新規なオピオイド活性ペプチド、新規な抗不安ペプチド
【課題】ストレスが原因の不安症や疼痛の改善に有用な、ダイズ蛋白質由来の機能性ペプチドを得ることが本発明の課題である。
【解決手段】本発明により新規ペプチドであるＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（ＹＰＦＶＶ）が与えられ、そのペプチドの抗不安活性を利用して新たな抗不安剤を開発することも可能である。更に本発明により新規ペプチドであるＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（ＹＰＦＶＶＮＡ）が与えられ、そのペプチドのオピオイド活性を利用して新たな鎮痛剤を開発することが可能である。
【解決手段】本発明により新規ペプチドであるＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（ＹＰＦＶＶ）が与えられ、そのペプチドの抗不安活性を利用して新たな抗不安剤を開発することも可能である。更に本発明により新規ペプチドであるＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（ＹＰＦＶＶＮＡ）が与えられ、そのペプチドのオピオイド活性を利用して新たな鎮痛剤を開発することが可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌで表される新規ペプチド、および該ペプチドを有効成分として含有する抗不安剤に関する。更に本発明はＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａで表される新規ペプチド、および該ペプチドを有効成分として含有する鎮痛剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
オピオイド活性を有するペプチド（いわゆるオピオイドペプチド）であるβ-カゾモルフィン４を、カゼインペプトンから単離したことが報告された。これは食品蛋白質から生理活性ペプチドが派生するという最初の例である（Brandl,V. et al.,Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.,360,1211-1216(1979)）。また本発明者らは人乳β-カゼインの部分的な一次配列を決定し、その中に牛乳β-カゾモルフィンに類似した配列であるＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏを見出した。なおこの配列は、決定された人乳β-カゼインの全一次構造の第５１−５８残基に相当する。そして本発明者らは人乳β-カゼインのＴｙｒ51をＮ末端にもつ種々の長さのペプチドを化学合成し、オピオイド受容体に対するそれらの評価を行なったことを報告している（食品・医薬分野における蛋白質テーラリング、学会出版センター発行、R.E.フィニー、J.R.ウィテーカー編、p101-105）。
【０００３】
しかしながら、人乳カゼイン由来のペプチドを大量に調製することは困難である。そこで本発明者らは食品蛋白質の一次構造データベース中でヒトβ-カゾモルフィン４（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ：ＹＰＦＶ）配列について検索を行なったところ、該配列がダイズβ-コングリシニンのβ-サブユニット中に存在することを見出した。
【０００４】
ところでダイズおよびダイズの加工食品はわが国の伝統食品として多く食されており、ダイズに含有される成分の生理活性に関する研究が行なわれている。しかし、ダイズ蛋白質又はその酵素分解物であるペプチドが脳機能に及ぼす影響についての報告はまだ少ない。ダイズおよびその加工食品が多く食されている現状を考えると、ダイズ由来の蛋白質又はペプチドの脳機能調節作用について検討することは非常に意義が大きいと考えられる。そしてそのような検討の一環として近年ダイズ蛋白質を摂取することにより、ヒトの精神的なストレスが緩和されたり、学習や記憶などの脳の高次機能の向上に資することが知られている（畠山英子ら、大豆たん白質研究、Vol.6,147-152(2003)）。
【０００５】
【非特許文献１】Brandl, V. et al.,Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.,360,1211-1216(1979)
【非特許文献２】食品・医薬分野における蛋白質テーラリング、学会出版センター発行、R.E.フィニー、J.R.ウィテーカー編、p101-105
【非特許文献３】畠山英子ら、大豆たん白質研究、Vol.6,147-152(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ダイズ由来の新たな生理活性ペプチドを得ることの需要は未だにある。そこでＹＰＦＶ配列を基にしてその誘導体である新規ペプチドを取得し、その生理活性を検討することにより、疼痛の改善やストレスが原因の不安症などに有用な、ダイズ蛋白質由来の新規な機能性ペプチドを得ることが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで上記課題を解決するべく、本発明者らはＹＰＦＶ配列を含むＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（ＹＰＦＶＶ）からなる新規ペプチド、およびＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（ＹＰＦＶＶＮＡ）からなる新規ペプチドを合成し、それらのペプチドの生理活性についても検討した。その結果本発明者らは、ＹＰＦＶＶＮＡがオピオイド活性を有することと、ＹＰＦＶＶが抗不安活性を有することを見出した。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の新規ペプチドであるＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（ＹＰＦＶＶ）は抗不安活性を有している。また本発明の新規ペプチドであるＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（ＹＰＦＶＶＮＡ）はオピオイド活性を有している。本発明により得られた生理活性ペプチドは、ダイズのコングリシニンの酵素分解によって得られるので、容易に大量に取得できるという利点を有する。またＹＰＦＶＶの抗不安活性は腹腔内投与のみならず経口投与をした場合でも認められたので、ＹＰＦＶＶは経口投与が可能な抗不安薬となり得るという利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌで表される新規ペプチドを提供するものである。Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌで表されるペプチドは抗不安活性を有するので、本発明により当該ペプチドを有効成分として含有する抗不安剤が提供される。また当該ペプチドを用いて不安を緩和する方法も本発明の範囲内である。なお下記の実施例で示すように、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌで表されるペプチドはオピオイド活性も有していた。
【００１０】
更に本発明は、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａで表される新規ペプチドを提供するものである。Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａで表されるペプチドはオピオイド活性を有するので、本発明により当該ペプチドを有効成分として含有する鎮痛剤が提供される。また当該ペプチドを用いて疼痛を緩和する方法も本発明の範囲内である。なお上記でいうＴｙｒはチロシン、Ｐｒｏはプロリン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｖａｌはバリン、Ａｓｎはアスパラギン、Ａｌａはアラニンを示す。かかるアミノ酸はいずれもＬ−体である。
【００１１】
上記のペプチドはダイズ由来の蛋白質であるβ-コングリシニンの酵素分解によって、簡便に且つ大量に得ることができる。なおＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（以下ＹＰＦＶと記載する）からなるβ-カゾモルフィン４は人乳のβ−カゼイン由来のペプチドであるが、人乳カゼインを大量に入手することは困難である。
【００１２】
なおβ-コングリシニンの部分配列であるＶＩＰＡＡＹＰＦＶＶＮＡＴＳＮＬから、膵臓エラスターゼで消化することによりＡＹＰＦＶＶを得ることが可能であり、これを更にロイシンアミノペプチダーゼで消化したところ、本発明のＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（以下ＹＰＦＶＶと記載する）を得ることができた。そのようにして本発明者らがＹＰＦＶＶを得たところ、その収率は36.5%であった。更にＹＰＦＶＶからＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（以下ＹＰＦＶＶＮＡと記載する）を得ることも可能である。なおダイズペプチドから酵素分解によりＹＰＦＶＶを得る方法は上記において述べたものに限定されるものではない。エラスターゼ以外のエンドペプチダーゼを使用することも、ロイシンアミノペプチダーゼ以外のアミノペプチダーゼを使用することも可能である。
【００１３】
更に分離ダイズ蛋白質を上記と同様に膵臓エラスターゼおよびロイシンアミノペプチダーゼで消化することによりＹＰＦＶＶが生成することを、LC/MS（液体クロマトグラフィー質量分析）により確認した。なお原料中のβ-コングリシニンβ-サブユニットの含量が不明であるために収率の計算はできなかった。
【００１４】
また本発明のペプチドは、ペプチド合成法で取得することもできる。即ち、ペプチド合成に通常用いられる方法である液相法または固相法で、ペプチド結合の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料とを、2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate（ＨＢＴＵ）等の活性エステルを用いた方法や、カルボジイミドを用いた方法等を用いて縮合させることができる。生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去することによっても製造し得る。
【００１５】
この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ），ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボニル、９ーフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が挙げられる。カルボキシル基の保護剤としては例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性エステルを用いて実施する。
【００１６】
縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。合成したペプチドの合成はエドマン分解法でＣ−末端からアミノ酸配列を読み取るプロティンシークエンサー、ＧＣ−ＭＳ等で分析される。
【００１７】
次に医薬品として用いる場合について説明する。本発明のペプチドであるＹＰＦＶＶＮＡはオピオイド活性を有するので、そのペプチドを鎮痛剤として用いることができる。
【００１８】
現在オピオイド活性を有する化合物はいくつも知られているが、代表的な化合物としてはモルヒネやコデインなどのアヘンアルカロイドを挙げることができる。これらの物質は麻薬性鎮痛物質（オピエート）ともいわれ、オピオイド受容体を認識して結合し、中枢神経系を介して強力な鎮痛効果を発揮するために、末梢に作用する解熱性鎮痛薬では抑えられない痛みを抑えることができる。そのためにオピオイド活性を有する化合物の臨床的な意義は大きい。
【００１９】
また脳内にはオピエートを認識する受容体（オピオイド受容体）があることが見出されている。そして、そのオピオイド受容体に対する内因性リガンドとして、エンケファリン、ダイノルフィン、β-エンドルフィンなどのオピオイドペプチドが存在することが知られている。本発明のＹＰＦＶＶＮＡはペプチドであり、脳内麻薬といわれているオピオイドペプチドと同じくペプチド性のオピオイド活性物質が本発明により提供されるので、本発明のペプチドは副作用の少ない鎮痛剤となり得る。
【００２０】
またＹＰＦＶＶは抗不安活性を有するので、そのペプチドを抗不安剤として用いることもできる。現在医薬品として市販されている主要な抗不安剤はベンゾジアゼピン系誘導体の物質である。これらのベンゾジアゼピン系誘導体の抗不安剤は安全性が高く、優れた性質を有する薬物であるが、抗痙攣作用、筋弛緩作用、鎮静催眠作用や麻酔増強作用などの薬理作用を同時に有する。そこでベンゾジアゼピン系誘導体以外に、穏やかでかつ安全性が高く、経口で手軽に服用することができる抗不安剤を求める需要は未だに大きい。それを考えると、食品であるダイズに由来し且つ経口投与で有効であるという特徴を有する、本発明により提供される抗不安剤の意義は大きい。
【００２１】
本発明のペプチドの投与経路は特に限定されるものではなく、経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれを採用することも可能であり、経口的あるいは非経口的に投与することができる。本ペプチドの投与量は化合物の種類、投与方法、投与される者の状態や年齢等により異なるが、１日あたり通常は０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。本発明のペプチドは通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。
【００２２】
具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
【００２３】
剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解または懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００２４】
これらの製剤は、本発明のペプチドを０．０１％〜１００重量％、好ましくは１〜９０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００２５】
経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分例えば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま或いはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま或いはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。
【００２６】
経口投与用の液状製剤を製造するには、有効成分と白糖、ソルビトール、グリセリンなどの甘味剤とを水に溶解して透明なシロップ剤、更に精油、エタノールなどを加えてエリキシル剤とするか、アラビアゴム、トラガント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを加えて乳剤又は懸濁剤としてもよい。これらの液状製剤には所望により矯味剤、着色剤、保存剤などを加えてもよい。
【００２７】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ぶどう糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
【００２８】
直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。
【００２９】
皮膚用外用剤を製造するには、有効成分を白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどに加えて必要ならば加湿して練合し軟膏剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体などの粘着剤と練合した後ポリアルキルなどの不織布に展延してテープ剤とする。
【実施例】
【００３０】
次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。しかし下記の実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００３１】
まずβ−コングリシニン中に含まれているＹＰＦＶ、ＹＰＦＶＶ、ＹＰＦＶＶＮＡをペプチド合成により取得した。そしてそれらのオピオイド活性をモルモット回腸アッセイの系で測定した。
【００３２】
（モルモット回腸アッセイ）
モルモット回腸縦走筋を剥離すると、Auerbach神経叢が付随した形で得られる。このようにして得られた縦走筋神経叢標本はオピオイドに対して丸ごとの回腸よりも高い感度を示す。この標本を栄養液中に吊るして電気刺激を与えると、神経終末からアセチルコリンが放出され、平滑筋は収縮する。オピオイドアゴニストは電気刺激によるアセチルコリンの放出を阻害して収縮の抑制を抑制するので、かかるモルモット回腸の収縮を検出することによってオピオイド活性を評価するのが、モルモット回腸アッセイの系である。
【００３３】
モルモット回腸アッセイにおいては、まずモルモットを屠殺してその回腸を摘出し、縦走筋標本の一方を支持棒に、もう一方についてはリングを介してトランスジューサーに接続する。そしてその標本を、栄養液を満たしたマグヌス管にセットする。標本に電気刺激を与えて収縮させ、その電気刺激による収縮が安定したらオピオイド活性を評価する対象である薬物を添加し、平滑筋の収縮による張力の変化からその薬物のオピオイド活性を検出する。なお張力の変化はトランスジューサーによって電気信号に変換されてレコーダーに記録される。モルモット回腸アッセイは本技術分野で繁用されている方法であり、その詳細は例えば川岸舜朗編著、学会出版センター、生物化学実験法３８「食品中の生体機能調節物質研究法」p99-116などに記載されている。
【００３４】
（結果）
上記のモルモット回腸アッセイの系を用いて以下の５つのペプチドについてオピオイド活性を評価し、それらのペプチドのオピオイド活性についてIC50値を求めた。その結果を表１に示す。
（１）ＹＰＦＶ（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）
（２）ＹＰＦＶＶ（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ）
（３）ＹＰＦＶＶＮＡ（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ）
（４）人乳β-カゾモルフィン５（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ）
（５）人乳β-カゾモルフィン７（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ）
【００３５】
【表１】
【００３６】
表１に示されるように、ＹＰＦＶのIC50は20μM、ＹＰＦＶＶのIC50は8μM、ＹＰＦＶＶＮＡのIC50は3μM、人乳β-カゾモルフィン５のIC50は14μM、人乳β-カゾモルフィン７のIC50は25μMであった。よってＹＰＦＶＶのオピオイド活性はＹＰＦＶ（人乳β-カゾモルフィン４）の2.5倍であり、また人乳β-カゾモルフィン５の1.8倍であった。そしてＹＰＦＶＶＮＡのオピオイド活性は更に強かった。この結果により、本発明のペプチドであるＹＰＦＶＶとＹＰＦＶＶＮＡの両者は、いずれも強いオピオイド活性を有することが示された。
【００３７】
（高架十字迷路実験）
高架十字迷路（Eleveted plus maze：EPM）は、２つのオープンアーム（24x5x0.5）と２つのクローズアーム（24x5x13）からなり、それらのアームは床から50cm高くなった中央プラットフォームと結合している。高い位置にあるにも関わらず、クローズアームの周りには囲いがあるために、マウスは安全に歩行する事ができる。一方オープンアームの周囲は開放されていて囲いがないために、オープンアームを歩行するマウスは高い位置から転落するという不安感を感じる。そのために、マウスがオープンアームにいる時間が長いほどマウスの不安感は緩和されており、抗不安活性の指標となる。
【００３８】
オープンアームの一つに面している中央プラットフォーム上にマウスを置いて試験を開始した。５分の試験時間の間、オープンアーム内で過ごした累積時間を記録した。オープンアーム内で過ごした時間のパーセンテージを不安の指標として計算した。
【００３９】
（統計解析）
高架十字迷路試験で得たデータを、平均とSEMで表した。データを１方向または２方向ANOVAにより解析し、引き続いて多重比較のためのダネット試験を行った。
【００４０】
（結果）
生理食塩水溶水に溶解したＹＰＦＶＶを、マウスを高架十字迷路上に置く前に腹腔内投与（i.p）した（n=12）。そしてＹＰＦＶＶの投与群（3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg）と非投与群（0mg/kg）において、オープンアーム内で過ごした時間のパーセンテージを比較した。その結果を図１に示す。図１に示されるように、ＹＰＦＶＶを3mg/kgまたは10mg/kg腹腔内投与投与した群ではオープンアーム内で過ごした時間が有意に（*はp<0.05の有意差、**はp<0.01の有意差を示す）増加した。この結果は、ＹＰＦＶＶが腹腔内投与で抗不安活性を有することを示すものである。
【００４１】
更にマウスを高架十字迷路上に置く３０分前に、生理食塩水に溶解したＹＰＦＶＶを経口投与（p.o）した（n=12）。そしてオープンアーム内で過ごした時間のパーセンテージを、ＹＰＦＶＶの投与群（10mg/kg、30mg/kgおよび100mg/kg）と非投与群（0mg/kg）で比較した。その結果を図２に示す。図２に示されるように、ＹＰＦＶＶを10mg/kgまたは30mg/kgの用量で経口投与した群では、オープンアーム内で過ごした時間が有意に増加した（***はP<0.001の有意差を示す）。この結果は、ＹＰＦＶＶが経口投与でも抗不安活性を有することを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の新規ペプチドであるＹＰＦＶＶは抗不安活性を有しているので、当該ペプチドを有効成分と含有する抗不安剤を得ることが可能である。ＹＰＦＶＶの抗不安活性は経口投与でも認められたので、ＹＰＦＶＶは経口投与が可能な抗不安薬となり得るという利点を有する。更に本発明の新規ペプチドであるＹＰＦＶＶＮＡはオピオイド活性を有しているので、当該ペプチドを有効成分として含有する鎮痛剤を得ることも可能である。本発明により得られた生理活性ペプチドは、ダイズのコングリシニンの酵素分解によって大量に得ることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１はＹＰＦＶＶをマウスに腹腔内投与した際の抗不安作用を示すグラフである。
【図２】図２はＹＰＦＶＶをマウスに経口投与した際の抗不安作用を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明はＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌで表される新規ペプチド、および該ペプチドを有効成分として含有する抗不安剤に関する。更に本発明はＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａで表される新規ペプチド、および該ペプチドを有効成分として含有する鎮痛剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
オピオイド活性を有するペプチド（いわゆるオピオイドペプチド）であるβ-カゾモルフィン４を、カゼインペプトンから単離したことが報告された。これは食品蛋白質から生理活性ペプチドが派生するという最初の例である（Brandl,V. et al.,Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.,360,1211-1216(1979)）。また本発明者らは人乳β-カゼインの部分的な一次配列を決定し、その中に牛乳β-カゾモルフィンに類似した配列であるＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏを見出した。なおこの配列は、決定された人乳β-カゼインの全一次構造の第５１−５８残基に相当する。そして本発明者らは人乳β-カゼインのＴｙｒ51をＮ末端にもつ種々の長さのペプチドを化学合成し、オピオイド受容体に対するそれらの評価を行なったことを報告している（食品・医薬分野における蛋白質テーラリング、学会出版センター発行、R.E.フィニー、J.R.ウィテーカー編、p101-105）。
【０００３】
しかしながら、人乳カゼイン由来のペプチドを大量に調製することは困難である。そこで本発明者らは食品蛋白質の一次構造データベース中でヒトβ-カゾモルフィン４（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ：ＹＰＦＶ）配列について検索を行なったところ、該配列がダイズβ-コングリシニンのβ-サブユニット中に存在することを見出した。
【０００４】
ところでダイズおよびダイズの加工食品はわが国の伝統食品として多く食されており、ダイズに含有される成分の生理活性に関する研究が行なわれている。しかし、ダイズ蛋白質又はその酵素分解物であるペプチドが脳機能に及ぼす影響についての報告はまだ少ない。ダイズおよびその加工食品が多く食されている現状を考えると、ダイズ由来の蛋白質又はペプチドの脳機能調節作用について検討することは非常に意義が大きいと考えられる。そしてそのような検討の一環として近年ダイズ蛋白質を摂取することにより、ヒトの精神的なストレスが緩和されたり、学習や記憶などの脳の高次機能の向上に資することが知られている（畠山英子ら、大豆たん白質研究、Vol.6,147-152(2003)）。
【０００５】
【非特許文献１】Brandl, V. et al.,Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.,360,1211-1216(1979)
【非特許文献２】食品・医薬分野における蛋白質テーラリング、学会出版センター発行、R.E.フィニー、J.R.ウィテーカー編、p101-105
【非特許文献３】畠山英子ら、大豆たん白質研究、Vol.6,147-152(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ダイズ由来の新たな生理活性ペプチドを得ることの需要は未だにある。そこでＹＰＦＶ配列を基にしてその誘導体である新規ペプチドを取得し、その生理活性を検討することにより、疼痛の改善やストレスが原因の不安症などに有用な、ダイズ蛋白質由来の新規な機能性ペプチドを得ることが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで上記課題を解決するべく、本発明者らはＹＰＦＶ配列を含むＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（ＹＰＦＶＶ）からなる新規ペプチド、およびＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（ＹＰＦＶＶＮＡ）からなる新規ペプチドを合成し、それらのペプチドの生理活性についても検討した。その結果本発明者らは、ＹＰＦＶＶＮＡがオピオイド活性を有することと、ＹＰＦＶＶが抗不安活性を有することを見出した。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の新規ペプチドであるＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（ＹＰＦＶＶ）は抗不安活性を有している。また本発明の新規ペプチドであるＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（ＹＰＦＶＶＮＡ）はオピオイド活性を有している。本発明により得られた生理活性ペプチドは、ダイズのコングリシニンの酵素分解によって得られるので、容易に大量に取得できるという利点を有する。またＹＰＦＶＶの抗不安活性は腹腔内投与のみならず経口投与をした場合でも認められたので、ＹＰＦＶＶは経口投与が可能な抗不安薬となり得るという利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌで表される新規ペプチドを提供するものである。Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌで表されるペプチドは抗不安活性を有するので、本発明により当該ペプチドを有効成分として含有する抗不安剤が提供される。また当該ペプチドを用いて不安を緩和する方法も本発明の範囲内である。なお下記の実施例で示すように、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌで表されるペプチドはオピオイド活性も有していた。
【００１０】
更に本発明は、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａで表される新規ペプチドを提供するものである。Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａで表されるペプチドはオピオイド活性を有するので、本発明により当該ペプチドを有効成分として含有する鎮痛剤が提供される。また当該ペプチドを用いて疼痛を緩和する方法も本発明の範囲内である。なお上記でいうＴｙｒはチロシン、Ｐｒｏはプロリン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｖａｌはバリン、Ａｓｎはアスパラギン、Ａｌａはアラニンを示す。かかるアミノ酸はいずれもＬ−体である。
【００１１】
上記のペプチドはダイズ由来の蛋白質であるβ-コングリシニンの酵素分解によって、簡便に且つ大量に得ることができる。なおＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（以下ＹＰＦＶと記載する）からなるβ-カゾモルフィン４は人乳のβ−カゼイン由来のペプチドであるが、人乳カゼインを大量に入手することは困難である。
【００１２】
なおβ-コングリシニンの部分配列であるＶＩＰＡＡＹＰＦＶＶＮＡＴＳＮＬから、膵臓エラスターゼで消化することによりＡＹＰＦＶＶを得ることが可能であり、これを更にロイシンアミノペプチダーゼで消化したところ、本発明のＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（以下ＹＰＦＶＶと記載する）を得ることができた。そのようにして本発明者らがＹＰＦＶＶを得たところ、その収率は36.5%であった。更にＹＰＦＶＶからＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ（以下ＹＰＦＶＶＮＡと記載する）を得ることも可能である。なおダイズペプチドから酵素分解によりＹＰＦＶＶを得る方法は上記において述べたものに限定されるものではない。エラスターゼ以外のエンドペプチダーゼを使用することも、ロイシンアミノペプチダーゼ以外のアミノペプチダーゼを使用することも可能である。
【００１３】
更に分離ダイズ蛋白質を上記と同様に膵臓エラスターゼおよびロイシンアミノペプチダーゼで消化することによりＹＰＦＶＶが生成することを、LC/MS（液体クロマトグラフィー質量分析）により確認した。なお原料中のβ-コングリシニンβ-サブユニットの含量が不明であるために収率の計算はできなかった。
【００１４】
また本発明のペプチドは、ペプチド合成法で取得することもできる。即ち、ペプチド合成に通常用いられる方法である液相法または固相法で、ペプチド結合の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料とを、2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate（ＨＢＴＵ）等の活性エステルを用いた方法や、カルボジイミドを用いた方法等を用いて縮合させることができる。生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去することによっても製造し得る。
【００１５】
この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ），ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボニル、９ーフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が挙げられる。カルボキシル基の保護剤としては例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性エステルを用いて実施する。
【００１６】
縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。合成したペプチドの合成はエドマン分解法でＣ−末端からアミノ酸配列を読み取るプロティンシークエンサー、ＧＣ−ＭＳ等で分析される。
【００１７】
次に医薬品として用いる場合について説明する。本発明のペプチドであるＹＰＦＶＶＮＡはオピオイド活性を有するので、そのペプチドを鎮痛剤として用いることができる。
【００１８】
現在オピオイド活性を有する化合物はいくつも知られているが、代表的な化合物としてはモルヒネやコデインなどのアヘンアルカロイドを挙げることができる。これらの物質は麻薬性鎮痛物質（オピエート）ともいわれ、オピオイド受容体を認識して結合し、中枢神経系を介して強力な鎮痛効果を発揮するために、末梢に作用する解熱性鎮痛薬では抑えられない痛みを抑えることができる。そのためにオピオイド活性を有する化合物の臨床的な意義は大きい。
【００１９】
また脳内にはオピエートを認識する受容体（オピオイド受容体）があることが見出されている。そして、そのオピオイド受容体に対する内因性リガンドとして、エンケファリン、ダイノルフィン、β-エンドルフィンなどのオピオイドペプチドが存在することが知られている。本発明のＹＰＦＶＶＮＡはペプチドであり、脳内麻薬といわれているオピオイドペプチドと同じくペプチド性のオピオイド活性物質が本発明により提供されるので、本発明のペプチドは副作用の少ない鎮痛剤となり得る。
【００２０】
またＹＰＦＶＶは抗不安活性を有するので、そのペプチドを抗不安剤として用いることもできる。現在医薬品として市販されている主要な抗不安剤はベンゾジアゼピン系誘導体の物質である。これらのベンゾジアゼピン系誘導体の抗不安剤は安全性が高く、優れた性質を有する薬物であるが、抗痙攣作用、筋弛緩作用、鎮静催眠作用や麻酔増強作用などの薬理作用を同時に有する。そこでベンゾジアゼピン系誘導体以外に、穏やかでかつ安全性が高く、経口で手軽に服用することができる抗不安剤を求める需要は未だに大きい。それを考えると、食品であるダイズに由来し且つ経口投与で有効であるという特徴を有する、本発明により提供される抗不安剤の意義は大きい。
【００２１】
本発明のペプチドの投与経路は特に限定されるものではなく、経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれを採用することも可能であり、経口的あるいは非経口的に投与することができる。本ペプチドの投与量は化合物の種類、投与方法、投与される者の状態や年齢等により異なるが、１日あたり通常は０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。本発明のペプチドは通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。
【００２２】
具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
【００２３】
剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解または懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００２４】
これらの製剤は、本発明のペプチドを０．０１％〜１００重量％、好ましくは１〜９０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００２５】
経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分例えば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま或いはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま或いはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。
【００２６】
経口投与用の液状製剤を製造するには、有効成分と白糖、ソルビトール、グリセリンなどの甘味剤とを水に溶解して透明なシロップ剤、更に精油、エタノールなどを加えてエリキシル剤とするか、アラビアゴム、トラガント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを加えて乳剤又は懸濁剤としてもよい。これらの液状製剤には所望により矯味剤、着色剤、保存剤などを加えてもよい。
【００２７】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ぶどう糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
【００２８】
直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。
【００２９】
皮膚用外用剤を製造するには、有効成分を白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどに加えて必要ならば加湿して練合し軟膏剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体などの粘着剤と練合した後ポリアルキルなどの不織布に展延してテープ剤とする。
【実施例】
【００３０】
次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。しかし下記の実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００３１】
まずβ−コングリシニン中に含まれているＹＰＦＶ、ＹＰＦＶＶ、ＹＰＦＶＶＮＡをペプチド合成により取得した。そしてそれらのオピオイド活性をモルモット回腸アッセイの系で測定した。
【００３２】
（モルモット回腸アッセイ）
モルモット回腸縦走筋を剥離すると、Auerbach神経叢が付随した形で得られる。このようにして得られた縦走筋神経叢標本はオピオイドに対して丸ごとの回腸よりも高い感度を示す。この標本を栄養液中に吊るして電気刺激を与えると、神経終末からアセチルコリンが放出され、平滑筋は収縮する。オピオイドアゴニストは電気刺激によるアセチルコリンの放出を阻害して収縮の抑制を抑制するので、かかるモルモット回腸の収縮を検出することによってオピオイド活性を評価するのが、モルモット回腸アッセイの系である。
【００３３】
モルモット回腸アッセイにおいては、まずモルモットを屠殺してその回腸を摘出し、縦走筋標本の一方を支持棒に、もう一方についてはリングを介してトランスジューサーに接続する。そしてその標本を、栄養液を満たしたマグヌス管にセットする。標本に電気刺激を与えて収縮させ、その電気刺激による収縮が安定したらオピオイド活性を評価する対象である薬物を添加し、平滑筋の収縮による張力の変化からその薬物のオピオイド活性を検出する。なお張力の変化はトランスジューサーによって電気信号に変換されてレコーダーに記録される。モルモット回腸アッセイは本技術分野で繁用されている方法であり、その詳細は例えば川岸舜朗編著、学会出版センター、生物化学実験法３８「食品中の生体機能調節物質研究法」p99-116などに記載されている。
【００３４】
（結果）
上記のモルモット回腸アッセイの系を用いて以下の５つのペプチドについてオピオイド活性を評価し、それらのペプチドのオピオイド活性についてIC50値を求めた。その結果を表１に示す。
（１）ＹＰＦＶ（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）
（２）ＹＰＦＶＶ（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ）
（３）ＹＰＦＶＶＮＡ（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ）
（４）人乳β-カゾモルフィン５（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ）
（５）人乳β-カゾモルフィン７（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ）
【００３５】
【表１】
【００３６】
表１に示されるように、ＹＰＦＶのIC50は20μM、ＹＰＦＶＶのIC50は8μM、ＹＰＦＶＶＮＡのIC50は3μM、人乳β-カゾモルフィン５のIC50は14μM、人乳β-カゾモルフィン７のIC50は25μMであった。よってＹＰＦＶＶのオピオイド活性はＹＰＦＶ（人乳β-カゾモルフィン４）の2.5倍であり、また人乳β-カゾモルフィン５の1.8倍であった。そしてＹＰＦＶＶＮＡのオピオイド活性は更に強かった。この結果により、本発明のペプチドであるＹＰＦＶＶとＹＰＦＶＶＮＡの両者は、いずれも強いオピオイド活性を有することが示された。
【００３７】
（高架十字迷路実験）
高架十字迷路（Eleveted plus maze：EPM）は、２つのオープンアーム（24x5x0.5）と２つのクローズアーム（24x5x13）からなり、それらのアームは床から50cm高くなった中央プラットフォームと結合している。高い位置にあるにも関わらず、クローズアームの周りには囲いがあるために、マウスは安全に歩行する事ができる。一方オープンアームの周囲は開放されていて囲いがないために、オープンアームを歩行するマウスは高い位置から転落するという不安感を感じる。そのために、マウスがオープンアームにいる時間が長いほどマウスの不安感は緩和されており、抗不安活性の指標となる。
【００３８】
オープンアームの一つに面している中央プラットフォーム上にマウスを置いて試験を開始した。５分の試験時間の間、オープンアーム内で過ごした累積時間を記録した。オープンアーム内で過ごした時間のパーセンテージを不安の指標として計算した。
【００３９】
（統計解析）
高架十字迷路試験で得たデータを、平均とSEMで表した。データを１方向または２方向ANOVAにより解析し、引き続いて多重比較のためのダネット試験を行った。
【００４０】
（結果）
生理食塩水溶水に溶解したＹＰＦＶＶを、マウスを高架十字迷路上に置く前に腹腔内投与（i.p）した（n=12）。そしてＹＰＦＶＶの投与群（3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg）と非投与群（0mg/kg）において、オープンアーム内で過ごした時間のパーセンテージを比較した。その結果を図１に示す。図１に示されるように、ＹＰＦＶＶを3mg/kgまたは10mg/kg腹腔内投与投与した群ではオープンアーム内で過ごした時間が有意に（*はp<0.05の有意差、**はp<0.01の有意差を示す）増加した。この結果は、ＹＰＦＶＶが腹腔内投与で抗不安活性を有することを示すものである。
【００４１】
更にマウスを高架十字迷路上に置く３０分前に、生理食塩水に溶解したＹＰＦＶＶを経口投与（p.o）した（n=12）。そしてオープンアーム内で過ごした時間のパーセンテージを、ＹＰＦＶＶの投与群（10mg/kg、30mg/kgおよび100mg/kg）と非投与群（0mg/kg）で比較した。その結果を図２に示す。図２に示されるように、ＹＰＦＶＶを10mg/kgまたは30mg/kgの用量で経口投与した群では、オープンアーム内で過ごした時間が有意に増加した（***はP<0.001の有意差を示す）。この結果は、ＹＰＦＶＶが経口投与でも抗不安活性を有することを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の新規ペプチドであるＹＰＦＶＶは抗不安活性を有しているので、当該ペプチドを有効成分と含有する抗不安剤を得ることが可能である。ＹＰＦＶＶの抗不安活性は経口投与でも認められたので、ＹＰＦＶＶは経口投与が可能な抗不安薬となり得るという利点を有する。更に本発明の新規ペプチドであるＹＰＦＶＶＮＡはオピオイド活性を有しているので、当該ペプチドを有効成分として含有する鎮痛剤を得ることも可能である。本発明により得られた生理活性ペプチドは、ダイズのコングリシニンの酵素分解によって大量に得ることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１はＹＰＦＶＶをマウスに腹腔内投与した際の抗不安作用を示すグラフである。
【図２】図２はＹＰＦＶＶをマウスに経口投与した際の抗不安作用を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌで表される新規ペプチド。
【請求項２】
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌで表される抗不安ペプチド。
【請求項３】
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌで表されるペプチドを有効成分として含有する抗不安剤。
【請求項４】
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌで表されるペプチドを用いて不安を緩和する方法。
【請求項５】
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａで表される新規ペプチド。
【請求項６】
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａで表されるオピオイド活性ペプチド。
【請求項７】
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａで表されるペプチドを有効成分として含有する鎮痛剤。
【請求項８】
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａで表されるペプチドを用いて疼痛を緩和する方法。
【請求項１】
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌで表される新規ペプチド。
【請求項２】
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌで表される抗不安ペプチド。
【請求項３】
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌで表されるペプチドを有効成分として含有する抗不安剤。
【請求項４】
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌで表されるペプチドを用いて不安を緩和する方法。
【請求項５】
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａで表される新規ペプチド。
【請求項６】
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａで表されるオピオイド活性ペプチド。
【請求項７】
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａで表されるペプチドを有効成分として含有する鎮痛剤。
【請求項８】
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａで表されるペプチドを用いて疼痛を緩和する方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−９１６５６（Ｐ２００７−９１６５６Ａ）
【公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２８４６０２（Ｐ２００５−２８４６０２）
【出願日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１７年度生物系特定産業技術研究支援センター「新技術・新分野創出のための基礎研究推進事業」、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの」
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１７年度生物系特定産業技術研究支援センター「新技術・新分野創出のための基礎研究推進事業」、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの」
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
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