新規なアルブミン
本発明は、ミュータントの由来となった天然アルブミンに対して金属結合及び／または他の特性の改変を示す血清アルブミンの突然変異型並びに医学分野あるいは培養における細胞の発育におけるミュータントアルブミンの利用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミュータントの由来となった天然アルブミンに対して金属結合及び／または他の特性の改変を示す血清アルブミンの突然変異型並びに医学分野あるいは培養における細胞の発育におけるミュータントアルブミンの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトアルブミンは血漿中に最も豊富に存在する蛋白である。一般に、約７５０μＭの濃度で存在する。主として螺旋状のトリプルドメイン構造を有する５８５個のアミノ酸からなる１本のポリペプチド鎖である。ヒト血清アルブミンの遺伝子は想定される「キャッピング」部位からポリＡの最初の付加部位まで16,961個のヌクレオチドからなる。
【０００３】
アルブミンは血中の主な輸送蛋白で、脂肪酸、ホルモン及び薬物等の広範囲の小分子と可逆的に結合する。アルブミンはまた、多くの金属イオンの輸送と貯蔵にも関与している。現在、ヒトアルブミンは臨床的には、重度の火傷、ショックまたは失血状態にある患者の治療に用いられている。他の哺乳類のアルブミンはヒトアルブミンと構造などが非常に良く一致する。
【０００４】
亜鉛と銅はそれぞれ3.4×107M-1および1.5×1016M-1の結合定数でアルブミンと結合することが知られている（非特許文献１：Masuoka et al.(1993)J.Biol.Chem.268,21533-21537）。Ｃｕ2+はアルブミンのＮ末端アミノ酸のＡｓｐｌ−Ａｌａ２−Ｈｉｓ３に最も強く結合し、分子上に他の結合部位が知られているにもかかわらず４個のＮリガンドの正方形‐平面部位を供給する。
【０００５】
血漿中Ｚｎ2+の約７５％（約１４μＭ）がアルブミンに結合している。これは血清中のＺｎ2+の交換可能な画分の９８％ほどを占める（非特許文献２：Giroux et al.(1976)J.Bioinorg.Chem.5,211-218；非特許文献３：Foote and Delves(1984)Analyst 109,709-711）。アルブミンは内皮細胞による亜鉛の取り込みを調整することが以前から知られており、一方内皮を透過するレセプターを介する小胞共輸送がアルブミン−亜鉛複合体によりインビトロで証明されている（非特許文献４：Bobilya et al.(1993)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.202,159-166；非特許文献５：Tibaduiza et al.(1996)J.Cell Physiol.167,539-547）。アルブミンは循環における主な亜鉛輸送蛋白と信じられているにもかかわらず、アルブミン上のＺｎ2+の結合部位はこれまで明確に突きとめられていなかった。
【０００６】
亜鉛は体内の必須元素であり、３００以上の酵素中に存在する。亜鉛にはビタミンＡの輸送、創傷の治癒、男性での精子産生を含む多くの重要な役割があり、炭疽菌致死因子や細菌腸毒素により取り込まれる。それ故血中亜鉛濃度の調節は生理的に非常に重要である。血液からのＺｎ2+の取り込みは金属結合性を有する有機薬物、例えば、トリプシンのようなセリンプロテアーゼのベンズイミダゾール阻害剤の蛋白や酵素に対する親和力を高めるのに用い得ることが示唆されている（非特許文献６：Katz and Luong(1999)J.Mol.Biol.292,669-684；非特許文献７：Janc et al.(2000)Biochemistry 39,4792-4800；非特許文献８：Katz et al.(2001)Chem.&Biol.8,1107-1121；非特許文献９：Liang et al.(2002)J.Am.Chem.Soc.)。
【０００７】
ReedとBurrington（非特許文献１０：J.Biol.Chem.(1989),264,17, p9867-9872）はアルブミンの肝細胞への結合およびこのことがアルブミンに対する細胞の表面レセプターを必要とするか否かに関する。彼らの研究は肝細胞表面へのアルブミンの可逆的吸着を証明し、アルブミンと肝細胞表面との間の相互作用を促進させる立体配座の変化を伴うことを提唱した。しかしながら、どのような立体配座の変化が生じあるいはどのようにしてそれが調節されるかについての示唆はない。
Bosらは（非特許文献１１：J.Biol.Chem.(1989),264,2,p953-959）ヒスチジン残基を介するＣａ2+の結合によるヒト血清アルブミンの中性−塩基遷移の分子メカニズムに関する。彼らの論文はＮ−Ｂ遷移が薬物の体内動態に役割を果たしている可能性を明らかにしているが、ミュータント血清アルブミンの創造を示唆してはおらず、そのようなミュータントが有するであろう効果についても何ら示唆していない。
【０００８】
【非特許文献１】Masuoka et al., J.Biol.Chem. 268, 21533-21537(1993)
【非特許文献２】Giroux et al., J.Bioinorg.Chem., 5, 211-218(1976)
【非特許文献３】Foote and Delves, Analyst 109, 709-711(1984)
【非特許文献４】Bobilya et al., Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 202, 159-166(1993)
【非特許文献５】Tibaduiza et al., J.Cell Physiol., 167, 539-547(1996)
【非特許文献６】Katz and Luong,J.Mol.Biol., 292, 669-684(1999)
【非特許文献７】Janc et al., Biochemistry, 39, 4792-4800(2000)
【非特許文献８】Katz et al., Chem.& Biol., 8, 1107-1121(2001)
【非特許文献９】Liang et al., J.Am.Chem.Soc.(2002)
【非特許文献１０】J.Biol.Chem., 264, 17, p9867-9872(1989)
【非特許文献１１】J.Biol.Chem., 264, 2, p953-959(1989)
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は４個のアミノ酸（Ｈｉｓ６７，Ａｓｎ９９，Ｈｉｓ２４７，Ａｓｐ２４９）のクラスターが亜鉛、銅及び／またはカドミウムの結合部位（図１および２を参照）に含まれるドメインＩとＩＩの間の界面に位置するという当初の発見に基づいている。これら４残基はすべて、現在までに配列決定された哺乳類アルブミンのいずれにおいても良く保存されている（表１を参照）。ここで言及したナンバリングは、プレプロ−アルブミン配列が翻訳に続き開裂された後のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列の特定の位置に見られるアミノ酸に関するものである（表１を参照）。この部位の同定は利用できる亜鉛及び／または他の金属イオンの血中濃度を調節するための治療用アルブミンの設計および標的組織へのそれらのデリバリーの原理を提供する。本発明はミュータントアルブミンが有する細胞接着に対する効果の観察結果にも基づいている。
【００１０】
このように、第一に、ミュータントの由来となった天然アルブミンに対してミュータントが金属結合親和力及び／または他の生理学的特性の改変を示すように突然変異を生じた単離されたミュータント血清アルブミンが提供される。
金属結合及び／または他の生理学的特性の改変をもたらす天然アルブミン配列へのいかなる突然変異も、以下に定義するように本発明に包含されると認識される。特定のミュータントを産生させ、ここで述べられた実験に基づいてこのようなミュータントが金属結合及び／または他の生理学的特性の改変を示すか否かを試験することは専門家にとっては比較的簡単な課題である。
突然変異され得る好ましい残基は、表１で明らかなように残基Ｘ1〜Ｘ11及び／または特定の血清アルブミンに対し測定された結晶構造から決定され得る残基のいずれかと水素結合できる残基として同定される。
【００１１】
第二に実質的に以下のアミノ酸配列（配列番号１）からなる単離されたミュータントヒト血清アルブミンが提供される：
DahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqX5lqqcpfedhvkLvnevtefaktcvadesaencdkslX1tlfgdklctvatlretygemadccakqeperx2X8cfX6qhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrX9pyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvX10TEccX3X7X4llecaddradlakyicenqdsissklkeccekplleksX11ciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpdysvvlllrlaktyettlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasqaalgl
（上記配列中、X1はＨ以外；X2はＮ以外、X3はＨ以外、X4はＤ以外；X5はＹ以外；X6はＬ以外；X7はＧ以外、X8はＥ以外、X9はＨ以外、X10はＨ以外およびX11はＨ以外であり、前記ミュータントは天然ヒト血清アルブミンに関して金属結合親和力の改変を示す）。
【００１２】
本明細書及び特許請求の範囲を通して慣用のアミノ酸の１文字表記を用いている。アミノ酸置換は他の天然アミノ酸，特にＤＮＡにより直接コードされる２０個のアミノ酸あるいは例えば専門家に知られている合成アミノ酸あるいは珍しいアミノ酸に対する。上記の配列はＧｅｎｂａｎｋデータベースに見られるヒト血清アルブミンの配列に基づいている。ヒト血清アルブミンはＸ1がＨ、Ｘ2がＮ，Ｘ3がＨ，Ｘ4がＤ、Ｘ5がＹ、Ｘ6がＬ、Ｘ7がＧ、Ｘ8がＥ、Ｘ9がＨ、Ｘ10がＨおよびＸ11がＨである上記配列からなる。このように、本発明に従ってミュータント血清アルブミンは上述の位置に見られる特定の種の”アルブミン”の天然アミノ酸に関して、典型的には、残基X1〜X11に対する少なくとも１ヶ所の突然変異からなる。それにもかかわらず、種の個体間で自然変動が存在するので配列に小さな変動が生じ得る。X1〜X7において明らかにされた変動以外のそのような小さな配列変動は本発明からはずれていないと理解される。配列中のこのような変動は置換、反転，欠失あるいは転移として現れる。しかしながら、このような変異体のアルブミン配列は図１で示されたいずれの配列ともかなり類似している。一般に変異体アルブミンの配列は同定された配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％あるいは９９％の同一性（Ｘ位置を除く。）を示す。
【００１３】
アミノ酸配列間の相同性（すなわち、同一性）は市販のアルゴリズムを用いて決定することができる。プログラムＢＬＡＳＴ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ，ＢＬＡＳＴＮ，ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２配列（National Center for Biotechnology Informationにより提供された）はこの目的のために当該技術分野において広く用いられ、２つのアミノ酸配列の相同領域を整列させることができる。これらは構造の知られた蛋白とモデルとされた他の標的蛋白のアミノ酸間の相同性の程度を決定するためにデフォルトパラメータが使用される。
ミュータント血清アルブミンは生物体のプロテオームにおいて結合し得る他の蛋白を含まないあるいは実質的に含まないあるいは一部含む意味で単離され、それ故細胞あるいは生物体のプロテオーム内のいかなる天然アルブミンをも包含しない。
【００１４】
上記配列はリーダー配列（すなわち、MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR (Met-Lys-Trp-Val-Thr-Phe-Ile-Ser-Leu-Leu-Phe-Leu-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Ser-Arg-Gly-Val-Phe-Arg-Arg)(配列番号１３)）が配列から開裂された後の血清アルブミンのヒト型に基づいている。本発明はこのようなリーダー配列を含むミュータント配列にも及ぶ。
上記のことはヒト血清アルブミンのミュータントに関連する一方、本発明はミュータントヒト血清アルブミンにのみ限定されない。すべての種に渡って血清アルブミンはかなり保存されており、他の種のアルブミンから上記配列中Ｘｓで表された位置のアミノ酸を同定することおよび金属結合及び／または他の生理学的特性を改変するために上述のアミノ酸を変えることは十分に専門家の専門技術内である。表１は実際哺乳類の血清アルブミンポリペプチド配列の並びを示しており、本発明に従って突然変異を生じ得る残基が強調されている。ミュータント血清アルブミンを産生するために少なくとも前記残基の１つは同定された天然残基以外であるべきで、それは天然血清アルブミンに関して金属結合及び／または他の生理学的特性の改変を示す。
【００１５】
多くの血清アルブミンの配列は知られており、例えば、National Center for Biotechnology Infomation:www.ncbi.nlm.gov.のＧｅｎｂａｎｋデータベースから容易に入手できる。例えばヒトの配列はアクセッション番号Ｐ０２７６８で見ることができる。他の配列（１文字符号）もwww.albumin.org.で見ることができる。
本発明のミュータントは特定の種の天然血清アルブミンの一般的な全体のフォールディングに関して大体は類似している。例えば、ミュータント血清アルブミンの円偏光二色バンドの符号と大きさが天然の血清アルブミンと類似しているかどうかを調べるために円偏光二色性の研究が行われる。もし類似しているなら、ミュータント血清アルブミンは天然の血清アルブミンに類似した二次構造を示す。
【００１６】
本発明のミュータントはミュータントの由来となった天然アルブミンに関して金属結合親和力の改変あるいは他の改変された特性、例えば培養における細胞接着及び／または発育の改変を示す。金属結合親和力の改変は金属結合親和力（例えばＫｄ）における低下あるいは増強及び／または金属の結合／解離の比率の増大あるいは低下を意味する。トグＫｄ値に置き換えてＫｄ値を求める時１０あるいは１００の係数のような好ましくは２，４、あるいは６の係数による増加あるいは減少が生理的条件（すなわち、約ｐＨ７．３）、適切な濃度、約２０℃〜３７℃の温度で測定される。そのようなミュータントアルブミンに対し結合親和力の改変を示す金属は亜鉛、銅、ニッケルおよびコバルトがある。好ましくはミュータントアルブミンは亜鉛に対して結合親和力の改変を示す。一般に、金属結合親和力の改変はＺｎ2+，Ｃｕ2+などのような金属イオンに関する。適切な金属結合側鎖を持たない残基への金属結合に必要と考えられる残基の突然変異は金属結合親和力の低下をもたらすと考えられる。逆に金属への結合に必要と考えられる残基および結合を手助けし促進する残基の近傍に存在するが、金属／金属イオン結合に関連しない残基の突然変異は金属結合親和力を高めると期待される。
【００１７】
例えば以下の突然変異体は金属結合親和力の低下をもたらすと仮定される：
X1 ＝＞ A, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X2 ＝＞ A, F, G, I, K, L, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X3 ＝＞ A, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X4 ＝＞ A, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
また、金属親和力の上昇と調節を生じさせる金属結合リガンドを導入する側鎖の突然変異は以下の変異体を含む：
X5 ＝＞ C, D, E, H (これはブタアルブミンでは既にＨｉｓ残基)
X6 ＝＞ C, D, E, H
X7 ＝＞ C, D, E, H
X2 ＝＞ C, D, E, H
X4 ＝＞ C, E, H
X1 ＝＞ C, D, E
X3 ＝＞ C, D, E
【００１８】
提案部位の金属結合は脂肪酸結合により影響を受けることを本発明者らは見出した（A.J.Stewart,C.A.Blindauer,S.Berezenko,D.Sleep,P.J.Sadler,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100,3701-3706(2003)）。脂肪酸フリーのアルブミンと５モルのミリステート（ｐｄｂ １ｂｊ５）と結合したアルブミンのＸ線構造の比較から、いわゆる結合部位２に脂肪酸のアニオンを提供するためにドメインＩおよびＩＩベンドを結びつける長いヘリックスとリガンド配位していないｒＨＡにおける２カ所のハーフサイトは１０Å以上移動し連続した空洞を形成することが明らかである（Curry,S.,Mandelkow,H.,Brick,P.&Franks,N., Nat.Struct.Biol.5,827-835 (1998)）。この脂肪酸結合は提案亜鉛部位（図Ｘ３ｅ（ａ＆ｂ）を参照）における他の２残基、Ｈ６７とＮ９９から４〜６Å離れることにより残基Ｈ２４７とＤ２４９の移動をもたらす。Ｄ２４９はまたＨ６７のN'に対するＨ結合を維持するために側鎖の立体配座を変化させ、さらにＮ９９に対するＨ結合を形成する。アンリガンド構造においてＮ９９にＨ結合しているＨ２４７は脂肪酸結合構造においてＥ１００とＨ結合を形成する。ヒトアルブミンにおける脂肪酸結合による亜鉛部位の提案されたスイッチングは有機栄養素と必須金属イオンとの間のアロステリック相互作用の興味深い例である。Ｈ２４７−Ｅ１００のＨ−結合は"switched"型を安定化させると期待されるので、Ｅ１００の以下の突然変異体は相互作用する金属／脂肪酸結合に影響すると予測される。
X8 ＝＞ C, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
【００１９】
さらに、より最近の研究はＨ６７Ａ、Ｎ９９ＤおよびＮ９９Ｈの突然変異を有するアルブミンは、細胞培養培地で用いた時、野生型と劇的に異なる性質を示すことを明らかにした。細胞接着はＨ６７ＡおよびＮ９９Ｈミュータントの両方において傷害される。アルブミンから例えば脂肪酸の肝による取り込みは細胞表面へのアルブミンの非特異的結合とアルブミン分子の立体配座変化の誘導を必要とすることが知られている(R.G.Reed,C.M.Burrington,J.Biol.Chem.264,9867-9872, 1989)。突然変異残基はいずれもＨ結合を介したドメインＩ−ドメインＩＩ接触を安定化させるのに必要である。ドメインＩ／ＩＩ界面における一ヶ所の突然変異は細胞に対する突然変異アルブミンの作用に大きな影響を与えるという知見はドメイン間のＨ結合に必要とされるドメインＩ／ＩＩヒスチジン残基に関する以下の突然変異は細胞接着及び／または細胞発育に同様の影響を与える。
X9 ＝＞ A, D, E, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X10 ＝＞ A, D, E, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X11 ＝＞ A, D, E, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
なお、本明細書において標準的なアミノ酸の１文字表記が使用されている点に留意されたい。
【００２０】
アルブミンに対するＺｎ2+の性質は113Ｃｄ−ＮＭＲによる研究によって示された。哺乳類の幾つかのアルブミンはＣｄ2+に対しＮ／Ｏ配位に特有のケミカルシフトを有する２個の強力な結合部位を有する（Sadler & Viles, Inorg.Chem., 35, 4490-4496 (1996)）。ヒトアルブミンでの２４ｐｐｍと１１４ｐｐｍの113Ｃｄシフト（Ｃｄ（ＣｌＯ4）に比して）はそれぞれ１個のイミダゾール窒素および２〜３個のイミダゾール窒素を含む部位を暗示している。Ｚｎ2+，Ｃｕ2+およびＮｉ2+イオンはヒトアルブミンにおいてこれらの部位のＣｄ2+を置換し得る。アルブミンの結晶構造に基づいた本発明者による分子モデリング（ＰＤＢ １ＡＯ６）は、多数の金属結合部位がＨｉｓ６７、Ａｓｎ９９、Ｈｉｓ２４７およびＡｓｐ２４９のクラスターを含むことを示唆した。本発明者らはＨｉｓ６７のアラニンへの部位特異的(site directed)突然変異誘発とそれに続く111Ｃｄ−ＮＭＲを用いる同位元素に富んだカドミウムによる金属競合研究によりこの部位の位置を立証した。月並みにこのことはアラニンに突然変異した位置６７のヒスチジンをＨ６７Ａとして表される。このような表記は本願の他の部分でも用いる。
【００２１】
他の残基、例えば、チロシン３０（X5）およびグリシン２４８（X7）の突然変異は亜鉛結合に影響すると考えられる。チロシン３０はそれ自身金属に結合しないが、金属に結合している残基９９に水素結合する。このように、残基３０の突然変異は金属結合部位に影響する。Ｇｌｙ２４８のバックボーンのカルボニルは残基９９に水素結合する、それ故この残基の突然変異は金属結合部位に影響を与える。
【００２２】
本発明の突然変異アルブミンは新たに合成されるが、好ましくは当該技術分野の専門家に良く知られている遺伝子組み換え法により産生される。例えば突然変異アルブミンは関連した遺伝子配列に対する部位特異的(site directed)突然変異誘発およびその後の蛋白発現により天然アルブミンから導かれる。このような技術は良く知られており、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYに述べられている。
本発明はそれ故本発明に従ってミュータント血清アルブミンをコードする核酸配列にも拡張される
【００２３】
宿主生物体でのミュータントアルブミンの遺伝子組み換えによる産生のために、ミュータントアルブミン蛋白をコードするヌクレオチド配列を選択宿主に対し設計されたＤＮＡ構築物を作成するために発現カセットに挿入し、宿主に導入する。選択宿主にとって適切なプロモーター、シグナル配列、５’および３’非翻訳配列、エンハンサーおよびターミネーターのような特異的な制御配列の選択は当該技術分野におけるルーチンワーカーの技術レベル内である。適切なリーディングフレームにリンクした個々の要素を含む結果として得られた分子は、リン酸カルシウム沈降法、エレクトロポレーション法、バイオリスティック導入法、ウイルス導入法などのような当該技術分野の専門家に良く知られている技術を用いて選択した細胞に導入することができる。トランスフェクション（Schenborn ET, Goiffon V. Methods Mol Bio. 2000; 130: 135-45, Schenborn ET, Oler J. Methods Mol Biol. 2000; 130: 155-64），エレクトロポレーション（Heiser WC. Methods Mol Biol. 2000; 130: 117-34）あるいは組み替えウイルス（Walther W. Stein U; Drugs 2000 Aug; 60 (2): 249-71）による適切な発現カセット、ベクターおよび蛋白の組み換え法は大腸菌（Studier and Moffatt, J. Mol. Biol. 189: 113 (1986); Brosius, DNA 8: 759 (1989))を参照）、酵母（Schneider and Guarente, Meth. Enzymol 194: 373 (1991)を参照）および昆虫の細胞（Luckow and Summers, Bio/Technol. 6: 47 (1988)を参照）のような宿主微生物および哺乳類の細胞（組織培養あるいは遺伝子療法）にとって良く知られている。
【００２４】
微生物、特に酵母においてアルブミンを発現し、培養培地からそれを精製する技術は米国特許第5637504号、米国特許第6034221号及びWO00/44772に開示されており、いずれも言及により本願に組み込まれる。
それ故、発明はさらにここで述べたミュータントアルブミンをコードするここで述べたヌクレオチド配列に機能的にリンクしたプロモーターからなる発現カセットを提供する。本発明に従って突然変異を生じ得る血清アルブミンをコードするヌクレオチド配列もＧｅｎｂａｎｋデータベースから容易に入手できる。
【００２５】
更に、発明はここで述べたミュータントアルブミンと医薬上許容される担体を含む医薬品組成を提供する。
医薬上許容される担体は当該技術分野の専門家に良く知られており、０．１Ｍおよび好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液または０．８％の食塩水が挙げられる（但し、これらに限定されない。）。さらに、このような医薬上許容される担体は、水性または非水性の溶液、懸濁液および乳濁液のいずれでもよい。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルが挙げられる。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、食塩水や緩衝剤媒体を含む乳濁液あるいは懸濁液が挙げられる。非経口投与賦形剤としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲル液のブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸添加リンゲル液あるいは不揮発性油が挙げられる。静脈内投与賦形剤としては、液体および栄養補給剤、リンゲル液のブドウ糖などに基づくものなど、電解質補給剤が挙げられる。防腐剤や他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどを含有させてもよい。
【００２６】
本発明のミュータントアルブミンは、通常の方法により医薬品組成とするために医薬上許容される担体（例えば、結合剤、調整剤、矯味剤、崩壊剤、乳剤、賦形剤）、希釈剤あるいは安定剤と混合して医薬品製剤として供給され、それは例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤、シロップ剤、懸濁液、溶液、注射剤、注入剤、デポ剤、坐剤に製剤化され、例えば経口あるいは非経口投与される。
【００２７】
経口投与に錠剤を用いる場合、一般に用いられる担体としては、ショ糖、乳糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、コーンスターチ、ステアリン酸マグネシウムのような典型的な潤滑剤、パラベン、ソルビンのような防腐剤、アスコルビン酸、α−トコフェロール、システインのような抗酸化剤、崩壊剤あるいは結合剤が挙げられる。カプセル剤として経口投与する時には、有効な希釈剤としては、乳糖や乾燥コーンスターチが挙げられる。経口投与の液体としては、シロップ、懸濁液、溶液および乳濁液が挙げられ、それらはこの分野で用いられる水などの典型的な不活性希釈液を含有してもよい。さらに、甘味剤あるいは香料を含有させてもよい。
【００２８】
皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射あるいは点滴のような非経口投与の場合には、活性成分の溶液のｐＨは適切に調整され、緩衝剤で処理されあるいは滅菌される。使用できる賦形剤あるいは溶剤の例としては、蒸留水、リンゲル水および等張の塩水が挙げられる。静脈内投与には、溶質の総濃度は溶液を等張とするように調整される。
坐剤は本発明化合物を正常温度で個体であるが腸内温度で液体となり直腸で融解し活性成分を放出するココアバターおよびポリエチレングリコールのような適切な非刺激性の賦形剤と混合することにより作成できる。
【００２９】
投与量は年齢、体重、投与時間、投与法、薬剤の組み合わせ、治療を行っている患者の健康状態のレベルおよび他の因子によって決定される。１日の投与量は患者の健康状態および体重、活性成分の種類および投与経路に依存して変わるが、経口投与の場合、１日投与量は約０．１〜１００ｍｇ／人／日、好ましくは０．５〜３０ｍｇ／人／日である。非経口投与の場合には、１日投与量は皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射および直腸内投与に対し望ましくは０．１〜５０ｍｇ／人／日、好ましくは０．１〜３０ｍｇ／人／日である。
【００３０】
本発明のミュータントアルブミンは、例えば、欠損疾患および感染症の治療、金属過負荷の治療及び／または金属濃度の調節が別の金属イオンあるいは薬物あるいは天然分子のような有機分子の生理機能に結びついている病気に対するヒトあるいは動物の医薬品として使用される。
本発明のミュータントアルブミンを用いて血中亜鉛のような金属の量を調節したり亜鉛吸収に問題のある患者の治療を促進することも可能である。さらに、特に強力な金属結合力を示すミュータントアルブミンは環境中の金属を検出するバイオセンサーに用いられる。
【００３１】
アルブミンに結合した亜鉛は塩素イオンに結合し得るZn2+の形であるというさらなる観察からは、亜鉛を結合したアルブミンが塩素センサーとして用いることができ、亜鉛への接触は血中塩素濃度によって制御され得る（このことは触媒作用をも調節する）という可能性が導かれる。
本発明者らは、本発明によるミュータントアルブミンは培養中細胞の発育に影響を及ぼすことも観察した。ミュータントは基質に結合したおよび培地中に見られる細胞の分布に影響を及ぼす。幾つかのミュータント、例えば、Ａｓｎ９９Ａｓｐは細胞発育を全体として促進させることも観察された。それ故、本発明は、本発明に従って培養における細胞の発育特性を変えるミュータント血清アルブミンの方法あるいは使用にも関連する。発育特性の改変は接着、生存力百分率及び／または細胞発育における変化例えば力価、基質が接着した細胞および培地中に分散した細胞間の細胞分布の変化あるいは接着したあるいは培地中の死細胞あるいは生存細胞間の違いを含む。
【００３２】
アルブミンは一般に細胞培養培地、特に哺乳類の細胞培養および特に血清を含まない培地に含まれる。発明の修飾アルブミンが加えられる培養液は銅、亜鉛及び／またはカドミウムを含むかあるいは含まない。適切な例はイーグル（Ｅａｇｌｅ）培地、ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改変イーグル培地（ダルベッコ最小培地）、ハム（Ｈａｍ）Ｆ１０およびＦ１２培地、イスコーブ（Ｉｓｃｏｖｅ）改変ダルベッコ培地およびＲＰＭＩ培地を含む。普通にアルブミンを含むこのような培地の場合には、発明の修飾アルブミンは天然アルブミン（ヒトあるいはウシ）と一部あるいは完全に置き換えられるかあるいはアルブミンの通常量より過剰に加えられる。通常アルブミンを含まないような培地の場合には、発明の修飾アルブミンが加えられる。
【００３３】
培地が用いられる細胞には動物細胞、特に鳥類（ニワトリのような）あるいはヒトのような哺乳類の細胞、他の霊長類（サルのような）あるいはげっ歯類（ハムスター、ラットあるいはマウスのような）の細胞がある。細胞型は例えば腎臓、卵巣あるいは肝臓のいずれかの組織由来で、内皮、上皮、皮膚、神経、リンパ球、幹細胞などである。ハイブリドーマのような人工細胞もある。適切な細胞の例には腫瘍形成性あるいは非腫瘍形成性ヒト肝細胞、Ｂリンパ球、ハイブリドーマ、胎仔ハムスター腎臓細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞およびヒト胎児腎臓細胞がある。細胞は容器壁、多孔性のマトリックスあるいはビーズのような表面で培養されるかあるいは培地中に自由に懸濁される。
【００３４】
培養細胞は特定の細胞により自然に産生される物質を産生するのに用いられるかあるいは治療用蛋白のような他の産物を発現させるために遺伝子工学により作成される。例はモノクローナル抗体およびそのアナログ（１本鎖可変領域フラグメントおよびヒト化ＩｇＧκ軽鎖のような）、血液凝固因子（第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＸＩ因子および第ＸＩＩＩ因子のような）、抗トロンビンＩＩＩ、サイトカイン（インターロイキン、例えばインターロイキン‐２のような、およびインターフェロン‐αあるいはインターフェロン‐γのようなインターフェロン）、成長因子（インスリン様成長因子のような）、トロンボモジュリン、グルタミン合成酵素、プロウロキナーゼおよびプラスミノーゲンを含む。
【００３５】
発明の修飾アルブミンは付着、発育及び／または発現および分泌の増強のような細胞に対する望ましい作用をもたらすために脊椎動物および無脊椎動物由来の培養細胞および組織と同様に、原核生物および酵母に対し作成された組織培養培地に含まれる。
【００３６】
選択された培養培地における発明の修飾アルブミンの適切な濃度決定は当該技術分野において通常の技術内である。一つの具体例では、修飾アルブミンは約５０μＭから約３０ｍＭの濃度で細胞培養システムに加えられる。さらなる具体例では、ペプチドは約２５０μＭから約２０ｍＭの濃度で細胞培養システムに加えられる。さらに、多様に修飾されたアルブミンは相乗作用を生じさせるために（もしこれらが細胞に対し同じ作用を有するなら）あるいは多様な作用を生じさせるために（もしそれぞれの修飾アルブミンが同じ細胞に異なる作用を有するなら）培養培地の表面に加えられる。
【００３７】
細胞接着を促進させる発明の修飾アルブミンは組織培養基質をコーティングするための溶液あるいは固定型細胞の発育のための他の表面を作成するために水のような担体に溶解される。例えば、発明の上記修飾アルブミンを１個以上含む溶液は表面上に分布し逆空気流フードで乾燥され、その結果乾燥フィルムの形で表面に存在する上記修飾アルブミンを生じる。
【００３８】
発明の上記修飾アルブミンの表面への吸着様式は非共有結合性の相互作用、非特異的吸着および共有結合を含む。発明の一つの具体例では、アルブミンは表面に直接吸着される。さらなる具体例では、ペプチドはキイホールリンペットヘモシアニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ポリリジン、細胞表面レセプター認識配列を持つペプチド、免疫グロブリン、ポリサッカライドあるいは成長因子に限定されないが、少なくともこのうちの１つで既に被覆された表面に吸着される。別の具体例では、アルブミンと上記蛋白の１つは、表面にフリーあるいは抱合体として同時に用いられる。
【００３９】
本発明の成長促進修飾アルブミンは二次元あるいは三次元表面を含む表面において様々な固定依存性細胞の接着及び／または発育を促進するのに適している。例えば、その表面は細胞を３‐Ｄ配列に付着させるバイオリアクターの表面である。現在存在するよりも効率の良いバイオリアクターは発明ペプチドで修飾した３‐Ｄ表面に細胞を付着させることによって設計することができる。
【００４０】
本発明の実施に際して用いられる表面のタイプに関して、適切な表面はこれに限定されないが、セラミック、金属あるいはポリマーの表面が含まれる。最も望ましくは、本発明はポリマーの表面およびセラミック、例えばガラス表面の処置に用いられる。本発明で用いられる適切な表面は、これに限定されないが、プラスチック皿、プラスチックフラスコ、プラスチックの微量滴定プレート、プラスチックチューブ、縫糸、膜、フィルム、バイオリアクターおよび微粒子を含む。ポリマー表面は、これに限定されないが、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（テトラフルオロエチレン）、フッ素化エチレン、ポリ（ジメチルシロキサン）およびその他のシリコンゴムを含む。ガラス表面はグリセロールポリシラン結合ガラスを含む。
本発明に従ってミュータント血清アルブミンからなる細胞培養培地も提供される。
【００４１】
本発明は実施例の方法によりおよび添付図面を参照することによりさらに説明される。
材料と方法
ａ）分子モデリング
ｕｎｌｉｇａｎｄｅｄ（アポ）アルブミン（ＰＤＢ取得コード１ＡＯ６）の２．５Åでの報告された結晶構造をモデルの出発点として終止用いた。モデルはＳｙｂｙｌ（ＴＲＩＰＯＳ Ｉｎｃ．，Ｖｅｒｓｉｏｎ６．８）で構築し、ジオメトリーを最適化するためにエネルギー最小化を行った。以前の実行ではプログラムはジスルフィド結合の存在を無視したことにより、水素原子の追加とジスルフィド結合の開裂をもたらした。亜鉛部位それ自身に対してではないが蛋白の全体構造にわずかに影響を及ぼすこの問題は、現在最終モデリングの実行において修正されている。最小化において、亜鉛に対する特定の力場パラメーターを満たした後に、ＴＲＩＰＯＳ力場を用いた。ヒスチジン（２．００Å）、アスパルテートあるいはグルタメート（２．００Å）および水（２．０６Å）に結合したZn2+の結合距離はHarding, M.M. Acta Cyst. D57, 401-411 (2001), http://tanna.bch.ed.ac.uk.から採用した。これらの値は金属蛋白のデータベースを用いたｐｄｂの分析結果とも一致する(Castagnetto, J.M., Hennessy, S.W., Roberts, V.A., Getzoff, E.D., Tainer, J.A., Pique, M.E., Nucleic Acids Res., 30, 379-382 (2002)。力定数はＴＲＩＰＯＳ力場から採用した。亜鉛周囲の結合角は不自然でなかった。最初のステップでは、Zn2+周囲のジオメトリーはZn2+イオン、４個の蛋白リガンド残基および水分子のみを考慮した１００ステップのエネルギー最小化により最適化された。最初のステップにおける不適切なジオメトリーおよび原子運動を通して導入されたファンデルワールスの接触を除くために、さらに５０ステップのエネルギー最小化が残基６５−６９、９７−１０１および２４７−２５１およびZn2+イオンおよび水分子に適用された。最後に、同じ理由で３０以上のステップが全蛋白に適用された。図のオーバーレイはｒｍｓｄ値も与える"Fit monomers"ルーチンを用いてＳｙｂｌで作成された。亜鉛フリーのミュータントアルブミンのモデリングに際し、Ｎ９９側鎖をin silicoで望む側鎖（ＡｓｐあるいはＨｉｓ）に変異させ、全分子に３０ステップのエネルギー最小化を適用することにより不適切な接触の可能性は軽減された。野生型モデルに用いられたと同じアプローチが用いられ、亜鉛を含むミュータントモデルのために、異なる金属−リガンド結合性を有する幾つかの可能な出発構造を探索した。
【００４２】
コンピュータプログラムとデータベース
配列の並び替えはEntrez Protein, National Centre for Biotechnolgy Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)から得られた配列よりClustal W, European Bioinformatics Institute (www.ebi.ac.uk/clustalw/)を用いて行われた。ヒトアルブミン（ＰＤＢ １ＡＯ６）に対する三次元配位（ＰＤＢ １ＡＯ６）はBrookhaven Protein Databank (www.rcsb.org/pdb/)から得られた。
【００４３】
部位特異的突然変異誘発
オリゴヌクレオチド‐直接突然変異誘発はアルブミンのＨ６７Ａ変異型をコードするｃＤＮＡを作成するために用いられた。突然変異誘発性のオリゴヌクレオチド5'-gctgaaattgtgacaaatcacttgctaccctttttggagacaaattatgc-3'（配列番号１１）と5'-gcataatttgtctccaaaaagggtagcaagtgatttgtcacaattttcagc-3'（配列番号１２）はDelta Biotechnology Ltd., Nottinghamにより供給された。突然変異誘発はthe QuikChange（登録商標）Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて行われた。望む突然変異体を含むクローンはジデオキシ鎖終止配列により変異部位をヌクレオチド配列分析により同定した。変異ｃＤＮＡはＰＵＣ９酵母発現ベクターに挿入され、エレクトロポレーションによりサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) DXY1細胞に形質転換された。
【００４４】
発現と精製
３０℃で４日間生育後S.セレビシエ(S. cerevisiae)DXY1細胞培養を３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離機にかけた。その後上清を除き、ろ過した。組み換え蛋白は陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、上清から濃縮した。ＳＰ‐セファロースファーストフロー陽イオン交換カラム（カラム容積＝２２５ｍＬ）は４倍のカラム容積量の３０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５で平衡に到達させた。ろ過上清は約３Ｌの２バッチに分けた。オクタン酸ナトリウム（２Ｍ溶液の７．５ｍＬ）をそれぞれのバッチに加え、ｐＨを酢酸で４．５に調整し、カラムに充填する前に脱イオン水で伝導度を5.5mS cm-1に調整した。充填後、カラムを８倍のカラム容積量の５０ｍＭ酢酸塩、８０ｍＭＮａＯＨ，ｐＨ４．０および４倍のカラム容積量の２ＭＮａＣｌ，ｐＨ４．０を含む２７ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。３度目の洗浄は１０倍のカラム容積量の平衡緩衝液で行った。最後にカラムを２倍のカラム容積量の５ｍＭのオクタン酸、ｐＨ５．５を含む８５ｍＭの酢酸ナトリウムで溶出した。
【００４５】
ＳＰ‐セファロースファーストフロー溶出液はＤＥＡＥファーストフローカラム（カラム容積＝１６７ｍＬ）で陰イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。カラムは１５倍のカラム容積量の３０ｍＭ酢酸塩、２７ｍＭＮａＯＨ，ｐＨ５．５で平衡に到達させた。ＳＰ‐セファロース溶出液の伝導度をカラムに充填する前に脱イオン水で３，０mS cm-1に調整した。充填後カラムを５倍のカラム容積量の15.7mM K2B4O7.4H2O,pH9.2で洗浄した。カラムを０．７５倍のカラム容積量の８５ｍＭ酢酸塩、110mM K2B4O7.4H2O,pH9.4で溶出した。
【００４６】
ＤＥＡＥ溶出液をDelta Blue Agarose(Prometic Biosciences)カラム（カラム容積＝４２３ｍＬ）でアフィニティクロマトグラフィーによりさらに精製した。カラムはＤＥＡＥ溶出液を充填する前に２倍のカラム容積量の２５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ８．９で平衡に到達させた。充填後、５倍のカラム容積量の平衡緩衝液で洗浄した。カラムを２倍のカラム容積量の２ＭＮａＣｌ，ｐＨ６．９を含む５０ｍＭリン酸塩緩衝液で溶出した。
【００４７】
Delta Blue溶出液は蠕動ポンプに連結した10kD MWCO Pall Filtron LU Centramate filterを用いて濃縮した。４．２５ｇのＨ６７Ａアルブミンが回収された。精製産物からの濃縮溶液のサンプルを5mg mL-1に希釈し、１０μＬをＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルに使用した。ゲルはLaemmli(1970)Nature 227, 680-685の標準法を用いて作成し使用した。ゲルをクマシーブルー染色および銀染色の両方で染色し、１％の濃度で存在する他の蛋白のないことを明らかにした（それ故蛋白の純度は約９９％）。
【００４８】
円偏光二色性分光分析
天然組み換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）（Delta Biotechnology Ltd., Nottingham）とＨ６７Ａミュータントアルブミンを２００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４中約1.5mg mL-1に希釈した。両蛋白のスペクトルを測定した。機器はＪＡＳＣＯ Ｊ‐６００分光偏光計を用いた。二次構造の推定はＳＥＬＣＯＮ法を用いて計算した。
1D111Cd-{1H}ＮＭＲスペクトル（106.04MHz,Bruker DMX500）は２９５Ｋで10mm BBO（直接観察）プローブヘッドおよび外部標準として0.1M Cd(ClO4)2(0ppm)を用いてごく普通に得られた。プロトンデカッップリングはＧＡＲＰを用いる複合パルスデカップリングにより行った。蛋白のサンプルは一般に２モル当量の111CdCl2と共に５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．１、１００ｍＭＮａＣｌ，１０％重水中であった。111CdCl2
は適切な量の１ＭＨＣｌに111CdO（９５．１１％の同位元素純度、Oak Ridge National Laboratory, Tennessee, USA）を溶解することにより産生させた。
【００４９】
111Cd-NMR研究は同じ濃度で１，５ｍＭｒＨＡあるいはＨｉｓ６７Ａｌａミュータント蛋白を用いて行った。金属滴定実験のために様々な当量のZnCl2あるいはCuCl2を加え、ｐＨはそれぞれを加えた後にチェックし、調整した（もし必要なら）。スペクトルは１７．５μｓ（９０°）の111Cdパルス幅、３６ｋ減衰シグナル，０．１０ｓの補足時間および０．３０ｓのリサイクルディレイを用いて３０ｋＨｚ（２８０ｐｐｍ）の掃引幅に渡って４ｋ複合データポイントにおいて得られた。フーリエ変換に先立ち、データは１６ｋデータポイントにｚｅｒｏ‐ｆｉｌｌｅｄし、指数乗法によりアポディゼーションした（１２０Ｈｚラインブロードニング）
【００５０】
Ａｓｎ９９ＡｓｐおよびＡｓｎ９９ＨｉｓミュータントｒＨＡに関する111Cd-NMR研究はミュータントアルブミンの１ｍＭ溶液を用いて行った。ほとんどのスペクトルは１７．５μｓ（９０°）の111Cdパルス幅、３６ｋ減衰シグナル，０．１３ｓの補足時間および０．２４ｓのリサイクルディレイを用いて３２ｋＨｚ（３００ｐｐｍ）の掃引幅に渡って８ｋ複合データポイントにおいて得られた。フーリエ変換に先立ち、データは３２ｋデータポイントにｚｅｒｏ‐ｆｉｌｌｅｄし、指数乗法によりアポディゼーションした（１５０Ｈｚライン‐ブロードニング）。
【００５１】
d)1H-NMRスペクトル
ＮＨ共鳴を除くために、凍結乾燥サンプルを重水（９９．９％の同位元素純度、Ａｌｄｒｉｃｈ）に約５０ｍｇ／ｍＬに溶解し、２９６Ｋで４８時間保ち、再度凍結乾燥しそれから５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓを含む重水中１ｍＭ溶液となるように溶解した。１ｍＭの濃度の蟻酸ナトリウムを内部キャリブレーション標準（sodium 3-(trimethylsilyl)propionate; TSPに比して８．４８ｐｐｍ）として加えた。pH*（ｐＨ計の読み）は６．９−７．０のｐＨ（Glasoe, P.K. and Long, F.A. J. Phys. Chem., 64, 188 (1960)）に相当する７．３−７．４に調整した。1D and 2D 1H-NMR実験はＺ‐グラジエント三重共鳴（1H,13C,15N）プローブヘッドを用い５９９．８２ＭＨｚで操作するBruker Avance 600 spectrometerを用い３１０Ｋでごく普通に行われた。残留水を抑えるために簡単なプレサチュレーションパルスシークエンスを用いた１Ｄスペクトル（９０°励起パルス、９ｋＨｚ掃引幅、８ｋタイムドメインデータポイント）に対して、５１２の減衰シグナルが一般に得られた。
【００５２】
データは３２ｋにｚｅｒｏ‐ｆｉｌｌｅｄし、分解能向上およびフーリエ変換のためｓｑｕａｒｅｄ ｓｉｎｅ ｂｅｌｌとＧａｕｓｓｉａｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎの至適組み合わせによりアポディゼーションした。２ＤＴＯＣＳＹ実験に際し（９０°励起パルス、８．４ｋＨｚ掃引幅，ミキシング時間６５ｍｓ、１．３ｓ緩和ディレイ）、2x 512 t1インクレメントのそれぞれに対する４８あるいは５６の減衰シグナル（ｔｉｍｅ‐ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ｐｈａｓｅ ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ＴＰＰＩ）を用いた多次元取得）が残留水を抑えるために、感受性の向上した二重パルスフィールドグラジエントスピンエコーシークエンスを用いて４ｋ複合データポイントにおいて得られた。データはｓｑｕａｒｅｄ ｓｉｎｅｂｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓを用いてアポディゼーションされ、実際のフーリエ変換は２ｋ×２ｋデータポイントで行われた。
【００５３】
野生型に対する幾つかのスペクトルも０．１Ｍのリン酸カリウム（ＫＨＰ）緩衝液中で測定した。ヒスチジンＨε１プロトンのケミカルシフトも緩衝液の同一性に依存する。一般に、シグナルはＴｒｉｓ緩衝液中同じpH*（重水中で測定されたｐＤ）で測定されたスペクトルに比べてＫＨＰ緩衝液では高磁場にシフトする。スペクトルの質は同様で、１ｍＭの蛋白濃度は行われたほとんどの実験で最適であった。この濃度以上では、溶液はあまりにも粘性が高く、そのことはシグナルの線幅に対すると同様に明らかにシミングにとって不利であり、溶液の取り扱い（例えばｐＨ調整、反応物との混合）を難しくする。
【００５４】
ｅ）ＵＶ‐Visスペクトロスコピー：銅滴定
アルブミンのサンプルは２００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４中１ｍＭあるいは２ｍＭであった。７００ｍＭのCuCl2貯蔵溶液から、０．２μｌ（０．２モル当量に相当）を逐次追加した。サンプルを完全に混合し、５分後に４００ｎｍから８００ｎｍの間でＳｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ２５０ＩＰＣ分光光度計を用いてＵＶ‐Ｖｉｓスペクトルを測定した。最初、溶液はピンク色に変わり、一方後の追加は混濁をもたらし、スペクトルにおいて観察された吸収の全体的な増加が説明された。混濁の出現（Cu3(PO4)2の形成）は様々のアルブミンミュータントで明らかに異なる。
【００５５】
ｆ）細胞毒性を評価する細胞培養実験
発明者らの研究の間、亜鉛とアルブミンの細胞毒性を調べる２つのアプローチを開発した。最初の実験で用いたアプローチはトリパンブルーを用いる細胞生存力の測定により、２番目のアプローチは死亡細胞をプロピジウムアイオダイドで染色した後に、ＦＡＣＳ（Fluorescence-activated cell sorting、フローサイトメトリーの応用）を用いた。２番目のアプローチは幾つかの利点がある；時間と材料の消費の両方に関してより効率がよい。
【００５６】
ｉ）標準的な培養条件
ＷＲＬ‐６８細胞を１０％ＦＣＳ（新生仔ウシ血清）、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび×１の濃縮ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）で培養した。細胞はインキュベーターにおいて８０cm2の組織培養グレードフラスコで３７℃、５％CO2で生育した。細胞に２〜３日毎に新鮮な培地を補給するかあるいはモニタリングにより必要な時には黄色により補給を示唆する重炭酸塩のカラー指示薬が培地に必要であった。フラスコ中生育した細胞はいったんコンフルーエントとなると、トリプシン＋ＥＤＴＡおよびＰＢＳを用いて採取された。細胞懸濁液はペレットまでＭＳＥ Ｍｉｓｔｒａｌ１０００遠心機で１０分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を除き細胞のペレットを培地中に再懸濁し、必要な時に用いた。
【００５７】
ｉｉ）トリパンブルーを用いる細胞生存率の計測
トリパンブルーは母集団における生存細胞の割合を評価するために用いられる。染料の反応性は発色団が陰性に電荷を帯びており膜が傷害されていなければ細胞と反応しないという事実に基づいている。生存細胞は色素を取り込まないが死亡細胞は取り込む。一般に細胞は15.2x105cells/ml（Ｋｅｒｒｙ Ｂｕｎｙａｎでこの値をチェックする必要がある）の0.5mlを用いて小さな細胞培養フラスコに接種した。これらを終夜放置して平衡に到達させた。培地を除きＰＢＳで細胞を洗浄した。それから細胞を組み替えヒトアルブミン（ｒＨＡ）単独（４０ｍｇ／ｍｌ）、Ｈ６７Ａヒトアルブミン（Ｈ６７Ａ）（４０ｍｇ／ｍｌ）、ｒＨＡおよびｈ６７Ａと０．１、０．５および１．０モル当量の亜鉛とで処理し、同じ濃度で亜鉛単独で処理した。いずれの処理も補充ＤＭＥＭで行った。対照には培地のみを加えた。処理後フラスコを２晩放置した。アルブミンと亜鉛でインキュベーション後培地を除き分析のために保存した。細胞層はＰＢＳで２回洗浄し、この洗浄液を集めた培地に加えた。細胞層はトリプシン＋ＥＤＴＡを用いてフラスコから除いた。再びフラスコをＰＢＳで洗浄し、この洗浄液を細胞の懸濁液に加えた。培地と細胞懸濁液のすべてのサンプルを遠心分離した。一度遠心した上清を吸引して除きペレットをＰＢＳに再度懸濁させた。集めた培地と細胞層の生存細胞の濃度と総細胞数を評価するために、２００μｌの良く混合したサンプル、３００μｌのＰＢＳおよび５００μｌの０．４％トリパンブルー（シグマ）を混合し、２〜３分間室温に放置した。懸濁液を血球計に移し、オリンパス倒立位相差光学顕微鏡を用いて観察し、４×４の正方形格子内の死亡細胞(青)と生存細胞(無色)の数を数えた。全部で１０個の正方形格子の数をカウントした。これらの細胞数は以下の式に従って総細胞数および生存細胞数を評価するのに用いた：
細胞／ｍｌ＝平均細胞数×５（希釈係数）×１×１０4（血球計のチェンバー係数）
生存細胞／ｍｌ＝生存細胞数×５（希釈係数）×１×１０4（血球計のチェンバー係数）
細胞生存力（％）＝（総生存／総生存および非生存）×１００
これらの数字は培地と細胞層に認められる総細胞数およびこれら細胞の生存力を示すために図の形で示した。
【００５８】
ｉｉｉ）フローサイトメトリーと蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）による分析
細胞を０．５ｍｌ／穴の１２穴プレート上0.0995x106cells/mlで培養した。平衡にするためプレートを終夜放置した。それから培地を吸引で除き細胞層をＰＢＳで洗浄した。その後野生型アルブミンあるいはＨｉｓ６７Ａｌａ、Ａｓｎ９９ＡｓｐあるいはＡｓｎ９９Ｈｉｓミュータントアルブミンの有無下、０、６０，３００あるいは６００μＭのZnCl2を補充した培地で細胞を処理した。培地のみで処理した細胞を対照とした。４８時間インキュベーション後フローサイトメトリーを用いてプレートを分析した。このために培地を除き細胞層をＰＢＳで２回洗浄した。前に除いていた培地にこの洗浄液を加えた。それから細胞層をトリプシン＋ＥＤＴＡを用いて除き、ＰＢＳで２回洗浄し、これらの洗浄液を細胞懸濁液に加えた。細胞選別に先立ちすべてのサンプルに１０％ＦＣＳを加えた。細胞死を検出するためにカウント前にすぐにサンプルにプロピジウムアイオダイド（１μｇ／ｍｌ）を加えた。それからBeckman Coulter EPICSセルカウンターを用いてサンプルを測定した。群間比較のために細胞数を測定するべく６０秒後イベントの総数を記録した。
【実施例】
【００５９】
分子モデリングによる亜鉛結合部位の同定
ＮＭＲの研究はアルブミンへの結合に関し113Cdケミカルシフトは２ヶ所での蛋白への金属配位を示唆することを明らかにした（Sadler and Viles(1996)Inorg. Chem. 35, 4490-4496）。Zn2+がCd2+を置換する部位におけるケミカルシフトは２−３個のイミダゾール窒素原子を含む蛋白に対する金属の配位の範囲内である（Oez et al. (1998) Biochem. Cell Biol. 76, 223-234）。
【００６０】
ヒトアルブミンの結晶構造配位はBrookhaven Protein Databank (PDB 1AO6)から得、WebLab Viewer Pro v4.0(Accelrys)を用いて調べた。ヒスチジン残基に焦点を当て（これらは金属配位にとって蛋白における主な窒素供与残基であるので）、それぞれの間の距離を測定した。本発明者らは分子上１ヶ所のみがお互いから５Å以内の２本のヒスチジン側鎖を与えることを見出した。このことからＨｉｓ６７とＨｉｓ２４７が亜鉛結合部位に含まれると発明者らには信じられた。この部位周辺の他の残基の同定から、Ａｓｎ９９とＡｓｐ９９も金属結合に対する酸素リガンドを与えるのに十分接近していることが明らかとなった。Ａｓｎはその側鎖のアミド基から窒素リガンドを与え得る可能性もある。
【００６１】
蛋白における金属に配位するアミノ酸側鎖のデータベース(Harding (2001) Acta Cyst. D57, 401-411;http://tanna.bch.ed.ac.uk)は他の３種の蛋白（ヒトカルシニューリン、大腸菌の5'-エンドヌクレオチダーゼおよびインゲンマメパープルホスファターゼ）が２個のＨｉｓ，１個のＡｓｐおよび１個のＡｓｎ残基に結合する亜鉛を含むことを明らかにし、さらにこれが亜鉛結合にとって適切な部位であることを示唆した。本発明者らにより決定されたように金属結合の予測領域を示す図１と２を参照せよ。
【００６２】
提案された結合部位への亜鉛のモデリング
亜鉛を含むアルブミンの最初のモデルは報告された結晶構造（ｐｄｂ取得コード１ＡＯ６）に基づいてWeblabviewer(Accelrys)を用いて構築した。本発明者らの1D111CdＮＭＲ研究において生理条件下塩素の結合をおおいにありそうなこととするCl-濃度に共鳴シフトが依存することを認めていたので、５番目のリガンドとしてCl-を含む５配位として亜鉛部位のモデルを構築した。５番目のリガンドとして水にもう一つの可能性がある。
【００６３】
亜鉛に対し幾つかの特定のパラメーターを定義した後に、ＴＲＩＰＯＳ力場を用いてジオメトリーを最適化するためエネルギー最小化のモデルをSybyl v6.8(TRIPOS Inc.)に取り込んだ。ヒスチジン（２．００Å）およびアスパルテート（２．００Å）（および水、２．０６Å）に結合したZn2+に対する結合距離はHarding (2001)Acta Cyst. D57, 401-411から採用し、Asn-Zn2+相互作用に対する結合距離（２．１５Å）はBrookhaven Protein Databank (pdb取得コード４ＫＰＢ、ＩＡＵＩおよび１ＴＣＯ)から得たカルシニューリン、5'-エンドヌクレオチダーゼ、およびインゲンマメパープル酸ホスファターゼの結晶構造に基づいて推定した。Ｚｎ‐Ｃｌ結合距離に対する値はCambridge structural database (Allen and Kennard (1993) Chem. Design Autom. News 8, 31-37)から引用した。力定数はＴＲＩＰＯＳ力場から採用した。配位数５のZn2+にとって、一定の均一な角度は期待できないので、亜鉛周辺の結合角は少しも制約されなかった。
最初のステップにおいて、亜鉛周辺のジオメトリーは亜鉛原子、４個の蛋白リガンド残基および塩素イオンのみのエネルギー最小化の２００ステップによって最適化された。不適切なジオメトリーと最初のステップにおける原子運動を介して導入されたファンデルワールス接触を除くために全蛋白にエネルギー最小化の１０ステップをさらに用いた。元の蛋白構造と修飾モデル間の二乗平均偏差（ｒｍｓｄ）値（構造差の表示である）はいずれの原子も０．１３Å、リガンド残基原子のみに対して１．２１Åである。
【００６４】
図３は水素の無い元の構造（黒色）と亜鉛結合部位を合わせるのに比較的わずかな移動のみが必要であったことを立証している本発明者らのモデル（灰色）との間のオーバーレイを示す。その部位はアキシャル位において２個のヒスチジンとねじれた三方晶系のビピラミダルジオメトリーを示す。塩素リガンドは蛋白の外側の方向を指す。異なる出発構造を用いた追加のモデリングの試みは同様のジオメトリー部位をもたらしたが、亜鉛の反対側に塩素イオンを有する部位をもたらした。
【００６５】
蛋白リガンドのみを含む四面体部位のモデルを構築する試みは、角度のねじれの適用にもかかわらず、５配位モデルに見られたねじれた三方晶系のビピラミッドに類似した、Cl-が存在していた空のエカトリアル結合部位を持つジオメトリーをもたらした。
モデリング理論を支持する実験証拠
【００６６】
本発明者らはサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) DXY1細胞でミュータントＨ６７Ａを発現し、イオン交換およびアフィニティクロマトグラフィーにより＞９５％に精製した。円偏光二色性はＨ６７Ａミュータントと野生型蛋白との間で二次構造に大きな変更のないことを明らかにした(図４)。５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．１中で２モル当量の111CdCl2を用いた１．５ｍＭ組み替えヒトアルブミン（ｒＨＡ）に関する111Cd-NMR研究によりそれぞれ２７ｐｐｍおよび１３１ｐｐｍ（Cd(ClO4)に比して）にピークを有する２ヶ所（ＡおよびＢ）での結合を確認した。同様の条件下でＨ６７Ａミュータントは２９ｐｐｍに１本のピークを生じた(図５)。２モル当量の111Cd2+の存在下ｒＨＡへの０．５および１モル当量のZnCl2の添加は１３１ｐｐｍのピーク強度を低下させた(図６ａ)。２モル当量の111CdCl2の存在下ｒＨＡへの２および３モル当量のCuCl2の添加は部位ＢでのCd2+結合に影響し、３７ｐｐｍに新しい111Cdピークの生成をもたらした（図６ｂ）。CuCl2１モル当量の添加はCd2+結合に影響しなかった。これはこの部位での結合飽和後にのみ生じるCd2+の置換によるＮ末端に対するCu2+の高い親和力によるのが最も本当らしい。これらの結果は部位ＢはCd2+に対するよりもZn2+に対しより高い親和力を有し、Cu2+もこの部位に競合的に結合することを示し、金属配位に対するＨｉｓ６７の関与をも示唆している。
【００６７】
図４は天然型およびＨ６７Ａに対する円偏光二色性バンドのサインと大きさが同様なことを示している。このことは天然アルブミンと同様の二次構造を有するＨ６７ＡｒＨＡを示している。
【００６８】
ペプチドと蛋白においてCu2+に配位する窒素リガンド数はこれら複合体のｄ‐ｄ吸収バンドの波長に影響することが知られている。CuCl2の一部を２００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４中ｒＨＡおよびＨ６７Ａミュータントの２ｍＭ溶液に加えた。CuCl2の最初の添加後５２５ｎｍに吸収バンドが出現し、Cu2+への４Ｎ配位の特徴であるCu2+による蛋白のＮ末端荷重を示す。しかしながら吸収の著しい違いはそれぞれの蛋白に１モル当量のCuCl2を更に加えた後に観察された。天然蛋白は６２５ｎｍに２番目の吸収バンドを生じ、ミュータントはより広いバンドを７５０ｎｍに生じた（図７）。これらのバンドはそれぞれ２Ｎおよび１ＮへのCu2+の配位を示唆する(Pettit et al., J. Chem. Soc. Dalton. Trans., 3565-3570(1990))。このことはCu2+イオンがなおこの部位に結合するか（Ｈｉｓ６７の関与なしに）あるいは蛋白の他の部位に結合するかどうかに関し情報を提供しないにもかかわらず、Ｈｉｓ６７残基がZn2+同様Cu2+結合にとって重要なことを示している。
ミュータントアルブミンにおける金属部位のさらなる分子モデリング
【００６９】
本発明者らはエネルギー最小化プロトコールを最適化し、異なる出発構造を探究することによりモデリングの方法論を改善することができた：それ故発明者らは様々なモデル間で意味のある比較を行うために野生型アルブミンについて提案された亜鉛（ＩＩ）部位の再モデリングを行った。以下に結果を要約する。
【００７０】
ａ）野生型アルブミン
新しいモデルの全体のジオメトリーは５番目のリガンドとして現在水を用いていることを別にすれば、以前のモデル（図３ａ）とは大きく異なっていない（全原子のｒｍｓｄ：０．０５Å；亜鉛部位のｒｍｓｄ：０．２５Å）。元の構造（ｐｄｂ登録１ＡＯ６；［図３］）とモデル間のｒｍｓｄは亜鉛部位の原子のみに対し０．６７Åで、このことは本質的にアルブミンにおける亜鉛部位は前もって配置されていることを示唆している。
【００７１】
ｂ）モデリング研究はＡｓｎ９９ＨｉｓミュータントおよびＡｓｎ９９Ａｓｐミュータントについても行われた
ミュータントモデルは図３ｃ、３ｄおよび３ｅに示されている。金属フリー形での提案部位を示す図１９は立体配座動態およびアロステリック相互作用において役割を果たす可能性のあるドメイン間水素結合に対する突然変異の影響を立証している。
【００７２】
要約すると、モデリング研究は野生型アルブミンに関して様々な親和力で金属例えば亜鉛を結合できる及び／または他の生理学的特性を発揮できるミュータント血清アルブミンを産生できるアイデアを支持する。
【００７３】
突然変異金属部位の検出
Ｚｎ（ＩＩ）イオンが大抵の分光技術にとって目に見えないので、蛋白における亜鉛結合の評価は難しい。この本来の問題を回避するための最も一般的なアプローチは比較的Ｚｎ（ＩＩ）に類似するＣｏ（ＩＩ）（ＵＶ／Ｖｉｓスペクトルスコピー）あるいはＣｄ（ＩＩ）（ＮＭＲスペクトルスコピー）のような他の金属を用いることである。別のアプローチは着色したＺｎ（ＩＩ）指示薬を使用する。発明者らは111CdＮＭＲスペクトロスコピーおよびＣｕ（ＩＩ）を用いた滴定により得られた新しいミュータントアルブミンに関する結果を以下に述べる。
【００７４】
ａ）ミュータントアルブミンの111CdＮＭＲ
111Cd（あるいは113Cd；両方の核が用いられる）ＮＭＲ実験は、もし金属荷重蛋白が同位元素に富んだＣｄ（ＩＩ）で作ることができるなら、蛋白における金属結合を検出する比較的直接的な方法である。本研究の結果は両ミュータントの金属結合性質の興味ある改変を明らかにしている。
【００７５】
ｉ）Ａｓｎ９９Ｈｉｓミュータント
図９と１０は同じ条件下で野生型およびＡｓｎ９９Ａｓｐミュータントアルブミンの1D111Cdスペクトルを比較している。
野生型ｒＨＡの場合のように、Ａｓｎ９９Ｈｉｓミュータントの1D111Cdスペクトルにおいて２当量の111Cd2+が容易に結合することを示唆する２本のピークが観察されることを図は明らかに示している。野生型およびミュータントｒＨＡのスペクトルにおいてピークの線幅は同等であることに注目される。ピークのケミカルシフトは８０ｍＭ塩素の存在下１２２ｐｐｍ（ピークＡ）と２８ｐｐｍ（ピークＢ）である。野生型ｒＨＡ（１３１ｐｐｍと２７ｐｐｍ）と比較すると、金属結合部位Ｂは突然変異により影響されないが、一方ミュータント部位ＡにおけるＣｄ（ＩＩ）イオンは野生型におけるよりもやや遮蔽されていることを意味する。
【００７６】
酸素の窒素ドナーによる置換が脱遮蔽をもたらすことが予測されるが、ミュータントにおけるＮ‐Ｃｄ結合が野生型におけるＯ‐Ｃｄ結合よりも短いと仮定するなら、観察された低いｐｐｍ値へのピークＡの移動は定性的に理解される。Ａｓｎは非常に弱いリガンドなのでこのことは合理的な仮定であり、発明者らは以前にＺｎ‐Ｎ（Ｈｉｓ）結合に対する１．９５−２．００Åに比べてＯ‐Ｚｎ結合は約２．１５Åと推定していた。同様の傾向がＣｄに対しても期待される。
【００７７】
発明者らはCd2rHAサンプルにZn2+を加えることによりCd2+とZn2+間の競合をも検出した。Zn2+の添加は明らかにピークＡに影響するが、３当量の添加後でさえも、111CdピークＡはなおスペクトルにみられる。対照的に、野生型ｒＨＡのスペクトルにおいて１モル当量のZn2+はピークＡを完全に消去するのに十分であり、Cd2+は完全に置換されたことを示唆する。この知見はハード酸、ソフト酸および塩基の原理を考慮することによりある程度解釈することができる。Cd2+はZn2+よりもよりソフトな金属イオンであり、窒素は酸素よりもよりソフトなリガンドである。結合部位をよりソフトにすることは野生型ｒＨＡにおけるよりもCd2+結合を好都合にするであろう。本質的に、実験はＡｓｎ９９が野生型ｒＨＡの亜鉛部位に寄与し、変異部位は実際にCd2+とZn2+に結合し得ることを示している。
【００７８】
ｉｉ）Ａｓｎ９９Ａｓｐミュータント
図１０に野生型ｒＨＡと比較したＡｓｎ９９ＡｓｐミュータントｒＨＡに関する111Cd2+結合研究の結果を要約する。
Cd2+部位Ｂの再度の占有は突然変異により影響されないことは明らかである（野生型のスペクトルにおける２７ｐｐｍに比べた２８ｐｐｍ）。部位Ｂは未だ同定されていないが、蛋白のこの特定部分の折りたたみに突然変異は影響しないと結論される。
驚くことに、111Cdスペクトル（図１０の説明を参照）に対する発明者らの通常の条件においてピークＡは検出されなかった。ケミカルシフトスケールの拡張は何らそれ以上のピークを示さなかった。十分な111Cdが利用できることを保証するために、２モル当量の111Cdを加えた。このサンプルのスペクトルにおいて、さらに２本のピークが示唆されるが、上昇温度（３１０Ｋ）においてのみ２本の新しい非常に幅の広い共鳴（ピークＢに対する約１５０−２００Ｈｚに比べ、ほぼ２０００Ｈｚの線幅を持つ）が確かに検出された。このことは化学的な交換現象がスペクトルに影響することを示唆している。過剰のＣｄ（ＩＩ）にもかかわらず、おそらくＴｒｉｓがCd2+に結合しそれを溶解させる事実によりＮＭＲチューブ中に沈殿は見られなかった。Ｃｄ／Ｔｒｉｓ複合体に対するケミカルシフトは１０６ｐｐｍ（２９５Ｋで）で、これは図１０のピークＣに対して観察された値でもある。３１０ＫのスペクトルにおけるピークA'は十分に１個の窒素を持つ111Cd部位の範囲および３個と５個の酸素ドナー間の６７ｐｐｍのシフトを有する(Coleman, J.A., Methods Enzymol. 227, 16-43 (1993); Oez, G.L., Pountney, D.L. & Armitage, I.M. Biochem. Cell Biol.-Biochim. Biol. Cell. 76, 223-234 (1998)。発明者らは利用可能な111Cdは変異結合部位A'とＴｒｉｓ（あるいは二者択一的に蛋白上の非特異的部位）間の中間の（２９５Ｋ）あるいは遅い交換（３１０Ｋ）にあると仮定を立てている。
【００７９】
ｂ）ＵＶ‐Ｖｉｓスペクトロスコピーによりモニターした銅（ＩＩ）の結合
野生型ｒＨＡへのCu2+の添加はｉｎ ｖｉｔｒｏのCu2+がこの亜鉛部位に結合できることをも示す111CdピークＡの消失をもたらすことを以前に示した（図６ｂも参照）。
発明者らはＵＶ‐Ｖｉｓスペクトロスコピーにより野生型およびミュータントアルブミンのアポ型でCu2+の滴定を行った、なぜなら定量的評価は直接的でないにもかかわらず、このような実験は金属結合について迅速な定性的情報を与えるからである。図１１に示す実験はＡｓｎ９９ミュータントへのCu2+結合は野生型への結合とは異なることを示している。それらはＨｉｓ６７ＡｌａミュータントｒＨＡとの比較から判るように第二の部位でCu2+と結合することは明らかである。両ミュータントの吸収プロフィールはお互いに異なり、変異リガンドの関与を意味する。
このように、突然変異は主たるZn2+部位であると知られている第二のCu2+部位に実際に影響を及ぼす。
【００８０】
５．ミュータントアルブミンの1H-NMR
発明者らは1D and 2D 1H-NMRスペクトルを得、図１４は検討したミュータントすべての1D 1Hスペクトルの芳香族化合物の領域を比較した。図１５は亜鉛の有無による野生型の2D TOCSYスペクトルの関連部分を含む。検討したすべてのミュータントに対し同様のスペクトルが得られた（データは示していない）。いずれのスペクトルも全体として比較的野生型のスペクトルに類似している。このことはいかなる突然変異も少なくともアポ型における蛋白の折りたたみに対して劇的な影響を及ぼしていないを示している。しかしながら解釈し得る微妙な変化がある。
【００８１】
特に、野生型ＮＭＲスペクトルのピーク１と３は考慮した突然変異（Ｈｉｓ６７Ａｌａ，Ａｓｎ９９ＡｓｐおよびＡｓｎ９９Ｈｉｓ）のどれによっても影響を受ける。それ故これらは残基Ｈｉｓ６７とＨｉｓ２４７に帰属することができるとの仮説が立てられる。
結論：野生型およびＨｉｓ６７Ａｌａ，Ａｓｎ９９Ａｓｐ，およびＡｓｎ９９ＨｉｓミュータントｒＨＡの1D and 2D 1H-NMRスペクトルの分析は残基Ｈｉｓ６７、Ａｓｎ９９、Ｈｉｓ２４７およびＡｓｐ２４９により形成される提案結合部位と矛盾しない。Ｈｉｓ６７Ａｌａの突然変異は野生型のスペクトルにおける２本の交差ピークに影響を及ぼし、変異残基は別のＨｉｓ（Ｈｉｓ２４７）の近くにあるとの考えと矛盾しない。Ａｓｎ９９の突然変異も同じ２本の野生型交差ピークに影響を及ぼし、上に述べた３残基が実際に互いに密接に接していることを示唆する。交差ピーク１とＡはＨｉｓ２４７に交差ピーク３とＢはＨｉｓ６７に帰属される。
【００８２】
６．1H-NMR：結合イベントに対する実態分析プローブとしてのヒスチジンHε1共鳴
Ｈｉｓ６７とＨｉｓ２４７に相当する２本のピークを帰属した後に、亜鉛結合に関しこれら残基に影響があるかどうかを調べることが重要である。
ａ）亜鉛結合
野生型アルブミンへの１モル当量のZn2+の添加は１Ｄおよび２Ｄスペクトルから判断されるようにＨｉｓ残基の動態に劇的な結果をもたらす。
幾つかのピークは大きく影響され、一方ピーク４，６，７，８および１１は未変化のままである。ピーク１と３はもはや観察されないが、ピーク５も消失し、ピーク２および９／１０は強度が低下する。
【００８３】
ピークがシフトするよりもむしろ消失する事実はZn2+結合の２つの影響による可能性がある。残基が亜鉛結合の際より硬くなる、それは線幅の広がりをもたらすであろう、あるいは亜鉛（およびこのようにそのリガンド）がフリーと結合状態の間で交換する、そしてこの化学的な交換現象も線幅の広がりをもたらす。いずれの場合においても、亜鉛結合は1H-NMRによりモニターでき、残基Ｈｉｓ６７とＨｉｓ２４７への影響、直接あるいは間接に他の未だ同定されていないヒスチジン残基に対する影響をも確認することができる。
Ａｓｎ９９ＡｓｐおよびＡｓｎ９９Ｈｉｓに対する亜鉛結合
１モル当量のＺｎ（ＩＩ）を含む１ｍＭＮＭＲの両サンプルは約３０分間（１Ｄスペクトルを取るのに要する時間）３１０Ｋに保った後沈殿を生じた。サンプルを磁石に導入する前に沈殿物は観察されなかった、そしてサンプルを終夜２７９Ｋに保った後、沈殿物は再び溶解した。観察された影響はＡｓｎ９９Ｈｉｓミュータントに対するよりもＡｓｎ９９Ａｓｐミュータントで大きかった。現在発明者らはおそらくドメイン間の相互作用に関連した立体配座動態に亜鉛が深く影響すると推測できるだけである。この考えは野生型で得られた観察とも矛盾しない。Ａｓｎ９９Ａｓｐミュータントサンプルも数時間３１０Ｋに保ったが、111Cdサンプルによる沈殿は観察されなかった。
【００８４】
ｂ）野生型ｒＨＡに対する脂肪酸結合の影響
アルブミンは血漿中他の不溶の長鎖脂肪酸の輸送に重要な役割を演じている。正常な条件下で、１−２の脂肪酸分子はアルブミンに結合するが、運動中，この数は４に上昇する(Peters, T., Jr. All About Albumin: Biochemistry, Genetics, and Medical Applications. Academic Press, New Your (1995))。アルブミンのＸ線構造は５(Curry, S., M,andelkow, H., Brick, P. & Franks, N. Nat. Struct. Biol. 5, 827-835(1998)と１０(Bhattacharya, A.A., Groene, T. & Curry, S. J. Mol. Biol. 303, 721-732(2000)の間の脂肪酸結合部位を示すが、ｉｎ ｖｉｖｏで観察された最大数は６である。アルブミンへの脂肪酸の結合は13C (Hamilton, J.A., Era, S., Bhamidipati, S.P. & Reed, R.G. Proc. Natl. Acd. Sci. U.S.A. 88, 2051-4 (1991)および1H-NMR(Oida, T. J. Biochem. (Japan) 100, 1533-42 (1986)を含む種々の技術を用いて過去に広く研究された。
多数のHis Hε1ピークは大体は脂肪酸結合により影響されることが直接図１７で見られる。このことは相互に作用する亜鉛と脂肪酸結合の影響をモニタリングする手がかりを与える。
【００８５】
７．相互に作用する金属／脂肪酸結合のプローブとしての111Cd-NMR
オクタノエート飽和ｒＨＡサンプルを用いた最初の111Cd-NMRスペクトロスコピー実験はそのようなサンプルのスペクトルにピークＡがないことを明らかにした。
２モル当量の111Cd2+を含む徹底的に透析したサンプル（発明者らはそのような透析サンプルあるいはＣｈｅｎ‐脱脂標品の1D 111Cd-NMRスペクトル間で認識し得る差のないことを確認もしていた）で始め、オクタン酸カリウムの当量を加えた。図Ｘは滴定研究の結果を示す。
【００８６】
最も著しい知見はピークＡは始めに減少するが、数時間後に再び出現することである。脂肪酸と金属イオンの再分配に導く遅い平衡によると思われる。ピーク強度の低下がサンプルの混合後直接観察できるように（少なくとも２あるいは３当量の追加に対し；その後の追加において動態は明らかにスローダウンする）、部位Ｆ２への脂肪酸の最初の結合は比較的早いことは明らかである。ピークＡが再出現するので、その後脂肪酸分子は熱力学的により好ましい結合部位へ移動すると推測できる。部位Ｆ２から脂肪酸の解離は金属結合部位の再形成をもたらすと期待され、利用可能なCd2+は再び結合できる。この方法は４当量まで繰り返すことができるので、部位Ｆ２よりも高い熱力学的安定性を有するすべての脂肪酸結合部位は明らかに飽和される。５当量のオクタノエートを含むサンプルの最終スペクトルにおいて、ピークＡはもはや存在しない。
本研究の重要な結果は脂肪酸の結合が金属結合を妨げるのみならず、金属と脂肪酸の結合は相互に作用する過程であり、脂肪酸陰イオンの結合は結局結合した金属イオンの解離を導くと思われる結論である。
【００８７】
８．細胞の発現
アルブミンは虚血および低酸素による肝傷害に対して肝組織を保護することが知られており、その効果はアルブミンの金属結合能に起因する(Strubelt, O., Younes, M., Li, Y. Pharmacology and Toxicology 75, 280-284(1994)。発明者らは肝細胞の培養に際し亜鉛、組み換えヒト血清アルブミンおよびミュータントアルブミンの効果を探究するためにｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を開発した。
【００８８】
ヒト肝細胞株ＷＲＬ‐６８を用いた。その細胞はDulbecco's最小培地で生育した。Ｈｉｓ６７ＡｌａミュータントアルブミンのｒＨＡの効果を研究するために、６００μＭのｒＨＡあるいはＨｉｓ６７Ａｌａミュータントを培地に加えた。Ｚｎ（ＩＩ）の効果は培地に６０，３００、ならびに６００μＭのZnCl2を加えることにより調べた。
これらの最初の実験は細胞数を数えることおよびトリパンブルーを用いて細胞の生存力を評価することにより行った。それらは細胞の生存力と接着に対する亜鉛濃度上昇の明瞭なネガティブな効果を示唆した、それは野生型アルブミンの添加によって救われたが、Ｈｉｓ６７Ａｌａミュータントは細胞毒であり細胞接着を阻害することも示唆した。
【００８９】
その後、アルブミン添加に先立ち細胞層を生成するために、野生型あるはミュータントアルブミン（６００μＭ）の有無下様々な用量（60, 300, and 600μM）のＺｎを追加したダルベッコ最小イーグル培養液で４８時間インキュベートする前にヒトＷＲＬ‐６８肝細胞を１８時間培養した。他に、生育条件（37C,5%CO2）は以前の実験と同じであった。発明者らは２つの新しいミュータント、Ａｓｎ９９ＡｓｐとＡｓｎ９９Ｈｉｓにも研究を拡張した。
【００９０】
図１８のグラフはヒト肝細胞の亜鉛と様々なミュータントアルブミンを組み合わせて用いた効果を要約している。肝細胞は１２穴プレートの層で生育し、細胞数と生存力は層と培養液の両方において測定した。いずれの実験も３回行い、誤差のバーは個々の実験間の標準偏差に相当する。
【００９１】
図１８ａ〜１８ｄに示した結果から以下の結論を引き出すことができる。
ａ）Zn2+濃度の上昇は細胞死と接着の喪失をもたらすことが確認された。
ｂ）野生型ｒＨＡは細胞により非常に良く許容される；対照における細胞数と野生型ｒＨＡを含む細胞数との間に生育あるいは接着の有意な差はない。
ｃ）Zn2+の有害な効果は６００μＭの野生型ｒＨＡによって逆転される。
ｄ）Zn2+の追加なしにＨｉｓ６７Ａｌａミュータントは細胞接着に対し劇的な効果があり、細胞の生存力は層あるいは培養液のいずれにおいても傷害されているようには見えないが、大多数の細胞の培養液中での浮遊をもたらす。
ｅ）驚くことにZn2+の追加は細胞接着に関しＨｉｓ６７Ａｌａのネガティブ効果を明らかに逆転させ，もし単独ならば同じ傷害効果を発揮することはない。
ｆ）Ａｓｎ９９Ａｓｐミュータントアルブミンの添加はZn2+の追加量とは無関係に、生育細胞の増加（約＋２０％）をもたらす。
ｇ）Ａｓｎ９９ＨｉｓミュータントｒＨＡの添加は最も劇的な接着の喪失を誘発する。Ｈｉｓ６７ＡｌａミュータントｒＨＡとは逆に、Zn2+の追加に有益な効果はない。細胞の生存力は影響されないようである。
要約すると、発明者らは亜鉛部位リガンドに対する突然変異は蛋白の物理化学的性質および生存細胞に対しても影響が及ぶことを示した。観察された様々な効果に対する理由は未だ立証されていないが、発明者らは理論に結びつけることを望むことなく、立体配座の動態、ドメイン／ドメイン相互作用、蛋白／蛋白相互作用ならびにおそらく蛋白／膜相互作用が本観察のほとんどの原因であると推測する。
【００９２】
これらの研究結果として金属部位の周辺の残基の突然変異によりZn2+のような金属イオンに対する親和力の低下したあるいは増強した新規なミュータントアルブミンを作ることが可能である。これらは金属に結合できない（あるいは弱くしか結合できない）および金属親和力の低下を生じている側鎖に金属を結合させることができる側鎖の突然変異を含む。
なお、下表は、哺乳類アルブミン間のアミノ酸配列の比較である。突然変異を起こしている残基を強調している。Ｎ末端アミノ酸（残基番号１）前の枠内のアミノ酸はプレアルブミン配列の一部で、翻訳後開裂されアルブミン自身を与える。配列のアクセッション番号はヒト、Ｐ０２７６８（配列番号２）；アカゲザル、Ｍ９０４６３（配列番号３）；イヌ、ＣＡＢ６４８６７（配列番号４）；ネコ、Ｐ４９０６４（配列番号５）；ウシ、Ｐ０２７６９（配列番号６）；ヒツジ、Ｐ１４６３９（配列番号７）；ブタ、ＡＢＰＧＳ（配列番号８）；ウサギ、Ｐ４９０６５（配列番号９）およびラット、Ｐ０２７７０（配列番号１０）である。
【００９３】
【表１（ａ）】
【表１（ｂ）】
【表１（ｃ）】
【表１（ｄ）】
【表１（ｅ）】
【表１（ｆ）】
【表１（ｇ）】
【表１（ｈ）】
【表１（ｉ）】
【表１（ｊ）】
【表１（ｋ）】
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ＰＤＢ １ＡＯ６で報告されているように、ここで明らかにされ、強調された金属結合部位を有するヒト血清アルブミンの三次元構造のモデルを示す模式図。
【図２】図２は提案した亜鉛結合部位内および周辺に位置するより詳細なアミノ酸側鎖を示す模式図。
【図３（ａ）】野生型アルブミンにおける亜鉛部位の最初のモデルをアポ‐ｒＨＡ（１ＡＯ６）と比較して示す模式図。
【図３（ｂ）】野生型ヒト血清アルブミンの亜鉛部位の再計算した、改良モデルをアポ‐ｒＨＡ（１ＡＯ６）と比較して示す模式図（亜鉛部位の力場エネルギー：５９．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ。）。
【図３（ｃ）】Ａｓｎ９９Ｈｉｓミュータントの金属部位モデルを野生型ＺｎｒＨＡ（緑色）と比較して示す模式図（亜鉛部位に対する力場エネルギーは野生型アポ：０．５４Å；野生型Ｚｎアルブミン：０．５６Åに対し８３．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ．ｒｍｓｄである。）。
【図３（ｄ）】Ａｓｎ９９Ａｓｐミュータントの金属部位モデルを示す模式図。
【図３（ｅ）】亜鉛フリー野生型およびミュータントアルブミンのモデルにおける可能な亜鉛部位でのドメイン間Ｈ結合を示す。ａ：野生型；ｂ：脂肪酸を負荷した野生型；ｃ：Ａｓｎ９９Ｈｉｓミュータントモデル；ｄ：Ａｓｎ９９Ａｓｐミュータントモデルを示す模式図。
【図４】野生型（実線）およびＨ６７Ａアルブミン（点線）の円偏光二色スペクトルを示すグラフ。
【図５】２モル当量の111CdCl2による野生ｒＨＡおよびＨ６７ＡｒＨＡの111Cd-NMRを示すチャート。
【図６】ａ）亜鉛およびｂ）銅の存在下２モル当量の111CdCl2によるｒＨＡの111Cd-NMRを示すチャート。
【図７】０．２当量ステップで（ボトムからトップ）０．２から２モル当量のCuCl2による（ａ）天然ｒＨＡおよび（ｂ）Ｈ６７ＡｒＨＡのＵＶ‐可視吸収スペクトルを示すグラフ。
【図８】亜鉛結合の無いａｓｎ９９ａｓｎミュータントにおける可能な亜鉛結合部位を示す模式図（右側のオーバーレイにおいて赤紫色で示したのが野生型構造である、変異部位の力場エネルギー（101.4ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は野生型（55.6ｋｃａｌ／ｍｏｌ）およびａｓｎ９９ｈｉｓ部位（75.6ｋｃａｌ／ｍｏｌ）のそれよりわずかに大きい。）。
【図９】２モル当量の111Cd2+（条件：１ｍＭ蛋白、５０ｍＭTris-Cl、５０ｍＭNaCl、２９５Ｋ）による組み換えアルブミン（野生型およびＡｓｎ９９Ｈｉｓミュータント）の１Ｄ111Cd-NMRスペクトルを示すチャート。
【図１０】２モル当量の111Cd2+（条件：１ｍＭ蛋白、５０ｍＭTris-Cl、５０ｍＭNaCl、もし他に述べなければ２９５Ｋ）による組み換えアルブミン（野生型およびＡｓｎ９９Ａｓｐミュータント）の１Ｄ111Cd-NMRスペクトルを示すチャート。
【図１１】銅（II）による１ｍＭｒＨＡの滴定を示すグラフ（ｐＨ7.4、0.2Ｍリン酸カリウム。CuCl2はそれぞれのケースで0.2当量部に加えられた。アルブミンの吸収に対し補正した差スペクトルを示す。）。
【図１２】野生型およびミュータントアルブミンのＵＶ‐Ｖｉｓ差スペクトルに対する様々な量のCu2+の影響の直接比較を示すグラフ。
【図１３】野生型ｒＨＡのdeconvoluted FT-ICR-MSスペクトル（8 mM NH4Ac、２５％メタノール、１％酢酸中２０μＭ。小分子付加体の検出を可能にする狭い線形（ｈａｌｆ‐ｈｅｉｇｈｔ幅約２５Ｄａ）に注目。）。
【図１４】組み替えアルブミンミュータントの高分解能1D 1H-NMRスペクトルの測定結果を示すチャート（順に、組み替えアルブミンミュータントの高分解能1D 1H-NMRスペクトルの測定結果、ＨｉｓＨδ２／Ｈε１交差ピークを示す野生型、Ｈｉｓ６７Ａｌａ，Ａｓｎ９９ＡｓｐおよびＡｓｎ９９ＡｓｐｒＨＡそれぞれの２ＤＴＯＣＳＹ ＮＭＲスペクトルの一部を示す。いずれのサンプルも50 mM Tris-Cl, 50 mM NaCl中１ｍＭで、いずれの実験も３１０Ｋで行われた。ｐＨ値は７．２８（Ｎ９９Ｈ）と７．４０（Ｈ６７Ａ）の間で変化し、個々のプロトンに対するケミカルシフトのわずかな違いを説明する。観察できるHε1プロトンは数字を付し、ケミカルスフトの標準として加えた蟻酸塩を表す）。
【図１５】ヒスチジンＨδ２／Ｈε１交差ピークを示す１モルの当量Zn2+を加えた（pH*= 7.3７）１Ｄおよび２ＤＴＯＣＳＹスペクトルの一部を示すグラフ。
【図１６】オクタノエートの量を変えた野生型ｒＨＡ（50 mM Tris-Cl, 50 mM NaCl, pH* = 7.26中１ｍＭ）の高分解能１ＤＮＭＲスペクトルの一部を示すチャート（右図はヒスチジンＨε１プロトンのケミカルシフトに対するオクタノエートの増量効果を示す）。
【図１７（ａ）】オクタノエートによるCd2rHAの滴定を示すチャート（条件：１ｍＭｒＨＡ、２モル当量111CdCl2, 50 mM Tris-Cl, 50 mM NaCl, 10% D2O, pH 7.1, 298 K, 10 mm BBOプローブ。１スペクトルの取得に一般に４時間を要する。
【図１７（ｂ）】オクタノエートによるCd2rHAの滴定を示すチャート（条件：１ｍＭｒＨＡ、２モル当量111CdCl2, 50 mM Tris-Cl, 50 mM NaCl, 10% D2O, pH 7.1, 298 K, 10 mm BBOプローブ。１スペクトルの取得に一般に４時間を要する。図１７ｂのグラフは４当量に対する時間経過を示す［各スペクトルの取得に４時間かかるので、各スペクトルの中間点（すなわち、実験開始後２時間）は平均タイムポイントとして取得される］。
【図１８（ａ）】天然およびミュータント血清アルブミンを用いた層中の細胞数を示すグラフ。
【図１８（ｂ）】天然およびミュータント血清アルブミンを用いた層中の死亡細胞の百分率を示すグラフ。
【図１８（ｃ）】天然およびミュータント血清アルブミンを用いた培地中の細胞数を示すグラフ。
【図１８（ｄ）】天然およびミュータント血清アルブミンを用いた培地中の死亡細胞の百分率を示すグラフ。
【図１９】Ｈ結合を介するドメインＩ‐ドメインＩＩ接触面に含まれると同定された突然変異体を示す模式図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミュータントの由来となった天然アルブミンに対して金属結合及び／または他の特性の改変を示す血清アルブミンの突然変異型並びに医学分野あるいは培養における細胞の発育におけるミュータントアルブミンの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトアルブミンは血漿中に最も豊富に存在する蛋白である。一般に、約７５０μＭの濃度で存在する。主として螺旋状のトリプルドメイン構造を有する５８５個のアミノ酸からなる１本のポリペプチド鎖である。ヒト血清アルブミンの遺伝子は想定される「キャッピング」部位からポリＡの最初の付加部位まで16,961個のヌクレオチドからなる。
【０００３】
アルブミンは血中の主な輸送蛋白で、脂肪酸、ホルモン及び薬物等の広範囲の小分子と可逆的に結合する。アルブミンはまた、多くの金属イオンの輸送と貯蔵にも関与している。現在、ヒトアルブミンは臨床的には、重度の火傷、ショックまたは失血状態にある患者の治療に用いられている。他の哺乳類のアルブミンはヒトアルブミンと構造などが非常に良く一致する。
【０００４】
亜鉛と銅はそれぞれ3.4×107M-1および1.5×1016M-1の結合定数でアルブミンと結合することが知られている（非特許文献１：Masuoka et al.(1993)J.Biol.Chem.268,21533-21537）。Ｃｕ2+はアルブミンのＮ末端アミノ酸のＡｓｐｌ−Ａｌａ２−Ｈｉｓ３に最も強く結合し、分子上に他の結合部位が知られているにもかかわらず４個のＮリガンドの正方形‐平面部位を供給する。
【０００５】
血漿中Ｚｎ2+の約７５％（約１４μＭ）がアルブミンに結合している。これは血清中のＺｎ2+の交換可能な画分の９８％ほどを占める（非特許文献２：Giroux et al.(1976)J.Bioinorg.Chem.5,211-218；非特許文献３：Foote and Delves(1984)Analyst 109,709-711）。アルブミンは内皮細胞による亜鉛の取り込みを調整することが以前から知られており、一方内皮を透過するレセプターを介する小胞共輸送がアルブミン−亜鉛複合体によりインビトロで証明されている（非特許文献４：Bobilya et al.(1993)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.202,159-166；非特許文献５：Tibaduiza et al.(1996)J.Cell Physiol.167,539-547）。アルブミンは循環における主な亜鉛輸送蛋白と信じられているにもかかわらず、アルブミン上のＺｎ2+の結合部位はこれまで明確に突きとめられていなかった。
【０００６】
亜鉛は体内の必須元素であり、３００以上の酵素中に存在する。亜鉛にはビタミンＡの輸送、創傷の治癒、男性での精子産生を含む多くの重要な役割があり、炭疽菌致死因子や細菌腸毒素により取り込まれる。それ故血中亜鉛濃度の調節は生理的に非常に重要である。血液からのＺｎ2+の取り込みは金属結合性を有する有機薬物、例えば、トリプシンのようなセリンプロテアーゼのベンズイミダゾール阻害剤の蛋白や酵素に対する親和力を高めるのに用い得ることが示唆されている（非特許文献６：Katz and Luong(1999)J.Mol.Biol.292,669-684；非特許文献７：Janc et al.(2000)Biochemistry 39,4792-4800；非特許文献８：Katz et al.(2001)Chem.&Biol.8,1107-1121；非特許文献９：Liang et al.(2002)J.Am.Chem.Soc.)。
【０００７】
ReedとBurrington（非特許文献１０：J.Biol.Chem.(1989),264,17, p9867-9872）はアルブミンの肝細胞への結合およびこのことがアルブミンに対する細胞の表面レセプターを必要とするか否かに関する。彼らの研究は肝細胞表面へのアルブミンの可逆的吸着を証明し、アルブミンと肝細胞表面との間の相互作用を促進させる立体配座の変化を伴うことを提唱した。しかしながら、どのような立体配座の変化が生じあるいはどのようにしてそれが調節されるかについての示唆はない。
Bosらは（非特許文献１１：J.Biol.Chem.(1989),264,2,p953-959）ヒスチジン残基を介するＣａ2+の結合によるヒト血清アルブミンの中性−塩基遷移の分子メカニズムに関する。彼らの論文はＮ−Ｂ遷移が薬物の体内動態に役割を果たしている可能性を明らかにしているが、ミュータント血清アルブミンの創造を示唆してはおらず、そのようなミュータントが有するであろう効果についても何ら示唆していない。
【０００８】
【非特許文献１】Masuoka et al., J.Biol.Chem. 268, 21533-21537(1993)
【非特許文献２】Giroux et al., J.Bioinorg.Chem., 5, 211-218(1976)
【非特許文献３】Foote and Delves, Analyst 109, 709-711(1984)
【非特許文献４】Bobilya et al., Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 202, 159-166(1993)
【非特許文献５】Tibaduiza et al., J.Cell Physiol., 167, 539-547(1996)
【非特許文献６】Katz and Luong,J.Mol.Biol., 292, 669-684(1999)
【非特許文献７】Janc et al., Biochemistry, 39, 4792-4800(2000)
【非特許文献８】Katz et al., Chem.& Biol., 8, 1107-1121(2001)
【非特許文献９】Liang et al., J.Am.Chem.Soc.(2002)
【非特許文献１０】J.Biol.Chem., 264, 17, p9867-9872(1989)
【非特許文献１１】J.Biol.Chem., 264, 2, p953-959(1989)
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は４個のアミノ酸（Ｈｉｓ６７，Ａｓｎ９９，Ｈｉｓ２４７，Ａｓｐ２４９）のクラスターが亜鉛、銅及び／またはカドミウムの結合部位（図１および２を参照）に含まれるドメインＩとＩＩの間の界面に位置するという当初の発見に基づいている。これら４残基はすべて、現在までに配列決定された哺乳類アルブミンのいずれにおいても良く保存されている（表１を参照）。ここで言及したナンバリングは、プレプロ−アルブミン配列が翻訳に続き開裂された後のヒト血清アルブミンのアミノ酸配列の特定の位置に見られるアミノ酸に関するものである（表１を参照）。この部位の同定は利用できる亜鉛及び／または他の金属イオンの血中濃度を調節するための治療用アルブミンの設計および標的組織へのそれらのデリバリーの原理を提供する。本発明はミュータントアルブミンが有する細胞接着に対する効果の観察結果にも基づいている。
【００１０】
このように、第一に、ミュータントの由来となった天然アルブミンに対してミュータントが金属結合親和力及び／または他の生理学的特性の改変を示すように突然変異を生じた単離されたミュータント血清アルブミンが提供される。
金属結合及び／または他の生理学的特性の改変をもたらす天然アルブミン配列へのいかなる突然変異も、以下に定義するように本発明に包含されると認識される。特定のミュータントを産生させ、ここで述べられた実験に基づいてこのようなミュータントが金属結合及び／または他の生理学的特性の改変を示すか否かを試験することは専門家にとっては比較的簡単な課題である。
突然変異され得る好ましい残基は、表１で明らかなように残基Ｘ1〜Ｘ11及び／または特定の血清アルブミンに対し測定された結晶構造から決定され得る残基のいずれかと水素結合できる残基として同定される。
【００１１】
第二に実質的に以下のアミノ酸配列（配列番号１）からなる単離されたミュータントヒト血清アルブミンが提供される：
DahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqX5lqqcpfedhvkLvnevtefaktcvadesaencdkslX1tlfgdklctvatlretygemadccakqeperx2X8cfX6qhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrX9pyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvX10TEccX3X7X4llecaddradlakyicenqdsissklkeccekplleksX11ciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpdysvvlllrlaktyettlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasqaalgl
（上記配列中、X1はＨ以外；X2はＮ以外、X3はＨ以外、X4はＤ以外；X5はＹ以外；X6はＬ以外；X7はＧ以外、X8はＥ以外、X9はＨ以外、X10はＨ以外およびX11はＨ以外であり、前記ミュータントは天然ヒト血清アルブミンに関して金属結合親和力の改変を示す）。
【００１２】
本明細書及び特許請求の範囲を通して慣用のアミノ酸の１文字表記を用いている。アミノ酸置換は他の天然アミノ酸，特にＤＮＡにより直接コードされる２０個のアミノ酸あるいは例えば専門家に知られている合成アミノ酸あるいは珍しいアミノ酸に対する。上記の配列はＧｅｎｂａｎｋデータベースに見られるヒト血清アルブミンの配列に基づいている。ヒト血清アルブミンはＸ1がＨ、Ｘ2がＮ，Ｘ3がＨ，Ｘ4がＤ、Ｘ5がＹ、Ｘ6がＬ、Ｘ7がＧ、Ｘ8がＥ、Ｘ9がＨ、Ｘ10がＨおよびＸ11がＨである上記配列からなる。このように、本発明に従ってミュータント血清アルブミンは上述の位置に見られる特定の種の”アルブミン”の天然アミノ酸に関して、典型的には、残基X1〜X11に対する少なくとも１ヶ所の突然変異からなる。それにもかかわらず、種の個体間で自然変動が存在するので配列に小さな変動が生じ得る。X1〜X7において明らかにされた変動以外のそのような小さな配列変動は本発明からはずれていないと理解される。配列中のこのような変動は置換、反転，欠失あるいは転移として現れる。しかしながら、このような変異体のアルブミン配列は図１で示されたいずれの配列ともかなり類似している。一般に変異体アルブミンの配列は同定された配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％あるいは９９％の同一性（Ｘ位置を除く。）を示す。
【００１３】
アミノ酸配列間の相同性（すなわち、同一性）は市販のアルゴリズムを用いて決定することができる。プログラムＢＬＡＳＴ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ，ＢＬＡＳＴＮ，ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２配列（National Center for Biotechnology Informationにより提供された）はこの目的のために当該技術分野において広く用いられ、２つのアミノ酸配列の相同領域を整列させることができる。これらは構造の知られた蛋白とモデルとされた他の標的蛋白のアミノ酸間の相同性の程度を決定するためにデフォルトパラメータが使用される。
ミュータント血清アルブミンは生物体のプロテオームにおいて結合し得る他の蛋白を含まないあるいは実質的に含まないあるいは一部含む意味で単離され、それ故細胞あるいは生物体のプロテオーム内のいかなる天然アルブミンをも包含しない。
【００１４】
上記配列はリーダー配列（すなわち、MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR (Met-Lys-Trp-Val-Thr-Phe-Ile-Ser-Leu-Leu-Phe-Leu-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Ser-Arg-Gly-Val-Phe-Arg-Arg)(配列番号１３)）が配列から開裂された後の血清アルブミンのヒト型に基づいている。本発明はこのようなリーダー配列を含むミュータント配列にも及ぶ。
上記のことはヒト血清アルブミンのミュータントに関連する一方、本発明はミュータントヒト血清アルブミンにのみ限定されない。すべての種に渡って血清アルブミンはかなり保存されており、他の種のアルブミンから上記配列中Ｘｓで表された位置のアミノ酸を同定することおよび金属結合及び／または他の生理学的特性を改変するために上述のアミノ酸を変えることは十分に専門家の専門技術内である。表１は実際哺乳類の血清アルブミンポリペプチド配列の並びを示しており、本発明に従って突然変異を生じ得る残基が強調されている。ミュータント血清アルブミンを産生するために少なくとも前記残基の１つは同定された天然残基以外であるべきで、それは天然血清アルブミンに関して金属結合及び／または他の生理学的特性の改変を示す。
【００１５】
多くの血清アルブミンの配列は知られており、例えば、National Center for Biotechnology Infomation:www.ncbi.nlm.gov.のＧｅｎｂａｎｋデータベースから容易に入手できる。例えばヒトの配列はアクセッション番号Ｐ０２７６８で見ることができる。他の配列（１文字符号）もwww.albumin.org.で見ることができる。
本発明のミュータントは特定の種の天然血清アルブミンの一般的な全体のフォールディングに関して大体は類似している。例えば、ミュータント血清アルブミンの円偏光二色バンドの符号と大きさが天然の血清アルブミンと類似しているかどうかを調べるために円偏光二色性の研究が行われる。もし類似しているなら、ミュータント血清アルブミンは天然の血清アルブミンに類似した二次構造を示す。
【００１６】
本発明のミュータントはミュータントの由来となった天然アルブミンに関して金属結合親和力の改変あるいは他の改変された特性、例えば培養における細胞接着及び／または発育の改変を示す。金属結合親和力の改変は金属結合親和力（例えばＫｄ）における低下あるいは増強及び／または金属の結合／解離の比率の増大あるいは低下を意味する。トグＫｄ値に置き換えてＫｄ値を求める時１０あるいは１００の係数のような好ましくは２，４、あるいは６の係数による増加あるいは減少が生理的条件（すなわち、約ｐＨ７．３）、適切な濃度、約２０℃〜３７℃の温度で測定される。そのようなミュータントアルブミンに対し結合親和力の改変を示す金属は亜鉛、銅、ニッケルおよびコバルトがある。好ましくはミュータントアルブミンは亜鉛に対して結合親和力の改変を示す。一般に、金属結合親和力の改変はＺｎ2+，Ｃｕ2+などのような金属イオンに関する。適切な金属結合側鎖を持たない残基への金属結合に必要と考えられる残基の突然変異は金属結合親和力の低下をもたらすと考えられる。逆に金属への結合に必要と考えられる残基および結合を手助けし促進する残基の近傍に存在するが、金属／金属イオン結合に関連しない残基の突然変異は金属結合親和力を高めると期待される。
【００１７】
例えば以下の突然変異体は金属結合親和力の低下をもたらすと仮定される：
X1 ＝＞ A, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X2 ＝＞ A, F, G, I, K, L, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X3 ＝＞ A, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X4 ＝＞ A, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
また、金属親和力の上昇と調節を生じさせる金属結合リガンドを導入する側鎖の突然変異は以下の変異体を含む：
X5 ＝＞ C, D, E, H (これはブタアルブミンでは既にＨｉｓ残基)
X6 ＝＞ C, D, E, H
X7 ＝＞ C, D, E, H
X2 ＝＞ C, D, E, H
X4 ＝＞ C, E, H
X1 ＝＞ C, D, E
X3 ＝＞ C, D, E
【００１８】
提案部位の金属結合は脂肪酸結合により影響を受けることを本発明者らは見出した（A.J.Stewart,C.A.Blindauer,S.Berezenko,D.Sleep,P.J.Sadler,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100,3701-3706(2003)）。脂肪酸フリーのアルブミンと５モルのミリステート（ｐｄｂ １ｂｊ５）と結合したアルブミンのＸ線構造の比較から、いわゆる結合部位２に脂肪酸のアニオンを提供するためにドメインＩおよびＩＩベンドを結びつける長いヘリックスとリガンド配位していないｒＨＡにおける２カ所のハーフサイトは１０Å以上移動し連続した空洞を形成することが明らかである（Curry,S.,Mandelkow,H.,Brick,P.&Franks,N., Nat.Struct.Biol.5,827-835 (1998)）。この脂肪酸結合は提案亜鉛部位（図Ｘ３ｅ（ａ＆ｂ）を参照）における他の２残基、Ｈ６７とＮ９９から４〜６Å離れることにより残基Ｈ２４７とＤ２４９の移動をもたらす。Ｄ２４９はまたＨ６７のN'に対するＨ結合を維持するために側鎖の立体配座を変化させ、さらにＮ９９に対するＨ結合を形成する。アンリガンド構造においてＮ９９にＨ結合しているＨ２４７は脂肪酸結合構造においてＥ１００とＨ結合を形成する。ヒトアルブミンにおける脂肪酸結合による亜鉛部位の提案されたスイッチングは有機栄養素と必須金属イオンとの間のアロステリック相互作用の興味深い例である。Ｈ２４７−Ｅ１００のＨ−結合は"switched"型を安定化させると期待されるので、Ｅ１００の以下の突然変異体は相互作用する金属／脂肪酸結合に影響すると予測される。
X8 ＝＞ C, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
【００１９】
さらに、より最近の研究はＨ６７Ａ、Ｎ９９ＤおよびＮ９９Ｈの突然変異を有するアルブミンは、細胞培養培地で用いた時、野生型と劇的に異なる性質を示すことを明らかにした。細胞接着はＨ６７ＡおよびＮ９９Ｈミュータントの両方において傷害される。アルブミンから例えば脂肪酸の肝による取り込みは細胞表面へのアルブミンの非特異的結合とアルブミン分子の立体配座変化の誘導を必要とすることが知られている(R.G.Reed,C.M.Burrington,J.Biol.Chem.264,9867-9872, 1989)。突然変異残基はいずれもＨ結合を介したドメインＩ−ドメインＩＩ接触を安定化させるのに必要である。ドメインＩ／ＩＩ界面における一ヶ所の突然変異は細胞に対する突然変異アルブミンの作用に大きな影響を与えるという知見はドメイン間のＨ結合に必要とされるドメインＩ／ＩＩヒスチジン残基に関する以下の突然変異は細胞接着及び／または細胞発育に同様の影響を与える。
X9 ＝＞ A, D, E, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X10 ＝＞ A, D, E, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X11 ＝＞ A, D, E, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
なお、本明細書において標準的なアミノ酸の１文字表記が使用されている点に留意されたい。
【００２０】
アルブミンに対するＺｎ2+の性質は113Ｃｄ−ＮＭＲによる研究によって示された。哺乳類の幾つかのアルブミンはＣｄ2+に対しＮ／Ｏ配位に特有のケミカルシフトを有する２個の強力な結合部位を有する（Sadler & Viles, Inorg.Chem., 35, 4490-4496 (1996)）。ヒトアルブミンでの２４ｐｐｍと１１４ｐｐｍの113Ｃｄシフト（Ｃｄ（ＣｌＯ4）に比して）はそれぞれ１個のイミダゾール窒素および２〜３個のイミダゾール窒素を含む部位を暗示している。Ｚｎ2+，Ｃｕ2+およびＮｉ2+イオンはヒトアルブミンにおいてこれらの部位のＣｄ2+を置換し得る。アルブミンの結晶構造に基づいた本発明者による分子モデリング（ＰＤＢ １ＡＯ６）は、多数の金属結合部位がＨｉｓ６７、Ａｓｎ９９、Ｈｉｓ２４７およびＡｓｐ２４９のクラスターを含むことを示唆した。本発明者らはＨｉｓ６７のアラニンへの部位特異的(site directed)突然変異誘発とそれに続く111Ｃｄ−ＮＭＲを用いる同位元素に富んだカドミウムによる金属競合研究によりこの部位の位置を立証した。月並みにこのことはアラニンに突然変異した位置６７のヒスチジンをＨ６７Ａとして表される。このような表記は本願の他の部分でも用いる。
【００２１】
他の残基、例えば、チロシン３０（X5）およびグリシン２４８（X7）の突然変異は亜鉛結合に影響すると考えられる。チロシン３０はそれ自身金属に結合しないが、金属に結合している残基９９に水素結合する。このように、残基３０の突然変異は金属結合部位に影響する。Ｇｌｙ２４８のバックボーンのカルボニルは残基９９に水素結合する、それ故この残基の突然変異は金属結合部位に影響を与える。
【００２２】
本発明の突然変異アルブミンは新たに合成されるが、好ましくは当該技術分野の専門家に良く知られている遺伝子組み換え法により産生される。例えば突然変異アルブミンは関連した遺伝子配列に対する部位特異的(site directed)突然変異誘発およびその後の蛋白発現により天然アルブミンから導かれる。このような技術は良く知られており、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYに述べられている。
本発明はそれ故本発明に従ってミュータント血清アルブミンをコードする核酸配列にも拡張される
【００２３】
宿主生物体でのミュータントアルブミンの遺伝子組み換えによる産生のために、ミュータントアルブミン蛋白をコードするヌクレオチド配列を選択宿主に対し設計されたＤＮＡ構築物を作成するために発現カセットに挿入し、宿主に導入する。選択宿主にとって適切なプロモーター、シグナル配列、５’および３’非翻訳配列、エンハンサーおよびターミネーターのような特異的な制御配列の選択は当該技術分野におけるルーチンワーカーの技術レベル内である。適切なリーディングフレームにリンクした個々の要素を含む結果として得られた分子は、リン酸カルシウム沈降法、エレクトロポレーション法、バイオリスティック導入法、ウイルス導入法などのような当該技術分野の専門家に良く知られている技術を用いて選択した細胞に導入することができる。トランスフェクション（Schenborn ET, Goiffon V. Methods Mol Bio. 2000; 130: 135-45, Schenborn ET, Oler J. Methods Mol Biol. 2000; 130: 155-64），エレクトロポレーション（Heiser WC. Methods Mol Biol. 2000; 130: 117-34）あるいは組み替えウイルス（Walther W. Stein U; Drugs 2000 Aug; 60 (2): 249-71）による適切な発現カセット、ベクターおよび蛋白の組み換え法は大腸菌（Studier and Moffatt, J. Mol. Biol. 189: 113 (1986); Brosius, DNA 8: 759 (1989))を参照）、酵母（Schneider and Guarente, Meth. Enzymol 194: 373 (1991)を参照）および昆虫の細胞（Luckow and Summers, Bio/Technol. 6: 47 (1988)を参照）のような宿主微生物および哺乳類の細胞（組織培養あるいは遺伝子療法）にとって良く知られている。
【００２４】
微生物、特に酵母においてアルブミンを発現し、培養培地からそれを精製する技術は米国特許第5637504号、米国特許第6034221号及びWO00/44772に開示されており、いずれも言及により本願に組み込まれる。
それ故、発明はさらにここで述べたミュータントアルブミンをコードするここで述べたヌクレオチド配列に機能的にリンクしたプロモーターからなる発現カセットを提供する。本発明に従って突然変異を生じ得る血清アルブミンをコードするヌクレオチド配列もＧｅｎｂａｎｋデータベースから容易に入手できる。
【００２５】
更に、発明はここで述べたミュータントアルブミンと医薬上許容される担体を含む医薬品組成を提供する。
医薬上許容される担体は当該技術分野の専門家に良く知られており、０．１Ｍおよび好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液または０．８％の食塩水が挙げられる（但し、これらに限定されない。）。さらに、このような医薬上許容される担体は、水性または非水性の溶液、懸濁液および乳濁液のいずれでもよい。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルが挙げられる。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、食塩水や緩衝剤媒体を含む乳濁液あるいは懸濁液が挙げられる。非経口投与賦形剤としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲル液のブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸添加リンゲル液あるいは不揮発性油が挙げられる。静脈内投与賦形剤としては、液体および栄養補給剤、リンゲル液のブドウ糖などに基づくものなど、電解質補給剤が挙げられる。防腐剤や他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどを含有させてもよい。
【００２６】
本発明のミュータントアルブミンは、通常の方法により医薬品組成とするために医薬上許容される担体（例えば、結合剤、調整剤、矯味剤、崩壊剤、乳剤、賦形剤）、希釈剤あるいは安定剤と混合して医薬品製剤として供給され、それは例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤、シロップ剤、懸濁液、溶液、注射剤、注入剤、デポ剤、坐剤に製剤化され、例えば経口あるいは非経口投与される。
【００２７】
経口投与に錠剤を用いる場合、一般に用いられる担体としては、ショ糖、乳糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、コーンスターチ、ステアリン酸マグネシウムのような典型的な潤滑剤、パラベン、ソルビンのような防腐剤、アスコルビン酸、α−トコフェロール、システインのような抗酸化剤、崩壊剤あるいは結合剤が挙げられる。カプセル剤として経口投与する時には、有効な希釈剤としては、乳糖や乾燥コーンスターチが挙げられる。経口投与の液体としては、シロップ、懸濁液、溶液および乳濁液が挙げられ、それらはこの分野で用いられる水などの典型的な不活性希釈液を含有してもよい。さらに、甘味剤あるいは香料を含有させてもよい。
【００２８】
皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射あるいは点滴のような非経口投与の場合には、活性成分の溶液のｐＨは適切に調整され、緩衝剤で処理されあるいは滅菌される。使用できる賦形剤あるいは溶剤の例としては、蒸留水、リンゲル水および等張の塩水が挙げられる。静脈内投与には、溶質の総濃度は溶液を等張とするように調整される。
坐剤は本発明化合物を正常温度で個体であるが腸内温度で液体となり直腸で融解し活性成分を放出するココアバターおよびポリエチレングリコールのような適切な非刺激性の賦形剤と混合することにより作成できる。
【００２９】
投与量は年齢、体重、投与時間、投与法、薬剤の組み合わせ、治療を行っている患者の健康状態のレベルおよび他の因子によって決定される。１日の投与量は患者の健康状態および体重、活性成分の種類および投与経路に依存して変わるが、経口投与の場合、１日投与量は約０．１〜１００ｍｇ／人／日、好ましくは０．５〜３０ｍｇ／人／日である。非経口投与の場合には、１日投与量は皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射および直腸内投与に対し望ましくは０．１〜５０ｍｇ／人／日、好ましくは０．１〜３０ｍｇ／人／日である。
【００３０】
本発明のミュータントアルブミンは、例えば、欠損疾患および感染症の治療、金属過負荷の治療及び／または金属濃度の調節が別の金属イオンあるいは薬物あるいは天然分子のような有機分子の生理機能に結びついている病気に対するヒトあるいは動物の医薬品として使用される。
本発明のミュータントアルブミンを用いて血中亜鉛のような金属の量を調節したり亜鉛吸収に問題のある患者の治療を促進することも可能である。さらに、特に強力な金属結合力を示すミュータントアルブミンは環境中の金属を検出するバイオセンサーに用いられる。
【００３１】
アルブミンに結合した亜鉛は塩素イオンに結合し得るZn2+の形であるというさらなる観察からは、亜鉛を結合したアルブミンが塩素センサーとして用いることができ、亜鉛への接触は血中塩素濃度によって制御され得る（このことは触媒作用をも調節する）という可能性が導かれる。
本発明者らは、本発明によるミュータントアルブミンは培養中細胞の発育に影響を及ぼすことも観察した。ミュータントは基質に結合したおよび培地中に見られる細胞の分布に影響を及ぼす。幾つかのミュータント、例えば、Ａｓｎ９９Ａｓｐは細胞発育を全体として促進させることも観察された。それ故、本発明は、本発明に従って培養における細胞の発育特性を変えるミュータント血清アルブミンの方法あるいは使用にも関連する。発育特性の改変は接着、生存力百分率及び／または細胞発育における変化例えば力価、基質が接着した細胞および培地中に分散した細胞間の細胞分布の変化あるいは接着したあるいは培地中の死細胞あるいは生存細胞間の違いを含む。
【００３２】
アルブミンは一般に細胞培養培地、特に哺乳類の細胞培養および特に血清を含まない培地に含まれる。発明の修飾アルブミンが加えられる培養液は銅、亜鉛及び／またはカドミウムを含むかあるいは含まない。適切な例はイーグル（Ｅａｇｌｅ）培地、ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改変イーグル培地（ダルベッコ最小培地）、ハム（Ｈａｍ）Ｆ１０およびＦ１２培地、イスコーブ（Ｉｓｃｏｖｅ）改変ダルベッコ培地およびＲＰＭＩ培地を含む。普通にアルブミンを含むこのような培地の場合には、発明の修飾アルブミンは天然アルブミン（ヒトあるいはウシ）と一部あるいは完全に置き換えられるかあるいはアルブミンの通常量より過剰に加えられる。通常アルブミンを含まないような培地の場合には、発明の修飾アルブミンが加えられる。
【００３３】
培地が用いられる細胞には動物細胞、特に鳥類（ニワトリのような）あるいはヒトのような哺乳類の細胞、他の霊長類（サルのような）あるいはげっ歯類（ハムスター、ラットあるいはマウスのような）の細胞がある。細胞型は例えば腎臓、卵巣あるいは肝臓のいずれかの組織由来で、内皮、上皮、皮膚、神経、リンパ球、幹細胞などである。ハイブリドーマのような人工細胞もある。適切な細胞の例には腫瘍形成性あるいは非腫瘍形成性ヒト肝細胞、Ｂリンパ球、ハイブリドーマ、胎仔ハムスター腎臓細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞およびヒト胎児腎臓細胞がある。細胞は容器壁、多孔性のマトリックスあるいはビーズのような表面で培養されるかあるいは培地中に自由に懸濁される。
【００３４】
培養細胞は特定の細胞により自然に産生される物質を産生するのに用いられるかあるいは治療用蛋白のような他の産物を発現させるために遺伝子工学により作成される。例はモノクローナル抗体およびそのアナログ（１本鎖可変領域フラグメントおよびヒト化ＩｇＧκ軽鎖のような）、血液凝固因子（第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＸＩ因子および第ＸＩＩＩ因子のような）、抗トロンビンＩＩＩ、サイトカイン（インターロイキン、例えばインターロイキン‐２のような、およびインターフェロン‐αあるいはインターフェロン‐γのようなインターフェロン）、成長因子（インスリン様成長因子のような）、トロンボモジュリン、グルタミン合成酵素、プロウロキナーゼおよびプラスミノーゲンを含む。
【００３５】
発明の修飾アルブミンは付着、発育及び／または発現および分泌の増強のような細胞に対する望ましい作用をもたらすために脊椎動物および無脊椎動物由来の培養細胞および組織と同様に、原核生物および酵母に対し作成された組織培養培地に含まれる。
【００３６】
選択された培養培地における発明の修飾アルブミンの適切な濃度決定は当該技術分野において通常の技術内である。一つの具体例では、修飾アルブミンは約５０μＭから約３０ｍＭの濃度で細胞培養システムに加えられる。さらなる具体例では、ペプチドは約２５０μＭから約２０ｍＭの濃度で細胞培養システムに加えられる。さらに、多様に修飾されたアルブミンは相乗作用を生じさせるために（もしこれらが細胞に対し同じ作用を有するなら）あるいは多様な作用を生じさせるために（もしそれぞれの修飾アルブミンが同じ細胞に異なる作用を有するなら）培養培地の表面に加えられる。
【００３７】
細胞接着を促進させる発明の修飾アルブミンは組織培養基質をコーティングするための溶液あるいは固定型細胞の発育のための他の表面を作成するために水のような担体に溶解される。例えば、発明の上記修飾アルブミンを１個以上含む溶液は表面上に分布し逆空気流フードで乾燥され、その結果乾燥フィルムの形で表面に存在する上記修飾アルブミンを生じる。
【００３８】
発明の上記修飾アルブミンの表面への吸着様式は非共有結合性の相互作用、非特異的吸着および共有結合を含む。発明の一つの具体例では、アルブミンは表面に直接吸着される。さらなる具体例では、ペプチドはキイホールリンペットヘモシアニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ポリリジン、細胞表面レセプター認識配列を持つペプチド、免疫グロブリン、ポリサッカライドあるいは成長因子に限定されないが、少なくともこのうちの１つで既に被覆された表面に吸着される。別の具体例では、アルブミンと上記蛋白の１つは、表面にフリーあるいは抱合体として同時に用いられる。
【００３９】
本発明の成長促進修飾アルブミンは二次元あるいは三次元表面を含む表面において様々な固定依存性細胞の接着及び／または発育を促進するのに適している。例えば、その表面は細胞を３‐Ｄ配列に付着させるバイオリアクターの表面である。現在存在するよりも効率の良いバイオリアクターは発明ペプチドで修飾した３‐Ｄ表面に細胞を付着させることによって設計することができる。
【００４０】
本発明の実施に際して用いられる表面のタイプに関して、適切な表面はこれに限定されないが、セラミック、金属あるいはポリマーの表面が含まれる。最も望ましくは、本発明はポリマーの表面およびセラミック、例えばガラス表面の処置に用いられる。本発明で用いられる適切な表面は、これに限定されないが、プラスチック皿、プラスチックフラスコ、プラスチックの微量滴定プレート、プラスチックチューブ、縫糸、膜、フィルム、バイオリアクターおよび微粒子を含む。ポリマー表面は、これに限定されないが、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（テトラフルオロエチレン）、フッ素化エチレン、ポリ（ジメチルシロキサン）およびその他のシリコンゴムを含む。ガラス表面はグリセロールポリシラン結合ガラスを含む。
本発明に従ってミュータント血清アルブミンからなる細胞培養培地も提供される。
【００４１】
本発明は実施例の方法によりおよび添付図面を参照することによりさらに説明される。
材料と方法
ａ）分子モデリング
ｕｎｌｉｇａｎｄｅｄ（アポ）アルブミン（ＰＤＢ取得コード１ＡＯ６）の２．５Åでの報告された結晶構造をモデルの出発点として終止用いた。モデルはＳｙｂｙｌ（ＴＲＩＰＯＳ Ｉｎｃ．，Ｖｅｒｓｉｏｎ６．８）で構築し、ジオメトリーを最適化するためにエネルギー最小化を行った。以前の実行ではプログラムはジスルフィド結合の存在を無視したことにより、水素原子の追加とジスルフィド結合の開裂をもたらした。亜鉛部位それ自身に対してではないが蛋白の全体構造にわずかに影響を及ぼすこの問題は、現在最終モデリングの実行において修正されている。最小化において、亜鉛に対する特定の力場パラメーターを満たした後に、ＴＲＩＰＯＳ力場を用いた。ヒスチジン（２．００Å）、アスパルテートあるいはグルタメート（２．００Å）および水（２．０６Å）に結合したZn2+の結合距離はHarding, M.M. Acta Cyst. D57, 401-411 (2001), http://tanna.bch.ed.ac.uk.から採用した。これらの値は金属蛋白のデータベースを用いたｐｄｂの分析結果とも一致する(Castagnetto, J.M., Hennessy, S.W., Roberts, V.A., Getzoff, E.D., Tainer, J.A., Pique, M.E., Nucleic Acids Res., 30, 379-382 (2002)。力定数はＴＲＩＰＯＳ力場から採用した。亜鉛周囲の結合角は不自然でなかった。最初のステップでは、Zn2+周囲のジオメトリーはZn2+イオン、４個の蛋白リガンド残基および水分子のみを考慮した１００ステップのエネルギー最小化により最適化された。最初のステップにおける不適切なジオメトリーおよび原子運動を通して導入されたファンデルワールスの接触を除くために、さらに５０ステップのエネルギー最小化が残基６５−６９、９７−１０１および２４７−２５１およびZn2+イオンおよび水分子に適用された。最後に、同じ理由で３０以上のステップが全蛋白に適用された。図のオーバーレイはｒｍｓｄ値も与える"Fit monomers"ルーチンを用いてＳｙｂｌで作成された。亜鉛フリーのミュータントアルブミンのモデリングに際し、Ｎ９９側鎖をin silicoで望む側鎖（ＡｓｐあるいはＨｉｓ）に変異させ、全分子に３０ステップのエネルギー最小化を適用することにより不適切な接触の可能性は軽減された。野生型モデルに用いられたと同じアプローチが用いられ、亜鉛を含むミュータントモデルのために、異なる金属−リガンド結合性を有する幾つかの可能な出発構造を探索した。
【００４２】
コンピュータプログラムとデータベース
配列の並び替えはEntrez Protein, National Centre for Biotechnolgy Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)から得られた配列よりClustal W, European Bioinformatics Institute (www.ebi.ac.uk/clustalw/)を用いて行われた。ヒトアルブミン（ＰＤＢ １ＡＯ６）に対する三次元配位（ＰＤＢ １ＡＯ６）はBrookhaven Protein Databank (www.rcsb.org/pdb/)から得られた。
【００４３】
部位特異的突然変異誘発
オリゴヌクレオチド‐直接突然変異誘発はアルブミンのＨ６７Ａ変異型をコードするｃＤＮＡを作成するために用いられた。突然変異誘発性のオリゴヌクレオチド5'-gctgaaattgtgacaaatcacttgctaccctttttggagacaaattatgc-3'（配列番号１１）と5'-gcataatttgtctccaaaaagggtagcaagtgatttgtcacaattttcagc-3'（配列番号１２）はDelta Biotechnology Ltd., Nottinghamにより供給された。突然変異誘発はthe QuikChange（登録商標）Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて行われた。望む突然変異体を含むクローンはジデオキシ鎖終止配列により変異部位をヌクレオチド配列分析により同定した。変異ｃＤＮＡはＰＵＣ９酵母発現ベクターに挿入され、エレクトロポレーションによりサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) DXY1細胞に形質転換された。
【００４４】
発現と精製
３０℃で４日間生育後S.セレビシエ(S. cerevisiae)DXY1細胞培養を３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離機にかけた。その後上清を除き、ろ過した。組み換え蛋白は陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、上清から濃縮した。ＳＰ‐セファロースファーストフロー陽イオン交換カラム（カラム容積＝２２５ｍＬ）は４倍のカラム容積量の３０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５で平衡に到達させた。ろ過上清は約３Ｌの２バッチに分けた。オクタン酸ナトリウム（２Ｍ溶液の７．５ｍＬ）をそれぞれのバッチに加え、ｐＨを酢酸で４．５に調整し、カラムに充填する前に脱イオン水で伝導度を5.5mS cm-1に調整した。充填後、カラムを８倍のカラム容積量の５０ｍＭ酢酸塩、８０ｍＭＮａＯＨ，ｐＨ４．０および４倍のカラム容積量の２ＭＮａＣｌ，ｐＨ４．０を含む２７ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。３度目の洗浄は１０倍のカラム容積量の平衡緩衝液で行った。最後にカラムを２倍のカラム容積量の５ｍＭのオクタン酸、ｐＨ５．５を含む８５ｍＭの酢酸ナトリウムで溶出した。
【００４５】
ＳＰ‐セファロースファーストフロー溶出液はＤＥＡＥファーストフローカラム（カラム容積＝１６７ｍＬ）で陰イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。カラムは１５倍のカラム容積量の３０ｍＭ酢酸塩、２７ｍＭＮａＯＨ，ｐＨ５．５で平衡に到達させた。ＳＰ‐セファロース溶出液の伝導度をカラムに充填する前に脱イオン水で３，０mS cm-1に調整した。充填後カラムを５倍のカラム容積量の15.7mM K2B4O7.4H2O,pH9.2で洗浄した。カラムを０．７５倍のカラム容積量の８５ｍＭ酢酸塩、110mM K2B4O7.4H2O,pH9.4で溶出した。
【００４６】
ＤＥＡＥ溶出液をDelta Blue Agarose(Prometic Biosciences)カラム（カラム容積＝４２３ｍＬ）でアフィニティクロマトグラフィーによりさらに精製した。カラムはＤＥＡＥ溶出液を充填する前に２倍のカラム容積量の２５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ８．９で平衡に到達させた。充填後、５倍のカラム容積量の平衡緩衝液で洗浄した。カラムを２倍のカラム容積量の２ＭＮａＣｌ，ｐＨ６．９を含む５０ｍＭリン酸塩緩衝液で溶出した。
【００４７】
Delta Blue溶出液は蠕動ポンプに連結した10kD MWCO Pall Filtron LU Centramate filterを用いて濃縮した。４．２５ｇのＨ６７Ａアルブミンが回収された。精製産物からの濃縮溶液のサンプルを5mg mL-1に希釈し、１０μＬをＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルに使用した。ゲルはLaemmli(1970)Nature 227, 680-685の標準法を用いて作成し使用した。ゲルをクマシーブルー染色および銀染色の両方で染色し、１％の濃度で存在する他の蛋白のないことを明らかにした（それ故蛋白の純度は約９９％）。
【００４８】
円偏光二色性分光分析
天然組み換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）（Delta Biotechnology Ltd., Nottingham）とＨ６７Ａミュータントアルブミンを２００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４中約1.5mg mL-1に希釈した。両蛋白のスペクトルを測定した。機器はＪＡＳＣＯ Ｊ‐６００分光偏光計を用いた。二次構造の推定はＳＥＬＣＯＮ法を用いて計算した。
1D111Cd-{1H}ＮＭＲスペクトル（106.04MHz,Bruker DMX500）は２９５Ｋで10mm BBO（直接観察）プローブヘッドおよび外部標準として0.1M Cd(ClO4)2(0ppm)を用いてごく普通に得られた。プロトンデカッップリングはＧＡＲＰを用いる複合パルスデカップリングにより行った。蛋白のサンプルは一般に２モル当量の111CdCl2と共に５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．１、１００ｍＭＮａＣｌ，１０％重水中であった。111CdCl2
は適切な量の１ＭＨＣｌに111CdO（９５．１１％の同位元素純度、Oak Ridge National Laboratory, Tennessee, USA）を溶解することにより産生させた。
【００４９】
111Cd-NMR研究は同じ濃度で１，５ｍＭｒＨＡあるいはＨｉｓ６７Ａｌａミュータント蛋白を用いて行った。金属滴定実験のために様々な当量のZnCl2あるいはCuCl2を加え、ｐＨはそれぞれを加えた後にチェックし、調整した（もし必要なら）。スペクトルは１７．５μｓ（９０°）の111Cdパルス幅、３６ｋ減衰シグナル，０．１０ｓの補足時間および０．３０ｓのリサイクルディレイを用いて３０ｋＨｚ（２８０ｐｐｍ）の掃引幅に渡って４ｋ複合データポイントにおいて得られた。フーリエ変換に先立ち、データは１６ｋデータポイントにｚｅｒｏ‐ｆｉｌｌｅｄし、指数乗法によりアポディゼーションした（１２０Ｈｚラインブロードニング）
【００５０】
Ａｓｎ９９ＡｓｐおよびＡｓｎ９９ＨｉｓミュータントｒＨＡに関する111Cd-NMR研究はミュータントアルブミンの１ｍＭ溶液を用いて行った。ほとんどのスペクトルは１７．５μｓ（９０°）の111Cdパルス幅、３６ｋ減衰シグナル，０．１３ｓの補足時間および０．２４ｓのリサイクルディレイを用いて３２ｋＨｚ（３００ｐｐｍ）の掃引幅に渡って８ｋ複合データポイントにおいて得られた。フーリエ変換に先立ち、データは３２ｋデータポイントにｚｅｒｏ‐ｆｉｌｌｅｄし、指数乗法によりアポディゼーションした（１５０Ｈｚライン‐ブロードニング）。
【００５１】
d)1H-NMRスペクトル
ＮＨ共鳴を除くために、凍結乾燥サンプルを重水（９９．９％の同位元素純度、Ａｌｄｒｉｃｈ）に約５０ｍｇ／ｍＬに溶解し、２９６Ｋで４８時間保ち、再度凍結乾燥しそれから５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓを含む重水中１ｍＭ溶液となるように溶解した。１ｍＭの濃度の蟻酸ナトリウムを内部キャリブレーション標準（sodium 3-(trimethylsilyl)propionate; TSPに比して８．４８ｐｐｍ）として加えた。pH*（ｐＨ計の読み）は６．９−７．０のｐＨ（Glasoe, P.K. and Long, F.A. J. Phys. Chem., 64, 188 (1960)）に相当する７．３−７．４に調整した。1D and 2D 1H-NMR実験はＺ‐グラジエント三重共鳴（1H,13C,15N）プローブヘッドを用い５９９．８２ＭＨｚで操作するBruker Avance 600 spectrometerを用い３１０Ｋでごく普通に行われた。残留水を抑えるために簡単なプレサチュレーションパルスシークエンスを用いた１Ｄスペクトル（９０°励起パルス、９ｋＨｚ掃引幅、８ｋタイムドメインデータポイント）に対して、５１２の減衰シグナルが一般に得られた。
【００５２】
データは３２ｋにｚｅｒｏ‐ｆｉｌｌｅｄし、分解能向上およびフーリエ変換のためｓｑｕａｒｅｄ ｓｉｎｅ ｂｅｌｌとＧａｕｓｓｉａｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎの至適組み合わせによりアポディゼーションした。２ＤＴＯＣＳＹ実験に際し（９０°励起パルス、８．４ｋＨｚ掃引幅，ミキシング時間６５ｍｓ、１．３ｓ緩和ディレイ）、2x 512 t1インクレメントのそれぞれに対する４８あるいは５６の減衰シグナル（ｔｉｍｅ‐ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ｐｈａｓｅ ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ＴＰＰＩ）を用いた多次元取得）が残留水を抑えるために、感受性の向上した二重パルスフィールドグラジエントスピンエコーシークエンスを用いて４ｋ複合データポイントにおいて得られた。データはｓｑｕａｒｅｄ ｓｉｎｅｂｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓを用いてアポディゼーションされ、実際のフーリエ変換は２ｋ×２ｋデータポイントで行われた。
【００５３】
野生型に対する幾つかのスペクトルも０．１Ｍのリン酸カリウム（ＫＨＰ）緩衝液中で測定した。ヒスチジンＨε１プロトンのケミカルシフトも緩衝液の同一性に依存する。一般に、シグナルはＴｒｉｓ緩衝液中同じpH*（重水中で測定されたｐＤ）で測定されたスペクトルに比べてＫＨＰ緩衝液では高磁場にシフトする。スペクトルの質は同様で、１ｍＭの蛋白濃度は行われたほとんどの実験で最適であった。この濃度以上では、溶液はあまりにも粘性が高く、そのことはシグナルの線幅に対すると同様に明らかにシミングにとって不利であり、溶液の取り扱い（例えばｐＨ調整、反応物との混合）を難しくする。
【００５４】
ｅ）ＵＶ‐Visスペクトロスコピー：銅滴定
アルブミンのサンプルは２００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４中１ｍＭあるいは２ｍＭであった。７００ｍＭのCuCl2貯蔵溶液から、０．２μｌ（０．２モル当量に相当）を逐次追加した。サンプルを完全に混合し、５分後に４００ｎｍから８００ｎｍの間でＳｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ２５０ＩＰＣ分光光度計を用いてＵＶ‐Ｖｉｓスペクトルを測定した。最初、溶液はピンク色に変わり、一方後の追加は混濁をもたらし、スペクトルにおいて観察された吸収の全体的な増加が説明された。混濁の出現（Cu3(PO4)2の形成）は様々のアルブミンミュータントで明らかに異なる。
【００５５】
ｆ）細胞毒性を評価する細胞培養実験
発明者らの研究の間、亜鉛とアルブミンの細胞毒性を調べる２つのアプローチを開発した。最初の実験で用いたアプローチはトリパンブルーを用いる細胞生存力の測定により、２番目のアプローチは死亡細胞をプロピジウムアイオダイドで染色した後に、ＦＡＣＳ（Fluorescence-activated cell sorting、フローサイトメトリーの応用）を用いた。２番目のアプローチは幾つかの利点がある；時間と材料の消費の両方に関してより効率がよい。
【００５６】
ｉ）標準的な培養条件
ＷＲＬ‐６８細胞を１０％ＦＣＳ（新生仔ウシ血清）、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび×１の濃縮ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）で培養した。細胞はインキュベーターにおいて８０cm2の組織培養グレードフラスコで３７℃、５％CO2で生育した。細胞に２〜３日毎に新鮮な培地を補給するかあるいはモニタリングにより必要な時には黄色により補給を示唆する重炭酸塩のカラー指示薬が培地に必要であった。フラスコ中生育した細胞はいったんコンフルーエントとなると、トリプシン＋ＥＤＴＡおよびＰＢＳを用いて採取された。細胞懸濁液はペレットまでＭＳＥ Ｍｉｓｔｒａｌ１０００遠心機で１０分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を除き細胞のペレットを培地中に再懸濁し、必要な時に用いた。
【００５７】
ｉｉ）トリパンブルーを用いる細胞生存率の計測
トリパンブルーは母集団における生存細胞の割合を評価するために用いられる。染料の反応性は発色団が陰性に電荷を帯びており膜が傷害されていなければ細胞と反応しないという事実に基づいている。生存細胞は色素を取り込まないが死亡細胞は取り込む。一般に細胞は15.2x105cells/ml（Ｋｅｒｒｙ Ｂｕｎｙａｎでこの値をチェックする必要がある）の0.5mlを用いて小さな細胞培養フラスコに接種した。これらを終夜放置して平衡に到達させた。培地を除きＰＢＳで細胞を洗浄した。それから細胞を組み替えヒトアルブミン（ｒＨＡ）単独（４０ｍｇ／ｍｌ）、Ｈ６７Ａヒトアルブミン（Ｈ６７Ａ）（４０ｍｇ／ｍｌ）、ｒＨＡおよびｈ６７Ａと０．１、０．５および１．０モル当量の亜鉛とで処理し、同じ濃度で亜鉛単独で処理した。いずれの処理も補充ＤＭＥＭで行った。対照には培地のみを加えた。処理後フラスコを２晩放置した。アルブミンと亜鉛でインキュベーション後培地を除き分析のために保存した。細胞層はＰＢＳで２回洗浄し、この洗浄液を集めた培地に加えた。細胞層はトリプシン＋ＥＤＴＡを用いてフラスコから除いた。再びフラスコをＰＢＳで洗浄し、この洗浄液を細胞の懸濁液に加えた。培地と細胞懸濁液のすべてのサンプルを遠心分離した。一度遠心した上清を吸引して除きペレットをＰＢＳに再度懸濁させた。集めた培地と細胞層の生存細胞の濃度と総細胞数を評価するために、２００μｌの良く混合したサンプル、３００μｌのＰＢＳおよび５００μｌの０．４％トリパンブルー（シグマ）を混合し、２〜３分間室温に放置した。懸濁液を血球計に移し、オリンパス倒立位相差光学顕微鏡を用いて観察し、４×４の正方形格子内の死亡細胞(青)と生存細胞(無色)の数を数えた。全部で１０個の正方形格子の数をカウントした。これらの細胞数は以下の式に従って総細胞数および生存細胞数を評価するのに用いた：
細胞／ｍｌ＝平均細胞数×５（希釈係数）×１×１０4（血球計のチェンバー係数）
生存細胞／ｍｌ＝生存細胞数×５（希釈係数）×１×１０4（血球計のチェンバー係数）
細胞生存力（％）＝（総生存／総生存および非生存）×１００
これらの数字は培地と細胞層に認められる総細胞数およびこれら細胞の生存力を示すために図の形で示した。
【００５８】
ｉｉｉ）フローサイトメトリーと蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）による分析
細胞を０．５ｍｌ／穴の１２穴プレート上0.0995x106cells/mlで培養した。平衡にするためプレートを終夜放置した。それから培地を吸引で除き細胞層をＰＢＳで洗浄した。その後野生型アルブミンあるいはＨｉｓ６７Ａｌａ、Ａｓｎ９９ＡｓｐあるいはＡｓｎ９９Ｈｉｓミュータントアルブミンの有無下、０、６０，３００あるいは６００μＭのZnCl2を補充した培地で細胞を処理した。培地のみで処理した細胞を対照とした。４８時間インキュベーション後フローサイトメトリーを用いてプレートを分析した。このために培地を除き細胞層をＰＢＳで２回洗浄した。前に除いていた培地にこの洗浄液を加えた。それから細胞層をトリプシン＋ＥＤＴＡを用いて除き、ＰＢＳで２回洗浄し、これらの洗浄液を細胞懸濁液に加えた。細胞選別に先立ちすべてのサンプルに１０％ＦＣＳを加えた。細胞死を検出するためにカウント前にすぐにサンプルにプロピジウムアイオダイド（１μｇ／ｍｌ）を加えた。それからBeckman Coulter EPICSセルカウンターを用いてサンプルを測定した。群間比較のために細胞数を測定するべく６０秒後イベントの総数を記録した。
【実施例】
【００５９】
分子モデリングによる亜鉛結合部位の同定
ＮＭＲの研究はアルブミンへの結合に関し113Cdケミカルシフトは２ヶ所での蛋白への金属配位を示唆することを明らかにした（Sadler and Viles(1996)Inorg. Chem. 35, 4490-4496）。Zn2+がCd2+を置換する部位におけるケミカルシフトは２−３個のイミダゾール窒素原子を含む蛋白に対する金属の配位の範囲内である（Oez et al. (1998) Biochem. Cell Biol. 76, 223-234）。
【００６０】
ヒトアルブミンの結晶構造配位はBrookhaven Protein Databank (PDB 1AO6)から得、WebLab Viewer Pro v4.0(Accelrys)を用いて調べた。ヒスチジン残基に焦点を当て（これらは金属配位にとって蛋白における主な窒素供与残基であるので）、それぞれの間の距離を測定した。本発明者らは分子上１ヶ所のみがお互いから５Å以内の２本のヒスチジン側鎖を与えることを見出した。このことからＨｉｓ６７とＨｉｓ２４７が亜鉛結合部位に含まれると発明者らには信じられた。この部位周辺の他の残基の同定から、Ａｓｎ９９とＡｓｐ９９も金属結合に対する酸素リガンドを与えるのに十分接近していることが明らかとなった。Ａｓｎはその側鎖のアミド基から窒素リガンドを与え得る可能性もある。
【００６１】
蛋白における金属に配位するアミノ酸側鎖のデータベース(Harding (2001) Acta Cyst. D57, 401-411;http://tanna.bch.ed.ac.uk)は他の３種の蛋白（ヒトカルシニューリン、大腸菌の5'-エンドヌクレオチダーゼおよびインゲンマメパープルホスファターゼ）が２個のＨｉｓ，１個のＡｓｐおよび１個のＡｓｎ残基に結合する亜鉛を含むことを明らかにし、さらにこれが亜鉛結合にとって適切な部位であることを示唆した。本発明者らにより決定されたように金属結合の予測領域を示す図１と２を参照せよ。
【００６２】
提案された結合部位への亜鉛のモデリング
亜鉛を含むアルブミンの最初のモデルは報告された結晶構造（ｐｄｂ取得コード１ＡＯ６）に基づいてWeblabviewer(Accelrys)を用いて構築した。本発明者らの1D111CdＮＭＲ研究において生理条件下塩素の結合をおおいにありそうなこととするCl-濃度に共鳴シフトが依存することを認めていたので、５番目のリガンドとしてCl-を含む５配位として亜鉛部位のモデルを構築した。５番目のリガンドとして水にもう一つの可能性がある。
【００６３】
亜鉛に対し幾つかの特定のパラメーターを定義した後に、ＴＲＩＰＯＳ力場を用いてジオメトリーを最適化するためエネルギー最小化のモデルをSybyl v6.8(TRIPOS Inc.)に取り込んだ。ヒスチジン（２．００Å）およびアスパルテート（２．００Å）（および水、２．０６Å）に結合したZn2+に対する結合距離はHarding (2001)Acta Cyst. D57, 401-411から採用し、Asn-Zn2+相互作用に対する結合距離（２．１５Å）はBrookhaven Protein Databank (pdb取得コード４ＫＰＢ、ＩＡＵＩおよび１ＴＣＯ)から得たカルシニューリン、5'-エンドヌクレオチダーゼ、およびインゲンマメパープル酸ホスファターゼの結晶構造に基づいて推定した。Ｚｎ‐Ｃｌ結合距離に対する値はCambridge structural database (Allen and Kennard (1993) Chem. Design Autom. News 8, 31-37)から引用した。力定数はＴＲＩＰＯＳ力場から採用した。配位数５のZn2+にとって、一定の均一な角度は期待できないので、亜鉛周辺の結合角は少しも制約されなかった。
最初のステップにおいて、亜鉛周辺のジオメトリーは亜鉛原子、４個の蛋白リガンド残基および塩素イオンのみのエネルギー最小化の２００ステップによって最適化された。不適切なジオメトリーと最初のステップにおける原子運動を介して導入されたファンデルワールス接触を除くために全蛋白にエネルギー最小化の１０ステップをさらに用いた。元の蛋白構造と修飾モデル間の二乗平均偏差（ｒｍｓｄ）値（構造差の表示である）はいずれの原子も０．１３Å、リガンド残基原子のみに対して１．２１Åである。
【００６４】
図３は水素の無い元の構造（黒色）と亜鉛結合部位を合わせるのに比較的わずかな移動のみが必要であったことを立証している本発明者らのモデル（灰色）との間のオーバーレイを示す。その部位はアキシャル位において２個のヒスチジンとねじれた三方晶系のビピラミダルジオメトリーを示す。塩素リガンドは蛋白の外側の方向を指す。異なる出発構造を用いた追加のモデリングの試みは同様のジオメトリー部位をもたらしたが、亜鉛の反対側に塩素イオンを有する部位をもたらした。
【００６５】
蛋白リガンドのみを含む四面体部位のモデルを構築する試みは、角度のねじれの適用にもかかわらず、５配位モデルに見られたねじれた三方晶系のビピラミッドに類似した、Cl-が存在していた空のエカトリアル結合部位を持つジオメトリーをもたらした。
モデリング理論を支持する実験証拠
【００６６】
本発明者らはサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) DXY1細胞でミュータントＨ６７Ａを発現し、イオン交換およびアフィニティクロマトグラフィーにより＞９５％に精製した。円偏光二色性はＨ６７Ａミュータントと野生型蛋白との間で二次構造に大きな変更のないことを明らかにした(図４)。５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．１中で２モル当量の111CdCl2を用いた１．５ｍＭ組み替えヒトアルブミン（ｒＨＡ）に関する111Cd-NMR研究によりそれぞれ２７ｐｐｍおよび１３１ｐｐｍ（Cd(ClO4)に比して）にピークを有する２ヶ所（ＡおよびＢ）での結合を確認した。同様の条件下でＨ６７Ａミュータントは２９ｐｐｍに１本のピークを生じた(図５)。２モル当量の111Cd2+の存在下ｒＨＡへの０．５および１モル当量のZnCl2の添加は１３１ｐｐｍのピーク強度を低下させた(図６ａ)。２モル当量の111CdCl2の存在下ｒＨＡへの２および３モル当量のCuCl2の添加は部位ＢでのCd2+結合に影響し、３７ｐｐｍに新しい111Cdピークの生成をもたらした（図６ｂ）。CuCl2１モル当量の添加はCd2+結合に影響しなかった。これはこの部位での結合飽和後にのみ生じるCd2+の置換によるＮ末端に対するCu2+の高い親和力によるのが最も本当らしい。これらの結果は部位ＢはCd2+に対するよりもZn2+に対しより高い親和力を有し、Cu2+もこの部位に競合的に結合することを示し、金属配位に対するＨｉｓ６７の関与をも示唆している。
【００６７】
図４は天然型およびＨ６７Ａに対する円偏光二色性バンドのサインと大きさが同様なことを示している。このことは天然アルブミンと同様の二次構造を有するＨ６７ＡｒＨＡを示している。
【００６８】
ペプチドと蛋白においてCu2+に配位する窒素リガンド数はこれら複合体のｄ‐ｄ吸収バンドの波長に影響することが知られている。CuCl2の一部を２００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４中ｒＨＡおよびＨ６７Ａミュータントの２ｍＭ溶液に加えた。CuCl2の最初の添加後５２５ｎｍに吸収バンドが出現し、Cu2+への４Ｎ配位の特徴であるCu2+による蛋白のＮ末端荷重を示す。しかしながら吸収の著しい違いはそれぞれの蛋白に１モル当量のCuCl2を更に加えた後に観察された。天然蛋白は６２５ｎｍに２番目の吸収バンドを生じ、ミュータントはより広いバンドを７５０ｎｍに生じた（図７）。これらのバンドはそれぞれ２Ｎおよび１ＮへのCu2+の配位を示唆する(Pettit et al., J. Chem. Soc. Dalton. Trans., 3565-3570(1990))。このことはCu2+イオンがなおこの部位に結合するか（Ｈｉｓ６７の関与なしに）あるいは蛋白の他の部位に結合するかどうかに関し情報を提供しないにもかかわらず、Ｈｉｓ６７残基がZn2+同様Cu2+結合にとって重要なことを示している。
ミュータントアルブミンにおける金属部位のさらなる分子モデリング
【００６９】
本発明者らはエネルギー最小化プロトコールを最適化し、異なる出発構造を探究することによりモデリングの方法論を改善することができた：それ故発明者らは様々なモデル間で意味のある比較を行うために野生型アルブミンについて提案された亜鉛（ＩＩ）部位の再モデリングを行った。以下に結果を要約する。
【００７０】
ａ）野生型アルブミン
新しいモデルの全体のジオメトリーは５番目のリガンドとして現在水を用いていることを別にすれば、以前のモデル（図３ａ）とは大きく異なっていない（全原子のｒｍｓｄ：０．０５Å；亜鉛部位のｒｍｓｄ：０．２５Å）。元の構造（ｐｄｂ登録１ＡＯ６；［図３］）とモデル間のｒｍｓｄは亜鉛部位の原子のみに対し０．６７Åで、このことは本質的にアルブミンにおける亜鉛部位は前もって配置されていることを示唆している。
【００７１】
ｂ）モデリング研究はＡｓｎ９９ＨｉｓミュータントおよびＡｓｎ９９Ａｓｐミュータントについても行われた
ミュータントモデルは図３ｃ、３ｄおよび３ｅに示されている。金属フリー形での提案部位を示す図１９は立体配座動態およびアロステリック相互作用において役割を果たす可能性のあるドメイン間水素結合に対する突然変異の影響を立証している。
【００７２】
要約すると、モデリング研究は野生型アルブミンに関して様々な親和力で金属例えば亜鉛を結合できる及び／または他の生理学的特性を発揮できるミュータント血清アルブミンを産生できるアイデアを支持する。
【００７３】
突然変異金属部位の検出
Ｚｎ（ＩＩ）イオンが大抵の分光技術にとって目に見えないので、蛋白における亜鉛結合の評価は難しい。この本来の問題を回避するための最も一般的なアプローチは比較的Ｚｎ（ＩＩ）に類似するＣｏ（ＩＩ）（ＵＶ／Ｖｉｓスペクトルスコピー）あるいはＣｄ（ＩＩ）（ＮＭＲスペクトルスコピー）のような他の金属を用いることである。別のアプローチは着色したＺｎ（ＩＩ）指示薬を使用する。発明者らは111CdＮＭＲスペクトロスコピーおよびＣｕ（ＩＩ）を用いた滴定により得られた新しいミュータントアルブミンに関する結果を以下に述べる。
【００７４】
ａ）ミュータントアルブミンの111CdＮＭＲ
111Cd（あるいは113Cd；両方の核が用いられる）ＮＭＲ実験は、もし金属荷重蛋白が同位元素に富んだＣｄ（ＩＩ）で作ることができるなら、蛋白における金属結合を検出する比較的直接的な方法である。本研究の結果は両ミュータントの金属結合性質の興味ある改変を明らかにしている。
【００７５】
ｉ）Ａｓｎ９９Ｈｉｓミュータント
図９と１０は同じ条件下で野生型およびＡｓｎ９９Ａｓｐミュータントアルブミンの1D111Cdスペクトルを比較している。
野生型ｒＨＡの場合のように、Ａｓｎ９９Ｈｉｓミュータントの1D111Cdスペクトルにおいて２当量の111Cd2+が容易に結合することを示唆する２本のピークが観察されることを図は明らかに示している。野生型およびミュータントｒＨＡのスペクトルにおいてピークの線幅は同等であることに注目される。ピークのケミカルシフトは８０ｍＭ塩素の存在下１２２ｐｐｍ（ピークＡ）と２８ｐｐｍ（ピークＢ）である。野生型ｒＨＡ（１３１ｐｐｍと２７ｐｐｍ）と比較すると、金属結合部位Ｂは突然変異により影響されないが、一方ミュータント部位ＡにおけるＣｄ（ＩＩ）イオンは野生型におけるよりもやや遮蔽されていることを意味する。
【００７６】
酸素の窒素ドナーによる置換が脱遮蔽をもたらすことが予測されるが、ミュータントにおけるＮ‐Ｃｄ結合が野生型におけるＯ‐Ｃｄ結合よりも短いと仮定するなら、観察された低いｐｐｍ値へのピークＡの移動は定性的に理解される。Ａｓｎは非常に弱いリガンドなのでこのことは合理的な仮定であり、発明者らは以前にＺｎ‐Ｎ（Ｈｉｓ）結合に対する１．９５−２．００Åに比べてＯ‐Ｚｎ結合は約２．１５Åと推定していた。同様の傾向がＣｄに対しても期待される。
【００７７】
発明者らはCd2rHAサンプルにZn2+を加えることによりCd2+とZn2+間の競合をも検出した。Zn2+の添加は明らかにピークＡに影響するが、３当量の添加後でさえも、111CdピークＡはなおスペクトルにみられる。対照的に、野生型ｒＨＡのスペクトルにおいて１モル当量のZn2+はピークＡを完全に消去するのに十分であり、Cd2+は完全に置換されたことを示唆する。この知見はハード酸、ソフト酸および塩基の原理を考慮することによりある程度解釈することができる。Cd2+はZn2+よりもよりソフトな金属イオンであり、窒素は酸素よりもよりソフトなリガンドである。結合部位をよりソフトにすることは野生型ｒＨＡにおけるよりもCd2+結合を好都合にするであろう。本質的に、実験はＡｓｎ９９が野生型ｒＨＡの亜鉛部位に寄与し、変異部位は実際にCd2+とZn2+に結合し得ることを示している。
【００７８】
ｉｉ）Ａｓｎ９９Ａｓｐミュータント
図１０に野生型ｒＨＡと比較したＡｓｎ９９ＡｓｐミュータントｒＨＡに関する111Cd2+結合研究の結果を要約する。
Cd2+部位Ｂの再度の占有は突然変異により影響されないことは明らかである（野生型のスペクトルにおける２７ｐｐｍに比べた２８ｐｐｍ）。部位Ｂは未だ同定されていないが、蛋白のこの特定部分の折りたたみに突然変異は影響しないと結論される。
驚くことに、111Cdスペクトル（図１０の説明を参照）に対する発明者らの通常の条件においてピークＡは検出されなかった。ケミカルシフトスケールの拡張は何らそれ以上のピークを示さなかった。十分な111Cdが利用できることを保証するために、２モル当量の111Cdを加えた。このサンプルのスペクトルにおいて、さらに２本のピークが示唆されるが、上昇温度（３１０Ｋ）においてのみ２本の新しい非常に幅の広い共鳴（ピークＢに対する約１５０−２００Ｈｚに比べ、ほぼ２０００Ｈｚの線幅を持つ）が確かに検出された。このことは化学的な交換現象がスペクトルに影響することを示唆している。過剰のＣｄ（ＩＩ）にもかかわらず、おそらくＴｒｉｓがCd2+に結合しそれを溶解させる事実によりＮＭＲチューブ中に沈殿は見られなかった。Ｃｄ／Ｔｒｉｓ複合体に対するケミカルシフトは１０６ｐｐｍ（２９５Ｋで）で、これは図１０のピークＣに対して観察された値でもある。３１０ＫのスペクトルにおけるピークA'は十分に１個の窒素を持つ111Cd部位の範囲および３個と５個の酸素ドナー間の６７ｐｐｍのシフトを有する(Coleman, J.A., Methods Enzymol. 227, 16-43 (1993); Oez, G.L., Pountney, D.L. & Armitage, I.M. Biochem. Cell Biol.-Biochim. Biol. Cell. 76, 223-234 (1998)。発明者らは利用可能な111Cdは変異結合部位A'とＴｒｉｓ（あるいは二者択一的に蛋白上の非特異的部位）間の中間の（２９５Ｋ）あるいは遅い交換（３１０Ｋ）にあると仮定を立てている。
【００７９】
ｂ）ＵＶ‐Ｖｉｓスペクトロスコピーによりモニターした銅（ＩＩ）の結合
野生型ｒＨＡへのCu2+の添加はｉｎ ｖｉｔｒｏのCu2+がこの亜鉛部位に結合できることをも示す111CdピークＡの消失をもたらすことを以前に示した（図６ｂも参照）。
発明者らはＵＶ‐Ｖｉｓスペクトロスコピーにより野生型およびミュータントアルブミンのアポ型でCu2+の滴定を行った、なぜなら定量的評価は直接的でないにもかかわらず、このような実験は金属結合について迅速な定性的情報を与えるからである。図１１に示す実験はＡｓｎ９９ミュータントへのCu2+結合は野生型への結合とは異なることを示している。それらはＨｉｓ６７ＡｌａミュータントｒＨＡとの比較から判るように第二の部位でCu2+と結合することは明らかである。両ミュータントの吸収プロフィールはお互いに異なり、変異リガンドの関与を意味する。
このように、突然変異は主たるZn2+部位であると知られている第二のCu2+部位に実際に影響を及ぼす。
【００８０】
５．ミュータントアルブミンの1H-NMR
発明者らは1D and 2D 1H-NMRスペクトルを得、図１４は検討したミュータントすべての1D 1Hスペクトルの芳香族化合物の領域を比較した。図１５は亜鉛の有無による野生型の2D TOCSYスペクトルの関連部分を含む。検討したすべてのミュータントに対し同様のスペクトルが得られた（データは示していない）。いずれのスペクトルも全体として比較的野生型のスペクトルに類似している。このことはいかなる突然変異も少なくともアポ型における蛋白の折りたたみに対して劇的な影響を及ぼしていないを示している。しかしながら解釈し得る微妙な変化がある。
【００８１】
特に、野生型ＮＭＲスペクトルのピーク１と３は考慮した突然変異（Ｈｉｓ６７Ａｌａ，Ａｓｎ９９ＡｓｐおよびＡｓｎ９９Ｈｉｓ）のどれによっても影響を受ける。それ故これらは残基Ｈｉｓ６７とＨｉｓ２４７に帰属することができるとの仮説が立てられる。
結論：野生型およびＨｉｓ６７Ａｌａ，Ａｓｎ９９Ａｓｐ，およびＡｓｎ９９ＨｉｓミュータントｒＨＡの1D and 2D 1H-NMRスペクトルの分析は残基Ｈｉｓ６７、Ａｓｎ９９、Ｈｉｓ２４７およびＡｓｐ２４９により形成される提案結合部位と矛盾しない。Ｈｉｓ６７Ａｌａの突然変異は野生型のスペクトルにおける２本の交差ピークに影響を及ぼし、変異残基は別のＨｉｓ（Ｈｉｓ２４７）の近くにあるとの考えと矛盾しない。Ａｓｎ９９の突然変異も同じ２本の野生型交差ピークに影響を及ぼし、上に述べた３残基が実際に互いに密接に接していることを示唆する。交差ピーク１とＡはＨｉｓ２４７に交差ピーク３とＢはＨｉｓ６７に帰属される。
【００８２】
６．1H-NMR：結合イベントに対する実態分析プローブとしてのヒスチジンHε1共鳴
Ｈｉｓ６７とＨｉｓ２４７に相当する２本のピークを帰属した後に、亜鉛結合に関しこれら残基に影響があるかどうかを調べることが重要である。
ａ）亜鉛結合
野生型アルブミンへの１モル当量のZn2+の添加は１Ｄおよび２Ｄスペクトルから判断されるようにＨｉｓ残基の動態に劇的な結果をもたらす。
幾つかのピークは大きく影響され、一方ピーク４，６，７，８および１１は未変化のままである。ピーク１と３はもはや観察されないが、ピーク５も消失し、ピーク２および９／１０は強度が低下する。
【００８３】
ピークがシフトするよりもむしろ消失する事実はZn2+結合の２つの影響による可能性がある。残基が亜鉛結合の際より硬くなる、それは線幅の広がりをもたらすであろう、あるいは亜鉛（およびこのようにそのリガンド）がフリーと結合状態の間で交換する、そしてこの化学的な交換現象も線幅の広がりをもたらす。いずれの場合においても、亜鉛結合は1H-NMRによりモニターでき、残基Ｈｉｓ６７とＨｉｓ２４７への影響、直接あるいは間接に他の未だ同定されていないヒスチジン残基に対する影響をも確認することができる。
Ａｓｎ９９ＡｓｐおよびＡｓｎ９９Ｈｉｓに対する亜鉛結合
１モル当量のＺｎ（ＩＩ）を含む１ｍＭＮＭＲの両サンプルは約３０分間（１Ｄスペクトルを取るのに要する時間）３１０Ｋに保った後沈殿を生じた。サンプルを磁石に導入する前に沈殿物は観察されなかった、そしてサンプルを終夜２７９Ｋに保った後、沈殿物は再び溶解した。観察された影響はＡｓｎ９９Ｈｉｓミュータントに対するよりもＡｓｎ９９Ａｓｐミュータントで大きかった。現在発明者らはおそらくドメイン間の相互作用に関連した立体配座動態に亜鉛が深く影響すると推測できるだけである。この考えは野生型で得られた観察とも矛盾しない。Ａｓｎ９９Ａｓｐミュータントサンプルも数時間３１０Ｋに保ったが、111Cdサンプルによる沈殿は観察されなかった。
【００８４】
ｂ）野生型ｒＨＡに対する脂肪酸結合の影響
アルブミンは血漿中他の不溶の長鎖脂肪酸の輸送に重要な役割を演じている。正常な条件下で、１−２の脂肪酸分子はアルブミンに結合するが、運動中，この数は４に上昇する(Peters, T., Jr. All About Albumin: Biochemistry, Genetics, and Medical Applications. Academic Press, New Your (1995))。アルブミンのＸ線構造は５(Curry, S., M,andelkow, H., Brick, P. & Franks, N. Nat. Struct. Biol. 5, 827-835(1998)と１０(Bhattacharya, A.A., Groene, T. & Curry, S. J. Mol. Biol. 303, 721-732(2000)の間の脂肪酸結合部位を示すが、ｉｎ ｖｉｖｏで観察された最大数は６である。アルブミンへの脂肪酸の結合は13C (Hamilton, J.A., Era, S., Bhamidipati, S.P. & Reed, R.G. Proc. Natl. Acd. Sci. U.S.A. 88, 2051-4 (1991)および1H-NMR(Oida, T. J. Biochem. (Japan) 100, 1533-42 (1986)を含む種々の技術を用いて過去に広く研究された。
多数のHis Hε1ピークは大体は脂肪酸結合により影響されることが直接図１７で見られる。このことは相互に作用する亜鉛と脂肪酸結合の影響をモニタリングする手がかりを与える。
【００８５】
７．相互に作用する金属／脂肪酸結合のプローブとしての111Cd-NMR
オクタノエート飽和ｒＨＡサンプルを用いた最初の111Cd-NMRスペクトロスコピー実験はそのようなサンプルのスペクトルにピークＡがないことを明らかにした。
２モル当量の111Cd2+を含む徹底的に透析したサンプル（発明者らはそのような透析サンプルあるいはＣｈｅｎ‐脱脂標品の1D 111Cd-NMRスペクトル間で認識し得る差のないことを確認もしていた）で始め、オクタン酸カリウムの当量を加えた。図Ｘは滴定研究の結果を示す。
【００８６】
最も著しい知見はピークＡは始めに減少するが、数時間後に再び出現することである。脂肪酸と金属イオンの再分配に導く遅い平衡によると思われる。ピーク強度の低下がサンプルの混合後直接観察できるように（少なくとも２あるいは３当量の追加に対し；その後の追加において動態は明らかにスローダウンする）、部位Ｆ２への脂肪酸の最初の結合は比較的早いことは明らかである。ピークＡが再出現するので、その後脂肪酸分子は熱力学的により好ましい結合部位へ移動すると推測できる。部位Ｆ２から脂肪酸の解離は金属結合部位の再形成をもたらすと期待され、利用可能なCd2+は再び結合できる。この方法は４当量まで繰り返すことができるので、部位Ｆ２よりも高い熱力学的安定性を有するすべての脂肪酸結合部位は明らかに飽和される。５当量のオクタノエートを含むサンプルの最終スペクトルにおいて、ピークＡはもはや存在しない。
本研究の重要な結果は脂肪酸の結合が金属結合を妨げるのみならず、金属と脂肪酸の結合は相互に作用する過程であり、脂肪酸陰イオンの結合は結局結合した金属イオンの解離を導くと思われる結論である。
【００８７】
８．細胞の発現
アルブミンは虚血および低酸素による肝傷害に対して肝組織を保護することが知られており、その効果はアルブミンの金属結合能に起因する(Strubelt, O., Younes, M., Li, Y. Pharmacology and Toxicology 75, 280-284(1994)。発明者らは肝細胞の培養に際し亜鉛、組み換えヒト血清アルブミンおよびミュータントアルブミンの効果を探究するためにｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を開発した。
【００８８】
ヒト肝細胞株ＷＲＬ‐６８を用いた。その細胞はDulbecco's最小培地で生育した。Ｈｉｓ６７ＡｌａミュータントアルブミンのｒＨＡの効果を研究するために、６００μＭのｒＨＡあるいはＨｉｓ６７Ａｌａミュータントを培地に加えた。Ｚｎ（ＩＩ）の効果は培地に６０，３００、ならびに６００μＭのZnCl2を加えることにより調べた。
これらの最初の実験は細胞数を数えることおよびトリパンブルーを用いて細胞の生存力を評価することにより行った。それらは細胞の生存力と接着に対する亜鉛濃度上昇の明瞭なネガティブな効果を示唆した、それは野生型アルブミンの添加によって救われたが、Ｈｉｓ６７Ａｌａミュータントは細胞毒であり細胞接着を阻害することも示唆した。
【００８９】
その後、アルブミン添加に先立ち細胞層を生成するために、野生型あるはミュータントアルブミン（６００μＭ）の有無下様々な用量（60, 300, and 600μM）のＺｎを追加したダルベッコ最小イーグル培養液で４８時間インキュベートする前にヒトＷＲＬ‐６８肝細胞を１８時間培養した。他に、生育条件（37C,5%CO2）は以前の実験と同じであった。発明者らは２つの新しいミュータント、Ａｓｎ９９ＡｓｐとＡｓｎ９９Ｈｉｓにも研究を拡張した。
【００９０】
図１８のグラフはヒト肝細胞の亜鉛と様々なミュータントアルブミンを組み合わせて用いた効果を要約している。肝細胞は１２穴プレートの層で生育し、細胞数と生存力は層と培養液の両方において測定した。いずれの実験も３回行い、誤差のバーは個々の実験間の標準偏差に相当する。
【００９１】
図１８ａ〜１８ｄに示した結果から以下の結論を引き出すことができる。
ａ）Zn2+濃度の上昇は細胞死と接着の喪失をもたらすことが確認された。
ｂ）野生型ｒＨＡは細胞により非常に良く許容される；対照における細胞数と野生型ｒＨＡを含む細胞数との間に生育あるいは接着の有意な差はない。
ｃ）Zn2+の有害な効果は６００μＭの野生型ｒＨＡによって逆転される。
ｄ）Zn2+の追加なしにＨｉｓ６７Ａｌａミュータントは細胞接着に対し劇的な効果があり、細胞の生存力は層あるいは培養液のいずれにおいても傷害されているようには見えないが、大多数の細胞の培養液中での浮遊をもたらす。
ｅ）驚くことにZn2+の追加は細胞接着に関しＨｉｓ６７Ａｌａのネガティブ効果を明らかに逆転させ，もし単独ならば同じ傷害効果を発揮することはない。
ｆ）Ａｓｎ９９Ａｓｐミュータントアルブミンの添加はZn2+の追加量とは無関係に、生育細胞の増加（約＋２０％）をもたらす。
ｇ）Ａｓｎ９９ＨｉｓミュータントｒＨＡの添加は最も劇的な接着の喪失を誘発する。Ｈｉｓ６７ＡｌａミュータントｒＨＡとは逆に、Zn2+の追加に有益な効果はない。細胞の生存力は影響されないようである。
要約すると、発明者らは亜鉛部位リガンドに対する突然変異は蛋白の物理化学的性質および生存細胞に対しても影響が及ぶことを示した。観察された様々な効果に対する理由は未だ立証されていないが、発明者らは理論に結びつけることを望むことなく、立体配座の動態、ドメイン／ドメイン相互作用、蛋白／蛋白相互作用ならびにおそらく蛋白／膜相互作用が本観察のほとんどの原因であると推測する。
【００９２】
これらの研究結果として金属部位の周辺の残基の突然変異によりZn2+のような金属イオンに対する親和力の低下したあるいは増強した新規なミュータントアルブミンを作ることが可能である。これらは金属に結合できない（あるいは弱くしか結合できない）および金属親和力の低下を生じている側鎖に金属を結合させることができる側鎖の突然変異を含む。
なお、下表は、哺乳類アルブミン間のアミノ酸配列の比較である。突然変異を起こしている残基を強調している。Ｎ末端アミノ酸（残基番号１）前の枠内のアミノ酸はプレアルブミン配列の一部で、翻訳後開裂されアルブミン自身を与える。配列のアクセッション番号はヒト、Ｐ０２７６８（配列番号２）；アカゲザル、Ｍ９０４６３（配列番号３）；イヌ、ＣＡＢ６４８６７（配列番号４）；ネコ、Ｐ４９０６４（配列番号５）；ウシ、Ｐ０２７６９（配列番号６）；ヒツジ、Ｐ１４６３９（配列番号７）；ブタ、ＡＢＰＧＳ（配列番号８）；ウサギ、Ｐ４９０６５（配列番号９）およびラット、Ｐ０２７７０（配列番号１０）である。
【００９３】
【表１（ａ）】
【表１（ｂ）】
【表１（ｃ）】
【表１（ｄ）】
【表１（ｅ）】
【表１（ｆ）】
【表１（ｇ）】
【表１（ｈ）】
【表１（ｉ）】
【表１（ｊ）】
【表１（ｋ）】
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ＰＤＢ １ＡＯ６で報告されているように、ここで明らかにされ、強調された金属結合部位を有するヒト血清アルブミンの三次元構造のモデルを示す模式図。
【図２】図２は提案した亜鉛結合部位内および周辺に位置するより詳細なアミノ酸側鎖を示す模式図。
【図３（ａ）】野生型アルブミンにおける亜鉛部位の最初のモデルをアポ‐ｒＨＡ（１ＡＯ６）と比較して示す模式図。
【図３（ｂ）】野生型ヒト血清アルブミンの亜鉛部位の再計算した、改良モデルをアポ‐ｒＨＡ（１ＡＯ６）と比較して示す模式図（亜鉛部位の力場エネルギー：５９．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ。）。
【図３（ｃ）】Ａｓｎ９９Ｈｉｓミュータントの金属部位モデルを野生型ＺｎｒＨＡ（緑色）と比較して示す模式図（亜鉛部位に対する力場エネルギーは野生型アポ：０．５４Å；野生型Ｚｎアルブミン：０．５６Åに対し８３．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ．ｒｍｓｄである。）。
【図３（ｄ）】Ａｓｎ９９Ａｓｐミュータントの金属部位モデルを示す模式図。
【図３（ｅ）】亜鉛フリー野生型およびミュータントアルブミンのモデルにおける可能な亜鉛部位でのドメイン間Ｈ結合を示す。ａ：野生型；ｂ：脂肪酸を負荷した野生型；ｃ：Ａｓｎ９９Ｈｉｓミュータントモデル；ｄ：Ａｓｎ９９Ａｓｐミュータントモデルを示す模式図。
【図４】野生型（実線）およびＨ６７Ａアルブミン（点線）の円偏光二色スペクトルを示すグラフ。
【図５】２モル当量の111CdCl2による野生ｒＨＡおよびＨ６７ＡｒＨＡの111Cd-NMRを示すチャート。
【図６】ａ）亜鉛およびｂ）銅の存在下２モル当量の111CdCl2によるｒＨＡの111Cd-NMRを示すチャート。
【図７】０．２当量ステップで（ボトムからトップ）０．２から２モル当量のCuCl2による（ａ）天然ｒＨＡおよび（ｂ）Ｈ６７ＡｒＨＡのＵＶ‐可視吸収スペクトルを示すグラフ。
【図８】亜鉛結合の無いａｓｎ９９ａｓｎミュータントにおける可能な亜鉛結合部位を示す模式図（右側のオーバーレイにおいて赤紫色で示したのが野生型構造である、変異部位の力場エネルギー（101.4ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は野生型（55.6ｋｃａｌ／ｍｏｌ）およびａｓｎ９９ｈｉｓ部位（75.6ｋｃａｌ／ｍｏｌ）のそれよりわずかに大きい。）。
【図９】２モル当量の111Cd2+（条件：１ｍＭ蛋白、５０ｍＭTris-Cl、５０ｍＭNaCl、２９５Ｋ）による組み換えアルブミン（野生型およびＡｓｎ９９Ｈｉｓミュータント）の１Ｄ111Cd-NMRスペクトルを示すチャート。
【図１０】２モル当量の111Cd2+（条件：１ｍＭ蛋白、５０ｍＭTris-Cl、５０ｍＭNaCl、もし他に述べなければ２９５Ｋ）による組み換えアルブミン（野生型およびＡｓｎ９９Ａｓｐミュータント）の１Ｄ111Cd-NMRスペクトルを示すチャート。
【図１１】銅（II）による１ｍＭｒＨＡの滴定を示すグラフ（ｐＨ7.4、0.2Ｍリン酸カリウム。CuCl2はそれぞれのケースで0.2当量部に加えられた。アルブミンの吸収に対し補正した差スペクトルを示す。）。
【図１２】野生型およびミュータントアルブミンのＵＶ‐Ｖｉｓ差スペクトルに対する様々な量のCu2+の影響の直接比較を示すグラフ。
【図１３】野生型ｒＨＡのdeconvoluted FT-ICR-MSスペクトル（8 mM NH4Ac、２５％メタノール、１％酢酸中２０μＭ。小分子付加体の検出を可能にする狭い線形（ｈａｌｆ‐ｈｅｉｇｈｔ幅約２５Ｄａ）に注目。）。
【図１４】組み替えアルブミンミュータントの高分解能1D 1H-NMRスペクトルの測定結果を示すチャート（順に、組み替えアルブミンミュータントの高分解能1D 1H-NMRスペクトルの測定結果、ＨｉｓＨδ２／Ｈε１交差ピークを示す野生型、Ｈｉｓ６７Ａｌａ，Ａｓｎ９９ＡｓｐおよびＡｓｎ９９ＡｓｐｒＨＡそれぞれの２ＤＴＯＣＳＹ ＮＭＲスペクトルの一部を示す。いずれのサンプルも50 mM Tris-Cl, 50 mM NaCl中１ｍＭで、いずれの実験も３１０Ｋで行われた。ｐＨ値は７．２８（Ｎ９９Ｈ）と７．４０（Ｈ６７Ａ）の間で変化し、個々のプロトンに対するケミカルシフトのわずかな違いを説明する。観察できるHε1プロトンは数字を付し、ケミカルスフトの標準として加えた蟻酸塩を表す）。
【図１５】ヒスチジンＨδ２／Ｈε１交差ピークを示す１モルの当量Zn2+を加えた（pH*= 7.3７）１Ｄおよび２ＤＴＯＣＳＹスペクトルの一部を示すグラフ。
【図１６】オクタノエートの量を変えた野生型ｒＨＡ（50 mM Tris-Cl, 50 mM NaCl, pH* = 7.26中１ｍＭ）の高分解能１ＤＮＭＲスペクトルの一部を示すチャート（右図はヒスチジンＨε１プロトンのケミカルシフトに対するオクタノエートの増量効果を示す）。
【図１７（ａ）】オクタノエートによるCd2rHAの滴定を示すチャート（条件：１ｍＭｒＨＡ、２モル当量111CdCl2, 50 mM Tris-Cl, 50 mM NaCl, 10% D2O, pH 7.1, 298 K, 10 mm BBOプローブ。１スペクトルの取得に一般に４時間を要する。
【図１７（ｂ）】オクタノエートによるCd2rHAの滴定を示すチャート（条件：１ｍＭｒＨＡ、２モル当量111CdCl2, 50 mM Tris-Cl, 50 mM NaCl, 10% D2O, pH 7.1, 298 K, 10 mm BBOプローブ。１スペクトルの取得に一般に４時間を要する。図１７ｂのグラフは４当量に対する時間経過を示す［各スペクトルの取得に４時間かかるので、各スペクトルの中間点（すなわち、実験開始後２時間）は平均タイムポイントとして取得される］。
【図１８（ａ）】天然およびミュータント血清アルブミンを用いた層中の細胞数を示すグラフ。
【図１８（ｂ）】天然およびミュータント血清アルブミンを用いた層中の死亡細胞の百分率を示すグラフ。
【図１８（ｃ）】天然およびミュータント血清アルブミンを用いた培地中の細胞数を示すグラフ。
【図１８（ｄ）】天然およびミュータント血清アルブミンを用いた培地中の死亡細胞の百分率を示すグラフ。
【図１９】Ｈ結合を介するドメインＩ‐ドメインＩＩ接触面に含まれると同定された突然変異体を示す模式図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミュータントの由来となった天然アルブミンに関して金属結合親和力および／または他の生理学的特性の改変を示すように突然変異を生じた単離されたミュータント血清アルブミン。
【請求項２】
他の生理学的特性が、培養における基質に対する細胞接着、細胞の生存力の百分率および／あるいは細胞の発育における変化である請求項１に記載のミュータント。
【請求項３】
実質的に以下のアミノ酸配列（配列番号１）からなる単離されたミュータントヒト血清アルブミン：
DahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqX5lqqcpfedhvkLvnevtefaktcvadesaencdkslX1tlfgdklctvatlretygemadccakqeperx2X8cfX6qhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrX9pyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvX10TEccX3X7X4llecaddradlakyicenqdsissklkeccekplleksX11ciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpdysvvlllrlaktyettlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasqaalgl
（上記配列中、X1はＨ以外；X2はＮ以外、X3はＨ以外、X4はＤ以外；X5はＹ以外；X6はＬ以外；X7はＧ以外、X8はＥ以外、X9はＨ以外、X10はＨ以外およびX11はＨ以外であり、前記ミュータントは天然ヒト血清アルブミンに関して金属結合親和力の改変を示す）。
【請求項４】
ミュータントが誘導される天然配列に関して上記ミュータント血清アルブミンが金属結合親和力または他の生理学的特性の改変を示すように灰色の濃淡により識別された残基の少なくとも１つが突然変異した実質上表１に示される配列の１つからなる単離された哺乳類のミュータント血清アルブミン。
【請求項５】
ミュータントが誘導される天然配列と少なくとも９０％同一である請求項３または４に記載の単離されたミュータント血清アルブミン。
【請求項６】
それが誘導される天然血清アルブミンに関して全体の折りたたみが実質上同様のものである先行する請求項に記載のミュータント血清アルブミン。
【請求項７】
金属結合親和力の改変が金属結合親和力の減少または増強である先行する請求項に記載のミュータント血清アルブミン。
【請求項８】
金属が亜鉛である先行する請求項に記載のミュータント。
【請求項９】
最後に以下の突然変異の１つからなる請求項３〜８のいずれか１つに記載のミュータント：
X1：A, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, C, D, E
X2：A, F, G, I, K, L, P, Q, R, S, T, V, W, Y, C, D E, H
X3：A, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, C, D, E
X4：A, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, C, E, H
X5：C, D, E, H
X6：C, D, E, H
X7：C, D, E, H
X8：A, C, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X9：A, D, E, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X10：A, D, E, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X11：A, D, E, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
【請求項１０】
X1,X2,X3あるいはX4の少なくとも１つの突然変異からなる請求項３〜８のいずれか１つに記載のミュータント。
【請求項１１】
突然変異体Ａｓｎ９９Ｈｉｓ、Ａｓｎ９９ＡｓｐまたはＨｉｓ６７Ａｌａからなるミュータントヒト血清アルブミン。
【請求項１２】
先行する請求項に記載のミュータント血清アルブミンをコードすることができる核酸配列。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸配列に機能的にリンクしたプロモーターからなる発現カセット。
【請求項１４】
先行する請求項に記載のミュータント血清アルブミン、核酸配列または発現カセット及びその医薬上許容される担体からなる医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１つに記載のミュータント血清アルブミン、核酸配列または発現カセットからなる細胞培養液。
【請求項１６】
細胞接着および／または細胞発育特性へ影響を及ぼすための細胞培養における請求項１〜１３のいずれか１つに記載のミュータント血清アルブミン、核酸あるいは発現カセットの使用。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか１つに記載のミュータント血清アルブミンの存在下細胞培養における培養細胞工程からなる細胞培養における細胞の発育特性を改変する方法。
【請求項１８】
下記の工程からなるミュータントが誘導された天然アルブミンに関して金属結合親和力および／または他の生理学的特性の改変を示すミュータント血清アルブミンを得る方法：
ａ）核アルブミンポリペプチドをコードする核酸配列を用意する工程；
ｂ）前記核酸を改変し、前記改変核酸配列が前記天然アルブミンに関して少なくとも１つの突然変異からなるミュータントアルブミンポリペプチドをコードするように前記核酸に対する突然変異誘発反応を実施する工程；
ｃ）前記上記ミュータントアルブミンポリペプチドの発現および前記ュータントアルブミンが金属結合および／または他の生理学的特性の改変を示すか否かを検出する工程。
【請求項１９】
ミュータントアルブミンが表１に示される残基X1〜X11に対する少なくとも１ヶ所の突然変異からなる請求項１８に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に以下のアミノ酸配列（配列番号１）からなる単離されたミュータントヒト血清アルブミン：
DahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqX5lqqcpfedhvkLvnevtefaktcvadesaencdkslX1tlfgdklctvatlretygemadccakqeperx2X8cfX6qhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrX9pyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvX10TEccX3X7X4llecaddradlakyicenqdsissklkeccekplleksX11ciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpdysvvlllrlaktyettlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasqaalgl
（上記配列中、X1はＨ以外；X2はＮ以外、X3はＨ以外、X4はＤ以外；X5はＹ以外；X6はＬ以外；X7はＧ以外、X8はＥ以外、X9はＨ以外、X10はＨ以外およびX11はＨ以外であり、前記ミュータントは天然ヒト血清アルブミンに関して金属結合親和力の改変を示す）。
【請求項２】
他の生理学的特性が培養における基質に対する細胞接着、細胞の生存力の百分率および／またはは細胞の成育における変化であ請求項１に記載のミュータント。
【請求項３】
ミュータントが誘導される天然配列に関して上記ミュータント血清アルブミンが金属結合親和力または他の生理学的特性の改変を示すように灰色の濃淡により識別された残基の少なくとも１つが突然変異した実質上表１に示される配列の１つからなる単離された哺乳類のミュータント血清アルブミン。
【請求項４】
ミュータントが誘導される天然配列と少なくとも９０％同一である先行するいずれかの請求項に記載の単離されたミュータント血清アルブミン。
【請求項５】
それが誘導される天然血清アルブミンに関して全体の折りたたみが実質上同様のものである先行するいずれかの請求項に記載のミュータント血清アルブミン。
【請求項６】
金属結合親和力の改変が金属結合親和力の減少または増強である先行するいずれかの請求項に記載のミュータント血清アルブミン。
【請求項７】
金属が亜鉛である先行するいずれかの請求項に記載のミュータント。
【請求項８】
最後に以下の突然変異の１つからなる先行するいずれかの請求項に記載のミュータント：
X1：A, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, C, D, E
X2：A, F, G, I, K, L, P, Q, R, S, T, V, W, Y, C, D E, H
X3：A, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, C, D, E
X4：A, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, C, E, H
X5：C, D, E, H
X6：C, D, E, H
X7：C, D, E, H
X8：A, C, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X9：A, D, E, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X10：A, D, E, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X11：A, D, E, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
【請求項９】
X1, X2, X3あるいはX4の少なくとも１つの突然変異からなる先行するいずれかの請求項に記載のミュータント。
【請求項１０】
突然変異体Ａｓｎ９９Ｈｉｓ、Ａｓｎ９９ＡｓｐまたはＨｉｓ６７Ａｌａからなるミュータントヒト血清アルブミン。
【請求項１１】
先行するいずれかの請求項に記載のミュータント血清アルブミンをコードすることができる核酸配列。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸配列に機能的にリンクしたプロモーターからなる発現カセット。
【請求項１３】
先行するいずれかの請求項に記載のミュータント血清アルブミン、核酸配列または発現カセット及びそれらの医薬上許容される担体からなる医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のミュータント血清アルブミン、核酸配列または発現カセットからなる細胞培養液。
【請求項１５】
細胞接着及び／または細胞発育特性へ影響を及ぼすための細胞培養における請求項１〜１２のいずれか１項に記載のミュータント血清アルブミン、核酸あるいは発現カセットの使用。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のミュータント血清アルブミンの存在下、細胞培養における培養細胞工程からなる細胞培養における細胞の発育特性を改変する方法。
【請求項１７】
下記の工程からなるミュータントが誘導された天然アルブミンに関して金属結合親和力および／または他の生理学的特性の改変を示すミュータント血清アルブミンを得る方法：
ａ）核アルブミンポリペプチドをコードする核酸配列を用意する工程；
ｂ）前記核酸を改変し、前記改変核酸配列が前記天然アルブミンに関して少なくとも１つの突然変異からなるミュータントアルブミンポリペプチドをコードするように前記核酸に対する突然変異誘発反応を実施する工程；
ｃ）前記上記ミュータントアルブミンポリペプチドの発現および前記ミュータントアルブミンが金属結合および／または他の生理学的特性の改変を示すか否かを検出する工程。
【請求項１８】
ミュータントアルブミンが表１に示される残基X1〜X11に対する少なくとも１ヶ所の突然変異からなる請求項１７に記載の方法。
【請求項１】
ミュータントの由来となった天然アルブミンに関して金属結合親和力および／または他の生理学的特性の改変を示すように突然変異を生じた単離されたミュータント血清アルブミン。
【請求項２】
他の生理学的特性が、培養における基質に対する細胞接着、細胞の生存力の百分率および／あるいは細胞の発育における変化である請求項１に記載のミュータント。
【請求項３】
実質的に以下のアミノ酸配列（配列番号１）からなる単離されたミュータントヒト血清アルブミン：
DahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqX5lqqcpfedhvkLvnevtefaktcvadesaencdkslX1tlfgdklctvatlretygemadccakqeperx2X8cfX6qhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrX9pyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvX10TEccX3X7X4llecaddradlakyicenqdsissklkeccekplleksX11ciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpdysvvlllrlaktyettlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasqaalgl
（上記配列中、X1はＨ以外；X2はＮ以外、X3はＨ以外、X4はＤ以外；X5はＹ以外；X6はＬ以外；X7はＧ以外、X8はＥ以外、X9はＨ以外、X10はＨ以外およびX11はＨ以外であり、前記ミュータントは天然ヒト血清アルブミンに関して金属結合親和力の改変を示す）。
【請求項４】
ミュータントが誘導される天然配列に関して上記ミュータント血清アルブミンが金属結合親和力または他の生理学的特性の改変を示すように灰色の濃淡により識別された残基の少なくとも１つが突然変異した実質上表１に示される配列の１つからなる単離された哺乳類のミュータント血清アルブミン。
【請求項５】
ミュータントが誘導される天然配列と少なくとも９０％同一である請求項３または４に記載の単離されたミュータント血清アルブミン。
【請求項６】
それが誘導される天然血清アルブミンに関して全体の折りたたみが実質上同様のものである先行する請求項に記載のミュータント血清アルブミン。
【請求項７】
金属結合親和力の改変が金属結合親和力の減少または増強である先行する請求項に記載のミュータント血清アルブミン。
【請求項８】
金属が亜鉛である先行する請求項に記載のミュータント。
【請求項９】
最後に以下の突然変異の１つからなる請求項３〜８のいずれか１つに記載のミュータント：
X1：A, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, C, D, E
X2：A, F, G, I, K, L, P, Q, R, S, T, V, W, Y, C, D E, H
X3：A, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, C, D, E
X4：A, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, C, E, H
X5：C, D, E, H
X6：C, D, E, H
X7：C, D, E, H
X8：A, C, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X9：A, D, E, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X10：A, D, E, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X11：A, D, E, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
【請求項１０】
X1,X2,X3あるいはX4の少なくとも１つの突然変異からなる請求項３〜８のいずれか１つに記載のミュータント。
【請求項１１】
突然変異体Ａｓｎ９９Ｈｉｓ、Ａｓｎ９９ＡｓｐまたはＨｉｓ６７Ａｌａからなるミュータントヒト血清アルブミン。
【請求項１２】
先行する請求項に記載のミュータント血清アルブミンをコードすることができる核酸配列。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸配列に機能的にリンクしたプロモーターからなる発現カセット。
【請求項１４】
先行する請求項に記載のミュータント血清アルブミン、核酸配列または発現カセット及びその医薬上許容される担体からなる医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１つに記載のミュータント血清アルブミン、核酸配列または発現カセットからなる細胞培養液。
【請求項１６】
細胞接着および／または細胞発育特性へ影響を及ぼすための細胞培養における請求項１〜１３のいずれか１つに記載のミュータント血清アルブミン、核酸あるいは発現カセットの使用。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか１つに記載のミュータント血清アルブミンの存在下細胞培養における培養細胞工程からなる細胞培養における細胞の発育特性を改変する方法。
【請求項１８】
下記の工程からなるミュータントが誘導された天然アルブミンに関して金属結合親和力および／または他の生理学的特性の改変を示すミュータント血清アルブミンを得る方法：
ａ）核アルブミンポリペプチドをコードする核酸配列を用意する工程；
ｂ）前記核酸を改変し、前記改変核酸配列が前記天然アルブミンに関して少なくとも１つの突然変異からなるミュータントアルブミンポリペプチドをコードするように前記核酸に対する突然変異誘発反応を実施する工程；
ｃ）前記上記ミュータントアルブミンポリペプチドの発現および前記ュータントアルブミンが金属結合および／または他の生理学的特性の改変を示すか否かを検出する工程。
【請求項１９】
ミュータントアルブミンが表１に示される残基X1〜X11に対する少なくとも１ヶ所の突然変異からなる請求項１８に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に以下のアミノ酸配列（配列番号１）からなる単離されたミュータントヒト血清アルブミン：
DahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqX5lqqcpfedhvkLvnevtefaktcvadesaencdkslX1tlfgdklctvatlretygemadccakqeperx2X8cfX6qhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrX9pyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvX10TEccX3X7X4llecaddradlakyicenqdsissklkeccekplleksX11ciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpdysvvlllrlaktyettlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasqaalgl
（上記配列中、X1はＨ以外；X2はＮ以外、X3はＨ以外、X4はＤ以外；X5はＹ以外；X6はＬ以外；X7はＧ以外、X8はＥ以外、X9はＨ以外、X10はＨ以外およびX11はＨ以外であり、前記ミュータントは天然ヒト血清アルブミンに関して金属結合親和力の改変を示す）。
【請求項２】
他の生理学的特性が培養における基質に対する細胞接着、細胞の生存力の百分率および／またはは細胞の成育における変化であ請求項１に記載のミュータント。
【請求項３】
ミュータントが誘導される天然配列に関して上記ミュータント血清アルブミンが金属結合親和力または他の生理学的特性の改変を示すように灰色の濃淡により識別された残基の少なくとも１つが突然変異した実質上表１に示される配列の１つからなる単離された哺乳類のミュータント血清アルブミン。
【請求項４】
ミュータントが誘導される天然配列と少なくとも９０％同一である先行するいずれかの請求項に記載の単離されたミュータント血清アルブミン。
【請求項５】
それが誘導される天然血清アルブミンに関して全体の折りたたみが実質上同様のものである先行するいずれかの請求項に記載のミュータント血清アルブミン。
【請求項６】
金属結合親和力の改変が金属結合親和力の減少または増強である先行するいずれかの請求項に記載のミュータント血清アルブミン。
【請求項７】
金属が亜鉛である先行するいずれかの請求項に記載のミュータント。
【請求項８】
最後に以下の突然変異の１つからなる先行するいずれかの請求項に記載のミュータント：
X1：A, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, C, D, E
X2：A, F, G, I, K, L, P, Q, R, S, T, V, W, Y, C, D E, H
X3：A, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, C, D, E
X4：A, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, C, E, H
X5：C, D, E, H
X6：C, D, E, H
X7：C, D, E, H
X8：A, C, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X9：A, D, E, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X10：A, D, E, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
X11：A, D, E, F, G, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y
【請求項９】
X1, X2, X3あるいはX4の少なくとも１つの突然変異からなる先行するいずれかの請求項に記載のミュータント。
【請求項１０】
突然変異体Ａｓｎ９９Ｈｉｓ、Ａｓｎ９９ＡｓｐまたはＨｉｓ６７Ａｌａからなるミュータントヒト血清アルブミン。
【請求項１１】
先行するいずれかの請求項に記載のミュータント血清アルブミンをコードすることができる核酸配列。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸配列に機能的にリンクしたプロモーターからなる発現カセット。
【請求項１３】
先行するいずれかの請求項に記載のミュータント血清アルブミン、核酸配列または発現カセット及びそれらの医薬上許容される担体からなる医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のミュータント血清アルブミン、核酸配列または発現カセットからなる細胞培養液。
【請求項１５】
細胞接着及び／または細胞発育特性へ影響を及ぼすための細胞培養における請求項１〜１２のいずれか１項に記載のミュータント血清アルブミン、核酸あるいは発現カセットの使用。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のミュータント血清アルブミンの存在下、細胞培養における培養細胞工程からなる細胞培養における細胞の発育特性を改変する方法。
【請求項１７】
下記の工程からなるミュータントが誘導された天然アルブミンに関して金属結合親和力および／または他の生理学的特性の改変を示すミュータント血清アルブミンを得る方法：
ａ）核アルブミンポリペプチドをコードする核酸配列を用意する工程；
ｂ）前記核酸を改変し、前記改変核酸配列が前記天然アルブミンに関して少なくとも１つの突然変異からなるミュータントアルブミンポリペプチドをコードするように前記核酸に対する突然変異誘発反応を実施する工程；
ｃ）前記上記ミュータントアルブミンポリペプチドの発現および前記ミュータントアルブミンが金属結合および／または他の生理学的特性の改変を示すか否かを検出する工程。
【請求項１８】
ミュータントアルブミンが表１に示される残基X1〜X11に対する少なくとも１ヶ所の突然変異からなる請求項１７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３（ａ）】
【図３（ｂ）】
【図３（ｃ）】
【図３（ｄ）】
【図３（ｅ）】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７（ａ）】
【図１７（ｂ）】
【図１８（ａ）】
【図１８（ｂ）】
【図１８（ｃ）】
【図１８（ｄ）】
【図１９】
【図２】
【図３（ａ）】
【図３（ｂ）】
【図３（ｃ）】
【図３（ｄ）】
【図３（ｅ）】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７（ａ）】
【図１７（ｂ）】
【図１８（ａ）】
【図１８（ｂ）】
【図１８（ｃ）】
【図１８（ｄ）】
【図１９】
【公表番号】特表２００６−５１５１５６（Ｐ２００６−５１５１５６Ａ）
【公表日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５２３９４１（Ｐ２００４−５２３９４１）
【出願日】平成１５年７月２８日（２００３．７．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００３１９９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１１４９９
【国際公開日】平成１６年２月５日（２００４．２．５）
【出願人】（５０５０６６３４９）ユニバーシティ・コート・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・エディンバラ (6)
【出願人】（５０５０６６３５０）デルタ・バイオテクノロジー・リミテイッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年７月２８日（２００３．７．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００３１９９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１１４９９
【国際公開日】平成１６年２月５日（２００４．２．５）
【出願人】（５０５０６６３４９）ユニバーシティ・コート・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・エディンバラ (6)
【出願人】（５０５０６６３５０）デルタ・バイオテクノロジー・リミテイッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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