新規レチノイド誘導因子およびその使用
本発明は、新規レチノイド応答性核酸、および新規タンパク質を記載する。さらに、本発明は、様々な疾患におけるかかる核酸またはタンパク質の使用、ならびに様々な疾患の治療、診断および予後のためのその使用、さらにレチノイド類に対する応答性の予後のための方法のためのその使用も記載する。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、新規レチノイド応答性核酸、および新規タンパク質に関する。さらに、本発明は、様々な疾患におけるかかる核酸またはタンパク質の使用、ならびに様々な疾患の治療、診断および予後のためのその使用、さらにレチノイド類に対する応答性の予後のための方法のためのその使用にも関する。
【発明の背景】
【０００２】
レチノイド類は多くのヒト組織において抗癌性を有する。これらの薬剤は、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）の治療においてそれらの有効性が特に証明されており、急性前骨髄球性白血病はこれらの薬剤に対する応答性のモデルとして用いることができる癌である。重要なことには、レチノイド受容体は十分に特定されており（ＲＡＲ、ＲＸＲ、ＰＭＬ−ＲＡＲ）この２０年広く研究されているが、それらの抗増殖性および抗癌性に関与するそれらの標的遺伝子の大部分はまだ明らかにされないままである。本発明者らは、マイクロアレイアプローチにより、本発明者らが初めて機能的に特徴付けＲＩＮＦ（レチノイド誘導核因子(Retinoid-Inducible Nuclear Factor)）と名付けた核因子をコードする、レチノイド類の新たな標的遺伝子、ＣＸＸＣ５を同定した。
【０００３】
ＲＩＮＦ発現は、レチノイド類によって引き起こされる白血病細胞の最終分化に必要であるように思われる。実際には、ＲＩＮＦ発現が白血病細胞のレチノイド誘導性分化や正常ＣＤ３４＋前駆体のサイトカイン誘導性骨髄造血に関連があるだけでなく、さらに、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）干渉がこの遺伝子について正常骨髄造血および腫瘍性骨髄造血の両方において調節機能を誘因する。また、ＲＩＮＦは癌において重要な役割を果たすこともある。興味深いことに、ＲＩＮＦ遺伝子は骨髄性白血病（急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］／骨髄異形成［ＭＤＳ］）では欠失していることが多い小領域５ｑ３１．３に局在する。
【０００４】
造血幹細胞の最終成熟顆粒球への分化は、系統限定転写因子により調整される遺伝子群の協調的発現を必要とする多段プロセスである。これまでのところ、造血に不可欠であると証明されている転写因子は比較的少数である。これらの因子の脱調節または突然変異は、細胞の運命を分化から増殖へと変え、骨髄、血液、および他の組織における成熟停止および未成熟芽球の蓄積を特徴とする悪性血液疾患群である急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の一因となり得る。
【０００５】
急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）としても知られるＡＭＬ−Ｍ３サブタイプ(the French-American-British（ＦＡＢ）分類による)は、顆粒球への分化の前骨髄球段階において阻止される白血病芽球のクローン性増加に相当する。この病変は、ｔ（１５；１７）転座を遺伝的特徴とし、最終分化を回復する転写に基づく療法により治療した最初の癌の代表である。実際には、この病変において、薬理学的用量の全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）は白血病芽球の最終成熟を引き起こす。分子レベルにおいて、ＡＴＲＡは、ＡＰＬ細胞においてレチノイン酸受容体（ＲＡＲα、ＰＭＬ−ＲＡＲα．．．）のリガンドとして働くことが分かっており、下流の標的遺伝子の転写活性化を調節する。実験モデル、ＮＢ４細胞系統を用いた広範な研究にもかかわらず、これまでのところ前骨髄球細胞のレチノイド誘導性分化に実際に不可欠であることが示されている、転写因子をコードする標的遺伝子はほんの数種類である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、マイクロアレイアプローチを用いることにより、ＮＢ４細胞においてレチノイド類により早期に誘導され、ＡＴＲＡによる最終分化の回復に関与する可能性がある転写因子をコードするいくつかの新規遺伝子を同定した。レチノイド処置により誘導されるこれらの遺伝子の１つは、本発明者らがＲＩＮＦ（レチノイド誘導核因子）と名付けた核因子をコードする。ＲＮＡ干渉によるＲＩＮＦ無効化は、レチノイド耐性表現型を強化することによりＮＢ４細胞におけるＡＴＲＡの分化作用を排除し、正常ＣＤ３４＋骨髄前駆体のサイトカイン誘導性顆粒球分化を遅延させることから、骨髄分化におけるＲＩＮＦの重要で一般的な調節的役割が示される。
【発明の具体的説明】
【０００７】
本発明の第一の実施態様は、配列番号１および配列番号２の配列またはその機能的断片もしくは変異体、またはそれとハイブリダイズ可能な機能的に同等の単離ＤＮＡ配列、またはそれに対応するｍＲＮＡを含んでなることを特徴とする新規レチノイド応答性核酸に関する。
【０００８】
本発明の第二の実施態様は、配列番号３（ＣＸＸＣ５）の配列またはその機能的断片もしくは変異体を含んでなることを特徴とするタンパク質またはタンパク質誘導体に関する。
【０００９】
本発明の第三の実施態様は、様々な疾患の予防および／または治療のための医薬組成物の製造のための、請求項２に記載のタンパク質もしくはタンパク質配列、または請求項１に記載の核酸の使用に関する。
【００１０】
好ましい実施態様は、哺乳類における、造血疾患の予防および／または治療、または造血細胞の分化の増進に関する。さらなる実施態様は、in vitroまたは哺乳類における造血細胞の分化および／または増殖増進の障害または阻止に関する。
【００１１】
前記造血細胞は、骨髄細胞、末梢血液細胞、臍帯血液細胞であり得、その細胞は腫瘍性または非腫瘍性であり得る。
【００１２】
好ましい使用は、リンパ系細胞または急性骨髄性白血病細胞などの細胞における分化の回復のための使用である。
【００１３】
前記造血疾患は、骨髄異形成（ＭＤＳ，骨髄異形成症候群）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄増殖性症候群（ＭＰＳ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）または慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）であり得る。
【００１４】
好ましい実施態様は、癌の予防および／または治療に関する。
【００１５】
前記癌は、白血病、（骨髄異形成（ＭＤＳ，骨髄異形成症候群）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄増殖性症候群（ＭＰＳ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および固形腫瘍（乳癌、黒色腫、肺癌、甲状腺癌、前立腺癌、神経芽腫、および腎癌）を含んでなる群から選択される癌タイプのうちの１つであり得る。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、それを必要とする哺乳類において、請求項１に記載の核酸の発現を活性化するための、および／または請求項２に記載のタンパク質もしくはタンパク質配列の発現を増強するための、レチノイドの使用に関する。好ましい実施態様はＡＴＲＡである。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、ＣＸＸＣ５の発現を、レトロウイルスまたはレンチウイルスのベクター（過剰発現）により、またはｓｈＲＮＡ分子（抑制）により調節する方法に関する。
【００１８】
本発明のさらなる実施態様は、レチノイド応答性の予後の、または疾患の予後のための方法に関する。
【００１９】
本発明のさらなる実施態様は、癌または造血疾患、または骨髄造血減少状態の診断のための方法であって、本発明による核酸の発現レベルおよび／または状態、または本発明によるタンパク質もしくはタンパク質配列の発現レベルおよび／または状態の検出を含んでなる方法に関する。好ましい実施態様は、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）遺伝子型の診断に関する。もう１つの好ましい実施態様は、白血病、前白血病（骨髄異形成）または癌の状態の診断に関する。好ましい実施態様は、診断のために抗体を用いる。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造のために、本発明によるタンパク質配列または核酸を用いる。
【００２１】
さらなる態様は、分子を癌細胞にターゲッティングする方法に関する。
【００２２】
さらなる態様は、請求項２に記載のタンパク質またはタンパク質配列と、または請求項１に記載のヌクレオチドと相互作用することができる分子に関する。
【００２３】
定義
造血(Hematopoiesis)：
造血(Hematopoiesis)（古代ギリシャ語：「haima」血液；「poiesis」作ること）（hemopoiesisと呼ばれることもある）は、血液細胞成分（赤血球、血小板、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）、単球、マクロファージ、およびリンパ球（Ｂ、ＴおよびＮＫ）を形成することである。血液細胞成分は総て造血幹細胞に由来する。
【００２４】
造血細胞：
造血組織の任意の細胞（リンパ系、骨髄の細胞を含む）。この細胞は、幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞（骨髄またはリンパ系の共通前駆体）、委任細胞または最終分化血液細胞であり得る。
【００２５】
骨髄造血：骨髄幹細胞による骨髄における多能性造血幹細胞からの骨髄細胞の形成。骨髄造血とは、一般的に、単球および顆粒球などの、血液中の白血球の生産を意味する。このプロセスは、リンパ系組織において見られるマクロファージおよび樹状細胞の前駆細胞も生産する。血液学において、「骨髄細胞」という用語は、リンパ球ではない任意の白血球を記載しさらに顆粒球、単球、マクロファージおよび樹状細胞に加えて赤血球および血小板(erythrocytes(platellet))も含むように用いられる。
【００２６】
急性骨髄性白血病(Acute myeloid leukemia)（ＡＭＬ）：
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（acute myelogenous leukemiaとしても知られる）は、骨髄に蓄積し正常な血液細胞の生産を妨げる異常細胞の急速増殖を特徴とする白血球の骨髄系癌である。ＡＭＬの症状は正常な骨髄が白血病細胞で置き換えられることによって起こり、その結果、赤血球、血小板、および正常な白血球の減少が起こる。これらの症状としては、倦怠感、息切れ、あざや出血が生じ易いこと、および感染症の危険性の増加が挙げられる。ＡＭＬは成熟時計を特徴とする。the French-American-British（ＦＡＢ）分類によれば、ＡＭＬの８つのサブタイプは、分化が阻止される段階、関係している造血コンパートメント、および白血病細胞の成熟度に基づいて区別することができる（Ｍ０〜Ｍ７）。
【００２７】
遺伝子またはタンパク質の「状態」とは、その遺伝子またはタンパク質の配列解析または発現レベル、および遺伝子のコピー数、およびメチル化状態を意味する。
【００２８】
レチノイド類：ビタミンＡと構造的にまたは機能的に関連している化学化合物の種類。本願において、レチノイドという用語は、レチノイン酸受容体と結合し活性化することができる任意の化合物を意味する。これらの受容体は、直接標的遺伝子のプロモーター中に存在するレチノイン酸応答性エレメント（ＲＡＲＥ）に結合し通常それらのリガンド（例えば、レチノイン酸）との結合後に遺伝子の転写を活性化する。
【００２９】
本明細書において、レチノイド応答性遺伝子またはタンパク質は、レチノイド（レチノイン酸など）による処置により発現レベルが誘導される遺伝子またはタンパク質である。
【００３０】
レチノイド応答性の予後：
レチノイド類による療法に応答するのは白血病または癌の細胞のうちのほんのわずかである。さらに、この療法に対する臨床応答は通常、患者に有益な効果があるまで数日または数週間の処置を必要とする。これらの薬剤による疾患治療の後の結果を予測することができる、レチノイド応答性についての初期遺伝子またはタンパク質バイオマーカーの存在は、患者がかかる治療を受けるべきかまたは別の治療を受けるべきかを臨床医が判断するに際して助けになる重要な予後指標となるであろう。
【実施例】
【００３１】
実験の節
材料および方法
細胞培養、処置およびＲＮＡ調製
ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ７）および骨髄細胞（ＮＢ４、ＮＢ４−ＬＲ１、ＮＢ４−ＬＲ２、Ｋ５６２、ＬＡＭＡ−８４およびＨＬ６０）を、１０％ウシ胎児血清(Biochrom AG)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０単位／ｍｌペニシリンＧおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン(lnvitrogen)を添加したＲＰＭＩ １６４０培地(lnvitrogen)で培養し、５％ＣＯ２／加湿雰囲気中暗所にて３７℃でインキュベートした。ヒト骨髄一次ＣＤ３４＋細胞(StemCell technologies)のin vitro増加のため、本発明者らは、上記培地に２０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン３（ＩＬ３）、２０ｎｇ／ｍＬの顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびPeprotechから購入した幹細胞因子（ＳＣＦ）５０ｎｇ／ｍＬを添加した。Duprez E, Ruchaud S, Houge G, et al. A retinoid acid 'resistant’ t(15;17) acute promyelocytic leukemia cell line: isolation, morphological, immunological, and molecular features. Leukemia. 1992; 6: 1281-1287.において従前に記載されているようにＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ（ＭＧＧ）染色による形態学によりおよびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）還元解析により成熟を評価した。細胞密度は、コールターカウンター(Beckman)を使用して決定した。細胞増殖は、式：ＰＤ＝Ｌｏｇ（Ｎ／Ｎ０）／Ｌｏｇ２（式中、Ｎは計数した細胞数であり、Ｎ０は第０日目に播種した細胞数である）により算出される集団倍加数（ＰＤ）として表した。ＡＴＲＡ(Sigma)により処置した細胞または処置していない細胞を一緒に集め、Ｔｒｉｚｏｌ(Invitrogen)またはＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ(Qiagen)を用いるＲＮＡ調製のためにそのまま−８０℃で保存した。抽出されたＲＮＡの収量および品質をＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計(NanoDrop Technologies)により評価した。
【００３２】
マイクロアレイハイブリダイゼーション
マイクロアレイ実験は総て、化学発光検出に基づいているＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢ）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｒｒａｙ ｓｙｓｔｅｍを使用して行った。ＡＢヒトマイクロアレイは、２７，８６８の個別ヒト遺伝子を表す３１，７００のオリゴヌクレオチドプローブ（６０量体）を含む。標識する前に、抽出されたＲＮＡの量および品質をＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計およびＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザ(Agilent technologies)により確認した。ＡＢ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＲＴ−ＩＶＴ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（ＰＮ ４３６３２５２, Roche）を利用して各サンプルから２μｇの全ＲＮＡを（ＤＩＧ−ｄＵＴＰを用いて）ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ｃＲＮＡに変換した。ＤＩＧ標識ｃＲＮＡの量（５０〜７０μｇ）および品質は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計およびＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザにより制御した。２０μgのＤＩＧ標識ｃＲＮＡをＡＢ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｕｒｖｅｙ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｖｅｒｓｉｏｎ １．０と製造業者の使用説明書によりハイブリダイズした。マイクロアレイの化学発光シグナル検出、画像取得および画像解析は、ＡＢ １７００ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＰＮ ４３３８０３６）において製造業者のプロトコール（ＰＮ ４３３９６２９）に従って行った。画像に自動グリッド表示し、化学発光シグナルを定量し、バックグラウンドについて補正し、最後に、ＡＢ １７００ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．０３（ＰＮ ４３３６３９１）を使用してスポットおよび空間的に正規化した。解析には合計６つのマイクロアレイを用いた。３時間の時点においてＮＢ４サンプルについて２つのレプリケート（独立した標識および独立したハイブリダイゼーション工程）を作成した。アレイ間正規化のため、各アレイについて同じシグナル強度中央値を達成するために本発明者らは総てのマイクロアレイでグローバルな中央値正規化を行った。マイクロアレイ実験についてのＭＩＡＭＥ対応の資料は、欧州バイオインフォマティクス研究所(the European Bioinformatics Institute) (www.ebi.ac.uk/arrayexpress)のＡｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓに受託番号Ｅ−ＢＡＳＥ−７で寄託されている。
【００３３】
マイクロアレイデータ解析および遺伝子分類
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してシグナルおよびシグナル対ノイズ比（ＳＩＨ）を抽出した。研究には５，０００を超える平均正規化シグナル強度と６００より低いバックグラウンド中央値を示すマイクロアレイだけを含めた。シグナル強度をDysvik B, Jonassen I. J-Expressに従ってＪ−Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｒｏ Ｖ２．７ソフトウェア(MolMine, Bergen, Norway)にインポートし：Java. Bioinformatics. 2001 ;17:369-370.を用いて遺伝子発現データを探索し、この際、データに導入される外部変数の影響を最小にするためにアレイ間分位点正規化を行った。適切な場合には、正規化の前に信頼性に欠けるスポットのクオリティーフィルタリング（Ｓ／Ｎ＜３）を行った。同定された総ての遺伝子を、ＰＡＮＴＨＥＲ（商標）(Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships)およびＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（商標）（ＧＯ）を用いて分類した。
【００３４】
定量ＲＴ−ＰＣＲ
オリゴｄＴプライマーをＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ(Roche)とともに用い製造業者の使用説明書に従って２０−μｌ容量において全ＲＮＡ（０，１〜１μｇ）から一本鎖ｃＤＮＡ合成（ＲＴ）を実施した。Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０装置(Roche)においてＳＹＢＲｇｒｅｅｎ検出キットを用い製造業者の使用説明書に従って定量ＰＣＲを行った。各遺伝子（ｃｘｘｃ５、ｃｄ３４、ｇｃｓｆｒおよびｃｄ１１ｂ）について、相対ｍＲＮＡ発現をｒｐＰ２遺伝子発現に対して正規化した。ｃｘｘｃ５（5'-tccgctgctctggagaag-3'および5'-cacacgagcagtgacattgc-3'）、ｒｐＰ２（5'-atgcgctacgtcgcc-3'および5'-ttaatcaaaaaggccaaatcccat-3'）、ｃｄ３４（5'-cagctggagccccacag-3'および5'-gaggtcccaggtcctgagc-3'）、ｇｃｓｆｒ（5'-gtgcccacaatcatggaggag-3'および5'-catcctcctccagcactgtg-3'）、およびｃｄ１１ｂ（5'-ctgctcctggccctcatc-3'および5'-gacccccttcactcatcatgtc-3'）の検出用プライマーは総て、同じリアルタイムＰＣＲ増幅条件で用いられるように設計した：９５℃で１０秒の変性；５８℃で１０秒のアニーリング；７２℃で１２秒の伸長。
【００３５】
図１２、図１３および図１４に示した結果については、定量ＲＴ−ＰＣＲに患者材料を使用している
様々な血液疾患に罹患している９４名の患者および１３名の健康ドナーから一連の１０５の骨髄または血液のサンプルを採取した。様々な病状をthe French-American-British分類（ＦＡＢ． Bennet et al. 1982）およびＷＨＯ分類(Vardiman et al. 2002)により分類し次のとおりであった：５ 染色体５ｑ欠失を有するＭＤＳ、１４ 染色体５ｑ欠失がないＭＤＳ、２０ ＡＭＬ（骨髄サンプル）および３７ ＡＭＬ（血液サンプル）、１４ ＡＬＬ Ｂ（血液）および２ ＡＬＬ Ｔ（血液）。総ての患者がインフォームド・コンセントに署名した。
【００３６】
患者サンプルにおけるＲＩＮＦの定量ＲＴ−ＰＣＲ（図１２、図１３および図１４）
オリゴｄＴプライマーおよびランダムヘキサマープライマーをＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Roche−０５ ５３１ ２８７ ００１）とともに用い製造業者の使用説明書に従って２０−μｌ容量において全ＲＮＡ（０，１〜１μｇ）から一本鎖ｃＤＮＡ合成（ＲＴ）を実施した。Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０装置(Roche)においてＣＸＸＣ５遺伝子を標的とする特異的ハイブリダイゼーションプローブを用い、キットＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ ＰｒｏｂｅｓＭａｓｔｅｒ（０４ ７０７ ４９４ ００１）の製造業者の使用説明書に従って定量ＰＣＲを行った。相対ｍＲＮＡ発現をｒｐＰ２遺伝子発現に対して正規化した。ｃｘｘｃ５（5'-tccgctgctctggagaag-3'、5'-cacacgagcagtgacattgc-3’および6FAM-AACCCAAAgCTgCCCTCTCC-BBQ）、ｒｐＰ２（5'-atgcgctacgtcgcc-3'、5'-ttaatcaaaaaggccaaatcccat-3’およびCy5-AgCTgAATggAAAAAACATTgAAgACgTC-BBQ）の検出用プライマーは総て、９５℃で５分間の最初の変性後に同じリアルタイムＰＣＲ増幅条件で用いられるように設計した。よって、次のとおり４４サイクルの間処理される：変性９５℃で１０秒間；および伸長５５℃で２０秒間。
【００３７】
ＣＸＸＣ５の配列決定
配列決定の前にＰＣＲ産物をＥｘｏＳＡＰ−ＩＴキット（GE healthcare−７８２０１）を用いて製品の使用説明書により精製に付した。ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ｖ３．１ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ABI−４３３７４５６）を特異的なフォワード（5'-gcacaaaagtggtgctgtg-3'）およびリバース−（5'-gcgtggtgcaggagcat-3'）配列決定プライマーとともに用いて全容量１０μｌで次の反応条件により配列決定を行った：変性 ９６℃、１０秒；５０℃で５秒のアニーリング；６０℃で４分の伸長、２５サイクルの間実施。
【００３８】
固形腫瘍
固形腫瘍に関して、本発明者らは、乳癌に罹患している患者の３５サンプル（および７つの健康対照）、転移性黒色腫に罹患している患者の４０サンプル（および８つの健康母斑対照）ならびに腫瘍および良性対応対の両方を含む２８の甲状腺癌サンプルにおけるＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現レベルを調査した。
【００３９】
クロマチン免疫沈降実験
２０００万のＮＢ４細胞をＲＰＭＩ培地(Invitrogen)中でホルムアルデヒド（１％ｖ／ｖ）により３７℃で１０分間架橋し、氷冷ＰＢＳで２回洗い流し、低張細胞溶解バッファー（０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ Ｎａ−ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ Ｎａ−ＥＧＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）に再懸濁した。Ｄｏｕｎｃｅ（２０ストローク）を使用して原形質膜を破壊し、集めた核（６５０ｇ、４℃で５分の遠心分離）を１２００μｌのＣｈＩＰバッファー（０．１％ＳＤＳ、０．１％デオキシコール酸Ｎａ、１％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）に再懸濁し、その後超音波処理して５００〜１０００ｂｐ長のＤＮＡ断片を得た。各ＩＰでは、２００μｌの超音波処理産物を回収し、希釈バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００）で１０倍希釈した。特異的結合を減少させるために、ハイブリダイゼーションの前に回転板上で７０μｌのサケ精子ＤＮＡ／プロテインＡアガロース５０％スラリー(Upstate)を４℃で２時間加えることにより前清浄工程を行った。免疫沈降（ＩＰ）では断片化したクロマチン混合物に４μｇの抗ＲＡＲα抗体（Abcam−Ｈ１９２０）、または抗ＰＭＬ抗体（Santa Cruz、ｓｃ−９６６）を加えることによりハイブリダイゼーションを行った（４℃で一晩）。回転板上で７０μｌのサケ精子ＤＮＡ／プロテインＡアガロース５０％スラリー(Upstate)を４℃で４時間加えることにより免疫沈降を行った。遠心分離により免疫複合体を回収し、十分な洗浄後に２００μｌの溶出バッファー（１％ＳＤＳ、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３）で溶出した。ＤＮＡ−タンパク質架橋を外すために、溶出液に８μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、続いて６５℃で一晩加熱した。次いで、これらの画分をＲＮアーゼＡ（１０μｇ／ｍｌ）およびプロテイナーゼＫにより４２℃で２時間処理した。各ＩＰから結果として得られたＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出により精製し、４０μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０．に再懸濁した。インプット分として、前清浄工程後に２０μｌの架橋クロマチンを確保し、Ｈ２Ｏで１０倍希釈し、ＤＮＡ−タンパク質架橋を外すために同じ工程に付した。インプット、ＩＰおよび無Ａｂの画分を、ＲＩＮＦまたはＲＡＲｈ２のプロモーター領域に位置するレチノイン酸応答性エレメントを含むプライマー対を用いるＰＣＲにより解析した。ＲＩＮＦプロモーターのプライマー（１０５ｂｐ）5'-gcagtctgagatggttcccagg-3'/5'-tgcatgtaccattccctctgcc-3’およびＲＡＲｂ２プロモーターのプライマー（２４７ｂｐ）5'-tcctgggagttggtgatgtcag-3'/5'-aaaccctgctcggatcgctc-3'。
【００４０】
細胞質および核の画分の調製
細胞分画を４℃で行った。ＮＢ４細胞を２００ｇでの遠心分離により集め、ＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼの阻害剤を含有する低張溶解バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１２．５ｍＭ ＮａＦ、０．２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１％プロテアーゼ阻害剤カクテル、Sigma Ｐ８３４０）に懸濁し、４０分間膨潤させた。マイクロチューブ(Eppendorf)中での円錐形乳棒による細胞懸濁液のホモジナイゼーションにより原形質膜を破壊した。１，０００ｇで３分間の遠心分離の直前にＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００を０．１％終濃度に加えた。細胞質画分からなる上清が、核からなるペレットから分離される。プロテアーゼおよびホスファターゼの阻害剤を含有する溶解バッファーで核を２回洗浄し、１，０００ｇでの遠心分離により回収し、４ｘサンプルバッファー(Laemmli 1970)で１００℃で８分間抽出した。
【００４１】
ウエスタンブロット
Wu YL, Dudognon C, Nguyen E, et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths. J Cell Sci. 2006;119:2797-2806により従前に記載されているようにウエスタンブロッティングを実施した。
【００４２】
ＲＩＮＦに対する特注ウサギポリクローナルペプチド特異的抗体は、Biogenes GmBHにより生産されたものである。免疫原ペプチドは、ＲＩＮＦタンパク質のアミノ酸４５〜４８に相当する。一次抗体溶液への免疫原ペプチドの添加によるウエスタンブロットシグナルの競合阻害により抗体特異性を確認した。要するに、ブロットをＲＩＮＦに対する一次抗体（ポリクローナル抗体）、ＰＡＲＰ（モノクローナルマウスＩｇＧ、Calbiochem、ｎ°ＡＭ３０）またはアクチン（ポリクローナルウサギＩｇＧ、Sigma、ｎ°Ａ２０６６）とともにインキュベートした後、適当なペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体とともにインキュベートした。化学発光検出システム(Amersham Pharmacia Biotech)を用いてタンパク質の検出を行った。ヒト組織抽出物を含むブロットはMilliporeから購入した（ＴＢ３００）。
【００４３】
細胞質および核の画分の調製
細胞分画を４℃で行った。ＮＢ４細胞を２００ｇでの遠心分離により集め、ＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼの阻害剤を含有する低張溶解バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１２．５ｍＭ ＮａＦ、０．２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１％プロテアーゼ阻害剤カクテル、Sigma Ｐ８３４０）に懸濁し、４０分間膨潤させた。マイクロチューブ(Eppendorf)中での円錐形乳棒による細胞懸濁液のホモジナイゼーションにより原形質膜を破壊した。１，０００ｇで３分間の遠心分離の直前にＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００を０．１％終濃度に加えた。細胞質画分からなる上清が、核からなるペレットから分離される。プロテアーゼおよびホスファターゼの阻害剤を含有する溶解バッファーで核を２回洗浄し、１，０００ｇでの遠心分離により回収し、４ｘサンプルバッファー(Laemmli 1970)で１００℃で８分間抽出した。
【００４４】
免疫蛍光
ＦＬＡＧタグ付きＲＩＮＦをコードするプラスミドをＮＢ４細胞 ｃＤＮＡから構築した。ＰＣＲ産物をｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−４発現ベクター(Sigma)に挿入した。ＭＣＦ７細胞をカバースリップ上で増殖させ、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ製造業者のプロトコール(Roche)によりＦＬＡＧタグ付きＲＩＮＦ構築物でトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、２％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定した。固定した細胞をＰＢＳで３回洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１０分間透過処理した後、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ、２％ＢＳＡ）中で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ、２％ＢＳＡ）で１：３，０００希釈した一次抗体（ウサギポリクローナル抗Ｆｌａｇ Ｍ２、Sigma）とともに一晩インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１：１，０００希釈（ＰＢＳ、２％ＢＳＡ）した二次抗体（Molecular ProbesのＡｌｅｘａ−４８８コンジュゲート抗ウサギ、Invitrogen）とともに室温で１時間インキュベートした。続いて、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤４’，６−ジアミニジン−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Vector Laboratories）で封入して核を対比染色した。Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ６３Ｘ Ｎ．Ａ．１．４油浸対物レンズを搭載したZeiss ＬＳＭ５１０ ＭＥＴＡ共焦点レーザー顕微鏡において共焦点顕微鏡によりＬＳＭ５１０ソフトウェアｖ４．０(Zeiss)を用いて免疫蛍光像を取得した。
【００４５】
レンチウイルス感染のためのプラスミド
ＲＩＮＦ発現を標的とするレンチウイルスプラスミド（ｐＬＫＯ．１／ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ）は、Sigmaから購入し（ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｓｈＲＮＡ大腸菌グリセロールストック）、対照ベクター（ｐＬＫＯ．１／ＴＲＣおよびｐＬＫＯ．１／ｓｈＲＮＡ／スクランブル対照）は、マテリアル移転契約を通じてDavid RootおよびDavid M. Sabatiniにより厚意で提供されたものである（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１０８７９および１８６４）。要するに、レンチウイルス粒子の作製は、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞と、Trono's labにより開発された第二世代のパッケージングシステム（例えば、パッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２およびエンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇ）（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１２２６０および１２２５９）との一過性同時トランスフェクション（Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ、Roche）により行った。トランスフェクションの２日後にウイルス上清を回収し濾過した後、スピン感染のために増殖細胞に適用し（２４００ｒｐｍ、室温で１時間）、そしてそれは硫酸プロテアミン（５μｇ／ｍＬ）の存在下で実施した。感染の２日後に、１μｇ／ｍＬのピューロマイシン (Sigma)を用いて少なくとも２日間ＮＢ４細胞を選抜した。
【００４６】
プラスミドおよびレトロウイルス感染
脳心筋炎ウイルス内部リボソーム進入配列とリポーター遺伝子としての緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むネズミ幹細胞ウイルスレトロウイルスベクターＭｉｇ−Ｒ１は、W. S. Pear(University of Pennsylvania, Philadelphia, PA)により厚意で提供されたものである。５’ウイルス長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターがＲＩＮＦの発現を駆動できるようにＭｉｇ−Ｒ１にＲＩＮＦを挿入した。Ｍｉｇ−Ｒ１構築物（Ｍｉｇ−Ｒ１／エンプティおよびＭｉｇ−Ｒ１／ＲＩＮＦ）をＰｈｏｅｎｉｘレトロウイルスパッケージング細胞系統にトランスフェクトして（ＶＳＶ−Ｇ偽型）ウイルス上清を生成し、このウイルス上清をトランスフェクションの２日後に回収した。次いで、４μｇ／ｍｌの硫酸プロテアミンの存在下で感染を実施した。感染の９日後に感染した細胞をＧＦＰ蛍光について選別した。
【００４７】
ＵＲＬ
Ｃｘｘｃ５遺伝子のエキソン−イントロン構築およびゲノム組織化は、de Ia Grange P, Dutertre M, Martin N, Auboeuf D. FAST DB: a website resource for the study of the expression regulation of human gene products. Nucleic Acids Res. 2005;33:4276-4284に従ってｆａｓｔ ＤＢ(http://www.fast-db.com)を利用して行った。ＲＩＮＦタンパク質の理論分子量は、ＥｘＰＡＳｙ(Expert Protein Analysis System)ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｓｅｒｖｅｒウェブサイト(www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)において計算した。推定NLSモチーフのコンピュータによる解析は、ＰｒｅｄｉｃｔＮＬＳ(cubic.bioc.columbia.edu/predictNLS/)を利用して行った。
【００４８】
結果
本発明および本発明につながる実験の結果を、以下の図を参照してさらに記載する。
【００４９】
実験結果
ＮＢ４細胞系統における、レチノイン酸により早期に誘導される遺伝子であるＣｘｘｃ５の同定
ＡＰＬにおける新規レチノイン酸標的遺伝子についての本発明者らの探索において、本発明者らは、ＡＴＲＡ（１μＭ）により短時間（９０分および３時間）処置したＮＢ４細胞を用いてマイクロアレイ実験を行った。マイクロアレイ発現解析によって本発明者らは３５個の遺伝子を同定でき、それらの遺伝子は、処置９０分の時点において一貫してアップレギュレートされ、未処置対照と比べて少なくとも２倍の誘導があり、３時間後もアップレギュレートされたままであった（表１）。これらの３５個の遺伝子の慎重な解析と分類によって、周知の転写因子または推定転写因子をコードする９個の遺伝子を同定した。他の２６個の遺伝子は、遺伝子オントロジーおよび／または配列解析による推定転写因子であるための基準を満たさなかった。９個の候補遺伝子のうちの７個は、顆粒球または単球への分化時に骨髄組織において発現されることが分かっている、明確に特徴付けられた転写因子をコードする。重要なことには、これらの遺伝子のうちの６個はＮＢ４細胞においてレチノイン酸により早期に誘導され、５個は直接標的であることはこれまでに確認されている。本発明者らのマイクロアレイスクリーニングの精度はこれらの観察により確認され、証明された。
【００５０】
【表１】
【００５１】
本発明は、これまでのところ機能的特性評価を受けていないゲノム配列であるＣｘｘｃ５に関する。
【００５２】
本発明者らの選択は２つの決定的な実験的発見後に行った。第１に、定量ＲＴ−ＰＣＲ解析（図１Ａ）により、Ｃｘｘｃ５ ｍＲＮＡ発現のＡＴＲＡによる誘導が見事に確認された（ここではレチノイン酸処置４時間において観察された）。第２に、レチノイド添加の３０分前に４時間続けたタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドによるＮＢ４細胞の前処置は、ＡＴＲＡによるＣＸＸＣ５ ｍＲＮＡアップレギュレーションを阻止しなかった（図１Ａ）。これらの実験は、Ｃｘｘｃ５のＡＴＲＡ媒介性転写がデノボタンパク質合成を必要としないことを示しており、Ｃｘｘｃ５がレチノイン酸の一次標的であることを示唆している。これは、ＮＢ４細胞におけるレチノイド受容体（ＲＡＲおよび／またはＰＭＬ−ＲＡＲｑとＣｘｘｃ５遺伝子のプロモーターとの直接結合を証明したＣｈＩＰ実験（図１Ｂ）により確認された。
【００５３】
Ｃｘｘｃ５遺伝子のコンピュータによる特性評価
データベースから入手可能なＣｘｘｃ５（ＥＮＳＧ０００００１７１６０４）の主なゲノムの特徴を図２に簡潔にまとめた。Ｃｘｘｃ５遺伝子は、５番染色体の長腕、５ｑ３１．３に位置する（図２Ａ）。この遺伝子は３５．５ｋｂｐに及び、４つのエキソンに組織化されている（図２Ｂ）。この遺伝子の上流プロモーター領域は、まだ機能的に解析されていないが本発明者らの研究に関連しており、転写開始部位から−３１１６ｂｐに潜在的レチノイド応答性エレメントを含む。２つの潜在的代替転写開始部位（エキソン１に１つとエキソン２にもう１つ）が存在するにもかかわらず、それらの２つのｍＲＮＡ配列はエキソン３に開始コドンを有する同じオープンリーディングフレームを示す。概念翻訳により、３２２個のアミノ酸からなるタンパク質（図２Ｃ）であり理論分子量が３２．９８ｋＤａであると予測される。タンパク質配列解析により、Ｃ末端の近位において、独特の保存されたドメイン、アミノ酸２５７〜３０２間に典型的なＣＸＸＣ亜鉛フィンガーモチーフ(CX2CX2CX4-5CX2CX2C9-15Cx2Cx4C)が示された。２個の亜鉛イオンに配位している８個の保存されたシステイン残基を含むことが分かっているこのモチーフは、１１個の他のタンパク質（多くの場合クロマチン関連タンパク質）において見られ、非メチル化ＣｐＧを認識すると考えられている。図２Ｄは、このモチーフを有するタンパク質ファミリーの既知メンバー総てのアラインメントを示している。
【００５４】
レチノイド類により処置した前骨髄球細胞におけるＣｘｘｃ５の遺伝子発現プロフィール
本発明者らのマイクロアレイデータに一致して、ＣＸＸＣ５ ｍＲＮＡレベルの経時的解析（定量ＲＴ−ＰＣＲによる）により、早くもＡＴＲＡ処置９０分に２倍の誘導が示された（図３Ａ）。Ｃｘｘｃ５の転写レベルは、処置１２時間の時点においてその最大レベルに達した（未処置対照において観察された発現レベルのおよそ６倍）。その後、そのレベルは少なくとも４８時間の間安定にアップレギュレートされたままであった（図３Ａ）。本発明者らは、Ｃｘｘｃ５発現およびそのタンパク質レベルの誘導を確認するために、予測されるＣＸＸＣ５ポリペプチド鎖のアミノ酸４５〜４８に対するポリクローナル抗体を特別注文した（方法参照）。ＣＸＸＣ５タンパク質の基礎発現レベルは未処置ＮＢ４細胞抽出物において非常に低かったが（図３Ｂ）、ＡＴＲＡ処置開始後４時間以内に予想分子量３３ｋＤａにＣＸＸＣ５タンパク質に対して特異的な強いバンド（その免疫原性ペプチドとの競合により確認された、示していない）が現われた。ＣＸＸＣ５タンパク質の誘導動態は、ｍＲＮＡレベルにおいて観察された誘導に一致している。興味深いことに、ＮＢ４細胞と比較すると、成熟耐性サブクローンＮＢ４−ＬＲ１およびＮＢ４−ＬＲ２のＡＴＲＡ処置後にはＣＸＸＣ５タンパク質の非常に弱い誘導しか認められなかった（図７）。これらの観察は、ＡＰＬ細胞の最終成熟時にＣＸＸＣ５が参加する可能性があることと一致する。さらに、公的に利用可能なマイクロアレイデータセットから抽出したデータ（図８）により、ＡＰＬ患者の一次細胞におけるＡＴＲＡによるＣｘｘｃ５ ｍＲＮＡの早期誘導が確認され、ＮＢ４細胞系統を用いて得たデータが証明された。
【００５５】
レチノイド誘導核因子、ＲＩＮＦ（ＣＸＸＣ５）の細胞内局在性
ＡＴＲＡ処置ＮＢ４細胞の核および細胞質の画分のウエスタンブロット解析により、核抽出物におけるＣＸＸＣ５の発現がはっきりと検出された（図３Ｃ）。この増加した発現レベルは少なくとも４８時間続いた。本発明者らのポリクローナル抗体では折り畳まれた天然タンパク質の関連エピトープ（アミノ酸４５〜４８）がほとんど検出されなかったため、本発明者らは、in situ免疫化学実験のためにＦＬＡＧタグ付きＣＸＸＣ５をコードするプラスミドを作製した。この構築物で一過性にトランスフェクトしたＭＣＦ７細胞のin situ共焦点解析により強い核の染色が示され（図３Ｄ）、ＣＸＸＣ５タンパク質の核局在パターンが確認された。注目すべきは、細胞によっておよび過剰発現レベルによって、蛍光パターンが核内の微細クロマチンマトリックス、核質および／または不連続断続構造(discrete punctured structures)と少しは関係していたことである。しかしながら、核膜においても核小体内においても蛍光シグナルは検出されなかった。
【００５６】
これらの実験的証拠に基づいて、本発明者らは、レチノイド誘導核因子(Retinoid-Inducible Nuclear Factor)にちなんでＣＸＸＣ５をＲＩＮＦと新たに命名することを提案する。この提案した名前にふさわしく、ＲＩＮＦ（ＣＸＸＣ５）配列の詳細な解析により、亜鉛フィンガードメインのＮ末端側に位置する、アミノ酸残基２５７〜２６２間の推定核局在シグナル(Nuclear Localization Signal)（ＮＬＳ）(KKKRKR)が明らかになった。
【００５７】
異なる骨髄細胞系統および様々なヒト組織におけるＲＩＮＦの発現パターン
本発明者らは、他の骨髄細胞系統（図３Ｅ−Ｆ）および様々なヒト組織（図３Ｇ）におけるＲｉｎｆ遺伝子の基礎発現レベル、ならびにレチノイド類によるその潜在的調節も評価した。検証したより未成熟な細胞系統、Ｋ５６２細胞およびＬＡＭＡ−８４細胞は最大のＲＩＮＦ ｍＲＮＡレベル（それぞれ、ＮＢ４細胞の基礎レベルの１６倍および１２倍）と、さらに最大のＲＩＮＦタンパク質発現も示した。これらの細胞系統ではＡＴＲＡ処置によりＲＩＮＦ ｍＲＮＡレベルもタンパク質レベルもアップレギュレートされないように思われた（図３Ｅ−Ｆ）。相対的に、ＨＬ６０（Ｍ２−サブタイプ）細胞系統とＮＢ４（Ｍ３−サブタイプ）細胞系統は両方ともＲＩＮＦ ｍＲＮＡおよびタンパク質の基礎レベルが低い。重要なことには、ＡＴＲＡによる後者の細胞系統の処置により、ＨＬ６０細胞（かかる処置により最終分化を始めることが分かっている）がＲＩＮＦ誘導に関してｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方においてＮＢ４細胞に似た挙動をする（ここでは４時間の時点において観察された）ことが示された。重要なことには、キメラ受容体ＰＭＬ−ＲＡＲｑの発現が起こらない細胞系統であるＨＬ６０におけるこの誘導により、ＡＴＲＡによるＲＩＮＦ誘導にＰＭＬ−ＲＡＲαが必要でないことが証明された。この観察に一致して、本発明者らは、ＮＢ４細胞に似た基礎発現レベル（データは示していない）を有する２つの他の細胞系統、Ａ５４９肺癌細胞（３倍増加）およびＨｅＬａ頸癌細胞（２倍増加）においてもＡＴＲＡによりＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現を誘導されることに注目した。最後に、ＲＩＮＦ発現が骨髄組織に限定されないという事実を実証するために、本発明者らは異なる器官からの様々なタンパク質抽出物においてウエスタンブロット解析を行った（図３Ｇ）。ＲＩＮＦタンパク質は検証したヒト組織において種々の発現レベルを示し、胎盤において発現レベルが最大であり、脳において最小であった。要するに、これらのデータは、ＲＩＮＦの調節発現および推定機能はＰＭＬ−ＲＡＲα発現に依存しておらず、ＡＰＬ病理学よりもずっと広範な関心分野を含むことを示している。
【００５８】
ＲＩＮＦ発現は前骨髄球性白血病細胞の分化に必要である
ＡＴＲＡ処置後のＮＢ４細胞最終分化へのＲＩＮＦの潜在的関与を調査するために、本発明者らは、レンチウイルスベクターにより送達されるｓｈＲＮＡを用いてＲＮＡ干渉アプローチを行った（図４Ａ）。ＲＩＮＦ ｍＲＮＡに対して向けられた５つの異なるｓｈＲＮＡ構築物のそれぞれを安定に発現するＮＢ４細胞の感染および選抜後に、（基礎ＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現レベルを標的とするための）それらの有効性を対照ベクター、すなわち、スクランブルドｓｈＲＮＡを発現する対照ベクターおよびエンプティベクターである対照ベクターと比較した。２つの最高ノックダウン効率がｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３（６１％）およびｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−４（８５％）で観察され、それらに関してはレチノイドの不在下ではＮＢ４細胞において増殖変化も形態学的変化も認められなかった。かかるサイレンシング効率に関し（図４Ａ）、本発明者らは、細胞の大きな割合においてＡＴＲＡによるＲＩＮＦ ｍＲＮＡ誘導を効率的に阻止することをかなり期待することができ、このようにして、ＡＴＲＡ処置後の細胞表現型にもたらす影響を評価することができた。
【００５９】
特筆すべきは、これらの２つのｓｈＲＮＡ構築物の発現により薬理学的用量のＡＴＲＡの存在下で増殖する能力がＮＢ４細胞集団に与えられることである（図４Ｂ）。実際には、対照ベクターを発現する細胞はＡＴＲＡ処置によって１週間以内に不可避に分化し死滅したが、一方ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−４レンチウイルスベクターまたはｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３レンチウイルスベクターのいずれかに感染させた細胞培養物はどちらも増殖停止（図４Ｂ）および最終分化プロセス（図４Ｃ）を回避した。ＡＴＲＡ誘導性ＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現を阻止するための本発明者らのＲＮＡ干渉戦略の有効性を定量ＲＴ−ＰＣＲにより、ＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現が最大であった（図３Ａも参照）処置１２時間の時点において評価した（図４Ｃ）。重要なことには、ＡＴＲＡにより処置した対照ベクターと比べてｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３（約５０％）およびｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−４（６０％）に関して得たノックダウンレベルは、ＮＢＴ還元および形態学的解析によって評価された通りＮＢ４細胞のおよそ３０％〜５０％を最終分化から救うのに十分であった（図４Ｃ、左パネル）。
【００６０】
注目すべきは、これらの細胞（ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３および−４）がレチノイド類の存在下で増殖し続け、ＡＴＲＡなしでの２週間の培養後も（第６日〜第２０日）ＡＴＲＡに対するそれらの耐性が確認され、ＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現における効率的な阻止と密接に関連していた（図４Ｃ、右パネル）ことである。要するに、これらの結果は、ｓｈＲＮＡ媒介性ＲＩＮＦノックダウンが前骨髄球性白血病細胞のＡＴＲＡ誘導性最終分化を障害することを示しており、ＮＢ４細胞のレチノイド誘導性最終成熟にＲＩＮＦ発現が必要であることを強く示唆している。
【００６１】
次に、薬理学的用量のＡＴＲＡにより顆粒球分化経路に委任されたＨＬ６０細胞系統においてＲＩＮＦの関与を評価した（図９）。ＮＢ４細胞で観察された通り、２つのｓｈＲＮＡはＲＩＮＦ発現を効率的に標的とし（図９）、成熟プロセス（ＮＢＴおよび形態学的解析により評価される）を遅延させ、顆粒球分化時のＲＩＮＦの機能的関与が実証された。しかしながら、レチノイド類の存在下で増殖し続けたＮＢ４−ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ細胞とは対照的に、ＡＴＲＡ処置ＨＬ６０−ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ細胞は不可避に衰弱し１２日以内に死滅した。
【００６２】
最後に、本発明者らは、ＲＩＮＦ過剰発現はＡＴＲＡの不在下でＮＢ４細胞またはＨＬ６０細胞の顆粒球成熟を誘導するのに十分であろうかと考えた（図１０）。本発明者らのデータは、異所性ＲＩＮＦ発現（図１０Ｂ）は白血病細胞の顆粒球分化を引き起こすために必要であるが十分ではないことを示している。実際には、ＲＩＮＦ過剰発現の１０日後でも、形態学的レベルにおいても（図１０、パネルＣ）、分子レベルにおいても（抗ＣＤ１１ｂ表面マーカーを使用、データは示していない）分化の徴候は認められなかった。
【００６３】
正常ＣＤ３４＋前駆細胞のサイトカインによる骨髄造血時のＲＩＮＦ発現および機能
本発明者らの上記発見は、造血組織および他のヒト組織における様々なＲＩＮＦ発現を明確に示している。これらのデータは、ＲＩＮＦ発現は、薬理学的濃度のＡＴＲＡにより誘導でき、一部の骨髄性白血病細胞の分化に必要であるが、正常前駆体骨髄造血時にはサイトカインにより生理学的に調節され得るということを示している。この場合、その調節発現は顆粒球系統に沿った正常発生時にも起こるより一般的な事象を意味することもあり得る。
【００６４】
この仮説を検証するために、本発明者らは、健康成人ドナーの骨髄から単離されたＣＤ３４＋細胞のサイトカイン誘導性顆粒球分化時のＲＩＮＦ発現を検証した。形態学的変化（図５Ａ）と、ＲＩＮＦとの比較によるＣＤ３４、ＣＤ１１ｂおよびＧ−ＣＳＦＲの発現の解析（図５Ｂ）により分化を評価した。ＲＩＮＦ ｍＲＮＡレベルの経時的発現プロフィールを定量ＲＴ−ＰＣＲ解析により決定した。ＲＩＮＦ ｍＲＮＡレベルは、初期低下（第２日〜第４日）後、第４日〜第６日の間にその最小発現に達し、その時点において培養細胞の大部分は芽球段階と前骨髄球段階にあった。その後、第６日〜第８日の間に、ＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現は、骨髄球、後骨髄球へ、最後には短寿命多核好中球への最終細胞成熟と同時に、その最小レベルからおよそ３．５倍増加した（図５Ａ−Ｂ）。サイトカインによる分化時のＣＤ３４＋前駆体および正常造血細胞におけるＲＩＮＦ ｍＲＮＡの検出により、その発現がＡＰＬ細胞に限定されない（それゆえＰＭＬ−ＲＡＲα発現に依存していない）こと、最も重要なことには、その誘導がＡＴＲＡの薬理学的シグナル伝達に限定されないことが確認される。これらのデータは、正常骨髄造血時のその潜在的役割に一致している。
【００６５】
正常骨髄造血時のＲＩＮＦ発現の機能的関連性を評価するために、サイトカイン処置により顆粒球系統に向けたＣＤ３４＋前駆細胞をレンチウイルスｓｈＲＮＡ構築物に感染させて、ＲＩＮＦ発現をノックダウンした。非感染細胞同様に、対照ベクター（ｓｈＲＮＡ／スクランブルおよび模擬対照）に感染させた細胞の大部分は多核顆粒球へと成熟した（図５Ａおよび図６）後死滅し、細胞培養物に徐々に分解された（示していない）。異なるドナー由来の検証した３つの細胞培養物では、異なる動態で顆粒球への分化が起こり（図６参照）、総ての培養物は、急速に死滅する多核好中球の細胞成熟で終わった。寿命がずっと長いことが分かっている単球と付着性マクロファージは培養物中にわずかしか存在しなかった。重要なことには、ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３およびｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−４に同じ条件下で感染させた細胞集団（図６）は、成熟していない細胞（前骨髄球および骨髄球）の著しい蓄積を示した。対照培養物と比べて２つのｓｈＲＮＡで観察された顆粒球成熟におけるこの違いは、ＡＴＲＡにより処置した白血病細胞系統ＮＢ４およびＨＬ６０に関して得た結果を見事に映し、正常骨髄造血時のＲＩＮＦの同様の役割を示唆している。
【００６６】
考察
造血細胞分化の多段プロセスは、長年、腫瘍病因の理解のためや治療戦略の設計のためのモデル研究として扱われてきた。成熟機能細胞の産生を制御する発生プログラムの攪乱は、シグナル変換および／または遺伝子転写制御をその選好機能とする限られた重要な調節遺伝子における遺伝子変化または後成的変化（遺伝子欠失、突然変異、メチル化など）によって頻繁に起こる。造血器悪性腫瘍の特定の症例では、この１０年間でこれらの重要な調節遺伝子の発見に関して大きな進歩がもたらされたがそれらの機能階層については不確実性が残っている。
【００６７】
本研究において、本発明者らは、亜鉛フィンガーファミリーの新規メンバーであるＣＸＸＣ５（ＲＩＮＦ）を同定し特徴付け、骨髄球性白血病細胞のレチノイド誘導性最終分化時だけでなくサイトカインによる正常骨髄造血時のそのかかわりも示した。亜鉛フィンガーを含むタンパク質は、哺乳類ゲノムにおいて最大のタンパク質スーパーファミリーの１つを構成し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、または他のタンパク質と相互作用する構造的に異なる保存されたドメインを有する、進化タンパク質ファミリーおよび機能的に多様なタンパク質ファミリーに分類することができる。ＣＸＸＣ型亜鉛フィンガーは、該タンパク質のヒストンメチル−トランスフェラーゼ（ＭＬＬ、ＭＬＬ２）、ヒストンデメチラーゼ（ＦＢＸＬ−１０、−１１、−１９）、ＤＮＡ−メチル−トランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ１）、またはＣｐＧ結合（ＣＧＢＰ、ＭＢＤ１）の活性によってクロマチン再構築に関与するというタンパク質の小サブセットにおいて見られる（図２）。ＭＬＬ、ＣＧＢＰ、およびＭＢＤ１のＣＸＸＣドメインは、非メチル化ＣｐＧと結合することがわかっており、この認識には保存されたＫＦＧＧモチーフ（亜鉛フィンガーの２番目のリンカー中にある）が不可欠である。ＫＦＧＧモチーフを欠いているパラログ（ＣＸＸＣ−４、−５、−６、および−１０、図２）は後の特性を共有しないと予想され、今後の課題の１つは、保存されているがＫＦＧＧモチーフを欠いているＣＸＸＣドメインを有するこの特異的サブセットのタンパク質により認識される分子標的（群）を同定することであろう。興味深いことに、ＣＸＸＣ型ファミリーの３メンバー（ＫＦＧＧモチーフを含むまたは含まない）、ＭＬＬ、ＭＬＬ２、およびＬＣＸは、これまで、染色体転座や内部再配列によって白血病誘発に関与してきた。ＭＬＬは、白血病において最も高頻度で転座される遺伝子の１つであり、記載されている種々の融合パートナーが３０を超えるにもかかわらずＣＸＸＣドメインは既知ＭＬＬ融合タンパク質総ての中に残り、ＣＸＸＣドメインは骨髄変化に不可欠であると思われ、作用機序がまだ解明されていなくてもこの亜鉛フィンガー亜型の生物学的重要性を実証している。
【００６８】
ここで報告したＣｘｘｃ５（Ｒｉｎｆ）遺伝子の発現および誘導のパターンにより、正常骨髄造血および腫瘍性骨髄造血の両方における、少なくとも成熟プロセスの最終段階（前骨髄球、骨髄球）におけるＲＩＮＦの機能的関与が裏付けられた。特異的ＲＮＡｉターゲッティングを用いたノックダウン実験により、前骨髄球性白血病細胞の最終分化プロセスにＲＩＮＦ発現が必要であることもさらに示された。しかしながら、重要なことには、本発明者らの研究は、Ｒｉｎｆ病態生理学がＡＰＬに限定されず、他の造血器悪性腫瘍および正常造血においてより広いかかわりを有する可能性があるという概念をはっきりと裏付けている。よって、Ｒｉｎｆの状態（例えば突然変異、異常な発現／誘導）はＡＴＲＡ応答性を予測するのに役に立つ可能性があり、それゆえ、ＡＭＬ患者の治療計画に関する決定に重要なツールとなる可能性がある。
【００６９】
臨床状況において、Ｃｘｘｃ５（Ｒｉｎｆ）生物学に関する刺激的な見通しはその脱調節発現がいくつかの血液疾患の病因となり得るかどうかを評価することである。実際には、５番染色体の長腕の中間部欠失または完全喪失は、骨髄異形成（ＭＤＳ、多くの場合前白血病性疾患として記載される）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のような、異常骨髄造血および骨髄中の芽球過剰を特徴とする悪性骨髄疾患における再発性染色体異常である。染色体バンド５ｑ３１の主要な共通欠失領域（ＣＤＲ）を明らかにした広範囲な研究にもかかわらず、白血病誘発の一因となると推測された候補腫瘍抑制遺伝子は、４Ｍｂｐサイズのこの領域においてまだ確認されていない。このセグメント内部において、Ｒｉｎｆは、今日記載されている(described at his date)最も小さい（１Ｍｂｐ未満）ＣＤＲを表す遠位マーカーＤ５Ｓ５９４から２０ｋｂｐまでに局在することに注目することが重要である。驚くべきことに、Ｒｉｎｆ遺伝子は、恐らくＣＤＲの外側に局在すると考えられていたため、これまでのところ遺伝学的および機能的調査を免れてきた。それでも、ＲｉｎｆとＣＤＲとが極めて接近していることで、同定遺伝子の上流における調節配列の喪失と、さらに５ｑ３１内でのより遠位の欠失を理由にＲｉｎｆ発現に影響を与える可能性がある。本発明者らの発見により、文献中のデータと合わせて考えて、本発明者らはＲｉｎｆを骨髄細胞形質転換についての強力な腫瘍抑制遺伝子候補であると考えるに至った。興味深いことに、骨髄病変について公的に利用可能なマイクロアレイデータベースを調べて、本発明者らは正常な健康ドナーと比べて、欠失５ｑを有する骨髄異形成患者のＣＤ３４＋細胞でのより低いＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現を明らかにした（図１１）。この観察は推定ハプロ不全機構と一致し、不応性貧血、５ｑ−症候群を含むＭＤＳのもう１つのサブグループにおいてリボソーム遺伝子ｒｐＳ１４（特徴的なＣＤＲの５ｑ３２に位置する）について最近記載されたため、これらの血液疾患におけるｒｉｎｆ脱調節の真の寄与を評価することが重要であろう。
【００７０】
Ｒｉｎｆ発現が骨髄組織に限定されないことから、この遺伝子は他の組織の発生および／またはホメオスタシスにも関与する可能性がある。レチノイド類によるその直接誘導は、中間タンパク質レギュレーターのデノボ合成を必要とせず、これは、分化と関係なくてもＲｉｎｆが少なくともある程度はレチノイド類の多面発現効果のいくつか、例えば、様々な固形腫瘍におけるそれらの抗増殖作用などを媒介する可能性があることを示唆している。まとめると、本発明者らの発見により、異なる組織においてレチノイド類により薬理学的に誘導できるＲｉｎｆ発現は、いくつかの発生プロセスおよび病変において予想されるそのかかわりから、幅広い利益がある可能性があるという仮説が裏付けられる。
【００７１】
配列情報
Organization Applicant
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PhoneNumber :
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<110> OrganizationName : AS Bergen Teknologioverf・ing AS
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<120> Title : Novel reinoid inducible factor, and uses thereof
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<213> OrganismName : Homo sapiens
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gttttgccgg cagcccccgg gcagcgttca tagctcctgc ccgggcgggc gcgcggcggc 60
ggcggcagag gcggctgagc ctgagcgggg atgtagaggc ggcggcagca gaggcggcac 120
tggcggcaag agcagacgcc cgagccgagc gagaagagcg gcagagcctt atcccctgaa 180
gccgggcccc gcgtcccagc cctgcccagc ccgcgcccag ccatgcgcgc cgcctgctga 240
gtccgggcgc cgcacgctga gccctccgcc cgcgagccgc gctcagctcg ggggtgatta 300
gttgcttttt gttgtttttt aatttgggcc gcggggaggg ggaggagggg caggtgctgc 360
aggctccccc ccctccccgc ctcgggccag ccgcggcggc gcgactcggg ctccggaccc 420
gggcactgct ggcggctgga gcggagcgca ccgcggcggt ggtgcccaga gcggagcgca 480
gctccctgcc ccgcccctcc ccctcggcct cgcggcgacg gcggcggtgg cggcttggac 540
gactcggaga gccggttcgg tgcgcggccg gggccggagt tcgctgcaag tcggcggaaa 600
gtttggctgc gcgggttccc ccgaagttca gagtgaagac atttccacct ggacacctga 660
ccatgtgcct gccctgagca gcgaggccca ccaggcatct ctgttgtggg cagcagggcc 720
aggtcctggt ctgtggaccc tcggcagttg gcaggctccc tctgcagtgg ggtctgggcc 780
tcggccccac catgtcgagc ctcggcggtg gctcccagga tgccggcggc agtagcagca 840
gcagcaccaa tggcagcggt ggcagtggca gcagtggccc aaaggcagga gcagcagaca 900
agagtgcagt ggtggctgcc gccgcaccag cctcagtggc agatgacaca ccaccccccg 960
agcgtcggaa caagagcggt atcatcagtg agcccctcaa caagagcctg cgccgctccc 1020
gcccgctctc ccactactct tcttttggca gcagtggtgg tagtggcggt ggcagcatga 1080
tgggcggaga gtctgctgac aaggccactg cggctgcagc cgctgcctcc ctgttggcca 1140
atgggcatga cctggcggcg gccatggcgg tggacaaaag caaccctacc tcaaagcaca 1200
aaagtggtgc tgtggccagc ctgctgagca aggcagagcg ggccacggag ctggcagccg 1260
agggacagct gacgctgcag cagtttgcgc agtccacaga gatgctgaag cgcgtggtgc 1320
aggagcatct cccgctgatg agcgaggcgg gtgctggcct gcctgacatg gaggctgtgg 1380
caggtgccga agccctcaat ggccagtccg acttccccta cctgggcgct ttccccatca 1440
acccaggcct cttcattatg accccggcag gtgtgttcct ggccgagagc gcgctgcaca 1500
tggcgggcct ggctgagtac cccatgcagg gagagctggc ctctgccatc agctccggca 1560
agaagaagcg gaaacgctgc ggcatgtgcg cgccctgccg gcggcgcatc aactgcgagc 1620
agtgcagcag ttgtaggaat cgaaagactg gccatcagat ttgcaaattc agaaaatgtg 1680
aggaactcaa aaagaagcct tccgctgctc tggagaaggt gatgcttccg acgggagccg 1740
ccttccggtg gtttcagtga cggcggcgga acccaaagct gccctctccg tgcaatgtca 1800
ctgctcgtgt ggtctccagc aagggattcg ggcgaagaca aacggatgca cccgtcttta 1860
gaaccaaaaa tattctctca cagatttcat tcctgttttt atatatatat tttttgttgt 1920
cgttttaaca tctccacgtc cctagcataa aaagaaaaag aaaaaaattt aaactgcttt 1980
ttcggaagaa caacaacaaa aaagaggtaa agacgaatct ataaagtacc gagacttcct 2040
gggcaaagaa tggacaatca gtttccttcc tgtgtcgatg tcgatgttgt ctgtgcagga 2100
gatgcagttt ttgtgtagag aatgtaaatt ttctgtaacc ttttgaaatc tagttactaa 2160
taagcactac tgtaatttag cacagtttaa ctccaccctc atttaaactt cctttgattc 2220
tttccgacca tgaaatagtg catagtttgc ctggagaatc cactcacgtt cataaagaga 2280
atgttgatgg cgccgtgtag aagccgctct gtatccatcc acgcgtgcag agctgccagc 2340
agggagctca cagaagggga gggagcacca ggccagctga gctgcaccca cagtcccgag 2400
actgggatcc cccaccccaa cagtgatttt ggaaaaaaaa atgaaagttc tgttcgttta 2460
tccattgcga tctggggagc cccatctcga tatttccaat cctggctact tttcttagag 2520
aaaataagtc ctttttttct ggccttgcta atggcaacag aagaaagggc ttctttgcgt 2580
ggtcccctgc tggtgggggt gggtccccag ggggccccct gcggcctggg cccccctgcc 2640
cacggccagc ttcctgctga tgaacatgct gtttgtattg ttttaggaaa ccaggctgtt 2700
ttgtgaataa aacgaatgca tgtttgtgtc acgaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760
aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2778
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<213> OrganismName : Homo sapiens
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atgtcgagcc tcggcggtgg ctcccaggat gccggcggca gtagcagcag cagcaccaat 60
ggcagcggtg gcagtggcag cagtggccca aaggcaggag cagcagacaa gagtgcagtg 120
gtggctgccg ccgcaccagc ctcagtggca gatgacacac caccccccga gcgtcggaac 180
aagagcggta tcatcagtga gcccctcaac aagagcctgc gccgctcccg cccgctctcc 240
cactactctt cttttggcag cagtggtggt agtggcggtg gcagcatgat gggcggagag 300
tctgctgaca aggccactgc ggctgcagcc gctgcctccc tgttggccaa tgggcatgac 360
ctggcggcgg ccatggcggt ggacaaaagc aaccctacct caaagcacaa aagtggtgct 420
gtggccagcc tgctgagcaa ggcagagcgg gccacggagc tggcagccga gggacagctg 480
acgctgcagc agtttgcgca gtccacagag atgctgaagc gcgtggtgca ggagcatctc 540
ccgctgatga gcgaggcggg tgctggcctg cctgacatgg aggctgtggc aggtgccgaa 600
gccctcaatg gccagtccga cttcccctac ctgggcgctt tccccatcaa cccaggcctc 660
ttcattatga ccccggcagg tgtgttcctg gccgagagcg cgctgcacat ggcgggcctg 720
gctgagtacc ccatgcaggg agagctggcc tctgccatca gctccggcaa gaagaagcgg 780
aaacgctgcg gcatgtgcgc gccctgccgg cggcgcatca actgcgagca gtgcagcagt 840
tgtaggaatc gaaagactgg ccatcagatt tgcaaattca gaaaatgtga ggaactcaaa 900
aagaagcctt ccgctgctct ggagaaggtg atgcttccga cgggagccgc cttccggtgg 960
tttcagtga 969
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<213> OrganismName : Homo sapiens
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MSSLGGGSQD AGGSSSSSTN GSGGSGSSGP KAGAADKSAV VAAAAPASVA DDTPPPERRN 60
KSGIISEPLN KSLRRSRPLS HYSSFGSSGG SGGGSMMGGE SADKATAAAA AASLLANGHD 120
LAAAMAVDKS NPTSKHKSGA VASLLSKAER ATELAAEGQL TLQQFAQSTE MLKRVVQEHL 180
PLMSEAGAGL PDMEAVAGAE ALNGQSDFPY LGAFPINPGL FIMTPAGVFL AESALHMAGL 240
AEYPMQGELA SAISSGKKKR KRCGMCAPCR RRINCEQCSS CRNRKTGHQI CKFRKCEELK 300
KKPSAALEKV MLPTGAAFRW FQ 322
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<213> OrganismName : Homo sapiens
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cgagttcatg aggtgagc 18
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<213> OrganismName : Homo sapiens
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ccccaagcac tgtctgagca ccccattcct tggagtctga agggaagggc agagtagggg 60
gtggtagctg gggtcttggg gccccaggtc tgaagagaaa gaggctgggc cattttcgga 120
agtctcagtg cgggccattt ctgaccctgc actgccctcc aggaccagat ttgtagagag 180
gaggctgagc cccaccctgc ctcctccagc aggcctcccc cacaccacca caccctagcc 240
ttcaggcttt gggtcgggca gggcactttc agggcaggct ggcttctcct gcccagggca 300
cccctcctcc aggtgcaggg ctccagattg ggacactgtg cctctgcctc ccctaaggcc 360
ccattcagtt acctccccac ctctcagcaa tgctctccct ccctcttcct gaagtgtggc 420
agggaggctg gagccacagc tttggcctct gggagcactc agtcccactc ccataggaca 480
gagttgaacc atgattgtgt ctagagaagc caagggttat tgtcaggggc acaacagccc 540
ccaaactgtc cctctcccca tcaatatccc atatacaggc tgagttccct gtgcctcact 600
gagaacaggg ctgtatctgg ttgtctatgg cgtgtatgta gctgtgcctg ggcaatggga 660
aatatagctt gcttcctgct ttctctcagc ctctgtcccc agagtcattt tgttctggga 720
ctggagtctt ccttctgtcc tcatcccttc ccctctgttt acacaggtca aggccaggca 780
ttggccacca aactgacttc tcaggaatgg gcaagcctgg gttacttgag agacttggct 840
ttttgaattt tcatttcaca gctctctgct ccttcagacg tcatgggggt ggggtgggga 900
ggacctaaag tccagtggtc agtgcgtgag ggcccagacc caaaggcccg gggccacagt 960
ctggtgcggt taggctcctc cctgcctctg cccgtgtttg cacccccagg cctgccctgg 1020
gattttggct gaggtcacag tccagcatga ccccactgaa cactatcctg tgccctgccc 1080
cagcaggcag ggtttcaaat gcctttgctc ccatcctttg tgatacaggt gacagaactg 1140
gggcccaaag aagggtaaac cttagactga gttccaaatt ggccatcttt attggagatc 1200
ctaactccca cactcctctc catgtggcca tttccagtca ctggatgttt aatcaatgac 1260
agatattagc agataaatgg cagtcatgga aaatgcctca gacaaggcat ggattgaaat 1320
cctggttttg ctactttgta acctcacaca ggtgtccaag cctgtggatt taataagcct 1380
atgttcaaaa agcaattagc atggtccctg acaagcaaga gctcagaaag attctggcta 1440
caattgttat tactggtacc tctttggagg ccaagcttcg ggcccaaggc aggtagggga 1500
ctcctcctta ccttcaaaga attttcatgg cgggaggtgg tggcgagggg acaagtagtg 1560
agatgagcaa ataaaagcta tttctgtgca ttgtggtcac tgtggccata ggaggggtcc 1620
caaagccaga tgaaggaccc aaagccaggc cacagagtac atctgtcctg tgcatgcact 1680
gcaaaaaggc acctagcaaa gggagctagg aagctgaaag gcagtctgtg acctccttca 1740
tggtttcctg tatctgccaa aagtgggtac ctttttctga tttgcacaaa ggctagtggt 1800
ggccctgtag gtatggccca aactcaggct ggaagtggca gtctgagatg gttcccaggt 1860
gatatgtgct cctggtcttc catgaggagt tcatgaggtg agcttgatga ggcctatctt 1920
ggcagaggga atggtacatg caaagctctg gaaatctgga gaggagtctt ggggtgtcag 1980
agggaactgc cagtgttaga tggcattggt cagcagggcc tggcagggaa gagagtcagt 2040
tagggaagcc aggctgagta gggtagtctg tgaggaacca ctgcaggatg tgaagcagat 2100
gagcctcact ggaggctgtg gaaagcctcc ctagaatagc acatggcctc aggggtttga 2160
gaacagctct gatgccaatc tcatttcagt ttcctcatct gaataatggg gatgacatta 2220
ttgcaggggc tgctataagg gctaaataag ataatgtacc ttaactgttt agcacaatgc 2280
cctgctcagg gtaagggctg cacaaatacc agccatgggt attatcagca ggatccagga 2340
gagcacactc cagggtcccg ggtggacgca cccctcccta gaagacaagg ctggtgatgc 2400
aggggccatc tcccccagcg gtgctggaga ctgaaggagc ttcttcctga cttgaaggct 2460
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ttgaggtagg cagaggtggg agaatagtga accaagcttc ccttcttctt ggggaagggg 2580
gctgtggtgg ggacagtctc acccaagggc agagatcctc accccatcct tcctggatgt 2640
cccccgcttg tctcattggc atctgtggtg gagagttctt tgtggatggc ttgcacatga 2700
cattttctgt ttctgtaaca ctttctgtgt ggacaattct gtccttttcc tctgtggctc 2760
ccatatgggt tggataggtg acagtctagg tctccctccc aaggtgttaa tttccagcaa 2820
gggaaaactc caagatccac cccctaaact gggccagaca agtcaacacc ccttccctga 2880
ggaagccatc accactggga ccacctggcc ttcctccatt gcagcctgtg gatccctggc 2940
ctcccgcctg agttgggggt gggggtggag gcataagtct gaaaaaaaag tgggtaatag 3000
tcagcagttc cctaaagtag aattactacc caccctctgc catggacccc agcataaagc 3060
tttttgtggg gcgtgcatga cctgactctg tactggcgtt aggcttcagg agatctgtgg 3120
aatagagttt gacttcatgg atcctaaccc tctgagacct gctgctgact cccagggagc 3180
aggtcctccc tcacagtctg tgcctcagct tccccagaaa aggtagatgg aggtgagtta 3240
aatgcttgga gatcctacac ctgggctttt gcttcctttt tccttgcacg gtcagtgccc 3300
aacacagtgc ctgacattca cactgaggcc cagcatacct atctttaagc agtttggaag 3360
tgatcttctg ggggtgatgg gcgtcttaaa acggtttcca tagcaagcac cttactttta 3420
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gactaaacgc ctccccaagg gagccatttc ttggcatagt agttaaggga gaccacttct 3540
cagcattcgg aaggaactgg ttgggagcag gtgtccacga tgtctgggga ggggtcactt 3600
cgtgtggtct tggatatcag gagtggcaga gaggcaacac attccagatg agctctgccc 3660
tttgacacct ccccccaccc caccccggct gggtcaaggc cccaaggcca catatagaag 3720
gcgtggaagg tgggcaccag ctgctgctgc caggagatcc atgctccata agccctcgcg 3780
ccagcctcgg agacagccag gctgcgcaga gcagaggaga ggaagcagcg aggtgggaga 3840
cagtttcgct tctcccaccg aggccgcgcc tgtggctgca ggcgcccgga tcgccacagt 3900
taactccctg ttatctgggc cccaatcgat ctcaggctgt aacgtttaac cctaggctga 3960
cttccccaac cgccctcccc ctctccctcc cctgcttggg tctggggact gcgttttctt 4020
cgcctcgcag aggaaggtcg gccttgcaca aatccgcccc cacgaatccc aaagaattgg 4080
agaaaacttc cactttggga ttatatgcag ttgggattat atgagcccgg ggcttgcacc 4140
atgggtacgt gaggtgaaga catctgcagc agcaggatta attagcctaa gatgggcata 4200
tggaggccac tgatggagtg aaagcgggat atgcgggccc aactctgtcc ccactgggcg 4260
cctactctgg caaggctgag ttttccttct gtctttcaat cagtacctat tgagcgctgc 4320
tgttccaagc attgtttcgg gttttgagtg cgtaggccat ggtctcaggg caccaaatgt 4380
acgtagtcgt tttagccccg ggactcaaga gttgaggctg atgcctgcct gagagataaa 4440
atatcctttc tcggatcagt ttcctcacct gagaaatggg aacgggaatc tccgcccctt 4500
ttctcccggg gccctagtgc ccactgaatc cattaaggag ctcttggaag ggtggggtct 4560
tggaacacgc gtctacctcc caggaccctc gactaggaat ctctggcccg ccgcgcacct 4620
gagctggggg gcgcggccaa attctccctc ccggtcctcg aagcttctgg ccccgctcta 4680
gagggggcag aaagatagca gatttccccg gaggtgcgtc tctaaaccca gaccgcctca 4740
ccaaagcggg gaggtcgtcc tttttttttt ttttttgtaa agttgcggga aataggcgaa 4800
gacggggcgc gcaagggagc tgagcctggg tggaccgcgt cagggcgcgg ggagctcgag 4860
gcgcagcggc tgcagctccg gcctcagagc ccgcggcgtc caagtggccc gagctgcgct 4920
gggagggagg cggcgggagg agggagggga gccgaggtgg agggggttgg ggggaggagg 4980
gagcggcgag tccggtccgg 5000
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【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】ＣＸＸＣ５（ＲＩＮＦ）がレチノイン酸の直接標的であることを示す図である。（Ａ）．ＡＴＲＡ処置（１μＭ）の４時間後に定量ＲＴ−ＰＣＲによりＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現レベルを測定した。１０μｇ／ｍＬにて用いたシクロヘキシミド（ＣＨＸ）による翻訳の阻害は、ＲＩＮＦ ｍＲＮＡレベルのＡＴＲＡによる上昇を阻止しなかった。これは、このプロセスがデノボタンパク質合成を必要としないことを示しており、Ｒｉｎｆがレチノイン酸の一次標的であることを強く示唆している。ヒストグラムは、２つの独立した細胞培養処置の平均（＋／−ｓ．ｅ．ｍ）を表している。（Ｂ）．ＮＢ４細胞におけるＲＡＲαおよびＰＭＬ−ＲＡＲαのＲＩＮＦプロモーターとのin vivo結合。１μＭ ＡＴＲＡで３時間処置したＮＢ４細胞または処置していないＮＢ４細胞から架橋クロマチンを調製し、抗ＲＡＲα抗体または抗ＰＭＬ抗体により免疫沈降させた。この沈降物を、ヒトＲＩＮＦまたはＲＡＲｂ２遺伝子プロモーターにわたるプライマー対を用いるＰＣＲ解析に付した。これらのプライマーは、ＲＩＮＦプロモーターに見られる推定レチノイド応答性エレメント(ggagttcatgaggtgagc)またはＲＡＲｂ２プロモーター（ここでは陽性対照として用いた）において確立されているＲＡＲＥ(ggttcaccgaaagttca)を含むように設計された。インプット：ＩＰの前にＮＢ４細胞の全クロマチンについてＰＣＲを行った。無Ａｂ（無抗体対照）：無関係の抗体を用いたまたは抗体を用いないＩＰ後に得られたサンプルについてＰＣＲを行った。
【図２】Ｃｘｘｃ５遺伝子構造とタンパク質産物（ＲＩＮＦ）を示す図である。（Ａ）Ｃｘｘｃ５（Ｒｉｎｆ）遺伝子は、染色体５ｑ３１．３に局在する。Ｃｘｘｃ５遺伝子はｐｔｅｒの１３９，００８，１３０ｂｐに始まり、ｐｔｅｒの１３９，０４３，６５１ｂｐに終わる。Ｃｘｘｃ５遺伝子はプラス鎖方向に配向され、３５，５２２ｋｂｐ長である。（Ｂ）Ｃｘｘｃ５（Ｒｉｎｆ）遺伝子のゲノム組織化。Ｃｘｘｃ５遺伝子は４つのエキソンに組織化され、オープンリーディングフレームの９５％はエキソン３に位置する。ダイレクトリピート２(Direct Repeat 2)（ＤＲ２）タイプの推定レチノイン酸応答性エレメント（ＲＡＲＥ）は、エキソン１転写開始部位の上流側−３１１６ｂｐに位置する。（Ｃ）一文字アミノ酸表示によるＲＩＮＦの予測アミノ酸配列。オープンリーディングフレームは３２２個のアミノ酸残基からなるタンパク質配列であり理論分子量が３２．９８ｋＤａである(www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)が見込まれる。亜鉛フィンガードメインに下線を施している。（Ｄ）ＣＸＸＣ亜鉛フィンガードメインを除いては、保存された構造ドメインは見られなかった。ＲＩＮＦタンパク質のＣＸＸＣ−モチーフとそのヒトパラログとのアラインメントを示している。ＣＸＸＣ−モチーフの中で不変であるアミノ酸は灰色で示し、保存されたシステイン残基は赤色で示している。ＣＸＸＣ型亜鉛フィンガーのコンセンサス配列は、Cx2Cx2Cx4-5Cx2Cx2C9-15Cx2Cx4Cにより定義することができる。
【図３】ＮＢ４細胞と他の骨髄細胞系統および組織におけるＲＩＮＦ発現と細胞内局在性を示す図である。（Ａ）ＮＢ４細胞のＡＴＲＡ処置（１μＭ）中のＲＩＮＦ ｍＲＮＡレベルの相対発現（定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定した）。（Ｂ）ＡＴＲＡ（１μＭ）により処置したＮＢ４細胞または処置していないＮＢ４細胞からの全抽出物におけるＲＩＮＦタンパク質の発現。３３ｋＤａにおいて特定バンドを検出する本発明者らの特注ポリクローナルウサギ抗体（方法参照）を用いてＲＩＮＦを検出した。アクチンをローディング対照として用いた。（Ｃ）ＡＴＲＡ（１μＭ）により処置したＮＢ４細胞または処置していないＮＢ４細胞の核および細胞質の画分におけるＲＩＮＦタンパク質の発現。前記ポリクローナル抗体を用いてＲＩＮＦを検出した。この実験では、ＰＡＲＰおよびアクチンを対照として用いて核および細胞質の抽出物の品質、純度、およびローディングを評価した。（Ｄ）ＦＬＡＧタグ付きＲＩＮＦ（緑色；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体）は、共焦点および微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡法により解析したＭＣＦ７細胞の核に局在する（ＤＡＰＩにより青色に染色された）。スケールバー、１０μｍ。（Ｅ）ＡＴＲＡを用いたまたは用いない、処置４時間の時点における、定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定した様々な骨髄細胞系統におけるＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現（方法参照）。ＡＴＲＡ（１μＭ、４時間）により処置したまたは処置していない様々な骨髄細胞系統における（Ｆ）、および様々なヒト組織における（Ｇ）ＲＩＮＦタンパク質の発現。骨髄細胞系統（２０μｇ）およびヒト組織抽出物（６５μｇ、方法参照）の各々には同量のタンパク質（ＢＣＡ定量法により決定した）をローディングした。アクチンをローディング対照として用いた。
【図４】ＲｉｎｆのｓｈＲＮＡ媒介性サイレンシングがＮＢ４細胞のＡＴＲＡ誘導性最終分化に対する耐性を与えることを示す図である。（Ａ）レンチウイルスｓｈＲＮＡベクターと、Ｒｉｎｆ発現をノックダウンするために用いたそれらのｍＲＮＡ標的配列。レンチウイルスベクター構築物を用いたＮＢ４細胞の感染および選抜（方法参照）後に、基礎ＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現レベルを測定する定量ＲＴ−ＰＣＲにより基礎Ｒｉｎｆ発現を標的とする標的配列の有効性をモニタリングした（模擬対照、ｐＬＫＯ．１／エンプティベクターに対する割合％で示した）。ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３構築物およびｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−４構築物で最も有効なノックダウンを得た（それぞれ６１％および８５％、ＡＴＲＡの不在下）。（Ｂ）ＡＴＲＡ（１μＭ）の存在下でｓｈＲＮＡ構築物を安定に発現するＮＢ４細胞の細胞増殖（集団倍加数）。示した動態実験（ここでは１２日のＡＴＲＡ処置中）は３つの独立した実験（異なる感染群から行った）を代表するものである。対照細胞の成熟後細胞死を†により示している。（Ｃ）定量ＲＴ−ＰＣＲにより評価したＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現（培養１２時間の時点における未処置模擬対照に対する割合％）と第４日目に細胞形態学により評価した最終分化（スケールバー、２５μｍ）とエンプティベクター、ｈＲＮＡ／スクランブルベクター、ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３ベクターおよびｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−４ベクターに感染させたＮＢ４細胞の第２日目に評価したＮＢＴ還元解析（スケールバー、２５μｍ）。細胞をＡＴＲＡ（１μＭ）により４日間処置したまたは処置しなかった（第１回目のＡＴＲＡ、第０日〜第４日、左パネル）。さらに２週間のＡＴＲＡの不在下での培養後に、第１回目のＡＴＲＡを免れたｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３細胞およびｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−４細胞をＡＴＲＡ（１μＭ）により４日間再処置した（第２回目のＡＴＲＡ、第２０日〜第２４日、右パネル）。
【図５】正常骨髄造血時のＲＩＮＦ発現を示す図である。（Ａ）骨髄ＣＤ３４＋細胞（健康ドナー由来）のサイトカイン誘導性（２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３およびＧ−ＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ）顆粒球分化。細胞形態学（スケールバー、２５μｍ）では、細胞をサイトスピンによりガラススライド上に広げ、風乾させ、培養の異なる時点（第２日〜第１０日）においてＭａｙ−Ｇｒ?ｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ（ＭＧＧ）により染色した。記録した培養日それぞれには、観察した骨髄造血の主要段階を示している。第１日目に、細胞の大部分が多核好中性顆粒球へと最終分化した。本発明者らの実験条件において、いくつかの単球細胞も認められた（示していない）。（Ｂ）ＣＤ３４＋前駆体のサイトカイン誘導性顆粒球分化時の様々な遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現（定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定した）（＋／−ｓ．ｅ．ｍ）。
【図６】正常骨髄造血時のＲＩＮＦの機能的関与を示す図である。３名の健康ドナー（Ａ、ＢおよびＣ）由来のＣＤ３４＋骨髄前駆体を、ＲＩＮＦ発現を標的とするレンチウイルスｓｈＲＮＡ構築物（ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３および−４）または対照ベクター（エンプティおよびｓｈＲＮＡ／スクランブル）に感染させ、サイトカイン（２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３およびＧ−ＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ）により処置してそれらを顆粒球にさせた。各ドナーでは、培養の２〜３日おきにサイトスピンおよびＭＧＧ染色後の細胞形態学解析（スケールバー、２５μｍ）により骨髄分化を評価した。培養した前駆体の細胞分化は異なる動態で進展した。それらの図は、それぞれ１４日後、３０日後、および１８日後の細胞集団の形態を示している。留意すべきは、ｓｈＲＮＡ−ＲＩＮＦ−３構築物またはｓｈＲＮＡ−ＲＩＮＦ−４構築物に感染させた細胞培養物が、前骨髄球／骨髄球段階において対照（エンプティベクターまたはスクランブルベクターに感染させた細胞培養物）よりも未成熟な細胞（矢印で示している）を表示していることである。ドナーＡでは、顆粒球分化動態は速く（第１０日まで）、第１４日目において対照培養物にはごくわずかの接着単球／マクロファージだけが存在した。
【図７】ＡＴＲＡ（１μＭ）により処置した、ＮＢ４細胞、ＮＢ４−ＬＲ１細胞およびＮＢ４−ＬＲ２細胞からの全抽出物におけるＲＩＮＦタンパク質の発現を示す図である。３３ｋＤａにおいて特定バンドを示す本発明者らの特注ポリクローナルウサギ抗体（方法参照）を用いてＲＩＮＦを検出した。アクチンをローディング対照として用いた。ＲＩＮＦ発現はＮＢ４細胞において、２つの耐性サブクローンＮＢ４−ＬＲ１およびＮＢ４−ＬＲ２よりも顕著であった。
【図８】３名の（ＰＭＬ−ＲＡＲａ陽性）ＡＰＬ患者に由来する芽球におけるＣｘｘｃ５ ｍＲＮＡ発現を示す図である。細胞をＡＴＲＡ（１μＭ）により４時間処置したまたは処置しなかった。データは、公的に利用可能なデータベースＡｒｒａｙｅｘｐｒｅｓｓ（Ｅ−ＭＥＸＰ−１４９）から抽出した。マイクロアレイ実験は、Meani et al.により、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ＨＧ−Ｕ １３３ＡおよびＨＧ−Ｕ １３３Ｂにより行った（各サンプルに対して２つの表示したハイブリダイゼーション）。発現値測定に用いた定量様式はａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ：ＣＨＰＳｉｇｎａｌである。Ｃｘｘｃ５発現を標的とする３つのプローブは、プローブａ（２２２９９６＿ｓ＿ａｔ）、ｂ（２２４５１６＿ｓ＿ａｔ）およびｃ（２３３９５５＿ｘ＿ａｔ）であった。２箇所の点線は、未処置群およびＡＴＲＡ処置群の平均を示している。本発明者らは、対応のあるスチューデントｔ検定を適用し、これらの２群についての値に有意差がある（ｐ値＜０．０５）ことを示した。
【図９】ＲｉｎｆのｓｈＲＮＡ媒介性サイレンシングがＨＬ６０細胞のＡＴＲＡ誘導性最終分化を遅延させることを示す図である。ＨＬ６０細胞を、エンプティレンチウイルスベクター、ｓｈＲＮＡ／スクランブルレンチウイルスベクター、ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３レンチウイルスベクターまたはｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−４レンチウイルスベクターに感染させ、選抜した。次いで、細胞をＡＴＲＡ（１μＭ）により処置したまたは処置しなかった。ＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現を定量ＲＴ−ＰＣＲにより評価した（培養６時間の時点における未処置模擬対照に対する割合％）。最終分化を、第２日目にＮＢＴ還元解析により第６日目に細胞形態学および（スケールバー、２５μｍ）により評価した。
【図１０】ＲＩＮＦ過剰発現がＮＢ４細胞系統およびＨＬ６０細胞系統の分化を誘導するのに十分ではないことを示す図である。（Ａ）ネズミ幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）由来のレトロウイルス系を用いて、２つの細胞系統においてＲＩＮＦを過剰発現させた。細胞を感染させ、感染の９日後にＧＦＰ発現について選別した。（Ｂ）２つの細胞系統では、ＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現を定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定し（ここでは第１０日目）、それらのそれぞれの模擬対照に対する割合％で表した（＋／−ｓ．ｅ．ｍ）。（Ｃ）細胞をサイトスピンし、細胞形態学解析についてＭＧＧにより染色し、ここでは２つの異なる大きさで視覚化した（スケールバー、２５μｍ）。ＲＩＮＦ過剰発現の１０日後でも分化の徴候は認められなかった。ＲＩＮＦを過剰発現している細胞培養物においてわずかな割合の細胞死（全体の約１０％）が一貫して認められた。
【図１１】骨髄異形成（ＭＤＳ）に罹患している５５名の患者に由来するＣＤ３４＋細胞におけるＣｘｘｃ５ ｍＲＮＡ発現を示す図である。データは、公的に利用可能なデータベースＡｒｒａｙｅｘｐｒｅｓｓ（Ｅ−ＧＥＯ−４６１９）およびＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ （ＧＤＳ２１１８）から抽出した。マイクロアレイ実験は、Pellagatti et al.により、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ａｒｒａｙｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）により行った。各ポイントは、１名のＭＤＳを有する患者または健康個体を表している。３箇所の点線は、正常な健康ドナー（ｎ＝１１）、欠失５ｑを有するＭＤＳ（ｎ＝２０）または欠失５ｑがないＭＤＳ（ｎ＝３５）についての群平均（９９８．１、５１２．２および９８５．９）を示している。ウイルコクソン２標本検定（ｐ＜０．００３）によれば、正常と欠失（５ｑ）を有するＭＤＳについての値に有意差があった。URL: http://www.ebi.ac.uk/Arrayexpress/（ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ）およびhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ）
【図１２】様々な血液疾患を有する患者の骨髄細胞においてＲＱ−ＰＣＲにより検出されたＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図１３】様々な血液疾患を有する患者の血液細胞においてＲＱ−ＰＣＲにより検出されたｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図１４】固形腫瘍におけるＲＩＮＦ発現を示す図である。
【図１５】甲状腺癌患者の対応サンプルの良性に対する腫瘍のＲＩＮＦ発現を示す図である。
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、新規レチノイド応答性核酸、および新規タンパク質に関する。さらに、本発明は、様々な疾患におけるかかる核酸またはタンパク質の使用、ならびに様々な疾患の治療、診断および予後のためのその使用、さらにレチノイド類に対する応答性の予後のための方法のためのその使用にも関する。
【発明の背景】
【０００２】
レチノイド類は多くのヒト組織において抗癌性を有する。これらの薬剤は、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）の治療においてそれらの有効性が特に証明されており、急性前骨髄球性白血病はこれらの薬剤に対する応答性のモデルとして用いることができる癌である。重要なことには、レチノイド受容体は十分に特定されており（ＲＡＲ、ＲＸＲ、ＰＭＬ−ＲＡＲ）この２０年広く研究されているが、それらの抗増殖性および抗癌性に関与するそれらの標的遺伝子の大部分はまだ明らかにされないままである。本発明者らは、マイクロアレイアプローチにより、本発明者らが初めて機能的に特徴付けＲＩＮＦ（レチノイド誘導核因子(Retinoid-Inducible Nuclear Factor)）と名付けた核因子をコードする、レチノイド類の新たな標的遺伝子、ＣＸＸＣ５を同定した。
【０００３】
ＲＩＮＦ発現は、レチノイド類によって引き起こされる白血病細胞の最終分化に必要であるように思われる。実際には、ＲＩＮＦ発現が白血病細胞のレチノイド誘導性分化や正常ＣＤ３４＋前駆体のサイトカイン誘導性骨髄造血に関連があるだけでなく、さらに、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）干渉がこの遺伝子について正常骨髄造血および腫瘍性骨髄造血の両方において調節機能を誘因する。また、ＲＩＮＦは癌において重要な役割を果たすこともある。興味深いことに、ＲＩＮＦ遺伝子は骨髄性白血病（急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］／骨髄異形成［ＭＤＳ］）では欠失していることが多い小領域５ｑ３１．３に局在する。
【０００４】
造血幹細胞の最終成熟顆粒球への分化は、系統限定転写因子により調整される遺伝子群の協調的発現を必要とする多段プロセスである。これまでのところ、造血に不可欠であると証明されている転写因子は比較的少数である。これらの因子の脱調節または突然変異は、細胞の運命を分化から増殖へと変え、骨髄、血液、および他の組織における成熟停止および未成熟芽球の蓄積を特徴とする悪性血液疾患群である急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の一因となり得る。
【０００５】
急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）としても知られるＡＭＬ−Ｍ３サブタイプ(the French-American-British（ＦＡＢ）分類による)は、顆粒球への分化の前骨髄球段階において阻止される白血病芽球のクローン性増加に相当する。この病変は、ｔ（１５；１７）転座を遺伝的特徴とし、最終分化を回復する転写に基づく療法により治療した最初の癌の代表である。実際には、この病変において、薬理学的用量の全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）は白血病芽球の最終成熟を引き起こす。分子レベルにおいて、ＡＴＲＡは、ＡＰＬ細胞においてレチノイン酸受容体（ＲＡＲα、ＰＭＬ−ＲＡＲα．．．）のリガンドとして働くことが分かっており、下流の標的遺伝子の転写活性化を調節する。実験モデル、ＮＢ４細胞系統を用いた広範な研究にもかかわらず、これまでのところ前骨髄球細胞のレチノイド誘導性分化に実際に不可欠であることが示されている、転写因子をコードする標的遺伝子はほんの数種類である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、マイクロアレイアプローチを用いることにより、ＮＢ４細胞においてレチノイド類により早期に誘導され、ＡＴＲＡによる最終分化の回復に関与する可能性がある転写因子をコードするいくつかの新規遺伝子を同定した。レチノイド処置により誘導されるこれらの遺伝子の１つは、本発明者らがＲＩＮＦ（レチノイド誘導核因子）と名付けた核因子をコードする。ＲＮＡ干渉によるＲＩＮＦ無効化は、レチノイド耐性表現型を強化することによりＮＢ４細胞におけるＡＴＲＡの分化作用を排除し、正常ＣＤ３４＋骨髄前駆体のサイトカイン誘導性顆粒球分化を遅延させることから、骨髄分化におけるＲＩＮＦの重要で一般的な調節的役割が示される。
【発明の具体的説明】
【０００７】
本発明の第一の実施態様は、配列番号１および配列番号２の配列またはその機能的断片もしくは変異体、またはそれとハイブリダイズ可能な機能的に同等の単離ＤＮＡ配列、またはそれに対応するｍＲＮＡを含んでなることを特徴とする新規レチノイド応答性核酸に関する。
【０００８】
本発明の第二の実施態様は、配列番号３（ＣＸＸＣ５）の配列またはその機能的断片もしくは変異体を含んでなることを特徴とするタンパク質またはタンパク質誘導体に関する。
【０００９】
本発明の第三の実施態様は、様々な疾患の予防および／または治療のための医薬組成物の製造のための、請求項２に記載のタンパク質もしくはタンパク質配列、または請求項１に記載の核酸の使用に関する。
【００１０】
好ましい実施態様は、哺乳類における、造血疾患の予防および／または治療、または造血細胞の分化の増進に関する。さらなる実施態様は、in vitroまたは哺乳類における造血細胞の分化および／または増殖増進の障害または阻止に関する。
【００１１】
前記造血細胞は、骨髄細胞、末梢血液細胞、臍帯血液細胞であり得、その細胞は腫瘍性または非腫瘍性であり得る。
【００１２】
好ましい使用は、リンパ系細胞または急性骨髄性白血病細胞などの細胞における分化の回復のための使用である。
【００１３】
前記造血疾患は、骨髄異形成（ＭＤＳ，骨髄異形成症候群）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄増殖性症候群（ＭＰＳ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）または慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）であり得る。
【００１４】
好ましい実施態様は、癌の予防および／または治療に関する。
【００１５】
前記癌は、白血病、（骨髄異形成（ＭＤＳ，骨髄異形成症候群）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄増殖性症候群（ＭＰＳ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および固形腫瘍（乳癌、黒色腫、肺癌、甲状腺癌、前立腺癌、神経芽腫、および腎癌）を含んでなる群から選択される癌タイプのうちの１つであり得る。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、それを必要とする哺乳類において、請求項１に記載の核酸の発現を活性化するための、および／または請求項２に記載のタンパク質もしくはタンパク質配列の発現を増強するための、レチノイドの使用に関する。好ましい実施態様はＡＴＲＡである。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、ＣＸＸＣ５の発現を、レトロウイルスまたはレンチウイルスのベクター（過剰発現）により、またはｓｈＲＮＡ分子（抑制）により調節する方法に関する。
【００１８】
本発明のさらなる実施態様は、レチノイド応答性の予後の、または疾患の予後のための方法に関する。
【００１９】
本発明のさらなる実施態様は、癌または造血疾患、または骨髄造血減少状態の診断のための方法であって、本発明による核酸の発現レベルおよび／または状態、または本発明によるタンパク質もしくはタンパク質配列の発現レベルおよび／または状態の検出を含んでなる方法に関する。好ましい実施態様は、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）遺伝子型の診断に関する。もう１つの好ましい実施態様は、白血病、前白血病（骨髄異形成）または癌の状態の診断に関する。好ましい実施態様は、診断のために抗体を用いる。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造のために、本発明によるタンパク質配列または核酸を用いる。
【００２１】
さらなる態様は、分子を癌細胞にターゲッティングする方法に関する。
【００２２】
さらなる態様は、請求項２に記載のタンパク質またはタンパク質配列と、または請求項１に記載のヌクレオチドと相互作用することができる分子に関する。
【００２３】
定義
造血(Hematopoiesis)：
造血(Hematopoiesis)（古代ギリシャ語：「haima」血液；「poiesis」作ること）（hemopoiesisと呼ばれることもある）は、血液細胞成分（赤血球、血小板、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）、単球、マクロファージ、およびリンパ球（Ｂ、ＴおよびＮＫ）を形成することである。血液細胞成分は総て造血幹細胞に由来する。
【００２４】
造血細胞：
造血組織の任意の細胞（リンパ系、骨髄の細胞を含む）。この細胞は、幹細胞（ＨＳＣ）、前駆細胞（骨髄またはリンパ系の共通前駆体）、委任細胞または最終分化血液細胞であり得る。
【００２５】
骨髄造血：骨髄幹細胞による骨髄における多能性造血幹細胞からの骨髄細胞の形成。骨髄造血とは、一般的に、単球および顆粒球などの、血液中の白血球の生産を意味する。このプロセスは、リンパ系組織において見られるマクロファージおよび樹状細胞の前駆細胞も生産する。血液学において、「骨髄細胞」という用語は、リンパ球ではない任意の白血球を記載しさらに顆粒球、単球、マクロファージおよび樹状細胞に加えて赤血球および血小板(erythrocytes(platellet))も含むように用いられる。
【００２６】
急性骨髄性白血病(Acute myeloid leukemia)（ＡＭＬ）：
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（acute myelogenous leukemiaとしても知られる）は、骨髄に蓄積し正常な血液細胞の生産を妨げる異常細胞の急速増殖を特徴とする白血球の骨髄系癌である。ＡＭＬの症状は正常な骨髄が白血病細胞で置き換えられることによって起こり、その結果、赤血球、血小板、および正常な白血球の減少が起こる。これらの症状としては、倦怠感、息切れ、あざや出血が生じ易いこと、および感染症の危険性の増加が挙げられる。ＡＭＬは成熟時計を特徴とする。the French-American-British（ＦＡＢ）分類によれば、ＡＭＬの８つのサブタイプは、分化が阻止される段階、関係している造血コンパートメント、および白血病細胞の成熟度に基づいて区別することができる（Ｍ０〜Ｍ７）。
【００２７】
遺伝子またはタンパク質の「状態」とは、その遺伝子またはタンパク質の配列解析または発現レベル、および遺伝子のコピー数、およびメチル化状態を意味する。
【００２８】
レチノイド類：ビタミンＡと構造的にまたは機能的に関連している化学化合物の種類。本願において、レチノイドという用語は、レチノイン酸受容体と結合し活性化することができる任意の化合物を意味する。これらの受容体は、直接標的遺伝子のプロモーター中に存在するレチノイン酸応答性エレメント（ＲＡＲＥ）に結合し通常それらのリガンド（例えば、レチノイン酸）との結合後に遺伝子の転写を活性化する。
【００２９】
本明細書において、レチノイド応答性遺伝子またはタンパク質は、レチノイド（レチノイン酸など）による処置により発現レベルが誘導される遺伝子またはタンパク質である。
【００３０】
レチノイド応答性の予後：
レチノイド類による療法に応答するのは白血病または癌の細胞のうちのほんのわずかである。さらに、この療法に対する臨床応答は通常、患者に有益な効果があるまで数日または数週間の処置を必要とする。これらの薬剤による疾患治療の後の結果を予測することができる、レチノイド応答性についての初期遺伝子またはタンパク質バイオマーカーの存在は、患者がかかる治療を受けるべきかまたは別の治療を受けるべきかを臨床医が判断するに際して助けになる重要な予後指標となるであろう。
【実施例】
【００３１】
実験の節
材料および方法
細胞培養、処置およびＲＮＡ調製
ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ７）および骨髄細胞（ＮＢ４、ＮＢ４−ＬＲ１、ＮＢ４−ＬＲ２、Ｋ５６２、ＬＡＭＡ−８４およびＨＬ６０）を、１０％ウシ胎児血清(Biochrom AG)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０単位／ｍｌペニシリンＧおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン(lnvitrogen)を添加したＲＰＭＩ １６４０培地(lnvitrogen)で培養し、５％ＣＯ２／加湿雰囲気中暗所にて３７℃でインキュベートした。ヒト骨髄一次ＣＤ３４＋細胞(StemCell technologies)のin vitro増加のため、本発明者らは、上記培地に２０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン３（ＩＬ３）、２０ｎｇ／ｍＬの顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびPeprotechから購入した幹細胞因子（ＳＣＦ）５０ｎｇ／ｍＬを添加した。Duprez E, Ruchaud S, Houge G, et al. A retinoid acid 'resistant’ t(15;17) acute promyelocytic leukemia cell line: isolation, morphological, immunological, and molecular features. Leukemia. 1992; 6: 1281-1287.において従前に記載されているようにＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ（ＭＧＧ）染色による形態学によりおよびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）還元解析により成熟を評価した。細胞密度は、コールターカウンター(Beckman)を使用して決定した。細胞増殖は、式：ＰＤ＝Ｌｏｇ（Ｎ／Ｎ０）／Ｌｏｇ２（式中、Ｎは計数した細胞数であり、Ｎ０は第０日目に播種した細胞数である）により算出される集団倍加数（ＰＤ）として表した。ＡＴＲＡ(Sigma)により処置した細胞または処置していない細胞を一緒に集め、Ｔｒｉｚｏｌ(Invitrogen)またはＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ(Qiagen)を用いるＲＮＡ調製のためにそのまま−８０℃で保存した。抽出されたＲＮＡの収量および品質をＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計(NanoDrop Technologies)により評価した。
【００３２】
マイクロアレイハイブリダイゼーション
マイクロアレイ実験は総て、化学発光検出に基づいているＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢ）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｒｒａｙ ｓｙｓｔｅｍを使用して行った。ＡＢヒトマイクロアレイは、２７，８６８の個別ヒト遺伝子を表す３１，７００のオリゴヌクレオチドプローブ（６０量体）を含む。標識する前に、抽出されたＲＮＡの量および品質をＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計およびＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザ(Agilent technologies)により確認した。ＡＢ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＲＴ−ＩＶＴ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（ＰＮ ４３６３２５２, Roche）を利用して各サンプルから２μｇの全ＲＮＡを（ＤＩＧ−ｄＵＴＰを用いて）ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ｃＲＮＡに変換した。ＤＩＧ標識ｃＲＮＡの量（５０〜７０μｇ）および品質は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計およびＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザにより制御した。２０μgのＤＩＧ標識ｃＲＮＡをＡＢ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｕｒｖｅｙ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｖｅｒｓｉｏｎ １．０と製造業者の使用説明書によりハイブリダイズした。マイクロアレイの化学発光シグナル検出、画像取得および画像解析は、ＡＢ １７００ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＰＮ ４３３８０３６）において製造業者のプロトコール（ＰＮ ４３３９６２９）に従って行った。画像に自動グリッド表示し、化学発光シグナルを定量し、バックグラウンドについて補正し、最後に、ＡＢ １７００ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．０３（ＰＮ ４３３６３９１）を使用してスポットおよび空間的に正規化した。解析には合計６つのマイクロアレイを用いた。３時間の時点においてＮＢ４サンプルについて２つのレプリケート（独立した標識および独立したハイブリダイゼーション工程）を作成した。アレイ間正規化のため、各アレイについて同じシグナル強度中央値を達成するために本発明者らは総てのマイクロアレイでグローバルな中央値正規化を行った。マイクロアレイ実験についてのＭＩＡＭＥ対応の資料は、欧州バイオインフォマティクス研究所(the European Bioinformatics Institute) (www.ebi.ac.uk/arrayexpress)のＡｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓに受託番号Ｅ−ＢＡＳＥ−７で寄託されている。
【００３３】
マイクロアレイデータ解析および遺伝子分類
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してシグナルおよびシグナル対ノイズ比（ＳＩＨ）を抽出した。研究には５，０００を超える平均正規化シグナル強度と６００より低いバックグラウンド中央値を示すマイクロアレイだけを含めた。シグナル強度をDysvik B, Jonassen I. J-Expressに従ってＪ−Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｒｏ Ｖ２．７ソフトウェア(MolMine, Bergen, Norway)にインポートし：Java. Bioinformatics. 2001 ;17:369-370.を用いて遺伝子発現データを探索し、この際、データに導入される外部変数の影響を最小にするためにアレイ間分位点正規化を行った。適切な場合には、正規化の前に信頼性に欠けるスポットのクオリティーフィルタリング（Ｓ／Ｎ＜３）を行った。同定された総ての遺伝子を、ＰＡＮＴＨＥＲ（商標）(Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships)およびＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（商標）（ＧＯ）を用いて分類した。
【００３４】
定量ＲＴ−ＰＣＲ
オリゴｄＴプライマーをＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ(Roche)とともに用い製造業者の使用説明書に従って２０−μｌ容量において全ＲＮＡ（０，１〜１μｇ）から一本鎖ｃＤＮＡ合成（ＲＴ）を実施した。Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０装置(Roche)においてＳＹＢＲｇｒｅｅｎ検出キットを用い製造業者の使用説明書に従って定量ＰＣＲを行った。各遺伝子（ｃｘｘｃ５、ｃｄ３４、ｇｃｓｆｒおよびｃｄ１１ｂ）について、相対ｍＲＮＡ発現をｒｐＰ２遺伝子発現に対して正規化した。ｃｘｘｃ５（5'-tccgctgctctggagaag-3'および5'-cacacgagcagtgacattgc-3'）、ｒｐＰ２（5'-atgcgctacgtcgcc-3'および5'-ttaatcaaaaaggccaaatcccat-3'）、ｃｄ３４（5'-cagctggagccccacag-3'および5'-gaggtcccaggtcctgagc-3'）、ｇｃｓｆｒ（5'-gtgcccacaatcatggaggag-3'および5'-catcctcctccagcactgtg-3'）、およびｃｄ１１ｂ（5'-ctgctcctggccctcatc-3'および5'-gacccccttcactcatcatgtc-3'）の検出用プライマーは総て、同じリアルタイムＰＣＲ増幅条件で用いられるように設計した：９５℃で１０秒の変性；５８℃で１０秒のアニーリング；７２℃で１２秒の伸長。
【００３５】
図１２、図１３および図１４に示した結果については、定量ＲＴ−ＰＣＲに患者材料を使用している
様々な血液疾患に罹患している９４名の患者および１３名の健康ドナーから一連の１０５の骨髄または血液のサンプルを採取した。様々な病状をthe French-American-British分類（ＦＡＢ． Bennet et al. 1982）およびＷＨＯ分類(Vardiman et al. 2002)により分類し次のとおりであった：５ 染色体５ｑ欠失を有するＭＤＳ、１４ 染色体５ｑ欠失がないＭＤＳ、２０ ＡＭＬ（骨髄サンプル）および３７ ＡＭＬ（血液サンプル）、１４ ＡＬＬ Ｂ（血液）および２ ＡＬＬ Ｔ（血液）。総ての患者がインフォームド・コンセントに署名した。
【００３６】
患者サンプルにおけるＲＩＮＦの定量ＲＴ−ＰＣＲ（図１２、図１３および図１４）
オリゴｄＴプライマーおよびランダムヘキサマープライマーをＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Roche−０５ ５３１ ２８７ ００１）とともに用い製造業者の使用説明書に従って２０−μｌ容量において全ＲＮＡ（０，１〜１μｇ）から一本鎖ｃＤＮＡ合成（ＲＴ）を実施した。Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０装置(Roche)においてＣＸＸＣ５遺伝子を標的とする特異的ハイブリダイゼーションプローブを用い、キットＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ ＰｒｏｂｅｓＭａｓｔｅｒ（０４ ７０７ ４９４ ００１）の製造業者の使用説明書に従って定量ＰＣＲを行った。相対ｍＲＮＡ発現をｒｐＰ２遺伝子発現に対して正規化した。ｃｘｘｃ５（5'-tccgctgctctggagaag-3'、5'-cacacgagcagtgacattgc-3’および6FAM-AACCCAAAgCTgCCCTCTCC-BBQ）、ｒｐＰ２（5'-atgcgctacgtcgcc-3'、5'-ttaatcaaaaaggccaaatcccat-3’およびCy5-AgCTgAATggAAAAAACATTgAAgACgTC-BBQ）の検出用プライマーは総て、９５℃で５分間の最初の変性後に同じリアルタイムＰＣＲ増幅条件で用いられるように設計した。よって、次のとおり４４サイクルの間処理される：変性９５℃で１０秒間；および伸長５５℃で２０秒間。
【００３７】
ＣＸＸＣ５の配列決定
配列決定の前にＰＣＲ産物をＥｘｏＳＡＰ−ＩＴキット（GE healthcare−７８２０１）を用いて製品の使用説明書により精製に付した。ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ｖ３．１ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ABI−４３３７４５６）を特異的なフォワード（5'-gcacaaaagtggtgctgtg-3'）およびリバース−（5'-gcgtggtgcaggagcat-3'）配列決定プライマーとともに用いて全容量１０μｌで次の反応条件により配列決定を行った：変性 ９６℃、１０秒；５０℃で５秒のアニーリング；６０℃で４分の伸長、２５サイクルの間実施。
【００３８】
固形腫瘍
固形腫瘍に関して、本発明者らは、乳癌に罹患している患者の３５サンプル（および７つの健康対照）、転移性黒色腫に罹患している患者の４０サンプル（および８つの健康母斑対照）ならびに腫瘍および良性対応対の両方を含む２８の甲状腺癌サンプルにおけるＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現レベルを調査した。
【００３９】
クロマチン免疫沈降実験
２０００万のＮＢ４細胞をＲＰＭＩ培地(Invitrogen)中でホルムアルデヒド（１％ｖ／ｖ）により３７℃で１０分間架橋し、氷冷ＰＢＳで２回洗い流し、低張細胞溶解バッファー（０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ Ｎａ−ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ Ｎａ−ＥＧＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）に再懸濁した。Ｄｏｕｎｃｅ（２０ストローク）を使用して原形質膜を破壊し、集めた核（６５０ｇ、４℃で５分の遠心分離）を１２００μｌのＣｈＩＰバッファー（０．１％ＳＤＳ、０．１％デオキシコール酸Ｎａ、１％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）に再懸濁し、その後超音波処理して５００〜１０００ｂｐ長のＤＮＡ断片を得た。各ＩＰでは、２００μｌの超音波処理産物を回収し、希釈バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００）で１０倍希釈した。特異的結合を減少させるために、ハイブリダイゼーションの前に回転板上で７０μｌのサケ精子ＤＮＡ／プロテインＡアガロース５０％スラリー(Upstate)を４℃で２時間加えることにより前清浄工程を行った。免疫沈降（ＩＰ）では断片化したクロマチン混合物に４μｇの抗ＲＡＲα抗体（Abcam−Ｈ１９２０）、または抗ＰＭＬ抗体（Santa Cruz、ｓｃ−９６６）を加えることによりハイブリダイゼーションを行った（４℃で一晩）。回転板上で７０μｌのサケ精子ＤＮＡ／プロテインＡアガロース５０％スラリー(Upstate)を４℃で４時間加えることにより免疫沈降を行った。遠心分離により免疫複合体を回収し、十分な洗浄後に２００μｌの溶出バッファー（１％ＳＤＳ、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３）で溶出した。ＤＮＡ−タンパク質架橋を外すために、溶出液に８μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、続いて６５℃で一晩加熱した。次いで、これらの画分をＲＮアーゼＡ（１０μｇ／ｍｌ）およびプロテイナーゼＫにより４２℃で２時間処理した。各ＩＰから結果として得られたＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出により精製し、４０μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０．に再懸濁した。インプット分として、前清浄工程後に２０μｌの架橋クロマチンを確保し、Ｈ２Ｏで１０倍希釈し、ＤＮＡ−タンパク質架橋を外すために同じ工程に付した。インプット、ＩＰおよび無Ａｂの画分を、ＲＩＮＦまたはＲＡＲｈ２のプロモーター領域に位置するレチノイン酸応答性エレメントを含むプライマー対を用いるＰＣＲにより解析した。ＲＩＮＦプロモーターのプライマー（１０５ｂｐ）5'-gcagtctgagatggttcccagg-3'/5'-tgcatgtaccattccctctgcc-3’およびＲＡＲｂ２プロモーターのプライマー（２４７ｂｐ）5'-tcctgggagttggtgatgtcag-3'/5'-aaaccctgctcggatcgctc-3'。
【００４０】
細胞質および核の画分の調製
細胞分画を４℃で行った。ＮＢ４細胞を２００ｇでの遠心分離により集め、ＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼの阻害剤を含有する低張溶解バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１２．５ｍＭ ＮａＦ、０．２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１％プロテアーゼ阻害剤カクテル、Sigma Ｐ８３４０）に懸濁し、４０分間膨潤させた。マイクロチューブ(Eppendorf)中での円錐形乳棒による細胞懸濁液のホモジナイゼーションにより原形質膜を破壊した。１，０００ｇで３分間の遠心分離の直前にＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００を０．１％終濃度に加えた。細胞質画分からなる上清が、核からなるペレットから分離される。プロテアーゼおよびホスファターゼの阻害剤を含有する溶解バッファーで核を２回洗浄し、１，０００ｇでの遠心分離により回収し、４ｘサンプルバッファー(Laemmli 1970)で１００℃で８分間抽出した。
【００４１】
ウエスタンブロット
Wu YL, Dudognon C, Nguyen E, et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths. J Cell Sci. 2006;119:2797-2806により従前に記載されているようにウエスタンブロッティングを実施した。
【００４２】
ＲＩＮＦに対する特注ウサギポリクローナルペプチド特異的抗体は、Biogenes GmBHにより生産されたものである。免疫原ペプチドは、ＲＩＮＦタンパク質のアミノ酸４５〜４８に相当する。一次抗体溶液への免疫原ペプチドの添加によるウエスタンブロットシグナルの競合阻害により抗体特異性を確認した。要するに、ブロットをＲＩＮＦに対する一次抗体（ポリクローナル抗体）、ＰＡＲＰ（モノクローナルマウスＩｇＧ、Calbiochem、ｎ°ＡＭ３０）またはアクチン（ポリクローナルウサギＩｇＧ、Sigma、ｎ°Ａ２０６６）とともにインキュベートした後、適当なペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体とともにインキュベートした。化学発光検出システム(Amersham Pharmacia Biotech)を用いてタンパク質の検出を行った。ヒト組織抽出物を含むブロットはMilliporeから購入した（ＴＢ３００）。
【００４３】
細胞質および核の画分の調製
細胞分画を４℃で行った。ＮＢ４細胞を２００ｇでの遠心分離により集め、ＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼの阻害剤を含有する低張溶解バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１２．５ｍＭ ＮａＦ、０．２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１％プロテアーゼ阻害剤カクテル、Sigma Ｐ８３４０）に懸濁し、４０分間膨潤させた。マイクロチューブ(Eppendorf)中での円錐形乳棒による細胞懸濁液のホモジナイゼーションにより原形質膜を破壊した。１，０００ｇで３分間の遠心分離の直前にＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００を０．１％終濃度に加えた。細胞質画分からなる上清が、核からなるペレットから分離される。プロテアーゼおよびホスファターゼの阻害剤を含有する溶解バッファーで核を２回洗浄し、１，０００ｇでの遠心分離により回収し、４ｘサンプルバッファー(Laemmli 1970)で１００℃で８分間抽出した。
【００４４】
免疫蛍光
ＦＬＡＧタグ付きＲＩＮＦをコードするプラスミドをＮＢ４細胞 ｃＤＮＡから構築した。ＰＣＲ産物をｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−４発現ベクター(Sigma)に挿入した。ＭＣＦ７細胞をカバースリップ上で増殖させ、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ製造業者のプロトコール(Roche)によりＦＬＡＧタグ付きＲＩＮＦ構築物でトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、２％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定した。固定した細胞をＰＢＳで３回洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１０分間透過処理した後、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ、２％ＢＳＡ）中で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ、２％ＢＳＡ）で１：３，０００希釈した一次抗体（ウサギポリクローナル抗Ｆｌａｇ Ｍ２、Sigma）とともに一晩インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１：１，０００希釈（ＰＢＳ、２％ＢＳＡ）した二次抗体（Molecular ProbesのＡｌｅｘａ−４８８コンジュゲート抗ウサギ、Invitrogen）とともに室温で１時間インキュベートした。続いて、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤４’，６−ジアミニジン−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Vector Laboratories）で封入して核を対比染色した。Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ６３Ｘ Ｎ．Ａ．１．４油浸対物レンズを搭載したZeiss ＬＳＭ５１０ ＭＥＴＡ共焦点レーザー顕微鏡において共焦点顕微鏡によりＬＳＭ５１０ソフトウェアｖ４．０(Zeiss)を用いて免疫蛍光像を取得した。
【００４５】
レンチウイルス感染のためのプラスミド
ＲＩＮＦ発現を標的とするレンチウイルスプラスミド（ｐＬＫＯ．１／ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ）は、Sigmaから購入し（ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｓｈＲＮＡ大腸菌グリセロールストック）、対照ベクター（ｐＬＫＯ．１／ＴＲＣおよびｐＬＫＯ．１／ｓｈＲＮＡ／スクランブル対照）は、マテリアル移転契約を通じてDavid RootおよびDavid M. Sabatiniにより厚意で提供されたものである（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１０８７９および１８６４）。要するに、レンチウイルス粒子の作製は、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞と、Trono's labにより開発された第二世代のパッケージングシステム（例えば、パッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２およびエンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇ）（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１２２６０および１２２５９）との一過性同時トランスフェクション（Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ、Roche）により行った。トランスフェクションの２日後にウイルス上清を回収し濾過した後、スピン感染のために増殖細胞に適用し（２４００ｒｐｍ、室温で１時間）、そしてそれは硫酸プロテアミン（５μｇ／ｍＬ）の存在下で実施した。感染の２日後に、１μｇ／ｍＬのピューロマイシン (Sigma)を用いて少なくとも２日間ＮＢ４細胞を選抜した。
【００４６】
プラスミドおよびレトロウイルス感染
脳心筋炎ウイルス内部リボソーム進入配列とリポーター遺伝子としての緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むネズミ幹細胞ウイルスレトロウイルスベクターＭｉｇ−Ｒ１は、W. S. Pear(University of Pennsylvania, Philadelphia, PA)により厚意で提供されたものである。５’ウイルス長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターがＲＩＮＦの発現を駆動できるようにＭｉｇ−Ｒ１にＲＩＮＦを挿入した。Ｍｉｇ−Ｒ１構築物（Ｍｉｇ−Ｒ１／エンプティおよびＭｉｇ−Ｒ１／ＲＩＮＦ）をＰｈｏｅｎｉｘレトロウイルスパッケージング細胞系統にトランスフェクトして（ＶＳＶ−Ｇ偽型）ウイルス上清を生成し、このウイルス上清をトランスフェクションの２日後に回収した。次いで、４μｇ／ｍｌの硫酸プロテアミンの存在下で感染を実施した。感染の９日後に感染した細胞をＧＦＰ蛍光について選別した。
【００４７】
ＵＲＬ
Ｃｘｘｃ５遺伝子のエキソン−イントロン構築およびゲノム組織化は、de Ia Grange P, Dutertre M, Martin N, Auboeuf D. FAST DB: a website resource for the study of the expression regulation of human gene products. Nucleic Acids Res. 2005;33:4276-4284に従ってｆａｓｔ ＤＢ(http://www.fast-db.com)を利用して行った。ＲＩＮＦタンパク質の理論分子量は、ＥｘＰＡＳｙ(Expert Protein Analysis System)ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｓｅｒｖｅｒウェブサイト(www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)において計算した。推定NLSモチーフのコンピュータによる解析は、ＰｒｅｄｉｃｔＮＬＳ(cubic.bioc.columbia.edu/predictNLS/)を利用して行った。
【００４８】
結果
本発明および本発明につながる実験の結果を、以下の図を参照してさらに記載する。
【００４９】
実験結果
ＮＢ４細胞系統における、レチノイン酸により早期に誘導される遺伝子であるＣｘｘｃ５の同定
ＡＰＬにおける新規レチノイン酸標的遺伝子についての本発明者らの探索において、本発明者らは、ＡＴＲＡ（１μＭ）により短時間（９０分および３時間）処置したＮＢ４細胞を用いてマイクロアレイ実験を行った。マイクロアレイ発現解析によって本発明者らは３５個の遺伝子を同定でき、それらの遺伝子は、処置９０分の時点において一貫してアップレギュレートされ、未処置対照と比べて少なくとも２倍の誘導があり、３時間後もアップレギュレートされたままであった（表１）。これらの３５個の遺伝子の慎重な解析と分類によって、周知の転写因子または推定転写因子をコードする９個の遺伝子を同定した。他の２６個の遺伝子は、遺伝子オントロジーおよび／または配列解析による推定転写因子であるための基準を満たさなかった。９個の候補遺伝子のうちの７個は、顆粒球または単球への分化時に骨髄組織において発現されることが分かっている、明確に特徴付けられた転写因子をコードする。重要なことには、これらの遺伝子のうちの６個はＮＢ４細胞においてレチノイン酸により早期に誘導され、５個は直接標的であることはこれまでに確認されている。本発明者らのマイクロアレイスクリーニングの精度はこれらの観察により確認され、証明された。
【００５０】
【表１】
【００５１】
本発明は、これまでのところ機能的特性評価を受けていないゲノム配列であるＣｘｘｃ５に関する。
【００５２】
本発明者らの選択は２つの決定的な実験的発見後に行った。第１に、定量ＲＴ−ＰＣＲ解析（図１Ａ）により、Ｃｘｘｃ５ ｍＲＮＡ発現のＡＴＲＡによる誘導が見事に確認された（ここではレチノイン酸処置４時間において観察された）。第２に、レチノイド添加の３０分前に４時間続けたタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドによるＮＢ４細胞の前処置は、ＡＴＲＡによるＣＸＸＣ５ ｍＲＮＡアップレギュレーションを阻止しなかった（図１Ａ）。これらの実験は、Ｃｘｘｃ５のＡＴＲＡ媒介性転写がデノボタンパク質合成を必要としないことを示しており、Ｃｘｘｃ５がレチノイン酸の一次標的であることを示唆している。これは、ＮＢ４細胞におけるレチノイド受容体（ＲＡＲおよび／またはＰＭＬ−ＲＡＲｑとＣｘｘｃ５遺伝子のプロモーターとの直接結合を証明したＣｈＩＰ実験（図１Ｂ）により確認された。
【００５３】
Ｃｘｘｃ５遺伝子のコンピュータによる特性評価
データベースから入手可能なＣｘｘｃ５（ＥＮＳＧ０００００１７１６０４）の主なゲノムの特徴を図２に簡潔にまとめた。Ｃｘｘｃ５遺伝子は、５番染色体の長腕、５ｑ３１．３に位置する（図２Ａ）。この遺伝子は３５．５ｋｂｐに及び、４つのエキソンに組織化されている（図２Ｂ）。この遺伝子の上流プロモーター領域は、まだ機能的に解析されていないが本発明者らの研究に関連しており、転写開始部位から−３１１６ｂｐに潜在的レチノイド応答性エレメントを含む。２つの潜在的代替転写開始部位（エキソン１に１つとエキソン２にもう１つ）が存在するにもかかわらず、それらの２つのｍＲＮＡ配列はエキソン３に開始コドンを有する同じオープンリーディングフレームを示す。概念翻訳により、３２２個のアミノ酸からなるタンパク質（図２Ｃ）であり理論分子量が３２．９８ｋＤａであると予測される。タンパク質配列解析により、Ｃ末端の近位において、独特の保存されたドメイン、アミノ酸２５７〜３０２間に典型的なＣＸＸＣ亜鉛フィンガーモチーフ(CX2CX2CX4-5CX2CX2C9-15Cx2Cx4C)が示された。２個の亜鉛イオンに配位している８個の保存されたシステイン残基を含むことが分かっているこのモチーフは、１１個の他のタンパク質（多くの場合クロマチン関連タンパク質）において見られ、非メチル化ＣｐＧを認識すると考えられている。図２Ｄは、このモチーフを有するタンパク質ファミリーの既知メンバー総てのアラインメントを示している。
【００５４】
レチノイド類により処置した前骨髄球細胞におけるＣｘｘｃ５の遺伝子発現プロフィール
本発明者らのマイクロアレイデータに一致して、ＣＸＸＣ５ ｍＲＮＡレベルの経時的解析（定量ＲＴ−ＰＣＲによる）により、早くもＡＴＲＡ処置９０分に２倍の誘導が示された（図３Ａ）。Ｃｘｘｃ５の転写レベルは、処置１２時間の時点においてその最大レベルに達した（未処置対照において観察された発現レベルのおよそ６倍）。その後、そのレベルは少なくとも４８時間の間安定にアップレギュレートされたままであった（図３Ａ）。本発明者らは、Ｃｘｘｃ５発現およびそのタンパク質レベルの誘導を確認するために、予測されるＣＸＸＣ５ポリペプチド鎖のアミノ酸４５〜４８に対するポリクローナル抗体を特別注文した（方法参照）。ＣＸＸＣ５タンパク質の基礎発現レベルは未処置ＮＢ４細胞抽出物において非常に低かったが（図３Ｂ）、ＡＴＲＡ処置開始後４時間以内に予想分子量３３ｋＤａにＣＸＸＣ５タンパク質に対して特異的な強いバンド（その免疫原性ペプチドとの競合により確認された、示していない）が現われた。ＣＸＸＣ５タンパク質の誘導動態は、ｍＲＮＡレベルにおいて観察された誘導に一致している。興味深いことに、ＮＢ４細胞と比較すると、成熟耐性サブクローンＮＢ４−ＬＲ１およびＮＢ４−ＬＲ２のＡＴＲＡ処置後にはＣＸＸＣ５タンパク質の非常に弱い誘導しか認められなかった（図７）。これらの観察は、ＡＰＬ細胞の最終成熟時にＣＸＸＣ５が参加する可能性があることと一致する。さらに、公的に利用可能なマイクロアレイデータセットから抽出したデータ（図８）により、ＡＰＬ患者の一次細胞におけるＡＴＲＡによるＣｘｘｃ５ ｍＲＮＡの早期誘導が確認され、ＮＢ４細胞系統を用いて得たデータが証明された。
【００５５】
レチノイド誘導核因子、ＲＩＮＦ（ＣＸＸＣ５）の細胞内局在性
ＡＴＲＡ処置ＮＢ４細胞の核および細胞質の画分のウエスタンブロット解析により、核抽出物におけるＣＸＸＣ５の発現がはっきりと検出された（図３Ｃ）。この増加した発現レベルは少なくとも４８時間続いた。本発明者らのポリクローナル抗体では折り畳まれた天然タンパク質の関連エピトープ（アミノ酸４５〜４８）がほとんど検出されなかったため、本発明者らは、in situ免疫化学実験のためにＦＬＡＧタグ付きＣＸＸＣ５をコードするプラスミドを作製した。この構築物で一過性にトランスフェクトしたＭＣＦ７細胞のin situ共焦点解析により強い核の染色が示され（図３Ｄ）、ＣＸＸＣ５タンパク質の核局在パターンが確認された。注目すべきは、細胞によっておよび過剰発現レベルによって、蛍光パターンが核内の微細クロマチンマトリックス、核質および／または不連続断続構造(discrete punctured structures)と少しは関係していたことである。しかしながら、核膜においても核小体内においても蛍光シグナルは検出されなかった。
【００５６】
これらの実験的証拠に基づいて、本発明者らは、レチノイド誘導核因子(Retinoid-Inducible Nuclear Factor)にちなんでＣＸＸＣ５をＲＩＮＦと新たに命名することを提案する。この提案した名前にふさわしく、ＲＩＮＦ（ＣＸＸＣ５）配列の詳細な解析により、亜鉛フィンガードメインのＮ末端側に位置する、アミノ酸残基２５７〜２６２間の推定核局在シグナル(Nuclear Localization Signal)（ＮＬＳ）(KKKRKR)が明らかになった。
【００５７】
異なる骨髄細胞系統および様々なヒト組織におけるＲＩＮＦの発現パターン
本発明者らは、他の骨髄細胞系統（図３Ｅ−Ｆ）および様々なヒト組織（図３Ｇ）におけるＲｉｎｆ遺伝子の基礎発現レベル、ならびにレチノイド類によるその潜在的調節も評価した。検証したより未成熟な細胞系統、Ｋ５６２細胞およびＬＡＭＡ−８４細胞は最大のＲＩＮＦ ｍＲＮＡレベル（それぞれ、ＮＢ４細胞の基礎レベルの１６倍および１２倍）と、さらに最大のＲＩＮＦタンパク質発現も示した。これらの細胞系統ではＡＴＲＡ処置によりＲＩＮＦ ｍＲＮＡレベルもタンパク質レベルもアップレギュレートされないように思われた（図３Ｅ−Ｆ）。相対的に、ＨＬ６０（Ｍ２−サブタイプ）細胞系統とＮＢ４（Ｍ３−サブタイプ）細胞系統は両方ともＲＩＮＦ ｍＲＮＡおよびタンパク質の基礎レベルが低い。重要なことには、ＡＴＲＡによる後者の細胞系統の処置により、ＨＬ６０細胞（かかる処置により最終分化を始めることが分かっている）がＲＩＮＦ誘導に関してｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方においてＮＢ４細胞に似た挙動をする（ここでは４時間の時点において観察された）ことが示された。重要なことには、キメラ受容体ＰＭＬ−ＲＡＲｑの発現が起こらない細胞系統であるＨＬ６０におけるこの誘導により、ＡＴＲＡによるＲＩＮＦ誘導にＰＭＬ−ＲＡＲαが必要でないことが証明された。この観察に一致して、本発明者らは、ＮＢ４細胞に似た基礎発現レベル（データは示していない）を有する２つの他の細胞系統、Ａ５４９肺癌細胞（３倍増加）およびＨｅＬａ頸癌細胞（２倍増加）においてもＡＴＲＡによりＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現を誘導されることに注目した。最後に、ＲＩＮＦ発現が骨髄組織に限定されないという事実を実証するために、本発明者らは異なる器官からの様々なタンパク質抽出物においてウエスタンブロット解析を行った（図３Ｇ）。ＲＩＮＦタンパク質は検証したヒト組織において種々の発現レベルを示し、胎盤において発現レベルが最大であり、脳において最小であった。要するに、これらのデータは、ＲＩＮＦの調節発現および推定機能はＰＭＬ−ＲＡＲα発現に依存しておらず、ＡＰＬ病理学よりもずっと広範な関心分野を含むことを示している。
【００５８】
ＲＩＮＦ発現は前骨髄球性白血病細胞の分化に必要である
ＡＴＲＡ処置後のＮＢ４細胞最終分化へのＲＩＮＦの潜在的関与を調査するために、本発明者らは、レンチウイルスベクターにより送達されるｓｈＲＮＡを用いてＲＮＡ干渉アプローチを行った（図４Ａ）。ＲＩＮＦ ｍＲＮＡに対して向けられた５つの異なるｓｈＲＮＡ構築物のそれぞれを安定に発現するＮＢ４細胞の感染および選抜後に、（基礎ＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現レベルを標的とするための）それらの有効性を対照ベクター、すなわち、スクランブルドｓｈＲＮＡを発現する対照ベクターおよびエンプティベクターである対照ベクターと比較した。２つの最高ノックダウン効率がｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３（６１％）およびｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−４（８５％）で観察され、それらに関してはレチノイドの不在下ではＮＢ４細胞において増殖変化も形態学的変化も認められなかった。かかるサイレンシング効率に関し（図４Ａ）、本発明者らは、細胞の大きな割合においてＡＴＲＡによるＲＩＮＦ ｍＲＮＡ誘導を効率的に阻止することをかなり期待することができ、このようにして、ＡＴＲＡ処置後の細胞表現型にもたらす影響を評価することができた。
【００５９】
特筆すべきは、これらの２つのｓｈＲＮＡ構築物の発現により薬理学的用量のＡＴＲＡの存在下で増殖する能力がＮＢ４細胞集団に与えられることである（図４Ｂ）。実際には、対照ベクターを発現する細胞はＡＴＲＡ処置によって１週間以内に不可避に分化し死滅したが、一方ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−４レンチウイルスベクターまたはｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３レンチウイルスベクターのいずれかに感染させた細胞培養物はどちらも増殖停止（図４Ｂ）および最終分化プロセス（図４Ｃ）を回避した。ＡＴＲＡ誘導性ＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現を阻止するための本発明者らのＲＮＡ干渉戦略の有効性を定量ＲＴ−ＰＣＲにより、ＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現が最大であった（図３Ａも参照）処置１２時間の時点において評価した（図４Ｃ）。重要なことには、ＡＴＲＡにより処置した対照ベクターと比べてｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３（約５０％）およびｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−４（６０％）に関して得たノックダウンレベルは、ＮＢＴ還元および形態学的解析によって評価された通りＮＢ４細胞のおよそ３０％〜５０％を最終分化から救うのに十分であった（図４Ｃ、左パネル）。
【００６０】
注目すべきは、これらの細胞（ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３および−４）がレチノイド類の存在下で増殖し続け、ＡＴＲＡなしでの２週間の培養後も（第６日〜第２０日）ＡＴＲＡに対するそれらの耐性が確認され、ＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現における効率的な阻止と密接に関連していた（図４Ｃ、右パネル）ことである。要するに、これらの結果は、ｓｈＲＮＡ媒介性ＲＩＮＦノックダウンが前骨髄球性白血病細胞のＡＴＲＡ誘導性最終分化を障害することを示しており、ＮＢ４細胞のレチノイド誘導性最終成熟にＲＩＮＦ発現が必要であることを強く示唆している。
【００６１】
次に、薬理学的用量のＡＴＲＡにより顆粒球分化経路に委任されたＨＬ６０細胞系統においてＲＩＮＦの関与を評価した（図９）。ＮＢ４細胞で観察された通り、２つのｓｈＲＮＡはＲＩＮＦ発現を効率的に標的とし（図９）、成熟プロセス（ＮＢＴおよび形態学的解析により評価される）を遅延させ、顆粒球分化時のＲＩＮＦの機能的関与が実証された。しかしながら、レチノイド類の存在下で増殖し続けたＮＢ４−ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ細胞とは対照的に、ＡＴＲＡ処置ＨＬ６０−ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ細胞は不可避に衰弱し１２日以内に死滅した。
【００６２】
最後に、本発明者らは、ＲＩＮＦ過剰発現はＡＴＲＡの不在下でＮＢ４細胞またはＨＬ６０細胞の顆粒球成熟を誘導するのに十分であろうかと考えた（図１０）。本発明者らのデータは、異所性ＲＩＮＦ発現（図１０Ｂ）は白血病細胞の顆粒球分化を引き起こすために必要であるが十分ではないことを示している。実際には、ＲＩＮＦ過剰発現の１０日後でも、形態学的レベルにおいても（図１０、パネルＣ）、分子レベルにおいても（抗ＣＤ１１ｂ表面マーカーを使用、データは示していない）分化の徴候は認められなかった。
【００６３】
正常ＣＤ３４＋前駆細胞のサイトカインによる骨髄造血時のＲＩＮＦ発現および機能
本発明者らの上記発見は、造血組織および他のヒト組織における様々なＲＩＮＦ発現を明確に示している。これらのデータは、ＲＩＮＦ発現は、薬理学的濃度のＡＴＲＡにより誘導でき、一部の骨髄性白血病細胞の分化に必要であるが、正常前駆体骨髄造血時にはサイトカインにより生理学的に調節され得るということを示している。この場合、その調節発現は顆粒球系統に沿った正常発生時にも起こるより一般的な事象を意味することもあり得る。
【００６４】
この仮説を検証するために、本発明者らは、健康成人ドナーの骨髄から単離されたＣＤ３４＋細胞のサイトカイン誘導性顆粒球分化時のＲＩＮＦ発現を検証した。形態学的変化（図５Ａ）と、ＲＩＮＦとの比較によるＣＤ３４、ＣＤ１１ｂおよびＧ−ＣＳＦＲの発現の解析（図５Ｂ）により分化を評価した。ＲＩＮＦ ｍＲＮＡレベルの経時的発現プロフィールを定量ＲＴ−ＰＣＲ解析により決定した。ＲＩＮＦ ｍＲＮＡレベルは、初期低下（第２日〜第４日）後、第４日〜第６日の間にその最小発現に達し、その時点において培養細胞の大部分は芽球段階と前骨髄球段階にあった。その後、第６日〜第８日の間に、ＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現は、骨髄球、後骨髄球へ、最後には短寿命多核好中球への最終細胞成熟と同時に、その最小レベルからおよそ３．５倍増加した（図５Ａ−Ｂ）。サイトカインによる分化時のＣＤ３４＋前駆体および正常造血細胞におけるＲＩＮＦ ｍＲＮＡの検出により、その発現がＡＰＬ細胞に限定されない（それゆえＰＭＬ−ＲＡＲα発現に依存していない）こと、最も重要なことには、その誘導がＡＴＲＡの薬理学的シグナル伝達に限定されないことが確認される。これらのデータは、正常骨髄造血時のその潜在的役割に一致している。
【００６５】
正常骨髄造血時のＲＩＮＦ発現の機能的関連性を評価するために、サイトカイン処置により顆粒球系統に向けたＣＤ３４＋前駆細胞をレンチウイルスｓｈＲＮＡ構築物に感染させて、ＲＩＮＦ発現をノックダウンした。非感染細胞同様に、対照ベクター（ｓｈＲＮＡ／スクランブルおよび模擬対照）に感染させた細胞の大部分は多核顆粒球へと成熟した（図５Ａおよび図６）後死滅し、細胞培養物に徐々に分解された（示していない）。異なるドナー由来の検証した３つの細胞培養物では、異なる動態で顆粒球への分化が起こり（図６参照）、総ての培養物は、急速に死滅する多核好中球の細胞成熟で終わった。寿命がずっと長いことが分かっている単球と付着性マクロファージは培養物中にわずかしか存在しなかった。重要なことには、ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３およびｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−４に同じ条件下で感染させた細胞集団（図６）は、成熟していない細胞（前骨髄球および骨髄球）の著しい蓄積を示した。対照培養物と比べて２つのｓｈＲＮＡで観察された顆粒球成熟におけるこの違いは、ＡＴＲＡにより処置した白血病細胞系統ＮＢ４およびＨＬ６０に関して得た結果を見事に映し、正常骨髄造血時のＲＩＮＦの同様の役割を示唆している。
【００６６】
考察
造血細胞分化の多段プロセスは、長年、腫瘍病因の理解のためや治療戦略の設計のためのモデル研究として扱われてきた。成熟機能細胞の産生を制御する発生プログラムの攪乱は、シグナル変換および／または遺伝子転写制御をその選好機能とする限られた重要な調節遺伝子における遺伝子変化または後成的変化（遺伝子欠失、突然変異、メチル化など）によって頻繁に起こる。造血器悪性腫瘍の特定の症例では、この１０年間でこれらの重要な調節遺伝子の発見に関して大きな進歩がもたらされたがそれらの機能階層については不確実性が残っている。
【００６７】
本研究において、本発明者らは、亜鉛フィンガーファミリーの新規メンバーであるＣＸＸＣ５（ＲＩＮＦ）を同定し特徴付け、骨髄球性白血病細胞のレチノイド誘導性最終分化時だけでなくサイトカインによる正常骨髄造血時のそのかかわりも示した。亜鉛フィンガーを含むタンパク質は、哺乳類ゲノムにおいて最大のタンパク質スーパーファミリーの１つを構成し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、または他のタンパク質と相互作用する構造的に異なる保存されたドメインを有する、進化タンパク質ファミリーおよび機能的に多様なタンパク質ファミリーに分類することができる。ＣＸＸＣ型亜鉛フィンガーは、該タンパク質のヒストンメチル−トランスフェラーゼ（ＭＬＬ、ＭＬＬ２）、ヒストンデメチラーゼ（ＦＢＸＬ−１０、−１１、−１９）、ＤＮＡ−メチル−トランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ１）、またはＣｐＧ結合（ＣＧＢＰ、ＭＢＤ１）の活性によってクロマチン再構築に関与するというタンパク質の小サブセットにおいて見られる（図２）。ＭＬＬ、ＣＧＢＰ、およびＭＢＤ１のＣＸＸＣドメインは、非メチル化ＣｐＧと結合することがわかっており、この認識には保存されたＫＦＧＧモチーフ（亜鉛フィンガーの２番目のリンカー中にある）が不可欠である。ＫＦＧＧモチーフを欠いているパラログ（ＣＸＸＣ−４、−５、−６、および−１０、図２）は後の特性を共有しないと予想され、今後の課題の１つは、保存されているがＫＦＧＧモチーフを欠いているＣＸＸＣドメインを有するこの特異的サブセットのタンパク質により認識される分子標的（群）を同定することであろう。興味深いことに、ＣＸＸＣ型ファミリーの３メンバー（ＫＦＧＧモチーフを含むまたは含まない）、ＭＬＬ、ＭＬＬ２、およびＬＣＸは、これまで、染色体転座や内部再配列によって白血病誘発に関与してきた。ＭＬＬは、白血病において最も高頻度で転座される遺伝子の１つであり、記載されている種々の融合パートナーが３０を超えるにもかかわらずＣＸＸＣドメインは既知ＭＬＬ融合タンパク質総ての中に残り、ＣＸＸＣドメインは骨髄変化に不可欠であると思われ、作用機序がまだ解明されていなくてもこの亜鉛フィンガー亜型の生物学的重要性を実証している。
【００６８】
ここで報告したＣｘｘｃ５（Ｒｉｎｆ）遺伝子の発現および誘導のパターンにより、正常骨髄造血および腫瘍性骨髄造血の両方における、少なくとも成熟プロセスの最終段階（前骨髄球、骨髄球）におけるＲＩＮＦの機能的関与が裏付けられた。特異的ＲＮＡｉターゲッティングを用いたノックダウン実験により、前骨髄球性白血病細胞の最終分化プロセスにＲＩＮＦ発現が必要であることもさらに示された。しかしながら、重要なことには、本発明者らの研究は、Ｒｉｎｆ病態生理学がＡＰＬに限定されず、他の造血器悪性腫瘍および正常造血においてより広いかかわりを有する可能性があるという概念をはっきりと裏付けている。よって、Ｒｉｎｆの状態（例えば突然変異、異常な発現／誘導）はＡＴＲＡ応答性を予測するのに役に立つ可能性があり、それゆえ、ＡＭＬ患者の治療計画に関する決定に重要なツールとなる可能性がある。
【００６９】
臨床状況において、Ｃｘｘｃ５（Ｒｉｎｆ）生物学に関する刺激的な見通しはその脱調節発現がいくつかの血液疾患の病因となり得るかどうかを評価することである。実際には、５番染色体の長腕の中間部欠失または完全喪失は、骨髄異形成（ＭＤＳ、多くの場合前白血病性疾患として記載される）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のような、異常骨髄造血および骨髄中の芽球過剰を特徴とする悪性骨髄疾患における再発性染色体異常である。染色体バンド５ｑ３１の主要な共通欠失領域（ＣＤＲ）を明らかにした広範囲な研究にもかかわらず、白血病誘発の一因となると推測された候補腫瘍抑制遺伝子は、４Ｍｂｐサイズのこの領域においてまだ確認されていない。このセグメント内部において、Ｒｉｎｆは、今日記載されている(described at his date)最も小さい（１Ｍｂｐ未満）ＣＤＲを表す遠位マーカーＤ５Ｓ５９４から２０ｋｂｐまでに局在することに注目することが重要である。驚くべきことに、Ｒｉｎｆ遺伝子は、恐らくＣＤＲの外側に局在すると考えられていたため、これまでのところ遺伝学的および機能的調査を免れてきた。それでも、ＲｉｎｆとＣＤＲとが極めて接近していることで、同定遺伝子の上流における調節配列の喪失と、さらに５ｑ３１内でのより遠位の欠失を理由にＲｉｎｆ発現に影響を与える可能性がある。本発明者らの発見により、文献中のデータと合わせて考えて、本発明者らはＲｉｎｆを骨髄細胞形質転換についての強力な腫瘍抑制遺伝子候補であると考えるに至った。興味深いことに、骨髄病変について公的に利用可能なマイクロアレイデータベースを調べて、本発明者らは正常な健康ドナーと比べて、欠失５ｑを有する骨髄異形成患者のＣＤ３４＋細胞でのより低いＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現を明らかにした（図１１）。この観察は推定ハプロ不全機構と一致し、不応性貧血、５ｑ−症候群を含むＭＤＳのもう１つのサブグループにおいてリボソーム遺伝子ｒｐＳ１４（特徴的なＣＤＲの５ｑ３２に位置する）について最近記載されたため、これらの血液疾患におけるｒｉｎｆ脱調節の真の寄与を評価することが重要であろう。
【００７０】
Ｒｉｎｆ発現が骨髄組織に限定されないことから、この遺伝子は他の組織の発生および／またはホメオスタシスにも関与する可能性がある。レチノイド類によるその直接誘導は、中間タンパク質レギュレーターのデノボ合成を必要とせず、これは、分化と関係なくてもＲｉｎｆが少なくともある程度はレチノイド類の多面発現効果のいくつか、例えば、様々な固形腫瘍におけるそれらの抗増殖作用などを媒介する可能性があることを示唆している。まとめると、本発明者らの発見により、異なる組織においてレチノイド類により薬理学的に誘導できるＲｉｎｆ発現は、いくつかの発生プロセスおよび病変において予想されるそのかかわりから、幅広い利益がある可能性があるという仮説が裏付けられる。
【００７１】
配列情報
Organization Applicant
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【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】ＣＸＸＣ５（ＲＩＮＦ）がレチノイン酸の直接標的であることを示す図である。（Ａ）．ＡＴＲＡ処置（１μＭ）の４時間後に定量ＲＴ−ＰＣＲによりＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現レベルを測定した。１０μｇ／ｍＬにて用いたシクロヘキシミド（ＣＨＸ）による翻訳の阻害は、ＲＩＮＦ ｍＲＮＡレベルのＡＴＲＡによる上昇を阻止しなかった。これは、このプロセスがデノボタンパク質合成を必要としないことを示しており、Ｒｉｎｆがレチノイン酸の一次標的であることを強く示唆している。ヒストグラムは、２つの独立した細胞培養処置の平均（＋／−ｓ．ｅ．ｍ）を表している。（Ｂ）．ＮＢ４細胞におけるＲＡＲαおよびＰＭＬ−ＲＡＲαのＲＩＮＦプロモーターとのin vivo結合。１μＭ ＡＴＲＡで３時間処置したＮＢ４細胞または処置していないＮＢ４細胞から架橋クロマチンを調製し、抗ＲＡＲα抗体または抗ＰＭＬ抗体により免疫沈降させた。この沈降物を、ヒトＲＩＮＦまたはＲＡＲｂ２遺伝子プロモーターにわたるプライマー対を用いるＰＣＲ解析に付した。これらのプライマーは、ＲＩＮＦプロモーターに見られる推定レチノイド応答性エレメント(ggagttcatgaggtgagc)またはＲＡＲｂ２プロモーター（ここでは陽性対照として用いた）において確立されているＲＡＲＥ(ggttcaccgaaagttca)を含むように設計された。インプット：ＩＰの前にＮＢ４細胞の全クロマチンについてＰＣＲを行った。無Ａｂ（無抗体対照）：無関係の抗体を用いたまたは抗体を用いないＩＰ後に得られたサンプルについてＰＣＲを行った。
【図２】Ｃｘｘｃ５遺伝子構造とタンパク質産物（ＲＩＮＦ）を示す図である。（Ａ）Ｃｘｘｃ５（Ｒｉｎｆ）遺伝子は、染色体５ｑ３１．３に局在する。Ｃｘｘｃ５遺伝子はｐｔｅｒの１３９，００８，１３０ｂｐに始まり、ｐｔｅｒの１３９，０４３，６５１ｂｐに終わる。Ｃｘｘｃ５遺伝子はプラス鎖方向に配向され、３５，５２２ｋｂｐ長である。（Ｂ）Ｃｘｘｃ５（Ｒｉｎｆ）遺伝子のゲノム組織化。Ｃｘｘｃ５遺伝子は４つのエキソンに組織化され、オープンリーディングフレームの９５％はエキソン３に位置する。ダイレクトリピート２(Direct Repeat 2)（ＤＲ２）タイプの推定レチノイン酸応答性エレメント（ＲＡＲＥ）は、エキソン１転写開始部位の上流側−３１１６ｂｐに位置する。（Ｃ）一文字アミノ酸表示によるＲＩＮＦの予測アミノ酸配列。オープンリーディングフレームは３２２個のアミノ酸残基からなるタンパク質配列であり理論分子量が３２．９８ｋＤａである(www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)が見込まれる。亜鉛フィンガードメインに下線を施している。（Ｄ）ＣＸＸＣ亜鉛フィンガードメインを除いては、保存された構造ドメインは見られなかった。ＲＩＮＦタンパク質のＣＸＸＣ−モチーフとそのヒトパラログとのアラインメントを示している。ＣＸＸＣ−モチーフの中で不変であるアミノ酸は灰色で示し、保存されたシステイン残基は赤色で示している。ＣＸＸＣ型亜鉛フィンガーのコンセンサス配列は、Cx2Cx2Cx4-5Cx2Cx2C9-15Cx2Cx4Cにより定義することができる。
【図３】ＮＢ４細胞と他の骨髄細胞系統および組織におけるＲＩＮＦ発現と細胞内局在性を示す図である。（Ａ）ＮＢ４細胞のＡＴＲＡ処置（１μＭ）中のＲＩＮＦ ｍＲＮＡレベルの相対発現（定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定した）。（Ｂ）ＡＴＲＡ（１μＭ）により処置したＮＢ４細胞または処置していないＮＢ４細胞からの全抽出物におけるＲＩＮＦタンパク質の発現。３３ｋＤａにおいて特定バンドを検出する本発明者らの特注ポリクローナルウサギ抗体（方法参照）を用いてＲＩＮＦを検出した。アクチンをローディング対照として用いた。（Ｃ）ＡＴＲＡ（１μＭ）により処置したＮＢ４細胞または処置していないＮＢ４細胞の核および細胞質の画分におけるＲＩＮＦタンパク質の発現。前記ポリクローナル抗体を用いてＲＩＮＦを検出した。この実験では、ＰＡＲＰおよびアクチンを対照として用いて核および細胞質の抽出物の品質、純度、およびローディングを評価した。（Ｄ）ＦＬＡＧタグ付きＲＩＮＦ（緑色；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体）は、共焦点および微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡法により解析したＭＣＦ７細胞の核に局在する（ＤＡＰＩにより青色に染色された）。スケールバー、１０μｍ。（Ｅ）ＡＴＲＡを用いたまたは用いない、処置４時間の時点における、定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定した様々な骨髄細胞系統におけるＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現（方法参照）。ＡＴＲＡ（１μＭ、４時間）により処置したまたは処置していない様々な骨髄細胞系統における（Ｆ）、および様々なヒト組織における（Ｇ）ＲＩＮＦタンパク質の発現。骨髄細胞系統（２０μｇ）およびヒト組織抽出物（６５μｇ、方法参照）の各々には同量のタンパク質（ＢＣＡ定量法により決定した）をローディングした。アクチンをローディング対照として用いた。
【図４】ＲｉｎｆのｓｈＲＮＡ媒介性サイレンシングがＮＢ４細胞のＡＴＲＡ誘導性最終分化に対する耐性を与えることを示す図である。（Ａ）レンチウイルスｓｈＲＮＡベクターと、Ｒｉｎｆ発現をノックダウンするために用いたそれらのｍＲＮＡ標的配列。レンチウイルスベクター構築物を用いたＮＢ４細胞の感染および選抜（方法参照）後に、基礎ＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現レベルを測定する定量ＲＴ−ＰＣＲにより基礎Ｒｉｎｆ発現を標的とする標的配列の有効性をモニタリングした（模擬対照、ｐＬＫＯ．１／エンプティベクターに対する割合％で示した）。ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３構築物およびｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−４構築物で最も有効なノックダウンを得た（それぞれ６１％および８５％、ＡＴＲＡの不在下）。（Ｂ）ＡＴＲＡ（１μＭ）の存在下でｓｈＲＮＡ構築物を安定に発現するＮＢ４細胞の細胞増殖（集団倍加数）。示した動態実験（ここでは１２日のＡＴＲＡ処置中）は３つの独立した実験（異なる感染群から行った）を代表するものである。対照細胞の成熟後細胞死を†により示している。（Ｃ）定量ＲＴ−ＰＣＲにより評価したＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現（培養１２時間の時点における未処置模擬対照に対する割合％）と第４日目に細胞形態学により評価した最終分化（スケールバー、２５μｍ）とエンプティベクター、ｈＲＮＡ／スクランブルベクター、ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３ベクターおよびｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−４ベクターに感染させたＮＢ４細胞の第２日目に評価したＮＢＴ還元解析（スケールバー、２５μｍ）。細胞をＡＴＲＡ（１μＭ）により４日間処置したまたは処置しなかった（第１回目のＡＴＲＡ、第０日〜第４日、左パネル）。さらに２週間のＡＴＲＡの不在下での培養後に、第１回目のＡＴＲＡを免れたｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３細胞およびｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−４細胞をＡＴＲＡ（１μＭ）により４日間再処置した（第２回目のＡＴＲＡ、第２０日〜第２４日、右パネル）。
【図５】正常骨髄造血時のＲＩＮＦ発現を示す図である。（Ａ）骨髄ＣＤ３４＋細胞（健康ドナー由来）のサイトカイン誘導性（２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３およびＧ−ＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ）顆粒球分化。細胞形態学（スケールバー、２５μｍ）では、細胞をサイトスピンによりガラススライド上に広げ、風乾させ、培養の異なる時点（第２日〜第１０日）においてＭａｙ−Ｇｒ?ｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ（ＭＧＧ）により染色した。記録した培養日それぞれには、観察した骨髄造血の主要段階を示している。第１日目に、細胞の大部分が多核好中性顆粒球へと最終分化した。本発明者らの実験条件において、いくつかの単球細胞も認められた（示していない）。（Ｂ）ＣＤ３４＋前駆体のサイトカイン誘導性顆粒球分化時の様々な遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現（定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定した）（＋／−ｓ．ｅ．ｍ）。
【図６】正常骨髄造血時のＲＩＮＦの機能的関与を示す図である。３名の健康ドナー（Ａ、ＢおよびＣ）由来のＣＤ３４＋骨髄前駆体を、ＲＩＮＦ発現を標的とするレンチウイルスｓｈＲＮＡ構築物（ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３および−４）または対照ベクター（エンプティおよびｓｈＲＮＡ／スクランブル）に感染させ、サイトカイン（２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３およびＧ−ＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ）により処置してそれらを顆粒球にさせた。各ドナーでは、培養の２〜３日おきにサイトスピンおよびＭＧＧ染色後の細胞形態学解析（スケールバー、２５μｍ）により骨髄分化を評価した。培養した前駆体の細胞分化は異なる動態で進展した。それらの図は、それぞれ１４日後、３０日後、および１８日後の細胞集団の形態を示している。留意すべきは、ｓｈＲＮＡ−ＲＩＮＦ−３構築物またはｓｈＲＮＡ−ＲＩＮＦ−４構築物に感染させた細胞培養物が、前骨髄球／骨髄球段階において対照（エンプティベクターまたはスクランブルベクターに感染させた細胞培養物）よりも未成熟な細胞（矢印で示している）を表示していることである。ドナーＡでは、顆粒球分化動態は速く（第１０日まで）、第１４日目において対照培養物にはごくわずかの接着単球／マクロファージだけが存在した。
【図７】ＡＴＲＡ（１μＭ）により処置した、ＮＢ４細胞、ＮＢ４−ＬＲ１細胞およびＮＢ４−ＬＲ２細胞からの全抽出物におけるＲＩＮＦタンパク質の発現を示す図である。３３ｋＤａにおいて特定バンドを示す本発明者らの特注ポリクローナルウサギ抗体（方法参照）を用いてＲＩＮＦを検出した。アクチンをローディング対照として用いた。ＲＩＮＦ発現はＮＢ４細胞において、２つの耐性サブクローンＮＢ４−ＬＲ１およびＮＢ４−ＬＲ２よりも顕著であった。
【図８】３名の（ＰＭＬ−ＲＡＲａ陽性）ＡＰＬ患者に由来する芽球におけるＣｘｘｃ５ ｍＲＮＡ発現を示す図である。細胞をＡＴＲＡ（１μＭ）により４時間処置したまたは処置しなかった。データは、公的に利用可能なデータベースＡｒｒａｙｅｘｐｒｅｓｓ（Ｅ−ＭＥＸＰ−１４９）から抽出した。マイクロアレイ実験は、Meani et al.により、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ＨＧ−Ｕ １３３ＡおよびＨＧ−Ｕ １３３Ｂにより行った（各サンプルに対して２つの表示したハイブリダイゼーション）。発現値測定に用いた定量様式はａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ：ＣＨＰＳｉｇｎａｌである。Ｃｘｘｃ５発現を標的とする３つのプローブは、プローブａ（２２２９９６＿ｓ＿ａｔ）、ｂ（２２４５１６＿ｓ＿ａｔ）およびｃ（２３３９５５＿ｘ＿ａｔ）であった。２箇所の点線は、未処置群およびＡＴＲＡ処置群の平均を示している。本発明者らは、対応のあるスチューデントｔ検定を適用し、これらの２群についての値に有意差がある（ｐ値＜０．０５）ことを示した。
【図９】ＲｉｎｆのｓｈＲＮＡ媒介性サイレンシングがＨＬ６０細胞のＡＴＲＡ誘導性最終分化を遅延させることを示す図である。ＨＬ６０細胞を、エンプティレンチウイルスベクター、ｓｈＲＮＡ／スクランブルレンチウイルスベクター、ｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−３レンチウイルスベクターまたはｓｈＲＮＡ／ＲＩＮＦ−４レンチウイルスベクターに感染させ、選抜した。次いで、細胞をＡＴＲＡ（１μＭ）により処置したまたは処置しなかった。ＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現を定量ＲＴ−ＰＣＲにより評価した（培養６時間の時点における未処置模擬対照に対する割合％）。最終分化を、第２日目にＮＢＴ還元解析により第６日目に細胞形態学および（スケールバー、２５μｍ）により評価した。
【図１０】ＲＩＮＦ過剰発現がＮＢ４細胞系統およびＨＬ６０細胞系統の分化を誘導するのに十分ではないことを示す図である。（Ａ）ネズミ幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）由来のレトロウイルス系を用いて、２つの細胞系統においてＲＩＮＦを過剰発現させた。細胞を感染させ、感染の９日後にＧＦＰ発現について選別した。（Ｂ）２つの細胞系統では、ＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現を定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定し（ここでは第１０日目）、それらのそれぞれの模擬対照に対する割合％で表した（＋／−ｓ．ｅ．ｍ）。（Ｃ）細胞をサイトスピンし、細胞形態学解析についてＭＧＧにより染色し、ここでは２つの異なる大きさで視覚化した（スケールバー、２５μｍ）。ＲＩＮＦ過剰発現の１０日後でも分化の徴候は認められなかった。ＲＩＮＦを過剰発現している細胞培養物においてわずかな割合の細胞死（全体の約１０％）が一貫して認められた。
【図１１】骨髄異形成（ＭＤＳ）に罹患している５５名の患者に由来するＣＤ３４＋細胞におけるＣｘｘｃ５ ｍＲＮＡ発現を示す図である。データは、公的に利用可能なデータベースＡｒｒａｙｅｘｐｒｅｓｓ（Ｅ−ＧＥＯ−４６１９）およびＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ （ＧＤＳ２１１８）から抽出した。マイクロアレイ実験は、Pellagatti et al.により、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ａｒｒａｙｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）により行った。各ポイントは、１名のＭＤＳを有する患者または健康個体を表している。３箇所の点線は、正常な健康ドナー（ｎ＝１１）、欠失５ｑを有するＭＤＳ（ｎ＝２０）または欠失５ｑがないＭＤＳ（ｎ＝３５）についての群平均（９９８．１、５１２．２および９８５．９）を示している。ウイルコクソン２標本検定（ｐ＜０．００３）によれば、正常と欠失（５ｑ）を有するＭＤＳについての値に有意差があった。URL: http://www.ebi.ac.uk/Arrayexpress/（ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ）およびhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ）
【図１２】様々な血液疾患を有する患者の骨髄細胞においてＲＱ−ＰＣＲにより検出されたＲＩＮＦ ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図１３】様々な血液疾患を有する患者の血液細胞においてＲＱ−ＰＣＲにより検出されたｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図１４】固形腫瘍におけるＲＩＮＦ発現を示す図である。
【図１５】甲状腺癌患者の対応サンプルの良性に対する腫瘍のＲＩＮＦ発現を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノイド誘導核因子（ＲＩＮＦ）をコードし、かつ、配列番号１または配列番号２の配列、またはその機能的断片もしくは変異体、またはそれとハイブリダイズ可能な機能的に同等の単離ＤＮＡ配列、またはそれに対応するｍＲＮＡを含んでなる、核酸。
【請求項２】
レチノイド誘導核因子（ＲＩＮＦ）であり、かつ、配列番号３（ＣＸＸＣ５）の配列またはその機能的断片もしくは変異体を含んでなる、タンパク質またはタンパク質誘導体。
【請求項３】
それを必要とする哺乳類における、造血疾患の予防および／または治療のための医薬組成物、または造血細胞の分化もしくは細胞死の誘導もしくは増進のための医薬組成物の製造のための、請求項２に記載のタンパク質もしくはタンパク質配列、または請求項１に記載の核酸の使用。
【請求項４】
in vitroまたはそれを必要とする哺乳類における、造血細胞の分化の障害もしくは阻止のための医薬組成物、または幹細胞の増加のための医薬組成物の製造のための、請求項２に記載のタンパク質もしくはタンパク質配列、または請求項１に記載の核酸、または請求項１もしくは請求項２の配列のうちの１つと相互作用する化合物の使用。
【請求項５】
前記造血細胞が骨髄細胞である、請求項３または４に記載の使用。
【請求項６】
前記造血細胞が末梢血液細胞である、請求項３または４に記載の使用。
【請求項７】
前記造血細胞が臍帯血液細胞または胎盤血液細胞である、請求項３または４に記載の使用。
【請求項８】
前記造血細胞が腫瘍性である、請求項３または４に記載の使用。
【請求項９】
前記造血細胞が正常、すなわち、非腫瘍性である、請求項３または４に記載の使用。
【請求項１０】
骨髄細胞の最終分化が回復される、請求項３に記載の使用。
【請求項１１】
リンパ系細胞の最終分化が回復される、請求項３に記載の使用。
【請求項１２】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）細胞または骨髄異形成（ＭＤＳ）細胞の最終分化または細胞死が回復される、請求項３に記載の使用。
【請求項１３】
造血疾患の予防および／または治療のための医薬組成物の製造のための、請求項２に記載のタンパク質もしくはタンパク質配列、または請求項１に記載の核酸の使用。
【請求項１４】
前記造血疾患が、骨髄異形成（ＭＤＳ，骨髄異形成症候群）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄増殖性症候群（ＭＰＳ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
癌の予防および／または治療のための医薬組成物の製造のための、請求項２に記載のタンパク質もしくはタンパク質配列、または請求項１に記載の核酸の使用。
【請求項１６】
前記癌が、白血病、骨髄異形成（ＭＤＳ，骨髄異形成症候群）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄増殖性症候群（ＭＰＳ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および固形腫瘍（乳癌、黒色腫、肺癌、甲状腺癌、前立腺癌、神経芽腫、および腎癌）を含んでなる群から選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
それを必要とする哺乳類において、請求項１に記載の核酸の発現を活性化するための、および／または請求項２に記載のタンパク質もしくはタンパク質配列の発現を増強するための、レチノイドの使用。
【請求項１８】
前記レチノイドが、レチノール、レチナール、トレチノイン(レチノイン酸)、イソトレチノイド、アリトレチノイン、エトレチナート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテンおよびアダパレンを含んでなる群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１９】
前記レチノイドが全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記哺乳類が癌を有する、請求項１７に記載の使用。
【請求項２１】
前記癌が、白血病、骨髄異形成（ＭＤＳ，骨髄異形成症候群）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄増殖性症候群（ＭＰＳ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および固形腫瘍（乳癌、黒色腫、肺癌、甲状腺癌、および腎癌）を含んでなる群から選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記哺乳類が造血疾患を有する、請求項１７に記載の使用。
【請求項２３】
前記哺乳類が造血細胞の分化の増進を必要とする、請求項１７に記載の使用。
【請求項２４】
レチノイドに加えてＢＭＰ４も用いられる、請求項１７に記載の使用。
【請求項２５】
レチノイドに加えてインターフェロンも用いられる、請求項１７に記載の使用。
【請求項２６】
レチノイドに加えてサイトカインも用いられる、請求項１７に記載の使用。
【請求項２７】
ＣＸＸＣ５の発現を、レトロウイルスまたはレンチウイルスのベクター（過剰発現）により、またはｓｈＲＮＡ分子（抑制）により調節する、方法。
【請求項２８】
レチノイド応答性の予後の、または請求項３〜２７のいずれか一項に記載の疾患の予後のための方法であって、請求項１に記載の核酸、および／または請求項２に記載のタンパク質もしくはタンパク質配列の状態を参照と比較することを特徴とする、方法。
【請求項２９】
発現レベル、突然変異、メチル化、再配列および転座の検出により状態を評価する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
癌または造血疾患、または骨髄造血減少状態の診断のための方法であって、請求項１に記載の核酸の発現レベルおよび／または状態、または請求項２に記載のタンパク質またはタンパク質配列の発現レベルおよび／または状態の検出を含んでなる、方法。
【請求項３１】
急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）遺伝子型の検出のための、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
哺乳類における白血病、前白血病（骨髄異形成）または癌の状態の判定のための、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記タンパク質またはタンパク質配列の発現レベルおよび／または局在性が抗体の使用により決定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体が、請求項２に記載のタンパク質またはタンパク質配列、好ましくは配列番号２のアミノ酸４５〜４８と反応する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造のための、請求項２に記載のタンパク質もしくはタンパク質配列、または請求項１に記載の核酸の使用。
【請求項３６】
分子を癌細胞にターゲッティングする方法であって、（ａ）第１に、前記細胞を、レチノイドと、前記細胞における請求項２に記載のタンパク質またはタンパク質配列の発現を増加させるのに有効な量で接触させる工程、および（ｂ）第２に、前記細胞を、請求項２に記載のタンパク質またはタンパク質配列に特異的に結合する薬剤と接触させる工程を含んでなり、前記薬剤が、前記分子および前記分子が結合している物質からなる群から選択される、方法。
【請求項３７】
請求項２に記載のタンパク質またはタンパク質配列の一部と相互作用することができる、分子。
【請求項３８】
抗体、好ましくは配列番号２のアミノ酸４５〜４８と反応する抗体である、請求項３７に記載の分子。
【請求項３９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３７に記載の分子。
【請求項４０】
ＦＬＡＧタグ付きの請求項２に記載のタンパク質またはタンパク質配列をコードするプラスミドである、請求項３７に記載の分子。
【請求項４１】
ＦＬＡＧタグ付きの請求項２に記載のタンパク質またはタンパク質配列をコードする少なくとも１つのプラスミドを含有する構築物である、請求項３７に記載の分子。
【請求項４２】
配列番号４の配列、またはその機能的断片もしくは変異体、またはそれとハイブリダイズ可能な機能的に同等の単離ＤＮＡ配列を含んでなる、レチノイド応答性エレメント。
【請求項４３】
配列番号５の配列、またはその機能的断片もしくは変異体、またはそれとハイブリダイズ可能な機能的に同等の単離ＤＮＡ配列を含んでなる、プロモーター。
【請求項１】
レチノイド誘導核因子（ＲＩＮＦ）をコードし、かつ、配列番号１または配列番号２の配列、またはその機能的断片もしくは変異体、またはそれとハイブリダイズ可能な機能的に同等の単離ＤＮＡ配列、またはそれに対応するｍＲＮＡを含んでなる、核酸。
【請求項２】
レチノイド誘導核因子（ＲＩＮＦ）であり、かつ、配列番号３（ＣＸＸＣ５）の配列またはその機能的断片もしくは変異体を含んでなる、タンパク質またはタンパク質誘導体。
【請求項３】
それを必要とする哺乳類における、造血疾患の予防および／または治療のための医薬組成物、または造血細胞の分化もしくは細胞死の誘導もしくは増進のための医薬組成物の製造のための、請求項２に記載のタンパク質もしくはタンパク質配列、または請求項１に記載の核酸の使用。
【請求項４】
in vitroまたはそれを必要とする哺乳類における、造血細胞の分化の障害もしくは阻止のための医薬組成物、または幹細胞の増加のための医薬組成物の製造のための、請求項２に記載のタンパク質もしくはタンパク質配列、または請求項１に記載の核酸、または請求項１もしくは請求項２の配列のうちの１つと相互作用する化合物の使用。
【請求項５】
前記造血細胞が骨髄細胞である、請求項３または４に記載の使用。
【請求項６】
前記造血細胞が末梢血液細胞である、請求項３または４に記載の使用。
【請求項７】
前記造血細胞が臍帯血液細胞または胎盤血液細胞である、請求項３または４に記載の使用。
【請求項８】
前記造血細胞が腫瘍性である、請求項３または４に記載の使用。
【請求項９】
前記造血細胞が正常、すなわち、非腫瘍性である、請求項３または４に記載の使用。
【請求項１０】
骨髄細胞の最終分化が回復される、請求項３に記載の使用。
【請求項１１】
リンパ系細胞の最終分化が回復される、請求項３に記載の使用。
【請求項１２】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）細胞または骨髄異形成（ＭＤＳ）細胞の最終分化または細胞死が回復される、請求項３に記載の使用。
【請求項１３】
造血疾患の予防および／または治療のための医薬組成物の製造のための、請求項２に記載のタンパク質もしくはタンパク質配列、または請求項１に記載の核酸の使用。
【請求項１４】
前記造血疾患が、骨髄異形成（ＭＤＳ，骨髄異形成症候群）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄増殖性症候群（ＭＰＳ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
癌の予防および／または治療のための医薬組成物の製造のための、請求項２に記載のタンパク質もしくはタンパク質配列、または請求項１に記載の核酸の使用。
【請求項１６】
前記癌が、白血病、骨髄異形成（ＭＤＳ，骨髄異形成症候群）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄増殖性症候群（ＭＰＳ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および固形腫瘍（乳癌、黒色腫、肺癌、甲状腺癌、前立腺癌、神経芽腫、および腎癌）を含んでなる群から選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
それを必要とする哺乳類において、請求項１に記載の核酸の発現を活性化するための、および／または請求項２に記載のタンパク質もしくはタンパク質配列の発現を増強するための、レチノイドの使用。
【請求項１８】
前記レチノイドが、レチノール、レチナール、トレチノイン(レチノイン酸)、イソトレチノイド、アリトレチノイン、エトレチナート、アシトレチン、タザロテン、ベキサロテンおよびアダパレンを含んでなる群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１９】
前記レチノイドが全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記哺乳類が癌を有する、請求項１７に記載の使用。
【請求項２１】
前記癌が、白血病、骨髄異形成（ＭＤＳ，骨髄異形成症候群）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄増殖性症候群（ＭＰＳ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および固形腫瘍（乳癌、黒色腫、肺癌、甲状腺癌、および腎癌）を含んでなる群から選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記哺乳類が造血疾患を有する、請求項１７に記載の使用。
【請求項２３】
前記哺乳類が造血細胞の分化の増進を必要とする、請求項１７に記載の使用。
【請求項２４】
レチノイドに加えてＢＭＰ４も用いられる、請求項１７に記載の使用。
【請求項２５】
レチノイドに加えてインターフェロンも用いられる、請求項１７に記載の使用。
【請求項２６】
レチノイドに加えてサイトカインも用いられる、請求項１７に記載の使用。
【請求項２７】
ＣＸＸＣ５の発現を、レトロウイルスまたはレンチウイルスのベクター（過剰発現）により、またはｓｈＲＮＡ分子（抑制）により調節する、方法。
【請求項２８】
レチノイド応答性の予後の、または請求項３〜２７のいずれか一項に記載の疾患の予後のための方法であって、請求項１に記載の核酸、および／または請求項２に記載のタンパク質もしくはタンパク質配列の状態を参照と比較することを特徴とする、方法。
【請求項２９】
発現レベル、突然変異、メチル化、再配列および転座の検出により状態を評価する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
癌または造血疾患、または骨髄造血減少状態の診断のための方法であって、請求項１に記載の核酸の発現レベルおよび／または状態、または請求項２に記載のタンパク質またはタンパク質配列の発現レベルおよび／または状態の検出を含んでなる、方法。
【請求項３１】
急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）遺伝子型の検出のための、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
哺乳類における白血病、前白血病（骨髄異形成）または癌の状態の判定のための、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記タンパク質またはタンパク質配列の発現レベルおよび／または局在性が抗体の使用により決定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体が、請求項２に記載のタンパク質またはタンパク質配列、好ましくは配列番号２のアミノ酸４５〜４８と反応する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造のための、請求項２に記載のタンパク質もしくはタンパク質配列、または請求項１に記載の核酸の使用。
【請求項３６】
分子を癌細胞にターゲッティングする方法であって、（ａ）第１に、前記細胞を、レチノイドと、前記細胞における請求項２に記載のタンパク質またはタンパク質配列の発現を増加させるのに有効な量で接触させる工程、および（ｂ）第２に、前記細胞を、請求項２に記載のタンパク質またはタンパク質配列に特異的に結合する薬剤と接触させる工程を含んでなり、前記薬剤が、前記分子および前記分子が結合している物質からなる群から選択される、方法。
【請求項３７】
請求項２に記載のタンパク質またはタンパク質配列の一部と相互作用することができる、分子。
【請求項３８】
抗体、好ましくは配列番号２のアミノ酸４５〜４８と反応する抗体である、請求項３７に記載の分子。
【請求項３９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３７に記載の分子。
【請求項４０】
ＦＬＡＧタグ付きの請求項２に記載のタンパク質またはタンパク質配列をコードするプラスミドである、請求項３７に記載の分子。
【請求項４１】
ＦＬＡＧタグ付きの請求項２に記載のタンパク質またはタンパク質配列をコードする少なくとも１つのプラスミドを含有する構築物である、請求項３７に記載の分子。
【請求項４２】
配列番号４の配列、またはその機能的断片もしくは変異体、またはそれとハイブリダイズ可能な機能的に同等の単離ＤＮＡ配列を含んでなる、レチノイド応答性エレメント。
【請求項４３】
配列番号５の配列、またはその機能的断片もしくは変異体、またはそれとハイブリダイズ可能な機能的に同等の単離ＤＮＡ配列を含んでなる、プロモーター。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１１−５２５３５２（Ｐ２０１１−５２５３５２Ａ）
【公表日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１３４４２（Ｐ２０１１−５１３４４２）
【出願日】平成２１年６月９日（２００９．６．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＯ２００９／０００２１４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５１３３７
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＪＡＶＡ
【出願人】（５０９３３８４００）ベルゲン・テクノロジオーヴァーフォリング・アクティーゼルスカブ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月９日（２００９．６．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＯ２００９／０００２１４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５１３３７
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＪＡＶＡ
【出願人】（５０９３３８４００）ベルゲン・テクノロジオーヴァーフォリング・アクティーゼルスカブ (3)
【Ｆターム（参考）】
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