胞は切断まで凍結貯蔵され、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮｅａｓｙミディキットを使用して製造者の実験手順に従いＲＮＡが単離された。
【００７０】
９．２−第一鎖合成
約５マイクログラムの１５８ＲＮＡが逆転写に供され、アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）第一鎖合成キットを使用して製造者の実験手順に従い１５８ｃＤＮＡが産生された−これが反復されることにより３つの個別のｃＤＮＡ産物（ラウンド１、２及び３）が生成され、ＲＴ反応によるＤＮＡ突然変異を防いだ。
【００７１】
９．３ １５８免疫グロブリンｃＤＮＡのクローニング
ハイブリドーマ１５８ｃＤＮＡがＰＣＲにより別個の２３反応において増幅された。免疫グロブリンκ鎖可変領域（ＶＫ）ｃＤＮＡが、１１個のＶＫプライマー（ＭＫＶ１〜１１）をκ定常領域プライマーＭＫＣ（表６）と組み合わせて使用して増幅された。同様に、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）ｃＤＮＡがＰＣＲにより、１２個の異なるＶＨプライマー（ＭＨＶ１〜１２）を４個のＩｇＧ定常領域プライマーの混合物（ＭＨＣＧ１／２ａ／２ｂ／３：表７）と組み合わせて使用して増幅された。
【００７２】
初回分のＩｇＨ−ＰＣＲ反応の結果は、ＭＨＶ５プライマーを使用した単一増幅産物であった。他の１１個のプライマー対はどれもＰＣＲ産物をもたらさなかった。オリゴヌクレオチドプライマーＭＨＶ５＋（ＭＨＣＧ１／２ａ／２ｂ／３混合物）によりプライミングされたＰＣＲ反応の産物が、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニング（登録商標）キットを使用してｐＣＲ２．１（登録商標）−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターに連結された。初回分のＩｇＫ−ＰＣＲ反応の結果は、プライマーＭＫＶ１及びＭＫＶ２をＭＫＣと共に使用した２個の単一増幅産物であった。他の９個のプライマー対は産物を生成しなかった。オリゴヌクレオチドプライマーＭＫＶ１又はＭＫＶ２＋ＭＫＣによりプライミングされたＰＣＲ反応の産物が、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニング（登録商標）キットを使用してｐＣＲ２．１（登録商標）−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターに連結された。
【００７３】
連結されたベクターで形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細菌が、ＬＢ／アンピシリン／Ｘ−ｇａｌ寒天プレート上で、寒天グリッド上のＰＣＲスクリーニング混合物中へと選び取ることによりクローニングされた。クローニングされたプラスミドインサートがＰＣＲ増幅によりスクリーニングされた。ＰＣＲ産物はゲル電気泳動され、及びサイズ補正されたＰＣＲ増幅産物（約５００ｂｐ）を産生するクローンが同定された。各クローンの一晩培養物（５ｍｌ）が、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット実験手順を使用して切断され、ＤＮＡプラスミドミニプレップが産生された。
【００７４】
９．４−ｃＤＮＡ配列決定
ＲＴ−ＰＣＲ、クローニング、及びＤＮＡ配列解析の完全サイクルが反復され、各免疫グロブリン鎖についての３つの完全に独立した配列情報を得た。各々独立したセットのＲＴ−ＰＣＲ反応からのプラスミドクローンが、１２１２及び１２３３プライマー（表１０）を使用して双方向で配列決定された。プラスミドがＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーターｖ３．０サイクル・シーケンシング・レディ・反応キット（ＡＢＩ）を使用して配列決定され、ＧｅｎｅＡｍｐ９６００ＰＣＲ機上でサイクルに付され、及びＡＢＩ３１０キャピラリシーケンサー上で解析された。
【００７５】
９．５−１５８ＶＫ ＤＮＡ配列
ＰＣＲプライマーＭＫＶ２及びＭＫＣを使用して第一鎖ｃＤＮＡラウンド１及び２で生成されたＶＫクローンの配列は、ＭＯＰＣ−２１、ＳＰ２及びＡｇ８などの骨髄腫融合パートナーに由来する無菌κ転写産物と同一であった。これは無菌転写産物である。ＰＣＲプライマーＭＫＶ１及びＭＫＣを使用して第一鎖ｃＤＮＡラウンド１〜３上で生成されたＶＫクローンの共通配列（１５８ＶＫ）が表１１に示される。これは機能上の再構成である。表１１は、表１、４及び５に示される配列といくらかの相違を示す。これらの相違は、ＰＣＲプライマーが位置したＦＷ１領域にある。本願出願人のプライマーによりコードされなかった、１５８ＶＫにおけるリーダーの断片と最も同一性の高いマウスＶＫリーダー配列は、Ｋ５．１＃であった（表１２）。＃Ｋ５．１シグナル配列を正確に切断するシグナルペプチドの予測が、予測プログラムにより行われた。最も可能性が高いと予測された切断部位は、正確にアミノ酸残基１９と２０との間であった（表１３）。キメラ１５８ＶＫタンパク質及びＤＮＡ配列が表１４に示される。
【００７６】
９．６−１５８ＶＨ ＤＮＡ配列
ＰＣＲプライマーＭＨＶ５及びＭＨＣＧ１／２ａ／２ｂ／３混合物を使用して第一鎖ｃＤＮＡラウンド１〜３で生成されたＶＨクローンの共通配列（１５８ＶＨ）が、表１５に示される。１５８ＶＫと同様、表１、４及び５に示されるＦＷ１配列とはいくらか異なる。本願出願人のプライマーによってはコードされなかった、リーダーの断片と最も同一性の高いマウスＶＨリーダー配列は、ＮＬ−１であった（表１６）。
【００７７】
実施例１０−キメラ発現ベクターの構築
キメラ発現ベクターの構築には、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位及びコザック配列の前方での、好適なリーダー配列のＶＨ及びＶＫへの付加が伴う。コザック配列（表８）により可変領域配列の効率的な翻訳が確実となる。これはリボソームが翻訳を開始し得る正確なＡＵＧコドンを定義するとともに、最も重要な塩基は第−３位、ＡＵＧ開始上流のアデニンである。リーダー配列は、Ｋａｂａｔデータベース内で最も類似したマウスリーダー配列として選択される。これらの付加は、順方向プライマー（表９）内でコードされる。さらには、キメラ発現ベクターの構築には、天然ＡｐａＩ制限部位に至り、１５８のＪ領域の３’末端と隣接する、ヒトγ１定常領域の５’断片の導入が伴う。ＣＨは挿入されたＶＨ配列の下流の発現ベクター内でコードされるが、Ｖ−Ｃイントロンが欠如している。軽鎖について、天然スプライスドナー部位（表８）及びＢａｍＨＩ部位が、Ｖ領域の下流に付加される。スプライスドナー配列は、ＶＫの定常領域へのインフレーム付着が必要なκＶ：Ｃイントロンのスプライシングを円滑にする。マウスＶＨ及びＶＫ遺伝子が解析され、不要なスプライスドナー部位、スプライス受容部位、コザック配列がいずれも、及び機能性の全抗体のサブクローニング及び／又は発現を後に干渉し得る任意の追加的なサブクローニング制限部位の存在について同定された。この場合、何も見つからなかった。
【００７８】
１０．１−発現ベクター
発現ベクターｐＫＮ１００、及びｐＧ１Ｄ２００のプラスミドＤＮＡ調製物が、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）マキシキットを使用して製造者の実験手順に従い精製された。ＴＯＰ１０細菌の培養物５００ｍｌ由来の、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）プラスミドミディ及びマキシキットを使用したプラスミドＤＮＡ精製物にいずれかのベクターが導入された。ベクターマップが図１０及び１１に示される。
【００７９】
１０．２−軽鎖キメラ化プライマー
マウスリーダー配列Ｋ５．１＃がキメラ１５８ＶＫの設計に組み込まれた。プライマーは、この完全リーダーと、ｐＫＮ１００発現ベクター（表９）へのクローニング用の末端制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩを備える１５８ＶＫとを含有するＰＣＲ産物を生成するよう設計された。順方向プライマー１５８ｖｌは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位；コザック部位及びＫ５．１＃リーダー配列を導入する。逆方向プライマー１５８ｖｌｒｅｖは、スプライスドナー部位及びＢａｍ ＨＩ制限部位を導入する。
【００８０】
１０．３−重鎖キメラ化プライマー
リーダー配列ＮＬ−１がキメラ１５８ＶＨの設計に組み込まれた。プライマーは、このリーダーと、ｐＧ１Ｄ２００発現ベクターへのクローニング用の末端制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩを備える１５８ＶＨ領域とを含むＰＣＲ産物を生成するよう設計された。これらは表９に示される。順方向プライマー１５８ｖｈは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位；コザック翻訳開始部位及びＮＬ−１リーダー配列を導入する。逆方向プライマー１５８ｖｈｒｅｖは、γ１Ｃ領域の５’末端及び天然ＡｐａＩ制限部位を導入する。ＶＫのＫ５．１リーダー配列についてのシグナルペプチド切断部位の予測が表１７に示される。
【００８１】
１０．４−キメラ１５８ＶＨ構築物、ｐＧ１Ｄ２００１５８ＶＨの生成
１５８ＶＨ ＤＮＡ断片がプライマーの１５８ｖｈ及び１５８ｖｈｒｅｖ（表９）で増幅された。４５０ｂｐ（約）のＰＣＲ産物がベクターｐＣＲ２．１にＴ−Ａ連結され、これを使用して化学的にコンピテントＴＯＰ１０細菌が形質転換された。クローンが然るべき挿入サイズにより選択され、１２１２プライマー（表１０）を使用して配列決定された。的確な発現インサートがｐＧ１Ｄ２００発現ベクターにサブクローニングされ、的確なサブクローンが、プライマーＢＤＳＨ６１Ｒ（表１０）を使用したＤＮＡ配列決定により選択された。このクローンを２００ｍｌの培養液中で成長させ、キアゲン・マキシキットを使用して製造者の実験手順を用いてプラスミドＤＮＡを産生した。キメラ１５８ＶＨタンパク質及びＤＮＡ配列が表１８に示される。
【００８２】
１０．５−キメラ１５８ＶＫ構築物、ｐＫＮ１００１５８ＶＫの生成
１５８ＶＫ ＤＮＡ断片がプライマー１５８ｖｌ及び１５８ｖｌｒｅｖ（表９）で増幅された。４５０ｂｐ（約）のＰＣＲ産物がベクターｐＣＲ２．１にＴ−Ａ連結され、これを使用して化学的にコンピテントなＴＯＰ１０細菌が形質転換された。クローンが然るべき挿入サイズにより選択され、１２１２プライマー（表１０）を使用して配列決定された。的確なクローンがｐＫＮ１００発現ベクターにサブクローニングされた。正しいサブクローンが、挿入サイズについてのスクリーニング及びプライマーＨｕ−Ｋ２（表１０）を使用したＤＮＡ配列決定により選択された。このクローンを２００ｍｌの培養液中で成長させ、キアゲン・マキシキットを使用して製造者の実験手順を用いてプラスミドＤＮＡを産生した。
【００８３】
実施例１１−キメラ１５８抗体の産生及び結合特性
１１．１−ＣＯＳ７細胞の形質転換及び細胞培養
１つのバイアルのＣＯＳ７細胞を解凍して、１０％の胎仔クローンＩ血清及び抗生物質を補給したＤＭＥＭ中で成長させた。１週間後、細胞（１０７／ｍｌで０．８ｍｌ）が、ｐＧ１Ｄ２００１５８ＶＨに加えｐＫＮ１００１５８ＶＫ（各１０μｇのＤＮＡ）によって電気穿孔処理された。細胞をペトリ皿の８ｍｌの成長培地中で３日間成長させた。
【００８４】
１１．２−キメラ抗体産生
サンドイッチＥＬＩＳＡを使用してＣＯＳ７上清中の抗体濃度が計測された。キメラ１５８ＶＨ×１５８ＶＫ抗体を０．３μｇ／ｍｌで、続いて３．７μｇ／ｍｌ（表１９）で、一時的に同時導入されたＣＯＳ細胞馴化培地において発現させた。
【００８５】
１１．３−キメラ抗体活性
２つのＥＬＩＳＡを使用してキメラ１５８の抗原結合を分析した。３．７μｇ／ｍｌのキメラ抗体馴化培地を使用して、Ａβ単量体の結合が直接ＥＬＩＳＡ実験手順（図１２）により計測され、マウス１５８ＩｇＧと比較された。次に、抗体と液相中で混合したうえ続いてＡβ単量体と固相で結合させた単量体又はプロトフィブリルを使用して、競合ＥＬＩＳＡが行われた（図１３）。これらから、キメラ１５８抗体が元の１５８マウス抗体と同様にアミロイドＡβ単量体及びプロトフィブリルと結合することが示された。
【００８６】
注釈
その後の配列決定により、表１及び４に示されるとおりのマウス抗体配列データが、５’末端でＶＨ鎖及びＶＫ鎖の双方にエラーを含むことが示された。本願出願人はこれが、Ｖ領域内に位置するプライマーの使用に起因することを提言したい。その後の配列決定において、Ｖ領域内に突然変異を導入できない、リーダー配列内に位置するプライマーが使用された。この配列決定は、配列の差異を示した（表１５及び１１を参照）。しかしながら、前記差異はＣＤＲ領域内には位置しない。
【００８７】
直接結合ＥＬＩＳＡ及び競合ＥＬＩＳＡによりそれぞれ示されるとおり、キメラ抗体はアミロイドＡβ単量体及びプロトフィブリルを結合する。この証拠から、１５８ＶＨ鎖及び１５８ＶＫ鎖の組み合わせが抗ＬＳＡＰ抗体１５８をコードすることが確認され、これらの配列がヒト化１５８抗体を生成するためのヒト化手順に好適であることが示唆される。
【００８８】
実施例１２−ヒト化抗体設計及び考察
【００８９】
【表Ｇ】
【００９０】
【表Ｈ】
【００９１】
１２．１−ヒトＶ遺伝子データベース
国際免疫遺伝学データベース（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ）２００６及び「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」のＫａｂａｔデータベース第５版（最終更新日１９９９年１１月１７日）からのヒト及びマウス免疫グロブリンのタンパク質配列を使用してＫａｂａｔアラインメントにおける免疫グロブリンタンパク質配列のデータベースを編纂した。本願出願人のデータベースは、９３２２本のヒトＶＨ配列及び２６８９本のヒトＶＫ配列を含む。配列分析プログラムＳＲ７．６が使用され、１５８ＶＨ及び１５８ＶＫタンパク質配列（表２０）についてヒトＶＨ及びＶＫデータベースに問い合わせた。
【００９２】
１２．２−１５８ＲＨＡのためのヒトフレームワークの選択
１２．２．１−１５８ＶＨのヒトＶＨ配列との比較
バーニヤ（フート・Ｊ（Ｆｏｏｔｅ，Ｊ．）及びＧ・ウィンター（Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒ）、１９９２年、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐｓ」、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９頁）、カノニカル（モレア・Ｖ（Ｍｏｒｅａ，Ｖ．）、Ａ・Ｍ・レスク（Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ）、及びＡ・トラモンタノ（Ａ．Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ）、２０００年、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０：２６７−２７９頁）及びＶＨ−ＶＬ界面（コチア・Ｃ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．）、Ｊ・ノボトニー（Ｊ．Ｎｏｖｏｔｎｙ）、Ｒ・ブルコレリ（Ｒ．Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ）、及びＭ・カープラス（Ｍ．Ｋａｒｐｌｕｓ）、１９８５年、「Ｄｏｍａｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｔｈｅ ｐａｃｋｉｎｇ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ」、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１−６６３頁）（ＶＣＩ）残基において、１５８ＶＨとの同一性が最も高いヒトＶＨ配列で、Ｖ領域フレームワーク（ＦＷ）内に位置するものが、表２１に示される。１５８と同一のＶＣＩ残基の数（ＶＣＩスコア）及びＦＷ残基の数（ＦＷスコア）もまた示される。これらのＶＨ配列の全てが、表２２に示されるとおり、同一のＶＣＩ残基、及びＣＤＲ長を共有する。ＡＪ５５６６６９は、このデータセットの他のヒト配列中には見られない異常なＰｒｏ７４を有することから、本願出願人は当初の分析においてこれを無視することとする。しかしながら、Ｐｒｏ７４は１５８ＶＨ配列中に存在するため、ＡＦ０６２２４３に基づくＶＨ構築物が抗原を結合しない場合には、ＡＪ５５６６６９がヒト化の代替ＦＷとして考慮され得るであろう。これらの配列のアラインメント（表２３）は、それらの相違を強調表示している。このデータセット内でＡＦ０６２２４３は唯一、保存された変化Ｔ（８２ａ）Ｓ及びＦ７９の保存を有する。ＡＦ０６２２４３の他の特徴は、保存された変化Ｄ１Ｅ、Ｋ１９Ｒ、Ａ２３Ｓ、Ｔ７７Ｓ、Ｓ１１８Ｔである。他の全てのＦＷ変化は、表２３のフレームワーク全てに共通していた。ＡＦ０６２２４３が１５８ＲＨＡの基盤となるフレームワークとして選択された。
【００９３】
１２．３−１５８ＲＨＡの生成
１５８ＲＨＡの設計は単に、１５８ＶＨからＡＦ０６２２４３のアクセプターＦＷへのＣＤＲ１、２及び３の移植である。ＡＦ０６２２４３と最も同一性の高いヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子は、ＶＨ Ｍ９９６４９（ＶＨ３−０７）であり（表２４）、これからリーダーペプチドが抽出された（表２５）。シグナルＰアルゴリズム（ニールセン・Ｈ（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．）、Ｊ・エンゲルブレヒト（Ｊ．Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ）、Ｓ・ブルナク（Ｓ．Ｂｒｕｎａｋ）、及びＧ・フォン・ヘイネ（Ｇ．ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ）、１９９７年、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １０：１−６頁）から、これがシグナルペプチダーゼにより適切に切断されるものと予測された（表２６）。表２７は、１５８ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３をＡＦ０６２２４３ＦＷに移植して１５８ＲＨＡタンパク質配列を生成するスキームを示す。表２８は、１５８ＶＨ及びＡＦ０６２２４３の天然ＤＮＡ配列からのＤＮＡ配列１５８ＲＨＡｓｓの生成を示す。１５８ＲＨＡｓｓ ＤＮＡ配列の分析からスプライスドナー部位の存在が予測されたが、その予測スコアが表２９に示される。非コード突然変異の導入により、表３０に示されるとおりのこれらの予測されたスプライス部位が不活化され、最終１５８ＲＨＡ ＤＮＡ配列（表３１）が生成された。
【００９４】
１２．４−１５８ＲＫＡのためのヒトフレームワークの選択
１２．４．１−１５８ＶＫのヒトＶＫ配列との比較
ＶＣＩ残基で１５８ＶＫとの同一性が最も高いヒトＶＫ配列が、１５８ＶＫと同一のＶＣＩ残基の数（ＶＣＩスコア）及びＦＷ残基の数（ＦＷスコア）と共に表３２に示される。１１本の配列が１５８ＶＫと同一のＶＣＩ残基を全て有する。表３３は、これらの配列の全てが１５８ＶＫと同一のＣＤＲ長を有することを示す。表３４は、これらの相違を強調表示しており、同様にＩ８５を保有するＡＢ０６４０５４のみがＫ４５を保有することを示す。Ｇ１００Ｐ変化は、Ｐ１００が本願出願人のヒトＶＫデータベース内で１５％の出現率を有して一般的なため、特別注目に値しない。２つの置換、Ｔ７Ｓ及びＫ７４Ｒが保存されているとともに、他の全ての置換は表３４の全ての配列に共通である。以上の理由から、１５８ＲＫＡを生成するためにＡＢ０６４０５４が選択された。
【００９５】
１２．５−１５８ＲＫＡの生成
１５８ＲＫＡの設計は単に、ＣＤＲ１、２及び３を１５８ＶＫからヒトＡＢ０６４０５４のアクセプターＦＷへと移植することである。ＡＢ０６４０５４に最も近い生殖細胞系列Ｖ遺伝子はＡ１９であり（表３５）、これからリーダーペプチドが抽出された（表３６）。シグナルＰアルゴリズムから、このリーダーペプチドの適切な切断（表３７）が予測された。表３８は、１５８ＶＫ ＣＤＲをＡＢ０６４０５４のＦＷに挿入することによる１５８ＲＫＡのタンパク質配列の生成を示す。表３９は、１５８ＶＫ及びＡＢ０６４０５４の天然ＤＮＡ配列からの１５８ＲＫＡｓｓのＤＮＡ配列の生成を示す。１５８ＲＫＡｓｓの分析からスプライスドナー部位の存在が予測されたが、そのスコアが表４０に示される。非コード突然変異（４１）の導入によりこれらの部位が不活化され、最終１５８ＲＫＡ ＤＮＡ構築物が生成された（表４２）。
【００９６】
１２．６ ヒト化抗体（ＢＡＮ２４０１）結合活性
１５８ＲＫＡ及び１５８ＲＨＡ遺伝子を、ＩｇＧ１定常領域を含む発現ベクターに挿入した。この構築物をＣＯＳ細胞で発現させてヒト化１５８抗体を生成した。ヒト化１５８抗体が結合活性及び特異性について競合ＥＬＩＳＡで試験した。ヒト化抗体は、ｍＡｂ１５８及び１５８キメラ抗体と同一の結合特性を示した（図１４を参照）。
【００９７】
１２．７ １５８ＲＨＡ鎖及び１５８ＲＫＡ鎖における追加的な突然変異
マウス生殖細胞系列Ｖ遺伝子ＶＨ ＡＡＫ７１６１２を１５８ＶＨと比較することにより、単一の体細胞突然変異Ａ６０ＧがＣＤＲ２において同定された。さらには、抗体１５８の分子モデルは、１５８ＲＨＡには保存されていない３個のＶＨ ＦＷ残基をＣＤＲ残基の５Å内に含む。これらの置換は、Ｄ１Ｅ、Ｐ７４Ａ及びＴ８２Ｓである（表４３）。同様に、１５８ＲＫＡに保存されていないＣＤＲ残基の５Å内に２個のＶＫ ＦＷ残基がある。この置換は、Ｌ３Ｖ及びＧ１００Ｐである（表４４）。ヒト化バージョン１５８ＲＨＢ、１５８ＲＨＣ、１５８ＲＨＤ、１５８ＲＫＢ及び１５８ＲＫＣにおける、１５８ＲＨＡ及び１５８ＲＫＡへの位置ＶＨ−１、ＶＨ−７４、ＶＨ−８２、ＶＫ−３及びＶＫ−１００での逆突然変異の導入が、表４３及び４４に示される。
【００９８】
【表Ｉ】
【００９９】
【表１】
【０１００】
【表２】
【０１０１】
【表３】
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
【表５】
【０１０４】
【表６】
【０１０５】
【表７】
【０１０６】
【表８】
【０１０７】
【表９】
【０１０８】
【表１０】
【０１０９】
【表１１】
【０１１０】
【表１２】
【０１１１】
【表１３】
【０１１２】
【表１４】
【０１１３】
【表１５】
【０１１４】
【表１６】
【０１１５】
【表１７】
【０１１６】
【表１８】
【０１１７】
【表１９】
【０１１８】
【表２０】
【０１１９】
【表２１】
【０１２０】
【表２２】
【０１２１】
【表２３】
【０１２２】
【表２４】
【０１２３】
【表２５】
【０１２４】
【表２６】
【０１２５】
【表２７】
【０１２６】
【表２８】
【０１２７】
【表２９】
【０１２８】
【表３０】
【０１２９】
【表３１】
【０１３０】
【表３２】
【０１３１】
【表３３】
【０１３２】
【表３４】
【０１３３】
【表３５】
【０１３４】
【表３６】
【０１３５】
【表３７】
【０１３６】
【表３８】
【０１３７】
【表３９】
【０１３８】
【表４０】
【０１３９】
【表４１】
【０１４０】
【表４２】
【０１４１】
【表４３】
【０１４２】
【表４４】
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病、及び他の類似疾患の予防、処置及び診断に関する。より正確には、プロトフィブリル高次構造においてアミロイドβタンパク質（Ａβ）に対し選択性を有し、且つＩｇＧクラス及びＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４サブクラス又はこれらの組み合わせ又はこれらの突然変異体であり、高Ｆｃ受容体結合性及び低Ｃ１（Ｃ１ｑ）結合性を保有し、Ａβプロトフィブリルのクリアランスに有効で、及び炎症のリスクが低減された、高親和性の１０−７Ｍ、好ましくは１０−８Ｍ、さらには１０−９Ｍ未満又は１０−１０Ｍ若しくは１０−１１Ｍ未満の抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知、記憶及び行動障害を引き起こす進行性で不可逆的な神経変性障害である。ＡＤは高齢者人口における認知症の最も一般的な原因であり、６５歳超の人口のおよそ５％及び８０歳超の２０％が発症している。ＡＤは複数の認知機能における潜行性の発病及び進行性の悪化を特徴とする。神経病理としては、細胞外及び細胞内の双方の好銀性タンパク質沈着を伴う。細胞外の沈着物は老人斑と称され、主に異栄養性神経突起（腫脹し、変形した神経突起）に囲まれるアミロイドβタンパク質（Ａβ）からなる。この細胞外沈着物内のＡβは原線維状であることを特徴とし、βひだ状シート構造を伴う。この沈着物のＡβはある種の色素、例えばコンゴレッドで染色でき、原線維状の超微細構造を呈する。老人斑中の原線維状構造のＡβが備えるこれらの特徴が、一般名称としてのアミロイドの定義である。古典的な細胞内のＡＤ病変は神経原線維変化（ＮＦＴ）であり、これは高リン酸化微小管結合タンパク質τのよじれた鎖で構成されるペアードヘリカルフィラメント（ＰＨＦ）と呼ばれる繊維状構造からなる。脳において頻繁に見られる老人斑及び神経原線維変化の堆積が、死後に行われるＡＤ診断の基準である。ＡＤ脳はまた、肉眼的な脳萎縮、神経細胞損失、局所炎症（ミクログリオーシス及び星状細胞増加症）及びしばしば脳血管壁内に脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）も呈する。
【０００３】
Ａβペプチドの２つの型、Ａβ４０及びＡβ４２がＡＤ老人斑における主な型であるが、ＡＤに関連する脳血管アミロイドにおいてはＡβ４０が顕著な型である。酵素活性によりＡβは、健常及びＡＤ罹患の双方の被験者における全ての体細胞中でアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる大型タンパク質から継続的に形成される。β−及びγ−セクレターゼ活性を通じた２つの主要なＡＰＰ切断イベントによりＡβ産生が可能となる一方、α−セクレターゼと呼ばれる第３の酵素がＡβ配列を内側で切断することによりＡβ生成を妨げる（セルコエ（Ｓｅｌｋｏｅ）、１９９４年；エスター（Ｅｓｔｅｒ）、２００１年；米国特許第５６０４１０２号明細書）。Ａβ４２は４２アミノ酸長のペプチドであり、すなわちＡβ４０と比較してＣ末端で２つのアミノ酸分だけ長い。Ａβ４２は疎水性がより高く、且つＡβ二量体、Ａβ三量体、Ａβ四量体、Ａβオリゴマー、Ａβプロトフィブリル又はＡβフィブリルなどのより大型の構造のＡβペプチドへとより容易に凝集する（ジャレット（Ｊａｒｒｅｔ）、１９９３年）。Ａβフィブリルは疎水性且つ不溶性だが、その他の構造は全て疎水性が低く可溶性である。これらのより高度な分子構造のＡβペプチドは全て、例えば電子顕微鏡法によるそれらの生物物理学的及び構造的外観、及び例えばサイズ排除クロマトグラフィー／ウエスタンブロットでの分析によるそれらの生化学的特徴に基づき、個々に定義される。これらのＡβペプチド、特にＡβ４２は、寿命の間に種々のより高度な分子構造のＡβへと徐々に集合することとなる。ＡＤは年齢に大きく依存する障害であり、この集合プロセスが急速に生じるほど、生涯においてより早期に発症する。これが、ＡＤの主原因はＡＰＰ切断、Ａβ４２のレベル及びこれらのより高度な分子構造への集合であると主張するＡＤの「アミロイドカスケード仮説」の中核をなす。他の全てのＡＤ脳についての神経病理及び認知症などのＡＤの症状が、何らかの形でＡβ又はその集合体により引き起こされている。
【０００４】
Ａβは、種々の長さで、すなわち１−３９、１−４０、１−４２及び１−４３が、並びに種々の断片サイズで、すなわち１−２８及び２５−３５が存在し得る。ペプチドのＮ末端で切断が生じ得る。これらの全てのペプチドは凝集して可溶性中間体及び不溶性フィブリルを形成することができ、各分子型が特有の構造的高次構造及び生物物理学的特性を有する。例えば単量体Ａβ１−４２は４２アミノ酸長の可溶性且つ非毒性ペプチドであり、正常なシナプス機能に関与していることが示唆される。一定の条件下で、Ａβ１−４２は凝集して二量体、三量体、四量体、五量体、最大１２量体及びそれ以上のオリゴマー型となることができ、それぞれの物理化学的特性、例えば分子の大きさ、ＥＭ構造及びＡＦＭ（原子間力顕微鏡法）分子形状などはどれも異なる。より高い分子量の可溶性オリゴマーＡβ型の例がプロトフィブリル（ウォルシュ（Ｗａｌｓｈ）、１９９７年）であり、これは見かけの分子量が１００ｋＤａより大きく、且つ直径４〜１１ｎｍ及び長さ２００ｎｍ未満の曲線線形構造を有する。近年、Ａβプロトフィブリルなどの可溶性オリゴマーＡβペプチドが、海馬における記憶形成を反映すると考えられているシナプス可塑性の尺度である長期増強（ＬＴＰ）を損なうことが実証されている（ウォルシュ（Ｗａｌｓｈ）、２００２年）。さらに、オリゴマーの北極型（Ａｒｃｔｉｃ）Ａβペプチドが脳におけるＬＴＰに対し野生型Ａβより一層深刻な阻害作用を呈し、これはそれらのＡβプロトフィブリルを形成する強力な性質に起因するものと思われる（クリュバン（Ｋｌｙｕｂｉｎ）、２００３年）。
【０００５】
文献には、プロトフィブリルとは明らかに異なる他の可溶性オリゴマー型も記載されている。かかるオリゴマー型の１つがＡＤＤＬ（アミロイド由来拡散性リガンド）である（ランベルト（Ｌａｍｂｅｒｔ）、１９９８年）。ＡＦＭ分析によりＡＤＤＬは、ｚ軸に沿った４．７〜６．２ｎｍの主に小球状の型で、分子量が１７〜４２ｋＤａであることが明らかとなった（スタイン（Ｓｔｉｎｅ）、１９９６年）。別の型はＡＳＰＤ（アミロイドスフェロイド）と呼ばれるものである（ホシ（Ｈｏｓｈｉ）、２００３年）。ＡＳＰＤはＡβ１−４０の球状オリゴマーである。毒性試験から、１０ｎｍより大きい球状ＡＳＰＤは低分子型のものより毒性が高いことが示された（ホシ（Ｈｏｓｈｉ）、２００３年）。この見解は、早期発症型ＡＤを引き起こす北極型（Ｅ６９３）ＡＰＰ突然変異の最近の発見により支持されている（米国特許出願公開第２００２／０１６２１２９Ａ１号明細書；ニルスバース（Ｎｉｌｓｂｅｒｔｈ）ら、２００１年）。この突然変異はＡβペプチド配列の内側に位置する。このため突然変異保因者は、Ａβペプチドの変異体、例えば北極型Ａβ４０及び北極型Ａβ４２を生成することになる。北極型Ａβ４０及び北極型Ａβ４２は双方とも、より高度な分子構造、すなわちプロトフィブリルへとより一層容易に凝集し得る。従って、北極型突然変異の発症機序から、可溶性でより高分子のプロトフィブリルがＡＤを引き起こしているとともに、特異的な固有のエピトープ、すなわち「ＡＤ疾患エピトープ」を含むことが示唆される。
【０００６】
アルツハイマー病（ＡＤ）脳においては一般的に、実質及び血管壁に細胞外アミロイドプラークが所見される。このプラークはアミロイド（Ａβ３８−４３アミノ酸長の疎水性で自己凝集性のペプチドを含み、徐々に重合してプラーク沈着となる。可溶性Ａβオリゴマー種はアミロイドプラークそれ自体より疾患相関性が高いことが提言されている（マクリーン（ＭｃＬｅａｎ）ら、１９９９年；ナスランド（Ｎａｅｓｌｕｎｄ）ら、２０００年）。これらの前フィブリル中間体Ａβ種のなかで、オリゴマー型は試験管内及び生体内の双方において有害な生物学的作用を誘発することが示されており（ウォルシュ（Ｗａｌｓｈ）ら、２００２年）、従って疾患病因の中心的役割を果たすものであり得る。様々な分子サイズのオリゴマーＡβ種がいくつか知られている。重要なことには、Ａβの単量体型、オリゴマー型及びフィブリル型の高次構造は異なり、高次構造選択的な抗体の標的となり得る。主要なＡβ病原体の主体は不明であるものの、一部の証拠からは高分子量Ａβオリゴマーが特に神経毒性を有することを示唆する（ホシ（Ｈｏｓｈｉ）ら、２００３年）。
【０００７】
早期発症型ＡＤを引き起こす、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子における病原性突然変異についても記載されている。そのうちの１つがスウェーデン型ＡＰＰ突然変異（ムーラン（Ｍｕｌｌａｎ）ら、１９９２年）であり、これはＡβレベルの上昇を引き起こす。Ａβドメイン内に位置する他の北極型ＡＰＰ突然変異（Ｅ６９３Ｇ）は大型のＡβオリゴマーであるプロトフィブリルの形成を亢進することが分かっており、これらのＡβ中間体が特に病原性を有することが示唆される（（米国特許出願公開第２００２／０１６２１２９Ａ１号明細書；ニルスバース（Ｎｉｌｓｂｅｒｔｈ）ら、２００１年）。北極型ＡＰＰ突然変異の同定及びＡβプロトフィブリルについての毒性作用の解明では、ＡＤ発病におけるＡβオリゴマーに一層焦点が当てられている。
【０００８】
アルツハイマー病に対する治療方針としての免疫活性化は、（シェンク（Ｓｃｈｅｎｋ）ら、１９９９年）により最初に報告された。免疫化戦略の標的は、アルツハイマープラークにおいて所見されるフィブリル型のＡβであった。フィブリル化したＡβをワクチン（ＡＮ−１７９２）として使用した活性Ａβワクチン接種の最近の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験は、少数の患者における髄膜脳炎の発症により中止せざるを得なかった（ベイヤー（Ｂａｙｅｒ）ら、２００５年）。この研究において見られた副作用は、血管壁の原線維性アミロイドに対し反応する抗Ａβ抗体により引き起こされたものと見られた。ＣＡＡにおける原線維性アミロイドは血液脳関門（ＢＢＢ）にごく近接しており、従って抗原抗体反応によりＢＢＢに傷害が起こり、Ｔリンパ球のＣＮＳへの浸潤に至った可能性がある（フェイファ（Ｐｆｅｉｆｅｒ）ら、２００２年；ラッケ（Ｒａｃｋｅ）ら、２００５年）。そのうえ、参加患者のうちＡβワクチンに対する免疫応答を呈したのは少数のみであった。当該研究は早々に終了されたが、活性Ａβ免疫化はＡＤ患者の一部にしか有益でない可能性を含むように思われる。
【０００９】
ヒトＡβプロトフィブリルに対し選択的なモノクローナル抗体が記載されている（米国特許出願公開第２００２／０１６２１２９Ａ１号明細書）。純度が高く、且つ安定なヒトＡβプロトフィブリルを生成するためのこの方法は、北極型突然変異（Ｇｌｕ２２Ｇｌｙ）を有する合成Ａβ４２ペプチドの使用を伴う。この突然変異により免疫化及びＡβプロトフィブリル選択的抗体のハイブリドーマスクリーニングが促進される。重要なことは、この抗体は野生型Ａβプロトフィブリル及びＡβ−Ａｒｃプロトフィブリルの双方と結合する（ＰＣＴ／ＳＥ２００５／０００９９３号明細書）。
【００１０】
Ａβフィブリル（オヌアライン（Ｏ’Ｎｕａｌｌａｉｎ）、２００２年）、ミセルＡβ（カイエド（Ｋａｙｅｄ）、２００３年）、ＡＤＤＬ（ランベルト（Ｌａｍｂｅｒｔ）、２００１年）などの他のＡβ高次構造に関して選択的な抗体が記載されている。しかしながら、これらはどれもＡβプロトフィブリル選択性ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、改良型抗体、すなわちアルツハイマー病、ダウン症候群又は他の神経変性障害の予防、処置及び診断を改善するための、炎症のリスクが低減された、クラスＩｇＧ及びサブクラスＩｇＧ１又はＩｇＧ４若しくはそれらの組み合わせ又はそれらの突然変異体の高親和性（１０−７Ｍ未満）Ａβプロトフィブリル選択的抗体に関する。前記抗体は、古典的ハイブリドーマ技術及び抗体工学により開発されたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、オリゴマーＡβ型、すなわち「アルツハイマー疾患エピトープ」を構成するＡβプロトフィブリルを選択的に結合する抗体由来のＶＬ鎖及びＶＨ鎖上のＣＤＲ１−３領域の共通アミノ酸配列を開示し、Ｆｃ領域の修飾と組み合わせることで補体因子Ｃ１ｑ結合を低減し、補体の活性化及び炎症のリスクを低減する。
【００１３】
抗体の定常領域は多くの重要な機能を有し、特にＦｃ受容体及び補体因子Ｃ１ｑを結合する機能を有する。このＣ１ｑ結合機能が不活化されることで炎症反応が回避された。
【発明の効果】
【００１４】
要約すれば、この種類の高親和性プロトフィブリル選択的抗体は、他の既知の免疫療法的な治療様式と比較した場合、以下の特徴的な利点を有する。
１）高親和性により、疾患の原因であるＡβプロトフィブリルを標的とする。
２）補体因子Ｃ１ｑとの結合性が低いか、又は全くないことにより、炎症性副作用、すなわち髄膜脳炎のリスクが低減する。
３）高親和性抗体により、有効な処置に必要な臨床用量が低減される。
４）正確な投薬様式を提供する。
５）血管壁におけるＡβフィブリルへの結合、すなわちＣＡＡが少なく、炎症性副作用のリスクが低減する。
６）末梢において結合する抗体が少なく、ひいてはより多くの抗体が血液脳関門を通過し得るとともに脳内でのＡβオリゴマー型の結合及び除去に利用可能となり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の一態様は、ヒト野生型Ａβプロトフィブリルを結合するＣＤＲ領域の抗体共通アミノ酸配列の発見である（実施例１）。この発見は、治療用又は診断用として野生型ヒトＡβプロトフィブリルに対し高親和性及び高選択性を供する結合部位（ＣＤＲ領域）を定義するものである。免疫グロブリン（ＩｇＧ）分子の基本構造は、ジスルフィド架橋により共に結合する２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖を含む（図１）。軽鎖はλ又はκのいずれかであり、それぞれ約１１０アミノ酸残基の可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ）を有する。重鎖の有する可変領域（ＶＨ）は約１１０アミノ酸残基だが、定常領域（ＣＨ）は３００〜４００アミノ酸残基とはるかに大きく、ＣＨγ１、ＣＨγ２及びＣＨγ３領域又はドメインを含む。
【００１６】
定常領域（Ｆｃ）は補体系を活性化するとともに、感染性微生物又は外来／非自己抗原を貪食及び破壊するマクロファージ、ミクログリア及び好中球上でＦｃ受容体と結合する。これは抗体の治療原理の一部、すなわちＦｃ受容体介在性ミクログリア食作用及びＡβプロトフィブリルのクリアランスであることから、この機能は特に重要である。沈降仮説に従えば、他の抗体介在性クリアランス機序、すなわちＡβ抗体の非凝集特性及び末梢におけるＡβプロトフィブリルのクリアランスもまた作動している。重鎖及び軽鎖の可変領域は相補性決定領域又はＣＤＲと呼ばれる３つの超可変領域を含む。ＣＤＲ領域は約１３〜２３アミノ酸長の短い伸長部であり、ＶＬ及びＶＨ領域に位置する。抗体の１本の「腕」上の６つのＣＤＲ領域が、抗原を結合する「ポケット」を形成する。図１は、ＩｇＧ免疫グロブリン及びそのサブドメインの基本構造を示す。
【００１７】
本発明の別の態様は、高親和性のプロトフィブリル選択的抗体に関する。プロトフィブリルに対する１０−７Ｍ、好ましくは１０−８Ｍ、さらには１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、又は１０−１１Ｍ未満の範囲の親和性が記載される（実施例２）。これらの抗体は、親和性が１０−６Ｍの範囲の抗体と比較してより低用量で投与され得る点で有利である。これは、効果を実現するうえで少量の抗体しか必要ないため、注射により投与されるこれらの高親和性抗体が皮下に投与され得る点で有意義な臨床上の利点を有する。投与様式は皮下注射に限定されない。さらには、有効とするために必要な用量が少なくなることから、抗体の製造原価が低減されるであろう。
【００１８】
本発明の別の態様においては、抗体がＩｇＧクラスのものであり、血液脳関門を通過し得るため、治療用途に好適である。脳実質内でのＡβプロトフィブリルのクリアランスは、ミクログリア細胞によるＦｃ受容体介在性食作用により実現される。他の抗Ａβクリアランス機序も同様に作動するものと見られる。可溶性Ａβプロトフィブリルのこのクリアランスが、処置の中心的な機序である。Ａβプロトフィブリルは神経毒性が高く、疾患プロセスを惹起及び駆動すると考えられる。脳におけるＡβプロトフィブリルのクリアランスは有意義な臨床的価値を有する。異なるＡβ凝集型、すなわち二量体、三量体、四量体及びプロトフィブリル及びフィブリルを含むより高分子のオリゴマー型は平衡状態にあるため、Ａβプロトフィブリルの除去を介して、Ａβプロトフィブリルのクリアランスに加え、Ａβフィブリルを含む他のＡβオリゴマー型が間接的に低減されるであろう。Ａβフィブリルを含むプラークの低減の例が、高親和性プロトフィブリル選択的抗体（ｍＡｂ１５８）による処置後７２時間のアルツハイマートランスジェニックマウスモデル（ＡＰＰｓｗｅ）において示されている（実施例３）。従って、前記抗体によるＡβプロトフィブリルのクリアランスは他のＡβ凝集型又はオリゴマー型を間接的に低減するという利点もまた有するであろう。
【００１９】
本発明のさらに別の態様は、サブクラスＩｇＧ１の高親和性ヒトＡβプロトフィブリル選択的抗体であり、これは脳内のミクログリア細胞上に存在するヒトＦｃγＲＩ受容体に対し高親和性を有する。高親和性抗体はＡβプロトフィブリルの効率的なクリアランスをもたらすこととなり、有意義な治療的価値を有するものである。従って、他の免疫療法方針、例えば活性ワクチン接種又は他のＡβ型を標的とするＩｇＧ１サブクラスの他のモノクローナル抗体によるモノクローナル抗体処置などと比較した場合、この抗体はＣＮＳ及び末梢の双方においてＡβプロトフィブリルのクリアランスを示す。重要なことは、この処置はＡβプロトフィブリルなどの毒性の可溶性Ａβ種が高いレベルで存在する疾患過程の初期だけでなく、疾患過程の後期においても効果的であり得る。スウェーデン型及び北極型突然変異ＡＰＰｓｗｅａｒｃを示すトランスジェニックマウスモデルにおいては、高いレベルのオリゴマーＡβ型が記載されている（ロード・Ａ（Ｌｏｒｄ Ａ．）ら、２００６年）。
【００２０】
本発明のさらに別の態様においては、高親和性Ａβプロトフィブリル選択的抗体がＡβ凝集を低減又は阻害し、それにより脳内の可溶性オリゴマーＡβ型のレベルが低下し得る。
【００２１】
さらに、本発明の別の態様においては、高親和性Ａβプロトフィブリル選択的抗体がＡβのオリゴマー型、すなわちＣＮＳ外のＡβプロトフィブリルも同様に結合し、それにより前記Ａβ型の血液脳関門にわたる平衡は、前記Ａβ型のＣＮＳレベルがより低くなるようにシフトし得る（ドレナージ）。
【００２２】
上記で考察されるとおり、アルツハイマー患者を処置するためＡβフィブリルに対し選択的なＡβワクチン（ＡＮ−１７９２）を使用したエラン（Ｅｌａｎ）臨床研究は、結果として症例の６％に副作用、すなわち髄膜脳炎を生じた。脳実質内、また重要なことには血管壁内にも存在するアミロイドプラークの中核となるＡβフィブリルを標的とする方針は、結果として重篤な副作用を生じた。この副作用は、脳の血管壁において抗体がＣＡＡ（脳アミロイド血管症）と結び付き、炎症性のプロセスを開始したことにより引き起こされた可能性が最も高いと見られた。この重大な臨床的課題は、補体活性化活性の低下した改良型高親和性プロトフィブリル選択的抗体により回避される。この抗体は、副作用、すなわち髄膜脳炎のリスクが低減した、高いＡβプロトフィブリルクリアランス効果を保有するであろう。
【００２３】
本発明の別の態様においては、高親和性プロトフィブリル選択的抗体が低Ａβフィブリル結合性を有し（実施例２を参照）、ＣＡＡ中に存在するＡβフィブリルへの結合性が低いため、副作用のリスクが低減する。
【００２４】
本発明のさらに別の態様においては、高親和性Ａβプロトフィブリル選択的ＩｇＧ抗体が改変されることによりＩｇＧ１のＣＨ２ドメインと結合する補体因子Ｃ１ｑが低減するとともに補体活性化及び炎症リスクが低減する。この修飾はいくつかの異なる方法で行われ得る。一つの方法は、ＩｇＧ１定常領域のＣＨγ２ドメインを欠失させて、ＩｇＧ４由来の対応するドメイン又はＣ１ｑ結合を供するドメインの一部に交換したキメラ抗体の作成である。ＩｇＧ４はＣ１ｑを結合せず、従って補体カスケードを活性化しないことが十分に立証されている。これを実現するため、ＩｇＧ１上の高親和性Ｆｃ受容体ドメイン（ＣＨγ３）を、補体因子Ｃ１ｑに対する結合性を有しないＩｇＧ４ドメイン（ＣＨγ２）と組み合わせるような方法で、重鎖（ＣＨ）の定常領域が改変される。キメラ定常重鎖（ＩｇＧ１：ＣＨγ１、ＣＨγ２：ＩｇＧ４、ＣＨγ３：ＩｇＧ１）を含むこの新規抗体は、Ｆｃ受容体介在性食作用を通じたＡβプロトフィブリルの効率的なクリアランス、及び副作用、すなわち髄膜脳炎などの炎症リスク低減の、双方の重要な特性を有することとなる。
【００２５】
炎症リスクを低減するさらに別の方法は、抗体のオリゴ糖構造を変化させることであり、これにより補体因子Ｃ１ｑ結合性及び補体活性化が低減されることとなる。ヒトＩｇＧ１ではＡｓｎ−２９７における二分岐の複合型オリゴ糖の異なる構造が３０種類記載されている。ＣＨ２関連炭水化物の不在が、抗体の「ヒンジ」領域に高次構造上の変化を引き起こし、エフェクター分子との相互作用効果並びに補体活性化機能及びＣ１ｑ結合の減退を低減すると考えられている。
【００２６】
任意の他のアミノ酸に対するＡｓｎ−２９７の部位特異的突然変異誘発による高親和性ヒトＡβプロトフィブリル選択的抗体の修飾は、Ｃ１ｑ結合性の低いＦｃ受容体を保有する抗体を生成し、従って特に血液脳関門における炎症リスクが低減するであろう。抗体上でグリコシル化を修飾する代替例としては、酵素Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素Ｉが不活化された細胞型における抗体の発現がある。これによりＡｓｎ−２９７の炭水化物構造が変化した抗体が得られることとなる。限定はされないが、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の構造が形成される。この炭水化物修飾は、補体因子Ｃ１ｑ結合性を低減するとともに炎症を阻害するものである（ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ら、１９９８年）。あるいは、グリコシル化されたプロトフィブリル選択的抗体は、グリコシル化を阻害するツニカマイシンの存在下で抗体を発現する細胞を培養することにより実現し得る。この抗体は、補体活性化活性が変化していると同時にＦｃ受容体機能も変化しているであろう（レザーバロウ（Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ）ら、１９８５年）。補体活性化が低く、且つＦｃ受容体結合性が高い抗体を発現するクローンのスクリーニングにより、Ａβプロトフィブリルの高Ｆｃ介在性クリアランス及び低Ｃ１ｑ結合性を示すプロトフィブリル選択的抗体が生成されることとなる。
【００２７】
本発明のさらに別の態様は、ＡＤを処置又は予防するための、補体因子Ｃ１ｑの結合を低減又は阻害するような方法で補体因子Ｃ１ｑ結合部位が修飾されている、すなわちＰｒｏ３３１＞Ｓｅｒ３３１（スー（Ｘｕ）ら、１９９４年）の、ＩｇＧ１サブクラスの高親和性ヒトＡβプロトフィブリル選択的抗体である。ヒトＩｇＧ１の第３３１位におけるプロリン残基はまた、スレオニン若しくはグリシン又は任意の他の極性アミノ酸に換えてもよい。この修飾は、部位特異的突然変異誘発又はＤＮＡ欠失などの標準的な分子生物学的技術により実現され得る。
【００２８】
本発明のさらに別の態様は、ヒト組織、特に脳脊髄液、血液、尿又は唾液においてプロトフィブリルレベルを特異的に測定するための、アルツハイマー病の診断ツール又はバイオマーカーとしての高親和性ヒトＡβプロトフィブリル選択的ＩｇＧ抗体の使用である。ＣＳＦ又は血液中のヒトＡβプロトフィブリルのレベルは、アルツハイマー病に罹っていない対応する高齢者対照群と比較した場合、異なると見られる。アルツハイマー病の発症者は、ＣＳＦ又は血液中のＡβプロトフィブリルレベルが上昇していると見られる。従って、ＣＳＦ又は血液中のＡβプロトフィブリルレベルの測定により疾患の早期診断が行われ得る。これは、新規高親和性Ａβプロトフィブリル選択的抗体をサンドイッチＥＬＩＳＡ法と組み合わせることにより実現可能であり（実施例２Ａ）、ここではＡβプロトフィブリルが１０ｐＭレベルに至るまで測定されている。測定における他のＡβ型、例えばＡβフィブリル、Ａβ単量体及びＡβ断片（１−１６；１７−４０）などの干渉は、１０％以下である。
【００２９】
本発明はさらに、ヒト及び動物組織、例えば限定はされないが、脳脊髄液、血液、血清、尿及び脳組織といった組織中のＡβプロトフィブリルを測定するための高親和性プロトフィブリル特異抗体の使用に関し、アルツハイマー病についての可能な診断方法を提供する。これらの組織中並びに細胞培養物中のＡβプロトフィブリルを、抗Ａβプロトフィブリル抗体を使用して測定するための好適な方法は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロッティング又はドットブロッティングなどの免疫測定法である。本方法は、臨床治験における処置効果（プロトフィブリル低減）の追跡に好適であり得るとともにアルツハイマー病又はダウン症候群の診断検査として好適であり得る。
【００３０】
ＣＳＦ及び血液中のＡβプロトフィブリルレベルは非常に低いため、低レベルのＡβプロトフィブリルを計測可能とするために、ＥＬＩＳＡ法に基づく診断検査において高親和性Ａβプロトフィブリル選択的抗体を必要とする。近接連結（実施例４）（グルベルグ（Ｇｕｌｌｂｅｒｇ）、２００４年）若しくは類似の増幅系又はビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）若しくは類似の技術など、他の高感度方法を使用して感度を高めてもよい。近接連結技術は、分析物（この場合タンパク質）上の異なるエピトープに対して産生した抗体が、前記分析物上で互いに近づいて結合し得るという発見に基づく。前記異なる抗体がオリゴヌクレオチドと接合する場合、前記オリゴヌクレオチド間の距離は、連結オリゴヌクレオチドが連結成分を用いてオリゴヌクレオチド間に架橋を形成するうえで十分に短いものであろう。増幅成分もまた付加され、その上でＲＴ−ＰＣＲが実施され得る。この原理により、主体性及び標的タンパク質量を反映する増幅可能なＤＮＡ配列が生成される。この技術により亢進されたシグナル応答が得られ、ひいてはより低濃度の分析物を検出することが可能となる。
【００３１】
本発明者らは意外にも、修正版近接連結技術を同様にこのＡβプロトフィブリル特異抗体に使用することで、Ａβ単量体は検出せずに、低濃度の大型Ａβペプチド構造、すなわちＡβプロトフィブリルを検出し得ることを発見した。本発明者らは、プロトフィブリル高次構造のＡβペプチドが、本発明により、２個の抗体がプロトフィブリル上で互いに十分に近づいて結合可能となる構造（反復単位）を示すことを発見した。前記抗体がオリゴヌクレオチドと接合される場合、前記オリゴヌクレオチドは連結オリゴヌクレオチドを使用して架橋され得る。増幅成分を使用してＰＣＲが実施される。この原理により、主体性及び標的プロトフィブリル量を反映する増幅可能なＤＮＡ配列が、生成される（図４Ａを参照）。
【００３２】
近接連結又はその「ローリングサークル」と呼ばれる種類の技術は、高感度技術であるとともに特に、アルツハイマー病及び他の神経変性障害の診断に使用されるＡβプロトフィブリルなどの反復配列を伴う重合体構造の検出に非常に適している。
【００３３】
本発明はさらに、ヒト及び動物組織中のＡβプロトフィブリルの検出、局在決定及び定量の画像化における高親和性プロトフィブリル特異抗体の使用に関する。抗体は、限定はされないが、Ｉ１３１、Ｃ１４、Ｈ３又はガリウム６８といった放射性同位元素などの検出用放射性リガンドで標識され得るであろう。本方法は、アルツハイマー病又はダウン症候群の診断ツールとして好適であろう。
【００３４】
本発明のさらに別の態様は、獣医学における使用に特化した抗体種の作製である。概説される診断方法もまた、獣医学上の使用に好適である。
【００３５】
本発明の別の態様は、副作用を回避するため、すなわち治療薬又は診断薬として使用する際のヒトにおける前記抗体に対する免疫応答を回避するための、前記抗体のヒト化である。
【００３６】
さらに別の態様は、例えば、限定はされないがＰＢＳなどの、ヒト及び動物への投与に好適な生理緩衝液中の抗体の製剤である。抗体製品は安定性を高めるため凍結乾燥され得る。凍結乾燥製剤は、限定はされないが、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）などの賦形剤を含んで、凍結乾燥後の製品を安定化させ得る。
【００３７】
抗体製品は、抗菌剤を含み得る。
【００３８】
本発明に係る抗体又は断片は、前記ＣＤＲ領域及び／又はそのフレームワーク内にアミノ酸欠失、置換及び挿入を示し得る。挿入又は置換されるアミノ酸はまた、抗体の親和性及び特異性がなお損なわれていないことを条件に、アミノ酸誘導体であってもよい。
【実施例】
【００３９】
以下の実施例は例示のために提供されるが、本発明をこれらの具体例に限定することを意図したものではない。
【００４０】
実施例１
ヒト野生型Ａβプロトフィブリル選択的モノクローナル抗体がクローニング及び配列決定された。重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列が表１に示される。ＣＤＲ領域１〜３の位置には下線が引かれているとともに、これらは表２及び３にも同様に示される。ＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、「アルツハイマー疾患エピトープ」を構成するヒト野生型Ａβプロトフィブリルを結合するための構造基盤を形成する。
【００４１】
高親和性プロトフィブリル特異抗体ＢＡ９／１５８についてのＶＬ鎖及びＶＨ鎖のＣＤＲ領域１〜３のアミノ酸配列が、表１、２及び３に示される。他のプロトフィブリル選択的抗体（ＢＡ２、ＢＡ３、ＢＡ４及びＢＡ７）の配列決定データがＣＤＲ領域の代替的アミノ酸配列を提供するが、これらに限定されない。ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＣＤＲ１−３領域のアミノ酸配列が組み合わされて分子「ポケット」を作り、これが高い親和性及び特異性でヒトＡβ野生型プロトフィブリルを結合する。この「ポケット」が「アルツハイマー病エピトープ」の構造基盤を形成する。ＣＤＲアミノ酸配列長の変動がＶＨ鎖及びＶＬ鎖の双方に観察され、ヒトＡβプロトフィブリルとの結合に適合する（表２及び３）。ＣＤＲ領域が短いほど、提供される抗体の結合ポケットの３次元構造はより限定的となり、長いほど適応性が高くなる。
【００４２】
本願出願人は、限定はされないが、表１、２及び３に示されるとおりのＣＤＲ配列、並びに表４及び５に示されるとおりのプロトフィブリル特異抗体についての、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の「マウスフレームワーク」領域、すなわちＣＤＲ領域外、並びにヒトＶＬ及びＶＨフレームワーク領域のアミノ酸配列を主張する。
【００４３】
高親和性プロトフィブリル特異抗体ＢＡ９／１５８に由来するＶＬ鎖及びＶＨ鎖のＶＬ及びＶＨ領域１〜３のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、表４及び５に示される。
【００４４】
表１、２及び３に示されるもの以外のＣＤＲ領域における他のアミノ酸置換は、ヒト野生型Ａβプロトフィブリルとの高親和性及び高特異性結合を伴うことで適合性を有する。ＣＤＲ領域の特定の位置に極性アミノ酸が存在する場合、当該の特定アミノ酸は、Ａβプロトフィブリルとの高い親和性及び特異性結合が保有又は改良されながら、別の極性アミノ酸に置換され得る。同様に、ある位置に非極性又は負若しくは正に帯電したアミノ酸が存在する場合、当該アミノ酸は同一群由来の類似のアミノ酸に置換され得る。
【００４５】
また、特定の１個又は複数のアミノ酸は、ＣＤＲ領域における任意の位置で、抗体と類似の機能及び構造を供する機能的等価物に交換され得る。
【００４６】
実施例２．ＥＬＩＳＡによる高親和性ヒトＡβ野生型プロトフィブリル（ｐｒｏｆｉｂｒｉｌ）選択的モノクローナル抗体の特性決定
実施例２は、サンドイッチＥＬＩＳＡにより計測した場合、Ａβ単量体との交差反応が２００〜１０００倍低く、且つＡβフィブリルとの交差反応が４０倍未満の高親和性プロトフィブリル選択的抗体を示す（図２Ａ）。競合ＥＬＩＳＡ実験から、抗体はヒトＡβ４２野生型プロトフィブリルに対し強力な親和性を有するが、ＡβペプチドのＮ末端部分及びＡβ単量体に対しては非常に弱い親和性しか有しない。ＡβのＣ末端断片との結合は観察されなかった（図２Ｂ）。さらにこの抗体は、メジン又はトランスサイレチンのような他の種類のアミロイドとは交差反応しない。さらにこの抗体は、Ａβの豊富な前駆体であるヒトＡＰＰを認識しない。
【００４７】
図２ＡにサンドイッチＥＬＩＳＡが示される。抗体１５８がウェル内に被膜され、続いて濃度を上昇させながら異なるＡβ型がウェルに添加された。結合したＡβ型の計測が、ビオチン化ｍＡｂ１５８及びＨＲＰ標識ストレプトアビジンを添加することにより行われた。製造者により推奨される手順に従い発色が計測された。
【００４８】
図２Ｂには、競合ＥＬＩＳＡが示される。ＥＬＩＳＡプレートをヒトＡβプロトフィブリルで被膜した。続いて抗体１５８が異なるＡβ型を増量させながらインキュベートされた（競合法）。インキュベーション混合物をマイクロタイタープレートウェルに添加して、遊離抗体をウェル中の固定プロトフィブリルと結合させた。結合した１５８抗体が標準的手順を使用して第２の抗体により計測された。
【００４９】
実施例３
高親和性Ａβプロトフィブリル選択的抗体の有効性が、アルツハイマートランスジェニックマウスモデル（ＡＰＰｓｗｅ）において急性脳内注射により測定された。有効性評価に使用されるトランスジェニックマウスは、スウェーデン型突然変異（ＡＰＰＳｗｅ）に伴うヒトＡＰＰを発現する。このパラダイムにおいて、抗体は脳実質のプラークリッチ領域に直接注射され、神経病理に対する影響が７２時間後に評価される（ウィルコック（Ｗｉｌｃｏｃｋ）ら、２００３年）。他の研究では、抗Ａβ抗体の直接施用により結果として生体内でアミロイド沈着物の急速なクリアランスが生じることが示されている（バクスカイ（Ｂａｃｓｋａｉ）ら、２００１年；ブレンザ（Ｂｒｅｎｄｚａ）ら、２００５年）。高親和性Ａβプロトフィブリル選択的抗体の注射は、ＡＰＰＳｗｅマウスモデルにおいて有意なプラーク低減をもたらす（図３）。
【００５０】
図３において、トランスジェニックマウスモデル（ＡＰＰｓｗｅ）における高親和性プロトフィブリル選択的抗体の治療有効性が試験された。Ａ：１４月齢のＡＰＰＳｗｅトランスジェニックマウスが頭蓋内にＰＢＳを、及びＢ：高親和性プロトフィブリル選択的抗体（１５８）を１μｇ／μｌ注射され、及び注射後７２時間で検査された。対照側（Ａ；矢印）と比較した場合、注射部位（Ｂ；矢印）の近傍の鉤状回における著しいＡβ負荷のクリアランスが注目される。
【００５１】
実施例４．Ａβプロトフィブリルを計測するための高親和性プロトフィブリル選択的抗体と組み合わせた近接連結
ヒト野生型Ａβプロトフィブリルが１０ｐＭの範囲に至るまで検出された一方、Ａβ単量体調製物は全く検出されなかった。超高感度近接連結法及び高親和性抗体の組み合わせが特に有利であるのは、アルツハイマー病及び他のタンパク質「凝集」疾患、例えばプリオン病、クロイツフェルトヤコブ病、アミロイドーシス及びパーキンソン病などを診断する際に特に好適なオリゴマー型の分析物のみを測定する系を提供するためである。
【００５２】
図４において、ヒトＡβプロトフィブリルが近接連結技術によりｐＭレベルで計測される。近接連結測定法（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）の方法説明を以下に示す（グルベルグ（Ｇｕｌｌｂｅｒｇ）ら、２００４年より）：ステップ１、近接プローブ対との試料のインキュベーション（約１時間）；ステップ２、連結に必要な全成分の添加及び定量的ＰＣＲによる検出（約５分間の連結時間）。測定においては高親和性プロトフィブリル選択的モノクローナル抗体が使用された；ステップ３、定量的ＰＣＲ（約２時間）。合成Ａβ単量体及びＡβプロトフィブリル調製物が希釈され、それらの反応性について上記の近接連結測定法で試験された。
【００５３】
実施例５．ｍＡｂ１５８は一般的なアミロイドエピトープを認識しない。
既に報告されているＡβ高次構造依存性抗体は他のアミロイド形成性タンパク質のオリゴマー及びフィブリルを結合することが示されており、全てのアミロイド凝集について共通のエピトープの存在が示唆される。Ａβ以外のアミロイド形成性タンパク質からプロトフィブリルを生成する技術的困難から、代わりにｍＡｂ１５８が異なるアミロイドフィブリルに対し試験された。これらの実験にはドットブロットアッセイが使用されたが、これは抗体抗原反応が溶液中で生じる場合、阻害ＥＬＩＳＡはフィブリルなどの不溶性抗原に好適でないためである。しかしながら、ドットブロットアッセイは、様々なＡβ型についての抗体特異性を評価する、すなわちプロトフィブリル（ｐｒｏｆｉｂｒｉｌ）及びフィブリルに対する選択性の差異を計測するうえでは好適でない。メジンのフィブリルである膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）及びα−シヌクレインがニトロセルロース膜上に固定され、天然の高次構造が維持された。ｍＡｂ１５８は、Ａβフィブリル以外のどのアミロイドとも反応性を示さなかった（図５Ａ）。ｍＡｂ１５８のＡβフィブリルに対する結合性は、Ａβプロトフィブリルエピトープの一部がＡβフィブリル構造中にも存在することを示唆する。陽性対照としては、抗体６Ｅ１０（Ａβ）、ｐＡｂ１７９（メジン）、ｐＡｂＡ１１０（ＩＡＰＰ）及びｍＡｂ２１１（α−シヌクレイン）が使用された（図５Ｂ）。代表的ブロットは反復実験（ｎ＝３）から示した。
【００５４】
ｍＡｂ１５８はＡＰＰを結合しない
ＡＰＰ及び可溶性ＡＰＰ断片のレベルは一般に、ＣＳＦ及び脳ホモジネートなどの生体試料中でＡβのレベルを上回り、従ってＡβ−抗体のＡＰＰに対する交差反応性はＡＰＰと結合することにより処置を阻害し、結果としてＡβプロトフィブリル及び／又はＡβオリゴマーを結合及び除去するための遊離抗体が少なくなる可能性がある。また、これはＡβのサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイによる生体試料中のＡβプロトフィブリルの計測を妨げ得る。ｍＡｂ１５８が未変性ＡＰＰと結合するかどうかを解明するため、免疫沈降実験が実施された。ＨＥＫ細胞培養培地（偽処理、ＡＰＰＳｗｅ及びＡＰＰＡｒｃ−Ｓｗｅ）及びマウス脳ホモジネート（非トランスジェニック、ＡＰＰＳｗｅ及びＡＰＰＡｒｃ−Ｓｗｅ）をｍＡｂ１５８又は６Ｅ１０で免疫沈降させた後、検出抗体として６Ｅ１０を伴う変性ウエスタンブロットを行った（図５Ｃ）。図５Ｃに見られるとおり、ｍＡｂ１５８は細胞培養培地由来のαＡＰＰ又はマウス脳ホモジネート由来の完全長ＡＰＰを免疫沈降させなかったが、予期されたとおり、６Ｅ１０は免疫沈降させた。対照として使用された合成Ａβプロトフィブリルは双方の抗体により同様に十分に免疫沈降した（図５Ｃ）。代表的なブロットは反復実験（ｎ＝３）から示した。
【００５５】
実施例６．Ａβプロトフィブリル特異的サンドイッチＥＬＩＳＡの確立。
生体試料中のＡβプロトフィブリルの計測を可能にするため、ｍＡｂ１５８を捕捉抗体及び検出抗体の双方として伴うサンドイッチＥＬＩＳＡが確立された。このアッセイは１ｐＭの検出限界及び最高２５０ｐＭの線形範囲でＡβプロトフィブリルを計測する（図６Ａ、線は標準曲線の線形回帰を示す）。標準曲線において使用されるＡβプロトフィブリルのサイズに関しては不確実であるため、濃度１ｐＭは１個のＡβ単量体の分子量（４５１４ｇ／ｍｏｌ）に基づくが、プロトフィブリルの分子量は少なくとも１００ｋＤａと推定されていることから、モルで計算されるＡβプロトフィブリルの検出限界は５０ｆＭという低さであり得る。ＡβＡｒｃプロトフィブリルの標準曲線から得られるシグナルは野生型Ａβプロトフィブリルより少なく、これはおそらくＡβプロトフィブリルのサイズの差に起因する（図６Ａ、６Ｂ）。合成ＬＭＷ−Ａβ（低分子量Ａβ）を滴定した。用語「低分子量Ａβ」は、分子量が約４〜１２ｋＤａのＡβの単量体、二量体及び三量体を意味する。Ａβプロトフィブリル及びＡβ１−１６を使用してＥＬＩＳＡの高次構造特異性が検証され（図６Ｂ）、ここでは凝集しないことを予期して親水性Ａβ１−１６ペプチドが使用された。２つの同一の抗体からなるＥＬＩＳＡでは、シグナルを生成するために少なくとも二量体のタンパク質が必要とされるが、予想通り、Ａβ１−１６はｍＡｂ１５８サンドイッチＥＬＩＳＡではμＭ濃度でさえ検出されなかった（図６Ｂ）。ＬＭＷ−Ａβ及びＡβプロトフィブリルを、凝集したＡβを単量体に解離させることが知られる７０％のギ酸（ＦＡ）で前処置すると、サンドイッチＥＬＩＳＡのシグナルは消失した（データは示さず）。従って、高ｎＭ濃度でのＬＭＷ−Ａβの検出（図６Ｂ）はおそらく、凝集量の少ないペプチド調製物に起因する。
【００５６】
過剰量の単量体Ａβ、ホロＡＰＰ及びＡＰＰ断片は、生体試料中に天然に存在するが、捕捉抗体被膜の結合部位を占有し、ひいてはプロトフィブリルの結合を阻害することによりＡβプロトフィブリル分析を妨げる可能性がある。この問題が、Ａβ１−１６の過剰量を一定濃度のＡβプロトフィブリル（５０ｐＭ、単量体単位としての表現）まで増加させながら添加し、それをｍＡｂ１５８ＥＬＩＳＡ及び６Ｅ１０−６Ｅ１０サンドイッチＥＬＩＳＡの双方で分析することにより調査された（図６Ｃ）。Ａβプロトフィブリルと比較したとき、モルで５００，０００倍の過剰量のＡβ１−１６はｍＡｂ１５８サンドイッチＥＬＩＳＡでの計測を妨害しなかったが、これはＡβ１−１６が捕捉抗体と結合しにくいことから予期されたとおりであった。対照的に、５００倍の過剰量のＡβ１−１６は６Ｅ１０−６Ｅ１０ＥＬＩＳＡにおけるシグナルを減少させるのに十分であったが、ここでＡβ１−１６は高親和性で捕捉抗体と結合した（図６Ｃ）。そのうえ、合成Ａβプロトフィブリルが偽処理のＨＥＫ細胞培養培地又は非トランスジェニックマウス脳ホモジネートに添加されると、９０％のシグナルが回復した（データは示さず）。
【００５７】
実施例７．生体試料中のＡβプロトフィブリルの計測
北極型突然変異を保因する細胞及びマウスモデルにおいてＡβプロトフィブリルの存在が示唆されているが、現在のところ生体試料中のＡβプロトフィブリルを直接測定する方法はない。従ってｍＡｂ１５８サンドイッチＥＬＩＳＡはまず初めに、かかる細胞及びマウスモデルにおいてＡβプロトフィブリルレベルを計測するとともにそれらをこのＡβ内突然変異を有しないモデルと比較する機会を提供する。スウェーデン型突然変異のみを保因する細胞及びマウス由来の試料が野生型Ａβプロトフィブリル標準曲線と比較された一方、北極型突然変異を伴うＡβを発現する細胞及びマウス由来の試料がＡβＡｒｃプロトフィブリル標準曲線（図６Ａ）と比較された。この測定において計測される全てのＡβを確実に溶解状態にするとともに、Ａβフィブリルからの干渉の可能性を一切排除するため、全試料が分析前に５分間、１７，９００×ｇで遠心された。一時的に導入されたＡＰＰＳｗｅ及びＡＰＰＡｒｃ−ＳｗｅＨＥＫ細胞からの細胞培地群が分析され、偽処理のＨＥＫ細胞培養培地と比較された。標準曲線（図６Ａ）からＡβプロトフィブリルレベルが３回の平均値として計算された後ＡＰＰレベルに対し正規化され、導入レベルの差が補正された（ステン（Ｓｔｅｎｈ）ら）。ＡＰＰＡｒｃ−ＳｗｅＨＥＫ細胞培養培地中のＡβプロトフィブリル濃度は２８ｐＭ（±２）であり、ＡＰＰＳｗｅに見られた８．２ｐＭ（±０．３）より有意に高かった（ｐ＜０．０００１）（図７Ａ）。偽処理の培地中ではＡβプロトフィブリルは検出できなかった。Ａβプロトフィブリルのレベルもまた、プラーク及び神経細胞内のＡβ病理の双方を伴う１０月齢のＡＰＰＡｒｃ−Ｓｗｅ及びＡＰＰＳｗｅトランスジェニックマウス由来の脳において計測された（ロード（Ｌｏｒｄ）ら）。脳はＴＢＳ中でホモジナイズされたうえで、分析に先立ち可溶性Ａβ画分を回収するため遠心された。細胞培養培地を使用した分析と同様、ＡβプロトフィブリルレベルはＡＰＰＡｒｃＳｗｅトランスジェニックマウス脳において３９７ｐＭ（±５９）及びＡＰＰＳｗｅトランスジェニックマウス脳において１０８ｐＭ（±１４）と、群間で有意に異なった（ｐ＝０．００５）（図７Ｂ）。
【００５８】
上述の図（図６及び７）における試料数は、偽処理の細胞（ｎ＝３）及びＡＰＰＳｗｅ（ｎ＝８）を一時的に導入したもの及びＡＰＰＡｒｃ−Ｓｗｅを一時的に導入したもの（ｎ＝１１）であった。ＡＰＰＡｒｃ−Ｓｗｅ培地中のＡβプロトフィブリルのレベルはＡＰＰＳｗｅ培地中より約９倍高かった一方、偽処理の培地からはシグナルは得られなかった（Ａ）。非トランスジェニックマウス脳ホモジネート（ｎ＝６）のＴＢＳ可溶性画分中のＡβプロトフィブリルレベルの計測値が、トランスジェニックマウス（ＡＰＰＳｗｅ、ｎ＝３、及びＡＰＰＡｒｃ−Ｓｗｅ、ｎ＝６）と比較された（Ｂ）。細胞培養培地と同様、ＡＰＰＡｒｃ−ＳｗｅマウスのＡβプロトフィブリルレベルはＡＰＰＳｗｅマウスのものより７倍高かった。エラーバーは±ＳＥＭを示す。
【００５９】
実施例８．ｍＡｂ１５８は腹腔内投与後のＡＰＰｓｗｅａｒｃトランスジェニックマウス中のＡβプロトフィブリル及び総Ａβを有意に低下させる
ｍＡｂ１５８（１２ｍｇ／ｋｇ）が９〜１０月齢のＡＰＰｓｗｅａｒｃマウスに対し１８週間にわたり１週間に１回、腹腔内注射された。研究後、脳が単離され、ＴＢＳ中でホモジナイズした後遠心にかけて不溶性物質を沈降させた。不溶性物質はギ酸中で可溶化された。従って、マウス脳からは２つの画分、すなわちＴＢＳ画分及びギ酸画分が得られた。ＴＢＳ画分中のＡβプロトフィブリルレベルがＥＬＩＳＡにより測定された。プラセボ群と比較してｍＡｂ１５８処置群にはＡβプロトフィブリルの有意な低減が見られた（図８）。図８は、ｍＡｂ１５８又はプラセボのいずれかによる処置後４ヶ月のＡＰＰｓｗｅａｒｃトランスジェニックマウス脳ＴＢＳ抽出物中のＡβプロトフィブリルレベルを示す。
【００６０】
ギ酸画分中の総ＡβがＥＬＩＳＡにより測定された（ギ酸を使用して全てのＡβ型が可溶化されたことにより、全てのＡβ型が検出可能となった）。プラセボ群と比較して処置群には総Ａβの有意な低減が観察された（図９）。図９は、ｍＡｂ１５８又はプラセボのいずれかによる処置後４ヶ月のＡＰＰｓｗｅａｒｃトランスジェニックマウス脳ギ酸抽出物中の総Ａβレベルを示す。
【００６１】
実施例９〜１１
【００６２】
【表Ａ】
【００６３】
物質
【００６４】
【表Ｂ】
【００６５】
【表Ｃ】
【００６６】
【表Ｄ】
【００６７】
【表Ｅ】
【００６８】
【表Ｆ】
【００６９】
実施例９−１５８抗体のＤＮＡ配列
９．１−ＲＮＡ調製
マウスハイブリドーマ１５８のスナップ凍結細胞ペレット（ラベル付きバイアル０６０８２４＃１５８ ５×１０６細胞）が、２００６年１０月３日にＴＡＧに入れられた。これらの細胞は切断まで凍結貯蔵され、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮｅａｓｙミディキットを使用して製造者の実験手順に従いＲＮＡが単離された。
【００７０】
９．２−第一鎖合成
約５マイクログラムの１５８ＲＮＡが逆転写に供され、アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）第一鎖合成キットを使用して製造者の実験手順に従い１５８ｃＤＮＡが産生された−これが反復されることにより３つの個別のｃＤＮＡ産物（ラウンド１、２及び３）が生成され、ＲＴ反応によるＤＮＡ突然変異を防いだ。
【００７１】
９．３ １５８免疫グロブリンｃＤＮＡのクローニング
ハイブリドーマ１５８ｃＤＮＡがＰＣＲにより別個の２３反応において増幅された。免疫グロブリンκ鎖可変領域（ＶＫ）ｃＤＮＡが、１１個のＶＫプライマー（ＭＫＶ１〜１１）をκ定常領域プライマーＭＫＣ（表６）と組み合わせて使用して増幅された。同様に、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）ｃＤＮＡがＰＣＲにより、１２個の異なるＶＨプライマー（ＭＨＶ１〜１２）を４個のＩｇＧ定常領域プライマーの混合物（ＭＨＣＧ１／２ａ／２ｂ／３：表７）と組み合わせて使用して増幅された。
【００７２】
初回分のＩｇＨ−ＰＣＲ反応の結果は、ＭＨＶ５プライマーを使用した単一増幅産物であった。他の１１個のプライマー対はどれもＰＣＲ産物をもたらさなかった。オリゴヌクレオチドプライマーＭＨＶ５＋（ＭＨＣＧ１／２ａ／２ｂ／３混合物）によりプライミングされたＰＣＲ反応の産物が、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニング（登録商標）キットを使用してｐＣＲ２．１（登録商標）−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターに連結された。初回分のＩｇＫ−ＰＣＲ反応の結果は、プライマーＭＫＶ１及びＭＫＶ２をＭＫＣと共に使用した２個の単一増幅産物であった。他の９個のプライマー対は産物を生成しなかった。オリゴヌクレオチドプライマーＭＫＶ１又はＭＫＶ２＋ＭＫＣによりプライミングされたＰＣＲ反応の産物が、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニング（登録商標）キットを使用してｐＣＲ２．１（登録商標）−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターに連結された。
【００７３】
連結されたベクターで形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細菌が、ＬＢ／アンピシリン／Ｘ−ｇａｌ寒天プレート上で、寒天グリッド上のＰＣＲスクリーニング混合物中へと選び取ることによりクローニングされた。クローニングされたプラスミドインサートがＰＣＲ増幅によりスクリーニングされた。ＰＣＲ産物はゲル電気泳動され、及びサイズ補正されたＰＣＲ増幅産物（約５００ｂｐ）を産生するクローンが同定された。各クローンの一晩培養物（５ｍｌ）が、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット実験手順を使用して切断され、ＤＮＡプラスミドミニプレップが産生された。
【００７４】
９．４−ｃＤＮＡ配列決定
ＲＴ−ＰＣＲ、クローニング、及びＤＮＡ配列解析の完全サイクルが反復され、各免疫グロブリン鎖についての３つの完全に独立した配列情報を得た。各々独立したセットのＲＴ−ＰＣＲ反応からのプラスミドクローンが、１２１２及び１２３３プライマー（表１０）を使用して双方向で配列決定された。プラスミドがＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーターｖ３．０サイクル・シーケンシング・レディ・反応キット（ＡＢＩ）を使用して配列決定され、ＧｅｎｅＡｍｐ９６００ＰＣＲ機上でサイクルに付され、及びＡＢＩ３１０キャピラリシーケンサー上で解析された。
【００７５】
９．５−１５８ＶＫ ＤＮＡ配列
ＰＣＲプライマーＭＫＶ２及びＭＫＣを使用して第一鎖ｃＤＮＡラウンド１及び２で生成されたＶＫクローンの配列は、ＭＯＰＣ−２１、ＳＰ２及びＡｇ８などの骨髄腫融合パートナーに由来する無菌κ転写産物と同一であった。これは無菌転写産物である。ＰＣＲプライマーＭＫＶ１及びＭＫＣを使用して第一鎖ｃＤＮＡラウンド１〜３上で生成されたＶＫクローンの共通配列（１５８ＶＫ）が表１１に示される。これは機能上の再構成である。表１１は、表１、４及び５に示される配列といくらかの相違を示す。これらの相違は、ＰＣＲプライマーが位置したＦＷ１領域にある。本願出願人のプライマーによりコードされなかった、１５８ＶＫにおけるリーダーの断片と最も同一性の高いマウスＶＫリーダー配列は、Ｋ５．１＃であった（表１２）。＃Ｋ５．１シグナル配列を正確に切断するシグナルペプチドの予測が、予測プログラムにより行われた。最も可能性が高いと予測された切断部位は、正確にアミノ酸残基１９と２０との間であった（表１３）。キメラ１５８ＶＫタンパク質及びＤＮＡ配列が表１４に示される。
【００７６】
９．６−１５８ＶＨ ＤＮＡ配列
ＰＣＲプライマーＭＨＶ５及びＭＨＣＧ１／２ａ／２ｂ／３混合物を使用して第一鎖ｃＤＮＡラウンド１〜３で生成されたＶＨクローンの共通配列（１５８ＶＨ）が、表１５に示される。１５８ＶＫと同様、表１、４及び５に示されるＦＷ１配列とはいくらか異なる。本願出願人のプライマーによってはコードされなかった、リーダーの断片と最も同一性の高いマウスＶＨリーダー配列は、ＮＬ−１であった（表１６）。
【００７７】
実施例１０−キメラ発現ベクターの構築
キメラ発現ベクターの構築には、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位及びコザック配列の前方での、好適なリーダー配列のＶＨ及びＶＫへの付加が伴う。コザック配列（表８）により可変領域配列の効率的な翻訳が確実となる。これはリボソームが翻訳を開始し得る正確なＡＵＧコドンを定義するとともに、最も重要な塩基は第−３位、ＡＵＧ開始上流のアデニンである。リーダー配列は、Ｋａｂａｔデータベース内で最も類似したマウスリーダー配列として選択される。これらの付加は、順方向プライマー（表９）内でコードされる。さらには、キメラ発現ベクターの構築には、天然ＡｐａＩ制限部位に至り、１５８のＪ領域の３’末端と隣接する、ヒトγ１定常領域の５’断片の導入が伴う。ＣＨは挿入されたＶＨ配列の下流の発現ベクター内でコードされるが、Ｖ−Ｃイントロンが欠如している。軽鎖について、天然スプライスドナー部位（表８）及びＢａｍＨＩ部位が、Ｖ領域の下流に付加される。スプライスドナー配列は、ＶＫの定常領域へのインフレーム付着が必要なκＶ：Ｃイントロンのスプライシングを円滑にする。マウスＶＨ及びＶＫ遺伝子が解析され、不要なスプライスドナー部位、スプライス受容部位、コザック配列がいずれも、及び機能性の全抗体のサブクローニング及び／又は発現を後に干渉し得る任意の追加的なサブクローニング制限部位の存在について同定された。この場合、何も見つからなかった。
【００７８】
１０．１−発現ベクター
発現ベクターｐＫＮ１００、及びｐＧ１Ｄ２００のプラスミドＤＮＡ調製物が、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）マキシキットを使用して製造者の実験手順に従い精製された。ＴＯＰ１０細菌の培養物５００ｍｌ由来の、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）プラスミドミディ及びマキシキットを使用したプラスミドＤＮＡ精製物にいずれかのベクターが導入された。ベクターマップが図１０及び１１に示される。
【００７９】
１０．２−軽鎖キメラ化プライマー
マウスリーダー配列Ｋ５．１＃がキメラ１５８ＶＫの設計に組み込まれた。プライマーは、この完全リーダーと、ｐＫＮ１００発現ベクター（表９）へのクローニング用の末端制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩを備える１５８ＶＫとを含有するＰＣＲ産物を生成するよう設計された。順方向プライマー１５８ｖｌは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位；コザック部位及びＫ５．１＃リーダー配列を導入する。逆方向プライマー１５８ｖｌｒｅｖは、スプライスドナー部位及びＢａｍ ＨＩ制限部位を導入する。
【００８０】
１０．３−重鎖キメラ化プライマー
リーダー配列ＮＬ−１がキメラ１５８ＶＨの設計に組み込まれた。プライマーは、このリーダーと、ｐＧ１Ｄ２００発現ベクターへのクローニング用の末端制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩを備える１５８ＶＨ領域とを含むＰＣＲ産物を生成するよう設計された。これらは表９に示される。順方向プライマー１５８ｖｈは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位；コザック翻訳開始部位及びＮＬ−１リーダー配列を導入する。逆方向プライマー１５８ｖｈｒｅｖは、γ１Ｃ領域の５’末端及び天然ＡｐａＩ制限部位を導入する。ＶＫのＫ５．１リーダー配列についてのシグナルペプチド切断部位の予測が表１７に示される。
【００８１】
１０．４−キメラ１５８ＶＨ構築物、ｐＧ１Ｄ２００１５８ＶＨの生成
１５８ＶＨ ＤＮＡ断片がプライマーの１５８ｖｈ及び１５８ｖｈｒｅｖ（表９）で増幅された。４５０ｂｐ（約）のＰＣＲ産物がベクターｐＣＲ２．１にＴ−Ａ連結され、これを使用して化学的にコンピテントＴＯＰ１０細菌が形質転換された。クローンが然るべき挿入サイズにより選択され、１２１２プライマー（表１０）を使用して配列決定された。的確な発現インサートがｐＧ１Ｄ２００発現ベクターにサブクローニングされ、的確なサブクローンが、プライマーＢＤＳＨ６１Ｒ（表１０）を使用したＤＮＡ配列決定により選択された。このクローンを２００ｍｌの培養液中で成長させ、キアゲン・マキシキットを使用して製造者の実験手順を用いてプラスミドＤＮＡを産生した。キメラ１５８ＶＨタンパク質及びＤＮＡ配列が表１８に示される。
【００８２】
１０．５−キメラ１５８ＶＫ構築物、ｐＫＮ１００１５８ＶＫの生成
１５８ＶＫ ＤＮＡ断片がプライマー１５８ｖｌ及び１５８ｖｌｒｅｖ（表９）で増幅された。４５０ｂｐ（約）のＰＣＲ産物がベクターｐＣＲ２．１にＴ−Ａ連結され、これを使用して化学的にコンピテントなＴＯＰ１０細菌が形質転換された。クローンが然るべき挿入サイズにより選択され、１２１２プライマー（表１０）を使用して配列決定された。的確なクローンがｐＫＮ１００発現ベクターにサブクローニングされた。正しいサブクローンが、挿入サイズについてのスクリーニング及びプライマーＨｕ−Ｋ２（表１０）を使用したＤＮＡ配列決定により選択された。このクローンを２００ｍｌの培養液中で成長させ、キアゲン・マキシキットを使用して製造者の実験手順を用いてプラスミドＤＮＡを産生した。
【００８３】
実施例１１−キメラ１５８抗体の産生及び結合特性
１１．１−ＣＯＳ７細胞の形質転換及び細胞培養
１つのバイアルのＣＯＳ７細胞を解凍して、１０％の胎仔クローンＩ血清及び抗生物質を補給したＤＭＥＭ中で成長させた。１週間後、細胞（１０７／ｍｌで０．８ｍｌ）が、ｐＧ１Ｄ２００１５８ＶＨに加えｐＫＮ１００１５８ＶＫ（各１０μｇのＤＮＡ）によって電気穿孔処理された。細胞をペトリ皿の８ｍｌの成長培地中で３日間成長させた。
【００８４】
１１．２−キメラ抗体産生
サンドイッチＥＬＩＳＡを使用してＣＯＳ７上清中の抗体濃度が計測された。キメラ１５８ＶＨ×１５８ＶＫ抗体を０．３μｇ／ｍｌで、続いて３．７μｇ／ｍｌ（表１９）で、一時的に同時導入されたＣＯＳ細胞馴化培地において発現させた。
【００８５】
１１．３−キメラ抗体活性
２つのＥＬＩＳＡを使用してキメラ１５８の抗原結合を分析した。３．７μｇ／ｍｌのキメラ抗体馴化培地を使用して、Ａβ単量体の結合が直接ＥＬＩＳＡ実験手順（図１２）により計測され、マウス１５８ＩｇＧと比較された。次に、抗体と液相中で混合したうえ続いてＡβ単量体と固相で結合させた単量体又はプロトフィブリルを使用して、競合ＥＬＩＳＡが行われた（図１３）。これらから、キメラ１５８抗体が元の１５８マウス抗体と同様にアミロイドＡβ単量体及びプロトフィブリルと結合することが示された。
【００８６】
注釈
その後の配列決定により、表１及び４に示されるとおりのマウス抗体配列データが、５’末端でＶＨ鎖及びＶＫ鎖の双方にエラーを含むことが示された。本願出願人はこれが、Ｖ領域内に位置するプライマーの使用に起因することを提言したい。その後の配列決定において、Ｖ領域内に突然変異を導入できない、リーダー配列内に位置するプライマーが使用された。この配列決定は、配列の差異を示した（表１５及び１１を参照）。しかしながら、前記差異はＣＤＲ領域内には位置しない。
【００８７】
直接結合ＥＬＩＳＡ及び競合ＥＬＩＳＡによりそれぞれ示されるとおり、キメラ抗体はアミロイドＡβ単量体及びプロトフィブリルを結合する。この証拠から、１５８ＶＨ鎖及び１５８ＶＫ鎖の組み合わせが抗ＬＳＡＰ抗体１５８をコードすることが確認され、これらの配列がヒト化１５８抗体を生成するためのヒト化手順に好適であることが示唆される。
【００８８】
実施例１２−ヒト化抗体設計及び考察
【００８９】
【表Ｇ】
【００９０】
【表Ｈ】
【００９１】
１２．１−ヒトＶ遺伝子データベース
国際免疫遺伝学データベース（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ）２００６及び「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」のＫａｂａｔデータベース第５版（最終更新日１９９９年１１月１７日）からのヒト及びマウス免疫グロブリンのタンパク質配列を使用してＫａｂａｔアラインメントにおける免疫グロブリンタンパク質配列のデータベースを編纂した。本願出願人のデータベースは、９３２２本のヒトＶＨ配列及び２６８９本のヒトＶＫ配列を含む。配列分析プログラムＳＲ７．６が使用され、１５８ＶＨ及び１５８ＶＫタンパク質配列（表２０）についてヒトＶＨ及びＶＫデータベースに問い合わせた。
【００９２】
１２．２−１５８ＲＨＡのためのヒトフレームワークの選択
１２．２．１−１５８ＶＨのヒトＶＨ配列との比較
バーニヤ（フート・Ｊ（Ｆｏｏｔｅ，Ｊ．）及びＧ・ウィンター（Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒ）、１９９２年、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐｓ」、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９頁）、カノニカル（モレア・Ｖ（Ｍｏｒｅａ，Ｖ．）、Ａ・Ｍ・レスク（Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ）、及びＡ・トラモンタノ（Ａ．Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ）、２０００年、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０：２６７−２７９頁）及びＶＨ−ＶＬ界面（コチア・Ｃ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．）、Ｊ・ノボトニー（Ｊ．Ｎｏｖｏｔｎｙ）、Ｒ・ブルコレリ（Ｒ．Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ）、及びＭ・カープラス（Ｍ．Ｋａｒｐｌｕｓ）、１９８５年、「Ｄｏｍａｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｔｈｅ ｐａｃｋｉｎｇ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ」、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１−６６３頁）（ＶＣＩ）残基において、１５８ＶＨとの同一性が最も高いヒトＶＨ配列で、Ｖ領域フレームワーク（ＦＷ）内に位置するものが、表２１に示される。１５８と同一のＶＣＩ残基の数（ＶＣＩスコア）及びＦＷ残基の数（ＦＷスコア）もまた示される。これらのＶＨ配列の全てが、表２２に示されるとおり、同一のＶＣＩ残基、及びＣＤＲ長を共有する。ＡＪ５５６６６９は、このデータセットの他のヒト配列中には見られない異常なＰｒｏ７４を有することから、本願出願人は当初の分析においてこれを無視することとする。しかしながら、Ｐｒｏ７４は１５８ＶＨ配列中に存在するため、ＡＦ０６２２４３に基づくＶＨ構築物が抗原を結合しない場合には、ＡＪ５５６６６９がヒト化の代替ＦＷとして考慮され得るであろう。これらの配列のアラインメント（表２３）は、それらの相違を強調表示している。このデータセット内でＡＦ０６２２４３は唯一、保存された変化Ｔ（８２ａ）Ｓ及びＦ７９の保存を有する。ＡＦ０６２２４３の他の特徴は、保存された変化Ｄ１Ｅ、Ｋ１９Ｒ、Ａ２３Ｓ、Ｔ７７Ｓ、Ｓ１１８Ｔである。他の全てのＦＷ変化は、表２３のフレームワーク全てに共通していた。ＡＦ０６２２４３が１５８ＲＨＡの基盤となるフレームワークとして選択された。
【００９３】
１２．３−１５８ＲＨＡの生成
１５８ＲＨＡの設計は単に、１５８ＶＨからＡＦ０６２２４３のアクセプターＦＷへのＣＤＲ１、２及び３の移植である。ＡＦ０６２２４３と最も同一性の高いヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子は、ＶＨ Ｍ９９６４９（ＶＨ３−０７）であり（表２４）、これからリーダーペプチドが抽出された（表２５）。シグナルＰアルゴリズム（ニールセン・Ｈ（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．）、Ｊ・エンゲルブレヒト（Ｊ．Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ）、Ｓ・ブルナク（Ｓ．Ｂｒｕｎａｋ）、及びＧ・フォン・ヘイネ（Ｇ．ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ）、１９９７年、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １０：１−６頁）から、これがシグナルペプチダーゼにより適切に切断されるものと予測された（表２６）。表２７は、１５８ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３をＡＦ０６２２４３ＦＷに移植して１５８ＲＨＡタンパク質配列を生成するスキームを示す。表２８は、１５８ＶＨ及びＡＦ０６２２４３の天然ＤＮＡ配列からのＤＮＡ配列１５８ＲＨＡｓｓの生成を示す。１５８ＲＨＡｓｓ ＤＮＡ配列の分析からスプライスドナー部位の存在が予測されたが、その予測スコアが表２９に示される。非コード突然変異の導入により、表３０に示されるとおりのこれらの予測されたスプライス部位が不活化され、最終１５８ＲＨＡ ＤＮＡ配列（表３１）が生成された。
【００９４】
１２．４−１５８ＲＫＡのためのヒトフレームワークの選択
１２．４．１−１５８ＶＫのヒトＶＫ配列との比較
ＶＣＩ残基で１５８ＶＫとの同一性が最も高いヒトＶＫ配列が、１５８ＶＫと同一のＶＣＩ残基の数（ＶＣＩスコア）及びＦＷ残基の数（ＦＷスコア）と共に表３２に示される。１１本の配列が１５８ＶＫと同一のＶＣＩ残基を全て有する。表３３は、これらの配列の全てが１５８ＶＫと同一のＣＤＲ長を有することを示す。表３４は、これらの相違を強調表示しており、同様にＩ８５を保有するＡＢ０６４０５４のみがＫ４５を保有することを示す。Ｇ１００Ｐ変化は、Ｐ１００が本願出願人のヒトＶＫデータベース内で１５％の出現率を有して一般的なため、特別注目に値しない。２つの置換、Ｔ７Ｓ及びＫ７４Ｒが保存されているとともに、他の全ての置換は表３４の全ての配列に共通である。以上の理由から、１５８ＲＫＡを生成するためにＡＢ０６４０５４が選択された。
【００９５】
１２．５−１５８ＲＫＡの生成
１５８ＲＫＡの設計は単に、ＣＤＲ１、２及び３を１５８ＶＫからヒトＡＢ０６４０５４のアクセプターＦＷへと移植することである。ＡＢ０６４０５４に最も近い生殖細胞系列Ｖ遺伝子はＡ１９であり（表３５）、これからリーダーペプチドが抽出された（表３６）。シグナルＰアルゴリズムから、このリーダーペプチドの適切な切断（表３７）が予測された。表３８は、１５８ＶＫ ＣＤＲをＡＢ０６４０５４のＦＷに挿入することによる１５８ＲＫＡのタンパク質配列の生成を示す。表３９は、１５８ＶＫ及びＡＢ０６４０５４の天然ＤＮＡ配列からの１５８ＲＫＡｓｓのＤＮＡ配列の生成を示す。１５８ＲＫＡｓｓの分析からスプライスドナー部位の存在が予測されたが、そのスコアが表４０に示される。非コード突然変異（４１）の導入によりこれらの部位が不活化され、最終１５８ＲＫＡ ＤＮＡ構築物が生成された（表４２）。
【００９６】
１２．６ ヒト化抗体（ＢＡＮ２４０１）結合活性
１５８ＲＫＡ及び１５８ＲＨＡ遺伝子を、ＩｇＧ１定常領域を含む発現ベクターに挿入した。この構築物をＣＯＳ細胞で発現させてヒト化１５８抗体を生成した。ヒト化１５８抗体が結合活性及び特異性について競合ＥＬＩＳＡで試験した。ヒト化抗体は、ｍＡｂ１５８及び１５８キメラ抗体と同一の結合特性を示した（図１４を参照）。
【００９７】
１２．７ １５８ＲＨＡ鎖及び１５８ＲＫＡ鎖における追加的な突然変異
マウス生殖細胞系列Ｖ遺伝子ＶＨ ＡＡＫ７１６１２を１５８ＶＨと比較することにより、単一の体細胞突然変異Ａ６０ＧがＣＤＲ２において同定された。さらには、抗体１５８の分子モデルは、１５８ＲＨＡには保存されていない３個のＶＨ ＦＷ残基をＣＤＲ残基の５Å内に含む。これらの置換は、Ｄ１Ｅ、Ｐ７４Ａ及びＴ８２Ｓである（表４３）。同様に、１５８ＲＫＡに保存されていないＣＤＲ残基の５Å内に２個のＶＫ ＦＷ残基がある。この置換は、Ｌ３Ｖ及びＧ１００Ｐである（表４４）。ヒト化バージョン１５８ＲＨＢ、１５８ＲＨＣ、１５８ＲＨＤ、１５８ＲＫＢ及び１５８ＲＫＣにおける、１５８ＲＨＡ及び１５８ＲＫＡへの位置ＶＨ−１、ＶＨ−７４、ＶＨ−８２、ＶＫ−３及びＶＫ−１００での逆突然変異の導入が、表４３及び４４に示される。
【００９８】
【表Ｉ】
【００９９】
【表１】
【０１００】
【表２】
【０１０１】
【表３】
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
【表５】
【０１０４】
【表６】
【０１０５】
【表７】
【０１０６】
【表８】
【０１０７】
【表９】
【０１０８】
【表１０】
【０１０９】
【表１１】
【０１１０】
【表１２】
【０１１１】
【表１３】
【０１１２】
【表１４】
【０１１３】
【表１５】
【０１１４】
【表１６】
【０１１５】
【表１７】
【０１１６】
【表１８】
【０１１７】
【表１９】
【０１１８】
【表２０】
【０１１９】
【表２１】
【０１２０】
【表２２】
【０１２１】
【表２３】
【０１２２】
【表２４】
【０１２３】
【表２５】
【０１２４】
【表２６】
【０１２５】
【表２７】
【０１２６】
【表２８】
【０１２７】
【表２９】
【０１２８】
【表３０】
【０１２９】
【表３１】
【０１３０】
【表３２】
【０１３１】
【表３３】
【０１３２】
【表３４】
【０１３３】
【表３５】
【０１３４】
【表３６】
【０１３５】
【表３７】
【０１３６】
【表３８】
【０１３７】
【表３９】
【０１３８】
【表４０】
【０１３９】
【表４１】
【０１４０】
【表４２】
【０１４１】
【表４３】
【０１４２】
【表４４】
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ヒトＡβプロトフィブリルに対し選択的および高親和性を有する抗体又はその断片であって、前記抗体又は断片がその６つのＣＤＲ領域において以下の共通配列、
ＶＨ−ＣＤＲ１ ＳＦＧＭＨ
ＶＨ−ＣＤＲ２ ＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＧＤＴＶＫＧ
ＶＨ−ＣＤＲ３ ＥＧＧＹＹＹＧＲＳＹＹＴＭＤＹ
ＶＬ−ＣＤＲ１ ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ
ＶＬ−ＣＤＲ２ ＫＶＳＮＲＦＳ
ＶＬ−ＣＤＲ３ ＦＱＧＳＨＶＰＰＴ
を有し、前記抗体又は断片が前記ＣＤＲ領域内でアミノ酸欠失、置換及び挿入を示し得る、抗体。
【請求項２】
前記ＣＤＲ領域内に１〜１０個のアミノ酸欠失、置換及び挿入を示す、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記ＣＤＲ領域内に１〜５個のアミノ酸欠失、置換及び挿入を示す、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記ＣＤＲ領域内に１〜３個のアミノ酸欠失を示す、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が低減された補体活性化活性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
前記低減された補体活性化活性を、前記アミノ酸のプロリンを第３３１位でセリン又は他の極性アミノ酸に換えることにより獲得する、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
前記低減された補体活性化活性を、グリコシル化を阻害するか、又は低下させるか、又は変化させることにより獲得する、請求項６に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体がＩｇＧクラスである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体がＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスである、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスのキメラである抗体であって、重鎖定常領域ＣＨ２又はＣＨ２の一部がＩｇＧ４に由来し、および領域ＣＨ１及びＣＨ３がＩｇＧ１に由来することにより補体活性化が低減される、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
表３１の完全重鎖配列及び表４２の完全軽鎖配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
表４３の重鎖（ＶＨ）に、Ａ６０Ｇ、Ｄ１Ｅ、Ｐ７４Ａ及びＴ８２Ｓから選択される突然変異を含むか、及び／又は表４４の軽鎖（ＶＫ）に、Ｌ３Ｖ及びＧ１００Ｐから選択される突然変異を含むか、又はこれらのＶＨ及びＶＫ突然変異の組み合わせを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
ＣＤＲ１の前記重鎖配列の左側８番目のアミノ酸がＳであることを除き、表３１の完全重鎖配列及び表４２の完全軽鎖配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
ヒト又はヒト化又は変異型であることによりヒトにおける抗原性が低減される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
マウス抗体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
Ａβ単量体とプロトフィブリルとの間の特異性の比が少なくとも１：２００である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
６つのＣＤＲ領域に以下の共通配列：
ＶＨ−ＣＤＲ１ ＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＨＷＶＲ
ＶＨ−ＣＤＲ２ ＷＶＡＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＧＤＴＶＫＧＲＦＴ
ＶＨ−ＣＤＲ３ ＣＡＲＥＧＧＹＹＹＧＲＳＹＹＴＭＤＹＷＧＱ
ＶＬ−ＣＤＲ１ ＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬ
ＶＬ−ＣＤＲ２ ＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰ
ＶＬ−ＣＤＲ３ ＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＰＴＦＧＧ
を有する抗体であって、前記抗体又は断片が前記ＣＤＲ領域内にアミノ酸欠失、置換及び挿入を示し得る、請求項１に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体がマウス抗体である、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
前記抗体が表１１の完全軽鎖配列１５８ＶＫ及び表１５の完全重鎖配列１５８ＶＨを含む、請求項１８又は１９に記載の抗体。
【請求項２１】
ヒト及び獣医学用途の、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体及び薬学的に許容可能な緩衝液を含む組成物。
【請求項２２】
抗菌剤をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物が凍結乾燥されている、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物が賦形剤と共に凍結乾燥されることにより凍結乾燥中及びその後の前記抗体の安定性が向上する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記賦形剤がマンニトール又はトレハロースである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
アルツハイマー病を予防又は処置する方法であって、アルツハイマー病に罹っている、又は罹っていることが疑われる患者に対し、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２１〜２５に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項２７】
ダウン症候群、レビー小体認知症、血管性認知症及び他の神経変性障害を予防又は処置する方法であって、ダウン症候群、レビー小体認知症、血管性認知症及び他の神経変性障害に罹っている、又は罹っていることが疑われる患者に対し、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２１〜２５に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項２８】
Ａβプロトフィブリルを試験管内で検出する方法であって、
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体を、Ａβプロトフィブリルを含む、又は含むことが疑われる生体試料に付加する工程と、
前記Ａβプロトフィブリルと前記抗体との間に形成される複合体の濃度を計測する工程と、
を含む、方法。
【請求項２９】
前記検出方法が免疫測定法である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記検出方法が近接連結測定法である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
Ａβプロトフィブリルを生体内で検出する方法であって、
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体を、Ａβプロトフィブリルを含む、又は含むことが疑われる哺乳動物に付加する工程と、
前記Ａβプロトフィブリルと前記抗体との間に形成される複合体の濃度を計測する工程と、
を含んでなる、方法。
【請求項３２】
アルツハイマー病を診断する方法であって、
被験者から生体試料を採取する工程と、
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体を前記試料に付加する工程と、
前記試料中の前記抗体と任意のＡβプロトフィブリルとの間に形成される複合体の濃度を計測する工程と、
を含む、方法。
【請求項３３】
ダウン症候群、レビー小体認知症、血管性認知症及び他の神経変性障害を診断する方法であって、
被験者から生体試料を採取する工程と、
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体を前記試料に付加する工程と、
前記試料中の前記抗体と任意のＡβプロトフィブリルとの間に形成される複合体の濃度を計測する工程と、
を含む、方法。
【請求項３４】
アルツハイマー病の処置用薬剤を調製するための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３５】
ダウン症候群、レビー小体認知症、血管性認知症及び他の神経変性障害の処置用薬剤を調製するための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１】
野生型ヒトＡβプロトフィブリルに対し選択的および高親和性を有する抗体又はその断片であって、前記抗体又は断片がその６つのＣＤＲ領域において以下の共通配列、
ＶＨ−ＣＤＲ１ ＳＦＧＭＨ
ＶＨ−ＣＤＲ２ ＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＧＤＴＶＫＧ
ＶＨ−ＣＤＲ３ ＥＧＧＹＹＹＧＲＳＹＹＴＭＤＹ
ＶＬ−ＣＤＲ１ ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ
ＶＬ−ＣＤＲ２ ＫＶＳＮＲＦＳ
ＶＬ−ＣＤＲ３ ＦＱＧＳＨＶＰＰＴ
を有し、前記抗体又は断片が前記ＣＤＲ領域内でアミノ酸欠失、置換及び挿入を示し得る、抗体。
【請求項２】
前記ＣＤＲ領域内に１〜１０個のアミノ酸欠失、置換及び挿入を示す、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記ＣＤＲ領域内に１〜５個のアミノ酸欠失、置換及び挿入を示す、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記ＣＤＲ領域内に１〜３個のアミノ酸欠失を示す、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が低減された補体活性化活性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
前記低減された補体活性化活性を、前記アミノ酸のプロリンを第３３１位でセリン又は他の極性アミノ酸に換えることにより獲得する、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
前記低減された補体活性化活性を、グリコシル化を阻害するか、又は低下させるか、又は変化させることにより獲得する、請求項６に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体がＩｇＧクラスである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体がＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスである、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスのキメラである抗体であって、重鎖定常領域ＣＨ２又はＣＨ２の一部がＩｇＧ４に由来し、および領域ＣＨ１及びＣＨ３がＩｇＧ１に由来することにより補体活性化が低減される、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
表３１の完全重鎖配列及び表４２の完全軽鎖配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
表４３の重鎖（ＶＨ）に、Ａ６０Ｇ、Ｄ１Ｅ、Ｐ７４Ａ及びＴ８２Ｓから選択される突然変異を含むか、及び／又は表４４の軽鎖（ＶＫ）に、Ｌ３Ｖ及びＧ１００Ｐから選択される突然変異を含むか、又はこれらのＶＨ及びＶＫ突然変異の組み合わせを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
ＣＤＲ１の前記重鎖配列の左側８番目のアミノ酸がＳであることを除き、表３１の完全重鎖配列及び表４２の完全軽鎖配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
ヒト又はヒト化又は変異型であることによりヒトにおける抗原性が低減される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
マウス抗体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
Ａβ単量体とプロトフィブリルとの間の特異性の比が少なくとも１：２００である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
６つのＣＤＲ領域に以下の共通配列：
ＶＨ−ＣＤＲ１ ＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＨＷＶＲ
ＶＨ−ＣＤＲ２ ＷＶＡＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＧＤＴＶＫＧＲＦＴ
ＶＨ−ＣＤＲ３ ＣＡＲＥＧＧＹＹＹＧＲＳＹＹＴＭＤＹＷＧＱ
ＶＬ−ＣＤＲ１ ＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬ
ＶＬ−ＣＤＲ２ ＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰ
ＶＬ−ＣＤＲ３ ＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＰＴＦＧＧ
を有する抗体であって、前記抗体又は断片が前記ＣＤＲ領域内にアミノ酸欠失、置換及び挿入を示し得る、請求項１に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体がマウス抗体である、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
前記抗体が表１１の完全軽鎖配列１５８ＶＫ及び表１５の完全重鎖配列１５８ＶＨを含む、請求項１８又は１９に記載の抗体。
【請求項２１】
ヒト及び獣医学用途の、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体及び薬学的に許容可能な緩衝液を含む組成物。
【請求項２２】
抗菌剤をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物が凍結乾燥されている、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物が賦形剤と共に凍結乾燥されることにより凍結乾燥中及びその後の前記抗体の安定性が向上する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記賦形剤がマンニトール又はトレハロースである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
アルツハイマー病を予防又は処置する方法であって、アルツハイマー病に罹っている、又は罹っていることが疑われる患者に対し、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２１〜２５に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項２７】
ダウン症候群、レビー小体認知症、血管性認知症及び他の神経変性障害を予防又は処置する方法であって、ダウン症候群、レビー小体認知症、血管性認知症及び他の神経変性障害に罹っている、又は罹っていることが疑われる患者に対し、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２１〜２５に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項２８】
Ａβプロトフィブリルを試験管内で検出する方法であって、
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体を、Ａβプロトフィブリルを含む、又は含むことが疑われる生体試料に付加する工程と、
前記Ａβプロトフィブリルと前記抗体との間に形成される複合体の濃度を計測する工程と、
を含む、方法。
【請求項２９】
前記検出方法が免疫測定法である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記検出方法が近接連結測定法である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
Ａβプロトフィブリルを生体内で検出する方法であって、
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体を、Ａβプロトフィブリルを含む、又は含むことが疑われる哺乳動物に付加する工程と、
前記Ａβプロトフィブリルと前記抗体との間に形成される複合体の濃度を計測する工程と、
を含んでなる、方法。
【請求項３２】
アルツハイマー病を診断する方法であって、
被験者から生体試料を採取する工程と、
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体を前記試料に付加する工程と、
前記試料中の前記抗体と任意のＡβプロトフィブリルとの間に形成される複合体の濃度を計測する工程と、
を含む、方法。
【請求項３３】
ダウン症候群、レビー小体認知症、血管性認知症及び他の神経変性障害を診断する方法であって、
被験者から生体試料を採取する工程と、
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体を前記試料に付加する工程と、
前記試料中の前記抗体と任意のＡβプロトフィブリルとの間に形成される複合体の濃度を計測する工程と、
を含む、方法。
【請求項３４】
アルツハイマー病の処置用薬剤を調製するための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３５】
ダウン症候群、レビー小体認知症、血管性認知症及び他の神経変性障害の処置用薬剤を調製するための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００９−５３０３７４（Ｐ２００９−５３０３７４Ａ）
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０１３８３（Ｐ２００９−５０１３８３）
【出願日】平成１９年３月２３日（２００７．３．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００７／０００２９２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０８７５６
【国際公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【出願人】（５０６３１８９１９）バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２３日（２００７．３．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００７／０００２９２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０８７５６
【国際公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【出願人】（５０６３１８９１９）バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー (2)
【Ｆターム（参考）】
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