新規植物ウイルス粒子及びその不活性化の方法
本発明は一般に、ワクチン等としての使用のための、植物によって生産される植物ウイルスに関する。より詳細には、本発明は、簡単な不活性化方法及びそれによって得られる植物ウイルス粒子に関する。本明細書で述べる本発明は、不活性化植物ウイルス様粒子の表面での病原体由来エピトープのエピトープ提示に基づく安全なワクチンを生産するための手段及び方法を提供する。本発明は、キメラ植物ウイルス粒子の不活性化及びウイルス粒子精製手順への不活性化工程の組込みを教示する。不活性化方法は、ウイルスを植物に感染することができないようにし、ウイルス粒子の完全性は保持される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、一部が、国立衛生研究所によって授与された認可番号１Ｕ０１ＡＩ０５４６４１−０１の下での政府援助を得て為された。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の交差参照
本出願は、開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００５年１２月２日出願の米国特許仮出願第６０／７４２，１９７号の優先権を主張する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般に、ワクチン等としての使用のための、植物によって生産される植物ウイルスに関する。より詳細には、本発明は、ウイルス不活性化方法及びワクチン等としての植物ウイルス粒子に関する。
【０００４】
発明の背景
ワクチン接種は、個体及び個体群全体を感染因子から保護する。安全で有効なワクチンを開発することは、しかしながら、有効な抗原の同定から開発されたワクチンに関する安全上の懸念にまで及ぶ多くの理由から、必ずしも容易ではない。外来性ペプチドの担体としてのウイルスの使用は、複合ウイルスワクチンの分野で研究されてきた。そのようなワクチンは、異なる動物ウイルス成分の雑種である、キメラウイルスに基づく。通常そのような雑種の主要成分は、無害であるか又は無害にしたウイルスに由来し、重要でない少量の成分は、病原性ウイルスの選択された抗原成分である。例えばワクシニアなどのポックスウイルス又は弱毒化ポリオウイルスは、ヒトウイルスを含む他の動物ウイルスの免疫原性成分のためのベクターとして使用され得る。
【０００５】
しかし、上述したような手法は不都合であり得る。そのようなワクチンは細胞培養系で増殖されたウイルスから生産され、細胞培養系は、設計し、実施するのに費用がかかり得る。複合ウイルスアプローチは、突然変異が変化した感染性、抗原性及び／又は病原性を有する新規形態のウイルスを生じさせ得る危険性を伴う、動物感染性生存ウイルスの遺伝子操作を含む。加えて、ベクターとして使用される動物ウイルスは、動物が既に暴露された可能性があるウイルスであり得、動物が既にそのベクターに対する抗体を産生している可能性がある。従ってベクターは、２番目のウイルスの組み込まれた抗原部位が免疫応答を誘導する前に免疫系によって破壊され得る。
【０００６】
多くの方法が哺乳動物ウイルス不活性化のために使用されてきた。これらは、ＵＶ照射、ＵＶ／ソラレン照射、Ｐｅｎｔｏｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの化学物質、マイクロ波、ホルマリン、ＢＰＬ、ｐＨ、温度、及び塩化アンモニウム中でのインキュベーションを含む。ＵＶ照射は組換え植物ウイルスを不活性化するために使用されてきた。例えばLangeveld et al. (2001) 「Inactivated Recombinant Plant Virus Protects Dogs from a Lethal Challenge with Canine Parvovirus」, Vaccine 19:3661-3670参照。
【０００７】
粒子を生産する方法及び、特にワクチンとしての、粒子の使用に関する特許は、ウイルスのコートタンパク質の一部として所定の外来性ペプチドを含む植物ウイルスの集合粒子を論じた、米国特許第６，１１０，４６６号及びウイルスのコートタンパク質内に外来性ペプチド挿入物を含有し、挿入部位が、好ましくは挿入物に隣接する直列反復配列を含まない、植物ウイルスの集合粒子を論じている、米国特許第６，８８４，６２３号を含む。
【０００８】
米国特許第５，６０２，２４２号は、異種の、好ましくは桿状コートタンパク質キャプシドへの遺伝子操作されたウイルス配列のキャプシド化のための組換えＲＮＡウイルスに関する。本特許はまた、特に植物において遺伝子型及び表現型変化を生じさせるための植物のトランスフェクションに関して、そのような組換えウイルスを作製し、使用する方法に関する。ウイルスコートタンパク質遺伝子を欠失させる又は不活性化するための手段は、Ahlquist et al. (1981) 「Complete Nucleotide Sequence of Brome Mosaic Virus RNA3」, J. Mol. Biol. 153:23-38に述べられている。
【０００９】
Burge et al., 「Effect of Heat on Virus Inactivation by Ammonia」, Appl. Environ. Microbiology, Aug. 46(2):446-51, 1983は、塩化アンモニウムによるウイルス不活性化への熱の影響を論じている。バクテリオファージｆ２及びポリオウイルス１（エンベロープを持つ哺乳動物ウイルス）が検討された。４０℃以上の温度は、本明細書で試験されたウイルスを損傷することが認められた。Cramer WN, et al. 「Kinetics of virus inactivation by ammonia」, Appl Environ Microbiology, Mar 45(3):760-5, 1983は、Burge et al.と同様に、ウイルスを不活性化する試みにおいて下水を処理するために塩化アンモニウムを様々なｐＨで使用した。やはり、バクテリオファージｆ２及びポリオウイルス１（ＣＨＡＴ菌株）が検討された。それらの試験の結果は、ポリオウイルスの不活性化率はＮＨ4+濃度の作用によって、皆無ではないにせよ、ｆ２の不活性化率が受けるよりもはるかに低い影響しか受けなかったことを示すと報告されている。論文は、特にエンテロウイルス群のメンバーに関して、塩素に代わる可能性のあるものとして廃水処理施設における前記方法論の可能な適用を論じている。
【００１０】
発明の概要
本発明は、不活性化ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成するために８．０を上回るｐＨで植物、植物組織、植物細胞及びプロトプラストからなる群より選択される植物材料に硫酸アンモニウムを投与すること、植物材料を少なくとも１０時間インキュベートすること、及び植物材料から不活性化ＶＬＰを採取することによって植物ウイルスを不活性化するための方法を含む。これらの方法は、ウイルスへの外来性ペプチドの組込みを含み得る。ウイルスは、エンベロープを有さないＲＮＡウイルスであり得る。不活性化ＶＬＰは、異種生物活性ペプチドを提供し得る。硫酸アンモニウムは０．５Ｍ〜１．０Ｍの濃度で、一般に０．７Ｍで投与される。ｐＨは一般に９．０であり、植物材料は室温でインキュベートされ得る。ＶＬＰは、植物ウイルス中に存在するＲＮＡの少なくとも一部を欠くので、非感染性である。加えて、接種後に感染を開始することができず、複製することができない。
【００１１】
本発明はまた、キメラ植物ウイルス粒子の不活性化及びウイルス粒子精製手順への不活性化工程の組込みを含み得る。不活性化方法は、ウイルスを植物に感染することができないようにする。ウイルス粒子の内部に存在する感染性ウイルスゲノムＲＮＡは破壊されるが、ウイルス粒子の完全性は維持される。これらの方法は拡大可能であり、精製工程に組み込むことができる。
【００１２】
本発明はまた、８．０を上回るｐＨで、植物、植物組織、植物細胞及びプロトプラストからなる群より選択され、及び植物ウイルス中に存在するＲＮＡの少なくとも一部を欠く植物材料に硫酸アンモニウムを投与すること、植物材料を少なくとも１０時間インキュベートすること、及び植物材料から、複製することができない不活性化ＶＬＰを採取することによって非感染性ＶＬＰを生産する方法を含む。
【００１３】
加えて、本発明の実施形態はワクチンを含むことができ、前記ワクチンはウイルスを含み、前記ウイルスは組み込まれた外来性ペプチドを含み、前記ワクチンは、不活性化ＶＬＰを生成するために８．０を上回るｐＨで植物、植物組織、植物細胞及びプロトプラストからなる群より選択される植物材料に硫酸アンモニウムを投与すること、植物材料を少なくとも１０時間インキュベートすること、及びその後植物材料から不活性化ＶＬＰを採取することを含む方法によって生産される。提供されるＶＬＰペプチドは、ＶＬＰを哺乳動物に投与したとき免疫応答を惹起することができる。ワクチンは、インフルエンザウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、イヌパルボウイルス又は炭疽菌のために使用できる。加えて、ワクチンは、ペプチドが抗原の部分であり、前記部分がワクチンとして有効であるサブユニットワクチンであり得る。
【００１４】
配列の簡単な説明
配列番号１は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１のペプチド配列である。
配列番号２は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ２のペプチド配列である。
配列番号３は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ３のペプチド配列である。
配列番号４は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ３Ｅのペプチド配列である。
配列番号５は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ４のペプチド配列である。
配列番号６は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ５のペプチド配列である。
配列番号７は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ６のペプチド配列である。
配列番号８は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ７のペプチド配列である。
配列番号９は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ７Ｅのペプチド配列である。
配列番号１０は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ８のペプチド配列である。
配列番号１１は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ９のペプチド配列である。
配列番号１２は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１０のペプチド配列である。
配列番号１３は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１１のペプチド配列である。
配列番号１４は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１２のペプチド配列である。
配列番号１５は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１３のペプチド配列である。
配列番号１６は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１４のペプチド配列である。
配列番号１７は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１５のペプチド配列である。
配列番号１８は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１６のペプチド配列である。
配列番号１９は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１７のペプチド配列である。
配列番号２０は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１８のペプチド配列である。
配列番号２１は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１９のペプチド配列である。
配列番号２２は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ２０のペプチド配列である。
配列番号２３は、本発明の炭疽ワクチンの防御抗原（ＰＡ）のアミノ酸配列である。
配列番号２４は、インフルエンザウイルスエピトープＭ２ｅのアミノ酸配列である。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明の実施形態を示す添付の図面を参照しながら、本発明を以下でより詳細に説明する。本発明は、しかし、多くの異なる形態で具体化でき、本明細書で示す実施形態に限定されると解釈されるべきではない。
【００１６】
本発明は、一部には、ワクチン等としての使用のための新規植物ウイルス様粒子を作製するための新規ウイルス不活性化方法に関する。ウイルス不活性化のための方法を本明細書で述べる。本発明は、キメラ植物ウイルス粒子の不活性化及びウイルス粒子精製手順への不活性化工程の組込みの例を提供する。不活性化方法は、ウイルスを植物に感染することができないようにする。本発明の実施形態は、不活性化植物ウイルス様粒子の表面での病原体由来エピトープのエピトープ提示に基づく安全なワクチンを生産するための手段及び方法を含み得る。
【００１７】
本発明の実施形態は、ウイルスの完全な感染性ゲノムを欠くウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生産するためのウイルスの不活性化についての効率的で拡大可能な手順を含む。そのような実施形態は、初期抽出緩衝液として、一般にｐＨ９で、硫酸アンモニウム緩衝液を使用することを含む。硫酸アンモニウムは非毒性であるとみなされ、規制当局によって許容されている。
【００１８】
本発明の実施形態は、約９．０のｐＨ範囲内の硫酸アンモニウムによるウイルス不活性化を含む。ウイルス不活性化はＲＮＡの切断と分解を通して起こり得る。ウイルス粒子は透過性となり得、アンモニウムイオンのウイルス内への侵入を許容し得る。従って、アンモニウムイオンとのインキュベーションはｐＨ８．０を上回って実施されるべきであり、これは、このｐＨレベルでウイルスは「膨張」してその構造を「開放」し、その結果ウイルスコートを通しての低分子の浸透を許容するからである。
【００１９】
本発明はまた、典型的に結合しているＲＮＡを欠く、新規ＲＮＡウイルス様粒子を提供することができ、前記ウイルス様粒子は適切に提示される抗原を含む。
【００２０】
本発明の実施形態は、他の精製操作と継ぎ目のない方法での粒子の不活性化の組込みのための方法を含む。これらの方法は、植物組織が、ｐＨ９の０．７Ｍ硫酸アンモニウムである抽出緩衝液中で収集され、均質化されて、室温で約２０時間インキュベートされる場合を含み得る。インキュベーション後、粒子はもはや植物に対して感染性ではなく、接種後に感染を開始することができない。ｐＨ７．０の同じ条件はウイルスを不活性化せず、より高い温度、すなわち４０℃はウイルス構造を損傷すると思われた。
【００２１】
付加的な処理工程及びパラメータ
本発明の実施形態はまた、不活性化緩衝液中で植物材料を摩砕／均質化すること、摩砕されたスラリーを、ウイルスゲノムＲＮＡを分解するために不活性化緩衝液中でインキュベートすること、及び生じたウイルス粒子を精製することを含み得る。摩砕された材料は、不活性化緩衝液中でのインキュベーションの前に遠心分離／ろ過によってさらに清澄化することができる。インキュベーション後、粒子を、ＰＥＧによって又は硫酸アンモニウムのモル濃度を、粒子を溶液から沈殿させるレベルまで上昇させることによって沈殿させ得る。通常、不活性化工程に続いて緩衝液交換及びクロマトグラフィー工程を実施する。不活性化工程は、いかなる時点でも精製手順に組み込むことができる。例えば一部の手順では、不活性化を以下のように過程に組み込んだ。０．７Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ７中でのＨＩＣカラムへのＣＰＭＶ結合。０．７Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ９での結合ＣＰＭＶの洗浄。０．７Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ９でのＣＰＭＶの溶出。以下の範囲が使用できる。０．５〜１．０Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、８．０を上回るｐＨ及び１０〜４０℃の温度。
【００２２】
ＶＬＰを作製するために使用できるウイルスの種類と選択
本発明のワクチンは、抗原の形態であり得、エンベロープを有さないＲＮＡウイルス（＋、−及び／又は二本鎖）のコートタンパク質に融合できる。本発明の実施形態は、正二十面体植物ＲＮＡウイルスと共に植物ＲＮＡウイルスを含み得る。本明細書ではササゲモザイクウイルスを例示するが、本発明の方法は他の類似ウイルスにも適用できる。例えば、本発明に従った使用のための、一部の好ましいウイルスは以下の通りである。
【００２３】
【表１】
【００２４】
本発明はいかなるＲＮＡ植物ウイルスにも適用できる。このシステムを明らかにするため、植物ウイルス、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）を選択した。ＣＰＭＶの三次元構造は公知であり、これは、粒子構造の破壊を伴わない修飾に適した部位の同定を可能にする。現在まで、少なくとも９の植物ウイルス属からのウイルス及び３つの亜型２ｓｓＲＮＡサテライトウイルスが、高分解能でそれらの三次及び四次構造が解明されている。これらの一部を上記の表１に列挙する。
【００２５】
ベクターとしての使用のための植物ウイルスの１つの例示的な群は、そのコートタンパク質がβバレル構造を有するものである。βバレル構造を有するウイルスを使用することの利点は、βシートの個々の鎖間のループが外来性ペプチドの挿入のために好都合な部位を提供することである。１又はそれ以上のループの修飾は、本発明に従った外来性ペプチドの発現のための１つの戦略であり得る。コートタンパク質の他の領域への挿入、例えばＮ末端及び／又はＣ末端への挿入も可能である。
【００２６】
その構造が解明されている正二十面体対称性を有するすべての植物ウイルスは、ＣＰＭＶに例示される８本鎖βバレルフォールドに適合し、これがすべての正二十面体ウイルスにおける共通構造である可能性が高い。そのようなウイルスはすべて、β鎖の間のループ及び／又はＮ末端及び／又はＣ末端で起こり得る、外来性ペプチド配列の提示のための本発明における使用に適する。
【００２７】
異種又は外来性配列を挿入するためにＤＮＡ配列を修飾する方法は当分野で周知である。一般にウイルスＲＮＡ配列は、完全長ｃＤＮＡ転写産物に変換し、ベクターにクローニングして、その後外来性ＤＮＡセグメントを、ＲＮＡ複製、粒子形成を破壊することなく、又は感染性を妨げることなくそのような挿入を認容することができる領域に挿入することによって修飾される。
【００２８】
コモウイルスは、主としてマメ科植物に感染する少なくとも１４の植物ウイルスの群である。それらのゲノムは、直径約２８ｎｍの同寸法の粒子内に別々にキャプシド化された、異なる大きさの一本鎖プラス‐センスＲＮＡの２個の分子からなる。２種類のヌクレオタンパク質粒子は、塩化セシウム密度勾配でのそれらの行動の結果として中間（middle:Ｍ）及び底部（bottom:Ｂ）成分と称され、粒子内のＲＮＡはそれぞれＭ及びＢ ＲＮＡとして知られる。どちらの型の粒子も、高分子（ＶＰ３７）及び低分子（ＶＰ２３）コートタンパク質の各々６０コピーからなる同じタンパク質組成物を有する。ヌクレオタンパク質粒子に加えて、コモウイルス試料は、上部（top:Ｔ）成分として知られる可変量の空の（タンパク質のみの）キャプシドを含有する。
【００２９】
コモウイルス群のタイプメンバーであるササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）の場合、Ｍ及びＢ ＲＮＡの両方がポリアデニル化され、それらの５’末端に共有結合された低分子タンパク質（ＶＰｇ）を有することが知られている。他のコモウイルスに関するより限られた試験は、これらの特徴が群のすべてのメンバーのＲＮＡによって共有されることを示唆する。ＣＰＭＶからの両方のＲＮＡが配列決定され、ポリ（Ａ）尾部を除いて、３４８１（Ｍ）及び５８８９（Ｂ）ヌクレオチドからなることが示された（van Wezenbeek et al. 1983; Lomonossoff and Shanks, 1983）。両方のＲＮＡが、１つの長いオープンリーディングフレームを含有する。ウイルス遺伝子産物の発現は、大きな前駆体ポリペプチドの合成とその後の切断を通して起こる。両方のＲＮＡが植物全体の感染のために必要である。より大きなＢ ＲＮＡはプロトプラスト中で独立して複製することができるが、この場合ウイルス粒子は生成されない（Goldbach et al., 1980）。この所見は、より早期の遺伝学的試験と合わせて、コートタンパク質がＭ ＲＮＡによってコードされること、及び感染性ウイルス粒子の形成がＢ及びＭの両方のウイルスゲノムＲＮＡの存在に依存することを確証した。
【００３０】
コモウイルス科の利点は、キャプシドが、個別に操作できる３つの異なるβバレルの各々６０コピーを含有することである。上記に列挙した他のすべてのウイルス科及び属は、類似の三次元構造を有するが、１種類のβバレルを備える。（ＣＰＭＶの場合は、例えば、外来性挿入物は低分子キャプシドタンパク質（ＶＰ２３）のβＢ−βＣループ内のプロリン２３（Ｐｒｏ23）残基の直前に作製できる。米国特許第６，８８４，６２３号参照。
【００３１】
本発明はまた、その結晶構造がまだ決定されていない正二十面体植物ウイルス（βバレル構造を有するものを含有する）にも適用できる。結晶構造が未知のウイルスと結晶構造が公知である第二のウイルスの間でコートタンパク質遺伝子内に有意の配列相同性が存在する場合、一次構造のアラインメントはβ鎖の間のループの位置を推測することを可能にする［Dolja, V. V. and Koonin, E. V. (1991) J. Gen. Virol., 72, pp 1481-1486参照］。加えて、ウイルスが、結晶構造が決定されているウイルスに対してごくわずかなコートタンパク質配列相同性を有する場合、潜在的挿入部位の位置の決定を可能にするために、一次構造アラインメントを適切な二次及び三次構造予測アルゴリズムと共に使用し得る。
【００３２】
ＣＰＭＶ及びインゲンポッドモトルウイルス（bean pod mottle virus）（ＢＰＭＶ）は、ＢＰＭＶとＣＰＭＶの三次元構造が非常に類似し、一般にコモウイルス科に特有であることを示す。
【００３３】
ＣＰＭＶは、２つのサブユニット、低分子（Ｓ）及び高分子（Ｌ）コートタンパク質を含み、ウイルス粒子当たりその各々６０コピーが存在する。外来性ペプチド配列は、Ｌ又はＳタンパク質のいずれかから又は同じビリオン上で両方のコートタンパク質から発現され得る。
【００３４】
ＣＰＭＶは二分節ＲＮＡウイルスである。何らかのＲＮＡウイルスのゲノムを、外来性ペプチドを発現するように操作するために、ＲＮＡのｃＤＮＡクローンが使用できる。両方のＣＰＭＶ ＲＮＡ分子の完全長ｃＤＮＡクローンが使用可能であり、外来性ペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列を挿入するために操作できる。植物ＲＮＡウイルスからのゲノムのｃＤＮＡクローンは、植物に接種したとき感染性であるインビトロ転写産物を生成するために使用できる。
【００３５】
本発明のさらなる態様では、植物中で感染性転写産物を生成するためにウイルスｃＤＮＡの５’末端に連結されたキャッサバ葉脈モザイク（ＣｓＶＭＶ）プロモーター配列を利用する、ＣＰＭＶ ＲＮＡ Ｍ及びＢのｃＤＮＡクローンを構築し、そのうちＭ ＲＮＡのｃＤＮＡクローンは、外来性ペプチドをコードする挿入オリゴヌクレオチド配列を含む。この手法は、インビトロで生成される転写産物の使用に伴って遭遇する問題のいくつかを克服し、すべての植物ＲＮＡウイルスに適用できる。
【００３６】
他のウイルスは、様々なブロモウイルス、特にササゲクロロティックモトルウイルス（ＣＣＭＶ）及びソベモウイルス、特に南部インゲンモザイクウイルス（ＳＢＭＶ）を含み得る。三分節ウイルスのＲＮＡセグメントも使用できる。そのような有用なウイルスの例は、正二十面体キャプシドにパッケージングされた、ブロモウイルス科の三分節ウイルス、例えばブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）及びササゲクロロティックモトルウイルス（ＣＣＭＶ）である。
【００３７】
ＢＭＶのゲノムは、それぞれ３．２、２．９及び２．１ｋｂのメッセンジャーセンスＲＮＡの１、２及び３に分けられる。コートタンパク質は、ＲＮＡ３から形成されるサブゲノムＲＮＡ４によってコードされる。細胞がＢＭＶ ＲＮＡ３に感染するためには、ＢＭＶ ＲＮＡ１及び２によってコードされるタンパク質が存在しなければならない。これら３つのＢＭＶ ＲＮＡは同一粒子内に別々にキャプシド化されている。各々の粒子は１８０のコートタンパク質を含有する。コートタンパク質は、ペプチド挿入物を担持するように修飾できる。
【００３８】
表１に示す多くのウイルスのコートタンパク質を比較した。二次構造エレメント及びそれらの空間構成の類似性が、米国特許第６，８８４，６２３号の図１０に示されている。β鎖の間に存在するループのいずれもが外来性エピトープの挿入のため使用できる。しかし、挿入は、付加物がウイルスの内側又は外側表面に暴露されるように、及びコートタンパク質サブユニットの構築とウイルスの感染性が破壊されないように行われる。特定ループの選択は、挿入がウイルス集合を妨げる可能性が低いように、結晶構造によって示される、個々のコートタンパク質サブユニットの構造及びそれらの互いの相互作用についての知識を用いて実施できる。正確な挿入部位の選択は、最初に結晶構造の検査、次いで最適部位を同定するためのインビボ実験によって実施できる。
【００３９】
そこで、特にウイルス表面で暴露され、従って潜在的に挿入のための良好な部位であるコートタンパク質の部分を同定するために、植物ウイルスの三次元構造を検討することができる。コートタンパク質の暴露部分のアミノ酸配列も、α−へリックス構造を破壊するアミノ酸に関して検討することができ、なぜなら、これらもまた挿入のための潜在的に良好な部位であるからである。適切なアミノ酸の例は、ポリペプチド鎖においてα−へリックスを中断し、構造内に堅固なねじれ又は屈曲を創造する、プロリン及びヒドロキシプロリンである。コートタンパク質のＮ及びＣ末端も挿入のための魅力的な部位である。
【００４０】
抗原及びエピトープの種類
本発明の実施形態は、サブユニット型ワクチンのための方法を含み得る；すなわち、提示される抗原は、有効であることが公知の抗原のセグメントだけである。そのようなワクチン（抗原）は、感染過程又は疾患の病理に関連するすべての機能性を欠くので、本質的に全生物又は全タンパク質ワクチンよりも安全であり得る。
【００４１】
本発明の実施形態は、炭疽菌（Bacillus anthracis)感染の作用に対するサブユニットワクチンのための方法を含み得る。この炭疽ワクチンにおいて、サブユニット抗原、配列番号２３は、いわゆる防御抗原又はＰＡに由来する約２５アミノ酸のセグメントである。このタンパク質は、炭疽菌に対する免疫を惹起する上で有効であることが公知であり、新生代の炭疽菌ワクチンのための基剤である。
【００４２】
イヌパルボウイルスワクチンも生産できる。例えばLangeveld et al. (2001) 「Inactivated Recombinant Plant Virus Protects Dogs from a Lethal Challenge with Canine Parvovirus」, Vaccine 19:3661-3670及びLangeveld et al. (1995) 「Full Protection in Mink Against Mink Enteritis Virus with New Generation Canine Parvovirus Vaccines Based on Synthetic Peptide or Recombinant Protein」, Vaccine 13:1033-1037参照。これらのウイルス粒子に基づくサブユニットワクチンは、ウイルス病原体（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）に対して有効であることが既に証明され、感染因子による致死的攻撃誘発から動物を保護した。キメラ粒子は、現在、植物を予め操作された組換えウイルスＲＮＡ又はＤＮＡに感染させることによって、ササゲ植物において生産されている。接種後、組換えウイルスは細胞から細胞へと長い距離を伝播する。これは植物の全身感染を生じさせる。感染植物組織を収集し、キメラウイルス粒子を抽出して、製剤し、ワクチンとして使用する。本発明の実施形態によれば、環境保護についての必要条件を満たすためにワクチン候補物質を不活性化することは好都合であり得る。
【００４３】
本発明の不活性化方法は、その後ワクチンとして使用される抗原エピトープを提示する粒子だけでなく、他の有用なペプチド、例えばターゲティングペプチド、抗菌ペプチド等を提示する粒子にも適用できる。この技術はまた、その後粒子表面への様々な部分の共有結合のために使用される野生型又は修飾粒子にも適用できる。これは、抗原タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、核酸、検出試薬（蛍光染料など）、放射性物質、ターゲティングリガンド等を含むタンパク質の結合を含む。粒子複合体は、ワクチンとして並びに標的組織への結合薬剤の送達のため等に使用できる。この技術も、その後投与のため及びカプセル化された物質の送達のために使用される、粒子の内部への様々な物質、例えば薬剤、外来性遺伝子の発現のための外来性核酸、毒素等のカプセル化に先立って適用できる。
【００４４】
本発明に従って使用でき、キャプシドの表面で発現され得る多くのペプチドエピトープの中には、インフルエンザウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス及び炭疽菌からのものを含む、ウイルス及び細菌病原体及び癌からのペプチドエピトープが含まれる。
【００４５】
植物ウイルスに組み込み得る外来性ペプチドは（例えばＷＯ９２／１８６１８参照）、極めて多様な種類であり得る。外来性ペプチドの性質と大きさ及びウイルス粒子内で又はウイルス粒子上でそれが位置する部位の故に、いくつかの制限が存在し得る。ペプチド配列は、インビボで培養したとき修飾ウイルスが集合する能力を妨げてはならない。本明細書において、ペプチド又はそれをコードする核酸に適用するとき、「外来性」という用語は、ベクターとして使用される植物ウイルスにとって天然ではないペプチド又は核酸配列を意味する。そのような配列は、選択的に、外因性又は異種配列とも表わされ得る。「ペプチド」という用語は、低分子ペプチド及びポリペプチドを含む。ペプチドは、一般に６以上のアミノ酸残基を含有する。
【００４６】
修飾ウイルス粒子は、何らかの生物学的有用なペプチドから形成され得る。そのようなペプチドの例は、ペプチドホルモン；酵素；増殖因子；原生動物、ウイルス、細菌、真菌又は動物起源の抗原；抗イディオタイプ抗体を含む抗体；免疫調節剤及びサイトカイン、例えばインターフェロン及びインターロイキン；受容体；付着因子；及び前記種類のペプチドのいずれかの部分又は前駆体である。
【００４７】
植物ウイルスベクター上で提示される広範囲の生物活性ペプチド配列の中で（例えばＷＯ９２／１８６１８による）、特に重要なのは、ワクチンの基剤である抗原ペプチド、特に動物（ヒトを含む）ウイルス及び細菌ウイルスである。ワクチンは予防的（すなわち疾患予防）又は治療的（すなわち疾患治療）適用を有し得ることに留意すべきである。ワクチン適用のために、特に魅力的なエピトープ提示系が提供される。そのような適用のために使用するとき、抗原ペプチド成分は、例えばウイルスのコートタンパク質の暴露部分に位置することによって、免疫系によって容易に認識されるようにウイルス粒子上に適切に位置づけられる。そこで、本発明の一部の実施形態では、植物ウイルスのコートタンパク質の表面の暴露部分に組み込まれた、病原体、例えば動物ウイルス又は細菌病原体に由来する抗原を含有する修飾植物ウイルスの集合粒子が提供される。集合修飾植物ウイルス粒子は、ワクチンの免疫原成分として使用できる。抗原ペプチドを提示するそのような集合修飾植物ウイルス粒子はまた、例えば動物（ヒトを含む）病原体及び疾患の検出のための、免疫診断アッセイの抗原提示成分としての適用を有する。
【００４８】
本発明の実施形態では、抗原性ＶＬＰは、抗原の完全性を維持しながら不活性化される及び／又は非感染性にされる。従ってこれは、それらが植物ウイルスである場合でも、感染性ウイルス粒子の意図しない伝播の危険性を排除する。これは、規制懸念を大きく削減することができる。そこで、植物への植物ウイルスの伝播と拡大は、治療される人間又は動物に投与された後、大きく低下する。この系は、ウイルスコートタンパク質に挿入され得る外来性ペプチドの大きさに関して極めて融通性がある。すなわち、３８まで又はそれ以上のアミノ酸を含有するペプチドが本発明に従って使用できる。
【００４９】
投与方法
これらの、今や組換え体であるウイルスのための投与方法は、粘膜に投与されるエーロゾルを含み得る。しかし、様々な投与方法が本発明に従って使用できる。これらは、注射投与（ＩＰ、ＩＭ、ＳＣ）、あるいは経皮、鼻内又は経口投与を含む。
【００５０】
候補ウイルス、そのキャプシド形態学、及びその中への抗原／エピトープの挿入
外来性ペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントは、ウイルスが複製し、宿主に感染する能力に干渉せず、及びペプチドの適切な生産と修飾ウイルス粒子上でのペプチドの提示を可能にする、もとのウイルスのコートタンパク質内の適切な位置に挿入され得る。一般に、外来性ポリヌクレオチドは、コートタンパク質の一部として又はコートタンパク質との融合物として生産されるように挿入される。
【００５１】
ＲＮＡ転写産物は、当分野で公知のように、インビボで、例えば細菌宿主において、又はインビトロで調製され、適切な植物宿主又は植物組織に接種するために使用される。キャプシド化は宿主生物内で起こるので、ＲＮＡはキャプシド化形態で又は溶液中で使用され得る。あるいは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに融合したウイルスＤＮＡが、植物宿主においてインビボでウイルスＲＮＡの転写を開始させるために使用できる。転写されたＲＮＡは、その後、植物宿主においてウイルス感染を開始することができる。
【００５２】
当業者に理解されるように、所与のウイルスは、シス又はトランスで作用する遺伝子の存在を含む、最適の感染性及び複製のために特別の条件を必要とすることがあり、植物又は植物組織に感染するときにはそれらのすべてが存在すべきである。例えばＢＭＶ ＲＮＡ３の感染性のためには、ＢＭＶ ＲＮＡ１及び２の存在が必要である。さらに、所与の宿主に関して必要な宿主特異性遺伝子を有するウイルスによる感染は、一部の状況では、通常はその宿主に影響を及ぼさない第二のウイルスによる宿主の感染を可能にすることがあり、例えばＢＭＶ単独ではタバコに感染せず、ＴＭＶ単独ではオオムギに感染しないが、ＴＭＶとＢＭＶウイルスの混合物はオオムギとタバコの両方に感染する（Hamilton and Nichols (1977) Phytopathology, 67:484-489）。
【００５３】
植物は、圃場及び／又は温室条件下でトランスフェクトされ得る。通常、葉組織の表皮剥離がトランスフェクションのために必要である。植物は、成長周期の間のいずれの時点でも接種することができ、好ましくは植物が幼若であるときに接種する。ウイルスの選択及び修飾の詳細は、当業者に公知であり、理解されているパラメータに依存する自由選択事項である。
【００５４】
コートタンパク質を修飾することに加えて、他の適切な遺伝子を宿主植物における発現のためにもとのウイルスゲノムに挿入し得る。これらは、植物における商業的に有用なペプチド、タンパク質、薬剤又は他の何らかの有用なポリペプチドの生産のための遺伝子を含む。一般に、その発現産物が植物細胞において機能性である異種遺伝子は、ここで述べるウイルス発現系に挿入することができる。
【００５５】
修飾されたコートタンパク質自体を異種ウイルスのゲノムに挿入することができる。異種コートタンパク質遺伝子の翻訳の忠実性を確実にするためには、もとのコートタンパク質についての翻訳開始ＡＴＧコドンを、それが欠失されていない場合は、修飾する必要があり得、これは当分野で公知の手段によって、例えばオリゴヌクレオチド指定置換によって達成され得る。付加されるコートタンパク質配列がそれ自体の翻訳開始コドンを有する場合は、もとのタンパク質についての開始コドンの欠失又は不活性化が必要である；あるいは、しかしながら、それによって導入されるアミノ酸配列変化がＲＮＡパッケージング及びキャプシド形成を妨げないことを条件として、前記開始コドンは保持されてもよく、付加されるコートタンパク質配列の翻訳を開始するために使用され得る。
【００５６】
広い範囲の感受性植物宿主及び植物細胞が使用できる。これらは、双子葉及び単子葉植物、植物の組織並びに懸濁培養で増殖する又はカルスを形成する植物細胞を含む。
【００５７】
さらなる処理工程
修飾植物ウイルス粒子を作製するために、外来性ペプチド（動物ウイルス又は細菌抗原など）をコードするヌクレオチド配列を、コートタンパク質をコードする植物ウイルスゲノムの部分との融合物として導入し、植物又は植物細胞を修飾ウイルス核酸に感染させて、修飾ウイルスの集合粒子を採取することにより、植物ウイルス核酸を修飾することができる。単離ウイルスを、その後、本発明に従って不活性化する。
【００５８】
外来性ペプチドをコードする核酸配列は、典型的には、コートタンパク質の暴露部分をコードする植物ウイルスゲノムの部分で導入される。この手順は、ＲＮＡウイルスのＲＮＡに対応するｃＤＮＡの操作によって実施できる。ＲＮＡウイルスの場合は、修飾ウイルスの集合粒子の採取の前に操作段階を達成するために、通常、修飾ＤＮＡのＲＮＡ転写産物を植物細胞、又は好ましくは全植物の接種のために調製する。あるいは、ウイルスコートタンパク質をコードする配列の５’末端が植物宿主において活性なプロモーターの転写開始部位に直接融合されるように、ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡクローンをプラスミドにおいて構築し得る。外来性ペプチドは、最初にキャプシドタンパク質の部分として発現され、それにより全ウイルス粒子の部分として生産される。ペプチドは、従って、それ自体での使用が意図された複合体分子として生産され得る。あるいは、ウイルス粒子からの開裂を生じさせる適切な試薬の適用によってウイルス粒子から所望ペプチドの放出を可能にするために、ウイルスの遺伝子修飾を設計し得る。これは、酸加水分解に感受性である対象ペプチドに隣接するアミノ酸を挿入することによって達成され得る。例えばａｓｐ−ｐｒｏアミノ酸を挿入ペプチドに隣接するように操作することができ、ペプチドは、弱酸での処理によって粒子から放出され得る。
【００５９】
商業規模で修飾ウイルスを生産するために、ウイルス生産の各バッチについて無効な接種剤（ＤＮＡ又はＲＮＡ転写産物）を調製する必要はない。その代わりに、初期接種剤を、植物を感染させるために使用し得る；生じた修飾ウイルスを植物において増幅して、全ウイルス又はウイルスＲＮＡをその後のバッチのための接種剤として生産し得る。
【００６０】
外来性ＲＮＡ又はＤＮＡは、様々な立体配置で植物ウイルスゲノムに挿入し得る。例えばコートタンパク質をコードする既存の核酸への付加物として又はコートタンパク質をコードする既存配列の一部の置換物として挿入し得る。この選択は、一部には、コートタンパク質の構造及び遺伝的に修飾されたウイルスが植物中で粒子へと集合する能力を妨げずに付加又は置換を実施し得ることの容易さによって決定され得る。本発明のための付加又は欠失の許容される最も適切な大きさの決定は、各々特定の場合に、おそらく多少の付加的な実験を伴って、本開示に照らして実施され得る。付加挿入物の使用は、一部の場合には、置換挿入物よりも大きな柔軟性を提供すると思われる。
【００６１】
植物における修飾ウイルスの増殖は有意の収量を生産することができる。上述したように、挿入される異種ヌクレオチド配列は、容易に切断されるアミノ酸をコードするものを含み得るので、増殖段階後に、所望物質をウイルス粒子から分離し得る。例えば２個のペプチドをコートタンパク質に挿入することができ、１個は、例えばアフィニティー精製による修飾粒子の精製のために使用されて、精製後に切断除去される；他方は、粒子上に保持され、ワクチン接種のために使用される抗原ペプチドであり得る。ペプチドの全体切断に代わるものとして、一部の場合には、キャプシドの主要部分内が無傷のままである形態でペプチドを放出することが可能であり、望ましいと考えられる。
【００６２】
本発明のもう１つの態様によれば、２つの異なる制限酵素部位を、コートタンパク質をコードするウイルス核酸内で選択してもよく、適切な制限酵素を用いて核酸を制限する。ウイルスコートタンパク質に挿入することが望まれる外来性ペプチドをコードする相補的オリゴヌクレオチドの対を合成する。オリゴヌクレオチドは制限酵素部位と適合性の末端で終結し、従って制限ウイルス核酸への挿入を可能にする。この手順は、コートタンパク質配列内への、外来性ペプチドをコードするヌクレオチド配列の導入を生じさせる。
【００６３】
本明細書で使用するとき、「ハイブリッドＲＮＡウイルス」又は「修飾ＲＮＡウイルス」という用語は、ＲＮＡウイルスに由来する感染性ウイルス配列と、もう１つ別の供給源に由来するエピトープ／抗原／ペプチドについてのポリヌクレオチドセグメントを含む、組換えウイルスＲＮＡ配列を指す。従って、不活性化の前には、本発明のハイブリッド又は修飾ウイルスＲＮＡは、１個のＲＮＡウイルスに由来する感染性ウイルス配列と、もう１つ別のウイルス、細菌又は他の供給源に由来するエピトープ／抗原／ペプチドについてのポリヌクレオチドセグメントを含むＲＮＡ配列である。「ハイブリッドＲＮＡビリオン」又は「ハイブリッドウイルス粒子」という用語は、そのようなウイルスのキャプシド化形態を指すために使用され得る。挿入されるペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントを受け入れるのに適したもとのウイルスＲＮＡ配列は、ＲＮＡウイルスのものに対応する配列の一例である。これらの配列は、挿入又は別の方法によって修飾されたとき、もとの／天然に生じるウイルス配列「に由来する」。
【００６４】
そのようなウイルス配列は、最小限、宿主における複製能力及び宿主に感染する能力の機能を有さなければならない。そのような機能の決定因子は、シスで必要とされるか、又は別の場合にはトランスで供給され得る。トランスでの複製に十分である条件の一例は、ＢＭＶ ＲＮＡ３が宿主において複製するのを可能にするための、ＢＭＶ ＲＮＡ１及び２によってコードされるタンパク質の存在の必要性である。これに対し、ＲＮＡ１及び２により感染細胞で誘導される機構によってＲＮＡ３誘導体を複製させるには、ある種の複製シグナルがシスで（すなわちＲＮＡ３誘導体に直接結合して）存在しなければならない。トランス機能のもう１つの例は、ＣＰＭＶ ＲＮＡ２が宿主において複製することを可能にするための、ＣＰＭＶ ＲＮＡ１によってコードされるタンパク質である。これに対し、ＲＮＡ１によって感染細胞において誘導される機構によるＲＮＡ２誘導体の複製を可能にするためには、ある種の複製シグナルがシスで（すなわちＲＮＡ２誘導体に直接結合して）存在しなければならない。
【００６５】
また、もとのウイルス配列が外来性又は異種ペプチドをコードするポリヌクレオチドの付加のために適切な部位を有することも望ましいと考えられる。これらのポリヌクレオチドセグメント及び配列に関する「外来性」及び「異種」という用語は、天然でもとのウイルスにはない配列を意味する。同様に、外来性又は異種ペプチド及びポリペプチドは、本明細書ではウイルス発現／産生系に付加された抗原又はエピトープを指す。そのような外来性ポリヌクレオチド又は配列は、もとのウイルス配列に必要な機能、すなわち複製し、宿主に感染する能力に干渉しない位置で挿入され得る。宿主における発現に関して、「異種」又は「単離」ポリヌクレオチドは、それが配置された宿主内の位置に天然では存在しないポリヌクレオチドである。異種ペプチドをコードするセグメントの配置は、もとのウイルス配列の必要な機能に干渉しないことが望ましい。
【００６６】
挿入される核酸セグメントは、天然に生じる必要はなく、修飾されていてもよく、２個以上のコードセグメントの複合物であってもよく、又は２個以上のペプチド／ポリペプチドをコードしてもよい。ＲＮＡもまた、修飾ＲＮＡ分子の全長又は他の性質を制御するために挿入と欠失を組み合わせることによって修飾され得る。
【００６７】
挿入される外来性ＲＮＡ配列は、非ウイルス又はウイルス起源であり得、本来はＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかに相当し得る。それらは、受容細胞の翻訳機構によって直接翻訳され得るか又はさもなければそれらの機能、構造又は調節機能のために認識され、利用され得る形態である限り、原核生物又は真核生物起源であり得る。
【００６８】
いかなる植物も、当業者に明らかなように、適切な宿主特異性と複製機能を与えることにより、本発明のＲＮＡ配列に感染させ得る。適切な構築物により、他の真核生物も、単細胞及び組織培養物と同様に感染させ得る。本発明は、宿主の所与のクラス又はＲＮＡウイルスの型に限定されない。
【００６９】
「全身感染」という用語は、最初の接種部位の細胞より多くを含むように宿主生物系を通して感染が拡大することを意味する。宿主生物全体が感染する必要はない；ある種の組織が感染の標的であり得る。好ましい組織は葉組織である。
【００７０】
宿主生物に適用される「トランスフェクトされた」という用語は、その内部で複製されるような方法で生物細胞内に本発明のウイルス配列を組み込むことを意味する。トランスフェクトさせるために、生物を全身感染させる必要はないが、全身感染させ得る。しかし、ウイルスの全身拡大は本発明のために必要ではない。
【００７１】
宿主生物の感染を開始するための方法は当分野において周知であり、いかなる適切な方法も使用し得る。植物の感染のための好ましい方法は、ウイルスがその内部で複製するか又は植物に感染するように、傷つけた植物をウイルス又はウイルスＲＮＡを含有する溶液と接触させることである。
【００７２】
本発明の実施形態は、植物において及び植物によってワクチン様ポリペプチド及び他のポリペプチドを生産するためのベクター系として植物ウイルスを利用することができる。本発明の１つの態様は、ＲＮＡが本発明の方法を用いて除去された又は非感染性にされた、ウイルスのコートタンパク質の部分として所定の外来性ペプチドを含有する植物ＲＮＡウイルスの集合粒子に関する。本発明はまた、内部提示が可能である、外来性ペプチドを提示する植物ウイルスの集合粒子を含み得る。本発明はまた、感染性ＲＮＡを欠くウイルスを含む。
【００７３】
ワクチンの製剤に適用されるとき、本発明は、従来のワクチン、動物ウイルス又は細菌に基づく組換えワクチン、及びペプチドワクチンに比べて利点を有すると考えられ、それらは以下を含む：１）純粋なウイルス粒子の非常に高い収量が感染植物から入手可能であり、組織培養生産工程を必要としないので、より低い生産コスト；２）植物ウイルスは動物において感染及び複製することができず、従って、従来のワクチンや組換え動物ウイルスワクチンの場合のように毒性形態に突然変異することができないので、改善された安全性；３）有効性を失わずに精製製剤を乾燥して、何年間も保存することができるので、コモウイルスとして例外的な安定性；４）免疫原性の上昇を生じさせ、従って粒子の表面でのペプチドの提示をもたらす、ペプチドの複合の欠如；及び５）インビボでの相同的組換え（トランスフェクション）と異なり、インビトロでの操作によるキメラ遺伝子の導入を可能にする、より低分子のウイルス。
【００７４】
異なる指示がない限り、本明細書で使用する「１つの」（「a」、「an」）及び「その」（「the」）は、少なくとも１つを指す。
【００７５】
本明細書で言及する又は引用するすべての特許、特許出願、特許仮出願及び刊行物は、本明細書の明白な教示と矛盾しない範囲でそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７６】
以下は、本発明を実施するための手順を説明する実施例である。これらの実施例は限定と解釈されるべきではない。異なる記載がない限り、すべてのパーセンテージは重量比であり、すべての溶媒混合物の割合は容積比である。
【実施例】
【００７７】
実施例１
ＣＰＭＶ粒子の不活性化の要旨
１７以上の異なるＣＰＭＶ粒子（異なるエピトープを担持する）ならびに野生型ＣＰＭＶウイルスを、この手順を用いて不活性化した。ＲＮＡを不活性化ウイルスから単離し、ＲＮＡが分解されているかどうかを判定するためゲル上で泳動させた。また不活性化粒子を、感染を誘導する能力に関して試験するために植物に接種した。接種した植物のいずれも、ウイルス感染を生じなかった。不活性化ウイルス粒子から単離したＲＮＡは、試験したいずれの場合にも分解された（一例として図１参照）。
【００７８】
実施例２
ＣＰＭＶ不活性化のさらなる例
０．８Ｍ硫酸アンモニウムが、ＣＰＭＶの完全性を保存しながらＣＰＭＶを不活性化できるかどうかを測定するための試験を設計した。０．８Ｍ硫酸アンモニウムを本発明の精製過程の一部として使用した。過程の間のｐＨ上昇はウイルスの透過性を上げるが、同時に遊離ＮＨ3の濃度も上昇させる。
【００７９】
この試験からの結論は、２２℃及び４０℃でｐＨ９及びｐＨ７の０．８Ｍ硫酸アンモニウムはウイルスの完全性を保存し、ウイルスの感染性はｐＨ９でのみ失われるというものであった。ＣＰＭＶを２２℃及び４０℃にて３０ｍＭトリス−ＨＣｌ中でインキュベートした対照実験は、完全に感染性のＣＰＭＶ粒子を生産した。これらの結果から、不活性化を生じさせるために必要であるのは０．８Ｍ硫酸アンモニウムとｐＨ９の組合せであり、温度又は硫酸アンモニウム単独ではないとさらに結論された。この試験では、適切な硫酸アンモニウム濃度とｐＨに調整した摩砕細胞汁液に関して実験を実施し、植物スラリー中の化合物が不活性化を生じさせている（例えばソラレン）懸念があった。これを立証する又は反証するため、精製ＣＰＭＶ粒子が硫酸アンモニウムとｐＨ９の組合せを用いて不活性化され得るかどうかを判定するための２番目の試験を設計した。化学物質中の何らかの不純物が不活性化の原因であるかどうかを判定するために様々な純度グレードの化学物質を使用した。実験マトリックスを設定し、すべての条件を表１に示すように試験した。容易な組込みが可能であるように、本発明者らの再最適化過程の一部であるので０．７Ｍ硫酸アンモニウムを使用した。
【表２】
【００８０】
ｐＨ９で０．５Ｍ及び０．７Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4の濃度はＣＰＭＶを不活性化したが、ｐＨ９で０．１Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4はＣＰＭＶを不活性化しなかった。図１は、活性及び不活性化ウイルスから抽出し、１．２％アガロースゲル上を泳動させて、ＥｔＢｒで染色したＲＮＡを示す。結果は、活性ウイルス中のＣＰＭＶゲノムＲＮＡ１及び２の存在、及び不活性ウイルス調製物中の分解されたＲＮＡを示す。１５超の他のキメラウイルス粒子及び野生型ウイルスについても同じ結果が得られた。
【００８１】
実施例３
不活性化実験において使用したキメラＣＰＭＶ粒子
炭疽菌の防御抗原（「ＰＡ」）タンパク質に由来するペプチドを発現するキメラＣＰＭＶ粒子を構築した。米国特許第５，８７４，０８７号、同第５，９５８，４２２号及び同第６，１１０，４６６号に述べられている方法を使用して、ＣＰＭＶの高分子及び／又は低分子コートタンパク質上でペプチドを発現させた。以下のペプチドが発現された。
【００８２】
【表３】
【００８３】
実施例４
植物におけるキメラＣＰＭＶ粒子の生産
Ｆｅｒｒｙ ＭｏｒｓｅからのＣｏｗｐｅａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｎｏ．５種子、カタログ番号１４５０をぬらしたペーパータオルにおいて室温で一晩発芽させた。発芽した種子を土壌に移した。発芽後７日目に、実生苗にＷＴ又はキメラＣＰＭＶ粒子を接種した。接種後、植物を２５℃にて、明１６時間、暗８時間の光周期で２〜３週間成長させた。症状を示した葉を採取し、精製の前に−８０℃で凍結した。
【００８４】
実施例５
キメラＣＰＭＶ粒子の不活性化及び不活性化キメラＣＰＭＶウイルス様粒子の精製
ＣＰＭＶ感染葉組織４０ｇを−８０℃で凍結した。凍結葉組織を手で破砕し、Ｗａｒｉｎｇ高速混合機、カタログ番号８０１１Ｓに注ぎ入れた。低温不活性化緩衝液１２０ｍｌ（０．５Ｍ硫酸アンモニウム、０．０３Ｍトリス塩基、ｐＨ９．００、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ）を破砕した葉に注いだ。葉を高速で３秒間、２回粉砕した。溶液を５００ｍｌ遠心管中に傾瀉した。混合機を低温不活性化緩衝液３０ｍｌで洗い、洗浄液を５００ｍｌ遠心管に注ぎ入れた。植物細胞デブリを除去するために溶液を１５，０００Ｇで３０分間遠心分離した。上清をメスシリンダー中に傾瀉し、ウイルスを不活性化するために室温で２０時間インキュベートした。ＣＰＭＶウイルスを沈殿させるため、低温ＰＥＧ６０００溶液（２０％ＰＥＧ６０００、１Ｍ ＮａＣｌ）を上清に添加して、最終ＰＥＧ濃度を４％ＰＥＧ６０００、０．２Ｍ ＮａＣｌとし、溶液を静かに混合した。溶液を氷上で１時間沈殿させた。ウイルス沈殿物溶液を、次に、１５，０００Ｇで３０分間遠心分離して、ＣＰＭＶウイルスペレットを収集した。上清を廃棄し、ウイルスを直ちに陰イオン交換結合緩衝液（３０ｍＭトリス塩基、ｐＨ７．５０）に再懸濁した。ウイルス様粒子をさらに精製するため、タンパク質混合物を、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ強陰イオン交換樹脂、カタログ番号１−２５５９−１１を使用した陰イオン交換クロマトグラフィーによって分画した。２０カラム容量勾配は、緩衝液Ａ、３０ｍＭトリス塩基、ｐＨ６．７５から緩衝液Ｂ、３０ｍＭトリス塩基、ｐＨ６．７５及び１Ｍ ＮａＣｌまでであった。クロマトグラフィーは、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ、カタログ番号１８−１１１２−４１で実施した。図２は、ＰＡ７ＥのＡＩＥＣクロマトグラムを示す。実施例３で列挙したすべての試料を、本実施例で述べる方法を用いて処理し、同様の結果を得た。２つの主要ピークが検出された。青色のトレースは２８０の吸光度、赤色トレースは２６０の吸光度、緑色トレースは緩衝液Ｂパーセント、及び褐色トレースは伝導率である。クロマトグラムの下部の赤色の目盛は画分である。所望ウイルス様粒子を含有する勾配上の最初のピークを、１００ｋＤａカットオフ膜のＭｉｌｌｉｐｏｒｅスピン濃縮機、カタログ番号ＵＦＣ９１００９６を使用してＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中に緩衝液交換した。その後試料を−８０℃で保存した。２番目のピークは切断された粒子夾雑物を含有した。ＰＡ７Ｅ ＰＥＧ沈殿物のＡＩＥＣ負荷物、ＷＴ ＣＰＭＶ標準品、及びＡＩＥＣ ＰＡ７Ｅ分画に関して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｕｐａｇｅ ４〜１２％ビス−トリス、１２ウェルゲル、カタログ番号ＮＰ０３２２で実施した。泳動緩衝液は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｕｐａｇｅ ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液、カタログ番号ＮＰ０００２であった。ゲルを２００Ｖの電圧低下で３５分間泳動させた。レーン１は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２ ラダー、カタログ番号ＬＣ５９２５を含有した。レーン２は、ＡＩＥＣカラムに負荷した再懸濁ＰＥＧ沈殿物ＰＡ７Ｅを含有した。レーン３は、ＷＴ ＣＰＭＶを含有した。レーン４〜８は、ＡＩＥＣピーク１に対応する標的精製ＰＡ７Ｅ粒子を含有し、それらを収集して、さらに処理した。レーン９〜１０は、ＡＩＥＣピーク２に対応する切断ＰＡ７Ｅ粒子夾雑物を含有した。
【００８５】
実施例６
不活性化キメラＣＰＭＶウイルス様粒子の分析−ウイルスゲノムＲＮＡ抽出
Ａｍｂｉｏｎ ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ、カタログ番号１９１２のキットを、ＰＥＧ精製不活性化ＣＰＭＶ試料からウイルスゲノムＲＮＡを抽出するために使用した。不活性化されなかったＣＰＭＶウイルス粒子を対照として使用した（活性試料）。図３〜５は、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、ＰＡ１２及びＰＡ１８についてのＲＮＡ不活性化の結果を示す。実施例３で列挙したすべての試料を、実施例６で述べる方法を用いて処理し、同様の結果を得た。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＰｒｅｃａｓｔ １．２％ Ｅ−Ｇｅｌｓ、カタログ番号Ｇ５０１８０１を、図１〜３に関して抽出ＲＮＡを視覚化するために使用した。図３〜５のすべてのラダーは、１ＫＢ ＰＬＵＳ Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号１０７８７−０２６の１ｕｌ負荷であった。図３において、レーン１はラダー１μｌである。レーン２は活性ＰＡ９である。レーン３は不活性化ＰＡ９である。レーン４はラダーである。レーン５は活性ＰＡ１０、レーン６は不活性ＰＡ１０である。レーン７はラダーである。図４では、レーン１はラダー１ｕｌである。レーン２は活性ＰＡ１１である。レーン３は不活性化ＰＡ１１である。レーン４はラダーである。レーン５は活性ＰＡ１２、レーン６は不活性ＰＡ１２である。レーン７はラダーである。図５において、レーン１はラダー１ｕｌである。レーン２は活性ＰＡ１８である。レーン３は不活性化ＰＡ１８である。不活性化試料では、「スミア」の検出によって指示されたようにウイルスゲノムＲＮＡは分解されたが、不活性化を受けなかった試料では完全長ＣＰＭＶゲノムＲＮＡ１及びＲＮＡ２が検出された。
【００８６】
実施例７
不活性化キメラＣＰＭＶウイルス様粒子の分析−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる安定性
低分子及び高分子コートタンパク質の安定性をＳＤＳ−ＰＡＧＥで検定した。図６は、一例としてＰＡ１Ｓについての５日間の温度安定性アッセイのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｕｐａｇｅ ４〜１２％ビス−トリス、１２ウェルゲル、カタログ番号ＮＰ０３２２で実施した。ゲルを１５０Ｖの電圧低下で６０分間泳動させた。泳動緩衝液は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｕｐａｇｅ ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液、カタログ番号ＮＰ０００２であった。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号１０７４７−０１２ ７ｕｌを含有した。レーン２は、室温で５日間インキュベートした不活性化ＰＡ１Ｓウイルス粒子を含有した。レーン３は、４℃で５日間インキュベートした不活性化ＰＡ１Ｓウイルス粒子を含有した。レーン４は、−２０℃で５日間インキュベートした不活性化ＰＡ１Ｓウイルス粒子を含有した。タンパク質分解は検出されなかった。
【００８７】
実施例８
不活性化キメラＣＰＭＶウイルス様粒子の分析−ＳＥＣによる安定性
集合ウイルス様粒子の完全性を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて検定した。実施例３で列挙したすべての試料を、ＳＥＣを使用して分析し、同様の結果を得た。使用したＳＥＣカラムは、１０ミクロンビーズサイズの、Ｓｕｐｅｌｃｏからの３０ｃｍ×７．８ｍｍ Ｔｏｓｏｈ ＴｓｋＧｅｌ Ｇ５０００分析用ＳＥＣカラム、カタログ番号０８０２３であった。ＳＥＣの移動相は、０．１Ｍ ＮａＰＯ4、ｐＨ７．００であった。集合ウイルス粒子に対応する単一ピークが検出された。集合ＣＰＭＶ粒子は１４．０分の保持時間でカラムから溶出した。
【００８８】
実施例９
不活性化キメラＣＰＭＶウイルス様粒子の分析−植物における感染性
実施例３で列挙した不活性化キメラＣＰＭＶ粒子を、植物に感染するそれらの能力に関して試験した。Ｆｅｒｒｙ ＭｏｒｓｅからのＣｏｗｐｅａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｎｏ．５種子、カタログ番号１４５０をぬらしたペーパータオルにおいて室温で一晩発芽させた。発芽した種子を土壌に移した。発芽後７日目に、１０の実生苗に不活性化及び活性ＷＴ又はキメラＣＰＭＶ粒子を接種した。接種後、植物を２５℃にて、明１６時間、暗８時間の光周期で２〜３週間成長させ、症状形成を観察した。不活性化ＷＴ又はキメラＣＰＭＶ粒子を接種した植物は症状を示さなかったが、活性ＷＴ又はキメラＣＰＭＶ粒子を接種した植物はＣＰＭＶ感染の典型的な症状を示した。不活性化ＷＴ又はキメラＣＰＭＶ粒子を接種した葉を採取し、ウイルス粒子単離のために処理した。葉組織４０ｇを−８０℃で凍結した。凍結葉組織を手で破砕し、Ｗａｒｉｎｇ高速混合機、カタログ番号８０１１Ｓに注ぎ入れた。低温３０ｍＭトリス塩基、ｐＨ７．５０ １２０ｍｌ、０．２ｍＭ ＰＭＳＦを破砕した葉に注いだ。葉を高速で３秒間、２回粉砕した。溶液を５００ｍｌ遠心管中に傾瀉した。混合機を低温緩衝液３０ｍｌで洗い、洗浄液を５００ｍｌ遠心管に注ぎ入れた。植物細胞デブリを除去するために溶液を１５，０００Ｇで３０分間遠心分離した。上清をメスシリンダー中に傾瀉した。ＣＰＭＶウイルスを沈殿させるため、低温ＰＥＧ６０００溶液（２０％ＰＥＧ６０００、１Ｍ ＮａＣｌ）を上清に添加して、最終ＰＥＧ濃度を４％ＰＥＧ６０００、０．２Ｍ ＮａＣｌとし、溶液を静かに混合した。溶液を氷上で１時間沈殿させた。ウイルス沈殿物溶液を、次に、１５，０００Ｇで３０分間遠心分離して、ペレット中のウイルス粒子を収集した。上清を廃棄し、ペレットを直ちにＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４に再懸濁した。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでウイルス粒子の存在に関して検定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｕｐａｇｅ ４〜１２％ビス−トリス、１２ウェルゲル、カタログ番号ＮＰ０３２２で実施した。ゲルを１５０Ｖの電圧低下で６０分間泳動させた。泳動緩衝液は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｕｐａｇｅ ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液、カタログ番号ＮＰ０００２であった。ウイルス粒子は検出されなかった。
【００８９】
実施例１０
ＰＡエピトープを含有する不活性化ＣＰＭＶ粒子によるマウスの免疫
７週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスに、アジュバントの存在下で精製不活性化ＣＰＭＶ−ＰＡ１００μｇを腹腔内に３回注射した。対照マウスには、無関係なペプチドを含む不活性化ＣＰＭＶ粒子又はＰＢＳ、ｐＨ７．０中のアジュバントだけを投与した。試料１００μｌと混合したＲｉｂｉアジュバント（Ｒ−７００；Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａ）１００μｌを使用した。投与の総容量は２００μｌであった。注射は３週間の間隔を置いて実施した。
【００９０】
鼻内免疫のために、不活性化ＣＰＭＶ−ＰＡを、アジュバントを伴わずに、麻酔したマウスに投与した。総容量１００μｌを２つの外鼻孔に投与した（各々の外鼻孔につき５０μｌ）。対照マウスには、無関係なペプチドを含む不活性化ＣＰＭＶ又はＰＢＳ、ｐＨ７．０だけを投与した。
【００９１】
最初の投与の１日前及びその後の２回の投与の各々２週間後に血液試料を採取した。
【００９２】
マウス免疫試験の要旨を以下に示す。
【００９３】
【表４】
【００９４】
実施例１１
ＰＡエピトープを含有する不活性化ＣＰＭＶ粒子による非ヒト霊長動物の免疫
ＰＡエピトープを含む不活性化ＣＰＭＶ粒子を、アカゲザルに投与したときの共発現炭疽菌ペプチドに対する抗体応答を生じさせるそれらの能力に関して試験した。４匹のサルを不活性化ＣＰＭＶ−ＰＡペプチド構築物で及び１匹のサルを不活性化野生型ＣＰＭＶ対照で筋肉内経路によって免疫した。各々の免疫用量は、１６のＰＡ−ＣＰＭＶ構築物すべてのウイルス−ペプチド混合物２ｍｇからなった。動物を０、７、１４及び２８日目にワクチン接種した。
【００９５】
ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体を、ＰＡタンパク質を標的としてＥＬＩＳＡアッセイを用いて観測した。各々の免疫日に血液３〜５ｍｌをヘパリン中に採取した。細胞と血漿を分離し、凍結保存した。ケタミン麻酔したサルを０、１４及び２８日目に気管支鏡検査し、気管支洗浄液標本を採取して、凍結保存した。気管支洗浄液と血漿を解凍し、ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体力価をＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した。ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体の両方の高い力価が血漿及び気管支洗浄液中で検出された。結果を図７及び８に示す。
【００９６】
実施例１２
インフルエンザウイルスエピトープＭ２ｅを含有する不活性化ＣＰＭＶ粒子によるマウスの免疫
７週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスに、アジュバントの存在下でインフルエンザペプチドＭ２ｅを発現する精製不活性化ＣＰＭＶ１００μｇを腹腔内に３回注射した。配列は、ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＧＣＲＣＮＤＳＳＤ（配列番号２４）である。対照マウスには、無関係なペプチドを含む不活性化ＣＰＭＶ粒子又はＰＢＳ、ｐＨ７．０中のアジュバントだけを投与した。試料１００μｌと混合したＲｉｂｉアジュバント（Ｒ−７００；Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａ）１００μｌを使用した。投与の総容量は２００μｌであった。注射は３週間の間隔を置いて実施した。
【００９７】
鼻内免疫のために、インフルエンザペプチドＭ２ｅを含有する不活性化ＣＰＭＶを、アジュバントを伴わずに、麻酔したマウスに投与した。総容量１００μｌを２つの外鼻孔に投与した（各々の外鼻孔につき５０μｌ）。対照マウスには、無関係なペプチドを含む不活性化ＣＰＭＶ又はＰＢＳ、ｐＨ７．０だけを投与した。
【００９８】
最初の投与の１日前及びその後の２回の投与の各々２週間後に血液試料を採取した。
【００９９】
マウス免疫試験の要旨を以下に示す。
【０１００】
【表５】
【０１０１】
上記は本発明の例示であり、その限定と解釈されるべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲及びその中に含まれる特許請求の範囲の等価物によって定義される。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】臭化エチジウムで染色した１．２％アガロースゲル上で泳動させたＰＡ１０活性及びＰＡ１０不活性化ウイルスから抽出したＲＮＡを示し、活性ウイルス中のＣＰＭＶゲノムＲＮＡ１及び２、及び不活性化ウイルス製剤中の分解されたＲＮＡを明らかにする。
【図２】ＰＡ７ＥのＡＩＥＣクロマトグラムを示す。
【図３】ＰＡ９、ＰＡ１１及びＰＡ１８のＲＮＡ不活性化を示す。
【図４】ＰＡ９、ＰＡ１１及びＰＡ１８のＲＮＡ不活性化を示す。
【図５】ＰＡ９、ＰＡ１１及びＰＡ１８のＲＮＡ不活性化を示す。
【図６】ＰＡ１Ｓについての５日間の温度安定性アッセイのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図７】ＥＬＩＳＡによって検出されたＣＰＭＶ−ＰＡ免疫サルにおける抗ＰＡ抗体を示す。
【図８】１４０日目の血清及び気管支洗浄液中の抗ＰＡ抗体（ＩｇＧ）を示す。
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、一部が、国立衛生研究所によって授与された認可番号１Ｕ０１ＡＩ０５４６４１−０１の下での政府援助を得て為された。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の交差参照
本出願は、開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００５年１２月２日出願の米国特許仮出願第６０／７４２，１９７号の優先権を主張する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般に、ワクチン等としての使用のための、植物によって生産される植物ウイルスに関する。より詳細には、本発明は、ウイルス不活性化方法及びワクチン等としての植物ウイルス粒子に関する。
【０００４】
発明の背景
ワクチン接種は、個体及び個体群全体を感染因子から保護する。安全で有効なワクチンを開発することは、しかしながら、有効な抗原の同定から開発されたワクチンに関する安全上の懸念にまで及ぶ多くの理由から、必ずしも容易ではない。外来性ペプチドの担体としてのウイルスの使用は、複合ウイルスワクチンの分野で研究されてきた。そのようなワクチンは、異なる動物ウイルス成分の雑種である、キメラウイルスに基づく。通常そのような雑種の主要成分は、無害であるか又は無害にしたウイルスに由来し、重要でない少量の成分は、病原性ウイルスの選択された抗原成分である。例えばワクシニアなどのポックスウイルス又は弱毒化ポリオウイルスは、ヒトウイルスを含む他の動物ウイルスの免疫原性成分のためのベクターとして使用され得る。
【０００５】
しかし、上述したような手法は不都合であり得る。そのようなワクチンは細胞培養系で増殖されたウイルスから生産され、細胞培養系は、設計し、実施するのに費用がかかり得る。複合ウイルスアプローチは、突然変異が変化した感染性、抗原性及び／又は病原性を有する新規形態のウイルスを生じさせ得る危険性を伴う、動物感染性生存ウイルスの遺伝子操作を含む。加えて、ベクターとして使用される動物ウイルスは、動物が既に暴露された可能性があるウイルスであり得、動物が既にそのベクターに対する抗体を産生している可能性がある。従ってベクターは、２番目のウイルスの組み込まれた抗原部位が免疫応答を誘導する前に免疫系によって破壊され得る。
【０００６】
多くの方法が哺乳動物ウイルス不活性化のために使用されてきた。これらは、ＵＶ照射、ＵＶ／ソラレン照射、Ｐｅｎｔｏｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの化学物質、マイクロ波、ホルマリン、ＢＰＬ、ｐＨ、温度、及び塩化アンモニウム中でのインキュベーションを含む。ＵＶ照射は組換え植物ウイルスを不活性化するために使用されてきた。例えばLangeveld et al. (2001) 「Inactivated Recombinant Plant Virus Protects Dogs from a Lethal Challenge with Canine Parvovirus」, Vaccine 19:3661-3670参照。
【０００７】
粒子を生産する方法及び、特にワクチンとしての、粒子の使用に関する特許は、ウイルスのコートタンパク質の一部として所定の外来性ペプチドを含む植物ウイルスの集合粒子を論じた、米国特許第６，１１０，４６６号及びウイルスのコートタンパク質内に外来性ペプチド挿入物を含有し、挿入部位が、好ましくは挿入物に隣接する直列反復配列を含まない、植物ウイルスの集合粒子を論じている、米国特許第６，８８４，６２３号を含む。
【０００８】
米国特許第５，６０２，２４２号は、異種の、好ましくは桿状コートタンパク質キャプシドへの遺伝子操作されたウイルス配列のキャプシド化のための組換えＲＮＡウイルスに関する。本特許はまた、特に植物において遺伝子型及び表現型変化を生じさせるための植物のトランスフェクションに関して、そのような組換えウイルスを作製し、使用する方法に関する。ウイルスコートタンパク質遺伝子を欠失させる又は不活性化するための手段は、Ahlquist et al. (1981) 「Complete Nucleotide Sequence of Brome Mosaic Virus RNA3」, J. Mol. Biol. 153:23-38に述べられている。
【０００９】
Burge et al., 「Effect of Heat on Virus Inactivation by Ammonia」, Appl. Environ. Microbiology, Aug. 46(2):446-51, 1983は、塩化アンモニウムによるウイルス不活性化への熱の影響を論じている。バクテリオファージｆ２及びポリオウイルス１（エンベロープを持つ哺乳動物ウイルス）が検討された。４０℃以上の温度は、本明細書で試験されたウイルスを損傷することが認められた。Cramer WN, et al. 「Kinetics of virus inactivation by ammonia」, Appl Environ Microbiology, Mar 45(3):760-5, 1983は、Burge et al.と同様に、ウイルスを不活性化する試みにおいて下水を処理するために塩化アンモニウムを様々なｐＨで使用した。やはり、バクテリオファージｆ２及びポリオウイルス１（ＣＨＡＴ菌株）が検討された。それらの試験の結果は、ポリオウイルスの不活性化率はＮＨ4+濃度の作用によって、皆無ではないにせよ、ｆ２の不活性化率が受けるよりもはるかに低い影響しか受けなかったことを示すと報告されている。論文は、特にエンテロウイルス群のメンバーに関して、塩素に代わる可能性のあるものとして廃水処理施設における前記方法論の可能な適用を論じている。
【００１０】
発明の概要
本発明は、不活性化ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成するために８．０を上回るｐＨで植物、植物組織、植物細胞及びプロトプラストからなる群より選択される植物材料に硫酸アンモニウムを投与すること、植物材料を少なくとも１０時間インキュベートすること、及び植物材料から不活性化ＶＬＰを採取することによって植物ウイルスを不活性化するための方法を含む。これらの方法は、ウイルスへの外来性ペプチドの組込みを含み得る。ウイルスは、エンベロープを有さないＲＮＡウイルスであり得る。不活性化ＶＬＰは、異種生物活性ペプチドを提供し得る。硫酸アンモニウムは０．５Ｍ〜１．０Ｍの濃度で、一般に０．７Ｍで投与される。ｐＨは一般に９．０であり、植物材料は室温でインキュベートされ得る。ＶＬＰは、植物ウイルス中に存在するＲＮＡの少なくとも一部を欠くので、非感染性である。加えて、接種後に感染を開始することができず、複製することができない。
【００１１】
本発明はまた、キメラ植物ウイルス粒子の不活性化及びウイルス粒子精製手順への不活性化工程の組込みを含み得る。不活性化方法は、ウイルスを植物に感染することができないようにする。ウイルス粒子の内部に存在する感染性ウイルスゲノムＲＮＡは破壊されるが、ウイルス粒子の完全性は維持される。これらの方法は拡大可能であり、精製工程に組み込むことができる。
【００１２】
本発明はまた、８．０を上回るｐＨで、植物、植物組織、植物細胞及びプロトプラストからなる群より選択され、及び植物ウイルス中に存在するＲＮＡの少なくとも一部を欠く植物材料に硫酸アンモニウムを投与すること、植物材料を少なくとも１０時間インキュベートすること、及び植物材料から、複製することができない不活性化ＶＬＰを採取することによって非感染性ＶＬＰを生産する方法を含む。
【００１３】
加えて、本発明の実施形態はワクチンを含むことができ、前記ワクチンはウイルスを含み、前記ウイルスは組み込まれた外来性ペプチドを含み、前記ワクチンは、不活性化ＶＬＰを生成するために８．０を上回るｐＨで植物、植物組織、植物細胞及びプロトプラストからなる群より選択される植物材料に硫酸アンモニウムを投与すること、植物材料を少なくとも１０時間インキュベートすること、及びその後植物材料から不活性化ＶＬＰを採取することを含む方法によって生産される。提供されるＶＬＰペプチドは、ＶＬＰを哺乳動物に投与したとき免疫応答を惹起することができる。ワクチンは、インフルエンザウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、イヌパルボウイルス又は炭疽菌のために使用できる。加えて、ワクチンは、ペプチドが抗原の部分であり、前記部分がワクチンとして有効であるサブユニットワクチンであり得る。
【００１４】
配列の簡単な説明
配列番号１は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１のペプチド配列である。
配列番号２は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ２のペプチド配列である。
配列番号３は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ３のペプチド配列である。
配列番号４は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ３Ｅのペプチド配列である。
配列番号５は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ４のペプチド配列である。
配列番号６は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ５のペプチド配列である。
配列番号７は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ６のペプチド配列である。
配列番号８は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ７のペプチド配列である。
配列番号９は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ７Ｅのペプチド配列である。
配列番号１０は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ８のペプチド配列である。
配列番号１１は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ９のペプチド配列である。
配列番号１２は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１０のペプチド配列である。
配列番号１３は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１１のペプチド配列である。
配列番号１４は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１２のペプチド配列である。
配列番号１５は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１３のペプチド配列である。
配列番号１６は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１４のペプチド配列である。
配列番号１７は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１５のペプチド配列である。
配列番号１８は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１６のペプチド配列である。
配列番号１９は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１７のペプチド配列である。
配列番号２０は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１８のペプチド配列である。
配列番号２１は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ１９のペプチド配列である。
配列番号２２は、本発明の実施例３に従って使用されるエピトープＰＡ２０のペプチド配列である。
配列番号２３は、本発明の炭疽ワクチンの防御抗原（ＰＡ）のアミノ酸配列である。
配列番号２４は、インフルエンザウイルスエピトープＭ２ｅのアミノ酸配列である。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明の実施形態を示す添付の図面を参照しながら、本発明を以下でより詳細に説明する。本発明は、しかし、多くの異なる形態で具体化でき、本明細書で示す実施形態に限定されると解釈されるべきではない。
【００１６】
本発明は、一部には、ワクチン等としての使用のための新規植物ウイルス様粒子を作製するための新規ウイルス不活性化方法に関する。ウイルス不活性化のための方法を本明細書で述べる。本発明は、キメラ植物ウイルス粒子の不活性化及びウイルス粒子精製手順への不活性化工程の組込みの例を提供する。不活性化方法は、ウイルスを植物に感染することができないようにする。本発明の実施形態は、不活性化植物ウイルス様粒子の表面での病原体由来エピトープのエピトープ提示に基づく安全なワクチンを生産するための手段及び方法を含み得る。
【００１７】
本発明の実施形態は、ウイルスの完全な感染性ゲノムを欠くウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生産するためのウイルスの不活性化についての効率的で拡大可能な手順を含む。そのような実施形態は、初期抽出緩衝液として、一般にｐＨ９で、硫酸アンモニウム緩衝液を使用することを含む。硫酸アンモニウムは非毒性であるとみなされ、規制当局によって許容されている。
【００１８】
本発明の実施形態は、約９．０のｐＨ範囲内の硫酸アンモニウムによるウイルス不活性化を含む。ウイルス不活性化はＲＮＡの切断と分解を通して起こり得る。ウイルス粒子は透過性となり得、アンモニウムイオンのウイルス内への侵入を許容し得る。従って、アンモニウムイオンとのインキュベーションはｐＨ８．０を上回って実施されるべきであり、これは、このｐＨレベルでウイルスは「膨張」してその構造を「開放」し、その結果ウイルスコートを通しての低分子の浸透を許容するからである。
【００１９】
本発明はまた、典型的に結合しているＲＮＡを欠く、新規ＲＮＡウイルス様粒子を提供することができ、前記ウイルス様粒子は適切に提示される抗原を含む。
【００２０】
本発明の実施形態は、他の精製操作と継ぎ目のない方法での粒子の不活性化の組込みのための方法を含む。これらの方法は、植物組織が、ｐＨ９の０．７Ｍ硫酸アンモニウムである抽出緩衝液中で収集され、均質化されて、室温で約２０時間インキュベートされる場合を含み得る。インキュベーション後、粒子はもはや植物に対して感染性ではなく、接種後に感染を開始することができない。ｐＨ７．０の同じ条件はウイルスを不活性化せず、より高い温度、すなわち４０℃はウイルス構造を損傷すると思われた。
【００２１】
付加的な処理工程及びパラメータ
本発明の実施形態はまた、不活性化緩衝液中で植物材料を摩砕／均質化すること、摩砕されたスラリーを、ウイルスゲノムＲＮＡを分解するために不活性化緩衝液中でインキュベートすること、及び生じたウイルス粒子を精製することを含み得る。摩砕された材料は、不活性化緩衝液中でのインキュベーションの前に遠心分離／ろ過によってさらに清澄化することができる。インキュベーション後、粒子を、ＰＥＧによって又は硫酸アンモニウムのモル濃度を、粒子を溶液から沈殿させるレベルまで上昇させることによって沈殿させ得る。通常、不活性化工程に続いて緩衝液交換及びクロマトグラフィー工程を実施する。不活性化工程は、いかなる時点でも精製手順に組み込むことができる。例えば一部の手順では、不活性化を以下のように過程に組み込んだ。０．７Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ７中でのＨＩＣカラムへのＣＰＭＶ結合。０．７Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ９での結合ＣＰＭＶの洗浄。０．７Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ９でのＣＰＭＶの溶出。以下の範囲が使用できる。０．５〜１．０Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、８．０を上回るｐＨ及び１０〜４０℃の温度。
【００２２】
ＶＬＰを作製するために使用できるウイルスの種類と選択
本発明のワクチンは、抗原の形態であり得、エンベロープを有さないＲＮＡウイルス（＋、−及び／又は二本鎖）のコートタンパク質に融合できる。本発明の実施形態は、正二十面体植物ＲＮＡウイルスと共に植物ＲＮＡウイルスを含み得る。本明細書ではササゲモザイクウイルスを例示するが、本発明の方法は他の類似ウイルスにも適用できる。例えば、本発明に従った使用のための、一部の好ましいウイルスは以下の通りである。
【００２３】
【表１】
【００２４】
本発明はいかなるＲＮＡ植物ウイルスにも適用できる。このシステムを明らかにするため、植物ウイルス、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）を選択した。ＣＰＭＶの三次元構造は公知であり、これは、粒子構造の破壊を伴わない修飾に適した部位の同定を可能にする。現在まで、少なくとも９の植物ウイルス属からのウイルス及び３つの亜型２ｓｓＲＮＡサテライトウイルスが、高分解能でそれらの三次及び四次構造が解明されている。これらの一部を上記の表１に列挙する。
【００２５】
ベクターとしての使用のための植物ウイルスの１つの例示的な群は、そのコートタンパク質がβバレル構造を有するものである。βバレル構造を有するウイルスを使用することの利点は、βシートの個々の鎖間のループが外来性ペプチドの挿入のために好都合な部位を提供することである。１又はそれ以上のループの修飾は、本発明に従った外来性ペプチドの発現のための１つの戦略であり得る。コートタンパク質の他の領域への挿入、例えばＮ末端及び／又はＣ末端への挿入も可能である。
【００２６】
その構造が解明されている正二十面体対称性を有するすべての植物ウイルスは、ＣＰＭＶに例示される８本鎖βバレルフォールドに適合し、これがすべての正二十面体ウイルスにおける共通構造である可能性が高い。そのようなウイルスはすべて、β鎖の間のループ及び／又はＮ末端及び／又はＣ末端で起こり得る、外来性ペプチド配列の提示のための本発明における使用に適する。
【００２７】
異種又は外来性配列を挿入するためにＤＮＡ配列を修飾する方法は当分野で周知である。一般にウイルスＲＮＡ配列は、完全長ｃＤＮＡ転写産物に変換し、ベクターにクローニングして、その後外来性ＤＮＡセグメントを、ＲＮＡ複製、粒子形成を破壊することなく、又は感染性を妨げることなくそのような挿入を認容することができる領域に挿入することによって修飾される。
【００２８】
コモウイルスは、主としてマメ科植物に感染する少なくとも１４の植物ウイルスの群である。それらのゲノムは、直径約２８ｎｍの同寸法の粒子内に別々にキャプシド化された、異なる大きさの一本鎖プラス‐センスＲＮＡの２個の分子からなる。２種類のヌクレオタンパク質粒子は、塩化セシウム密度勾配でのそれらの行動の結果として中間（middle:Ｍ）及び底部（bottom:Ｂ）成分と称され、粒子内のＲＮＡはそれぞれＭ及びＢ ＲＮＡとして知られる。どちらの型の粒子も、高分子（ＶＰ３７）及び低分子（ＶＰ２３）コートタンパク質の各々６０コピーからなる同じタンパク質組成物を有する。ヌクレオタンパク質粒子に加えて、コモウイルス試料は、上部（top:Ｔ）成分として知られる可変量の空の（タンパク質のみの）キャプシドを含有する。
【００２９】
コモウイルス群のタイプメンバーであるササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）の場合、Ｍ及びＢ ＲＮＡの両方がポリアデニル化され、それらの５’末端に共有結合された低分子タンパク質（ＶＰｇ）を有することが知られている。他のコモウイルスに関するより限られた試験は、これらの特徴が群のすべてのメンバーのＲＮＡによって共有されることを示唆する。ＣＰＭＶからの両方のＲＮＡが配列決定され、ポリ（Ａ）尾部を除いて、３４８１（Ｍ）及び５８８９（Ｂ）ヌクレオチドからなることが示された（van Wezenbeek et al. 1983; Lomonossoff and Shanks, 1983）。両方のＲＮＡが、１つの長いオープンリーディングフレームを含有する。ウイルス遺伝子産物の発現は、大きな前駆体ポリペプチドの合成とその後の切断を通して起こる。両方のＲＮＡが植物全体の感染のために必要である。より大きなＢ ＲＮＡはプロトプラスト中で独立して複製することができるが、この場合ウイルス粒子は生成されない（Goldbach et al., 1980）。この所見は、より早期の遺伝学的試験と合わせて、コートタンパク質がＭ ＲＮＡによってコードされること、及び感染性ウイルス粒子の形成がＢ及びＭの両方のウイルスゲノムＲＮＡの存在に依存することを確証した。
【００３０】
コモウイルス科の利点は、キャプシドが、個別に操作できる３つの異なるβバレルの各々６０コピーを含有することである。上記に列挙した他のすべてのウイルス科及び属は、類似の三次元構造を有するが、１種類のβバレルを備える。（ＣＰＭＶの場合は、例えば、外来性挿入物は低分子キャプシドタンパク質（ＶＰ２３）のβＢ−βＣループ内のプロリン２３（Ｐｒｏ23）残基の直前に作製できる。米国特許第６，８８４，６２３号参照。
【００３１】
本発明はまた、その結晶構造がまだ決定されていない正二十面体植物ウイルス（βバレル構造を有するものを含有する）にも適用できる。結晶構造が未知のウイルスと結晶構造が公知である第二のウイルスの間でコートタンパク質遺伝子内に有意の配列相同性が存在する場合、一次構造のアラインメントはβ鎖の間のループの位置を推測することを可能にする［Dolja, V. V. and Koonin, E. V. (1991) J. Gen. Virol., 72, pp 1481-1486参照］。加えて、ウイルスが、結晶構造が決定されているウイルスに対してごくわずかなコートタンパク質配列相同性を有する場合、潜在的挿入部位の位置の決定を可能にするために、一次構造アラインメントを適切な二次及び三次構造予測アルゴリズムと共に使用し得る。
【００３２】
ＣＰＭＶ及びインゲンポッドモトルウイルス（bean pod mottle virus）（ＢＰＭＶ）は、ＢＰＭＶとＣＰＭＶの三次元構造が非常に類似し、一般にコモウイルス科に特有であることを示す。
【００３３】
ＣＰＭＶは、２つのサブユニット、低分子（Ｓ）及び高分子（Ｌ）コートタンパク質を含み、ウイルス粒子当たりその各々６０コピーが存在する。外来性ペプチド配列は、Ｌ又はＳタンパク質のいずれかから又は同じビリオン上で両方のコートタンパク質から発現され得る。
【００３４】
ＣＰＭＶは二分節ＲＮＡウイルスである。何らかのＲＮＡウイルスのゲノムを、外来性ペプチドを発現するように操作するために、ＲＮＡのｃＤＮＡクローンが使用できる。両方のＣＰＭＶ ＲＮＡ分子の完全長ｃＤＮＡクローンが使用可能であり、外来性ペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列を挿入するために操作できる。植物ＲＮＡウイルスからのゲノムのｃＤＮＡクローンは、植物に接種したとき感染性であるインビトロ転写産物を生成するために使用できる。
【００３５】
本発明のさらなる態様では、植物中で感染性転写産物を生成するためにウイルスｃＤＮＡの５’末端に連結されたキャッサバ葉脈モザイク（ＣｓＶＭＶ）プロモーター配列を利用する、ＣＰＭＶ ＲＮＡ Ｍ及びＢのｃＤＮＡクローンを構築し、そのうちＭ ＲＮＡのｃＤＮＡクローンは、外来性ペプチドをコードする挿入オリゴヌクレオチド配列を含む。この手法は、インビトロで生成される転写産物の使用に伴って遭遇する問題のいくつかを克服し、すべての植物ＲＮＡウイルスに適用できる。
【００３６】
他のウイルスは、様々なブロモウイルス、特にササゲクロロティックモトルウイルス（ＣＣＭＶ）及びソベモウイルス、特に南部インゲンモザイクウイルス（ＳＢＭＶ）を含み得る。三分節ウイルスのＲＮＡセグメントも使用できる。そのような有用なウイルスの例は、正二十面体キャプシドにパッケージングされた、ブロモウイルス科の三分節ウイルス、例えばブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）及びササゲクロロティックモトルウイルス（ＣＣＭＶ）である。
【００３７】
ＢＭＶのゲノムは、それぞれ３．２、２．９及び２．１ｋｂのメッセンジャーセンスＲＮＡの１、２及び３に分けられる。コートタンパク質は、ＲＮＡ３から形成されるサブゲノムＲＮＡ４によってコードされる。細胞がＢＭＶ ＲＮＡ３に感染するためには、ＢＭＶ ＲＮＡ１及び２によってコードされるタンパク質が存在しなければならない。これら３つのＢＭＶ ＲＮＡは同一粒子内に別々にキャプシド化されている。各々の粒子は１８０のコートタンパク質を含有する。コートタンパク質は、ペプチド挿入物を担持するように修飾できる。
【００３８】
表１に示す多くのウイルスのコートタンパク質を比較した。二次構造エレメント及びそれらの空間構成の類似性が、米国特許第６，８８４，６２３号の図１０に示されている。β鎖の間に存在するループのいずれもが外来性エピトープの挿入のため使用できる。しかし、挿入は、付加物がウイルスの内側又は外側表面に暴露されるように、及びコートタンパク質サブユニットの構築とウイルスの感染性が破壊されないように行われる。特定ループの選択は、挿入がウイルス集合を妨げる可能性が低いように、結晶構造によって示される、個々のコートタンパク質サブユニットの構造及びそれらの互いの相互作用についての知識を用いて実施できる。正確な挿入部位の選択は、最初に結晶構造の検査、次いで最適部位を同定するためのインビボ実験によって実施できる。
【００３９】
そこで、特にウイルス表面で暴露され、従って潜在的に挿入のための良好な部位であるコートタンパク質の部分を同定するために、植物ウイルスの三次元構造を検討することができる。コートタンパク質の暴露部分のアミノ酸配列も、α−へリックス構造を破壊するアミノ酸に関して検討することができ、なぜなら、これらもまた挿入のための潜在的に良好な部位であるからである。適切なアミノ酸の例は、ポリペプチド鎖においてα−へリックスを中断し、構造内に堅固なねじれ又は屈曲を創造する、プロリン及びヒドロキシプロリンである。コートタンパク質のＮ及びＣ末端も挿入のための魅力的な部位である。
【００４０】
抗原及びエピトープの種類
本発明の実施形態は、サブユニット型ワクチンのための方法を含み得る；すなわち、提示される抗原は、有効であることが公知の抗原のセグメントだけである。そのようなワクチン（抗原）は、感染過程又は疾患の病理に関連するすべての機能性を欠くので、本質的に全生物又は全タンパク質ワクチンよりも安全であり得る。
【００４１】
本発明の実施形態は、炭疽菌（Bacillus anthracis)感染の作用に対するサブユニットワクチンのための方法を含み得る。この炭疽ワクチンにおいて、サブユニット抗原、配列番号２３は、いわゆる防御抗原又はＰＡに由来する約２５アミノ酸のセグメントである。このタンパク質は、炭疽菌に対する免疫を惹起する上で有効であることが公知であり、新生代の炭疽菌ワクチンのための基剤である。
【００４２】
イヌパルボウイルスワクチンも生産できる。例えばLangeveld et al. (2001) 「Inactivated Recombinant Plant Virus Protects Dogs from a Lethal Challenge with Canine Parvovirus」, Vaccine 19:3661-3670及びLangeveld et al. (1995) 「Full Protection in Mink Against Mink Enteritis Virus with New Generation Canine Parvovirus Vaccines Based on Synthetic Peptide or Recombinant Protein」, Vaccine 13:1033-1037参照。これらのウイルス粒子に基づくサブユニットワクチンは、ウイルス病原体（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）に対して有効であることが既に証明され、感染因子による致死的攻撃誘発から動物を保護した。キメラ粒子は、現在、植物を予め操作された組換えウイルスＲＮＡ又はＤＮＡに感染させることによって、ササゲ植物において生産されている。接種後、組換えウイルスは細胞から細胞へと長い距離を伝播する。これは植物の全身感染を生じさせる。感染植物組織を収集し、キメラウイルス粒子を抽出して、製剤し、ワクチンとして使用する。本発明の実施形態によれば、環境保護についての必要条件を満たすためにワクチン候補物質を不活性化することは好都合であり得る。
【００４３】
本発明の不活性化方法は、その後ワクチンとして使用される抗原エピトープを提示する粒子だけでなく、他の有用なペプチド、例えばターゲティングペプチド、抗菌ペプチド等を提示する粒子にも適用できる。この技術はまた、その後粒子表面への様々な部分の共有結合のために使用される野生型又は修飾粒子にも適用できる。これは、抗原タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、核酸、検出試薬（蛍光染料など）、放射性物質、ターゲティングリガンド等を含むタンパク質の結合を含む。粒子複合体は、ワクチンとして並びに標的組織への結合薬剤の送達のため等に使用できる。この技術も、その後投与のため及びカプセル化された物質の送達のために使用される、粒子の内部への様々な物質、例えば薬剤、外来性遺伝子の発現のための外来性核酸、毒素等のカプセル化に先立って適用できる。
【００４４】
本発明に従って使用でき、キャプシドの表面で発現され得る多くのペプチドエピトープの中には、インフルエンザウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス及び炭疽菌からのものを含む、ウイルス及び細菌病原体及び癌からのペプチドエピトープが含まれる。
【００４５】
植物ウイルスに組み込み得る外来性ペプチドは（例えばＷＯ９２／１８６１８参照）、極めて多様な種類であり得る。外来性ペプチドの性質と大きさ及びウイルス粒子内で又はウイルス粒子上でそれが位置する部位の故に、いくつかの制限が存在し得る。ペプチド配列は、インビボで培養したとき修飾ウイルスが集合する能力を妨げてはならない。本明細書において、ペプチド又はそれをコードする核酸に適用するとき、「外来性」という用語は、ベクターとして使用される植物ウイルスにとって天然ではないペプチド又は核酸配列を意味する。そのような配列は、選択的に、外因性又は異種配列とも表わされ得る。「ペプチド」という用語は、低分子ペプチド及びポリペプチドを含む。ペプチドは、一般に６以上のアミノ酸残基を含有する。
【００４６】
修飾ウイルス粒子は、何らかの生物学的有用なペプチドから形成され得る。そのようなペプチドの例は、ペプチドホルモン；酵素；増殖因子；原生動物、ウイルス、細菌、真菌又は動物起源の抗原；抗イディオタイプ抗体を含む抗体；免疫調節剤及びサイトカイン、例えばインターフェロン及びインターロイキン；受容体；付着因子；及び前記種類のペプチドのいずれかの部分又は前駆体である。
【００４７】
植物ウイルスベクター上で提示される広範囲の生物活性ペプチド配列の中で（例えばＷＯ９２／１８６１８による）、特に重要なのは、ワクチンの基剤である抗原ペプチド、特に動物（ヒトを含む）ウイルス及び細菌ウイルスである。ワクチンは予防的（すなわち疾患予防）又は治療的（すなわち疾患治療）適用を有し得ることに留意すべきである。ワクチン適用のために、特に魅力的なエピトープ提示系が提供される。そのような適用のために使用するとき、抗原ペプチド成分は、例えばウイルスのコートタンパク質の暴露部分に位置することによって、免疫系によって容易に認識されるようにウイルス粒子上に適切に位置づけられる。そこで、本発明の一部の実施形態では、植物ウイルスのコートタンパク質の表面の暴露部分に組み込まれた、病原体、例えば動物ウイルス又は細菌病原体に由来する抗原を含有する修飾植物ウイルスの集合粒子が提供される。集合修飾植物ウイルス粒子は、ワクチンの免疫原成分として使用できる。抗原ペプチドを提示するそのような集合修飾植物ウイルス粒子はまた、例えば動物（ヒトを含む）病原体及び疾患の検出のための、免疫診断アッセイの抗原提示成分としての適用を有する。
【００４８】
本発明の実施形態では、抗原性ＶＬＰは、抗原の完全性を維持しながら不活性化される及び／又は非感染性にされる。従ってこれは、それらが植物ウイルスである場合でも、感染性ウイルス粒子の意図しない伝播の危険性を排除する。これは、規制懸念を大きく削減することができる。そこで、植物への植物ウイルスの伝播と拡大は、治療される人間又は動物に投与された後、大きく低下する。この系は、ウイルスコートタンパク質に挿入され得る外来性ペプチドの大きさに関して極めて融通性がある。すなわち、３８まで又はそれ以上のアミノ酸を含有するペプチドが本発明に従って使用できる。
【００４９】
投与方法
これらの、今や組換え体であるウイルスのための投与方法は、粘膜に投与されるエーロゾルを含み得る。しかし、様々な投与方法が本発明に従って使用できる。これらは、注射投与（ＩＰ、ＩＭ、ＳＣ）、あるいは経皮、鼻内又は経口投与を含む。
【００５０】
候補ウイルス、そのキャプシド形態学、及びその中への抗原／エピトープの挿入
外来性ペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントは、ウイルスが複製し、宿主に感染する能力に干渉せず、及びペプチドの適切な生産と修飾ウイルス粒子上でのペプチドの提示を可能にする、もとのウイルスのコートタンパク質内の適切な位置に挿入され得る。一般に、外来性ポリヌクレオチドは、コートタンパク質の一部として又はコートタンパク質との融合物として生産されるように挿入される。
【００５１】
ＲＮＡ転写産物は、当分野で公知のように、インビボで、例えば細菌宿主において、又はインビトロで調製され、適切な植物宿主又は植物組織に接種するために使用される。キャプシド化は宿主生物内で起こるので、ＲＮＡはキャプシド化形態で又は溶液中で使用され得る。あるいは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに融合したウイルスＤＮＡが、植物宿主においてインビボでウイルスＲＮＡの転写を開始させるために使用できる。転写されたＲＮＡは、その後、植物宿主においてウイルス感染を開始することができる。
【００５２】
当業者に理解されるように、所与のウイルスは、シス又はトランスで作用する遺伝子の存在を含む、最適の感染性及び複製のために特別の条件を必要とすることがあり、植物又は植物組織に感染するときにはそれらのすべてが存在すべきである。例えばＢＭＶ ＲＮＡ３の感染性のためには、ＢＭＶ ＲＮＡ１及び２の存在が必要である。さらに、所与の宿主に関して必要な宿主特異性遺伝子を有するウイルスによる感染は、一部の状況では、通常はその宿主に影響を及ぼさない第二のウイルスによる宿主の感染を可能にすることがあり、例えばＢＭＶ単独ではタバコに感染せず、ＴＭＶ単独ではオオムギに感染しないが、ＴＭＶとＢＭＶウイルスの混合物はオオムギとタバコの両方に感染する（Hamilton and Nichols (1977) Phytopathology, 67:484-489）。
【００５３】
植物は、圃場及び／又は温室条件下でトランスフェクトされ得る。通常、葉組織の表皮剥離がトランスフェクションのために必要である。植物は、成長周期の間のいずれの時点でも接種することができ、好ましくは植物が幼若であるときに接種する。ウイルスの選択及び修飾の詳細は、当業者に公知であり、理解されているパラメータに依存する自由選択事項である。
【００５４】
コートタンパク質を修飾することに加えて、他の適切な遺伝子を宿主植物における発現のためにもとのウイルスゲノムに挿入し得る。これらは、植物における商業的に有用なペプチド、タンパク質、薬剤又は他の何らかの有用なポリペプチドの生産のための遺伝子を含む。一般に、その発現産物が植物細胞において機能性である異種遺伝子は、ここで述べるウイルス発現系に挿入することができる。
【００５５】
修飾されたコートタンパク質自体を異種ウイルスのゲノムに挿入することができる。異種コートタンパク質遺伝子の翻訳の忠実性を確実にするためには、もとのコートタンパク質についての翻訳開始ＡＴＧコドンを、それが欠失されていない場合は、修飾する必要があり得、これは当分野で公知の手段によって、例えばオリゴヌクレオチド指定置換によって達成され得る。付加されるコートタンパク質配列がそれ自体の翻訳開始コドンを有する場合は、もとのタンパク質についての開始コドンの欠失又は不活性化が必要である；あるいは、しかしながら、それによって導入されるアミノ酸配列変化がＲＮＡパッケージング及びキャプシド形成を妨げないことを条件として、前記開始コドンは保持されてもよく、付加されるコートタンパク質配列の翻訳を開始するために使用され得る。
【００５６】
広い範囲の感受性植物宿主及び植物細胞が使用できる。これらは、双子葉及び単子葉植物、植物の組織並びに懸濁培養で増殖する又はカルスを形成する植物細胞を含む。
【００５７】
さらなる処理工程
修飾植物ウイルス粒子を作製するために、外来性ペプチド（動物ウイルス又は細菌抗原など）をコードするヌクレオチド配列を、コートタンパク質をコードする植物ウイルスゲノムの部分との融合物として導入し、植物又は植物細胞を修飾ウイルス核酸に感染させて、修飾ウイルスの集合粒子を採取することにより、植物ウイルス核酸を修飾することができる。単離ウイルスを、その後、本発明に従って不活性化する。
【００５８】
外来性ペプチドをコードする核酸配列は、典型的には、コートタンパク質の暴露部分をコードする植物ウイルスゲノムの部分で導入される。この手順は、ＲＮＡウイルスのＲＮＡに対応するｃＤＮＡの操作によって実施できる。ＲＮＡウイルスの場合は、修飾ウイルスの集合粒子の採取の前に操作段階を達成するために、通常、修飾ＤＮＡのＲＮＡ転写産物を植物細胞、又は好ましくは全植物の接種のために調製する。あるいは、ウイルスコートタンパク質をコードする配列の５’末端が植物宿主において活性なプロモーターの転写開始部位に直接融合されるように、ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡクローンをプラスミドにおいて構築し得る。外来性ペプチドは、最初にキャプシドタンパク質の部分として発現され、それにより全ウイルス粒子の部分として生産される。ペプチドは、従って、それ自体での使用が意図された複合体分子として生産され得る。あるいは、ウイルス粒子からの開裂を生じさせる適切な試薬の適用によってウイルス粒子から所望ペプチドの放出を可能にするために、ウイルスの遺伝子修飾を設計し得る。これは、酸加水分解に感受性である対象ペプチドに隣接するアミノ酸を挿入することによって達成され得る。例えばａｓｐ−ｐｒｏアミノ酸を挿入ペプチドに隣接するように操作することができ、ペプチドは、弱酸での処理によって粒子から放出され得る。
【００５９】
商業規模で修飾ウイルスを生産するために、ウイルス生産の各バッチについて無効な接種剤（ＤＮＡ又はＲＮＡ転写産物）を調製する必要はない。その代わりに、初期接種剤を、植物を感染させるために使用し得る；生じた修飾ウイルスを植物において増幅して、全ウイルス又はウイルスＲＮＡをその後のバッチのための接種剤として生産し得る。
【００６０】
外来性ＲＮＡ又はＤＮＡは、様々な立体配置で植物ウイルスゲノムに挿入し得る。例えばコートタンパク質をコードする既存の核酸への付加物として又はコートタンパク質をコードする既存配列の一部の置換物として挿入し得る。この選択は、一部には、コートタンパク質の構造及び遺伝的に修飾されたウイルスが植物中で粒子へと集合する能力を妨げずに付加又は置換を実施し得ることの容易さによって決定され得る。本発明のための付加又は欠失の許容される最も適切な大きさの決定は、各々特定の場合に、おそらく多少の付加的な実験を伴って、本開示に照らして実施され得る。付加挿入物の使用は、一部の場合には、置換挿入物よりも大きな柔軟性を提供すると思われる。
【００６１】
植物における修飾ウイルスの増殖は有意の収量を生産することができる。上述したように、挿入される異種ヌクレオチド配列は、容易に切断されるアミノ酸をコードするものを含み得るので、増殖段階後に、所望物質をウイルス粒子から分離し得る。例えば２個のペプチドをコートタンパク質に挿入することができ、１個は、例えばアフィニティー精製による修飾粒子の精製のために使用されて、精製後に切断除去される；他方は、粒子上に保持され、ワクチン接種のために使用される抗原ペプチドであり得る。ペプチドの全体切断に代わるものとして、一部の場合には、キャプシドの主要部分内が無傷のままである形態でペプチドを放出することが可能であり、望ましいと考えられる。
【００６２】
本発明のもう１つの態様によれば、２つの異なる制限酵素部位を、コートタンパク質をコードするウイルス核酸内で選択してもよく、適切な制限酵素を用いて核酸を制限する。ウイルスコートタンパク質に挿入することが望まれる外来性ペプチドをコードする相補的オリゴヌクレオチドの対を合成する。オリゴヌクレオチドは制限酵素部位と適合性の末端で終結し、従って制限ウイルス核酸への挿入を可能にする。この手順は、コートタンパク質配列内への、外来性ペプチドをコードするヌクレオチド配列の導入を生じさせる。
【００６３】
本明細書で使用するとき、「ハイブリッドＲＮＡウイルス」又は「修飾ＲＮＡウイルス」という用語は、ＲＮＡウイルスに由来する感染性ウイルス配列と、もう１つ別の供給源に由来するエピトープ／抗原／ペプチドについてのポリヌクレオチドセグメントを含む、組換えウイルスＲＮＡ配列を指す。従って、不活性化の前には、本発明のハイブリッド又は修飾ウイルスＲＮＡは、１個のＲＮＡウイルスに由来する感染性ウイルス配列と、もう１つ別のウイルス、細菌又は他の供給源に由来するエピトープ／抗原／ペプチドについてのポリヌクレオチドセグメントを含むＲＮＡ配列である。「ハイブリッドＲＮＡビリオン」又は「ハイブリッドウイルス粒子」という用語は、そのようなウイルスのキャプシド化形態を指すために使用され得る。挿入されるペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントを受け入れるのに適したもとのウイルスＲＮＡ配列は、ＲＮＡウイルスのものに対応する配列の一例である。これらの配列は、挿入又は別の方法によって修飾されたとき、もとの／天然に生じるウイルス配列「に由来する」。
【００６４】
そのようなウイルス配列は、最小限、宿主における複製能力及び宿主に感染する能力の機能を有さなければならない。そのような機能の決定因子は、シスで必要とされるか、又は別の場合にはトランスで供給され得る。トランスでの複製に十分である条件の一例は、ＢＭＶ ＲＮＡ３が宿主において複製するのを可能にするための、ＢＭＶ ＲＮＡ１及び２によってコードされるタンパク質の存在の必要性である。これに対し、ＲＮＡ１及び２により感染細胞で誘導される機構によってＲＮＡ３誘導体を複製させるには、ある種の複製シグナルがシスで（すなわちＲＮＡ３誘導体に直接結合して）存在しなければならない。トランス機能のもう１つの例は、ＣＰＭＶ ＲＮＡ２が宿主において複製することを可能にするための、ＣＰＭＶ ＲＮＡ１によってコードされるタンパク質である。これに対し、ＲＮＡ１によって感染細胞において誘導される機構によるＲＮＡ２誘導体の複製を可能にするためには、ある種の複製シグナルがシスで（すなわちＲＮＡ２誘導体に直接結合して）存在しなければならない。
【００６５】
また、もとのウイルス配列が外来性又は異種ペプチドをコードするポリヌクレオチドの付加のために適切な部位を有することも望ましいと考えられる。これらのポリヌクレオチドセグメント及び配列に関する「外来性」及び「異種」という用語は、天然でもとのウイルスにはない配列を意味する。同様に、外来性又は異種ペプチド及びポリペプチドは、本明細書ではウイルス発現／産生系に付加された抗原又はエピトープを指す。そのような外来性ポリヌクレオチド又は配列は、もとのウイルス配列に必要な機能、すなわち複製し、宿主に感染する能力に干渉しない位置で挿入され得る。宿主における発現に関して、「異種」又は「単離」ポリヌクレオチドは、それが配置された宿主内の位置に天然では存在しないポリヌクレオチドである。異種ペプチドをコードするセグメントの配置は、もとのウイルス配列の必要な機能に干渉しないことが望ましい。
【００６６】
挿入される核酸セグメントは、天然に生じる必要はなく、修飾されていてもよく、２個以上のコードセグメントの複合物であってもよく、又は２個以上のペプチド／ポリペプチドをコードしてもよい。ＲＮＡもまた、修飾ＲＮＡ分子の全長又は他の性質を制御するために挿入と欠失を組み合わせることによって修飾され得る。
【００６７】
挿入される外来性ＲＮＡ配列は、非ウイルス又はウイルス起源であり得、本来はＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかに相当し得る。それらは、受容細胞の翻訳機構によって直接翻訳され得るか又はさもなければそれらの機能、構造又は調節機能のために認識され、利用され得る形態である限り、原核生物又は真核生物起源であり得る。
【００６８】
いかなる植物も、当業者に明らかなように、適切な宿主特異性と複製機能を与えることにより、本発明のＲＮＡ配列に感染させ得る。適切な構築物により、他の真核生物も、単細胞及び組織培養物と同様に感染させ得る。本発明は、宿主の所与のクラス又はＲＮＡウイルスの型に限定されない。
【００６９】
「全身感染」という用語は、最初の接種部位の細胞より多くを含むように宿主生物系を通して感染が拡大することを意味する。宿主生物全体が感染する必要はない；ある種の組織が感染の標的であり得る。好ましい組織は葉組織である。
【００７０】
宿主生物に適用される「トランスフェクトされた」という用語は、その内部で複製されるような方法で生物細胞内に本発明のウイルス配列を組み込むことを意味する。トランスフェクトさせるために、生物を全身感染させる必要はないが、全身感染させ得る。しかし、ウイルスの全身拡大は本発明のために必要ではない。
【００７１】
宿主生物の感染を開始するための方法は当分野において周知であり、いかなる適切な方法も使用し得る。植物の感染のための好ましい方法は、ウイルスがその内部で複製するか又は植物に感染するように、傷つけた植物をウイルス又はウイルスＲＮＡを含有する溶液と接触させることである。
【００７２】
本発明の実施形態は、植物において及び植物によってワクチン様ポリペプチド及び他のポリペプチドを生産するためのベクター系として植物ウイルスを利用することができる。本発明の１つの態様は、ＲＮＡが本発明の方法を用いて除去された又は非感染性にされた、ウイルスのコートタンパク質の部分として所定の外来性ペプチドを含有する植物ＲＮＡウイルスの集合粒子に関する。本発明はまた、内部提示が可能である、外来性ペプチドを提示する植物ウイルスの集合粒子を含み得る。本発明はまた、感染性ＲＮＡを欠くウイルスを含む。
【００７３】
ワクチンの製剤に適用されるとき、本発明は、従来のワクチン、動物ウイルス又は細菌に基づく組換えワクチン、及びペプチドワクチンに比べて利点を有すると考えられ、それらは以下を含む：１）純粋なウイルス粒子の非常に高い収量が感染植物から入手可能であり、組織培養生産工程を必要としないので、より低い生産コスト；２）植物ウイルスは動物において感染及び複製することができず、従って、従来のワクチンや組換え動物ウイルスワクチンの場合のように毒性形態に突然変異することができないので、改善された安全性；３）有効性を失わずに精製製剤を乾燥して、何年間も保存することができるので、コモウイルスとして例外的な安定性；４）免疫原性の上昇を生じさせ、従って粒子の表面でのペプチドの提示をもたらす、ペプチドの複合の欠如；及び５）インビボでの相同的組換え（トランスフェクション）と異なり、インビトロでの操作によるキメラ遺伝子の導入を可能にする、より低分子のウイルス。
【００７４】
異なる指示がない限り、本明細書で使用する「１つの」（「a」、「an」）及び「その」（「the」）は、少なくとも１つを指す。
【００７５】
本明細書で言及する又は引用するすべての特許、特許出願、特許仮出願及び刊行物は、本明細書の明白な教示と矛盾しない範囲でそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７６】
以下は、本発明を実施するための手順を説明する実施例である。これらの実施例は限定と解釈されるべきではない。異なる記載がない限り、すべてのパーセンテージは重量比であり、すべての溶媒混合物の割合は容積比である。
【実施例】
【００７７】
実施例１
ＣＰＭＶ粒子の不活性化の要旨
１７以上の異なるＣＰＭＶ粒子（異なるエピトープを担持する）ならびに野生型ＣＰＭＶウイルスを、この手順を用いて不活性化した。ＲＮＡを不活性化ウイルスから単離し、ＲＮＡが分解されているかどうかを判定するためゲル上で泳動させた。また不活性化粒子を、感染を誘導する能力に関して試験するために植物に接種した。接種した植物のいずれも、ウイルス感染を生じなかった。不活性化ウイルス粒子から単離したＲＮＡは、試験したいずれの場合にも分解された（一例として図１参照）。
【００７８】
実施例２
ＣＰＭＶ不活性化のさらなる例
０．８Ｍ硫酸アンモニウムが、ＣＰＭＶの完全性を保存しながらＣＰＭＶを不活性化できるかどうかを測定するための試験を設計した。０．８Ｍ硫酸アンモニウムを本発明の精製過程の一部として使用した。過程の間のｐＨ上昇はウイルスの透過性を上げるが、同時に遊離ＮＨ3の濃度も上昇させる。
【００７９】
この試験からの結論は、２２℃及び４０℃でｐＨ９及びｐＨ７の０．８Ｍ硫酸アンモニウムはウイルスの完全性を保存し、ウイルスの感染性はｐＨ９でのみ失われるというものであった。ＣＰＭＶを２２℃及び４０℃にて３０ｍＭトリス−ＨＣｌ中でインキュベートした対照実験は、完全に感染性のＣＰＭＶ粒子を生産した。これらの結果から、不活性化を生じさせるために必要であるのは０．８Ｍ硫酸アンモニウムとｐＨ９の組合せであり、温度又は硫酸アンモニウム単独ではないとさらに結論された。この試験では、適切な硫酸アンモニウム濃度とｐＨに調整した摩砕細胞汁液に関して実験を実施し、植物スラリー中の化合物が不活性化を生じさせている（例えばソラレン）懸念があった。これを立証する又は反証するため、精製ＣＰＭＶ粒子が硫酸アンモニウムとｐＨ９の組合せを用いて不活性化され得るかどうかを判定するための２番目の試験を設計した。化学物質中の何らかの不純物が不活性化の原因であるかどうかを判定するために様々な純度グレードの化学物質を使用した。実験マトリックスを設定し、すべての条件を表１に示すように試験した。容易な組込みが可能であるように、本発明者らの再最適化過程の一部であるので０．７Ｍ硫酸アンモニウムを使用した。
【表２】
【００８０】
ｐＨ９で０．５Ｍ及び０．７Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4の濃度はＣＰＭＶを不活性化したが、ｐＨ９で０．１Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4はＣＰＭＶを不活性化しなかった。図１は、活性及び不活性化ウイルスから抽出し、１．２％アガロースゲル上を泳動させて、ＥｔＢｒで染色したＲＮＡを示す。結果は、活性ウイルス中のＣＰＭＶゲノムＲＮＡ１及び２の存在、及び不活性ウイルス調製物中の分解されたＲＮＡを示す。１５超の他のキメラウイルス粒子及び野生型ウイルスについても同じ結果が得られた。
【００８１】
実施例３
不活性化実験において使用したキメラＣＰＭＶ粒子
炭疽菌の防御抗原（「ＰＡ」）タンパク質に由来するペプチドを発現するキメラＣＰＭＶ粒子を構築した。米国特許第５，８７４，０８７号、同第５，９５８，４２２号及び同第６，１１０，４６６号に述べられている方法を使用して、ＣＰＭＶの高分子及び／又は低分子コートタンパク質上でペプチドを発現させた。以下のペプチドが発現された。
【００８２】
【表３】
【００８３】
実施例４
植物におけるキメラＣＰＭＶ粒子の生産
Ｆｅｒｒｙ ＭｏｒｓｅからのＣｏｗｐｅａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｎｏ．５種子、カタログ番号１４５０をぬらしたペーパータオルにおいて室温で一晩発芽させた。発芽した種子を土壌に移した。発芽後７日目に、実生苗にＷＴ又はキメラＣＰＭＶ粒子を接種した。接種後、植物を２５℃にて、明１６時間、暗８時間の光周期で２〜３週間成長させた。症状を示した葉を採取し、精製の前に−８０℃で凍結した。
【００８４】
実施例５
キメラＣＰＭＶ粒子の不活性化及び不活性化キメラＣＰＭＶウイルス様粒子の精製
ＣＰＭＶ感染葉組織４０ｇを−８０℃で凍結した。凍結葉組織を手で破砕し、Ｗａｒｉｎｇ高速混合機、カタログ番号８０１１Ｓに注ぎ入れた。低温不活性化緩衝液１２０ｍｌ（０．５Ｍ硫酸アンモニウム、０．０３Ｍトリス塩基、ｐＨ９．００、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ）を破砕した葉に注いだ。葉を高速で３秒間、２回粉砕した。溶液を５００ｍｌ遠心管中に傾瀉した。混合機を低温不活性化緩衝液３０ｍｌで洗い、洗浄液を５００ｍｌ遠心管に注ぎ入れた。植物細胞デブリを除去するために溶液を１５，０００Ｇで３０分間遠心分離した。上清をメスシリンダー中に傾瀉し、ウイルスを不活性化するために室温で２０時間インキュベートした。ＣＰＭＶウイルスを沈殿させるため、低温ＰＥＧ６０００溶液（２０％ＰＥＧ６０００、１Ｍ ＮａＣｌ）を上清に添加して、最終ＰＥＧ濃度を４％ＰＥＧ６０００、０．２Ｍ ＮａＣｌとし、溶液を静かに混合した。溶液を氷上で１時間沈殿させた。ウイルス沈殿物溶液を、次に、１５，０００Ｇで３０分間遠心分離して、ＣＰＭＶウイルスペレットを収集した。上清を廃棄し、ウイルスを直ちに陰イオン交換結合緩衝液（３０ｍＭトリス塩基、ｐＨ７．５０）に再懸濁した。ウイルス様粒子をさらに精製するため、タンパク質混合物を、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ強陰イオン交換樹脂、カタログ番号１−２５５９−１１を使用した陰イオン交換クロマトグラフィーによって分画した。２０カラム容量勾配は、緩衝液Ａ、３０ｍＭトリス塩基、ｐＨ６．７５から緩衝液Ｂ、３０ｍＭトリス塩基、ｐＨ６．７５及び１Ｍ ＮａＣｌまでであった。クロマトグラフィーは、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ、カタログ番号１８−１１１２−４１で実施した。図２は、ＰＡ７ＥのＡＩＥＣクロマトグラムを示す。実施例３で列挙したすべての試料を、本実施例で述べる方法を用いて処理し、同様の結果を得た。２つの主要ピークが検出された。青色のトレースは２８０の吸光度、赤色トレースは２６０の吸光度、緑色トレースは緩衝液Ｂパーセント、及び褐色トレースは伝導率である。クロマトグラムの下部の赤色の目盛は画分である。所望ウイルス様粒子を含有する勾配上の最初のピークを、１００ｋＤａカットオフ膜のＭｉｌｌｉｐｏｒｅスピン濃縮機、カタログ番号ＵＦＣ９１００９６を使用してＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中に緩衝液交換した。その後試料を−８０℃で保存した。２番目のピークは切断された粒子夾雑物を含有した。ＰＡ７Ｅ ＰＥＧ沈殿物のＡＩＥＣ負荷物、ＷＴ ＣＰＭＶ標準品、及びＡＩＥＣ ＰＡ７Ｅ分画に関して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｕｐａｇｅ ４〜１２％ビス−トリス、１２ウェルゲル、カタログ番号ＮＰ０３２２で実施した。泳動緩衝液は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｕｐａｇｅ ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液、カタログ番号ＮＰ０００２であった。ゲルを２００Ｖの電圧低下で３５分間泳動させた。レーン１は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２ ラダー、カタログ番号ＬＣ５９２５を含有した。レーン２は、ＡＩＥＣカラムに負荷した再懸濁ＰＥＧ沈殿物ＰＡ７Ｅを含有した。レーン３は、ＷＴ ＣＰＭＶを含有した。レーン４〜８は、ＡＩＥＣピーク１に対応する標的精製ＰＡ７Ｅ粒子を含有し、それらを収集して、さらに処理した。レーン９〜１０は、ＡＩＥＣピーク２に対応する切断ＰＡ７Ｅ粒子夾雑物を含有した。
【００８５】
実施例６
不活性化キメラＣＰＭＶウイルス様粒子の分析−ウイルスゲノムＲＮＡ抽出
Ａｍｂｉｏｎ ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ、カタログ番号１９１２のキットを、ＰＥＧ精製不活性化ＣＰＭＶ試料からウイルスゲノムＲＮＡを抽出するために使用した。不活性化されなかったＣＰＭＶウイルス粒子を対照として使用した（活性試料）。図３〜５は、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、ＰＡ１２及びＰＡ１８についてのＲＮＡ不活性化の結果を示す。実施例３で列挙したすべての試料を、実施例６で述べる方法を用いて処理し、同様の結果を得た。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＰｒｅｃａｓｔ １．２％ Ｅ−Ｇｅｌｓ、カタログ番号Ｇ５０１８０１を、図１〜３に関して抽出ＲＮＡを視覚化するために使用した。図３〜５のすべてのラダーは、１ＫＢ ＰＬＵＳ Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号１０７８７−０２６の１ｕｌ負荷であった。図３において、レーン１はラダー１μｌである。レーン２は活性ＰＡ９である。レーン３は不活性化ＰＡ９である。レーン４はラダーである。レーン５は活性ＰＡ１０、レーン６は不活性ＰＡ１０である。レーン７はラダーである。図４では、レーン１はラダー１ｕｌである。レーン２は活性ＰＡ１１である。レーン３は不活性化ＰＡ１１である。レーン４はラダーである。レーン５は活性ＰＡ１２、レーン６は不活性ＰＡ１２である。レーン７はラダーである。図５において、レーン１はラダー１ｕｌである。レーン２は活性ＰＡ１８である。レーン３は不活性化ＰＡ１８である。不活性化試料では、「スミア」の検出によって指示されたようにウイルスゲノムＲＮＡは分解されたが、不活性化を受けなかった試料では完全長ＣＰＭＶゲノムＲＮＡ１及びＲＮＡ２が検出された。
【００８６】
実施例７
不活性化キメラＣＰＭＶウイルス様粒子の分析−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる安定性
低分子及び高分子コートタンパク質の安定性をＳＤＳ−ＰＡＧＥで検定した。図６は、一例としてＰＡ１Ｓについての５日間の温度安定性アッセイのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｕｐａｇｅ ４〜１２％ビス−トリス、１２ウェルゲル、カタログ番号ＮＰ０３２２で実施した。ゲルを１５０Ｖの電圧低下で６０分間泳動させた。泳動緩衝液は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｕｐａｇｅ ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液、カタログ番号ＮＰ０００２であった。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号１０７４７−０１２ ７ｕｌを含有した。レーン２は、室温で５日間インキュベートした不活性化ＰＡ１Ｓウイルス粒子を含有した。レーン３は、４℃で５日間インキュベートした不活性化ＰＡ１Ｓウイルス粒子を含有した。レーン４は、−２０℃で５日間インキュベートした不活性化ＰＡ１Ｓウイルス粒子を含有した。タンパク質分解は検出されなかった。
【００８７】
実施例８
不活性化キメラＣＰＭＶウイルス様粒子の分析−ＳＥＣによる安定性
集合ウイルス様粒子の完全性を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて検定した。実施例３で列挙したすべての試料を、ＳＥＣを使用して分析し、同様の結果を得た。使用したＳＥＣカラムは、１０ミクロンビーズサイズの、Ｓｕｐｅｌｃｏからの３０ｃｍ×７．８ｍｍ Ｔｏｓｏｈ ＴｓｋＧｅｌ Ｇ５０００分析用ＳＥＣカラム、カタログ番号０８０２３であった。ＳＥＣの移動相は、０．１Ｍ ＮａＰＯ4、ｐＨ７．００であった。集合ウイルス粒子に対応する単一ピークが検出された。集合ＣＰＭＶ粒子は１４．０分の保持時間でカラムから溶出した。
【００８８】
実施例９
不活性化キメラＣＰＭＶウイルス様粒子の分析−植物における感染性
実施例３で列挙した不活性化キメラＣＰＭＶ粒子を、植物に感染するそれらの能力に関して試験した。Ｆｅｒｒｙ ＭｏｒｓｅからのＣｏｗｐｅａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｎｏ．５種子、カタログ番号１４５０をぬらしたペーパータオルにおいて室温で一晩発芽させた。発芽した種子を土壌に移した。発芽後７日目に、１０の実生苗に不活性化及び活性ＷＴ又はキメラＣＰＭＶ粒子を接種した。接種後、植物を２５℃にて、明１６時間、暗８時間の光周期で２〜３週間成長させ、症状形成を観察した。不活性化ＷＴ又はキメラＣＰＭＶ粒子を接種した植物は症状を示さなかったが、活性ＷＴ又はキメラＣＰＭＶ粒子を接種した植物はＣＰＭＶ感染の典型的な症状を示した。不活性化ＷＴ又はキメラＣＰＭＶ粒子を接種した葉を採取し、ウイルス粒子単離のために処理した。葉組織４０ｇを−８０℃で凍結した。凍結葉組織を手で破砕し、Ｗａｒｉｎｇ高速混合機、カタログ番号８０１１Ｓに注ぎ入れた。低温３０ｍＭトリス塩基、ｐＨ７．５０ １２０ｍｌ、０．２ｍＭ ＰＭＳＦを破砕した葉に注いだ。葉を高速で３秒間、２回粉砕した。溶液を５００ｍｌ遠心管中に傾瀉した。混合機を低温緩衝液３０ｍｌで洗い、洗浄液を５００ｍｌ遠心管に注ぎ入れた。植物細胞デブリを除去するために溶液を１５，０００Ｇで３０分間遠心分離した。上清をメスシリンダー中に傾瀉した。ＣＰＭＶウイルスを沈殿させるため、低温ＰＥＧ６０００溶液（２０％ＰＥＧ６０００、１Ｍ ＮａＣｌ）を上清に添加して、最終ＰＥＧ濃度を４％ＰＥＧ６０００、０．２Ｍ ＮａＣｌとし、溶液を静かに混合した。溶液を氷上で１時間沈殿させた。ウイルス沈殿物溶液を、次に、１５，０００Ｇで３０分間遠心分離して、ペレット中のウイルス粒子を収集した。上清を廃棄し、ペレットを直ちにＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４に再懸濁した。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでウイルス粒子の存在に関して検定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｕｐａｇｅ ４〜１２％ビス−トリス、１２ウェルゲル、カタログ番号ＮＰ０３２２で実施した。ゲルを１５０Ｖの電圧低下で６０分間泳動させた。泳動緩衝液は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｕｐａｇｅ ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液、カタログ番号ＮＰ０００２であった。ウイルス粒子は検出されなかった。
【００８９】
実施例１０
ＰＡエピトープを含有する不活性化ＣＰＭＶ粒子によるマウスの免疫
７週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスに、アジュバントの存在下で精製不活性化ＣＰＭＶ−ＰＡ１００μｇを腹腔内に３回注射した。対照マウスには、無関係なペプチドを含む不活性化ＣＰＭＶ粒子又はＰＢＳ、ｐＨ７．０中のアジュバントだけを投与した。試料１００μｌと混合したＲｉｂｉアジュバント（Ｒ−７００；Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａ）１００μｌを使用した。投与の総容量は２００μｌであった。注射は３週間の間隔を置いて実施した。
【００９０】
鼻内免疫のために、不活性化ＣＰＭＶ−ＰＡを、アジュバントを伴わずに、麻酔したマウスに投与した。総容量１００μｌを２つの外鼻孔に投与した（各々の外鼻孔につき５０μｌ）。対照マウスには、無関係なペプチドを含む不活性化ＣＰＭＶ又はＰＢＳ、ｐＨ７．０だけを投与した。
【００９１】
最初の投与の１日前及びその後の２回の投与の各々２週間後に血液試料を採取した。
【００９２】
マウス免疫試験の要旨を以下に示す。
【００９３】
【表４】
【００９４】
実施例１１
ＰＡエピトープを含有する不活性化ＣＰＭＶ粒子による非ヒト霊長動物の免疫
ＰＡエピトープを含む不活性化ＣＰＭＶ粒子を、アカゲザルに投与したときの共発現炭疽菌ペプチドに対する抗体応答を生じさせるそれらの能力に関して試験した。４匹のサルを不活性化ＣＰＭＶ−ＰＡペプチド構築物で及び１匹のサルを不活性化野生型ＣＰＭＶ対照で筋肉内経路によって免疫した。各々の免疫用量は、１６のＰＡ−ＣＰＭＶ構築物すべてのウイルス−ペプチド混合物２ｍｇからなった。動物を０、７、１４及び２８日目にワクチン接種した。
【００９５】
ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体を、ＰＡタンパク質を標的としてＥＬＩＳＡアッセイを用いて観測した。各々の免疫日に血液３〜５ｍｌをヘパリン中に採取した。細胞と血漿を分離し、凍結保存した。ケタミン麻酔したサルを０、１４及び２８日目に気管支鏡検査し、気管支洗浄液標本を採取して、凍結保存した。気管支洗浄液と血漿を解凍し、ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体力価をＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した。ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体の両方の高い力価が血漿及び気管支洗浄液中で検出された。結果を図７及び８に示す。
【００９６】
実施例１２
インフルエンザウイルスエピトープＭ２ｅを含有する不活性化ＣＰＭＶ粒子によるマウスの免疫
７週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスに、アジュバントの存在下でインフルエンザペプチドＭ２ｅを発現する精製不活性化ＣＰＭＶ１００μｇを腹腔内に３回注射した。配列は、ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＧＣＲＣＮＤＳＳＤ（配列番号２４）である。対照マウスには、無関係なペプチドを含む不活性化ＣＰＭＶ粒子又はＰＢＳ、ｐＨ７．０中のアジュバントだけを投与した。試料１００μｌと混合したＲｉｂｉアジュバント（Ｒ−７００；Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａ）１００μｌを使用した。投与の総容量は２００μｌであった。注射は３週間の間隔を置いて実施した。
【００９７】
鼻内免疫のために、インフルエンザペプチドＭ２ｅを含有する不活性化ＣＰＭＶを、アジュバントを伴わずに、麻酔したマウスに投与した。総容量１００μｌを２つの外鼻孔に投与した（各々の外鼻孔につき５０μｌ）。対照マウスには、無関係なペプチドを含む不活性化ＣＰＭＶ又はＰＢＳ、ｐＨ７．０だけを投与した。
【００９８】
最初の投与の１日前及びその後の２回の投与の各々２週間後に血液試料を採取した。
【００９９】
マウス免疫試験の要旨を以下に示す。
【０１００】
【表５】
【０１０１】
上記は本発明の例示であり、その限定と解釈されるべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲及びその中に含まれる特許請求の範囲の等価物によって定義される。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】臭化エチジウムで染色した１．２％アガロースゲル上で泳動させたＰＡ１０活性及びＰＡ１０不活性化ウイルスから抽出したＲＮＡを示し、活性ウイルス中のＣＰＭＶゲノムＲＮＡ１及び２、及び不活性化ウイルス製剤中の分解されたＲＮＡを明らかにする。
【図２】ＰＡ７ＥのＡＩＥＣクロマトグラムを示す。
【図３】ＰＡ９、ＰＡ１１及びＰＡ１８のＲＮＡ不活性化を示す。
【図４】ＰＡ９、ＰＡ１１及びＰＡ１８のＲＮＡ不活性化を示す。
【図５】ＰＡ９、ＰＡ１１及びＰＡ１８のＲＮＡ不活性化を示す。
【図６】ＰＡ１Ｓについての５日間の温度安定性アッセイのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図７】ＥＬＩＳＡによって検出されたＣＰＭＶ−ＰＡ免疫サルにおける抗ＰＡ抗体を示す。
【図８】１４０日目の血清及び気管支洗浄液中の抗ＰＡ抗体（ＩｇＧ）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
８．０を上回るｐＨで、植物、植物組織、植物細胞及びプロトプラストからなる群より選択される、ウイルス様粒子を発現する植物材料に硫酸アンモニウムを投与すること、
不活性化ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成するために植物材料を少なくとも１０時間インキュベートすること、及び
植物材料から不活性化ＶＬＰを採取すること
を含む、植物ウイルスを不活性化する方法。
【請求項２】
ウイルスに組み込まれた少なくとも１つの外来性ペプチドをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルスがエンベロープを有さないＲＮＡウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記不活性化ＶＬＰが異種生物活性ペプチドを提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドがエピトープである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
硫酸アンモニウムが０．５Ｍ〜１．０Ｍの濃度で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ｐＨがｐＨ９．０である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
植物材料が１０℃〜４０℃でインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、前記植物ウイルスをｐＨ７の０．７Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4中の疎水性相互作用クロマトグラフィーに結合すること、結合したウイルスをｐＨ９の０．７Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4で洗浄すること、及び前記ウイルスをｐＨ９の０．７Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4で溶出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
ウイルスが、正二十面体であるキャプシドを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ウイルスが、ブロモウイルス科（Bromoviridae）、コモウイルス科（Comoviridae）及びトンブスウイルス科（Tombusviridae）からなる群より選択される科のウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ウイルスが、ブロモウイルス属（Bromovirus）、コモウイルス属（Comovirus）、トンブスウイルス属（Tombusvirus）、アルファモウイルス属（Alfamovirus）及びソベモウイルス属（Sobemovirus）からなる群より選択される属のウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ウイルスが、ササゲモザイクウイルス（cowpea mosaic virus）、ササゲクロロティックモトルウイルス（cowpea chlorotic mottle virus）、トマトブッシースタントウイルス（tomato bushy stunt virus）、アルファルファモザイクウイルス（alfalfa mosaic virus）、ブロムモザイクウイルス（brome mosaic virus）及び南部インゲンモザイクウイルス（southern bean mosaic virus）からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ウイルスがコートタンパク質を含み、及びペプチドがコートタンパク質に融合した抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ペプチドが、ペプチドホルモン、酵素、増殖因子、抗体、免疫調節剤及びサイトカインからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、ウイルスＲＮＡ配列を完全長ｃＤＮＡ転写産物に変換すること、前記ｃＤＮＡをベクターにクローニングすること、及び外来性ＤＮＡセグメントを、ＲＮＡ複製、粒子形成又は感染性を破壊することなくそのような挿入を認容することができる領域に挿入することによって前記ｃＤＮＡを修飾することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
ウイルスに組み込まれた外来性ペプチドが、インフルエンザウイルスのサブユニット、東部ウマ脳脊髄炎ウイルスのサブユニット、イヌパルボウイルスのサブユニット及び炭疽菌（Bacillus anthracis)のサブユニットからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
８．０を上回るｐＨで、植物、植物組織、植物細胞及びプロトプラストからなる群より選択され、及び植物ウイルス中に存在するＲＮＡの少なくとも一部を欠く植物材料に硫酸アンモニウムを投与すること、
植物材料を少なくとも１０時間インキュベートすること、及び
植物材料から、複製することができない不活性化ＶＬＰを採取すること
を含む、非感染性ＶＬＰを生産する方法。
【請求項２０】
ＶＬＰを含むワクチンであって、ウイルスに組み込まれた少なくとも１つの外来性ペプチドを含む植物ウイルスを含み、及び不活性化ＶＬＰを生成するために８．０を上回るｐＨで植物、植物組織、植物細胞及びプロトプラストからなる群より選択される植物材料に硫酸アンモニウムを投与すること、植物材料を少なくとも１０時間インキュベートすること、及び植物材料から不活性化ＶＬＰを採取することを含む方法によって生産される、ワクチン。
【請求項２１】
提供されるＶＬＰペプチドが、前記ＶＬＰを哺乳動物に投与したとき免疫応答を惹起する、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
ワクチンが、インフルエンザウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、イヌパルボウイルス及び炭疽菌のためである、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２３】
ペプチドがエピトープである、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２４】
エピトープが、ウイルス病原体、細菌病原体又は癌である、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２５】
前記ワクチンが、前記ペプチドが抗原の部分であり、前記部分がワクチンとして有効である、サブユニットワクチンである、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２６】
前記外来性ペプチドが配列番号２３を含む、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項１】
８．０を上回るｐＨで、植物、植物組織、植物細胞及びプロトプラストからなる群より選択される、ウイルス様粒子を発現する植物材料に硫酸アンモニウムを投与すること、
不活性化ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成するために植物材料を少なくとも１０時間インキュベートすること、及び
植物材料から不活性化ＶＬＰを採取すること
を含む、植物ウイルスを不活性化する方法。
【請求項２】
ウイルスに組み込まれた少なくとも１つの外来性ペプチドをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルスがエンベロープを有さないＲＮＡウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記不活性化ＶＬＰが異種生物活性ペプチドを提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドがエピトープである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
硫酸アンモニウムが０．５Ｍ〜１．０Ｍの濃度で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ｐＨがｐＨ９．０である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
植物材料が１０℃〜４０℃でインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、前記植物ウイルスをｐＨ７の０．７Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4中の疎水性相互作用クロマトグラフィーに結合すること、結合したウイルスをｐＨ９の０．７Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4で洗浄すること、及び前記ウイルスをｐＨ９の０．７Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4で溶出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
ウイルスが、正二十面体であるキャプシドを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ウイルスが、ブロモウイルス科（Bromoviridae）、コモウイルス科（Comoviridae）及びトンブスウイルス科（Tombusviridae）からなる群より選択される科のウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ウイルスが、ブロモウイルス属（Bromovirus）、コモウイルス属（Comovirus）、トンブスウイルス属（Tombusvirus）、アルファモウイルス属（Alfamovirus）及びソベモウイルス属（Sobemovirus）からなる群より選択される属のウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ウイルスが、ササゲモザイクウイルス（cowpea mosaic virus）、ササゲクロロティックモトルウイルス（cowpea chlorotic mottle virus）、トマトブッシースタントウイルス（tomato bushy stunt virus）、アルファルファモザイクウイルス（alfalfa mosaic virus）、ブロムモザイクウイルス（brome mosaic virus）及び南部インゲンモザイクウイルス（southern bean mosaic virus）からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ウイルスがコートタンパク質を含み、及びペプチドがコートタンパク質に融合した抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ペプチドが、ペプチドホルモン、酵素、増殖因子、抗体、免疫調節剤及びサイトカインからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、ウイルスＲＮＡ配列を完全長ｃＤＮＡ転写産物に変換すること、前記ｃＤＮＡをベクターにクローニングすること、及び外来性ＤＮＡセグメントを、ＲＮＡ複製、粒子形成又は感染性を破壊することなくそのような挿入を認容することができる領域に挿入することによって前記ｃＤＮＡを修飾することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
ウイルスに組み込まれた外来性ペプチドが、インフルエンザウイルスのサブユニット、東部ウマ脳脊髄炎ウイルスのサブユニット、イヌパルボウイルスのサブユニット及び炭疽菌（Bacillus anthracis)のサブユニットからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
８．０を上回るｐＨで、植物、植物組織、植物細胞及びプロトプラストからなる群より選択され、及び植物ウイルス中に存在するＲＮＡの少なくとも一部を欠く植物材料に硫酸アンモニウムを投与すること、
植物材料を少なくとも１０時間インキュベートすること、及び
植物材料から、複製することができない不活性化ＶＬＰを採取すること
を含む、非感染性ＶＬＰを生産する方法。
【請求項２０】
ＶＬＰを含むワクチンであって、ウイルスに組み込まれた少なくとも１つの外来性ペプチドを含む植物ウイルスを含み、及び不活性化ＶＬＰを生成するために８．０を上回るｐＨで植物、植物組織、植物細胞及びプロトプラストからなる群より選択される植物材料に硫酸アンモニウムを投与すること、植物材料を少なくとも１０時間インキュベートすること、及び植物材料から不活性化ＶＬＰを採取することを含む方法によって生産される、ワクチン。
【請求項２１】
提供されるＶＬＰペプチドが、前記ＶＬＰを哺乳動物に投与したとき免疫応答を惹起する、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
ワクチンが、インフルエンザウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、イヌパルボウイルス及び炭疽菌のためである、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２３】
ペプチドがエピトープである、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２４】
エピトープが、ウイルス病原体、細菌病原体又は癌である、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２５】
前記ワクチンが、前記ペプチドが抗原の部分であり、前記部分がワクチンとして有効である、サブユニットワクチンである、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２６】
前記外来性ペプチドが配列番号２３を含む、請求項２０に記載のワクチン。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５２４６９９（Ｐ２００９−５２４６９９Ａ）
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５３２３０（Ｐ２００８−５５３２３０）
【出願日】平成１８年１２月１日（２００６．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４６１６０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８５１４７
【国際公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【出願人】（５０２１４１０５０）ダウ グローバル テクノロジーズ インコーポレイティド (1,383)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１日（２００６．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４６１６０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８５１４７
【国際公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【出願人】（５０２１４１０５０）ダウ グローバル テクノロジーズ インコーポレイティド (1,383)
【Ｆターム（参考）】
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