新規なＲＡＮＫＬ−グリコサミノグリカン結合体、及び該活性調節剤。
【課題】本発明は、ＲＡＮＫＬ分子とデルマタン硫酸又はコンドロイチン硫酸Ｅと結合体並びに該結合体を精製するための担体、方法等を提供し、ＲＡＮＫＬ分子、デルマタン硫酸又はコンドロイチン硫酸Ｅの活性の調節方法を提供することを課題とする。
【解決手段】デルマタン硫酸及び／又はコンドロイチン硫酸ＥとＲＡＮＫＬ分子とから構成される結合体を提供する。また、ＲＡＮＫＬ分子を固定化した担体を提供する。また、該担体を用いること特徴とする、該結合体、デルマタン硫酸又はコンドロイチン硫酸Ｅを分離、精製及び／又は検出する方法を提供する。さらに該結合体又はＲＡＮＫＬ分子を、分離、精製及び／又は検出するための、デルマタン硫酸又はコンドロイチン硫酸Ｅを固定化した担体を提供する。また、該担体を用いることを特徴とする、該結合体又はＲＡＮＫＬ分子を分離、精製及び／又は検出する方法を提供する。
【解決手段】デルマタン硫酸及び／又はコンドロイチン硫酸ＥとＲＡＮＫＬ分子とから構成される結合体を提供する。また、ＲＡＮＫＬ分子を固定化した担体を提供する。また、該担体を用いること特徴とする、該結合体、デルマタン硫酸又はコンドロイチン硫酸Ｅを分離、精製及び／又は検出する方法を提供する。さらに該結合体又はＲＡＮＫＬ分子を、分離、精製及び／又は検出するための、デルマタン硫酸又はコンドロイチン硫酸Ｅを固定化した担体を提供する。また、該担体を用いることを特徴とする、該結合体又はＲＡＮＫＬ分子を分離、精製及び／又は検出する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＲＡＮＫＬ−グリコサミノグリカン結合体、ＲＡＮＫＬ活性調整剤及びグリコサミノグリカン活性調節剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本出願書類において用いる略号を説明する。
ＣＨ：コンドロイチン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＣＳ−Ａ：コンドロイチン硫酸Ａ
ＤＳ：デルマタン硫酸（ＣＳ−Ｂ：コンドロイチン硫酸ともいう）
ＣＳ−Ｃ：コンドロイチン硫酸Ｃ
ＣＳ−Ｄ：コンドロイチン硫酸Ｄ
ＣＳ−Ｅ：コンドロイチン硫酸Ｅ
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン
ＧＡＧは、細胞外マトリクスの構成成分の一つとして生体内に存在しており、その中のＣＳは、関節領域において、サプリメント、関節内治療薬として既に臨床応用されている。最近の研究においては、その動的な生体活性が注目されおり、ＤＳ、ＣＳ−Ｅ及びヘパラン硫酸は、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びＣＤ４４に特異的に結合し生体活性を発現すること（非特許文献１）や硫酸化多糖類がＢＭＰと結合して、その生理活性を増強すること（非特許文献２）等の報告がある。また、骨質を溶かす酵素の破骨細胞による放出や骨表面の硫酸化を阻害することに基づく骨吸収の抑制作用を有する物質についての報告や、硫酸化ＧＡＧのカルシウム塩を含有する口腔用組成物が歯周病原性細菌の内毒素刺激による骨のカルシウム遊離量に抑制効果を示すこと（特許文献１）や硫酸化ＧＡＧナトリウムとカルシウム化合物を併用する骨代謝改善剤が内毒素やヒト副甲状腺ホルモン等による骨のカルシウム遊離量に抑制効果を示すこと（特許文献２）及びインシュリン、プロタミン及びＧＡＧから選択される少なくとも１種を含む石灰化促進剤と骨補填剤からなる骨疾患治療剤（特許文献３）等の報告がある。
【０００３】
一方、ＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｒ ｏｆ ＮＦ−κＢ ｌｉｇａｎｄ）は、ヤスダら及びPenningerらのグループによって破骨細胞の分化を制御する中心的なサイトカインであることが報告されたが（非特許文献３，４）、既にＴ細胞上に発現する樹状細胞活性化因子としてクローニングされていた分子であった。
【０００４】
ＲＡＮＫＬは、骨生物学における不可欠なサイトカインであり、単球−マクロファージ前駆体からの破骨細胞への分化を媒介し、かつ成熟破骨細胞の生存及び機能を調節する（非特許文献５）。またＲＡＮＫＬは免疫生物学的にも重要な役割を果たし、Ｔ細胞、樹状細胞及びそれらの前駆体上で発現されることにより、Ｔ及びＢリンパ球の分化並びに免疫系における樹状細胞の生存を媒介する。
【０００５】
またＲＡＮＫＬは、破骨細胞及びその前駆細胞の細胞表面に発現するＲＡＮＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｒ ｏｆ ＮＦ−κＢ）と結合することによって、破骨細胞及びその前駆細胞を活性化し、それらの細胞の分化・成熟、寿命延長、骨吸収亢進を誘発することが知られている（非特許文献６）。
【０００６】
しかしながら、特定の構造を持ったＧＡＧがＲＡＮＫＬと結合体を形成すること、及びその結合体の生物学的活性を制御する方法は知られていない。
【０００７】
【特許文献１】特開平６−８０５４６号公報
【特許文献２】特開平７−５３３８８号公報
【特許文献３】特開昭６２−２０１８２５号公報
【非特許文献１】カワシマ、Ｈ（Kawashima, H.）ら、２０００年、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、第２７５巻、第４５号、ｐ．３５４４８−３５４５６
【非特許文献２】タカダ、Ｔ（Takada， T.）ら、２００３年、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、第２７８巻、第４４号、ｐ．４３２２９−４３２３５
【非特許文献３】ヤスダ、Ｈ（Yasuda， H.）ら、１９９８年、プロシーディング ナショナル アカデミック サイエンス ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、第９５巻、ｐ３５９７−３６０２
【非特許文献４】レイシー、Ｄ. Ｌ．（Lacey D. L.）ら、１９９８年、セル（Cell）、第９３巻、ｐ１６５−１７６
【非特許文献５】リ、Ｊ.（Ｌｉ Ｊ．）ら、２０００年、プロシーディング ナショナル アカデミック サイエンス ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、第９７巻、ｐ１５６６−１５７１
【非特許文献６】アンダーソン（Anderson）ら、１９９７年、ネイチャー（Nature）、第３９０巻、ｐ２５１９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＲＡＮＫＬ分子とＤＳ又はＣＳ−Ｅとの新規な結合体並びにＲＡＮＫＬ，ＤＳ又はＣＳ−Ｅを固定化した担体、該担体を用いたＲＡＮＫＬ、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを分離、精製及び／又は検出する方法、該担体を用いたキット、該結合体の生物学的活性の促進又は阻害方法、並びに該結合体を含有する医療用材料等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＲＡＮＫＬ分子がＤＳ及び／又はＣＳ−Ｅと特異的に結合することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、ＤＳ及び／又はＣＳ−ＥとＲＡＮＫＬ分子とから構成される結合体（以下、「本発明結合体」という。）を提供する。
【００１１】
また本発明は、ＲＡＮＫＬ分子を固定化した担体（以下、「本発明担体１」という。）を提供する。
【００１２】
また本発明は、本発明結合体又はＲＡＮＫＬ分子を、分離、精製及び／又は検出するための、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを固定化した担体（以下、「本発明担体２」という。）を提供する。
【００１３】
以下、本発明担体１及び２をあわせて単に「本発明担体」ともいう。
【００１４】
また本発明は、本発明担体１を用いることを特徴とする、本発明結合体、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを分離、精製及び／又は検出する方法（以下、「本発明方法１」という。）を提供する。
【００１５】
また本発明は、本発明担体２を用いることを特徴とする、本発明結合体又はＲＡＮＫＬ分子を、分離、精製及び／又は検出する方法（以下、「本発明方法２」という。）を提供する。
【００１６】
また本発明は、本発明担体１を含むキット（以下、「本発明キット１」という。）を提供する。
【００１７】
また本発明は、本発明担体２を含むキット（以下、「本発明キット２」という。）を提供する。
【００１８】
以下、本発明キット１及び２を単に「本発明キット」ともいう。
【００１９】
また本発明は、ＤＳ又はＣＳ−ＥによりＲＡＮＫＬ分子の生物学的活性を促進又は阻害する方法（以下、「本発明方法３」という。）を提供する。
【００２０】
また本発明は、ＲＡＮＫＬ分子により、ＤＳ又はＣＳ−Ｅの生物学的活性を促進又は阻害する方法（以下、「本発明方法４」という。）を提供する。
【００２１】
以下、本発明方法１〜４をあわせて単に「本発明方法」ともいう。
【００２２】
また本発明は、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを含有する、ＲＡＮＫＬ分子の生物学的活性を促進又は阻害する組成物（以下、「本発明組成物１」という。）を提供する。
【００２３】
また本発明は、ＲＡＮＫＬ分子を含有するＤＳ又はＣＳ−Ｅの生物学的活性を促進又は阻害する組成物（以下、「本発明組成物２」という。）を提供する。
【００２４】
また本発明は、本発明組成物１又は２を含有する医療用材料（以下、「本発明医療用材料２」という。）を提供する。
また本発明は、本発明結合体を含有する医療用材料（以下、「本発明医療用材料２」という。）を提供する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、新規物質としての本発明結合体が提供されるとともに、本発明担体、本発明方法並びに本発明キットが提供される。
【００２６】
また、生体内におけるＲＡＮＫＬ分子の生理的機能を、外部から与えるＤＳ又はＣＳ−Ｅによって、正・負の方向に制御できる可能性があり、それらＲＡＮＫＬ分子結合性のＤＳ及び／又はＣＳ−Ｅは医療への適用が期待され、ＤＳ及び／又はＣＳ−Ｅを含有する、ＲＡＮＫＬ分子の活性調整剤並びに調整方法が提供される。
【００２７】
また、実施例の結果からコンドロイチン硫酸の硫酸基の位置に活性に依存することから、ＤＳ又はＣＳ−Ｅの活性を、ＲＡＮＫＬ分子によって制御できる可能性があり、ＲＡＮＫＬ分子を含有する、ＤＳ及び／又はＣＳ−Ｅの活性調整剤並びに調節方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞本発明結合体
本発明結合体は、ＤＳ及び／又はＣＳ−ＥとＲＡＮＫＬ分子とから構成される結合体である。
【００２９】
本発明結合体に使用される「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」は広く市販されているもの（例えば生化学工業（株）社製等）を用いることができる。またＤＳはウシ腎、ＣＳ−Ｅはイカ脊索等から公知の方法により調整することもでき、化学的に合成することもできる。また「ＲＡＮＫＬ分子」も同様に市販されているものを用いることができ、遺伝子工学的及び生化学的に常用される方法を用いて製造することもできる。また発明の実施例におけるＡｆｆｉｎｉｘＱを用いた相互作用実験によりＤＳとＲＡＮＫＬの結合性を示した。
【００３０】
また、本発明結合体とは、ＲＡＮＫＬとＤＳ又はＲＡＮＫＬとＣＳ−Ｅとが結合しているものであればよく、上に記載されているようにＲＡＮＫＬ、ＤＳ及びＣＳ−Ｅの由来等も特に限定されない。また本発明結合体を製造するには、ＲＡＮＫＬ分子とＤＳ又はＣＳ−Ｅとを共存させればよく、その共存方法も特に限定されない。例えば、ＲＡＮＫＬ分子を有する細胞が含まれる培地にＤＳ又はＣＳ−Ｅを添加し共存することにより得ることもできる。
＜２＞本発明担体１
本発明担体１は、ＲＡＮＫＬ分子を固定化した担体である。
【００３１】
本発明担体１のＲＡＮＫＬ分子の担体への固定化は、代用的には組換えポリペプチドを少なくとも水不溶性担体に固定して行われる。固定化方法としては、（１）担体結合法、（２）包括法等、及びそれらを組み合わせた複合法が挙げられる。該固定化には、当該分野で汎用されている方法を用いることができる。
【００３２】
前記担体結合法としては、例えばイオン相互作用、疎水相互作用、物理的吸着などを利用する方法、共有結合などの化学的結合により行うことができる。
【００３３】
前記イオン相互作用を利用する担体結合方法では、デキストラン、セルロース、アガロース、デンプンなどの多糖類のイオン交換体、例えばＤＥＡＥ基、ＴＥＡＥ基、ＣＭ基、スルホン酸アルキル基などを持つ誘導体、イオン交換樹脂などを担体として用いることができる。
【００３４】
前記疎水相互作用を利用する担体結合方法では、ポリスチレンビーズやガラスビーズ、さらに、ブチル基やフェニル基などの疎水性官能基が結合された一般的な担体などを担体として用いることができる。
【００３５】
前記物理的な吸着を利用する担体結合方法では、例えば活性炭、酸性白土、漂白土、カオリナイト、アルミナ、シリカゲル、ベントナイト、金属酸化物、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウムなどの無機物質、デンプン、キチン、グルテン、セルロース、アガロース、タンニンなどの天然高分子、ポリスチレンなどの合成高分子、疎水性基を持ったアガロース誘導体などを担体として用いることができる。
【００３６】
前記共有結合などの化学的結合による担体結合方法としては、ペプチド法、ジアゾ法、アルキル化法、臭化シアン活性化法、架橋試薬による結合法、ユギ（Ｕｇｉ）反応を利用した固定化法、チオール・ジスルフィド交換反応を利用した固定化法、シッフ塩基形成法、キレート結合法、トシルクロリド法、生化学的特異結合法などが挙げられる。好ましくは、共有結合などのより安定した結合には、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応等を利用して行うことができ、公知の方法或いは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらにはそれらを修飾した方法の中から適宜選択して適用できる。好ましくは共有結合などのより安定した結合を形成できる化学的結合材・架橋剤などが使用される。
【００３７】
前記化学的結合材剤・架橋剤としては、カルボジイミド、イソシアネート、ジアゾ化合物、ベンゾキノン、アルデヒド、過ヨウ素酸、マレイミド化合物、ピリジルスルフィド化合物などが挙げられる。好ましい試薬としては、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ‘−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレイミド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネート、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル４−（１−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハクサンイミド（ＥＭＣＳ）、イミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、メチル−３−（４’−ジチオピリジル）プロピオンイミデート、メチル−４−メルカプトブチリルイミデート、メチル−３−メルカプトプロピオンイミデート、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテートなどが挙げられる。
【００３８】
前記ペプチド法では担体と所要のポリペプチドの間にペプチド結合を形成させて固定化される。例えばカルボキシル基を持つ担体をアジド、クロリド、イソシアネートなどの誘導体とし、当該ポリペプチド中の遊離アミノ基との間でペプチド結合を形成させる。ペプチド合成に用いられる試薬、例えばカルボジイミド試薬、ウッドワード試薬Ｋ（Ｎ−エチル−５−フェニルイソキサリウム−３’−スルホナート）などが用いられる。担体のアミノ基及びカルボキシル基と所要のポリペプチド中のアミノ基及びカルボキシル基との間でペプチド結合を形成させることもできる。
【００３９】
前記ジアゾ法は、芳香族アミノ基を持つ担体をジアゾニウム化合物とし、これと所要のポリペプチドとをジアゾカップリングさせて固定化するものである。遊離アミノ基、ヒスチジンのイミダゾール基、チロシンのフェノール性水酸基などを持つ当該ポリペプチドに好適に適用できる。担体としては、多糖類、アミノ酸共重合物、ポリアクリルアミド、スチレン系樹脂、エチレン・マレイン酸共重合物、多孔性ガラス、芳香族アミド誘導体などが挙げられる。
【００４０】
前記アルキル化法は、当該ポリペプチド中の遊離アミノ基、フェノール性水酸基、スルフヒドリル基をハロゲンの様な反応性官能基を持つ担体によりアルキル化して固定化する方法である。担体としては、ハロゲン化アセチル誘導体、トリアジニル誘導体、ハロゲン化メタクリル誘導体などが挙げられる。
【００４１】
前記臭化シアン活性化法は、デキストラン、セルロース、アガロース、デンプンなどの多糖類、多孔性ガラスなどを臭化シアンで活性化した後、当該ポリペプチドを固定化するものである。架橋試薬による結合法のうち、特にグルタルアルデヒドなどの二官能性試薬を用いた場合、セルロース、アガロース、アルブミン、ゼラチン、キトサンなどのアミノ基を導入されたあるいは有する天然高分子、合成高分子、多孔性ガラス、多孔性セラミックスなどの無機担体のアミノシラン誘導体などが挙げられる。
【００４２】
前記ユギ反応とは、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、イソニトリル基が共存していて反応させると縮合反応が起こることを利用するものである。カルボキシル基又はアミノ基を持つ担体と当該ポリペプチドとを混合した中にアセトアルデヒド及び３−ジメチルアミノプロピルイソシアニドを加えることで反応させるものが挙げられる。担体としては、多糖類、ポリアクリルアミドのアミノ誘導体、ナイロンのイソニトリル誘導体などが挙げられる。
【００４３】
前記生化学的特異結合法においては、特異的結合反応ペア同志の生化学的特異結合反応を利用するもので、例えば抗原とそれに対する抗体、抗体とハプテン、エフェクターとレセプター、酵素と酵素インヒビター、酵素基質、補酵素類、複合蛋白質における補欠分子団、レクチンと糖鎖含有物質、酵素と酵素基質、核酸とその相補的な核酸などが挙げられ、それらは公知のものの中から選んでよい。
【００４４】
前記包括法とは、多糖類や蛋白質などの天然高分子や合成高分子の細いゲル・マトリックスの中に当該ポリペプチドを閉じ込めることによる高分子ゲルを用いる方法と、膜で区切られた空間に当該ポリペプチドを閉じ込める方法とに大別できる。膜包括法には、半透性の固体膜に包み込むマイクロカプセル型膜包括法、半透膜性のホロー・ファイバーや限外濾過膜による空間に包み込む方法、液体状の膜に包み込むリポソーム型などの方法が挙げられる。
【００４５】
前記高分子ゲルを用いる方法は、網目構造を持つ高分子ゲルのマトリックスの中に当該ポリペプチドを閉じ込めて固定化するもので、固定時にゲルを球状、フィルム状、チューブ状、膜状に自由に成形できる。当該ゲルの調製法としては、モノマーと架橋剤を重合させて高分子ゲルを形成させる方法、プレポリマーあるいはオリゴマーを重合させる方法、高分子を可溶性の状態から不溶の状態に変化させることによりゲルを形成させる方法などが挙げられる。当該ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、光硬化性樹脂、ウレタンポリマーなどの合成高分子、κ−カラギーナン、アルギン酸、ペクチン、キトサン、デンプン、コラーゲンなどの天然高分子などが挙げられる。
【００４６】
前記ポリアクリルアミドを用いる場合、アクリルアミドモノマー、架橋剤Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、重合促進剤Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、重合開始剤過硫酸カリウムを用いてゲル化させたり、γ線又はＸ線のような放射線を用いたりできる。アルギン酸カルシウムを利用する場合、アルギン酸ナトリウムは水に可溶であるが、そのカルシウム塩やアルミニウム塩は水に不溶であることを利用している。まずアルギン酸ナトリウム水溶液と当該ポリペプチドとを混合し、塩化カルシウム水溶液と接触させる。
【００４７】
前記κ−カラギーナンを用いる場合、κ−カラギーナンは加熱すると水に溶解するが、アンモニウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、脂肪族アミンなどが存在するとゲル化するので、こうして得られたゲルをグルタルアルデヒドやヘキサメチレンジアミンなどで架橋して安定化させる。
【００４８】
前記光硬化性樹脂を用いる場合、適度な重合度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）あるいはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を主鎖とし、その末端にアクリロイル基、メタクリロイル基、シンナモイル基などの光感応性基を組み込んだプレポリマーを用いることができる。該プレポリマーは光増感剤ベンゾインエチルエーテル又はベンゾインイソブチルエーテル存在下、当該ポリペプチドを含む溶液と混合し、紫外線を照射してゲル化させることができる。ウレタンプレポリマーは当該ポリペプチドを含む水溶液と混合するだけでゲル化させることができる。
【００４９】
前記マイクロカプセル型膜包括法は、例えば親水性モノマーと疎水性モノマーとをその界面で重合させる際、当該ポリペプチドを被覆して固定化したり、液中乾燥法で例えばベンゼン、ヘキサン、クロロホルムなどの揮発性の高い有機溶媒にポリマーを溶解し、その中に当該ポリペプチドを含む水溶液を分散させ一次乳化液とし、次にこの一次乳化液をゼラチン、ポリビニル又は界面活性剤などの保護コロイド物質を含む水溶液中に分散させ、得られた二次乳化液から有機溶媒を除去することによりカプセルを形成させるものである。
【００５０】
前記ホロー・ファイバーや限外濾過膜に当該ポリペプチドを固定化する方法では、複数の当該ポリペプチドを固定化することも可能で、さらに膜に結合すること無く遊離状態で固定化することができる。
【００５１】
参考となる文献としては、例えば文献〔米国特許第４，００３，９８８号；Ｂ． Ｋ． Ｖａｎ Ｗｅｅｍｅｎ 及び Ａ． Ｈ． Ａ． Ｓｃｈｕｕｒｓ， Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｖｏｌ． １５， Ｎｏ． １５：２３２−２３５（１９７１）；Ｐ． Ｌｅｉｎｉｋｋ
ｉ；Ｓｕｖｉ Ｐａｓｓｉｌａ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈ．， ２９：１１６−１２０（１９７６）；Ｂ． Ｒ． Ｂｒｏｄｅｕｒ， Ｆ． Ｅ． Ａｓｈｔｏｎ及び Ｂ．Ｂ． Ｄｉｅｎａ， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５， Ｎｏ． １：１−９（１９８１）；Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈ．， ２９：１５０−１５３（１９７６）；石川栄治、他編「酵素免疫測定法」株式会社医学書院、１９７８年〕などを挙げることができる。
【００５２】
前記水不溶性担体とは、固定化、保存、測定などにおいて用いられる液体媒質に実質的に不溶性である担体を指す。当該担体としては、特異的結合反応に使用されるものが種々知られており、本発明においてもこれらの公知のものの中から選んで使用できる。特に好適に使用されるものとしては、例えば架橋化アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、架橋アガロース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテート、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体などのポリエステル、ナイロンなどのポリアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機高分子物質を乳化重合して得られたものなどの有機高分子物質、ガラス、例えば活性化ガラス、シリカゲル、シリカ−アルミナ、アルミナなどの無機材料などからなるもので、必要に応じ、シランカップリング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられる。
【００５３】
本発明担体１は、本発明結合体、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを、分離精製及び／又は検出するために、用いることができる。
【００５４】
また、本発明担体１で用いる「ＲＡＮＫＬ」、「ＤＳ」及び「ＣＳ−Ｅ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
＜３＞本発明担体２
本発明担体２は、本発明結合体又はＲＡＮＫＬを、分離、精製及び／又は検出するための、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを固定化した担体である。
【００５５】
本発明担体２におけるＤＳ又はＣＳ−Ｅの担体への固定化は本発明担体１で例示された方法で固定化することができる。
【００５６】
また、本発明担体２で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
＜４＞ 本発明方法１
本発明方法１は、本発明担体１を用いることを特徴とする、本発明結合体、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを分離、精製及び／又は検出する方法である。
【００５７】
本発明方法１は、ＲＡＮＫＬ分子を固定化した担体をカラムなどに詰めて、被検試料を該カラムに通すことによって、該結合体、ＤＳ又はＣＳ−Ｅの分離、精製及び／又は検出することができる。
【００５８】
前記ＲＡＮＫＬ分子を固定化した担体に、ＲＡＮＫＬ分子を介して結合したＤＳ又はＣＳ−Ｅ並びに形成されたＲＡＮＫＬ−ＤＳ結合体又はＲＡＮＫＬ−ＣＳ−Ｅ結合体の検出は、該ＤＳ又は該ＣＳ−Ｅに特異的に結合する物質を用いて行うことが好ましい。当該物質としては、例えば該ＤＳ又はＣＳ−Ｅに対する抗体等が親和性の強さから好ましい。
【００５９】
前記抗体としてはポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いることが可能であり特に限定はされない。前記検出において、上記ＤＳ又はＣＳ−Ｅに対する抗体を用いる場合は、当該抗体又は当該抗体に対する二次抗体を標識物質により標識することが、より正確なＤＳ又はＣＳ−Ｅの検出が可能となるため好ましい。
【００６０】
前記標識物質としては、例えば特異的結合対（例えばビオチンとストレプトアビジン等のアビジン類、又はレクチンとそのレクチンが認識する糖鎖等）の一方の物質；ＦＩＴＣ、フィコエリトン、ユーロピウム、フィコシアニン、ローダミン、テキサスレッド、ウンベリフェロン、トリカラー、シアニン又は７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）等の蛍光物質；ルミノール、アクリジニウム又はルシゲニン等の発光物質類、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼ等の酵素類；ジニトロフルオロベンゼン、ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）又は２，４−ジニトロアニリン等のハプテン類；及び１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ等のラジオアイソトープ類を用いることができる。
【００６１】
前記標識物質の検出は、使用する標識物質に適した通常実施される方法により行うことが可能である。例えば、標識物質として上記酵素に分類されるペルオキシダーゼを用いた場合は、テトラメチルベンゼン（ＴＭＢ）等の酸素受容体と過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）などの酸素供与体を反応させることにより、溶液の着色により検出することが可能である。
【００６２】
また、本発明方法１で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
【００６３】
また本発明方法１は、例えば後述する本発明キット１に応用することができる。
＜５＞本発明方法２
本発明方法２は、本発明担体２を用いることを特徴とする、本発明結合体又はＲＡＮＫＬ分子を分離、精製及び／又は検出する方法である。
【００６４】
本発明方法２は、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを固定化した担体はカラムなどに詰めて被検試料を該カラムに通すことによって、該結合体又はＲＡＮＫＬ分子の分離、精製及び／又は検出することができる。
【００６５】
前記ＤＳ又はＣＳ−Ｅを固定化した担体にＤＳ又はＣＳ−Ｅを介して結合したＲＡＮＫＬ分子又は形成されたＲＡＮＫＬ−ＤＳ結合体又はＲＡＮＫＬ−ＣＳ−Ｅ結合体の検出は、該ＲＡＮＫＬ分子に特異的に結合する物質を用いて行うことが好ましい。当該物質としては、例えばＲＡＮＫＬ分子に対する抗体等が親和性の強さから好ましい。
【００６６】
前記抗体としては、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いることが可能であり特に限定されない。前記検出において、上記ＲＡＮＫＬ分子に対する抗体を用いる場合は、当該抗体又は当該抗体に対する二次抗体を標識物質により標識することが、より正確なＲＡＮＫＬ分子の検出が可能となるため好ましい。
【００６７】
前記標識物質及び標識物質の検出方法等としては、本発明方法１に例示したものが例示される。
【００６８】
また、本発明方法２で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
【００６９】
また本発明方法２は、例えば後述する本発明キット２に応用できる。
＜６＞本発明キット１
本発明キット１は、本発明担体１を含むキットであり、本発明方法１によりＤＳ又はＣＳ−Ｅを分離、精製及び／又は検出することができる。
【００７０】
本発明キット１で好ましい標識物質や検出方法は前記本発明方法１のものと同じである。
＜７＞本発明キット２
本発明キット２は、本発明担体２を含むキットであり、本発明方法２によりＲＡＮＫＬ分子を分離、精製及び／又は検出することができる。
【００７１】
本発明キットで好ましい標識物質や検出方法等は前記本発明方法２のものと同じである。
＜８＞本発明方法３
本発明方法３は、ＤＳ又はＣＳ−Ｅにより、ＲＡＮＫＬ分子の生物学的活性を促進又は阻害する方法である。
【００７２】
本明細書の実施例によるとＲＡＮＫＬ分子はＤＳ又はＣＳ−Ｅと結合することにより破骨細胞の分化誘導が阻害されていることがわかる。また、その阻害効果はＤＳ又はＣＳ−Ｅの濃度に依存することがわかる。このことからＲＡＮＫＬ分子の機能は、外部から加えたＤＳ又はＣＳ−Ｅにより促進又は阻害することができる。
【００７３】
また、本発明方法３で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
＜９＞本発明方法４
本発明方法４は、ＲＡＮＫＬ分子により、ＤＳ又はＣＳ−Ｅの生物学的活性を抑制又は阻害する方法である。
【００７４】
本明細書の実施例によると、ＧＡＧの種類により（硫酸基の位置により）ＲＡＮＫＬとの結合能が異なることから、硫酸基の位置に依存してＲＡＮＫＬ分子が結合していることがわかる。また、ＧＡＧはその硫酸基の位置及びその割合により薬理活性等が異なることが知られている。このことからＤＳ又はＣＳ−Ｅの機能はＲＡＮＫＬ分子を添加することにより促進又は阻害することができる。
【００７５】
また、本発明方法４で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
＜１０＞本発明組成物１
本発明組成物１は、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを含有する、ＲＡＮＫＬ分子の生物学的活性を促進又は阻害する組成物である。
【００７６】
本明細書の実施例によると、ＲＡＮＫＬ分子による破骨細胞の分化誘導はＤＳ又はＣＳ−Ｅの濃度依存的に阻害されていることがわかる。このことからＲＡＮＫＬ分子の生物学的活性は該結合体の組成により異なることがわかる。
【００７７】
また、本発明組成物１で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
＜１１＞本発明組成物２
本発明組成物２は、ＲＡＮＫＬ分子を含有する、ＤＳ又はＣＳ−Ｅの生物学的活性を促進又は阻害する組成物である。
【００７８】
また、本発明組成物２で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
＜１２＞本発明医療用材料１
本発明医療用材料１は、本発明組成物１又は本発明組成物２を含有する医療用材料である。当該組成物は、各種疾病の予防及び／又は治療の為の種々の医療用材料として用いることが可能である。
＜１３＞本発明医療用材料２
本発明医療材料２は、本発明結合体を含有する医療材料である。本発明に係るＲＡＮＫＬ−ＤＳ結合体及びＲＡＮＫＬ−ＣＳ−Ｅ結合体は、各種疾病の予防及び／又は治療のための種々の医療用材料として用いることが可能である。
【実施例】
【００７９】
以下、本発明を実施例により更に具体的に詳説するが、本発明は以下の具体例に限定されるものではない。
実施例１
各ＧＡＧ（ＣＨ、ＣＳ、ＣＳ−Ａ，ＤＳ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ）を１０μｇ/ｍＬ、３００μｇ/ｍＬとなるように調製し、それぞれ２４穴細胞培養用プレートに添加した。１０−６ＭプロスタグランジンＥ２（以下、ＰＥＧ２という。ＳＩＧＭＡ社製）をさらに添加し、ＣＯ２（５％）、３７℃で３時間静置した。その後、ｄｄＹマウス（６週齢雌）の腓骨、大腿骨を摘出し、両骨の遠心端より骨髄細胞を採取した。骨髄細胞は２４穴細胞培養用プレートに５×１０６細胞/穴となる様に播種し、１０％牛胎児血清（ベーリンガー社製、以下ＦＣＳという。）含有Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ａｌｐｈａ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ社製、以下αＭＥＭという。）培地にて８日間３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。８日間の培養の後、破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（以下、ＴＲＡＰという。）をナフトールＡＳ−ＢＩフォスフェート及びfast garnet GBC saltを含有するアゾ色素法を用いた染色測定キット「Acid Phosphatase Leukocyte」（SIGMA社製）を用いて染色し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。
【００８０】
結果を図１〜３に示す。図１の写真は各ＧＡＧの濃度は３００μｇ/ｍＬである。図１〜３より、マウス骨髄細胞を用いたＰＥＧ２刺激下における破骨細胞形成実験系において、ＤＳ及びＣＳ−Ｅは容量依存的に破骨細胞の形成を有意に抑制することが判明した。
実施例２
破骨細胞の骨破壊・吸収活性はピットアッセイにて測定した。ｄｄＹマウス（六週齢雌）の腓骨、大腿骨を摘出し、両骨の遠心端より骨髄細胞を採取した。骨髄細胞はOsteologicTMプレートに４×１０６細胞／穴となるように播種した。１０−６Ｍ ＰＥＧ２刺激下において３００μｇ/ｍLのＤＳ及びＣＳ−Ｅを各プレートへ添加した。１０日間の培養の後、プレート上の細胞を除去し顕微鏡にてピットを計測した。
図４及び５からわかるように、ＰＥＧ２刺激下においてＤＳ及びＣＳ−Ｅは骨吸収を顕著に減少させることがわかる。
実施例３
破骨細胞の前駆細胞であるＲＡＮＫＬ誘導性の単核細胞ＲＡＷ−２６４．７（以下「ＲＡＷ細胞」という）及び破骨細胞支持細胞であるＳＴ−２細胞を９６ウェルプレートに２×１０４個となるように播種した。その後ＤＳ及びＣＳ−Ｅを０〜３００μｇ/ｍL（０、０．２９、１．１７、４．６８、１８．８、７５、３００μｇ/ｍL）をそれぞれ各プレートへ添加した。ＧＡＧを添加した後、１，３，６日目に５４０〜６２０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、それぞれの細胞の生細胞の指標とした。
【００８１】
図６〜９からわかるようにＤＳ及びＣＳ−Ｅの破骨細胞分化誘導抑制の効果は破骨細胞支持細胞及び前駆細胞の細胞増殖活性には影響を及ぼさないことがわかる。
【００８２】
続いて、上記ＲＡＷ細胞にＲＡＮＫＬを添加する際に高発現Ｐ−ｐ３８及びＰ−ＥＲＫについて、ＤＳ添加による変化をウエスタンブロッティングにより確認した。ＲＡＮＫＬにＤＳ又はＣＨを加え、α−ＭＥＭ中にて、３７℃、５％ＣＯ２下で３時間インキュベートした後、ＲＡＷ細胞に作用させた。１５、３０及び６０分後のサンプルを回収し、常法に従いウエスタンブロッティングを行った。
【００８３】
その結果を図１０，１１に示す。図中の各レーンの条件としては、レーン１はそれぞれコントロール、レーン２はＲＡＮＫＬ（40 ng/mL）、レーン３はＲＡＮＫＬ（40 ng/mL）及びＤＳ（300 μg/mL）、レーン４はＲＡＮＫＬ（40 ng/mL）及びＣＨ（300 μg/mL）である。これらの結果からＤＳを共存させることによって、Ｐ−Ｐ３８やＰ−ＥＲＫの発現を抑制することがわかった。
実施例４
ＤＳ及びＣＳ−Ｅ３００μｇ/ｍＬをそれぞれ２４穴細胞培養用プレートに添加した。ＲＡＮＫＬ（４０μｇ/ｍL）及びＭ−ＣＳＦ（５０μｇ/ｍL）をさらに添加し、ＣＯ２（５％）、３７℃で３三時間静置した。その後、ｄｄＹマウス（６週齢雌）の腓骨、大腿骨を摘出し、両骨の遠心端より骨髄細胞を採取した。骨髄細胞は２４穴細胞培養用プレートに５×１０６細胞/穴となる様に播種し、１０％ＦＣＳ含有αＭＥＭ培地にて８日間３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。コントロールとしては骨髄細胞のみを培養したもの及びＲＡＮＫＬ（４０μｇ/ｍL）及びＭ−ＣＳＦ（５０μｇ/ｍL）のみを骨髄細胞に添加したものを用いた。８日間の培養の後、ＴＲＡＰをAcid Phosphatase Leukocyteを用いて染色し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。
【００８４】
図１２より、ＲＡＮＫＬ及びＭ−ＣＦＳ刺激下においてＤＳ及びＣＳ−Ｅ添加群においては顕著な破骨細胞分化誘導抑制効果が見られた。その効果はＤＳの方がより顕著であった。
【００８５】
そこで、ＤＳについて ０〜５０μｇ/ｍＬにおける濃度の依存性を調べ、その結果図１３に示す。図からわかるように、ＲＡＮＫＬ及びＭ−ＣＦＳ刺激下においてもＤＳの濃度の上昇に伴い抑制効果も上昇することがわかる。
実施例５
次にウエスタンブロッティングによりＤＳ及びＣＳ−ＥのＲＡＮＫの抑制効果を調べた。
【００８６】
１０ｃｍシャーレ上にＲＡＮＫＬ（４０μｇ/ｍL）及びＤＳ（３００μｇ/ｍL）をα−ＭＥＭ中に添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下、３時間静置した。ＲＡＷ細胞をシャーレに１×１０５個ずつ播種し、２４時間後及び４８時間後にサンプルを回収した。各サンプルを１０％ゲル上で電気泳動し、転写膜に転写した。コントロールとしてはＤＳ未添加のものを用いた。１次抗体として、抗ＲＡＮＫ抗体及び抗βアクチン抗体（タンパク質の標準化）を反応させた後、二次抗体として抗マウス抗体を添加した。なお、バンドの検出はEnhanced chemiluminescence (ＥＣＬ plus：アマシャム・ファーマシア・バイオテック社製)を用いてフイルムに感光させ行った。
【００８７】
その結果を図１４に示す。図より、培養時間に依存してＲＡＮＫの発現が低下すること及びＤＳの存在下でＲＡＮＫの発現が抑制されることがわかる。
実施例６
ＡｆｆｉｎｉｘＱ（イニシャム社製）のセンサーセルを用いて相互作用実験を行った。まず、センサーチップ上にＲＡＮＫＬ（１０μｇ／ｍＬ）を２μｇ乗せ、４時間乾燥させ固着した。チャンバーにブロッキング剤として０．１％ＢＳＡを添加し、１％ＰＢＳを１０ｍＬ注入後、センサーチップをＰＢＳ中に浸漬し、水晶の振動数が安定するまで静置した。水晶の振動数の安定後、ＰＢＳ中にＤＳを１００μｇ／ｍＬ又は３００μｇ/ｍLとなるように添加し、振動数を測定した。ＰＢＳ及びＲＡＮＫ（モル比でＲＡＮＫＬ：ＲＡＮＫ＝２：１）をコントロールとして用いた。
【００８８】
その結果、図１５に見られるようにＲＡＮＫＬがＤＳに結合することがＡｆｆｉｎｉｘＱによる実験で明らかになった。また、図からわかるようにＲＡＮＫＬに飽和するまでの時間（グラフがプラトーになるまでの時間）がＲＡＮＫに比べ早いこともわかる。
【００８９】
これらの実施例よりＤＳ及びＣＳ−ＥがＲＡＮＫＬと高いアフィニティーを示すことが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
上記に述べたように、本発明により新規物質としてＲＡＮＫＬ−ＤＳ結合体又はＲＡＮＫＬ−ＣＳ−Ｅ結合体が提供されるとともに、ＲＡＮＫＬ分子、ＤＳ又はＣＳ−Ｅの分離、精製、検出ツールが提供される。また、ＲＡＮＫＬ分子結合性のＤＳ及びＣＳ−Ｅは生体内における該ＲＡＮＫＬ分子の生理的機能の調節に利用できる可能性があり、医療への適用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ＰＥＧ２刺激下における各ＧＡＧを添加したときのＴＲＡＰ染色を示す顕微鏡写真である。
【図２】ＰＥＧ２刺激下における破骨細胞形成時のＧＡＧによる影響を示す図である。
【図３】ＰＥＧ２刺激下における破骨細胞形成時のＤＳ及びＣＳ−Ｅの濃度依存性を示す図である。
【図４】ピットアッセイの結果を示す顕微鏡写真である。
【図５】破骨細胞の機能に対するＤＳ及びＣＳ−Ｅの影響を示す図である。
【図６】ＰＥＧ２刺激下におけるＤＳを添加したときのＲＡＷ２６４．７細胞の増殖効果を示す図である。
【図７】ＰＥＧ２刺激下におけるＤＳを添加したときのＳＴ−２細胞の増殖効果を示す図である。
【図８】ＰＥＧ２刺激下におけるＣＳ−Ｅを添加したときのＲＡＷ２６４．７細胞の増殖効果を示す図である。
【図９】ＰＥＧ２刺激下におけるＣＳ−Ｅを添加したときのＳＴ−２細胞の増殖効果を示す図である。
【図１０】ＲＡＮＫＬによるＰ−Ｐ３８の発現へのＤＳ及びＣＨの効果を示す図である。
【図１１】ＲＡＮＫＬによるＰ−ＥＲＫの発現へのＤＳ及びＣＨの効果を示す図である。
【図１２】ＲＡＮＫＬ及びＭ−ＣＳＦ存在下におけるＤＳ及びＣＳ−Ｅを添加したときの破骨細胞の分化に及ぼす影響を示す図である。
【図１３】破骨細胞形成のＤＳ濃度依存性を示す図である。
【図１４】ウエスタンブロッティング分析を行った結果を示す図である。
【図１５】ＲＡＮＫＬに対するアフィニティーアッセイの結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＲＡＮＫＬ−グリコサミノグリカン結合体、ＲＡＮＫＬ活性調整剤及びグリコサミノグリカン活性調節剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本出願書類において用いる略号を説明する。
ＣＨ：コンドロイチン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＣＳ−Ａ：コンドロイチン硫酸Ａ
ＤＳ：デルマタン硫酸（ＣＳ−Ｂ：コンドロイチン硫酸ともいう）
ＣＳ−Ｃ：コンドロイチン硫酸Ｃ
ＣＳ−Ｄ：コンドロイチン硫酸Ｄ
ＣＳ−Ｅ：コンドロイチン硫酸Ｅ
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン
ＧＡＧは、細胞外マトリクスの構成成分の一つとして生体内に存在しており、その中のＣＳは、関節領域において、サプリメント、関節内治療薬として既に臨床応用されている。最近の研究においては、その動的な生体活性が注目されおり、ＤＳ、ＣＳ−Ｅ及びヘパラン硫酸は、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びＣＤ４４に特異的に結合し生体活性を発現すること（非特許文献１）や硫酸化多糖類がＢＭＰと結合して、その生理活性を増強すること（非特許文献２）等の報告がある。また、骨質を溶かす酵素の破骨細胞による放出や骨表面の硫酸化を阻害することに基づく骨吸収の抑制作用を有する物質についての報告や、硫酸化ＧＡＧのカルシウム塩を含有する口腔用組成物が歯周病原性細菌の内毒素刺激による骨のカルシウム遊離量に抑制効果を示すこと（特許文献１）や硫酸化ＧＡＧナトリウムとカルシウム化合物を併用する骨代謝改善剤が内毒素やヒト副甲状腺ホルモン等による骨のカルシウム遊離量に抑制効果を示すこと（特許文献２）及びインシュリン、プロタミン及びＧＡＧから選択される少なくとも１種を含む石灰化促進剤と骨補填剤からなる骨疾患治療剤（特許文献３）等の報告がある。
【０００３】
一方、ＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｒ ｏｆ ＮＦ−κＢ ｌｉｇａｎｄ）は、ヤスダら及びPenningerらのグループによって破骨細胞の分化を制御する中心的なサイトカインであることが報告されたが（非特許文献３，４）、既にＴ細胞上に発現する樹状細胞活性化因子としてクローニングされていた分子であった。
【０００４】
ＲＡＮＫＬは、骨生物学における不可欠なサイトカインであり、単球−マクロファージ前駆体からの破骨細胞への分化を媒介し、かつ成熟破骨細胞の生存及び機能を調節する（非特許文献５）。またＲＡＮＫＬは免疫生物学的にも重要な役割を果たし、Ｔ細胞、樹状細胞及びそれらの前駆体上で発現されることにより、Ｔ及びＢリンパ球の分化並びに免疫系における樹状細胞の生存を媒介する。
【０００５】
またＲＡＮＫＬは、破骨細胞及びその前駆細胞の細胞表面に発現するＲＡＮＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｒ ｏｆ ＮＦ−κＢ）と結合することによって、破骨細胞及びその前駆細胞を活性化し、それらの細胞の分化・成熟、寿命延長、骨吸収亢進を誘発することが知られている（非特許文献６）。
【０００６】
しかしながら、特定の構造を持ったＧＡＧがＲＡＮＫＬと結合体を形成すること、及びその結合体の生物学的活性を制御する方法は知られていない。
【０００７】
【特許文献１】特開平６−８０５４６号公報
【特許文献２】特開平７−５３３８８号公報
【特許文献３】特開昭６２−２０１８２５号公報
【非特許文献１】カワシマ、Ｈ（Kawashima, H.）ら、２０００年、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、第２７５巻、第４５号、ｐ．３５４４８−３５４５６
【非特許文献２】タカダ、Ｔ（Takada， T.）ら、２００３年、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、第２７８巻、第４４号、ｐ．４３２２９−４３２３５
【非特許文献３】ヤスダ、Ｈ（Yasuda， H.）ら、１９９８年、プロシーディング ナショナル アカデミック サイエンス ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、第９５巻、ｐ３５９７−３６０２
【非特許文献４】レイシー、Ｄ. Ｌ．（Lacey D. L.）ら、１９９８年、セル（Cell）、第９３巻、ｐ１６５−１７６
【非特許文献５】リ、Ｊ.（Ｌｉ Ｊ．）ら、２０００年、プロシーディング ナショナル アカデミック サイエンス ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、第９７巻、ｐ１５６６−１５７１
【非特許文献６】アンダーソン（Anderson）ら、１９９７年、ネイチャー（Nature）、第３９０巻、ｐ２５１９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＲＡＮＫＬ分子とＤＳ又はＣＳ−Ｅとの新規な結合体並びにＲＡＮＫＬ，ＤＳ又はＣＳ−Ｅを固定化した担体、該担体を用いたＲＡＮＫＬ、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを分離、精製及び／又は検出する方法、該担体を用いたキット、該結合体の生物学的活性の促進又は阻害方法、並びに該結合体を含有する医療用材料等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＲＡＮＫＬ分子がＤＳ及び／又はＣＳ−Ｅと特異的に結合することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、ＤＳ及び／又はＣＳ−ＥとＲＡＮＫＬ分子とから構成される結合体（以下、「本発明結合体」という。）を提供する。
【００１１】
また本発明は、ＲＡＮＫＬ分子を固定化した担体（以下、「本発明担体１」という。）を提供する。
【００１２】
また本発明は、本発明結合体又はＲＡＮＫＬ分子を、分離、精製及び／又は検出するための、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを固定化した担体（以下、「本発明担体２」という。）を提供する。
【００１３】
以下、本発明担体１及び２をあわせて単に「本発明担体」ともいう。
【００１４】
また本発明は、本発明担体１を用いることを特徴とする、本発明結合体、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを分離、精製及び／又は検出する方法（以下、「本発明方法１」という。）を提供する。
【００１５】
また本発明は、本発明担体２を用いることを特徴とする、本発明結合体又はＲＡＮＫＬ分子を、分離、精製及び／又は検出する方法（以下、「本発明方法２」という。）を提供する。
【００１６】
また本発明は、本発明担体１を含むキット（以下、「本発明キット１」という。）を提供する。
【００１７】
また本発明は、本発明担体２を含むキット（以下、「本発明キット２」という。）を提供する。
【００１８】
以下、本発明キット１及び２を単に「本発明キット」ともいう。
【００１９】
また本発明は、ＤＳ又はＣＳ−ＥによりＲＡＮＫＬ分子の生物学的活性を促進又は阻害する方法（以下、「本発明方法３」という。）を提供する。
【００２０】
また本発明は、ＲＡＮＫＬ分子により、ＤＳ又はＣＳ−Ｅの生物学的活性を促進又は阻害する方法（以下、「本発明方法４」という。）を提供する。
【００２１】
以下、本発明方法１〜４をあわせて単に「本発明方法」ともいう。
【００２２】
また本発明は、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを含有する、ＲＡＮＫＬ分子の生物学的活性を促進又は阻害する組成物（以下、「本発明組成物１」という。）を提供する。
【００２３】
また本発明は、ＲＡＮＫＬ分子を含有するＤＳ又はＣＳ−Ｅの生物学的活性を促進又は阻害する組成物（以下、「本発明組成物２」という。）を提供する。
【００２４】
また本発明は、本発明組成物１又は２を含有する医療用材料（以下、「本発明医療用材料２」という。）を提供する。
また本発明は、本発明結合体を含有する医療用材料（以下、「本発明医療用材料２」という。）を提供する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、新規物質としての本発明結合体が提供されるとともに、本発明担体、本発明方法並びに本発明キットが提供される。
【００２６】
また、生体内におけるＲＡＮＫＬ分子の生理的機能を、外部から与えるＤＳ又はＣＳ−Ｅによって、正・負の方向に制御できる可能性があり、それらＲＡＮＫＬ分子結合性のＤＳ及び／又はＣＳ−Ｅは医療への適用が期待され、ＤＳ及び／又はＣＳ−Ｅを含有する、ＲＡＮＫＬ分子の活性調整剤並びに調整方法が提供される。
【００２７】
また、実施例の結果からコンドロイチン硫酸の硫酸基の位置に活性に依存することから、ＤＳ又はＣＳ−Ｅの活性を、ＲＡＮＫＬ分子によって制御できる可能性があり、ＲＡＮＫＬ分子を含有する、ＤＳ及び／又はＣＳ−Ｅの活性調整剤並びに調節方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞本発明結合体
本発明結合体は、ＤＳ及び／又はＣＳ−ＥとＲＡＮＫＬ分子とから構成される結合体である。
【００２９】
本発明結合体に使用される「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」は広く市販されているもの（例えば生化学工業（株）社製等）を用いることができる。またＤＳはウシ腎、ＣＳ−Ｅはイカ脊索等から公知の方法により調整することもでき、化学的に合成することもできる。また「ＲＡＮＫＬ分子」も同様に市販されているものを用いることができ、遺伝子工学的及び生化学的に常用される方法を用いて製造することもできる。また発明の実施例におけるＡｆｆｉｎｉｘＱを用いた相互作用実験によりＤＳとＲＡＮＫＬの結合性を示した。
【００３０】
また、本発明結合体とは、ＲＡＮＫＬとＤＳ又はＲＡＮＫＬとＣＳ−Ｅとが結合しているものであればよく、上に記載されているようにＲＡＮＫＬ、ＤＳ及びＣＳ−Ｅの由来等も特に限定されない。また本発明結合体を製造するには、ＲＡＮＫＬ分子とＤＳ又はＣＳ−Ｅとを共存させればよく、その共存方法も特に限定されない。例えば、ＲＡＮＫＬ分子を有する細胞が含まれる培地にＤＳ又はＣＳ−Ｅを添加し共存することにより得ることもできる。
＜２＞本発明担体１
本発明担体１は、ＲＡＮＫＬ分子を固定化した担体である。
【００３１】
本発明担体１のＲＡＮＫＬ分子の担体への固定化は、代用的には組換えポリペプチドを少なくとも水不溶性担体に固定して行われる。固定化方法としては、（１）担体結合法、（２）包括法等、及びそれらを組み合わせた複合法が挙げられる。該固定化には、当該分野で汎用されている方法を用いることができる。
【００３２】
前記担体結合法としては、例えばイオン相互作用、疎水相互作用、物理的吸着などを利用する方法、共有結合などの化学的結合により行うことができる。
【００３３】
前記イオン相互作用を利用する担体結合方法では、デキストラン、セルロース、アガロース、デンプンなどの多糖類のイオン交換体、例えばＤＥＡＥ基、ＴＥＡＥ基、ＣＭ基、スルホン酸アルキル基などを持つ誘導体、イオン交換樹脂などを担体として用いることができる。
【００３４】
前記疎水相互作用を利用する担体結合方法では、ポリスチレンビーズやガラスビーズ、さらに、ブチル基やフェニル基などの疎水性官能基が結合された一般的な担体などを担体として用いることができる。
【００３５】
前記物理的な吸着を利用する担体結合方法では、例えば活性炭、酸性白土、漂白土、カオリナイト、アルミナ、シリカゲル、ベントナイト、金属酸化物、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウムなどの無機物質、デンプン、キチン、グルテン、セルロース、アガロース、タンニンなどの天然高分子、ポリスチレンなどの合成高分子、疎水性基を持ったアガロース誘導体などを担体として用いることができる。
【００３６】
前記共有結合などの化学的結合による担体結合方法としては、ペプチド法、ジアゾ法、アルキル化法、臭化シアン活性化法、架橋試薬による結合法、ユギ（Ｕｇｉ）反応を利用した固定化法、チオール・ジスルフィド交換反応を利用した固定化法、シッフ塩基形成法、キレート結合法、トシルクロリド法、生化学的特異結合法などが挙げられる。好ましくは、共有結合などのより安定した結合には、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応等を利用して行うことができ、公知の方法或いは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらにはそれらを修飾した方法の中から適宜選択して適用できる。好ましくは共有結合などのより安定した結合を形成できる化学的結合材・架橋剤などが使用される。
【００３７】
前記化学的結合材剤・架橋剤としては、カルボジイミド、イソシアネート、ジアゾ化合物、ベンゾキノン、アルデヒド、過ヨウ素酸、マレイミド化合物、ピリジルスルフィド化合物などが挙げられる。好ましい試薬としては、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ‘−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレイミド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネート、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル４−（１−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハクサンイミド（ＥＭＣＳ）、イミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、メチル−３−（４’−ジチオピリジル）プロピオンイミデート、メチル−４−メルカプトブチリルイミデート、メチル−３−メルカプトプロピオンイミデート、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテートなどが挙げられる。
【００３８】
前記ペプチド法では担体と所要のポリペプチドの間にペプチド結合を形成させて固定化される。例えばカルボキシル基を持つ担体をアジド、クロリド、イソシアネートなどの誘導体とし、当該ポリペプチド中の遊離アミノ基との間でペプチド結合を形成させる。ペプチド合成に用いられる試薬、例えばカルボジイミド試薬、ウッドワード試薬Ｋ（Ｎ−エチル−５−フェニルイソキサリウム−３’−スルホナート）などが用いられる。担体のアミノ基及びカルボキシル基と所要のポリペプチド中のアミノ基及びカルボキシル基との間でペプチド結合を形成させることもできる。
【００３９】
前記ジアゾ法は、芳香族アミノ基を持つ担体をジアゾニウム化合物とし、これと所要のポリペプチドとをジアゾカップリングさせて固定化するものである。遊離アミノ基、ヒスチジンのイミダゾール基、チロシンのフェノール性水酸基などを持つ当該ポリペプチドに好適に適用できる。担体としては、多糖類、アミノ酸共重合物、ポリアクリルアミド、スチレン系樹脂、エチレン・マレイン酸共重合物、多孔性ガラス、芳香族アミド誘導体などが挙げられる。
【００４０】
前記アルキル化法は、当該ポリペプチド中の遊離アミノ基、フェノール性水酸基、スルフヒドリル基をハロゲンの様な反応性官能基を持つ担体によりアルキル化して固定化する方法である。担体としては、ハロゲン化アセチル誘導体、トリアジニル誘導体、ハロゲン化メタクリル誘導体などが挙げられる。
【００４１】
前記臭化シアン活性化法は、デキストラン、セルロース、アガロース、デンプンなどの多糖類、多孔性ガラスなどを臭化シアンで活性化した後、当該ポリペプチドを固定化するものである。架橋試薬による結合法のうち、特にグルタルアルデヒドなどの二官能性試薬を用いた場合、セルロース、アガロース、アルブミン、ゼラチン、キトサンなどのアミノ基を導入されたあるいは有する天然高分子、合成高分子、多孔性ガラス、多孔性セラミックスなどの無機担体のアミノシラン誘導体などが挙げられる。
【００４２】
前記ユギ反応とは、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、イソニトリル基が共存していて反応させると縮合反応が起こることを利用するものである。カルボキシル基又はアミノ基を持つ担体と当該ポリペプチドとを混合した中にアセトアルデヒド及び３−ジメチルアミノプロピルイソシアニドを加えることで反応させるものが挙げられる。担体としては、多糖類、ポリアクリルアミドのアミノ誘導体、ナイロンのイソニトリル誘導体などが挙げられる。
【００４３】
前記生化学的特異結合法においては、特異的結合反応ペア同志の生化学的特異結合反応を利用するもので、例えば抗原とそれに対する抗体、抗体とハプテン、エフェクターとレセプター、酵素と酵素インヒビター、酵素基質、補酵素類、複合蛋白質における補欠分子団、レクチンと糖鎖含有物質、酵素と酵素基質、核酸とその相補的な核酸などが挙げられ、それらは公知のものの中から選んでよい。
【００４４】
前記包括法とは、多糖類や蛋白質などの天然高分子や合成高分子の細いゲル・マトリックスの中に当該ポリペプチドを閉じ込めることによる高分子ゲルを用いる方法と、膜で区切られた空間に当該ポリペプチドを閉じ込める方法とに大別できる。膜包括法には、半透性の固体膜に包み込むマイクロカプセル型膜包括法、半透膜性のホロー・ファイバーや限外濾過膜による空間に包み込む方法、液体状の膜に包み込むリポソーム型などの方法が挙げられる。
【００４５】
前記高分子ゲルを用いる方法は、網目構造を持つ高分子ゲルのマトリックスの中に当該ポリペプチドを閉じ込めて固定化するもので、固定時にゲルを球状、フィルム状、チューブ状、膜状に自由に成形できる。当該ゲルの調製法としては、モノマーと架橋剤を重合させて高分子ゲルを形成させる方法、プレポリマーあるいはオリゴマーを重合させる方法、高分子を可溶性の状態から不溶の状態に変化させることによりゲルを形成させる方法などが挙げられる。当該ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、光硬化性樹脂、ウレタンポリマーなどの合成高分子、κ−カラギーナン、アルギン酸、ペクチン、キトサン、デンプン、コラーゲンなどの天然高分子などが挙げられる。
【００４６】
前記ポリアクリルアミドを用いる場合、アクリルアミドモノマー、架橋剤Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、重合促進剤Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、重合開始剤過硫酸カリウムを用いてゲル化させたり、γ線又はＸ線のような放射線を用いたりできる。アルギン酸カルシウムを利用する場合、アルギン酸ナトリウムは水に可溶であるが、そのカルシウム塩やアルミニウム塩は水に不溶であることを利用している。まずアルギン酸ナトリウム水溶液と当該ポリペプチドとを混合し、塩化カルシウム水溶液と接触させる。
【００４７】
前記κ−カラギーナンを用いる場合、κ−カラギーナンは加熱すると水に溶解するが、アンモニウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、脂肪族アミンなどが存在するとゲル化するので、こうして得られたゲルをグルタルアルデヒドやヘキサメチレンジアミンなどで架橋して安定化させる。
【００４８】
前記光硬化性樹脂を用いる場合、適度な重合度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）あるいはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を主鎖とし、その末端にアクリロイル基、メタクリロイル基、シンナモイル基などの光感応性基を組み込んだプレポリマーを用いることができる。該プレポリマーは光増感剤ベンゾインエチルエーテル又はベンゾインイソブチルエーテル存在下、当該ポリペプチドを含む溶液と混合し、紫外線を照射してゲル化させることができる。ウレタンプレポリマーは当該ポリペプチドを含む水溶液と混合するだけでゲル化させることができる。
【００４９】
前記マイクロカプセル型膜包括法は、例えば親水性モノマーと疎水性モノマーとをその界面で重合させる際、当該ポリペプチドを被覆して固定化したり、液中乾燥法で例えばベンゼン、ヘキサン、クロロホルムなどの揮発性の高い有機溶媒にポリマーを溶解し、その中に当該ポリペプチドを含む水溶液を分散させ一次乳化液とし、次にこの一次乳化液をゼラチン、ポリビニル又は界面活性剤などの保護コロイド物質を含む水溶液中に分散させ、得られた二次乳化液から有機溶媒を除去することによりカプセルを形成させるものである。
【００５０】
前記ホロー・ファイバーや限外濾過膜に当該ポリペプチドを固定化する方法では、複数の当該ポリペプチドを固定化することも可能で、さらに膜に結合すること無く遊離状態で固定化することができる。
【００５１】
参考となる文献としては、例えば文献〔米国特許第４，００３，９８８号；Ｂ． Ｋ． Ｖａｎ Ｗｅｅｍｅｎ 及び Ａ． Ｈ． Ａ． Ｓｃｈｕｕｒｓ， Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｖｏｌ． １５， Ｎｏ． １５：２３２−２３５（１９７１）；Ｐ． Ｌｅｉｎｉｋｋ
ｉ；Ｓｕｖｉ Ｐａｓｓｉｌａ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈ．， ２９：１１６−１２０（１９７６）；Ｂ． Ｒ． Ｂｒｏｄｅｕｒ， Ｆ． Ｅ． Ａｓｈｔｏｎ及び Ｂ．Ｂ． Ｄｉｅｎａ， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５， Ｎｏ． １：１−９（１９８１）；Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈ．， ２９：１５０−１５３（１９７６）；石川栄治、他編「酵素免疫測定法」株式会社医学書院、１９７８年〕などを挙げることができる。
【００５２】
前記水不溶性担体とは、固定化、保存、測定などにおいて用いられる液体媒質に実質的に不溶性である担体を指す。当該担体としては、特異的結合反応に使用されるものが種々知られており、本発明においてもこれらの公知のものの中から選んで使用できる。特に好適に使用されるものとしては、例えば架橋化アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、架橋アガロース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテート、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体などのポリエステル、ナイロンなどのポリアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機高分子物質を乳化重合して得られたものなどの有機高分子物質、ガラス、例えば活性化ガラス、シリカゲル、シリカ−アルミナ、アルミナなどの無機材料などからなるもので、必要に応じ、シランカップリング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられる。
【００５３】
本発明担体１は、本発明結合体、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを、分離精製及び／又は検出するために、用いることができる。
【００５４】
また、本発明担体１で用いる「ＲＡＮＫＬ」、「ＤＳ」及び「ＣＳ−Ｅ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
＜３＞本発明担体２
本発明担体２は、本発明結合体又はＲＡＮＫＬを、分離、精製及び／又は検出するための、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを固定化した担体である。
【００５５】
本発明担体２におけるＤＳ又はＣＳ−Ｅの担体への固定化は本発明担体１で例示された方法で固定化することができる。
【００５６】
また、本発明担体２で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
＜４＞ 本発明方法１
本発明方法１は、本発明担体１を用いることを特徴とする、本発明結合体、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを分離、精製及び／又は検出する方法である。
【００５７】
本発明方法１は、ＲＡＮＫＬ分子を固定化した担体をカラムなどに詰めて、被検試料を該カラムに通すことによって、該結合体、ＤＳ又はＣＳ−Ｅの分離、精製及び／又は検出することができる。
【００５８】
前記ＲＡＮＫＬ分子を固定化した担体に、ＲＡＮＫＬ分子を介して結合したＤＳ又はＣＳ−Ｅ並びに形成されたＲＡＮＫＬ−ＤＳ結合体又はＲＡＮＫＬ−ＣＳ−Ｅ結合体の検出は、該ＤＳ又は該ＣＳ−Ｅに特異的に結合する物質を用いて行うことが好ましい。当該物質としては、例えば該ＤＳ又はＣＳ−Ｅに対する抗体等が親和性の強さから好ましい。
【００５９】
前記抗体としてはポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いることが可能であり特に限定はされない。前記検出において、上記ＤＳ又はＣＳ−Ｅに対する抗体を用いる場合は、当該抗体又は当該抗体に対する二次抗体を標識物質により標識することが、より正確なＤＳ又はＣＳ−Ｅの検出が可能となるため好ましい。
【００６０】
前記標識物質としては、例えば特異的結合対（例えばビオチンとストレプトアビジン等のアビジン類、又はレクチンとそのレクチンが認識する糖鎖等）の一方の物質；ＦＩＴＣ、フィコエリトン、ユーロピウム、フィコシアニン、ローダミン、テキサスレッド、ウンベリフェロン、トリカラー、シアニン又は７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）等の蛍光物質；ルミノール、アクリジニウム又はルシゲニン等の発光物質類、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼ等の酵素類；ジニトロフルオロベンゼン、ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）又は２，４−ジニトロアニリン等のハプテン類；及び１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ等のラジオアイソトープ類を用いることができる。
【００６１】
前記標識物質の検出は、使用する標識物質に適した通常実施される方法により行うことが可能である。例えば、標識物質として上記酵素に分類されるペルオキシダーゼを用いた場合は、テトラメチルベンゼン（ＴＭＢ）等の酸素受容体と過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）などの酸素供与体を反応させることにより、溶液の着色により検出することが可能である。
【００６２】
また、本発明方法１で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
【００６３】
また本発明方法１は、例えば後述する本発明キット１に応用することができる。
＜５＞本発明方法２
本発明方法２は、本発明担体２を用いることを特徴とする、本発明結合体又はＲＡＮＫＬ分子を分離、精製及び／又は検出する方法である。
【００６４】
本発明方法２は、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを固定化した担体はカラムなどに詰めて被検試料を該カラムに通すことによって、該結合体又はＲＡＮＫＬ分子の分離、精製及び／又は検出することができる。
【００６５】
前記ＤＳ又はＣＳ−Ｅを固定化した担体にＤＳ又はＣＳ−Ｅを介して結合したＲＡＮＫＬ分子又は形成されたＲＡＮＫＬ−ＤＳ結合体又はＲＡＮＫＬ−ＣＳ−Ｅ結合体の検出は、該ＲＡＮＫＬ分子に特異的に結合する物質を用いて行うことが好ましい。当該物質としては、例えばＲＡＮＫＬ分子に対する抗体等が親和性の強さから好ましい。
【００６６】
前記抗体としては、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いることが可能であり特に限定されない。前記検出において、上記ＲＡＮＫＬ分子に対する抗体を用いる場合は、当該抗体又は当該抗体に対する二次抗体を標識物質により標識することが、より正確なＲＡＮＫＬ分子の検出が可能となるため好ましい。
【００６７】
前記標識物質及び標識物質の検出方法等としては、本発明方法１に例示したものが例示される。
【００６８】
また、本発明方法２で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
【００６９】
また本発明方法２は、例えば後述する本発明キット２に応用できる。
＜６＞本発明キット１
本発明キット１は、本発明担体１を含むキットであり、本発明方法１によりＤＳ又はＣＳ−Ｅを分離、精製及び／又は検出することができる。
【００７０】
本発明キット１で好ましい標識物質や検出方法は前記本発明方法１のものと同じである。
＜７＞本発明キット２
本発明キット２は、本発明担体２を含むキットであり、本発明方法２によりＲＡＮＫＬ分子を分離、精製及び／又は検出することができる。
【００７１】
本発明キットで好ましい標識物質や検出方法等は前記本発明方法２のものと同じである。
＜８＞本発明方法３
本発明方法３は、ＤＳ又はＣＳ−Ｅにより、ＲＡＮＫＬ分子の生物学的活性を促進又は阻害する方法である。
【００７２】
本明細書の実施例によるとＲＡＮＫＬ分子はＤＳ又はＣＳ−Ｅと結合することにより破骨細胞の分化誘導が阻害されていることがわかる。また、その阻害効果はＤＳ又はＣＳ−Ｅの濃度に依存することがわかる。このことからＲＡＮＫＬ分子の機能は、外部から加えたＤＳ又はＣＳ−Ｅにより促進又は阻害することができる。
【００７３】
また、本発明方法３で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
＜９＞本発明方法４
本発明方法４は、ＲＡＮＫＬ分子により、ＤＳ又はＣＳ−Ｅの生物学的活性を抑制又は阻害する方法である。
【００７４】
本明細書の実施例によると、ＧＡＧの種類により（硫酸基の位置により）ＲＡＮＫＬとの結合能が異なることから、硫酸基の位置に依存してＲＡＮＫＬ分子が結合していることがわかる。また、ＧＡＧはその硫酸基の位置及びその割合により薬理活性等が異なることが知られている。このことからＤＳ又はＣＳ−Ｅの機能はＲＡＮＫＬ分子を添加することにより促進又は阻害することができる。
【００７５】
また、本発明方法４で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
＜１０＞本発明組成物１
本発明組成物１は、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを含有する、ＲＡＮＫＬ分子の生物学的活性を促進又は阻害する組成物である。
【００７６】
本明細書の実施例によると、ＲＡＮＫＬ分子による破骨細胞の分化誘導はＤＳ又はＣＳ−Ｅの濃度依存的に阻害されていることがわかる。このことからＲＡＮＫＬ分子の生物学的活性は該結合体の組成により異なることがわかる。
【００７７】
また、本発明組成物１で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
＜１１＞本発明組成物２
本発明組成物２は、ＲＡＮＫＬ分子を含有する、ＤＳ又はＣＳ−Ｅの生物学的活性を促進又は阻害する組成物である。
【００７８】
また、本発明組成物２で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
＜１２＞本発明医療用材料１
本発明医療用材料１は、本発明組成物１又は本発明組成物２を含有する医療用材料である。当該組成物は、各種疾病の予防及び／又は治療の為の種々の医療用材料として用いることが可能である。
＜１３＞本発明医療用材料２
本発明医療材料２は、本発明結合体を含有する医療材料である。本発明に係るＲＡＮＫＬ−ＤＳ結合体及びＲＡＮＫＬ−ＣＳ−Ｅ結合体は、各種疾病の予防及び／又は治療のための種々の医療用材料として用いることが可能である。
【実施例】
【００７９】
以下、本発明を実施例により更に具体的に詳説するが、本発明は以下の具体例に限定されるものではない。
実施例１
各ＧＡＧ（ＣＨ、ＣＳ、ＣＳ−Ａ，ＤＳ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ）を１０μｇ/ｍＬ、３００μｇ/ｍＬとなるように調製し、それぞれ２４穴細胞培養用プレートに添加した。１０−６ＭプロスタグランジンＥ２（以下、ＰＥＧ２という。ＳＩＧＭＡ社製）をさらに添加し、ＣＯ２（５％）、３７℃で３時間静置した。その後、ｄｄＹマウス（６週齢雌）の腓骨、大腿骨を摘出し、両骨の遠心端より骨髄細胞を採取した。骨髄細胞は２４穴細胞培養用プレートに５×１０６細胞/穴となる様に播種し、１０％牛胎児血清（ベーリンガー社製、以下ＦＣＳという。）含有Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ａｌｐｈａ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ社製、以下αＭＥＭという。）培地にて８日間３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。８日間の培養の後、破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（以下、ＴＲＡＰという。）をナフトールＡＳ−ＢＩフォスフェート及びfast garnet GBC saltを含有するアゾ色素法を用いた染色測定キット「Acid Phosphatase Leukocyte」（SIGMA社製）を用いて染色し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。
【００８０】
結果を図１〜３に示す。図１の写真は各ＧＡＧの濃度は３００μｇ/ｍＬである。図１〜３より、マウス骨髄細胞を用いたＰＥＧ２刺激下における破骨細胞形成実験系において、ＤＳ及びＣＳ−Ｅは容量依存的に破骨細胞の形成を有意に抑制することが判明した。
実施例２
破骨細胞の骨破壊・吸収活性はピットアッセイにて測定した。ｄｄＹマウス（六週齢雌）の腓骨、大腿骨を摘出し、両骨の遠心端より骨髄細胞を採取した。骨髄細胞はOsteologicTMプレートに４×１０６細胞／穴となるように播種した。１０−６Ｍ ＰＥＧ２刺激下において３００μｇ/ｍLのＤＳ及びＣＳ−Ｅを各プレートへ添加した。１０日間の培養の後、プレート上の細胞を除去し顕微鏡にてピットを計測した。
図４及び５からわかるように、ＰＥＧ２刺激下においてＤＳ及びＣＳ−Ｅは骨吸収を顕著に減少させることがわかる。
実施例３
破骨細胞の前駆細胞であるＲＡＮＫＬ誘導性の単核細胞ＲＡＷ−２６４．７（以下「ＲＡＷ細胞」という）及び破骨細胞支持細胞であるＳＴ−２細胞を９６ウェルプレートに２×１０４個となるように播種した。その後ＤＳ及びＣＳ−Ｅを０〜３００μｇ/ｍL（０、０．２９、１．１７、４．６８、１８．８、７５、３００μｇ/ｍL）をそれぞれ各プレートへ添加した。ＧＡＧを添加した後、１，３，６日目に５４０〜６２０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、それぞれの細胞の生細胞の指標とした。
【００８１】
図６〜９からわかるようにＤＳ及びＣＳ−Ｅの破骨細胞分化誘導抑制の効果は破骨細胞支持細胞及び前駆細胞の細胞増殖活性には影響を及ぼさないことがわかる。
【００８２】
続いて、上記ＲＡＷ細胞にＲＡＮＫＬを添加する際に高発現Ｐ−ｐ３８及びＰ−ＥＲＫについて、ＤＳ添加による変化をウエスタンブロッティングにより確認した。ＲＡＮＫＬにＤＳ又はＣＨを加え、α−ＭＥＭ中にて、３７℃、５％ＣＯ２下で３時間インキュベートした後、ＲＡＷ細胞に作用させた。１５、３０及び６０分後のサンプルを回収し、常法に従いウエスタンブロッティングを行った。
【００８３】
その結果を図１０，１１に示す。図中の各レーンの条件としては、レーン１はそれぞれコントロール、レーン２はＲＡＮＫＬ（40 ng/mL）、レーン３はＲＡＮＫＬ（40 ng/mL）及びＤＳ（300 μg/mL）、レーン４はＲＡＮＫＬ（40 ng/mL）及びＣＨ（300 μg/mL）である。これらの結果からＤＳを共存させることによって、Ｐ−Ｐ３８やＰ−ＥＲＫの発現を抑制することがわかった。
実施例４
ＤＳ及びＣＳ−Ｅ３００μｇ/ｍＬをそれぞれ２４穴細胞培養用プレートに添加した。ＲＡＮＫＬ（４０μｇ/ｍL）及びＭ−ＣＳＦ（５０μｇ/ｍL）をさらに添加し、ＣＯ２（５％）、３７℃で３三時間静置した。その後、ｄｄＹマウス（６週齢雌）の腓骨、大腿骨を摘出し、両骨の遠心端より骨髄細胞を採取した。骨髄細胞は２４穴細胞培養用プレートに５×１０６細胞/穴となる様に播種し、１０％ＦＣＳ含有αＭＥＭ培地にて８日間３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。コントロールとしては骨髄細胞のみを培養したもの及びＲＡＮＫＬ（４０μｇ/ｍL）及びＭ−ＣＳＦ（５０μｇ/ｍL）のみを骨髄細胞に添加したものを用いた。８日間の培養の後、ＴＲＡＰをAcid Phosphatase Leukocyteを用いて染色し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。
【００８４】
図１２より、ＲＡＮＫＬ及びＭ−ＣＦＳ刺激下においてＤＳ及びＣＳ−Ｅ添加群においては顕著な破骨細胞分化誘導抑制効果が見られた。その効果はＤＳの方がより顕著であった。
【００８５】
そこで、ＤＳについて ０〜５０μｇ/ｍＬにおける濃度の依存性を調べ、その結果図１３に示す。図からわかるように、ＲＡＮＫＬ及びＭ−ＣＦＳ刺激下においてもＤＳの濃度の上昇に伴い抑制効果も上昇することがわかる。
実施例５
次にウエスタンブロッティングによりＤＳ及びＣＳ−ＥのＲＡＮＫの抑制効果を調べた。
【００８６】
１０ｃｍシャーレ上にＲＡＮＫＬ（４０μｇ/ｍL）及びＤＳ（３００μｇ/ｍL）をα−ＭＥＭ中に添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下、３時間静置した。ＲＡＷ細胞をシャーレに１×１０５個ずつ播種し、２４時間後及び４８時間後にサンプルを回収した。各サンプルを１０％ゲル上で電気泳動し、転写膜に転写した。コントロールとしてはＤＳ未添加のものを用いた。１次抗体として、抗ＲＡＮＫ抗体及び抗βアクチン抗体（タンパク質の標準化）を反応させた後、二次抗体として抗マウス抗体を添加した。なお、バンドの検出はEnhanced chemiluminescence (ＥＣＬ plus：アマシャム・ファーマシア・バイオテック社製)を用いてフイルムに感光させ行った。
【００８７】
その結果を図１４に示す。図より、培養時間に依存してＲＡＮＫの発現が低下すること及びＤＳの存在下でＲＡＮＫの発現が抑制されることがわかる。
実施例６
ＡｆｆｉｎｉｘＱ（イニシャム社製）のセンサーセルを用いて相互作用実験を行った。まず、センサーチップ上にＲＡＮＫＬ（１０μｇ／ｍＬ）を２μｇ乗せ、４時間乾燥させ固着した。チャンバーにブロッキング剤として０．１％ＢＳＡを添加し、１％ＰＢＳを１０ｍＬ注入後、センサーチップをＰＢＳ中に浸漬し、水晶の振動数が安定するまで静置した。水晶の振動数の安定後、ＰＢＳ中にＤＳを１００μｇ／ｍＬ又は３００μｇ/ｍLとなるように添加し、振動数を測定した。ＰＢＳ及びＲＡＮＫ（モル比でＲＡＮＫＬ：ＲＡＮＫ＝２：１）をコントロールとして用いた。
【００８８】
その結果、図１５に見られるようにＲＡＮＫＬがＤＳに結合することがＡｆｆｉｎｉｘＱによる実験で明らかになった。また、図からわかるようにＲＡＮＫＬに飽和するまでの時間（グラフがプラトーになるまでの時間）がＲＡＮＫに比べ早いこともわかる。
【００８９】
これらの実施例よりＤＳ及びＣＳ−ＥがＲＡＮＫＬと高いアフィニティーを示すことが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
上記に述べたように、本発明により新規物質としてＲＡＮＫＬ−ＤＳ結合体又はＲＡＮＫＬ−ＣＳ−Ｅ結合体が提供されるとともに、ＲＡＮＫＬ分子、ＤＳ又はＣＳ−Ｅの分離、精製、検出ツールが提供される。また、ＲＡＮＫＬ分子結合性のＤＳ及びＣＳ−Ｅは生体内における該ＲＡＮＫＬ分子の生理的機能の調節に利用できる可能性があり、医療への適用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ＰＥＧ２刺激下における各ＧＡＧを添加したときのＴＲＡＰ染色を示す顕微鏡写真である。
【図２】ＰＥＧ２刺激下における破骨細胞形成時のＧＡＧによる影響を示す図である。
【図３】ＰＥＧ２刺激下における破骨細胞形成時のＤＳ及びＣＳ−Ｅの濃度依存性を示す図である。
【図４】ピットアッセイの結果を示す顕微鏡写真である。
【図５】破骨細胞の機能に対するＤＳ及びＣＳ−Ｅの影響を示す図である。
【図６】ＰＥＧ２刺激下におけるＤＳを添加したときのＲＡＷ２６４．７細胞の増殖効果を示す図である。
【図７】ＰＥＧ２刺激下におけるＤＳを添加したときのＳＴ−２細胞の増殖効果を示す図である。
【図８】ＰＥＧ２刺激下におけるＣＳ−Ｅを添加したときのＲＡＷ２６４．７細胞の増殖効果を示す図である。
【図９】ＰＥＧ２刺激下におけるＣＳ−Ｅを添加したときのＳＴ−２細胞の増殖効果を示す図である。
【図１０】ＲＡＮＫＬによるＰ−Ｐ３８の発現へのＤＳ及びＣＨの効果を示す図である。
【図１１】ＲＡＮＫＬによるＰ−ＥＲＫの発現へのＤＳ及びＣＨの効果を示す図である。
【図１２】ＲＡＮＫＬ及びＭ−ＣＳＦ存在下におけるＤＳ及びＣＳ−Ｅを添加したときの破骨細胞の分化に及ぼす影響を示す図である。
【図１３】破骨細胞形成のＤＳ濃度依存性を示す図である。
【図１４】ウエスタンブロッティング分析を行った結果を示す図である。
【図１５】ＲＡＮＫＬに対するアフィニティーアッセイの結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デルマタン硫酸及び／又はコンドロイチン硫酸ＥとＲＡＮＫＬ分子とから構成される結合体。
【請求項２】
ＲＡＮＫＬ分子を固定化した担体。
【請求項３】
請求項１に記載の結合体又はＲＡＮＫＬ分子を、分離、精製及び／又は検出するための、デルマタン硫酸又はコンドロイチン硫酸Ｅを固定化した担体。
【請求項４】
請求項２に記載の担体を用いることを特徴とする、請求項１に記載の結合体、デルマタン硫酸又はコンドロイチン硫酸Ｅを分離、精製及び／又は検出する方法。
【請求項５】
請求項３に記載の担体を用いることを特徴とする、請求項１に記載の結合体又はＲＡＮＫＬ分子を、分離、精製及び／又は検出する方法。
【請求項６】
請求項２に記載の担体を含むキット。
【請求項７】
請求項３に記載の担体を含むキット。
【請求項８】
デルマタン硫酸又はコンドロイチン硫酸ＥによりＲＡＮＫＬ分子の生物学的活性を促進又は阻害する方法。
【請求項９】
ＲＡＮＫＬ分子により、デルマタン硫酸又はコンドロイチン硫酸Ｅの生物学的活性を促進又は阻害する方法。
【請求項１０】
デルマタン硫酸又はコンドロイチン硫酸Ｅを含有する、ＲＡＮＫＬ分子の生物学的活性を促進又は阻害する組成物。
【請求項１１】
ＲＡＮＫＬ分子を含有する、デルマタン硫酸又はコンドロイチン硫酸Ｅの生物学的活性を促進又は阻害する組成物。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の組成物を含有する医療用材料。
【請求項１３】
請求項１に記載の結合体を含有する医療用材料。
【請求項１】
デルマタン硫酸及び／又はコンドロイチン硫酸ＥとＲＡＮＫＬ分子とから構成される結合体。
【請求項２】
ＲＡＮＫＬ分子を固定化した担体。
【請求項３】
請求項１に記載の結合体又はＲＡＮＫＬ分子を、分離、精製及び／又は検出するための、デルマタン硫酸又はコンドロイチン硫酸Ｅを固定化した担体。
【請求項４】
請求項２に記載の担体を用いることを特徴とする、請求項１に記載の結合体、デルマタン硫酸又はコンドロイチン硫酸Ｅを分離、精製及び／又は検出する方法。
【請求項５】
請求項３に記載の担体を用いることを特徴とする、請求項１に記載の結合体又はＲＡＮＫＬ分子を、分離、精製及び／又は検出する方法。
【請求項６】
請求項２に記載の担体を含むキット。
【請求項７】
請求項３に記載の担体を含むキット。
【請求項８】
デルマタン硫酸又はコンドロイチン硫酸ＥによりＲＡＮＫＬ分子の生物学的活性を促進又は阻害する方法。
【請求項９】
ＲＡＮＫＬ分子により、デルマタン硫酸又はコンドロイチン硫酸Ｅの生物学的活性を促進又は阻害する方法。
【請求項１０】
デルマタン硫酸又はコンドロイチン硫酸Ｅを含有する、ＲＡＮＫＬ分子の生物学的活性を促進又は阻害する組成物。
【請求項１１】
ＲＡＮＫＬ分子を含有する、デルマタン硫酸又はコンドロイチン硫酸Ｅの生物学的活性を促進又は阻害する組成物。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の組成物を含有する医療用材料。
【請求項１３】
請求項１に記載の結合体を含有する医療用材料。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２００８−７４７３１（Ｐ２００８−７４７３１Ａ）
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２５３５７３（Ｐ２００６−２５３５７３）
【出願日】平成１８年９月１９日（２００６．９．１９）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月１９日（２００６．９．１９）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]