新規マンノシルエリスリトールリピッド及びその製造方法
【課題】
生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、従来のマンノシルエリスリトールリピッドにはみられない界面活性作用を有する、新規構造のマンノシルエリスリトールリピッドを提供する。
【課題を解決するための手段】
次の式（１）で表されるマンノシルエリスリトールリピッド。
【化１】
（式中、Ｒ１は、同一でも異なっていてもよい炭素数６〜２０の脂肪族アシル基であり、Ｒ２は水素又はアセチル基、Ｒ３は水素又は炭素数６〜２０の脂肪族アシル基を表す。）
生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、従来のマンノシルエリスリトールリピッドにはみられない界面活性作用を有する、新規構造のマンノシルエリスリトールリピッドを提供する。
【課題を解決するための手段】
次の式（１）で表されるマンノシルエリスリトールリピッド。
【化１】
（式中、Ｒ１は、同一でも異なっていてもよい炭素数６〜２０の脂肪族アシル基であり、Ｒ２は水素又はアセチル基、Ｒ３は水素又は炭素数６〜２０の脂肪族アシル基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンノースとエリスリトールを構成要素とするマンノシルエリスリトールリピッドにおいて、エリスリトール部分に脂肪酸が結合した新規マンノシルエリスリトールリピッド及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖脂質は、脂質に１〜１０数個の単糖が結合した物質であり、生体内において細胞間の情報伝達に関与し、神経系・免疫系の機能維持にも重要な役割を果たしていること等が明らかにされつつある。一方で、糖脂質は、糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、このような性質を有する物質は界面活性物質と呼ばれている。石油化学工業が隆盛となるまでは、レシチン、サポニン等の生体成分由来の界面活性剤（バイオサーファクタント）を利用してきたが、石油化学工業の発展により合成界面活性剤が開発され、界面活性剤の生産量は飛躍的に増加し、日常生活には無くてはならない物質となった。しかしながら、その使用量の拡大につれて環境汚染が広がってきた。そこで、安全性が高く、環境に対する負荷を低減するために生分解性の高い界面活性物質の開発が望まれていた。
【０００３】
現在、微生物が生産する界面活性物質としては、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子化合物系の５つに分類されている。この内の糖脂質系の界面活性剤については、最もよく研究され、細菌及び酵母による多くの種類の物質が報告されている。
【０００４】
ラムノリピッドは、結核菌の抗生物質としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（シュードモナス アエルジノーサ）（緑膿菌）の培養液から最初に発見された（非特許文献１参照）。以来、これまでにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）属の細菌から４種類の同族体が報告され、当初は数ｇ／Ｌ程度の生産量であったが、現在では１００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている（非特許文献２参照）。
【０００５】
ソホロースリピッドは、Ｃａｎｄｉｄａ（以前はＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ） ｂｏｍｂｉｃｏｌａ（キャンデダ ボンビコーラ）の培養液から発見された（非特許文献３参照）。これ以外に、Ｃａｎｄｉｄａ ａｐｉｃｏｌａも生産し、脂肪酸の結合様式によりラクトン型と線状型の２種類が報告されている。現在では、３００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている（非特許文献４及び５参照）。
【０００６】
トレハロースリピッドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（コリネバクテリウム）等の細胞表層物質として発見された。類似の物質が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（マイコバクテリウム）、Ｎｏｃａｒｄｉａ（ノカルディア）、Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ（ロドコッカス）属細菌からも報告されている（非特許文献６参照）。一般に、細胞壁に結合しているために生産量は低いが、Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ロドコッカス エリスロポリス）を窒素制限下で培養を行うとサクシノイルトレハロースリピッドを３２ｇ／Ｌ生産することが報告されている（非特許文献７参照）。
【０００７】
マンノシルエリスリトールリピッドは、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｎｕｄａ（ウスチラゴ ヌーダ）とＳｈｉｚｏｎｅｌｌａ ｍｅｌａｎｏｇｒａｍｍａ（シゾネラ メラノグラマ）から発見された（非特許文献８及び９参照）。その後、イタコン酸生産の変異株であるＣａｎｄｉｄａ属酵母（特許文献１及び非特許文献１０参照）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ（キャンデダ アンダークチカ）（非特許文献１１及び１２参照）、Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ（クルツマノマイセス）属（非特許文献１３参照）等の酵母が生産することを報告している。現在では、長時間の連続培養・生産を行うことで３００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている。
【０００８】
セロビオースリピッドは、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ（ウスチラゴ マイディス）により１５ｇ／Ｌ（非特許文献１４及び１５参照）、オリゴ糖リピッドは、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ（ツカムレラ）属の酵母により３０ｇ／Ｌ生産される（非特許文献１６参照）ことが報告されている。
【０００９】
糖脂質等のバイオサーファクタントは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれている。このことから、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等にこれらのバイオサーファクタントを幅広く適用することは、持続可能社会の実現と高機能製品の提供という、両面を兼ね備えており極めて有意義である。
【００１０】
現在、一般的に用いられている合成界面活性剤の種類は、細かな構造の違いまで見ると数百、数千種類に上る。親水基・親油基の種類が異なるものから、それぞれのドメインの組成が同じでも分子量、立体構造の違いによって親水性疎水性バランス（ＨＬＢ）の異なる同族体など、ありとあらゆる化合物が開発されており、これらを単一種類で用いるだけでなく、数種混合して用いることで、上記のような幅広い産業分野において要求される性能に対応している。
【００１１】
したがって、これらのバイオサーファクタントの幅広い普及を図るためには、多くの種類のバイオサーファクタントが必要である。しかしながら、現在までに発見されているバイオサーファクタントの種類は２０数種類と少なく、新規な構造を有するバイオサーファクタントの発見が望まれている。さらに、構造・組成に多くのバリエーションを持たせ、これらを組み合わせて機能を緻密に制御することが極めて重要である。
【００１２】
【特許文献１】特公昭６０−２４７９７号公報
【非特許文献１】エフ．ジー．ジャービス（Ｆ．Ｇ．Ｊａｒｖｉｓ），エム．ジョンソン（Ｍ．Ｊｏｈｎｓｏｎ），「ジャーナル オブ ザ アメリカン ケミカル ソサイティ（Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」，７１巻，ｐ４１２４−４１２６（１９４９）．
【非特許文献２】エス．ラング（Ｓ．Ｌａｎｇ），ディ．ウルブラント（Ｄ．Ｗｕｌｌｂｒａｎｄｔ）「アプライド マイクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，５１巻，ｐ２２−３２（１９９９）．
【非特許文献３】ピー．エー．ゴーリン（Ｐ．Ａ．Ｇｏｒｉｎ），ジェイ．エフ．ティ．スペンサー（Ｊ．Ｆ．Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒ），エイ．ピー．ツロテェ（Ａ．Ｐ．Ｔｕｌｌｏｃｈ），「カナデアンジャーナル オブ ケミストリー（Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．）」，３９巻,ｐ８４６−８５５（１９６１）．
【非特許文献４】エイ．エム．ダビラ（Ａ．Ｍ．Ｄａｖｉｌａ），アール．マークバル（Ｒ．Ｍａｒｃｂａｌ），ジェイ．ピー．バンデカテーレ（Ｊ．−Ｐ．Ｖａｎｄｅｃａｔｅｅｌｅ），「アプライドマイクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，４７巻，ｐ４９６−５０１（１９９７）．
【非特許文献５】エイチ．ジェイ．ダニエル（Ｈ．−Ｊ．Ｄａｎｉｅｌ），エム．リュッシ（Ｍ．Ｒｅｕｓｓ），シー．シィルダック（Ｃ．Ｓｙｌｄａｔｋ），「バイテクノロジーレターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，２０巻，ｐ１１５３−１１５６（１９９８）．
【非特許文献６】エヌ．コサリック（Ｎ．Ｋｏｓａｒｉｃ），ダブリュ．エル．ケルン（Ｗ．Ｌ．Ｃａｉｒｎｓ），エヌ．シー．シー．グレイ（Ｎ．Ｃ．Ｃ．Ｇｒａｙ），「バイオサーファクタントアンド バイオテクノロジー（Ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，（米国），マーシャル デッカー インコーポレーション ニューヨーク（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８７）．
【非特許文献７】ジェイ．エス．キム（Ｊ．−Ｓ．Ｋｉｍ），エム．ポワラ（Ｍ．Ｐｏｗａｌｌａ），エス．ラング（Ｓ．Ｌａｎｇ），エフ．ワーグナー（Ｆ．Ｗａｇｎｅｒ），エイチ．ランスドルフ，ブイ．レイ（Ｖ．Ｗｒａｙ），「ジャーナルオブ バイオテクノロジー（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（英国），１３巻，ｐ２５７−２６６（１９９０）．
【非特許文献８】アール．エイチ．ハスキンス（Ｒ．Ｈ．Ｈａｓｋｉｎｓ），ジェイ．エイ．トーン（Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｒｎ），Ｂ．Ｂｏｏｔｈｒｏｙｄ，「カナデアン ジャーナルオブ ケミストリー（Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」，１巻，ｐ７４９−７５６（１９５５）．
【非特許文献９】ジー．デム（Ｇ．Ｄｅｍｌ），ティ．アンケ（Ｔ．Ａｎｋｅ），エフ．オーバーウインカー（Ｆ．Ｏｂｅｒｗｉｎｋｌｅｒ），ビー．エム．ジアネッティー（Ｂ．Ｍ．Ｇｉａｎｎｅｔｔｉ），ダブリュ．ステグリッチ（Ｗ．Ｓｔｅｇｌｉｃｈ），「フィトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９巻，ｐ８３−８７（１９８０）．
【非特許文献１０】ティ．ナカハラ（Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ），エイチ．カワサキ（Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ），ティ．スギサワ（Ｔ．Ｓｕｇｉｓａｗａ），ワイ．タカモリ（Ｙ．Ｔａｋａｍｏｒｉ），テイ．タブチ（Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ），「ジャーナルオブ ファーメンテーション テクノロジー（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（日本），日本発酵工学会，６１巻，ｐ１９−２３（１９８３）．
【非特許文献１１】ディ．キタモト（Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ），エス．アキバ（Ｓ．Ａｋｉｂａ），シー．ヒオキ（Ｃ．Ｈｉｏｋｉ），ティ．タブチ（Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ）「アグリカリチュラルアンド バイオロジカル ケミストリー（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）」，（日本），日本農芸化学会，５４巻．ｐ３１−３６（１９９０）．
【非特許文献１２】エイチ．エス．キム（Ｈ．−Ｓ．Ｋｉｍ），ビー．ディ．ユーン（Ｂ．−Ｄ．Ｙｏｏｎ），ディ．エイチ．チョン（Ｄ．−Ｈ．Ｃｈｏｕｎｇ），エイチ．エム．オー（Ｈ．−Ｍ．Ｏｈ），ティ．カツラギ（Ｔ．Ｋａｔｓｕｒａｇｉ），ワイ．タニ（Ｙ．Ｔａｎｉ）「アプライドマイクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（ドイツ），スプリンガー−バーラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ），５２巻，ｐ７１３−７２１（１９９９）．
【非特許文献１３】角川（Ｋ．ｋａｋｕｋａｗａ），玉井（Ｍ．Ｔａｍａｉ），今村（Ｋ．Ｉｍａｍｕｒａ），宮本（Ｋ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ），三好（Ｓ．Ｍｉｙｏｓｈｉ），森永（Ｙ．Ｍｏｒｉｎａｇａ），鈴木（Ｏ．Ｓｕｚｕｋｉ），宮川（Ｔ．Ｍｉｙａｋａｗａ）「バイオサイエンス，バイオテクノロジーアンド バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」，（日本），日本農芸化学会，６６巻，ｐ１８８−１９１（２００２）．
【非特許文献１４】ビー．フラッツ（Ｂ．Ｆｒａｕｔｚ），エス．ラング（Ｓ．Ｌａｎｇ），エフ．ワーグナー（Ｆ．Ｗａｒｇｎｅｒ）「バイオテクノロジー レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，（オランダ），クルーワーアカデミック パブリッシャー（ＫＬＵＷＥＲ ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ），８巻，ｐ７５７−７６２（１９８６）．
【非特許文献１５】エス．スペンサー（Ｓ．Ｓｐｏｅｃｋｎｅｒ），ブイ．レイ（Ｖ．Ｗｒａｙ），エム．ニミッツ（Ｍ．Ｎｉｍｔｚ），エス．ラング（Ｓ．Ｌａｎｇ）「アプライドマイクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（ドイツ），スプリンガー−バーラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ），５１巻，ｐ３３−３９（１９９９）．
【非特許文献１６】イー．ボルブレクト（Ｅ．Ｖｏｌｌｂｒｅｃｈｔ），ユー．ラウ（Ｕ．Ｒａｕ），エス．ラング（Ｓ．Ｌａｎｇ）「フェット／リピッド（Ｆｅｔｔ／Ｌｉｐｉｄ．）」，１０１巻，ｐ３８９−３９４（１９９９）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記事情に鑑み,本発明は、分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つ糖脂質等のバイオサーファクタントを、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等に広く普及をはかるため、従来のマンノシルエリスリトールリピッドとは親油基の結合位置、結合数が異なる、新規構造のマンノシルエリスリトールリピッド及びその製造方法を提供することを目的とするものである。
界面活性剤の高機能化の手段として、一般的にはHLBの調節や他成分との混合等を施すことで乳化・可溶化、分散化、洗浄能の向上が図られている。糖脂質型バイオサーファクタントの場合では、親油基である脂肪酸由来ドメインの結合数や結合位置、鎖長等の違いによって界面活性の幅広い制御が可能となる。例えば、脂質ドメインの結合数、鎖長の増加は油溶性の増大に繋がり、乳化・可溶化技術の精密化をもたらす。また、結合位置の違いは自己集合能を大きく変化させ、それに応じた相挙動の変化に伴って液晶化技術など従来の界面制御技術をより高度化することも可能となる。
これらの構造改変は化学的な手法を用いても理論上では可能であるが、糖脂質の場合では反応を位置・立体選択的に制御することが極めて困難であり、また糖骨格を維持したまま構造改変を行うためには多段階の複雑な保護・脱保護反応を必要とする。これに対して、微生物生産では精巧な生合成経路を経由するため、位置・立体構造が完全に制御された特殊構造を維持し、かつHLB等の性質の異なる同族体を、一段階のステップのみで製造する方法を提供でき、バイオサーファクタントのバリエーションの拡張に繋がる極めて有効な手段と成り得る。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する微生物の培養物から様々な生産物を採取し、これらについて精密な分離・構造解析を行うことにより、これまで全く注目されていない、新規構造の糖脂質が存在することを知見した。さらに培養方法等を含む上記新規糖脂質の生産方法についても検討することにより、本発明をなすに至ったものである。
【００１５】
従って、本発明は下記発明を提供する。
〔１〕次の式（１）で表されるマンノシルエリスリトールリピッド。
【化１】
（式中、Ｒ１は、同一でも異なっていてもよい炭素数６〜２０の脂肪族アシル基であり、Ｒ２は水素又はアセチル基、Ｒ３は水素又は炭素数６〜２０の脂肪族アシル基を表す。）
〔２〕上記式中、Ｒ１で示される各置換基、及びＲ３で示される置換基が、 それぞれ炭素数６〜２０の飽和又は不飽和脂肪族アシル基からなることを特徴とする、上記〔１〕に記載のマンノシルエリスリトールリピッド。
〔３〕シュードザイマ属に属し、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物から上記〔１〕又は〔２〕に記載のマンノシルエリスリトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
〔４〕生産培地に油脂類を加えることを特徴とする上記〔３〕に記載の糖脂質の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物の培養物から、新規構造のマンノシルエリスリトールリピッド（以下、ＭＥＬという場合がある。）を得ることができ、この糖脂質は従来のマンノシルエリスリトールリピッドにはみられない性質を有し、バイオサーファクタントとして有用である。一方、この新規ＭＥＬを生産する微生物としては、シュードザイマ属に属する微生物が挙げられるが、その中でも、特にシュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica JCM 11752 株）を使用した場合に、この新規ＭＥＬをきわめて効率よく生産できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明につきさらに詳しく説明する。
〈糖脂質〉
ＭＥＬはＭＥＬ生産菌の培養によって得られ、従来型ＭＥＬの化学構造の代表例は以下の式（２）に示され、４−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトールをその基本構造とするものである。
【化２】
上記各ＭＥＬにおける各置換基Ｒの炭素数は、ＭＥＬ生産培地に含有させる油脂類中のトリグリセリドを構成する脂肪酸の炭素数及び使用するＭＥＬ生産菌の脂肪酸の資化の程度により変化する。また、上記トリグリセライドが不飽和脂肪酸残基を有する場合、ＭＥＬ生産菌が上記不飽和脂肪酸の二重結合部分まで資化しなければ、置換基Ｒは不飽和脂肪酸残基を含むことも可能である。 以上の説明から明らかなように、得られる各ＭＥＬは、通常、置換基Ｒの脂肪酸残基部分が異なる化合物の混合物の形態である。
本発明の新規ＭＥＬもこれらの点では従来型MELと同様ではあるが、本発明の新規ＭＥＬは、以下の式（１）で表され、エリスリトール部分にも脂肪酸残基が結合している点で、従来型ＭＥＬと区別される。
【化１】
（式中、Ｒ１は、同一でも異なっていてもよい炭素数６〜２０の脂肪族アシル基であり、Ｒ２は水素又はアセチル基、Ｒ３は水素又は炭素数６〜２０の脂肪族アシル基を表す。）
なお、上記式中の各置換基Ｒ１及びＲ３は、直鎖飽和脂肪族アシル基であっても同不飽和脂肪族アシル基であってもよく、また、これらが同一分子内に共存するものを含んでもよい。
【００１８】
本発明の新規ＭＥＬは、界面活性能を有する新規構造を有するバイオサーファクタントであり、たとえば、シュードザイマ属に属する酵母を油脂類添加培地で培養することによって得ることができる。
本発明の新規ＭＥＬは、基本的には、上記式（１）におけるこれら置換基Ｒの脂肪族アシル基の炭素数あるいは二重結合の有無等において異なる各化合物の混合物の形態で得られるが、油脂類として例えば、単一の脂肪酸 あるいは単一の脂肪酸を有するトリグリセライドを培地に含有させ、培養条件を厳密に制御すれば、単一化合物に近いＭＥＬ（例えば純度７５〜８０％）も得ることが可能である。これらはさらに分取ＨＰＬＣ等により精製すれば、単一のＭＥＬ化合物とすることもできる。
【００１９】
〈使用微生物〉
本発明の使用微生物については、シュードザイマ属に属し、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有するものであれば特に制限はなく、例えばシュードザイマ・パラアンタクティカ、シュードザイマ・アンタクティカ、シュードザイマ・ルグローサ等に属する微生物が挙げられ、このうち特に好ましい微生物としては、シュードザイマ・パラアンタクティカに属する微生物が挙げることができる。このシュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica）に属する微生物は、例えば３３〜３７℃で培養した場合の生産性向上効果が高く、特にシュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica）JCM 11752株の場合、培養温度３５℃の場合に最も良好な生産性が得られる。
〈培地・培養条件〉
本発明における使用微生物の培養においては、培地に、脂肪酸、脂肪酸トリグリセリド等の脂肪酸エステル類、あるいは植物油等の油脂類を含有させるが、その他の条件については、特に制限はなく、適宜選定することができる。例えば、酵母に対して一般に用いられる培地を使用でき、このような培地として、例えば、ＹＰＤ培地（イーストイクストラクト１０ｇ、 ポリペプトン２０ｇ、及びグルコース１００ｇ）を挙げることができる。特に、シュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica）JCM 11752株を用いる場合は培養温度を３３〜３７℃に設定することが好ましいという知見を得ている。
本発明の使用微生物、特に前記シュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica JCM 11752）株を用いてマンノシルエリスリトールリピッドを生産する場合の好適な培地組成は、以下のとおりである。
酵母エキス；０．１〜２ｇ／Ｌが好ましく、１ｇ／Ｌが特に好ましい
硝酸ナトリウム；０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．５ｇ／Ｌが特に好ましい。
リン酸２水素カリウム；、０．１〜２ｇ／Ｌが好ましく、０．４ｇ／Ｌが特に好ましい。
硫酸マグネシウム；、０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
油脂類；８０ｇ／Ｌ以上が好ましく、１８０ｇ／Ｌが特に好ましい。
【００２０】
本発明の新規ＭＥＬの製造方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、種培養、本培養及びマンノシルエリスリトールリピッド生産培養の順にスケールアップしていくことが望ましい。
これらの培養における、培地、培養条件を例示すると以下のとおりである。
ａ）種培養；グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地４ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行う。
ｂ）本培養；所定量の植物性油脂等の油脂類と、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３３〜３７℃で２日間培養を行う。
ｃ）マンノシルエリスリトールリピッド生産培養；所定量の植物性油脂等の油脂類と酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム ０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、３３〜３７℃で８００ｒｐｍの撹拌速度で培養を行う。この培養においては、培養途中から植物性油脂を培養容器中に流下させて、培地中の油脂類濃度を４０〜２００ｇ／Ｌに保持することが望ましい。
【００２１】
炭素源としては油脂類であれば特に制限がなく、例えば、植物油脂としては、大豆油、菜種油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、バーム油等が挙げられ、これらの中でも、大豆油が好ましい。これらは、１種を単独で又は２種以上を適宜混合して用いてもよい。
【００２２】
培養終了後、等〜４容積倍の酢酸エチルで脂質成分を抽出し、酢酸エチルを、エバポレーターを用いて留去して脂質及び糖脂質成分を回収する。この脂質成分を等量のクロロホルムに溶解し、これをシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム、クロロホルム：アセトン（７０：３０）、アセトン：クロロホルム（４０：６０）、アセトンの順で溶出させる。各溶液を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートにチャージし、クロロホルム：メタノール：アンモニア水＝６５：１５：２（容積比）で展開する。展開終了後、アンスロン硫酸試薬で糖脂質の存在を確認する。糖脂質の含まれる溶出液を集め、溶媒を留去して糖脂質成分を得る。
【００２３】
得られた糖脂質成分を再度クロロホルムに溶解し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムを搭載した分取ＨＰＬＣシステムを用いることで、分子量の異なるフラクションに分離、回収する。各フラクション分離物についてＴＬＣ分析を行い、原料である油脂類、脂肪酸、グリセリンエステル等を除いた糖脂質成分のみが含まれているフラクションについて、再度シリカゲルクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム：アセトン＝８５：１５（容積比）で溶出させ、ＴＬＣで単一のバンドを示す糖脂質成分を単離することにより、本発明の新規ＭＥＬを得ることができる。
【００２４】
〈新規ＭＥＬの構造決定〉
上記により得られる糖脂質成分の構造決定は、以下のようにして行う（シュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica JCM 11752 株）を用いて大豆油を炭素源として培養して得られた新規ＭＥＬの構造決定手法を例にして以下説明する）。
単離した糖脂質成分は、ＴＬＣプレート上で、アンスロン硫酸試薬で青緑色に呈色することにより糖脂質成分であると判断できる。この糖脂質について、1Ｈ、13Ｃ、二次元ＮＭＲ解析を行い、得られたスペクトルと、構造既知である従来型のマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ−Ａ〜Ｄ）（式２）のスペクトルとを比較することで、構造解析を行う。
【００２５】
【化２】
１）糖組成の解析
糖脂質の糖組成の決定は、アルカリ（ＮａＯＣＨ３）でケン化して得られた糖鎖のＮＭＲ解析により行う。得られた糖脂質と従来型のＭＥＬの糖鎖のＮＭＲスペクトルを比較することで、本発明のＭＥＬの糖鎖部分の構造が、従来型ＭＥＬと同じ４−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトール構造を有し、本糖脂質が新規構造のＭＥＬであることを確認できる。
【００２６】
２）脂質組成の解析
一方、脂質部分の組成は、得られた糖脂質を塩酸メタノールでメタノリシスし、ヘキサンで抽出して得られた脂肪酸メチルエステルのＧＣ／ＭＳで分析することにより決定する。
【００２７】
３）脂肪酸成分の結合部位の解析
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは、一般に糖アルコール上の還元末端以外のプロトンは３．５ｐｐｍ前後にまとまって検出されるが、水酸基の水素がアシル基とエステル結合すると、そのα−プロトンのシグナルは低磁場にシフトすることが知られている。本糖脂質の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、従来型ＭＥＬ（ＭＥＬ−Ａ）のものと比較し、各プロトンに由来するピークの化学シフトを帰属した後、どの水酸基に何分子アシル基が結合しているかを類推する。また、２ｐｐｍ付近に観測されるアセチル基（−ＣＯＣＨ3）由来のシグナルを確認することで、結合しているアシル基の何分子が酢酸で、何分子が脂肪酸であるかを予測する。
【００２８】
次に、ＨＭＱＣ（Heteronuclear Multiple Quantum Coherence）、ＨＭＢＣ（Heteronuclear Multiple Bond Coherence）スペクトル解析を行い、上記の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲ解析の結果を基にして糖骨格の完全帰属を行う。ＨＭＱＣスペクトルによって、マンノース及びエリスリトール上の炭素、水素の化学シフトをそれぞれ完全帰属する。また、ＨＭＢＣスペクトルにおいて、どの水酸基に酢酸と脂肪酸がエステル結合しているかを証明する。
【００２９】
得られた糖脂質は脂質部分の脂肪酸鎖長が異なる成分の混合物として回収されるが、さらにこれは逆相カラム（ODSカラム）を用いたHPLC分析を行うことで分離できる。分離した各ピーク化合物についてMS分析を行うことで主成分の構造を決定する。
【００３０】
さらに、これらの菌体が生産する化合物群には、ＴＬＣ上で他にもいくつかのスポットが検出されており、マンノース上のアセチル基の数とその結合位置の異なる成分、エリスリトール上に結合している脂肪酸の数と結合位置の異なる成分等も存在していることが認められる。
【００３１】
本発明の新規ＭＥＬは、優れた界面活性能を有するため、バイオサーファクタントとして用いることができる。界面活性能については、下記の方法で簡易に観察することができる。
【００３２】
〈界面活性能の観察〉
単離した新規ＭＥＬの水溶液を疎水性のフィルム上にスポットし、その表面張力の変化を観察する。また、コントロールとして水、及び従来型ＭＥＬの水溶液をそれぞれスポットして比較する。
【実施例】
【００３３】
実施例１
（Pseudozyma parantarctica JCM 11752株の培養）
ａ）種培養；グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地４ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行い、次いで、
ｂ）本培養；得られた菌体培養液を大豆油１６０ｇ／Ｌと、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３５℃で行い、さらに
ｃ）（マンノシルエリスリトールリピッド生産培養）これを大豆油１６０ｇ／Ｌと酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム ０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地５００ｍＬが入った坂口フラスコに接種して、３５℃で３００ｒｐｍの撹拌速度で培養を行った。
上記ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を、７日間行い、得られたPseudozyma parantarctica JCM 11752株の菌体培養液に等量の酢酸エチルを添加・攪拌して、酢酸エチル抽出物を得た。この酢酸エチル抽出物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供し、糖脂質を青緑色に発色させるアンスロン試薬を用いて、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）の生産を確認した。展開溶媒はクロロホルム：メタノール：７Ｎアンモニア水= ６５：１５：２ を用いた。比較例としてPseudozyma antarctica KM-34(FERMP-20730) 株由来のＭＥＬ精製標品を用いた。結果を図１に示す。なお、図中、左端は従来型ＭＥＬの標準であり、ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ及びＭＥＬ−Ｃはそれぞれ先述の式（２）で表される化合物を示す。これによれば、両株とも大豆油含有培地でＭＥＬを生産しており、さらに、ＭＥＬよりＲｆ値の高い（上方）位置に糖脂質の存在を示す青緑色のスポットが生じている。
【００３４】
実施例２
（Pseudozyma parantarctica JCM 11752株の培養）
上記ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を、２日間行い、さらにｃ）の培養７日間行い、得られたPseudozyma parantarctica JCM 11752株の菌体培養液に等量の酢酸エチルを添加・攪拌して、酢酸エチル抽出物を得た。この酢酸エチル抽出物をＴＬＣに供し、糖脂質を青緑色に発色させるアンスロン試薬を用いて、ＭＥＬの生産を確認した。比較例としてPseudozyma antarctica KM-34(FERMP-20730) 株由来のＭＥＬ精製標品を用いた。結果を図２に示す。これによれば、両株とも大豆油含有培地でＭＥＬを生産しており、さらに、ＭＥＬよりＲｆ値の高い（上方）位置に糖脂質の存在を示す青緑色のスポットが生じている。
【００３５】
実施例３
（Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株の培養）
上記ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を、３０℃で７日間行い、得られたPseudozyma rugulosa NBRC 10877株の菌体培養液に等量の酢酸エチルを添加・攪拌して、酢酸エチル抽出物を得た。この酢酸エチル抽出物をＴＬＣに供し、糖脂質を青緑色に発色させるアンスロン試薬を用いて、ＭＥＬの生産を確認した。比較例としてPseudozyma antarctica KM-34(FERMP-20730) 株由来のＭＥＬ精製標品を用いた。結果を図３に示す。これによれば、両株とも大豆油含有培地でＭＥＬを生産しており、さらに、ＭＥＬよりＲｆ値の高い（上方）位置に糖脂質の存在を示す青緑色のスポットが生じている。
【００３６】
実施例４
（Pseudozyma parantarctica JCM 11752株由来マンノシルエリスリトールリピッドの精製）
実施例２で得られたマンノシルエリスリトールリピッドの精製を、既知の精製手法によって分離した。すなわち、上記酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムに供し、クロロホルムとアセトンの混合液を展開溶媒とするカラムクロマトグラフィーで精製した。クロロホルムとアセトンの割合は、７０：３０で残存原料と脂肪酸を含むMEL-AよりRf値の高い物質を分離回収し、続いて４０：６０でMEL-A、-B、-Cを分離回収した。そして、それぞれの回収した画分を上記ＴＬＣに供した（図４）。これによれば、構造不明の糖脂質はクロロホルム：アセトン＝７０：３０の画分に検出できた。
【００３７】
実施例５
（構造不明糖脂質の単離・精製）
実施例４で得られた構造不明の糖脂質を含む画分を全て回収し、エバポレーターを用いて溶媒を留去した後、再度クロロホルムに溶解させ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムを搭載したリサイクル分取ＨＰＬＣシステムを用いることで、分子量の異なるフラクションに分離、回収した。リサイクル回数を増やすことで大きく３つのフラクションに分離された。クロマトグラムを図５に示す。
【００３８】
各フラクション成分を上記ＴＬＣに供した（図６）。これによれば、ＨＰＬＣ分析において最も高分子量であったフラクション（１）に構造不明の糖脂質が含有されていることが確認された。
【００３９】
さらに上記フラクション（１）をシリカゲルカラムに供し、クロロホルムとアセトンの混合液を展開溶媒とするカラムクロマトグラフィーで精製した。クロロホルムとアセトンの割合は８５：１５とし、回収したそれぞれの画分を上記ＴＬＣに供した（図７）。これによれば、フラクション（１）中には単一成分である主な２つの成分（a）、（ｂ）、及びその他の分離できない成分があることが分かる。
以降、フラクション（１）中の成分（a）の成分について詳細に説明する。
【００４０】
実施例６
（構造不明糖脂質の構造解析）
１）糖組成の解析
実施例５で得られた糖脂質を、メタノール中でナトリウムメトキシドによって加水分解を行った。反応終了後の生成物を酢酸エチル中に再沈殿させて回収し、９０％エタノール中で再結晶操作を行うことにより糖鎖の結晶を得た。従来型ＭＥＬについても同様の操作で糖鎖を回収し、得られた各糖鎖について、重水素化ジメチルスルホキシド（DMSO-ｄ６）を溶媒として１H−ＮＭＲ解析を行った。その結果、本糖脂質と従来型のＭＥＬの糖鎖のＮＭＲスペクトルは完全に一致した。よって以上の結果から、実施例５で得られた構造不明糖脂質の糖鎖部分の構造は、従来型MELと同様４−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトールであり、本糖脂質が新規構造のＭＥＬであることが予想された。
【００４１】
２）脂質組成の解析
実施例５で得られた糖脂質の脂質部分の組成は、塩酸メタノール加水分解物からヘキサンで抽出して得られた脂肪酸メチルエステルのGC/MS分析により行った。分析結果とGCチャートを図８に示す。比較のために構造既知である従来型MEL（MEL-A）のチャートも示す。分析の結果、本糖脂質では、短〜中鎖の脂肪酸（C８〜C１２）の直鎖飽和及び不飽和脂肪酸が主成分として検出さる点で従来型のものとよく一致したチャートが得られたが、さらに長鎖脂肪酸（C１６、１８）が含まれていることが示された。特に、不飽和基を一つ有するC１８の脂肪酸（オレイン酸）が主成分として検出された。以上の結果より、本糖脂質では従来型のMELに対してもう１つこれらの長鎖脂肪酸がエステル結合していると予測された。
【００４２】
３）脂肪酸成分の結合部位の解析
実施例５で得られた糖脂質について、重クロロホルム（CDCｌ３）を溶媒とするＮＭＲ解析により構造の同定を行った。本糖脂質の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図９）は、構造既知である従来型ＭＥＬ（ＭＥＬ−Ａ）のものと比較して非常によく一致しており、特にマンノース上のＨ−２’〜４’、６’のプロトンに由来するピークの化学シフトは完全に一致した（Ｈ−２’；５．５１ｐｐｍ、Ｈ−３’；５．０７、Ｈ−４’；５．２７、Ｈ−６’；４．２０ｐｐｍ）、このことから本糖脂質は従来型のMEL−Aと同様、マンノース上の４つの水酸基の全てにアシル基が結合していると同定できる。一方、本糖脂質ではさらに、アシル基とエステル結合したことで低磁場シフトしたα−プロトンのシグナルが４．３ｐｐｍ付近にも観測された。以上の結果から、本糖脂質は従来型のＭＥＬとは異なりエリスリトール上の水酸基にもアシル基が結合していることが示された。さらに、２．１０ｐｐｍと２．０３ｐｐｍに２分子のアセチル基（−ＣＯＣＨ3）のメチルプロトンの存在を示すシグナルが観測されたことから、合計５分子のアシル基のうち、２分子が酢酸で３分子が脂肪酸であると同定できる。
【００４３】
次に、ＨＭＱＣ（Heteronuclear Multiple Quantum Coherence）、ＨＭＢＣ（Heteronuclear Multiple Bond Coherence）スペクトル解析を行い、糖骨格の完全帰属を行った。ＨＭＱＣスペクトル（図１０）により、マンノース及びエリスリトール上の炭素、水素の化学シフトがそれぞれ完全帰属された。また、ＨＭＢＣスペクトル（図１１）において、Ｈ−４’とＨ−６’のプロトンシグナルが、アセチル基由来のカルボニル基のシグナル（１６９．６ｐｐｍと１７０．９ｐｐｍ）とそれぞれカップリングしていることが認められたことから、マンノースの４’位と６’位には酢酸がエステル結合していることが証明された。さらに、Ｈ−２’とＨ−３’、及びＨ−１（４．３ｐｐｍ）のプロトンシグナルが、脂肪酸アシル基由来のカルボニル基のシグナル（173.4ppm、172.9ppm、及び174.7ppm）とそれぞれカップリングしていることが認められたことから、マンノースの２’、３’位及びエリスリトールの１位には脂肪酸がエステル結合していることが証明された。
【００４４】
以上のことから、本糖脂質の構造は、１−アルカノイル−４−（４’，６’−ジ−Ｏ−アセチル−２’，３’−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル−）ｍｅｓｏ−エリスリトールと同定できた。
【００４５】
さらに、この糖脂質はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析において、擬似分子イオン［Ｍ＋Ｎａ］+ ｍ／ｚ ９３５．９が検出された（図１２）。この結果と脂肪酸組成分析の結果から、本糖脂質はマンノシルエリスリトール骨格の２’位と３’位の水酸基にC８及びC１０の直鎖飽和脂肪酸が１つずつエステル結合しており、１位水酸基にオレイン酸が結合している構造の化合物が主成分であることが示唆される。
【００４６】
また、フラクション（１）中の成分（ｂ）について同様の解析を行った結果、これは上記の新規MELに対して、マンノース上の４’位の水酸基に酢酸エステルが存在しない、１−アルカノイル−４−（６’−Ｏ−アセチル−２’，３’−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル−）ｍｅｓｏ−エリスリトールであることが確認された。図１３にその1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【００４７】
これらの菌体が生産する化合物群には、上記のようにマンノース上のアセチル基の数との結合位置の異なる成分が存在しており、またTLC上にはエリスリトール上に結合している脂肪酸の数と結合位置の異なる成分と思しきスポット等も認められている。
【００４８】
実施例７
（界面活性能の観察）
実施例５で得られた新規ＭＥＬの希釈水溶液を作成し、疎水性のフィルム上にスポットすることで、その表面張力の変化を観察した。また、コントロールとして水、及び従来型ＭＥＬ（ＭＥＬ−Ａ）の水溶液をそれぞれスポットして比較した。これらの結果を図１４に示す。これによれば、本発明での糖脂質は水溶液の表面張力が低下しており、界面活性剤としての機能を有することが示された。また、本糖脂質の水溶液のスポットは、従来型ＭＥＬと比較するとスポットの広がりは小さくなった。本糖脂質は親油基である脂肪酸エステルの結合数が従来型ＭＥＬよりも１つ多いため、より疎水的なバイオサーファクタントであると推測されるが、本観察の結果はそれを示唆するものであった。
【００４９】
さらに、新規ＭＥＬとＭＥＬ−Ａを任意の割合で混ぜたＭＥＬ混合水溶液（０．５mg/mL）を作成し、疎水性のフィルム上にスポットすることで、その表面張力の変化を観察した（図１５）。新規ＭＥＬの混合比を増加させることで、表面張力の低下率を容易に制御できることが示された。新規ＭＥＬは従来型ＭＥＬの類似骨格を有しており、これを混合することは溶液の性質を変えることなく界面活性を調節できると推測される。したがって、他の合成界面活性剤やバイオサーファクタントを混合するよりも有効と考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の糖脂質は従来型ＭＥＬと比較して、より親油的でバルキーな置換基が導入されており、ＨＬＢ、相挙動等が大きく異なっている。本発明の新規ＭＥＬを従来の系に数％添加するだけで構造・組成の類似性から活性剤そのものの性質を変えることなく、乳化、可溶化、分散化能を広く調整することが可能である。糖脂質型バイオサーファクタントとして本来有する特性である分解性の高さや低毒性、環境適合性、高生理活性に加え、目的に応じて界面活性を幅広く調整できる利便性等を利用して、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等に広く利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】実施例１で、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が新規糖脂質を生産していることを示す薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。
【図２】実施例２で、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が新規糖脂質を生産していることを示す薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。
【図３】実施例３で、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株が新規糖脂質を生産していることを示す薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。
【図４】実施例４で、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が生産する新規糖脂質をカラムクロマトグラフィーで分離した結果を示す薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。
【図５】実施例４で得られた構造不明の糖脂質を含む画分（クロロホルム：アセトン＝７０：３０画分）について、サイズ排除クロマトグラフィーカラムを搭載したリサイクル分取HPLC分析を行った結果を示すクロマトグラムである。
【図６】実施例５でHPLCによって分子量の違いで分離した各フラクションの薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。
【図７】実施例５でHPLCによって分離したフラクション（１）について、カラムクロマトグラフィーで分離した結果を示す薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。
【図８】実施例５で得られた糖脂質成分（a）及び従来型MEL（MEL-A）について、GC/MS分析により行った脂肪酸組成分析結果を示す成分表とGCチャートである。
【図９】実施例５で得られた糖脂質成分（a）の1HNMRスペクトルである。
【図１０】実施例５で得られた糖脂質成分（a）のHMQCスペクトルにおいて、糖骨格の1H-13C相関を示す部分の拡大図である。
【図１１】実施例５で得られた糖脂質成分（a）のHMBCスペクトルにおいて、糖骨格とカルボニル基との相関を示す部分の拡大図である。
【図１２】実施例５で得られた糖脂質成分（a）のMALDI-TOF/MS測定結果を示すマススペクトルにおいて、主成分の擬似分子イオンの分子量付近の拡大図である。
【図１３】実施例５で得られた糖脂質成分（ｂ）の1H NMRスペクトルである。
【図１４】実施例５で得られた糖脂質の水溶液を疎水性フィルム上にスポットし、その表面張力を観察した結果を示す写真である。
【図１５】実施例５で得られた糖脂質と従来型ＭＥＬの混合水溶液を疎水性フィルム上にスポットし、その表面張力を観察した結果を示す写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンノースとエリスリトールを構成要素とするマンノシルエリスリトールリピッドにおいて、エリスリトール部分に脂肪酸が結合した新規マンノシルエリスリトールリピッド及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖脂質は、脂質に１〜１０数個の単糖が結合した物質であり、生体内において細胞間の情報伝達に関与し、神経系・免疫系の機能維持にも重要な役割を果たしていること等が明らかにされつつある。一方で、糖脂質は、糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、このような性質を有する物質は界面活性物質と呼ばれている。石油化学工業が隆盛となるまでは、レシチン、サポニン等の生体成分由来の界面活性剤（バイオサーファクタント）を利用してきたが、石油化学工業の発展により合成界面活性剤が開発され、界面活性剤の生産量は飛躍的に増加し、日常生活には無くてはならない物質となった。しかしながら、その使用量の拡大につれて環境汚染が広がってきた。そこで、安全性が高く、環境に対する負荷を低減するために生分解性の高い界面活性物質の開発が望まれていた。
【０００３】
現在、微生物が生産する界面活性物質としては、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子化合物系の５つに分類されている。この内の糖脂質系の界面活性剤については、最もよく研究され、細菌及び酵母による多くの種類の物質が報告されている。
【０００４】
ラムノリピッドは、結核菌の抗生物質としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（シュードモナス アエルジノーサ）（緑膿菌）の培養液から最初に発見された（非特許文献１参照）。以来、これまでにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）属の細菌から４種類の同族体が報告され、当初は数ｇ／Ｌ程度の生産量であったが、現在では１００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている（非特許文献２参照）。
【０００５】
ソホロースリピッドは、Ｃａｎｄｉｄａ（以前はＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ） ｂｏｍｂｉｃｏｌａ（キャンデダ ボンビコーラ）の培養液から発見された（非特許文献３参照）。これ以外に、Ｃａｎｄｉｄａ ａｐｉｃｏｌａも生産し、脂肪酸の結合様式によりラクトン型と線状型の２種類が報告されている。現在では、３００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている（非特許文献４及び５参照）。
【０００６】
トレハロースリピッドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（コリネバクテリウム）等の細胞表層物質として発見された。類似の物質が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（マイコバクテリウム）、Ｎｏｃａｒｄｉａ（ノカルディア）、Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ（ロドコッカス）属細菌からも報告されている（非特許文献６参照）。一般に、細胞壁に結合しているために生産量は低いが、Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ロドコッカス エリスロポリス）を窒素制限下で培養を行うとサクシノイルトレハロースリピッドを３２ｇ／Ｌ生産することが報告されている（非特許文献７参照）。
【０００７】
マンノシルエリスリトールリピッドは、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｎｕｄａ（ウスチラゴ ヌーダ）とＳｈｉｚｏｎｅｌｌａ ｍｅｌａｎｏｇｒａｍｍａ（シゾネラ メラノグラマ）から発見された（非特許文献８及び９参照）。その後、イタコン酸生産の変異株であるＣａｎｄｉｄａ属酵母（特許文献１及び非特許文献１０参照）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ（キャンデダ アンダークチカ）（非特許文献１１及び１２参照）、Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ（クルツマノマイセス）属（非特許文献１３参照）等の酵母が生産することを報告している。現在では、長時間の連続培養・生産を行うことで３００ｇ／Ｌ以上の生産を可能にしている。
【０００８】
セロビオースリピッドは、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ（ウスチラゴ マイディス）により１５ｇ／Ｌ（非特許文献１４及び１５参照）、オリゴ糖リピッドは、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ（ツカムレラ）属の酵母により３０ｇ／Ｌ生産される（非特許文献１６参照）ことが報告されている。
【０００９】
糖脂質等のバイオサーファクタントは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれている。このことから、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等にこれらのバイオサーファクタントを幅広く適用することは、持続可能社会の実現と高機能製品の提供という、両面を兼ね備えており極めて有意義である。
【００１０】
現在、一般的に用いられている合成界面活性剤の種類は、細かな構造の違いまで見ると数百、数千種類に上る。親水基・親油基の種類が異なるものから、それぞれのドメインの組成が同じでも分子量、立体構造の違いによって親水性疎水性バランス（ＨＬＢ）の異なる同族体など、ありとあらゆる化合物が開発されており、これらを単一種類で用いるだけでなく、数種混合して用いることで、上記のような幅広い産業分野において要求される性能に対応している。
【００１１】
したがって、これらのバイオサーファクタントの幅広い普及を図るためには、多くの種類のバイオサーファクタントが必要である。しかしながら、現在までに発見されているバイオサーファクタントの種類は２０数種類と少なく、新規な構造を有するバイオサーファクタントの発見が望まれている。さらに、構造・組成に多くのバリエーションを持たせ、これらを組み合わせて機能を緻密に制御することが極めて重要である。
【００１２】
【特許文献１】特公昭６０−２４７９７号公報
【非特許文献１】エフ．ジー．ジャービス（Ｆ．Ｇ．Ｊａｒｖｉｓ），エム．ジョンソン（Ｍ．Ｊｏｈｎｓｏｎ），「ジャーナル オブ ザ アメリカン ケミカル ソサイティ（Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」，７１巻，ｐ４１２４−４１２６（１９４９）．
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【非特許文献３】ピー．エー．ゴーリン（Ｐ．Ａ．Ｇｏｒｉｎ），ジェイ．エフ．ティ．スペンサー（Ｊ．Ｆ．Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒ），エイ．ピー．ツロテェ（Ａ．Ｐ．Ｔｕｌｌｏｃｈ），「カナデアンジャーナル オブ ケミストリー（Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．）」，３９巻,ｐ８４６−８５５（１９６１）．
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【非特許文献５】エイチ．ジェイ．ダニエル（Ｈ．−Ｊ．Ｄａｎｉｅｌ），エム．リュッシ（Ｍ．Ｒｅｕｓｓ），シー．シィルダック（Ｃ．Ｓｙｌｄａｔｋ），「バイテクノロジーレターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，２０巻，ｐ１１５３−１１５６（１９９８）．
【非特許文献６】エヌ．コサリック（Ｎ．Ｋｏｓａｒｉｃ），ダブリュ．エル．ケルン（Ｗ．Ｌ．Ｃａｉｒｎｓ），エヌ．シー．シー．グレイ（Ｎ．Ｃ．Ｃ．Ｇｒａｙ），「バイオサーファクタントアンド バイオテクノロジー（Ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，（米国），マーシャル デッカー インコーポレーション ニューヨーク（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８７）．
【非特許文献７】ジェイ．エス．キム（Ｊ．−Ｓ．Ｋｉｍ），エム．ポワラ（Ｍ．Ｐｏｗａｌｌａ），エス．ラング（Ｓ．Ｌａｎｇ），エフ．ワーグナー（Ｆ．Ｗａｇｎｅｒ），エイチ．ランスドルフ，ブイ．レイ（Ｖ．Ｗｒａｙ），「ジャーナルオブ バイオテクノロジー（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（英国），１３巻，ｐ２５７−２６６（１９９０）．
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【非特許文献１０】ティ．ナカハラ（Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ），エイチ．カワサキ（Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ），ティ．スギサワ（Ｔ．Ｓｕｇｉｓａｗａ），ワイ．タカモリ（Ｙ．Ｔａｋａｍｏｒｉ），テイ．タブチ（Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ），「ジャーナルオブ ファーメンテーション テクノロジー（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（日本），日本発酵工学会，６１巻，ｐ１９−２３（１９８３）．
【非特許文献１１】ディ．キタモト（Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ），エス．アキバ（Ｓ．Ａｋｉｂａ），シー．ヒオキ（Ｃ．Ｈｉｏｋｉ），ティ．タブチ（Ｔ．Ｔａｂｕｃｈｉ）「アグリカリチュラルアンド バイオロジカル ケミストリー（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）」，（日本），日本農芸化学会，５４巻．ｐ３１−３６（１９９０）．
【非特許文献１２】エイチ．エス．キム（Ｈ．−Ｓ．Ｋｉｍ），ビー．ディ．ユーン（Ｂ．−Ｄ．Ｙｏｏｎ），ディ．エイチ．チョン（Ｄ．−Ｈ．Ｃｈｏｕｎｇ），エイチ．エム．オー（Ｈ．−Ｍ．Ｏｈ），ティ．カツラギ（Ｔ．Ｋａｔｓｕｒａｇｉ），ワイ．タニ（Ｙ．Ｔａｎｉ）「アプライドマイクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（ドイツ），スプリンガー−バーラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ），５２巻，ｐ７１３−７２１（１９９９）．
【非特許文献１３】角川（Ｋ．ｋａｋｕｋａｗａ），玉井（Ｍ．Ｔａｍａｉ），今村（Ｋ．Ｉｍａｍｕｒａ），宮本（Ｋ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ），三好（Ｓ．Ｍｉｙｏｓｈｉ），森永（Ｙ．Ｍｏｒｉｎａｇａ），鈴木（Ｏ．Ｓｕｚｕｋｉ），宮川（Ｔ．Ｍｉｙａｋａｗａ）「バイオサイエンス，バイオテクノロジーアンド バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」，（日本），日本農芸化学会，６６巻，ｐ１８８−１９１（２００２）．
【非特許文献１４】ビー．フラッツ（Ｂ．Ｆｒａｕｔｚ），エス．ラング（Ｓ．Ｌａｎｇ），エフ．ワーグナー（Ｆ．Ｗａｒｇｎｅｒ）「バイオテクノロジー レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，（オランダ），クルーワーアカデミック パブリッシャー（ＫＬＵＷＥＲ ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ），８巻，ｐ７５７−７６２（１９８６）．
【非特許文献１５】エス．スペンサー（Ｓ．Ｓｐｏｅｃｋｎｅｒ），ブイ．レイ（Ｖ．Ｗｒａｙ），エム．ニミッツ（Ｍ．Ｎｉｍｔｚ），エス．ラング（Ｓ．Ｌａｎｇ）「アプライドマイクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）」，（ドイツ），スプリンガー−バーラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ），５１巻，ｐ３３−３９（１９９９）．
【非特許文献１６】イー．ボルブレクト（Ｅ．Ｖｏｌｌｂｒｅｃｈｔ），ユー．ラウ（Ｕ．Ｒａｕ），エス．ラング（Ｓ．Ｌａｎｇ）「フェット／リピッド（Ｆｅｔｔ／Ｌｉｐｉｄ．）」，１０１巻，ｐ３８９−３９４（１９９９）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記事情に鑑み,本発明は、分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つ糖脂質等のバイオサーファクタントを、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等に広く普及をはかるため、従来のマンノシルエリスリトールリピッドとは親油基の結合位置、結合数が異なる、新規構造のマンノシルエリスリトールリピッド及びその製造方法を提供することを目的とするものである。
界面活性剤の高機能化の手段として、一般的にはHLBの調節や他成分との混合等を施すことで乳化・可溶化、分散化、洗浄能の向上が図られている。糖脂質型バイオサーファクタントの場合では、親油基である脂肪酸由来ドメインの結合数や結合位置、鎖長等の違いによって界面活性の幅広い制御が可能となる。例えば、脂質ドメインの結合数、鎖長の増加は油溶性の増大に繋がり、乳化・可溶化技術の精密化をもたらす。また、結合位置の違いは自己集合能を大きく変化させ、それに応じた相挙動の変化に伴って液晶化技術など従来の界面制御技術をより高度化することも可能となる。
これらの構造改変は化学的な手法を用いても理論上では可能であるが、糖脂質の場合では反応を位置・立体選択的に制御することが極めて困難であり、また糖骨格を維持したまま構造改変を行うためには多段階の複雑な保護・脱保護反応を必要とする。これに対して、微生物生産では精巧な生合成経路を経由するため、位置・立体構造が完全に制御された特殊構造を維持し、かつHLB等の性質の異なる同族体を、一段階のステップのみで製造する方法を提供でき、バイオサーファクタントのバリエーションの拡張に繋がる極めて有効な手段と成り得る。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する微生物の培養物から様々な生産物を採取し、これらについて精密な分離・構造解析を行うことにより、これまで全く注目されていない、新規構造の糖脂質が存在することを知見した。さらに培養方法等を含む上記新規糖脂質の生産方法についても検討することにより、本発明をなすに至ったものである。
【００１５】
従って、本発明は下記発明を提供する。
〔１〕次の式（１）で表されるマンノシルエリスリトールリピッド。
【化１】
（式中、Ｒ１は、同一でも異なっていてもよい炭素数６〜２０の脂肪族アシル基であり、Ｒ２は水素又はアセチル基、Ｒ３は水素又は炭素数６〜２０の脂肪族アシル基を表す。）
〔２〕上記式中、Ｒ１で示される各置換基、及びＲ３で示される置換基が、 それぞれ炭素数６〜２０の飽和又は不飽和脂肪族アシル基からなることを特徴とする、上記〔１〕に記載のマンノシルエリスリトールリピッド。
〔３〕シュードザイマ属に属し、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物から上記〔１〕又は〔２〕に記載のマンノシルエリスリトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
〔４〕生産培地に油脂類を加えることを特徴とする上記〔３〕に記載の糖脂質の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物の培養物から、新規構造のマンノシルエリスリトールリピッド（以下、ＭＥＬという場合がある。）を得ることができ、この糖脂質は従来のマンノシルエリスリトールリピッドにはみられない性質を有し、バイオサーファクタントとして有用である。一方、この新規ＭＥＬを生産する微生物としては、シュードザイマ属に属する微生物が挙げられるが、その中でも、特にシュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica JCM 11752 株）を使用した場合に、この新規ＭＥＬをきわめて効率よく生産できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明につきさらに詳しく説明する。
〈糖脂質〉
ＭＥＬはＭＥＬ生産菌の培養によって得られ、従来型ＭＥＬの化学構造の代表例は以下の式（２）に示され、４−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトールをその基本構造とするものである。
【化２】
上記各ＭＥＬにおける各置換基Ｒの炭素数は、ＭＥＬ生産培地に含有させる油脂類中のトリグリセリドを構成する脂肪酸の炭素数及び使用するＭＥＬ生産菌の脂肪酸の資化の程度により変化する。また、上記トリグリセライドが不飽和脂肪酸残基を有する場合、ＭＥＬ生産菌が上記不飽和脂肪酸の二重結合部分まで資化しなければ、置換基Ｒは不飽和脂肪酸残基を含むことも可能である。 以上の説明から明らかなように、得られる各ＭＥＬは、通常、置換基Ｒの脂肪酸残基部分が異なる化合物の混合物の形態である。
本発明の新規ＭＥＬもこれらの点では従来型MELと同様ではあるが、本発明の新規ＭＥＬは、以下の式（１）で表され、エリスリトール部分にも脂肪酸残基が結合している点で、従来型ＭＥＬと区別される。
【化１】
（式中、Ｒ１は、同一でも異なっていてもよい炭素数６〜２０の脂肪族アシル基であり、Ｒ２は水素又はアセチル基、Ｒ３は水素又は炭素数６〜２０の脂肪族アシル基を表す。）
なお、上記式中の各置換基Ｒ１及びＲ３は、直鎖飽和脂肪族アシル基であっても同不飽和脂肪族アシル基であってもよく、また、これらが同一分子内に共存するものを含んでもよい。
【００１８】
本発明の新規ＭＥＬは、界面活性能を有する新規構造を有するバイオサーファクタントであり、たとえば、シュードザイマ属に属する酵母を油脂類添加培地で培養することによって得ることができる。
本発明の新規ＭＥＬは、基本的には、上記式（１）におけるこれら置換基Ｒの脂肪族アシル基の炭素数あるいは二重結合の有無等において異なる各化合物の混合物の形態で得られるが、油脂類として例えば、単一の脂肪酸 あるいは単一の脂肪酸を有するトリグリセライドを培地に含有させ、培養条件を厳密に制御すれば、単一化合物に近いＭＥＬ（例えば純度７５〜８０％）も得ることが可能である。これらはさらに分取ＨＰＬＣ等により精製すれば、単一のＭＥＬ化合物とすることもできる。
【００１９】
〈使用微生物〉
本発明の使用微生物については、シュードザイマ属に属し、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有するものであれば特に制限はなく、例えばシュードザイマ・パラアンタクティカ、シュードザイマ・アンタクティカ、シュードザイマ・ルグローサ等に属する微生物が挙げられ、このうち特に好ましい微生物としては、シュードザイマ・パラアンタクティカに属する微生物が挙げることができる。このシュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica）に属する微生物は、例えば３３〜３７℃で培養した場合の生産性向上効果が高く、特にシュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica）JCM 11752株の場合、培養温度３５℃の場合に最も良好な生産性が得られる。
〈培地・培養条件〉
本発明における使用微生物の培養においては、培地に、脂肪酸、脂肪酸トリグリセリド等の脂肪酸エステル類、あるいは植物油等の油脂類を含有させるが、その他の条件については、特に制限はなく、適宜選定することができる。例えば、酵母に対して一般に用いられる培地を使用でき、このような培地として、例えば、ＹＰＤ培地（イーストイクストラクト１０ｇ、 ポリペプトン２０ｇ、及びグルコース１００ｇ）を挙げることができる。特に、シュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica）JCM 11752株を用いる場合は培養温度を３３〜３７℃に設定することが好ましいという知見を得ている。
本発明の使用微生物、特に前記シュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica JCM 11752）株を用いてマンノシルエリスリトールリピッドを生産する場合の好適な培地組成は、以下のとおりである。
酵母エキス；０．１〜２ｇ／Ｌが好ましく、１ｇ／Ｌが特に好ましい
硝酸ナトリウム；０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．５ｇ／Ｌが特に好ましい。
リン酸２水素カリウム；、０．１〜２ｇ／Ｌが好ましく、０．４ｇ／Ｌが特に好ましい。
硫酸マグネシウム；、０．１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
油脂類；８０ｇ／Ｌ以上が好ましく、１８０ｇ／Ｌが特に好ましい。
【００２０】
本発明の新規ＭＥＬの製造方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、種培養、本培養及びマンノシルエリスリトールリピッド生産培養の順にスケールアップしていくことが望ましい。
これらの培養における、培地、培養条件を例示すると以下のとおりである。
ａ）種培養；グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地４ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行う。
ｂ）本培養；所定量の植物性油脂等の油脂類と、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３３〜３７℃で２日間培養を行う。
ｃ）マンノシルエリスリトールリピッド生産培養；所定量の植物性油脂等の油脂類と酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム ０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、３３〜３７℃で８００ｒｐｍの撹拌速度で培養を行う。この培養においては、培養途中から植物性油脂を培養容器中に流下させて、培地中の油脂類濃度を４０〜２００ｇ／Ｌに保持することが望ましい。
【００２１】
炭素源としては油脂類であれば特に制限がなく、例えば、植物油脂としては、大豆油、菜種油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、バーム油等が挙げられ、これらの中でも、大豆油が好ましい。これらは、１種を単独で又は２種以上を適宜混合して用いてもよい。
【００２２】
培養終了後、等〜４容積倍の酢酸エチルで脂質成分を抽出し、酢酸エチルを、エバポレーターを用いて留去して脂質及び糖脂質成分を回収する。この脂質成分を等量のクロロホルムに溶解し、これをシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム、クロロホルム：アセトン（７０：３０）、アセトン：クロロホルム（４０：６０）、アセトンの順で溶出させる。各溶液を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートにチャージし、クロロホルム：メタノール：アンモニア水＝６５：１５：２（容積比）で展開する。展開終了後、アンスロン硫酸試薬で糖脂質の存在を確認する。糖脂質の含まれる溶出液を集め、溶媒を留去して糖脂質成分を得る。
【００２３】
得られた糖脂質成分を再度クロロホルムに溶解し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムを搭載した分取ＨＰＬＣシステムを用いることで、分子量の異なるフラクションに分離、回収する。各フラクション分離物についてＴＬＣ分析を行い、原料である油脂類、脂肪酸、グリセリンエステル等を除いた糖脂質成分のみが含まれているフラクションについて、再度シリカゲルクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム：アセトン＝８５：１５（容積比）で溶出させ、ＴＬＣで単一のバンドを示す糖脂質成分を単離することにより、本発明の新規ＭＥＬを得ることができる。
【００２４】
〈新規ＭＥＬの構造決定〉
上記により得られる糖脂質成分の構造決定は、以下のようにして行う（シュードザイマ・パラアンタクティカ（Pseudozyma parantarctica JCM 11752 株）を用いて大豆油を炭素源として培養して得られた新規ＭＥＬの構造決定手法を例にして以下説明する）。
単離した糖脂質成分は、ＴＬＣプレート上で、アンスロン硫酸試薬で青緑色に呈色することにより糖脂質成分であると判断できる。この糖脂質について、1Ｈ、13Ｃ、二次元ＮＭＲ解析を行い、得られたスペクトルと、構造既知である従来型のマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ−Ａ〜Ｄ）（式２）のスペクトルとを比較することで、構造解析を行う。
【００２５】
【化２】
１）糖組成の解析
糖脂質の糖組成の決定は、アルカリ（ＮａＯＣＨ３）でケン化して得られた糖鎖のＮＭＲ解析により行う。得られた糖脂質と従来型のＭＥＬの糖鎖のＮＭＲスペクトルを比較することで、本発明のＭＥＬの糖鎖部分の構造が、従来型ＭＥＬと同じ４−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトール構造を有し、本糖脂質が新規構造のＭＥＬであることを確認できる。
【００２６】
２）脂質組成の解析
一方、脂質部分の組成は、得られた糖脂質を塩酸メタノールでメタノリシスし、ヘキサンで抽出して得られた脂肪酸メチルエステルのＧＣ／ＭＳで分析することにより決定する。
【００２７】
３）脂肪酸成分の結合部位の解析
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは、一般に糖アルコール上の還元末端以外のプロトンは３．５ｐｐｍ前後にまとまって検出されるが、水酸基の水素がアシル基とエステル結合すると、そのα−プロトンのシグナルは低磁場にシフトすることが知られている。本糖脂質の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、従来型ＭＥＬ（ＭＥＬ−Ａ）のものと比較し、各プロトンに由来するピークの化学シフトを帰属した後、どの水酸基に何分子アシル基が結合しているかを類推する。また、２ｐｐｍ付近に観測されるアセチル基（−ＣＯＣＨ3）由来のシグナルを確認することで、結合しているアシル基の何分子が酢酸で、何分子が脂肪酸であるかを予測する。
【００２８】
次に、ＨＭＱＣ（Heteronuclear Multiple Quantum Coherence）、ＨＭＢＣ（Heteronuclear Multiple Bond Coherence）スペクトル解析を行い、上記の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲ解析の結果を基にして糖骨格の完全帰属を行う。ＨＭＱＣスペクトルによって、マンノース及びエリスリトール上の炭素、水素の化学シフトをそれぞれ完全帰属する。また、ＨＭＢＣスペクトルにおいて、どの水酸基に酢酸と脂肪酸がエステル結合しているかを証明する。
【００２９】
得られた糖脂質は脂質部分の脂肪酸鎖長が異なる成分の混合物として回収されるが、さらにこれは逆相カラム（ODSカラム）を用いたHPLC分析を行うことで分離できる。分離した各ピーク化合物についてMS分析を行うことで主成分の構造を決定する。
【００３０】
さらに、これらの菌体が生産する化合物群には、ＴＬＣ上で他にもいくつかのスポットが検出されており、マンノース上のアセチル基の数とその結合位置の異なる成分、エリスリトール上に結合している脂肪酸の数と結合位置の異なる成分等も存在していることが認められる。
【００３１】
本発明の新規ＭＥＬは、優れた界面活性能を有するため、バイオサーファクタントとして用いることができる。界面活性能については、下記の方法で簡易に観察することができる。
【００３２】
〈界面活性能の観察〉
単離した新規ＭＥＬの水溶液を疎水性のフィルム上にスポットし、その表面張力の変化を観察する。また、コントロールとして水、及び従来型ＭＥＬの水溶液をそれぞれスポットして比較する。
【実施例】
【００３３】
実施例１
（Pseudozyma parantarctica JCM 11752株の培養）
ａ）種培養；グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム ０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地４ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養を行い、次いで、
ｂ）本培養；得られた菌体培養液を大豆油１６０ｇ／Ｌと、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地１００ｍＬの入った坂口フラスコに接種して、３５℃で行い、さらに
ｃ）（マンノシルエリスリトールリピッド生産培養）これを大豆油１６０ｇ／Ｌと酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム ０．５ｇ／Ｌの組成の液体培地５００ｍＬが入った坂口フラスコに接種して、３５℃で３００ｒｐｍの撹拌速度で培養を行った。
上記ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を、７日間行い、得られたPseudozyma parantarctica JCM 11752株の菌体培養液に等量の酢酸エチルを添加・攪拌して、酢酸エチル抽出物を得た。この酢酸エチル抽出物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供し、糖脂質を青緑色に発色させるアンスロン試薬を用いて、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）の生産を確認した。展開溶媒はクロロホルム：メタノール：７Ｎアンモニア水= ６５：１５：２ を用いた。比較例としてPseudozyma antarctica KM-34(FERMP-20730) 株由来のＭＥＬ精製標品を用いた。結果を図１に示す。なお、図中、左端は従来型ＭＥＬの標準であり、ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ及びＭＥＬ−Ｃはそれぞれ先述の式（２）で表される化合物を示す。これによれば、両株とも大豆油含有培地でＭＥＬを生産しており、さらに、ＭＥＬよりＲｆ値の高い（上方）位置に糖脂質の存在を示す青緑色のスポットが生じている。
【００３４】
実施例２
（Pseudozyma parantarctica JCM 11752株の培養）
上記ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を、２日間行い、さらにｃ）の培養７日間行い、得られたPseudozyma parantarctica JCM 11752株の菌体培養液に等量の酢酸エチルを添加・攪拌して、酢酸エチル抽出物を得た。この酢酸エチル抽出物をＴＬＣに供し、糖脂質を青緑色に発色させるアンスロン試薬を用いて、ＭＥＬの生産を確認した。比較例としてPseudozyma antarctica KM-34(FERMP-20730) 株由来のＭＥＬ精製標品を用いた。結果を図２に示す。これによれば、両株とも大豆油含有培地でＭＥＬを生産しており、さらに、ＭＥＬよりＲｆ値の高い（上方）位置に糖脂質の存在を示す青緑色のスポットが生じている。
【００３５】
実施例３
（Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株の培養）
上記ａ）の培養を１日間行った後、ｂ）の培養を、３０℃で７日間行い、得られたPseudozyma rugulosa NBRC 10877株の菌体培養液に等量の酢酸エチルを添加・攪拌して、酢酸エチル抽出物を得た。この酢酸エチル抽出物をＴＬＣに供し、糖脂質を青緑色に発色させるアンスロン試薬を用いて、ＭＥＬの生産を確認した。比較例としてPseudozyma antarctica KM-34(FERMP-20730) 株由来のＭＥＬ精製標品を用いた。結果を図３に示す。これによれば、両株とも大豆油含有培地でＭＥＬを生産しており、さらに、ＭＥＬよりＲｆ値の高い（上方）位置に糖脂質の存在を示す青緑色のスポットが生じている。
【００３６】
実施例４
（Pseudozyma parantarctica JCM 11752株由来マンノシルエリスリトールリピッドの精製）
実施例２で得られたマンノシルエリスリトールリピッドの精製を、既知の精製手法によって分離した。すなわち、上記酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムに供し、クロロホルムとアセトンの混合液を展開溶媒とするカラムクロマトグラフィーで精製した。クロロホルムとアセトンの割合は、７０：３０で残存原料と脂肪酸を含むMEL-AよりRf値の高い物質を分離回収し、続いて４０：６０でMEL-A、-B、-Cを分離回収した。そして、それぞれの回収した画分を上記ＴＬＣに供した（図４）。これによれば、構造不明の糖脂質はクロロホルム：アセトン＝７０：３０の画分に検出できた。
【００３７】
実施例５
（構造不明糖脂質の単離・精製）
実施例４で得られた構造不明の糖脂質を含む画分を全て回収し、エバポレーターを用いて溶媒を留去した後、再度クロロホルムに溶解させ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムを搭載したリサイクル分取ＨＰＬＣシステムを用いることで、分子量の異なるフラクションに分離、回収した。リサイクル回数を増やすことで大きく３つのフラクションに分離された。クロマトグラムを図５に示す。
【００３８】
各フラクション成分を上記ＴＬＣに供した（図６）。これによれば、ＨＰＬＣ分析において最も高分子量であったフラクション（１）に構造不明の糖脂質が含有されていることが確認された。
【００３９】
さらに上記フラクション（１）をシリカゲルカラムに供し、クロロホルムとアセトンの混合液を展開溶媒とするカラムクロマトグラフィーで精製した。クロロホルムとアセトンの割合は８５：１５とし、回収したそれぞれの画分を上記ＴＬＣに供した（図７）。これによれば、フラクション（１）中には単一成分である主な２つの成分（a）、（ｂ）、及びその他の分離できない成分があることが分かる。
以降、フラクション（１）中の成分（a）の成分について詳細に説明する。
【００４０】
実施例６
（構造不明糖脂質の構造解析）
１）糖組成の解析
実施例５で得られた糖脂質を、メタノール中でナトリウムメトキシドによって加水分解を行った。反応終了後の生成物を酢酸エチル中に再沈殿させて回収し、９０％エタノール中で再結晶操作を行うことにより糖鎖の結晶を得た。従来型ＭＥＬについても同様の操作で糖鎖を回収し、得られた各糖鎖について、重水素化ジメチルスルホキシド（DMSO-ｄ６）を溶媒として１H−ＮＭＲ解析を行った。その結果、本糖脂質と従来型のＭＥＬの糖鎖のＮＭＲスペクトルは完全に一致した。よって以上の結果から、実施例５で得られた構造不明糖脂質の糖鎖部分の構造は、従来型MELと同様４−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−ｍｅｓｏ−エリスリトールであり、本糖脂質が新規構造のＭＥＬであることが予想された。
【００４１】
２）脂質組成の解析
実施例５で得られた糖脂質の脂質部分の組成は、塩酸メタノール加水分解物からヘキサンで抽出して得られた脂肪酸メチルエステルのGC/MS分析により行った。分析結果とGCチャートを図８に示す。比較のために構造既知である従来型MEL（MEL-A）のチャートも示す。分析の結果、本糖脂質では、短〜中鎖の脂肪酸（C８〜C１２）の直鎖飽和及び不飽和脂肪酸が主成分として検出さる点で従来型のものとよく一致したチャートが得られたが、さらに長鎖脂肪酸（C１６、１８）が含まれていることが示された。特に、不飽和基を一つ有するC１８の脂肪酸（オレイン酸）が主成分として検出された。以上の結果より、本糖脂質では従来型のMELに対してもう１つこれらの長鎖脂肪酸がエステル結合していると予測された。
【００４２】
３）脂肪酸成分の結合部位の解析
実施例５で得られた糖脂質について、重クロロホルム（CDCｌ３）を溶媒とするＮＭＲ解析により構造の同定を行った。本糖脂質の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図９）は、構造既知である従来型ＭＥＬ（ＭＥＬ−Ａ）のものと比較して非常によく一致しており、特にマンノース上のＨ−２’〜４’、６’のプロトンに由来するピークの化学シフトは完全に一致した（Ｈ−２’；５．５１ｐｐｍ、Ｈ−３’；５．０７、Ｈ−４’；５．２７、Ｈ−６’；４．２０ｐｐｍ）、このことから本糖脂質は従来型のMEL−Aと同様、マンノース上の４つの水酸基の全てにアシル基が結合していると同定できる。一方、本糖脂質ではさらに、アシル基とエステル結合したことで低磁場シフトしたα−プロトンのシグナルが４．３ｐｐｍ付近にも観測された。以上の結果から、本糖脂質は従来型のＭＥＬとは異なりエリスリトール上の水酸基にもアシル基が結合していることが示された。さらに、２．１０ｐｐｍと２．０３ｐｐｍに２分子のアセチル基（−ＣＯＣＨ3）のメチルプロトンの存在を示すシグナルが観測されたことから、合計５分子のアシル基のうち、２分子が酢酸で３分子が脂肪酸であると同定できる。
【００４３】
次に、ＨＭＱＣ（Heteronuclear Multiple Quantum Coherence）、ＨＭＢＣ（Heteronuclear Multiple Bond Coherence）スペクトル解析を行い、糖骨格の完全帰属を行った。ＨＭＱＣスペクトル（図１０）により、マンノース及びエリスリトール上の炭素、水素の化学シフトがそれぞれ完全帰属された。また、ＨＭＢＣスペクトル（図１１）において、Ｈ−４’とＨ−６’のプロトンシグナルが、アセチル基由来のカルボニル基のシグナル（１６９．６ｐｐｍと１７０．９ｐｐｍ）とそれぞれカップリングしていることが認められたことから、マンノースの４’位と６’位には酢酸がエステル結合していることが証明された。さらに、Ｈ−２’とＨ−３’、及びＨ−１（４．３ｐｐｍ）のプロトンシグナルが、脂肪酸アシル基由来のカルボニル基のシグナル（173.4ppm、172.9ppm、及び174.7ppm）とそれぞれカップリングしていることが認められたことから、マンノースの２’、３’位及びエリスリトールの１位には脂肪酸がエステル結合していることが証明された。
【００４４】
以上のことから、本糖脂質の構造は、１−アルカノイル−４−（４’，６’−ジ−Ｏ−アセチル−２’，３’−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル−）ｍｅｓｏ−エリスリトールと同定できた。
【００４５】
さらに、この糖脂質はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析において、擬似分子イオン［Ｍ＋Ｎａ］+ ｍ／ｚ ９３５．９が検出された（図１２）。この結果と脂肪酸組成分析の結果から、本糖脂質はマンノシルエリスリトール骨格の２’位と３’位の水酸基にC８及びC１０の直鎖飽和脂肪酸が１つずつエステル結合しており、１位水酸基にオレイン酸が結合している構造の化合物が主成分であることが示唆される。
【００４６】
また、フラクション（１）中の成分（ｂ）について同様の解析を行った結果、これは上記の新規MELに対して、マンノース上の４’位の水酸基に酢酸エステルが存在しない、１−アルカノイル−４−（６’−Ｏ−アセチル−２’，３’−ジ−Ｏ−アルカノイル−β−Ｄ−マンノピラノシル−）ｍｅｓｏ−エリスリトールであることが確認された。図１３にその1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【００４７】
これらの菌体が生産する化合物群には、上記のようにマンノース上のアセチル基の数との結合位置の異なる成分が存在しており、またTLC上にはエリスリトール上に結合している脂肪酸の数と結合位置の異なる成分と思しきスポット等も認められている。
【００４８】
実施例７
（界面活性能の観察）
実施例５で得られた新規ＭＥＬの希釈水溶液を作成し、疎水性のフィルム上にスポットすることで、その表面張力の変化を観察した。また、コントロールとして水、及び従来型ＭＥＬ（ＭＥＬ−Ａ）の水溶液をそれぞれスポットして比較した。これらの結果を図１４に示す。これによれば、本発明での糖脂質は水溶液の表面張力が低下しており、界面活性剤としての機能を有することが示された。また、本糖脂質の水溶液のスポットは、従来型ＭＥＬと比較するとスポットの広がりは小さくなった。本糖脂質は親油基である脂肪酸エステルの結合数が従来型ＭＥＬよりも１つ多いため、より疎水的なバイオサーファクタントであると推測されるが、本観察の結果はそれを示唆するものであった。
【００４９】
さらに、新規ＭＥＬとＭＥＬ−Ａを任意の割合で混ぜたＭＥＬ混合水溶液（０．５mg/mL）を作成し、疎水性のフィルム上にスポットすることで、その表面張力の変化を観察した（図１５）。新規ＭＥＬの混合比を増加させることで、表面張力の低下率を容易に制御できることが示された。新規ＭＥＬは従来型ＭＥＬの類似骨格を有しており、これを混合することは溶液の性質を変えることなく界面活性を調節できると推測される。したがって、他の合成界面活性剤やバイオサーファクタントを混合するよりも有効と考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の糖脂質は従来型ＭＥＬと比較して、より親油的でバルキーな置換基が導入されており、ＨＬＢ、相挙動等が大きく異なっている。本発明の新規ＭＥＬを従来の系に数％添加するだけで構造・組成の類似性から活性剤そのものの性質を変えることなく、乳化、可溶化、分散化能を広く調整することが可能である。糖脂質型バイオサーファクタントとして本来有する特性である分解性の高さや低毒性、環境適合性、高生理活性に加え、目的に応じて界面活性を幅広く調整できる利便性等を利用して、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等に広く利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】実施例１で、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が新規糖脂質を生産していることを示す薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。
【図２】実施例２で、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が新規糖脂質を生産していることを示す薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。
【図３】実施例３で、Pseudozyma rugulosa NBRC 10877株が新規糖脂質を生産していることを示す薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。
【図４】実施例４で、Pseudozyma parantarctica JCM 11752株が生産する新規糖脂質をカラムクロマトグラフィーで分離した結果を示す薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。
【図５】実施例４で得られた構造不明の糖脂質を含む画分（クロロホルム：アセトン＝７０：３０画分）について、サイズ排除クロマトグラフィーカラムを搭載したリサイクル分取HPLC分析を行った結果を示すクロマトグラムである。
【図６】実施例５でHPLCによって分子量の違いで分離した各フラクションの薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。
【図７】実施例５でHPLCによって分離したフラクション（１）について、カラムクロマトグラフィーで分離した結果を示す薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。
【図８】実施例５で得られた糖脂質成分（a）及び従来型MEL（MEL-A）について、GC/MS分析により行った脂肪酸組成分析結果を示す成分表とGCチャートである。
【図９】実施例５で得られた糖脂質成分（a）の1HNMRスペクトルである。
【図１０】実施例５で得られた糖脂質成分（a）のHMQCスペクトルにおいて、糖骨格の1H-13C相関を示す部分の拡大図である。
【図１１】実施例５で得られた糖脂質成分（a）のHMBCスペクトルにおいて、糖骨格とカルボニル基との相関を示す部分の拡大図である。
【図１２】実施例５で得られた糖脂質成分（a）のMALDI-TOF/MS測定結果を示すマススペクトルにおいて、主成分の擬似分子イオンの分子量付近の拡大図である。
【図１３】実施例５で得られた糖脂質成分（ｂ）の1H NMRスペクトルである。
【図１４】実施例５で得られた糖脂質の水溶液を疎水性フィルム上にスポットし、その表面張力を観察した結果を示す写真である。
【図１５】実施例５で得られた糖脂質と従来型ＭＥＬの混合水溶液を疎水性フィルム上にスポットし、その表面張力を観察した結果を示す写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（１）で表されるマンノシルエリスリトールリピッド。
【化１】
（式中、Ｒ１は、同一でも異なっていてもよい炭素数６〜２０の脂肪族アシル基であり、Ｒ２は水素又はアセチル基、Ｒ３は水素又は炭素数６〜２０の脂肪族アシル基を表す。）
【請求項２】
上記式中、Ｒ１で示される各置換基、及びＲ３で示される置換基が、 それぞれ炭素数６〜２０の飽和又は不飽和脂肪族アシル基からなることを特徴とする、請求項１に記載のマンノシルエリスリトールリピッド。
【請求項３】
シュードザイマ属に属し、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物から請求項１又は２に記載のマンノシルエリスリトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項４】
生産培地に油脂類を加えることを特徴とする請求項３に記載の糖脂質の製造方法。
【請求項１】
次の式（１）で表されるマンノシルエリスリトールリピッド。
【化１】
（式中、Ｒ１は、同一でも異なっていてもよい炭素数６〜２０の脂肪族アシル基であり、Ｒ２は水素又はアセチル基、Ｒ３は水素又は炭素数６〜２０の脂肪族アシル基を表す。）
【請求項２】
上記式中、Ｒ１で示される各置換基、及びＲ３で示される置換基が、 それぞれ炭素数６〜２０の飽和又は不飽和脂肪族アシル基からなることを特徴とする、請求項１に記載のマンノシルエリスリトールリピッド。
【請求項３】
シュードザイマ属に属し、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物から請求項１又は２に記載のマンノシルエリスリトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【請求項４】
生産培地に油脂類を加えることを特徴とする請求項３に記載の糖脂質の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２００７−２６９６６３（Ｐ２００７−２６９６６３Ａ）
【公開日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−９５８８２（Ｐ２００６−９５８８２）
【出願日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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