新規の毒素−抗毒素系
ｍＲＮＡをＧＣＵで切断するｍＲＮＡインターフェラーゼの発現を誘導することを含む、細胞機能を阻害する方法が、或る特定の実施形態において開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本願は２００８年８月２０日付で出願された米国仮特許出願第６１／１８９，６３９号（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に対する優先権を主張するものである。
【０００２】
配列リスト
書面及びコンピュータ可読形式の配列リストを本明細書に添えて提出する。コンピュータ可読形式で記録された情報は、書面の配列リストと同一である。
【背景技術】
【０００３】
クオラムセンシングがバイオフィルム形成に関与することが報告されている（１〜４）。ＭｑｓＲ発現がバイオフィルムにおいて（５）、また、大腸菌を含むグラム陰性菌及びグラム陽性菌の両方によって産生される、非種特異的（species-nonspecific）シグナリング分子であるクオラムセンシングシグナルオートインデューサー−２（ＡＩ−２）によって（６）８倍に誘導されることが見出された。ＭｑｓＲの誘導によって、バイオフィルム形成において重要な役割を果たすことが知られている、二成分系であるｑｓｅＢｑｓｅＣオペロンが活性化されることが報告されている（６）。したがって、ＭｑｓＲ（９８アミノ酸残基）が、大腸菌における運動性及びバイオフィルム形成に必要とされるｆｌｈＤＣ発現を制御するｑｓｅＢを活性化するため、バイオフィルム形成の調節因子であることが提唱されている（６）。しかしながら、ＭｑｓＲの細胞機能は不明なままであった。
【０００４】
興味深いことに、これまでに調査された自由生活性細菌は全て、そのゲノム内に多数の自殺遺伝子又は毒素遺伝子を含有している（７、８）。これらの毒素の多くは、１つのオペロン（毒素−抗毒素オペロンすなわちＴＡオペロンと称される）内のその同種（cognate）抗毒素と共転写され、通常の成長条件下でその毒性が抑制されるように、細胞内で安定な複合体を形成する（９〜１１）。しかしながら、抗毒素の安定性はその同種毒素よりも実質的に低いため、プロテアーゼを誘導する細胞傷害又は成長阻害を引き起こす任意のストレスが毒素と抗毒素との間の平衡を変更させ、細胞における毒素放出をもたらす。
【０００５】
これまで、大腸菌ゲノムについてｒｅｌＢ−ｒｅｌＥ（１２、１３）、ｃｈｐＢＩ−ｃｈｐＢＫ（１４）、ｍａｚＥ−ｍａｚＦ（１５〜１７）、ｙｅｆＭ−ｙｏｅＢ（１８、１９）、ｄｉｎＪ−ｙａｆＱ（２０、２１）、ｈｉｐＢ−ｈｉｐＡ、ｈｉｃＡ−ｈｉｃＢ（２５、２６）、ｐｒｌＦ−ｙｈａＶ（２７）及びｙｂａＪ−ｈｈａ（２８）を含む１６個の（２４）ＴＡ系が報告されている。興味深いことに、これらのＴＡオペロンは全て、同様の調節様式を用いるようである；毒素活性を中和する抗毒素とその同種毒素との間の複合体の形成、及びその発現を自己調節するＴＡ複合体の能力。幾つかの毒素の細胞標的が同定されている：ＣｃｄＢはジャイレースＡと直接相互作用し、ＤＮＡ複製を阻止する（２９，３０）；ＲｅｌＥ（それ自体はエンドリボヌクレアーゼ活性を有しない）は、リボソームＡ部位でのｍＲＮＡ切断を促進するリボソーム結合因子として働くと考えられる（１２、３１、３２）。ＰｅｍＫ（３３）、ＣｈｐＢＫ（１４）及びＭａｚＦ（３４）は、タンパク質合成を効率的に阻害し、それにより細胞成長を効率的に阻害するために、配列特異的エンドリボヌクレアーゼとして機能することによって細胞ｍＲＮＡを分解の標的とするため、毒素の中でも独特である。
【０００６】
ＭａｚＦ、ＣｈｐＢＫ及びＰｅｍＫは、ｍＲＮＡをそれぞれＡＣＡ、ＡＣＹ（ＹはＵ、Ａ又はＧである）及びＵＡＨ（ＨはＣ、Ａ又はＵである）配列で切断する配列特異的エンドリボヌクレアーゼとして特徴付けられている。これらの毒素は細胞ｍＲＮＡの機能を妨げることによってタンパク質合成阻害物質として機能するため、リボヌクレアーゼＥ、Ａ及びＴ１といった他の既知のエンドリボヌクレアーゼとは完全に異なる。ｍｉｃＲＮＡ（ｍＲＮＡ干渉相補的ＲＮＡ）（３７）、ｍｉＲＮＡ（３８）及びｓｉＲＮＡ（３９）等の低分子ＲＮＡが、特定のＲＮＡの機能を妨げることが知られている。これらの低分子ＲＮＡは特定のｍＲＮＡと結合してその発現を阻害する。リボザイムもその標的ＲＮＡに特異的に作用して、その機能を妨げる（４０）。したがって、ＭａｚＦ、ＣｈｐＢＫ及びＰｅｍＫホモログは、ｍＲＮＡを特異的な配列で切断することにより新たなｍＲＮＡ干渉機構を示す新規のエンドリボヌクレアーゼファミリーを形成する。このため、これらは「ｍＲＮＡインターフェラーゼ」と称されている（２）。
【０００７】
本明細書中に記載される全ての参照文献は、その全体が全ての目的のために参照により本明細書中に援用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
大腸菌ゲノムについて、ＭｑｓＲ遺伝子が下流遺伝子のＹｇｉＴと共転写されることが発見されている。これら２つの遺伝子は、サイズが小さく（ＭｑｓＲについては９８残基、ＹｇｉＴについては１３１残基）、それぞれのオープンリーディングフレームが一塩基対で隔てられていることからＴＡ系として機能すると考えられる。本明細書中に開示されるように、ＭｑｓＲ／ＹｇｉＴは毒素のＭｑｓＲと抗毒素のＹｇｉＴとからなる新たな大腸菌ＴＡ系である。さらに、本明細書中に開示されるように、ＭｑｓＲはＭａｚＦに対して相同性を示さない新規のｍＲＮＡインターフェラーゼである。この毒素は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡをＧＣＵ配列で切断し、したがって本明細書中に開示されるように細胞生理及びバイオフィルム形成に影響を与える。
【０００９】
本明細書中に開示されるように、ＭｑｓＲ誘導は極めて有害であり、その毒性はＹｇｉＴの同時発現によって阻止され、ＭｑｓＲが誘導されると細胞ｍＲＮＡは分解される。このｉｎ ｖｉｖｏ結果を、精製ＭｑｓＲを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで立証した。大腸菌の全ＲＮＡをＭｑｓＲと共に３７℃で３０分間インキュベートすると、明らかに精製ＭｑｓＲがＲＮＡを切断することが示される。重要なことには、このエンドリボヌクレアーゼ活性は、その推定の抗毒素であるＹｇｉＴを反応混合物中に添加した場合に完全に阻害された。３．５ｋｂのファージＭＳ２のＲＮＡを使用することによって、本発明者らはこの毒素による主要切断部位を同定した。これにより、この毒素はトリプレット配列ＧＣＵを認識する極めて配列特異的なｍＲＮＡインターフェラーゼであると考えられる。
【００１０】
この配列は一部の遺伝子において過小発現（underrepresented）又は過剰発現される（overrepresented）場合があり、それらの遺伝子はクオラムセンシング及び／又はバイオフィルム形成と関連し得る。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明は、大腸菌における新たなＴＡ系であるＭｑｓＲ ＹｇｉＴに関する。大腸菌におけるＭｑｓＲの誘導は極めて有害であり、ｉｎ ｖｉｖｏでｍＲＮＡの分解を引き起こした。精製ＭｑｓＲはエンドリボヌクレアーゼ活性を示し、ＹｇｉＴはｉｎ ｖｉｔｒｏでその活性を中和した。ＭｑｓＲはＭＳ２ファージＲＮＡをＧＣＵで切断する。
【００１２】
本発明は、大腸菌及び哺乳動物細胞等の原核細胞及び真核細胞における単一タンパク質産生に使用することができる。本発明は癌、細菌感染及びＡＩＤＳを含むウイルス感染といった様々なヒト疾患を治療するための、ＭｑｓＲ／ＹｇｉＴ系を用いることによる遺伝子療法にも適用される。本発明はＲＮＡ構造研究のためのＲＮＡ制限酵素として使用することができる。
【００１３】
或る特定の実施の形態では、本発明は細胞機能を阻害する方法であって、ｍＲＮＡをＧＣｘ（ここでｘはＡ、Ｃ、Ｇ又はＵである）で切断するｍＲＮＡインターフェラーゼの発現を誘導することを含む、方法に関する。前記ｍＲＮＡインターフェラーゼはリボソーム非依存性であってもよく、好ましくはＭｑｓＲ又はそのホモログである。代替的な実施の形態では、前記誘導を抗毒素、例えばＹｇｉＴによって阻害することが可能である。前記細胞は例えば大腸菌又はヒトであり得る。
【００１４】
本明細書中に開示される実施の形態では、前記ｍＲＮＡインターフェラーゼの阻害はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれかであり得る。
【００１５】
或る特定の実施の形態では、本発明は細胞機能を阻害する方法であって、ＭｑｓＲ又はそのホモログの発現を誘導することを含む、方法に関する。
【００１６】
或る特定の実施の形態では、本発明はＭｑｓＲ又はそのホモログをコードする遺伝子を含むプラスミドに関する。前記ＭｑｓＲの発現は、例えばＩＰＴＧを用いて誘導することができ、該プラスミドは、例えばｐＥＴ２８ａプラスミドであり得る。代替的な実施の形態では、前記遺伝子は配列番号１による配列を有する。
【００１７】
或る特定の実施の形態では、本発明はＹｇｉＴ又はそのホモログをコードする遺伝子を含むプラスミドに関する。前記ＹｇｉＴの発現は、例えばアラビノースを用いて誘導することができ、該プラスミドは、例えばｐＢＡＤ２４プラスミドであり得る。代替的な実施の形態では、前記遺伝子は配列番号３による配列を有する。
【００１８】
或る特定の実施の形態では、本発明は、プラスミドであって、
ａ）ＭｑｓＲ又はそのホモログをコードする遺伝子、及び
ｂ）ＹｇｉＴ又はそのホモログをコードする遺伝子を含む、プラスミドに関する。代替的な実施の形態では、前記ＭｑｓＲをコードする遺伝子は配列番号１による配列を有し、前記ＹｇｉＴをコードする遺伝子は配列番号３による配列を有する。
【００１９】
或る特定の実施の形態では、本発明は、本明細書中に開示される１つ又は複数のプラスミドによって形質転換される細胞（例えば大腸菌又はヒト）に関する。
【００２０】
或る特定の実施の形態では、本発明は、ＭｑｓＲエンドリボヌクレアーゼ活性を阻害する方法であって、ＭｑｓＲをＹｇｉＴと接触させることを含む、方法に関する。代替的な実施の形態では、該方法はＭｑｓＲをＹｇｉＴと共にプレインキュベートすることを含む。
【００２１】
或る特定の実施の形態では、本発明は、ＭｑｓＲに対する抗毒素としてのＹｇｉＴの使用に関する。
【００２２】
或る特定の実施の形態では、本発明は、大腸菌の細胞溶解を阻害する方法であって、ＭｑｓＲを不活性化することを含む、方法に関する。代替的な実施の形態では、前記ＭｑｓＲをＹｇｉＴによって不活性化する。
【００２３】
或る特定の実施の形態では、本発明は、配列番号４によるアミノ酸配列を有する単離ＹｇｉＴポリペプチドに関する。代替的な実施の形態では、該ポリペプチドは、このアミノ酸配列と９０％相同であるアミノ酸配列を有し、抗毒素活性を有する。
【００２４】
或る特定の実施の形態では、本発明は、配列番号３によるＤＮＡ配列を有する単離ＹｇｉＴポリヌクレオチドに関する。代替的な実施の形態では、該ポリヌクレオチドは、このＤＮＡ配列と９０％相同であるＤＮＡ配列を有し、抗毒素活性を有するポリペプチドをコードする。
【００２５】
或る特定の実施の形態では、本発明は、ＭｑｓＲ及びＹｇｉＴ、又はそれらのホモログを含む複合体に関する。代替的な実施の形態では、該複合体は、配列番号２によるポリペプチド及び配列番号４によるポリペプチドを含む。
【００２６】
或る特定の実施の形態では、本発明は、エンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、
ａ）細胞を、該細胞にＭｑｓＲをコードするポリヌクレオチドを導入することによって形質転換すること、及び
ｂ）形質転換した前記細胞を培養することを含む、方法に関する。
【００２７】
或る特定の実施の形態では、本発明は、抗毒素活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、
ａ）細胞を、該細胞にＹｇｉＴをコードするポリヌクレオチドを導入することによって形質転換すること、及び
ｂ）形質転換した前記細胞を培養することを含む、方法に関する。
【００２８】
或る特定の実施の形態では、本発明はｍＲＮＡを切断する方法であって、ｍＲＮＡインターフェラーゼをｍＲＮＡと接触させることを含み、該ｍＲＮＡインターフェラーゼがＭａｚＦと相同でない、方法に関する。代替的な実施の形態では、前記ｍＲＮＡをＧＣｘ（ここでｘはＡ、Ｃ、Ｇ又はＵである）で切断する。
【００２９】
或る特定の実施の形態では、本発明は、細胞機能を変化させる方法であって、ＭｑｓＲ及びＹｇｉＴの一方又は両方の発現を操作することを含む、方法に関する。
【００３０】
或る特定の実施の形態では、本発明は、疾患を有する患者を治療する方法であって、該患者にｍＲＮＡをＧＣｘ（ここでｘはＡ、Ｃ、Ｇ又はＵである）で切断するｍＲＮＡインターフェラーゼを投与することを含む、方法に関する。前記疾患は例えば癌、細菌感染又はウイルス感染であり得る。前記ウイルス感染は、例えばＨＩＶ又はレトロウイルスによって引き起こされ得る。
【００３１】
或る特定の実施の形態では、本発明は、疾患を有する患者を治療する方法であって、該患者にｍＲＮＡをＧＣｘ（ここでｘはＡ、Ｃ、Ｇ又はＵである）で切断するｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする遺伝子を投与することを含む、方法に関する。前記疾患は例えば癌、細菌感染又はウイルス感染であり得る。前記ウイルス感染は、一本鎖ＲＮＡゲノムを有するウイルス、例えばＨＩＶ又はレトロウイルスによって引き起こされる感染であり得る。
【００３２】
或る特定の実施の形態では、本発明は、配列番号５〜配列番号３６のいずれかによるプライマーに関する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】大腸菌染色体上のＭｑｓＲ−ＹｇｉＴオペロンの遺伝子地図を示す図である。Ａ：矢印はそれぞれの遺伝子：ｑｓｅＣ、ｑｓｅＢ、ｙｇｉＷ、ｙｇｉＶ、ｍｑｓＲ、ｙｇｉＴ、ｙｇｉＳ及びｐａｒＣの方向及びサイズを示す。ＭｑｓＲＹｇｉＴプロモーター配列も同様に示し、パリンドローム配列（１及び２）は枠で囲んでいる。曲がった矢印はＭｑｓＲ−ＹｇｉＴオペロンの転写開始部位を表す。ＭｑｓＲＹｇｉＴプロモーターの−１０領域及び−３５領域は太字で示し、シャイン・ダルガノ配列ＧＧＡＧＧは枠で囲んでいる。下線を引いたＤＮＡ配列を図５に示すようなＥＭＳＡアッセイに使用した。Ｂ：ＭｑｓＲＹｇｉＴオペロンのＲＴ−ＰＣＲ解析。３７℃でＯ．Ｄ．６００＝０．８まで増殖させた大腸菌ＢＬ２１株からの全ＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡを逆転写酵素を用いて合成した。ｃＤＮＡ産物を鋳型として使用して、ＰＣＲをＲＴ−Ｆｗプライマー及びＲＴ−Ｒｖプライマーを用いて行った。レーン１、１００ｂｐのＤＮＡラダー（Genscript）；レーン２及びレーン４、それぞれｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲに使用した；レーン３、逆転写酵素を用いないＰＣＲ産物。Ｃ：ＭｑｓＲＹｇｉＴの転写開始部位。プライマー伸長解析を、図１Ｂの説明に記載されるものと同じＲＮＡ及びＰＸ−ＲＴプライマーを用いて行った。Ｇ、Ａ、Ｔ及びＣ（レーン１〜レーン４）は、ｐＣＲ（登録商標）２．１−Ｔｏｐｏ（登録商標）−ＭｑｓＲＹｇｉＴ及び同じプライマーを用いた配列ラダーを含む。転写開始部位は＋１という文字で示す。
【図２】タンパク質及びＤＮＡの合成並びにｍＲＮＡ安定性に対するＭｑｓＲ誘導の影響を示す図である。Ａ：ｐＥＴ−ＭｑｓＲ及びｐＢＡＤ−ＹｇｊＴによって形質転換した大腸菌ＢＬ２１を、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ、０．２％アラビノース、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ＋０．２％アラビノースを含むか、又はどちらの誘導因子も含まないＭ９（グリセロール、ＣＡＡ）プレート上に線条接種した（streaked）。プレートを３７℃で１８時間インキュベートした。Ｂ：ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを有する大腸菌ＢＬ２１細胞の成長曲線。細胞をＭ９−グリセロール液体培地中、０．２％アラビノースの存在下（黒丸）又は非存在下（白丸）で３７℃で培養した。Ｃ：ｉｎ ｖｉｖｏでの［３５Ｓ］メチオニン取り込みに対するＭｑｓＲの影響。指定の種々の時間間隔で、０．４ｍｌの培養物を３０μＣｉの［３５Ｓ］メチオニンを含有する試験管に取り出し、混合物を３７℃で３０秒間インキュベートした。インキュベーション後、５０μｌの反応混合物を円形濾紙（Whatman ３ｍｍ、２．３ｃｍ径）にアプライした。円形濾紙を、以前に記載されているように（３４）、１０％トリクロロ酢酸溶液中で処理した。濾紙上の放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。Ｄ：Ｃからの産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。指定の時点で、４００μｌの反応混合物を、１００μｇ／ｍｌの非放射性メチオニンを含有する冷却した試験管中に入れ、細胞を遠心分離によって回収した。このペレットを４０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー中に溶解させた。この試料を沸騰水浴内で１０分間インキュベートした。不溶性物質を遠心分離によって除去した後、上清画分（１２．５μｌ）を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにアプライした。Ｅ：ｉｎ ｖｉｖｏでの［３Ｈ］チミジン取り込みに対するＭｑｓＲの影響。ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを有する大腸菌ＢＬ２１細胞を３７℃で増殖させた。培養物のＯ．Ｄ．６００値が０．３に達した時点で、ＭｑｓＲをアラビノース（０．２％）を用いて誘導した。指定の種々の時間間隔で、０．４ｍｌの培養物を試験管に取り出し、１０μＣｉの［３Ｈ］チミジン＋３０μｇの非放射性チミジンと共にインキュベートした。次いで、混合物を３７℃で３０秒間インキュベートした。インキュベーション後、細胞に取り込まれた放射能を、以前に記載されているように（３４）測定した。Ｆ：細胞ｍＲＮＡ安定性に対するＭｑｓＲの影響。アラビノース（０．２％）の添加後、指定の様々な時点で、ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを有する大腸菌ＢＬ２１細胞から全ＲＮＡを抽出し、標識したｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ及びｌｐｐをそれぞれプローブとして用いたノーザンブロット解析に供した。ＲＮＡをメンブレンに転写する前に、２３Ｓ ｒＲＮＡ及び１６Ｓ ｒＲＮＡを検出するためにゲルをエチジウムブロマイドで染色した。
【図３】ｉｎ ｖｉｖｏでのｏｍｐＦ ｍＲＮＡ中のＭｑｓＲ切断部位のプライマー伸長解析を示す図である。ＭｑｓＲの誘導前及び誘導後の指定の時点で、全ＲＮＡをｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを有する大腸菌ＢＬ２１細胞から調製した。配列ラダーはｐＣＲ（登録商標）２．１−Ｔｏｐｏ（登録商標）−ｏｍｐＦを鋳型として用いて得た（３４）。切断部位周辺の配列を下部に示し、切断部位を矢印で示す。
【図４】ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭｑｓＲのｍＲＮＡインターフェラーゼ活性を示す図である。Ａ：無細胞系におけるタンパク質合成に対するＨ−ＭｑｓＲの影響。ＭａｚＧタンパク質合成を、環状ＤＮＡ用の大腸菌Ｔ７ Ｓ３０抽出系（Promega）を使用して、ｐｅＴ１１ａ−ｍａｚＧを用いて行った。レーン１、Ｈ−ＭｑｓＲを添加しない；レーン２〜レーン６、それぞれ５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ及び８０ｎＭのＨ−ＭｑｓＲを添加した；レーン７、８０ｎＭのＨ−ＭｑｓＲ＋４０ｎＭのＹｇｉＴ−Ｈを添加した；レーン８、４０ｎＭのＹｇｉＴ−Ｈを添加した。Ｂ：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの精製Ｈ−ＭｑｓＲのｍＲＮＡインターフェラーゼ活性。ＭＳ２ファージＲＮＡ（０．８μｇ）をＨ−ＭｑｓＲと共に、１ｍＭ ＤＴＴを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中、３７℃で１０分間インキュベートした。産物を１．２％アガロースゲル上で分離した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色した。
【図５】ＭｑｓＲＹｇｉＴの５’−ＵＴＲ領域におけるパリンドローム配列へのＭｑｓＲ、ＭｑｓＲＹｇｉＴ及びＹｇｉＴの結合を示す図である。電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を、実験手順の項に記載されるような種々の濃度のタンパク質と共にインキュベートした５’末端標識パリンドローム１（レーン１〜レーン６）及び２（レーン７〜レーン１２）のＤＮＡ断片（図１Ａを参照されたい）を用いて行った。レーン１〜レーン６及びレーン７〜レーン１２はそれぞれ０ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ及び８０ｎＭのＨ−ＭｑｓＲ（Ａ）、ＹｇｉＴ−Ｈ（Ｂ）及びＨ−ＭｑｓＲＹｇｉＴ（Ｃ）を表す。
【図６】ＴＡ遺伝子座の一般的な遺伝子コンテクスト（genetic context）を示す図である。
【図７】大腸菌におけるＭｑｓＲによるバイオフィルム形成の調節のモデルを示す図である。
【図８】ｍＲＮＡ安定性並びにタンパク質及びＤＮＡの合成に対するＭｑｓＲの影響を示す図である。
【図９】無原核細胞系におけるタンパク質合成に対するＨｉｓ−ＭｑｓＲの影響を示す図である。
【図１０】精製Ｈｉｓ−ＭｑｓＲによる全ＲＮＡ及びＭＳ２ファージＲＮＡの切断を示す図である。
【図１１】ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭＳ２ ＲＮＡ中のＭｑｓＲ切断部位のプライマー伸長解析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
［実施例］
実験手順
本発明を以下の非限定的な実験手順によってさらに説明する。
【００３５】
大腸菌におけるＭｑｓＲの毒性
大腸菌ＢＬ２１細胞を、ｐＥＴ−ＭｑｓＲ及びｐＢＡＤ−ＹｇｉＴ又はｐＢＡＤ及びｐＥＴプラスミドによって形質転換した。細胞を図２Ａに示すように、誘導因子［アラビノース（０．２％）及びＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）］を含む、及び含まないグリセロール−Ｍ９−カザミノ酸寒天プレート上に広げ、これらのプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。３７℃で、０．２％アラビノースの存在下（黒丸）及び非存在（白丸）でのＭ９（グリセロール、ＣＡＡ）液体培地における、ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲプラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１の成長曲線を図２Ｂに示す。細胞成長を６００ｎｍでのＡ（吸光度）によって測定した。
【００３６】
ｍＲＮＡ安定性並びにタンパク質及びＤＮＡの合成に対するＭｑｓＲの影響
アラビノースの添加後、指定の様々な時点で、ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを含有する大腸菌ＢＬ２１細胞から全細胞ＲＮＡを抽出し、放射標識したｌｐｐ、ｏｍｐＦ及びｏｍｐＡ ＯＲＦ ＤＮＡをプローブとして用いたノーザンブロット解析に供した。ｉｎ ｖｉｖｏでの［３Ｈ］ｄＴＴＰ取り込みに対するＭｑｓＲの影響を図４Ａに示す。ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞ｍＲＮＡに対するＭｑｓＲの影響を図４Ｂに示す。ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを含有する大腸菌ＢＬ２１細胞への３５Ｓ−メチオニン取り込みを、ＭｑｓＲ誘導後の指定の様々な時点で測定した。ｉｎ ｖｉｖｏでの３５Ｓ−メチオニン取り込みに対するＭｑｓＲの影響を図４Ｃに示す。図４Ｃと同じ培養物を用いて、図８Ｄに示すように、ＭｑｓＲ誘導後のｉｎ ｖｉｖｏタンパク質合成のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示した。
【００３７】
無原核細胞系におけるタンパク質合成に対するＨｉｓ−ＭｑｓＲの影響
ＭａｚＧタンパク質合成を、大腸菌Ｔ７ Ｓ３０抽出系（Promega）においてｐＥＴ−１１ａ−ＭａｚＧを鋳型として用いて行った。結果を図９に示す。
【００３８】
精製Ｈｉｓ−ＭｑｓＲによる全ＲＮＡ及びＭＳ２ファージＲＮＡの切断
大腸菌全ＲＮＡを、精製Ｈｉｓタグ付きＭｑｓＲと共に３７℃で３０分間インキュベートした。最後のレーンには、精製ＹｇｉＴを添加した。ＲＮＡを１．２％ＴＢＥアガロースゲル中で解析し、図１０Ａに示すように、ゲルをエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色した。
【００３９】
ＭＳ２ ｓｓＲＮＡの切断及びＹｇｉＴによるその阻害
ＭＳ２ ｓｓＲＮＡ（０．８μｇ；３５６９塩基；Roche）を、Ｈｉｓ−ＭｑｓＲによって３７℃で２０分間消化した。Ｈｉｓ−ＭｑｓＲを、精製ＹｇｉＴと共に氷上で１０分間プレインキュベートした後、ＭＳ２ ＲＮＡと共に３０分間さらにインキュベートした。尿素中の変性産物を１．２％ＴＢＥ未変性（native）アガロースゲル上で分離した。ゲルをＥｔＢｒで染色した。結果を図１０Ｂ及び図１０Ｃに示す。
【００４０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭＳ２ ＲＮＡ中のＭｑｓＲ切断部位のプライマー伸長解析
Ｈｉｓ−ＭｑｓＲによるＭＳ２ ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断。レーン１、Ｈｉｓ−ＭｑｓＲを添加したＭＳ２ ＲＮＡ；レーン２、タンパク質を添加しなかった対照反応を表す。切断部位はＲＮＡ配列上の赤色の矢印で表し、左に示したＲＮＡラダーを用いて決定した。結果を図１１に示す。
【００４１】
さらに詳細な実験手順
細菌株及びプラスミド
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＣ４３を使用した。ＭｑｓＲＹｇｉＴオペロン中のＭｑｓＲ遺伝子及びＹｇｉＴ遺伝子の両方を、大腸菌ゲノムＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによって別個に増幅し、初めにｐＥＴ２８ａ（Novagen）にクローニングした。ＭｑｓＲＹｇｉＴオペロンも、大腸菌ゲノムＤＮＡを鋳型として使用するＭｑｓＲ−Ｆｗプライマー及びＹｇｉＴ−Ｒｖプライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、ｐＥＴ２８ａにクローニングして、ＭｑｓＲ−ＹｇｉＴ複合体を発現させた。続いて、ＭｑｓＲ遺伝子及びＹｇｉＴ遺伝子を、ｐＢＡＤ２４に別個にクローニングし、ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲ及びｐＢＡＤ−ＹｇｉＴをそれぞれ作製した。ＭｑｓＲＹｇｉＴのプロモーター領域を、ＲＴ−ｐｒｏＦプライマー及びＲＴ−ｐｒｏＲプライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、ｐＣＲ（登録商標）２．１−Ｔｏｐｏ（登録商標）ベクター（invitrogen）にクローニングした。
【００４２】
ｉｎ ｖｉｖｏでのＤＮＡ及びタンパク質合成のアッセイ
ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、０．５％グリセロール（グルコース無添加）及びメチオニン以外の各アミノ酸を１ｍＭ添加したＭ９培地中で増殖させた。培養物のＯ．Ｄ．６００値が０．３に達した時点で、アラビノースを０．２％の最終濃度まで添加して、ＭｑｓＲを誘導した。細胞培養物のアリコート（０．４ｍｌ）を図２に示されるような時間間隔で取り出し、それぞれ３０μＣｉの［３５Ｓ］−メチオニン又は１０μＣｉの［３Ｈ］チミジン＋８０μｇの非放射性メチオニン及び３０μｇの非放射性チミジンと混合した）。３７℃で３０秒間のインキュベーションの後、タンパク質及びＤＮＡの合成速度を以前に記載されているように（３４）求めた。全細胞タンパク質合成のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析については、４００μｌの試料を［３５Ｓ］−メチオニンを含有する反応混合物から図１Ｆに示されるような時間間隔で取り出し、１００μｇ／ｍｌの非放射性メチオニン溶液を１００μｌ含有する冷却した試験管に移した。細胞ペレットを遠心分離によって回収し、４０μｌのＬａｅｍｍｌｉバッファー中に再懸濁して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてオートラジオグラフィーに供した。
【００４３】
ＲＮＡ単離及びノーザンブロット解析
ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、０．２％グリセロールを添加した（グルコース無添加）Ｍ９培地中、３７℃で増殖させた。Ｏ．Ｄ．６００値が０．４に達した時点で、アラビノースを０．２％の最終濃度まで添加した。試料を図２に示されるような種々の間隔で採取した。全ＲＮＡを以前に記載されているように（３５）、熱フェノール法（hot-phenol method）を用いて単離した。ノーザンブロット解析を以前に記載されているように（３６）行った。
【００４４】
ｉｎ ｖｉｖｏでのプライマー伸長解析
ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡ切断部位のプライマー伸長解析については、全ＲＮＡをｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞から、図３に示されるようなＭｑｓＲ誘導後の種々の時点で抽出した。プライマー伸長を、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰと共に、１５μｇの全ＲＮＡ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ株式会社）で標識した１ｐｍｏｌのプライマー（表１）を使用して、１０単位のＡＭＶ逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）（Roche）を用いて４７℃で１時間行った。１２μｌのシークエンシングローディングバッファー（９５％ホルムアルデヒド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー及び０．０５％キシレンシアノール）を添加することによって反応を停止させ、９５℃で２分間加熱した後、氷上に載せた。産物を同じプライマーから作製したシークエンシングラダーを用いて、８Ｍ尿素を含有する６％ポリアクリルアミドゲル上で解析した。
【００４５】
タンパク質精製
Ｎ末端ヒスチジンタグ付きＭｑｓＲ（Ｈ−ＭｑｓＲ）及びＣ末端ヒスチジンタグ付きＹｇｉＴ（ＹｇｉＴ−Ｈ）を精製するために、ｐＥＴ−ＭｑｓＲＹｇｉＴ及びｐＥＴ−ＹｇｉＴを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。Ｈ−ＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体及びＹｇｉＴ−Ｈの発現を、それぞれ１ｍＭイソプロピル−ｂ−Ｄ−１−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いて３時間誘導した。Ｈ−ＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体及びＹｇｉＴ−Ｈを、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Qiagen）を用いて、製造業者のプロトコルに従って精製した。続いて、Ｈ−ＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体を６ＭグアニジンＨＣｌによって変性させた。次いで、変性Ｈ−ＭｑｓＲをＮｉ−ＮＴＡアガロースを用いて精製し、Ｈ−ＭｑｓＲのリフォールディングを、ＭａｚＦに関して以前に記載されているように（１６）段階透析によって行った。
【００４６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質合成のアッセイ
無細胞タンパク質合成を、環状ＤＮＡ用の大腸菌Ｔ７ Ｓ３０抽出系（Promega）を用いて行った。反応混合物を製造業者のプロトコルに記載のように調製した。次いで、種々の量のＨ−ＭｑｓＲ及びＹｇｉＴ−Ｈを２９μｌの最終容量で添加した。ｐＥＴ１１ａ−ｍａｚＧプラスミドＤＮＡを添加することによって反応を開始させ（１８、３７）、混合物を３７℃で１時間インキュベートした。タンパク質をアセトンで沈殿させ、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。乾燥させたゲルをオートラジオグラフィーによって解析した。
【００４７】
ＭｑｓＲのｍＲＮＡインターフェラーゼ活性
ＭＳ２ファージＲＮＡ（Roche）を、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）中、３７℃で１０分間Ｈ−ＭｑｓＲと共にインキュベートした。ＹｇｉＴの抗毒素機能を調査するために、Ｈ−ＭｑｓＲをＹｇｉＴ−Ｈと共に氷上で１０分間プレインキュベートした後、ＭＳ２ ＲＮＡと共に１０分間さらにインキュベートした。尿素中での変性の後、産物を０．５×ＴＢＥバッファー（４４．５ｍＭ Ｔｒｉｓホウ酸塩及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）中、１．２％アガロースゲル上で分離した（３８）。
【００４８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのプライマー伸長解析
ＭＳ２ ＲＮＡを、１ｍＭ ＤＴＴを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で、精製Ｈ−ＭｑｓＲを添加して又は添加せずに３７℃で１５分間インキュベートし、消化したＭＳ２ ＲＮＡ（０．８μｇ）を上記のようなプライマー伸長に使用した。
【００４９】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
相補鎖（表１）をアニーリングさせ、精製して、パリンドローム１及びパリンドローム２の二本鎖ＤＮＡをそれぞれ得た。この二本鎖ＤＮＡ断片を、Ｔ４キナーゼ（タカラバイオ株式会社）によって［ｇ−３２Ｐ］ＡＴＰで末端標識した。結合反応を５０ｍＭ ＫＣｌ、５％グリセロール、１００ｎｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）、標識ＤＮＡ断片及び精製タンパク質を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）バッファー中、４℃で３０分間行った。電気泳動を５％アクリルアミド／ビスアクリルアミド（４０：１．２）ゲルにおいて、ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中、４℃、１１０Ｖで行った。電気泳動の後、ゲルを乾燥させて、オートラジオグラフィーによって解析した（３９）。
【００５０】
逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ
大腸菌から全ＲＮＡを対数期（Ｏ．Ｄ．６００＝０．８）に上記のように抽出し、０．５μｌ（２０単位）のリボヌクレアーゼ阻害物質（Roche）の存在下で、１００単位のＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｉ（Promega）で処理した。ＲＴ反応を、全ＲＮＡ（２０μｇ）及びプライマーＹＴ−Ｒｖ（２０ｐｍｏｌ）を使用し、１０単位のＡＭＶ−ＲＴ（Roche）を用いて４７℃で１時間行った。合成したｃＤＮＡを鋳型として使用し、ＲＴ−Ｆｗプライマー及びＲＴ−Ｒｖプライマー（表１）を用いてＰＣＲを行った。
【００５１】
結果
ＭｑｓＲ遺伝子及びＹｇｉＴ遺伝子は１つのオペロン内にある
大腸菌Ｋ−１２染色体上の６８分でのＭｑｓＲＹｇｉＴオペロンの位置を図１Ａに示す。ＭｑｓＲは９８残基のタンパク質であり、そのＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）に対する開始コドンの８塩基上流に、予測シャイン・ダルガノ配列（ＧＧＡＧＧ）が存在する（図１Ａ中、枠で囲んだ）。下流のＹｇｉＴは１３１残基のタンパク質であり、ＹｇｉＴの開始コドンはＭｑｓＲの翻訳停止コドンの１塩基下流にある。ＭｑｓＲＹｇｉＴがオペロンとして転写されるか否かを決定するために、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）から抽出した全ＲＮＡを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。ｃＤＮＡを実験手順に記載されるように、ＹｇｉＴ停止コドンの３１ｂｐ上流に位置するＹＴ−Ｒｖプライマー（表１）を用いて全ＲＮＡから合成した。図１Ｂのレーン２に示すように、ＲＴ−Ｆｗ及びＲＴ−Ｒｖ（表１）をプライマーとして用いたＰＣＲによって、およそ６００ｂｐの位置にバンドが検出された。大腸菌ゲノムＤＮＡを同じプライマーを用いたＰＣＲの鋳型として使用した場合、期待される５７６ｂｐのバンドが検出された（図１Ｂ；レーン３）。このバンドは、逆転写酵素を添加せずに行った反応においては検出されなかった（図１Ｂ；レーン２）。これらの結果によって、ＭｑｓＲ遺伝子が下流遺伝子のＹｇｉＴと共転写されることが実証される。転写開始部位を同定するために、上記と同じＲＮＡを使用してＰＸ−ＲＴプライマーを用いたプライマー伸長を行った。このプライマーはＭｑｓＲ遺伝子の開始コドンの２ｂｐ下流に位置する。図１Ｃに示すように、転写開始部位は矢印で示されるＭｑｓＲ開始コドンの１０９ｂｐ上流に位置する。これにより、図１Ａに示される転写開始部位の上流領域に、典型的なＲＮＡポリメラーゼプロモーターである−１０領域及び−３５領域を同定した。ＭｑｓＲとＹｇｉＴとの間の領域には転写開始部位は検出されず（データは示さない）、ＹｇｉＴ遺伝子に対する独立した転写単位がないことが示される。また、図１Ａの枠内に示されるように、１０９塩基の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）中に２つのパリンドローム配列が存在する。
【００５２】
細胞成長に対するＭｑｓＲの影響
ＭｑｓＲ遺伝子及びＹｇｉＴ遺伝子を、ＩＰＴＧ誘導性ｐＥＴ２８ａプラスミド（Novagen）及びアラビノース誘導性ｐＢＡＤ２４プラスミド（４０）のそれぞれにクローニングした。ｐＥＴ−ＭｑｓＲ及びｐＢＡＤ−ＹｇｉＴを有する大腸菌Ｃ４３細胞は、アラビノース（０．２％）の存在下でＭ９−グリセロール−カザミノ酸寒天プレート上にコロニーを形成することができなかった（図２Ａ）。しかしながら、０．２％アラビノース存在下でのＹｇｉＴの共誘導（co-induction）によってＭｑｓＲの毒性が中和され、コロニーの形成がもたらされたため、ＭｑｓＲが毒素であり、ＹｇｉＴがＭｑｓＲに対する抗毒素であることが示される。液体培養物におけるＭｑｓＲの毒性も調査した（図２Ｂ）。ＭｑｓＲをアラビノース（０．２％）の添加によって誘導した場合、３０分後に細胞成長が完全に阻害された。
【００５３】
次に、［３５Ｓ］メチオニン取り込みによって測定されるタンパク質合成に対するＭｑｓＲ誘導の影響を調査した。ＭｑｓＲ誘導の５分以内に、タンパク質合成はほとんど完全に阻害された（図２Ｃ）。これらの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した（図２Ｄ）。図２Ｃの結果と一致して、ＭｑｓＲによって細胞タンパク質への［３５Ｓ］メチオニンの取り込みが完全に阻止された。見掛けの分子量が１２ｋＤａの２分時点に存在する強いバンド（矢印で示す）は、ＭｑｓＲ（ＭＷ １１２３２）であると考えられる。これらの結果から、ＭｑｓＲが全ての細胞タンパク質合成の一般的な阻害物質であることが示された。実際には、［３Ｈ］チミジンの取り込みは、ＭｑｓＲ誘導に有意に影響を受けず（図２Ｅ）、ＭｑｓＲはタンパク質合成を阻害するが、ＤＮＡ合成を阻害しないことが示される。ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の細胞ｍＲＮＡ（ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ及びｌｐｐ）を、アラビノースによるＭｑｓＲ誘導後の種々の時点でノーザンブロット解析によって解析すると、完全長ｍＲＮＡはいかなる場合においても０時点でしか観察されなかった（図２Ｆ）。２分の時点では、フルサイズのｍＲＮＡは或る特定の長さだけ短縮され、試験した全てのｍＲＮＡが５’末端又は３’末端の近くに位置する優先的な初期切断部位を有することが示される。これらのバンドの強度は５分後には有意に減少した。これらのデータから、ＭｑｓＲがエンドリボヌクレアーゼ活性を有し、ｍＲＮＡの切断によってタンパク質合成を阻害することが示唆される。１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡが、それらのバンド強度において有意な変化が観察されず、ＭｑｓＲ誘導の１０分後でもｉｎ ｖｉｖｏで非常に安定であったことに留意することが重要である（図２Ｆ）。これは、ＭａｚＦ ｍＲＮＡインターフェラーゼを用いて見られる結果（３４）と同様であった。ｒＲＮＡはリボソームタンパク質によるＭｑｓＲ切断から保護されるようである。
【００５４】
ＭｑｓＲによるｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ及びｌｐｐ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ切断
次に、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ及びｌｐｐ ｍＲＮＡのＭｑｓＲ媒介切断をプライマー伸長実験によって調査した。種々のプライマーを用いたｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ及びｌｐｐのプライマー伸長解析によって、ＭｑｓＲ誘導の２分後に現れた、各々のｍＲＮＡにおける特異的な切断部位に相当する明らかなバンドが同定された（表２及び図３Ａ〜図３Ｄ）。これらのバンドは０分では検出されなかった。全ての切断配列のアラインメントによると、切断はＧＣＵ配列のＧ残基の前後で起こり、ｉｎ ｖｉｖｏでＭｑｓＲがｍＲＮＡを特異的な配列ＧＣＵで切断することが示された。ｏｍｐＦ ｍＲＮＡ中のＧＣＵ配列は全て、ＭｑｓＲ誘導後に例外なく切断された（表２）。
【００５５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭｑｓＲのｍＲＮＡインターフェラーゼ活性
精製ＭｑｓＲを得るために、最初にＮ末端ヒスチジンタグ付きＭｑｓＲ（Ｈ−ＭｑｓＲ）を、ｐＥＴ−ＭｑｓＲＹｒｇｉＴを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞からＨ−ＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体として発現させ、複合体をＮｉ−ＮＴＡアガロースを用いて精製した。次いで、精製Ｈ−ＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体を６ＭグアニジンＨＣｌを用いて変性させた。変性Ｈ−ＭｑｓＲをＮｉ−ＮＴＡアガロース上に再捕捉し、溶出させて、段階透析によってリフォールディングさせた（１６）。Ｃ末端ヒスチジンタグ付きＹｇｉＴ（ＹｇｉＴ−Ｈ）を大腸菌中で発現させ、実験手順に記載されるように精製した。ゲル濾過によって、精製したＨ−ＭｑｓＲ、ＹｇｉＴ−Ｈ及びＨ−ＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体の分子量が、それぞれ２６ｋＤａ、３２ｋＤａ及び９０ｋＤａであると求められた（データは示さない）。この結果から、ＭｑｓＲ及びＹｇｉＴの両方が二量体として存在し、ＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体がおそらく２つのＭｑｓＲ二量体及び１つのＹｇｉＴ二量体からなり、ＭａｚＥＭａｚＦ複合体の場合もこれと同様であることが示唆される（１６）。
【００５６】
次に、無細胞タンパク質合成に対するＨ−ＭｑｓＲ及びＨ−ＭｑｓＲＹｇｉＴの影響を、大腸菌Ｔ７ Ｓ３０抽出系（Promega）を用いて調査した。ＭａｚＧタンパク質の合成は、４０ｎＭ以上の濃度のＭｑｓＲによってほとんど完全に阻害された（図４Ａ；レーン５及びレーン６）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質合成の阻害は、ＭａｚＦ（３４）及びＹｏｅＢ（１８）の場合に観察された。ＹｇｉＴ−Ｈ及びＨ−ＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体はタンパク質合成を阻害しなかった（図４Ａ；レーン７及びレーン８）。
【００５７】
上で観察されたｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ及びｌｐｐ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ切断がＭｑｓＲのｍＲＮＡインターフェラーゼ活性によるものであることをさらに証明するために、ＭＳ２ファージＲＮＡ（３５６９塩基）を精製ＭｑｓＲ−Ｈを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで切断させた。この精製ＭｑｓＲ調製物はエンドリボヌクレアーゼ活性を明らかに示していた（図４Ｂ、レーン２及びレーン３）。精製ＹｇｉＴ−ＨをＨ−ＭｑｓＲと共にプレインキュベートした場合に、エンドリボヌクレアーゼ活性は完全に阻害された（図４Ｂ、レーン４）。精製ＹｇｉＴ−Ｈ自体はｍＲＮＡに対する検出可能な影響を有しなかった（図４Ｂ、レーン５）。この結果から、ＹｇｉＴが抗毒素として機能し、ＭｑｓＲ ｍＲＮＡインターフェラーゼ活性を阻止することが確認される。ＹｇｉＴがＭｑｓＲに対する特異的な阻害物質であることを確認するために、ＹｇｉＴがｍＲＮＡをＡＣＡ配列で切断するＭａｚＦを阻害するか否かを調査した。ＭａｚＦはＭＳ２ ＲＮＡを切断したが（図４Ｂ、レーン６）、その活性は精製ＭａｚＥ（ＭａｚＦの解毒剤（antidote）である）と共にプレインキュベートした場合に完全に阻害された（図４Ｂ、レーン７）。しかしながら、ＭａｚＦを精製ＹｇｉＴ−Ｈと共にインキュベートしても、その活性は阻害されなかった（図４Ｂ、レーン８）。この結果から、ＹｇｉＴがＭｑｓＲエンドリボヌクレアーゼ活性を特異的に阻害することが示された。
【００５８】
リボソームの非存在下でＲＮＡを切断するＭｑｓＲの能力は、ｍＲＮＡインターフェラーゼ活性がリボソームに依存するＲｅｌＥ又はＹｏｅＢとは明らかに異なる（１２、１８、４１）。ＭｑｓＲ活性は、ＭａｚＦに関して以前に記載されているように（３４）、ＭｇＣｌ２によって阻害された（データは示さない）。
【００５９】
精製ＭｑｓＲによるＭＳ２ ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断部位
ＭＳ２ ＲＮＡに対するｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭｑｓＲ活性もプライマー伸長によって解析した。ＭＳ２ ＲＮＡをＭｑｓＲと共に３７℃で１０分間インキュベートした。産物をプライマー伸長の鋳型として使用した。ＭｑｓＲはＭＳ２ ＲＮＡを５つの切断部位で切断し、切断部位の全ての配列がＧＣＵであることが決定された（表２）。総合すると、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでのプライマー伸長実験の結果（図３及び表２）から、ＭｑｓＲがＲＮＡをＧＣＵ配列で特異的に切断するｍＲＮＡインターフェラーゼであることが示される。
【００６０】
ＭｑｓＲＹｇｉＴプロモーター領域へのＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体の結合
ｃｃｄＡＢ（４２、４３）、ｐａｒＤＥ（４４）、ｍａｚＥＦ（４５）及びｒｅｌＢＥ（４６）を含む他の多くのＴＡ系のプロモーター領域にはパリンドローム配列が存在する。これらの抗毒素又は毒素−抗毒素複合体は、その同種パリンドローム配列に結合して、自身のオペロンを負に調節する。ＭｑｓＲＹｇｉＴオペロンの５’−ＵＴＲ領域中には２つのパリンドローム配列が存在するため（図１Ａ）、次にＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体がそれらに結合することが可能か否かを調査した。パリンドローム１及びパリンドローム２のＤＮＡ断片を実験手順に記載されるように調製し、Ｔ４キナーゼによって［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで標識した。ＹｇｉＴ及びＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体を標識ＤＮＡと混合し、パリンドローム配列と結合するそれらの能力を試験した。ＹｇｉＴはパリンドローム１断片及びパリンドローム２断片の移動度を、それぞれ１０ｎＭ及び２０ｎＭ以上の濃度でシフトさせることが可能であった（図５Ａ；レーン３〜レーン６及びレーン１０〜レーン１２）。５ｎＭでは、パリンドローム１断片又はパリンドローム２断片のいずれによってもシフトバンドは観察されなかった。注目すべきことに、Ｈ−ＭｑｓＲタンパク質単独では、８０ｎＭの濃度であっても、いずれのパリンドローム配列にも結合することができなかった（図５Ａ）。しかしながら、ＭｑｓＲをＹｇｉＴに添加することによって、両方のパリンドローム配列へのＹｇｉＴの結合が増強された。ＭｑｓＲはＹｇｉＴに２対１のモル比で添加した。複合体は両方のパリンドローム配列に、ＹｇｉＴ単独と比較してより強く結合する（図５Ｃ；それぞれレーン２〜レーン６及びレーン９〜レーン１２）。これらの条件下では、パリンドローム配列を表すバンドの位置は、パリンドローム１断片及びパリンドローム２断片に対してそれぞれ５ｎＭ及び１０ｎＭのＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体でシフトした。この結果から、ＹｇｉＴ及びＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体の両方がパリンドローム配列に結合して、他のＴＡ系と同様にＭｑｓＲＹｇｉＴオペロンを負に調節することが示唆される。
【００６１】
考察
本明細書中に開示されるように、本発明者らは、大腸菌染色体上のＭｑｓＲ遺伝子及びＹｇｉＴ遺伝子が共転写され、ＭｑｓＲ−ＹｇｉＴが新たな毒素−抗毒素系であることを実証した。他のＴＡ系の多くとは対照的に、オペロン中の第１の遺伝子が毒素のＭｑｓＲをコードし、第２の遺伝子が抗毒素のＹｇｉＴをコードする。ＭｑｓＲは、ｍＲＮＡ中のＡＣＡ配列で特異的に切断する（２９）、よく特徴付けられたｍＲＮＡインターフェラーゼであるＭａｚＦとは相同性を有しないが、ＭｑｓＲはｍＲＮＡをＧＣＵ配列で切断するｍＲＮＡインターフェラーゼであることが見出された。注目すべきことに、ＭｑｓＲはＭａｚＦと同様、ＲｅｌＥ（１２、４６）、ＹｏｅＢ（１８）及びＨｉｇＢ（４７）といったリボソーム依存性ｍＲＮＡインターフェラーゼとは明らかに異なるリボソーム非依存性のｍＲＮＡインターフェラーゼである。
【００６２】
ＭｑｓＲがバイオフィルム形成の際に（１）、またクオラムセンシングオートインデューサー−２（ＡＩ−２）によって（２）誘導されることが報告されている。ＭｑｓＲの活性化は次に、バイオフィルム形成において重要な役割を果たすことが知られる二成分系ｑｓｅＢＣを活性化する（２）。ＱｓｅＣはセンサーヒスチジンキナーゼであり、ＱｓｅＢはｑｓｅＢＣオペロンの５’−ＵＴＲ領域に結合して、このオペロンの転写を活性化する転写調節因子である（４８、４９）。ＭｑｓＲ−ＹｇｉＴ複合体は、ＭｑｓＲＹｇｉＴオペロンの５’−ＵＴＲ中に存在する２つのパリンドローム配列に結合することが可能であり、ＭｑｓＲＹｇｉＴの転写を抑制すると考えられる。本発明者らは、ＭｑｓＲ−ＹｇｉＴ複合体がｑｓｅＢＣオペロンの発現も調節することの可能性を調査した。しかしながら、Ｈ−ＭｑｓＲ−ＹｇｉＴ複合体は、ＱｓｅＢ結合部位を含むｑｓｅＢＣプロモーター領域に結合可能ではなかった（データは示さない）。パリンドローム配列（パリンドローム１及びパリンドローム２；図１Ａ）の両方が、この２つのパリンドローム配列をどちらも有する他の大腸菌遺伝子はＭｑｓＲＹｇｉＴオペロン以外にないため、大腸菌染色体で独特である。また、精製ＱｓｅＢはＭｑｓＲＹｇｉＴオペロンの５’−ＵＴＲ領域に結合しなかった（データは示さない）。これらの結果から、ＭｑｓＲがｑｓｅＢＣオペロンの活性化とは直接には関与しないことが示される。
【００６３】
本発明者らは、ＧＣＵ配列の存在について大腸菌ゲノム（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ；アクセッション番号ＮＣ００００９１）上の４２２６個のＯＲＦの全てを解析し、単一のＧＣＵ配列を含有しないＯＲＦが１４個しかないことを見出した（表３）。これらの１４個の遺伝子のうち、６個の遺伝子（ｐｈｅＬ、ｔｎａＣ、ｔｒｐＬ、ｙｃｉＧ、ｙｇａＱ及びｒａｌＲ）が、大腸菌におけるバイオフィルム形成の際に誘導されることが示されている（５０）。特に興味深いのはバイオフィルムにおいて３２倍に誘導されるＹｇａＱ（３３０ｂｐ）であり、大腸菌のスウォーミング運動（swarming mobility）に関与することも示されている（５１）。これらの遺伝子はＭｑｓＲ ｍＲＮＡインターフェラーゼ活性に対して抵抗性であるため、バイオフィルム形成の際のＭｑｓＲ誘導は、これら１４個の遺伝子以外の全ての大腸菌ｍＲＮＡを不活性化する場合があり、このことがバイオフィルム形成において重要な役割を果たし得る。ほとんど全ての細胞が緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）におけるバイオフィルム形成の際に死滅する（５２）。バイオフィルム形成の際のＭｑｓＲ誘導は、ＭａｚＦによる場合と同様に（８、５３）、細胞を準休眠状態（quasi-dormant state）に入らせ、最終的に細胞死をもたらし得る。
【００６４】
本明細書（present paper）における大腸菌中の新たなＴＡ系としてのＭｑｓＲ−ＹｇｉＴ系の発見によって、ＭａｚＦ−ＭａｚＥ（１６、３４）、ＲｅｌＥ−ＲｅｌＢ（１２、１３）、ＣｈｐＢＫ−ＣｈｐＢＩ（１４）、ＹａｆＱ−ＤｉｎＪ（２１）、ＹｏｅＢ−ＹｅｆＭ（１８、１９）、ＨｉｐＡ−ＨｉｐＢ（２２、２３）、ＨｉｃＡ−ＨｉｃＢ（２５、２６）、ＹｈａＶ−ＰｒｌＦ（２７）及びＹａｆＯ−ＹａｆＮ（２４）を含む大腸菌ＴＡ系の総数が１６個にまで増加する。
【００６５】
【表１】
【００６６】
【表２】
【００６７】
【表３】
【００６８】
本発明は、本発明の幾つかの態様を説明することを意図する実施例に開示される具体的な実施形態による範囲に限定されず、機能的に等価ないかなる実施形態も本発明の範囲内にある。実際に、本明細書中に示し、説明したもの以外の本発明の様々な変更形態が当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本願は２００８年８月２０日付で出願された米国仮特許出願第６１／１８９，６３９号（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に対する優先権を主張するものである。
【０００２】
配列リスト
書面及びコンピュータ可読形式の配列リストを本明細書に添えて提出する。コンピュータ可読形式で記録された情報は、書面の配列リストと同一である。
【背景技術】
【０００３】
クオラムセンシングがバイオフィルム形成に関与することが報告されている（１〜４）。ＭｑｓＲ発現がバイオフィルムにおいて（５）、また、大腸菌を含むグラム陰性菌及びグラム陽性菌の両方によって産生される、非種特異的（species-nonspecific）シグナリング分子であるクオラムセンシングシグナルオートインデューサー−２（ＡＩ−２）によって（６）８倍に誘導されることが見出された。ＭｑｓＲの誘導によって、バイオフィルム形成において重要な役割を果たすことが知られている、二成分系であるｑｓｅＢｑｓｅＣオペロンが活性化されることが報告されている（６）。したがって、ＭｑｓＲ（９８アミノ酸残基）が、大腸菌における運動性及びバイオフィルム形成に必要とされるｆｌｈＤＣ発現を制御するｑｓｅＢを活性化するため、バイオフィルム形成の調節因子であることが提唱されている（６）。しかしながら、ＭｑｓＲの細胞機能は不明なままであった。
【０００４】
興味深いことに、これまでに調査された自由生活性細菌は全て、そのゲノム内に多数の自殺遺伝子又は毒素遺伝子を含有している（７、８）。これらの毒素の多くは、１つのオペロン（毒素−抗毒素オペロンすなわちＴＡオペロンと称される）内のその同種（cognate）抗毒素と共転写され、通常の成長条件下でその毒性が抑制されるように、細胞内で安定な複合体を形成する（９〜１１）。しかしながら、抗毒素の安定性はその同種毒素よりも実質的に低いため、プロテアーゼを誘導する細胞傷害又は成長阻害を引き起こす任意のストレスが毒素と抗毒素との間の平衡を変更させ、細胞における毒素放出をもたらす。
【０００５】
これまで、大腸菌ゲノムについてｒｅｌＢ−ｒｅｌＥ（１２、１３）、ｃｈｐＢＩ−ｃｈｐＢＫ（１４）、ｍａｚＥ−ｍａｚＦ（１５〜１７）、ｙｅｆＭ−ｙｏｅＢ（１８、１９）、ｄｉｎＪ−ｙａｆＱ（２０、２１）、ｈｉｐＢ−ｈｉｐＡ、ｈｉｃＡ−ｈｉｃＢ（２５、２６）、ｐｒｌＦ−ｙｈａＶ（２７）及びｙｂａＪ−ｈｈａ（２８）を含む１６個の（２４）ＴＡ系が報告されている。興味深いことに、これらのＴＡオペロンは全て、同様の調節様式を用いるようである；毒素活性を中和する抗毒素とその同種毒素との間の複合体の形成、及びその発現を自己調節するＴＡ複合体の能力。幾つかの毒素の細胞標的が同定されている：ＣｃｄＢはジャイレースＡと直接相互作用し、ＤＮＡ複製を阻止する（２９，３０）；ＲｅｌＥ（それ自体はエンドリボヌクレアーゼ活性を有しない）は、リボソームＡ部位でのｍＲＮＡ切断を促進するリボソーム結合因子として働くと考えられる（１２、３１、３２）。ＰｅｍＫ（３３）、ＣｈｐＢＫ（１４）及びＭａｚＦ（３４）は、タンパク質合成を効率的に阻害し、それにより細胞成長を効率的に阻害するために、配列特異的エンドリボヌクレアーゼとして機能することによって細胞ｍＲＮＡを分解の標的とするため、毒素の中でも独特である。
【０００６】
ＭａｚＦ、ＣｈｐＢＫ及びＰｅｍＫは、ｍＲＮＡをそれぞれＡＣＡ、ＡＣＹ（ＹはＵ、Ａ又はＧである）及びＵＡＨ（ＨはＣ、Ａ又はＵである）配列で切断する配列特異的エンドリボヌクレアーゼとして特徴付けられている。これらの毒素は細胞ｍＲＮＡの機能を妨げることによってタンパク質合成阻害物質として機能するため、リボヌクレアーゼＥ、Ａ及びＴ１といった他の既知のエンドリボヌクレアーゼとは完全に異なる。ｍｉｃＲＮＡ（ｍＲＮＡ干渉相補的ＲＮＡ）（３７）、ｍｉＲＮＡ（３８）及びｓｉＲＮＡ（３９）等の低分子ＲＮＡが、特定のＲＮＡの機能を妨げることが知られている。これらの低分子ＲＮＡは特定のｍＲＮＡと結合してその発現を阻害する。リボザイムもその標的ＲＮＡに特異的に作用して、その機能を妨げる（４０）。したがって、ＭａｚＦ、ＣｈｐＢＫ及びＰｅｍＫホモログは、ｍＲＮＡを特異的な配列で切断することにより新たなｍＲＮＡ干渉機構を示す新規のエンドリボヌクレアーゼファミリーを形成する。このため、これらは「ｍＲＮＡインターフェラーゼ」と称されている（２）。
【０００７】
本明細書中に記載される全ての参照文献は、その全体が全ての目的のために参照により本明細書中に援用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
大腸菌ゲノムについて、ＭｑｓＲ遺伝子が下流遺伝子のＹｇｉＴと共転写されることが発見されている。これら２つの遺伝子は、サイズが小さく（ＭｑｓＲについては９８残基、ＹｇｉＴについては１３１残基）、それぞれのオープンリーディングフレームが一塩基対で隔てられていることからＴＡ系として機能すると考えられる。本明細書中に開示されるように、ＭｑｓＲ／ＹｇｉＴは毒素のＭｑｓＲと抗毒素のＹｇｉＴとからなる新たな大腸菌ＴＡ系である。さらに、本明細書中に開示されるように、ＭｑｓＲはＭａｚＦに対して相同性を示さない新規のｍＲＮＡインターフェラーゼである。この毒素は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡをＧＣＵ配列で切断し、したがって本明細書中に開示されるように細胞生理及びバイオフィルム形成に影響を与える。
【０００９】
本明細書中に開示されるように、ＭｑｓＲ誘導は極めて有害であり、その毒性はＹｇｉＴの同時発現によって阻止され、ＭｑｓＲが誘導されると細胞ｍＲＮＡは分解される。このｉｎ ｖｉｖｏ結果を、精製ＭｑｓＲを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで立証した。大腸菌の全ＲＮＡをＭｑｓＲと共に３７℃で３０分間インキュベートすると、明らかに精製ＭｑｓＲがＲＮＡを切断することが示される。重要なことには、このエンドリボヌクレアーゼ活性は、その推定の抗毒素であるＹｇｉＴを反応混合物中に添加した場合に完全に阻害された。３．５ｋｂのファージＭＳ２のＲＮＡを使用することによって、本発明者らはこの毒素による主要切断部位を同定した。これにより、この毒素はトリプレット配列ＧＣＵを認識する極めて配列特異的なｍＲＮＡインターフェラーゼであると考えられる。
【００１０】
この配列は一部の遺伝子において過小発現（underrepresented）又は過剰発現される（overrepresented）場合があり、それらの遺伝子はクオラムセンシング及び／又はバイオフィルム形成と関連し得る。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明は、大腸菌における新たなＴＡ系であるＭｑｓＲ ＹｇｉＴに関する。大腸菌におけるＭｑｓＲの誘導は極めて有害であり、ｉｎ ｖｉｖｏでｍＲＮＡの分解を引き起こした。精製ＭｑｓＲはエンドリボヌクレアーゼ活性を示し、ＹｇｉＴはｉｎ ｖｉｔｒｏでその活性を中和した。ＭｑｓＲはＭＳ２ファージＲＮＡをＧＣＵで切断する。
【００１２】
本発明は、大腸菌及び哺乳動物細胞等の原核細胞及び真核細胞における単一タンパク質産生に使用することができる。本発明は癌、細菌感染及びＡＩＤＳを含むウイルス感染といった様々なヒト疾患を治療するための、ＭｑｓＲ／ＹｇｉＴ系を用いることによる遺伝子療法にも適用される。本発明はＲＮＡ構造研究のためのＲＮＡ制限酵素として使用することができる。
【００１３】
或る特定の実施の形態では、本発明は細胞機能を阻害する方法であって、ｍＲＮＡをＧＣｘ（ここでｘはＡ、Ｃ、Ｇ又はＵである）で切断するｍＲＮＡインターフェラーゼの発現を誘導することを含む、方法に関する。前記ｍＲＮＡインターフェラーゼはリボソーム非依存性であってもよく、好ましくはＭｑｓＲ又はそのホモログである。代替的な実施の形態では、前記誘導を抗毒素、例えばＹｇｉＴによって阻害することが可能である。前記細胞は例えば大腸菌又はヒトであり得る。
【００１４】
本明細書中に開示される実施の形態では、前記ｍＲＮＡインターフェラーゼの阻害はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれかであり得る。
【００１５】
或る特定の実施の形態では、本発明は細胞機能を阻害する方法であって、ＭｑｓＲ又はそのホモログの発現を誘導することを含む、方法に関する。
【００１６】
或る特定の実施の形態では、本発明はＭｑｓＲ又はそのホモログをコードする遺伝子を含むプラスミドに関する。前記ＭｑｓＲの発現は、例えばＩＰＴＧを用いて誘導することができ、該プラスミドは、例えばｐＥＴ２８ａプラスミドであり得る。代替的な実施の形態では、前記遺伝子は配列番号１による配列を有する。
【００１７】
或る特定の実施の形態では、本発明はＹｇｉＴ又はそのホモログをコードする遺伝子を含むプラスミドに関する。前記ＹｇｉＴの発現は、例えばアラビノースを用いて誘導することができ、該プラスミドは、例えばｐＢＡＤ２４プラスミドであり得る。代替的な実施の形態では、前記遺伝子は配列番号３による配列を有する。
【００１８】
或る特定の実施の形態では、本発明は、プラスミドであって、
ａ）ＭｑｓＲ又はそのホモログをコードする遺伝子、及び
ｂ）ＹｇｉＴ又はそのホモログをコードする遺伝子を含む、プラスミドに関する。代替的な実施の形態では、前記ＭｑｓＲをコードする遺伝子は配列番号１による配列を有し、前記ＹｇｉＴをコードする遺伝子は配列番号３による配列を有する。
【００１９】
或る特定の実施の形態では、本発明は、本明細書中に開示される１つ又は複数のプラスミドによって形質転換される細胞（例えば大腸菌又はヒト）に関する。
【００２０】
或る特定の実施の形態では、本発明は、ＭｑｓＲエンドリボヌクレアーゼ活性を阻害する方法であって、ＭｑｓＲをＹｇｉＴと接触させることを含む、方法に関する。代替的な実施の形態では、該方法はＭｑｓＲをＹｇｉＴと共にプレインキュベートすることを含む。
【００２１】
或る特定の実施の形態では、本発明は、ＭｑｓＲに対する抗毒素としてのＹｇｉＴの使用に関する。
【００２２】
或る特定の実施の形態では、本発明は、大腸菌の細胞溶解を阻害する方法であって、ＭｑｓＲを不活性化することを含む、方法に関する。代替的な実施の形態では、前記ＭｑｓＲをＹｇｉＴによって不活性化する。
【００２３】
或る特定の実施の形態では、本発明は、配列番号４によるアミノ酸配列を有する単離ＹｇｉＴポリペプチドに関する。代替的な実施の形態では、該ポリペプチドは、このアミノ酸配列と９０％相同であるアミノ酸配列を有し、抗毒素活性を有する。
【００２４】
或る特定の実施の形態では、本発明は、配列番号３によるＤＮＡ配列を有する単離ＹｇｉＴポリヌクレオチドに関する。代替的な実施の形態では、該ポリヌクレオチドは、このＤＮＡ配列と９０％相同であるＤＮＡ配列を有し、抗毒素活性を有するポリペプチドをコードする。
【００２５】
或る特定の実施の形態では、本発明は、ＭｑｓＲ及びＹｇｉＴ、又はそれらのホモログを含む複合体に関する。代替的な実施の形態では、該複合体は、配列番号２によるポリペプチド及び配列番号４によるポリペプチドを含む。
【００２６】
或る特定の実施の形態では、本発明は、エンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、
ａ）細胞を、該細胞にＭｑｓＲをコードするポリヌクレオチドを導入することによって形質転換すること、及び
ｂ）形質転換した前記細胞を培養することを含む、方法に関する。
【００２７】
或る特定の実施の形態では、本発明は、抗毒素活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、
ａ）細胞を、該細胞にＹｇｉＴをコードするポリヌクレオチドを導入することによって形質転換すること、及び
ｂ）形質転換した前記細胞を培養することを含む、方法に関する。
【００２８】
或る特定の実施の形態では、本発明はｍＲＮＡを切断する方法であって、ｍＲＮＡインターフェラーゼをｍＲＮＡと接触させることを含み、該ｍＲＮＡインターフェラーゼがＭａｚＦと相同でない、方法に関する。代替的な実施の形態では、前記ｍＲＮＡをＧＣｘ（ここでｘはＡ、Ｃ、Ｇ又はＵである）で切断する。
【００２９】
或る特定の実施の形態では、本発明は、細胞機能を変化させる方法であって、ＭｑｓＲ及びＹｇｉＴの一方又は両方の発現を操作することを含む、方法に関する。
【００３０】
或る特定の実施の形態では、本発明は、疾患を有する患者を治療する方法であって、該患者にｍＲＮＡをＧＣｘ（ここでｘはＡ、Ｃ、Ｇ又はＵである）で切断するｍＲＮＡインターフェラーゼを投与することを含む、方法に関する。前記疾患は例えば癌、細菌感染又はウイルス感染であり得る。前記ウイルス感染は、例えばＨＩＶ又はレトロウイルスによって引き起こされ得る。
【００３１】
或る特定の実施の形態では、本発明は、疾患を有する患者を治療する方法であって、該患者にｍＲＮＡをＧＣｘ（ここでｘはＡ、Ｃ、Ｇ又はＵである）で切断するｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする遺伝子を投与することを含む、方法に関する。前記疾患は例えば癌、細菌感染又はウイルス感染であり得る。前記ウイルス感染は、一本鎖ＲＮＡゲノムを有するウイルス、例えばＨＩＶ又はレトロウイルスによって引き起こされる感染であり得る。
【００３２】
或る特定の実施の形態では、本発明は、配列番号５〜配列番号３６のいずれかによるプライマーに関する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】大腸菌染色体上のＭｑｓＲ−ＹｇｉＴオペロンの遺伝子地図を示す図である。Ａ：矢印はそれぞれの遺伝子：ｑｓｅＣ、ｑｓｅＢ、ｙｇｉＷ、ｙｇｉＶ、ｍｑｓＲ、ｙｇｉＴ、ｙｇｉＳ及びｐａｒＣの方向及びサイズを示す。ＭｑｓＲＹｇｉＴプロモーター配列も同様に示し、パリンドローム配列（１及び２）は枠で囲んでいる。曲がった矢印はＭｑｓＲ−ＹｇｉＴオペロンの転写開始部位を表す。ＭｑｓＲＹｇｉＴプロモーターの−１０領域及び−３５領域は太字で示し、シャイン・ダルガノ配列ＧＧＡＧＧは枠で囲んでいる。下線を引いたＤＮＡ配列を図５に示すようなＥＭＳＡアッセイに使用した。Ｂ：ＭｑｓＲＹｇｉＴオペロンのＲＴ−ＰＣＲ解析。３７℃でＯ．Ｄ．６００＝０．８まで増殖させた大腸菌ＢＬ２１株からの全ＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡを逆転写酵素を用いて合成した。ｃＤＮＡ産物を鋳型として使用して、ＰＣＲをＲＴ−Ｆｗプライマー及びＲＴ−Ｒｖプライマーを用いて行った。レーン１、１００ｂｐのＤＮＡラダー（Genscript）；レーン２及びレーン４、それぞれｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲに使用した；レーン３、逆転写酵素を用いないＰＣＲ産物。Ｃ：ＭｑｓＲＹｇｉＴの転写開始部位。プライマー伸長解析を、図１Ｂの説明に記載されるものと同じＲＮＡ及びＰＸ−ＲＴプライマーを用いて行った。Ｇ、Ａ、Ｔ及びＣ（レーン１〜レーン４）は、ｐＣＲ（登録商標）２．１−Ｔｏｐｏ（登録商標）−ＭｑｓＲＹｇｉＴ及び同じプライマーを用いた配列ラダーを含む。転写開始部位は＋１という文字で示す。
【図２】タンパク質及びＤＮＡの合成並びにｍＲＮＡ安定性に対するＭｑｓＲ誘導の影響を示す図である。Ａ：ｐＥＴ−ＭｑｓＲ及びｐＢＡＤ−ＹｇｊＴによって形質転換した大腸菌ＢＬ２１を、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ、０．２％アラビノース、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ＋０．２％アラビノースを含むか、又はどちらの誘導因子も含まないＭ９（グリセロール、ＣＡＡ）プレート上に線条接種した（streaked）。プレートを３７℃で１８時間インキュベートした。Ｂ：ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを有する大腸菌ＢＬ２１細胞の成長曲線。細胞をＭ９−グリセロール液体培地中、０．２％アラビノースの存在下（黒丸）又は非存在下（白丸）で３７℃で培養した。Ｃ：ｉｎ ｖｉｖｏでの［３５Ｓ］メチオニン取り込みに対するＭｑｓＲの影響。指定の種々の時間間隔で、０．４ｍｌの培養物を３０μＣｉの［３５Ｓ］メチオニンを含有する試験管に取り出し、混合物を３７℃で３０秒間インキュベートした。インキュベーション後、５０μｌの反応混合物を円形濾紙（Whatman ３ｍｍ、２．３ｃｍ径）にアプライした。円形濾紙を、以前に記載されているように（３４）、１０％トリクロロ酢酸溶液中で処理した。濾紙上の放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。Ｄ：Ｃからの産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。指定の時点で、４００μｌの反応混合物を、１００μｇ／ｍｌの非放射性メチオニンを含有する冷却した試験管中に入れ、細胞を遠心分離によって回収した。このペレットを４０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー中に溶解させた。この試料を沸騰水浴内で１０分間インキュベートした。不溶性物質を遠心分離によって除去した後、上清画分（１２．５μｌ）を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにアプライした。Ｅ：ｉｎ ｖｉｖｏでの［３Ｈ］チミジン取り込みに対するＭｑｓＲの影響。ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを有する大腸菌ＢＬ２１細胞を３７℃で増殖させた。培養物のＯ．Ｄ．６００値が０．３に達した時点で、ＭｑｓＲをアラビノース（０．２％）を用いて誘導した。指定の種々の時間間隔で、０．４ｍｌの培養物を試験管に取り出し、１０μＣｉの［３Ｈ］チミジン＋３０μｇの非放射性チミジンと共にインキュベートした。次いで、混合物を３７℃で３０秒間インキュベートした。インキュベーション後、細胞に取り込まれた放射能を、以前に記載されているように（３４）測定した。Ｆ：細胞ｍＲＮＡ安定性に対するＭｑｓＲの影響。アラビノース（０．２％）の添加後、指定の様々な時点で、ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを有する大腸菌ＢＬ２１細胞から全ＲＮＡを抽出し、標識したｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ及びｌｐｐをそれぞれプローブとして用いたノーザンブロット解析に供した。ＲＮＡをメンブレンに転写する前に、２３Ｓ ｒＲＮＡ及び１６Ｓ ｒＲＮＡを検出するためにゲルをエチジウムブロマイドで染色した。
【図３】ｉｎ ｖｉｖｏでのｏｍｐＦ ｍＲＮＡ中のＭｑｓＲ切断部位のプライマー伸長解析を示す図である。ＭｑｓＲの誘導前及び誘導後の指定の時点で、全ＲＮＡをｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを有する大腸菌ＢＬ２１細胞から調製した。配列ラダーはｐＣＲ（登録商標）２．１−Ｔｏｐｏ（登録商標）−ｏｍｐＦを鋳型として用いて得た（３４）。切断部位周辺の配列を下部に示し、切断部位を矢印で示す。
【図４】ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭｑｓＲのｍＲＮＡインターフェラーゼ活性を示す図である。Ａ：無細胞系におけるタンパク質合成に対するＨ−ＭｑｓＲの影響。ＭａｚＧタンパク質合成を、環状ＤＮＡ用の大腸菌Ｔ７ Ｓ３０抽出系（Promega）を使用して、ｐｅＴ１１ａ−ｍａｚＧを用いて行った。レーン１、Ｈ−ＭｑｓＲを添加しない；レーン２〜レーン６、それぞれ５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ及び８０ｎＭのＨ−ＭｑｓＲを添加した；レーン７、８０ｎＭのＨ−ＭｑｓＲ＋４０ｎＭのＹｇｉＴ−Ｈを添加した；レーン８、４０ｎＭのＹｇｉＴ−Ｈを添加した。Ｂ：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの精製Ｈ−ＭｑｓＲのｍＲＮＡインターフェラーゼ活性。ＭＳ２ファージＲＮＡ（０．８μｇ）をＨ−ＭｑｓＲと共に、１ｍＭ ＤＴＴを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中、３７℃で１０分間インキュベートした。産物を１．２％アガロースゲル上で分離した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色した。
【図５】ＭｑｓＲＹｇｉＴの５’−ＵＴＲ領域におけるパリンドローム配列へのＭｑｓＲ、ＭｑｓＲＹｇｉＴ及びＹｇｉＴの結合を示す図である。電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を、実験手順の項に記載されるような種々の濃度のタンパク質と共にインキュベートした５’末端標識パリンドローム１（レーン１〜レーン６）及び２（レーン７〜レーン１２）のＤＮＡ断片（図１Ａを参照されたい）を用いて行った。レーン１〜レーン６及びレーン７〜レーン１２はそれぞれ０ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ及び８０ｎＭのＨ−ＭｑｓＲ（Ａ）、ＹｇｉＴ−Ｈ（Ｂ）及びＨ−ＭｑｓＲＹｇｉＴ（Ｃ）を表す。
【図６】ＴＡ遺伝子座の一般的な遺伝子コンテクスト（genetic context）を示す図である。
【図７】大腸菌におけるＭｑｓＲによるバイオフィルム形成の調節のモデルを示す図である。
【図８】ｍＲＮＡ安定性並びにタンパク質及びＤＮＡの合成に対するＭｑｓＲの影響を示す図である。
【図９】無原核細胞系におけるタンパク質合成に対するＨｉｓ−ＭｑｓＲの影響を示す図である。
【図１０】精製Ｈｉｓ−ＭｑｓＲによる全ＲＮＡ及びＭＳ２ファージＲＮＡの切断を示す図である。
【図１１】ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭＳ２ ＲＮＡ中のＭｑｓＲ切断部位のプライマー伸長解析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
［実施例］
実験手順
本発明を以下の非限定的な実験手順によってさらに説明する。
【００３５】
大腸菌におけるＭｑｓＲの毒性
大腸菌ＢＬ２１細胞を、ｐＥＴ−ＭｑｓＲ及びｐＢＡＤ−ＹｇｉＴ又はｐＢＡＤ及びｐＥＴプラスミドによって形質転換した。細胞を図２Ａに示すように、誘導因子［アラビノース（０．２％）及びＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）］を含む、及び含まないグリセロール−Ｍ９−カザミノ酸寒天プレート上に広げ、これらのプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。３７℃で、０．２％アラビノースの存在下（黒丸）及び非存在（白丸）でのＭ９（グリセロール、ＣＡＡ）液体培地における、ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲプラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１の成長曲線を図２Ｂに示す。細胞成長を６００ｎｍでのＡ（吸光度）によって測定した。
【００３６】
ｍＲＮＡ安定性並びにタンパク質及びＤＮＡの合成に対するＭｑｓＲの影響
アラビノースの添加後、指定の様々な時点で、ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを含有する大腸菌ＢＬ２１細胞から全細胞ＲＮＡを抽出し、放射標識したｌｐｐ、ｏｍｐＦ及びｏｍｐＡ ＯＲＦ ＤＮＡをプローブとして用いたノーザンブロット解析に供した。ｉｎ ｖｉｖｏでの［３Ｈ］ｄＴＴＰ取り込みに対するＭｑｓＲの影響を図４Ａに示す。ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞ｍＲＮＡに対するＭｑｓＲの影響を図４Ｂに示す。ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを含有する大腸菌ＢＬ２１細胞への３５Ｓ−メチオニン取り込みを、ＭｑｓＲ誘導後の指定の様々な時点で測定した。ｉｎ ｖｉｖｏでの３５Ｓ−メチオニン取り込みに対するＭｑｓＲの影響を図４Ｃに示す。図４Ｃと同じ培養物を用いて、図８Ｄに示すように、ＭｑｓＲ誘導後のｉｎ ｖｉｖｏタンパク質合成のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示した。
【００３７】
無原核細胞系におけるタンパク質合成に対するＨｉｓ−ＭｑｓＲの影響
ＭａｚＧタンパク質合成を、大腸菌Ｔ７ Ｓ３０抽出系（Promega）においてｐＥＴ−１１ａ−ＭａｚＧを鋳型として用いて行った。結果を図９に示す。
【００３８】
精製Ｈｉｓ−ＭｑｓＲによる全ＲＮＡ及びＭＳ２ファージＲＮＡの切断
大腸菌全ＲＮＡを、精製Ｈｉｓタグ付きＭｑｓＲと共に３７℃で３０分間インキュベートした。最後のレーンには、精製ＹｇｉＴを添加した。ＲＮＡを１．２％ＴＢＥアガロースゲル中で解析し、図１０Ａに示すように、ゲルをエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色した。
【００３９】
ＭＳ２ ｓｓＲＮＡの切断及びＹｇｉＴによるその阻害
ＭＳ２ ｓｓＲＮＡ（０．８μｇ；３５６９塩基；Roche）を、Ｈｉｓ−ＭｑｓＲによって３７℃で２０分間消化した。Ｈｉｓ−ＭｑｓＲを、精製ＹｇｉＴと共に氷上で１０分間プレインキュベートした後、ＭＳ２ ＲＮＡと共に３０分間さらにインキュベートした。尿素中の変性産物を１．２％ＴＢＥ未変性（native）アガロースゲル上で分離した。ゲルをＥｔＢｒで染色した。結果を図１０Ｂ及び図１０Ｃに示す。
【００４０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭＳ２ ＲＮＡ中のＭｑｓＲ切断部位のプライマー伸長解析
Ｈｉｓ−ＭｑｓＲによるＭＳ２ ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断。レーン１、Ｈｉｓ−ＭｑｓＲを添加したＭＳ２ ＲＮＡ；レーン２、タンパク質を添加しなかった対照反応を表す。切断部位はＲＮＡ配列上の赤色の矢印で表し、左に示したＲＮＡラダーを用いて決定した。結果を図１１に示す。
【００４１】
さらに詳細な実験手順
細菌株及びプラスミド
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＣ４３を使用した。ＭｑｓＲＹｇｉＴオペロン中のＭｑｓＲ遺伝子及びＹｇｉＴ遺伝子の両方を、大腸菌ゲノムＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによって別個に増幅し、初めにｐＥＴ２８ａ（Novagen）にクローニングした。ＭｑｓＲＹｇｉＴオペロンも、大腸菌ゲノムＤＮＡを鋳型として使用するＭｑｓＲ−Ｆｗプライマー及びＹｇｉＴ−Ｒｖプライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、ｐＥＴ２８ａにクローニングして、ＭｑｓＲ−ＹｇｉＴ複合体を発現させた。続いて、ＭｑｓＲ遺伝子及びＹｇｉＴ遺伝子を、ｐＢＡＤ２４に別個にクローニングし、ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲ及びｐＢＡＤ−ＹｇｉＴをそれぞれ作製した。ＭｑｓＲＹｇｉＴのプロモーター領域を、ＲＴ−ｐｒｏＦプライマー及びＲＴ−ｐｒｏＲプライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、ｐＣＲ（登録商標）２．１−Ｔｏｐｏ（登録商標）ベクター（invitrogen）にクローニングした。
【００４２】
ｉｎ ｖｉｖｏでのＤＮＡ及びタンパク質合成のアッセイ
ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、０．５％グリセロール（グルコース無添加）及びメチオニン以外の各アミノ酸を１ｍＭ添加したＭ９培地中で増殖させた。培養物のＯ．Ｄ．６００値が０．３に達した時点で、アラビノースを０．２％の最終濃度まで添加して、ＭｑｓＲを誘導した。細胞培養物のアリコート（０．４ｍｌ）を図２に示されるような時間間隔で取り出し、それぞれ３０μＣｉの［３５Ｓ］−メチオニン又は１０μＣｉの［３Ｈ］チミジン＋８０μｇの非放射性メチオニン及び３０μｇの非放射性チミジンと混合した）。３７℃で３０秒間のインキュベーションの後、タンパク質及びＤＮＡの合成速度を以前に記載されているように（３４）求めた。全細胞タンパク質合成のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析については、４００μｌの試料を［３５Ｓ］−メチオニンを含有する反応混合物から図１Ｆに示されるような時間間隔で取り出し、１００μｇ／ｍｌの非放射性メチオニン溶液を１００μｌ含有する冷却した試験管に移した。細胞ペレットを遠心分離によって回収し、４０μｌのＬａｅｍｍｌｉバッファー中に再懸濁して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてオートラジオグラフィーに供した。
【００４３】
ＲＮＡ単離及びノーザンブロット解析
ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、０．２％グリセロールを添加した（グルコース無添加）Ｍ９培地中、３７℃で増殖させた。Ｏ．Ｄ．６００値が０．４に達した時点で、アラビノースを０．２％の最終濃度まで添加した。試料を図２に示されるような種々の間隔で採取した。全ＲＮＡを以前に記載されているように（３５）、熱フェノール法（hot-phenol method）を用いて単離した。ノーザンブロット解析を以前に記載されているように（３６）行った。
【００４４】
ｉｎ ｖｉｖｏでのプライマー伸長解析
ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡ切断部位のプライマー伸長解析については、全ＲＮＡをｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞から、図３に示されるようなＭｑｓＲ誘導後の種々の時点で抽出した。プライマー伸長を、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰと共に、１５μｇの全ＲＮＡ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ株式会社）で標識した１ｐｍｏｌのプライマー（表１）を使用して、１０単位のＡＭＶ逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）（Roche）を用いて４７℃で１時間行った。１２μｌのシークエンシングローディングバッファー（９５％ホルムアルデヒド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー及び０．０５％キシレンシアノール）を添加することによって反応を停止させ、９５℃で２分間加熱した後、氷上に載せた。産物を同じプライマーから作製したシークエンシングラダーを用いて、８Ｍ尿素を含有する６％ポリアクリルアミドゲル上で解析した。
【００４５】
タンパク質精製
Ｎ末端ヒスチジンタグ付きＭｑｓＲ（Ｈ−ＭｑｓＲ）及びＣ末端ヒスチジンタグ付きＹｇｉＴ（ＹｇｉＴ−Ｈ）を精製するために、ｐＥＴ−ＭｑｓＲＹｇｉＴ及びｐＥＴ−ＹｇｉＴを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。Ｈ−ＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体及びＹｇｉＴ−Ｈの発現を、それぞれ１ｍＭイソプロピル−ｂ−Ｄ−１−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いて３時間誘導した。Ｈ−ＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体及びＹｇｉＴ−Ｈを、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Qiagen）を用いて、製造業者のプロトコルに従って精製した。続いて、Ｈ−ＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体を６ＭグアニジンＨＣｌによって変性させた。次いで、変性Ｈ−ＭｑｓＲをＮｉ−ＮＴＡアガロースを用いて精製し、Ｈ−ＭｑｓＲのリフォールディングを、ＭａｚＦに関して以前に記載されているように（１６）段階透析によって行った。
【００４６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質合成のアッセイ
無細胞タンパク質合成を、環状ＤＮＡ用の大腸菌Ｔ７ Ｓ３０抽出系（Promega）を用いて行った。反応混合物を製造業者のプロトコルに記載のように調製した。次いで、種々の量のＨ−ＭｑｓＲ及びＹｇｉＴ−Ｈを２９μｌの最終容量で添加した。ｐＥＴ１１ａ−ｍａｚＧプラスミドＤＮＡを添加することによって反応を開始させ（１８、３７）、混合物を３７℃で１時間インキュベートした。タンパク質をアセトンで沈殿させ、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。乾燥させたゲルをオートラジオグラフィーによって解析した。
【００４７】
ＭｑｓＲのｍＲＮＡインターフェラーゼ活性
ＭＳ２ファージＲＮＡ（Roche）を、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）中、３７℃で１０分間Ｈ−ＭｑｓＲと共にインキュベートした。ＹｇｉＴの抗毒素機能を調査するために、Ｈ−ＭｑｓＲをＹｇｉＴ−Ｈと共に氷上で１０分間プレインキュベートした後、ＭＳ２ ＲＮＡと共に１０分間さらにインキュベートした。尿素中での変性の後、産物を０．５×ＴＢＥバッファー（４４．５ｍＭ Ｔｒｉｓホウ酸塩及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）中、１．２％アガロースゲル上で分離した（３８）。
【００４８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのプライマー伸長解析
ＭＳ２ ＲＮＡを、１ｍＭ ＤＴＴを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で、精製Ｈ−ＭｑｓＲを添加して又は添加せずに３７℃で１５分間インキュベートし、消化したＭＳ２ ＲＮＡ（０．８μｇ）を上記のようなプライマー伸長に使用した。
【００４９】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
相補鎖（表１）をアニーリングさせ、精製して、パリンドローム１及びパリンドローム２の二本鎖ＤＮＡをそれぞれ得た。この二本鎖ＤＮＡ断片を、Ｔ４キナーゼ（タカラバイオ株式会社）によって［ｇ−３２Ｐ］ＡＴＰで末端標識した。結合反応を５０ｍＭ ＫＣｌ、５％グリセロール、１００ｎｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）、標識ＤＮＡ断片及び精製タンパク質を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）バッファー中、４℃で３０分間行った。電気泳動を５％アクリルアミド／ビスアクリルアミド（４０：１．２）ゲルにおいて、ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中、４℃、１１０Ｖで行った。電気泳動の後、ゲルを乾燥させて、オートラジオグラフィーによって解析した（３９）。
【００５０】
逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ
大腸菌から全ＲＮＡを対数期（Ｏ．Ｄ．６００＝０．８）に上記のように抽出し、０．５μｌ（２０単位）のリボヌクレアーゼ阻害物質（Roche）の存在下で、１００単位のＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｉ（Promega）で処理した。ＲＴ反応を、全ＲＮＡ（２０μｇ）及びプライマーＹＴ−Ｒｖ（２０ｐｍｏｌ）を使用し、１０単位のＡＭＶ−ＲＴ（Roche）を用いて４７℃で１時間行った。合成したｃＤＮＡを鋳型として使用し、ＲＴ−Ｆｗプライマー及びＲＴ−Ｒｖプライマー（表１）を用いてＰＣＲを行った。
【００５１】
結果
ＭｑｓＲ遺伝子及びＹｇｉＴ遺伝子は１つのオペロン内にある
大腸菌Ｋ−１２染色体上の６８分でのＭｑｓＲＹｇｉＴオペロンの位置を図１Ａに示す。ＭｑｓＲは９８残基のタンパク質であり、そのＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）に対する開始コドンの８塩基上流に、予測シャイン・ダルガノ配列（ＧＧＡＧＧ）が存在する（図１Ａ中、枠で囲んだ）。下流のＹｇｉＴは１３１残基のタンパク質であり、ＹｇｉＴの開始コドンはＭｑｓＲの翻訳停止コドンの１塩基下流にある。ＭｑｓＲＹｇｉＴがオペロンとして転写されるか否かを決定するために、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）から抽出した全ＲＮＡを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。ｃＤＮＡを実験手順に記載されるように、ＹｇｉＴ停止コドンの３１ｂｐ上流に位置するＹＴ−Ｒｖプライマー（表１）を用いて全ＲＮＡから合成した。図１Ｂのレーン２に示すように、ＲＴ−Ｆｗ及びＲＴ−Ｒｖ（表１）をプライマーとして用いたＰＣＲによって、およそ６００ｂｐの位置にバンドが検出された。大腸菌ゲノムＤＮＡを同じプライマーを用いたＰＣＲの鋳型として使用した場合、期待される５７６ｂｐのバンドが検出された（図１Ｂ；レーン３）。このバンドは、逆転写酵素を添加せずに行った反応においては検出されなかった（図１Ｂ；レーン２）。これらの結果によって、ＭｑｓＲ遺伝子が下流遺伝子のＹｇｉＴと共転写されることが実証される。転写開始部位を同定するために、上記と同じＲＮＡを使用してＰＸ−ＲＴプライマーを用いたプライマー伸長を行った。このプライマーはＭｑｓＲ遺伝子の開始コドンの２ｂｐ下流に位置する。図１Ｃに示すように、転写開始部位は矢印で示されるＭｑｓＲ開始コドンの１０９ｂｐ上流に位置する。これにより、図１Ａに示される転写開始部位の上流領域に、典型的なＲＮＡポリメラーゼプロモーターである−１０領域及び−３５領域を同定した。ＭｑｓＲとＹｇｉＴとの間の領域には転写開始部位は検出されず（データは示さない）、ＹｇｉＴ遺伝子に対する独立した転写単位がないことが示される。また、図１Ａの枠内に示されるように、１０９塩基の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）中に２つのパリンドローム配列が存在する。
【００５２】
細胞成長に対するＭｑｓＲの影響
ＭｑｓＲ遺伝子及びＹｇｉＴ遺伝子を、ＩＰＴＧ誘導性ｐＥＴ２８ａプラスミド（Novagen）及びアラビノース誘導性ｐＢＡＤ２４プラスミド（４０）のそれぞれにクローニングした。ｐＥＴ−ＭｑｓＲ及びｐＢＡＤ−ＹｇｉＴを有する大腸菌Ｃ４３細胞は、アラビノース（０．２％）の存在下でＭ９−グリセロール−カザミノ酸寒天プレート上にコロニーを形成することができなかった（図２Ａ）。しかしながら、０．２％アラビノース存在下でのＹｇｉＴの共誘導（co-induction）によってＭｑｓＲの毒性が中和され、コロニーの形成がもたらされたため、ＭｑｓＲが毒素であり、ＹｇｉＴがＭｑｓＲに対する抗毒素であることが示される。液体培養物におけるＭｑｓＲの毒性も調査した（図２Ｂ）。ＭｑｓＲをアラビノース（０．２％）の添加によって誘導した場合、３０分後に細胞成長が完全に阻害された。
【００５３】
次に、［３５Ｓ］メチオニン取り込みによって測定されるタンパク質合成に対するＭｑｓＲ誘導の影響を調査した。ＭｑｓＲ誘導の５分以内に、タンパク質合成はほとんど完全に阻害された（図２Ｃ）。これらの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した（図２Ｄ）。図２Ｃの結果と一致して、ＭｑｓＲによって細胞タンパク質への［３５Ｓ］メチオニンの取り込みが完全に阻止された。見掛けの分子量が１２ｋＤａの２分時点に存在する強いバンド（矢印で示す）は、ＭｑｓＲ（ＭＷ １１２３２）であると考えられる。これらの結果から、ＭｑｓＲが全ての細胞タンパク質合成の一般的な阻害物質であることが示された。実際には、［３Ｈ］チミジンの取り込みは、ＭｑｓＲ誘導に有意に影響を受けず（図２Ｅ）、ＭｑｓＲはタンパク質合成を阻害するが、ＤＮＡ合成を阻害しないことが示される。ｐＢＡＤ−ＭｑｓＲを保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の細胞ｍＲＮＡ（ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ及びｌｐｐ）を、アラビノースによるＭｑｓＲ誘導後の種々の時点でノーザンブロット解析によって解析すると、完全長ｍＲＮＡはいかなる場合においても０時点でしか観察されなかった（図２Ｆ）。２分の時点では、フルサイズのｍＲＮＡは或る特定の長さだけ短縮され、試験した全てのｍＲＮＡが５’末端又は３’末端の近くに位置する優先的な初期切断部位を有することが示される。これらのバンドの強度は５分後には有意に減少した。これらのデータから、ＭｑｓＲがエンドリボヌクレアーゼ活性を有し、ｍＲＮＡの切断によってタンパク質合成を阻害することが示唆される。１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡが、それらのバンド強度において有意な変化が観察されず、ＭｑｓＲ誘導の１０分後でもｉｎ ｖｉｖｏで非常に安定であったことに留意することが重要である（図２Ｆ）。これは、ＭａｚＦ ｍＲＮＡインターフェラーゼを用いて見られる結果（３４）と同様であった。ｒＲＮＡはリボソームタンパク質によるＭｑｓＲ切断から保護されるようである。
【００５４】
ＭｑｓＲによるｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ及びｌｐｐ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ切断
次に、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ及びｌｐｐ ｍＲＮＡのＭｑｓＲ媒介切断をプライマー伸長実験によって調査した。種々のプライマーを用いたｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ及びｌｐｐのプライマー伸長解析によって、ＭｑｓＲ誘導の２分後に現れた、各々のｍＲＮＡにおける特異的な切断部位に相当する明らかなバンドが同定された（表２及び図３Ａ〜図３Ｄ）。これらのバンドは０分では検出されなかった。全ての切断配列のアラインメントによると、切断はＧＣＵ配列のＧ残基の前後で起こり、ｉｎ ｖｉｖｏでＭｑｓＲがｍＲＮＡを特異的な配列ＧＣＵで切断することが示された。ｏｍｐＦ ｍＲＮＡ中のＧＣＵ配列は全て、ＭｑｓＲ誘導後に例外なく切断された（表２）。
【００５５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭｑｓＲのｍＲＮＡインターフェラーゼ活性
精製ＭｑｓＲを得るために、最初にＮ末端ヒスチジンタグ付きＭｑｓＲ（Ｈ−ＭｑｓＲ）を、ｐＥＴ−ＭｑｓＲＹｒｇｉＴを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞からＨ−ＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体として発現させ、複合体をＮｉ−ＮＴＡアガロースを用いて精製した。次いで、精製Ｈ−ＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体を６ＭグアニジンＨＣｌを用いて変性させた。変性Ｈ−ＭｑｓＲをＮｉ−ＮＴＡアガロース上に再捕捉し、溶出させて、段階透析によってリフォールディングさせた（１６）。Ｃ末端ヒスチジンタグ付きＹｇｉＴ（ＹｇｉＴ−Ｈ）を大腸菌中で発現させ、実験手順に記載されるように精製した。ゲル濾過によって、精製したＨ−ＭｑｓＲ、ＹｇｉＴ−Ｈ及びＨ−ＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体の分子量が、それぞれ２６ｋＤａ、３２ｋＤａ及び９０ｋＤａであると求められた（データは示さない）。この結果から、ＭｑｓＲ及びＹｇｉＴの両方が二量体として存在し、ＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体がおそらく２つのＭｑｓＲ二量体及び１つのＹｇｉＴ二量体からなり、ＭａｚＥＭａｚＦ複合体の場合もこれと同様であることが示唆される（１６）。
【００５６】
次に、無細胞タンパク質合成に対するＨ−ＭｑｓＲ及びＨ−ＭｑｓＲＹｇｉＴの影響を、大腸菌Ｔ７ Ｓ３０抽出系（Promega）を用いて調査した。ＭａｚＧタンパク質の合成は、４０ｎＭ以上の濃度のＭｑｓＲによってほとんど完全に阻害された（図４Ａ；レーン５及びレーン６）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質合成の阻害は、ＭａｚＦ（３４）及びＹｏｅＢ（１８）の場合に観察された。ＹｇｉＴ−Ｈ及びＨ−ＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体はタンパク質合成を阻害しなかった（図４Ａ；レーン７及びレーン８）。
【００５７】
上で観察されたｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ及びｌｐｐ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ切断がＭｑｓＲのｍＲＮＡインターフェラーゼ活性によるものであることをさらに証明するために、ＭＳ２ファージＲＮＡ（３５６９塩基）を精製ＭｑｓＲ−Ｈを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで切断させた。この精製ＭｑｓＲ調製物はエンドリボヌクレアーゼ活性を明らかに示していた（図４Ｂ、レーン２及びレーン３）。精製ＹｇｉＴ−ＨをＨ−ＭｑｓＲと共にプレインキュベートした場合に、エンドリボヌクレアーゼ活性は完全に阻害された（図４Ｂ、レーン４）。精製ＹｇｉＴ−Ｈ自体はｍＲＮＡに対する検出可能な影響を有しなかった（図４Ｂ、レーン５）。この結果から、ＹｇｉＴが抗毒素として機能し、ＭｑｓＲ ｍＲＮＡインターフェラーゼ活性を阻止することが確認される。ＹｇｉＴがＭｑｓＲに対する特異的な阻害物質であることを確認するために、ＹｇｉＴがｍＲＮＡをＡＣＡ配列で切断するＭａｚＦを阻害するか否かを調査した。ＭａｚＦはＭＳ２ ＲＮＡを切断したが（図４Ｂ、レーン６）、その活性は精製ＭａｚＥ（ＭａｚＦの解毒剤（antidote）である）と共にプレインキュベートした場合に完全に阻害された（図４Ｂ、レーン７）。しかしながら、ＭａｚＦを精製ＹｇｉＴ−Ｈと共にインキュベートしても、その活性は阻害されなかった（図４Ｂ、レーン８）。この結果から、ＹｇｉＴがＭｑｓＲエンドリボヌクレアーゼ活性を特異的に阻害することが示された。
【００５８】
リボソームの非存在下でＲＮＡを切断するＭｑｓＲの能力は、ｍＲＮＡインターフェラーゼ活性がリボソームに依存するＲｅｌＥ又はＹｏｅＢとは明らかに異なる（１２、１８、４１）。ＭｑｓＲ活性は、ＭａｚＦに関して以前に記載されているように（３４）、ＭｇＣｌ２によって阻害された（データは示さない）。
【００５９】
精製ＭｑｓＲによるＭＳ２ ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断部位
ＭＳ２ ＲＮＡに対するｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭｑｓＲ活性もプライマー伸長によって解析した。ＭＳ２ ＲＮＡをＭｑｓＲと共に３７℃で１０分間インキュベートした。産物をプライマー伸長の鋳型として使用した。ＭｑｓＲはＭＳ２ ＲＮＡを５つの切断部位で切断し、切断部位の全ての配列がＧＣＵであることが決定された（表２）。総合すると、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでのプライマー伸長実験の結果（図３及び表２）から、ＭｑｓＲがＲＮＡをＧＣＵ配列で特異的に切断するｍＲＮＡインターフェラーゼであることが示される。
【００６０】
ＭｑｓＲＹｇｉＴプロモーター領域へのＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体の結合
ｃｃｄＡＢ（４２、４３）、ｐａｒＤＥ（４４）、ｍａｚＥＦ（４５）及びｒｅｌＢＥ（４６）を含む他の多くのＴＡ系のプロモーター領域にはパリンドローム配列が存在する。これらの抗毒素又は毒素−抗毒素複合体は、その同種パリンドローム配列に結合して、自身のオペロンを負に調節する。ＭｑｓＲＹｇｉＴオペロンの５’−ＵＴＲ領域中には２つのパリンドローム配列が存在するため（図１Ａ）、次にＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体がそれらに結合することが可能か否かを調査した。パリンドローム１及びパリンドローム２のＤＮＡ断片を実験手順に記載されるように調製し、Ｔ４キナーゼによって［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで標識した。ＹｇｉＴ及びＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体を標識ＤＮＡと混合し、パリンドローム配列と結合するそれらの能力を試験した。ＹｇｉＴはパリンドローム１断片及びパリンドローム２断片の移動度を、それぞれ１０ｎＭ及び２０ｎＭ以上の濃度でシフトさせることが可能であった（図５Ａ；レーン３〜レーン６及びレーン１０〜レーン１２）。５ｎＭでは、パリンドローム１断片又はパリンドローム２断片のいずれによってもシフトバンドは観察されなかった。注目すべきことに、Ｈ−ＭｑｓＲタンパク質単独では、８０ｎＭの濃度であっても、いずれのパリンドローム配列にも結合することができなかった（図５Ａ）。しかしながら、ＭｑｓＲをＹｇｉＴに添加することによって、両方のパリンドローム配列へのＹｇｉＴの結合が増強された。ＭｑｓＲはＹｇｉＴに２対１のモル比で添加した。複合体は両方のパリンドローム配列に、ＹｇｉＴ単独と比較してより強く結合する（図５Ｃ；それぞれレーン２〜レーン６及びレーン９〜レーン１２）。これらの条件下では、パリンドローム配列を表すバンドの位置は、パリンドローム１断片及びパリンドローム２断片に対してそれぞれ５ｎＭ及び１０ｎＭのＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体でシフトした。この結果から、ＹｇｉＴ及びＭｑｓＲＹｇｉＴ複合体の両方がパリンドローム配列に結合して、他のＴＡ系と同様にＭｑｓＲＹｇｉＴオペロンを負に調節することが示唆される。
【００６１】
考察
本明細書中に開示されるように、本発明者らは、大腸菌染色体上のＭｑｓＲ遺伝子及びＹｇｉＴ遺伝子が共転写され、ＭｑｓＲ−ＹｇｉＴが新たな毒素−抗毒素系であることを実証した。他のＴＡ系の多くとは対照的に、オペロン中の第１の遺伝子が毒素のＭｑｓＲをコードし、第２の遺伝子が抗毒素のＹｇｉＴをコードする。ＭｑｓＲは、ｍＲＮＡ中のＡＣＡ配列で特異的に切断する（２９）、よく特徴付けられたｍＲＮＡインターフェラーゼであるＭａｚＦとは相同性を有しないが、ＭｑｓＲはｍＲＮＡをＧＣＵ配列で切断するｍＲＮＡインターフェラーゼであることが見出された。注目すべきことに、ＭｑｓＲはＭａｚＦと同様、ＲｅｌＥ（１２、４６）、ＹｏｅＢ（１８）及びＨｉｇＢ（４７）といったリボソーム依存性ｍＲＮＡインターフェラーゼとは明らかに異なるリボソーム非依存性のｍＲＮＡインターフェラーゼである。
【００６２】
ＭｑｓＲがバイオフィルム形成の際に（１）、またクオラムセンシングオートインデューサー−２（ＡＩ−２）によって（２）誘導されることが報告されている。ＭｑｓＲの活性化は次に、バイオフィルム形成において重要な役割を果たすことが知られる二成分系ｑｓｅＢＣを活性化する（２）。ＱｓｅＣはセンサーヒスチジンキナーゼであり、ＱｓｅＢはｑｓｅＢＣオペロンの５’−ＵＴＲ領域に結合して、このオペロンの転写を活性化する転写調節因子である（４８、４９）。ＭｑｓＲ−ＹｇｉＴ複合体は、ＭｑｓＲＹｇｉＴオペロンの５’−ＵＴＲ中に存在する２つのパリンドローム配列に結合することが可能であり、ＭｑｓＲＹｇｉＴの転写を抑制すると考えられる。本発明者らは、ＭｑｓＲ−ＹｇｉＴ複合体がｑｓｅＢＣオペロンの発現も調節することの可能性を調査した。しかしながら、Ｈ−ＭｑｓＲ−ＹｇｉＴ複合体は、ＱｓｅＢ結合部位を含むｑｓｅＢＣプロモーター領域に結合可能ではなかった（データは示さない）。パリンドローム配列（パリンドローム１及びパリンドローム２；図１Ａ）の両方が、この２つのパリンドローム配列をどちらも有する他の大腸菌遺伝子はＭｑｓＲＹｇｉＴオペロン以外にないため、大腸菌染色体で独特である。また、精製ＱｓｅＢはＭｑｓＲＹｇｉＴオペロンの５’−ＵＴＲ領域に結合しなかった（データは示さない）。これらの結果から、ＭｑｓＲがｑｓｅＢＣオペロンの活性化とは直接には関与しないことが示される。
【００６３】
本発明者らは、ＧＣＵ配列の存在について大腸菌ゲノム（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ；アクセッション番号ＮＣ００００９１）上の４２２６個のＯＲＦの全てを解析し、単一のＧＣＵ配列を含有しないＯＲＦが１４個しかないことを見出した（表３）。これらの１４個の遺伝子のうち、６個の遺伝子（ｐｈｅＬ、ｔｎａＣ、ｔｒｐＬ、ｙｃｉＧ、ｙｇａＱ及びｒａｌＲ）が、大腸菌におけるバイオフィルム形成の際に誘導されることが示されている（５０）。特に興味深いのはバイオフィルムにおいて３２倍に誘導されるＹｇａＱ（３３０ｂｐ）であり、大腸菌のスウォーミング運動（swarming mobility）に関与することも示されている（５１）。これらの遺伝子はＭｑｓＲ ｍＲＮＡインターフェラーゼ活性に対して抵抗性であるため、バイオフィルム形成の際のＭｑｓＲ誘導は、これら１４個の遺伝子以外の全ての大腸菌ｍＲＮＡを不活性化する場合があり、このことがバイオフィルム形成において重要な役割を果たし得る。ほとんど全ての細胞が緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）におけるバイオフィルム形成の際に死滅する（５２）。バイオフィルム形成の際のＭｑｓＲ誘導は、ＭａｚＦによる場合と同様に（８、５３）、細胞を準休眠状態（quasi-dormant state）に入らせ、最終的に細胞死をもたらし得る。
【００６４】
本明細書（present paper）における大腸菌中の新たなＴＡ系としてのＭｑｓＲ−ＹｇｉＴ系の発見によって、ＭａｚＦ−ＭａｚＥ（１６、３４）、ＲｅｌＥ−ＲｅｌＢ（１２、１３）、ＣｈｐＢＫ−ＣｈｐＢＩ（１４）、ＹａｆＱ−ＤｉｎＪ（２１）、ＹｏｅＢ−ＹｅｆＭ（１８、１９）、ＨｉｐＡ−ＨｉｐＢ（２２、２３）、ＨｉｃＡ−ＨｉｃＢ（２５、２６）、ＹｈａＶ−ＰｒｌＦ（２７）及びＹａｆＯ−ＹａｆＮ（２４）を含む大腸菌ＴＡ系の総数が１６個にまで増加する。
【００６５】
【表１】
【００６６】
【表２】
【００６７】
【表３】
【００６８】
本発明は、本発明の幾つかの態様を説明することを意図する実施例に開示される具体的な実施形態による範囲に限定されず、機能的に等価ないかなる実施形態も本発明の範囲内にある。実際に、本明細書中に示し、説明したもの以外の本発明の様々な変更形態が当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞機能を阻害する方法であって、ｍＲＮＡをＧＣｘ（ここでｘはＡ、Ｃ、Ｇ又はＵである）で切断するｍＲＮＡインターフェラーゼの発現を誘導することを含む、方法。
【請求項２】
前記ｍＲＮＡインターフェラーゼがｍＲＮＡをＧＣＵで切断する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｍＲＮＡインターフェラーゼがＭｑｓＲ又はそのホモログである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｍＲＮＡインターフェラーゼがリボソーム非依存性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記誘導をＹｇｉＴによって阻害することが可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｍＲＮＡインターフェラーゼをｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｍＲＮＡインターフェラーゼをｉｎ ｖｉｖｏで阻害することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が大腸菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
細胞機能を阻害する方法であって、ＭｑｓＲ又はそのホモログの発現を誘導することを含む、方法。
【請求項１１】
ＭｑｓＲ又はそのホモログをコードする遺伝子を含むプラスミド。
【請求項１２】
前記ＭｑｓＲの発現をＩＰＴＧを用いて誘導することができる、請求項１１に記載のプラスミド。
【請求項１３】
前記プラスミドがｐＥＴ２８ａプラスミドである、請求項１１に記載のプラスミド。
【請求項１４】
前記遺伝子が配列番号１による配列を有する、請求項１１に記載のプラスミド。
【請求項１５】
請求項１１に記載のプラスミドによって形質転換される細胞。
【請求項１６】
前記細胞が大腸菌である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
ＹｇｉＴ又はそのホモログをコードする遺伝子を含むプラスミド。
【請求項１８】
前記ＹｇｉＴの発現をアラビノースを用いて誘導することができる、請求項１７に記載のプラスミド。
【請求項１９】
前記プラスミドがｐＢＡＤ２４プラスミドである、請求項１７に記載のプラスミド。
【請求項２０】
前記遺伝子が配列番号３による配列を有する、請求項１７に記載のプラスミド。
【請求項２１】
請求項１７に記載のプラスミドによって形質転換される細胞。
【請求項２２】
前記細胞が大腸菌である、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
請求項１１に記載のプラスミド及び請求項１７に記載のプラスミドによって形質転換される細胞。
【請求項２４】
プラスミドであって、
ａ．ＭｑｓＲ又はそのホモログをコードする遺伝子、及び
ｂ．ＹｇｉＴ又はそのホモログをコードする遺伝子を含む、プラスミド。
【請求項２５】
前記ＭｑｓＲをコードする遺伝子が配列番号１による配列を有し、前記ＹｇｉＴをコードする遺伝子が配列番号３による配列を有する、請求項２４に記載のプラスミド。
【請求項２６】
請求項２４に記載のプラスミドによって形質転換される細胞。
【請求項２７】
前記細胞が大腸菌である、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
ＭｑｓＲエンドリボヌクレアーゼ活性を阻害する方法であって、ＭｑｓＲをＹｇｉＴと接触させることを含む、方法。
【請求項２９】
ＭｑｓＲをＹｇｉＴと共にプレインキュベートすることを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＭｑｓＲに対する抗毒素としてのＹｇｉＴの使用。
【請求項３１】
大腸菌の細胞溶解を阻害する方法であって、ＭｑｓＲを不活性化することを含む、方法。
【請求項３２】
前記ＭｑｓＲをＹｇｉＴによって不活性化する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
配列番号４によるアミノ酸配列を有する単離ＹｇｉＴポリペプチド。
【請求項３４】
請求項３３に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と９０％相同であるアミノ酸配列を有し、抗毒素活性を有するポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号３によるＤＮＡ配列を有する単離ＹｇｉＴポリヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項３５に記載のポリヌクレオチドのＤＮＡ配列と９０％相同であるＤＮＡ配列を有し、抗毒素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３７】
ＭｑｓＲ及びＹｇｉＴ、又はそれらのホモログを含む複合体。
【請求項３８】
配列番号２によるポリペプチド及び配列番号４によるポリペプチドを含む複合体。
【請求項３９】
エンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、
ａ．細胞を、該細胞にＭｑｓＲをコードするポリヌクレオチドを導入することによって形質転換すること、及び
ｂ．形質転換した前記細胞を培養することを含む、方法。
【請求項４０】
抗毒素活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、
ａ．細胞を、該細胞にＹｇｉＴをコードするポリヌクレオチドを導入することによって形質転換すること、及び
ｂ．形質転換した前記細胞を培養することを含む、方法。
【請求項４１】
ｍＲＮＡを切断する方法であって、ｍＲＮＡインターフェラーゼをｍＲＮＡと接触させることを含み、該ｍＲＮＡインターフェラーゼがＭａｚＦと相同でない、方法。
【請求項４２】
前記ｍＲＮＡをＧＣｘ（ここでｘはＡ、Ｃ、Ｇ又はＵである）で切断する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ｍＲＮＡをＧＣＵで切断する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
細胞機能を変化させる方法であって、ＭｑｓＲ及びＹｇｉＴの一方又は両方の発現を操作することを含む、方法。
【請求項４５】
疾患を有する患者を治療する方法であって、該患者にｍＲＮＡをＧＣｘ（ここでｘはＡ、Ｃ、Ｇ又はＵである）で切断するｍＲＮＡインターフェラーゼを投与することを含む、方法。
【請求項４６】
前記ｍＲＮＡがＧＣＵで切断される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患が癌、細菌感染又はウイルス感染である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ウイルス感染がＨＩＶによって引き起こされる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記ウイルス感染が、一本鎖ＲＮＡゲノムを有するウイルスによって引き起こされる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
疾患を有する患者を治療する方法であって、該患者にｍＲＮＡをＧＣｘ（ここでｘはＡ、Ｃ、Ｇ又はＵである）で切断するｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする遺伝子を投与することを含む、方法。
【請求項５１】
前記ｍＲＮＡがＧＣＵで切断される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記疾患が癌、細菌感染又はウイルス感染である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記ウイルス感染がＨＩＶによって引き起こされる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記ウイルス感染が、一本鎖ＲＮＡゲノムを有するウイルスによって引き起こされる、請求項５０に記載の方法。
【請求項１】
細胞機能を阻害する方法であって、ｍＲＮＡをＧＣｘ（ここでｘはＡ、Ｃ、Ｇ又はＵである）で切断するｍＲＮＡインターフェラーゼの発現を誘導することを含む、方法。
【請求項２】
前記ｍＲＮＡインターフェラーゼがｍＲＮＡをＧＣＵで切断する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｍＲＮＡインターフェラーゼがＭｑｓＲ又はそのホモログである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｍＲＮＡインターフェラーゼがリボソーム非依存性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記誘導をＹｇｉＴによって阻害することが可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｍＲＮＡインターフェラーゼをｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｍＲＮＡインターフェラーゼをｉｎ ｖｉｖｏで阻害することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が大腸菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
細胞機能を阻害する方法であって、ＭｑｓＲ又はそのホモログの発現を誘導することを含む、方法。
【請求項１１】
ＭｑｓＲ又はそのホモログをコードする遺伝子を含むプラスミド。
【請求項１２】
前記ＭｑｓＲの発現をＩＰＴＧを用いて誘導することができる、請求項１１に記載のプラスミド。
【請求項１３】
前記プラスミドがｐＥＴ２８ａプラスミドである、請求項１１に記載のプラスミド。
【請求項１４】
前記遺伝子が配列番号１による配列を有する、請求項１１に記載のプラスミド。
【請求項１５】
請求項１１に記載のプラスミドによって形質転換される細胞。
【請求項１６】
前記細胞が大腸菌である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
ＹｇｉＴ又はそのホモログをコードする遺伝子を含むプラスミド。
【請求項１８】
前記ＹｇｉＴの発現をアラビノースを用いて誘導することができる、請求項１７に記載のプラスミド。
【請求項１９】
前記プラスミドがｐＢＡＤ２４プラスミドである、請求項１７に記載のプラスミド。
【請求項２０】
前記遺伝子が配列番号３による配列を有する、請求項１７に記載のプラスミド。
【請求項２１】
請求項１７に記載のプラスミドによって形質転換される細胞。
【請求項２２】
前記細胞が大腸菌である、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
請求項１１に記載のプラスミド及び請求項１７に記載のプラスミドによって形質転換される細胞。
【請求項２４】
プラスミドであって、
ａ．ＭｑｓＲ又はそのホモログをコードする遺伝子、及び
ｂ．ＹｇｉＴ又はそのホモログをコードする遺伝子を含む、プラスミド。
【請求項２５】
前記ＭｑｓＲをコードする遺伝子が配列番号１による配列を有し、前記ＹｇｉＴをコードする遺伝子が配列番号３による配列を有する、請求項２４に記載のプラスミド。
【請求項２６】
請求項２４に記載のプラスミドによって形質転換される細胞。
【請求項２７】
前記細胞が大腸菌である、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
ＭｑｓＲエンドリボヌクレアーゼ活性を阻害する方法であって、ＭｑｓＲをＹｇｉＴと接触させることを含む、方法。
【請求項２９】
ＭｑｓＲをＹｇｉＴと共にプレインキュベートすることを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＭｑｓＲに対する抗毒素としてのＹｇｉＴの使用。
【請求項３１】
大腸菌の細胞溶解を阻害する方法であって、ＭｑｓＲを不活性化することを含む、方法。
【請求項３２】
前記ＭｑｓＲをＹｇｉＴによって不活性化する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
配列番号４によるアミノ酸配列を有する単離ＹｇｉＴポリペプチド。
【請求項３４】
請求項３３に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と９０％相同であるアミノ酸配列を有し、抗毒素活性を有するポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号３によるＤＮＡ配列を有する単離ＹｇｉＴポリヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項３５に記載のポリヌクレオチドのＤＮＡ配列と９０％相同であるＤＮＡ配列を有し、抗毒素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３７】
ＭｑｓＲ及びＹｇｉＴ、又はそれらのホモログを含む複合体。
【請求項３８】
配列番号２によるポリペプチド及び配列番号４によるポリペプチドを含む複合体。
【請求項３９】
エンドリボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、
ａ．細胞を、該細胞にＭｑｓＲをコードするポリヌクレオチドを導入することによって形質転換すること、及び
ｂ．形質転換した前記細胞を培養することを含む、方法。
【請求項４０】
抗毒素活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、
ａ．細胞を、該細胞にＹｇｉＴをコードするポリヌクレオチドを導入することによって形質転換すること、及び
ｂ．形質転換した前記細胞を培養することを含む、方法。
【請求項４１】
ｍＲＮＡを切断する方法であって、ｍＲＮＡインターフェラーゼをｍＲＮＡと接触させることを含み、該ｍＲＮＡインターフェラーゼがＭａｚＦと相同でない、方法。
【請求項４２】
前記ｍＲＮＡをＧＣｘ（ここでｘはＡ、Ｃ、Ｇ又はＵである）で切断する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ｍＲＮＡをＧＣＵで切断する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
細胞機能を変化させる方法であって、ＭｑｓＲ及びＹｇｉＴの一方又は両方の発現を操作することを含む、方法。
【請求項４５】
疾患を有する患者を治療する方法であって、該患者にｍＲＮＡをＧＣｘ（ここでｘはＡ、Ｃ、Ｇ又はＵである）で切断するｍＲＮＡインターフェラーゼを投与することを含む、方法。
【請求項４６】
前記ｍＲＮＡがＧＣＵで切断される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患が癌、細菌感染又はウイルス感染である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ウイルス感染がＨＩＶによって引き起こされる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記ウイルス感染が、一本鎖ＲＮＡゲノムを有するウイルスによって引き起こされる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
疾患を有する患者を治療する方法であって、該患者にｍＲＮＡをＧＣｘ（ここでｘはＡ、Ｃ、Ｇ又はＵである）で切断するｍＲＮＡインターフェラーゼをコードする遺伝子を投与することを含む、方法。
【請求項５１】
前記ｍＲＮＡがＧＣＵで切断される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記疾患が癌、細菌感染又はウイルス感染である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記ウイルス感染がＨＩＶによって引き起こされる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記ウイルス感染が、一本鎖ＲＮＡゲノムを有するウイルスによって引き起こされる、請求項５０に記載の方法。
【図６】
【図７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１２−５０００２７（Ｐ２０１２−５０００２７Ａ）
【公表日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２３９９８（Ｐ２０１１−５２３９９８）
【出願日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５４５０３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２２２６０
【国際公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【出願人】（５１００１１２９３）ユニヴァーシティ オブ メディシン アンド デンティストリ オブ ニュージャーシィ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５４５０３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２２２６０
【国際公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【出願人】（５１００１１２９３）ユニヴァーシティ オブ メディシン アンド デンティストリ オブ ニュージャーシィ (3)
【Ｆターム（参考）】
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