新規ペプチダーゼ基質
本発明は、下記の式（Ｉ）：
［式中、
・ＸはＳ；ＮＸ１；Ｏ；またはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｒ１は無し、あるいはＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＨまたはアルキル、アリールまたはカルボキシル基の置換基の一つであり；
・Ｒ２は無し、あるいはＣｌ;Ｏ-ＣＨ２-Ｏ;Ｏ-ＣＨ３;Ｆ、ジエチレンジアミン-ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリールまたはカルボキシル基、ＮＯ２、または
の置換基の一であり；
・Ｘ１は、Ｈ、Ｃ２Ｈ４Ｐｈ、ＯＨ、アルキル基及びアリール基から選択され；
・Ｒ３及びＲ４は、独立にＨ又は１から４の炭素原子を含むアルキル基であり；
・Ｐはペプチドである］
の、ペプチダーゼ活性を検出するための酵素基質に関する。
［式中、
・ＸはＳ；ＮＸ１；Ｏ；またはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｒ１は無し、あるいはＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＨまたはアルキル、アリールまたはカルボキシル基の置換基の一つであり；
・Ｒ２は無し、あるいはＣｌ;Ｏ-ＣＨ２-Ｏ;Ｏ-ＣＨ３;Ｆ、ジエチレンジアミン-ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリールまたはカルボキシル基、ＮＯ２、または
の置換基の一であり；
・Ｘ１は、Ｈ、Ｃ２Ｈ４Ｐｈ、ＯＨ、アルキル基及びアリール基から選択され；
・Ｒ３及びＲ４は、独立にＨ又は１から４の炭素原子を含むアルキル基であり；
・Ｐはペプチドである］
の、ペプチダーゼ活性を検出するための酵素基質に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はペプチダーゼ活性を検出するための新規酵素基質に関する。これらの基質は、特に微生物学、生化学、免疫学、分子生物学、組織学等において、物理化学的シグナルを生じる酵素加水分解の工程を含む適用に使用できる。本発明は、当該基質を含む反応培地、またはペプチダーゼ活性を検出するためのおよび／またはグラム陰性菌からグラム陽性菌を識別するための基質又は培地の使用、及び使用方法に関する。
【０００２】
現在、非常に多数の培地が、微生物を検出するために存在する。特に、この検出は、検出が要求される微生物の酵素に特異的な特定の基質の使用に基づくことができる。一般に、酵素のための合成基質は、明らかにされる酵素活性に特異的な第１の部分と標識（通常は発色標識か蛍光標識）として働く第２の部分から構成される。したがって、バクテリアの場合、基質の選択のおかげで、反応があるか否かに応じて、微生物の性質を特徴づけることが可能である。ペプチダーゼ活性は、バクテリアのグループ、属または種を明らかにするために特に用いることができる。したがって、アラニンアミノペプチダーゼ活性は、例えば、グラム陰性菌とグラム陽性菌とを区別することを可能にする。
【０００３】
ペプチダーゼ活性を検出するための発色性酵素基質は、従来技術で知られている。微生物学で使用される酵素基質の総説であるManafi(Manafi et al, Microbiol Rev 55(3): 335-348, 1991)を挙げることができる。しかしながら、記載されているアミノペプチダーゼ基質は、加水分解によって、培地中に拡散する化合物を放出する（β-ナフチルアミン、7-アミノ-4-メチルクマリン）。その結果、不均一反応培地（シャーレ上のコロニー、組織学的切片など）において、加水分解の場所を正確に局在化することは可能でない。また、本出願人によって出願された特許出願WO98/04735及びWO99/38995に記載されている基質を挙げることができる。しかしながら、これらの基質は培養培地中に大量に拡散しないけれども、合成が難しく、純度が低く、収率が低く、特定の微生物に関して有毒であるという特定の欠点がある。
【０００４】
従って、本発明は、微生物を検出するための新規ペプチダーゼ基質を提案する。従来の基質と比較して、これらの新規基質は合成が容易であり、それらは反応培地中に拡散しない呈色を生じるので、特に微生物を検出するためのゲル化培地で使用できる。これは、ペプチダーゼ活性を発現しているコロニーまたはオルガネラを、それを発現しない他のものの中から、特定することを可能にする。
【０００５】
本発明の記載を続ける前に、下記の定義を、本発明の開示を容易にするために提供する。
「酵素基質」なる用語は、酵素によって加水分解され、微生物の、細胞の、またはオルガネラの、直接的または間接的な検出を可能にする生成物を提供し得る基質を意味することを目的とする。この基質は、特に、明らかにされる酵素活性に特異的な第１の部分と、標識として働く第２の部分を含む。
本発明に係る基質は、加水分解の生成物が酵素活性を発現している細胞に主に局在したままであるので、この活性を発現している細胞を特に計数することに、又はサンプルの残りからそれらを分離することさえ可能であるので、フローサイトメトリーでの使用に特に適している。
【０００６】
加水分解の生成物が加水分解の場所に主に局在したままであるため、組織中でこの活性を発現している細胞またはオルガネラを特に同定することが可能であるので、本発明に係る基質は組織酵素学での使用に非常に適している。
低い毒性のおかげで、本発明に係る基質は、細胞培養ペプチダーゼ活性を観察することに非常に適している。
【０００７】
また、本発明に係る基質は、反応培地中に拡散しない呈色または蛍光を生じるので、検出および／または同定培地での使用に非常に適している。本出願において、「呈色」なる用語は、可視スペクトルにおける光の吸収である呈色、又はある波長（λex）での吸収とより高い波長（λem、λem ＞λex）での放出である蛍光をカバーするために使用される。
本発明の基質は、塩を形成してもよく、すなわち塩化物、臭化物またはトリフルオロ酢酸塩のような塩の形態でもよい。
【０００８】
「ペプチダーゼ」なる用語は、加水分解によって、ペプチドのアシル残基と一級アミンとの間で形成されるアミド基を切断することができる酵素を意味することを目的とする。「アミノペプチダーゼ」なる用語は、加水分解によって、アミノ酸アシルと一級アミンとの間で形成されるアミド基を切断することができる酵素を意味することを目的とする。本出願において、「ペプチダーゼ」なる用語は、適切には、上に定義のペプチダーゼとアミノペプチダーゼを意味することができる。
【０００９】
「ペプチド」なる用語は、１から１０アミノ酸、好ましくは１から４アミノ酸を含むペプチド鎖を意味することを目的とする。ペプチドはジアラニンまたはトリアラニンであることが望ましい。「アミノ酸」なる用語は、当業者に知られている任意の天然または非天然アミノ酸を意味することを目的とする。本発明のある実施形態によれば、アミノ酸はβ-アラニンまたはＬ-アラニン、またはグリシン、ピログルタミル等である。
上記ペプチドは、そのＮ末端終端に遮断剤を含んでもよい。本発明に係る遮断剤は、アミンを保護することができる当業者に知られている任意の遮断剤を含む。例えば、ｔ-ブトキシカルボニル（Ｎ-ｔＢＯＣ）、9-フルオレニルオキシカルボニル、サクシニルのような可溶化剤、または非代謝性アミノ酸、すなわち、ピペコリン酸のような非天然アミノ酸またはＤ-フェニルアラニンようなＤ型のアミノ酸を挙げることができる。遮断剤は、本発明の化合物に体系的に存在しない。
【００１０】
「アルキル基」なる用語は、飽和炭化水素ベースの基の鎖、特にＣ１-Ｃ６アルキル、すなわち１から６の炭素原子を含む直鎖または分枝状アルキルを意味することを目的とする。例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、t-ブチル、ペンチル、イソペンチル及びヘキシルを挙げることができる。
【００１１】
「アリール基」なる用語は、芳香環、例えばＣ６-Ｃ１０芳香環、特にフェニル、ベンジル、1-ナフチルまたは2-ナフチルに由来する官能基（または置換基）を意味することを目的とする。
【００１２】
「カルボキシル基」なる用語は、第１の酸素原子に二重結合により、及び第２の酸素原子（それ自体が負に荷電しているか、又は水素原子に結合している）に単結合により結合された炭素原子から成る官能基を意味することを目的とする。分子のｐＫａ及び培地のｐＨに応じて、カルボキシル基はイオン化型、すなわち第２の酸素原子に結合するＨを有さないで負に帯電していてもよい。
【００１３】
「反応培地」なる用語は、代謝の発現のために及び／又は微生物、細胞、またはオルガネラの増殖のために必要な全ての要素を含む培地を意味することを目的とする。この反応培地は、フローサイトメトリ、組織酵素学、細胞培養等や、あるいは微生物検出および／または同定培地として使用できる。
反応培地は、例えばアミノ酸、ペプトン、炭水化物、ヌクレオチド、ミネラル、ビタミン、抗生物質、界面活性剤、バッファー、リン酸塩、アンモニウム塩、ソーダ塩、金属塩のような一つ以上の成分を組合せて含んでもよい。
【００１４】
また、培地は着色剤を含んでもよい。例として、着色剤として、エバンスブルー、ニュートラルレッド、ヒツジ血液、ウマ血液、酸化チタンのような乳白剤、ニトロアニリン、マラカイトグリーン、ブリリアントグリーン等を挙げることができる。
【００１５】
反応培地は、固体、半固体、又は液体でもよい。「固形培地」なる用語は、例えば、ゲル化培地を意味することを目的とする。寒天は微生物を培養するための微生物学における通常のゲル化剤であるが、ゼラチンまたはアガロースを使用することが可能である。一定数の調製物は、例えばコロンビア寒天、トリプケース−ソイ寒天、マッコンキー寒天、サブロー寒天、又はさらに一般的にいえば、微生物学培地ハンドブック（the Handbook of Microbiological Media：ＣＲＣ出版）に記載されているものは、市販されている。
【００１６】
反応培地は、「検出および／または同定培地」、すなわち発現用培地または培養且つ発現用培地であってもよい。第１の場合において、微生物は接種の前に培養され、第２の場合において、検出および／または同定培地は培養培地をも構成する。
【００１７】
「生物試料」なる用語は、生体液標本に由来する臨床試料、又は任意の種類の食品に由来する食品試料を意味することを目的とする。従って、この試料は液体又は固体でもよく、血液、血漿、尿または糞便、鼻、のど、皮膚、傷又は脳脊髄液から採取された試料に由来する臨床試料、水又例えば牛乳または果汁等の飲料由来の；ヨーグルト、肉、卵、野菜、マヨネーズまたはチーズ由来の；魚等に由来の食品試料、あるいは、特に動物の餌のような動物飼料に由来する食品試料を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、サンプルは、臨床環境からの標本、家畜標本、食品、化粧品または薬剤生産からの標本であってもよい。「環境標本」なる用語は、特に、表層から、液体から、出発原料からまたは製品から採取される標本を意味することを目的とする。
【００１８】
本発明の目的において、「微生物」なる用語はバクテリア、酵母、さらに一般的にいえば、通常は単細胞生物であって、肉眼では見えず、且つ実験室で増殖させ及び操作できる生物を含む。
グラム陰性菌について、以下の属のバクテリアを挙げることができる：シュードモナス属、エシェリヒア属、サルモネラ属、赤痢菌属、エンテロバクター属、クレブシェラ属、霊菌属、プロテウス属、カンピロバクター属、ヘモフィルス属、モルガネラ属、ビブリオ属、エルシニア属、アシネトバクター属、ブランハメラ属、ナイセリア属、バークホルデリア属、シトロバクター属、ハフニア属、エドバルシエラ属、エーロモナス属、モラクセラ属、パスツレラ属、プロビデンシア属、アクチノバチルス属、アルカリゲネス属、ボルデテラ属、セデセア属、エルウィニア属、パントエア属、ラルストニア属、ステノトロホモナス属、キサントモナス属及びレジオネラ属。
グラム陽性菌について、以下の属のバクテリアを挙げることができる：エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、バシラス属、乳酸桿菌属、リステリア属、クロストリジウム属、ガルドネレラ属、コクリア属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ミクロコッカス属、ファルカミア属（Falkamia）、ゲメラ属、ペジオコックス属、マイコバクテリア属及びコリネバクテリウム属。
酵母について、以下の属の酵母を挙げることができる：カンジダ属、クリプトコックス属、サッカロミセス属及びトリコスポロン属。
【００１９】
本発明は、下記の式（Ｉ）：
［式中、
・ＸはＳ；ＮＸ１；Ｏ；またはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｒ１は無し、あるいはＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＨまたはアルキル、アリールまたはカルボキシル基の置換基の一つであり；
・Ｒ２は無し、あるいはＣｌ;Ｏ-ＣＨ２-Ｏ;Ｏ-ＣＨ３;Ｆ、ジエチレンジアミン-ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリールまたはカルボキシル基、ＮＯ２、または
の置換基の一つであり；
・Ｘ１は、Ｈ、Ｃ２Ｈ４Ｐｈ、ＯＨ、アルキル基及びアリール基から選択され；
・Ｒ３及びＲ４は、独立にＨ又は１から４の炭素原子を有するアルキル基であり；
・Ｐはペプチドである］
の、ペプチダーゼ活性を検出するための酵素基質に関する。
ヘテロ環の１位の窒素と２位の炭素との間の結合は一重（1,2-ジヒドロ）あるいは二重でもよく、好ましくはニ重である。
【００２０】
もちろん、本発明に係る基質は、複数の置換基、すなわち環のさまざまな位置に複数のＲ１及びＲ２基を含んでもよい。Ｒ１および／またはＲ２がアルキルまたはアリール基であるとき、ＯＨ、カルボキシル、Ｂｒ、Ｃｌ、ＦまたはＩのような一以上の置換基によって置換されてもよい。Ｒ２がＯ-ＣＨ２-Ｏであるとき、Ｒ２は環員の２つが共有されているアミノフェニルに結合する環である。
第１の変形例によれば、ＸがＮＸ１-ＣＯであるとき、Ｘを含む環は６員環であって、当該６員環の３位のＯと４位のＮＸ１を含む。
第２の変形例によれば、ＸがＮＸ１-ＣＯであるとき、Ｘを含む環は６員環であって、当該６員環の３位のＮＸ１と４位のＯに二重結合を介して結合するＣを含む。
本発明のある好ましい実施形態によれば、ＸはＳである。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、ＸはＮ-Ｘ１である。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、ＸはＯである。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、ＸはＮＸ１-ＣＯである。
【００２１】
本発明のある特定の実施形態によれば、Ｒ１は５位にある。
本発明のある特定の実施形態によれば、Ｒ２は４’位にある。本発明のある特定の実施形態によれば、Ｒ２は５’位にある。本発明のある特定の実施形態によれば、Ｒ２は４’位及び５’位にある。
本発明のある特定の実施形態によれば、ＰはそのＮ末端終端に遮断剤を含む。
【００２２】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ ＸはＯであり；
・ Ｒ１とＲ２は無し;
・ Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはβ-アラニン、Ｌ-アラニン及びグリシンから選択される。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１とＲ２は無し、及びＰはβ-アラニンである。
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１とＲ２は無し、及びＰはＬ-アラニンである。
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１とＲ２は無し、及びＰはグリシンである。
【００２３】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり；
・Ｒ１はＣｌであり;
・Ｒ２は無し；
・Ｐはペプチドである。
好ましくは、Ｐはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。好ましくは、Ｒ１は５位にある。
【００２４】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１は５位でＣｌであり、Ｒ２は無し、及びＰはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり;
・Ｒ１はＣＨ３であり;
・Ｒ２は無し;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１は５位でＣＨ３であり、Ｒ２は無し、及びＰはＬ-アラニンである。
【００２５】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり;
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＣｌであり;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は５’位でＣｌであり、及びＰはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は５’位でＣｌであり、及びＰはβ-アラニンである。
【００２６】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２はＯ-ＣＨ２-Ｏであり;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニン及びβ-アラニンから選択される。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は４’位と５’位でアミノ環に結合されたＯ-ＣＨ２-Ｏであり、ＰはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は４’位と５’位でアミノ環に結合されたＯ-ＣＨ２-Ｏであり、Ｐはβ-アラニンである。
【００２７】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２はＯ-ＣＨ３であり;
・Ｐはペプチドである。
Ｐはアミノ酸、好ましくはβ-アラニンまたはＬ-アラニンであることが望ましい。好ましくは、Ｒ２は４’位と５’位である。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は４’位と５’位におけるＯ-ＣＨ３であり、Ｐはβ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は４’位と５’位におけるＯ-ＣＨ３であり、ＰはＬ-アラニンである。
【００２８】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２はＦであり;
・Ｐはペプチドである。
好ましくは、Ｐはアミノ酸、好ましくはβ-アラニンである。好ましくは、Ｒ２は５’位にある。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は５’位におけるＦであり、Ｐはβ-アラニンである。
【００２９】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり;
・Ｘ１はＣＨ３であり;
・Ｒ１とＲ２は無し;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＮＸ１であり、Ｘ１はＣＨ３であり、Ｒ１とＲ２は無し、ＰはＬ-アラニンである。
【００３０】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり;
・Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり;
・Ｒ１とＲ２は無し;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＮＸ１であり、Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり、Ｒ１とＲ２は無し、ＰはＬ-アラニンである。
【００３１】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり;
・Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２はＣｌである;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＮＸ１であり、Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は５’位におけるＣｌであり、ＰはＬ-アラニンである。
【００３２】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり;
・Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２はＯ-ＣＨ２-Ｏであり;
・Ｐは、ペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニン及びβ-アラニンから選択される。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＮＸ１であり、Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は４’位と５’位でアミノ環に結合されたＯ-ＣＨ２-Ｏであり、ＰはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＮＸ１であり、Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は４’位と５’位でアミノ環に結合されたＯ-ＣＨ２-Ｏであり、Ｐはβ-アラニンである。
【００３３】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、且つ式中：
・ＸはＳであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２は無し;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニン及びβ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＳであり、Ｒ１とＲ２は無し、ＰはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＳであり、Ｒ１とＲ２は無し、Ｐはβ-アラニンである。
【００３４】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＳであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２はＣｌであり;
・Ｐはペプチドである。
好ましくは、Ｐはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。好ましくは、Ｒ２は５’位にある。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＳであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は５’位におけるＣｌであり、ＰはＬ-アラニンである。
【００３５】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＳであり;
・Ｒ１はＣＨ３であり;
・Ｒ２は無し;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＳであり、Ｒ１は５’位におけるＣＨ３であり、Ｒ２は無し、ＰはＬ-アラニンである。
【００３６】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１-ＣＯであり;
・Ｘ１はＨであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２はＣｌであり;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＮＸ１-ＣＯであり、Ｘ１はＨであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は５’位におけるＣｌであり、ＰはＬ-アラニンである。
【００３７】
本 発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１-ＣＯであり;
・Ｘ１はＨであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２は無し;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＮＸ１-ＣＯであり、Ｘ１はＨであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は無し、ＰはＬ-アラニンである。
【００３８】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１-ＣＯであり;
・Ｘ１はＣＨ３であり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２は無し;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＮＸ１-ＣＯであり、Ｘ１はＣＨ３であり、Ｒ１は無し、Ｒ２は無し、ＰはＬ-アラニンである。
【００３９】
好ましくは、本発明に係る基質は、表１に記載されている基質から選択される。
表１
表１のつづき
【００４０】
また、本発明は、上記の通り少なくとも一つの酵素基質を含む反応培地にも関する。
好ましくは、上記反応培地は微生物検出および／または同定培地であり、上記培地が上記の通り少なくとも一つの酵素基質を含む。
好ましくは、上記基質は１と１０００ｍｇ／ｌとの間の濃度、好ましくは１０と５００ｍｇ／ｌとの間の濃度である。
本発明のある特定の実施形態によれば、本発明に係る上記検出および／または同定培地は、本発明に係る基質によって検出されるものとは異なる酵素活性に特異的な、少なくとも一つの他の酵素基質を含む。
他の基質の酵素加水分解は検出可能なシグナルであって、本発明の基質を介して検出されるシグナルとは異なるシグナル、例えば異なる着色性あるいは蛍光性生成物を生じ、それにより一つ以上の微生物の検出および／または同定および／または定量のような実証を可能にする。他の特異的な基質について、微生物の検出において従来使用されている他の任意の基質を使用してもよい。他の特異的な酵素基質の濃度は、通常０．０１と１ｇ／ｌとの間にある。当業者は、使用する基質の関数として、容易にこのような濃度を決定することが可能である。例として、本発明に係る基質は、ペプチダーゼ、オシダーゼ、エステラーゼまたはレダクターゼ酵素基質と組合わせることが可能である。特に、本発明に係る基質であってＰがβ-アラニンであるものは、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルコシドまたはアリザリン-β-ガラクトシドのようなオシダーゼと組合わせることが可能である。また、本発明に係る基質であってＰがＬ-アラニンであるものは、5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシル・オクタノエートまたは5-ブロモ-3-インドキシル・ホスフェートのようなエステラーゼ基質と組合わせることが可能である。
【００４１】
本発明のある特定の実施形態によれば、本発明に係る上記検出および／または同定培地は、本発明に係る基質によって検出される酵素活性に特異的な少なくとも一つの他の酵素基質を含む。基質の特定の選択によって、同じ酵素活性を発現している微生物の群を同定することが可能である。他の特異的な酵素基質の濃度は、通常０．０１と１ｇ／ｌとの間にある。当業者は、使用する基質の作用として、容易にこのような濃度を決定することが可能である。特に、本発明に係る基質であってＰがＬ-アラニンであるものは、出願WO2006/030119に記載されているＬ-アラニンアミノペプチダーゼ、例えばＬ-アラニンペンチルレゾルファミンと組合わせることが可能である。
【００４２】
また、本発明は、微生物の少なくとも一つのペプチダーゼ活性を検出するための、上記の酵素基質の使用または上記の検出および／または同定培地の使用にも関する。
また、本発明は、グラム陽性菌をグラム陰性菌から分離するための、上記の酵素基質の使用または上記の検出および／または同定培地の使用にも関する。
【００４３】
また、本発明は微生物の少なくとも一つのペプチダーゼ活性を検出する方法であって、
ａ）上記の検出及び／又は同定培地を用意すること、
ｂ）培地に試験される生物試料を接種すること、
ｃ）これをインキュベートすること、及び
ｄ）少なくとも１のペプチダーゼ活性の存在を明らかにする工程
を含むか、又はそれにより構成されることを特徴とする方法に関する。
微生物の接種は、当業者に知られている任意の接種技術によって実施できる。インキュベーション工程は、検出が要求される酵素活性にとって最適な温度で実行されてもよく、検出される酵素活性に応じて、当業者は容易に選択することができる。
工程ｄ）は、目視検査によって、あるいは比色法または蛍光測定法によって実行できる。工程ｄ）の間、ペプチダーゼ活性の存在を、単独で、または少なくとも一つの他の酵素活性との組合わせにより、明らかにすることが可能である。
【００４４】
また、本発明は、バクテリアがグラム陽性菌に属するか又はグラム陰性菌に属するかどうかの点から区別する方法であって、
ａ）上記の検出及び／又は同定培地を用意すること、
ｂ）培地に試験される生物試料を接種すること、
ｃ）これをインキュベートすること、
ｄ）少なくとも１のペプチダーゼ活性の存在を明らかにする工程
を含むか、又はそれにより構成されることを特徴とする方法に関する。
上記のように、微生物の接種は、当業者に知られている任意の接種技術によって実施できる。インキュベーション工程は、検出が要求される酵素活性にとって最適な温度で実行されてもよく、検出される酵素活性に応じて、当業者は容易に選択することができる。工程ｄ）は、目視検査によって、あるいは比色法または蛍光測定法によって実行できる。工程ｄ）の間、ペプチダーゼ活性の存在を、単独または少なくとも一つの他の酵素活性との組合わせにより、明らかにすることが可能である。
【００４５】
下記の実施例は、説明として示すものであり、事実上決して制限するものではない。それらは、より明らかに本発明を理解することを可能にする。
【００４６】
実施例１−基質の合成
・「ＸはＳである 」
１ 2-(2'-アミノフェニル)ベンゾチアゾールの合成
１．１ 2-(2'-ニトロフェニル)ベンゾチアゾール
１ｅｑの2-アミノフェノールとエタノールと１ｅｑの2-ニトロベンズアルデヒドの混合物を、油浴を用いて、温度１１０℃で１時間、還流した。
発明者は混合物を周囲温度に冷却するまで置き、濾過によって沈殿物を回収した。生成物を最大で回収するために、丸底フラスコをろ液でリンスし、それによりかなりの部分を蒸発させた。
固体は、減圧下のデシケータ中で乾燥し、それにより中間生成物を得た。
上で得られた固体を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、次に１ｅｑの2,3-ジシアノ-5,6-ジクロロ-パラ-ベンゾキノンを周囲温度で小分けに加えた。反応はオーバーナイトで実行され、次に濾過後、ＤＣＭに可溶性の生成物を最大で回収するために、ガラス製品をＤＣＭでリンスした。
次に、生成物を得るために、溶媒を減圧下で蒸発させた。
【００４７】
１．２ 2-(2'-アミノフェニル)ベンゾチアゾール
１５ｇ（０．１５モル）のポリリン酸を２５０ｍｌのビーカーに入れ、次に４．５６ｇ（０．０３６モル）の2-アミノチオフェノールと５．００ｇ（０．０３６モル）のアントラニル酸を加えた。混合物は、砂浴でブンゼンバーナにより、３時間、２００−２２０℃に熱され、ガラス撹拌器で一定の間隔で撹拌された。混合物は６０℃までゆっくり冷却され、クラッシュアイスを加えた。
次に、６０ｍｌの水を加え、得られた溶液は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液でｐＨ９−１０に達するまでアルカリ化された。ブフナー漏斗による濾過によって回収されたオレンジ色の沈殿物をこのように得た。得られた固体を乾燥し、次に５０ｍｌのジクロロメタンに溶解し、次に水で３回洗った。有機相を回収し、次にＭｇＳＯ４で乾燥および濾過し、次に溶媒は粗生成物を得るために蒸発させた。質量３．０１ｇの黄/緑色の固体を、カラムクロマトグラフィーによる精製の後に、６４％の収率で得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 6.40 (2H, broad s, Ar-NH2), 6.75 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 6.78 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.23 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.35 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.46 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.71 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.87 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.97 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H).
【００４８】
２ 2-（L-アラニル-2'-アミドフェニル）ベンゾチアゾール（基質１７）の合成
２．１ 混合酸無水物法
質量１．５１ｇ（０．００８モル）のBoc-Ala-OHを１０ｍｌのドライテトラヒドロフラン中に溶解し、ＣａＣｌ２トラップを丸底フラスコの首に不透過性にするために付けた。混合物は磁気的に撹拌され、温度を下げた。ＮａＣｌ塩を混合した冷凍アイスの槽を使用して−１５℃まで温度を下げた。
この温度に到達したならば、混合物は更に５分間撹拌した。次の工程を実施する前に、温度が−１５℃に降下したことを確実にするために十分な注意を払いながら、次に１．０１ｇ（０．０１０）モルのN-メチルモルホリンを加えた。
１．０９ｇ（０．００８モル）のイソクロロブチル・ホルマートは、次に最大の注意を払いながら滴下して加えた；混合物は、加えられる滴下ごとに、予想通りに濁った。
１．３６ｇ（０．００６モル）の 2-（2'-アミノフェニル）ベンゾチアゾールは、次に極少量のドライＴＨＦに溶解し、混合物に加えた。２時間後に氷浴を取り除き、混合物をオーバーナイトで撹拌した。
溶液をろ過し、丸底フラスコを通常のＴＨＦでリンスし、ろ液を保存した。
次に、溶液を、パスツールピペットを使用して、氷と水と炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）を含む４００ｍｌビーカーに移した。次に溶液を、透明溶液を得るまで２時間撹拌した。溶液は次に小さいブフナー漏斗でろ過し、それを再結晶化するためにメタノール中に溶解した。
質量０．８７ｇのＯＦ３７Ａ（ベージュ/褐色の粉末）は、３７％の収率で得られた。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 1.42 (9H, s, C-CH3x3), 1.57 (3H, d, J = 7.92 Hz, CH3-CH-), 3.50 (1H, s, NH-Ar), 4.52 (1H, qt, NH-CH-CH3), 4.51 (21H, d, NH-CH), 7.18 (1H, t, J = 7.42 Hz, Ar-H), 7.44 (1H, t, J = 7.42 Hz, Ar-H), 7.48 (1H, t, J = 7.42 Hz, Ar-H), 7.49 (1H, t, J = 7.42 Hz, Ar-H), 7.87 (1H, d, J = 7.92 Hz, Ar-H), 7.92 (1H, d, J = 7.92 Hz, Ar-H), 8.14 (1H, d, J=7.92 Hz, Ar-H), 8.82 (1H, d, J= 7.92 Hz, Ar-H).
【００４９】
２．２ 脱保護
脱保護される化合物の質量０．３０ｇ（０．０００７５モル）を、ＣａＣｌ２トラップを付けた丸底フラスコに入れ、７ｍｌのトリフルオロ酢酸を加えた。混合物をオーバーナイトで撹拌した。
ＴＦＡを蒸発させ、それによりトリフルオロ酢酸塩の形態の０．３５ｇのＯＦ３８Ａを８８％の収率で、ベージュ/褐色の粉末を得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, DMSO): δ = 1.62 (3H, d, J = 7.42 Hz, CH3-CH-), 4.35 (1H, sx, NH2-CH-CH3), 5.31 (2H, broad s, NH2), 7.37 (1H, t, J = 7.8 Hz, Ar-H), 7.53 (1H, t, J = 7.8 Hz, Ar-H), 7.61 (1H, t, J = 7.8 Hz, Ar-H), 7.62 (1H, t, J = 7.8 Hz, Ar-H), 8.02 (1H, d, J = 7.42 Hz, Ar-H), 8.12 (1H, d, J = 7.42 Hz, Ar-H), 8.20 (1H, d, J = 7.42 Hz, Ar-H), 8.31 (2H, Ar-H + NH).
m. p.: 150-154°C.
【００５０】
３ 2-（L-アラニル-2'-アミド-5'-クロロフェニル）ベンゾチアゾール（基質１９）の合成
３．１ 2-（2'-ニトロ-5'-クロロフェニル）ベンゾチアゾール
１．１８ｇ（０．００９４モル）の2-アミノチオフェノールと１．７４ｇ（０．００９４モル）の5-ニトロ-3-クロロベンズアルデヒドのエタノール（１５０ｍｌ）溶液の混合物を、２時間還流した。周囲温度に冷却した後に、溶液を減圧下で濃縮した。残りの固体は水と酢酸エチルの混合物（５００ｍｌ）に希釈され、酢酸エチル（２×５００ｍｌ）を使用して更に２回抽出した。合わせた有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、エタノールから再結晶化して、粗生成物を得るために濃縮した。質量０．６６ｇのＯＦ３１Ａ（茶色の固体）を、収率２５％で得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 7.55 (4H, m, Ar-H), 7.79 (1H, d, J = 2 Hz, Ar-H), 7.90 (1H, s, Ar-H), 8.10 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H).
【００５１】
３．２ 2-（2'-アミノ-5'-クロロフェニル）ベンゾチアゾール
０．６５ｇ（０．００２２３モル）の2-（2'-ニトロ- 5'-クロロフェニル）ベンゾチアゾールＯＦ３１Ａと２．５２ｇ（０．０１１１８モル）のＳｎＣｌ２．２Ｈ２Ｏの１００ｍｌエタノール溶液の混合物は、２時間７０℃に加熱した。薄層クロマトグラフィを用いた確認工程は、混合物が出発反応物をもはや含まないことを示した。
混合物を周囲温度に冷却した後に、溶液は氷を含むビーカーに注入した。酢酸エチルで水相を抽出する前に、ｐＨは重炭酸ナトリウムＮａＨＣＯ３水溶液（５％）の添加によって、わずかに塩基性のｐＨ（ｐＨ７−８）に合わせた。
このように得られた水相は、慎重にブライン（飽和ＮａＣｌ水溶液）で洗い、硫酸ナトリウムを使用して乾燥し、それにより０．３１ｇのＯＦ５３Ａ（茶黄色の固体）を収率５３％で得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 6.41 (2H, broad s, Ar-NH2), 6.74 (1H, d, J = 9 Hz, Ar-H), 7.42 (3H, m, Ar-H), 7.67 (1H, d, J = 2 Hz, Ar-H), 7.90 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.98 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H).
【００５２】
３．３ 2-（アラニル-2'-アミド-5'-クロロフェニル）ベンゾチアゾール
３．３．１． 混合酸無水物法
質量０．２９ｇ（０．００１５３モル）のBoc-L-Alaを、１０ｍｌのドライテトラヒドロフランに溶解した。ＣａＣｌ２トラップを丸底フラスコの首に不透過性にするために付けた。混合物は磁気的に撹拌され、ＮａＣｌ塩を混合した冷凍アイスの槽を使用して−１５℃まで温度を下げた。
この温度に到達したならば、混合物は更に５分間撹拌された。次の工程を実施する前に、温度が−１５℃に降下したことを確実にするために十分な注意を払いながら、０．１９ｇ（０．００１９１モル）のN-メチルモルホリンを次に加えた。０．２１ｇ（０．００１５３モル）のイソクロロブチル・ホルマートは、次に最大の注意を払いながら滴下して加えた；混合物は、加えられる各滴下によって予想通りに濁った。
数分後、質量０．３０ｇ（０．００１１５モル）の 2-（2'-アミノ-5'-クロロフェニル）ベンゾチアゾールを極少量のドライＴＨＦに溶解し、混合物に加えた。２時間後に氷浴を取り除き、混合物をオーバーナイトで撹拌した。
溶液をろ過し、丸底フラスコを通常のＴＨＦでリンスし、ろ液を保存した。溶液を、パスツールピペットを使用して、氷と水と更に炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）を含む４００ｍｌビーカーに移した。次に溶液を、透明溶液を得るまで２時間撹拌した。溶液は次に小さいブフナー漏斗でろ過し、それを再結晶化するためにメタノール中に溶解した。
質量０．１８ｇのＯＦ５５Ａ（薄緑色の固体）を収率３６％で得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 1.41 (9H, s, 3xCH3), 1.56 (1H, d, J = 7 Hz, CH-CH3), 1.58 (3H, d, J = 4 Hz, CH3-CH), 6.45 (1H, broad s, NH), 6.74 (1H, d, J = 3 Hz, Ar-H), 7.45 (3H, m, Ar-H), 7.66 (1H, d, J = 3 Hz, Ar-H), 7.92 (2H, m, Ar-H).
【００５３】
３．３．２ 脱保護
脱保護される化合物の質量０．１８ｇ（０．０００４２モル）を、ＣａＣｌ２トラップを付けた丸底フラスコに入れ、５ｍｌのトリフルオロ酢酸を加えた。混合物をオーバーナイトで撹拌した。
ＴＦＡを蒸発させ、それによりトリフルオロ酢酸塩の形態の０．２２ｇのＯＦ５７Ａを９４％の収率で、粘性の茶色固体を得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, DMSO): δ = 1.50 (1H, d, J = 7 Hz, CH-CH3), 1.55 (3H, d, J = 4 Hz, CH3-CH), 4.80 (3H, broad s, NH3), 6.87 (1H, d, J = 9 Hz, Ar-H), 7.21 (1H, d, J = 9 Hz, Ar-H), 7.52 (1H, m, Ar-H), 8.10 (4H, m, Ar-H).
m. p.: 124-128°C.
【００５４】
・「ＸはＯである」
１ 2-（2'-アミノフェニル）ベンゾオキサゾールの合成
１．１ 2-（2'-ニトロフェニル）ベンゾオキサゾール
８．７３ｇ（０．０８００モル）の2-アミノフェノールと２０ｍｌのエタノールと１２．０９ｇ（０．０８００モル）の2-ニトロベンズアルデヒドの混合物を、温度１１０℃で１時間、油浴を用いて還流した。
混合物を周囲温度にし、沈殿物は濾過によって回収した。生成物を最大で回収するために、丸底フラスコをろ液でリンスし、それによりかなりの部分を蒸発させた。
固体は、減圧下のデシケータ中で乾燥し、それにより１３．２５ｇの2-（2'-ニトロベンジリジンアミノ）フェノールを収率６９％で得た。
上で得られた固体を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、次に１２．４３ｇ（０．０５４７モル）の2,3-ジシアノ-5,6 -ジクロロ-パラ-ベンゾキノンを周囲温度で小分けにして加えた。反応はオーバーナイトで実行し、次に濾過後、生成物を最大で回収するために、ガラス製品をＤＣＭでリンスした。
溶媒は、次に減圧下で蒸発させ、それにより８．３９ｇの2-（2-ニトロフェニル）ベンゾオキサゾール（茶−ベージュ色の固体）を収率６４％で得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 7.40 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.42 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.50 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.72 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.73 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.80 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.89 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 8.15 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H).
m. p.: 104-107°C.
【００５５】
１．２ 2-（2'-アミノフェニル）ベンゾオキサゾール
８ｇ（０．０３３モル）の2-（2'-ニトロフェニル）ベンゾオキサゾールと３７．５８ｇ（０．１６７モル）のＳｎＣｌ２．２Ｈ２Ｏの混合物の２００ｍｌエタノール溶液を、反応が完全に終わるまで７０℃に加熱した。
混合物を周囲温度に冷却した後、溶液を氷を含むビーカーに注入した。酢酸エチルで水相を抽出する前に、ｐＨは重炭酸ナトリウムＮａＨＣＯ３水溶液（５％）の添加によって、わずかに塩基性のｐＨ（ｐＨ７−８）に合わせた。
このように得られた水相は、慎重にブライン（飽和ＮａＣｌ水溶液）で洗い、硫酸ナトリウムを使用して乾燥し、それにより４．７２ｇのＯＦ１０Ｃ（茶黄色の固体）を収率６７％で得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 6.20 (2H, broad s, Ar-NH2), 6.78 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 6.81 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.31 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.32 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.34 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.58 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.72 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 8.08 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H).
m. p.: 100-104°C.
【００５６】
２ 2-（グリシル-2'-アミドフェニル）ベンゾオキサゾール（基質３）の合成
２．１ 混合酸無水物法
質量１．４０ｇ（０．００８モル）のN-t-Ｂｏｃ-Ｇｌｙを１０ｍｌのドライ・テトラヒドロフランに溶解し、ＣａＣｌ２トラップを丸底フラスコの首に、それを不透過性にするために付けた。混合物を磁気的に撹拌し、ＮａＣｌ塩を混ぜた冷凍アイスの槽を使用して−１５℃まで温度を下げた。
この温度に到達したならば、混合物は更に５分間撹拌された。次の工程を実施する前に、温度が−１５℃に降下したことを確認するために十分な注意を払いながら、１．０１ｇ（０．０１０モル）のN-メチルモルホリンを次に加えた。
次に、１．０９ｇ（０．００８モル）のイソクロロブチル・ホルマートは、次に最大の注意を払いながら滴下で加えた； 混合物は、加えられる各滴下によって予想通りに濁った。
数分後に、質量１．２６ｇ（０．００６モル）の 2-（2'-アミノフェニル）ベンゾオキサゾールを極少量のドライＴＨＦに溶解し、混合物に加えた。２時間後に氷浴を取り除き、混合物をオーバーナイトで撹拌した。
溶液をろ過し、丸底フラスコを通常のＴＨＦでリンスし、ろ液を保存した。ほんのわずかな沈殿物が存在した。溶液を、パスツールピペットを使用して、氷と水と炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）を含む４００ｍｌビーカーに移した。次に溶液を、透明溶液を得るまで２時間撹拌した。溶液は小さいブフナー漏斗でろ過し、次にそれを再結晶化するためにメタノール中に溶解した。
質量０．９８ｇのＯＦ２７Ａ（白色の粉末）は、４５%の収率で得られた。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 1.47 (9H, s, C-CH3x3), 4.05 (1H, d, J = 8 Hz, -NH-CH2), 4.17 (2H, d, J = 8 Hz, CO-CH2-NH), 5.38 (1H, broad s, Ar-NH-), 7.20 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.40 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.50 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.60 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.80 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.85 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 8.25 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 8.85 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H).
【００５７】
２．２ 脱保護
脱保護される化合物の質量０．２５ｇ（０．０００６８モル）を、ＣａＣｌ２トラップを付けた丸底フラスコに入れ、７ｍｌのトリフルオロ酢酸を加えた。混合物をオーバーナイトで撹拌した。
ＴＦＡを蒸発させ、それによりトリフルオロ酢酸塩の形態の０．２９ｇのＯＦ３０Ｂを８６％の収率で、ベージュ色の粉末を得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, DMSO): δ = 4.05 (2H, d, J = 8 Hz, CH2-NH3), 4.90 (3H, broad s, NH3), 7.40 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.46 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.50 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.70 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.85 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 8.20 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H) 8.25 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 8.40 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H).
ESI-MS: C15H15N3O2+ requires m/z 269.77 [M + H]+, 226.96 [M + H]- High-resolution M.S.E.I. for C15H15N3O2+. Calculated mass of molecular ion 268.1081 [M + H]+. Measured mass: 268.1083 [M + H]+.
m. p.: 219-222°C.
【００５８】
・「ＸはＮＸ１-ＣＯである」
１ 2-（2'-アミノ-5'-クロロフェニル）キノキサゾル-4-ワンの合成
１．１ 1,2-ジヒドロ-2-（2'-ニトロ- 5'-クロロフェニル）キノキサゾリン-4-ワン（参照：VLS 276）の合成
質量２．３１ｇ（０．０１７モル）の2-アミノベンズアミドと３．１４ｇ（０．０１７モル）の3-クロロ-6-ニトロベンズアルデヒドをエタノール中で１時間還流した。次に混合物を冷却し、得られたオレンジ色の結晶は集めて、減圧下のデシケータで乾燥した。質量３．９７ｇの薄オレンジ色の結晶が収率７６％で得られ、測定された融点は２３４−２３６℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR:(DMSO) δ 6.35 (1H, t, J=2 Hz, CH), 6.70 (1H, d, J=1 Hz, Ph-H(8H)), 6.80 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (6H)), 7.05 (1H, s (broad), NH), 7.25 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (7H)), 7.65 (1H, d,d, J=6 Hz, J=1.5 Hz, Ph-H (5H)), 7.75 (1H, d,d, J=9 Hz, J=3 Hz, Ph-H (4’H)), 7.85 (1H, d, J=3 Hz, Ph-H (6’H)), 8.15 (1H, d, J=9 Hz, Ph-H (3’H)), 8.30 (1H, d (broad), NH-CO), High-resolution M.S.E.I for C14H10ClN3O3 Calculated mass of molecular ion 304.0483 (M+H)+. Measured mass: 304.0482
υmax cm-1 1661 (C=ONH), 1564 (NO2), 1358 (NO2), 1602 (C=N), 774 (C-Cl).
【００５９】
１．２ 2-（2'-ニトロ- 5'-クロロフェニル）キノキサゾリン-4-ワン（参照：VLS 278）の酸化
質量９．１０ｇ（０．０３モル）の2-（2'-ニトロ- 5'-クロロフェニル）キノキサゾリン-4-ワンを４０ｍｌの無水アセトンに溶解し、４．７４ｇ（０．０３モル）の過マンガン酸カリウムの無水アセトン溶液で処理した。この溶液は、周囲温度で２−３時間にわたって混合物に滴下された。次に、反応はオーバーナイトで撹拌したままにした。過剰なＫＭｎＯ４は、固体の亜硫酸水素ナトリウムを過剰に加えることによって除去した。次に、溶液をろ過し、蒸発させた。質量２．２６ｇのペールホワイト色の粉末が、収率２５％で得られ、測定された融点は２７６−２７８℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C14H8ClN3O3 Calculated mass of molecular ion 302.0327 (M+H)+. Measured mass: 304.0327 .1H-NMR:(DMSO) δ 7.55 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (7H)), 7.65 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H (4’H)), 7.85 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (6H)), 7.90 (1H, d,d, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H (5H)), 8.05 (1H, d, J=2 Hz, Ph-H (6’H), 8.25 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H (3’H). υmax cm-1 3132 (NH2), 3070 (NH2), 1578 (NO2), 1368 (NO2), 1603 (NH), 1660 (CONH), 1531 (C=N), 772 (C-Cl).
【００６０】
１．３ 2-（2' -アミノ-5' -クロロフェニル）キノキサゾル-4-ワンの合成−化合物VLS 278の還元（VLS 285）
質量４．９６ｇ（０．０２８モル）のＳｎＣｌ２.２Ｈ２Ｏを、４０ｍｌのＨＣｌと５ｍｌの氷酢酸の混合物に溶解した。溶液は１２０℃で還流され、１．３４ｇ（０．００４４モル）の化合物ＶＬ２７８を小分けにして加えた。混合物は３０分間１２０℃に保たれ、次に２−３時間１００℃に下げた。黄色の固体を得て、ろ過により回収し、水に溶解し、４ＭのＮａＯＨ溶液を加えることによってアルカリ化した。淡黄色の沈殿物を収集して、減圧下のデシケータで乾燥させた。質量１．１７ｇの黄色の粉末が、収率９８％で得られ、測定された融点は２８６−２８８℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR:(DMSO) δ 6.80 (1H, d, J= 8.6 Hz, Ph-H (3’H)), 7.20 (1H, d,d, J=8.6 Hz, J=1 Hz, Ph-H), 7.30 (1H, s (broad), NH), 7.45 (1H, t, J=8 Hz Ph-H), 7.70 (1H, d J=7 Hz, Ph-H), 7.75 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H), 7.90 (1H, d J=2 Hz, Ph-H (6’H), 8.10 (1H, d,d, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H).
υmax cm-1 3465 (NH2), 3278 (NH2), 1674 (CO), 1582 (NH), 1560 (C=N), 1159 (C-N), 766 (C-Cl).
【００６１】
２ 2-（Ｌ-アラニル-2'-アミド-5'-クロロフェニル）キノキサゾル-4-ワンの合成（基質２１）
２．１ 混合酸無水物法（VLS 286 rep）
質量０．５０ｇ（０．００２モル）のt-Boc-L-Alaは、１０ｍｌの無水ＴＨＦ中に溶解された。温度を１５℃にし、０．３４ｇ（０．００３２モル）のＮＭＭ（N-メチルモルホリン）を１分間にわたって加え、つづいて０．３６ｇ（０．００２６６モル）のＩＢＣＦ（イソブチルクロロホルメート）を更に同じ温度で加えた。この添加後、混合物を５−１０分間撹拌し、次に極少量（すなわち５ｍｌ）の無水ＴＨＦに溶解した０．５５ｇ（０．００２モル）の2-（2' -アミノ-5'-クロロフェニル）キノキサゾル-4-ワンを同じ温度で２分間にわたって滴下で加えた。混合物は、２−３時間の氷浴に供され、次にオーバーナイトで周囲温度に置かれた。混合物は、次にＮＭＭ塩を除去するためにろ過され、ろ液の体積は、水と炭酸ナトリウムとを含むビーカーに注ぐために減らされた。黄色の固体を回収し、エタノールで再結晶化した。質量０．４３ｇの黄色の粉末を収率５０％で得て、測定された融点は２６８−２７０℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR:(DMSO) δ 1.20 (9H, s, (CH3)3C), 1.18 (1H, s (broad), NHCO), 1.40 (1H, d, J=7 Hz, CH3), 1.37 (1H, d, J=2 Hz, NH), 4.05 (1H, quartet, J=7 Hz, alaH), 7.25 (1H, t, J=7 Hz, NH-CO(CH3)3), 7.3-7.42 (2H, m, Ph-H), 7.55 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H), 7.65 (1H, d, Ph-H (3’ H)), 8.00 (1H, d, J=7 Hz, Ph-H (4’H)), 8.60 (1H, d, J=2 Hz, Ph-H), 8.65 (1H, s, Ph-H (6’H)). υmax cm-1 1668 (CONH), 1608 (NH), 1560 (C=N), 1169 (C-N), 722 (C-Cl).
【００６２】
２．２ 脱保護（参照：VLS 289）
2-（2'-アミノ-5-クロロフェニル）キノキサゾル-4-ワンのt-Boc-L-Ala誘導体は、トリフルオロ酢酸を加えることによって脱保護した。質量０．３０ｇ（０．０００７モル）の2-（t-Boc-L-Ala-2'-アミド-5-クロロフェニル）キノキサゾル-4-ワンと５ｍｌのトリフルオロ酢酸の混合物を、周囲温度でオーバーナイトで混合した。過剰なＴＦＡを蒸発させ、したがって得られた茶色の固体は減圧下でデシケータを使用して乾燥した。質量０．２６ｇ（０．０００５７モル）のオレンジ茶色の固体が、収率８１％で得られ、測定された融点は２６８−２７０℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR:(DMSO) δ 1.40 (3H, d, CH3), 3.40 (1H, quartet, H-ala), 7.55 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H), 7.67 (1H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H), 7.71 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H), 7.83 (1H, m, Ph-H), 7.90 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H), 8.20 (1H, d,d, J=8 Hz, J=1 Hz, Ph-H), 8.30 (2H, s (broad), NH2), 10.92 (1H, s (broad), NHCO). υma cm-1 1667 (CONH), 1605 (NH), 1560 (C=N), 1435 (CH3), 1181 (C-N), 770 (C-Cl).
【００６３】
・「ＸはＮＸ１である」
１ 2-（2' -アミノ-4',5'-シクロメチレンジオキシフェニル）-3- フェネチルベンズイミダゾール（または2-（2' -アミノ-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3- フェニルエチルベンズイミダゾール）の合成
１．１ 2-（2'-ニトロ-4',5'-シクロメチレンジオキシフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール（または2-（2'-ニトロ-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3 -フェニルエチルベンズイミダゾール）の合成
１．１．１ N-フェニルエチル-2-ニトロアニリン（参照：VLS 209）
質量４．８ｇ（０．０４モル）の2-フェニルエチルアミンを周囲温度で、５．６ｇ（０．０４モル）の2-フルオロニトロベンゼンと１１．０６ｇ（０．０８モル）の無水炭酸カリウムの３０ｍｌのＤＭＳＯ溶液混合物に滴下した。混合物は、３時間１００℃に加熱した。混合物は次に周囲温度に冷却して、１００ｍｌの水に加えられ、それにより薄オレンジ色の化合物の沈殿となった。固体を濾過によって回収し、減圧下でデシケータを使用して乾燥した。質量９．４ｇのオレンジ色の結晶を収率９８％で得た。求められた融点は理論値（すなわち６４−６６℃）と一致した。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR: (CDCl3) δ 3.00 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), δ 3.55 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), δ 6.65 (1H, m, Ph-H), δ 6.85 (1H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H), δ 7.20-7.50 (6H, m, Ph-H), δ 8.10 (1H, s (broad), NH), δ 8.20 (1H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H).
【００６４】
１．１．２ N-フェニルエチル-1,2-ジアミノベンゼン（参照：VLS 210）
０．３８ｇ（０．０１モル）の水素化ホウ素ナトリウムの溶液を、０．５２ｇ（０．００２モル）のアセチルアセトン銅のエタノール懸濁液に、周囲温度、窒素下で磁気的に撹拌しながら加えた。２．４２ｇ（０．０１モル）のニトロ化合物ＶＬＳ２０９のエタノール溶液をこの溶液に加え、つづいて０．７６ｇ（０．０２モル）の水素化ホウ素ナトリウムのエタノール溶液を加えた。混合物は、周囲温度で窒素下でオーバーナイトで撹拌された。次に混合物は過剰なエタノールを取り除くために濃縮し、水を加えた。次に抽出工程を２×２０ｍｌのＤＣＭで実施し、有機相は水で複数回洗い、炭酸カリウムを使用して乾燥し、回転蒸発装置で濃縮した。質量１．６９ｇの黒ずんだ油状の液体であって、続いて固体化されたものを収率８０％で得た。求められた融点は理論値（すなわち４２−４４℃）と一致した。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR: (CDCl3) δ 2.95 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), δ 3.27 (2H, s (broad), NH2), δ 3.38 (2H, t, J=7 Hz, -CH2), δ 6.69 (3H, m, Ph-H), δ 6.82 (1H, m, Ph-H), δ 7.10-7.40 (5H, m, Ph-H).
【００６５】
１．１．３ 2-（2'-ニトロ-4',5'-シクロメチレンジオキシフェニル）-3-フェネチルベンズイミダゾール（参照：VLS 213）（または2-（2'-ニトロ-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール）
８．６０ｇ（０．０１４モル）のオキソン（モノ過硫酸カリウム）を、５．０８ｇ（０．０２４モル）のN-フェニルエチル-1,2-ジアミノベンゼンと４．８ｇ（０．０２４モル）の6-ニトロピペロナールの２５ｍｌＤＭＦ溶液と１ｍｌの水の溶液に、周囲温度で１５分間にわたって磁気的に撹拌しながら加えた。反応が発熱性だったので、混合物を水の槽で冷却し、オーバーナイトで撹拌しておいた。次に水を混合物に加え、ＤＣＭで２回連続した抽出を実行した。混合した有機相を複数回水によって洗い、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、それにより黄／茶色の粗生成物を得た。エタノールによる再結晶化を、化合物を精製するために実行した。質量６．１９ｇの茶色の結晶を収率６７％で得て、測定された融点は１６２−１６４℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C22H17N3O4 Calculated mass of molecular ion 388.1292 (M+H)+. Measured mass: 388.1297 .1H-NMR: (CDCl3) δ 3.10 (2H, t, J=7 Hz,-CH2-), δ 4.20 (2H, t, J=7 Hz,-CH2-), δ 6.02 (1H, s, Ph-H), δ 6.18 (2H, s, O-CH2-O), δ 6.80 (2H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H), δ 7.10-7.40 (5H, m, Ph-H), δ 7.48 (1H, m, Ph-H), δ 7.65 (1H, s, Ph-H), δ 7.80 (1H, m, Ph-H).
υmax cm-1 1364 (NO2), 1523 (NO2), 1610 (C=N), 1152 (C-N), 1207 (C-N), 1089 (C-O), 1473 (C-H), 728 (-CH2).
【００６６】
１．２ 2-（2'-アミノ-4',5'-シクロ・メチレンジオキシフェニル）-3 - フェニルエチルベンズイミダゾール（または2-（2'-アミノ-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3- フェニルエチルベンズイミダゾール）
０．１１ｇ（０．００３モル）の水素化ホウ素ナトリウムの溶液を、０．１６ｇ（０．０００６モル）のアセチルアセトン銅のエタノール懸濁液に、周囲温度、窒素下で加えた。１．０７ｇ（０．００３モル）のニトロ化合物ＶＬＳ２１３のエタノール溶液を加え、続いて０．２３ｇ（０．００６モル）の水素化ホウ素ナトリウムのエタノール溶液に加えた。混合物は、周囲温度、窒素下、オーバーナイトで撹拌した。次に混合物は過剰なエタノールを取り除くために濃縮され、水を加えた。次に抽出を２×２０ｍｌのＤＣＭで実施し、有機相は水で複数回洗い、乾燥し（Ｋ２ＣＯ３）、回転蒸発装置で濃縮した。質量０．９２ｇの茶色の粉末が収率８７％が得られ、測定された融点は１７０−１７２℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C22H19N3O2 Calculated mass of molecular ion 358.1550 (M+H)+. Measured mass: 358.1550
1H-NMR: (CDCl3) δ 3.00 (2H, t, J=7 Hz -CH2-), δ 4.40 (2H, t, J=7 Hz, -CH2), δ 6.00 (2H, s, O-CH2-O), δ 6.35 (1H, s, Ph-H (6’H), δ 6.50 (1H, s, Ph-H (3’ H)), δ 7.00 (2H, m, Ph-H), δ 7.20-7.40 (5H, m, Ph-H), δ 7.55 (1H, m, Ph-H), δ 7.85 (1H, m, Ph-H).
υmax cm-1 3434 (N-H), 3350 (N-H), 1618 (C=N), 1219 (C-O), 1037 (C-N), 1157 (C-N), 1495 (Ar), 1473 (Ar), 1521 (Ar), 728 (-CH2-).
【００６７】
２ 2-（L-アラニル-2' -アミド-4',5'-シクロ・メチレンジオキシフェニル）-3-フェネチルベンズイミダゾール（基質１６）（または2-（L-アラニル-2' -アミド-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール）
質量０．５０ｇ（０．００２６モル）のt-Boc-L-アラニンを１０ｍｌの無水ＤＣＭに溶解し、０．５４ｇ（０．００２６モル）のジシクロヘキシルカルボジイミドをこの溶液に撹拌しながら加え、つづいて０．３５ｇ（０．００２６モル）のヒドロキシベンゾトリアゾールを加えた。混合物は４５分間、周囲温度で撹拌したままにし、次に０．６５ｇ（０．００１９モル）の2-（2'-アミノ-4',5'-メチレンジオキソランフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール（または2-（2'-アミノ-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール）を加え、オーバーナイトで反応を続けた。次の日、混合物をセリットによりろ過し、溶媒を蒸発させ、次に結果として生じる液体を水/氷混合物に注入した。このようにして形成された油状の沈殿物を酢酸エチルに溶解し、ＮａＨＣＯ３の１０％溶液で複数回洗い、次に水で洗った。有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮した。このように得られた茶色の固体は、酢酸エチルのＨＣｌの飽和溶液を加えることによって脱保護した。沈殿物は、Ｎａ２ＣＯ３の飽和水溶液と１０ｍｌのＤＣＭにより撹拌した。有機相を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、次に濃縮した。質量０．３７ｇの茶色の固体を収率３８％で得て、測定された融点は８０−８２℃であった。
化合物はカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）で精製し、黄/茶色の固体を得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR: (CDCl3) δ 1.30 (3H, d, J=6 Hz, ala CH3), 1.50 (2H, s (broad), NH2), 3.07 (2H, t, J=7 Hz, CH2), 3.40 (1H, quartet, ala H), 4.45 (2H, t , J=7 Hz, CH2), 6.04 (2H, s, CH2O2), 6.58 (1H, s, Ph-H (6’H)), 6.85 (2H, m, Ph-H (6H,7H)), 7.15 (3H, m, Ph-H), 7.35 (2H, d,d, Ph-H (5H, 8H)), 8.10 (1H, s, Ph-H (3’H)) , υmax cm-11667 (C=O), 1622 (C=N), 1239 (C-O), 1152 (C-N), 728 (-CH2-).
【００６８】
３ 2-（L-アラニル-2'-アミドフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール（基質１４、= VLS237）の合成
2-（2'-ニトロフェニル）-3- フェニルエチルベンズイミダゾール：この基質は、2-（2'-ニトロ-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3- フェニルエチルベンズイミダゾールの合成に類似した方法で合成した。収率７８％の白色の結晶が得られ、測定された融点は１２８−１３０℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C21H17N3O2. Calculated mass of molecular ion 344.1394 (M+H)+. Measured mass: 344.1394. 1H-NMR: (CDCl3) δ 3.07 (2H, t, J=6.93 Hz, -CH2-), 4.20 (2H, t, J=6.93 Hz, -CH2-N), 6.79 (2H, dd, J=7.67 and 1.24 Hz, Ph-H), 6.85 (1H, dd, J=7.42 and 1.73 Hz, Ph-H), 7.17 (3H, m, Ph-H), 7.36 (2H, m, Ph-H), 7.47 (1H, m, Ph-H), 7.53 (1H, t, J=7.42 Hz, Ph-H), 7.63 (1H, t, J=7.92 Hz, Ph-H), 7.81 (1H, m, Ph-H), 8.17 (1H, dd, J=8.16 and 1.48 Hz, Ph-H). IR: υmax cm-1 1520 (NO2), 1358 (NO2), 1454 (C=N), 1155 (C-N), 746 (-CH2-).
2-（2' -アミノフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール：この基質は、2-（2'-アミノ-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾールの合成に類似した方法で合成された（２６頁、２８行目）。収率７７％の茶色の粉末が得られ、測定された融点は１３０−１３２℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C21H19N3. Calculated mass of molecular ion 314.1652 (M+H)+. Measured mass: 314.1652. 1H-NMR: (CDCl3) δ 3.10 (2H, t, J=7.92 Hz, -CH2-), δ 4.40 (2H, t, J=7.92 Hz, -CH2-), δ 4.65 (2H, s (broad), NH2), δ 6.80-7.90 (13H, m, Ph-H) IR: υmax cm-1 3417 (-NH2), 3400 (NH2), 1616 (C=N), 1484 (C-H), 1454 (C-H), 1155 (C-N), 733 (CH2), 698 (CH2), 1591 (Ph), 1484 (Ph).
2-（L-アラニル-2' -アミドフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール：この基質は、2-（L-アラニル-2'-アミド-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾールの合成に類似した方法で合成された（２９頁、８行目）。収率５８％の黄／茶色の粉末が得られ、測定された融点は８０−８２℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C25H24N4O3. Calculated mass of molecular ion 429.1921 (M+H)+.Measured mass: 429.1926. 1H-NMR: (CDCl3) δ 1.30 (3H, d, J=6 Hz, ala CH3), 1.50 (2H, s (broad), NH2), 3.07 (2H, t, J=7 Hz, CH2), 3.40 (1H, q, J=6 Hz, ala-H), 4.45 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), 6.04 (2H, s, -CH2O2-), 6.58 (1H, s, C6'-H), 6.85 (2H, m, C6-H, and C7-H), 7.15 (3H, m, Ph-H), 7.35 (2H, dd, J=7 Hz, J=2 Hz, C5-H, C8-H), 8.10 (1H, s, N-H) , IR υmax cm-1 2918 (-CH2-), 2850 (CH3), 1675 (C=O),1625 (NH2), 1622 (C=N), 1152 (C-N), 749 (-CH2-), 1476 (Ar), 1455 (Ar), 1034 (C-N), 1365 (CH3).
【００６９】
実施例２−ペプチダーゼ活性を検出するための本発明に係る式Ｉの基質の使用
ａ）基質の合成
・基質Ｎｏ．１−2-（L-アラニル-2'-アミドフェニル）ベンゾオキサゾール −VLS206
・基質Ｎｏ．２−2-（β-アラニル-2'-アミドフェニル）ベンゾオキサゾール −OF22A
・基質Ｎｏ．３−2-（グリシル-2'-アミドフェニル）ベンゾオキサゾール −OF30B
・基質Ｎｏ．４−2-（L-アラニル-2'-アミドフェニル）-5-クロロベンゾオキサゾール ― 35
・基質Ｎｏ．１１−2-（β-アラニル-2'-アミド-4',5'-ジメトキシフェニル）ベンゾオキサゾール −OF24A
・基質Ｎｏ．１２−2-（L-アラニル-2'-アミドフェニル）ベンゾチアゾール −OF38A
・基質Ｎｏ．１８−2-（β-アラニル-2'-アミドフェニル）ベンゾチアゾール −OF33A
・基質Ｎｏ．１９−2-（L-アラニル-2'-アミド-5'-クロロフェニル）ベンゾチアゾール
・基質Ｎｏ．１６−2-（L-アラニル-2'-アミド-4',5'-メチレンジオキソラン）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール（または2-（L-アラニル-2'-アミド-4',5'-メチレンジオキシフェニル）
・基質Ｎｏ．１４−2-（L-アラニル-2'-アミドフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール（= VLS237）
・基質Ｎｏ．１、２、４及び１１は、実施例１の2-（グリシル-2'-アミドフェニル）ベンゾオキサゾール（基質Ｎｏ．３）の合成に類似した方法で合成された。
同様に、基質Ｎｏ．１７と１８は、実施例１の2-（L-アラニル-2'-アミド-5'-クロロフェニル）ベンゾチアゾール（基質Ｎｏ．１９）の合成に類似した方法で合成された。
【００７０】
ｂ）培地の調製
４０ｍｇの各基質は、４ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解する。この溶液は、前もってオートクレーブされた４００ｍｌのコロンビア寒天にすっかり混ぜられ、５０℃に溶解して保たれる。従って、各基質の最終濃度は、１００ｍｇ／ｌである。各々の培地を、９０ｍｍシャーレに、シャーレつき２０ｍｌの割合で分配する。
ｃ）接種とインキュベーション
コレクションに由来する、バクテリアと酵母のさまざまな種類に属する１８の微生物菌株は、１０μｌの１／２０に希釈された０．５マクファーランドの懸濁液の半定量的隔離によって、これらの培地に接種される。培地は３７℃で２４時間インキュベートされ、次に形成されたコロニーは３６０−３６５ｎｍのＵＶ照射下で視覚的に調べられる。
ｄ） 結果の記録
得られた結果を表２と表３に示す。
【００７１】
表２
表２のつづき
【００７２】
表３
【００７３】
7-アミノ-4-メチルクマリン（ＡＭＣ）（例えばL-アラニン-7-AMC）に基づく基質で観察されることとは反対に、試験された本発明に係る全ての基質では、蛍光はコロニーのみに、又はすぐ近辺に局在化していた。
基質１、２及び３の場合、それらはＰが異なるだけだが（それぞれL-アラニン、β-アラニンとグリシン）、同じ菌株によって生産される蛍光の強度および／または色は異なっていた。基質１では、全てのグラム陰性菌の菌株（ブルクホルデリア・セパシア 菌株を除いて）は、強い青色蛍光を生じた。２つのエンテロコッカス菌株は弱い青色蛍光を生じ、２つの黄色ブドウ球菌菌株は中程度の緑色蛍光を生じた。一方で、B. セパシア菌株は基質３では中程度の青色蛍光を生じ、基質２では緑色蛍光を生じた。
また、これらの結果は、Ｐが一定であるが、Ｘ及び／又はＲ２が変化する場合、蛍光の色、その強度及び毒性が変化したことを示した。これは、基質１、４、１７及び１９の間で事実であった。したがって、基質４では、緑膿菌（シュードモナス・アエルギノーサ）の菌株は弱い青紫色蛍光を生じ、S.アウレウス菌株では蛍光は検出されなかった。基質１７は全てのグラム陽性の菌株と酵母を阻害し、基質１９では緑膿菌の菌株は陰性だった。
同様に、Ｐがβ−アラニンである基質２、１１及び１８の間では、蛍光の色（放出波長で）、強度と毒性において、大きな違いがあった。
【００７４】
ｅ） 結論
所望の適用に応じて、Ｐ、Ｘ、Ｒ２またはＲ１は決められるべきである。
例えば、基質１（2-（L-アラニル-2'-アミドフェニル）ベンゾオキサゾール）は、グラム陰性菌（強い青色蛍光）と酵母とグラム陰性菌との間、および後者２つの間で、他からエンテロコッカス属（弱い青色蛍光）とS.アウレウス（中程度の緑色蛍光）を区別できる。また、基質３は、他の微生物からグラム陰性菌（青色蛍光）を区別することを可能にする。
基質１９は、他の微生物から特定の腸内細菌（大腸菌、サルモネラ属、エンテロバクター属、モルガネラ属とプロビデンシア属）を区別することを可能にする。
他の置換基、特に他のペプチドの使用は、微生物の他の群を分離することを可能にすることができる。Ｘ、Ｒ１及びＲ２基に応じて、蛍光の色と強度の両方、微生物群の検出の感受性または特異性、さらには毒性を変化させることが可能である。特に他の酵素基質と組合せる場合に、これらのバリエーションは非常に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明はペプチダーゼ活性を検出するための新規酵素基質に関する。これらの基質は、特に微生物学、生化学、免疫学、分子生物学、組織学等において、物理化学的シグナルを生じる酵素加水分解の工程を含む適用に使用できる。本発明は、当該基質を含む反応培地、またはペプチダーゼ活性を検出するためのおよび／またはグラム陰性菌からグラム陽性菌を識別するための基質又は培地の使用、及び使用方法に関する。
【０００２】
現在、非常に多数の培地が、微生物を検出するために存在する。特に、この検出は、検出が要求される微生物の酵素に特異的な特定の基質の使用に基づくことができる。一般に、酵素のための合成基質は、明らかにされる酵素活性に特異的な第１の部分と標識（通常は発色標識か蛍光標識）として働く第２の部分から構成される。したがって、バクテリアの場合、基質の選択のおかげで、反応があるか否かに応じて、微生物の性質を特徴づけることが可能である。ペプチダーゼ活性は、バクテリアのグループ、属または種を明らかにするために特に用いることができる。したがって、アラニンアミノペプチダーゼ活性は、例えば、グラム陰性菌とグラム陽性菌とを区別することを可能にする。
【０００３】
ペプチダーゼ活性を検出するための発色性酵素基質は、従来技術で知られている。微生物学で使用される酵素基質の総説であるManafi(Manafi et al, Microbiol Rev 55(3): 335-348, 1991)を挙げることができる。しかしながら、記載されているアミノペプチダーゼ基質は、加水分解によって、培地中に拡散する化合物を放出する（β-ナフチルアミン、7-アミノ-4-メチルクマリン）。その結果、不均一反応培地（シャーレ上のコロニー、組織学的切片など）において、加水分解の場所を正確に局在化することは可能でない。また、本出願人によって出願された特許出願WO98/04735及びWO99/38995に記載されている基質を挙げることができる。しかしながら、これらの基質は培養培地中に大量に拡散しないけれども、合成が難しく、純度が低く、収率が低く、特定の微生物に関して有毒であるという特定の欠点がある。
【０００４】
従って、本発明は、微生物を検出するための新規ペプチダーゼ基質を提案する。従来の基質と比較して、これらの新規基質は合成が容易であり、それらは反応培地中に拡散しない呈色を生じるので、特に微生物を検出するためのゲル化培地で使用できる。これは、ペプチダーゼ活性を発現しているコロニーまたはオルガネラを、それを発現しない他のものの中から、特定することを可能にする。
【０００５】
本発明の記載を続ける前に、下記の定義を、本発明の開示を容易にするために提供する。
「酵素基質」なる用語は、酵素によって加水分解され、微生物の、細胞の、またはオルガネラの、直接的または間接的な検出を可能にする生成物を提供し得る基質を意味することを目的とする。この基質は、特に、明らかにされる酵素活性に特異的な第１の部分と、標識として働く第２の部分を含む。
本発明に係る基質は、加水分解の生成物が酵素活性を発現している細胞に主に局在したままであるので、この活性を発現している細胞を特に計数することに、又はサンプルの残りからそれらを分離することさえ可能であるので、フローサイトメトリーでの使用に特に適している。
【０００６】
加水分解の生成物が加水分解の場所に主に局在したままであるため、組織中でこの活性を発現している細胞またはオルガネラを特に同定することが可能であるので、本発明に係る基質は組織酵素学での使用に非常に適している。
低い毒性のおかげで、本発明に係る基質は、細胞培養ペプチダーゼ活性を観察することに非常に適している。
【０００７】
また、本発明に係る基質は、反応培地中に拡散しない呈色または蛍光を生じるので、検出および／または同定培地での使用に非常に適している。本出願において、「呈色」なる用語は、可視スペクトルにおける光の吸収である呈色、又はある波長（λex）での吸収とより高い波長（λem、λem ＞λex）での放出である蛍光をカバーするために使用される。
本発明の基質は、塩を形成してもよく、すなわち塩化物、臭化物またはトリフルオロ酢酸塩のような塩の形態でもよい。
【０００８】
「ペプチダーゼ」なる用語は、加水分解によって、ペプチドのアシル残基と一級アミンとの間で形成されるアミド基を切断することができる酵素を意味することを目的とする。「アミノペプチダーゼ」なる用語は、加水分解によって、アミノ酸アシルと一級アミンとの間で形成されるアミド基を切断することができる酵素を意味することを目的とする。本出願において、「ペプチダーゼ」なる用語は、適切には、上に定義のペプチダーゼとアミノペプチダーゼを意味することができる。
【０００９】
「ペプチド」なる用語は、１から１０アミノ酸、好ましくは１から４アミノ酸を含むペプチド鎖を意味することを目的とする。ペプチドはジアラニンまたはトリアラニンであることが望ましい。「アミノ酸」なる用語は、当業者に知られている任意の天然または非天然アミノ酸を意味することを目的とする。本発明のある実施形態によれば、アミノ酸はβ-アラニンまたはＬ-アラニン、またはグリシン、ピログルタミル等である。
上記ペプチドは、そのＮ末端終端に遮断剤を含んでもよい。本発明に係る遮断剤は、アミンを保護することができる当業者に知られている任意の遮断剤を含む。例えば、ｔ-ブトキシカルボニル（Ｎ-ｔＢＯＣ）、9-フルオレニルオキシカルボニル、サクシニルのような可溶化剤、または非代謝性アミノ酸、すなわち、ピペコリン酸のような非天然アミノ酸またはＤ-フェニルアラニンようなＤ型のアミノ酸を挙げることができる。遮断剤は、本発明の化合物に体系的に存在しない。
【００１０】
「アルキル基」なる用語は、飽和炭化水素ベースの基の鎖、特にＣ１-Ｃ６アルキル、すなわち１から６の炭素原子を含む直鎖または分枝状アルキルを意味することを目的とする。例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、t-ブチル、ペンチル、イソペンチル及びヘキシルを挙げることができる。
【００１１】
「アリール基」なる用語は、芳香環、例えばＣ６-Ｃ１０芳香環、特にフェニル、ベンジル、1-ナフチルまたは2-ナフチルに由来する官能基（または置換基）を意味することを目的とする。
【００１２】
「カルボキシル基」なる用語は、第１の酸素原子に二重結合により、及び第２の酸素原子（それ自体が負に荷電しているか、又は水素原子に結合している）に単結合により結合された炭素原子から成る官能基を意味することを目的とする。分子のｐＫａ及び培地のｐＨに応じて、カルボキシル基はイオン化型、すなわち第２の酸素原子に結合するＨを有さないで負に帯電していてもよい。
【００１３】
「反応培地」なる用語は、代謝の発現のために及び／又は微生物、細胞、またはオルガネラの増殖のために必要な全ての要素を含む培地を意味することを目的とする。この反応培地は、フローサイトメトリ、組織酵素学、細胞培養等や、あるいは微生物検出および／または同定培地として使用できる。
反応培地は、例えばアミノ酸、ペプトン、炭水化物、ヌクレオチド、ミネラル、ビタミン、抗生物質、界面活性剤、バッファー、リン酸塩、アンモニウム塩、ソーダ塩、金属塩のような一つ以上の成分を組合せて含んでもよい。
【００１４】
また、培地は着色剤を含んでもよい。例として、着色剤として、エバンスブルー、ニュートラルレッド、ヒツジ血液、ウマ血液、酸化チタンのような乳白剤、ニトロアニリン、マラカイトグリーン、ブリリアントグリーン等を挙げることができる。
【００１５】
反応培地は、固体、半固体、又は液体でもよい。「固形培地」なる用語は、例えば、ゲル化培地を意味することを目的とする。寒天は微生物を培養するための微生物学における通常のゲル化剤であるが、ゼラチンまたはアガロースを使用することが可能である。一定数の調製物は、例えばコロンビア寒天、トリプケース−ソイ寒天、マッコンキー寒天、サブロー寒天、又はさらに一般的にいえば、微生物学培地ハンドブック（the Handbook of Microbiological Media：ＣＲＣ出版）に記載されているものは、市販されている。
【００１６】
反応培地は、「検出および／または同定培地」、すなわち発現用培地または培養且つ発現用培地であってもよい。第１の場合において、微生物は接種の前に培養され、第２の場合において、検出および／または同定培地は培養培地をも構成する。
【００１７】
「生物試料」なる用語は、生体液標本に由来する臨床試料、又は任意の種類の食品に由来する食品試料を意味することを目的とする。従って、この試料は液体又は固体でもよく、血液、血漿、尿または糞便、鼻、のど、皮膚、傷又は脳脊髄液から採取された試料に由来する臨床試料、水又例えば牛乳または果汁等の飲料由来の；ヨーグルト、肉、卵、野菜、マヨネーズまたはチーズ由来の；魚等に由来の食品試料、あるいは、特に動物の餌のような動物飼料に由来する食品試料を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、サンプルは、臨床環境からの標本、家畜標本、食品、化粧品または薬剤生産からの標本であってもよい。「環境標本」なる用語は、特に、表層から、液体から、出発原料からまたは製品から採取される標本を意味することを目的とする。
【００１８】
本発明の目的において、「微生物」なる用語はバクテリア、酵母、さらに一般的にいえば、通常は単細胞生物であって、肉眼では見えず、且つ実験室で増殖させ及び操作できる生物を含む。
グラム陰性菌について、以下の属のバクテリアを挙げることができる：シュードモナス属、エシェリヒア属、サルモネラ属、赤痢菌属、エンテロバクター属、クレブシェラ属、霊菌属、プロテウス属、カンピロバクター属、ヘモフィルス属、モルガネラ属、ビブリオ属、エルシニア属、アシネトバクター属、ブランハメラ属、ナイセリア属、バークホルデリア属、シトロバクター属、ハフニア属、エドバルシエラ属、エーロモナス属、モラクセラ属、パスツレラ属、プロビデンシア属、アクチノバチルス属、アルカリゲネス属、ボルデテラ属、セデセア属、エルウィニア属、パントエア属、ラルストニア属、ステノトロホモナス属、キサントモナス属及びレジオネラ属。
グラム陽性菌について、以下の属のバクテリアを挙げることができる：エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、バシラス属、乳酸桿菌属、リステリア属、クロストリジウム属、ガルドネレラ属、コクリア属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ミクロコッカス属、ファルカミア属（Falkamia）、ゲメラ属、ペジオコックス属、マイコバクテリア属及びコリネバクテリウム属。
酵母について、以下の属の酵母を挙げることができる：カンジダ属、クリプトコックス属、サッカロミセス属及びトリコスポロン属。
【００１９】
本発明は、下記の式（Ｉ）：
［式中、
・ＸはＳ；ＮＸ１；Ｏ；またはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｒ１は無し、あるいはＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＨまたはアルキル、アリールまたはカルボキシル基の置換基の一つであり；
・Ｒ２は無し、あるいはＣｌ;Ｏ-ＣＨ２-Ｏ;Ｏ-ＣＨ３;Ｆ、ジエチレンジアミン-ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリールまたはカルボキシル基、ＮＯ２、または
の置換基の一つであり；
・Ｘ１は、Ｈ、Ｃ２Ｈ４Ｐｈ、ＯＨ、アルキル基及びアリール基から選択され；
・Ｒ３及びＲ４は、独立にＨ又は１から４の炭素原子を有するアルキル基であり；
・Ｐはペプチドである］
の、ペプチダーゼ活性を検出するための酵素基質に関する。
ヘテロ環の１位の窒素と２位の炭素との間の結合は一重（1,2-ジヒドロ）あるいは二重でもよく、好ましくはニ重である。
【００２０】
もちろん、本発明に係る基質は、複数の置換基、すなわち環のさまざまな位置に複数のＲ１及びＲ２基を含んでもよい。Ｒ１および／またはＲ２がアルキルまたはアリール基であるとき、ＯＨ、カルボキシル、Ｂｒ、Ｃｌ、ＦまたはＩのような一以上の置換基によって置換されてもよい。Ｒ２がＯ-ＣＨ２-Ｏであるとき、Ｒ２は環員の２つが共有されているアミノフェニルに結合する環である。
第１の変形例によれば、ＸがＮＸ１-ＣＯであるとき、Ｘを含む環は６員環であって、当該６員環の３位のＯと４位のＮＸ１を含む。
第２の変形例によれば、ＸがＮＸ１-ＣＯであるとき、Ｘを含む環は６員環であって、当該６員環の３位のＮＸ１と４位のＯに二重結合を介して結合するＣを含む。
本発明のある好ましい実施形態によれば、ＸはＳである。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、ＸはＮ-Ｘ１である。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、ＸはＯである。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、ＸはＮＸ１-ＣＯである。
【００２１】
本発明のある特定の実施形態によれば、Ｒ１は５位にある。
本発明のある特定の実施形態によれば、Ｒ２は４’位にある。本発明のある特定の実施形態によれば、Ｒ２は５’位にある。本発明のある特定の実施形態によれば、Ｒ２は４’位及び５’位にある。
本発明のある特定の実施形態によれば、ＰはそのＮ末端終端に遮断剤を含む。
【００２２】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ ＸはＯであり；
・ Ｒ１とＲ２は無し;
・ Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはβ-アラニン、Ｌ-アラニン及びグリシンから選択される。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１とＲ２は無し、及びＰはβ-アラニンである。
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１とＲ２は無し、及びＰはＬ-アラニンである。
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１とＲ２は無し、及びＰはグリシンである。
【００２３】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり；
・Ｒ１はＣｌであり;
・Ｒ２は無し；
・Ｐはペプチドである。
好ましくは、Ｐはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。好ましくは、Ｒ１は５位にある。
【００２４】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１は５位でＣｌであり、Ｒ２は無し、及びＰはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり;
・Ｒ１はＣＨ３であり;
・Ｒ２は無し;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１は５位でＣＨ３であり、Ｒ２は無し、及びＰはＬ-アラニンである。
【００２５】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は、上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり;
・Ｒ１は無し；
・Ｒ２はＣｌであり;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は５’位でＣｌであり、及びＰはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は５’位でＣｌであり、及びＰはβ-アラニンである。
【００２６】
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２はＯ-ＣＨ２-Ｏであり;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニン及びβ-アラニンから選択される。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は４’位と５’位でアミノ環に結合されたＯ-ＣＨ２-Ｏであり、ＰはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は４’位と５’位でアミノ環に結合されたＯ-ＣＨ２-Ｏであり、Ｐはβ-アラニンである。
【００２７】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２はＯ-ＣＨ３であり;
・Ｐはペプチドである。
Ｐはアミノ酸、好ましくはβ-アラニンまたはＬ-アラニンであることが望ましい。好ましくは、Ｒ２は４’位と５’位である。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は４’位と５’位におけるＯ-ＣＨ３であり、Ｐはβ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は４’位と５’位におけるＯ-ＣＨ３であり、ＰはＬ-アラニンである。
【００２８】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＯであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２はＦであり;
・Ｐはペプチドである。
好ましくは、Ｐはアミノ酸、好ましくはβ-アラニンである。好ましくは、Ｒ２は５’位にある。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＯであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は５’位におけるＦであり、Ｐはβ-アラニンである。
【００２９】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり;
・Ｘ１はＣＨ３であり;
・Ｒ１とＲ２は無し;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＮＸ１であり、Ｘ１はＣＨ３であり、Ｒ１とＲ２は無し、ＰはＬ-アラニンである。
【００３０】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり;
・Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり;
・Ｒ１とＲ２は無し;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＮＸ１であり、Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり、Ｒ１とＲ２は無し、ＰはＬ-アラニンである。
【００３１】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり;
・Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２はＣｌである;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＮＸ１であり、Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は５’位におけるＣｌであり、ＰはＬ-アラニンである。
【００３２】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１であり;
・Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２はＯ-ＣＨ２-Ｏであり;
・Ｐは、ペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニン及びβ-アラニンから選択される。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＮＸ１であり、Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は４’位と５’位でアミノ環に結合されたＯ-ＣＨ２-Ｏであり、ＰはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＮＸ１であり、Ｘ１はＣ２Ｈ４Ｐｈであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は４’位と５’位でアミノ環に結合されたＯ-ＣＨ２-Ｏであり、Ｐはβ-アラニンである。
【００３３】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式(I)に対応し、且つ式中：
・ＸはＳであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２は無し;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニン及びβ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＳであり、Ｒ１とＲ２は無し、ＰはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＳであり、Ｒ１とＲ２は無し、Ｐはβ-アラニンである。
【００３４】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＳであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２はＣｌであり;
・Ｐはペプチドである。
好ましくは、Ｐはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。好ましくは、Ｒ２は５’位にある。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＳであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は５’位におけるＣｌであり、ＰはＬ-アラニンである。
【００３５】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＳであり;
・Ｒ１はＣＨ３であり;
・Ｒ２は無し;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＳであり、Ｒ１は５’位におけるＣＨ３であり、Ｒ２は無し、ＰはＬ-アラニンである。
【００３６】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１-ＣＯであり;
・Ｘ１はＨであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２はＣｌであり;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＮＸ１-ＣＯであり、Ｘ１はＨであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は５’位におけるＣｌであり、ＰはＬ-アラニンである。
【００３７】
本 発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１-ＣＯであり;
・Ｘ１はＨであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２は無し;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＮＸ１-ＣＯであり、Ｘ１はＨであり、Ｒ１は無し、Ｒ２は無し、ＰはＬ-アラニンである。
【００３８】
本発明の他の特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、且つ式中：
・ＸはＮＸ１-ＣＯであり;
・Ｘ１はＣＨ３であり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２は無し;
・Ｐはペプチド、好ましくはアミノ酸、好ましくはＬ-アラニンである。
本発明のある特定の実施形態によれば、上記酵素基質は上記の式（Ｉ）に対応し、ＸはＮＸ１-ＣＯであり、Ｘ１はＣＨ３であり、Ｒ１は無し、Ｒ２は無し、ＰはＬ-アラニンである。
【００３９】
好ましくは、本発明に係る基質は、表１に記載されている基質から選択される。
表１
表１のつづき
【００４０】
また、本発明は、上記の通り少なくとも一つの酵素基質を含む反応培地にも関する。
好ましくは、上記反応培地は微生物検出および／または同定培地であり、上記培地が上記の通り少なくとも一つの酵素基質を含む。
好ましくは、上記基質は１と１０００ｍｇ／ｌとの間の濃度、好ましくは１０と５００ｍｇ／ｌとの間の濃度である。
本発明のある特定の実施形態によれば、本発明に係る上記検出および／または同定培地は、本発明に係る基質によって検出されるものとは異なる酵素活性に特異的な、少なくとも一つの他の酵素基質を含む。
他の基質の酵素加水分解は検出可能なシグナルであって、本発明の基質を介して検出されるシグナルとは異なるシグナル、例えば異なる着色性あるいは蛍光性生成物を生じ、それにより一つ以上の微生物の検出および／または同定および／または定量のような実証を可能にする。他の特異的な基質について、微生物の検出において従来使用されている他の任意の基質を使用してもよい。他の特異的な酵素基質の濃度は、通常０．０１と１ｇ／ｌとの間にある。当業者は、使用する基質の関数として、容易にこのような濃度を決定することが可能である。例として、本発明に係る基質は、ペプチダーゼ、オシダーゼ、エステラーゼまたはレダクターゼ酵素基質と組合わせることが可能である。特に、本発明に係る基質であってＰがβ-アラニンであるものは、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルコシドまたはアリザリン-β-ガラクトシドのようなオシダーゼと組合わせることが可能である。また、本発明に係る基質であってＰがＬ-アラニンであるものは、5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシル・オクタノエートまたは5-ブロモ-3-インドキシル・ホスフェートのようなエステラーゼ基質と組合わせることが可能である。
【００４１】
本発明のある特定の実施形態によれば、本発明に係る上記検出および／または同定培地は、本発明に係る基質によって検出される酵素活性に特異的な少なくとも一つの他の酵素基質を含む。基質の特定の選択によって、同じ酵素活性を発現している微生物の群を同定することが可能である。他の特異的な酵素基質の濃度は、通常０．０１と１ｇ／ｌとの間にある。当業者は、使用する基質の作用として、容易にこのような濃度を決定することが可能である。特に、本発明に係る基質であってＰがＬ-アラニンであるものは、出願WO2006/030119に記載されているＬ-アラニンアミノペプチダーゼ、例えばＬ-アラニンペンチルレゾルファミンと組合わせることが可能である。
【００４２】
また、本発明は、微生物の少なくとも一つのペプチダーゼ活性を検出するための、上記の酵素基質の使用または上記の検出および／または同定培地の使用にも関する。
また、本発明は、グラム陽性菌をグラム陰性菌から分離するための、上記の酵素基質の使用または上記の検出および／または同定培地の使用にも関する。
【００４３】
また、本発明は微生物の少なくとも一つのペプチダーゼ活性を検出する方法であって、
ａ）上記の検出及び／又は同定培地を用意すること、
ｂ）培地に試験される生物試料を接種すること、
ｃ）これをインキュベートすること、及び
ｄ）少なくとも１のペプチダーゼ活性の存在を明らかにする工程
を含むか、又はそれにより構成されることを特徴とする方法に関する。
微生物の接種は、当業者に知られている任意の接種技術によって実施できる。インキュベーション工程は、検出が要求される酵素活性にとって最適な温度で実行されてもよく、検出される酵素活性に応じて、当業者は容易に選択することができる。
工程ｄ）は、目視検査によって、あるいは比色法または蛍光測定法によって実行できる。工程ｄ）の間、ペプチダーゼ活性の存在を、単独で、または少なくとも一つの他の酵素活性との組合わせにより、明らかにすることが可能である。
【００４４】
また、本発明は、バクテリアがグラム陽性菌に属するか又はグラム陰性菌に属するかどうかの点から区別する方法であって、
ａ）上記の検出及び／又は同定培地を用意すること、
ｂ）培地に試験される生物試料を接種すること、
ｃ）これをインキュベートすること、
ｄ）少なくとも１のペプチダーゼ活性の存在を明らかにする工程
を含むか、又はそれにより構成されることを特徴とする方法に関する。
上記のように、微生物の接種は、当業者に知られている任意の接種技術によって実施できる。インキュベーション工程は、検出が要求される酵素活性にとって最適な温度で実行されてもよく、検出される酵素活性に応じて、当業者は容易に選択することができる。工程ｄ）は、目視検査によって、あるいは比色法または蛍光測定法によって実行できる。工程ｄ）の間、ペプチダーゼ活性の存在を、単独または少なくとも一つの他の酵素活性との組合わせにより、明らかにすることが可能である。
【００４５】
下記の実施例は、説明として示すものであり、事実上決して制限するものではない。それらは、より明らかに本発明を理解することを可能にする。
【００４６】
実施例１−基質の合成
・「ＸはＳである 」
１ 2-(2'-アミノフェニル)ベンゾチアゾールの合成
１．１ 2-(2'-ニトロフェニル)ベンゾチアゾール
１ｅｑの2-アミノフェノールとエタノールと１ｅｑの2-ニトロベンズアルデヒドの混合物を、油浴を用いて、温度１１０℃で１時間、還流した。
発明者は混合物を周囲温度に冷却するまで置き、濾過によって沈殿物を回収した。生成物を最大で回収するために、丸底フラスコをろ液でリンスし、それによりかなりの部分を蒸発させた。
固体は、減圧下のデシケータ中で乾燥し、それにより中間生成物を得た。
上で得られた固体を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、次に１ｅｑの2,3-ジシアノ-5,6-ジクロロ-パラ-ベンゾキノンを周囲温度で小分けに加えた。反応はオーバーナイトで実行され、次に濾過後、ＤＣＭに可溶性の生成物を最大で回収するために、ガラス製品をＤＣＭでリンスした。
次に、生成物を得るために、溶媒を減圧下で蒸発させた。
【００４７】
１．２ 2-(2'-アミノフェニル)ベンゾチアゾール
１５ｇ（０．１５モル）のポリリン酸を２５０ｍｌのビーカーに入れ、次に４．５６ｇ（０．０３６モル）の2-アミノチオフェノールと５．００ｇ（０．０３６モル）のアントラニル酸を加えた。混合物は、砂浴でブンゼンバーナにより、３時間、２００−２２０℃に熱され、ガラス撹拌器で一定の間隔で撹拌された。混合物は６０℃までゆっくり冷却され、クラッシュアイスを加えた。
次に、６０ｍｌの水を加え、得られた溶液は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液でｐＨ９−１０に達するまでアルカリ化された。ブフナー漏斗による濾過によって回収されたオレンジ色の沈殿物をこのように得た。得られた固体を乾燥し、次に５０ｍｌのジクロロメタンに溶解し、次に水で３回洗った。有機相を回収し、次にＭｇＳＯ４で乾燥および濾過し、次に溶媒は粗生成物を得るために蒸発させた。質量３．０１ｇの黄/緑色の固体を、カラムクロマトグラフィーによる精製の後に、６４％の収率で得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 6.40 (2H, broad s, Ar-NH2), 6.75 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 6.78 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.23 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.35 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.46 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.71 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.87 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.97 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H).
【００４８】
２ 2-（L-アラニル-2'-アミドフェニル）ベンゾチアゾール（基質１７）の合成
２．１ 混合酸無水物法
質量１．５１ｇ（０．００８モル）のBoc-Ala-OHを１０ｍｌのドライテトラヒドロフラン中に溶解し、ＣａＣｌ２トラップを丸底フラスコの首に不透過性にするために付けた。混合物は磁気的に撹拌され、温度を下げた。ＮａＣｌ塩を混合した冷凍アイスの槽を使用して−１５℃まで温度を下げた。
この温度に到達したならば、混合物は更に５分間撹拌した。次の工程を実施する前に、温度が−１５℃に降下したことを確実にするために十分な注意を払いながら、次に１．０１ｇ（０．０１０）モルのN-メチルモルホリンを加えた。
１．０９ｇ（０．００８モル）のイソクロロブチル・ホルマートは、次に最大の注意を払いながら滴下して加えた；混合物は、加えられる滴下ごとに、予想通りに濁った。
１．３６ｇ（０．００６モル）の 2-（2'-アミノフェニル）ベンゾチアゾールは、次に極少量のドライＴＨＦに溶解し、混合物に加えた。２時間後に氷浴を取り除き、混合物をオーバーナイトで撹拌した。
溶液をろ過し、丸底フラスコを通常のＴＨＦでリンスし、ろ液を保存した。
次に、溶液を、パスツールピペットを使用して、氷と水と炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）を含む４００ｍｌビーカーに移した。次に溶液を、透明溶液を得るまで２時間撹拌した。溶液は次に小さいブフナー漏斗でろ過し、それを再結晶化するためにメタノール中に溶解した。
質量０．８７ｇのＯＦ３７Ａ（ベージュ/褐色の粉末）は、３７％の収率で得られた。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 1.42 (9H, s, C-CH3x3), 1.57 (3H, d, J = 7.92 Hz, CH3-CH-), 3.50 (1H, s, NH-Ar), 4.52 (1H, qt, NH-CH-CH3), 4.51 (21H, d, NH-CH), 7.18 (1H, t, J = 7.42 Hz, Ar-H), 7.44 (1H, t, J = 7.42 Hz, Ar-H), 7.48 (1H, t, J = 7.42 Hz, Ar-H), 7.49 (1H, t, J = 7.42 Hz, Ar-H), 7.87 (1H, d, J = 7.92 Hz, Ar-H), 7.92 (1H, d, J = 7.92 Hz, Ar-H), 8.14 (1H, d, J=7.92 Hz, Ar-H), 8.82 (1H, d, J= 7.92 Hz, Ar-H).
【００４９】
２．２ 脱保護
脱保護される化合物の質量０．３０ｇ（０．０００７５モル）を、ＣａＣｌ２トラップを付けた丸底フラスコに入れ、７ｍｌのトリフルオロ酢酸を加えた。混合物をオーバーナイトで撹拌した。
ＴＦＡを蒸発させ、それによりトリフルオロ酢酸塩の形態の０．３５ｇのＯＦ３８Ａを８８％の収率で、ベージュ/褐色の粉末を得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, DMSO): δ = 1.62 (3H, d, J = 7.42 Hz, CH3-CH-), 4.35 (1H, sx, NH2-CH-CH3), 5.31 (2H, broad s, NH2), 7.37 (1H, t, J = 7.8 Hz, Ar-H), 7.53 (1H, t, J = 7.8 Hz, Ar-H), 7.61 (1H, t, J = 7.8 Hz, Ar-H), 7.62 (1H, t, J = 7.8 Hz, Ar-H), 8.02 (1H, d, J = 7.42 Hz, Ar-H), 8.12 (1H, d, J = 7.42 Hz, Ar-H), 8.20 (1H, d, J = 7.42 Hz, Ar-H), 8.31 (2H, Ar-H + NH).
m. p.: 150-154°C.
【００５０】
３ 2-（L-アラニル-2'-アミド-5'-クロロフェニル）ベンゾチアゾール（基質１９）の合成
３．１ 2-（2'-ニトロ-5'-クロロフェニル）ベンゾチアゾール
１．１８ｇ（０．００９４モル）の2-アミノチオフェノールと１．７４ｇ（０．００９４モル）の5-ニトロ-3-クロロベンズアルデヒドのエタノール（１５０ｍｌ）溶液の混合物を、２時間還流した。周囲温度に冷却した後に、溶液を減圧下で濃縮した。残りの固体は水と酢酸エチルの混合物（５００ｍｌ）に希釈され、酢酸エチル（２×５００ｍｌ）を使用して更に２回抽出した。合わせた有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、エタノールから再結晶化して、粗生成物を得るために濃縮した。質量０．６６ｇのＯＦ３１Ａ（茶色の固体）を、収率２５％で得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 7.55 (4H, m, Ar-H), 7.79 (1H, d, J = 2 Hz, Ar-H), 7.90 (1H, s, Ar-H), 8.10 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H).
【００５１】
３．２ 2-（2'-アミノ-5'-クロロフェニル）ベンゾチアゾール
０．６５ｇ（０．００２２３モル）の2-（2'-ニトロ- 5'-クロロフェニル）ベンゾチアゾールＯＦ３１Ａと２．５２ｇ（０．０１１１８モル）のＳｎＣｌ２．２Ｈ２Ｏの１００ｍｌエタノール溶液の混合物は、２時間７０℃に加熱した。薄層クロマトグラフィを用いた確認工程は、混合物が出発反応物をもはや含まないことを示した。
混合物を周囲温度に冷却した後に、溶液は氷を含むビーカーに注入した。酢酸エチルで水相を抽出する前に、ｐＨは重炭酸ナトリウムＮａＨＣＯ３水溶液（５％）の添加によって、わずかに塩基性のｐＨ（ｐＨ７−８）に合わせた。
このように得られた水相は、慎重にブライン（飽和ＮａＣｌ水溶液）で洗い、硫酸ナトリウムを使用して乾燥し、それにより０．３１ｇのＯＦ５３Ａ（茶黄色の固体）を収率５３％で得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 6.41 (2H, broad s, Ar-NH2), 6.74 (1H, d, J = 9 Hz, Ar-H), 7.42 (3H, m, Ar-H), 7.67 (1H, d, J = 2 Hz, Ar-H), 7.90 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.98 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H).
【００５２】
３．３ 2-（アラニル-2'-アミド-5'-クロロフェニル）ベンゾチアゾール
３．３．１． 混合酸無水物法
質量０．２９ｇ（０．００１５３モル）のBoc-L-Alaを、１０ｍｌのドライテトラヒドロフランに溶解した。ＣａＣｌ２トラップを丸底フラスコの首に不透過性にするために付けた。混合物は磁気的に撹拌され、ＮａＣｌ塩を混合した冷凍アイスの槽を使用して−１５℃まで温度を下げた。
この温度に到達したならば、混合物は更に５分間撹拌された。次の工程を実施する前に、温度が−１５℃に降下したことを確実にするために十分な注意を払いながら、０．１９ｇ（０．００１９１モル）のN-メチルモルホリンを次に加えた。０．２１ｇ（０．００１５３モル）のイソクロロブチル・ホルマートは、次に最大の注意を払いながら滴下して加えた；混合物は、加えられる各滴下によって予想通りに濁った。
数分後、質量０．３０ｇ（０．００１１５モル）の 2-（2'-アミノ-5'-クロロフェニル）ベンゾチアゾールを極少量のドライＴＨＦに溶解し、混合物に加えた。２時間後に氷浴を取り除き、混合物をオーバーナイトで撹拌した。
溶液をろ過し、丸底フラスコを通常のＴＨＦでリンスし、ろ液を保存した。溶液を、パスツールピペットを使用して、氷と水と更に炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）を含む４００ｍｌビーカーに移した。次に溶液を、透明溶液を得るまで２時間撹拌した。溶液は次に小さいブフナー漏斗でろ過し、それを再結晶化するためにメタノール中に溶解した。
質量０．１８ｇのＯＦ５５Ａ（薄緑色の固体）を収率３６％で得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 1.41 (9H, s, 3xCH3), 1.56 (1H, d, J = 7 Hz, CH-CH3), 1.58 (3H, d, J = 4 Hz, CH3-CH), 6.45 (1H, broad s, NH), 6.74 (1H, d, J = 3 Hz, Ar-H), 7.45 (3H, m, Ar-H), 7.66 (1H, d, J = 3 Hz, Ar-H), 7.92 (2H, m, Ar-H).
【００５３】
３．３．２ 脱保護
脱保護される化合物の質量０．１８ｇ（０．０００４２モル）を、ＣａＣｌ２トラップを付けた丸底フラスコに入れ、５ｍｌのトリフルオロ酢酸を加えた。混合物をオーバーナイトで撹拌した。
ＴＦＡを蒸発させ、それによりトリフルオロ酢酸塩の形態の０．２２ｇのＯＦ５７Ａを９４％の収率で、粘性の茶色固体を得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, DMSO): δ = 1.50 (1H, d, J = 7 Hz, CH-CH3), 1.55 (3H, d, J = 4 Hz, CH3-CH), 4.80 (3H, broad s, NH3), 6.87 (1H, d, J = 9 Hz, Ar-H), 7.21 (1H, d, J = 9 Hz, Ar-H), 7.52 (1H, m, Ar-H), 8.10 (4H, m, Ar-H).
m. p.: 124-128°C.
【００５４】
・「ＸはＯである」
１ 2-（2'-アミノフェニル）ベンゾオキサゾールの合成
１．１ 2-（2'-ニトロフェニル）ベンゾオキサゾール
８．７３ｇ（０．０８００モル）の2-アミノフェノールと２０ｍｌのエタノールと１２．０９ｇ（０．０８００モル）の2-ニトロベンズアルデヒドの混合物を、温度１１０℃で１時間、油浴を用いて還流した。
混合物を周囲温度にし、沈殿物は濾過によって回収した。生成物を最大で回収するために、丸底フラスコをろ液でリンスし、それによりかなりの部分を蒸発させた。
固体は、減圧下のデシケータ中で乾燥し、それにより１３．２５ｇの2-（2'-ニトロベンジリジンアミノ）フェノールを収率６９％で得た。
上で得られた固体を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、次に１２．４３ｇ（０．０５４７モル）の2,3-ジシアノ-5,6 -ジクロロ-パラ-ベンゾキノンを周囲温度で小分けにして加えた。反応はオーバーナイトで実行し、次に濾過後、生成物を最大で回収するために、ガラス製品をＤＣＭでリンスした。
溶媒は、次に減圧下で蒸発させ、それにより８．３９ｇの2-（2-ニトロフェニル）ベンゾオキサゾール（茶−ベージュ色の固体）を収率６４％で得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 7.40 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.42 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.50 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.72 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.73 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.80 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.89 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 8.15 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H).
m. p.: 104-107°C.
【００５５】
１．２ 2-（2'-アミノフェニル）ベンゾオキサゾール
８ｇ（０．０３３モル）の2-（2'-ニトロフェニル）ベンゾオキサゾールと３７．５８ｇ（０．１６７モル）のＳｎＣｌ２．２Ｈ２Ｏの混合物の２００ｍｌエタノール溶液を、反応が完全に終わるまで７０℃に加熱した。
混合物を周囲温度に冷却した後、溶液を氷を含むビーカーに注入した。酢酸エチルで水相を抽出する前に、ｐＨは重炭酸ナトリウムＮａＨＣＯ３水溶液（５％）の添加によって、わずかに塩基性のｐＨ（ｐＨ７−８）に合わせた。
このように得られた水相は、慎重にブライン（飽和ＮａＣｌ水溶液）で洗い、硫酸ナトリウムを使用して乾燥し、それにより４．７２ｇのＯＦ１０Ｃ（茶黄色の固体）を収率６７％で得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 6.20 (2H, broad s, Ar-NH2), 6.78 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 6.81 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.31 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.32 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.34 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.58 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.72 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 8.08 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H).
m. p.: 100-104°C.
【００５６】
２ 2-（グリシル-2'-アミドフェニル）ベンゾオキサゾール（基質３）の合成
２．１ 混合酸無水物法
質量１．４０ｇ（０．００８モル）のN-t-Ｂｏｃ-Ｇｌｙを１０ｍｌのドライ・テトラヒドロフランに溶解し、ＣａＣｌ２トラップを丸底フラスコの首に、それを不透過性にするために付けた。混合物を磁気的に撹拌し、ＮａＣｌ塩を混ぜた冷凍アイスの槽を使用して−１５℃まで温度を下げた。
この温度に到達したならば、混合物は更に５分間撹拌された。次の工程を実施する前に、温度が−１５℃に降下したことを確認するために十分な注意を払いながら、１．０１ｇ（０．０１０モル）のN-メチルモルホリンを次に加えた。
次に、１．０９ｇ（０．００８モル）のイソクロロブチル・ホルマートは、次に最大の注意を払いながら滴下で加えた； 混合物は、加えられる各滴下によって予想通りに濁った。
数分後に、質量１．２６ｇ（０．００６モル）の 2-（2'-アミノフェニル）ベンゾオキサゾールを極少量のドライＴＨＦに溶解し、混合物に加えた。２時間後に氷浴を取り除き、混合物をオーバーナイトで撹拌した。
溶液をろ過し、丸底フラスコを通常のＴＨＦでリンスし、ろ液を保存した。ほんのわずかな沈殿物が存在した。溶液を、パスツールピペットを使用して、氷と水と炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）を含む４００ｍｌビーカーに移した。次に溶液を、透明溶液を得るまで２時間撹拌した。溶液は小さいブフナー漏斗でろ過し、次にそれを再結晶化するためにメタノール中に溶解した。
質量０．９８ｇのＯＦ２７Ａ（白色の粉末）は、４５%の収率で得られた。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ = 1.47 (9H, s, C-CH3x3), 4.05 (1H, d, J = 8 Hz, -NH-CH2), 4.17 (2H, d, J = 8 Hz, CO-CH2-NH), 5.38 (1H, broad s, Ar-NH-), 7.20 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.40 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.50 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.60 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.80 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.85 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 8.25 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 8.85 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H).
【００５７】
２．２ 脱保護
脱保護される化合物の質量０．２５ｇ（０．０００６８モル）を、ＣａＣｌ２トラップを付けた丸底フラスコに入れ、７ｍｌのトリフルオロ酢酸を加えた。混合物をオーバーナイトで撹拌した。
ＴＦＡを蒸発させ、それによりトリフルオロ酢酸塩の形態の０．２９ｇのＯＦ３０Ｂを８６％の収率で、ベージュ色の粉末を得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H NMR (270 MHz, DMSO): δ = 4.05 (2H, d, J = 8 Hz, CH2-NH3), 4.90 (3H, broad s, NH3), 7.40 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.46 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.50 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.70 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.85 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 8.20 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H) 8.25 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 8.40 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H).
ESI-MS: C15H15N3O2+ requires m/z 269.77 [M + H]+, 226.96 [M + H]- High-resolution M.S.E.I. for C15H15N3O2+. Calculated mass of molecular ion 268.1081 [M + H]+. Measured mass: 268.1083 [M + H]+.
m. p.: 219-222°C.
【００５８】
・「ＸはＮＸ１-ＣＯである」
１ 2-（2'-アミノ-5'-クロロフェニル）キノキサゾル-4-ワンの合成
１．１ 1,2-ジヒドロ-2-（2'-ニトロ- 5'-クロロフェニル）キノキサゾリン-4-ワン（参照：VLS 276）の合成
質量２．３１ｇ（０．０１７モル）の2-アミノベンズアミドと３．１４ｇ（０．０１７モル）の3-クロロ-6-ニトロベンズアルデヒドをエタノール中で１時間還流した。次に混合物を冷却し、得られたオレンジ色の結晶は集めて、減圧下のデシケータで乾燥した。質量３．９７ｇの薄オレンジ色の結晶が収率７６％で得られ、測定された融点は２３４−２３６℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR:(DMSO) δ 6.35 (1H, t, J=2 Hz, CH), 6.70 (1H, d, J=1 Hz, Ph-H(8H)), 6.80 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (6H)), 7.05 (1H, s (broad), NH), 7.25 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (7H)), 7.65 (1H, d,d, J=6 Hz, J=1.5 Hz, Ph-H (5H)), 7.75 (1H, d,d, J=9 Hz, J=3 Hz, Ph-H (4’H)), 7.85 (1H, d, J=3 Hz, Ph-H (6’H)), 8.15 (1H, d, J=9 Hz, Ph-H (3’H)), 8.30 (1H, d (broad), NH-CO), High-resolution M.S.E.I for C14H10ClN3O3 Calculated mass of molecular ion 304.0483 (M+H)+. Measured mass: 304.0482
υmax cm-1 1661 (C=ONH), 1564 (NO2), 1358 (NO2), 1602 (C=N), 774 (C-Cl).
【００５９】
１．２ 2-（2'-ニトロ- 5'-クロロフェニル）キノキサゾリン-4-ワン（参照：VLS 278）の酸化
質量９．１０ｇ（０．０３モル）の2-（2'-ニトロ- 5'-クロロフェニル）キノキサゾリン-4-ワンを４０ｍｌの無水アセトンに溶解し、４．７４ｇ（０．０３モル）の過マンガン酸カリウムの無水アセトン溶液で処理した。この溶液は、周囲温度で２−３時間にわたって混合物に滴下された。次に、反応はオーバーナイトで撹拌したままにした。過剰なＫＭｎＯ４は、固体の亜硫酸水素ナトリウムを過剰に加えることによって除去した。次に、溶液をろ過し、蒸発させた。質量２．２６ｇのペールホワイト色の粉末が、収率２５％で得られ、測定された融点は２７６−２７８℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C14H8ClN3O3 Calculated mass of molecular ion 302.0327 (M+H)+. Measured mass: 304.0327 .1H-NMR:(DMSO) δ 7.55 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (7H)), 7.65 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H (4’H)), 7.85 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (6H)), 7.90 (1H, d,d, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H (5H)), 8.05 (1H, d, J=2 Hz, Ph-H (6’H), 8.25 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H (3’H). υmax cm-1 3132 (NH2), 3070 (NH2), 1578 (NO2), 1368 (NO2), 1603 (NH), 1660 (CONH), 1531 (C=N), 772 (C-Cl).
【００６０】
１．３ 2-（2' -アミノ-5' -クロロフェニル）キノキサゾル-4-ワンの合成−化合物VLS 278の還元（VLS 285）
質量４．９６ｇ（０．０２８モル）のＳｎＣｌ２.２Ｈ２Ｏを、４０ｍｌのＨＣｌと５ｍｌの氷酢酸の混合物に溶解した。溶液は１２０℃で還流され、１．３４ｇ（０．００４４モル）の化合物ＶＬ２７８を小分けにして加えた。混合物は３０分間１２０℃に保たれ、次に２−３時間１００℃に下げた。黄色の固体を得て、ろ過により回収し、水に溶解し、４ＭのＮａＯＨ溶液を加えることによってアルカリ化した。淡黄色の沈殿物を収集して、減圧下のデシケータで乾燥させた。質量１．１７ｇの黄色の粉末が、収率９８％で得られ、測定された融点は２８６−２８８℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR:(DMSO) δ 6.80 (1H, d, J= 8.6 Hz, Ph-H (3’H)), 7.20 (1H, d,d, J=8.6 Hz, J=1 Hz, Ph-H), 7.30 (1H, s (broad), NH), 7.45 (1H, t, J=8 Hz Ph-H), 7.70 (1H, d J=7 Hz, Ph-H), 7.75 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H), 7.90 (1H, d J=2 Hz, Ph-H (6’H), 8.10 (1H, d,d, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H).
υmax cm-1 3465 (NH2), 3278 (NH2), 1674 (CO), 1582 (NH), 1560 (C=N), 1159 (C-N), 766 (C-Cl).
【００６１】
２ 2-（Ｌ-アラニル-2'-アミド-5'-クロロフェニル）キノキサゾル-4-ワンの合成（基質２１）
２．１ 混合酸無水物法（VLS 286 rep）
質量０．５０ｇ（０．００２モル）のt-Boc-L-Alaは、１０ｍｌの無水ＴＨＦ中に溶解された。温度を１５℃にし、０．３４ｇ（０．００３２モル）のＮＭＭ（N-メチルモルホリン）を１分間にわたって加え、つづいて０．３６ｇ（０．００２６６モル）のＩＢＣＦ（イソブチルクロロホルメート）を更に同じ温度で加えた。この添加後、混合物を５−１０分間撹拌し、次に極少量（すなわち５ｍｌ）の無水ＴＨＦに溶解した０．５５ｇ（０．００２モル）の2-（2' -アミノ-5'-クロロフェニル）キノキサゾル-4-ワンを同じ温度で２分間にわたって滴下で加えた。混合物は、２−３時間の氷浴に供され、次にオーバーナイトで周囲温度に置かれた。混合物は、次にＮＭＭ塩を除去するためにろ過され、ろ液の体積は、水と炭酸ナトリウムとを含むビーカーに注ぐために減らされた。黄色の固体を回収し、エタノールで再結晶化した。質量０．４３ｇの黄色の粉末を収率５０％で得て、測定された融点は２６８−２７０℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR:(DMSO) δ 1.20 (9H, s, (CH3)3C), 1.18 (1H, s (broad), NHCO), 1.40 (1H, d, J=7 Hz, CH3), 1.37 (1H, d, J=2 Hz, NH), 4.05 (1H, quartet, J=7 Hz, alaH), 7.25 (1H, t, J=7 Hz, NH-CO(CH3)3), 7.3-7.42 (2H, m, Ph-H), 7.55 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H), 7.65 (1H, d, Ph-H (3’ H)), 8.00 (1H, d, J=7 Hz, Ph-H (4’H)), 8.60 (1H, d, J=2 Hz, Ph-H), 8.65 (1H, s, Ph-H (6’H)). υmax cm-1 1668 (CONH), 1608 (NH), 1560 (C=N), 1169 (C-N), 722 (C-Cl).
【００６２】
２．２ 脱保護（参照：VLS 289）
2-（2'-アミノ-5-クロロフェニル）キノキサゾル-4-ワンのt-Boc-L-Ala誘導体は、トリフルオロ酢酸を加えることによって脱保護した。質量０．３０ｇ（０．０００７モル）の2-（t-Boc-L-Ala-2'-アミド-5-クロロフェニル）キノキサゾル-4-ワンと５ｍｌのトリフルオロ酢酸の混合物を、周囲温度でオーバーナイトで混合した。過剰なＴＦＡを蒸発させ、したがって得られた茶色の固体は減圧下でデシケータを使用して乾燥した。質量０．２６ｇ（０．０００５７モル）のオレンジ茶色の固体が、収率８１％で得られ、測定された融点は２６８−２７０℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR:(DMSO) δ 1.40 (3H, d, CH3), 3.40 (1H, quartet, H-ala), 7.55 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H), 7.67 (1H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H), 7.71 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H), 7.83 (1H, m, Ph-H), 7.90 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H), 8.20 (1H, d,d, J=8 Hz, J=1 Hz, Ph-H), 8.30 (2H, s (broad), NH2), 10.92 (1H, s (broad), NHCO). υma cm-1 1667 (CONH), 1605 (NH), 1560 (C=N), 1435 (CH3), 1181 (C-N), 770 (C-Cl).
【００６３】
・「ＸはＮＸ１である」
１ 2-（2' -アミノ-4',5'-シクロメチレンジオキシフェニル）-3- フェネチルベンズイミダゾール（または2-（2' -アミノ-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3- フェニルエチルベンズイミダゾール）の合成
１．１ 2-（2'-ニトロ-4',5'-シクロメチレンジオキシフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール（または2-（2'-ニトロ-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3 -フェニルエチルベンズイミダゾール）の合成
１．１．１ N-フェニルエチル-2-ニトロアニリン（参照：VLS 209）
質量４．８ｇ（０．０４モル）の2-フェニルエチルアミンを周囲温度で、５．６ｇ（０．０４モル）の2-フルオロニトロベンゼンと１１．０６ｇ（０．０８モル）の無水炭酸カリウムの３０ｍｌのＤＭＳＯ溶液混合物に滴下した。混合物は、３時間１００℃に加熱した。混合物は次に周囲温度に冷却して、１００ｍｌの水に加えられ、それにより薄オレンジ色の化合物の沈殿となった。固体を濾過によって回収し、減圧下でデシケータを使用して乾燥した。質量９．４ｇのオレンジ色の結晶を収率９８％で得た。求められた融点は理論値（すなわち６４−６６℃）と一致した。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR: (CDCl3) δ 3.00 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), δ 3.55 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), δ 6.65 (1H, m, Ph-H), δ 6.85 (1H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H), δ 7.20-7.50 (6H, m, Ph-H), δ 8.10 (1H, s (broad), NH), δ 8.20 (1H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H).
【００６４】
１．１．２ N-フェニルエチル-1,2-ジアミノベンゼン（参照：VLS 210）
０．３８ｇ（０．０１モル）の水素化ホウ素ナトリウムの溶液を、０．５２ｇ（０．００２モル）のアセチルアセトン銅のエタノール懸濁液に、周囲温度、窒素下で磁気的に撹拌しながら加えた。２．４２ｇ（０．０１モル）のニトロ化合物ＶＬＳ２０９のエタノール溶液をこの溶液に加え、つづいて０．７６ｇ（０．０２モル）の水素化ホウ素ナトリウムのエタノール溶液を加えた。混合物は、周囲温度で窒素下でオーバーナイトで撹拌された。次に混合物は過剰なエタノールを取り除くために濃縮し、水を加えた。次に抽出工程を２×２０ｍｌのＤＣＭで実施し、有機相は水で複数回洗い、炭酸カリウムを使用して乾燥し、回転蒸発装置で濃縮した。質量１．６９ｇの黒ずんだ油状の液体であって、続いて固体化されたものを収率８０％で得た。求められた融点は理論値（すなわち４２−４４℃）と一致した。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR: (CDCl3) δ 2.95 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), δ 3.27 (2H, s (broad), NH2), δ 3.38 (2H, t, J=7 Hz, -CH2), δ 6.69 (3H, m, Ph-H), δ 6.82 (1H, m, Ph-H), δ 7.10-7.40 (5H, m, Ph-H).
【００６５】
１．１．３ 2-（2'-ニトロ-4',5'-シクロメチレンジオキシフェニル）-3-フェネチルベンズイミダゾール（参照：VLS 213）（または2-（2'-ニトロ-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール）
８．６０ｇ（０．０１４モル）のオキソン（モノ過硫酸カリウム）を、５．０８ｇ（０．０２４モル）のN-フェニルエチル-1,2-ジアミノベンゼンと４．８ｇ（０．０２４モル）の6-ニトロピペロナールの２５ｍｌＤＭＦ溶液と１ｍｌの水の溶液に、周囲温度で１５分間にわたって磁気的に撹拌しながら加えた。反応が発熱性だったので、混合物を水の槽で冷却し、オーバーナイトで撹拌しておいた。次に水を混合物に加え、ＤＣＭで２回連続した抽出を実行した。混合した有機相を複数回水によって洗い、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、それにより黄／茶色の粗生成物を得た。エタノールによる再結晶化を、化合物を精製するために実行した。質量６．１９ｇの茶色の結晶を収率６７％で得て、測定された融点は１６２−１６４℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C22H17N3O4 Calculated mass of molecular ion 388.1292 (M+H)+. Measured mass: 388.1297 .1H-NMR: (CDCl3) δ 3.10 (2H, t, J=7 Hz,-CH2-), δ 4.20 (2H, t, J=7 Hz,-CH2-), δ 6.02 (1H, s, Ph-H), δ 6.18 (2H, s, O-CH2-O), δ 6.80 (2H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H), δ 7.10-7.40 (5H, m, Ph-H), δ 7.48 (1H, m, Ph-H), δ 7.65 (1H, s, Ph-H), δ 7.80 (1H, m, Ph-H).
υmax cm-1 1364 (NO2), 1523 (NO2), 1610 (C=N), 1152 (C-N), 1207 (C-N), 1089 (C-O), 1473 (C-H), 728 (-CH2).
【００６６】
１．２ 2-（2'-アミノ-4',5'-シクロ・メチレンジオキシフェニル）-3 - フェニルエチルベンズイミダゾール（または2-（2'-アミノ-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3- フェニルエチルベンズイミダゾール）
０．１１ｇ（０．００３モル）の水素化ホウ素ナトリウムの溶液を、０．１６ｇ（０．０００６モル）のアセチルアセトン銅のエタノール懸濁液に、周囲温度、窒素下で加えた。１．０７ｇ（０．００３モル）のニトロ化合物ＶＬＳ２１３のエタノール溶液を加え、続いて０．２３ｇ（０．００６モル）の水素化ホウ素ナトリウムのエタノール溶液に加えた。混合物は、周囲温度、窒素下、オーバーナイトで撹拌した。次に混合物は過剰なエタノールを取り除くために濃縮され、水を加えた。次に抽出を２×２０ｍｌのＤＣＭで実施し、有機相は水で複数回洗い、乾燥し（Ｋ２ＣＯ３）、回転蒸発装置で濃縮した。質量０．９２ｇの茶色の粉末が収率８７％が得られ、測定された融点は１７０−１７２℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C22H19N3O2 Calculated mass of molecular ion 358.1550 (M+H)+. Measured mass: 358.1550
1H-NMR: (CDCl3) δ 3.00 (2H, t, J=7 Hz -CH2-), δ 4.40 (2H, t, J=7 Hz, -CH2), δ 6.00 (2H, s, O-CH2-O), δ 6.35 (1H, s, Ph-H (6’H), δ 6.50 (1H, s, Ph-H (3’ H)), δ 7.00 (2H, m, Ph-H), δ 7.20-7.40 (5H, m, Ph-H), δ 7.55 (1H, m, Ph-H), δ 7.85 (1H, m, Ph-H).
υmax cm-1 3434 (N-H), 3350 (N-H), 1618 (C=N), 1219 (C-O), 1037 (C-N), 1157 (C-N), 1495 (Ar), 1473 (Ar), 1521 (Ar), 728 (-CH2-).
【００６７】
２ 2-（L-アラニル-2' -アミド-4',5'-シクロ・メチレンジオキシフェニル）-3-フェネチルベンズイミダゾール（基質１６）（または2-（L-アラニル-2' -アミド-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール）
質量０．５０ｇ（０．００２６モル）のt-Boc-L-アラニンを１０ｍｌの無水ＤＣＭに溶解し、０．５４ｇ（０．００２６モル）のジシクロヘキシルカルボジイミドをこの溶液に撹拌しながら加え、つづいて０．３５ｇ（０．００２６モル）のヒドロキシベンゾトリアゾールを加えた。混合物は４５分間、周囲温度で撹拌したままにし、次に０．６５ｇ（０．００１９モル）の2-（2'-アミノ-4',5'-メチレンジオキソランフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール（または2-（2'-アミノ-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール）を加え、オーバーナイトで反応を続けた。次の日、混合物をセリットによりろ過し、溶媒を蒸発させ、次に結果として生じる液体を水/氷混合物に注入した。このようにして形成された油状の沈殿物を酢酸エチルに溶解し、ＮａＨＣＯ３の１０％溶液で複数回洗い、次に水で洗った。有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮した。このように得られた茶色の固体は、酢酸エチルのＨＣｌの飽和溶液を加えることによって脱保護した。沈殿物は、Ｎａ２ＣＯ３の飽和水溶液と１０ｍｌのＤＣＭにより撹拌した。有機相を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、次に濃縮した。質量０．３７ｇの茶色の固体を収率３８％で得て、測定された融点は８０−８２℃であった。
化合物はカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）で精製し、黄/茶色の固体を得た。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
1H-NMR: (CDCl3) δ 1.30 (3H, d, J=6 Hz, ala CH3), 1.50 (2H, s (broad), NH2), 3.07 (2H, t, J=7 Hz, CH2), 3.40 (1H, quartet, ala H), 4.45 (2H, t , J=7 Hz, CH2), 6.04 (2H, s, CH2O2), 6.58 (1H, s, Ph-H (6’H)), 6.85 (2H, m, Ph-H (6H,7H)), 7.15 (3H, m, Ph-H), 7.35 (2H, d,d, Ph-H (5H, 8H)), 8.10 (1H, s, Ph-H (3’H)) , υmax cm-11667 (C=O), 1622 (C=N), 1239 (C-O), 1152 (C-N), 728 (-CH2-).
【００６８】
３ 2-（L-アラニル-2'-アミドフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール（基質１４、= VLS237）の合成
2-（2'-ニトロフェニル）-3- フェニルエチルベンズイミダゾール：この基質は、2-（2'-ニトロ-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3- フェニルエチルベンズイミダゾールの合成に類似した方法で合成した。収率７８％の白色の結晶が得られ、測定された融点は１２８−１３０℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C21H17N3O2. Calculated mass of molecular ion 344.1394 (M+H)+. Measured mass: 344.1394. 1H-NMR: (CDCl3) δ 3.07 (2H, t, J=6.93 Hz, -CH2-), 4.20 (2H, t, J=6.93 Hz, -CH2-N), 6.79 (2H, dd, J=7.67 and 1.24 Hz, Ph-H), 6.85 (1H, dd, J=7.42 and 1.73 Hz, Ph-H), 7.17 (3H, m, Ph-H), 7.36 (2H, m, Ph-H), 7.47 (1H, m, Ph-H), 7.53 (1H, t, J=7.42 Hz, Ph-H), 7.63 (1H, t, J=7.92 Hz, Ph-H), 7.81 (1H, m, Ph-H), 8.17 (1H, dd, J=8.16 and 1.48 Hz, Ph-H). IR: υmax cm-1 1520 (NO2), 1358 (NO2), 1454 (C=N), 1155 (C-N), 746 (-CH2-).
2-（2' -アミノフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール：この基質は、2-（2'-アミノ-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾールの合成に類似した方法で合成された（２６頁、２８行目）。収率７７％の茶色の粉末が得られ、測定された融点は１３０−１３２℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C21H19N3. Calculated mass of molecular ion 314.1652 (M+H)+. Measured mass: 314.1652. 1H-NMR: (CDCl3) δ 3.10 (2H, t, J=7.92 Hz, -CH2-), δ 4.40 (2H, t, J=7.92 Hz, -CH2-), δ 4.65 (2H, s (broad), NH2), δ 6.80-7.90 (13H, m, Ph-H) IR: υmax cm-1 3417 (-NH2), 3400 (NH2), 1616 (C=N), 1484 (C-H), 1454 (C-H), 1155 (C-N), 733 (CH2), 698 (CH2), 1591 (Ph), 1484 (Ph).
2-（L-アラニル-2' -アミドフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール：この基質は、2-（L-アラニル-2'-アミド-4',5'-メチレンジオキシフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾールの合成に類似した方法で合成された（２９頁、８行目）。収率５８％の黄／茶色の粉末が得られ、測定された融点は８０−８２℃であった。
ＮＭＲによって得られたデータを下に示す：
High-resolution M.S.E.I for C25H24N4O3. Calculated mass of molecular ion 429.1921 (M+H)+.Measured mass: 429.1926. 1H-NMR: (CDCl3) δ 1.30 (3H, d, J=6 Hz, ala CH3), 1.50 (2H, s (broad), NH2), 3.07 (2H, t, J=7 Hz, CH2), 3.40 (1H, q, J=6 Hz, ala-H), 4.45 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), 6.04 (2H, s, -CH2O2-), 6.58 (1H, s, C6'-H), 6.85 (2H, m, C6-H, and C7-H), 7.15 (3H, m, Ph-H), 7.35 (2H, dd, J=7 Hz, J=2 Hz, C5-H, C8-H), 8.10 (1H, s, N-H) , IR υmax cm-1 2918 (-CH2-), 2850 (CH3), 1675 (C=O),1625 (NH2), 1622 (C=N), 1152 (C-N), 749 (-CH2-), 1476 (Ar), 1455 (Ar), 1034 (C-N), 1365 (CH3).
【００６９】
実施例２−ペプチダーゼ活性を検出するための本発明に係る式Ｉの基質の使用
ａ）基質の合成
・基質Ｎｏ．１−2-（L-アラニル-2'-アミドフェニル）ベンゾオキサゾール −VLS206
・基質Ｎｏ．２−2-（β-アラニル-2'-アミドフェニル）ベンゾオキサゾール −OF22A
・基質Ｎｏ．３−2-（グリシル-2'-アミドフェニル）ベンゾオキサゾール −OF30B
・基質Ｎｏ．４−2-（L-アラニル-2'-アミドフェニル）-5-クロロベンゾオキサゾール ― 35
・基質Ｎｏ．１１−2-（β-アラニル-2'-アミド-4',5'-ジメトキシフェニル）ベンゾオキサゾール −OF24A
・基質Ｎｏ．１２−2-（L-アラニル-2'-アミドフェニル）ベンゾチアゾール −OF38A
・基質Ｎｏ．１８−2-（β-アラニル-2'-アミドフェニル）ベンゾチアゾール −OF33A
・基質Ｎｏ．１９−2-（L-アラニル-2'-アミド-5'-クロロフェニル）ベンゾチアゾール
・基質Ｎｏ．１６−2-（L-アラニル-2'-アミド-4',5'-メチレンジオキソラン）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール（または2-（L-アラニル-2'-アミド-4',5'-メチレンジオキシフェニル）
・基質Ｎｏ．１４−2-（L-アラニル-2'-アミドフェニル）-3-フェニルエチルベンズイミダゾール（= VLS237）
・基質Ｎｏ．１、２、４及び１１は、実施例１の2-（グリシル-2'-アミドフェニル）ベンゾオキサゾール（基質Ｎｏ．３）の合成に類似した方法で合成された。
同様に、基質Ｎｏ．１７と１８は、実施例１の2-（L-アラニル-2'-アミド-5'-クロロフェニル）ベンゾチアゾール（基質Ｎｏ．１９）の合成に類似した方法で合成された。
【００７０】
ｂ）培地の調製
４０ｍｇの各基質は、４ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解する。この溶液は、前もってオートクレーブされた４００ｍｌのコロンビア寒天にすっかり混ぜられ、５０℃に溶解して保たれる。従って、各基質の最終濃度は、１００ｍｇ／ｌである。各々の培地を、９０ｍｍシャーレに、シャーレつき２０ｍｌの割合で分配する。
ｃ）接種とインキュベーション
コレクションに由来する、バクテリアと酵母のさまざまな種類に属する１８の微生物菌株は、１０μｌの１／２０に希釈された０．５マクファーランドの懸濁液の半定量的隔離によって、これらの培地に接種される。培地は３７℃で２４時間インキュベートされ、次に形成されたコロニーは３６０−３６５ｎｍのＵＶ照射下で視覚的に調べられる。
ｄ） 結果の記録
得られた結果を表２と表３に示す。
【００７１】
表２
表２のつづき
【００７２】
表３
【００７３】
7-アミノ-4-メチルクマリン（ＡＭＣ）（例えばL-アラニン-7-AMC）に基づく基質で観察されることとは反対に、試験された本発明に係る全ての基質では、蛍光はコロニーのみに、又はすぐ近辺に局在化していた。
基質１、２及び３の場合、それらはＰが異なるだけだが（それぞれL-アラニン、β-アラニンとグリシン）、同じ菌株によって生産される蛍光の強度および／または色は異なっていた。基質１では、全てのグラム陰性菌の菌株（ブルクホルデリア・セパシア 菌株を除いて）は、強い青色蛍光を生じた。２つのエンテロコッカス菌株は弱い青色蛍光を生じ、２つの黄色ブドウ球菌菌株は中程度の緑色蛍光を生じた。一方で、B. セパシア菌株は基質３では中程度の青色蛍光を生じ、基質２では緑色蛍光を生じた。
また、これらの結果は、Ｐが一定であるが、Ｘ及び／又はＲ２が変化する場合、蛍光の色、その強度及び毒性が変化したことを示した。これは、基質１、４、１７及び１９の間で事実であった。したがって、基質４では、緑膿菌（シュードモナス・アエルギノーサ）の菌株は弱い青紫色蛍光を生じ、S.アウレウス菌株では蛍光は検出されなかった。基質１７は全てのグラム陽性の菌株と酵母を阻害し、基質１９では緑膿菌の菌株は陰性だった。
同様に、Ｐがβ−アラニンである基質２、１１及び１８の間では、蛍光の色（放出波長で）、強度と毒性において、大きな違いがあった。
【００７４】
ｅ） 結論
所望の適用に応じて、Ｐ、Ｘ、Ｒ２またはＲ１は決められるべきである。
例えば、基質１（2-（L-アラニル-2'-アミドフェニル）ベンゾオキサゾール）は、グラム陰性菌（強い青色蛍光）と酵母とグラム陰性菌との間、および後者２つの間で、他からエンテロコッカス属（弱い青色蛍光）とS.アウレウス（中程度の緑色蛍光）を区別できる。また、基質３は、他の微生物からグラム陰性菌（青色蛍光）を区別することを可能にする。
基質１９は、他の微生物から特定の腸内細菌（大腸菌、サルモネラ属、エンテロバクター属、モルガネラ属とプロビデンシア属）を区別することを可能にする。
他の置換基、特に他のペプチドの使用は、微生物の他の群を分離することを可能にすることができる。Ｘ、Ｒ１及びＲ２基に応じて、蛍光の色と強度の両方、微生物群の検出の感受性または特異性、さらには毒性を変化させることが可能である。特に他の酵素基質と組合せる場合に、これらのバリエーションは非常に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
［式中、
・ＸはＳ；ＮＸ１；Ｏ；またはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｒ１は無し、あるいはＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＨまたはアルキル基、アリール基またはカルボキシル基の置換基の一つであり；
・Ｒ２は無し、あるいはＣｌ;Ｏ-ＣＨ２-Ｏ;Ｏ-ＣＨ３;Ｆ、ジエチレンジアミン-ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリールまたはカルボキシル基、ＮＯ２、または
の置換基の一つであり；
・Ｘ１は、Ｈ、Ｃ２Ｈ４Ｐｈ、ＯＨ、アルキル基及びアリール基から選択され；
・Ｒ３及びＲ４は、独立にＨ又は１から４の炭素原子を含むアルキル基であり；
・Ｐはペプチドである］
の、ペプチダーゼ活性を検出するための酵素基質。
【請求項２】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ ＸはＯであり；
・ Ｒ１とＲ２は無し;
・ Ｐはペプチドである、
酵素基質。
【請求項３】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＯであり；
・Ｒ１はＣｌであり;
・Ｒ２は無し；
・Ｐはペプチドである、
酵素基質。
【請求項４】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＳであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２は無し;
・Ｐはペプチドである、
酵素基質。
【請求項５】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＳであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２はＣｌであり;
・Ｐはペプチドである、
酵素基質。
【請求項６】
請求項１から５の何れか一項に記載の少なくとも一つの酵素基質を含む、反応培地。
【請求項７】
請求項１から５の何れか一項に記載の少なくとも一つの酵素基質を含む、微生物検出および／または同定培地。
【請求項８】
請求項７に記載の検出培地であって、更に請求項１から５の何れか一項に記載の基質によって検出されるものとは異なる酵素活性に特異的な少なくとも一つの酵素基質を含む、検出培地。
【請求項９】
請求項７または８に記載の検出培地であって、更に請求項１から５の何れか一項に記載の基質によって検出される酵素活性に特異的な少なくとも一つの酵素基質を含む、検出培地。
【請求項１０】
微生物の少なくとも一つのペプチダーゼ活性を検出するための、請求項１から５の何れか一項に記載の酵素基質又は請求項７から９の何れか一項に記載の検出および／または同定培地の使用。
【請求項１１】
グラム陽性菌をグラム陰性菌から分離するための、請求項１から５の何れか一項に記載の酵素基質又は請求項７から９の何れか一項に記載の検出および／または同定培地の使用。
【請求項１２】
微生物の少なくとも一つのペプチダーゼ活性を検出する方法であって、
ａ）請求項７から９の何れか一項に記載の検出及び／又は同定培地を用意すること、
ｂ）培地に試験される生物試料を接種すること、
ｃ）これをインキュベートすること、
ｄ）少なくとも１つのペプチダーゼ活性の存在を明らかにする工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
バクテリアをグラム陽性菌に属するか又はグラム陰性菌に属するかの点から区別する方法であって、
ａ）請求項７から９の何れか一項に記載の検出及び／又は同定培地を用意すること、
ｂ）培地に試験される生物試料を接種すること、
ｃ）これをインキュベートすること、
ｄ）少なくとも１つのペプチダーゼ活性の存在を明らかにする工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１】
式（Ｉ）
［式中、
・ＸはＳ；ＮＸ１；Ｏ；またはＮＸ１-ＣＯであり；
・Ｒ１は無し、あるいはＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＯＨまたはアルキル基、アリール基またはカルボキシル基の置換基の一つであり；
・Ｒ２は無し、あるいはＣｌ;Ｏ-ＣＨ２-Ｏ;Ｏ-ＣＨ３;Ｆ、ジエチレンジアミン-ＣＨ３、ＮＲ３Ｒ４、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリールまたはカルボキシル基、ＮＯ２、または
の置換基の一つであり；
・Ｘ１は、Ｈ、Ｃ２Ｈ４Ｐｈ、ＯＨ、アルキル基及びアリール基から選択され；
・Ｒ３及びＲ４は、独立にＨ又は１から４の炭素原子を含むアルキル基であり；
・Ｐはペプチドである］
の、ペプチダーゼ活性を検出するための酵素基質。
【請求項２】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ ＸはＯであり；
・ Ｒ１とＲ２は無し;
・ Ｐはペプチドである、
酵素基質。
【請求項３】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＯであり；
・Ｒ１はＣｌであり;
・Ｒ２は無し；
・Ｐはペプチドである、
酵素基質。
【請求項４】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＳであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２は無し;
・Ｐはペプチドである、
酵素基質。
【請求項５】
請求項１に記載の酵素基質であって、
式中
・ＸはＳであり;
・Ｒ１は無し;
・Ｒ２はＣｌであり;
・Ｐはペプチドである、
酵素基質。
【請求項６】
請求項１から５の何れか一項に記載の少なくとも一つの酵素基質を含む、反応培地。
【請求項７】
請求項１から５の何れか一項に記載の少なくとも一つの酵素基質を含む、微生物検出および／または同定培地。
【請求項８】
請求項７に記載の検出培地であって、更に請求項１から５の何れか一項に記載の基質によって検出されるものとは異なる酵素活性に特異的な少なくとも一つの酵素基質を含む、検出培地。
【請求項９】
請求項７または８に記載の検出培地であって、更に請求項１から５の何れか一項に記載の基質によって検出される酵素活性に特異的な少なくとも一つの酵素基質を含む、検出培地。
【請求項１０】
微生物の少なくとも一つのペプチダーゼ活性を検出するための、請求項１から５の何れか一項に記載の酵素基質又は請求項７から９の何れか一項に記載の検出および／または同定培地の使用。
【請求項１１】
グラム陽性菌をグラム陰性菌から分離するための、請求項１から５の何れか一項に記載の酵素基質又は請求項７から９の何れか一項に記載の検出および／または同定培地の使用。
【請求項１２】
微生物の少なくとも一つのペプチダーゼ活性を検出する方法であって、
ａ）請求項７から９の何れか一項に記載の検出及び／又は同定培地を用意すること、
ｂ）培地に試験される生物試料を接種すること、
ｃ）これをインキュベートすること、
ｄ）少なくとも１つのペプチダーゼ活性の存在を明らかにする工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
バクテリアをグラム陽性菌に属するか又はグラム陰性菌に属するかの点から区別する方法であって、
ａ）請求項７から９の何れか一項に記載の検出及び／又は同定培地を用意すること、
ｂ）培地に試験される生物試料を接種すること、
ｃ）これをインキュベートすること、
ｄ）少なくとも１つのペプチダーゼ活性の存在を明らかにする工程
を含むことを特徴とする方法。
【公表番号】特表２０１０−５２８０９５（Ｐ２０１０−５２８０９５Ａ）
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０９８７５（Ｐ２０１０−５０９８７５）
【出願日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／０５０９３６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５２３０６
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／０５０９３６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５２３０６
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]