新菌株ラクトバチルス・クリスパタスＫＴ−１１、ＫＴ−２３、およびＫＴ−２５を用いた抗アレルギー用組成物
【課題】本発明では従来の乳酸菌より抗アレルギー効果の高い新規の乳酸菌株を含有する抗アレルギー用組成物を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明は、糞便中から単離した新規のラクトバチルス・クリスパタス株に高い抗アレルギー効果があることを発見した。すなわち本発明は、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11株（FERM P-21457）、KT-23株（FERM P-21458）、KT-25株（FERM P-21459）のいずれか1種あるいは２種以上含有することを特徴とする抗アレルギー用組成物及びそれを含有する医薬品、飲食品又はサプリメント、ペットフード又はペット用サプリメント及び飼料に関するものである。
【解決手段】本発明は、糞便中から単離した新規のラクトバチルス・クリスパタス株に高い抗アレルギー効果があることを発見した。すなわち本発明は、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11株（FERM P-21457）、KT-23株（FERM P-21458）、KT-25株（FERM P-21459）のいずれか1種あるいは２種以上含有することを特徴とする抗アレルギー用組成物及びそれを含有する医薬品、飲食品又はサプリメント、ペットフード又はペット用サプリメント及び飼料に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の菌株ラクトバチルス・クリスパタスKT-11、KT-23、およびKT-25を含有する抗アレルギー用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘルパーT細胞（Th細胞）は、B細胞やT細胞などの増殖や働きを調節するサイトカインを分泌して、液性免疫や細胞性免疫を誘導する。ヘルパーT細胞は、そのサイトカインの産生パターンから、1型ヘルパーT細胞（Th1細胞）と2型ヘルパーT細胞（Th2細胞）との二種類に分類され、Th1は細胞性免疫を活性化し、Th2は液性免疫を活性化することが知られている。いわゆる免疫バランスとは一般に、このTh1とTh2との間のバランスを指し、例えば患者のアレルギー状態を示す指標などとして広く利用されている。
【０００３】
アレルギーとは、Th1/Th2バランスが崩れてTh2側に異常に偏ると、本来は無害である外来抗原に対して免疫系が過剰に反応することにより生じる疾患である。反応機序の違いによりI型からIV型の4つの型に分類される。日本では、ダニ、埃などのハウスダストによる通年性アレルギー性鼻炎やスギ花粉などによる季節性アレルギー性鼻炎に代表されるI型アレルギー患者数の増加が顕著であり、今後も更なる患者の増加が懸念されている。
【０００４】
I型アレルギーは、主に抗原と結合したIgEにより肥満細胞が刺激され、ヒスタミンなどのケミカルメディエーターを放出することにより発症するアレルギーである。体内に侵入した花粉やハウスダストは抗原と認識され、それらに対する特異的IgE抗体が産生される。特異的IgE抗体は、マスト細胞や血中の好塩基球表面のFcレセプターに結合して感作された状態となる。その後、抗原が再び体内に侵入すると、抗原はIgE抗体と結合し、抗原−抗体複合体が形成されて脱顆粒を引き起こし、顆粒中のヒスタミンやロイコトリエンなどの化学伝達物質が放出され、これらの作用がアレルギー症状となって現れる。
【０００５】
こうしたアレルギー症状に使われる薬物としては、抗ヒスタミン剤、ロイコトリエン拮抗薬、トロンボキサン拮抗薬、Th2サイトカイン阻害薬、メディエーター遊離抑制剤、ステロイド薬などがある。しかしながら、例えば抗ヒスタミン剤は副作用として眠気や口渇が出ることがあり、ロイコトリエン拮抗薬の副作用としては血球減少や胃腸障害、メディエーター遊離抑制剤の副作用としては胃腸障害や膀胱炎様症状等が知られるなど、これらの薬物は必ずしも安全であるとはいえない。
【０００６】
こうした背景のもと、近年では、食経験が豊富で安全が確認されている食品、あるいはその原料から抗アレルギー効果を有する素材の探索が盛んに行われており、乳酸菌やポリフェノール類、ヌクレオチドなどが抗アレルギー素材として注目されている（特許文献1及び2参照）。
【０００７】
抗アレルギー効果を有するといわれている食品としては、ヨーグルトや乳酸菌飲料が、その他乳酸菌の乾燥死菌体粉末等を用いた健康食品、医薬品等も販売されている。これらに使用されている乳酸菌としては動物性乳酸菌であるエンテロコッカス フェカリス（Enterococcus faecalis）などがあり、インターフェロンなどのサイトカイン産生を促進しTh1免疫応答を高め、Th2免疫応答を抑制することによりアレルギー症状を軽減することがすでに知られている（特許文献3）が、食品としての日持ちの問題や調製及び取り扱いの困難性、抗アレルギー効果が不十分であるため大量の摂取を必要とするなどの問題があった。
【０００８】
一般に、単純な栄養培地（ぶどう糖と無機質のみ）でも生育できる細菌は多いが、とくに乳酸菌はアミノ酸、ビタミン、無機質などの栄養要求性がある。乳酸菌の培養に一般的に用いられる培地として、MRS培地、BL培地が一般的に広く知られている（非特許文献１及び非特許文献２）。
【０００９】
上述した一般的な培地以外の培養基材を用いた例として、芋焼酎の蒸留粕と糖類と乳酸菌を混合して発酵した焼酎粕発酵食品があり、乳酸菌が有する生体の免疫賦活効果、整腸効果、抗腫瘍性効果等により生体機能に対する改善効果を発揮するもの（特許文献４）や、大麦焼酎蒸留残液を加工（精製、濃縮、粉末化など）したもので、乳酸菌などの微生物の増殖を促進する効果を有するもの（特許文献５）、ワインの澱で乳酸菌の培養を試みた例がある（非特許文献３）。上記のようなアルコール発酵の残留物には、微生物が分泌した様々な酵素が糖質原料（大麦や芋等の穀物、ぶどう等の果物 等）に作用することで生成された糖類やアミノ酸、ペプチドが豊富に含まれており、これらが培養時の乳酸菌の栄養源となる。
【００１０】
しかしながら、上記の技術は、もともと焼酎粕に含まれる食物繊維や乳酸菌の健康効果を組み合わせることで相乗的に生体機能の改善を目指すものや、蒸留残液やワインの澱に含まれる成分によって微生物の増殖を促進することに着目しており、乳酸菌の持つ抗アレルギー効果自体を高める技術ではない。また、発酵に用いる微生物や糖質原料が異なれば残留物に含まれる各種栄養素の成分や含有比率は異なり一様ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平5-252900号公報
【特許文献２】特開平9-2959号公報
【特許文献３】特開平7-228536号公報
【特許文献４】特開2007-259742号公報
【特許文献５】特開平10-327852号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】学会出版センター、乳酸菌の科学と技術、ｐ１８、乳酸菌研究集談会 編、１９９６年
【非特許文献２】社団法人 日本食品衛生協会、食品衛生検査指針 微生物編、ｐ３５４−３５５、厚生労働省 監修、２００４年
【非特許文献３】Bustos,G., et al., 2004. Evalution of Vinification Lees as a General Medium for Lactobacillus Strains. J. Agric.Food Chem.52(16), 5233-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は従来の乳酸菌より抗アレルギー効果の高い新規の乳酸菌株を含有する抗アレルギー用組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、糞便中から単離した新規のラクトバチルス・クリスパタス株に高い抗アレルギー効果があることを発見し、完成させるに至った。すなわち本発明は、下記の構成を要旨とする抗アレルギー用組成物に関する。
【００１５】
(１)ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11株（FERM P-21457）、KT-23株（FERM P-21458）、KT-25株（FERM P-21459）のいずれか1種あるいは２種以上含有することを特徴とする抗アレルギー用組成物。
（２）大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材に糖類、乳化剤を添加した培地で培養することを特徴とする(１)記載の抗アレルギー用組成物。
（３）(１)又は(２)記載の抗アレルギー用組成物を含有する医薬品。
（４）ダニ用であることを特徴とする(３)記載の医薬品。
（５）アレルギー性鼻炎用であることを特徴とする（３）記載の医薬品。
（６)(１)又は（２）記載の抗アレルギー用組成物を含有する飲食品又はサプリメント。
（７)(１)又は（２）記載の抗アレルギー用組成物を含有するペットフード又はペット用サプリメント。
（８)(１)又は（２）記載の抗アレルギー用組成物を含有する飼料。
（９)ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11株（FERM P-21457）、KT-23株（FERM P-21458）、KT-25株（FERM P-21459）のいずれか1種あるいは2種以上と製剤用剤とを混合することを特徴とする抗アレルギー用組成物の製造方法。
（１０)新菌株ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11株（FERM P-21457）、KT-23株（FERM P-21458）又はKT-25株（FERM P-21459）。
【００１６】
本発明は、免疫バランスをTh1型に誘導することでTh2型の働きを抑制し、アレルギー疾患、とくに食物（乳・乳製品、卵、小麦、そば、落花生、あわび、いか、いくら、えび、オレンジ、かに、キウイフルーツ、牛肉、くるみ、さけ、さば、大豆、鶏肉、バナナ、豚肉、まつたけ、もも、やまいも、りんご、ゼラチンなど）、ハウスダスト、動物の毛（イヌ・ネコなどペットの毛、ウール・コットン・羽毛などの毛など）、草・雑草・樹木などの花粉、昆虫（ダニ、蜂、蚊、ハエ、ノミ、ゴキブリなど）などによる喘息、皮膚炎、鼻炎、花粉症、アナフィラキシーショックなどのI型アレルギー疾患の改善に有効な抗アレルギー用組成物を提供することができる。
【００１７】
本発明において使用される乳酸菌としては、ラクトバシルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11株（FERM P-21457）、KT-23株（FERM P-21458）、KT-25株（FERM P-21459）が挙げられる。これらの菌株は独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託している。
【００１８】
上記菌株の菌学的性状を以下に示す。
〔１〕形態学的性状
MRS寒天培地（Difco）で37℃、72時間培養後の観察では、細胞の大きさが0.5〜1×3〜5μmの桿菌であり、運動をしない。胞子形成は無く、グラム染色は、陽性である。
〔２〕培養学的性状
MRS寒天培地（Difco）で37℃、72時間培養後のコロニーは直径2〜3mm、円形、全縁である。コロニーの色調は黄白色で、半透明である。
〔３〕生理学的性状
ガス産生 陰性
グルコース資化 陽性
カタラーゼ活性 陰性
ゼラチン液化性 陰性
硝酸塩還元性 陰性
インドール産性 陰性
硫化水素産性 陰性
酸素に対する態度 通性嫌気性
至適生育温度 37〜40℃
至適生育ｐH pH5.5〜5.8
【００１９】
ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11、KT-23、KT-25はそれぞれ、後述する実施例に示す通り、標準株であるラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）JCM1185およびJCM2009に比べて、Th2型の働きを抑制するTh1型細胞（IFN-γ産生ヘルパーT細胞）数を有意に増加させるところに特徴がある。
【００２０】
上記ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）株は、生菌、死菌のいずれを用いてもよく、乾燥菌体、湿潤菌体、培養液、菌体懸濁液、菌体破砕物、菌体成分などいずれの状態を用いても良い。また、組成物の形態としては、粉末状、顆粒状、ペースト状、液状などいずれの形態を用いても良い。
【００２１】
本発明の抗アレルギー組成物は、本発明による有効成分を生理学的に許容され得る担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などと混合することにより製剤化して用いることができる。抗アレルギー組成物は経口的あるいは非経口的に投与することができるが、経口的に投与することが好ましい。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。非経口剤としては、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）が挙げられる。
【００２２】
また、米飯類、菓子類、麺類、カマボコ・チクワ等の水産練り製品、ハム・ソーセージ等の畜産加工品、栄養補助食品（サプリメント）、保健機能食品、清涼飲料・果実飲料・茶飲料等の飲料類、スープ類、マヨネーズ・ドレッシング・味付け調味液等の調味料などの食品やペットフード、栄養補助製品（サプリメント）、あるいは家畜・家禽・その他の哺乳動物又は魚類に用いる粉状、練り製品状、ペレット状、固形状、フレーク状等の飼料などに配合して使用することができる。
【００２３】
本発明の抗アレルギー組成物の医薬品又は飲食品の一日当たりの摂取量は、年齢、症状、体重、用途等によって異なるため、一概に決めることはできないが、一応の目安として０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重を摂取することが好ましい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の抗アレルギー用組成物は、アレルギー疾患、とくに食物、ハウスダスト、動物の毛、草・雑草・樹木などの花粉、昆虫などによる喘息、皮膚炎、鼻炎、花粉症、アナフィラキシーショックなどのI型アレルギー疾患の改善に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】糞便中から単離した菌体試料添加時のマウス脾臓細胞におけるIFN-γおよびIL-2産生ヘルパーT細胞数相対値を示した図。
【図２】ダニ抗原によって誘発された右耳介部位の腫脹の厚さを測定した結果を示す図。
【図３】表4をもとに作成した、右耳介部のアレルギー症状を評価したアレルギースコアを示す図。
【図４】血清中の総IgE量およびダニ抗原特異的IgE量を示した図。
【図５】マウス脾臓中のTh2サイトカイン産生ヘルパーT細胞数を示した図。
【図６】大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材（三和酒類（株）のバーレックス）を主成分とする培地で培養した菌体試料添加時のマウス脾臓細胞におけるIFN-γ産生ヘルパーT細胞数の増加を示した図。
【図７】新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を含有した培養液粉末添加時のマウス脾臓細胞におけるIFN-γ産生ヘルパーT細胞数の増加を示した図。
【図８】卵白アルブミン（OVA）によって誘発されたアレルギー性鼻炎のくしゃみの回数を数えた結果を示した図。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下に、実施例を用いて本発明を説明するが、本発明は実施例の記載内容に制限されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
(菌体の単離、同定)
以下に、本発明で使用される菌体の単離、同定方法を示す。
【００２８】
0.85% NaCl水溶液を用いて、乳幼児（生後3ヶ月〜1.5歳）から採取後直ちに冷蔵保管した糞便を懸濁し、混釈平板法により市販MRS寒天培地で37℃、72時間培養した。培養後、形態の異なるコロニーをそれぞれ釣菌し、単離した。単離した菌はいずれもグラム陽性、カタラーゼ陰性を示した。
【００２９】
単離した菌を表１に示すMRS液体培地にそれぞれ接種し、37℃、72時間培養した。培養後、遠心分離（2,000 rpm、10分間）で菌体を回収し、0.85 % NaCl水溶液で3回洗浄した。洗浄した菌体は凍結乾燥処理後、熱処理（65℃、30分間）し、さらに滅菌0.15 M塩化ナトリウム-0.01 Mリン酸緩衝液 (PBS、pH7.2) に懸濁して菌体試料とした。
【表１】
【００３０】
6週齢、雄のC3H/HeN系マウスから無菌的に脾臓を採取し、ペニシリン100 IU/mlおよびストレプトマイシン100 μg/mlを含むRPMI 1640培地5 mlに懸濁した。懸濁液は上記RPMI1640培地で2回、さらに5%FBSを含む上記RPMI 1640培地で1回遠心洗浄（4℃、1200rpm、5分間）を行った。洗浄した菌体は、1.0×106 cells/mlになるよう調製し、マウス脾臓細胞浮遊液とした。
【００３１】
上記で調製したマウス脾臓細胞浮遊液1,000 μlを平底の48穴マイクロプレートに分注し、さらに上記菌体試料100 μlを加え、37℃、5% CO2存在下で48時間培養した。なお、乳酸菌の最終濃度は0および100 μg/mlである。
【００３２】
上記で培養した脾臓細胞浮遊液を、1 mM EDTA、5% FBSを含むHank’s Balanced Salt Solution (HBSS)で遠心洗浄（4℃、2,000rpm、3分間）した。洗浄したマウス脾臓細胞1.0×106 cellsを活性化培地 (10% FBSを含むRPMI 1640培地にブレフェルジンA 20 μg/ml、イオノマイシン2 μg/mlおよびPMA 20 ng/mlを含む) 1,000 μlに懸濁し、37℃、5% CO2存在下で4時間培養し、細胞内にサイトカインを産生および蓄積させた。
【００３３】
培養したマウス脾臓細胞をHBSSで遠心洗浄（4℃、2,000 rpm、3分間）した後、ビオチン標識抗マウスCD4を1 μl添加し、4℃で15分間反応させた。さらに、ストレプトアビジン-PE/Cy5を1 μl添加して4℃、遮光下で15分間放置した。反応液をHBSSで洗浄（4℃、2000 rpm、3分間）後、IntraPrepTMReagent 1を100 μl加え、室温遮光下で15分間放置して細胞を固定した。HBSSで洗浄（4℃、2,000rpm、3分間）後、IntraPrepTMReagent 2を100 μl加え、室温遮光下で15分間反応させて膜透過処理を行った。次いで、Th1サイトカインであるIL-2、あるいはＩＦＮ-γを測定するため、PE標識抗マウスIL-2、あるいはPE標識抗マウスIFN-γを1 μlを添加し、室温遮光下で15分間放置した後、再度HBSSで遠心洗浄（4℃、2,000 rpm、3分間）した。洗浄後、Guava(R) Personal Cell Function Analyzer (PCA)を用いて、培養細胞中のIFN-γ産生ヘルパーT細胞およびIL-2産生ヘルパーT細胞数の測定を行った。
【００３４】
図1は、各菌体試料添加時のマウス脾臓細胞中のIFN-γ産生ヘルパーT細胞数およびIL-2産生ヘルパーT細胞数を、菌体試料無添加時の細胞数を1として相対値として示したものである。KT-11、KT-23、KT-25を添加した場合、IFN-γ産生ヘルパーT細胞数、IL-2産生ヘルパーT細胞数が顕著に増加した。
【００３５】
KT-11、KT-23、KT-25の3株について、16Sr DNA塩基配列の相同性検索による菌種の同定を行った。同定の結果、上記3株はすべてラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）であることがわかった。以上の結果から、上記3株が、Th1免疫応答を強く誘導する新規のラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）であることが示めされた。
【実施例２】
【００３６】
(抗アレルギー効果の優位性測定)
新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）の抗アレルギー効果の優位性について以下に示す。
【００３７】
表2に示す乳酸菌を実施例1と同様の方法で調製し、乳酸菌試料とした。なお、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）JCM1185及びJCM2009はラクトバチルス・クリスパタスの標準株である。
【表２】
【００３８】
実施例1と同様に調製したマウス脾臓細胞浮遊液1,000 μlを平底の48穴マイクロプレートに分注し、さらに上記乳酸菌試料を加え、37℃、5% CO2存在下で48時間培養した。培養後、実施例1と同様の方法でIFN-γ産生ヘルパーT細胞数を測定した。結果の有意性は、乳酸菌無添加あるいはラクトバチルス・クリスパタスの標準株であるJCM1185およびJCM2009を基準として、ダネットの検定分析により判定した。検定結果はいずれもp<0.001であり、0.1%の危険率で有意差があった。
【００３９】
表3は、各乳酸菌添加時のマウス脾臓細胞中におけるIFN-γ産生ヘルパーT細胞数を示したものである。新規に単離したラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11、KT-23、KT-25の3株はいずれも、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）の標準株であるJCM1185およびJCM2009よりIFN-γ産生ヘルパーT細胞数が顕著に増加した。また、他の動物性乳酸菌2株と比べても強い活性を示した。このことから、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11、KT-23、KT-25は、従来の乳酸菌より抗アレルギー効果が高いことが示された。
【表３】
【実施例３】
【００４０】
(ダニ誘発性アレルギー症状への効果)
マウスへの新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）経口投与によるダニ誘発性アレルギー症状への影響について以下に示す。
【００４１】
被検体として4週齢、雄、NC/Nga系マウスを用いた。飼料（市販のマウス用飼料）と水は自由摂取とし、12時間/12時間の明暗サイクルおよび22 ± 2℃の飼育環境を保った。新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11、KT-23、KT-25は、実施例1と同様の方法で調製し、乳酸菌試料とした。上記乳酸菌試料の投与は、6週齢より1日1回、胃ゾンデを用いて行った。ダニ抗原による感作は、生理食塩水10 μlに市販ダニ抗原5 μgを溶解したものを、週に1回、右耳介部にそれぞれ皮内注射することで誘導し、右耳介部の厚さを1週間に1回測定した。また、アレルギー症状は、表4のアレルギースコアにより評価した。
【表４】
【００４２】
以上の項目について、右耳介部位のアレルギー症状を「０点・・・無症状」、「1点・・・軽中度の症状」、「２点・・・重度の症状」として採点し、合計点のスコア化を行った。
【００４３】
図2は、ダニ抗原によって誘発された右耳介部位の腫脹の厚さを測定した結果である。また図3は、表４をもとに作成した、右耳介部のアレルギー症状を評価したアレルギースコアである。乳酸菌試料を投与していないマウスに比べて、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11、KT-23およびKT-25を投与した場合は右耳介部位の腫脹が薄く、またアレルギースコアが有意に減少している。以上の結果から、新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）の経口投与により、ダニによって誘発されるアレルギー症状が軽減されることがわかった。
【実施例４】
【００４４】
(マウス血清中の総IｇE及びダニ抗原特異的IgE量の変化)
新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）経口投与によるマウス血清中の総IｇE及びダニ抗原特異的IgE量の変化について以下に示す。
【００４５】
表5に示した各飼育試験群のマウスの腹部門脈から採血し、直ちに遠心分離（4℃、3,000 rpm、30分間）を行い、血清を回収した。回収した血清は、使用する直前まで-30℃で保存した。
【表５】
【００４６】
血清中の総IgE量はサンドイッチELISA法で測定した。まず、0.05 M 炭酸緩衝液 (pH 9.6) に溶解したヤギ抗マウスIgE (10 μg/ml) 100 μlを96穴マイクロプレートの各ウェルに分注し、4℃で一晩静置した。PBS-Tweenで3回洗浄した後、各ウェルに0.05 M 炭酸緩衝液に溶解した0.4% BSA溶液 300 μlを加え、25℃で120分間静置した。再びPBS-Tweenで3回洗浄した後、2% ポリビニルピロリドン (PVP) を含むPBS-Tweenで500倍に希釈したマウス血清100μlを各ウェルに分注し、25℃で120分間反応させた。反応終了後、再びPBS-Tweenでプレートを3回洗浄し、2% PVPを含むPBS-Tweenで希釈したHRP標識ヤギ抗マウスIgE (0.2 μg/ml) 100 μlを各ウェルに分注し、25℃で60分間反応させた。PBS-Tweenでプレートを5回洗浄した後、暗室でTMB基質溶液 100 μlを各ウェルに分注し、完全に遮光して25℃で15分間反応させた。反応後、4N硫酸 100 μlを各ウェルに分注して反応を停止させ、直ちにモデル550マイクロプレートリーダーを用いて、450 nmにおける吸光度を測定した。
【００４７】
また、ダニ抗原特異的IgE量はELISA法で測定した。まず、0.1 M 炭酸緩衝液 (pH 9.6) に溶解した市販ダニ抗原 (100 μg/ml) 100 μlを96穴マイクロプレートの各ウェルに分注し、4℃で一晩静置した。PBS-Tweenで3回洗浄した後、0.1 M 炭酸緩衝液に溶解した0.4% BSA溶液 300 μlを加え、25℃で120分静置した。再びPBS-Tweenで3回洗浄した後、2% ポリビニルピロリドン (PVP) を含むPBS-Tweenで10倍に希釈したマウス血清100 μlを各ウェルに分注し、25℃で120分間反応させた。反応終了後は、上記と同様の方法で処理し、モデル550マイクロプレートリーダーを用いて、450 nmにおける吸光度を測定した。
【００４８】
図4は、血清中の総IgE量およびダニ抗原特異的IgE量を示したものである。測定結果の有意性は、コントロール群を基準としてダネットの検定分析により判定した。KT-11、KT-23、およびKT-25を投与したマウス群では、いずれもコントロール群に比べて総IgE量および血清中のダニ抗原特異的IgE量が減少したことがわかった。
【実施例５】
【００４９】
(Th2サイトカイン産生ヘルパーT細胞数の変化)
新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）経口投与による、マウス脾臓細胞中のTh2サイトカイン産生ヘルパーT細胞数の変化について以下に示す。
【００５０】
実施例4のマウスから無菌的に脾臓を採取し、実施例1と同様の方法で脾臓細胞浮遊液を調製し、Th2サイトカイン産生ヘルパーT細胞であるIL-4産生ヘルパーT細胞数を測定した。測定結果の有意性は、コントロール群を基準としてダネットの検定分析により判定した。
【００５１】
図5は、マウス脾臓中のIL-4産生ヘルパーT細胞数を示したものである。新規のラクトバチルス・クリスパタスKT-11、KT-23、およびKT-25を経口投与したマウス群では、コントロール群に比べて脾臓中のTh2サイトカイン産生ヘルパーT細胞数が有意に減少したことがわかった。
【００５２】
以上の結果から、新規のラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11、KT-23、およびKT-25を含有する組成物が、Th2型の免疫応答を抑制することでIgE量が減少し、アレルギー症状を軽減させることが示めされた。
【実施例６】
【００５３】
（大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材による乳酸菌株の抗アレルギー効果の向上）
大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材（例えば三和種類（株）のバーレックス）を主成分とする培地で培養した新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）のTh1免疫応答に及ぼす影響について以下に示す。
【００５４】
表６に示す培地にラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を接種し、37℃で24時間培養した。培養後、遠心分離（2,000rpm、10分間）で菌体を回収し、蒸留水で遠心洗浄した。洗浄した菌体は熱処理（65℃、30分間）した後、凍結乾燥した。さらに滅菌0.15M塩化ナトリウム-0.01Mリン酸緩衝液（PBS、pH7.2）に1.1×108CFU/mｌになるように懸濁して乳酸菌試料とした。
【表６】
【００５５】
実施例1と同様に調製したマウス脾臓細胞浮遊液1,000 μlを平底の48穴マイクロプレートに分注し、さらに上記乳酸菌試料を加え、37℃、5% CO2存在下で48時間培養した。なお、乳酸菌の最終濃度は0及び1.0×107CFU/mｌである。
【００５６】
培養後、実施例1と同様の方法でIFN-γ産生ヘルパーT細胞数を測定した。結果の有意性は、乳酸菌無添加あるいはMRS培地で培養したラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を基準として、ダネットの検定分析により判定した。ｐ＜0.001の時は0.1%の、p＜0.05の時は5%の危険率で有意差があることを示す。
【００５７】
図６は、マウス脾臓中のTh1細胞数を示したものである。大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材（バーレックス）を主成分とする培地で培養したラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を添加したマウス脾臓細胞では、MRS培地で培養した場合よりIFN-γ産生ヘルパーT細胞数が増加した。このことから、大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材を主成分とする培地で培養することでラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11の抗アレルギー効果が向上することが示された。
【実施例７】
【００５８】
（培養液粉末の抗アレルギー効果の検証）
大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材（バーレックス）を主成分とする培地で新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を培養し、培養液を粉末化した。培養液粉末のTh1免疫応答に及ぼす影響について以下に示す。
【００５９】
実施例６と同様に培養した新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11培養液を３０℃に調整し、粉末基材として7.4％（ｗ/ｗ）のデキストリン粉末（パインデックス＃100、松谷化学工業社製）を添加、溶解した。溶解後、スプレードライヤ（L-12型スプレードライヤ、大川原化工機社製）にて噴霧乾燥し、新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を含有した培養液粉末を得た。
【００６０】
実施例1と同様に調製したマウス脾臓細胞浮遊液1,000 μlを平底の48穴マイクロプレートに分注し、さらに上記粉末試料を最終濃度100μg/mlになるように加え、37℃、5% CO2存在下で48時間培養した。対照区として大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材（バーレックス）を主成分とする培地のみを粉末化したものを同様に処理した。
【００６１】
培養後、実施例1と同様の方法でIFN-γ産生ヘルパーT細胞数を測定した。結果の有意性は、乳酸菌無添加あるいは培地のみの粉末を基準として、ダネットの検定分析により判定した。ｐ＜0.01は1%の危険率で有意差があることを示す。
【００６２】
図7は、マウス脾臓中のTh1細胞数を示したものである。新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を含有した培養液粉末を添加したマウス脾臓細胞では、乳酸菌無添加及び培地のみの粉末を添加した場合よりIFN-γ産生ヘルパーT細胞数が有意に増加した。また、培地のみの粉末は、IFN-γ産生ヘルパーT細胞数の増加は見られなかった。このことから、新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を含有した培養液粉末により抗アレルギー効果が向上することが示された。
【実施例８】
【００６３】
（アレルギー性鼻炎への効果）
MRS培地または大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材（バーレックス）を主成分とする培地で培養したラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11投与によるアレルギー性鼻炎への影響について以下に示す。
【００６４】
5週齢ＢＡＬＢ/cマウスを市販飼料で1週間予備飼育後、MRS培地で培養したラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11、または大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材（バーレックス）を主成分とする培地で培養したラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を5×107CFU/g含む市販飼料（粉末MF：オリエンタル酵母）で飼育した。アレルギー陰性群、及び対照群には市販飼料のみ与えた。6及び8週齢時に1回、20μg卵白アルブミン（OVA）と200μｌになるよう調製した2mg水酸化アルミニウムゲル（Sigma、USA）を腹腔内投与した。アレルギー陰性群のマウスには生理食塩水を200μｌ投与した。また、9週齢より週に3回、10mg/mｌ OVA水溶液をマウス鼻腔内に10μｌ投与した。アレルギー症状は、OVAを鼻腔内投与から1分間経過した後、10分間のくしゃみの回数を測定した。なお、いずれの群も飲用水及び飼料は自由摂取とした。
【００６５】
結果の有意性は、乳酸菌無添加を基準として、ダネットの検定分析により判定した。p＜0.05の時は5%の危険率で有意差があることを示す。
【００６６】
図８は、OVAによって誘発された、マウスのアレルギー性鼻炎の回数を示したものである。MRS培地またはバーレックスを主成分とする培地で培養したラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を与えたマウスは、くしゃみの回数が有意に減少した。以上の結果から、新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11の投与によりアレルギー性鼻炎症状を軽減することがわかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の菌株ラクトバチルス・クリスパタスKT-11、KT-23、およびKT-25を含有する抗アレルギー用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘルパーT細胞（Th細胞）は、B細胞やT細胞などの増殖や働きを調節するサイトカインを分泌して、液性免疫や細胞性免疫を誘導する。ヘルパーT細胞は、そのサイトカインの産生パターンから、1型ヘルパーT細胞（Th1細胞）と2型ヘルパーT細胞（Th2細胞）との二種類に分類され、Th1は細胞性免疫を活性化し、Th2は液性免疫を活性化することが知られている。いわゆる免疫バランスとは一般に、このTh1とTh2との間のバランスを指し、例えば患者のアレルギー状態を示す指標などとして広く利用されている。
【０００３】
アレルギーとは、Th1/Th2バランスが崩れてTh2側に異常に偏ると、本来は無害である外来抗原に対して免疫系が過剰に反応することにより生じる疾患である。反応機序の違いによりI型からIV型の4つの型に分類される。日本では、ダニ、埃などのハウスダストによる通年性アレルギー性鼻炎やスギ花粉などによる季節性アレルギー性鼻炎に代表されるI型アレルギー患者数の増加が顕著であり、今後も更なる患者の増加が懸念されている。
【０００４】
I型アレルギーは、主に抗原と結合したIgEにより肥満細胞が刺激され、ヒスタミンなどのケミカルメディエーターを放出することにより発症するアレルギーである。体内に侵入した花粉やハウスダストは抗原と認識され、それらに対する特異的IgE抗体が産生される。特異的IgE抗体は、マスト細胞や血中の好塩基球表面のFcレセプターに結合して感作された状態となる。その後、抗原が再び体内に侵入すると、抗原はIgE抗体と結合し、抗原−抗体複合体が形成されて脱顆粒を引き起こし、顆粒中のヒスタミンやロイコトリエンなどの化学伝達物質が放出され、これらの作用がアレルギー症状となって現れる。
【０００５】
こうしたアレルギー症状に使われる薬物としては、抗ヒスタミン剤、ロイコトリエン拮抗薬、トロンボキサン拮抗薬、Th2サイトカイン阻害薬、メディエーター遊離抑制剤、ステロイド薬などがある。しかしながら、例えば抗ヒスタミン剤は副作用として眠気や口渇が出ることがあり、ロイコトリエン拮抗薬の副作用としては血球減少や胃腸障害、メディエーター遊離抑制剤の副作用としては胃腸障害や膀胱炎様症状等が知られるなど、これらの薬物は必ずしも安全であるとはいえない。
【０００６】
こうした背景のもと、近年では、食経験が豊富で安全が確認されている食品、あるいはその原料から抗アレルギー効果を有する素材の探索が盛んに行われており、乳酸菌やポリフェノール類、ヌクレオチドなどが抗アレルギー素材として注目されている（特許文献1及び2参照）。
【０００７】
抗アレルギー効果を有するといわれている食品としては、ヨーグルトや乳酸菌飲料が、その他乳酸菌の乾燥死菌体粉末等を用いた健康食品、医薬品等も販売されている。これらに使用されている乳酸菌としては動物性乳酸菌であるエンテロコッカス フェカリス（Enterococcus faecalis）などがあり、インターフェロンなどのサイトカイン産生を促進しTh1免疫応答を高め、Th2免疫応答を抑制することによりアレルギー症状を軽減することがすでに知られている（特許文献3）が、食品としての日持ちの問題や調製及び取り扱いの困難性、抗アレルギー効果が不十分であるため大量の摂取を必要とするなどの問題があった。
【０００８】
一般に、単純な栄養培地（ぶどう糖と無機質のみ）でも生育できる細菌は多いが、とくに乳酸菌はアミノ酸、ビタミン、無機質などの栄養要求性がある。乳酸菌の培養に一般的に用いられる培地として、MRS培地、BL培地が一般的に広く知られている（非特許文献１及び非特許文献２）。
【０００９】
上述した一般的な培地以外の培養基材を用いた例として、芋焼酎の蒸留粕と糖類と乳酸菌を混合して発酵した焼酎粕発酵食品があり、乳酸菌が有する生体の免疫賦活効果、整腸効果、抗腫瘍性効果等により生体機能に対する改善効果を発揮するもの（特許文献４）や、大麦焼酎蒸留残液を加工（精製、濃縮、粉末化など）したもので、乳酸菌などの微生物の増殖を促進する効果を有するもの（特許文献５）、ワインの澱で乳酸菌の培養を試みた例がある（非特許文献３）。上記のようなアルコール発酵の残留物には、微生物が分泌した様々な酵素が糖質原料（大麦や芋等の穀物、ぶどう等の果物 等）に作用することで生成された糖類やアミノ酸、ペプチドが豊富に含まれており、これらが培養時の乳酸菌の栄養源となる。
【００１０】
しかしながら、上記の技術は、もともと焼酎粕に含まれる食物繊維や乳酸菌の健康効果を組み合わせることで相乗的に生体機能の改善を目指すものや、蒸留残液やワインの澱に含まれる成分によって微生物の増殖を促進することに着目しており、乳酸菌の持つ抗アレルギー効果自体を高める技術ではない。また、発酵に用いる微生物や糖質原料が異なれば残留物に含まれる各種栄養素の成分や含有比率は異なり一様ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平5-252900号公報
【特許文献２】特開平9-2959号公報
【特許文献３】特開平7-228536号公報
【特許文献４】特開2007-259742号公報
【特許文献５】特開平10-327852号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】学会出版センター、乳酸菌の科学と技術、ｐ１８、乳酸菌研究集談会 編、１９９６年
【非特許文献２】社団法人 日本食品衛生協会、食品衛生検査指針 微生物編、ｐ３５４−３５５、厚生労働省 監修、２００４年
【非特許文献３】Bustos,G., et al., 2004. Evalution of Vinification Lees as a General Medium for Lactobacillus Strains. J. Agric.Food Chem.52(16), 5233-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は従来の乳酸菌より抗アレルギー効果の高い新規の乳酸菌株を含有する抗アレルギー用組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、糞便中から単離した新規のラクトバチルス・クリスパタス株に高い抗アレルギー効果があることを発見し、完成させるに至った。すなわち本発明は、下記の構成を要旨とする抗アレルギー用組成物に関する。
【００１５】
(１)ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11株（FERM P-21457）、KT-23株（FERM P-21458）、KT-25株（FERM P-21459）のいずれか1種あるいは２種以上含有することを特徴とする抗アレルギー用組成物。
（２）大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材に糖類、乳化剤を添加した培地で培養することを特徴とする(１)記載の抗アレルギー用組成物。
（３）(１)又は(２)記載の抗アレルギー用組成物を含有する医薬品。
（４）ダニ用であることを特徴とする(３)記載の医薬品。
（５）アレルギー性鼻炎用であることを特徴とする（３）記載の医薬品。
（６)(１)又は（２）記載の抗アレルギー用組成物を含有する飲食品又はサプリメント。
（７)(１)又は（２）記載の抗アレルギー用組成物を含有するペットフード又はペット用サプリメント。
（８)(１)又は（２）記載の抗アレルギー用組成物を含有する飼料。
（９)ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11株（FERM P-21457）、KT-23株（FERM P-21458）、KT-25株（FERM P-21459）のいずれか1種あるいは2種以上と製剤用剤とを混合することを特徴とする抗アレルギー用組成物の製造方法。
（１０)新菌株ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11株（FERM P-21457）、KT-23株（FERM P-21458）又はKT-25株（FERM P-21459）。
【００１６】
本発明は、免疫バランスをTh1型に誘導することでTh2型の働きを抑制し、アレルギー疾患、とくに食物（乳・乳製品、卵、小麦、そば、落花生、あわび、いか、いくら、えび、オレンジ、かに、キウイフルーツ、牛肉、くるみ、さけ、さば、大豆、鶏肉、バナナ、豚肉、まつたけ、もも、やまいも、りんご、ゼラチンなど）、ハウスダスト、動物の毛（イヌ・ネコなどペットの毛、ウール・コットン・羽毛などの毛など）、草・雑草・樹木などの花粉、昆虫（ダニ、蜂、蚊、ハエ、ノミ、ゴキブリなど）などによる喘息、皮膚炎、鼻炎、花粉症、アナフィラキシーショックなどのI型アレルギー疾患の改善に有効な抗アレルギー用組成物を提供することができる。
【００１７】
本発明において使用される乳酸菌としては、ラクトバシルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11株（FERM P-21457）、KT-23株（FERM P-21458）、KT-25株（FERM P-21459）が挙げられる。これらの菌株は独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託している。
【００１８】
上記菌株の菌学的性状を以下に示す。
〔１〕形態学的性状
MRS寒天培地（Difco）で37℃、72時間培養後の観察では、細胞の大きさが0.5〜1×3〜5μmの桿菌であり、運動をしない。胞子形成は無く、グラム染色は、陽性である。
〔２〕培養学的性状
MRS寒天培地（Difco）で37℃、72時間培養後のコロニーは直径2〜3mm、円形、全縁である。コロニーの色調は黄白色で、半透明である。
〔３〕生理学的性状
ガス産生 陰性
グルコース資化 陽性
カタラーゼ活性 陰性
ゼラチン液化性 陰性
硝酸塩還元性 陰性
インドール産性 陰性
硫化水素産性 陰性
酸素に対する態度 通性嫌気性
至適生育温度 37〜40℃
至適生育ｐH pH5.5〜5.8
【００１９】
ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11、KT-23、KT-25はそれぞれ、後述する実施例に示す通り、標準株であるラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）JCM1185およびJCM2009に比べて、Th2型の働きを抑制するTh1型細胞（IFN-γ産生ヘルパーT細胞）数を有意に増加させるところに特徴がある。
【００２０】
上記ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）株は、生菌、死菌のいずれを用いてもよく、乾燥菌体、湿潤菌体、培養液、菌体懸濁液、菌体破砕物、菌体成分などいずれの状態を用いても良い。また、組成物の形態としては、粉末状、顆粒状、ペースト状、液状などいずれの形態を用いても良い。
【００２１】
本発明の抗アレルギー組成物は、本発明による有効成分を生理学的に許容され得る担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などと混合することにより製剤化して用いることができる。抗アレルギー組成物は経口的あるいは非経口的に投与することができるが、経口的に投与することが好ましい。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。非経口剤としては、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）が挙げられる。
【００２２】
また、米飯類、菓子類、麺類、カマボコ・チクワ等の水産練り製品、ハム・ソーセージ等の畜産加工品、栄養補助食品（サプリメント）、保健機能食品、清涼飲料・果実飲料・茶飲料等の飲料類、スープ類、マヨネーズ・ドレッシング・味付け調味液等の調味料などの食品やペットフード、栄養補助製品（サプリメント）、あるいは家畜・家禽・その他の哺乳動物又は魚類に用いる粉状、練り製品状、ペレット状、固形状、フレーク状等の飼料などに配合して使用することができる。
【００２３】
本発明の抗アレルギー組成物の医薬品又は飲食品の一日当たりの摂取量は、年齢、症状、体重、用途等によって異なるため、一概に決めることはできないが、一応の目安として０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重を摂取することが好ましい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の抗アレルギー用組成物は、アレルギー疾患、とくに食物、ハウスダスト、動物の毛、草・雑草・樹木などの花粉、昆虫などによる喘息、皮膚炎、鼻炎、花粉症、アナフィラキシーショックなどのI型アレルギー疾患の改善に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】糞便中から単離した菌体試料添加時のマウス脾臓細胞におけるIFN-γおよびIL-2産生ヘルパーT細胞数相対値を示した図。
【図２】ダニ抗原によって誘発された右耳介部位の腫脹の厚さを測定した結果を示す図。
【図３】表4をもとに作成した、右耳介部のアレルギー症状を評価したアレルギースコアを示す図。
【図４】血清中の総IgE量およびダニ抗原特異的IgE量を示した図。
【図５】マウス脾臓中のTh2サイトカイン産生ヘルパーT細胞数を示した図。
【図６】大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材（三和酒類（株）のバーレックス）を主成分とする培地で培養した菌体試料添加時のマウス脾臓細胞におけるIFN-γ産生ヘルパーT細胞数の増加を示した図。
【図７】新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を含有した培養液粉末添加時のマウス脾臓細胞におけるIFN-γ産生ヘルパーT細胞数の増加を示した図。
【図８】卵白アルブミン（OVA）によって誘発されたアレルギー性鼻炎のくしゃみの回数を数えた結果を示した図。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下に、実施例を用いて本発明を説明するが、本発明は実施例の記載内容に制限されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
(菌体の単離、同定)
以下に、本発明で使用される菌体の単離、同定方法を示す。
【００２８】
0.85% NaCl水溶液を用いて、乳幼児（生後3ヶ月〜1.5歳）から採取後直ちに冷蔵保管した糞便を懸濁し、混釈平板法により市販MRS寒天培地で37℃、72時間培養した。培養後、形態の異なるコロニーをそれぞれ釣菌し、単離した。単離した菌はいずれもグラム陽性、カタラーゼ陰性を示した。
【００２９】
単離した菌を表１に示すMRS液体培地にそれぞれ接種し、37℃、72時間培養した。培養後、遠心分離（2,000 rpm、10分間）で菌体を回収し、0.85 % NaCl水溶液で3回洗浄した。洗浄した菌体は凍結乾燥処理後、熱処理（65℃、30分間）し、さらに滅菌0.15 M塩化ナトリウム-0.01 Mリン酸緩衝液 (PBS、pH7.2) に懸濁して菌体試料とした。
【表１】
【００３０】
6週齢、雄のC3H/HeN系マウスから無菌的に脾臓を採取し、ペニシリン100 IU/mlおよびストレプトマイシン100 μg/mlを含むRPMI 1640培地5 mlに懸濁した。懸濁液は上記RPMI1640培地で2回、さらに5%FBSを含む上記RPMI 1640培地で1回遠心洗浄（4℃、1200rpm、5分間）を行った。洗浄した菌体は、1.0×106 cells/mlになるよう調製し、マウス脾臓細胞浮遊液とした。
【００３１】
上記で調製したマウス脾臓細胞浮遊液1,000 μlを平底の48穴マイクロプレートに分注し、さらに上記菌体試料100 μlを加え、37℃、5% CO2存在下で48時間培養した。なお、乳酸菌の最終濃度は0および100 μg/mlである。
【００３２】
上記で培養した脾臓細胞浮遊液を、1 mM EDTA、5% FBSを含むHank’s Balanced Salt Solution (HBSS)で遠心洗浄（4℃、2,000rpm、3分間）した。洗浄したマウス脾臓細胞1.0×106 cellsを活性化培地 (10% FBSを含むRPMI 1640培地にブレフェルジンA 20 μg/ml、イオノマイシン2 μg/mlおよびPMA 20 ng/mlを含む) 1,000 μlに懸濁し、37℃、5% CO2存在下で4時間培養し、細胞内にサイトカインを産生および蓄積させた。
【００３３】
培養したマウス脾臓細胞をHBSSで遠心洗浄（4℃、2,000 rpm、3分間）した後、ビオチン標識抗マウスCD4を1 μl添加し、4℃で15分間反応させた。さらに、ストレプトアビジン-PE/Cy5を1 μl添加して4℃、遮光下で15分間放置した。反応液をHBSSで洗浄（4℃、2000 rpm、3分間）後、IntraPrepTMReagent 1を100 μl加え、室温遮光下で15分間放置して細胞を固定した。HBSSで洗浄（4℃、2,000rpm、3分間）後、IntraPrepTMReagent 2を100 μl加え、室温遮光下で15分間反応させて膜透過処理を行った。次いで、Th1サイトカインであるIL-2、あるいはＩＦＮ-γを測定するため、PE標識抗マウスIL-2、あるいはPE標識抗マウスIFN-γを1 μlを添加し、室温遮光下で15分間放置した後、再度HBSSで遠心洗浄（4℃、2,000 rpm、3分間）した。洗浄後、Guava(R) Personal Cell Function Analyzer (PCA)を用いて、培養細胞中のIFN-γ産生ヘルパーT細胞およびIL-2産生ヘルパーT細胞数の測定を行った。
【００３４】
図1は、各菌体試料添加時のマウス脾臓細胞中のIFN-γ産生ヘルパーT細胞数およびIL-2産生ヘルパーT細胞数を、菌体試料無添加時の細胞数を1として相対値として示したものである。KT-11、KT-23、KT-25を添加した場合、IFN-γ産生ヘルパーT細胞数、IL-2産生ヘルパーT細胞数が顕著に増加した。
【００３５】
KT-11、KT-23、KT-25の3株について、16Sr DNA塩基配列の相同性検索による菌種の同定を行った。同定の結果、上記3株はすべてラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）であることがわかった。以上の結果から、上記3株が、Th1免疫応答を強く誘導する新規のラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）であることが示めされた。
【実施例２】
【００３６】
(抗アレルギー効果の優位性測定)
新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）の抗アレルギー効果の優位性について以下に示す。
【００３７】
表2に示す乳酸菌を実施例1と同様の方法で調製し、乳酸菌試料とした。なお、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）JCM1185及びJCM2009はラクトバチルス・クリスパタスの標準株である。
【表２】
【００３８】
実施例1と同様に調製したマウス脾臓細胞浮遊液1,000 μlを平底の48穴マイクロプレートに分注し、さらに上記乳酸菌試料を加え、37℃、5% CO2存在下で48時間培養した。培養後、実施例1と同様の方法でIFN-γ産生ヘルパーT細胞数を測定した。結果の有意性は、乳酸菌無添加あるいはラクトバチルス・クリスパタスの標準株であるJCM1185およびJCM2009を基準として、ダネットの検定分析により判定した。検定結果はいずれもp<0.001であり、0.1%の危険率で有意差があった。
【００３９】
表3は、各乳酸菌添加時のマウス脾臓細胞中におけるIFN-γ産生ヘルパーT細胞数を示したものである。新規に単離したラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11、KT-23、KT-25の3株はいずれも、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）の標準株であるJCM1185およびJCM2009よりIFN-γ産生ヘルパーT細胞数が顕著に増加した。また、他の動物性乳酸菌2株と比べても強い活性を示した。このことから、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11、KT-23、KT-25は、従来の乳酸菌より抗アレルギー効果が高いことが示された。
【表３】
【実施例３】
【００４０】
(ダニ誘発性アレルギー症状への効果)
マウスへの新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）経口投与によるダニ誘発性アレルギー症状への影響について以下に示す。
【００４１】
被検体として4週齢、雄、NC/Nga系マウスを用いた。飼料（市販のマウス用飼料）と水は自由摂取とし、12時間/12時間の明暗サイクルおよび22 ± 2℃の飼育環境を保った。新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11、KT-23、KT-25は、実施例1と同様の方法で調製し、乳酸菌試料とした。上記乳酸菌試料の投与は、6週齢より1日1回、胃ゾンデを用いて行った。ダニ抗原による感作は、生理食塩水10 μlに市販ダニ抗原5 μgを溶解したものを、週に1回、右耳介部にそれぞれ皮内注射することで誘導し、右耳介部の厚さを1週間に1回測定した。また、アレルギー症状は、表4のアレルギースコアにより評価した。
【表４】
【００４２】
以上の項目について、右耳介部位のアレルギー症状を「０点・・・無症状」、「1点・・・軽中度の症状」、「２点・・・重度の症状」として採点し、合計点のスコア化を行った。
【００４３】
図2は、ダニ抗原によって誘発された右耳介部位の腫脹の厚さを測定した結果である。また図3は、表４をもとに作成した、右耳介部のアレルギー症状を評価したアレルギースコアである。乳酸菌試料を投与していないマウスに比べて、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11、KT-23およびKT-25を投与した場合は右耳介部位の腫脹が薄く、またアレルギースコアが有意に減少している。以上の結果から、新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）の経口投与により、ダニによって誘発されるアレルギー症状が軽減されることがわかった。
【実施例４】
【００４４】
(マウス血清中の総IｇE及びダニ抗原特異的IgE量の変化)
新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）経口投与によるマウス血清中の総IｇE及びダニ抗原特異的IgE量の変化について以下に示す。
【００４５】
表5に示した各飼育試験群のマウスの腹部門脈から採血し、直ちに遠心分離（4℃、3,000 rpm、30分間）を行い、血清を回収した。回収した血清は、使用する直前まで-30℃で保存した。
【表５】
【００４６】
血清中の総IgE量はサンドイッチELISA法で測定した。まず、0.05 M 炭酸緩衝液 (pH 9.6) に溶解したヤギ抗マウスIgE (10 μg/ml) 100 μlを96穴マイクロプレートの各ウェルに分注し、4℃で一晩静置した。PBS-Tweenで3回洗浄した後、各ウェルに0.05 M 炭酸緩衝液に溶解した0.4% BSA溶液 300 μlを加え、25℃で120分間静置した。再びPBS-Tweenで3回洗浄した後、2% ポリビニルピロリドン (PVP) を含むPBS-Tweenで500倍に希釈したマウス血清100μlを各ウェルに分注し、25℃で120分間反応させた。反応終了後、再びPBS-Tweenでプレートを3回洗浄し、2% PVPを含むPBS-Tweenで希釈したHRP標識ヤギ抗マウスIgE (0.2 μg/ml) 100 μlを各ウェルに分注し、25℃で60分間反応させた。PBS-Tweenでプレートを5回洗浄した後、暗室でTMB基質溶液 100 μlを各ウェルに分注し、完全に遮光して25℃で15分間反応させた。反応後、4N硫酸 100 μlを各ウェルに分注して反応を停止させ、直ちにモデル550マイクロプレートリーダーを用いて、450 nmにおける吸光度を測定した。
【００４７】
また、ダニ抗原特異的IgE量はELISA法で測定した。まず、0.1 M 炭酸緩衝液 (pH 9.6) に溶解した市販ダニ抗原 (100 μg/ml) 100 μlを96穴マイクロプレートの各ウェルに分注し、4℃で一晩静置した。PBS-Tweenで3回洗浄した後、0.1 M 炭酸緩衝液に溶解した0.4% BSA溶液 300 μlを加え、25℃で120分静置した。再びPBS-Tweenで3回洗浄した後、2% ポリビニルピロリドン (PVP) を含むPBS-Tweenで10倍に希釈したマウス血清100 μlを各ウェルに分注し、25℃で120分間反応させた。反応終了後は、上記と同様の方法で処理し、モデル550マイクロプレートリーダーを用いて、450 nmにおける吸光度を測定した。
【００４８】
図4は、血清中の総IgE量およびダニ抗原特異的IgE量を示したものである。測定結果の有意性は、コントロール群を基準としてダネットの検定分析により判定した。KT-11、KT-23、およびKT-25を投与したマウス群では、いずれもコントロール群に比べて総IgE量および血清中のダニ抗原特異的IgE量が減少したことがわかった。
【実施例５】
【００４９】
(Th2サイトカイン産生ヘルパーT細胞数の変化)
新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）経口投与による、マウス脾臓細胞中のTh2サイトカイン産生ヘルパーT細胞数の変化について以下に示す。
【００５０】
実施例4のマウスから無菌的に脾臓を採取し、実施例1と同様の方法で脾臓細胞浮遊液を調製し、Th2サイトカイン産生ヘルパーT細胞であるIL-4産生ヘルパーT細胞数を測定した。測定結果の有意性は、コントロール群を基準としてダネットの検定分析により判定した。
【００５１】
図5は、マウス脾臓中のIL-4産生ヘルパーT細胞数を示したものである。新規のラクトバチルス・クリスパタスKT-11、KT-23、およびKT-25を経口投与したマウス群では、コントロール群に比べて脾臓中のTh2サイトカイン産生ヘルパーT細胞数が有意に減少したことがわかった。
【００５２】
以上の結果から、新規のラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11、KT-23、およびKT-25を含有する組成物が、Th2型の免疫応答を抑制することでIgE量が減少し、アレルギー症状を軽減させることが示めされた。
【実施例６】
【００５３】
（大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材による乳酸菌株の抗アレルギー効果の向上）
大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材（例えば三和種類（株）のバーレックス）を主成分とする培地で培養した新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）のTh1免疫応答に及ぼす影響について以下に示す。
【００５４】
表６に示す培地にラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を接種し、37℃で24時間培養した。培養後、遠心分離（2,000rpm、10分間）で菌体を回収し、蒸留水で遠心洗浄した。洗浄した菌体は熱処理（65℃、30分間）した後、凍結乾燥した。さらに滅菌0.15M塩化ナトリウム-0.01Mリン酸緩衝液（PBS、pH7.2）に1.1×108CFU/mｌになるように懸濁して乳酸菌試料とした。
【表６】
【００５５】
実施例1と同様に調製したマウス脾臓細胞浮遊液1,000 μlを平底の48穴マイクロプレートに分注し、さらに上記乳酸菌試料を加え、37℃、5% CO2存在下で48時間培養した。なお、乳酸菌の最終濃度は0及び1.0×107CFU/mｌである。
【００５６】
培養後、実施例1と同様の方法でIFN-γ産生ヘルパーT細胞数を測定した。結果の有意性は、乳酸菌無添加あるいはMRS培地で培養したラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を基準として、ダネットの検定分析により判定した。ｐ＜0.001の時は0.1%の、p＜0.05の時は5%の危険率で有意差があることを示す。
【００５７】
図６は、マウス脾臓中のTh1細胞数を示したものである。大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材（バーレックス）を主成分とする培地で培養したラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を添加したマウス脾臓細胞では、MRS培地で培養した場合よりIFN-γ産生ヘルパーT細胞数が増加した。このことから、大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材を主成分とする培地で培養することでラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11の抗アレルギー効果が向上することが示された。
【実施例７】
【００５８】
（培養液粉末の抗アレルギー効果の検証）
大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材（バーレックス）を主成分とする培地で新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を培養し、培養液を粉末化した。培養液粉末のTh1免疫応答に及ぼす影響について以下に示す。
【００５９】
実施例６と同様に培養した新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11培養液を３０℃に調整し、粉末基材として7.4％（ｗ/ｗ）のデキストリン粉末（パインデックス＃100、松谷化学工業社製）を添加、溶解した。溶解後、スプレードライヤ（L-12型スプレードライヤ、大川原化工機社製）にて噴霧乾燥し、新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を含有した培養液粉末を得た。
【００６０】
実施例1と同様に調製したマウス脾臓細胞浮遊液1,000 μlを平底の48穴マイクロプレートに分注し、さらに上記粉末試料を最終濃度100μg/mlになるように加え、37℃、5% CO2存在下で48時間培養した。対照区として大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材（バーレックス）を主成分とする培地のみを粉末化したものを同様に処理した。
【００６１】
培養後、実施例1と同様の方法でIFN-γ産生ヘルパーT細胞数を測定した。結果の有意性は、乳酸菌無添加あるいは培地のみの粉末を基準として、ダネットの検定分析により判定した。ｐ＜0.01は1%の危険率で有意差があることを示す。
【００６２】
図7は、マウス脾臓中のTh1細胞数を示したものである。新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を含有した培養液粉末を添加したマウス脾臓細胞では、乳酸菌無添加及び培地のみの粉末を添加した場合よりIFN-γ産生ヘルパーT細胞数が有意に増加した。また、培地のみの粉末は、IFN-γ産生ヘルパーT細胞数の増加は見られなかった。このことから、新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を含有した培養液粉末により抗アレルギー効果が向上することが示された。
【実施例８】
【００６３】
（アレルギー性鼻炎への効果）
MRS培地または大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材（バーレックス）を主成分とする培地で培養したラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11投与によるアレルギー性鼻炎への影響について以下に示す。
【００６４】
5週齢ＢＡＬＢ/cマウスを市販飼料で1週間予備飼育後、MRS培地で培養したラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11、または大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材（バーレックス）を主成分とする培地で培養したラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を5×107CFU/g含む市販飼料（粉末MF：オリエンタル酵母）で飼育した。アレルギー陰性群、及び対照群には市販飼料のみ与えた。6及び8週齢時に1回、20μg卵白アルブミン（OVA）と200μｌになるよう調製した2mg水酸化アルミニウムゲル（Sigma、USA）を腹腔内投与した。アレルギー陰性群のマウスには生理食塩水を200μｌ投与した。また、9週齢より週に3回、10mg/mｌ OVA水溶液をマウス鼻腔内に10μｌ投与した。アレルギー症状は、OVAを鼻腔内投与から1分間経過した後、10分間のくしゃみの回数を測定した。なお、いずれの群も飲用水及び飼料は自由摂取とした。
【００６５】
結果の有意性は、乳酸菌無添加を基準として、ダネットの検定分析により判定した。p＜0.05の時は5%の危険率で有意差があることを示す。
【００６６】
図８は、OVAによって誘発された、マウスのアレルギー性鼻炎の回数を示したものである。MRS培地またはバーレックスを主成分とする培地で培養したラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11を与えたマウスは、くしゃみの回数が有意に減少した。以上の結果から、新規ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11の投与によりアレルギー性鼻炎症状を軽減することがわかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11株（FERM P-21457）、KT-23株（FERM P-21458）、KT-25株（FERM P-21459）のいずれか1種あるいは2種以上含有することを特徴とする抗アレルギー用組成物。
【請求項２】
大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材に糖類、乳化剤を添加した培地で培養することを特徴とする請求項１記載の抗アレルギー用組成物。
【請求項３】
請求項１又は２記載の抗アレルギー用組成物を含有する医薬品。
【請求項４】
ダニ用であることを特徴とする請求項３記載の医薬品。
【請求項５】
アレルギー性鼻炎用であることを特徴とする請求項３記載の医薬品。
【請求項６】
請求項１又は２記載の抗アレルギー用組成物を含有する飲食品又はサプリメント。
【請求項７】
請求項１又は２記載の抗アレルギー用組成物を含有するペットフード又はペット用サプリメント。
【請求項８】
請求項１又は２記載の抗アレルギー用組成物を含有する飼料。
【請求項９】
ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11株（FERM P-21457）、KT-23株（FERM P-21458）、KT-25株（FERM P-21459）のいずれか1種あるいは2種以上と製剤用剤とを混合することを特徴とする抗アレルギー用組成物の製造方法。
【請求項１０】
新菌株ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11株（FERM P-21457）、KT-23株（FERM P-21458）又はKT-25株（FERM P-21459）。
【請求項１】
ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11株（FERM P-21457）、KT-23株（FERM P-21458）、KT-25株（FERM P-21459）のいずれか1種あるいは2種以上含有することを特徴とする抗アレルギー用組成物。
【請求項２】
大麦焼酎蒸留残液から成る培養基材に糖類、乳化剤を添加した培地で培養することを特徴とする請求項１記載の抗アレルギー用組成物。
【請求項３】
請求項１又は２記載の抗アレルギー用組成物を含有する医薬品。
【請求項４】
ダニ用であることを特徴とする請求項３記載の医薬品。
【請求項５】
アレルギー性鼻炎用であることを特徴とする請求項３記載の医薬品。
【請求項６】
請求項１又は２記載の抗アレルギー用組成物を含有する飲食品又はサプリメント。
【請求項７】
請求項１又は２記載の抗アレルギー用組成物を含有するペットフード又はペット用サプリメント。
【請求項８】
請求項１又は２記載の抗アレルギー用組成物を含有する飼料。
【請求項９】
ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11株（FERM P-21457）、KT-23株（FERM P-21458）、KT-25株（FERM P-21459）のいずれか1種あるいは2種以上と製剤用剤とを混合することを特徴とする抗アレルギー用組成物の製造方法。
【請求項１０】
新菌株ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）KT-11株（FERM P-21457）、KT-23株（FERM P-21458）又はKT-25株（FERM P-21459）。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−２０９１３２（Ｐ２００９−２０９１３２Ａ）
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２１７９５（Ｐ２００９−２１７９５）
【出願日】平成２１年２月２日（２００９．２．２）
【出願人】（３９１００４１２６）株式会社キティー (6)
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２日（２００９．２．２）
【出願人】（３９１００４１２６）株式会社キティー (6)
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【Ｆターム（参考）】
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