新規加水分解酵素
【課題】α−ヒドロキシカルボン酸エステルのラセミ混合物から光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を効率的に製造できる手段を提供する。
【解決手段】下記の一般式(I)：
〔Ａは５員又は６員の環状化合物の残基を示し、Ｘは水素原子又はアルキル基を示し、Ｒはアルキル基を示し、＊＊で示される炭素原子について光学的に純粋ではない〕で表される化合物を加水分解して光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を製造することができる酵素であって、好ましくは特定な配列からなるアミノ酸配列を有するタンパク質；又は該アミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質からなる酵素。
【解決手段】下記の一般式(I)：
〔Ａは５員又は６員の環状化合物の残基を示し、Ｘは水素原子又はアルキル基を示し、Ｒはアルキル基を示し、＊＊で示される炭素原子について光学的に純粋ではない〕で表される化合物を加水分解して光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を製造することができる酵素であって、好ましくは特定な配列からなるアミノ酸配列を有するタンパク質；又は該アミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質からなる酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造に有用な新規加水分解酵素、及び該加水分解酵素を用いた光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の効率的な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
α−ヒドロキシカルボン酸又はその誘導体は、各種の医薬や農薬の製造用中間体として有用であり、特にα位に不斉中心を有する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸又はそのエステル誘導体を用いて様々な生理活性化合物を製造することができることから、高い光学純度を有する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸又はそのエステル誘導体を効率的に製造する方法の開発が鋭意行なわれている。例えば、血小板凝集阻害剤や抗血栓剤として高い有用性が期待されるクロピドグレル（clopidogrel: (S)-2(2-クロロフェニル)-2-(4,5,6,7-テトラヒドロチエノ[3,2-c]-5-ピリジル)酢酸メチル)を光学活性α−ヒドロキシカルボン酸エステルから効率よく製造できることが知られている（特開2001-519353号公報）。この方法は、（R）-2-クロロマンデル酸メチルのα-ヒドロキシル基をスルホニル化し、4,5,6,7-テトラヒドロチエノ[3,2-c]-5-ピリジンと反応させる工程を含んでいる。
【０００３】
光学活性α−ヒドロキシカルボン酸又はそのエステルの製造方法としては、光学活性スレオ-1-(p-ニトロフェニル)-2-アミノ-1,3-プロパンジオールや光学活性リジンを用い、ジアステレオマー塩をたて2‐クロロマンデル酸ラセミ混合物を光学分割して光学活性2-クロロマンデル酸を製造する方法が知られている（特開2004-530717号公報）。しかしながら、この方法では光学分割のための分割剤として高価な試薬を使わなければならないという欠点がある。
【０００４】
また、2-クロロベンズアルデヒドとシアニドドナー（シアン化水素など）からヒドロキシニトリルリアーゼを用いて光学活性シアノヒドリン（2-クロロマンデロニトリル）を製造する方法が提案されており、この光学活性シアノヒドリンから加水分解により光学活性2-クロロマンデル酸が得られる（特開2004-57005号公報）。2-クロロベンズアルデヒドとシアニドドナー（シアン化水素など）から得たシアノヒドリン（2-クロロマンデロニトリル）に対して不斉加水分解を行って光学活性2-クロロマンデル酸を得る方法も提案されている（特開平4-99496号公報）。しかしながら、これらの方法で用いるシアニドドナー（シアン化水素など）は取り扱いに危険性を伴うという欠点がある。
【０００５】
フェニルグリオキシル酸誘導体に対してα位カルボニル基を立体選択的に還元する能力のもつ微生物を用いて光学活性なマンデル酸誘導体を得る方法も提案されている（特開2003-199595号公報及び特開2004-49028号公報）。しかしながら、原料として用いるαケト酸（フェニルグリオキシル酸誘導体）が高価であり、補酵素の再生系も必要となることから、この方法は製造コストが高いという欠点がある。さらに、マンデル酸誘導体を立体選択的に酸化してαオキソ体を生成する能力を有した微生物をマンデル酸誘導体のラセミ混合物に対して作用させ、未反応物を取り出して光学純度の高いマンデル酸誘導体を得る方法も提案されている（特開平6-165695号公報）。しかしながら、この方法では、αオキソ体とαヒドロキシ体の分離が煩雑であり、場合によっては分離自体が困難になるという欠点がある。
【０００６】
α-アリール-α-ヒドロキシ酸エステルの酵素的加水分解を特徴とする光学活性体の製法に関する技術としては特開平2-53497号公報及び特開平2-156892号公報に記載された方法が知られているが、これらの特許公報に具体的に開示された実施例はマンデル酸を用いた方法に限定されており、有用性が低いという問題がある。また、Canadian Journal of Chemistry, 68(2), p.314, 1990には各種置換基を有するα-アリール-α-ヒドロキシ酸エステルを酵素的に加水分解する方法が開示されているが、使用される酵素は炭酸脱水酵素に限定されており、生成物の光学純度も40〜50％ ee程度であり選択性が低いために有用性が低いという問題がある。
【０００７】
また、国際公開WO 2007/26860号には微生物を用いた光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法が開示されているが、微生物の菌体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物で処理する工程が開示されているものの、反応に関与する酵素自体は特定されていない。なお、米国特許第6632650号明細書にはラウリルラクトンを加水分解することができるRhodococcus ruber由来の酵素が記載されており、国際公開2007/128496号には上記米国特許に記載された酵素をコードする塩基配列と65%の相同性の塩基配列によりコードされるカルボキシエステラーゼ活性を有する酵素が開示されているが、本発明により提供される酵素とのアミノ酸配列での相同性は、それぞれ56.2%及び54.5%である。
【特許文献１】特開2001-519353号公報
【特許文献２】特開2004-530717号公報
【特許文献３】特開2004-57005号公報
【特許文献４】特開平4-99496号公報
【特許文献５】特開2003-199595号公報
【特許文献６】特開2004-49028号公報
【特許文献７】特開平6-165695号公報
【特許文献８】特開平2-53497号公報
【特許文献９】特開平2-156892号公報
【特許文献１０】国際公開WO 2007/26860号
【特許文献１１】米国特許第6632650号明細書
【特許文献１２】国際公開2007/128496号
【非特許文献１】Canadian Journal of Chemistry, 68(2), p.314, 1990
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造に有用な新規加水分解酵素を提供することにある。
また、本発明の別の課題は、上記の特徴を有する加水分解酵素を用いた光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の効率的な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、エクソフィアラ(Exophiala)属に属する微生物から単離した新規な酵素を用いてα−ヒドロキシカルボン酸エステルのラセミ混合物を加水分解するとエステルの加水分解が立体選択的に進行すること、及びその加水分解反応を利用して光学活性α−ヒドロキシカルボン酸又は光学活性ヒドロキシカルボン酸エステルを極めて効率的に製造できることを見出した。また、上記酵素が2-クロロマンデル酸エステルの不斉加水分解酵素として極めて高い選択性を有しており、高い基質濃度においても効率的に不斉加水分解を行うことができることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明により、下記の一般式(I)：
下記の一般式(I)：
【化１】
〔式中、Ａは５員又は６員の環状化合物の残基を示し、該環状化合物は芳香族化合物、部分飽和環状化合物、又は飽和環状化合物から選択され、環構成原子として１個以上のヘテロ原子を有していてもよく、環上には置換基を有していてもよく（該置換基はハロゲン原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜４個のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜４個のアルキルオキシ基、及び保護基で保護されていてもよい水酸基、保護基で保護されていてもよいアミノ基、ニトロ基からなる群から選ばれる１又は２個以上の置換基であり、２個以上の置換基が存在する場合にはそれらは同一でも異なっていてもよく、２個以上の置換基が存在する場合にはそれらが結合して環を形成してもよい）、Ｘは水素原子又は炭素数１〜４個のアルキル基を示し、Ｒは炭素数１〜４個のアルキル基（該アルキル基はアリール基で置換されていてもよい）を示し、ただし、一般式(I)で表される化合物は＊＊で示される炭素原子について光学的に純粋ではない〕
で表される化合物を加水分解して下記の一般式(II)：
【化２】
〔式中、Ａ及びＸは上記定義と同義であり、＊はＳ又はＲのいずれかの立体配置を有する炭素原子を示す〕で表される化合物を製造することができる酵素、好ましくは単離された酵素、及び該酵素であって、
(a)配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
(b)配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質
からなる酵素が提供される。
【００１１】
上記発明の好ましい態様によれば、Ａがクロロフェニル基であり、Ｒが炭素数１〜４個のアルキル基又はベンジル基であり、Ｘが水素原子であり、＊で表される炭素原子がＲ配置である化合物を製造することができる上記の酵素；Ａが2-クロロフェニル基であり、Ｒが炭素数１〜４個のアルキル基であり、Ｘが水素原子であり、＊で表される炭素原子がＲ配置である化合物を製造することができる上記の酵素；エクソフィアラ・デルマチチジス(Exophiala dermatitidis)由来の上記酵素が提供される。また、配列表の配列番号１に記載のエクソフィアラ・ジーンセルメイ(Exophiala jeanselmei)・NBRC6857由来の酵素のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有するタンパク質からなる上記酵素も提供される。さらに、活性ドメインである上記アミノ酸配列の部分配列を含むアミノ酸配列を有するタンパク質からなる酵素も提供される。
【００１２】
別の観点からは、本発明により、上記酵素をコードする核酸が提供される。この発明の好ましい態様によれば、上記(a)のアミノ酸配列をコードする核酸；配列表の配列番号２に記載された塩基配列を含む核酸；配列表の配列番号２に記載された塩基配列と80%以上の相同性を有する塩基配列を含む核酸；配列表の配列番号２に記載された塩基配列により特定される核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；配列表の配列番号２に記載された塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換、及び／又は付加を有する塩基配列を含む核酸が提供される。
【００１３】
さらに別の観点からは、本発明により、上記核酸を含む組み換えベクター、及び上記組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
また、本発明により、上記の形質転換体を培養し、得られた培養物から上記酵素を採取する工程を含む、上記酵素の製造方法；及び、上記一般式(II)で表される化合物の製造方法であって、上記一般式(I)で表される化合物を上記酵素および／または上記形質転換体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物により不斉加水分解する工程を含む方法が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により提供される新規な酵素はα−ヒドロキシカルボン酸エステルのラセミ混合物から立体選択的にエステルを加水分解して光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を極めて効率的に製造することができる。特に、上記酵素は2-クロロマンデル酸アルキルエステルの不斉加水分解酵素として極めて高い選択性を有しているという特徴がある。また、本発明の酵素は形質転換微生物の短時間の培養により容易かつ大量に調製でき、微生物の菌体若しくは培養物などを用いる方法（国際公開WO 2007/26860号）に比べて高い基質濃度においても効率的に不斉加水分解を行うことができるという優れた特徴を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
一般式(I)及び(II)で表される化合物において、Ａは５員又は６員の環状化合物の残基を示す。残基とは環状化合物の環構成原子に結合する水素を１つ除いて得られる１価の基のことである。該環状化合物は芳香族化合物、部分飽和環状化合物、又は飽和環状化合物のいずれであってもよく、環構成原子として１個以上のヘテロ原子を有していてもよい。ヘテロ原子の種類は特に限定されないが、例えば、窒素原子、酸素原子、又はイオウ原子などを用いることができ、２個以上の環構成ヘテロ原子を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。環状化合物としては、より具体的には、ベンゼン、５員又は６員の芳香族ヘテロ環化合物（例えばフラン、チオフェン、ピリジン、ピリミジンなど）、５員又は６員の脂肪族環状化合物（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘキセンなど）、あるいは５員又は６員のヘテロ環化合物（例えば、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ジヒドロフラン、テトラヒドロフランなど）などを挙げることができる。これらのうち、環状化合物としてはベンゼンが好ましい。
【００１６】
環状化合物は置換基を有していてもよく、該置換基は、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜４個のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜４個のアルキルオキシ基、及び保護基で保護されていてもよい水酸基、保護基で保護されていてもよいアミノ基、ニトロ基からなる群から選ばれる１又は２個以上の置換基である。環状化合物が置換基を有する場合、置換基の個数及び置換位置は特に限定されない。２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。上記アルキル基又はアルキルオキシ基が置換基を有する場合、置換基の種類、個数、及び置換位置は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。上記アルキル基又はアルキルオキシ基の置換基としては、例えば、水酸基、ハロゲン原子、又はアミノ基などを例示することができるが、これらに限定されることはない。環状化合物が２個以上の置換基を有する場合には、それらの置換基は互いに結合して環を構成してもよい。この場合、環構造は芳香族、部分飽和、又は完全飽和のいずれであってもよい。例えば、２個のアルキル基が結合して炭素環を形成する場合や、1個のアルキルオキシ基と水酸基とが結合してアルキレンジオキシ基の環構造を形成する場合などを例示することができるが、これらに限定されることはない。
【００１７】
保護基としては、例えば、Protective Groups in Organic Chemistry(J.F.W.McOmieeta1., P1enum Press; Protective Groups in Organic Synthesis,3rd Edition (Theodora W. Green, Peter G.M. Wuts, John Wi1y & Sons, Inc. (ISBN O-471-16019-9),April 1999)に記載の保護基が挙げられ、具体的には、メチル基、エチル基、イソプロピル基、t-ブチル基、メトキシメチル基、ベンジルオキシメチル基、メトキシエトキシメチル基、メチルチオメチル基、フェニルチオメチル基、テトラヒドロピラニル基、p-ブロモフェナシル基、アリル基、シクロヘキシル基等のエーテル型保護基；ベンジル基、2,6-ジメチルベンジル基、4-メトキシベンジル基、2,6-ジクロロベンジル基、9-アントラニルメチル基、ジフェニルメチル基、フェネチル基、トリフェニルメチル基等のベンジル型保護基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ジメチルエチルシリル基、t-ブチルジメチルシリル基等のシリル型保護基；アセチル基、クロロアセチル基、トリフルオロアセチル基、ピバロイル基等のアシル型保護基；ベンゾイル基、p-メチルベンゾイル基、p-クロロベンゾイル基、o-クロロベンゾイル基、p-ニトロベンゾイル基等のアロイル型保護基;メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、t-ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、p-メチルベンジルオキシカルボニル基等のカーボネート型保護基；ジメチルホスフィニル基、ジエチルホスフィニル基等のホスフィネート型保護基；メタンスルホニル基、エタンスルホニル基、クロロメタンスルホニル基、クロロエタンスルホニル基、トリクロロメタンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、p-トルエンスルホニル基、o-ニトロベンゼンスルホニル基、m-ニトロベンゼンスルホニル基、p-ニトロベンゼンスルホニル基、o-クロロベンゼンスルホニル基、m-クロロベンゼンスルホニル基、p-クロロベンゼンスルホニル基等のスルホニル型保護基などが挙げられる。
【００１８】
Ｘは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を示す。該アルキル基は直鎖状であっても分枝鎖状のいずれであってもよい。
一般式(I)で表される化合物において、Ｒは炭素数１〜４個のアルキル基を示す。該アルキル基は１個又は２個以上のアリール基で置換されていてもよく、アリール基としてはフェニル基などが好適である。該アルキル基がフェニル基などのアリール基で置換された場合の例としては、ベンジル基、ベンズヒドリル基、フェネチル基などを挙げることができる。
【００１９】
一般式(I)及び(II)で表される化合物においてＡがクロロフェニル基であり、Ｘが水素原子であることが好ましく、Ａが2-クロロフェニル基であることがさらに好ましい。一般式(I)で表される化合物において、Ｒが炭素数１〜４個のアルキル基であることが好ましく、メチル基であることがより好ましい。一般式(II)で表される化合物において、＊で表される炭素原子はＲ配置であることが好ましい。
【００２０】
本発明の酵素は上記一般式(I)で表される化合物を不斉加水分解して上記一般式(II)を製造することができることを特徴としており、好ましくは単離された酵素であり、さらに好ましくは(a)配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質；又は(b)配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質からなる酵素である。上記(b)の態様において、相同性は70%以上であれば特に限定されないが、さらに好ましくは80%以上、さらに好ましくは85％以上、さらに好ましくは90%、特に好ましくは95%以上である。
【００２１】
本発明の酵素としては、エクソフィアラ・デルマチチジス NBRC8193またはエクソフィアラ・デルマチチジス NBRC8193株由来の酵素のほか、(a)の態様、すなわち配列表の配列番号１に記載のエクソフィアラ・ジーンセルメイ・NBRC6857由来の酵素のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有するタンパク質からなる上記酵素が好ましい。本明細書において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列に言及する場合、「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から20個、好ましくは１から10個、より好ましくは１から7個、さらに好ましくは１から5個、特に好ましくは１から3個程度である。上記のアミノ酸配列を全長の一部分の配列として含む酵素も好ましく、このような酵素も本発明の範囲に包含される。さらに、上記のアミノ酸配列において酵素活性に関与する部分（本明細書において「活性ドメイン」と呼ぶ）を含む酵素も好ましく、このような酵素も本発明の範囲に包含される。
【００２２】
本発明の核酸は、上記の酵素のアミノ酸配列をコードする核酸であり、DNA又はRNAのいずれでもよいが、好ましくはDNAである。好ましい核酸としては、上記(a)の態様のアミノ酸配列をコードする核酸を挙げることができ、それらのうちの特に好ましい核酸として配列表の配列番号２に記載された塩基配列を含む核酸を挙げることができる。
【００２３】
また、配列表の配列番号２に記載された塩基配列により特定される核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、又は配列表の配列番号２に記載された塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換、及び／又は付加を有する塩基配列を含む核酸を本発明の核酸として用いることもできる。１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列において、１から数個の範囲は特には限定されないが、例えば、１から40個、好ましくは１から30個、より好ましくは１から20個、より好ましくは１から10個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは1から3個程度である。
【００２４】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、例えば、配列表の配列番号２に記載されたDNAをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、又はサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるDNAの塩基配列を意味しており、例えば、コロニー又はプラーク由来のDNA又は該DNAの断片を固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0 MのNaCl存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2×SSC溶液（1×SSC溶液は、150 mM塩化ナトリウム、15 mMクエン酸ナトリウム）を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるDNA等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションはMolecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、「モレキュラークローニング第２版」と略す場合がある）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２５】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAとしては、プローブとして使用する配列番号２に記載されたDNAの塩基配列と一定以上の相同性を有するDNAが挙げられるが、相同性は、例えば80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは93%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上である。
【００２６】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、上記酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法、又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。例えば、配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、又は遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であるが、この手法はモレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２７】
また、配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて各種微生物の染色体DNAをスクリーニングすることにより本発明の核酸を単離することもできる。例えば、PCR法により本発明の核酸を取得することもできる。各種微生物由来の染色体DNAライブラリー又はcDNAライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載したアミノ酸配列をコードする塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてPCRを行うことができる。PCRの反応条件は適宜設定することができ、例えば、94℃で30秒間（変性）、55℃で30秒〜1分間（アニーリング）、72℃で2分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば30サイクル行った後、72℃で7分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたDNA断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００２８】
上記のプローブ又はプライマーの調製、cDNAライブラリーの構築、cDNAライブラリーのスクリーニング、並びに目的核酸のクローニングなどの手法は当業者に周知かつ慣用であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」と略す場合がある）等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２９】
本発明の核酸の好ましい態様として配列表の配列番号２に記載された塩基配列と、国際公開2007/128496号の配列番号１に記載されたカルボキシエステラーゼ活性を有する酵素をコードする塩基配列の相同性を容易に入手可能なプログラム(ＤＮＡＳＩＳ（登録商標）Ｐｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．９、日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社）により決定したところ66%であり、核酸全長（ストップコドンを含む遺伝子の塩基数）は、それぞれ1179塩基及び1131塩基であり、タンパク質のサイズが異なる。
【００３０】
本発明の核酸は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）、あるいは宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の核酸は転写に必要な要素（例えばプロモーター等）と機能的に連結されていることが望ましい。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すDNA配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００３１】
例えば、細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus Ｓubtilis alkaline protease gene)若しくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモータ、又はファージ・ラムダのＰR若しくはＰLプロモータ、大腸菌の lac、trp、若しくはtacプロモータなどが挙げられる。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、P10プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス39K遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、TPI1プロモータ、ADH2-4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ADH3プロモータまたはtpiAプロモータなどがある。
【００３２】
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の遺伝子、プロモータ、並びに所望によりターミネータ及び／又は分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００３３】
本発明の遺伝子又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。本発明の遺伝子又は組み換えベクターを導入するための宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現できる限り特にその種類は限定されない。例えば、細菌、酵母、真菌、及び高等真核細胞等が挙げられるが、細菌や酵母などが好ましい。細菌細胞の例としては、バチルス又はストレプトマイセス等のグラム陽性菌、あるいは大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられるが、大腸菌などが好ましい。これらの細菌の形質転換は、プロトプラスト法又は公知の方法などによりコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
【００３４】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセス又はシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevis1ae)又はサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓaccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００３５】
他の真菌細胞の例として、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、又はトリコデルマに属する細胞などを挙げることができる。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、DNA構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。DNA構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換え又は異種組換えにより行うことができる。
【００３６】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組み換えベクター及びバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等）。
【００３７】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるSf9、Sf21〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるHiFive(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクター及び上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
【００３８】
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養することができる。形質転換体の培養物から本発明の酵素を単離・精製する手段は特に限定されず、通常のタンパク質又は膜結合タンパク質の単離、精製法を用いることができる。例えば、本発明の酵素をコードする核酸を組換えベクターとしてプラスミドに導入し、この組換えベクターを大腸菌に導入して形質転換した後、大腸菌を培養することにより目的の酵素を分離することができるが、本発明は上記の特定の態様に限定されることはない。
【００３９】
上記の形質転換体の培養における諸条件は特に制限されず、例えば微生物を形質転換体として用いる場合には、微生物の培養に適した通常の培養条件を適宜選択できる。培地の種類も特に限定されず、細菌、真菌、又は酵母それぞれに適した培地を適宜選択することができる。培地としては、通常は、炭素源、窒素源、及びその他の栄養素を含む液体培地を使用することができる。培地の炭素源は、上記微生物が利用可能であればその種類は特に限定されず、任意の炭素源を用いることができる。より具体的には、炭素源として資化性のものが挙げられ、例えば、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリン、デンプン、ソルビトールなどの糖類、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びその塩類、パラフィンなどの炭化水素類、糖蜜、又はこれらの混合物などが使用できる。
【００４０】
窒素源は、上記微生物が利用可能であればその種類は特に限定されず、任意の窒素源を用いることができる。具体的には、資化性のものが挙げられ、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、大豆タンパク加水分解物などの無機または有機含窒素化合物、あるいはこれらの混合物などが使用できる。また、培地には、リン酸カリウム、硫酸鉄、硫酸亜鉛、硫酸マンガン等の無機物、微量金属塩、ビタミン類などの通常の培養に用いられる栄養源を適宜添加してもよい。必要に応じて、培地には微生物の活性を誘導する物質、培地のｐＨ保持に有効な緩衝物質、消泡剤、シリコン、アデカノール、プルロニックなどを添加してもよい。
【００４１】
微生物の培養は、それぞれの微生物の生育に適した条件下で行うことができ、そのような条件は当業者に適宜選択可能である。一例を挙げれば、培地のpHを 3〜10、好ましくは4〜9とし、温度0〜50℃、好ましくは20〜40℃で培養を行うことができる。微生物の培養は、それぞれの微生物の性質に応じて好気的又は嫌気的条件下で行うことができる。培養時間は、1〜300時間、好ましくは、10〜150時間であるが、それぞれの微生物により適宜決定することができる。
【００４２】
形質転換体として大腸菌を用いる場合には、適宜の細菌用培地で培養した大腸菌を集菌してリゾチームなどで処理して溶菌し、菌体を遠心分離して得られるライセートから目的の酵素を分離・精製することができる。ライセートからの酵素の分離・精製は通常のタンパク質の単離精製法、例えば、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法により行うことができ、必要に応じてこれらの手法を2以上組合わせて行うことができる。
【００４３】
本発明の方法は、上記の一般式(II)で表される化合物の製造方法であって、上記の一般式(I)で表される化合物を上記の酵素で処理して不斉加水分解する工程を含むことを特徴としている。一般式(I)において＊はＳ又はＲのいずれかの立体配置を有する炭素原子を示し、一般式(I)で表される化合物は、この不斉炭素に関して実質的に光学的に純粋な化合物である。一般式(II)で表される化合物が他の不斉炭素を有する場合には、その立体配置は特に限定されない。また、一般式(I)で表される化合物において、＊＊はこの炭素原子について一般式(I)で表される化合物が実質的に光学的に純粋ではないことを示す。例えば、この炭素原子に関してＳ体とＲ体との任意の割合の混合物やラセミ体などを用いることができる。
【００４４】
上記の方法の好ましい一態様として、上記一般式(I)で表される化合物において＊＊で表される炭素原子がＲ配置である化合物のエステル基を加水分解して上記一般式(II)で表される化合物において＊で表される炭素原子がＲ配置である化合物を分離精製する工程を含む方法を挙げることができる。
【００４５】
本発明の方法では、上記の酵素を用いて不斉加水分解を行うことができる。酵素を適宜の手段で固定化して用いることもできる。固定化は、当業者に周知の方法（例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行うことができる。固定化担体としては、一般に用いられているものであれば何れでもよく、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、κ−カラギーナン、アルギン酸、ゼラチン、酢酸セルロース等の多糖類；例えば、グルテン等の天然高分子；例えば、活性炭、ガラス、白土、カオリナイト、アルミナ、シリカゲル、ベントナイト、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム等の無機物；例えば、ポリアクリルアミド、ポリビニルアセテート、ポリプロピレングリコール、ウレタン等の合成吸着剤等が挙げられる。本発明の酵素をマイクロカプセルに封入した形で使用することもできる。本発明の酵素の使用態様は上記のものに限定されることはなく、当業者が当業界で利用可能な方法から適宜選択して使用できることは言うまでもない。
【００４６】
本発明の方法において、一般式(I)で表される化合物を上記の酵素で処理する条件は特に限定されず、上記の化合物が酵素と十分に接触でき、その結果、エステル部位の加水分解反応が進行する条件であれば、いかなる条件を選択することもできる。例えば、一般式(I)で表される化合物の溶液に、緩衝液又は水などに溶解した酵素を混合すればよい。上記の工程は、水性の均一系中で行うか、あるいは水に実質的に不溶性又は水に難溶性の有機溶媒と水との二相系中で行うことができるが、一般的には水性の均一系中で行うことが好ましい。水性の均一系を形成する溶媒としては、水のみを溶媒として用いるか、あるいは水と混和する適当な有機溶媒、例えば、エタノール、メタノール、ジオキサン、ジメチルスルホキシド等と水との混合物を用いてもよい。一般式(I)で表される化合物を上記の有機溶媒に溶解し、得られた溶液を上記の酵素溶液に添加して反応を行ってもよい。上記の酵素とともに、又は上記酵素に替えて上記形質転換体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物を用いてもよい。培養物、又はその処理物若しくはその抽出物については国際公開WO 2007/26860号に調製方法が記載されており、上記国際公開の開示を参照により本明細書の開示として含める。
【００４７】
処理条件は、エステルの不斉加水分解反応が進行する条件であれば特に限定されない。酵素の使用量は特に限定されないが、例えば、一般式(I)で表される化合物に対して10000分の1〜1000倍、好ましくは1000分の1〜100倍程度、さらに好ましくは100分の1〜10倍程度である。また、基質である一般式(I)で表される化合物の濃度は、反応系の全重量に対して0.1〜50重量%、好ましくは、0.5〜30重量%、さらに好ましくは1.0〜20重量%程度である。本発明の酵素を用いると、国際公開WO 2007/26860号に記載された微生物を用いる方法に比べて基質濃度を10倍程度高くでき、効率よく目的物を製造できる。反応液のpHは、4〜9、好ましくは5〜8であり、反応温度は、10〜50℃、好ましくは20〜40℃である。pHを安定させるために緩衝液を使用することもできる。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液などを用いることができる。さらに、pHを調節するために、酸、塩基を使用して調節することもできる。また、反応時間は、1〜200時間、好ましくは5〜150時間であるが、酵素の種類に応じて適宜選択することが可能である。反応系内には、必要に応じて、基質及び／又は酵素を一度に添加するか、又は逐次添加するか、若しくは連続的に添加することもできる。生成物である加水分解物を連続的に取り出しながら反応速度を高めることもできる。上記の酵素とともに、又は上記酵素に替えて上記形質転換体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物を用いる場合についても同様である。
【００４８】
反応によって得られた一般式(II)で表される光学活性α−ヒドロキシカルボン酸は、慣用の分離精製手段によって単離精製できる。例えば、反応液から必要に応じて菌体を分離した後、培養物を膜分離、有機溶媒（例えば、トルエン、クロロホルム等）による抽出、カラムクロマトグラフィー、減圧濃縮、蒸留、晶析、再結晶等の通常の精製方法により精製して一般式(II)で表される光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を得ることができる。また、例えば、反応終了後、酢酸ブチル、酢酸エチル、トルエン、クロロホルム等の有機溶媒で反応液から生成物を抽出し、溶媒を留去することにより粗生成物を得ることができ、該粗生成物は、必要によりシリカゲルクロマトグラフィー、再結晶（n-ヘキサン、酢酸エチル等）、減圧蒸留等により精製することができる。
【００４９】
また、不斉加水分解反応を行うことにより、反応液中には、一般式(II)で表される光学活性α−ヒドロキシカルボン酸のほか、加水分解されずに反応液中に残存した光学的に純粋な未反応のエステル化合物（光学活性α−ヒドロキシカルボン酸エステル）が存在する。この光学活性α−ヒドロキシカルボン酸エステルを分離精製した後にエステル基を加水分解することにより、一般式(II)で表される光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を製造することができる。加水分解に使用する酸又は塩基としては、通常の反応において酸又は塩基として使用されるものであれば特に制限はないが、例えば、塩酸、硫酸などの鉱酸類、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、水素化ナトリウム、水素化リチウム、又はアンモニア水等の塩基が挙げられ、好ましくは水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムなどを用いることができる。塩基による加水分解の際には、一般式(II)で表される化合物の立体反転が生じないように適宜の条件を選択することが望ましい。加水分解のための反応溶媒としては、反応の進行を妨げず、原料を十分に溶解できる溶媒であれば特に制限はないが、例えば、アルコール類（メタノール、エタノール等）、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルアセトアミド（DMAc）、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、水、アセトン、又はこれらの混合物などを挙げることができ、好ましくはアルコール類、水、又はこれらの混合物を用いることができる。反応温度は、通常は−20〜150℃であり、好ましくは10〜30℃である。反応時間は、使用する原料、溶媒、反応温度などにより異なるが、通常5分〜36時間であり、好ましくは10分〜16時間である。
基質は安価に供給される光学的に純粋でないα−ヒドロキシカルボン酸とアルコールから通常の方法によって製造できる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
例１
（酵素精製）
Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ ８１９３（独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ） 郵便番号２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８より分譲）を１００ｍＬのＧＰＹ液体培地（１％グルコース（和光純薬工業株式会社）、０．５％ペプトン（和光純薬工業株式会社）、０．３％酵母エキス（和光純薬工業株式会社）、ｐＨ７．０）に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで９６時間、振盪培養を行った。その１００ｍＬの培養液を３ＬのＧＰＹＡ液体培地（１％グルコース、０．５％ペプトン、０．３％酵母エキス、０．０３％アデカノール ＬＧ−１０９（株式会社ＡＤＥＫＡ）、ｐＨ７．０）に加え、３０℃、１ｖｖｍ、４００ｒｐｍで４８時間、ジャー培養を行った。
【００５１】
１２Ｌのジャー培養液を１２ｋｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し上清を取り除いた後、０．８％ ＮａＣｌ（和光純薬工業株式会社）で懸濁した。その懸濁溶液を１２ｋｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し上清を取り除いた後、５０ｍＭ ＭＥＳ（ＭＥＳ ｈｙｄｒａｔｅ、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社） Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５)を加え３０％菌体懸濁液とした。３０％菌懸濁液を４等分し、氷中で各々３００μＡ、３時間、１０秒間破砕−２０秒間休止の間欠で超音波処理を行った。超音波破砕機は株式会社 日本精機製作所の超音波ホモジナイザー モデル ＵＳ−３００を使用し、チップは直径１２ｍｍを使用した。超音波破砕した菌体を１２ｋｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した後上清を回収しクルードとした。２５０ｍＬのクルードに対しＣｏｍｐｌｅｔｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を１錠加えた。また、クルードに終濃度が０．１％になるようにポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬工業株式会社）を加えた。さらに、１００ｍＬのクルードに対し２２．６ｇの硫酸アンモニウムを加え、４℃で１時間穏やかに攪拌した。
【００５２】
そのクルードを１２ｋｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、上清を新しい容器に移し、１００ｍＬの上清に対し１２．０ｇの硫酸アンモニウムを加え４℃で１時間穏やかに攪拌した。１２ｋｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した後、沈殿物に２５０ｍＬあたりＣｏｍｐｌｅｔｅを１錠加え、さらに終濃度が０．１％になるようにポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルを加えた５０ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）（５０ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳ）を加え、１８ｍＬの酵素溶液とした。その酵素溶液をスペクトラ／ポア（登録商標）メンブレン ＭＷＣＯ：１２０００−１４０００（フナコシ株式会社）を用いて、２Ｌの５０ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳに対して４℃で透析を行った（酵素溶液Ａ）。
【００５３】
２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳで平衡化した４０ｍＬのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に酵素溶液Ａをアプライした。４０ｍＬの２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳを加えた後、グラジエントで溶出を行った。グラジエントは２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳから０．２Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳまでの濃度で行い、溶出液は２４０ｍＬ使用した。溶出液を１ｍＬずつ分取し、活性測定を行った。
【００５４】
活性測定の反応は１００ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、０．０５％ クロロマンデル酸メチルエステル（ＣＭＭ）、及び分取した酵素溶液を含む反応液を３０分間、３０℃で２００ｒｐｍの振盪で行った。振盪後、１０％ 過塩素酸を加えることにより反応を停止した。ＣＭＭの合成は、メタノール（和光純薬工業株式会社）を使用して２−クロロマンデル酸（和光純薬工業株式会社）をエステル化することにより行った。酵素反応した溶液の加水分解反応の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓ（アジレント・テクノロジー株式会社）を使用した。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（４．６×７５ｍｍ）（ジーエルサイエンス株式会社）、溶離液は５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）（リン酸２水素ナトリウム２水和物（関東化学株式会社）とリン酸（和光純薬工業株式会社）より作製））：アセトニトリル（和光純薬工業株式会社）＝７５：２５を使用した。流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は４０℃、分析時間は１０分間、検出は２５４ｎｍで行った。
【００５５】
酵素反応した溶液の光学純度の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓ（アジレント・テクノロジー株式会社）を使用した。カラムはＭＣＩ（登録商標）ＧＥＬ ＰＡＣＫＥＤ ＣＯＬＵＭＮ ＣＲＳ１０Ｗ（４．６×５０ｍｍ）（三菱化学株式会社）、溶離液は ０．２ｍＭ 硫酸銅（ＩＩ）（和光純薬工業株式会社）：アセトニトリル＝８５：１５を使用した。流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は２５℃、分析時間は３０分間、検出は２５４ｎｍで行った。このとき標品はＲ−２−クロロマンデル酸（東京化成工業株式会社）を使用した。
【００５６】
活性測定し、活性画分を集め、塩化ナトリウムの濃度が１Ｍになるように、２Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳを加えた。 １Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳで平衡化した３０ｍＬのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に酵素溶液Ｄをアプライし、９０ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳを加えた後、９０ｍＬの０．１Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳを加えた。溶出はグラジエントで行った。グラジエントは０．１Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳから２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳまでの濃度で行い、溶出液は１２０ｍＬ使用した。溶出液を１ｍＬずつ分取し、活性測定を行った。
【００５７】
活性測定の反応は１００ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、０．０５％ ＣＭＭ、及び分取した酵素溶液を含む反応液を３０分間、３０℃で２００ｒｐｍの振盪で行った。振盪後、１０％ 過塩素酸を加えることにより反応を停止した。酵素反応した溶液の加水分解反応の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（４．６×７５ｍｍ）、溶離液は ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝７５：２５を使用した。流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は４０℃、分析時間は１０分間、検出は２５４ｎｍで行った。また、酵素反応した溶液の光学純度の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＭＣＩ（登録商標）ＧＥＬ ＰＡＣＫＥＤ ＣＯＬＵＭＮ ＣＲＳ１０Ｗ（４．６×５０ｍｍ）、溶離液は ０．２ｍＭ 硫酸銅（ＩＩ）：アセトニトリル＝８５：１５を使用した。流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は２５℃、分析時間は３０分間、検出は２５４ｎｍで行った。このとき標品はＲ−２−クロロマンデル酸を使用した。
【００５８】
活性測定し、活性画分を集め、ＶＩＶＡＳＰＩＮ ６（ＭＷＣＯ：１００００）（家田貿易株式会社）を用いて、濃縮を行った。その酵素溶液をスペクトラ／ポア（登録商標）メンブレン ＭＷＣＯ：１２０００−１４０００（フナコシ株式会社）を用いて、２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）（和光純薬工業株式会社）に対して４℃で透析を行った（酵素溶液Ｐ）。AKTAexplorer 10S（アマシャム ファルマシア バイオテク株式会社）を使用して、２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＳＯＵＲＣＥ（ＴＭ）１５Ｓ ＰＥ ４．６／１００（アマシャム ファルマシア バイオテク株式会社）に酵素溶液Ｐをアプライし、５ｍＬの２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で溶出した後、ＶＩＶＡＳＰＩＮ（ＭＷＣＯ：１００００）を用いて濃縮を行った（酵素溶液Ｓ）。
【００５９】
AKTAexplorer 10Sを使用して、２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（リン酸水素２ナトリウム１２水和物（関東化学株式会社）とリン酸２水素ナトリウム２水和物（関東化学株式会社）を用いて調製）で平衡化したＨｉＬｏａｄ（登録商標）１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（ＴＭ） ２００ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（アマシャム ファルマシア バイオテク株式会社）に酵素溶液Ｓをアプライし、１６０ｍＬの２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて溶出した。１ｍＬずつ分取し、活性測定を行った。
【００６０】
活性測定の反応は１００ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、０．０５％ ＣＭＭ、及び分取した酵素溶液を含む反応液を３０分間、３０℃で２００ｒｐｍの振盪で行った。 振盪後、１０％ 過塩素酸を加えることにより反応を停止した。酵素反応した溶液の加水分解反応の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（４．６×７５ｍｍ）、溶離液は ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝７５：２５を使用した。 流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は４０℃、分析時間は１０分間、検出は２５４ｎｍで行った。また、酵素反応した溶液の光学純度の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＭＣＩ（登録商標）ＧＥＬ ＰＡＣＫＥＤ ＣＯＬＵＭＮ ＣＲＳ１０Ｗ（４．６×５０ｍｍ）、溶離液は ０．２ｍＭ 硫酸銅（ＩＩ）：アセトニトリル＝８５：１５を使用した。 流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は２５℃、分析時間は３０分間、検出は２５４ｎｍで行った。このとき標品はＲ−２−クロロマンデル酸を使用した。活性を確認できた画分を精製酵素溶液とした。
精製酵素溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。０．１％ ドデシル硫酸ナトリウムを含む１２％ポリアクリルアミドゲルに精製酵素溶液をアプライした。電気泳動した結果、約４２ｋＤａの位置に単一のバンドを確認した。このときサイズマーカーはＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を使用した。
【００６１】
（遺伝子取得）
１．５ｍＬの精製酵素を凍結乾燥し、２ｍＬの５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）（和光純薬工業株式会社）を加えた。さらに、１１μＬの３０ｎｍｏｌ／ｍＬ リシルエンドペプチターゼ（登録商標）、アクロモバクター属菌Ｍ４９７−１由来（和光純薬工業株式会社）を加えた後、３７℃で６時間静置した（酵素溶液Ｌ）。
【００６２】
AKTAexplorer 10Sを使用して、０．１％ トリフルオロ酢酸（和光純薬工業株式会社）で平衡化したＳｅｐｈａｓｉｌ（登録商標）ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃ１８ ５μ ＳＴ ４．６／１００（アマシャム ファルマシア バイオテク株式会社）に酵素溶液Ｌをアプライし、０．１％トリフルオロ酢酸から８０％アセトニトリルを含む０．１％トリフルオロ酢酸のグラジエントで溶出した。溶出液は７０ｍＬ使用し、１ｍＬずつ分取した。
【００６３】
分取した各々のサンプルを全自動タンパク質一次構造分析装置 ＰＰＳＱ−２１Ａ（株式会社 島津製作所）に供したところ、アミノ酸配列「ＴＶＶＤＩＷＧＧＷＡＤＥＥＨＴＱＰＰＴＲ」を得た。このアミノ酸配列をＤＮＡＳＩＳ（登録商標）Ｐｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．９（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社）を用いてＢｌａｓｔ検索を行ったところＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＭＡ−４６８０のｐｕｔａｔｉｖｅ ｅｓｔｅｒａｓｅ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿８２２４７９．１）と７１％の相同性があった。そこで、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＭＡ−４６８０のｐｕｔａｔｉｖｅ ｅｓｔｅｒａｓｅのアミノ酸配列のうち、「ＹＷＰＥＦＡＡＡＧＫ」を基にプライマー Ｅｓｔｅｒ Ｆ１００ａａ「５'ＴＡＹＴＧＧＣＣＮＧＡＲＴＴＹＧＳＮＧＣＮＧＣＮＧＧＮＡＡ」を作製した（北海道システム・サイエンス株式会社）。また、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＭＡ−４６８０のｐｕｔａｔｉｖｅ ｅｓｔｅｒａｓｅのアミノ酸配列のうち「ＬＡＤＲＧＬＬＤＦＤＡＰＶＡＡＹＷＰＥＦＡＡＡＧＫＥＳＶＬＶＲＨＬＬＳＨＲＡＧＬ」とＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのｕｎｎａｍｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡＥ６６２１２）をＤＮＡＳＩＳ（登録商標）Ｐｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．９を用いて相同性検索を行ったところ、７５％の相同性があった。そこで、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのｕｎｎａｍｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔのアミノ酸配列のうち「ＦＷＧＧＷＧＧＳＦＡ」を基にプライマー Ｌａｃｔａｍ Ｒ３３０ａａ「 ５’ＧＣＲＡＡＮＳＷＮＣＣＮＣＣＣＣＡＮＣＣＮＣＣＣＣＡＲＡＡ」を作製した（北海道システム・サイエンス株式会社）。なお配列表中の略号は次の核酸塩基を示す。
Ｎ：Ｇ（グアニン）とＡ（アデニン）とＴ（チミン）とＣ（シトシン）
Ｗ：Ａ（アデニン）とＴ（チミン）
Ｙ：Ｃ（シトシン）とＴ（チミン）
Ｒ：Ａ（アデニン）とＧ（グアニン）
Ｓ：Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）
【００６４】
Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ ＮＢＲＣ ６８５７（独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ） 郵便番号２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８より分譲）を５ｍＬのＧＰＹ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間、振盪培養を行った。培養液からゲノムＤＮＡの取得を行った。ゲノムＤＮＡの取得はＧｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｂｕｆｆｅｒ ｓｅｔ（株式会社キアゲン）及びＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｎｏｍｉｃ―ｔｉｐ ５００／Ｇ（株式会社キアゲン）を用いた。取得したゲノムＤＮＡを鋳型としてＫＯＤ ―ｐｌｕｓ―（東洋紡績株式会社）を用いてＰＣＲを行った。 プライマーはＥｓｔｅｒ Ｆ１００ａａとＬａｃｔａｍ Ｒ３３０ａａを使用し、ＫＯＤ ―ｐｌｕｓ―の説明書に従いＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を １．５％アガロースゲル（ナカライテスク株式会社）を用いてアガロース電気泳動に供したところ、約０．８ｋｂｐのバンドを確認した。このときサイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ（登録商標）λ／ＥｃｏＲ Ｉ ＋ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔ（東洋紡績株式会社）を使用した。
【００６５】
約０．８ｋｂｐのバンドをＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｆｒｅｅｚｅ’Ｎ Ｓｑｕｅｅｚｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を用いて精製し、このＤＮＡとＨｉｎｃ ＩＩ（東洋紡績株式会社）で消化したｐＵＣ１８（タカラバイオ株式会社）を混合した溶液をＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績株式会社）を用いてライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡをＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９（東洋紡績株式会社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム（和光純薬工業株式会社）を含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン（和光純薬工業株式会社）、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム（和光純薬工業株式会社）、２％アガー（和光純薬工業株式会社）、ｐＨ ７．２）で生育したコロニーを５ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ液体培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、ｐＨ ７．２）に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩、振盪培養を行った。ＬａｂｏＰａｓｓ（登録商標）Ｍｉｎｉ（北海道システム・サイエンス株式会社）を用いて、その培養液からプラスミドを精製した。ｐＵＣ１８にインサートＤＮＡが挿入したプラスミドをスクリーニングするために 精製したＤＮＡを０．８％ アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供した。
【００６６】
インサートＤＮＡの塩基配列の解読はプライマーウォーキング法で行った。塩基配列解読にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ＮＴ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）とＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を使用した。
【００６７】
塩基配列を解読した結果、酵素のオープン リーディング フレーム（ｏｒｆ）の一部であることが推定された。そこで、全長ｏｒｆの塩基配列を取得するために、解読したインサートＤＮＡの塩基配列を基にプライマー ｐＥＣＭ―Ｇ２８Ｐ８Ｒ３００ 「５'ＣＧＴＧＴＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＣＧＧＣＴＧＧ」（北海道システム・サイエンス株式会社）、プライマー ｐＥＣＭ―Ｇ２８Ｐ８Ｒ２５０ 「５'ＧＴＧＧＴＣＴＧＧＣＧＡＧＡＧＴＧＴＴＧＴＣＴＡＣＣＧＴＣ」（北海道システム・サイエンス株式会社）、プライマー ｐＥＣＭ―Ｇ２８Ｐ７Ｒ２７０ 「５'ＣＣＴＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＣＴＡＴＣＴＣＧＴＣＧＣＧＣＡＣ」（北海道システム・サイエンス株式会社）、及びプライマー ｐＥＣＭ―Ｇ２８Ｐ７Ｒ２３０ 「５'ＧＣＴＴＣＡＴＧＧＧＣＴＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＣＧＴＣＡＣＧ」（北海道システム・サイエンス株式会社）を作製した。
【００６８】
目的酵素のＣ末端をコードする塩基配列の取得を行った。ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ（登録商標）ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を使用し、その説明書に従い、プライマー ｐＥＣＭ−Ｇ２８Ｐ８Ｒ３００、プライマー ｐＥＣＭ−Ｇ２８Ｐ８Ｒ２５０、及びＰｓｔ Ｉ（東洋紡績株式会社）で消化したゲノムＤＮＡ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ ＮＢＲＣ ６８５７より精製）を使用した。得られたＤＮＡ産物を０．８％ アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供し（サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ（登録商標）λ／ＥｃｏＲ Ｉ ＋ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔを使用）、約２．７ｋｂｐのバンドをＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｆｒｅｅｚｅ’Ｎ Ｓｑｕｅｅｚｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓを用いて精製し、このＤＮＡとＨｉｎｃ ＩＩで消化したｐＵＣ１８を混合した溶液をＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡをＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９を用いて大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地で生育したコロニーを５ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩、振盪培養を行った。ＬａｂｏＰａｓｓ（登録商標）Ｍｉｎｉを用いて、その培養液からプラスミドを精製した。ｐＵＣ１８にインサートＤＮＡが挿入したプラスミドをスクリーニングするために精製したＤＮＡを０．８％ アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供した。得られたプラスミドをｐＥＣＭ−Ｇ５１と命名した。
【００６９】
インサートＤＮＡの塩基配列の解読はプライマーウォーキング法で行った。塩基配列解読にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ＮＴ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒとＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを使用し、目的酵素のＣ末端の塩基配列を得た。
【００７０】
次に、目的酵素のＮ末端をコードする塩基配列の取得を行った。ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ（登録商標）ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用し、その説明書に従い、プライマー ｐＥＣＭ−Ｇ２８Ｐ７Ｒ２３０、プライマー ｐＥＣＭ−Ｇ２８Ｐ７Ｒ２７０、及びＳａｌ Ｉ（東洋紡績株式会社）で消化したゲノムＤＮＡ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ ＮＢＲＣ ６８５７より精製）を使用した。得られたＤＮＡ産物を１．５％ アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供し（サイズマーカーはＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒ（２００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ）（東洋紡績株式会社）を使用）、約０．３ｋｂｐのバンドをＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｆｒｅｅｚｅ’Ｎ Ｓｑｕｅｅｚｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓを用いて精製し、このＤＮＡとＨｉｎｃ ＩＩで消化したｐＵＣ１８を混合した溶液をＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。
【００７１】
ライゲーションしたＤＮＡをＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９を用いて大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地で生育したコロニーを５ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩、振盪培養を行った。ＬａｂｏＰａｓｓ（登録商標）Ｍｉｎｉを用いて、その培養液からプラスミドを精製した。ｐＵＣ１８にインサートＤＮＡが挿入したプラスミドをスクリーニングするために精製したＤＮＡを０．８％ アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供した。インサートＤＮＡの塩基配列の解読はプライマーウォーキング法で行った。塩基配列解読にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ＮＴ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒとＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを使用した。
【００７２】
得られた塩基配列を基にプライマー ｐＥＣＭ−Ｇ３１Ｒ７０「５'ＣＴＣＣＡＡＡＴＴＣＴＧＧＣＣＡＧＴＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣ」（北海道システム・サイエンス株式会社）を作製した。ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ（登録商標）ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用し、その説明書に従い、プライマー ｐＥＣＭ−Ｇ２８Ｐ７Ｒ２７０、プライマー ｐＥＣＭ−Ｇ３１Ｒ７０、及びＥｃｏＲ Ｉ（東洋紡績株式会社）で消化したゲノムＤＮＡ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ ＮＢＲＣ ６８５７より精製）を使用した。得られたＤＮＡ産物を０．８％ アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供し（サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ（登録商標）λ／ＥｃｏＲ Ｉ ＋ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔを使用）、約３．２ｋｂｐのバンドをＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｆｒｅｅｚｅ’Ｎ Ｓｑｕｅｅｚｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓを用いて精製し、このＤＮＡとＨｉｎｃ ＩＩで消化したｐＵＣ１８を混合した溶液をＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡをＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９を用いて大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地で生育したコロニーを５ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩、振盪培養を行った。ＬａｂｏＰａｓｓ（登録商標）Ｍｉｎｉを用いて、その培養液からプラスミドを精製した。ｐＵＣ１８にインサートＤＮＡが挿入したプラスミドをスクリーニングするために精製したＤＮＡを０．８％ アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供した。得られたプラスミドをｐＥＣＭ−Ｇ５３と命名した。
【００７３】
インサートＤＮＡの塩基配列の解読はプライマーウォーキング法で行った。塩基配列解読にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ＮＴ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒとＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを使用し、目的酵素のＮ末端の塩基配列を得た。
【００７４】
ｐＥＣＭ−Ｇ５１及びｐＥＣＭ−Ｇ５３より得られた塩基配列を基にプライマー ＣＭＭ Ｆ１Ｓｐ「５'ＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＡＧＣＣＧＡＡＧＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＡＣＣＧＡＡＧ」（北海道システム・サイエンス株式会社）及びプライマー ＣＭＭ Ｒ１１７０Ｂｇｌ(Ｓｔ)「５'ＣＧＴＣＣＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＡＧＴＡＴＣＣＴＴＣ」（北海道システム・サイエンス株式会社）、プライマー ＣＭＭ Ｒ１１５０Ｂｇｌ(Ｆｕ)「５' ＣＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＧＴＡＴＣＣＴＴＣＧＡＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＴＴＧＴＡＡＧＣ」（北海道システム・サイエンス株式会社）を作製した。Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ ＮＢＲＣ ６８５７より精製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＫＯＤ ―ｐｌｕｓ―（東洋紡績株式会社）を用いてＰＣＲを行った。 プライマーはＣＭＭ Ｆ１ＳｐとＣＭＭ Ｒ１１７０Ｂｇｌ(Ｓｔ)、または、ＣＭＭ Ｆ１ＳｐとＣＭＭ Ｒ１１５０Ｂｇｌ(Ｆｕ)を使用し、ＫＯＤ ―ｐｌｕｓ―の説明書に従いＰＣＲを行った。
【００７５】
ＰＣＲ産物をＳｐｈ Ｉ（東洋紡績株式会社）およびＢｇｌ ＩＩ（東洋紡績株式会社）で消化し、０．８％アガロースゲルを用いてアガロース電気泳動に供したところ、それぞれ約１．２ｋｂｐのバンドを確認した。このときサイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ（登録商標）λ／ＥｃｏＲ Ｉ ＋ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔ（東洋紡績株式会社）を使用した。約１．２ｋｂｐの各々のバンドをＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｆｒｅｅｚｅ’Ｎ Ｓｑｕｅｅｚｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を用いて精製した（Ｇ６５インサートＤＮＡ断片またはＧ６４インサートＤＮＡ断片）。また、ｐＱＥ−７０（株式会社キアゲン）をＳｐｈ Ｉ及びＢｇｌ ＩＩで消化し、０．８％アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供して確認された約３．４ｋｂｐのバンドをＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｆｒｅｅｚｅ’Ｎ Ｓｑｕｅｅｚｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓを用いて精製した。このときサイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ（登録商標）λ／ＥｃｏＲ Ｉ ＋ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔを使用した。
【００７６】
この精製したｐＱＥ−７０のＤＮＡ断片とＧ６５インサートＤＮＡ断片、またはこの精製したｐＱＥ−７０のＤＮＡ断片とＧ６４インサートＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈを用いてライゲーションし、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９を用いて大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地で生育したコロニーを５ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩、振盪培養を行った。ＬａｂｏＰａｓｓ（登録商標）Ｍｉｎｉを用いて、その培養液からプラスミドを精製した。ｐＱＥ７０にインサートＤＮＡ断片が挿入したプラスミドをスクリーニングするために 精製したＤＮＡを０．８％ アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供した。得られたプラスミドをそれぞれｐＥＣＭ−Ｇ６５またはｐＥＣＭ−Ｇ６４と命名した。
【００７７】
ｐＥＣＭ−Ｇ６５のインサートＤＮＡの塩基配列の解読はプライマーウォーキング法で行った。塩基配列解読にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ＮＴ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒとＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを使用し、インサートＤＮＡの塩基配列を得た。
【００７８】
ｐＥＣＭ−Ｇ５３とｐＥＣＭ−Ｇ６５から得られた塩基配列から目的酵素の遺伝子（ｃｍｍ遺伝子）を取得した（配列表の配列番号２）。また、ｃｍｍ遺伝子がコードしている酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示した。配列番号２に示したｃｍｍ遺伝子配列を基に、ＤＮＡＳＩＳ（登録商標）Ｐｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．９を使用して相同性検索を行った。相同性検索を行った結果、相同性が高かった上位の２つの配列について、再度、ＤＮＡＳＩＳ（登録商標）Ｐｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．９を使用して相同性を解析したところ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ ｓｔｒａｉｎ ＳＣ1（遺伝子 ＩＤ：ＡＹ０５２６３０）との相同性は６２．７５％、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｗｉｔｔｉｃｈｉｉ ＲＷ１（遺伝子 ＩＤ：ＣＰ０００６９９）との相同性は５８．４６％の相同性であった。
【００７９】
また、ｃｍｍ遺伝子はカルボキシルエステルを加水分解する酵素であるが、カルボキシルエステルを分解する酵素はカルボキシルエステラーゼとして知られている。カルボキシルエステラーゼとしては国際公開ＷＯ２００７／１２８４９６で報告されているが、記載されている塩基配列とｃｍｍ遺伝子の相同性についてＤＮＡＳＩＳ（登録商標）Ｐｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．９を使用して解析した。国際公開ＷＯ２００７／１２８４９６に記載されている配列の中で最も相同性の高かった配列はｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｇｅｎｅ Ｅｓｔ１の遺伝子配列であるＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であった。
【００８０】
ＤＮＡＳＩＳ（登録商標）Ｐｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．９を使用して、ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｇｅｎｅ Ｅｓｔ１の遺伝子配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１とｃｍｍ遺伝子の相同性検索を行ったところ６６．１９％であった。また、ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｇｅｎｅ Ｅｓｔ１の遺伝子配列 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１とＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ ｓｔｒａｉｎ ＳＣ1（遺伝子 ＩＤ：ＡＹ０５２６３０）との相同性は６８．４７％であった。一方、国際公開ＷＯ２００７／１２８４９６に記載されているｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｇｅｎｅ Ｅｓｔ１の遺伝子配列 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１とＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ ｓｔｒａｉｎ ＳＣ1（遺伝子 ＩＤ：ＡＹ０５２６３０）との相同性は６５．４８３％であった。従って、国際公開ＷＯ２００７／１２８４９６に記載されている方法でｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｇｅｎｅ Ｅｓｔ１の遺伝子配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１とｃｍｍ遺伝子の相同性検索を行った場合の相同性は６５．４８３％未満であることが示唆された。
【００８１】
（目的酵素発現確認および活性測定）
ｐＥＣＭ−Ｇ６５またはｐＥＣＭ−Ｇ６４をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９を用いて大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入し、それぞれ大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６５または大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６４とした。大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６５または大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６４を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地で生育したコロニーを５ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム及び１ｍＭ イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（和光純薬工業株式会社）を含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩、振盪培養を行った。
【００８２】
培養菌体をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。０．１％ ドデシル硫酸ナトリウムを含む１２％ポリアクリルアミドゲルを使用した。電気泳動した結果、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６５および大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６４は大腸菌内で約４２ｋＤａの酵素が過剰発現していることを確認した。このときサイズマーカーはＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ， Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を使用した。ｃｍｍ遺伝子がコードしている目的酵素のサイズは約４２ｋＤａであり、目的酵素が大腸菌内で過剰発現していることが示唆された。また、上記に記載したように精製酵素の分子量は約４２ｋＤａであるため、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ ８１９３から精製した酵素とＥｘｏｐｈｉａｌａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ ＮＢＲＣ ６８５７のｃｍｍ遺伝子がコードしている酵素は同じ性質のものであることが示唆された。
【００８３】
また、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６４をＣ−Ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｐＱＥ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｅｔ（株式会社キアゲン）を使用し、Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｐＱＥ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｅｔの説明書に従い、ｃｍｍ遺伝子がコードしている酵素を精製した（酵素溶液Ｎ）。酵素溶液ＮをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。０．１％ ドデシル硫酸ナトリウムを含む１２％ポリアクリルアミドゲルを使用した。電気泳動した結果、約４２ｋＤａの酵素が精製できたことを確認した。このときサイズマーカーはＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅを使用した。
【００８４】
酵素溶液Ｎの活性測定を行った。活性測定の反応は１００ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、０．０５％ ＣＭＭ、及び酵素溶液Ｎを含む反応液を３０分間、３０℃で２００ｒｐｍの振盪で行った。 振盪後、１０％ 過塩素酸を加えることにより反応を停止した。酵素反応した溶液の加水分解反応の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（４．６×７５ｍｍ）、溶離液は ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝７５：２５を使用した。 流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は４０℃、分析時間は１０分間、検出は２５４ｎｍで行った。また、酵素反応した溶液の光学純度の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＭＣＩ（登録商標）ＧＥＬ ＰＡＣＫＥＤ ＣＯＬＵＭＮ ＣＲＳ１０Ｗ（４．６×５０ｍｍ）、溶離液は ０．２ｍＭ 硫酸銅（ＩＩ）：アセトニトリル＝８５：１５を使用した。 流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は２５℃、分析時間は３０分間、検出は２５４ｎｍで行った。このとき標品はＲ−２−クロロマンデル酸を使用した。
【００８５】
酵素溶液ＮはＥｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ ８１９３から精製した酵素と同様の活性を有していた。また、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ ８１９３から精製した酵素と同様にＲ−２−クロロマンデル酸メチルエステルの選択性が９９％ｅｅ以上を示したため、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ ８１９３から精製した酵素とｃｍｍ遺伝子がコードしている酵素は同じ性質のものであることが示唆された。
【００８６】
（形質転換体の活性測定）
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６５または大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６４を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地で生育したコロニーを５ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム及び１ｍＭ イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシドを含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩、振盪培養を行った。培養液を１２ｋｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した後０．９％ 塩化ナトリウム水溶液に懸濁し、その懸濁液の一部、１０％ エタノール（和光純薬工業株式会社）、５０ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）及び１％ ＣＭＭを含む反応液で反応を行った。反応は２００ｒｐｍ、３０℃で３０分間行い、１０％ 過塩素酸を加えることにより反応を停止した。
【００８７】
反応終了液の加水分解反応の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（４．６×７５ｍｍ）、溶離液は ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝７５：２５を使用した。 流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は４０℃、分析時間は１０分間、検出は２５４ｎｍで行った。また、反応した溶液の光学純度の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＭＣＩ（登録商標）ＧＥＬ ＰＡＣＫＥＤ ＣＯＬＵＭＮ ＣＲＳ１０Ｗ（４．６×５０ｍｍ）、溶離液は ０．２ｍＭ 硫酸銅（ＩＩ）：アセトニトリル＝８５：１５を使用した。流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は２５℃、分析時間は３０分間、検出は２５４ｎｍで行った。このとき標品はＲ−２−クロロマンデル酸を使用した。１分間にＲ−２−クロロマンデル酸を１μｍｏｌ生成する活性を１Ｕとした。反応液を分析した結果、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６５及び大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６４の活性は培養液１ｍＬあたり２１Ｕであり同じ活性を示した。この大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６５の活性と５ｍＬのＧＰＹ液体培地で培養しＥｘｏｐｈｉａｌａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ ＮＢＲＣ ６８５７の活性と比較したところ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６５の活性は５５２倍高い活性であった。
【００８８】
光学純度に関してはＥｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ ８１９３から精製した酵素、５ｍＬのＧＰＹ液体培地で培養したＥｘｏｐｈｉａｌａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ ＮＢＲＣ ６８５７の培養菌体、ｃｍｍ遺伝子を過剰発現した大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６５及び大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６４の培養菌体はすべてＲ−２−クロロマンデル酸メチルエステルの選択性が９９％ｅｅ以上を示したため、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ ８１９３から精製した酵素とｃｍｍ遺伝子がコードしている酵素は同じ性質のものであることが示唆された。
【００８９】
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６５を１００ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム及び１ｍＭ イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシドを含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃、２００ｒｐｍで１２時間、フラスコ振盪培養を行った。培養液を１２ｋｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した後１００ｍＬの０．９％ 塩化ナトリウム水溶液に懸濁し、５ｍＬを恒温槽に設置した４口フラスコに投入し、０．９％塩化ナトリウム水溶液８５ｍＬを加えた。撹拌下、徐々に１０ｇのＣＭＭを投入した。その４口フラスコを３０℃に維持し、ｐＨは２８％ＮａＯＨにて調整した。２４時間後、溶液をＨＰＬＣに供した。Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（４．６×７５ｍｍ）、溶離液は ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝７５：２５を使用した。流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は４０℃、分析時間は１０分間、検出は２５４ｎｍで行った。
【００９０】
反応した溶液の光学純度の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＭＣＩ（登録商標）ＧＥＬ ＰＡＣＫＥＤ ＣＯＬＵＭＮ ＣＲＳ１０Ｗ（４．６×５０ｍｍ）、溶離液は０．２ｍＭ 硫酸銅（ＩＩ）：アセトニトリル＝８５：１５を使用した。 流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は２５℃、分析時間は３０分間、検出は２５４ｎｍで行った。このとき標品はＲ−２−クロロマンデル酸を使用した。１分間にＲ−２−クロロマンデル酸を１μｍｏｌ生成する活性を１Ｕとした。反応液を分析した結果、精製した２−クロロマンデル酸はＲ体であり、光学純度は９４．５％ｅｅであった。
【００９１】
（基質特異性）
Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ ８１９３由来精製酵素の基質特異性を調べるために、以下のように基質を合成した。
メタノールを使用して３−クロロマンデル酸（和光純薬工業株式会社）または、フェニル乳酸（和光純薬工業株式会社）、アトロラクチン酸（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）、４−クロロマンデル酸（和光純薬工業株式会社）、４−メトキシマンデル酸（和光純薬工業株式会社）をエステル化し、３−クロロマンデル酸メチルエステルまたは、フェニル乳酸メチルエステル、アトロラクチン酸メチルエステル、４−クロロマンデル酸メチルエステル、４−メトキシマンデル酸メチルエステルを合成した。
エタノール（和光純薬工業株式会社）を使用して２−クロロマンデル酸をエステル化し、２−クロロマンデル酸エチルエステルを合成した。
イソプロパノール（東京化成工業株式会社）を使用して、２−クロロマンデル酸をエステル化し、２−クロロマンデル酸イソプロピルエステルを合成した。
ベンジルアルコール（東京化成工業株式会社）を使用して、２−クロロマンデル酸をエステル化し、２−クロロマンデル酸ベンジルエステルを合成した。
【００９２】
基質特異性を解析するための活性測定の反応は１００ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、０．２％ 酵素溶液Ｓを含む溶液に０．０５％ ＣＭＭまたは、３−クロロマンデル酸メチルエステル、フェニル乳酸メチルエステル、アトロラクチン酸メチルエステル、マンデル酸メチルエステル（関東化学株式会社）、２−クロロマンデル酸エチルエステル、２−クロロマンデル酸イソプロピルエステル、２−クロロマンデル酸ベンジルエステル、４−クロロマンデル酸メチルエステル、４−メトキシマンデル酸メチルエステルを加え３０℃で３０分間２００ｒｐｍの振盪で行った。振盪後、１０％ 過塩素酸を加えることにより反応を停止した。
【００９３】
酵素反応した溶液の加水分解反応の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（４．６×７５ｍｍ）を使用した。ＣＭＭまたは、３−クロロマンデル酸メチルエステル、フェニル乳酸メチルエステル、アトロラクチン酸メチルエステル、マンデル酸メチルエステル、２−クロロマンデル酸エチルエステル、２−クロロマンデル酸イソプロピルエステル、２−クロロマンデル酸ベンジルエステル、４−クロロマンデル酸メチルエステル、４−メトキシマンデル酸メチルエステルを基質とした場合は、溶離液は ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝７５：２５を使用し、流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は４０℃、分析時間は２０分間、検出は２５４ｎｍで行い、ＤＬ−２−ヒドロキシ酪酸メチルエステルまたは、乳酸メチルエステルを基質とした場合は、溶離液は ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝９０：１０を使用し、流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は４０℃、分析時間は２０分間、検出は２５４ｎｍで行った。
【００９４】
酵素反応した溶液の光学純度の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。３−クロロマンデル酸メチルエステルまたは、フェニル乳酸メチルエステル、アトロラクチン酸メチルエステル、マンデル酸メチルエステル、２−クロロマンデル酸エチルエステル、２−クロロマンデル酸イソプロピルエステル、２−クロロマンデル酸ベンジルエステル、４−クロロマンデル酸メチルエステル、４−メトキシマンデル酸メチルエステルを基質とした場合は、カラムはＭＣＩ（登録商標）ＧＥＬ ＰＡＣＫＥＤ ＣＯＬＵＭＮ ＣＲＳ１０Ｗ（４．６×５０ｍｍ）、溶離液は ０．２ｍＭ 硫酸銅（ＩＩ）：アセトニトリル＝８５：１５を使用し、流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は２５℃、分析時間は１２０分間、検出は２５４ｎｍで行った。２−ヒドロキシ−ｎ−オクタン酸メチルエステルを基質とした場合は、カラムはＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ−ＲＨ（和光純薬工業株式会社）、溶離液は ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝６０：４０を使用し、流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は２５℃、分析時間は２０分間、検出は２５４ｎｍで行った。活性測定した結果、すべての化合物について反応が進行することが確認された。ＣＭＭを基質とした場合の活性を基準とした場合の相対活性および光学活性選択性を表１に示した。
【００９５】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造に有用な新規加水分解酵素、及び該加水分解酵素を用いた光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の効率的な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
α−ヒドロキシカルボン酸又はその誘導体は、各種の医薬や農薬の製造用中間体として有用であり、特にα位に不斉中心を有する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸又はそのエステル誘導体を用いて様々な生理活性化合物を製造することができることから、高い光学純度を有する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸又はそのエステル誘導体を効率的に製造する方法の開発が鋭意行なわれている。例えば、血小板凝集阻害剤や抗血栓剤として高い有用性が期待されるクロピドグレル（clopidogrel: (S)-2(2-クロロフェニル)-2-(4,5,6,7-テトラヒドロチエノ[3,2-c]-5-ピリジル)酢酸メチル)を光学活性α−ヒドロキシカルボン酸エステルから効率よく製造できることが知られている（特開2001-519353号公報）。この方法は、（R）-2-クロロマンデル酸メチルのα-ヒドロキシル基をスルホニル化し、4,5,6,7-テトラヒドロチエノ[3,2-c]-5-ピリジンと反応させる工程を含んでいる。
【０００３】
光学活性α−ヒドロキシカルボン酸又はそのエステルの製造方法としては、光学活性スレオ-1-(p-ニトロフェニル)-2-アミノ-1,3-プロパンジオールや光学活性リジンを用い、ジアステレオマー塩をたて2‐クロロマンデル酸ラセミ混合物を光学分割して光学活性2-クロロマンデル酸を製造する方法が知られている（特開2004-530717号公報）。しかしながら、この方法では光学分割のための分割剤として高価な試薬を使わなければならないという欠点がある。
【０００４】
また、2-クロロベンズアルデヒドとシアニドドナー（シアン化水素など）からヒドロキシニトリルリアーゼを用いて光学活性シアノヒドリン（2-クロロマンデロニトリル）を製造する方法が提案されており、この光学活性シアノヒドリンから加水分解により光学活性2-クロロマンデル酸が得られる（特開2004-57005号公報）。2-クロロベンズアルデヒドとシアニドドナー（シアン化水素など）から得たシアノヒドリン（2-クロロマンデロニトリル）に対して不斉加水分解を行って光学活性2-クロロマンデル酸を得る方法も提案されている（特開平4-99496号公報）。しかしながら、これらの方法で用いるシアニドドナー（シアン化水素など）は取り扱いに危険性を伴うという欠点がある。
【０００５】
フェニルグリオキシル酸誘導体に対してα位カルボニル基を立体選択的に還元する能力のもつ微生物を用いて光学活性なマンデル酸誘導体を得る方法も提案されている（特開2003-199595号公報及び特開2004-49028号公報）。しかしながら、原料として用いるαケト酸（フェニルグリオキシル酸誘導体）が高価であり、補酵素の再生系も必要となることから、この方法は製造コストが高いという欠点がある。さらに、マンデル酸誘導体を立体選択的に酸化してαオキソ体を生成する能力を有した微生物をマンデル酸誘導体のラセミ混合物に対して作用させ、未反応物を取り出して光学純度の高いマンデル酸誘導体を得る方法も提案されている（特開平6-165695号公報）。しかしながら、この方法では、αオキソ体とαヒドロキシ体の分離が煩雑であり、場合によっては分離自体が困難になるという欠点がある。
【０００６】
α-アリール-α-ヒドロキシ酸エステルの酵素的加水分解を特徴とする光学活性体の製法に関する技術としては特開平2-53497号公報及び特開平2-156892号公報に記載された方法が知られているが、これらの特許公報に具体的に開示された実施例はマンデル酸を用いた方法に限定されており、有用性が低いという問題がある。また、Canadian Journal of Chemistry, 68(2), p.314, 1990には各種置換基を有するα-アリール-α-ヒドロキシ酸エステルを酵素的に加水分解する方法が開示されているが、使用される酵素は炭酸脱水酵素に限定されており、生成物の光学純度も40〜50％ ee程度であり選択性が低いために有用性が低いという問題がある。
【０００７】
また、国際公開WO 2007/26860号には微生物を用いた光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法が開示されているが、微生物の菌体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物で処理する工程が開示されているものの、反応に関与する酵素自体は特定されていない。なお、米国特許第6632650号明細書にはラウリルラクトンを加水分解することができるRhodococcus ruber由来の酵素が記載されており、国際公開2007/128496号には上記米国特許に記載された酵素をコードする塩基配列と65%の相同性の塩基配列によりコードされるカルボキシエステラーゼ活性を有する酵素が開示されているが、本発明により提供される酵素とのアミノ酸配列での相同性は、それぞれ56.2%及び54.5%である。
【特許文献１】特開2001-519353号公報
【特許文献２】特開2004-530717号公報
【特許文献３】特開2004-57005号公報
【特許文献４】特開平4-99496号公報
【特許文献５】特開2003-199595号公報
【特許文献６】特開2004-49028号公報
【特許文献７】特開平6-165695号公報
【特許文献８】特開平2-53497号公報
【特許文献９】特開平2-156892号公報
【特許文献１０】国際公開WO 2007/26860号
【特許文献１１】米国特許第6632650号明細書
【特許文献１２】国際公開2007/128496号
【非特許文献１】Canadian Journal of Chemistry, 68(2), p.314, 1990
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造に有用な新規加水分解酵素を提供することにある。
また、本発明の別の課題は、上記の特徴を有する加水分解酵素を用いた光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の効率的な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、エクソフィアラ(Exophiala)属に属する微生物から単離した新規な酵素を用いてα−ヒドロキシカルボン酸エステルのラセミ混合物を加水分解するとエステルの加水分解が立体選択的に進行すること、及びその加水分解反応を利用して光学活性α−ヒドロキシカルボン酸又は光学活性ヒドロキシカルボン酸エステルを極めて効率的に製造できることを見出した。また、上記酵素が2-クロロマンデル酸エステルの不斉加水分解酵素として極めて高い選択性を有しており、高い基質濃度においても効率的に不斉加水分解を行うことができることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明により、下記の一般式(I)：
下記の一般式(I)：
【化１】
〔式中、Ａは５員又は６員の環状化合物の残基を示し、該環状化合物は芳香族化合物、部分飽和環状化合物、又は飽和環状化合物から選択され、環構成原子として１個以上のヘテロ原子を有していてもよく、環上には置換基を有していてもよく（該置換基はハロゲン原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜４個のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜４個のアルキルオキシ基、及び保護基で保護されていてもよい水酸基、保護基で保護されていてもよいアミノ基、ニトロ基からなる群から選ばれる１又は２個以上の置換基であり、２個以上の置換基が存在する場合にはそれらは同一でも異なっていてもよく、２個以上の置換基が存在する場合にはそれらが結合して環を形成してもよい）、Ｘは水素原子又は炭素数１〜４個のアルキル基を示し、Ｒは炭素数１〜４個のアルキル基（該アルキル基はアリール基で置換されていてもよい）を示し、ただし、一般式(I)で表される化合物は＊＊で示される炭素原子について光学的に純粋ではない〕
で表される化合物を加水分解して下記の一般式(II)：
【化２】
〔式中、Ａ及びＸは上記定義と同義であり、＊はＳ又はＲのいずれかの立体配置を有する炭素原子を示す〕で表される化合物を製造することができる酵素、好ましくは単離された酵素、及び該酵素であって、
(a)配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
(b)配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質
からなる酵素が提供される。
【００１１】
上記発明の好ましい態様によれば、Ａがクロロフェニル基であり、Ｒが炭素数１〜４個のアルキル基又はベンジル基であり、Ｘが水素原子であり、＊で表される炭素原子がＲ配置である化合物を製造することができる上記の酵素；Ａが2-クロロフェニル基であり、Ｒが炭素数１〜４個のアルキル基であり、Ｘが水素原子であり、＊で表される炭素原子がＲ配置である化合物を製造することができる上記の酵素；エクソフィアラ・デルマチチジス(Exophiala dermatitidis)由来の上記酵素が提供される。また、配列表の配列番号１に記載のエクソフィアラ・ジーンセルメイ(Exophiala jeanselmei)・NBRC6857由来の酵素のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有するタンパク質からなる上記酵素も提供される。さらに、活性ドメインである上記アミノ酸配列の部分配列を含むアミノ酸配列を有するタンパク質からなる酵素も提供される。
【００１２】
別の観点からは、本発明により、上記酵素をコードする核酸が提供される。この発明の好ましい態様によれば、上記(a)のアミノ酸配列をコードする核酸；配列表の配列番号２に記載された塩基配列を含む核酸；配列表の配列番号２に記載された塩基配列と80%以上の相同性を有する塩基配列を含む核酸；配列表の配列番号２に記載された塩基配列により特定される核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；配列表の配列番号２に記載された塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換、及び／又は付加を有する塩基配列を含む核酸が提供される。
【００１３】
さらに別の観点からは、本発明により、上記核酸を含む組み換えベクター、及び上記組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
また、本発明により、上記の形質転換体を培養し、得られた培養物から上記酵素を採取する工程を含む、上記酵素の製造方法；及び、上記一般式(II)で表される化合物の製造方法であって、上記一般式(I)で表される化合物を上記酵素および／または上記形質転換体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物により不斉加水分解する工程を含む方法が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により提供される新規な酵素はα−ヒドロキシカルボン酸エステルのラセミ混合物から立体選択的にエステルを加水分解して光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を極めて効率的に製造することができる。特に、上記酵素は2-クロロマンデル酸アルキルエステルの不斉加水分解酵素として極めて高い選択性を有しているという特徴がある。また、本発明の酵素は形質転換微生物の短時間の培養により容易かつ大量に調製でき、微生物の菌体若しくは培養物などを用いる方法（国際公開WO 2007/26860号）に比べて高い基質濃度においても効率的に不斉加水分解を行うことができるという優れた特徴を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
一般式(I)及び(II)で表される化合物において、Ａは５員又は６員の環状化合物の残基を示す。残基とは環状化合物の環構成原子に結合する水素を１つ除いて得られる１価の基のことである。該環状化合物は芳香族化合物、部分飽和環状化合物、又は飽和環状化合物のいずれであってもよく、環構成原子として１個以上のヘテロ原子を有していてもよい。ヘテロ原子の種類は特に限定されないが、例えば、窒素原子、酸素原子、又はイオウ原子などを用いることができ、２個以上の環構成ヘテロ原子を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。環状化合物としては、より具体的には、ベンゼン、５員又は６員の芳香族ヘテロ環化合物（例えばフラン、チオフェン、ピリジン、ピリミジンなど）、５員又は６員の脂肪族環状化合物（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘキセンなど）、あるいは５員又は６員のヘテロ環化合物（例えば、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ジヒドロフラン、テトラヒドロフランなど）などを挙げることができる。これらのうち、環状化合物としてはベンゼンが好ましい。
【００１６】
環状化合物は置換基を有していてもよく、該置換基は、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜４個のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜４個のアルキルオキシ基、及び保護基で保護されていてもよい水酸基、保護基で保護されていてもよいアミノ基、ニトロ基からなる群から選ばれる１又は２個以上の置換基である。環状化合物が置換基を有する場合、置換基の個数及び置換位置は特に限定されない。２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。上記アルキル基又はアルキルオキシ基が置換基を有する場合、置換基の種類、個数、及び置換位置は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。上記アルキル基又はアルキルオキシ基の置換基としては、例えば、水酸基、ハロゲン原子、又はアミノ基などを例示することができるが、これらに限定されることはない。環状化合物が２個以上の置換基を有する場合には、それらの置換基は互いに結合して環を構成してもよい。この場合、環構造は芳香族、部分飽和、又は完全飽和のいずれであってもよい。例えば、２個のアルキル基が結合して炭素環を形成する場合や、1個のアルキルオキシ基と水酸基とが結合してアルキレンジオキシ基の環構造を形成する場合などを例示することができるが、これらに限定されることはない。
【００１７】
保護基としては、例えば、Protective Groups in Organic Chemistry(J.F.W.McOmieeta1., P1enum Press; Protective Groups in Organic Synthesis,3rd Edition (Theodora W. Green, Peter G.M. Wuts, John Wi1y & Sons, Inc. (ISBN O-471-16019-9),April 1999)に記載の保護基が挙げられ、具体的には、メチル基、エチル基、イソプロピル基、t-ブチル基、メトキシメチル基、ベンジルオキシメチル基、メトキシエトキシメチル基、メチルチオメチル基、フェニルチオメチル基、テトラヒドロピラニル基、p-ブロモフェナシル基、アリル基、シクロヘキシル基等のエーテル型保護基；ベンジル基、2,6-ジメチルベンジル基、4-メトキシベンジル基、2,6-ジクロロベンジル基、9-アントラニルメチル基、ジフェニルメチル基、フェネチル基、トリフェニルメチル基等のベンジル型保護基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ジメチルエチルシリル基、t-ブチルジメチルシリル基等のシリル型保護基；アセチル基、クロロアセチル基、トリフルオロアセチル基、ピバロイル基等のアシル型保護基；ベンゾイル基、p-メチルベンゾイル基、p-クロロベンゾイル基、o-クロロベンゾイル基、p-ニトロベンゾイル基等のアロイル型保護基;メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、t-ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、p-メチルベンジルオキシカルボニル基等のカーボネート型保護基；ジメチルホスフィニル基、ジエチルホスフィニル基等のホスフィネート型保護基；メタンスルホニル基、エタンスルホニル基、クロロメタンスルホニル基、クロロエタンスルホニル基、トリクロロメタンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、p-トルエンスルホニル基、o-ニトロベンゼンスルホニル基、m-ニトロベンゼンスルホニル基、p-ニトロベンゼンスルホニル基、o-クロロベンゼンスルホニル基、m-クロロベンゼンスルホニル基、p-クロロベンゼンスルホニル基等のスルホニル型保護基などが挙げられる。
【００１８】
Ｘは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を示す。該アルキル基は直鎖状であっても分枝鎖状のいずれであってもよい。
一般式(I)で表される化合物において、Ｒは炭素数１〜４個のアルキル基を示す。該アルキル基は１個又は２個以上のアリール基で置換されていてもよく、アリール基としてはフェニル基などが好適である。該アルキル基がフェニル基などのアリール基で置換された場合の例としては、ベンジル基、ベンズヒドリル基、フェネチル基などを挙げることができる。
【００１９】
一般式(I)及び(II)で表される化合物においてＡがクロロフェニル基であり、Ｘが水素原子であることが好ましく、Ａが2-クロロフェニル基であることがさらに好ましい。一般式(I)で表される化合物において、Ｒが炭素数１〜４個のアルキル基であることが好ましく、メチル基であることがより好ましい。一般式(II)で表される化合物において、＊で表される炭素原子はＲ配置であることが好ましい。
【００２０】
本発明の酵素は上記一般式(I)で表される化合物を不斉加水分解して上記一般式(II)を製造することができることを特徴としており、好ましくは単離された酵素であり、さらに好ましくは(a)配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質；又は(b)配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質からなる酵素である。上記(b)の態様において、相同性は70%以上であれば特に限定されないが、さらに好ましくは80%以上、さらに好ましくは85％以上、さらに好ましくは90%、特に好ましくは95%以上である。
【００２１】
本発明の酵素としては、エクソフィアラ・デルマチチジス NBRC8193またはエクソフィアラ・デルマチチジス NBRC8193株由来の酵素のほか、(a)の態様、すなわち配列表の配列番号１に記載のエクソフィアラ・ジーンセルメイ・NBRC6857由来の酵素のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有するタンパク質からなる上記酵素が好ましい。本明細書において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列に言及する場合、「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から20個、好ましくは１から10個、より好ましくは１から7個、さらに好ましくは１から5個、特に好ましくは１から3個程度である。上記のアミノ酸配列を全長の一部分の配列として含む酵素も好ましく、このような酵素も本発明の範囲に包含される。さらに、上記のアミノ酸配列において酵素活性に関与する部分（本明細書において「活性ドメイン」と呼ぶ）を含む酵素も好ましく、このような酵素も本発明の範囲に包含される。
【００２２】
本発明の核酸は、上記の酵素のアミノ酸配列をコードする核酸であり、DNA又はRNAのいずれでもよいが、好ましくはDNAである。好ましい核酸としては、上記(a)の態様のアミノ酸配列をコードする核酸を挙げることができ、それらのうちの特に好ましい核酸として配列表の配列番号２に記載された塩基配列を含む核酸を挙げることができる。
【００２３】
また、配列表の配列番号２に記載された塩基配列により特定される核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、又は配列表の配列番号２に記載された塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換、及び／又は付加を有する塩基配列を含む核酸を本発明の核酸として用いることもできる。１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列において、１から数個の範囲は特には限定されないが、例えば、１から40個、好ましくは１から30個、より好ましくは１から20個、より好ましくは１から10個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは1から3個程度である。
【００２４】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、例えば、配列表の配列番号２に記載されたDNAをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、又はサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるDNAの塩基配列を意味しており、例えば、コロニー又はプラーク由来のDNA又は該DNAの断片を固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0 MのNaCl存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2×SSC溶液（1×SSC溶液は、150 mM塩化ナトリウム、15 mMクエン酸ナトリウム）を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるDNA等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションはMolecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、「モレキュラークローニング第２版」と略す場合がある）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２５】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAとしては、プローブとして使用する配列番号２に記載されたDNAの塩基配列と一定以上の相同性を有するDNAが挙げられるが、相同性は、例えば80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは93%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上である。
【００２６】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、上記酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法、又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。例えば、配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、又は遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であるが、この手法はモレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２７】
また、配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて各種微生物の染色体DNAをスクリーニングすることにより本発明の核酸を単離することもできる。例えば、PCR法により本発明の核酸を取得することもできる。各種微生物由来の染色体DNAライブラリー又はcDNAライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載したアミノ酸配列をコードする塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてPCRを行うことができる。PCRの反応条件は適宜設定することができ、例えば、94℃で30秒間（変性）、55℃で30秒〜1分間（アニーリング）、72℃で2分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば30サイクル行った後、72℃で7分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたDNA断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００２８】
上記のプローブ又はプライマーの調製、cDNAライブラリーの構築、cDNAライブラリーのスクリーニング、並びに目的核酸のクローニングなどの手法は当業者に周知かつ慣用であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」と略す場合がある）等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２９】
本発明の核酸の好ましい態様として配列表の配列番号２に記載された塩基配列と、国際公開2007/128496号の配列番号１に記載されたカルボキシエステラーゼ活性を有する酵素をコードする塩基配列の相同性を容易に入手可能なプログラム(ＤＮＡＳＩＳ（登録商標）Ｐｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．９、日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社）により決定したところ66%であり、核酸全長（ストップコドンを含む遺伝子の塩基数）は、それぞれ1179塩基及び1131塩基であり、タンパク質のサイズが異なる。
【００３０】
本発明の核酸は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）、あるいは宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の核酸は転写に必要な要素（例えばプロモーター等）と機能的に連結されていることが望ましい。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すDNA配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００３１】
例えば、細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus Ｓubtilis alkaline protease gene)若しくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモータ、又はファージ・ラムダのＰR若しくはＰLプロモータ、大腸菌の lac、trp、若しくはtacプロモータなどが挙げられる。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、P10プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス39K遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、TPI1プロモータ、ADH2-4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ADH3プロモータまたはtpiAプロモータなどがある。
【００３２】
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の遺伝子、プロモータ、並びに所望によりターミネータ及び／又は分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００３３】
本発明の遺伝子又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。本発明の遺伝子又は組み換えベクターを導入するための宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現できる限り特にその種類は限定されない。例えば、細菌、酵母、真菌、及び高等真核細胞等が挙げられるが、細菌や酵母などが好ましい。細菌細胞の例としては、バチルス又はストレプトマイセス等のグラム陽性菌、あるいは大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられるが、大腸菌などが好ましい。これらの細菌の形質転換は、プロトプラスト法又は公知の方法などによりコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
【００３４】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセス又はシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevis1ae)又はサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓaccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００３５】
他の真菌細胞の例として、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、又はトリコデルマに属する細胞などを挙げることができる。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、DNA構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。DNA構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換え又は異種組換えにより行うことができる。
【００３６】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組み換えベクター及びバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等）。
【００３７】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるSf9、Sf21〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるHiFive(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクター及び上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
【００３８】
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養することができる。形質転換体の培養物から本発明の酵素を単離・精製する手段は特に限定されず、通常のタンパク質又は膜結合タンパク質の単離、精製法を用いることができる。例えば、本発明の酵素をコードする核酸を組換えベクターとしてプラスミドに導入し、この組換えベクターを大腸菌に導入して形質転換した後、大腸菌を培養することにより目的の酵素を分離することができるが、本発明は上記の特定の態様に限定されることはない。
【００３９】
上記の形質転換体の培養における諸条件は特に制限されず、例えば微生物を形質転換体として用いる場合には、微生物の培養に適した通常の培養条件を適宜選択できる。培地の種類も特に限定されず、細菌、真菌、又は酵母それぞれに適した培地を適宜選択することができる。培地としては、通常は、炭素源、窒素源、及びその他の栄養素を含む液体培地を使用することができる。培地の炭素源は、上記微生物が利用可能であればその種類は特に限定されず、任意の炭素源を用いることができる。より具体的には、炭素源として資化性のものが挙げられ、例えば、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリン、デンプン、ソルビトールなどの糖類、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びその塩類、パラフィンなどの炭化水素類、糖蜜、又はこれらの混合物などが使用できる。
【００４０】
窒素源は、上記微生物が利用可能であればその種類は特に限定されず、任意の窒素源を用いることができる。具体的には、資化性のものが挙げられ、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、大豆タンパク加水分解物などの無機または有機含窒素化合物、あるいはこれらの混合物などが使用できる。また、培地には、リン酸カリウム、硫酸鉄、硫酸亜鉛、硫酸マンガン等の無機物、微量金属塩、ビタミン類などの通常の培養に用いられる栄養源を適宜添加してもよい。必要に応じて、培地には微生物の活性を誘導する物質、培地のｐＨ保持に有効な緩衝物質、消泡剤、シリコン、アデカノール、プルロニックなどを添加してもよい。
【００４１】
微生物の培養は、それぞれの微生物の生育に適した条件下で行うことができ、そのような条件は当業者に適宜選択可能である。一例を挙げれば、培地のpHを 3〜10、好ましくは4〜9とし、温度0〜50℃、好ましくは20〜40℃で培養を行うことができる。微生物の培養は、それぞれの微生物の性質に応じて好気的又は嫌気的条件下で行うことができる。培養時間は、1〜300時間、好ましくは、10〜150時間であるが、それぞれの微生物により適宜決定することができる。
【００４２】
形質転換体として大腸菌を用いる場合には、適宜の細菌用培地で培養した大腸菌を集菌してリゾチームなどで処理して溶菌し、菌体を遠心分離して得られるライセートから目的の酵素を分離・精製することができる。ライセートからの酵素の分離・精製は通常のタンパク質の単離精製法、例えば、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法により行うことができ、必要に応じてこれらの手法を2以上組合わせて行うことができる。
【００４３】
本発明の方法は、上記の一般式(II)で表される化合物の製造方法であって、上記の一般式(I)で表される化合物を上記の酵素で処理して不斉加水分解する工程を含むことを特徴としている。一般式(I)において＊はＳ又はＲのいずれかの立体配置を有する炭素原子を示し、一般式(I)で表される化合物は、この不斉炭素に関して実質的に光学的に純粋な化合物である。一般式(II)で表される化合物が他の不斉炭素を有する場合には、その立体配置は特に限定されない。また、一般式(I)で表される化合物において、＊＊はこの炭素原子について一般式(I)で表される化合物が実質的に光学的に純粋ではないことを示す。例えば、この炭素原子に関してＳ体とＲ体との任意の割合の混合物やラセミ体などを用いることができる。
【００４４】
上記の方法の好ましい一態様として、上記一般式(I)で表される化合物において＊＊で表される炭素原子がＲ配置である化合物のエステル基を加水分解して上記一般式(II)で表される化合物において＊で表される炭素原子がＲ配置である化合物を分離精製する工程を含む方法を挙げることができる。
【００４５】
本発明の方法では、上記の酵素を用いて不斉加水分解を行うことができる。酵素を適宜の手段で固定化して用いることもできる。固定化は、当業者に周知の方法（例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行うことができる。固定化担体としては、一般に用いられているものであれば何れでもよく、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、κ−カラギーナン、アルギン酸、ゼラチン、酢酸セルロース等の多糖類；例えば、グルテン等の天然高分子；例えば、活性炭、ガラス、白土、カオリナイト、アルミナ、シリカゲル、ベントナイト、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム等の無機物；例えば、ポリアクリルアミド、ポリビニルアセテート、ポリプロピレングリコール、ウレタン等の合成吸着剤等が挙げられる。本発明の酵素をマイクロカプセルに封入した形で使用することもできる。本発明の酵素の使用態様は上記のものに限定されることはなく、当業者が当業界で利用可能な方法から適宜選択して使用できることは言うまでもない。
【００４６】
本発明の方法において、一般式(I)で表される化合物を上記の酵素で処理する条件は特に限定されず、上記の化合物が酵素と十分に接触でき、その結果、エステル部位の加水分解反応が進行する条件であれば、いかなる条件を選択することもできる。例えば、一般式(I)で表される化合物の溶液に、緩衝液又は水などに溶解した酵素を混合すればよい。上記の工程は、水性の均一系中で行うか、あるいは水に実質的に不溶性又は水に難溶性の有機溶媒と水との二相系中で行うことができるが、一般的には水性の均一系中で行うことが好ましい。水性の均一系を形成する溶媒としては、水のみを溶媒として用いるか、あるいは水と混和する適当な有機溶媒、例えば、エタノール、メタノール、ジオキサン、ジメチルスルホキシド等と水との混合物を用いてもよい。一般式(I)で表される化合物を上記の有機溶媒に溶解し、得られた溶液を上記の酵素溶液に添加して反応を行ってもよい。上記の酵素とともに、又は上記酵素に替えて上記形質転換体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物を用いてもよい。培養物、又はその処理物若しくはその抽出物については国際公開WO 2007/26860号に調製方法が記載されており、上記国際公開の開示を参照により本明細書の開示として含める。
【００４７】
処理条件は、エステルの不斉加水分解反応が進行する条件であれば特に限定されない。酵素の使用量は特に限定されないが、例えば、一般式(I)で表される化合物に対して10000分の1〜1000倍、好ましくは1000分の1〜100倍程度、さらに好ましくは100分の1〜10倍程度である。また、基質である一般式(I)で表される化合物の濃度は、反応系の全重量に対して0.1〜50重量%、好ましくは、0.5〜30重量%、さらに好ましくは1.0〜20重量%程度である。本発明の酵素を用いると、国際公開WO 2007/26860号に記載された微生物を用いる方法に比べて基質濃度を10倍程度高くでき、効率よく目的物を製造できる。反応液のpHは、4〜9、好ましくは5〜8であり、反応温度は、10〜50℃、好ましくは20〜40℃である。pHを安定させるために緩衝液を使用することもできる。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液などを用いることができる。さらに、pHを調節するために、酸、塩基を使用して調節することもできる。また、反応時間は、1〜200時間、好ましくは5〜150時間であるが、酵素の種類に応じて適宜選択することが可能である。反応系内には、必要に応じて、基質及び／又は酵素を一度に添加するか、又は逐次添加するか、若しくは連続的に添加することもできる。生成物である加水分解物を連続的に取り出しながら反応速度を高めることもできる。上記の酵素とともに、又は上記酵素に替えて上記形質転換体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物を用いる場合についても同様である。
【００４８】
反応によって得られた一般式(II)で表される光学活性α−ヒドロキシカルボン酸は、慣用の分離精製手段によって単離精製できる。例えば、反応液から必要に応じて菌体を分離した後、培養物を膜分離、有機溶媒（例えば、トルエン、クロロホルム等）による抽出、カラムクロマトグラフィー、減圧濃縮、蒸留、晶析、再結晶等の通常の精製方法により精製して一般式(II)で表される光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を得ることができる。また、例えば、反応終了後、酢酸ブチル、酢酸エチル、トルエン、クロロホルム等の有機溶媒で反応液から生成物を抽出し、溶媒を留去することにより粗生成物を得ることができ、該粗生成物は、必要によりシリカゲルクロマトグラフィー、再結晶（n-ヘキサン、酢酸エチル等）、減圧蒸留等により精製することができる。
【００４９】
また、不斉加水分解反応を行うことにより、反応液中には、一般式(II)で表される光学活性α−ヒドロキシカルボン酸のほか、加水分解されずに反応液中に残存した光学的に純粋な未反応のエステル化合物（光学活性α−ヒドロキシカルボン酸エステル）が存在する。この光学活性α−ヒドロキシカルボン酸エステルを分離精製した後にエステル基を加水分解することにより、一般式(II)で表される光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を製造することができる。加水分解に使用する酸又は塩基としては、通常の反応において酸又は塩基として使用されるものであれば特に制限はないが、例えば、塩酸、硫酸などの鉱酸類、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、水素化ナトリウム、水素化リチウム、又はアンモニア水等の塩基が挙げられ、好ましくは水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムなどを用いることができる。塩基による加水分解の際には、一般式(II)で表される化合物の立体反転が生じないように適宜の条件を選択することが望ましい。加水分解のための反応溶媒としては、反応の進行を妨げず、原料を十分に溶解できる溶媒であれば特に制限はないが、例えば、アルコール類（メタノール、エタノール等）、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルアセトアミド（DMAc）、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、水、アセトン、又はこれらの混合物などを挙げることができ、好ましくはアルコール類、水、又はこれらの混合物を用いることができる。反応温度は、通常は−20〜150℃であり、好ましくは10〜30℃である。反応時間は、使用する原料、溶媒、反応温度などにより異なるが、通常5分〜36時間であり、好ましくは10分〜16時間である。
基質は安価に供給される光学的に純粋でないα−ヒドロキシカルボン酸とアルコールから通常の方法によって製造できる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
例１
（酵素精製）
Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ ８１９３（独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ） 郵便番号２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８より分譲）を１００ｍＬのＧＰＹ液体培地（１％グルコース（和光純薬工業株式会社）、０．５％ペプトン（和光純薬工業株式会社）、０．３％酵母エキス（和光純薬工業株式会社）、ｐＨ７．０）に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで９６時間、振盪培養を行った。その１００ｍＬの培養液を３ＬのＧＰＹＡ液体培地（１％グルコース、０．５％ペプトン、０．３％酵母エキス、０．０３％アデカノール ＬＧ−１０９（株式会社ＡＤＥＫＡ）、ｐＨ７．０）に加え、３０℃、１ｖｖｍ、４００ｒｐｍで４８時間、ジャー培養を行った。
【００５１】
１２Ｌのジャー培養液を１２ｋｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し上清を取り除いた後、０．８％ ＮａＣｌ（和光純薬工業株式会社）で懸濁した。その懸濁溶液を１２ｋｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し上清を取り除いた後、５０ｍＭ ＭＥＳ（ＭＥＳ ｈｙｄｒａｔｅ、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社） Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５)を加え３０％菌体懸濁液とした。３０％菌懸濁液を４等分し、氷中で各々３００μＡ、３時間、１０秒間破砕−２０秒間休止の間欠で超音波処理を行った。超音波破砕機は株式会社 日本精機製作所の超音波ホモジナイザー モデル ＵＳ−３００を使用し、チップは直径１２ｍｍを使用した。超音波破砕した菌体を１２ｋｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した後上清を回収しクルードとした。２５０ｍＬのクルードに対しＣｏｍｐｌｅｔｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を１錠加えた。また、クルードに終濃度が０．１％になるようにポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬工業株式会社）を加えた。さらに、１００ｍＬのクルードに対し２２．６ｇの硫酸アンモニウムを加え、４℃で１時間穏やかに攪拌した。
【００５２】
そのクルードを１２ｋｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、上清を新しい容器に移し、１００ｍＬの上清に対し１２．０ｇの硫酸アンモニウムを加え４℃で１時間穏やかに攪拌した。１２ｋｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した後、沈殿物に２５０ｍＬあたりＣｏｍｐｌｅｔｅを１錠加え、さらに終濃度が０．１％になるようにポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルを加えた５０ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）（５０ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳ）を加え、１８ｍＬの酵素溶液とした。その酵素溶液をスペクトラ／ポア（登録商標）メンブレン ＭＷＣＯ：１２０００−１４０００（フナコシ株式会社）を用いて、２Ｌの５０ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳに対して４℃で透析を行った（酵素溶液Ａ）。
【００５３】
２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳで平衡化した４０ｍＬのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に酵素溶液Ａをアプライした。４０ｍＬの２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳを加えた後、グラジエントで溶出を行った。グラジエントは２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳから０．２Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳまでの濃度で行い、溶出液は２４０ｍＬ使用した。溶出液を１ｍＬずつ分取し、活性測定を行った。
【００５４】
活性測定の反応は１００ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、０．０５％ クロロマンデル酸メチルエステル（ＣＭＭ）、及び分取した酵素溶液を含む反応液を３０分間、３０℃で２００ｒｐｍの振盪で行った。振盪後、１０％ 過塩素酸を加えることにより反応を停止した。ＣＭＭの合成は、メタノール（和光純薬工業株式会社）を使用して２−クロロマンデル酸（和光純薬工業株式会社）をエステル化することにより行った。酵素反応した溶液の加水分解反応の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓ（アジレント・テクノロジー株式会社）を使用した。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（４．６×７５ｍｍ）（ジーエルサイエンス株式会社）、溶離液は５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）（リン酸２水素ナトリウム２水和物（関東化学株式会社）とリン酸（和光純薬工業株式会社）より作製））：アセトニトリル（和光純薬工業株式会社）＝７５：２５を使用した。流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は４０℃、分析時間は１０分間、検出は２５４ｎｍで行った。
【００５５】
酵素反応した溶液の光学純度の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓ（アジレント・テクノロジー株式会社）を使用した。カラムはＭＣＩ（登録商標）ＧＥＬ ＰＡＣＫＥＤ ＣＯＬＵＭＮ ＣＲＳ１０Ｗ（４．６×５０ｍｍ）（三菱化学株式会社）、溶離液は ０．２ｍＭ 硫酸銅（ＩＩ）（和光純薬工業株式会社）：アセトニトリル＝８５：１５を使用した。流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は２５℃、分析時間は３０分間、検出は２５４ｎｍで行った。このとき標品はＲ−２−クロロマンデル酸（東京化成工業株式会社）を使用した。
【００５６】
活性測定し、活性画分を集め、塩化ナトリウムの濃度が１Ｍになるように、２Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳを加えた。 １Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳで平衡化した３０ｍＬのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に酵素溶液Ｄをアプライし、９０ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳを加えた後、９０ｍＬの０．１Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳを加えた。溶出はグラジエントで行った。グラジエントは０．１Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳから２５ｍＭ ＭＥＳ−ＯＳまでの濃度で行い、溶出液は１２０ｍＬ使用した。溶出液を１ｍＬずつ分取し、活性測定を行った。
【００５７】
活性測定の反応は１００ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、０．０５％ ＣＭＭ、及び分取した酵素溶液を含む反応液を３０分間、３０℃で２００ｒｐｍの振盪で行った。振盪後、１０％ 過塩素酸を加えることにより反応を停止した。酵素反応した溶液の加水分解反応の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（４．６×７５ｍｍ）、溶離液は ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝７５：２５を使用した。流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は４０℃、分析時間は１０分間、検出は２５４ｎｍで行った。また、酵素反応した溶液の光学純度の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＭＣＩ（登録商標）ＧＥＬ ＰＡＣＫＥＤ ＣＯＬＵＭＮ ＣＲＳ１０Ｗ（４．６×５０ｍｍ）、溶離液は ０．２ｍＭ 硫酸銅（ＩＩ）：アセトニトリル＝８５：１５を使用した。流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は２５℃、分析時間は３０分間、検出は２５４ｎｍで行った。このとき標品はＲ−２−クロロマンデル酸を使用した。
【００５８】
活性測定し、活性画分を集め、ＶＩＶＡＳＰＩＮ ６（ＭＷＣＯ：１００００）（家田貿易株式会社）を用いて、濃縮を行った。その酵素溶液をスペクトラ／ポア（登録商標）メンブレン ＭＷＣＯ：１２０００−１４０００（フナコシ株式会社）を用いて、２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）（和光純薬工業株式会社）に対して４℃で透析を行った（酵素溶液Ｐ）。AKTAexplorer 10S（アマシャム ファルマシア バイオテク株式会社）を使用して、２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＳＯＵＲＣＥ（ＴＭ）１５Ｓ ＰＥ ４．６／１００（アマシャム ファルマシア バイオテク株式会社）に酵素溶液Ｐをアプライし、５ｍＬの２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で溶出した後、ＶＩＶＡＳＰＩＮ（ＭＷＣＯ：１００００）を用いて濃縮を行った（酵素溶液Ｓ）。
【００５９】
AKTAexplorer 10Sを使用して、２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（リン酸水素２ナトリウム１２水和物（関東化学株式会社）とリン酸２水素ナトリウム２水和物（関東化学株式会社）を用いて調製）で平衡化したＨｉＬｏａｄ（登録商標）１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（ＴＭ） ２００ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（アマシャム ファルマシア バイオテク株式会社）に酵素溶液Ｓをアプライし、１６０ｍＬの２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて溶出した。１ｍＬずつ分取し、活性測定を行った。
【００６０】
活性測定の反応は１００ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、０．０５％ ＣＭＭ、及び分取した酵素溶液を含む反応液を３０分間、３０℃で２００ｒｐｍの振盪で行った。 振盪後、１０％ 過塩素酸を加えることにより反応を停止した。酵素反応した溶液の加水分解反応の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（４．６×７５ｍｍ）、溶離液は ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝７５：２５を使用した。 流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は４０℃、分析時間は１０分間、検出は２５４ｎｍで行った。また、酵素反応した溶液の光学純度の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＭＣＩ（登録商標）ＧＥＬ ＰＡＣＫＥＤ ＣＯＬＵＭＮ ＣＲＳ１０Ｗ（４．６×５０ｍｍ）、溶離液は ０．２ｍＭ 硫酸銅（ＩＩ）：アセトニトリル＝８５：１５を使用した。 流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は２５℃、分析時間は３０分間、検出は２５４ｎｍで行った。このとき標品はＲ−２−クロロマンデル酸を使用した。活性を確認できた画分を精製酵素溶液とした。
精製酵素溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。０．１％ ドデシル硫酸ナトリウムを含む１２％ポリアクリルアミドゲルに精製酵素溶液をアプライした。電気泳動した結果、約４２ｋＤａの位置に単一のバンドを確認した。このときサイズマーカーはＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を使用した。
【００６１】
（遺伝子取得）
１．５ｍＬの精製酵素を凍結乾燥し、２ｍＬの５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）（和光純薬工業株式会社）を加えた。さらに、１１μＬの３０ｎｍｏｌ／ｍＬ リシルエンドペプチターゼ（登録商標）、アクロモバクター属菌Ｍ４９７−１由来（和光純薬工業株式会社）を加えた後、３７℃で６時間静置した（酵素溶液Ｌ）。
【００６２】
AKTAexplorer 10Sを使用して、０．１％ トリフルオロ酢酸（和光純薬工業株式会社）で平衡化したＳｅｐｈａｓｉｌ（登録商標）ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃ１８ ５μ ＳＴ ４．６／１００（アマシャム ファルマシア バイオテク株式会社）に酵素溶液Ｌをアプライし、０．１％トリフルオロ酢酸から８０％アセトニトリルを含む０．１％トリフルオロ酢酸のグラジエントで溶出した。溶出液は７０ｍＬ使用し、１ｍＬずつ分取した。
【００６３】
分取した各々のサンプルを全自動タンパク質一次構造分析装置 ＰＰＳＱ−２１Ａ（株式会社 島津製作所）に供したところ、アミノ酸配列「ＴＶＶＤＩＷＧＧＷＡＤＥＥＨＴＱＰＰＴＲ」を得た。このアミノ酸配列をＤＮＡＳＩＳ（登録商標）Ｐｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．９（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社）を用いてＢｌａｓｔ検索を行ったところＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＭＡ−４６８０のｐｕｔａｔｉｖｅ ｅｓｔｅｒａｓｅ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿８２２４７９．１）と７１％の相同性があった。そこで、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＭＡ−４６８０のｐｕｔａｔｉｖｅ ｅｓｔｅｒａｓｅのアミノ酸配列のうち、「ＹＷＰＥＦＡＡＡＧＫ」を基にプライマー Ｅｓｔｅｒ Ｆ１００ａａ「５'ＴＡＹＴＧＧＣＣＮＧＡＲＴＴＹＧＳＮＧＣＮＧＣＮＧＧＮＡＡ」を作製した（北海道システム・サイエンス株式会社）。また、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＭＡ−４６８０のｐｕｔａｔｉｖｅ ｅｓｔｅｒａｓｅのアミノ酸配列のうち「ＬＡＤＲＧＬＬＤＦＤＡＰＶＡＡＹＷＰＥＦＡＡＡＧＫＥＳＶＬＶＲＨＬＬＳＨＲＡＧＬ」とＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのｕｎｎａｍｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔ（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡＥ６６２１２）をＤＮＡＳＩＳ（登録商標）Ｐｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．９を用いて相同性検索を行ったところ、７５％の相同性があった。そこで、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのｕｎｎａｍｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔのアミノ酸配列のうち「ＦＷＧＧＷＧＧＳＦＡ」を基にプライマー Ｌａｃｔａｍ Ｒ３３０ａａ「 ５’ＧＣＲＡＡＮＳＷＮＣＣＮＣＣＣＣＡＮＣＣＮＣＣＣＣＡＲＡＡ」を作製した（北海道システム・サイエンス株式会社）。なお配列表中の略号は次の核酸塩基を示す。
Ｎ：Ｇ（グアニン）とＡ（アデニン）とＴ（チミン）とＣ（シトシン）
Ｗ：Ａ（アデニン）とＴ（チミン）
Ｙ：Ｃ（シトシン）とＴ（チミン）
Ｒ：Ａ（アデニン）とＧ（グアニン）
Ｓ：Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）
【００６４】
Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ ＮＢＲＣ ６８５７（独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ） 郵便番号２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８より分譲）を５ｍＬのＧＰＹ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間、振盪培養を行った。培養液からゲノムＤＮＡの取得を行った。ゲノムＤＮＡの取得はＧｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｂｕｆｆｅｒ ｓｅｔ（株式会社キアゲン）及びＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｎｏｍｉｃ―ｔｉｐ ５００／Ｇ（株式会社キアゲン）を用いた。取得したゲノムＤＮＡを鋳型としてＫＯＤ ―ｐｌｕｓ―（東洋紡績株式会社）を用いてＰＣＲを行った。 プライマーはＥｓｔｅｒ Ｆ１００ａａとＬａｃｔａｍ Ｒ３３０ａａを使用し、ＫＯＤ ―ｐｌｕｓ―の説明書に従いＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を １．５％アガロースゲル（ナカライテスク株式会社）を用いてアガロース電気泳動に供したところ、約０．８ｋｂｐのバンドを確認した。このときサイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ（登録商標）λ／ＥｃｏＲ Ｉ ＋ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔ（東洋紡績株式会社）を使用した。
【００６５】
約０．８ｋｂｐのバンドをＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｆｒｅｅｚｅ’Ｎ Ｓｑｕｅｅｚｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を用いて精製し、このＤＮＡとＨｉｎｃ ＩＩ（東洋紡績株式会社）で消化したｐＵＣ１８（タカラバイオ株式会社）を混合した溶液をＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績株式会社）を用いてライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡをＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９（東洋紡績株式会社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム（和光純薬工業株式会社）を含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン（和光純薬工業株式会社）、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム（和光純薬工業株式会社）、２％アガー（和光純薬工業株式会社）、ｐＨ ７．２）で生育したコロニーを５ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ液体培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、ｐＨ ７．２）に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩、振盪培養を行った。ＬａｂｏＰａｓｓ（登録商標）Ｍｉｎｉ（北海道システム・サイエンス株式会社）を用いて、その培養液からプラスミドを精製した。ｐＵＣ１８にインサートＤＮＡが挿入したプラスミドをスクリーニングするために 精製したＤＮＡを０．８％ アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供した。
【００６６】
インサートＤＮＡの塩基配列の解読はプライマーウォーキング法で行った。塩基配列解読にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ＮＴ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）とＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を使用した。
【００６７】
塩基配列を解読した結果、酵素のオープン リーディング フレーム（ｏｒｆ）の一部であることが推定された。そこで、全長ｏｒｆの塩基配列を取得するために、解読したインサートＤＮＡの塩基配列を基にプライマー ｐＥＣＭ―Ｇ２８Ｐ８Ｒ３００ 「５'ＣＧＴＧＴＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＣＧＧＣＴＧＧ」（北海道システム・サイエンス株式会社）、プライマー ｐＥＣＭ―Ｇ２８Ｐ８Ｒ２５０ 「５'ＧＴＧＧＴＣＴＧＧＣＧＡＧＡＧＴＧＴＴＧＴＣＴＡＣＣＧＴＣ」（北海道システム・サイエンス株式会社）、プライマー ｐＥＣＭ―Ｇ２８Ｐ７Ｒ２７０ 「５'ＣＣＴＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＣＴＡＴＣＴＣＧＴＣＧＣＧＣＡＣ」（北海道システム・サイエンス株式会社）、及びプライマー ｐＥＣＭ―Ｇ２８Ｐ７Ｒ２３０ 「５'ＧＣＴＴＣＡＴＧＧＧＣＴＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＣＧＴＣＡＣＧ」（北海道システム・サイエンス株式会社）を作製した。
【００６８】
目的酵素のＣ末端をコードする塩基配列の取得を行った。ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ（登録商標）ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を使用し、その説明書に従い、プライマー ｐＥＣＭ−Ｇ２８Ｐ８Ｒ３００、プライマー ｐＥＣＭ−Ｇ２８Ｐ８Ｒ２５０、及びＰｓｔ Ｉ（東洋紡績株式会社）で消化したゲノムＤＮＡ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ ＮＢＲＣ ６８５７より精製）を使用した。得られたＤＮＡ産物を０．８％ アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供し（サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ（登録商標）λ／ＥｃｏＲ Ｉ ＋ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔを使用）、約２．７ｋｂｐのバンドをＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｆｒｅｅｚｅ’Ｎ Ｓｑｕｅｅｚｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓを用いて精製し、このＤＮＡとＨｉｎｃ ＩＩで消化したｐＵＣ１８を混合した溶液をＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡをＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９を用いて大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地で生育したコロニーを５ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩、振盪培養を行った。ＬａｂｏＰａｓｓ（登録商標）Ｍｉｎｉを用いて、その培養液からプラスミドを精製した。ｐＵＣ１８にインサートＤＮＡが挿入したプラスミドをスクリーニングするために精製したＤＮＡを０．８％ アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供した。得られたプラスミドをｐＥＣＭ−Ｇ５１と命名した。
【００６９】
インサートＤＮＡの塩基配列の解読はプライマーウォーキング法で行った。塩基配列解読にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ＮＴ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒとＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを使用し、目的酵素のＣ末端の塩基配列を得た。
【００７０】
次に、目的酵素のＮ末端をコードする塩基配列の取得を行った。ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ（登録商標）ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用し、その説明書に従い、プライマー ｐＥＣＭ−Ｇ２８Ｐ７Ｒ２３０、プライマー ｐＥＣＭ−Ｇ２８Ｐ７Ｒ２７０、及びＳａｌ Ｉ（東洋紡績株式会社）で消化したゲノムＤＮＡ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ ＮＢＲＣ ６８５７より精製）を使用した。得られたＤＮＡ産物を１．５％ アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供し（サイズマーカーはＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒ（２００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ）（東洋紡績株式会社）を使用）、約０．３ｋｂｐのバンドをＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｆｒｅｅｚｅ’Ｎ Ｓｑｕｅｅｚｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓを用いて精製し、このＤＮＡとＨｉｎｃ ＩＩで消化したｐＵＣ１８を混合した溶液をＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。
【００７１】
ライゲーションしたＤＮＡをＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９を用いて大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地で生育したコロニーを５ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩、振盪培養を行った。ＬａｂｏＰａｓｓ（登録商標）Ｍｉｎｉを用いて、その培養液からプラスミドを精製した。ｐＵＣ１８にインサートＤＮＡが挿入したプラスミドをスクリーニングするために精製したＤＮＡを０．８％ アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供した。インサートＤＮＡの塩基配列の解読はプライマーウォーキング法で行った。塩基配列解読にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ＮＴ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒとＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを使用した。
【００７２】
得られた塩基配列を基にプライマー ｐＥＣＭ−Ｇ３１Ｒ７０「５'ＣＴＣＣＡＡＡＴＴＣＴＧＧＣＣＡＧＴＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣ」（北海道システム・サイエンス株式会社）を作製した。ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ（登録商標）ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用し、その説明書に従い、プライマー ｐＥＣＭ−Ｇ２８Ｐ７Ｒ２７０、プライマー ｐＥＣＭ−Ｇ３１Ｒ７０、及びＥｃｏＲ Ｉ（東洋紡績株式会社）で消化したゲノムＤＮＡ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ ＮＢＲＣ ６８５７より精製）を使用した。得られたＤＮＡ産物を０．８％ アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供し（サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ（登録商標）λ／ＥｃｏＲ Ｉ ＋ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔを使用）、約３．２ｋｂｐのバンドをＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｆｒｅｅｚｅ’Ｎ Ｓｑｕｅｅｚｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓを用いて精製し、このＤＮＡとＨｉｎｃ ＩＩで消化したｐＵＣ１８を混合した溶液をＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡをＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９を用いて大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地で生育したコロニーを５ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩、振盪培養を行った。ＬａｂｏＰａｓｓ（登録商標）Ｍｉｎｉを用いて、その培養液からプラスミドを精製した。ｐＵＣ１８にインサートＤＮＡが挿入したプラスミドをスクリーニングするために精製したＤＮＡを０．８％ アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供した。得られたプラスミドをｐＥＣＭ−Ｇ５３と命名した。
【００７３】
インサートＤＮＡの塩基配列の解読はプライマーウォーキング法で行った。塩基配列解読にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ＮＴ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒとＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを使用し、目的酵素のＮ末端の塩基配列を得た。
【００７４】
ｐＥＣＭ−Ｇ５１及びｐＥＣＭ−Ｇ５３より得られた塩基配列を基にプライマー ＣＭＭ Ｆ１Ｓｐ「５'ＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＡＧＣＣＧＡＡＧＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＡＣＣＧＡＡＧ」（北海道システム・サイエンス株式会社）及びプライマー ＣＭＭ Ｒ１１７０Ｂｇｌ(Ｓｔ)「５'ＣＧＴＣＣＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＡＧＴＡＴＣＣＴＴＣ」（北海道システム・サイエンス株式会社）、プライマー ＣＭＭ Ｒ１１５０Ｂｇｌ(Ｆｕ)「５' ＣＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＧＴＡＴＣＣＴＴＣＧＡＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＴＴＧＴＡＡＧＣ」（北海道システム・サイエンス株式会社）を作製した。Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ ＮＢＲＣ ６８５７より精製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＫＯＤ ―ｐｌｕｓ―（東洋紡績株式会社）を用いてＰＣＲを行った。 プライマーはＣＭＭ Ｆ１ＳｐとＣＭＭ Ｒ１１７０Ｂｇｌ(Ｓｔ)、または、ＣＭＭ Ｆ１ＳｐとＣＭＭ Ｒ１１５０Ｂｇｌ(Ｆｕ)を使用し、ＫＯＤ ―ｐｌｕｓ―の説明書に従いＰＣＲを行った。
【００７５】
ＰＣＲ産物をＳｐｈ Ｉ（東洋紡績株式会社）およびＢｇｌ ＩＩ（東洋紡績株式会社）で消化し、０．８％アガロースゲルを用いてアガロース電気泳動に供したところ、それぞれ約１．２ｋｂｐのバンドを確認した。このときサイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ（登録商標）λ／ＥｃｏＲ Ｉ ＋ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔ（東洋紡績株式会社）を使用した。約１．２ｋｂｐの各々のバンドをＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｆｒｅｅｚｅ’Ｎ Ｓｑｕｅｅｚｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を用いて精製した（Ｇ６５インサートＤＮＡ断片またはＧ６４インサートＤＮＡ断片）。また、ｐＱＥ−７０（株式会社キアゲン）をＳｐｈ Ｉ及びＢｇｌ ＩＩで消化し、０．８％アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供して確認された約３．４ｋｂｐのバンドをＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｆｒｅｅｚｅ’Ｎ Ｓｑｕｅｅｚｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓを用いて精製した。このときサイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ（登録商標）λ／ＥｃｏＲ Ｉ ＋ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔを使用した。
【００７６】
この精製したｐＱＥ−７０のＤＮＡ断片とＧ６５インサートＤＮＡ断片、またはこの精製したｐＱＥ−７０のＤＮＡ断片とＧ６４インサートＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈを用いてライゲーションし、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９を用いて大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地で生育したコロニーを５ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ液体培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩、振盪培養を行った。ＬａｂｏＰａｓｓ（登録商標）Ｍｉｎｉを用いて、その培養液からプラスミドを精製した。ｐＱＥ７０にインサートＤＮＡ断片が挿入したプラスミドをスクリーニングするために 精製したＤＮＡを０．８％ アガロースゲルを用いたアガロース電気泳動に供した。得られたプラスミドをそれぞれｐＥＣＭ−Ｇ６５またはｐＥＣＭ−Ｇ６４と命名した。
【００７７】
ｐＥＣＭ−Ｇ６５のインサートＤＮＡの塩基配列の解読はプライマーウォーキング法で行った。塩基配列解読にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ＮＴ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒとＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを使用し、インサートＤＮＡの塩基配列を得た。
【００７８】
ｐＥＣＭ−Ｇ５３とｐＥＣＭ−Ｇ６５から得られた塩基配列から目的酵素の遺伝子（ｃｍｍ遺伝子）を取得した（配列表の配列番号２）。また、ｃｍｍ遺伝子がコードしている酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示した。配列番号２に示したｃｍｍ遺伝子配列を基に、ＤＮＡＳＩＳ（登録商標）Ｐｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．９を使用して相同性検索を行った。相同性検索を行った結果、相同性が高かった上位の２つの配列について、再度、ＤＮＡＳＩＳ（登録商標）Ｐｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．９を使用して相同性を解析したところ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ ｓｔｒａｉｎ ＳＣ1（遺伝子 ＩＤ：ＡＹ０５２６３０）との相同性は６２．７５％、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｗｉｔｔｉｃｈｉｉ ＲＷ１（遺伝子 ＩＤ：ＣＰ０００６９９）との相同性は５８．４６％の相同性であった。
【００７９】
また、ｃｍｍ遺伝子はカルボキシルエステルを加水分解する酵素であるが、カルボキシルエステルを分解する酵素はカルボキシルエステラーゼとして知られている。カルボキシルエステラーゼとしては国際公開ＷＯ２００７／１２８４９６で報告されているが、記載されている塩基配列とｃｍｍ遺伝子の相同性についてＤＮＡＳＩＳ（登録商標）Ｐｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．９を使用して解析した。国際公開ＷＯ２００７／１２８４９６に記載されている配列の中で最も相同性の高かった配列はｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｇｅｎｅ Ｅｓｔ１の遺伝子配列であるＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であった。
【００８０】
ＤＮＡＳＩＳ（登録商標）Ｐｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．９を使用して、ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｇｅｎｅ Ｅｓｔ１の遺伝子配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１とｃｍｍ遺伝子の相同性検索を行ったところ６６．１９％であった。また、ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｇｅｎｅ Ｅｓｔ１の遺伝子配列 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１とＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ ｓｔｒａｉｎ ＳＣ1（遺伝子 ＩＤ：ＡＹ０５２６３０）との相同性は６８．４７％であった。一方、国際公開ＷＯ２００７／１２８４９６に記載されているｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｇｅｎｅ Ｅｓｔ１の遺伝子配列 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１とＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ ｓｔｒａｉｎ ＳＣ1（遺伝子 ＩＤ：ＡＹ０５２６３０）との相同性は６５．４８３％であった。従って、国際公開ＷＯ２００７／１２８４９６に記載されている方法でｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｇｅｎｅ Ｅｓｔ１の遺伝子配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１とｃｍｍ遺伝子の相同性検索を行った場合の相同性は６５．４８３％未満であることが示唆された。
【００８１】
（目的酵素発現確認および活性測定）
ｐＥＣＭ−Ｇ６５またはｐＥＣＭ−Ｇ６４をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９を用いて大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入し、それぞれ大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６５または大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６４とした。大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６５または大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６４を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地で生育したコロニーを５ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム及び１ｍＭ イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（和光純薬工業株式会社）を含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩、振盪培養を行った。
【００８２】
培養菌体をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。０．１％ ドデシル硫酸ナトリウムを含む１２％ポリアクリルアミドゲルを使用した。電気泳動した結果、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６５および大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６４は大腸菌内で約４２ｋＤａの酵素が過剰発現していることを確認した。このときサイズマーカーはＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ， Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を使用した。ｃｍｍ遺伝子がコードしている目的酵素のサイズは約４２ｋＤａであり、目的酵素が大腸菌内で過剰発現していることが示唆された。また、上記に記載したように精製酵素の分子量は約４２ｋＤａであるため、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ ８１９３から精製した酵素とＥｘｏｐｈｉａｌａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ ＮＢＲＣ ６８５７のｃｍｍ遺伝子がコードしている酵素は同じ性質のものであることが示唆された。
【００８３】
また、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６４をＣ−Ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｐＱＥ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｅｔ（株式会社キアゲン）を使用し、Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｐＱＥ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｅｔの説明書に従い、ｃｍｍ遺伝子がコードしている酵素を精製した（酵素溶液Ｎ）。酵素溶液ＮをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。０．１％ ドデシル硫酸ナトリウムを含む１２％ポリアクリルアミドゲルを使用した。電気泳動した結果、約４２ｋＤａの酵素が精製できたことを確認した。このときサイズマーカーはＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅを使用した。
【００８４】
酵素溶液Ｎの活性測定を行った。活性測定の反応は１００ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、０．０５％ ＣＭＭ、及び酵素溶液Ｎを含む反応液を３０分間、３０℃で２００ｒｐｍの振盪で行った。 振盪後、１０％ 過塩素酸を加えることにより反応を停止した。酵素反応した溶液の加水分解反応の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（４．６×７５ｍｍ）、溶離液は ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝７５：２５を使用した。 流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は４０℃、分析時間は１０分間、検出は２５４ｎｍで行った。また、酵素反応した溶液の光学純度の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＭＣＩ（登録商標）ＧＥＬ ＰＡＣＫＥＤ ＣＯＬＵＭＮ ＣＲＳ１０Ｗ（４．６×５０ｍｍ）、溶離液は ０．２ｍＭ 硫酸銅（ＩＩ）：アセトニトリル＝８５：１５を使用した。 流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は２５℃、分析時間は３０分間、検出は２５４ｎｍで行った。このとき標品はＲ−２−クロロマンデル酸を使用した。
【００８５】
酵素溶液ＮはＥｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ ８１９３から精製した酵素と同様の活性を有していた。また、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ ８１９３から精製した酵素と同様にＲ−２−クロロマンデル酸メチルエステルの選択性が９９％ｅｅ以上を示したため、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ ８１９３から精製した酵素とｃｍｍ遺伝子がコードしている酵素は同じ性質のものであることが示唆された。
【００８６】
（形質転換体の活性測定）
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６５または大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６４を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地で生育したコロニーを５ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム及び１ｍＭ イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシドを含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩、振盪培養を行った。培養液を１２ｋｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した後０．９％ 塩化ナトリウム水溶液に懸濁し、その懸濁液の一部、１０％ エタノール（和光純薬工業株式会社）、５０ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）及び１％ ＣＭＭを含む反応液で反応を行った。反応は２００ｒｐｍ、３０℃で３０分間行い、１０％ 過塩素酸を加えることにより反応を停止した。
【００８７】
反応終了液の加水分解反応の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（４．６×７５ｍｍ）、溶離液は ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝７５：２５を使用した。 流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は４０℃、分析時間は１０分間、検出は２５４ｎｍで行った。また、反応した溶液の光学純度の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＭＣＩ（登録商標）ＧＥＬ ＰＡＣＫＥＤ ＣＯＬＵＭＮ ＣＲＳ１０Ｗ（４．６×５０ｍｍ）、溶離液は ０．２ｍＭ 硫酸銅（ＩＩ）：アセトニトリル＝８５：１５を使用した。流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は２５℃、分析時間は３０分間、検出は２５４ｎｍで行った。このとき標品はＲ−２−クロロマンデル酸を使用した。１分間にＲ−２−クロロマンデル酸を１μｍｏｌ生成する活性を１Ｕとした。反応液を分析した結果、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６５及び大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６４の活性は培養液１ｍＬあたり２１Ｕであり同じ活性を示した。この大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６５の活性と５ｍＬのＧＰＹ液体培地で培養しＥｘｏｐｈｉａｌａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ ＮＢＲＣ ６８５７の活性と比較したところ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６５の活性は５５２倍高い活性であった。
【００８８】
光学純度に関してはＥｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ ８１９３から精製した酵素、５ｍＬのＧＰＹ液体培地で培養したＥｘｏｐｈｉａｌａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ ＮＢＲＣ ６８５７の培養菌体、ｃｍｍ遺伝子を過剰発現した大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６５及び大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６４の培養菌体はすべてＲ−２−クロロマンデル酸メチルエステルの選択性が９９％ｅｅ以上を示したため、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ ８１９３から精製した酵素とｃｍｍ遺伝子がコードしている酵素は同じ性質のものであることが示唆された。
【００８９】
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＥＣＭ−Ｇ６５を１００ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム及び１ｍＭ イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシドを含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃、２００ｒｐｍで１２時間、フラスコ振盪培養を行った。培養液を１２ｋｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した後１００ｍＬの０．９％ 塩化ナトリウム水溶液に懸濁し、５ｍＬを恒温槽に設置した４口フラスコに投入し、０．９％塩化ナトリウム水溶液８５ｍＬを加えた。撹拌下、徐々に１０ｇのＣＭＭを投入した。その４口フラスコを３０℃に維持し、ｐＨは２８％ＮａＯＨにて調整した。２４時間後、溶液をＨＰＬＣに供した。Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（４．６×７５ｍｍ）、溶離液は ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝７５：２５を使用した。流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は４０℃、分析時間は１０分間、検出は２５４ｎｍで行った。
【００９０】
反応した溶液の光学純度の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＭＣＩ（登録商標）ＧＥＬ ＰＡＣＫＥＤ ＣＯＬＵＭＮ ＣＲＳ１０Ｗ（４．６×５０ｍｍ）、溶離液は０．２ｍＭ 硫酸銅（ＩＩ）：アセトニトリル＝８５：１５を使用した。 流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は２５℃、分析時間は３０分間、検出は２５４ｎｍで行った。このとき標品はＲ−２−クロロマンデル酸を使用した。１分間にＲ−２−クロロマンデル酸を１μｍｏｌ生成する活性を１Ｕとした。反応液を分析した結果、精製した２−クロロマンデル酸はＲ体であり、光学純度は９４．５％ｅｅであった。
【００９１】
（基質特異性）
Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ ８１９３由来精製酵素の基質特異性を調べるために、以下のように基質を合成した。
メタノールを使用して３−クロロマンデル酸（和光純薬工業株式会社）または、フェニル乳酸（和光純薬工業株式会社）、アトロラクチン酸（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）、４−クロロマンデル酸（和光純薬工業株式会社）、４−メトキシマンデル酸（和光純薬工業株式会社）をエステル化し、３−クロロマンデル酸メチルエステルまたは、フェニル乳酸メチルエステル、アトロラクチン酸メチルエステル、４−クロロマンデル酸メチルエステル、４−メトキシマンデル酸メチルエステルを合成した。
エタノール（和光純薬工業株式会社）を使用して２−クロロマンデル酸をエステル化し、２−クロロマンデル酸エチルエステルを合成した。
イソプロパノール（東京化成工業株式会社）を使用して、２−クロロマンデル酸をエステル化し、２−クロロマンデル酸イソプロピルエステルを合成した。
ベンジルアルコール（東京化成工業株式会社）を使用して、２−クロロマンデル酸をエステル化し、２−クロロマンデル酸ベンジルエステルを合成した。
【００９２】
基質特異性を解析するための活性測定の反応は１００ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、０．２％ 酵素溶液Ｓを含む溶液に０．０５％ ＣＭＭまたは、３−クロロマンデル酸メチルエステル、フェニル乳酸メチルエステル、アトロラクチン酸メチルエステル、マンデル酸メチルエステル（関東化学株式会社）、２−クロロマンデル酸エチルエステル、２−クロロマンデル酸イソプロピルエステル、２−クロロマンデル酸ベンジルエステル、４−クロロマンデル酸メチルエステル、４−メトキシマンデル酸メチルエステルを加え３０℃で３０分間２００ｒｐｍの振盪で行った。振盪後、１０％ 過塩素酸を加えることにより反応を停止した。
【００９３】
酵素反応した溶液の加水分解反応の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−３（４．６×７５ｍｍ）を使用した。ＣＭＭまたは、３−クロロマンデル酸メチルエステル、フェニル乳酸メチルエステル、アトロラクチン酸メチルエステル、マンデル酸メチルエステル、２−クロロマンデル酸エチルエステル、２−クロロマンデル酸イソプロピルエステル、２−クロロマンデル酸ベンジルエステル、４−クロロマンデル酸メチルエステル、４−メトキシマンデル酸メチルエステルを基質とした場合は、溶離液は ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝７５：２５を使用し、流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は４０℃、分析時間は２０分間、検出は２５４ｎｍで行い、ＤＬ−２−ヒドロキシ酪酸メチルエステルまたは、乳酸メチルエステルを基質とした場合は、溶離液は ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝９０：１０を使用し、流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は４０℃、分析時間は２０分間、検出は２５４ｎｍで行った。
【００９４】
酵素反応した溶液の光学純度の測定はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓを使用した。３−クロロマンデル酸メチルエステルまたは、フェニル乳酸メチルエステル、アトロラクチン酸メチルエステル、マンデル酸メチルエステル、２−クロロマンデル酸エチルエステル、２−クロロマンデル酸イソプロピルエステル、２−クロロマンデル酸ベンジルエステル、４−クロロマンデル酸メチルエステル、４−メトキシマンデル酸メチルエステルを基質とした場合は、カラムはＭＣＩ（登録商標）ＧＥＬ ＰＡＣＫＥＤ ＣＯＬＵＭＮ ＣＲＳ１０Ｗ（４．６×５０ｍｍ）、溶離液は ０．２ｍＭ 硫酸銅（ＩＩ）：アセトニトリル＝８５：１５を使用し、流速は２．０ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は２５℃、分析時間は１２０分間、検出は２５４ｎｍで行った。２−ヒドロキシ−ｎ−オクタン酸メチルエステルを基質とした場合は、カラムはＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ−ＲＨ（和光純薬工業株式会社）、溶離液は ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝６０：４０を使用し、流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度は２５℃、分析時間は２０分間、検出は２５４ｎｍで行った。活性測定した結果、すべての化合物について反応が進行することが確認された。ＣＭＭを基質とした場合の活性を基準とした場合の相対活性および光学活性選択性を表１に示した。
【００９５】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式(I)：
【化１】
〔式中、Ａは５員又は６員の環状化合物の残基を示し、該環状化合物は芳香族化合物、部分飽和環状化合物、又は飽和環状化合物から選択され、環構成原子として１個以上のヘテロ原子を有していてもよく、環上には置換基を有していてもよく（該置換基はハロゲン原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜４個のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜４個のアルキルオキシ基、及び保護基で保護されていてもよい水酸基、保護基で保護されていてもよいアミノ基、ニトロ基からなる群から選ばれる１又は２個以上の置換基であり、２個以上の置換基が存在する場合にはそれらは同一でも異なっていてもよく、２個以上の置換基が存在する場合にはそれらが結合して環を形成してもよい）、Ｘは水素原子又は炭素数１〜４個のアルキル基を示し、Ｒは炭素数１〜４個のアルキル基（該アルキル基はアリール基で置換されていてもよい）を示し、ただし、一般式(I)で表される化合物は＊＊で示される炭素原子について光学的に純粋ではない〕
で表される化合物を加水分解して下記の一般式(II)：
【化２】
〔式中、Ａ及びＸは上記定義と同義であり、＊はＳ又はＲのいずれかの立体配置を有する炭素原子を示す〕で表される化合物を製造することができる酵素。
【請求項２】
請求項１に記載の酵素であって、
(a)配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
(b)配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質
からなる酵素。
【請求項３】
Ａがクロロフェニル基であり、Ｒが炭素数１〜４個のアルキル基又はベンジル基であり、Ｘが水素原子であり、＊で表される炭素原子がＲ配置である化合物を製造することができる請求項１又は２に記載の酵素。
【請求項４】
エクソフィアラ・デルマチチジス(Exophiala dermatitidis)またはエクソフィアラ・ジーンセルメイ(Exophiala jeanselmei)由来の請求項１ないし３のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項５】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有するタンパク質からなる請求項２又は３に記載の酵素。
【請求項６】
請求項２又は５のいずれか１項に記載の酵素をコードする核酸。
【請求項７】
請求項２に記載の(a)に記載のアミノ酸配列をコードする請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
配列表の配列番号２に記載された塩基配列を含む請求項６に記載の核酸。
【請求項９】
配列表の配列番号２に記載された塩基配列と80%以上の相同性を有する塩基配列を含む請求項６に記載の核酸。
【請求項１０】
配列表の配列番号２に記載された塩基配列により特定される核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする請求項６に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項６ないし１０のいずれか１項に記載の核酸を含む組み換えベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
【請求項１３】
請求項１２に記載の形質転換体を培養し、得られた培養物から上記酵素を分離採取する工程を含む請求項１ないし５のいずれか１項に記載の酵素の製造方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の一般式(II)で表される化合物の製造方法であって、請求項１に記載の一般式(I)で表される化合物を請求項１ないし５のいずれか１項に記載の酵素および／または請求項１３に記載の形質転換体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物により不斉加水分解する工程を含む方法。
【請求項１】
下記の一般式(I)：
【化１】
〔式中、Ａは５員又は６員の環状化合物の残基を示し、該環状化合物は芳香族化合物、部分飽和環状化合物、又は飽和環状化合物から選択され、環構成原子として１個以上のヘテロ原子を有していてもよく、環上には置換基を有していてもよく（該置換基はハロゲン原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜４個のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜４個のアルキルオキシ基、及び保護基で保護されていてもよい水酸基、保護基で保護されていてもよいアミノ基、ニトロ基からなる群から選ばれる１又は２個以上の置換基であり、２個以上の置換基が存在する場合にはそれらは同一でも異なっていてもよく、２個以上の置換基が存在する場合にはそれらが結合して環を形成してもよい）、Ｘは水素原子又は炭素数１〜４個のアルキル基を示し、Ｒは炭素数１〜４個のアルキル基（該アルキル基はアリール基で置換されていてもよい）を示し、ただし、一般式(I)で表される化合物は＊＊で示される炭素原子について光学的に純粋ではない〕
で表される化合物を加水分解して下記の一般式(II)：
【化２】
〔式中、Ａ及びＸは上記定義と同義であり、＊はＳ又はＲのいずれかの立体配置を有する炭素原子を示す〕で表される化合物を製造することができる酵素。
【請求項２】
請求項１に記載の酵素であって、
(a)配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
(b)配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質
からなる酵素。
【請求項３】
Ａがクロロフェニル基であり、Ｒが炭素数１〜４個のアルキル基又はベンジル基であり、Ｘが水素原子であり、＊で表される炭素原子がＲ配置である化合物を製造することができる請求項１又は２に記載の酵素。
【請求項４】
エクソフィアラ・デルマチチジス(Exophiala dermatitidis)またはエクソフィアラ・ジーンセルメイ(Exophiala jeanselmei)由来の請求項１ないし３のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項５】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有するタンパク質からなる請求項２又は３に記載の酵素。
【請求項６】
請求項２又は５のいずれか１項に記載の酵素をコードする核酸。
【請求項７】
請求項２に記載の(a)に記載のアミノ酸配列をコードする請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
配列表の配列番号２に記載された塩基配列を含む請求項６に記載の核酸。
【請求項９】
配列表の配列番号２に記載された塩基配列と80%以上の相同性を有する塩基配列を含む請求項６に記載の核酸。
【請求項１０】
配列表の配列番号２に記載された塩基配列により特定される核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする請求項６に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項６ないし１０のいずれか１項に記載の核酸を含む組み換えベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
【請求項１３】
請求項１２に記載の形質転換体を培養し、得られた培養物から上記酵素を分離採取する工程を含む請求項１ないし５のいずれか１項に記載の酵素の製造方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の一般式(II)で表される化合物の製造方法であって、請求項１に記載の一般式(I)で表される化合物を請求項１ないし５のいずれか１項に記載の酵素および／または請求項１３に記載の形質転換体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物により不斉加水分解する工程を含む方法。
【公開番号】特開２００９−２３２６９３（Ｐ２００９−２３２６９３Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−７９５１４（Ｐ２００８−７９５１４）
【出願日】平成２０年３月２６日（２００８．３．２６）
【出願人】（３９００１０２０５）第一ファインケミカル株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２６日（２００８．３．２６）
【出願人】（３９００１０２０５）第一ファインケミカル株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
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