改良植物品種の迅速な育種方法
本発明は、改良植物品種の作出を目的とした連続戻し交配において、次世代の交配に供する個体の選抜効率を高め、迅速な育種方法を提供すること、及び「コシヒカリ」の良食味を保持したまま耐倒伏性を付与した改良イネ品種を短期間に作出することを目的とする。 本発明は、目的形質が導入された改良植物品種の迅速な育種方法であって、以下の工程：（ａ）対象となる植物品種に目的形質を有する他の植物品種を交配し、（ｂ）交配後代の染色体の遺伝子型を、幼植物期において一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーを用いてタイピングし、（ｃ）タイピングした遺伝子型に基づいて次世代の交配に供する個体を選抜し、（ｄ）選抜した個体に前記の対象となる植物品種を戻し交配し、（ｅ）上記（ｂ）から（ｄ）の工程を少なくとも３回繰り返すこと、を含む、前記育種方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、目的形質が導入された改良植物品種の迅速な育種方法、及び該方法により作出された改良植物品種、詳しくは「コシヒカリ」を反復親とし、半矮性形質を有する「ＩＲ２４」を供与親とする連続戻し交配において、一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーを用いてタイピングした遺伝子型に基づいて次世代の交配に供する供与親を選抜することを特徴とする改良イネ品種の迅速な育種方法、及び該方法により作出された改良イネ品種に関する。
【背景技術】
作物の交雑育種では、望ましい形質を持つ品種・系統を交配し、その雑種後代からより優れた性質を持つ個体を選んで新品種を作出する。従来は、そのような雑種後代における個体の選抜を表現型によって行っていた。そのため、特性評価や個体選抜に膨大な手間と時間がかかり、１つの品種を育成には十数年の年月が必要だった。また、このような方法では同じものを選ぶことができる再現性は低く、基本的には偶然性の度合いが高い。突然変異体を用いた育種法や、培養変異を用いた細胞培養育種方法も品種育成に用いられるが、いずれも新規形質の付与が困難であったり、他形質に影響を及ぼす可能性もあって好ましいとはいえない。
福井県の農業試験場で作出された「コシヒカリ」は良食味品種として多くの人々に支持され、品種化されてから現在に至るまでの約半世紀にわたり栽培されている。栽培技術の改良と消費者の良食味志向により作付面積は年々拡大し、栽培の限界も北上しつつある。一方で、「コシヒカリ」は長稈で台風により倒伏しやすく、またいもち病に弱いという欠点がある。従って良食味を生かしつつ、耐倒伏性や、耐病性などの付与が求められている。
そこで良食味米としての「コシヒカリ」の特徴を保持したまま短稈化させるために、稈を矮化させる遺伝子座のみを導入することが試みられている。従来の育種法では、ある優れた品種（反復親）に他品種（供与親）の特定の遺伝子座のみを導入する場合にはＦ１雑種に反復親を用いて「連続戻し交配」し、表現型のみを用いて選抜を行ってきた。しかしながら、この育種法においては選抜に経験を要し、染色体を置換するのに年月がかかりなおかつ当該遺伝子座の遺伝子作用が劣性である場合には選抜に際して困難を伴うという問題点がある。従って、この「連続戻し交配」による染色体の置換を効率的に行うことができれば育種期間の短縮に繋がるだけでなく、余分な領域の混入を正確に除くことができるはずである。
イネゲノム解析の初期段階から、ゲノム解析技術を育種に役立てることが育種現場との連携の下に検討されてきた。最初の段階では目的とする遺伝形質と連鎖するＤＮＡマーカーを作ること（標識化）が行われた（Ｋｕｒａｔａ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，８，３６５−３７２，１９９４；Ｈａｒｕｓｈｉｍａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４８，４７９−４９４，１９９８）。多くの遺伝子が関与する量的形質遺伝子座（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｕｓ：ＱＴＬ）の解析にもＤＮＡマーカーが利用され、矢野らはこの解析により出穂期に関連するいくつかの遺伝子を見出し、それらを組み合わせて様々な出穂期を示すイネを作出した（Ｙａｎｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２７，１４２５−１４２９，２００１参照）。ＤＮＡマーカーについては従来のＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）マーカーに代わり、ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）、ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＣＡＰＳ（Ｃｌｅａｖｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、ＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ）などのマーカーが登場し、これらを用いた育種法が開発されている（ＭｃＣｏｕｃｈ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５，８９−９９，１９９７；Ｙａｎｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ｈｔｔｐ：／／ｒｇｐ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｐｕｂｌｉｃｄａｔａ／ｃａｐｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ参照）。
連続戻し交配育種法では目的遺伝子座周辺に上記ＤＮＡマーカーを設定し、各世代の選抜の際に遺伝子型をそれらのマーカーを用いて分析し、目的遺伝座を保持しつつ、他の染色体を反復親の染色体に置換していく。しかしながら、この方法では特定の遺伝子座周辺の遺伝子型のみで選抜を行うため、その遺伝子座以外の全染色体を反復親の染色体に置換するには時間を要する。従って、この時間を短縮するために全染色体にＤＮＡマーカーを設定し、各世代において置換の程度の高い個体を選抜できることが望まれる。
本発明者らのグループでは、イネゲノム全域の一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）の探索を行い、育種に利用可能なマーカー化を行っている（Ｎａｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓ．，９，１６３−１７１，２００２）。
本発明の課題は、改良植物品種の作出を目的とした連続戻し交配において、次世代の交配に供する個体の選抜効率を高め、迅速な育種方法を提供することにある。また、本発明のさらなる課題は、「コシヒカリ」の良食味を保持したまま耐倒伏性を付与した改良イネ品種を短期間に作出することにある。
【発明の開示】
本発明者らは上記課題を解決すべき鋭意研究を重ねた結果、植物ゲノム全域を網羅する一塩基多型（ＳＮＰ）マーカー（以下、ＳＮＰマーカーと記載する）を用いることによって、連続戻し交配後代の染色体の遺伝子型を幼植物期において迅速にタイピングでき、次世代の交配に供する個体の選抜が飛躍的に効率化できることを見出した。その結果、所望の改良植物品種を短期間に作出することに成功し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）目的形質が導入された改良植物品種の迅速な育種方法であって、以下の工程：
（ａ）対象となる植物品種に目的形質を有する他の植物品種を交配し、
（ｂ）交配後代の染色体の遺伝子型を、幼植物期においてＳＮＰマーカーを用いてタイピングし、
（ｃ）タイピングした遺伝子型に基づいて次世代の交配に供する個体を選抜し、
（ｄ）選抜した個体に前記の対象となる植物品種を戻し交配し、
（ｅ）上記（ｂ）から（ｄ）の工程を少なくとも３回繰り返すこと、
を含む、前記育種方法。
（２） 対象となる植物品種がイネ品種である、上記（１）の方法。
（３） イネ品種が「コシヒカリ」である、上記（２）の方法。
（４） 他の植物品種が半矮性遺伝子を有するイネ品種である、上記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（５） 半矮性遺伝子を有するイネ品種がｓｄ−１遺伝子を有する「ＩＲ２４」である、上記（４）の方法。
（６） 上記（１）から（５）のいずれかの方法により作出された改良植物品種。
（７） 「ＩＲ２４」由来のｓｄ−１遺伝子座がホモ接合であり、それ以外の染色体領域が「コシヒカリ」由来の染色体で構成されていることを特徴とする、上記（１）から（５）のいずれかの方法により作出された改良イネ品種。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＩＲ２４」「コシヒカリ」間で利用できるＳＮＰマーカーの染色体上の分布を示す。地図距離は「日本晴」「カサラス」の地図に準ずる。
図２は、「コシヒカリ」、および「コシヒカリ」と「ＩＲ２４」の交配後代（戻し交配４回）の植物体の写真を示す。
図３は、各世代におけるｓｄ−１遺伝子座の遺伝子型と全染色体レベルでの「コシヒカリ」への置換の程度を示す。
図４は、「半矮性コシヒカリ」育成の流れ図を示す。置換率とは全マーカーに対して「コシヒカリ」「ＩＲ２４」ヘテロ型の遺伝子型が観測されたマーカーの割合である（図中、１：「コシヒカリ」ホモ接合領域、２：「ＩＲ２４」「コシヒカリ」ヘテロ接合領域、３：「ＩＲ２４」ホモ接合領域を表す）。
図５は、「半矮性コシヒカリ」の所内圃場試験栽培の様子である。左側が「コシヒカリ」、右側が「半矮性コシヒカリ」である。
図６は、所内圃場で試験栽培した株である。左側が「コシヒカリ」、右側が「半矮性コシヒカリ」である。
図７は、所内圃場で栽培した「半矮性コシヒカリ」と「コシヒカリ」の到穂日数を示す（出穂始め：全個体の１０％以上が出穂した日、出穂日：全個体の５０％以上が出穂した日、出穂揃え：全個体の９０％以上が出穂した日）。
図８は、「半矮性コシヒカリ」と「コシヒカリ」の稈長を示す。図中のエラーバーは平均値と標準偏差を示す。
図９は、「半矮性コシヒカリ」と「コシヒカリ」の籾と玄米の写真を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００３年１月３１日に出願された日本国特許出願２００３−０２４１４３号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本発明は、目的形質が導入された改良植物品種の迅速な育種方法であって、以下の工程：
（ａ）対象となる植物品種に目的形質を有する他の植物品種を交配し、
（ｂ）交配した後代の染色体の遺伝子型を、幼植物期においてＳＮＰマーカーを用いてタイピングし、
（ｃ）タイピングした遺伝子型に基づいて次世代の交配に供する個体を選抜し、
（ｄ）選抜した個体に前記の対象となる植物品種を戻し交配し、
（ｅ）上記（ｂ）から（ｄ）の工程を少なくとも３回繰り返すこと、
を含むことを特徴とする。
本発明の育種方法は、従来の交雑育種に、ゲノム全域をカバーするマーカーを用いた効率的な解析に基づく雑種後代の個体の選抜と世代促進を組み合わせた画期的な方法であり、非常に短期間に確実に新形質を付加する新しい育種方法である。
本発明において、「対象となる植物品種」とは、優良品種ではあるが、改良すべき形質を有する植物品種をいい、戻し交配における「反復親」に該当する。
一方、「目的形質を有する植物品種」とは、上記の「対象となる植物品種」における改良すべき形質を有している他の品種をいい、戻し交配における「供与親」に該当する。
本発明の育種方法の対象となる植物としては、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ．）、トウモロコシ（Ｚｅａｍａｙｓ Ｌ．）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ Ｂｉｃｏｌｏｒ）、トマト（Ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、オランダイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ ａｎａｎａｓｓａ）、キク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｃｖｓ）などが挙げられるが、ゲノム配列データが公開されているイネ（Ｏｔｙｚａ ｓａｔｉｖａ）をはじめとしてイネと遺伝的相同性（シンテニー）を持つイネ科の植物（Ｇａｌｅ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２（５３８９），６５６−６５９（１９９８））、例えばコムギ、オオムギ、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ Ｌ．）、トウモロコシ、ソルガム、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ Ｌ．）が好ましい。
「目的形質を有する植物品種」は、「対象となる植物品種」に目的形質を導入できる限り特には限定されないが、同種の植物で、和合性を持つものであることが好ましい。例えば「対象となる植物品種」が「コシヒカリ」の場合、「目的形質を有する植物品種」として矮化遺伝子を有するイネ品種を用いれば、「コシヒカリ」に耐倒伏性を付与することができる。矮化遺伝子を有するイネ品種としては、いくつかの種類が存在するが、半矮性遺伝子であるｓｄ−１遺伝子をもつインド型イネ品種「ＩＲ２４」が好ましい。「ＩＲ２４」はＧｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ ２０−ｏｘｉｄａｓｅをコードするｓｄ−１遺伝子が欠損変異しており（Ｌｉｓａ Ｍｏｎｎａ，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓｅｒｃｈ，９，１１−１７，２００２）、「ＩＲ２４」型ｓｄ−１遺伝子のホモ接合体は半矮性を示し、短稈化する一方で収量形質に影響を及ぼさないので好適である（Ｆｕｔｓｕｈａｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｉｃｅ Ｐｌａｎｔ，ｖｏｌ．３；Ｍａｔｓｕｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｏｌｉｃｙ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｏｋｙｏ，３００−３１８，１９９７）。これに対し、矮性遺伝子であるｄ１、ｄ６１（Ａｓｈｉｋａｒｉ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９６，１０２８４−１０２８９，１９９９；Ｙａｍａｍｕｒｏ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１２，１５９１−１６０５，２０００）は、イネを短稈化させる遺伝子として知られているが、これらは穂の長さ、米粒の大きさをも矮化させ収量形質を悪化させるという、いわゆる矮性の形質を示し、好ましくない。
本発明において、「矮性遺伝子」とは正常型より稈長を短縮させ、穂長、種子の粒形を矮化させる作用を持つ遺伝子（狭義の矮性遺伝子）をいい、「半矮性遺伝子」とは正常型より稈長を短縮させる一方で、穂長、種子の粒形等の収量形質には影響を与えない遺伝子をいう。また、「矮化遺伝子」とは、正常型より稈長を短縮させる作用を持つ遺伝子（広義の矮性遺伝子）をいい、「矮性遺伝子」と「半矮性遺伝子」とを包含する。
本発明において、「連続戻し交配」又は「戻し交配」とは、反復親と供与親とを交配することによって得られた交配後代から次世代の交配に供する個体を選抜し、反復親を再びその選抜した個体に交配する操作を繰り返すことをいう。かかる交配によって、最終的に目的の遺伝子座が供与親型のホモ接合で、それ以外の染色体領域が反復親由来の染色体で構成されている植物体を得ることができる。
本発明においては、交配後代の染色体の遺伝子型を、幼植物期においてＳＮＰマーカーを用いてタイピングし、染色体の遺伝子型に基づいて次世代の交配に供する個体を選抜する。
ここで、「一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）」とは、塩基配列において１個の塩基が変異した多型をいい、本発明においては「対象となる植物品種」と「目的形質を有する植物品種」との間の点変異を意味する。本発明においては、ＳＮＰは一塩基の置換による多型を意味するほか、塩基の挿入又は欠失もＳＮＰに含めることことする。
また、「幼植物期」とは、胚〜発芽期の形態から成体への移行過程をいう。
以下、イネを例に本発明方法について具体的に説明する。
（１）反復親と供与親の交配
イネの世代促進のために、栽培は日長調節が可能な遮光カーテン付の温室で行うことが好ましい。発芽しにくい種子については、４０−５０℃で１週間程度保温することで休眠打破しておく。催芽は、２日間種子を水に浸し、３０℃に保温することによって行い、催芽期間中は水を毎日交換する。反復親と供与親の出穂期が大きく異なる場合には、出穂が揃うように両系統の種子を催芽、播種、育成しておく。
催芽開始より２日後、育苗箱に播種し、播種から２週間後にプラスチックポットに移植、栽培を行う。反復親（「コシヒカリ」）と供与親（「ＩＲ２４」）が出穂したら交配を行う。
交配は、まず母本の除雄を行い、次に授粉を行う。母本の除雄法としては、温湯除雄法又は剪定法が挙げられる。温湯除雄法は、除雄のために出穂後２、３日後の穂を４２℃の７分間温湯に浸し、その後開花した穎花上部を切除し、開花しない穎花は切除する方法である。剪定法は、出穂後２、３日後の穎花のうち開花が予測される穎花の上部を切除しピンセットで雄蕊を除去する一方でそれ以外の穎花は切除する方法である。授粉は父本の雄蕊をピンセットで摘み取り母本の柱頭にふりかけることで行う。
種子は交配を行った日より３週間から４週間程度で登熟するのでＦ１世代の種子回収を行う。Ｆ１種子は両親系統と同じように休眠打破後、催芽し、播種する。反復親の播種は、交配後代（ここではＦ１）の出穂期が予測しえない場合、Ｆ１種子の播種日に前後して播種を行えばよい。Ｆ１雑種と反復親が出穂したら戻し交配を行う。交配後３週間から４週間程度で登熟するので、ＢＣ１Ｆ１世代の種子回収を行う。
（２）ＳＮＰマーカーの設定
交配後代の染色体の遺伝子型をタイピングするために、あらかじめ反復親、供与親間で使用できるＳＮＰマーカーを全染色体上に設定しておく。
「コシヒカリ」、「ＩＲ２４」からのゲノムＤＮＡ抽出は、ＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ，Ｍ．Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，８，４３２１−４３２５，１９８０；Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．，分子マーカーを利用した有用形質の遺伝解析方法，ｐｐ．４−１１，２０００）を用いて行う。
ＳＮＰマーカーの設定にはＲｉｃｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＲＧＰ）により公開されているイネＥＳＴ，ＢＡＣ等の塩基配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｒｇｐ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／Ｐｕｂｌｉｃｄａｔａ．ｈｔｍｌ）や、他の品種間で既に公知のＳＮＰマーカーの情報、例えば、Ｎａｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓ．，９，１６３−７１，２００２に記載のＳＮＰマーカーの情報が利用できる。
他の品種間で既に公知のＳＮＰマーカーの情報を用いる場合、例えば以下の方法によってＳＮＰマーカーの設定を行う。「コシヒカリ」、「ＩＲ２４」のそれぞれのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＳＮＰを含む領域をＮａｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓ．，９，１６３−７１，２００２に開示されている、インド型イネ「廣陸矮４号（Ｇ４）」と野生イネ（Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ）「Ｗ１９４３」間で使用できるＳＮＰマーカーに対するゲノムＰＣＲプライマーセット（５’側プライマー、３’側プライマー）を用いてＰＣＲによって増幅し、増幅産物を酵素処理して残存プライマーの分解、モノヌクレオチドの脱リン酸化を行う。次に、それぞれのＳＮＰに対応するＳＮＰプライマー（ＳＮＰの一塩基手前に３’末端が位置するプライマー）と２種類の蛍光標識ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ，ｄｄＣＴＰのうちいずれか２種類）を用いて、上記ＰＣＲ産物を鋳型として一塩基伸長反応（ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ反応）を行い、蛍光偏光度を測定し、ＳＮＰ部位の塩基種（遺伝子型）を判定する（ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ法；Ｃｈｅｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，９，４９２−９８，１９９９）。「コシヒカリ」、「ＩＲ２４」間に公知の情報と同じＳＮＰが存在する場合、そのＳＮＰプライマーを「コシヒカリ」、「ＩＲ２４」間のＳＮＰマーカーとして設定することができる。ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ反応には、市販の試薬、例えばＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ ＳＮＰｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いることができる。
一方、公知のＳＮＰマーカーの情報を用いない場合は、例えば、以下の方法によってＳＮＰマーカーの設定を行うことができる。公表されているゲノム配列とＲｉｃｅＧＡＡＳ（Ｓａｋａｔａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０，９８−１０２，２００２；ｈｔｔｐ：／／ＲｉｃｅＧＡＡＳ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）を用いて推定される遺伝子間領域内の５００から１０００ｂｐの断片を増幅するプライマーを設計する。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅をアガロースゲル電気泳動で確認した後、増幅産物を酵素処理して残存プライマーの分解、モノヌクレオチドの脱リン酸化を行う。増幅断片のヌクレオチド配列を決定し、「コシヒカリ」、「ＩＲ２４」２品種の配列を市販のソフトウェア（例えばＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いてアラインメントし、ＳＮＰを探索する。
ＳＮＰが検出された断片につき、ＳＮＰの一塩基手前に３’末端が位置するプライマー（ＳＮＰプライマー）を設計する。このＳＮＰプライマーと２種類の蛍光標識ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ，ｄｄＣＴＰのうちいずれか２種類）を用いて上記ＰＣＲ産物を鋳型として一塩基伸長反応（ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ反応）を行い、蛍光偏光度を測定することによってＳＮＰ部位の塩基種（遺伝子型）を判定する（ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ法）。判定した遺伝子型が前記の配列決定の結果から予想されるものと同じである場合、そのＳＮＰプライマーをＳＮＰマーカーとして設定することができる。
ＳＮＰ検出は、上記のＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ法（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９，４９２−４９８，１９９９）のほか、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法（Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｏｎｙｍｏｕｓ Ａｌｕ ｒｅｐｅａｔｓ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，１１，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｊａｎ １，１２（１），１３９−１４６，１９９２；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ａｕｇ １，６（８），１３１３−１３１８，１９９１；Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ＰＣＲ−ＳＳＣＰ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．，Ａｐｒ １，４（５），２７５−２８２，１９９５）、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐｐ．９４−１０５；Ｇｅｎｅｔ Ａｎａｌ．，１４，１４３−１４９，１９９９）、Ｉｎｖａｄｅｒ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐｐ．９４−１０５；Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，３３０−３４３，２０００）、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０，１０３−１１０，２０００）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ法（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８，７７−８４，２０００）、ＤＮＡアレイ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐｐ．１２８−１３５；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２，１６４−１６７，１９９９）等によっても行うことができる。
本発明においては、ＳＮＰマーカーの中から、対象となる植物の染色体１本あたり少なくとも５個、または１５ｃＭ当たり少なくとも１つのＳＮＰマーカーが存在するように、ほぼ均等に設定することが好ましい。「均等」とは、染色体の一定領域にＳＮＰマーカーが集中しないように、染色体上にほぼ満遍なく、網羅的にＳＮＰが存在していることをいう。
本発明の育種方法を適用する「コシヒカリ」と「ＩＲ２４」との間で利用できるＳＮＰマーカーは、例えばイネ染色体１から１２に存在する以下の多型である。
染色体１：Ｓ０３４９、Ｓ０００２、Ｓ０００３、Ｓ０３５３、Ｓ０２４７、Ｓ０５５４、Ｓ０４１９、Ｓ００１５、Ｓ０００８、Ｓ０３５８、Ｓ００１０、Ｓ００１１、Ｓ００１３、Ｓ０２５９、Ｓ０００７、Ｓ０５１３
染色体２：Ｓ０５１４、Ｓ００３１、Ｓ０２６２、Ｓ０４２８、Ｓ０４２９、Ｓ０２９６、Ｓ００２８、Ｓ００１８、Ｓ０４３０、Ｓ０２９８、Ｓ００２３、Ｓ００２４、Ｓ０１９９、Ｓ０３７８、Ｓ００２１、Ｓ０３７９、Ｓ０３０２、Ｓ０３８０
染色体３：Ｓ０５２４、Ｓ００４０、Ｓ０２７６、Ｓ０２７７、Ｓ０４３４、Ｓ００３５、Ｓ００４３、Ｓ０３３０、Ｓ０３３３ Ｓ０２９２、Ｓ００３６、Ｓ００３８、Ｓ０５３２、Ｓ００４５、Ｓ０５３４、Ｓ００４６
染色体４：Ｓ００５６、Ｓ００６１、Ｓ００６３、Ｓ００５２、Ｓ０４４７、Ｓ００４８、Ｓ００５７、Ｓ００５９、Ｓ００５４、Ｓ００５５、Ｓ０４４４、Ｓ０４４３、Ｓ００６０、Ｓ００５１
染色体５：Ｓ００７４、Ｓ０５６２、Ｓ００６８、Ｓ００７２、Ｓ０２８６、Ｓ００７９、Ｓ００６９
染色体６：Ｓ０２３３、Ｓ０２７０、Ｓ０１２７、Ｓ００８６、Ｓ０４９３、Ｓ０４９４、Ｓ０３７０、Ｓ００９７、Ｓ００８９、Ｓ０２７３、Ｓ０１５７、Ｓ００８８
染色体７：Ｓ０１００、Ｓ００９９、Ｓ０２６４、Ｓ０３０４、Ｓ０１８９、Ｓ０１０３、Ｓ０１０４、Ｓ０１１３、Ｓ０５４８、Ｓ０１１８、Ｓ０１１６、Ｓ０３０６、Ｓ０１２５
染色体８：Ｓ０４９９、Ｓ０３０８、Ｓ０１３０、Ｓ０１３５、Ｓ０１３６、Ｓ０１３８、Ｓ０１２８、Ｓ０１３９、Ｓ０１４０、Ｓ０２６６、Ｓ０３３７、Ｓ０１４１、Ｓ０１４４、Ｓ０１４５
染色体９：Ｓ０１５１、Ｓ０３１６、Ｓ０１５２、Ｓ０４６７、Ｓ０１５５、Ｓ０１６７、Ｓ０３１４
染色体１０：Ｓ０３３９、Ｓ０１６８、Ｓ０１６１、Ｓ０３４０、Ｓ０１６６、Ｓ０３４２、Ｓ０１６２、Ｓ０２６９、Ｓ０１６９、Ｓ０１５８、Ｓ０１７０
染色体１１：Ｓ０３８９、Ｓ０３４６、Ｓ０１７９、Ｓ０１８１、Ｓ０１７５
染色体１２：Ｓ０１９６、Ｓ０４６０、Ｓ０２１１、Ｓ０２０８、Ｓ０４６１、Ｓ０２０７、Ｓ０２１０、Ｓ０５８６
また、上記のＳＮＰマーカーに対応するゲノムＰＣＲプライマーセット（５’側プライマー、３’側プライマー）及びＳＮＰプライマーの配列を表１から表４に示す（表中、「Ｋｏ」は「コシヒカリ」を示す。）
（３）交配後代のＳＮＰマーカーによる遺伝子型のタイピング
ＢＣ１Ｆ１種子の休眠打破後、交配後代を播種し、反復親は交配後代より前後に時期をずらして播種する。播種日より７日から１４日後に幼苗の葉を５ｍｍ程度採取する。ゲノムＤＮＡは簡易ゲノム抽出法（Ｌｉｓａ Ｍｏｎｎａ，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９，１１−１７，２００２）により抽出する。
まず、両系統それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型としてＳＮＰを含む領域をＰＣＲにより増幅し、アガロースゲル電気泳動で増幅を確認した後、増幅産物を酵素処理して残存プライマーの分解、モノヌクレオチドの脱リン酸化を行う。次に、ＳＮＰの一塩基手前に作成したＳＮＰプライマーとそれぞれのＳＮＰに対応する２種類の蛍光標識ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ，ｄｄＣＴＰのうちいずれか２種類）を用いて、ＰＣＲ産物を鋳型とし一塩基伸長反応させる（ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ反応）。反応産物はそれぞれのＳＮＰに対応した蛍光偏光度を示すため（Ｃｈｅｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，９，４９２−４９８，１９９９）、この蛍光偏光度を測定し、遺伝子型をタイピングする。
ここで、遺伝子型の「タイピング」とは、ＳＮＰ部位の塩基種が「コシヒカリ」型か、「ＩＲ２４」型かを決定することをいう。この遺伝子型のタイピングは交配後代の幼植物期、イネの場合は播種から出穂までの間に行うことが好ましい。
（４）次世代交配に供する個体の選抜、戻し交配
遺伝子型のタイピング後、グラフィカルマップによる選抜には、（ｉ）目的の遺伝子座（ｓｄ−１遺伝子座）が供与親型、反復親型のヘテロ接合になっていること、（ｉｉ）他の染色体領域において反復親型のホモ接合の割合が高いこと、を基準にすればよい。選抜した個体を次世代の戻し交配に用いることとする。ＢＣ２Ｆ１世代以降の選抜においては１世代前の系統において供与親と反復親のヘテロ接合領域のみ遺伝子型のタイピングを行い、上記と同様の基準で次世代の戻し交配に供する個体を選抜する。
上記の遺伝子のタイピング、選抜、戻し交配からなる操作は、少なくとも３回、好ましくは５回、繰り返せばよい。
（５）自殖
戻し交配、選抜を繰り返し目的の遺伝子座以外に供与親型、反復親型のヘテロ接合が検出されなくなった世代で自殖を行う。
自殖種子を育苗箱に播種し７日後に幼苗の葉よりゲノムＤＮＡを抽出する。目的の遺伝子座（本発明においてはｓｄ−１遺伝子座）のみで遺伝子型のタイピングを行い供与親型のホモ接合となった個体を選抜することで、目的の遺伝子座のみ導入された植物体（半矮性コシヒカリ）を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１） ＳＮＰマーカーの設定
育種に先立ち、反復親として用いる日本型イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｓｐｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）品種「コシヒカリ」と、供与親として用いるインド型（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｓｐｐ．ｉｎｄｉｃａ）イネ品種「ＩＲ２４」間で使用できるＳＮＰマーカーを以下のようにして全染色体上に設定した。
【００００】
まず、「コシヒカリ」、「ＩＲ２４」の成葉からＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，８，４３２１−２５，１９８０；Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．，分子マーカーを利用した有用形質の遺伝解析方法，ｐ．４−１１，２０００）によってゲノムＤＮＡを抽出した。次に、Ｎａｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓ．，９，１６３−１７１，２００２、表３に記載のインド型イネ「廣陸矮４号（Ｇ４）」と野生イネ（Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ）「Ｗ１９４３」間及びその後追加作成された合計２６３個のＳＮＰマーカーに対するゲノムＰＣＲプライマーセット（５’側プライマー、３’側プライマー）を用いて、上記で抽出した「コシヒカリ」、「ＩＲ２４」のそれぞれのゲノムＤＮＡを鋳型としてＳＮＰを含む領域を増幅した。増幅産物をアルカリフォスファターゼとエクソヌクレアーゼＩで処理して残存プライマーの分解、モノヌクレオチドの脱リン酸化を行った。それぞれのＳＮＰに対応するＳＮＰプライマーと２種類の蛍光標識ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ，ｄｄＣＴＰのうちいずれか２種類）を用いて、ＰＣＲ産物を鋳型とし一塩基伸長反応（ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ反応）をＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ ＳＮＰｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。反応産物の蛍光偏光度をマルチラベルカウンターＷａｌｌａｃ１４２０ ＡＲＶＯ ｓｘ（Ｗａｌｌａｃ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で読みとり、ＳＮＰ部位の塩基種（遺伝子型）を判定した（Ｃｈｅｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，９，４９２−４９８，１９９９）。この探索と、公知のイネ塩基配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｒｇｐ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／Ｐｕｂｌｉｃｄａｔａ．ｈｔｍｌ）を利用して新規に作成した１個を合わせ、「コシヒカリ」「ＩＲ２４」間で多型を示す１４１個のＳＮＰマーカーを設定した（表５；表中、カバー率は、日本晴／カサラスおける地図距離、すなわち遺伝的な染色体の大きさに対して作成したＳＮＰマーカーがどれだけ染色体を網羅したかを示す）。また、設定したＳＮＰマーカーの染色体上の位置を図１に示す。
（実施例２） 半矮性コシヒカリの育成
反復親として日本型イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｓｐｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）品種「コシヒカリ」、半矮性遺伝子ｓｄ−１の供与親としてインド型（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｓｐｐ．ｉｎｄｉｃａ）イネ品種「ＩＲ２４」を用いて「半矮性コシヒカリ」の育成を行った。育成スケジュールを下記表６に示す。
短日処理のために、日長調節が可能な遮光カーテン付の温室で行い、午前７時に開き午後５時に閉じるように設定した。栽培は水深１５ｃｍの水槽にてポット栽培を行った。交配において授粉はピンセットで摘みあらかじめ穎花の上部を切除した母本の柱頭にふりかける方法を用い、母本の除雄のために温湯除雄法または剪定法を用いた（山本隆一，農研センター資料，３０，ｐｐ．１７６−１８０，１９９５）。
▲１▼交配〜Ｆ１
２０００年１１月に「コシヒカリ」を同年１１月に「ＩＲ２４」を育苗箱に播種し、播種１４日後にそれぞれをポットへ移植し温室にて栽培した。２００１年２月に「コシヒカリ」が、また「ＩＲ２４」が同年２月に出穂したので、「コシヒカリ」を母本、「ＩＲ２４」を父本として交配を行った。交配は温湯除雄法により行った。同年３月にＦ１種子を得た。
２００１年３月にこのＦ１種子を育苗箱に５粒播種し、同年３月に５株をポットへ移植し温室において栽培した。このＦ１雑種を「ＰＫＳ１」と名付けた。ｓｄ−１遺伝子座は不完全優性を示すために「ＰＫＳ１」の稈長は「コシヒカリ」に近い。
▲２▼第１回戻し交配〜ＢＣ１Ｆ１
この「ＰＫＳ１」は順調に生育し、２００１年７月には出穂が観察されたので「ＰＫＳ１」を母本、「コシヒカリ」を父本として交配を行った。交配は温湯除雄法により行った。同年８月にＢＣ１Ｆ１種子を３４粒得た。
２００１年８月にこれを育苗箱に播種し３４個体の幼苗を得た。播種から１２日後に幼苗の葉を５ｍｍ程度採取し、９６穴のラックチューブ［ＱＩＡＧＥＮ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ（ｒａｃｋｅｄ，１０＊９６）］に入れた。ＴＰＳ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１Ｍ ＫＣｌ）を４００ｕｌ加え、直径３ｍｍのジルコニアビーズ（ＹＴＺボール，ニッカトー）を１個加えチューブキャップ（ＱＩＡＧＥＮ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ Ｃａｐｓ）で封をした後、ミキサーミルＭＭ３００（Ｒｅｔｓｃｈ）を用いて破砕した（３０ｓ−１，１ｍｉｎ）。冷却遠心機（ＨＩＴＡＣＨＩ ＣＲ ２１Ｇ，スイングローター Ｒ３Ｓ，３０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ，４℃）により残渣を沈殿させ、上清１００ｕｌをとり、あらかじめ１００ｕｌのイソプロパノールを分注しておいた９６穴ＰＣＲプレートに加えピペッティングにより混和した。これを室温にて遠心分離し（ＫＵＢＯＴＡ ８１００，ローター ＲＳ−３０１０，２０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，ＲＴ）、上清を除いた後、２００ｕｌの７０％エタノールを加え、同様に遠心分離して上清を除き風乾した。滅菌水を５０ｕｌ加え、ゲノムＤＮＡを溶解させた。
次に、遺伝子型のタイピングを実施例１で設定した１４１個のＳＮＰマーカーを用いて以下のようにして行った。まず、「ＩＲ２４」「コシヒカリ」それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型としてＳＮＰを含む領域をＰＣＲにより増幅した。増幅産物をアルカリフォスファターゼとエクソヌクレアーゼＩによりプライマーを分解し、モノヌクレオチドを脱リン酸化した。それぞれのＳＮＰに対応するＳＮＰプライマー（前記表１〜４参照）と２種類の蛍光標識ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ，ｄｄＣＴＰのうちいずれか２種類）を用いて、ＰＣＲ産物を鋳型として一塩基伸長反応（ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ反応）をＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ ＳＮＰｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。反応産物はそれぞれのＳＮＰに対応した蛍光偏光度を示すため、この蛍光偏光度をマルチラベルカウンターＷａｌｌａｃ１４２０ ＡＲＶＯ ｓｘ（Ｗａｌｌａｃ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で読みとり、遺伝子型のタイピングを行った。
選抜には次の２点、（ｉ）ｓｄ−１遺伝子座において「ＩＲ２４」「コシヒカリ」のヘテロ接合になっていること、（ｉｉ）他の染色体領域において「コシヒカリ」のホモ接合の割合が高いもの、を基準とした。遺伝子型のタイピングと、グラフィカルマップによる選抜は出穂前に完了した。
ｓｄ−１遺伝子座が「コシヒカリ」「ＩＲ２４」のヘテロ接合である個体を１８個体選抜し、このうち２個体を戻し交配に用いた。さらにこのうち１個体を「ＰＫＳ３」と名付けた。
▲３▼第２回戻し交配〜ＢＣ２Ｆ１
２００１年１０月に「ＰＫＳ３」が出穂したので「ＰＫＳ３」を母本、「コシヒカリ」を父本として交配を行った。交配は剪定法により行った。
２００１年１１月にＢＣ２Ｆ１種子を２６粒得た。５０℃，７日間の休眠打破後、同年１２月にこのＢＣ２Ｆ１種子を育苗箱に２６粒播種し、１４個体の幼苗を得た。同年１２月、前述した簡易ゲノムＤＮＡ抽出法により、ゲノムＤＮＡを調製した。ＢＣ２Ｆ１以降の世代の遺伝子型タイピングは１世代前の母本（ＢＣ２Ｆ１においては「ＰＫＳ３」を示す）の染色体領域のうち「コシヒカリ」「ＩＲ２４」のヘテロ接合領域のみを対象とした。この選抜により、ｓｄ−１遺伝子座が「ＩＲ２４」「コシヒカリ」のヘテロ接合である個体を６個体を得、このうち３個体を戻し交配に用いた。さらにこのうち１個体を「ＰＫＳ１３」と名付けた。
▲４▼第３回戻し交配〜ＢＣ３Ｆ１
２００２年２月に「ＰＫＳ１３」が出穂したので、「ＰＫＳ１３」を母本、「コシヒカリ」を父本として交配を行った。交配は剪定法により行った。
２００２年３月にＢＣ３Ｆ１種子を３０粒得た。５０℃，７日間の休眠打破後、同年４月にこのＢＣ３Ｆ１種子を育苗箱に３０粒播種し、２１個体の幼苗を得た。同年４月、前述した簡易ゲノムＤＮＡ抽出法によりゲノムＤＮＡを調製した。「コシヒカリ」「ＩＲ２４」のヘテロ接合領域のみ遺伝子型のタイピングを行い、ｓｄ−１遺伝子座がヘテロ接合である個体を７個体選抜し、このうち３個体を戻し交配に用いた。さらにこのうち１個体を「ＰＫＳ２１」と名付けた。
▲５▼第４回戻し交配〜ＢＣ４Ｆ１
２００２年５月に「ＰＫＳ２１」が出穂したので、「ＰＫＳ２１」を母本、「コシヒカリ」を父本として交配を行った。交配は剪定法により行った。同年６月にＢＣ４Ｆ１種子を３５粒得た。
２００２年７月にＢＣ４Ｆ１種子を５０℃，７日間の休眠打破を行い育苗箱に３５粒播種し、２３個体の幼苗を得た。同年７月、前述した簡易ゲノムＤＮＡ抽出法によりゲノムＤＮＡを調製した。「コシヒカリ」「ＩＲ２４」のヘテロ接合である領域のみを対象として遺伝子型のタイピングを行い、ｓｄ−１遺伝子座がヘテロ接合である個体を１０個体選抜した。このうち最も「コシヒカリ」の染色体に置き換わった１個体を「ＰＫＳ３１」と名付けた。
【００００】
▲６▼自殖及び固定系統選抜〜ＢＣ４Ｆ２
２００２年９月に「ＰＫＳ３１」が出穂したので、そのまま自殖させ種子を６４粒得た。２００２年１０月にＢＣ４Ｆ１種子を５０℃，７日間の休眠打破を行い、育苗箱に６４粒播種し、３１個体の幼苗を得た。ｓｄ−１遺伝子座が「ＩＲ２４」のホモ接合である個体を１１個体選抜した。このうち１系統を「ＰＫＳ３１−２７」と名付け、ここで、ｓｄ−１遺伝子座のみ導入された「コシヒカリ」である「半矮性コシヒカリ」を完成した。
表７に以上の育成経過をまとめた。
「コシヒカリ」、および「コシヒカリ」と「ＩＲ２４」の交配後代（戻し交配４回）の植物体の写真を図２に示す。また、各世代におけるｓｄ−１遺伝子座の遺伝子型と全染色体レベルでの「コシヒカリ」への置換の程度を図３に、また、「半矮性コシヒカリ」育成の流れ図を図４に示す。
（実施例３） 半矮性コシヒカリの栽培
実施例２で育成した「半矮性コシヒカリ」を２００３年度に圃場に展開し試験栽培を行った。試験栽培地は株式会社植物ゲノムセンター（茨城県つくば市観音台）の所内圃場で行った。播種時期は２００３年４月２４日、移植日は２００３年５月２３日であった。２００３年７月７日に鳥害を防ぐために防鳥ネットを圃場にかけた。図５に試験栽培を行った圃場の様子（左側：「コシヒカリ」、右側：「半矮性コシヒカリ」）を示す。
（実施例４） 半矮性コシヒカリの特性
実施例３で示したように「半矮性コシヒカリ」の試験栽培を行い、２００３年９月にその特性調査を行った。特性項目及び特性基準は農水省で公開されている水稲の特性表・特性審査基準に従った。その結果を表８にまとめた。また、圃場で栽培した「半矮性コシヒカリ」と「コシヒカリ」を図６（左側「コシヒカリ」、右側：「半矮性コシヒカリ」）に示す。
（ｉ）出穂期
両品種の出穂日を調査し、播種日（２００３年４月２４日）より出穂に至るまでの日数を求めた。図７に出穂調査の結果を示す。出穂始めとは全個体の１０％以上が出穂した日、出穂日は全個体の５０％以上が出穂した日また出穂揃えは全個体の９０％以上が出穂した日とする。出穂期は「コシヒカリ」と同日であり、出穂始め、出穂揃えも同日であった。したがって、「半矮性コシヒカリ」の出穂特性は全く「コシヒカリ」と同じであるといえる。
（ｉｉ）稈長
移植時には「半矮性コシヒカリ」の苗丈、葉身の形状は「コシヒカリ」に類似していたが、分けつ期、出穂期を経るにつれ次第に草丈に差が現れ、稈長では明らかな差が見られた。成熟期における稈長は「コシヒカリ」より約１０ｃｍ低くなっていた。その結果を図８に示す。
（ｉｉｉ）止葉の直立の程度、穂数、着粒密度、草型
「半矮性コシヒカリ」につき、止葉は「コシヒカリ」より直立しており、受光体勢は良く、穂数は「コシヒカリ」より多い。着粒密度は「コシヒカリ」と差異なく、穂長は１ｃｍほど短くなっている。この結果より、「半矮性コシヒカリ」の草型は偏穂数型と判断された（表８参照）。
（ｉｖ）耐倒伏性、穂首の抽出度
耐倒伏性はｃＬｒ法によるｃＬｒ値により判定した。「半矮性コシヒカリ」の耐倒伏性は「コシヒカリ」より強く、「日本晴」並かあるいは若干劣る程度であった。また、穂首の抽出度は「コシヒカリ」に比べて４ｃｍ程度短くなっており、なびき型倒伏により強くなっている（表８参照）。
（ｖ）地上部全重、玄米の形状、品質
育成地においては、「半矮性コシヒカリ」の地上部全重は「コシヒカリ」と同程度であるにもかかわらず、収量はより多くなっている。これは一穂当たりの籾数が若干少なくなっているにもかかわらず、穂数が多くなっているためである。玄米の形と大きさは「コシヒカリ」、「日本晴」と同程度であった。光沢、腹白、胴割は「コシヒカリ」と同程度で、玄米の外観品質も「コシヒカリ」と同程度と判定された（表８参照）。また、「半矮性コシヒカリ」と「コシヒカリ」の籾、玄米の外観を図９に示す。
（ｖｉ）食味、穂発芽性
「半矮性コシヒカリ」の食味について炊飯米の外観、香り、味、粘り、硬さの５項目より総合的に判断する官能試験で判定した。２００３年に収穫した「コシヒカリ」「半矮性コシヒカリ」とを供試した結果、「コシヒカリ」と同等の上中と判定された。穂発芽性は「コシヒカリ」と同程度で、穂発芽性易の「キヌヒカリ」と比較して難と判定された（表８参照）。
これらの特性検定によりｓｄ−１遺伝子座による半矮性の形質が発現する一方で、良食味である「コシヒカリ」の形質が保持されていることが裏付けられた。またこれは、ｓｄ−１遺伝子座のみ導入されているという遺伝子タイピングの結果に符合した。ここで、改良植物品種の迅速な育種法により半矮性コシヒカリを２年で育成できた。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、連続戻し交配育種法による植物への新形質付与を従来より迅速かつより省力的に行う方法が提供され、イネ品種の育種の効率化が図れる。また、本発明により育成された半矮性コシヒカリは良食味と高い倒伏性を兼ね備えており、安定した収量、品質を提供しうる。さらにこれを中間母本として本発明の方法で新形質を付与していくことで、良食味を保持したままより付加価値の高い品種を迅速に育成することが可能となる。
本発明により育成された半矮性コシヒカリは、遺伝子組換えによらず作出されたものであるので、安全性が高く、一般消費者が安心して受け入れることができ、その需要にかなうものである。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１〜４２３：合成ＤＮＡ
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【技術分野】
本発明は、目的形質が導入された改良植物品種の迅速な育種方法、及び該方法により作出された改良植物品種、詳しくは「コシヒカリ」を反復親とし、半矮性形質を有する「ＩＲ２４」を供与親とする連続戻し交配において、一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーを用いてタイピングした遺伝子型に基づいて次世代の交配に供する供与親を選抜することを特徴とする改良イネ品種の迅速な育種方法、及び該方法により作出された改良イネ品種に関する。
【背景技術】
作物の交雑育種では、望ましい形質を持つ品種・系統を交配し、その雑種後代からより優れた性質を持つ個体を選んで新品種を作出する。従来は、そのような雑種後代における個体の選抜を表現型によって行っていた。そのため、特性評価や個体選抜に膨大な手間と時間がかかり、１つの品種を育成には十数年の年月が必要だった。また、このような方法では同じものを選ぶことができる再現性は低く、基本的には偶然性の度合いが高い。突然変異体を用いた育種法や、培養変異を用いた細胞培養育種方法も品種育成に用いられるが、いずれも新規形質の付与が困難であったり、他形質に影響を及ぼす可能性もあって好ましいとはいえない。
福井県の農業試験場で作出された「コシヒカリ」は良食味品種として多くの人々に支持され、品種化されてから現在に至るまでの約半世紀にわたり栽培されている。栽培技術の改良と消費者の良食味志向により作付面積は年々拡大し、栽培の限界も北上しつつある。一方で、「コシヒカリ」は長稈で台風により倒伏しやすく、またいもち病に弱いという欠点がある。従って良食味を生かしつつ、耐倒伏性や、耐病性などの付与が求められている。
そこで良食味米としての「コシヒカリ」の特徴を保持したまま短稈化させるために、稈を矮化させる遺伝子座のみを導入することが試みられている。従来の育種法では、ある優れた品種（反復親）に他品種（供与親）の特定の遺伝子座のみを導入する場合にはＦ１雑種に反復親を用いて「連続戻し交配」し、表現型のみを用いて選抜を行ってきた。しかしながら、この育種法においては選抜に経験を要し、染色体を置換するのに年月がかかりなおかつ当該遺伝子座の遺伝子作用が劣性である場合には選抜に際して困難を伴うという問題点がある。従って、この「連続戻し交配」による染色体の置換を効率的に行うことができれば育種期間の短縮に繋がるだけでなく、余分な領域の混入を正確に除くことができるはずである。
イネゲノム解析の初期段階から、ゲノム解析技術を育種に役立てることが育種現場との連携の下に検討されてきた。最初の段階では目的とする遺伝形質と連鎖するＤＮＡマーカーを作ること（標識化）が行われた（Ｋｕｒａｔａ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，８，３６５−３７２，１９９４；Ｈａｒｕｓｈｉｍａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４８，４７９−４９４，１９９８）。多くの遺伝子が関与する量的形質遺伝子座（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｕｓ：ＱＴＬ）の解析にもＤＮＡマーカーが利用され、矢野らはこの解析により出穂期に関連するいくつかの遺伝子を見出し、それらを組み合わせて様々な出穂期を示すイネを作出した（Ｙａｎｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２７，１４２５−１４２９，２００１参照）。ＤＮＡマーカーについては従来のＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）マーカーに代わり、ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）、ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＣＡＰＳ（Ｃｌｅａｖｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、ＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ）などのマーカーが登場し、これらを用いた育種法が開発されている（ＭｃＣｏｕｃｈ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５，８９−９９，１９９７；Ｙａｎｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ｈｔｔｐ：／／ｒｇｐ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｐｕｂｌｉｃｄａｔａ／ｃａｐｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ参照）。
連続戻し交配育種法では目的遺伝子座周辺に上記ＤＮＡマーカーを設定し、各世代の選抜の際に遺伝子型をそれらのマーカーを用いて分析し、目的遺伝座を保持しつつ、他の染色体を反復親の染色体に置換していく。しかしながら、この方法では特定の遺伝子座周辺の遺伝子型のみで選抜を行うため、その遺伝子座以外の全染色体を反復親の染色体に置換するには時間を要する。従って、この時間を短縮するために全染色体にＤＮＡマーカーを設定し、各世代において置換の程度の高い個体を選抜できることが望まれる。
本発明者らのグループでは、イネゲノム全域の一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）の探索を行い、育種に利用可能なマーカー化を行っている（Ｎａｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓ．，９，１６３−１７１，２００２）。
本発明の課題は、改良植物品種の作出を目的とした連続戻し交配において、次世代の交配に供する個体の選抜効率を高め、迅速な育種方法を提供することにある。また、本発明のさらなる課題は、「コシヒカリ」の良食味を保持したまま耐倒伏性を付与した改良イネ品種を短期間に作出することにある。
【発明の開示】
本発明者らは上記課題を解決すべき鋭意研究を重ねた結果、植物ゲノム全域を網羅する一塩基多型（ＳＮＰ）マーカー（以下、ＳＮＰマーカーと記載する）を用いることによって、連続戻し交配後代の染色体の遺伝子型を幼植物期において迅速にタイピングでき、次世代の交配に供する個体の選抜が飛躍的に効率化できることを見出した。その結果、所望の改良植物品種を短期間に作出することに成功し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）目的形質が導入された改良植物品種の迅速な育種方法であって、以下の工程：
（ａ）対象となる植物品種に目的形質を有する他の植物品種を交配し、
（ｂ）交配後代の染色体の遺伝子型を、幼植物期においてＳＮＰマーカーを用いてタイピングし、
（ｃ）タイピングした遺伝子型に基づいて次世代の交配に供する個体を選抜し、
（ｄ）選抜した個体に前記の対象となる植物品種を戻し交配し、
（ｅ）上記（ｂ）から（ｄ）の工程を少なくとも３回繰り返すこと、
を含む、前記育種方法。
（２） 対象となる植物品種がイネ品種である、上記（１）の方法。
（３） イネ品種が「コシヒカリ」である、上記（２）の方法。
（４） 他の植物品種が半矮性遺伝子を有するイネ品種である、上記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（５） 半矮性遺伝子を有するイネ品種がｓｄ−１遺伝子を有する「ＩＲ２４」である、上記（４）の方法。
（６） 上記（１）から（５）のいずれかの方法により作出された改良植物品種。
（７） 「ＩＲ２４」由来のｓｄ−１遺伝子座がホモ接合であり、それ以外の染色体領域が「コシヒカリ」由来の染色体で構成されていることを特徴とする、上記（１）から（５）のいずれかの方法により作出された改良イネ品種。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＩＲ２４」「コシヒカリ」間で利用できるＳＮＰマーカーの染色体上の分布を示す。地図距離は「日本晴」「カサラス」の地図に準ずる。
図２は、「コシヒカリ」、および「コシヒカリ」と「ＩＲ２４」の交配後代（戻し交配４回）の植物体の写真を示す。
図３は、各世代におけるｓｄ−１遺伝子座の遺伝子型と全染色体レベルでの「コシヒカリ」への置換の程度を示す。
図４は、「半矮性コシヒカリ」育成の流れ図を示す。置換率とは全マーカーに対して「コシヒカリ」「ＩＲ２４」ヘテロ型の遺伝子型が観測されたマーカーの割合である（図中、１：「コシヒカリ」ホモ接合領域、２：「ＩＲ２４」「コシヒカリ」ヘテロ接合領域、３：「ＩＲ２４」ホモ接合領域を表す）。
図５は、「半矮性コシヒカリ」の所内圃場試験栽培の様子である。左側が「コシヒカリ」、右側が「半矮性コシヒカリ」である。
図６は、所内圃場で試験栽培した株である。左側が「コシヒカリ」、右側が「半矮性コシヒカリ」である。
図７は、所内圃場で栽培した「半矮性コシヒカリ」と「コシヒカリ」の到穂日数を示す（出穂始め：全個体の１０％以上が出穂した日、出穂日：全個体の５０％以上が出穂した日、出穂揃え：全個体の９０％以上が出穂した日）。
図８は、「半矮性コシヒカリ」と「コシヒカリ」の稈長を示す。図中のエラーバーは平均値と標準偏差を示す。
図９は、「半矮性コシヒカリ」と「コシヒカリ」の籾と玄米の写真を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００３年１月３１日に出願された日本国特許出願２００３−０２４１４３号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本発明は、目的形質が導入された改良植物品種の迅速な育種方法であって、以下の工程：
（ａ）対象となる植物品種に目的形質を有する他の植物品種を交配し、
（ｂ）交配した後代の染色体の遺伝子型を、幼植物期においてＳＮＰマーカーを用いてタイピングし、
（ｃ）タイピングした遺伝子型に基づいて次世代の交配に供する個体を選抜し、
（ｄ）選抜した個体に前記の対象となる植物品種を戻し交配し、
（ｅ）上記（ｂ）から（ｄ）の工程を少なくとも３回繰り返すこと、
を含むことを特徴とする。
本発明の育種方法は、従来の交雑育種に、ゲノム全域をカバーするマーカーを用いた効率的な解析に基づく雑種後代の個体の選抜と世代促進を組み合わせた画期的な方法であり、非常に短期間に確実に新形質を付加する新しい育種方法である。
本発明において、「対象となる植物品種」とは、優良品種ではあるが、改良すべき形質を有する植物品種をいい、戻し交配における「反復親」に該当する。
一方、「目的形質を有する植物品種」とは、上記の「対象となる植物品種」における改良すべき形質を有している他の品種をいい、戻し交配における「供与親」に該当する。
本発明の育種方法の対象となる植物としては、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ．）、トウモロコシ（Ｚｅａｍａｙｓ Ｌ．）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ Ｂｉｃｏｌｏｒ）、トマト（Ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、オランダイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ ａｎａｎａｓｓａ）、キク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｃｖｓ）などが挙げられるが、ゲノム配列データが公開されているイネ（Ｏｔｙｚａ ｓａｔｉｖａ）をはじめとしてイネと遺伝的相同性（シンテニー）を持つイネ科の植物（Ｇａｌｅ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２（５３８９），６５６−６５９（１９９８））、例えばコムギ、オオムギ、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ Ｌ．）、トウモロコシ、ソルガム、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ Ｌ．）が好ましい。
「目的形質を有する植物品種」は、「対象となる植物品種」に目的形質を導入できる限り特には限定されないが、同種の植物で、和合性を持つものであることが好ましい。例えば「対象となる植物品種」が「コシヒカリ」の場合、「目的形質を有する植物品種」として矮化遺伝子を有するイネ品種を用いれば、「コシヒカリ」に耐倒伏性を付与することができる。矮化遺伝子を有するイネ品種としては、いくつかの種類が存在するが、半矮性遺伝子であるｓｄ−１遺伝子をもつインド型イネ品種「ＩＲ２４」が好ましい。「ＩＲ２４」はＧｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ ２０−ｏｘｉｄａｓｅをコードするｓｄ−１遺伝子が欠損変異しており（Ｌｉｓａ Ｍｏｎｎａ，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓｅｒｃｈ，９，１１−１７，２００２）、「ＩＲ２４」型ｓｄ−１遺伝子のホモ接合体は半矮性を示し、短稈化する一方で収量形質に影響を及ぼさないので好適である（Ｆｕｔｓｕｈａｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｉｃｅ Ｐｌａｎｔ，ｖｏｌ．３；Ｍａｔｓｕｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｏｌｉｃｙ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｏｋｙｏ，３００−３１８，１９９７）。これに対し、矮性遺伝子であるｄ１、ｄ６１（Ａｓｈｉｋａｒｉ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９６，１０２８４−１０２８９，１９９９；Ｙａｍａｍｕｒｏ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１２，１５９１−１６０５，２０００）は、イネを短稈化させる遺伝子として知られているが、これらは穂の長さ、米粒の大きさをも矮化させ収量形質を悪化させるという、いわゆる矮性の形質を示し、好ましくない。
本発明において、「矮性遺伝子」とは正常型より稈長を短縮させ、穂長、種子の粒形を矮化させる作用を持つ遺伝子（狭義の矮性遺伝子）をいい、「半矮性遺伝子」とは正常型より稈長を短縮させる一方で、穂長、種子の粒形等の収量形質には影響を与えない遺伝子をいう。また、「矮化遺伝子」とは、正常型より稈長を短縮させる作用を持つ遺伝子（広義の矮性遺伝子）をいい、「矮性遺伝子」と「半矮性遺伝子」とを包含する。
本発明において、「連続戻し交配」又は「戻し交配」とは、反復親と供与親とを交配することによって得られた交配後代から次世代の交配に供する個体を選抜し、反復親を再びその選抜した個体に交配する操作を繰り返すことをいう。かかる交配によって、最終的に目的の遺伝子座が供与親型のホモ接合で、それ以外の染色体領域が反復親由来の染色体で構成されている植物体を得ることができる。
本発明においては、交配後代の染色体の遺伝子型を、幼植物期においてＳＮＰマーカーを用いてタイピングし、染色体の遺伝子型に基づいて次世代の交配に供する個体を選抜する。
ここで、「一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）」とは、塩基配列において１個の塩基が変異した多型をいい、本発明においては「対象となる植物品種」と「目的形質を有する植物品種」との間の点変異を意味する。本発明においては、ＳＮＰは一塩基の置換による多型を意味するほか、塩基の挿入又は欠失もＳＮＰに含めることことする。
また、「幼植物期」とは、胚〜発芽期の形態から成体への移行過程をいう。
以下、イネを例に本発明方法について具体的に説明する。
（１）反復親と供与親の交配
イネの世代促進のために、栽培は日長調節が可能な遮光カーテン付の温室で行うことが好ましい。発芽しにくい種子については、４０−５０℃で１週間程度保温することで休眠打破しておく。催芽は、２日間種子を水に浸し、３０℃に保温することによって行い、催芽期間中は水を毎日交換する。反復親と供与親の出穂期が大きく異なる場合には、出穂が揃うように両系統の種子を催芽、播種、育成しておく。
催芽開始より２日後、育苗箱に播種し、播種から２週間後にプラスチックポットに移植、栽培を行う。反復親（「コシヒカリ」）と供与親（「ＩＲ２４」）が出穂したら交配を行う。
交配は、まず母本の除雄を行い、次に授粉を行う。母本の除雄法としては、温湯除雄法又は剪定法が挙げられる。温湯除雄法は、除雄のために出穂後２、３日後の穂を４２℃の７分間温湯に浸し、その後開花した穎花上部を切除し、開花しない穎花は切除する方法である。剪定法は、出穂後２、３日後の穎花のうち開花が予測される穎花の上部を切除しピンセットで雄蕊を除去する一方でそれ以外の穎花は切除する方法である。授粉は父本の雄蕊をピンセットで摘み取り母本の柱頭にふりかけることで行う。
種子は交配を行った日より３週間から４週間程度で登熟するのでＦ１世代の種子回収を行う。Ｆ１種子は両親系統と同じように休眠打破後、催芽し、播種する。反復親の播種は、交配後代（ここではＦ１）の出穂期が予測しえない場合、Ｆ１種子の播種日に前後して播種を行えばよい。Ｆ１雑種と反復親が出穂したら戻し交配を行う。交配後３週間から４週間程度で登熟するので、ＢＣ１Ｆ１世代の種子回収を行う。
（２）ＳＮＰマーカーの設定
交配後代の染色体の遺伝子型をタイピングするために、あらかじめ反復親、供与親間で使用できるＳＮＰマーカーを全染色体上に設定しておく。
「コシヒカリ」、「ＩＲ２４」からのゲノムＤＮＡ抽出は、ＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ，Ｍ．Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，８，４３２１−４３２５，１９８０；Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．，分子マーカーを利用した有用形質の遺伝解析方法，ｐｐ．４−１１，２０００）を用いて行う。
ＳＮＰマーカーの設定にはＲｉｃｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＲＧＰ）により公開されているイネＥＳＴ，ＢＡＣ等の塩基配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｒｇｐ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／Ｐｕｂｌｉｃｄａｔａ．ｈｔｍｌ）や、他の品種間で既に公知のＳＮＰマーカーの情報、例えば、Ｎａｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓ．，９，１６３−７１，２００２に記載のＳＮＰマーカーの情報が利用できる。
他の品種間で既に公知のＳＮＰマーカーの情報を用いる場合、例えば以下の方法によってＳＮＰマーカーの設定を行う。「コシヒカリ」、「ＩＲ２４」のそれぞれのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＳＮＰを含む領域をＮａｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓ．，９，１６３−７１，２００２に開示されている、インド型イネ「廣陸矮４号（Ｇ４）」と野生イネ（Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ）「Ｗ１９４３」間で使用できるＳＮＰマーカーに対するゲノムＰＣＲプライマーセット（５’側プライマー、３’側プライマー）を用いてＰＣＲによって増幅し、増幅産物を酵素処理して残存プライマーの分解、モノヌクレオチドの脱リン酸化を行う。次に、それぞれのＳＮＰに対応するＳＮＰプライマー（ＳＮＰの一塩基手前に３’末端が位置するプライマー）と２種類の蛍光標識ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ，ｄｄＣＴＰのうちいずれか２種類）を用いて、上記ＰＣＲ産物を鋳型として一塩基伸長反応（ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ反応）を行い、蛍光偏光度を測定し、ＳＮＰ部位の塩基種（遺伝子型）を判定する（ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ法；Ｃｈｅｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，９，４９２−９８，１９９９）。「コシヒカリ」、「ＩＲ２４」間に公知の情報と同じＳＮＰが存在する場合、そのＳＮＰプライマーを「コシヒカリ」、「ＩＲ２４」間のＳＮＰマーカーとして設定することができる。ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ反応には、市販の試薬、例えばＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ ＳＮＰｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いることができる。
一方、公知のＳＮＰマーカーの情報を用いない場合は、例えば、以下の方法によってＳＮＰマーカーの設定を行うことができる。公表されているゲノム配列とＲｉｃｅＧＡＡＳ（Ｓａｋａｔａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０，９８−１０２，２００２；ｈｔｔｐ：／／ＲｉｃｅＧＡＡＳ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）を用いて推定される遺伝子間領域内の５００から１０００ｂｐの断片を増幅するプライマーを設計する。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅をアガロースゲル電気泳動で確認した後、増幅産物を酵素処理して残存プライマーの分解、モノヌクレオチドの脱リン酸化を行う。増幅断片のヌクレオチド配列を決定し、「コシヒカリ」、「ＩＲ２４」２品種の配列を市販のソフトウェア（例えばＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いてアラインメントし、ＳＮＰを探索する。
ＳＮＰが検出された断片につき、ＳＮＰの一塩基手前に３’末端が位置するプライマー（ＳＮＰプライマー）を設計する。このＳＮＰプライマーと２種類の蛍光標識ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ，ｄｄＣＴＰのうちいずれか２種類）を用いて上記ＰＣＲ産物を鋳型として一塩基伸長反応（ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ反応）を行い、蛍光偏光度を測定することによってＳＮＰ部位の塩基種（遺伝子型）を判定する（ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ法）。判定した遺伝子型が前記の配列決定の結果から予想されるものと同じである場合、そのＳＮＰプライマーをＳＮＰマーカーとして設定することができる。
ＳＮＰ検出は、上記のＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ法（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９，４９２−４９８，１９９９）のほか、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法（Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｏｎｙｍｏｕｓ Ａｌｕ ｒｅｐｅａｔｓ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，１１，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｊａｎ １，１２（１），１３９−１４６，１９９２；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ａｕｇ １，６（８），１３１３−１３１８，１９９１；Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ＰＣＲ−ＳＳＣＰ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．，Ａｐｒ １，４（５），２７５−２８２，１９９５）、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐｐ．９４−１０５；Ｇｅｎｅｔ Ａｎａｌ．，１４，１４３−１４９，１９９９）、Ｉｎｖａｄｅｒ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐｐ．９４−１０５；Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，３３０−３４３，２０００）、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０，１０３−１１０，２０００）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ法（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８，７７−８４，２０００）、ＤＮＡアレイ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐｐ．１２８−１３５；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２，１６４−１６７，１９９９）等によっても行うことができる。
本発明においては、ＳＮＰマーカーの中から、対象となる植物の染色体１本あたり少なくとも５個、または１５ｃＭ当たり少なくとも１つのＳＮＰマーカーが存在するように、ほぼ均等に設定することが好ましい。「均等」とは、染色体の一定領域にＳＮＰマーカーが集中しないように、染色体上にほぼ満遍なく、網羅的にＳＮＰが存在していることをいう。
本発明の育種方法を適用する「コシヒカリ」と「ＩＲ２４」との間で利用できるＳＮＰマーカーは、例えばイネ染色体１から１２に存在する以下の多型である。
染色体１：Ｓ０３４９、Ｓ０００２、Ｓ０００３、Ｓ０３５３、Ｓ０２４７、Ｓ０５５４、Ｓ０４１９、Ｓ００１５、Ｓ０００８、Ｓ０３５８、Ｓ００１０、Ｓ００１１、Ｓ００１３、Ｓ０２５９、Ｓ０００７、Ｓ０５１３
染色体２：Ｓ０５１４、Ｓ００３１、Ｓ０２６２、Ｓ０４２８、Ｓ０４２９、Ｓ０２９６、Ｓ００２８、Ｓ００１８、Ｓ０４３０、Ｓ０２９８、Ｓ００２３、Ｓ００２４、Ｓ０１９９、Ｓ０３７８、Ｓ００２１、Ｓ０３７９、Ｓ０３０２、Ｓ０３８０
染色体３：Ｓ０５２４、Ｓ００４０、Ｓ０２７６、Ｓ０２７７、Ｓ０４３４、Ｓ００３５、Ｓ００４３、Ｓ０３３０、Ｓ０３３３ Ｓ０２９２、Ｓ００３６、Ｓ００３８、Ｓ０５３２、Ｓ００４５、Ｓ０５３４、Ｓ００４６
染色体４：Ｓ００５６、Ｓ００６１、Ｓ００６３、Ｓ００５２、Ｓ０４４７、Ｓ００４８、Ｓ００５７、Ｓ００５９、Ｓ００５４、Ｓ００５５、Ｓ０４４４、Ｓ０４４３、Ｓ００６０、Ｓ００５１
染色体５：Ｓ００７４、Ｓ０５６２、Ｓ００６８、Ｓ００７２、Ｓ０２８６、Ｓ００７９、Ｓ００６９
染色体６：Ｓ０２３３、Ｓ０２７０、Ｓ０１２７、Ｓ００８６、Ｓ０４９３、Ｓ０４９４、Ｓ０３７０、Ｓ００９７、Ｓ００８９、Ｓ０２７３、Ｓ０１５７、Ｓ００８８
染色体７：Ｓ０１００、Ｓ００９９、Ｓ０２６４、Ｓ０３０４、Ｓ０１８９、Ｓ０１０３、Ｓ０１０４、Ｓ０１１３、Ｓ０５４８、Ｓ０１１８、Ｓ０１１６、Ｓ０３０６、Ｓ０１２５
染色体８：Ｓ０４９９、Ｓ０３０８、Ｓ０１３０、Ｓ０１３５、Ｓ０１３６、Ｓ０１３８、Ｓ０１２８、Ｓ０１３９、Ｓ０１４０、Ｓ０２６６、Ｓ０３３７、Ｓ０１４１、Ｓ０１４４、Ｓ０１４５
染色体９：Ｓ０１５１、Ｓ０３１６、Ｓ０１５２、Ｓ０４６７、Ｓ０１５５、Ｓ０１６７、Ｓ０３１４
染色体１０：Ｓ０３３９、Ｓ０１６８、Ｓ０１６１、Ｓ０３４０、Ｓ０１６６、Ｓ０３４２、Ｓ０１６２、Ｓ０２６９、Ｓ０１６９、Ｓ０１５８、Ｓ０１７０
染色体１１：Ｓ０３８９、Ｓ０３４６、Ｓ０１７９、Ｓ０１８１、Ｓ０１７５
染色体１２：Ｓ０１９６、Ｓ０４６０、Ｓ０２１１、Ｓ０２０８、Ｓ０４６１、Ｓ０２０７、Ｓ０２１０、Ｓ０５８６
また、上記のＳＮＰマーカーに対応するゲノムＰＣＲプライマーセット（５’側プライマー、３’側プライマー）及びＳＮＰプライマーの配列を表１から表４に示す（表中、「Ｋｏ」は「コシヒカリ」を示す。）
（３）交配後代のＳＮＰマーカーによる遺伝子型のタイピング
ＢＣ１Ｆ１種子の休眠打破後、交配後代を播種し、反復親は交配後代より前後に時期をずらして播種する。播種日より７日から１４日後に幼苗の葉を５ｍｍ程度採取する。ゲノムＤＮＡは簡易ゲノム抽出法（Ｌｉｓａ Ｍｏｎｎａ，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９，１１−１７，２００２）により抽出する。
まず、両系統それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型としてＳＮＰを含む領域をＰＣＲにより増幅し、アガロースゲル電気泳動で増幅を確認した後、増幅産物を酵素処理して残存プライマーの分解、モノヌクレオチドの脱リン酸化を行う。次に、ＳＮＰの一塩基手前に作成したＳＮＰプライマーとそれぞれのＳＮＰに対応する２種類の蛍光標識ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ，ｄｄＣＴＰのうちいずれか２種類）を用いて、ＰＣＲ産物を鋳型とし一塩基伸長反応させる（ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ反応）。反応産物はそれぞれのＳＮＰに対応した蛍光偏光度を示すため（Ｃｈｅｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，９，４９２−４９８，１９９９）、この蛍光偏光度を測定し、遺伝子型をタイピングする。
ここで、遺伝子型の「タイピング」とは、ＳＮＰ部位の塩基種が「コシヒカリ」型か、「ＩＲ２４」型かを決定することをいう。この遺伝子型のタイピングは交配後代の幼植物期、イネの場合は播種から出穂までの間に行うことが好ましい。
（４）次世代交配に供する個体の選抜、戻し交配
遺伝子型のタイピング後、グラフィカルマップによる選抜には、（ｉ）目的の遺伝子座（ｓｄ−１遺伝子座）が供与親型、反復親型のヘテロ接合になっていること、（ｉｉ）他の染色体領域において反復親型のホモ接合の割合が高いこと、を基準にすればよい。選抜した個体を次世代の戻し交配に用いることとする。ＢＣ２Ｆ１世代以降の選抜においては１世代前の系統において供与親と反復親のヘテロ接合領域のみ遺伝子型のタイピングを行い、上記と同様の基準で次世代の戻し交配に供する個体を選抜する。
上記の遺伝子のタイピング、選抜、戻し交配からなる操作は、少なくとも３回、好ましくは５回、繰り返せばよい。
（５）自殖
戻し交配、選抜を繰り返し目的の遺伝子座以外に供与親型、反復親型のヘテロ接合が検出されなくなった世代で自殖を行う。
自殖種子を育苗箱に播種し７日後に幼苗の葉よりゲノムＤＮＡを抽出する。目的の遺伝子座（本発明においてはｓｄ−１遺伝子座）のみで遺伝子型のタイピングを行い供与親型のホモ接合となった個体を選抜することで、目的の遺伝子座のみ導入された植物体（半矮性コシヒカリ）を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１） ＳＮＰマーカーの設定
育種に先立ち、反復親として用いる日本型イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｓｐｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）品種「コシヒカリ」と、供与親として用いるインド型（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｓｐｐ．ｉｎｄｉｃａ）イネ品種「ＩＲ２４」間で使用できるＳＮＰマーカーを以下のようにして全染色体上に設定した。
【００００】
まず、「コシヒカリ」、「ＩＲ２４」の成葉からＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，８，４３２１−２５，１９８０；Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．，分子マーカーを利用した有用形質の遺伝解析方法，ｐ．４−１１，２０００）によってゲノムＤＮＡを抽出した。次に、Ｎａｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓ．，９，１６３−１７１，２００２、表３に記載のインド型イネ「廣陸矮４号（Ｇ４）」と野生イネ（Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ）「Ｗ１９４３」間及びその後追加作成された合計２６３個のＳＮＰマーカーに対するゲノムＰＣＲプライマーセット（５’側プライマー、３’側プライマー）を用いて、上記で抽出した「コシヒカリ」、「ＩＲ２４」のそれぞれのゲノムＤＮＡを鋳型としてＳＮＰを含む領域を増幅した。増幅産物をアルカリフォスファターゼとエクソヌクレアーゼＩで処理して残存プライマーの分解、モノヌクレオチドの脱リン酸化を行った。それぞれのＳＮＰに対応するＳＮＰプライマーと２種類の蛍光標識ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ，ｄｄＣＴＰのうちいずれか２種類）を用いて、ＰＣＲ産物を鋳型とし一塩基伸長反応（ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ反応）をＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ ＳＮＰｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。反応産物の蛍光偏光度をマルチラベルカウンターＷａｌｌａｃ１４２０ ＡＲＶＯ ｓｘ（Ｗａｌｌａｃ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で読みとり、ＳＮＰ部位の塩基種（遺伝子型）を判定した（Ｃｈｅｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，９，４９２−４９８，１９９９）。この探索と、公知のイネ塩基配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｒｇｐ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／Ｐｕｂｌｉｃｄａｔａ．ｈｔｍｌ）を利用して新規に作成した１個を合わせ、「コシヒカリ」「ＩＲ２４」間で多型を示す１４１個のＳＮＰマーカーを設定した（表５；表中、カバー率は、日本晴／カサラスおける地図距離、すなわち遺伝的な染色体の大きさに対して作成したＳＮＰマーカーがどれだけ染色体を網羅したかを示す）。また、設定したＳＮＰマーカーの染色体上の位置を図１に示す。
（実施例２） 半矮性コシヒカリの育成
反復親として日本型イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｓｐｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）品種「コシヒカリ」、半矮性遺伝子ｓｄ−１の供与親としてインド型（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｓｐｐ．ｉｎｄｉｃａ）イネ品種「ＩＲ２４」を用いて「半矮性コシヒカリ」の育成を行った。育成スケジュールを下記表６に示す。
短日処理のために、日長調節が可能な遮光カーテン付の温室で行い、午前７時に開き午後５時に閉じるように設定した。栽培は水深１５ｃｍの水槽にてポット栽培を行った。交配において授粉はピンセットで摘みあらかじめ穎花の上部を切除した母本の柱頭にふりかける方法を用い、母本の除雄のために温湯除雄法または剪定法を用いた（山本隆一，農研センター資料，３０，ｐｐ．１７６−１８０，１９９５）。
▲１▼交配〜Ｆ１
２０００年１１月に「コシヒカリ」を同年１１月に「ＩＲ２４」を育苗箱に播種し、播種１４日後にそれぞれをポットへ移植し温室にて栽培した。２００１年２月に「コシヒカリ」が、また「ＩＲ２４」が同年２月に出穂したので、「コシヒカリ」を母本、「ＩＲ２４」を父本として交配を行った。交配は温湯除雄法により行った。同年３月にＦ１種子を得た。
２００１年３月にこのＦ１種子を育苗箱に５粒播種し、同年３月に５株をポットへ移植し温室において栽培した。このＦ１雑種を「ＰＫＳ１」と名付けた。ｓｄ−１遺伝子座は不完全優性を示すために「ＰＫＳ１」の稈長は「コシヒカリ」に近い。
▲２▼第１回戻し交配〜ＢＣ１Ｆ１
この「ＰＫＳ１」は順調に生育し、２００１年７月には出穂が観察されたので「ＰＫＳ１」を母本、「コシヒカリ」を父本として交配を行った。交配は温湯除雄法により行った。同年８月にＢＣ１Ｆ１種子を３４粒得た。
２００１年８月にこれを育苗箱に播種し３４個体の幼苗を得た。播種から１２日後に幼苗の葉を５ｍｍ程度採取し、９６穴のラックチューブ［ＱＩＡＧＥＮ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ（ｒａｃｋｅｄ，１０＊９６）］に入れた。ＴＰＳ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１Ｍ ＫＣｌ）を４００ｕｌ加え、直径３ｍｍのジルコニアビーズ（ＹＴＺボール，ニッカトー）を１個加えチューブキャップ（ＱＩＡＧＥＮ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ Ｃａｐｓ）で封をした後、ミキサーミルＭＭ３００（Ｒｅｔｓｃｈ）を用いて破砕した（３０ｓ−１，１ｍｉｎ）。冷却遠心機（ＨＩＴＡＣＨＩ ＣＲ ２１Ｇ，スイングローター Ｒ３Ｓ，３０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ，４℃）により残渣を沈殿させ、上清１００ｕｌをとり、あらかじめ１００ｕｌのイソプロパノールを分注しておいた９６穴ＰＣＲプレートに加えピペッティングにより混和した。これを室温にて遠心分離し（ＫＵＢＯＴＡ ８１００，ローター ＲＳ−３０１０，２０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，ＲＴ）、上清を除いた後、２００ｕｌの７０％エタノールを加え、同様に遠心分離して上清を除き風乾した。滅菌水を５０ｕｌ加え、ゲノムＤＮＡを溶解させた。
次に、遺伝子型のタイピングを実施例１で設定した１４１個のＳＮＰマーカーを用いて以下のようにして行った。まず、「ＩＲ２４」「コシヒカリ」それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型としてＳＮＰを含む領域をＰＣＲにより増幅した。増幅産物をアルカリフォスファターゼとエクソヌクレアーゼＩによりプライマーを分解し、モノヌクレオチドを脱リン酸化した。それぞれのＳＮＰに対応するＳＮＰプライマー（前記表１〜４参照）と２種類の蛍光標識ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ，ｄｄＣＴＰのうちいずれか２種類）を用いて、ＰＣＲ産物を鋳型として一塩基伸長反応（ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ反応）をＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ−ＦＰ ＳＮＰｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。反応産物はそれぞれのＳＮＰに対応した蛍光偏光度を示すため、この蛍光偏光度をマルチラベルカウンターＷａｌｌａｃ１４２０ ＡＲＶＯ ｓｘ（Ｗａｌｌａｃ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で読みとり、遺伝子型のタイピングを行った。
選抜には次の２点、（ｉ）ｓｄ−１遺伝子座において「ＩＲ２４」「コシヒカリ」のヘテロ接合になっていること、（ｉｉ）他の染色体領域において「コシヒカリ」のホモ接合の割合が高いもの、を基準とした。遺伝子型のタイピングと、グラフィカルマップによる選抜は出穂前に完了した。
ｓｄ−１遺伝子座が「コシヒカリ」「ＩＲ２４」のヘテロ接合である個体を１８個体選抜し、このうち２個体を戻し交配に用いた。さらにこのうち１個体を「ＰＫＳ３」と名付けた。
▲３▼第２回戻し交配〜ＢＣ２Ｆ１
２００１年１０月に「ＰＫＳ３」が出穂したので「ＰＫＳ３」を母本、「コシヒカリ」を父本として交配を行った。交配は剪定法により行った。
２００１年１１月にＢＣ２Ｆ１種子を２６粒得た。５０℃，７日間の休眠打破後、同年１２月にこのＢＣ２Ｆ１種子を育苗箱に２６粒播種し、１４個体の幼苗を得た。同年１２月、前述した簡易ゲノムＤＮＡ抽出法により、ゲノムＤＮＡを調製した。ＢＣ２Ｆ１以降の世代の遺伝子型タイピングは１世代前の母本（ＢＣ２Ｆ１においては「ＰＫＳ３」を示す）の染色体領域のうち「コシヒカリ」「ＩＲ２４」のヘテロ接合領域のみを対象とした。この選抜により、ｓｄ−１遺伝子座が「ＩＲ２４」「コシヒカリ」のヘテロ接合である個体を６個体を得、このうち３個体を戻し交配に用いた。さらにこのうち１個体を「ＰＫＳ１３」と名付けた。
▲４▼第３回戻し交配〜ＢＣ３Ｆ１
２００２年２月に「ＰＫＳ１３」が出穂したので、「ＰＫＳ１３」を母本、「コシヒカリ」を父本として交配を行った。交配は剪定法により行った。
２００２年３月にＢＣ３Ｆ１種子を３０粒得た。５０℃，７日間の休眠打破後、同年４月にこのＢＣ３Ｆ１種子を育苗箱に３０粒播種し、２１個体の幼苗を得た。同年４月、前述した簡易ゲノムＤＮＡ抽出法によりゲノムＤＮＡを調製した。「コシヒカリ」「ＩＲ２４」のヘテロ接合領域のみ遺伝子型のタイピングを行い、ｓｄ−１遺伝子座がヘテロ接合である個体を７個体選抜し、このうち３個体を戻し交配に用いた。さらにこのうち１個体を「ＰＫＳ２１」と名付けた。
▲５▼第４回戻し交配〜ＢＣ４Ｆ１
２００２年５月に「ＰＫＳ２１」が出穂したので、「ＰＫＳ２１」を母本、「コシヒカリ」を父本として交配を行った。交配は剪定法により行った。同年６月にＢＣ４Ｆ１種子を３５粒得た。
２００２年７月にＢＣ４Ｆ１種子を５０℃，７日間の休眠打破を行い育苗箱に３５粒播種し、２３個体の幼苗を得た。同年７月、前述した簡易ゲノムＤＮＡ抽出法によりゲノムＤＮＡを調製した。「コシヒカリ」「ＩＲ２４」のヘテロ接合である領域のみを対象として遺伝子型のタイピングを行い、ｓｄ−１遺伝子座がヘテロ接合である個体を１０個体選抜した。このうち最も「コシヒカリ」の染色体に置き換わった１個体を「ＰＫＳ３１」と名付けた。
【００００】
▲６▼自殖及び固定系統選抜〜ＢＣ４Ｆ２
２００２年９月に「ＰＫＳ３１」が出穂したので、そのまま自殖させ種子を６４粒得た。２００２年１０月にＢＣ４Ｆ１種子を５０℃，７日間の休眠打破を行い、育苗箱に６４粒播種し、３１個体の幼苗を得た。ｓｄ−１遺伝子座が「ＩＲ２４」のホモ接合である個体を１１個体選抜した。このうち１系統を「ＰＫＳ３１−２７」と名付け、ここで、ｓｄ−１遺伝子座のみ導入された「コシヒカリ」である「半矮性コシヒカリ」を完成した。
表７に以上の育成経過をまとめた。
「コシヒカリ」、および「コシヒカリ」と「ＩＲ２４」の交配後代（戻し交配４回）の植物体の写真を図２に示す。また、各世代におけるｓｄ−１遺伝子座の遺伝子型と全染色体レベルでの「コシヒカリ」への置換の程度を図３に、また、「半矮性コシヒカリ」育成の流れ図を図４に示す。
（実施例３） 半矮性コシヒカリの栽培
実施例２で育成した「半矮性コシヒカリ」を２００３年度に圃場に展開し試験栽培を行った。試験栽培地は株式会社植物ゲノムセンター（茨城県つくば市観音台）の所内圃場で行った。播種時期は２００３年４月２４日、移植日は２００３年５月２３日であった。２００３年７月７日に鳥害を防ぐために防鳥ネットを圃場にかけた。図５に試験栽培を行った圃場の様子（左側：「コシヒカリ」、右側：「半矮性コシヒカリ」）を示す。
（実施例４） 半矮性コシヒカリの特性
実施例３で示したように「半矮性コシヒカリ」の試験栽培を行い、２００３年９月にその特性調査を行った。特性項目及び特性基準は農水省で公開されている水稲の特性表・特性審査基準に従った。その結果を表８にまとめた。また、圃場で栽培した「半矮性コシヒカリ」と「コシヒカリ」を図６（左側「コシヒカリ」、右側：「半矮性コシヒカリ」）に示す。
（ｉ）出穂期
両品種の出穂日を調査し、播種日（２００３年４月２４日）より出穂に至るまでの日数を求めた。図７に出穂調査の結果を示す。出穂始めとは全個体の１０％以上が出穂した日、出穂日は全個体の５０％以上が出穂した日また出穂揃えは全個体の９０％以上が出穂した日とする。出穂期は「コシヒカリ」と同日であり、出穂始め、出穂揃えも同日であった。したがって、「半矮性コシヒカリ」の出穂特性は全く「コシヒカリ」と同じであるといえる。
（ｉｉ）稈長
移植時には「半矮性コシヒカリ」の苗丈、葉身の形状は「コシヒカリ」に類似していたが、分けつ期、出穂期を経るにつれ次第に草丈に差が現れ、稈長では明らかな差が見られた。成熟期における稈長は「コシヒカリ」より約１０ｃｍ低くなっていた。その結果を図８に示す。
（ｉｉｉ）止葉の直立の程度、穂数、着粒密度、草型
「半矮性コシヒカリ」につき、止葉は「コシヒカリ」より直立しており、受光体勢は良く、穂数は「コシヒカリ」より多い。着粒密度は「コシヒカリ」と差異なく、穂長は１ｃｍほど短くなっている。この結果より、「半矮性コシヒカリ」の草型は偏穂数型と判断された（表８参照）。
（ｉｖ）耐倒伏性、穂首の抽出度
耐倒伏性はｃＬｒ法によるｃＬｒ値により判定した。「半矮性コシヒカリ」の耐倒伏性は「コシヒカリ」より強く、「日本晴」並かあるいは若干劣る程度であった。また、穂首の抽出度は「コシヒカリ」に比べて４ｃｍ程度短くなっており、なびき型倒伏により強くなっている（表８参照）。
（ｖ）地上部全重、玄米の形状、品質
育成地においては、「半矮性コシヒカリ」の地上部全重は「コシヒカリ」と同程度であるにもかかわらず、収量はより多くなっている。これは一穂当たりの籾数が若干少なくなっているにもかかわらず、穂数が多くなっているためである。玄米の形と大きさは「コシヒカリ」、「日本晴」と同程度であった。光沢、腹白、胴割は「コシヒカリ」と同程度で、玄米の外観品質も「コシヒカリ」と同程度と判定された（表８参照）。また、「半矮性コシヒカリ」と「コシヒカリ」の籾、玄米の外観を図９に示す。
（ｖｉ）食味、穂発芽性
「半矮性コシヒカリ」の食味について炊飯米の外観、香り、味、粘り、硬さの５項目より総合的に判断する官能試験で判定した。２００３年に収穫した「コシヒカリ」「半矮性コシヒカリ」とを供試した結果、「コシヒカリ」と同等の上中と判定された。穂発芽性は「コシヒカリ」と同程度で、穂発芽性易の「キヌヒカリ」と比較して難と判定された（表８参照）。
これらの特性検定によりｓｄ−１遺伝子座による半矮性の形質が発現する一方で、良食味である「コシヒカリ」の形質が保持されていることが裏付けられた。またこれは、ｓｄ−１遺伝子座のみ導入されているという遺伝子タイピングの結果に符合した。ここで、改良植物品種の迅速な育種法により半矮性コシヒカリを２年で育成できた。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、連続戻し交配育種法による植物への新形質付与を従来より迅速かつより省力的に行う方法が提供され、イネ品種の育種の効率化が図れる。また、本発明により育成された半矮性コシヒカリは良食味と高い倒伏性を兼ね備えており、安定した収量、品質を提供しうる。さらにこれを中間母本として本発明の方法で新形質を付与していくことで、良食味を保持したままより付加価値の高い品種を迅速に育成することが可能となる。
本発明により育成された半矮性コシヒカリは、遺伝子組換えによらず作出されたものであるので、安全性が高く、一般消費者が安心して受け入れることができ、その需要にかなうものである。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１〜４２３：合成ＤＮＡ
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的形質が導入された改良植物品種の迅速な育種方法であって、以下の工程：
（ａ）対象となる植物品種に目的形質を有する他の植物品種を交配し、
（ｂ）交配後代の染色体の遺伝子型を、幼植物期において一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーを用いてタイピングし、
（ｃ）タイピングした遺伝子型に基づいて次世代の交配に供する個体を選抜し、
（ｄ）選抜した個体に前記の対象となる植物品種を戻し交配し、
（ｅ）上記（ｂ）から（ｄ）の工程を少なくとも３回繰り返すこと、
を含む、前記育種方法。
【請求項２】
対象となる植物品種がイネ品種である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イネ品種が「コシヒカリ」である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
他の植物品種が半矮性遺伝子を有するイネ品種である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
半矮性遺伝子を有するイネ品種がｓｄ−１遺伝子を有する「ＩＲ２４」である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記請求項１から５のいずれかに記載の方法により作出された改良植物品種。
【請求項７】
「ＩＲ２４」由来のｓｄ−１遺伝子座がホモ接合であり、それ以外の染色体領域が「コシヒカリ」由来の染色体で構成されていることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の方法により作出された改良イネ品種。
【請求項１】
目的形質が導入された改良植物品種の迅速な育種方法であって、以下の工程：
（ａ）対象となる植物品種に目的形質を有する他の植物品種を交配し、
（ｂ）交配後代の染色体の遺伝子型を、幼植物期において一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーを用いてタイピングし、
（ｃ）タイピングした遺伝子型に基づいて次世代の交配に供する個体を選抜し、
（ｄ）選抜した個体に前記の対象となる植物品種を戻し交配し、
（ｅ）上記（ｂ）から（ｄ）の工程を少なくとも３回繰り返すこと、
を含む、前記育種方法。
【請求項２】
対象となる植物品種がイネ品種である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イネ品種が「コシヒカリ」である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
他の植物品種が半矮性遺伝子を有するイネ品種である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
半矮性遺伝子を有するイネ品種がｓｄ−１遺伝子を有する「ＩＲ２４」である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記請求項１から５のいずれかに記載の方法により作出された改良植物品種。
【請求項７】
「ＩＲ２４」由来のｓｄ−１遺伝子座がホモ接合であり、それ以外の染色体領域が「コシヒカリ」由来の染色体で構成されていることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の方法により作出された改良イネ品種。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６６７１９
【国際公開日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【発行日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０４６７７（Ｐ２００５−５０４６７７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０００４３５
【国際出願日】平成１６年１月２０日（２００４．１．２０）
【出願人】（５００３０１３７１）株式会社植物ゲノムセンター (16)
【出願人】（５０３０４４６１７）株式会社 植物ディー・エヌ・エー機能研究所 (7)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【発行日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０００４３５
【国際出願日】平成１６年１月２０日（２００４．１．２０）
【出願人】（５００３０１３７１）株式会社植物ゲノムセンター (16)
【出願人】（５０３０４４６１７）株式会社 植物ディー・エヌ・エー機能研究所 (7)
【Ｆターム（参考）】
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