新規なコラーゲン分解酵素とその利用
【課題】アルカリ条件下でコラーゲン分解活性の高いコラーゲン分解酵素を提供すること。
【解決手段】次の理化学的性質を有するコラーゲン分解酵素である。(1)作用：カゼイン、ゼラチン、コラーゲン、ケラチンおよびエラスチンの蛋白質を分解し、特にコラーゲンおよびゼラチンに対して強い分解作用を有する。また、合成基質であるＡＩＰＭ、ＡＡＰＦ、ＡＡＰＭ、ＡＡＰＬ、ＡＡＶＡに対して活性を有するが、ＡＡＰＶ、ＧＰＬＧＰには活性を示さない。(2)最適反応ｐＨ：ｐＨ８．５〜９．０(3)最適反応温度：４０〜５０℃、４５℃まで安定な酵素活性を有する。(4)分子量：５０，０００〜７０，０００また、特定のアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する新規なコラーゲン分解酵素である。これらは、特にコラーゲン、ゼラチンに対してアルカリ条件下で高い分解活性を有する。
【解決手段】次の理化学的性質を有するコラーゲン分解酵素である。(1)作用：カゼイン、ゼラチン、コラーゲン、ケラチンおよびエラスチンの蛋白質を分解し、特にコラーゲンおよびゼラチンに対して強い分解作用を有する。また、合成基質であるＡＩＰＭ、ＡＡＰＦ、ＡＡＰＭ、ＡＡＰＬ、ＡＡＶＡに対して活性を有するが、ＡＡＰＶ、ＧＰＬＧＰには活性を示さない。(2)最適反応ｐＨ：ｐＨ８．５〜９．０(3)最適反応温度：４０〜５０℃、４５℃まで安定な酵素活性を有する。(4)分子量：５０，０００〜７０，０００また、特定のアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する新規なコラーゲン分解酵素である。これらは、特にコラーゲン、ゼラチンに対してアルカリ条件下で高い分解活性を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なコラーゲン分解酵素、その遺伝子とその利用に関する。更に詳しくは、本発明は、アルカリモナス属細菌由来のアルカリ領域において高い活性を有する新規なコラーゲン分解酵素、その遺伝子とその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲン分解酵素やゼラチン分解酵素は工業的利用価値の高い酵素である。例えばコラーゲンのペプチド性加水分解物には、シワ取りなどの美容整形用の材料としての有用性があり、また保湿性、シワ形成予防作用、血圧降下作用等の興味深い生理活性も見いだされており（例えば、非特許文献１、２参照）、実際に、コラーゲンを低分子化したペプチドが医療や化粧品分野において多量に用いられている（例えば、特許文献１〜３参照）。また、写真用乳剤などにはゼラチンが用いられており、レントゲンや写真のフィルムのリサイクルにはゼラチン分解酵素が用いられている（例えば、特許文献４参照）。ゼラチン分解酵素は廃棄フィルムから写真資源の回収に有用である。
【０００３】
また近年、有機廃棄物の有効利用のためのバイオコンバージョン（生物学的変換）が積極的に試みられている。例えば生ゴミのコンポスト化はその好例である。動物性タンパク質の３０％以上はコラーゲンからなっており、一般家庭や食堂から出される生ゴミ、および食肉加工業において排出される廃棄物にもコラーゲンが多量に含まれている。コラーゲンはその特殊な高次構造のために一般に難溶性・難分解性であり、コンポスト化においても比較的分解の遅いタンパク質である。畜産資源の非利用部分の多くは難分解性であるため、多くは焼却処分されているのが現状である。
【０００４】
従って、コラーゲンやゼラチンを分解できるコラーゲン分解酵素の開発は非常に重要であり、これまでコラーゲン分解酵素およびコラーゲン分解酵素生産菌についての多くの報告がなされている（例えば、特許文献５〜８参照）。しかしながら、これら酵素の多くは中性から酸性域において最適反応ｐＨを示すものであり、アルカリ条件下で最適反応ｐＨを示すコラーゲン分解酵素はあまり知られていない。さらに、微生物由来のコラーゲン分解酵素の多くはコラゲナーゼと呼ばれる金属酵素であり、セリンプロテアーゼに分類されるコラーゲン分解酵素はあまり知られていない（非特許文献３）。
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−１５１８４７号公報
【特許文献２】特開２００１−２６７５３号公報
【特許文献３】特開２００５−３１４２６５号公報
【特許文献４】特開２０００−２３１１７９号公報
【特許文献５】特開２００５−２４５２８５号公報
【特許文献６】特開平８−７０８５３号公報
【特許文献７】特開２００１−１７８４５６号公報
【特許文献８】特開２００１−６１４７４号公報
【特許文献９】特表２００６−５１６８８９号公報
【非特許文献１】田中ら「バイオインダストリー」第９号、１８〜２３頁、２００５年
【非特許文献２】Kuhareら「J. Immunol」155,3653-3659,1995
【非特許文献３】Watanabe「Appl. Microbiol Biotechnol」63,520-526, 2004
【非特許文献４】（Kurataら”Int. J. Syst. Evol. Microbiol.” 57,1549-53, 2007）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、以上のようなコラーゲン分解酵素に関する現状に鑑み、アルカリ条件下で活性なコラーゲン分解酵素を提供することを目的とするものであり、アルカリ条件に最適反応ｐＨを示し、セリンプロテアーゼに分類され、公知のコラーゲン分解酵素に対してはアミノ酸配列において相同性の低い、新規なコラーゲン分解酵素ならびにこれをコードする遺伝子を提供することをその目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上述のような目的を達成するために鋭意研究を行い、コラーゲン分解酵素の生産菌を深海底土壌中よりスクリーニングした結果、新たなコラーゲン分解酵素を見出し、さらに本酵素をコードする遺伝子をクローニングすることで本発明を完成させるに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、次の理化学的性質を有する新規なコラーゲン分解酵素を提供するものである。
(1)作用：
カゼイン、ゼラチン、コラーゲン、ケラチンおよびエラスチンの蛋白質を分解し、特にコラーゲンおよびゼラチンに対して強い分解作用を有する。
また、合成基質であるN-メトキシスクシニル-Ala-Ile-Pro-Met-p-ニトロアニリド、N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド、N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Met-p-ニトロアニリド、N-グルタリル-Ala-Ala-Pro-Leu-p-ニトロアニリド、及びN-スクシニル-Ala-Ala-Val-Ala-p-ニトロアニリドに対して分解作用を有するが、N-メトキシスクシニル- Ala-Ala-Pro-Val-p-ニトロアニリド、及びN-スクシニル-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-４-メチルクマリル-７-アミドに対して分解作用を示さない。
(2)最適反応ｐＨ： ｐＨ８．５〜９．０
(3)最適反応温度は４０〜５０℃であり、４５℃まで安定な酵素活性を有する。
(4)分子量：
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、５０，０００〜７０，０００である。
(5)阻害剤
セリンプロテアーゼの阻害剤であるフェニルメチルスルフォニルフルオライドにより完全に阻害されるが、キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸では１０ｍＭ濃度で３５％の残存活性を示す。
【０００９】
また、本発明は、配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する、或いは配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、上記の新規なコラーゲン分解酵素を提供するものである。
【００１０】
また、本発明は、配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する、上記の新規なコラーゲン分解酵素を提供するものである。
【００１１】
また、本発明は、配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する、上記の新規なコラーゲン分解酵素を提供するものである。
【００１２】
また、本発明は、アルカリモナス コラゲニマリナ由来のものである、前記の新規なコラーゲン分解酵素を提供するものである。
【００１３】
また、本発明は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有する、新規なコラーゲン分解酵素前駆体を提供するものである。
【００１４】
更に、本発明は、前記の新規なコラーゲン分解酵素またはその前駆体のアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、下記（ａ）〜（ｈ）からなる群、
（ａ）配列番号３に示す成熟酵素を構成するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号３に示す成熟酵素を構成するアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号５に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号７に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号７に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号２に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、又は
（ｈ）配列番号２に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコラーゲン分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
から選ばれるコラーゲン分解酵素をコードする遺伝子を提供するものである。
【００１５】
また、本発明は、前記いずれかの遺伝子を含有する組換えベクターおよび当該ベクターにより形質転換された微生物を提供するものである。
【００１６】
更に、また、本発明は、アルカリモナス コラゲニマリナ、又は前記形質転換された微生物を培養し、その培養液よりコラーゲン分解酵素を採取することを特徴とする、前記理化学的性質又は前記アミノ酸配列を有するコラーゲン分解酵素の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の新規なコラーゲン分解酵素は、従来のコラーゲン分解酵素には見られなかったアルカリ領域において高いコラーゲン分解活性を有し、セリンプロテアーゼに分類されるものである。従って、特にアルカリ領域においてコラーゲンやゼラチンを高い活性で分解することができるという特徴ある性質を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の新規なコラーゲン分解酵素（以下、「本発明酵素」ということもある）は、次の(1)〜(5)で規定される酵素学的性質を有するものである。
【００１９】
(1)作用：
本発明酵素は、カゼイン、ゼラチン、コラーゲン、ケラチンおよびエラスチンの蛋白質を分解し、特にコラーゲンおよびゼラチンに対して強い分解作用を有する。
また、本発明酵素は、合成基質であるN-メトキシスクシニル-Ala-Ile-Pro-Met-p-ニトロアニリド（「ＡＩＰＭ」という）、N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド（「ＡＡＰＦ」という）、N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Met-p-ニトロアニリド（「ＡＡＰＭ」という）、N-グルタリル-Ala-Ala-Pro-Leu-p-ニトロアニリド（「ＡＡＰＬ」という）、及びN-スクシニル-Ala-Ala-Val-Ala-p-ニトロアニリド（「ＡＡＶＡ」という）に対して分解作用を有するが、N-メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Val-p-ニトロアニリド（「ＡＡＰＶ」という）及びN-スクシニル-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-４-メチルクマリル-７-アミド（「ＧＰＬＧＰ」という）に対して分解作用を示さない。
(2)本発明酵素の最適反応ｐＨは、ｐＨ８．５〜９．０である。
(3)本発明酵素の最適反応温度は、４０〜５０℃である。また、本発明酵素は４５℃までは安定な酵素活性を有する。
(4)分子量：
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」という）による分子量が、５０，０００〜７０，０００である。
(5)阻害剤
本発明酵素は、セリンプロテアーゼの阻害剤であるフェニルメチルスルフォニルフルオライド（「ＰＭＳＦ」という）により完全に阻害されるが、キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」という）では１０ｍＭ濃度で３５％の残存活性を示す。
【００２０】
このような本発明のコラーゲン分解酵素は、以下に示す方法に特に限定されるものではないが、例えば、アルカリモナス属細菌が産生する酵素の中から見出される。このようなアルカリモナス属の微生物の一例として、好ましくはアルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株がある。この菌株は、倉田らにより既に詳細にその特定化がなされ、新規な菌株であることが証明されているものである。この菌株の菌学的性質等については、すでに非特許文献４（Kurataら”Int. J. Syst. Evol. Microbiol.”57,1549-53, 2007）に詳細に報告されているので、本明細書においてはその記載をここに引用する。また、この菌株は、アルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株（Alkalimonas collagenimarina AC40）として独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ、所在地：351-0198 埼玉県和光市広沢２−１、独立行政法人理化学研究所 微生物系統保存施設）にＪＣＭ１４２６７として、ならびにＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ（Ferguson Building Craibstone Estate Bucksburn Aberdeen AB21 9YA UK）にＮＣＩＭＢ１４２６６としてそれぞれ寄託されており、これらの寄託機関から入手することができる。
【００２１】
本発明のコラーゲン分解酵素は、上述したコラーゲン分解酵素産生菌、例えばアルカリモナス属に属する微生物、好ましくはアルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株（ＪＣＭ１４２６７、ＮＣＩＭＢ１４２６６)を資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地（好ましくはコラーゲンを添加する）を用いて培養し、その培養上清から得ることができる。
【００２２】
培養に必要な資化可能な炭素源としてはグルコース、マルトース、マンノースなどであり、資化可能な窒素源としては魚肉エキス、ポリペプトン、カゼイン、コラーゲンなどである。
培養温度は５〜３７℃、特に３３℃が好ましく、ｐＨは７．０〜１０．５、特に８．５〜１０．５が好ましく、この条件下において通常１〜３日間で培養が完了する。
【００２３】
本発明酵素は、培養上清中に蓄積したものであり、菌体を分離した残りの培養液を粗酵素液として利用することもできる。さらに、これらの粗酵素は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の通常の精製方法を用いて精製することができる。必要に応じて限外濾過あるいは沈澱法等の手段により回収し、適当な方法を用いて粉末化して用いることもできる。
【００２４】
この粗酵素液の分離・精製は、更に具体的には、例えば必要に応じて、塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の公知の方法を組み合わせて、更に分離精製したものも使用することができる。
【００２５】
また、本発明のコラーゲン分解酵素は、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号３のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、本発明の遺伝子は、配列番号４に示すような当該タンパク質をコードするＤＮＡである。
【００２６】
ここで、配列番号３に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号３のアミノ酸配列とそれぞれ等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは複数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、依然としてコラーゲン分解酵素活性を保持する配列をいい、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。なお、当該等価のアミノ酸配列は、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Science, 227,1435,1985）等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較することにより行うことができる。具体的にはＧＥＮＥＮＴＹＸ−Ｍａｃ（ソフトウエァ開発）のサーチホモロジーやマキシマムマッチングプログラムを用いて相同性を求めることができる。
【００２７】
また、本発明のコラーゲン分解酵素前駆体は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、本発明の遺伝子は、配列番号２に示す当該タンパク質をコードするＤＮＡである。
【００２８】
本発明のコラーゲン分解酵素前駆体は、配列番号１に示すアミノ酸の１番目のアミノ酸から７６０番目のアミノ酸から構成される。これは、配列番号２に示す塩基配列の１番目の塩基から２２８３番目の塩基からなるＤＮＡによりコードすることができる。配列番号１のアミノ酸配列の相同性を検索した結果、コルウェリア サイクレエリスリア（Colwellia psychrerythraea）３４Ｈ株の生産する cold-active alkaline serine protease（YP269576）と４７％の相同性を示した。また、先行特許出願である特表２００６−５１６８８９号公報（特許文献９）には、配列番号１に示すアミノ酸配列に類似したアミノ酸配列を有する新規プロテアーゼ（Proteases）が記載されていた。このものは５７％の相同性を示したが、タンパク質分解酵素としての記載はあるが、これがコラーゲン分解活性があるとの記載は見られない。
その他の公知のプロテアーゼやコラーゲン分解酵素との相同性は極めて低く、本発明のコラーゲン分解酵素前駆体は新規な酵素前駆体であることが示唆された。従って、配列番号１に示すアミノ酸配列と適切なアライメントがなされた場合、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有し、このコラーゲン分解酵素前駆体は本発明に包含される。
【００２９】
また、配列番号３に示す本発明のコラーゲン分解酵素は、アルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株において、プレプロペプチドが除去されて生産される。即ち、配列番号１に示すコラーゲン分解酵素前駆体において、１〜１２４番目までのアミノ酸（配列番号２では１〜３７２番目までのヌクレオチドに相当する）がプレペプチドとして本発明酵素の生産時に除去されるため、プレプロペプチドが除去された成熟型コラーゲン分解酵素として、配列番号３に示すアミノ酸の１番目のアミノ酸から６３６番目のアミノ酸から構成される本発明酵素が得られる。これは、配列番号４に示す塩基配列の１番目の塩基から１９１１番目の塩基からなるＤＮＡによりコードすることができる。
【００３０】
配列番号３のアミノ酸配列の相同性を検索した結果、コルウェリア サイクレエリスリア（Colwellia psychrerythraea）３４Ｈ株の生産するcold-active alkaline serine protease（YP269576）と５２％の相同性を示した。その他の公知のプロテアーゼやコラーゲン分解酵素との相同性は極めて低く、成熟型コラーゲン分解酵素は新規な酵素であることが示唆された。従って、配列番号３に示すアミノ酸の１番目のアミノ酸から６３６番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列と適切なアライメントがなされた場合、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有し、酵素学的特性の１〜４を満たすコラーゲン分解酵素は本発明に包含される。
【００３１】
一般的にアルカリプロテアーゼの遺伝子は、長いプレプロ配列を有している。プレ配列は酵素の菌体外への分泌に必要であり、プロ配列は酵素の活性型立体構造を形成する際に必要な配列である。本発明者らは、配列表の配列番号２で表わされるプレプロ配列を含むコラーゲン分解酵素前駆体をコードする全遺伝子配列を見出し、配列番号１で表わされる同前駆体のアミノ酸配列を見出した。更に、このコラーゲン分解酵素前駆体から、配列番号３で表わされる、菌体外に生産される本発明のコラーゲン分解酵素のアミノ酸配列、即ち成熟酵素のアミノ酸配列を見出したものである。
【００３２】
本発明のコラーゲン分解酵素は、例えばアルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株の染色体ＤＮＡからクローニングし、適当なベクターと宿主菌を用いて大量に生産することができる。さらに、成熟コラーゲン分解酵素よりも分子量の小さい、２種類の小型化コラーゲン分解酵素の生産をも可能とすることができる。この小型化酵素は成熟酵素に比べてＣ末端側においてアミノ酸の欠損がある。
この２種類の小型化コラーゲン分解酵素ＡおよびＢは、それぞれ配列番号３に示すアミノ酸配列の４４１番目から６３６番目のアミノ酸（配列番号４の１３２１〜１９０８番目の番目ヌクレオチドに相当する）、および配列番号３に示すアミノ酸配列の５５１番目から６３６番目のアミノ酸（配列番号４の１６５４〜１９０８番目の番目ヌクレオチドに相当する）が欠損しているものである。
【００３３】
即ち、小型化コラーゲン分解酵素Ａは、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するたんぱく質から構成される。これは、配列番号６に示す塩基配列の塩基を有するＤＮＡによりコードすることができるものである。
配列番号５のアミノ酸配列の相同性を検索した結果、シュワネラ アマゾネンシス（Shewanella amazonensis）ＳＢ２Ｂ株の生産する cold-active alkaline serine protease（YP929185）と５７％の相同性を示した。その他の公知のプロテアーゼやコラーゲン分解酵素との相同性は極めて低く、小型化コラーゲン分解酵素Ａは新規な酵素であることが示唆された。従って、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するたんぱく質のアミノ酸配列と適切なアライメントがなされた場合、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有し、酵素学的特性の１〜４を満たすコラーゲン分解酵素は本発明に包含される。
【００３４】
一方、小型化コラーゲン分解酵素Ｂは、配列番号７に示すアミノ酸配列を有するたんぱく質から構成される。これは、配列番号８に示す塩基配列の塩基を有するＤＮＡによりコードすることができるものである。
配列番号７のアミノ酸配列の相同性を検索した結果、コルウェリア サイクレエリスリア（Colwellia psychrerythraea）３４Ｈ株の生産する cold-active alkaline serine protease（YP269576）と５３％の相同性を示した。その他の公知のプロテアーゼやコラーゲン分解酵素との相同性は極めて低く、小型化コラーゲン分解酵素Ｂは新規な酵素であることが示唆された。従って、配列番号７に示すアミノ酸配列を有するたんぱく質のアミノ酸配列と適切なアライメントがなされた場合、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有し、酵素学的特性の１〜４を満たすコラーゲン分解酵素は本発明に包含される。
【００３５】
また、本発明のコラーゲン分解酵素をコードする遺伝子は、上述したコラーゲン分解酵素産生菌、例えばアルカリモナス属に属する微生物、好ましくはアルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株から、例えばショットガンクローニング、あるいは特定のプライマーを用いたＰＣＲ増幅等によって、本発明の遺伝子を取得することができる。
【００３６】
本発明遺伝子を用いてコラーゲン分解酵素を生産するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記コラーゲン分解酵素遺伝子を組込み、該組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、当該培養液からコラーゲン分解酵素を採取すればよい。
即ち、上記のアルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株から本発明酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得した後、遺伝子工学技術を用いて組換え微生物を作製し、当該組換え微生物を培養する方法が挙げられる。具体的には、本発明酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を上記菌株より取得し、次いでこのヌクレオチド配列を適当なベクターに組込み、更に、このベクターにより大腸菌等の宿主を形質転換し、これを培養して本発明酵素を産生させ、その培養物より本発明酵素を採取すればよい。
【００３７】
培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。微生物の資化可能な炭素源としては、グルコース、マルトース、マンノースなどが使用することができ、微生物の資化可能な窒素源としては、魚肉エキス、ポリペプトン、カゼイン、コラーゲンなどが使用することができる。
【００３８】
従って、本発明酵素またはその前駆体のアミノ酸配列をコードする遺伝子としては、具体的には、下記（ａ）〜（ｈ）からなる群より選ばれる遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号３に示す成熟酵素を構成するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号３に示す成熟酵素を構成するアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号５に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号７に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号７に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号２に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、又は
（ｈ）配列番号２に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコラーゲン分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
から選ばれる遺伝子である。
【００３９】
ここでいう、１個もしくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列とは、これらのもとの配列と等価の配列を意味し、１個もしくは複数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列であって、依然としてコラーゲン分解活性を保持する配列をいい、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００４０】
また、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル 第２版（Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd ed.）」（T. Maniatisら編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、１９８９年）に記載の条件等が挙げられる。具体的には、ストリンジェントな条件として、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート、１００μｇ／ｍＬの熱変性ニシン精子ＤＮＡを含む溶液中で、プローブとともに５０〜６５℃の温度で一晩保存しハイブリダイズさせる、という条件が挙げられる。
【００４１】
なお、当該等価のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（Mutan-super Express Km キット；タカラ社製）等を用いて変異を導入すればよい。
【００４２】
かくして得られた培養物中からの成熟型コラーゲン分解酵素や小型化コラーゲン分解酵素の採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養物から遠心分離または濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液または乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。以上のように調製された本発明のコラーゲン分解酵素は、医療や化粧品、食品分野におけるコラーゲンペプチドの生産や、写真フィルム特にレントゲン用写真フィルムからの銀イオンの回収など工業的利用が可能な酵素として有用である。
【実施例】
【００４３】
次に、実施例によって本発明を更に詳しく説明する。実施例中で特に注記しないものは「％」表示は質量％である。
【００４４】
なお、以下の実施例において、コラーゲン分解酵素の活性は以下の方法によって測定して求めた。
【００４５】
２．５％（ｗ／ｖ）コラーゲン（シグマアルドリッチ）、１ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）０．０９ｍＬを４５℃で２分間保温した後、０．０１ｍＬの酵素溶液を添加し、４５℃で２５分間反応を行った。１００％トリクロロ酢酸溶液（ＴＣＡ溶液）０．２５ｍＬを添加して反応を停止し、氷上で１５分間放置した後、遠心分離（２０，４００×ｇ，１０分間）して酸変性タンパク質を沈殿させた。ＤＣプロテインアッセイキット（バイオラッド）を用いて、得られた上清中の可溶性タンパク質を定量した。
一方、酵素溶液の代わりに１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）を添加したものを、ブランクに用いた。酵素１単位（Ｐ．Ｕ）は、上記の反応条件において１分間に１ｍｍｏＬのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質分解物を遊離する酵素量とした。
【００４６】
実施例１：コラーゲン分解酵素生産菌のスクリーニング
鳥島沖海底土壌より採取したサンプルを１．０％コラーゲン含有アルカリ寒天培地へ塗抹し、４℃で１ヶ月間、静置培養を行った。生育した菌を選抜し、純化した後に液体培地へ接種し、１５℃で２日間、振盪培養を行い、上清液中のコラーゲン分解活性を測定した。スクリーニング用の液体培地組成は次の表１に示すものであり、これにコラーゲン（タイプ１、シグマアルドリッチ）１．０％を加えた。得られた培養液から、コラーゲン分解酵素生産量の高い菌株としてアルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株を選抜した。
【００４７】
【表１】
【００４８】
実施例２：コラーゲン分解酵素の生産と精製、Ｎ末端および内部アミノ酸配列の決定
アルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株を、前記表１に示す組成からなる５００ｍＬの液体培地に接種し、１５℃、３日間振盪培養を行った。
培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、３０分間、４℃）し、得られた上清液４８０ｍＬに対し、硫安を８０％飽和になるように徐々に加え遠心分離（９,０００×ｇ、３０分間、４℃）し、沈殿したタンパク質を回収した。回収したタンパク質を１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）に溶解した後、限外濾過により脱塩濃縮した。溶解したタンパク質を、予め１００ｍＭグリシン水酸化−ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）にて平衡化しておいた ＤＥＡＥ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムへ添着させ、０．２２Ｍ塩化ナトリウムによりコラーゲン分解活性を有する吸着タンパク質を溶出した。
次いで、予め１Ｍ硫安を含む１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）で平衡化しておいたＢｕｔｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムへ添着させた後、１Ｍ〜０．５Ｍ硫安の直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させた。コラーゲン分解活性画分を集め、限外ろ過にて濃縮脱塩を行った。濃縮液のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、分子量６０ｋＤａ付近に２本のタンパク質バンドが確認された。これらのバンドをＰＶＤＦ膜（バイオラッド社製）にブロッティングし、アミノ酸シークエンサー（４７６Ａ型、アプライドバイオシステムズ製）にてＮ末端からのアミノ酸配列を決定した。
両方のバンドのアミノ酸配列は一致しており、Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎの１９アミノ酸配列が決定された。したがって、２本のバンドは双方とも同一のコラーゲン分解酵素であると判断した。分子量の小さいバンドは、分子量の大きいバンドのＣ末端部分が欠損したものと考えられた。
次に、Achromobacter Protease I (Residue-specific Proteases Kit, タカラバイオ)を用いて精製コラーゲン分解酵素を部分的に切断し、得られたペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、バンドのアミノ酸配列を解析した。その結果、Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｐの２０アミノ酸配列が決定された。
【００４９】
実施例３：コラーゲン分解酵素の性質
実施例２で得られた精製酵素（本発明酵素）を用いてその性質を検討した。
(1)最適反応ｐＨ：
２．５％（ｗ／ｖ）コラーゲン（シグマアルドリッチ）を含む１００ｍＭのｐＨが６．０から１３．０の範囲の下記の種々の緩衝液を用いて、本発明酵素によるコラーゲン分解反応を行った。
ｐＨ６．０−８．０ ・・・ モルホリノプロパンスルホン酸−水酸化ナトリウム
(MOPS)、（●）
ｐＨ７．１−８．９ ・・・ トリス−塩酸、（○）
ｐＨ８．０−１０．０ ・・・ ホウ酸−塩化カリウム−水酸化ナトリウム、（△）
ｐＨ８．５−１１．１ ・・・ グリシン−水酸化ナトリウム、（■）
ｐＨ１０．９−１３．０ ・・ 塩化カリウム−水酸化ナトリウム、（▲）
その結果を図１に示す。この図からわかるように、本発明酵素はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５〜９．０）中で最も反応速度が高かった。
【００５０】
(2)最適反応温度
標準反応条件｛２．５％（ｗ／ｖ）コラーゲン（シグマアルドリッチ）、１ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）０．０９ｍＬ、酵素画分０．０１ｍＬ｝において、反応温度を５〜７０℃に種々変化させ、本発明酵素によるコラーゲン分解反応を行った。その結果を図２に示す。この結果からわかるように、本発明酵素は４０〜５０℃で最も高い反応速度を示し、特に４５℃で最も高い反応速度を示した。
【００５１】
(3)熱安定性
１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）中に本発明酵素を添加して５〜５５℃の各温度で１５分間加熱処理を行ない、標準反応条件｛２．５％（ｗ／ｖ）コラーゲン（シグマアルドリッチ）、１ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）０．０９ｍＬ、酵素画分０．０１ｍＬ｝により残存活性を求めた。加熱前の活性を１００％として加熱処理後の残存活性を図３に示す。本発明のコラーゲン分解酵素は、４５℃までは安定で優れた活性を保持することが判った。また、塩化カルシウム（１mＭ）を添加して同様の試験を行なったところ、塩化カルシウムの添加によってその安定性を若干増加させることができた。
【００５２】
(4)基質特異性
同様に標準反応条件下においてコラーゲンの代わりに様々なタンパク質（カゼイン、ケラチン、ゼラチン、エラスチン）を添加し、これらのたんぱく質の分解反応を行った。その結果を図４に示す。ゼラチンに対する活性が最も高く、これを１００％としてその他の各基質に対する反応性を相対活性とした。この結果からわかるように、本発明酵素は特にコラーゲンおよびゼラチンに対して大きな分解活性を示した。
【００５３】
(5)合成基質に対する作用
合成オリゴペプチド基質として表２に示すもの又は下記のものを用いて本発明のコラーゲン分解酵素の各種合成基質に対する反応性を調べた。
１ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）０．０８５ｍＬに１０ｍＭの合成基質溶液０．００５ｍＬを混合し４５℃で２分間恒温した後、酵素画分０．０１ｍＬを加え、５分間反応を行った。分光光度計を用いて４０５
ｎｍにおける吸光度を２０秒ごとに測定して、１分間あたりに遊離したｐ-ニトロアニリンを定量した。
N-メトキシスクシニル-Ala-Ile-Pro-Met-p-ニトロアニリド(ＡＩＰＭ)に対する活性が最も高く、これを１００％としてその他の各合成基質に対する反応性を相対活性として表２に示す。
【００５４】
【表２】
【００５５】
ここで、ＡＩＰＭはN-メトキシスクシニル-Ala-Ile-Pro-Met-p-ニトロアニリド、ＡＡＰＦはN-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド、ＡＡＰＭはN-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Met-p-ニトロアニリド、ＡＡＰＬはN-グルタリル-Ala-Ala-Pro-Leu-p-ニトロアニリド、ＡＡＶＡはN-スクシニル-Ala-Ala-Val-Ala-p-ニトロアニリドである。また本発明酵素は、ＡＩＰＭとＡＡＰＦに対して優れた活性を示し、ＡＡＰＭとＡＡＰＬでもある程度の活性を示し、ＡＡＶＡに対してわずかながら活性を示したが、ＡＡＰＶ（N-メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Val-p-ニトロアニリド）に対して全く活性を示さなかった。
次に、同様の方法によってコラゲナーゼ用の合成オリゴペプチド基質としてＮ-スクシニル-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-４-メチルクマリル-７-アミド（ＧＰＬＧＰ）に対する反応性を調べた。反応組成、条件は上記と同様にし、分解により遊離する7-アミノ-4-メチルクマリンを分光光度計を用いて３７０ｎｍにて測定した。その結果、本発明酵素はＧＰＬＧＰを分解することはなく、活性を示さなかった。
【００５６】
(4)分子量
本発明酵素の分子量を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した。分子量マーカーにはプレシジョンPlusデュアルスタンダード（バイオラッド）を用いた。その結果を図５に示す。この結果から本発明酵素の分子量は５０〜７０ｋＤａであった。
【００５７】
(5)阻害剤
１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）に、表３に示す各種阻害剤を所定濃度になるように加え、本発明酵素を添加し、１５℃で１５分間恒温した。その後、標準反応条件｛２．５％（ｗ／ｖ）コラーゲン（シグマアルドリッチ）、１ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）０．０９ｍＬ、酵素画分０．０１ｍＬ｝において、残存活性を測定した。その結果を表３に示す。
【００５８】
【表３】
【００５９】
ここで、ＰＭＳＦはフェニルメチルスルフォニルフルオライドであり、ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸である。
表３に示すように、本発明のコラーゲン分解酵素は、セリンプロテアーゼの阻害剤であるＰＭＳＦより完全に阻害され、キレート剤であるＥＤＴＡにより活性が３５%となった。
【００６０】
実施例４：コラーゲン分解酵素遺伝子のクローニング
染色体ＤＮＡを抽出するために、アルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株を表１に示す組成の１０ｍＬの液体培地に接種し、３３℃で１日間振盪培養した。続いてＧｅｎｏｍｉｃ−Ｔｉｐ１００／Ｇ（キアゲン）を用いて菌体から染色体ＤＮＡを抽出した。
実施例２で得られた、Ｎ末端の１９アミノ酸配列と内部の２０アミノ酸配列を基に、それぞれ配列番号９に示すプライマー１（５‘−ＴＡＹ ＧＧＮ ＴＡＹ ＡＣＮ ＡＴＧ ＧＴ−３’、ここでＮはＧＡＴＣ、 ＹはＣＴ、 ＲはＡＧを示す。）、配列番号１０に示すプライマー２（５’−ＴＣＮ ＡＣＹ ＴＧＮ ＧＣＲ ＴＴＮ ＣＫＹ ＴＧ−３’、ここでＫはＧＴを示す。）をデザインした。上記で精製した染色体ＤＮＡを鋳型に、プライマー１（配列番号９）とプライマー２（配列番号１０）、ＥＸ Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、９４℃で４分間変性後、９４℃で１分間、５１．２℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を１サイクルとしてこれを３０サイクル行なった。その結果、約０．５ｋｂのＰＣＲ増幅断片を取得した。得られたＤＮＡ断片をｐＣＲ４−Ｔｏｐｏ（ＴＯＰＯ ＴＡ ＰＣＲ クローニングキット、インビトロジェン）に挿入し、Ｍ１３フォワードプライマー（インビトロジェン）およびＭ１３リバースプライマー（インビトロジェン）、Big Dye Teminator Cycle Sequencingキット（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてシーケンスを行い、コラーゲン分解酵素遺伝子の部分塩基配列を決定した。得られた増幅断片を基にプライマーを合成し、インバースＰＣＲ法とＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ キット（タカラバイオ）によりさらに上流と下流域の塩基配列を決定し、その中にプレプロ配列を含むコラーゲン分解酵素をコードする２２８３塩基対から成るオープンリーディングフレーム（配列番号２）を見出した。この塩基配列から配列番号１に示したアミノ酸配列を決定した。決定されたアミノ配列中には精製酵素のＮ末端アミノ酸配列（配列番号３の１〜１９番目のアミノ酸）およびAchromobacter Protease Iによって部分消化して得られたペプチド断片のアミノ酸配列（配列番号３の１８３〜２０１番目のアミノ酸）が確認された。
【００６１】
実施例５：組換え酵素の生産
コラーゲン分解酵素遺伝子の５’末端（配列番号２の１〜１９番目のヌクレオチド）にアニールするプライマー３（配列番号１１、５‘−ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＣＡ ＴＡＴ ＧＴＣ ＣＡＡ ＡＣＣ ＡＣＡ ＴＴＴ ＣＴ−３’、 下線部は新たに付加したＮｄｅＩサイトを示す）、さらに３’末端（配列番号２の２２６５〜２２８３番目のヌクレオチド）にアニールするプライマー４（配列番号１２、５’−ＣＣＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＴＡ ＣＴＣ ＧＴＡ ＧＣＴ ＡＡＣ ＴＴＴ Ｃ−３’、下線部は新たに付加したＥｃｏＲＩサイトを示す）、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を用いて、ＡＣ４０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、コラーゲン分解酵素をコードする遺伝子（配列番号２の両側にＮｄｅＩとＥｃｏＲＩサイトを新しく付加した遺伝子）をＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲ増幅断片をＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで分解した後、同様に処理しておいたベクターｐＲＳＥＴ−ａ（インビトロジェン）に導入し、組換えプラスミド（ｐＲＳＥＴ−ＡｃｐII）を調製した。この組換えプラスミドを用いて大腸菌ＴＯＰ１０株（インビトロジェン）を形質転換した。この形質転換体を２％スキムミルクと１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢプレート[１％トリプトン（ディフコ）、０．５％酵母エキス（ディフコ）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天]に生育させたところコロニーの周辺にスキムミルク溶解斑が認められた。
【００６２】
続いて、小型化コラーゲン分解酵素Ａ（配列番号５）と小型化コラーゲン分解酵素Ｂ（配列番号７）を生産するための組換えプラスミドを調製した。小型化コラーゲン分解酵素Ａ（配列番号５）と小型化コラーゲン分解酵素Ｂ（配列番号７）は、それぞれ配列番号３の４４１〜６３６番目のアミノ酸（配列番号４の１３２１〜１９０８番目のヌクレオチド）、５５１〜６３６番目のアミノ酸（配列番号４の１６５４〜１９０８番目のヌクレオチド）を削ったものである。プライマー６（配列番号１４、５‘−ＡＣＣ ＧＣＴ ＧＴＣ ＧＣＣ ＡＧＣ ＣＡＧ−３’、配列番号２の１６７５〜１６９２番目のヌクレオチドにアニールする。）とプライマー７（配列番号１５、５’−ＡＣＧ ＡＣＧ ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＣＴ ＧＡＴ ＡＴ−３’、配列番号２の２００６〜２０２５番目のヌクレオチドにアニールする。）、プライマー５（配列番号１３、５‘−ＴＡＡ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＡＡ ＧＣＴ ＴＧＡ ＴＣＣ−３’、コラーゲン分解酵素のストップコドンと、その下流域のｐＲＳＥＴ−ａ（インビトロジェン）部分にアニールする）を設計した。コラーゲン分解酵素生産用の組換えプラスミド（ｐＲＳＥＴ−ＡｃｐII）を鋳型として、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を用いたＰＣＲにより、プライマー５（配列番号１３）とプライマー６（配列番号１４）を用いて小型化コラーゲン分解酵素Ａ（配列番号５）を、プライマー５（配列番号１３）とプライマー７（配列番号１５）を用いて小型化コラーゲン分解酵素Ｂ（配列番号７）をコードするＤＮＡ断片をそれぞれ調製した。ＰＣＲの条件は、小型化コラーゲン分解酵素Ａ（配列番号５）と小型化コラーゲン分解酵素Ｂ（配列番号７）ともに９６℃で１分間変性後、９６℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間を１サイクルとして、これを３０サイクル行なった。その後、それぞれのＤＮＡ断片を分子内で環状化させて小型化コラーゲン分解酵素の発現プラスミドとするために、ＤＮＡ断片の５’末端をリン酸化してライゲーションした。小型化コラーゲン分解酵素Ａ（配列番号５）、小型化酵素Ｂ（配列番号７）のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号６、配列番号８に相当する。
得られたそれぞれの発現用プラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（インビトロジェン）を形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び３５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ培地にて３０℃、一晩好気的に振盪培養を行った結果、培養液中の小型化コラーゲン分解酵素Ａ（配列番号５）、小型化コラーゲン分解酵素Ｂ（配列番号７）の生産量はそれぞれ０．４４ Ｐ．Ｕ／Ｌ、０．６１ Ｐ．Ｕ／Ｌであった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明のコラーゲン分解酵素は、従来のたんぱく質分解酵素とはアミノ酸配列の異なる新規な酵素であり、特にコラーゲンとゼラチンに対して高い分解活性を有する。従って、コラーゲンとゼラチンを分解して低分子量化することができ、このような低分子量コラーゲンや低分子量ゼラチンを必要とする食品産業や保湿性や防シワ作用を利用する化粧品分野、或いは種々の医療分野において有用である。また、本発明により得られたこれらの酵素の遺伝子配列を利用することによって、遺伝子工学技術を用いてかかる酵素を容易に製造することができ、上記の産業分野での低分子量コラーゲンや低分子量ゼラチンの利用のために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明酵素の酵素活性とｐＨの関係を示す図である。
【図２】本発明酵素の温度依存性を評価するための酵素活性と温度の関係を示す図である。
【図３】本発明酵素の熱安定性を評価するための酵素活性と温度の関係を示す図である。
【図４】本発明酵素の種々のたんぱく質に対する酵素活性を示す図である。
【図５】本発明酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なコラーゲン分解酵素、その遺伝子とその利用に関する。更に詳しくは、本発明は、アルカリモナス属細菌由来のアルカリ領域において高い活性を有する新規なコラーゲン分解酵素、その遺伝子とその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲン分解酵素やゼラチン分解酵素は工業的利用価値の高い酵素である。例えばコラーゲンのペプチド性加水分解物には、シワ取りなどの美容整形用の材料としての有用性があり、また保湿性、シワ形成予防作用、血圧降下作用等の興味深い生理活性も見いだされており（例えば、非特許文献１、２参照）、実際に、コラーゲンを低分子化したペプチドが医療や化粧品分野において多量に用いられている（例えば、特許文献１〜３参照）。また、写真用乳剤などにはゼラチンが用いられており、レントゲンや写真のフィルムのリサイクルにはゼラチン分解酵素が用いられている（例えば、特許文献４参照）。ゼラチン分解酵素は廃棄フィルムから写真資源の回収に有用である。
【０００３】
また近年、有機廃棄物の有効利用のためのバイオコンバージョン（生物学的変換）が積極的に試みられている。例えば生ゴミのコンポスト化はその好例である。動物性タンパク質の３０％以上はコラーゲンからなっており、一般家庭や食堂から出される生ゴミ、および食肉加工業において排出される廃棄物にもコラーゲンが多量に含まれている。コラーゲンはその特殊な高次構造のために一般に難溶性・難分解性であり、コンポスト化においても比較的分解の遅いタンパク質である。畜産資源の非利用部分の多くは難分解性であるため、多くは焼却処分されているのが現状である。
【０００４】
従って、コラーゲンやゼラチンを分解できるコラーゲン分解酵素の開発は非常に重要であり、これまでコラーゲン分解酵素およびコラーゲン分解酵素生産菌についての多くの報告がなされている（例えば、特許文献５〜８参照）。しかしながら、これら酵素の多くは中性から酸性域において最適反応ｐＨを示すものであり、アルカリ条件下で最適反応ｐＨを示すコラーゲン分解酵素はあまり知られていない。さらに、微生物由来のコラーゲン分解酵素の多くはコラゲナーゼと呼ばれる金属酵素であり、セリンプロテアーゼに分類されるコラーゲン分解酵素はあまり知られていない（非特許文献３）。
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−１５１８４７号公報
【特許文献２】特開２００１−２６７５３号公報
【特許文献３】特開２００５−３１４２６５号公報
【特許文献４】特開２０００−２３１１７９号公報
【特許文献５】特開２００５−２４５２８５号公報
【特許文献６】特開平８−７０８５３号公報
【特許文献７】特開２００１−１７８４５６号公報
【特許文献８】特開２００１−６１４７４号公報
【特許文献９】特表２００６−５１６８８９号公報
【非特許文献１】田中ら「バイオインダストリー」第９号、１８〜２３頁、２００５年
【非特許文献２】Kuhareら「J. Immunol」155,3653-3659,1995
【非特許文献３】Watanabe「Appl. Microbiol Biotechnol」63,520-526, 2004
【非特許文献４】（Kurataら”Int. J. Syst. Evol. Microbiol.” 57,1549-53, 2007）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、以上のようなコラーゲン分解酵素に関する現状に鑑み、アルカリ条件下で活性なコラーゲン分解酵素を提供することを目的とするものであり、アルカリ条件に最適反応ｐＨを示し、セリンプロテアーゼに分類され、公知のコラーゲン分解酵素に対してはアミノ酸配列において相同性の低い、新規なコラーゲン分解酵素ならびにこれをコードする遺伝子を提供することをその目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上述のような目的を達成するために鋭意研究を行い、コラーゲン分解酵素の生産菌を深海底土壌中よりスクリーニングした結果、新たなコラーゲン分解酵素を見出し、さらに本酵素をコードする遺伝子をクローニングすることで本発明を完成させるに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、次の理化学的性質を有する新規なコラーゲン分解酵素を提供するものである。
(1)作用：
カゼイン、ゼラチン、コラーゲン、ケラチンおよびエラスチンの蛋白質を分解し、特にコラーゲンおよびゼラチンに対して強い分解作用を有する。
また、合成基質であるN-メトキシスクシニル-Ala-Ile-Pro-Met-p-ニトロアニリド、N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド、N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Met-p-ニトロアニリド、N-グルタリル-Ala-Ala-Pro-Leu-p-ニトロアニリド、及びN-スクシニル-Ala-Ala-Val-Ala-p-ニトロアニリドに対して分解作用を有するが、N-メトキシスクシニル- Ala-Ala-Pro-Val-p-ニトロアニリド、及びN-スクシニル-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-４-メチルクマリル-７-アミドに対して分解作用を示さない。
(2)最適反応ｐＨ： ｐＨ８．５〜９．０
(3)最適反応温度は４０〜５０℃であり、４５℃まで安定な酵素活性を有する。
(4)分子量：
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、５０，０００〜７０，０００である。
(5)阻害剤
セリンプロテアーゼの阻害剤であるフェニルメチルスルフォニルフルオライドにより完全に阻害されるが、キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸では１０ｍＭ濃度で３５％の残存活性を示す。
【０００９】
また、本発明は、配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する、或いは配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、上記の新規なコラーゲン分解酵素を提供するものである。
【００１０】
また、本発明は、配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する、上記の新規なコラーゲン分解酵素を提供するものである。
【００１１】
また、本発明は、配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する、上記の新規なコラーゲン分解酵素を提供するものである。
【００１２】
また、本発明は、アルカリモナス コラゲニマリナ由来のものである、前記の新規なコラーゲン分解酵素を提供するものである。
【００１３】
また、本発明は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有する、新規なコラーゲン分解酵素前駆体を提供するものである。
【００１４】
更に、本発明は、前記の新規なコラーゲン分解酵素またはその前駆体のアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、下記（ａ）〜（ｈ）からなる群、
（ａ）配列番号３に示す成熟酵素を構成するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号３に示す成熟酵素を構成するアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号５に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号７に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号７に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号２に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、又は
（ｈ）配列番号２に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコラーゲン分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
から選ばれるコラーゲン分解酵素をコードする遺伝子を提供するものである。
【００１５】
また、本発明は、前記いずれかの遺伝子を含有する組換えベクターおよび当該ベクターにより形質転換された微生物を提供するものである。
【００１６】
更に、また、本発明は、アルカリモナス コラゲニマリナ、又は前記形質転換された微生物を培養し、その培養液よりコラーゲン分解酵素を採取することを特徴とする、前記理化学的性質又は前記アミノ酸配列を有するコラーゲン分解酵素の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の新規なコラーゲン分解酵素は、従来のコラーゲン分解酵素には見られなかったアルカリ領域において高いコラーゲン分解活性を有し、セリンプロテアーゼに分類されるものである。従って、特にアルカリ領域においてコラーゲンやゼラチンを高い活性で分解することができるという特徴ある性質を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の新規なコラーゲン分解酵素（以下、「本発明酵素」ということもある）は、次の(1)〜(5)で規定される酵素学的性質を有するものである。
【００１９】
(1)作用：
本発明酵素は、カゼイン、ゼラチン、コラーゲン、ケラチンおよびエラスチンの蛋白質を分解し、特にコラーゲンおよびゼラチンに対して強い分解作用を有する。
また、本発明酵素は、合成基質であるN-メトキシスクシニル-Ala-Ile-Pro-Met-p-ニトロアニリド（「ＡＩＰＭ」という）、N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド（「ＡＡＰＦ」という）、N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Met-p-ニトロアニリド（「ＡＡＰＭ」という）、N-グルタリル-Ala-Ala-Pro-Leu-p-ニトロアニリド（「ＡＡＰＬ」という）、及びN-スクシニル-Ala-Ala-Val-Ala-p-ニトロアニリド（「ＡＡＶＡ」という）に対して分解作用を有するが、N-メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Val-p-ニトロアニリド（「ＡＡＰＶ」という）及びN-スクシニル-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-４-メチルクマリル-７-アミド（「ＧＰＬＧＰ」という）に対して分解作用を示さない。
(2)本発明酵素の最適反応ｐＨは、ｐＨ８．５〜９．０である。
(3)本発明酵素の最適反応温度は、４０〜５０℃である。また、本発明酵素は４５℃までは安定な酵素活性を有する。
(4)分子量：
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」という）による分子量が、５０，０００〜７０，０００である。
(5)阻害剤
本発明酵素は、セリンプロテアーゼの阻害剤であるフェニルメチルスルフォニルフルオライド（「ＰＭＳＦ」という）により完全に阻害されるが、キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」という）では１０ｍＭ濃度で３５％の残存活性を示す。
【００２０】
このような本発明のコラーゲン分解酵素は、以下に示す方法に特に限定されるものではないが、例えば、アルカリモナス属細菌が産生する酵素の中から見出される。このようなアルカリモナス属の微生物の一例として、好ましくはアルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株がある。この菌株は、倉田らにより既に詳細にその特定化がなされ、新規な菌株であることが証明されているものである。この菌株の菌学的性質等については、すでに非特許文献４（Kurataら”Int. J. Syst. Evol. Microbiol.”57,1549-53, 2007）に詳細に報告されているので、本明細書においてはその記載をここに引用する。また、この菌株は、アルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株（Alkalimonas collagenimarina AC40）として独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ、所在地：351-0198 埼玉県和光市広沢２−１、独立行政法人理化学研究所 微生物系統保存施設）にＪＣＭ１４２６７として、ならびにＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ（Ferguson Building Craibstone Estate Bucksburn Aberdeen AB21 9YA UK）にＮＣＩＭＢ１４２６６としてそれぞれ寄託されており、これらの寄託機関から入手することができる。
【００２１】
本発明のコラーゲン分解酵素は、上述したコラーゲン分解酵素産生菌、例えばアルカリモナス属に属する微生物、好ましくはアルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株（ＪＣＭ１４２６７、ＮＣＩＭＢ１４２６６)を資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地（好ましくはコラーゲンを添加する）を用いて培養し、その培養上清から得ることができる。
【００２２】
培養に必要な資化可能な炭素源としてはグルコース、マルトース、マンノースなどであり、資化可能な窒素源としては魚肉エキス、ポリペプトン、カゼイン、コラーゲンなどである。
培養温度は５〜３７℃、特に３３℃が好ましく、ｐＨは７．０〜１０．５、特に８．５〜１０．５が好ましく、この条件下において通常１〜３日間で培養が完了する。
【００２３】
本発明酵素は、培養上清中に蓄積したものであり、菌体を分離した残りの培養液を粗酵素液として利用することもできる。さらに、これらの粗酵素は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の通常の精製方法を用いて精製することができる。必要に応じて限外濾過あるいは沈澱法等の手段により回収し、適当な方法を用いて粉末化して用いることもできる。
【００２４】
この粗酵素液の分離・精製は、更に具体的には、例えば必要に応じて、塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の公知の方法を組み合わせて、更に分離精製したものも使用することができる。
【００２５】
また、本発明のコラーゲン分解酵素は、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号３のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、本発明の遺伝子は、配列番号４に示すような当該タンパク質をコードするＤＮＡである。
【００２６】
ここで、配列番号３に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号３のアミノ酸配列とそれぞれ等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは複数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、依然としてコラーゲン分解酵素活性を保持する配列をいい、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。なお、当該等価のアミノ酸配列は、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Science, 227,1435,1985）等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較することにより行うことができる。具体的にはＧＥＮＥＮＴＹＸ−Ｍａｃ（ソフトウエァ開発）のサーチホモロジーやマキシマムマッチングプログラムを用いて相同性を求めることができる。
【００２７】
また、本発明のコラーゲン分解酵素前駆体は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、本発明の遺伝子は、配列番号２に示す当該タンパク質をコードするＤＮＡである。
【００２８】
本発明のコラーゲン分解酵素前駆体は、配列番号１に示すアミノ酸の１番目のアミノ酸から７６０番目のアミノ酸から構成される。これは、配列番号２に示す塩基配列の１番目の塩基から２２８３番目の塩基からなるＤＮＡによりコードすることができる。配列番号１のアミノ酸配列の相同性を検索した結果、コルウェリア サイクレエリスリア（Colwellia psychrerythraea）３４Ｈ株の生産する cold-active alkaline serine protease（YP269576）と４７％の相同性を示した。また、先行特許出願である特表２００６−５１６８８９号公報（特許文献９）には、配列番号１に示すアミノ酸配列に類似したアミノ酸配列を有する新規プロテアーゼ（Proteases）が記載されていた。このものは５７％の相同性を示したが、タンパク質分解酵素としての記載はあるが、これがコラーゲン分解活性があるとの記載は見られない。
その他の公知のプロテアーゼやコラーゲン分解酵素との相同性は極めて低く、本発明のコラーゲン分解酵素前駆体は新規な酵素前駆体であることが示唆された。従って、配列番号１に示すアミノ酸配列と適切なアライメントがなされた場合、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有し、このコラーゲン分解酵素前駆体は本発明に包含される。
【００２９】
また、配列番号３に示す本発明のコラーゲン分解酵素は、アルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株において、プレプロペプチドが除去されて生産される。即ち、配列番号１に示すコラーゲン分解酵素前駆体において、１〜１２４番目までのアミノ酸（配列番号２では１〜３７２番目までのヌクレオチドに相当する）がプレペプチドとして本発明酵素の生産時に除去されるため、プレプロペプチドが除去された成熟型コラーゲン分解酵素として、配列番号３に示すアミノ酸の１番目のアミノ酸から６３６番目のアミノ酸から構成される本発明酵素が得られる。これは、配列番号４に示す塩基配列の１番目の塩基から１９１１番目の塩基からなるＤＮＡによりコードすることができる。
【００３０】
配列番号３のアミノ酸配列の相同性を検索した結果、コルウェリア サイクレエリスリア（Colwellia psychrerythraea）３４Ｈ株の生産するcold-active alkaline serine protease（YP269576）と５２％の相同性を示した。その他の公知のプロテアーゼやコラーゲン分解酵素との相同性は極めて低く、成熟型コラーゲン分解酵素は新規な酵素であることが示唆された。従って、配列番号３に示すアミノ酸の１番目のアミノ酸から６３６番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列と適切なアライメントがなされた場合、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有し、酵素学的特性の１〜４を満たすコラーゲン分解酵素は本発明に包含される。
【００３１】
一般的にアルカリプロテアーゼの遺伝子は、長いプレプロ配列を有している。プレ配列は酵素の菌体外への分泌に必要であり、プロ配列は酵素の活性型立体構造を形成する際に必要な配列である。本発明者らは、配列表の配列番号２で表わされるプレプロ配列を含むコラーゲン分解酵素前駆体をコードする全遺伝子配列を見出し、配列番号１で表わされる同前駆体のアミノ酸配列を見出した。更に、このコラーゲン分解酵素前駆体から、配列番号３で表わされる、菌体外に生産される本発明のコラーゲン分解酵素のアミノ酸配列、即ち成熟酵素のアミノ酸配列を見出したものである。
【００３２】
本発明のコラーゲン分解酵素は、例えばアルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株の染色体ＤＮＡからクローニングし、適当なベクターと宿主菌を用いて大量に生産することができる。さらに、成熟コラーゲン分解酵素よりも分子量の小さい、２種類の小型化コラーゲン分解酵素の生産をも可能とすることができる。この小型化酵素は成熟酵素に比べてＣ末端側においてアミノ酸の欠損がある。
この２種類の小型化コラーゲン分解酵素ＡおよびＢは、それぞれ配列番号３に示すアミノ酸配列の４４１番目から６３６番目のアミノ酸（配列番号４の１３２１〜１９０８番目の番目ヌクレオチドに相当する）、および配列番号３に示すアミノ酸配列の５５１番目から６３６番目のアミノ酸（配列番号４の１６５４〜１９０８番目の番目ヌクレオチドに相当する）が欠損しているものである。
【００３３】
即ち、小型化コラーゲン分解酵素Ａは、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するたんぱく質から構成される。これは、配列番号６に示す塩基配列の塩基を有するＤＮＡによりコードすることができるものである。
配列番号５のアミノ酸配列の相同性を検索した結果、シュワネラ アマゾネンシス（Shewanella amazonensis）ＳＢ２Ｂ株の生産する cold-active alkaline serine protease（YP929185）と５７％の相同性を示した。その他の公知のプロテアーゼやコラーゲン分解酵素との相同性は極めて低く、小型化コラーゲン分解酵素Ａは新規な酵素であることが示唆された。従って、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するたんぱく質のアミノ酸配列と適切なアライメントがなされた場合、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有し、酵素学的特性の１〜４を満たすコラーゲン分解酵素は本発明に包含される。
【００３４】
一方、小型化コラーゲン分解酵素Ｂは、配列番号７に示すアミノ酸配列を有するたんぱく質から構成される。これは、配列番号８に示す塩基配列の塩基を有するＤＮＡによりコードすることができるものである。
配列番号７のアミノ酸配列の相同性を検索した結果、コルウェリア サイクレエリスリア（Colwellia psychrerythraea）３４Ｈ株の生産する cold-active alkaline serine protease（YP269576）と５３％の相同性を示した。その他の公知のプロテアーゼやコラーゲン分解酵素との相同性は極めて低く、小型化コラーゲン分解酵素Ｂは新規な酵素であることが示唆された。従って、配列番号７に示すアミノ酸配列を有するたんぱく質のアミノ酸配列と適切なアライメントがなされた場合、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有し、酵素学的特性の１〜４を満たすコラーゲン分解酵素は本発明に包含される。
【００３５】
また、本発明のコラーゲン分解酵素をコードする遺伝子は、上述したコラーゲン分解酵素産生菌、例えばアルカリモナス属に属する微生物、好ましくはアルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株から、例えばショットガンクローニング、あるいは特定のプライマーを用いたＰＣＲ増幅等によって、本発明の遺伝子を取得することができる。
【００３６】
本発明遺伝子を用いてコラーゲン分解酵素を生産するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記コラーゲン分解酵素遺伝子を組込み、該組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、当該培養液からコラーゲン分解酵素を採取すればよい。
即ち、上記のアルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株から本発明酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得した後、遺伝子工学技術を用いて組換え微生物を作製し、当該組換え微生物を培養する方法が挙げられる。具体的には、本発明酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を上記菌株より取得し、次いでこのヌクレオチド配列を適当なベクターに組込み、更に、このベクターにより大腸菌等の宿主を形質転換し、これを培養して本発明酵素を産生させ、その培養物より本発明酵素を採取すればよい。
【００３７】
培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。微生物の資化可能な炭素源としては、グルコース、マルトース、マンノースなどが使用することができ、微生物の資化可能な窒素源としては、魚肉エキス、ポリペプトン、カゼイン、コラーゲンなどが使用することができる。
【００３８】
従って、本発明酵素またはその前駆体のアミノ酸配列をコードする遺伝子としては、具体的には、下記（ａ）〜（ｈ）からなる群より選ばれる遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号３に示す成熟酵素を構成するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号３に示す成熟酵素を構成するアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号５に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号７に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号７に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号２に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、又は
（ｈ）配列番号２に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコラーゲン分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
から選ばれる遺伝子である。
【００３９】
ここでいう、１個もしくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列とは、これらのもとの配列と等価の配列を意味し、１個もしくは複数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列であって、依然としてコラーゲン分解活性を保持する配列をいい、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００４０】
また、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル 第２版（Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd ed.）」（T. Maniatisら編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、１９８９年）に記載の条件等が挙げられる。具体的には、ストリンジェントな条件として、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート、１００μｇ／ｍＬの熱変性ニシン精子ＤＮＡを含む溶液中で、プローブとともに５０〜６５℃の温度で一晩保存しハイブリダイズさせる、という条件が挙げられる。
【００４１】
なお、当該等価のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（Mutan-super Express Km キット；タカラ社製）等を用いて変異を導入すればよい。
【００４２】
かくして得られた培養物中からの成熟型コラーゲン分解酵素や小型化コラーゲン分解酵素の採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養物から遠心分離または濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液または乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。以上のように調製された本発明のコラーゲン分解酵素は、医療や化粧品、食品分野におけるコラーゲンペプチドの生産や、写真フィルム特にレントゲン用写真フィルムからの銀イオンの回収など工業的利用が可能な酵素として有用である。
【実施例】
【００４３】
次に、実施例によって本発明を更に詳しく説明する。実施例中で特に注記しないものは「％」表示は質量％である。
【００４４】
なお、以下の実施例において、コラーゲン分解酵素の活性は以下の方法によって測定して求めた。
【００４５】
２．５％（ｗ／ｖ）コラーゲン（シグマアルドリッチ）、１ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）０．０９ｍＬを４５℃で２分間保温した後、０．０１ｍＬの酵素溶液を添加し、４５℃で２５分間反応を行った。１００％トリクロロ酢酸溶液（ＴＣＡ溶液）０．２５ｍＬを添加して反応を停止し、氷上で１５分間放置した後、遠心分離（２０，４００×ｇ，１０分間）して酸変性タンパク質を沈殿させた。ＤＣプロテインアッセイキット（バイオラッド）を用いて、得られた上清中の可溶性タンパク質を定量した。
一方、酵素溶液の代わりに１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）を添加したものを、ブランクに用いた。酵素１単位（Ｐ．Ｕ）は、上記の反応条件において１分間に１ｍｍｏＬのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質分解物を遊離する酵素量とした。
【００４６】
実施例１：コラーゲン分解酵素生産菌のスクリーニング
鳥島沖海底土壌より採取したサンプルを１．０％コラーゲン含有アルカリ寒天培地へ塗抹し、４℃で１ヶ月間、静置培養を行った。生育した菌を選抜し、純化した後に液体培地へ接種し、１５℃で２日間、振盪培養を行い、上清液中のコラーゲン分解活性を測定した。スクリーニング用の液体培地組成は次の表１に示すものであり、これにコラーゲン（タイプ１、シグマアルドリッチ）１．０％を加えた。得られた培養液から、コラーゲン分解酵素生産量の高い菌株としてアルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株を選抜した。
【００４７】
【表１】
【００４８】
実施例２：コラーゲン分解酵素の生産と精製、Ｎ末端および内部アミノ酸配列の決定
アルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株を、前記表１に示す組成からなる５００ｍＬの液体培地に接種し、１５℃、３日間振盪培養を行った。
培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、３０分間、４℃）し、得られた上清液４８０ｍＬに対し、硫安を８０％飽和になるように徐々に加え遠心分離（９,０００×ｇ、３０分間、４℃）し、沈殿したタンパク質を回収した。回収したタンパク質を１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）に溶解した後、限外濾過により脱塩濃縮した。溶解したタンパク質を、予め１００ｍＭグリシン水酸化−ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）にて平衡化しておいた ＤＥＡＥ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムへ添着させ、０．２２Ｍ塩化ナトリウムによりコラーゲン分解活性を有する吸着タンパク質を溶出した。
次いで、予め１Ｍ硫安を含む１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）で平衡化しておいたＢｕｔｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムへ添着させた後、１Ｍ〜０．５Ｍ硫安の直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させた。コラーゲン分解活性画分を集め、限外ろ過にて濃縮脱塩を行った。濃縮液のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、分子量６０ｋＤａ付近に２本のタンパク質バンドが確認された。これらのバンドをＰＶＤＦ膜（バイオラッド社製）にブロッティングし、アミノ酸シークエンサー（４７６Ａ型、アプライドバイオシステムズ製）にてＮ末端からのアミノ酸配列を決定した。
両方のバンドのアミノ酸配列は一致しており、Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎの１９アミノ酸配列が決定された。したがって、２本のバンドは双方とも同一のコラーゲン分解酵素であると判断した。分子量の小さいバンドは、分子量の大きいバンドのＣ末端部分が欠損したものと考えられた。
次に、Achromobacter Protease I (Residue-specific Proteases Kit, タカラバイオ)を用いて精製コラーゲン分解酵素を部分的に切断し、得られたペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、バンドのアミノ酸配列を解析した。その結果、Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｐの２０アミノ酸配列が決定された。
【００４９】
実施例３：コラーゲン分解酵素の性質
実施例２で得られた精製酵素（本発明酵素）を用いてその性質を検討した。
(1)最適反応ｐＨ：
２．５％（ｗ／ｖ）コラーゲン（シグマアルドリッチ）を含む１００ｍＭのｐＨが６．０から１３．０の範囲の下記の種々の緩衝液を用いて、本発明酵素によるコラーゲン分解反応を行った。
ｐＨ６．０−８．０ ・・・ モルホリノプロパンスルホン酸−水酸化ナトリウム
(MOPS)、（●）
ｐＨ７．１−８．９ ・・・ トリス−塩酸、（○）
ｐＨ８．０−１０．０ ・・・ ホウ酸−塩化カリウム−水酸化ナトリウム、（△）
ｐＨ８．５−１１．１ ・・・ グリシン−水酸化ナトリウム、（■）
ｐＨ１０．９−１３．０ ・・ 塩化カリウム−水酸化ナトリウム、（▲）
その結果を図１に示す。この図からわかるように、本発明酵素はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５〜９．０）中で最も反応速度が高かった。
【００５０】
(2)最適反応温度
標準反応条件｛２．５％（ｗ／ｖ）コラーゲン（シグマアルドリッチ）、１ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）０．０９ｍＬ、酵素画分０．０１ｍＬ｝において、反応温度を５〜７０℃に種々変化させ、本発明酵素によるコラーゲン分解反応を行った。その結果を図２に示す。この結果からわかるように、本発明酵素は４０〜５０℃で最も高い反応速度を示し、特に４５℃で最も高い反応速度を示した。
【００５１】
(3)熱安定性
１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）中に本発明酵素を添加して５〜５５℃の各温度で１５分間加熱処理を行ない、標準反応条件｛２．５％（ｗ／ｖ）コラーゲン（シグマアルドリッチ）、１ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）０．０９ｍＬ、酵素画分０．０１ｍＬ｝により残存活性を求めた。加熱前の活性を１００％として加熱処理後の残存活性を図３に示す。本発明のコラーゲン分解酵素は、４５℃までは安定で優れた活性を保持することが判った。また、塩化カルシウム（１mＭ）を添加して同様の試験を行なったところ、塩化カルシウムの添加によってその安定性を若干増加させることができた。
【００５２】
(4)基質特異性
同様に標準反応条件下においてコラーゲンの代わりに様々なタンパク質（カゼイン、ケラチン、ゼラチン、エラスチン）を添加し、これらのたんぱく質の分解反応を行った。その結果を図４に示す。ゼラチンに対する活性が最も高く、これを１００％としてその他の各基質に対する反応性を相対活性とした。この結果からわかるように、本発明酵素は特にコラーゲンおよびゼラチンに対して大きな分解活性を示した。
【００５３】
(5)合成基質に対する作用
合成オリゴペプチド基質として表２に示すもの又は下記のものを用いて本発明のコラーゲン分解酵素の各種合成基質に対する反応性を調べた。
１ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）０．０８５ｍＬに１０ｍＭの合成基質溶液０．００５ｍＬを混合し４５℃で２分間恒温した後、酵素画分０．０１ｍＬを加え、５分間反応を行った。分光光度計を用いて４０５
ｎｍにおける吸光度を２０秒ごとに測定して、１分間あたりに遊離したｐ-ニトロアニリンを定量した。
N-メトキシスクシニル-Ala-Ile-Pro-Met-p-ニトロアニリド(ＡＩＰＭ)に対する活性が最も高く、これを１００％としてその他の各合成基質に対する反応性を相対活性として表２に示す。
【００５４】
【表２】
【００５５】
ここで、ＡＩＰＭはN-メトキシスクシニル-Ala-Ile-Pro-Met-p-ニトロアニリド、ＡＡＰＦはN-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド、ＡＡＰＭはN-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Met-p-ニトロアニリド、ＡＡＰＬはN-グルタリル-Ala-Ala-Pro-Leu-p-ニトロアニリド、ＡＡＶＡはN-スクシニル-Ala-Ala-Val-Ala-p-ニトロアニリドである。また本発明酵素は、ＡＩＰＭとＡＡＰＦに対して優れた活性を示し、ＡＡＰＭとＡＡＰＬでもある程度の活性を示し、ＡＡＶＡに対してわずかながら活性を示したが、ＡＡＰＶ（N-メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Val-p-ニトロアニリド）に対して全く活性を示さなかった。
次に、同様の方法によってコラゲナーゼ用の合成オリゴペプチド基質としてＮ-スクシニル-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-４-メチルクマリル-７-アミド（ＧＰＬＧＰ）に対する反応性を調べた。反応組成、条件は上記と同様にし、分解により遊離する7-アミノ-4-メチルクマリンを分光光度計を用いて３７０ｎｍにて測定した。その結果、本発明酵素はＧＰＬＧＰを分解することはなく、活性を示さなかった。
【００５６】
(4)分子量
本発明酵素の分子量を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した。分子量マーカーにはプレシジョンPlusデュアルスタンダード（バイオラッド）を用いた。その結果を図５に示す。この結果から本発明酵素の分子量は５０〜７０ｋＤａであった。
【００５７】
(5)阻害剤
１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）に、表３に示す各種阻害剤を所定濃度になるように加え、本発明酵素を添加し、１５℃で１５分間恒温した。その後、標準反応条件｛２．５％（ｗ／ｖ）コラーゲン（シグマアルドリッチ）、１ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）０．０９ｍＬ、酵素画分０．０１ｍＬ｝において、残存活性を測定した。その結果を表３に示す。
【００５８】
【表３】
【００５９】
ここで、ＰＭＳＦはフェニルメチルスルフォニルフルオライドであり、ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸である。
表３に示すように、本発明のコラーゲン分解酵素は、セリンプロテアーゼの阻害剤であるＰＭＳＦより完全に阻害され、キレート剤であるＥＤＴＡにより活性が３５%となった。
【００６０】
実施例４：コラーゲン分解酵素遺伝子のクローニング
染色体ＤＮＡを抽出するために、アルカリモナス コラゲニマリナ ＡＣ４０株を表１に示す組成の１０ｍＬの液体培地に接種し、３３℃で１日間振盪培養した。続いてＧｅｎｏｍｉｃ−Ｔｉｐ１００／Ｇ（キアゲン）を用いて菌体から染色体ＤＮＡを抽出した。
実施例２で得られた、Ｎ末端の１９アミノ酸配列と内部の２０アミノ酸配列を基に、それぞれ配列番号９に示すプライマー１（５‘−ＴＡＹ ＧＧＮ ＴＡＹ ＡＣＮ ＡＴＧ ＧＴ−３’、ここでＮはＧＡＴＣ、 ＹはＣＴ、 ＲはＡＧを示す。）、配列番号１０に示すプライマー２（５’−ＴＣＮ ＡＣＹ ＴＧＮ ＧＣＲ ＴＴＮ ＣＫＹ ＴＧ−３’、ここでＫはＧＴを示す。）をデザインした。上記で精製した染色体ＤＮＡを鋳型に、プライマー１（配列番号９）とプライマー２（配列番号１０）、ＥＸ Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、９４℃で４分間変性後、９４℃で１分間、５１．２℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を１サイクルとしてこれを３０サイクル行なった。その結果、約０．５ｋｂのＰＣＲ増幅断片を取得した。得られたＤＮＡ断片をｐＣＲ４−Ｔｏｐｏ（ＴＯＰＯ ＴＡ ＰＣＲ クローニングキット、インビトロジェン）に挿入し、Ｍ１３フォワードプライマー（インビトロジェン）およびＭ１３リバースプライマー（インビトロジェン）、Big Dye Teminator Cycle Sequencingキット（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてシーケンスを行い、コラーゲン分解酵素遺伝子の部分塩基配列を決定した。得られた増幅断片を基にプライマーを合成し、インバースＰＣＲ法とＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ キット（タカラバイオ）によりさらに上流と下流域の塩基配列を決定し、その中にプレプロ配列を含むコラーゲン分解酵素をコードする２２８３塩基対から成るオープンリーディングフレーム（配列番号２）を見出した。この塩基配列から配列番号１に示したアミノ酸配列を決定した。決定されたアミノ配列中には精製酵素のＮ末端アミノ酸配列（配列番号３の１〜１９番目のアミノ酸）およびAchromobacter Protease Iによって部分消化して得られたペプチド断片のアミノ酸配列（配列番号３の１８３〜２０１番目のアミノ酸）が確認された。
【００６１】
実施例５：組換え酵素の生産
コラーゲン分解酵素遺伝子の５’末端（配列番号２の１〜１９番目のヌクレオチド）にアニールするプライマー３（配列番号１１、５‘−ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＣＡ ＴＡＴ ＧＴＣ ＣＡＡ ＡＣＣ ＡＣＡ ＴＴＴ ＣＴ−３’、 下線部は新たに付加したＮｄｅＩサイトを示す）、さらに３’末端（配列番号２の２２６５〜２２８３番目のヌクレオチド）にアニールするプライマー４（配列番号１２、５’−ＣＣＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＴＡ ＣＴＣ ＧＴＡ ＧＣＴ ＡＡＣ ＴＴＴ Ｃ−３’、下線部は新たに付加したＥｃｏＲＩサイトを示す）、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を用いて、ＡＣ４０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、コラーゲン分解酵素をコードする遺伝子（配列番号２の両側にＮｄｅＩとＥｃｏＲＩサイトを新しく付加した遺伝子）をＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲ増幅断片をＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで分解した後、同様に処理しておいたベクターｐＲＳＥＴ−ａ（インビトロジェン）に導入し、組換えプラスミド（ｐＲＳＥＴ−ＡｃｐII）を調製した。この組換えプラスミドを用いて大腸菌ＴＯＰ１０株（インビトロジェン）を形質転換した。この形質転換体を２％スキムミルクと１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢプレート[１％トリプトン（ディフコ）、０．５％酵母エキス（ディフコ）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天]に生育させたところコロニーの周辺にスキムミルク溶解斑が認められた。
【００６２】
続いて、小型化コラーゲン分解酵素Ａ（配列番号５）と小型化コラーゲン分解酵素Ｂ（配列番号７）を生産するための組換えプラスミドを調製した。小型化コラーゲン分解酵素Ａ（配列番号５）と小型化コラーゲン分解酵素Ｂ（配列番号７）は、それぞれ配列番号３の４４１〜６３６番目のアミノ酸（配列番号４の１３２１〜１９０８番目のヌクレオチド）、５５１〜６３６番目のアミノ酸（配列番号４の１６５４〜１９０８番目のヌクレオチド）を削ったものである。プライマー６（配列番号１４、５‘−ＡＣＣ ＧＣＴ ＧＴＣ ＧＣＣ ＡＧＣ ＣＡＧ−３’、配列番号２の１６７５〜１６９２番目のヌクレオチドにアニールする。）とプライマー７（配列番号１５、５’−ＡＣＧ ＡＣＧ ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＣＴ ＧＡＴ ＡＴ−３’、配列番号２の２００６〜２０２５番目のヌクレオチドにアニールする。）、プライマー５（配列番号１３、５‘−ＴＡＡ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＡＡ ＧＣＴ ＴＧＡ ＴＣＣ−３’、コラーゲン分解酵素のストップコドンと、その下流域のｐＲＳＥＴ−ａ（インビトロジェン）部分にアニールする）を設計した。コラーゲン分解酵素生産用の組換えプラスミド（ｐＲＳＥＴ−ＡｃｐII）を鋳型として、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）を用いたＰＣＲにより、プライマー５（配列番号１３）とプライマー６（配列番号１４）を用いて小型化コラーゲン分解酵素Ａ（配列番号５）を、プライマー５（配列番号１３）とプライマー７（配列番号１５）を用いて小型化コラーゲン分解酵素Ｂ（配列番号７）をコードするＤＮＡ断片をそれぞれ調製した。ＰＣＲの条件は、小型化コラーゲン分解酵素Ａ（配列番号５）と小型化コラーゲン分解酵素Ｂ（配列番号７）ともに９６℃で１分間変性後、９６℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間を１サイクルとして、これを３０サイクル行なった。その後、それぞれのＤＮＡ断片を分子内で環状化させて小型化コラーゲン分解酵素の発現プラスミドとするために、ＤＮＡ断片の５’末端をリン酸化してライゲーションした。小型化コラーゲン分解酵素Ａ（配列番号５）、小型化酵素Ｂ（配列番号７）のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号６、配列番号８に相当する。
得られたそれぞれの発現用プラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（インビトロジェン）を形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び３５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ培地にて３０℃、一晩好気的に振盪培養を行った結果、培養液中の小型化コラーゲン分解酵素Ａ（配列番号５）、小型化コラーゲン分解酵素Ｂ（配列番号７）の生産量はそれぞれ０．４４ Ｐ．Ｕ／Ｌ、０．６１ Ｐ．Ｕ／Ｌであった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明のコラーゲン分解酵素は、従来のたんぱく質分解酵素とはアミノ酸配列の異なる新規な酵素であり、特にコラーゲンとゼラチンに対して高い分解活性を有する。従って、コラーゲンとゼラチンを分解して低分子量化することができ、このような低分子量コラーゲンや低分子量ゼラチンを必要とする食品産業や保湿性や防シワ作用を利用する化粧品分野、或いは種々の医療分野において有用である。また、本発明により得られたこれらの酵素の遺伝子配列を利用することによって、遺伝子工学技術を用いてかかる酵素を容易に製造することができ、上記の産業分野での低分子量コラーゲンや低分子量ゼラチンの利用のために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明酵素の酵素活性とｐＨの関係を示す図である。
【図２】本発明酵素の温度依存性を評価するための酵素活性と温度の関係を示す図である。
【図３】本発明酵素の熱安定性を評価するための酵素活性と温度の関係を示す図である。
【図４】本発明酵素の種々のたんぱく質に対する酵素活性を示す図である。
【図５】本発明酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の理化学的性質を有する新規なコラーゲン分解酵素。
(1)作用：
カゼイン、ゼラチン、コラーゲン、ケラチンおよびエラスチンの蛋白質を分解し、特にコラーゲンおよびゼラチンに対して強い分解作用を有する。
また、合成基質であるN-メトキシスクシニル-Ala-Ile-Pro-Met-p-ニトロアニリド、N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド、N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Met-p-ニトロアニリド、N-グルタリル-Ala-Ala-Pro-Leu-p-ニトロアニリド、及びN-スクシニル-Ala-Ala-Val-Ala-p-ニトロアニリドに対して分解作用を有するが、N-メトキシスクシニル- Ala-Ala-Pro-Val-p-ニトロアニリド、及びN-スクシニル-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-４-メチルクマリル-７-アミドに対して分解作用を示さない。
(2)最適反応ｐＨ： ｐＨ８．５〜９．０
(3)最適反応温度及び熱安定性：
最適反応温度は４０〜５０℃であり、４５℃まで安定な酵素活性を有する。
(4)分子量：
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、５０，０００〜７０，０００である。
(5)阻害剤
セリンプロテアーゼの阻害剤であるフェニルメチルスルフォニルフルオライドにより完全に阻害されるが、キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸では１０ｍＭ濃度で３５％の残存活性を示す。
【請求項２】
配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の新規なコラーゲン分解酵素。
【請求項３】
配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の新規なコラーゲン分解酵素。
【請求項４】
配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する、新規なコラーゲン分解酵素。
【請求項５】
配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する、新規なコラーゲン分解酵素。
【請求項６】
アルカリモナス コラゲニマリナ由来のものである、請求項１ないし５のいずれかに記載の新規なコラーゲン分解酵素。
【請求項７】
配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有する、新規なコラーゲン分解酵素前駆体。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれかに記載の新規なコラーゲン分解酵素またはその前駆体のアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、下記（ａ）〜（ｈ）からなる群、
（ａ）配列番号３に示す成熟酵素を構成するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号３に示す成熟酵素を構成するアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号５に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号７に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号７に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号２に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、又は
（ｈ）配列番号２に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコラーゲン分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
から選ばれるコラーゲン分解酵素をコードする遺伝子。
【請求項９】
請求項８に記載の遺伝子のいずれかを含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターにより形質転換された微生物。
【請求項１１】
アルカリモナス コラゲニマリナ、又は請求項１０に記載の形質転換された微生物を培養し、その培養液よりコラーゲン分解酵素を採取することを特徴とする、前記理化学的性質又は前記アミノ酸配列を有するコラーゲン分解酵素の製造方法。
【請求項１】
次の理化学的性質を有する新規なコラーゲン分解酵素。
(1)作用：
カゼイン、ゼラチン、コラーゲン、ケラチンおよびエラスチンの蛋白質を分解し、特にコラーゲンおよびゼラチンに対して強い分解作用を有する。
また、合成基質であるN-メトキシスクシニル-Ala-Ile-Pro-Met-p-ニトロアニリド、N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド、N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Met-p-ニトロアニリド、N-グルタリル-Ala-Ala-Pro-Leu-p-ニトロアニリド、及びN-スクシニル-Ala-Ala-Val-Ala-p-ニトロアニリドに対して分解作用を有するが、N-メトキシスクシニル- Ala-Ala-Pro-Val-p-ニトロアニリド、及びN-スクシニル-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-４-メチルクマリル-７-アミドに対して分解作用を示さない。
(2)最適反応ｐＨ： ｐＨ８．５〜９．０
(3)最適反応温度及び熱安定性：
最適反応温度は４０〜５０℃であり、４５℃まで安定な酵素活性を有する。
(4)分子量：
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、５０，０００〜７０，０００である。
(5)阻害剤
セリンプロテアーゼの阻害剤であるフェニルメチルスルフォニルフルオライドにより完全に阻害されるが、キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸では１０ｍＭ濃度で３５％の残存活性を示す。
【請求項２】
配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の新規なコラーゲン分解酵素。
【請求項３】
配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の新規なコラーゲン分解酵素。
【請求項４】
配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する、新規なコラーゲン分解酵素。
【請求項５】
配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する、新規なコラーゲン分解酵素。
【請求項６】
アルカリモナス コラゲニマリナ由来のものである、請求項１ないし５のいずれかに記載の新規なコラーゲン分解酵素。
【請求項７】
配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列、又はこの配列中の１個もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有する、新規なコラーゲン分解酵素前駆体。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれかに記載の新規なコラーゲン分解酵素またはその前駆体のアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、下記（ａ）〜（ｈ）からなる群、
（ａ）配列番号３に示す成熟酵素を構成するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号３に示す成熟酵素を構成するアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号５に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号７に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号７に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号２に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、又は
（ｈ）配列番号２に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコラーゲン分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
から選ばれるコラーゲン分解酵素をコードする遺伝子。
【請求項９】
請求項８に記載の遺伝子のいずれかを含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターにより形質転換された微生物。
【請求項１１】
アルカリモナス コラゲニマリナ、又は請求項１０に記載の形質転換された微生物を培養し、その培養液よりコラーゲン分解酵素を採取することを特徴とする、前記理化学的性質又は前記アミノ酸配列を有するコラーゲン分解酵素の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００９−１１８７８２（Ｐ２００９−１１８７８２Ａ）
【公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２９６５６４（Ｐ２００７−２９６５６４）
【出願日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【出願人】（５０４１９４８７８）独立行政法人海洋研究開発機構 (110)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【出願人】（５０４１９４８７８）独立行政法人海洋研究開発機構 (110)
【Ｆターム（参考）】
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