新規線維芽細胞成長因子及びその使用方法
本発明は、卒中、創傷治ゆ及び関節疾患（例えば骨関節炎及び関節リウマチ）を含む（ただしこれらに限定されるわけではない）さまざまな症状の治療用の組成物及び方法に関する。より詳細には、本発明は、線維芽細胞成長因子ファミリーの成員、ＦＧＦ−ＣＸ（ＣＧ５３１３５−０５又はＦＧＦ−２０としても知られている）、その関連ポリペプチド、かかるポリペプチドをコードする核酸を含む組成物、及び卒中、創傷治ゆ及び関節疾患（例えば骨関節炎及び関節リウマチ）といった（ただしこれらに限定されるわけではない）症状を治療するためのそれらの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、全体が本明細書に参考により援用されている２００３年５月９日付けの米国仮出願第６０／４６９，３５３号明細書の利益を請求している。
【０００２】
技術分野
本発明は、卒中、創傷治ゆ及び関節疾患（例えば骨関節炎及び関節リウマチ）を含む（ただしこれらに限定されるわけではない）さまざまな症状の治療用の組成物及び方法に関する。より詳細には、本発明は、線維芽細胞成長因子ファミリーの成員、ＦＧＦ−ＣＸ（ＣＧ５３１３５−０５又はＦＧＦ−２０としても知られている）、その関連ポリペプチド、かかるポリペプチドをコードする核酸を含む組成物、及び卒中、創傷治ゆ及び関節疾患（例えば骨関節炎及び関節リウマチといった（ただしこれらに限定されるわけではない）症状を治療するためのそれらの使用に関する。
【０００３】
背景技術
その原型的成員として酸性ＦＧＦ（ＦＧＦ−１）及び塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ−２）が含まれるＦＧＦタンパク質ファミリーは、４つの関連するレセプタチロシンキナーゼに結合する。これらのＦＧＦレセプタは、組織培養中の細胞の大部分のタイプの中で発現される。リガンド結合時点でのＦＧＦレセプタ単量体の２量体化が、レセプタトランスリン酸化反応を導くキナーゼドメインの活性化にとっての１つの必要条件であることが報告されてきた。４つのＦＧＦレセプタの中で最も広い発現パターンを示すＦＧＦレセプタ−１（ＦＧＦＲ−１）は少なくとも７つのチロシンリン酸化反応部位を含んでいる。これらのリン酸化反応部位に対し異なる親和力で結合することによって数多くのシグナル変換分子が影響を受ける。
【０００４】
周産期の及び成体のマウスの脳内におけるＦＧＦ及びそのレセプタの発現が調査されてきた。ＦＧＦ−４を除いて全てのＦＧＦ遺伝子のメッセンジャＲＮＡがこれらの組織内で検出され、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７及びＦＧＦ−８遺伝子が、出生後期よりも後期胚形成期においてさらに高い発現を示し、これらの成員が脳の発達の後期に関与していることを示唆している。これとは対照的に、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−５の発現は、出生後に増大した。特に、周産期マウスにおけるＦＧＦ−６の発現は、中枢神経系及び骨格筋に限定されており、生後５日目の新生児の小脳を除き胚内の発達中の大脳において強力なシグナルを伴うことが報告されてきた。ＦＧＦ−６の同族レセプタであるＦＧＦ−レセプタ−（ＦＧＦＲ）−４は、類似の時空的発現を示し、ＦＧＦ−６Ｒ及びＦＧＦＲ−４が、リガンド−レセプタ系として神経系の成熟において有意な役割を果たすことを示唆している。オザワ（Ｏｚａｗａ）らによると、これらの結果はさまざまなＦＧＦ及びそのレセプタが、ニューロン前駆細胞の増殖及び遊走、ニューロン及びグリア分化、神経突起拡張及びシナプス形成といったような脳のさまざまな発達プロセスの調節に関与するということを強く示唆している。例えばオザワ（Ｏｚａｗａ）ら、脳研究、分子的脳研究（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）１９９６、４１（１−２）：２７９−８８を参照のこと。
【０００５】
ＦＧＦポリペプチドファミリーのその他の成員としては、ＦＧＦレセプタチロシンキナーゼ（ＦＧＦＲＴＫ）ファミリー及びＦＧＦレセプタヘパラン硫酸プロチオグリカン（ＦＧＦＲＨＳ）ファミリーが含まれている。これらの成員は、活性でかつ特異的なＦＧＦＲシグナル変換複合体を調節するように相互作用する。これらの調節活性は、哺乳動物の体内で広範囲の器官及び組織全体を通して、かつ正常な組織と腫瘍組織の両方において多様化する。変異体サブドメインの調節された代替的メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）スプライシング及び組合せは、多種多様なＦＧＦＲＴＫ単量体を発生させる。２価のカチオンがＦＧＦＲＨＳと協同してＦＧＦＲＴＫトランス−リン酸化反応を立体配座的に限定し、これがキナーゼ活性の不振をひき起こし、ＦＧＦによるＦＧＦＲの適切な活性化を容易にする。例えば、ＦＧＦＲＴＫ内の異なる点突然変異が一般に全ＦＧＦＲ複合体のＦＧＦ非依存性活性の段階的増大による段階的重度の頭がい顔面及び骨格の異常をひき起こすことがわかっている。ＦＧＦファミリーが重大な効果を及ぼすその他のプロセスとしては、肝臓の成長及び機能、及び前立腺腫瘍の進行がある。
【０００６】
もう１つのＦＧＦファミリー成員であるグリア活性化因子（ＧＡＦ）は、ヒトグリオーマ細胞系列の培養上清から精製されたヘパリン結合成長因子である。ミヤモト（Ｍｉｙａｍｏｔｏ）ら、１９９３、分子細胞生物学（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）１３（７）：４２５１−４２５９を参照のこと。ＧＡＦは、その他の既知の成長因子のものとはわずかに異なる活性スペクトルを示し、ＦＧＦ−９と呼称される。ヒトＦＧＦ−９ｃＤＮＡは、２０８個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。ＦＧＦファミリーのその他の成員との配列類似性は、３０％前後と推定された。その他のファミリー成員内で発見された２つのシステイン残基及びその他のコンセンサス配列は、ＦＧＦ−９配列内でも充分保存されていた。ＦＧＦ−９は、酸性ＦＧＦ及び塩基性ＦＧＦ内のものと同様、そのＮ末端にいかなる標準的シグナル配列ももたないことがわかった。酸性ＦＧＦ及び塩基性ＦＧＦは、細胞から従来の要領では分泌されないものとして知られている。しかしながら、ＦＧＦ−９は、標準的シグナル配列の欠如にもかかわらずｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞から効率良く分泌されることがわかった。それは、細胞の培地内でのみ専ら検出できた。分泌されたタンパク質は、開始メチオニンを除いて、ｃＤＮＡ配列によって予測されるものに比べてＮ末端でいかなるアミノ酸残基も欠如していなかった。ラットのＦＧＦ−９ｃＤＮＡも同じくクローニングされ、構造分析はＦＧＦ−９遺伝子が高度に保存されていることを示した。
【０００７】
ＦＧＦは、ニューロンの萌芽を誘発することが示されてきた。米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）１９９７、９４（１５）：８１７９−８４を参照のこと。カワマタ（Ｋａｗａｍａｔａ）ら、脳血流及び代謝ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、１６：５４２−５４７、１９９６は、１８ｋＤａで１５４アミノ酸の長さのポリペプチドである塩基性ＦＧＦが多種多様な脳ニューロンの生存及び増生を支持するということを提案した。米国特許出願第２００２／０１５１４９６Ａ１号明細書は、ＦＧＦ−２０が神経栄養性因子であり、ニューロン由来の細胞の生存を刺激することを示唆している。
【０００８】
２．１． 炎症：骨関節炎及び関節リウマチ
骨関節炎（「ＯＡ」）は、退行変性関節疾患であり、広範かつ増大する集団が罹患している関節痛の原因となることが多い。ＯＡは、成人における身体障害の最も一般的な原因であると推定されている。該疾患は標準的に、２０代〜３０代で現われ、４０代を超える大部分の人が体重支持関節の病的変化を幾分か示すものの、変化は無症候であり得る。英国における５５才を超える人々についての膝のＯＡの発生率及び有病率の系統的な再調査は、一年に２５パーセントの発生率、１０パーセントの身体障害有病率及び約２〜３パーセントの重症身体障害を報告した。The National Health and Nutrition Examination Survey (Center for Health Statistics, Centers for Disease Control and Prevention)は、この疾病の有病率が、２５才〜３４才では０．１パーセント未満であったのに対し、５５才を超える人々においては８０パーセントを上回ることを発見した。ＯＡは、関節無欠性、遺伝的特徴、局所的炎症、機械力及び細胞及び生化学プロセスを含めた多数の因子の複雑な相互作用の結果である。該疾病に特徴的な特長は、関節軟骨の劣化、周縁部での骨の肥大及び標準的に関節の疼痛と剛化を伴う滑膜の変化である。大部分の患者について、ＯＡは加齢、職業、外傷及び経時的な反復的で小さい損傷といったような１つ以上の因子に結びつけられる。ＯＡの病態生理学的プロセスはほぼつねに進行性である。
【０００９】
ＣＧ５３１３５−０５及びその変異体は、増殖を調節するＦＧＦファミリーに属する（全体が本明細書に参考により援用されている米国特許出願第１０／１７４，３９４号明細書を参照のこと）。ヒトの体内でのＦＧＦ２０様のタンパク質、ＣＧ５３１３５−０１をコードする遺伝子内の多型（ＣＧ５３１３５−１２）の同定及びＯＡについての遺伝的リスク改変因子のキャリヤである個体を同定する方法が、全体が本明細書に参考により援用されている米国特許出願第１０／７０２，１２６号明細書（「’１２６出願」）の中で記述されてきた。’１２６出願は、ＯＡ及び結果としての筋骨格合併症のリスクが増加した個体を同定するためのＤＮＡベースの診断試験について記述している。
【００１０】
ＯＡの充分に立証済みの治療様式は、非薬学的な介入から薬学的介入に至るまで複数存在している。非薬学的介入としては、行動修正、減量、運動、歩行補助、悪化させる活動の回避ならびに関節洗浄及び関節鏡視下手術及び外科手術がある。現行の薬学的介入としては、非ステロイド系抗炎症薬、関節内注射によるコルチコステロイド及びコルヒチンがある。さらに、ＦＧＦ−１８は、ＯＡ用のラット半月板裂傷モデルにおいて損傷した軟骨を修復することが示されてきた（論文第０１９９号、整形外科研究会第５０回年次総会（５０ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、カリフォルニア州サンフランシスコ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）、２００４）を参照のこと）。
【００１１】
しかしながら、既存の治療法は、疾病の発生率又は重症度を抑えるのに成功していないことから、ＯＡの満足のいく治療は、また満たされていない医療上のニーズである。従って、骨関節炎をうまく治療できる治療法は、観血的外科手術、身体障害及び補足的な介助サービスに付随するコスト中何百万ドルもの金額を健康医療制度に潜在的に節約させる一方で罹患率を減少させるという有利な効果を有する。
【００１２】
本明細書中の引用又は論述は、それが本発明に対する先行技術であるということの是認としてみなされるべきものではない。
【００１３】
発明の開示
本発明は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）タンパク質に対して相同性をもつＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを、それを必要としている対象に投与することを含む、疾病（例えば卒中、関節疾患及び外傷）を予防又は治療する方法を提供する。本発明は同様に、ＦＧＦ−ＣＸポリヌクレオチド配列及びこれらの核酸配列によりコードされるＦＧＦ−ＣＸポリペプチド及びそのフラグメント、相同体、類似体及び誘導体をも包含する。
【００１４】
本発明に従うと、予防又は治療すべき疾病としては、関節疾患（限定的な意味のない例は、関節炎、骨関節炎、関節病変、靭帯及び腱の損傷及び半月板損傷である）、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、外傷、脊髄損傷、重金属又は毒素中毒、及び神経変性疾患（限定的な意味のない例はアルツハイマー、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病である）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００１５】
１つの態様においては、該発明は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドをコードする単離されたＦＧＦ−ＣＸ核酸（表Ａに示されている通りの配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５）又はそのフラグメント、相同体、類似体又は誘導体を包含する。該核酸には、表Ａのアミノ酸配列（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６）を含むポリペプチドと少なくとも８５％の同一性をもつポリペプチドをコードする核酸配列が含まれ得るがこれらに限定されるわけではない。該発明は、同様に、配列番号３７、３８、３９、４０を含むＣＧ５３１３−０５（配列番号２）のタンパク質開裂の結果としてもたらされるポリペプチドをも包含する。該核酸は、ゲノムＤＮＡフラグメント及びｃＤＮＡ分子であり得るがこれらに限定されるわけではない。
【００１６】
本発明は同様に、本書に記述されている核酸のうちの１つ以上のものを含有するベクター、及び本書で記述されるベクター又は核酸を含有する細胞をも包含する。
【００１７】
本発明はさらに、上述の核酸分子のいずれかを含む組換え型発現ベクターで形質転換された宿主細胞を包含する。
【００１８】
一実施形態においては、該発明は、ＦＧＦ−ＣＸ核酸及び薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。もう１つの実施形態においては、該発明は、実質的に精製されたＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、例えばＦＧＦ−ＣＸ核酸によりコードされたＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのいずれか及びそのフラグメント、相同体、類似体及び誘導体を提供する。該発明は同様に、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド及び薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物をも提供する。
【００１９】
もう１つの実施形態においては、該発明は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。該抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体又はそのフラグメント、相同体、類似体及び誘導体であり得るがこれらに限定されるわけではない。該発明は同様にＦＧＦ−ＣＸ抗体及び薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物をも提供する。該発明は同様に、上述に核酸分子のいずれかによりコードされるポリペプチド上のエピトープに結合する単離された抗体をも包含する。
【００２０】
本発明はさらに、上述の核酸分子のいずれによってコードされるポリペプチドに結合する抗体及び負の対照抗体を含むキットを提供している。
【００２１】
該発明は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを産生するための方法を包含する。該方法は、例えばＦＧＦ−ＣＸ核酸を含むベクターといったＦＧＦ−ＣＸ核酸を含有する細胞を提供すること、及び核酸によりコードされるＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを発現するのに充分な条件下で細胞を培養することを含む。該発現されたＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは、次に細胞から回収される。好ましくは、該細胞は内因性ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドをほとんど又は全く産生しない。該細胞は、例えば、原核細胞又は真核細胞であり得る。
【００２２】
本発明は、免疫応答を誘発するのに充分な量のポリペプチドを哺乳動物に投与することによって以上で開示した核酸分子のいずれかによりコードされるポリペプチドに対する対象の中での免疫応答を誘発する方法を提供する。
【００２３】
本発明は同様に、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを１つの化合物と接触させ、その化合物がＦＧＦ−ＣＸポリペプチドに結合するか否かを判定することによってＦＧＦ−ＣＸポリペプチドに結合する化合物を同定する方法をも提供している。
【００２４】
該発明は、該対象を骨関節炎にかかりやすくする傷害が発生しても軟骨を無傷にする、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドでの予防的処置を提供する。
【００２５】
該発明は同様に、内在性又は外在性因子（それぞれ例えば遺伝的素因又は半月板損傷）が骨関節炎的変化及び軟骨損傷をひき起こした場合の、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドでの治療的処置をも提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は、対象の体内の関節疾患（例えば、骨関節炎、その他の関連する関節病変、例えば限定的な意味なく、靭帯及び腱自体の内部又はそれぞれの挿入部位内の靭帯及び腱の傷害、半月板裂傷、マトリクス被着が発生するその他の関節障害、リモデリング及び修復が必要とされる関節障害及び炎症性疾患の結果として発生した軟骨及び関節病変（例えば関節リウマチ））を予防又は治療する方法において、該対象に対しＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを含む組成物を投与することを含む方法を提供している。
【００２７】
本発明は同様に、ラットの体内での中大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞後の機能的回復を改善するべくＦＧＦ−ＣＸを使用する方法をも包含している。卒中は、運動力及び運動神経、感覚分別、視覚機能、言語、記憶又はその他の知的能力の混乱を結果としてもたらす可能性があることから、本発明は、これらのパラメータを評価する１つのモデルにおいてＦＧＦ−ＣＸの効能及び安全性を評価している。本発明に従うと、ＦＧＦ−ＣＸの投与は、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、外傷、脊髄損傷、重金属又は毒素中毒、及び神経変性疾患（例えばアルツハイマー、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化性、ハンチントン病）を含む（ただしこれらに限定されるわけではない）病的条件の治療において有利なものとなる。
【００２８】
ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、及びかかるポリペプチドを作る方法が、共に全体が本明細書に参考により援用されている米国特許出願第０９／４９４，５８５号明細書及び同第１０／１７４，３９４号明細書の中で記述されている。ＦＧＦ−ＣＸは「ＣＧ５３１８５」、「ＣＧ５３１３５−０５」及び「ＦＧＦ−２０」といった語と互換的に使用される。
【００２９】
該発明中に含まれているのは、ＦＧＦ−ＣＸ核酸、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド又はその一部分をコードする単離された核酸、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、これらの核酸を含有するベクター、ＦＧＦ−ＣＸ核酸で形質転換された宿主細胞、抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体及び医薬組成物である。同様に開示されているのは、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを作る方法ならびにこれらの化合物を用いて症状をスクリーニング、診断及び治療する方法、及びＦＧＦ−ＣＸポリペプチド活性を変調させる化合物のスクリーニング方法である。表Ａは、ＦＧＦ−ＣＸ核酸及びそのコード化されたポリペプチドの要約を提供している。
【００３０】
【表１】
【００３１】
本書で使用されている該「対象」という用語は、動物好ましくは非霊長類（例えば乳牛、ブタ、馬、ネコ、イヌ、ラット及びマウス）及び霊長類（例えばカニクイザルなどのサル、チンパンジー及びヒト）を含む哺乳動物、より好ましくはヒトを意味する。いくつかの実施形態においては、該対象は、関節疾患（例えば骨関節炎、その他の骨関節炎関連障害）、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、外傷、脊髄損傷、重金属又は毒素中毒、及び神経変性疾患（非限定的な例はアルツハイマー、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化性、ハンチントン病）を患う哺乳動物、好ましくはヒトである。もう１つの実施形態においては、該対象は、関節疾患、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、外傷、脊髄損傷、重金属又は毒素中毒、又は神経変性疾患のリスクのある哺乳動物、好ましくはヒトである。一実施形態においては、該対象は、関節疾患を患うものの卒中又は神経変性疾患は患っていない哺乳動物、好ましくはヒトである。該「対象」という用語は、本発明では「患者」と互換的に用いられる。
【００３２】
本書で使用されるように、該「治療上有効な量」という用語は、疾病（例えば関節疾患、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、外傷、脊髄損傷、重金属又は毒素中毒、又は神経変性疾患）の重症度を低減させ、疾病の持続時間を削減し、疾病の進行を防ぎ、疾病の退行をひき起こし、疾病に付随する１つ以上の症候を改善するか又はもう１つの療法の治療効果を増強又は改善させるのに充分な療法（例えばＦＧＦ−ＣＸポリペプチド）の量を意味する。
【００３３】
ＦＧＦ−ＣＸを含む組成物は、疾病（例えば関節疾患、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、外傷、脊髄損傷、重金属又は毒素中毒、又は神経変性疾患）又はその１つ以上の症候を防止、治療又は改善するため１つ以上のその他の療法と組合せて投与することもできる。好ましい実施形態においては、ＦＧＦ−ＣＸを含む組成物は、関節疾患、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、外傷、脊髄損傷、重金属又は毒素中毒、又は神経変性疾患といった疾病又はその１つ以上の症候を防止、治療又は改善する上で使用されるものとして知られている１つ以上のその他の療法と組合わせて投与される。
【００３４】
一実施形態においては、組合せ療法の間、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド及び／又はもう１つの療法は、例え当該技術分野において既知の方法により決定される通り、単独で投与された場合検出可能な治療上の利点を示さない量といった最適より少ない量で投与される。かかる方法においては、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドともう１つの療法の同時投与は結果として治療の有効性の全体的改善をもたらす。
【００３５】
一実施形態においては、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド及び１つ以上のその他の療法は、患者の同一診察時に投与される。もう１つの実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは１つ以上のその他の療法の投与に先立って投与される。さらにもう１つの態様では、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは１つ以上のその他の療法の投与の後に投与される。特定の一実施形態においては、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド及び１つ以上のその他の療法は、１人の対象に対し周期的に投与される。周期療法には、一定の期間のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの投与とそれに続く一定期間の１つ以上のその他の療法の投与及びこの逐次的投与の反復が関与する。周期療法は、１つ以上の療法に対する耐性の発生を低減させ、療法の１つに付随する副作用を回避又は低減させかつ／又は治療の効能を改善することができる。
【００３６】
該発明の組成物の毒性的及び治療的効能（例えばＦＧＦ−ＣＸポリペプチド）は、例えばＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効である用量）を判定するための細胞培養又は実験動物内における、標準的な薬学的手順により判定可能である。毒性及び治療効果の間の該用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表わすことができる。大きい治療指数を示す組成物が好ましい。毒性副作用を示す組成物も使用し得るが、感染を受けていない細胞に対する潜在的損傷を最小限におさえかくして副作用を低減させるため、感染を受けた組織の部位にかかる組成物をターゲティングする送達系を設計するよう配慮すべきである。
【００３７】
１つの実施形態においては、細胞培養検定及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための一投薬量範囲を処方する上で使用することができる。複合体の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんど又は全く無いＥＤ５０を含む一範囲の循環濃度内にある。該投薬量は、利用される剤形、利用される投与経路、疾病の重症度、対象の年令及び体重及び医療専門家（例えば医師）が通常考慮に入れるその他の因子に応じて、この範囲内で変動し得る。該発明の方法において使用されるあらゆる組成物について、最初に細胞培養検定から、治療上有効な用量を推定することができる。細胞培養中で判定される通りのＩＣ５０（すなわち症状の半最大阻害を達成するテスト化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデル内で１用量を処方することができる。かかる情報は、ヒトの体内での有用な用量をより正確に判定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば高性能液体クロマトグラフィによって測定することができる。［ここに好ましい投薬量範囲を挿入する］。
【００３８】
化学療法剤、放射線療法及び生物剤／免疫療法剤例えばサイトカインといったような治療方法用の適切な及び推奨される投薬量、処方及び投与経路は当該技術分野において既知であり、医師用卓上参考書（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）（第５８版、２００４年）といったような文献において記述されている。
【００３９】
さまざまな送達系が知られており、該発明の組成物を投与するために使用することができる。かかる送達系には、リポゾーム、マイクロ粒子、マイクロカプセル内への封入、組換え型細胞による発現、レセプタを媒介としたエンドサイトーシス、レトロウイルス又はその他のベクターなどの一部としての該発明の核酸の構築などが含まれるがこれらに限定されるわけではない。導入方法には、皮内、筋内、腹腔内、髄腔内、脳室内、硬膜外、静脈内、皮下、鼻腔内、腫瘍内、経皮、直腸内及び経口投与が含まれるがこれらに限定されるわけではない。該発明の組成物は、例えば輸液又はボーラス注入法、上皮層又は皮膚粘膜層（例えば口腔粘膜、膣粘膜、直腸及び腸粘膜など）を通した吸収などのあらゆる便利な経路によって投与され得、その他の生物学的に活性な作用物質と合わせて投与可能である。投与は全身的でも局所的でもあり得る。
【００４０】
いくつかの実施形態においては、治療を必要とする部域に局所的に該発明の医薬組成物を投与することが望ましい可能性がある。これは、例えば外科手術中の局所的輸液によってか又は例えば外科手術後の創傷包帯剤と併用した局所施用によって、又は注入によって、又はカテーテル、坐薬又はインプラント（このインプラントは、シラスチック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜といった膜又は繊維を含む多孔質、非多孔質又はゼラチン様材料でできている）を用いて達成可能である。一実施形態においては、投与は、放射線、化学療法又は化学兵器といったような傷害に最も敏感な急速に増殖する組織の部位（又は元の部位）での直接的注射によるものであり得る。
【００４１】
該発明の組成物が予防又は治療剤をコードする核酸であるいくつかの実施形態において、核酸は、適切な核酸発現ベクターの一部として核酸を構築しそれが細胞内のものとなるような形で例えばレトロウイルスベクタの使用によってか又は直接注入によってか又は微粒子ボンバード（例えば遺伝子銃）の使用によってか又は脂質又は細胞表面レセプタ又はトランスフェクション剤でのコーティングによってそれを投与するか、又は核内などに進入するものとして知られているホメオボックス様のペプチドに対する連結においてそれを投与することによって、そのコードされたタンパク質（例えばＦＧＦ−ＣＸポリペプチド）の発現を促進するべくインビボで投与することができる。代替的には、本発明の核酸は、相同的組換えにより、細胞内に導入され発現のため宿主細胞ＤＮＡ内に取込まれ得る。
【００４２】
該発明の組成物には、単位剤形の調製のために使用可能である医薬組成物の製造において有用なバルク製剤組成物が含まれる。好ましい実施形態においては、該発明の組成物は医薬組成物である。かかる組成物は、該発明の１つ以上の組成物（例えばＦＧＦ−ＣＸポリペプチド）を予防上又は治療上有効な量と、薬学的に受容可能な担体を含んでいる。好ましくは、該医薬組成物は、対象に対する投与経路にとって適切であるように処方される。
【００４３】
一実施形態においては、「薬学的に受容可能な」という語は、動物そしてより詳細にはヒトの体内で使用するため連邦又は州政府の管理機関により承認されているか又は、米国薬局方又はその他の一般的に認識された薬局方に列挙されていることを意味する。「担体」という語は、予防又は治療用作用物質と共に投与される希釈剤、アシュバント（例えばフロインドアシュバンド（完全及び不完全）、賦形剤又はビヒクルを意味する。かかる薬学的担体は、水又は油といった無菌液体（例えば、石油、動物、植物又は合成由来の油例えばピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）又は希釈剤、芳香剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁剤、結合剤、錠剤崩壊剤又はカプセル封入材料としても作用しうる１つ以上の物質といったような固体担体であり得る。医薬組成物が静脈内投与される場合には、水が好ましい担体である。食塩溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液も同様に、特に注射剤のための液体担体としても利用可能である。適切な薬学賦形剤としては、でんぷん、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール又はその組合せが含まれるがこれらに限定されるわけではない。該組成物は、望まれる場合、少量の湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝剤をも含有し得る。
【００４４】
本発明の組成物は、液状シロップ、錠剤、カプセル、ジェルカプセル、ソフトジェル、ピル、粉剤、浣腸剤、持続放出製剤などを含む（ただしこれらに限定されるわけではない）数多くの考えられる剤形のいずれかの形に処方され得る。本発明の組成物は同様に、水性、非水性又は混合培地中の懸濁液としても処方可能である。水性懸濁液はさらに、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランなどを含む懸濁液の粘度を増大させる物質をさらに含有し得る。懸濁液は同様に安定化剤も含有し得る。組成物は同様に、トリグリセリドといった従来の結合剤及び担体と共に坐薬として処方することもできる。経口処方は、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどといった標準的な担体を含み得る。
【００４５】
いくつかの実施形態においては、本発明の組成物は、発泡体として処方され使用されてよい。薬学的発泡体には、例えばエマルジョン、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリー及びリポゾームといったような（ただしこれらに限定されるわけではない）処方が含まれる。性質的に基本的に類似しているものの、これらの処方は、最終生成物の成分及びコンシステンシーという点で異なっている。かかる組成物及び製剤の調製は、薬学及び処方技術の当業者にとっては一般に既知であり、本発明の組成物の処方に適用可能である。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路と相容性のあるものとなるように処方されている。特定の実施形態においては、該組成物は、ヒトへの静脈内、皮下、筋内、経口、鼻腔内、腫瘍内又は局所投与に適合された医薬組成物として、規定通りの手順に従って処方される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、該組成物は同様に、注入部位における痛みを和げるためリドカインといったような局所麻酔剤及び可溶化剤も含み得る。
【００４７】
該発明の組成物を局所施用する場合には、該組成物を経皮性パッチ、軟こう、ローション、クリーム、ジェル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体及び粉末の形で処方することができる。従来の薬学的担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが必要であるか又は望ましい可能性がある。コーティングされたコンドーム、手袋なども有用であり得る。好ましい局所的処方には、該発明のポリペプチドが、脂質、リポゾーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤及び界面活性剤といった（ただしこれらに限定されるわけではない）局所送達剤との混和状態にある処方が含まれる。好ましい脂質及びリポゾームには、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、マイナス（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）、及び陽イオン（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。該発明のポリペプチドはリポゾーム内にカプセル封入されていてもよいし、或いは又リポゾーム特にカチオン性リポゾームに対する複合体を形成してもよい。代替的には、ポリペプチドは脂質特にカチオン脂質に対し複合体形成され得る。好ましい脂肪酸及びエステルには、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノレイン酸、リノレン酸、ジカプラート、トリカプラート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプラート、ｌ−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はＣ１−１０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリスタートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、又はその薬学的に受容可能な塩が含まれるがこれらに限定されるわけではない。非噴霧局所用剤形については、局所施用と相容性ある１つ以上の賦形剤又は担体を含み、好ましくは水より高い動的粘度を有する、粘性乃至半固体又は固体形態が標準的に利用される。その他の適切な局所的剤形としては、好ましくは固体又は液体不活性担体と組合せた形の活性成分が、加圧揮発性物質（例えばフレオンといったような気体高圧ガス）との混合物中又はスクイズボトル中に包装されている噴霧可能なエアゾル調製物が含まれる。所望の場合には、医薬組成物及び剤形に付して、保湿剤又は湿潤剤も添加することができる。かかる添加成分の例は、当該技術分野において周知である。
【００４８】
該発明の方法に１つの組成物の鼻腔内投与が含まれている場合、該組成物は、エアゾル形態、スプレー、霧又は液滴の形で処方可能である。特に、本発明に従った使用のための予防又は治療剤は、適切な高圧ガス（例えばジクロロジフルオロロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又はその他の適切な気体）を使用して、加圧パック又はネブライザからエアゾルスプレーの体裁で適切に送達され得る。加圧エアゾルの場合、投薬量単位は、計算された量を送達するためのバルブを具備することによって決定可能である。ラクトース又はでんぷんといったような適切な粉末と該化合物の粉末混合物を収納する、吸入器又は吸気器内で使用するための（例えばゼラチンで構成された）カプセル及びカートリッジを処方することが可能である。
【００４９】
該発明の方法が経口投与を含む場合、組成物は、粉末、顆粒、微粒子、ナノ粒子、懸濁液又は水溶液又は非水性媒質中溶液、カプセル、ジェルカプセル、小袋、錠剤又はミニ錠剤の形で処方可能である。増粘剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましいかもしれない。錠剤又はカプセルは、結合剤（例えば、アルファー化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、又はヒドキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、又はリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、又はシリカ）；錠剤分割物質（例えば、ジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えば、ラウリルリン酸ナトリウム）といった薬学的に受容可能な賦形剤と共に従来の手段により調製可能である。錠剤は、当該技術分野において周知の方法によりコーティングされ得る。経口投与のための液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、又は水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチン、又はアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、又は精留植物油）；及び防腐剤（例えば、メチル又はプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアート又はソルビン酸）といったような薬学的に受容可能添加剤と共に従来の手段によって調製され得る。該調製物は同様に、緩衝塩、芳香剤、着色剤及び甘味料を適宜含有し得る。経口投与のための調製物は、予防用又は治療用作用物質の徐放、制御放出又は持続放出のために適切に処方可能である。
【００５０】
一実施形態においては、本発明の組成物は、例えば界面活性剤及びキレート剤といった１つ以上の浸透エンハンサと併用して経口投与される。好ましい界面活性剤としては、脂肪酸及びそのエステル又は塩、胆汁酸及びその塩が含まれるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態においては、浸透エンハンサの組合せ、例えば胆汁酸／塩と組合せた形の脂肪酸／塩が用いられる。特定の一実施形態においては、ラウリン酸、カプリン酸のナトリウム塩が、ＵＤＣＡと組合わせて用いられる。さらなる浸透エンハンサとしては、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが含まれるがこれらに限定されるわけではない。該発明の組成物は、噴霧された乾燥粒子を含む（ただしこれに限定されるわけではない）顆粒形態で経口投与されてもよいし、又は、複合体化して微粒子又はナノ粒子を形成することもできる。該発明のペプチド（例えばＦＧＦ−ＣＸポリペプチド）と複合体化するのに用いることのできる複合体化剤としては、ポリ−アミノ酸、ポリイミン、ポリアクリラート、ポリアルキルアクリラート、ポリオキシエタン（ｐｏｌｙｏｘｅｔｈａｎｅｓ）、ポリアルキルシアノアクリラート、カチオン化ゼラチン、アルブミン、アクリラート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアルキルシアノアクリラート、ＤＥＡＥ−誘導体化ポリイミン、ポルラン、セルロース、及びデンプンが含まれるがこれらに限定されるわけではない。特に好ましい複合体化剤としては、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノ−メチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリラート）、ポリ（エチルシアノアクリラート）、ポリ（ブチルシアノアクリラート）、ポリ（イソブチルシアノアクリラート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリラート）、ＤＥＡＥ−メタクリラート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリラート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミン及びＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリラート、ポリヘキシルアクリラート、ポリ（ＤＬ−乳酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギナート、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００５１】
該発明の方法は、エアゾル化剤と共に処方された組成物の、例えば吸入器又はネブライザを用いた肺投与を含み得る。
【００５２】
該発明の方法は、（例えばボーラス注入又は持続注入といった）注入による非経口投与用に処方された組成物の投与を含み得る。注入用処方は、付加された防腐剤を伴う単位剤形（例えばアンプル又は多重用量容器）の体裁をとり得る。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンといった形態をとり得、又懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤といった処方剤を含有し得る。代替的には、活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば無菌で発熱物質を含まない水）で構成するように粉末形態をしていてよい。
【００５３】
好ましい実施形態においては、該組成物は、ヒトに対する静脈投与のために適合された医薬組成物として規定通りの手順に従って処方される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、該組成物は同様に、注入の部位における痛みを和げるためリグノカインといったような局所麻酔剤及び可溶化剤も含み得る。一般に、成分は、例えば活性作用物質の数量を示すアンプル又は小袋といった密封した容器に入った凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として単位剤形の形で混合された状態で又は別々に供給される。組成物を輸液により投与する場合には、それを無菌の薬学グレードの水又は食塩水の入った輸液びんで送り出すことができる。組成物を注射により投与する場合、投与に先立って成分を混合できるように注射用滅菌水又は食塩水のアンプルが提供され得る。
【００５４】
該発明の組成物は、中性形態又は塩形態として処方可能である。薬学的に受容可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されたものといった遊離アミノ酸で形成されたもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されたものといったような遊離カルボキシル基で形成されたものが含まれるがこれらに限定されるわけではない。薬学的に受容可能な塩の非限定的な例としては、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重酒石酸塩、臭化物、酢酸カルシウム、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストラート、エシラート、フマル酸塩、グルカプタート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グルコリルアルサニル酸塩、ヘキシルレソルシナート、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩化水素酸塩、ヒドロキシナフトアート、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩メシル酸塩、臭化メチル、窒化メチル、硫化メチル、ムカート、ナプシル酸、硝酸塩、パモアート（エンボナート)、パントテン酸塩、ホスファテルジホスファート、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トリエチオジド、ベンザチン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、プロカイン、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛がある。
【００５５】
上述の処方に加えて、該組成物は同様に、デポー製剤としても処方可能である。かかる長時間作用性処方は、移植（例えば皮下又は筋内）又は筋内注射により投与可能である。かくして例えば、該組成物を適切な重合体又は疎水性材料（例えば受容可能な油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂と共に、又は例えばやや溶けにくい塩といったようなやや溶けにくい誘導体として処方することができる。リポゾーム及びエマルジョンは、親水性薬物のための送達ビヒクル又は担体の周知の例である。
【００５６】
１つの実施形態においては、該発明の組成物（例えばＦＧＦ−ＣＸ）の成分は、かかる組成物のレシピエントと同じ種の起源又は種の反応性である対象から誘導される。
【００５７】
該発明は同様に、該発明の治療計画を実施するためのキットをも提供する。かかるキットは、薬学的に受容可能な形態で予防上又は治療上有効な量の該発明の組成物（例えばＦＧＦ−ＣＸポリペプチド）を１つ以上の容器内に収納している。該発明のキットの小びん中に入った組成物は、例えば無菌生理食塩水、デキストロース溶液又は緩衝溶液又はその他の薬学的に受容可能な無菌流体と組合せた状態の薬学的に受容可能な溶液の形をとり得る。代替的には、該組成物を凍結乾燥又は乾燥させることができる。この場合、キットは、任意にはさらに、注入目的の溶液を形成するため組成物を再構成するべく、好ましくは無菌である、薬学的に受容可能な溶液（例えば生理食塩水、デキストロース溶液等）を容器内に含んでいる。
【００５８】
もう１つの実施形態では、該発明のキットはさらに、処方を注入するための好ましくは無菌形態で包装された針又は注射器及び／又は包装されたアルコールパッドを含む。臨床医又は患者による該発明の処方の投与のための使用説明書が任意に含まれている。
【００５９】
いくつかの実施形態においては、本発明は、単回投与に充分な該発明の組成物（例えばＦＧＦ−ＣＸポリペプチド）の用量を含む薬学的処方又は組成物を各々含む複数の容器を含むキットを提供する。
【００６０】
あらゆる医薬品についてそうであるように、包装材料及び容器は、保管及び出荷中の製品の安定性を保護するように設計されている。１つの実施形態においては、該発明の組成は、レシチン、タウロコール酸及びコレステロールを含む（ただしこれらに限定されるわけではない）生体適合性のある洗浄剤；又はガンマグロブリン及び血清アルブリンを含む（ただしこれらに限定されるわけではない）その他のタンパク質と共に容器内に保管されている。さらに、該発明の製品には、使用説明書、又は医師、技師又は患者に対し問題の疾病又は障害をいかにして適切に予防又は治療するかについて助言を与えるその他の情報材料が含まれている。
【００６１】
本発明について、さらに、以下の実施例を用いて例示する。
【実施例】
【００６２】
５．１． 実施例１：配列分析
各々のＦＧＦ−ＣＸについての配列の関連性及びドメイン分析の詳細が、表１Ａに提示されている。ＦＧＦ−ＣＸ１クローンが分析され、ヌクレオチド及びコードされたポリペプチド配列が表１Ａに示されている。
【００６３】
【表２】
【００６４】
上述のタンパク質配列のクラスタルダブル（ＣｌｕｓｔａｌＷ）比較が、表１Ｂに示されている以下の配列アラインメントを生成する。
【００６５】
【表３】
【００６６】
ＦＧＦ−ＣＸ１ａタンパク質のさらなる分析が、表１Ｃに示された以下の特性を生成した。
【００６７】
【表４】
【００６８】
特許及び特許広報で公示された配列を含む専有のデータベースであるジンシーク（Ｇｅｎｅｓｅｑ）データベースに対するＦＧＦ−ＣＸ１ａタンパク質の探索は、表１Ｄに示された複数の相同性タンパク質を生成した。
【００６９】
【表５】
【００７０】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ探索において、ＦＧＦ−ＣＸ１ａタンパク質は、表１Ｅ内のＢＬＡＳＴＰデータ中に示されたタンパク質に対する相同性をもつことが発見された。
【００７１】
【表６】
【００７２】
ＰＦａｍ分析は、ＦＧＦ−ＣＸ１ａタンパク質が表１Ｆに示されたドメインを含むことを予測している。
【００７３】
【表７】
【００７４】
５．２． 実施例２：ＣＧ５３１３５−０５（ＦＧＦ−２０）のタンパク質分解による分割産物
ＣＧ５３１３５−０５の液体クロマトグラフィ、質量分析法及びＮ末端配列決定の結果、増殖検定において高い活性をもつ変異体がもたらされた。かくして、このセクションで詳述されるこれらの変異体は、ＣＧ５３１３５−０５と同じ有用性をもつものと期待されている。
【００７５】
ＣＧ５３１３５−０５の液体クロマトグラフィ（ＬＣ）及び質量分析法（ＭＳ）
精製されたＣＧ５３１３５−０５を、アセトニトリル、水及びトリフルオロ酢酸を含む移動相中の標準ＨＰＬＣシステム（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ））を用いて、フェニル−ヘキシルカラム（ルナ（Ｌｕｎａ）５ｍｍ、２５０ｍｍ×３ｍｍ、フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ））上に注入した。結果としての分析は、ＣＧ５３１３５−０５（図１）に関連する１つの大ピーク（＃３）と３つの小ピーク（＃１、２、４及び５）を示す、検出可能なレベルの微小不均一性を明らかにした。これらの種を特徴づけするため、自動化された画分収集装置（アジレント１１００）を用いて、画分を収集し、液体クロマトグラフィエレクトロスプレーイオン化イオントラップ質量分光法（ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ）、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）及びＮ末端アミノ酸配列決定を用いて画分を特徴づけした。
【００７６】
ピーク０はタンパク質ではなく、製品関連のものではなく、又、残留プロセス不純物でもない（すなわち、ＤＮＡ、内毒素、カナマイシン又はＩＰＴＧではない）。ＣＧ５３１３５−０５に関連する種（ピーク１、２、３及び４）は、３６％のアセトニトリル、６３％の水及び０．１％のトリフルオロ酢酸の移動相を溶出した。類似の画分を次にプールし、４℃の遠心機内でアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）１０，０００ダルトンカットオフフィルター（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ））を用いて試料を濃縮した。試料を２００ｍＭのアルギニン、４０ｍＭの酢酸ナトリウム及び３％のグリセロール中で１６倍に希釈し、次に約５００μｌの体積になるまで濃縮した。プールした画分の濃度を、アミノ酸分析を用いて決定した。
【００７７】
トリプシンを用いて４つのＣＧ５３１３５−０５関連種（ピーク１、２、３及び４）の全てをタンパク質分解により消化し、質量分析検出を伴う液体クロマトグラフィを用いてペプチドを分析した。究極ナノフロークロマトグラフィシステム（ＬＣパッキングス（ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ）、オランダアムステルダム（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））とインタフェースされたＸＰ ＤＥＣＡ ナノスプレー／イオントラップ器具（サーモフィンガン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）、カリフォルニア州サンノゼ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ））を用いて質量分析を実施した。自動化ＭＳ−ＭＳ／ＭＳスイッチングを用いてエクスカリバー（Ｘｃａｌｉｂｕｒ）ソフトウエア（サーモフィンガン）を介してデータを収集した。インスツルメント・メソッド（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄ）ファイル内で、４００〜１４００ｍ／ｚの間の全ＭＳ走査とそれにつづく先行ＭＳ走査からの最上位３つのイオンの４００〜２０００ｍ／ｚの間の全ＭＳ／ＭＳ走査を獲得するようにＸＰＤＥＣＡをセットした。ターボシークエスト（ＴｕｒｂｏＳｅｑｕｅｓｔ）（サーモフィンガン）を用いてデータを処理した。ＭＡＳＣＯＴ（マトリックスサイエンシーズ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、英国マンチェスター（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ））を用いてデータベース探索とタンパク質の同定を実施した。ＭＡＳＣＯＴは、ペプチドの分子質量、ＭＳ／ＭＳ配列情報、質量精度及び検出されたペプチド数に基づいて、同定されたタンパク質についての確率ベースのＭＯＷＳＥ評点及びカバレージ百分率を報告する。表２は、ＣＧ５３１３５−０５関連種についてのピーク番号、ＭＡＳＣＯＴにより提供される信頼度評点及びＭＳ／ＭＳスペクトルから得たカバレージ百分率を含んでいる。
【００７８】
【表８】
ＮＡ＝ データ入手不可
【００７９】
ＣＧ５３１３５−０５関連種の同一性を決定するため、収集された画分を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＮ末端配列決定によって分析した。精製したＣＧ５３１３５−０５のＮ末端アミノ酸を定性的に決定した。ＣＧ５３１３５−０５タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解像し、ポリフッ化ビニリデン膜に電気泳動によって移送した。膜からクマシー染色した約２３ｋＤａの主要バンドを切除し、自動エドマン（Ｅｄｍａｎ）シーケンサ（プロサイズ（Ｐｒｏｃｉｓｅ）、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスター市（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ））により分析した。表３は、各々の種について得られた分子量及びＮ末端配列決定（ここでＮ＝全長ＣＧ５３１３５）により決定された変異体を提示している。
【００８０】
【表９】
ＮＡ＝データ入手不可。タンパク質でなく製品関連でもない。
【００８１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＮ末端配列決定により決定された分子量は、４つの種を同定することができる。ピーク１については、Ｎ末端配列決定を介して４つの異なる種が検出され、そのうちの２つが同じくＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって検出された。これらの結果は同様に、ＬＣ／ＭＳを用いて得られたカバレージとも一致している。Ｎ末端配列決定により誘導された各々の種のポリペプチド配列は、表４に示されている。
【００８２】
【表１０】
【００８３】
【表１１】
多重アラインメント
【００８４】
全アミノ酸分析
ＣＧ５３１３５−０５のアミノ酸組成物を決定した。内部標準として２ｎｍｏｌのノルロイシンを含有する０．２％のフェノール、１００ｍＬの６ＮＨＣｌ中で１１５℃で１６時間ＣＧ５３１３５−０５の試料を加水分解した。試料を高速Ｖａｃ濃縮器（Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）内で乾燥させ、内部標準として２ｎｍｏｌのホモセリンを含有する試料緩衝液１００ｍＬ中に溶解させた。各試料中のアミノ酸を、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）７３００型イオン交換計器上で分離した。ＣＧ５３１３５−０５のアミノ酸組成物は、理論上のアミノ酸組成物と一貫性を有していた。
【００８５】
ＵＶ吸光度を介した濃度の推定（ブラッドフォード方法を用いたタンパク質の推定）の中で使用される消光係数を導出するために、実験用アミノ酸組成物を使用した。λｍａｘにおける消光散係数は、０．９７ｍＬ／ｍｇ・ｃｍである。
【００８６】
【表１２】
Ａ 処方中の余剰のａｒｇのため未判定。
Ｂ 分析中に酸加水分解においてｃｙｓが破壊されることから未判定。
Ｃ 分析中に酸加水分解においてｔｒｐが破壊されることから未判定。
Ｄ 酸加水分解中ａｓｎはａｓｐに、ｇｌｎはｇｌｕ酸に転換されることになる。従って、ａｓｘはａｓｎとａｓｐの和を表わし、一方ｇｌｘはｇｌｎとｇｌｕの和を表わす。
【００８７】
ペプチドマッピング
精製済みＣＧ５３１３５−０５（２５ｍｇ）を変性させ、５０℃で尿素とジチオトレイトール中で還元させ、ヨードアセタートでアルキル化させた。尿素の濃度を低下させた後、試料を２０℃で４０時間トリプシンで処理した。結果として得たペプチドフラグメントを、（トリフルオロアセテート中のアセトニトリル勾配を伴うＣ−１８カラムを用いることによって）ＲＰ−ＨＰＬＣにより分離してペプチドマップ（図２Ａ及び２Ｂ）を得た。図２Ａ中のクロマトグラムはトリプシンでのＣＧ５３１３５−０５の消化から予想された２０個のペプチドと一貫性をもつものであり、図２Ｂ中のクロマトグラムは、ＣＧ５３１３５−０５内の単一トリプトファン残基について予想された通りの単一のピークを明らかにしている。
【００８８】
生物学的検定
ＬＣ及びＭＳにより同定された４つのピークから収集されたＣＧ５３１３５−０５関連種の生物活性を、さまざまな用量の単離されたＣＧ５３１３５−０５関連種での血清欠乏培養ＮＩＨ３Ｔ３マウス胚線維芽細胞の処理及びＤＮＡ合成中のブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取込みの測定によって、測定した。この検定のためには、１０％のウシ胎児血清で補足されたダルベッコの修正イーグル培地の中で細胞を培養した。１０％ＣＯ２／空気中で３７℃で集密性に至るまで９６ウェル平板内で細胞を成長させ、次に２４〜７２時間、ダルベッコ修正イーグル培地内で欠乏させた。ＣＧ５３１３５−０５関連種を添加し、３７℃で１８時間、１０％ＣＯ２／空気中でインキュベートした。ＢｒｄＵ（１０ｍＭの最終濃度）を添加し、１０％ＣＯ２／空気中で２時間３７℃で細胞と共にインキュベートさせた。ＢｒｄＵの取込みを、メーカーの仕様書（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ））に従って、酵素免疫吸着法により測定した。
【００８９】
ピーク４は、不充分な材料しか収集されなかったため（ピーク４はＣＧ５３１３５−０５についての合計ピーク面積の３％未満である）、この検定には内含されなかった。ＣＧ５３１３５−０５及び３つの残りの画分（すなわちピーク１、２及び３）全てから収集した材料が、ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞内で用量依存的にＤＮＡ合成を誘発した（表７）。ＰＩ２００は、背景の２倍でのＢｒｄＵの取込みを結果としてもたらしたタンパク質の濃度として定義された。３つの測定可能なピーク全てから回収したＣＧ５３１３５−０５やＣＧ５３１３５−０５関連種は、０．７〜１１ｎｇ／ｍＬのＰＩ２００で類似の生物活性を実証した（表９）。
【００９０】
【表１３】
【００９１】
５．３． 実施例３：ＣＧ５３１３５のレセプタ結合特異性（研究Ｌ−１１６．０１）
ＦＧＦファミリー成員は、細胞表面免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン含有チロシンキナーゼＦＧＦレセプタ（ＦＧＦＲ）との高親和性相互作用を介して、細胞内部でシグナルを変換する。４つの全く異なるヒト遺伝子がＦＧＦＲをコードする（パワーズ（Ｐｏｗｅｒｓ）ら、エンドクリン関連癌（Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｌａｔ Ｃａｎｃｅｒ）２０００、７：１６５−９７；クリント（Ｋｌｉｎｔ）及びクリーソン・ウェルシュ（Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ）、生命科学の最先端（Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ）１９９９、４：Ｄ１６５−７７；シュー（Ｘｕ）ら、細胞及び組織研究（Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ）１９９９、２９６：３３−４３）。キナーゼドメインの欠如した関連する第５のヒト配列が最近になって同定され、ＦＧＦＲ−５と命名された（キム（Ｋｉｍ）ら、生物化学と生物物理学（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ）２００１、１５１８：１５２−６）。これらのレセプタは各々このファミリーの複数の異なる成員を結合させることができる（キムら、生物化学と生物物理学２００１、１５１８：１５２−６；オルニス（Ｏｒｎｉｔｚ）ら、生物化学ジャーナル（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ）１９９６、２７１：１５２９２−７）。ＦＧＦは同様に、低い親和性しかもたないにもかかわらず、大部分の細胞表面及び細胞外マトリクス（ＥＣＭ）上に存在するヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合する。ＦＧＦ及びＨＳＰＧの間の相互作用は、ＦＧＦ／ＦＧＦＲ相互作用を安定化させ、ＦＧＦを封鎖しそれを分離から保護するのに役立つ（パワーズら、エンドクリン関連癌２０００、７：１６５−９７；セベニ（Ｓｚｅｂｅｎｙｉ）及びファロン（Ｆａｌｌｏｎ）、国際細胞学評論（Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｃｙｔｏｌ）１９９９、１８５：４５−１０６）。レセプタトランスリン酸化を導くキナーゼドメインの活性化のためには、リガンド結合時点のＦＧＦレセプタ単量体の２量体化が必要条件であると報告されている。４つのＦＧＦレセプタの最大の発現パターンを示すＦＧＦレセプタ−１（ＦＧＦＲ−１）は、少なくとも７つのチロシンリン酸化部位を含んでいる。これらのリン酸化部位に対して異なる親和力で結合することにより、数多くのシグナル変換分子が影響を受ける。
【００９２】
ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２及びＦＧＦＲ−３は各々ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４及びＦＧＦ−８を認識する。さらに、ＦＧＦＲ−１とＦＧＦＲ−２はＦＧＦ−３、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−１０及びＦＧＦ−１７に結合する（パワーズら、エンドクリン関連癌２０００、７：１６５−９７）。さまざまなＦＧＦリガンドの結合は各々のレセプタスプライス形態と共に変動し、かくして、限定された数のレセプタコーディング遺伝子を通して広いレパートリのＦＧＦ媒介されたシグナリング事象を可能にする。組織特異的な交互のスプライシングにより、単一のＦＧＦＲ遺伝子を発現する細胞が、異なるリガンド特異性及び機能を示し得る全く異なるレセプタイソ型を生成することによってその生物学的応答を著しく多様化させることが可能となる。ＦＧＦＲ−４はＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−８及びＦＧＦ−９に結合するもののＦＧＦ−３、ＦＧＦ−５又はＦＧＦ−７に結合しない。ＦＧＦ−７つまりケラチノサイト成長因子−１（ＫＧＦ−１）は、ＦＧＦＲ−２によってのみ認識され、一方ＦＧＦ−９はＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３及びＦＧＦＲ−４に結合する。ＦＧＦ１１〜ＦＧＦ１９のレセプタ特異性は充分に理解されていない（パワーズら、エンドクリン関連癌２０００、７：１６５−９７；オルニス（Ｏｒｎｉｔｚ）ら、生物化学ジャーナル１９９６、２７１：１５２９２−７）。
【００９３】
主要な器官系由来の正常なヒト成人組織内の免疫組織学研究（ヒューズ（Ｈｕｇｈｅｓ）、組織化学及び細胞化学ジャーナル（Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ）１９９７、４５：１００５−１９）は、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２及びＦＧＦＲ−３が広く発現されることを示しており、これは、組織ホメオスタシスにおける重要な機能的役割を示唆している。組織特異的イソ型についてのタンパク質発現パターンはまだ判定されていない。ＦＧＦＲ−４は、その他の３つのレセプタの全てが主に発現されている組織である、肺、卵管、胎盤、睾丸、前立腺、甲状腺、副甲状腺及び交感神経節では著しく欠如しているより限定されたパターンを有している（ヒューズ、組織化学及び細胞化学ジャーナル１９９７、４５：１００５−１９）。
【００９４】
ＣＧ５３１３５のレセプタ結合特異性を判定するために、我々は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で産生された組換え型ＣＧ５３１３５−０１によるＮＩＨ３Ｔ３細胞内のＤＮＡ合成の誘発に対する可溶性ＦＧＦＲの効果を調査した。
【００９５】
材料と方法
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のタンパク質の精製：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の産生のためには、大腸菌発現宿主ＢＬ２１内にプラスミドｐＥＴＭＹ−ｈＦＧＦ２０Ｘを形質転換し（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））、タンパク質ＣＧ５３１３５発現の誘発をメーカーの指示事項に従って実施した。３７℃でＬＢ培地内においてｐＥＴＭＹｈＦＧＦ２０Ｘ／ＢＬ２１大腸菌の細菌を成長させた。０．６のＯＤで、最終的な感染多重度が５になるまでバクテリオファージラムダ（ＣＥ６）を添加した。３時間２７℃で、感染した培地をさらにインキュベートした。誘発の後、全細胞を収穫し、抗ＨｉｓＧｌｙ抗体（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ウェスタンブロット法によりタンパク質を分析した。低速遠心分離（４℃で１５分間ＧＳ−３回転子内で５０００ｒｐｍ）により細胞を収穫し、０．５ＭのＮａＣｌ及び１Ｍのアルギニンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁させ、ミクロフルイダイザに２回通して分断させた。細胞残屑を低速遠心分離により除去し、０．２ミクロンの低タンパク質結合膜を通したろ過により、可溶性タンパク質画分（上清）を清澄化させた。その後タンパク質試料を金属キレート化カラム（硫酸ニッケルが予め充填されているもの）上に投入した。ニッケルカラムをＰＢＳ／０．５ＭＮａＣｌ＋１ＭのＬ−アルギニンで洗浄し、結合したタンパク質をイミダゾールの線形勾配（０−０．５Ｍ）で溶出させた。ＣＧ５３１３５（１００−１５０ｍＭイミダゾール）を含有する画分をプールし、１ＭのＬ−アルギニンを含む１×１０６倍体積のＰＢＳｐＨ８．０に対して透析させた。タンパク質の試料を−８０℃で保管した。
【００９６】
レセプタ特異性：ＮＩＨ３Ｔ３細胞を９６ウェルの平板に約１００％の集密性に至るまで培養し、洗浄し、補足無しのＤＭＥＭ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補給し、２４時間インキュベートした。次に組換え型ＣＧ５３１３５−０１又は対照タンパク質を次に１８時間細胞に添加した。使用される対照タンパク質はａＦＧＦ（正の対照）及び血小板由来の成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦＢＢ）（負の対照）であった。ＣＧ５３１３５活性に対する可溶性ＦＧＦＲの効果を分析するために、組換え型ＣＧ５３１３５−０１、ａＦＧＦ、又はＰＤＧＦ−ＢＢ（それぞれ１０、５及び３ｎｇ／ｍＬの最終濃度）を可溶性レセプタ（０．２、１及び５μｇ／ｍＬの最終濃度）と混合し、血清欠乏ＮＩＨ３Ｔ３細胞への添加の前に３７℃で３０分間インキュベートした。因子濃度は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞中半値ＢｒｄＵ応答を生成するのに必要とされるリガンドの量を表わす。可溶性ＦＧＦＲは、以下のレセプタ形態（ＦＧＦＲ１β（ＩＩＩｃ）；ＦＧＦＲ２β（ＩＩＩｂ）；ＦＧＦＲ２α（ＩＩＩｂ）；ＦＧＦＲ２α（ＩＩＩｃ）；ＦＧＦＲ３α（ＩＩＩｃ）；ＦＧＦＲ４）のＦｃキメラであり、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ））から得られた。ＢｒｄＵ検定は、メーカーの仕様書（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、インディアナ州インディアナポリス)に従って、４時間のＢｒｄＵ取込み時間を用いて実施された。
【００９７】
結果と結論
ＣＧ５３１３５のレセプタ結合特異性を決定するために、我々は、大腸菌内で産生された組換え型ＣＧ５３１３５−０１によるＮＩＨ３Ｔ３細胞中でのＤＮＡ合成の誘発に対する可溶性ＦＧＦＲの効果について調査した。ＦＧＦＲ１β（ＩＩＩｃ）、ＦＧＦＲ２β（ＩＩＩｂ）、ＦＧＦＲ２α（ＩＩＩｂ）、ＦＧＦＲ２α（ＩＩＩｃ）、ＦＧＦＲ３α（ＩＩＩｃ）及びＦＧＦＲ４のための可溶性レセプタが利用された。我々は、これらのＦＧＦＲの各々の可溶性形態がＣＧ５３１３５の生物活性を特異的に阻害できるということを発見した（図３）。
【００９８】
可溶性ＦＧＦＲ２α（ＩＩＩｂ）、ＦＧＦＲ２β（ＩＩＩｂ）、ＦＧＦＲ２α（ＩＩＩｃ）及びＦＧＦＲ３α（ＩＩＩｃ）で完全又はほぼ完全な阻害が得られ、一方可溶性ＦＧＦＲ１β（ＩＩＩｃ）及びＦＧＦＲ４で部分阻害が達成された。可溶性レセプタ試薬のいずれもＰＤＧＦ−ＢＢによるＤＮＡ合成の誘発と干渉せず（図２）、かくしてそれらの特異性を実証した。分析中のＦＧＦＲの全てと相互作用するものとして知られる１つの因子であるａＦＧＦによるＤＮＡ合成の誘発を阻害するその能力を示すことにより、各々の可溶性レセプタ試薬の無欠性を実証した（図３）。
【００９９】
５．４． 実施例４：卒中の治療
３０匹の雄のスプラーグダウエルラットを、以下の表８の研究設計の中に示したとおりの治療グループに帰属た。
【０１００】
【表１４】
*投与用量及び体積は、３３０ｇの平均体重に基づくものである。
【０１０１】
実験手順
中大脳動脈（ＭＣＡ）外科手術及び槽内注入：外科手術に先立ち７日間動物を処理した。外科手術の前日及び手術直後にセファゾリンナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を投与した。外科手術の時点で、ラットを２：１のＮ２Ｏ：Ｏ２混合物中の２％ハロタンで麻酔した。体温は３７±０．５０℃に維持した。近位右側ＭＣＡを嗅索のすぐ近位から下大脳静脈まで電気凝固し、次に離断した。槽内注入のためには、上述の通りに動物を再度麻酔し、定位枠内に置いた。ラットに対しＣＧ５３１３５−０５又はビヒクル［４０ｍＭの酢酸塩、２００ｍＭマンニトール（ｐＨ５．３）］を、ＭＣＡから１日目（約２４時間）に１回と３日目（約７２時間）に１回、大槽内への皮内注射により与えた。動物にテスト品（２用量グループ）又はビヒクル処置を研究設計に従って与えた。
【０１０２】
臨床的観察事実／徴候
注射後直ちに１時間にわたり、（おりの回りの激しい動きと震えにより示される）発作、（大きな発声により示される）苦痛及び昏睡の徴候について、動物を観察した。毎日、死亡数及び頻死数についても動物を観察した。
【０１０３】
体重：動物を１日目、３日目、７日目、１４日目及び２１日目に計量した。
【０１０４】
四肢置き直し試験：四肢置き直し試験を全ての動物について、−１日目（術前）、１日目（注射直前）、３日目及びその後７日毎（７日目、１４日目、２１日目）行なった。
【０１０５】
前肢置き直し試験評価評点：前肢置き直し試験は、動物が、視覚、触覚及び自己受容刺激に応答してテーブル上面に肢を置くにつれて、各々の前肢内の感覚運動機能を測定する。前肢置き直し試験は、以下の評価及び評点から成り、ここで前肢置き直し試験についての組合せ合計評点は、０（機能障害無し）から１０（最大の機能障害）までの範囲を反映する。
視覚性置き直し（前方向、横方向）：０〜４
触覚性置き直し（背面、側面）：０〜４
自己受容的置き直し：０〜２
全前肢試験についての合計評点：０〜１０
【０１０６】
後肢置き直し試験評価評点：同様に、後肢置き直し試験は、動物が、触覚及び自己受容刺激に応答してテーブル上面に後肢を置くにつれて、後肢の感覚運動機能を測定する。後肢置き直し試験は、以下の評価及び評点から成り、ここで後肢置き直し試験についての組合せ合計評点は、０（機能障害無し）から６（最大の機能障害）までの範囲を反映する。
触覚性置き直し（背面、側面）：０〜４
自己受容的置き直し：０〜２
全後肢試験についての合計評点：０〜６
【０１０７】
ボディスイング試験：ボディスイング試験を、全ての動物について、−１日目（術前）、１日目（注射の直前）、３日目及びその後７日毎（７日目、１４日目、２１日目）に実施した。
【０１０８】
ボディスイング試験は、動物をテーブルの表面より約１インチ上に保持し右側又は左側に揺動するにつれての側方選好性を検査する。３０回の揺動を計数し、次に右への揺動の百分率に基づいて評点を計算する。（評点範囲＝約５０％の右方揺動（機能障害無し）−０％の右方揺動（最大の機能障害））。
【０１０９】
シリンダ試験：シリンダ試験を、−１日目（術前）及び術後７日目（７日目、１４日目、２１日目）に全ての動物について実施した。シリンダ試験は、前肢の自発運動活性を測定する。動物を狭いガラスシリンダ（１６．５×２５ｃｍ）の中に入れ、卒中手術の前日に５分間そしてその後毎週の間隔で５分間ビデオテープに録画する。その後ビデオテープを、１人の経験豊かなオブザーバにより独立して評定させ、最高５０回の自発運動を計数することになる（一日ラット一匹につき約５分）。自発運動には、立上がりを開始し、着地又はシリンダの壁に沿って側方に移動するため、又は立上がりの後床に着地するため各々の前肢により行なわれるものが含まれる。
【０１１０】
肉眼検査及び組織形態学：予定された終結日（３日目）において、動物を抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により安楽死させた。脳を肉眼で検査し取り出し、ホルマリン内でポストフィックスし、脱水し、パラフィン内に包埋した。ガラススライドに取りつけたマイクロトーム上で冠状断面（５ｍｍ）をカットし、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色することになる。７つのスライス（プレグマ（Ｂｒｅｇｍａ））と比べ＋４．７、＋２．７、＋０．７、−１．３、−３．３、−５．３及び−７．３ｍｍ）の各々の上の脳梗塞の部域を、処理中の脳収縮に対し補正するべく間接的方法を用いるコーピュータインタフェース撮像システムを使用して決定した（無傷の対側半球の部域−無傷の同側半球の部域）。次に、無傷の対側半球体積の百分率として、硬塞体積を表わした。これらの同じ方法を用いて別々に、皮質及び線条体中の硬塞形成体積も決定した。Ｈ＆Ｅ染色切片を、出血、膿瘍又は腫瘍形成といったような組織学的変化について検査した。
【０１１１】
統計的分析：各動物の治療帰属については、ブラインド状態にされた治験責任医師が、全ての槽内注射、行動試験及びその後の組織学的分析を行なった。このとき、データは平均±ＳＥＭとして表わされ、１つ又は２つの方法（ＡＮＯＶＡ）とそれに続く、多数の比較についての補正を伴う適切な対になったポストホック検定によって分析されることになる。
【０１１２】
結果
前肢置き直し試験：ＭＣＡ閉塞との関係において−１、１、３、７、１４及び２１日目に、視覚、触覚及び自己受容刺激に応答した前肢内の感覚運動機能を評価するため四肢置き直し試験を使用することによって動物を検査した（カワマタ（Ｋａｗａｍａｔａ）Ｔ．、ディートリッヒ（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ）Ｗ．Ｄ．、シャレート（Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ）Ｔ．、ゴッツ（Ｇｏｔｔｓ）Ｅ．、コック（Ｃｏｃｋｅ）Ｒ．Ｒ．、ベノウィッツ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ）Ｌ．Ｉ．及びフィンクルスタイン（Ｆｉｎｋｌｅｓｔｅｉｎ）Ｓ．Ｐ．（１９９７）米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９４、８１７９−８１８４；デリック（Ｄｅ Ｒｙｃｋ）Ｍ．、ファン・リンプツ（Ｖａｎ Ｒｅｅｍｐｔｓ）Ｊ．、デュイチェバー（Ｄｕｙｔｓｃｈａｅｖｅｒ）Ｈ．、ファン・デウレン（Ｖａｎ Ｄｅｕｒｅｎ）Ｂ．及びクリンケ（Ｃｌｉｎｃｋｅ）Ｇ．（１９９２）脳研究（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）５７３、４４−６０）。１２が最大機能障害を表わすものとして、０〜１２の潜在的合計評点範囲を得るべく、視覚性置き直し（０〜４で評定）、触覚性置き直し（０〜４で評定）及び自己受容置き直し（０〜２で評定）を合計した（図４）。
【０１１３】
後肢置き直し試験：ＭＣＡ閉塞との関係において−１、１、３、７、１４及び２１日目に、触覚及び自己受容刺激に応答した後肢内の感覚運動機能を評価するため四肢置き直し試験を使用することによって動物を検査した（カワマタ（Ｋａｗａｍａｔａ）Ｔ．、ディートリッヒ（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ）Ｗ．Ｄ．、シャレート（Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ）Ｔ．、ゴッツ（Ｇｏｔｔｓ）Ｅ．、コック（Ｃｏｃｋｅ）Ｒ．Ｒ．、ベノウィッツ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ）Ｌ．Ｉ．及びフィンクルスタイン（Ｆｉｎｋｌｅｓｔｅｉｎ）Ｓ．Ｐ．（１９９７）米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９４、８１７９−８１８４；デリック（Ｄｅ Ｒｙｃｋ）Ｍ．、ファン・リンプツ（Ｖａｎ Ｒｅｅｍｐｔｓ）Ｊ．、デュイチェバー（Ｄｕｙｔｓｃｈａｅｖｅｒ）Ｈ．、ファン・デウレン（Ｖａｎ Ｄｅｕｒｅｎ）Ｂ．及びクリンケ（Ｃｌｉｎｃｋｅ）Ｇ．（１９９２）脳研究（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）５７３、４４−６０）。６が最大機能障害を表わすものとして、０〜６の潜在的合計評点範囲を得るべく、触覚性置き直し（０〜４で評定）及び自己受容置き直し（０〜２で評定）を合計した（図５）。
【０１１４】
ボディスイング試験：ＭＣＡ閉塞との関係において−１、１、３、７、１４及び２１日目に、動物がテーブルの表面より上約１インチに保持され右側又は左側に揺動するにつれての側方選好性を評価するべくボディスイング試験を用いることにより動物を検査した（カワマタ（Ｋａｗａｍａｔａ）Ｔ．、ディートリッヒ（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ）Ｗ．Ｄ．、シャレート（Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ）Ｔ．、ゴッツ（Ｇｏｔｔｓ）Ｅ．、コック（Ｃｏｃｋｅ）Ｒ．Ｒ．、ベノウィッツ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ）Ｌ．Ｉ．及びフィンクルスタイン（Ｆｉｎｋｌｅｓｔｅｉｎ）Ｓ．Ｐ．（１９９７）米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９４、８１７９−８１８４；デリック（Ｄｅ Ｒｙｃｋ）Ｍ．、ファン・リンプツ（Ｖａｎ Ｒｅｅｍｐｔｓ）Ｊ．、デュイチェバー（Ｄｕｙｔｓｃｈａｅｖｅｒ）Ｈ．、ファン・デウレン（Ｖａｎ Ｄｅｕｒｅｎ）Ｂ．及びクリンケ（Ｃｌｉｎｃｋｅ）、Ｇ．（１９９２）脳研究（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）５７３、４４−６０）。３０回の揺動を計数し、右への揺動の百分率に基づいて評点を計算する（図６）。
【０１１５】
シリンダ試験：ＭＣＡ閉塞との関係において−１、１、３、７、１４及び２１日目に、前肢の自発運動活性を評価するために、シリンダ試験により動物を検査した（カワマタ（Ｋａｗａｍａｔａ）Ｔ．、ディートリッヒ（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ）Ｗ．Ｄ．、シャレート（Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ）Ｔ．、ゴッツ（Ｇｏｔｔｓ）Ｅ．、コック（Ｃｏｃｋｅ）Ｒ．Ｒ．、ベノウィッツ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ）Ｌ．Ｉ．及びフィンクルスタイン（Ｆｉｎｋｌｅｓｔｅｉｎ）Ｓ．Ｐ．（１９９７）米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９４、８１７９−８１８４；デリック（Ｄｅ Ｒｙｃｋ）Ｍ．、ファン・リンプツ（Ｖａｎ Ｒｅｅｍｐｔｓ）Ｊ．、デュイチェバー（Ｄｕｙｔｓｃｈａｅｖｅｒ）Ｈ．、ファン・デウレン（Ｖａｎ Ｄｅｕｒｅｎ）Ｂ．及びクリンケ（Ｃｌｉｎｃｋｅ）、Ｇ．（１９９２）脳研究（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）５７３、４４−６０）。簡単にいうと、動物を狭いガラスシリンダ（１６．５×２５ｃｍ）の中に入れ、卒中手術の前日に５分間そしてその後毎週の間隔で５分間ビデオテープに録画する。その後ビデオテープを、１人の経験豊かなオブザーバにより独立して評定させ、最高５０回の自発運動を計数することになる（一日ラット一匹につき約５分）。自発運動には、立上がりを開始し、着地又はシリンダの壁に沿って側方に移動するため、又は立上がりの後床に着地するため各々の前肢により行なわれるものが含まれる（図７）。
【０１１６】
体重：ＭＣＡ閉塞との関係において、−１、１、３、７、１４及び２１日目に動物を計量した。結果は、ビヒクルとＣＧ５３１３５−０５治療の間の有意な差異を全く示していない（図８）。
【０１１７】
結論
ＭＣＡ閉塞後のＣＧ５３１３５−０５の投与は、低い及び高い用量の両方共が、対側（罹患）四肢についての前肢（図４）及び後肢（図５）置き直し試験での回復の有意な増強、及びボディスイング試験での改善（図６）を生み出すということを示唆した。このモデルにおけるその他の療法でのこの活動パターンは、それぞれ大脳皮質及び皮質下（線条体）の機能の改善を反映することが一般に示されてきた（ダイクハウゼン（Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ）ＲＭ、レン（Ｒｅｎ）Ｊ、マンデビル（Ｍａｎｄｅｖｉｌｌｅ）ＪＢ、ウー（Ｗｕ）Ｏ、オズダッグ（Ｏｚｄａｇ）ＦＭ、モスコウィツ（Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ）ＭＡ、ローゼン（Ｒｏｓｅｎ）ＢＲ、フィンックルスタイン（Ｆｉｎｋｌｅｓｔｅｉｎ）ＳＰ．２００１、米国科学アカデミー紀要９８（２２）：１２７６６−７１）。自発的四肢使用のシリンダ試験（図７）又は動物の体重（図８）については、いかなる明白な差異もみられなかった。
【０１１８】
従って、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、外傷、脊髄損傷、重金属又は毒素中毒、及び神経変性疾患（例えばアルツハイマー、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病など）を含めた病的条件の治療において、ＣＧ５３１３５−０５の投与が有用となる。
【０１１９】
５．５． 実施例５：マトリックス金属プロテイナーゼ産生検定
マトリックス金属プロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、骨及び軟骨内で細胞外マトリックスを分解させる関連酵素の１ファミリーである。これらの酵素は、組織の分化及びリモデリングにおける正常な発達中に作用する。骨関節炎（ＯＡ）及び関節リウマチ（ＲＡ）といった関節病においては、これらの酵素の発現の上昇が不可逆的マトリックス分解に貢献する。かくしてＭＭＰ産生に対するＣＧ５３１３５−０５の効果が評価された。
【０１２０】
マトリックス金属プロテイナーゼ（ＭＭＰ）の産生に対するＣＧ５３１３５の活性は、ＳＷ１３５３軟骨肉腫細胞系列（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−９４）を用いて評価された。この細胞系列は、マトリックス金属プロテイナーゼ（ＭＭＰ）のための確立した軟骨細胞モデルである。ＤＭＥＭ培地−１０％ＦＢＳ中１×１０５細胞／ｍｌ（１ｍｌ）で２４ウェルの平板中にＳＷ１３５３細胞を平板固定した。一晩のインキュベーションの後、培地をＤＭＥＭ＋０．２％のラクトアルブミン血清で置換した。０．５ｍｌの最終体積までＩＬ−１ベータ（０．１〜１ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｓシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス）、ＴＮＦ−アルファ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄシステムズ）又はビヒクル対照の不在下又は存在下で１０〜５０００ｎｇ／ｍｌの範囲内の用量でウェルに対しＣＧ５３１３５−０５を添加した。ＩＬ−１ベータ及びＴＮＦ−アルファは両方共ＭＭＰ活性の強力な刺激物質である。全ての処置は、トリプリケートウェル内で行なった。２４時間後に、上清を収集し、ＭＭＰ活性の天然の阻害物質であるプローＭＭＰ−１及び−１３ならびにＴＩＭＰ−１（マトリックス金属プロテイナーゼの組織阻害物質）をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ）により測定した。測定値をＭＴＳ検定により細胞数に正規化した。
【０１２１】
結果
ＣＧ５３１３５−０５は、それぞれ図１４及び図１５で実証されているようにＩＬ−１ベータ又はＴＮＦ−アルファのいずれかの存在下でＭＭＰ−１３産生を著しく減少させた。ＩＬ−１ベータ及びＴＮＦ−アルファは両方共、ＭＭＰ活性の強力な刺激物質である。ＯＡ内で分解される主要コラーゲンであるＩＩ型コラーゲンに対するＭＭＰ−１３親和力はＭＭＰ−１のものより１０倍高い。ＭＭＰ−１３発現はＯＡ及びＲＡ内で増大することから、ＣＧ５３１３５−０５の付加に伴って観察されるＭＭＰ−１３の減少は、ＯＡ及びＲＡ療法剤として該タンパク質を使用できるということを示している（図１０）。さらに、ＣＧ５３１３５−０５は、ＭＭＰ活性の天然の阻害物質であるＴＩＭＰ−１の産生をアップレギュレートした（図１１）。ＣＧ５３１３５−０５によるＴＩＭＰ−１産生のこの増強は、ＯＡ及びＲＡにおいて観察されたＭＭＰ−１及びＭＭＰ−１３によるマトリックス破壊を低減する上で有益である。さらに、ＣＧ５３１３５−０５は、構成的に又はＩＬ−１誘発の後（データ示さず）ＭＭＰ−３産生に対し全く効果をもたなかった。同様にして、ＣＧ５３１３５−０５（ＦＧＦ−２０）は、ＳＷ１３５３細胞内でのＭＭＰ−１の基底発現の増大を示した（データ示さず）。
【０１２２】
５．６． 実施例６：正常なラットに対するＣＧ５３１３５−０５の効果：半月板裂傷モデルに対する概念の検証
正常なラットに対するＣＧ５３１３５−０５の効果を、疾病モデル（例えば、ラットにおける骨関節炎の半月板裂傷モデル）におけるさらなる研究を押し進めるための概念の検証として研究した。滑膜及び軟骨に対するＣＧ５３１３５−０５の効果を、正常な雄のルイスラット内にタンパク質を注射することによって評価した。
【０１２３】
正常なラットにおけるＣＧ５３１３５−０５の関節内注射の効果
ビヒクル溶液（約１％のヒアルロン酸中の８ｍＭの酢酸塩、４０ｍＭのアルギニン、及び０．６％のグリセロール（ｐＨ５．３））、１０μｇのＣＧ５３１３５−０５又は１００μｇのＣＧ５３１３５−０５を２週間、１週間に３回ずつラットの関節内に注射した。
【０１２４】
研究の設計：０日目に体重２９３−３２５グラムの雄のルイスラットをハーラン・スプラーグ・ダウレイ（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）インディアナ州インディアナポリス （Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ））から入手し、８日間馴化させた。ラットを、各々３匹の動物を含む３つの処置グループに分けた。２つのグループはＣＧ５３１３５を、１つのグループはビヒクル対照のみを受けた。ラットをイソフルランで麻酔し、両膝の十字付着の部域内に膝蓋腱を通して注射した。ＣＧ５３１３５は、０．１ｍｇ／ｍｌ（関節１つあたり０．０１ｍｇ）又は１．０ｍｇ／ｍｌ（関節１つあたり０．１ｍｇ）の用量で注射した。上述の通りに、ビヒクル溶液を対照に注射した。注射は、２週間、月、水及び金曜日に行なった。１５日目に動物を処分し、その時点で、増殖中の細胞をパルス標識するべくＢＲＤＵ（１００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に注射した。
【０１２５】
病変マーカーの観察及び分析
相対的観察。異常な膨れ又は歩行変化について毎日ラットを観察し、毎週体重測定した。
【０１２６】
組織病理学的に保存し脱灰した（５％蟻酸）膝を２つのおおよそ等しい長手方向（足首）又は前方（膝）半分へとトリミングし、段階アルコール及び清浄剤を通して処理し、浸潤させてパラフィン内に包埋し、切断し、トルイジンブルー（膝）で染色した。以下で列挙する問題のパラメータに注意しながら、右膝の多数の切片（３レベル）を顕微鏡で分析した。各パラメータを正常、最小、軽度、中度、高度又は重度として段階付けした。タンパク質の反復的注射により生成される改変のタイプを理由として、骨関節炎モデル内で一般的に用いられる評定基準よりもむしろ描写的パラメータを用いて軟骨の評価を行なった。動物は処分する前にＢＲＤＵの注射を受けたものの、増殖変化は、トルイジンブルーで染色した切片内に容易に見られた。
【０１２７】
結果
【表１５】
【０１２８】
研究全体を通して、生存段階パラメータ体重は、ビヒクル及びタンパク質を注射した動物のいずれにおいても類似していた（表１２）。１００μｇのタンパク質を注射した膝は、３番目の注射で始まって注射プロセス中に臨床的に幾分かの線維症の証拠を有していた。
【０１２９】
形態学的病理ビヒクルの注射を受けたラットは、線維化した滑膜内のマトリックス被着が全く乃至は最小限しかない状態で、最小乃至は軽度の滑膜過形成、炎症、線維増殖を有していた。関節軟骨は、いかなるプロテオグリカン損失もフィブリル化も有していなかった。十字が付着しその中に関節内注射が行なわれる関節の中央部域は、全く乃至は最小限の線維増殖及び軟骨／骨損傷しか有していなかった。いかなる辺縁軟骨形成も存在しなかった。
【０１３０】
１０μｇのＣＧ５３１３５−０５の注射を受けた膝は、線維化した滑膜内のマトリックス被着が最小限乃至は中度ある状態で、最小限乃至は中度の滑膜過形成、炎症、線維増殖を有していた。関節軟骨は、いかなるプロテオグリカンの損失もフィブリル化も有していなかった。十字が付着しその中に関節内注射が行なわれる関節の中央部域は、全く乃至は最小限の線維増殖及び軟骨／骨損傷しか有していなかった。１つの膝は、辺縁帯の最小限の軟骨形成を有していた。
【０１３１】
１００μｇのＣＧ５３１３５−０５の注射を受けた膝は、線維化した滑膜内に中度のマトリックス被着ある状態で、中度乃至は高度の滑膜過形成、炎症、線維増殖を有していた。関節軟骨は、全く乃至は最小限しかプロテオグリカンの損失又はフィブリル化を有していなかった。十字が付着し中で関節内注射が行なわれる関節の中央部域は、最小限乃至は高度の線維増殖及び軟骨／骨損傷を有していた。全ての膝は、軽度乃至中度の辺縁帯軟骨形成を有していた。１匹の動物は、関節軟骨に結びつけられた部域内に軟骨形成を有していた。
【０１３２】
結論
これらの結果はＣＧ５３１３５−０５の反復的関節内注射が滑膜線維増殖を誘発することを実証している。ビヒクル注射は結果として軽度の炎症及び線維増殖をもたらし、かくして、このビヒクルが幾分かの刺激性潜在能力をもつことを示唆した。タンパク質の注射を受けた動物において、滑膜増殖性応答の濃度応答性増加と辺縁帯軟骨成分が発生した。注射が行なわれた十字付着の部域は、それ自体滑膜炎症と同様にタンパク質の濃度増加に伴って重症度が増大する骨再吸収及び線維増殖の部域を有していた。観察された滑膜線維増殖及び骨再吸収の潜在的に不利な効果は、タンパク質を処方するのに使用された非臨床等級のヒアルロン酸内部のＦＧＦ−２０活性又は内毒素レベルのいずれかに起因するものであったと考えられる。さらに関節内の炎症は骨再吸収及び辺縁帯軟骨形成を誘発し得、従ってこれらの結果は、タンパク質注射に対する炎症性応答が増殖性応答に貢献した可能性に照らし合わせて解釈される必要がある。増殖性変化及び軟骨形成の形態学的外見は、明らかに、このタンパク質（ＣＧ５３１３５−０５）の生物活性が応答を生成する上で重要であることを示している。
【０１３３】
本書で報告されている実験の結果は、ＣＧ５３１３５−０５の反復的な関節内注射が滑膜線維増殖及び軟骨形成を誘発することを示している。
【０１３４】
５．７． 実施例７：ラット骨関節炎の半月板裂傷モデルにおけるＣＧ５３１３５−０５の関節内注射：予防及び治療的投薬
実施例６は、組織形態計測解析により関連する細胞集団に対する効果を同定するため、正常なラットの関節内へのＣＧ５３１３５−０５の投与を利用した。関節１つあたり１００μｇの用量で、ＣＧ５３１３５−０５は、ＴＧＦ−ベータといったようなその他の成長因子で見られるものに類似した有意な辺縁帯軟骨形成を誘発し、辺縁帯内部での多能性幹細胞に対する効果を示唆した。関節の成熟軟骨部域内の応答の欠如により証明されるように、成熟軟骨細胞に対する明らかな効果は全く存在しなかった。観察された滑膜線維増殖及び骨再吸収の潜在的に不利な効果は、タンパク質を処方するのに使用された非臨床的等級のヒアルロン酸内部のＦＧＦ−２０活性又は内毒素レベルのいずれかに起因するものであったと考えられる。
【０１３５】
実施された骨関節炎の動物におけるさらなる研究は、以下のことに関するものであった。１）抗炎症薬との相乗効果（骨関節炎患者についての標準的アプローチ）、２）ＣＧ５３１３５−０５（ＦＧＦ−２０）が関節軟骨層の機能的修復又は保護を誘発できるか否か及び３）滑膜線維増殖及び骨再吸収がＦＧＦ−２０誘発されたか又は処方内部の汚染性内毒素に起因するものであったか。
【０１３６】
かくしてこの研究の１つの側面は、ラット骨関節炎の半月板裂傷モデル内の骨関節炎における関節損傷に対するＣＧ５３１３５−０５の関節内注射の保護的及び治療的効果を評価することにあった。ＯＡのこの比較的新しいモデルは、その他の種における突発的疾病及び外科手術によって誘発された疾病において発生する変化に似た軟骨変性及び骨棘形成の形態的改変を有することが示されてきた（ベンデーレ（Ｂｅｎｄｅｌｅ）Ａ．Ｍ．、変形性関節症の動物モデル（Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、Ｊ．Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌ．Ｎｅｕｒｏｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２００１；１：３６３−３７６、ベンデーレ（Ｂｅｎｄｅｌｅ）Ａ．Ｍ．及びハルマン（Ｈｕｌｍａｎ）Ｊ．Ｆ．、テンジクネズミにおける突発性軟骨変性（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ）、関節炎とリューマチ（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ）、１９８８；３１：５６１−５６５）。該モデルは、抗変性ならびに再生療法の潜在的に有益な効果を評価するために使用することができる。
【０１３７】
実験的設計
おり１個に２匹の割合で収容した動物（１グループにつき１０匹）をイソフルランで麻酔し、右膝部域を外科手術のために前処理した。膝の内側面全体にわたり皮膚切開を行ない、鈍的切開により内側側副靭帯を露出させ、次に離断させた。内側半月を次に細いハサミで内側対称移動させ、完全な裂傷をシミュレートするべく全厚みにわたりカットを行なった。皮膚を縫合により閉じた。
【０１３８】
予防的投薬：外科手術の日に右膝関節の関節内投薬（ＣＧ５３１３５−０５）を開始し、ラットがイソフルラン麻酔下にある状態で、外科手術後２週間にわたり木曜、土曜及び月曜（０、２、４、７、９及び１１日目）に関節内注射することによってこれを継続した。非ステロイド系抗炎症薬であるインドメタシンを、外科手術の日から始めて経口経路で毎日投薬（１ｍｇ／ｋｇ／日）して、注射に起因するあらゆる潜在的炎症を低減させた。０日、７日及び１４日目に体重を記録した。外科手術から１４日目に動物を処分した後、両方の膝を組織病理的評価のために収集した。研究設計は、表１０に示されている。
【０１３９】
【表１６】
ａ 毎週３回で２週間の投与（１００μｇ／関節、関節内）
ｂ 毎日で、２週間の投与（０．５ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ）
【０１４０】
治療的投薬：外科手術から２１日目に右膝関節の関節内投薬（ＣＧ５３１３５−０５）を開始し、ラットがイソフルラン麻酔下にある状態で、２週間にわたり金曜、日曜及び火曜（２２、２５、２７、２９、３２、及び３４日目）に関節内注射することによってこれを継続する。インドメタシンを、外科手術の日から始めて経口経路で毎日投薬する。０日、７日、１４日、２１日、２８日及び３５日目に体重を記録する。３５日目に両方の膝を組織病理的評価のために収集する。研究設計は、表１１に示されている。
【０１４１】
【表１７】
ａ 毎週３回で２週間の投与（１００μｇ／関節、関節内）
ｂ 毎日で、２週間の投与（０．５ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ）
【０１４２】
予防的投薬研究の結果：行なわれた観察には、このモデルのために従った標準が含まれている。右膝の多数の切片（３レベル）を顕微鏡により分析し、以下の方法に従って評定した。３つの切片を評定するにあたっては、３つのレベルを表わす３枚のスライドの各々の上の２個の半分について最悪の場合の筋書きを、軟骨の変性及び骨棘の形成について判定した。各スライドについての各パラメータのこの値を次に平均して、脛骨及び大腿骨についての全体的な主観的軟骨変性評点及び脛骨についての骨棘評点を決定した。
【０１４３】
以下の基準を用いて深さ及び面積（表面積を３分したもの）について無から重度（数値で０〜５）の評点で軟骨変性を評定した。
０＝変性無し
１＝表面ゾーンが関与するフィブリル化を伴う又は伴わない、最低限の変性、軟骨細胞及びプロテオグリカン損失
２＝上３分の１が関与するフィブリル化を伴うか又は伴わない軽度の変性、軟骨細胞及びプロテオグリカンの損失
３＝フィブリル化が中央ゾーン内に充分拡がり一般に全軟骨厚みの１／２に影響を与えている、中度の変性、軟骨細胞及びプロテオグリカン損失。
４＝完全なマトリックス損失（最高到達点まで）は無いが、フィブリル化が深層ゾーン内へ充分に拡がっている状態の、高度の変性、軟骨細胞及びプロテオグリカン損失、
５＝重度の変性、最高到達点までのマトリックス損失。
【０１４４】
この評定方法においては、ゾーン（外側、中央、内側の３分の１）に対する厳密な注意を遵守した。合計評点は、脛骨変性の重症度の包括的合計を反映している。
【０１４５】
軟骨変性のこの全体的な主観的分析に加えて、脛骨プラトーを横断しての特定の領域的差異に注意を払いながら、変性重症度を評価するため類似の基準を用いて付加的な主観的評価を行なった。このＯＡモデルでは、一般に、外科手術後３週間までに病巣が往々にして最高到達点まで拡がっている状態で、脛骨の外側１／３が半月板裂傷傷害を最も重症で患っている。中央の１／３は、通常、重度又は高度の変化が中度又は軽度になる遷移ゾーンであり、内部の１／３は、軽度又は最小限よりも大きい変化を有している。外側１／３の重度病巣対中間１／３及び内側１／３のより軽度の病巣について潜在的な治療の差異を判定しようとして、これらの領域を各々別々に評定した。領域の値の合計を計算し、３つのゾーンの合計として表現した。
【０１４６】
上述の主観的評定に加えて、表面を横断して接線層及び下にある軟骨が組織学的に正常に見える点に至るまでの隣接する軟骨変性（外側１／３）に伴っていかなる骨棘も存在しなかった場合、骨棘又は辺縁帯の起点から拡がるあらゆる重症度の変性を患う脛骨プラトーの全範囲のマイクロメートル測定（全脛骨軟骨変性幅μｍ）が行われた。
【０１４７】
付加的な測定（有意な軟骨変性幅μｍ）は、軟骨細胞及びマトリックスの損失が軟骨厚みの５０％超にわたって拡がっていた脛骨軟骨変性の部域を反映していた。
【０１４８】
最後に、変化した部域の深さと最高到達点までの深さの比率として表わされたあらゆるタイプの病巣のマイクロメートル深さ（細胞／プロテオグリカン損失、メタクロマジア変化、ただしコラーゲンマトリックスの優れた保持を有しフィブリル化は無いかもしれない）が含み入れられ、脛骨表面上の４つの等間隔の点全体にわたって取られた。これらの測定は（Ｎｏ．１）骨棘に隣接するマトリックス、（Ｎｏ．２）脛骨プラトーを横断する距離の１／４、（Ｎｏ．３）脛骨プラトーを横断する距離の１／２、（Ｎｏ．４）脛骨プラトーを横断する距離の３／４、のところで行われた。この測定は、存在するあらゆるタイプの顕微鏡的変化の最も重大な分析であった。最高到達点（分母）までの深さは同様に、脛骨プラトーを横断する軟骨厚みの標示をも提供し、従って、肥大又は過形成が発生したか否かを判定しようとする場合に、グループを横断した比較を可能にする。
【０１４９】
切片の非接線平面内の全体的厚みを最も良く表わすものと思われている部域内で各切片について単一の成長脛骨板測定を行なった。
【０１５０】
接眼マイクロメータを用いて、骨棘の評定及び小中大分類を行なった。
無＝０、辺縁帯に測定可能な増殖性応答は全く存在しない。
小骨棘＝１（最高２９９μｍ）
中骨棘＝２（３００〜３９９μｍ）
大骨棘＝３（＞４００μｍ）
【０１５１】
評点（０−３）は全体的関節評点の中に含み入れられた。さらに、実際の骨棘測定（平均３つの切片について）のための平均±ＳＥも同様に決定された。
【０１５２】
一般に、外科手術を行なう上で、半月板が大腿骨に向かって近位に対称移動する結果となる場所で側副靭帯を離断させる試みがなされた。その後、脛骨ではなく大腿骨に向かってハサミの先端を挿入することにより、カットを行なった。このとき大腿骨の顆状軟骨内で幾分かの機械的損傷を検出し得るものの、脛骨上には稀にしか見られず、かくして脛骨は軟骨保護の評価のための最も適切な部位となっている。
【０１５３】
大腿骨軟骨に対する物理的外傷の結果である可能性が高かったプロテオグリカン及び細胞損失の小さな焦点部域は記述されたものの、脛骨について記述された方法に従って主観的評点を受けるより大きくより広範な部域についての評点内には含み入れられなかった。これらのより大きい部域は、非外傷性変性とより強い一貫性をもっていた。大腿骨上に医原性病巣の可能性があるため、全体的関節評点は、大腿骨軟骨変性評点を伴うものと伴わないものの両方で表現された。
【０１５４】
以下の基準を用いて、石灰化された軟骨層と軟骨下骨に対する損傷を評定した。
０＝変化無し
１＝最高到達点における好塩基球増加症の増大：最高到達点の断片化又は骨髄変化無し。
２＝最高到達点における好塩基性増加症の増大：最高到達点の石灰化軟骨の最小限乃至は軽度の断片化、骨髄内の間葉変化には合計部域の１／４が関与しているが、一般に病巣下の軟骨下領域に限定されている。
３＝最高到達点における好塩基性増加症の増大：石灰化軟骨の軽度乃至高度の断片化、骨髄中の間葉変化は合計部域の最高３／４であり、骨髄軟骨形成の部域は明白であり得るが、骨端骨内への関節軟骨の崩壊は全く無い。
４＝最高到達点における好塩基性増加症の増大：石灰化軟骨の高度乃至重度の断片化、骨髄間葉変化には最高３／４の部域が関与し、関節軟骨は、骨端内に最高到達点から２５０μｍ以下の深さまで崩壊していた。
５＝最高到達点における好塩基性増加症の増大：石灰化軟骨の高度乃至重度の断片化、骨髄間葉変化には最高３／４の部域が関与し、間節軟骨は、骨端内に最高到達点から２５０μｍを超える深さまで崩壊していた。
【０１５５】
滑膜炎、滑膜線維症、辺縁帯軟骨形成、骨再吸収、軟骨形成／既存軟骨への取込みを伴うか又は伴わない線維性発育過度の度合について記述的コメントがなされた。
【０１５６】
統計的分析：組織病理学的パラメータの統計的分析が、有意性がＰ≦０．０５に設定された状態でスチューデント両側ｔ−検定を用いて、グループ平均を比較することによって行なわれた。データの性格のため、評定されたパラメータを分析するのに、非パラメトリックＡＮＯＶＡ（クラスカル・ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ）検定を使用し、測定値を分析するのにパラメトリックＡＮＯＶＡを使用した。使用された適切な事後試験は、パラメトリックデータについてのダネット多重比較検定であり、非パラメータデータについてはダン検定が用いられた。有意性は、全てのパラメータについてＰ≦０．０５に設定された。
【０１５７】
結果：同時インドメタシン投与を伴う又は伴わない１００μｇのＣＧ５３１３５−０５の間節内注射は、中間１／３上で脛骨軟骨変性の有意な阻害（３９％）（ゾーン１については４０〜４３％）、そして４１％という合計３ゾーンの全体的に有意でない阻害を結果としてもたらした（図１２）。合計軟骨変性幅は有意に３５〜３７％減少し（図１３）、有意な変性は７０〜８９％減少し、この阻害はタンパク質及びインドメタシン処理したグループ内でのみ有意である（図１４）。
【０１５８】
予防的投薬研究の結果：記述されたデータは、内側半月裂傷を伴うラットの膝関節の中に１００μｇのＣＧ５３１３５−０５を関節内投与すると、軟骨変性の阻害と軟骨修復の刺激の両方の結果としての軟骨保護効果がもたらされるということを示している。一部の関節は、既存の正常とみえる又は損傷した軟骨全体にわたる増殖した新しい軟骨の層状化を有していた。この観察事実は、それが表面再建の発生の可能性を実証することから、特に興味深いものである。
【０１５９】
これらの有益な効果はつねに、広汎性滑膜線維増殖、骨再吸収及び滑膜炎の増加と結びついていた。同時インドメタシン処置（１ｍｇ／ｋｇ／日）は、シンビスク（Ｓｙｎｖｉｓｃ）単独の注射を受けた膝における疾病プロセス又はタンパク質を含有するシンビスクの注射を受けた膝におけるタンパク質に対する反応及び疾病プロセスに対して、何らかの効果があったにせよ、それは最小限のものであった。この供述に対する単一の例外は、タンパク質及びビヒクルｐｏで処置されたグループを除いて全てのグループが類似の測定値を有していた骨棘測定についてのデータの中に反映されている。前記グループは、より大きい測定値を有し、かくして、炎症のある関節においては、普通の出来事であるより大きい辺縁帯刺激を示唆していた。
【０１６０】
このタンパク質１００μｇの注射により誘発された形態学的変化は、軟骨修復プロセスにおいてＣＧ５３１３５−０５が有効である可能性を実証している。それは、軟骨への分化を伴う線維組織の増殖と、重要なことにその新しく増殖した組織の組込みを誘発する能力を有している。増殖性プロセスは、辺縁帯及び軟骨下骨といったような部域内では幾分かまとまりがなく反生産的である。しかしながら、ゲッ歯類は、炎症性媒介を含むさまざまな刺激から辺縁帯、骨膜及び骨髄の増殖を示すはるかに大きな傾向を確実に有しており、そのためラットにおいて見られる過度の及び反生産的な応答の一部分は、イヌ又は霊長類では起こらない可能性がある。同様に、抗体応答のいくらかの誘発が存在し、かくして抗体応答をもたなかったヒト又はその他の動物においては発生しないと思われる膝の炎症の増強が導かれた可能性がある。
【０１６１】
骨関節炎におけるＣＧ５３１３５−０５の潜在的効能を描写する上で有用な付加的な研究としては、以下のものが含まれる。
【０１６２】
１． ＯＡのイヌモデルにおける評価−これはヒトにより類似している軟骨及び骨の構造を伴うより大きい関節の中で評価を可能にすると思われ、これは、ゲッ歯類において発生するものといったような超増殖性応答を示す傾向が比較的低い種である。
【０１６３】
２． 可能な場合にはより攻撃的な抗炎症性全身的療法及びそれに続く新しい組織がいかにリモデリングするかを見るための回復期間を伴う、３〜４週間の関節内注射の評価が有利であると思われる。さらなる増殖性刺激が全く無い状態で関節をリモデリングさせることが、より好ましい形態学的評価項目という結果をもたらすことになるかもしれない。リモデリング期間を伴う処置サイクルは、最も満足のいく修復を達成する方法であるかもしれない。これらのような研究は、同様に、修復組織が長期間持ちこたえるか否かの問題にも答えることになるだろう。一般に、線維軟骨はこれを行なう傾向が少ない。
【０１６４】
結果：同時経口インドメタシン投与を伴う又は伴わない１００μｇのＣＧ５３１３５−０５の関節内注射は、脛骨軟骨変性評点の有意な阻害を結果としてもたらさなかった（図１５）。合計又は有意軟骨変性幅は減少しなかった（図１６、１７）。
【０１６５】
治療的投薬研究の結果：記述されたデータは、関節内投与されたＣＧ５３１３５−０５の潜在的軟骨増殖的活性を実証した。しかしながら、タンパク質を注射した関節は著しく増大した炎症、線維増殖及び結合組織再吸収プロセスを有していた。
【０１６６】
予防的投薬と治療的投薬の間の最も重要な差異は、投薬開始時点におけるＯＡ病巣の性質であった。治療的投薬研究におけるラットは、軟骨の外側乃至中間の１／３において重度のマトリックス損失の部域を有し、かくして石灰化軟骨／軟骨下骨をタンパク質に暴露した。かくして有効な修復には、辺縁帯又は暴露された骨髄多能性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）細胞に由来する新たに増殖した組織でこの欠陥を充填することが必要であった。予防的投薬研究においては、有益な効果には、マトリックス分解の阻害及び辺縁帯のみに由来する修復組織での変性足場上の修復の刺激が必要であった。欠陥の充填は損傷を受けた足場の修復よりもはるかにむずかしいと思われることから、有益な効果を得るためには治療的モデルにおいてより長い処置時間が必要となるかもしれない。
【０１６７】
インドメタシン処置は、炎症変化を削減する上で有効ではなく、骨の中で発生しつつある再吸収プロセスを阻害する上でも有益な効果を全くもたなかった。炎症及び組織破壊が無い状態で軟骨への有効な増殖及び分化を達成するために、治療的投薬研究に対する以下の修正を試みることができる。すなわち、投薬間隔を週１回又は２回まで増大させること及び／又は増殖性組織がこの疾病プロセスによって誘発された大きな軟骨欠陥を充填することのできる時間を与えるべく研究の持続時間を延長すること、である。イヌはゲッ歯類に比べてさまざまな刺激に応えて結合組織を増殖させ骨を再吸収する傾向が少ないことから、イヌといったようなより大きい種においてＣＧ５３１３５−０５の効果を調査することが、もう１つの可能性である。
【０１６８】
本書で詳述されている結果（予防的及び治療的の両方の投薬研究）は、ＣＧ５３１３５−０５が、関節置換術を目的とした重度の骨関節炎を患う関節において特に有用であることを示している。これらのタイプの作用物質は、わずかしか又は全く正常な軟骨が残っておらず表面再建を必要とする関節内に注射されることになる。この状況下では、修復は、辺縁帯又は骨髄内の多能性細胞を源とする可能性がある。これらの場所を出発点とする修復は、ヒアリン軟骨よりもむしろ線維軟骨の産生を結果としてもたらす確率が高くなる。しかしながら、一部の軟骨は、全く軟骨が無いよりは好ましいと思われ、修復を持続させるために経時的に治療をくり返さなくてはならない確率が高いとしても、軟骨表面を維持する注射可能な方法が受容可能であるかもしれない。注射用同化剤での処置には、持続性能動的耐負荷運動よりもむしろ連続的な受動的運動と併用した或る種の周期的プロセスが必要となる確率が高い。
【０１６９】
６． 等価物及び引用参考文献
本書で引用されている全ての参考文献は、各々個々の刊行物又は特許又は特許出願が全ての目的で全体として参考により援用されるべく特定的かつ個別に指示された場合と同じ程度で、全ての目的で全体が本明細書に参照により援用されている。
【０１７０】
当業者にとっては明白となるように、本発明の数多くの修正及び変更を、その精神及び範囲から逸脱することなく加えることが可能である。本書中に記述されている特定の実施形態は、例示のみを目的として提供されている。従って、本発明者らはここで記されている精確な用語に限定されることを望む者ではなく、本発明をさまざまな用途及び条件に適合させるために行なうことのできるような変化及び改変を利用できることを望む者である。かかる改変及び変化には、対象に対する本発明に従ったポリペプチドの投与のための異なる組成物；異なるポリペプチド量；異なる投与回数及び投与手段；例えば異なるペプチドの組合せ又は異なる生物学的に活性な化合物とペプチドの組合せを含む投与用量内に含まれる異なる材料が含まれるが、これらに限定されるわけではない。かかる変化及び改変は同様に、かかる変化がポリペプチドの機能性を変更せず、対象に投与すべき組成物中のペプチドの可溶性、身体によるペプチドの吸収、保管寿命中の又は体内でペプチドの生物学的活動が所望の効果をもたらすことのできる時までのポリペプチドの保護及びこのような類似の修飾を変更するような形で配列を改変する、本書中で記述されている特定のポリペプチドのアミノ酸配列中の修飾を含むように意図されている。従ってかかる変化及び改変は、本発明の等価物の全範囲内に入るものとして適切に意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】ＣＧ５３１３５−０５の液体クロマトグラフィ及び質量分析法を示す。ＣＧ５３１３５−０５は、９５％の水、５％のアセトニトリル及び０．１％のトリフルオロ酢酸を含有する水系移動相中のフェニル−ヘキシルカラム上に注入された。その後タンパク質を、９５％のアセトニトリル、５％の水、及び０．０８５％のトリフルオロ酢酸を含有する有機移動相での非線形勾配を用いることによって溶出させた。４つのピークの各々は、ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ及びＮ−末端アミノ酸配列決定を用いて特徴づけした。
【図２Ａ】ＣＧ５３１３５−０５のペプチドマップを表わす。各図版内の上部のトレースは、ＣＧ５３１３５−０５のペプチドマップを表し、各図版内の下部のトレースは、同様の要領で、ただしＣＧ５３１３５−０５無しで処置された同一の試料を表わしている。ＣＧ５３１３５ペプチドを監視するための２１４ｎｍでの検出。
【図２Ｂ】ＣＧ５３１３５−０５のペプチドマップを表わす。各図版内の上部のトレースは、ＣＧ５３１３５−０５のペプチドマップを表し、各図版内の下部のトレースは、同様の要領で、ただしＣＧ５３１３５−０５無しで処置された同一の試料を表わしている。トリプトファン含有ペプチドを監視するための２９５ｎｍでの検出。
【図３】ＣＧ５３１３５のレセプタ結合特異性を示す。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を血清欠乏させ、指示された因子（緑色正方形＝血小板由来の成長因子；青色三角形＝ＦＧＦ−１；赤色円＝ＣＧ５３１３５）を単独で又は指示された可溶性ＦＧＦＲと共に用いてインキュベートし、ＣＧ５３１３５に応答するＤＮＡ合成をＢｒｄＵ取込み検定の中で測定した。データの点数は、トリプリケートウェルから得た平均を表わし、因子を単独で受ける細胞に関するＢｒｄＵ取込みパーセントとして表わされている。
【図４】前肢置き直し試験の結果を示す。ビヒクル（菱形）、注射１回あたり１．０μｇのＣＧ５３１３５−０５（正方形）及び２．５μｇのＣＧ５３１３５−０５（三角形）を受けるグループについて評点の平均及び標準誤差が経時的に表わされている。アスタリスクは、一方向ＡＮＯＶＡによって評価される通りのビヒクル対照からの有意な差異を示している。
【図５】後肢置き直し試験の結果を示す。ビヒクル（菱形）、注射１回あたり１．０μｇのＣＧ５３１３５−０５（正方形）及び２．５μｇのＣＧ５３１３５−０５（三角形）を受けるグループについて評点の平均及び標準誤差が経時的に表わされている。アスタリスクは、一方向ＡＮＯＶＡによって評価される通りのビヒクル対照からの有意な差異を示している。
【図６】ボディスイング試験の結果を示す。ビヒクル（菱形）、注射１回あたり１．０μｇのＣＧ５３１３５−０５（正方形）及び２．５μｇのＣＧ５３１３５−０５（三角形）を受けるグループについて評点の平均及び標準誤差が経時的に表わされている。右方への約５０％の揺動の評点範囲は、いかなる機能障害も無いことを表し、一方右方への０％揺動は最大の機能障害を表す。アスタリスクは、一方向ＡＮＯＶＡによって評価される通りのビヒクル対照からの有意な差異を示している。
【図７】シリンダ試験の結果を示す。ビヒクル（菱形）、注射１回あたり１．０μｇのＣＧ５３１３５−０５（正方形）及び２．５μｇのＣＧ５３１３５−０５（三角形）を受けるグループについて評点の平均及び標準誤差が経時的に表わされている。
【図８】体重試験の結果を示す。ビヒクル（菱形）、注射１回あたり１．０μｇのＣＧ５３１３５−０５（正方形）及び２．５μｇのＣＧ５３１３５−０５（三角形）を受けるグループについて体重の平均及び標準誤差が経時的に表わされている。
【図９】ＩＬ−１ベータの存在下でのＳＷ１３５３細胞中のＰｒｏ−ＭＭＰ産生に対するＣＧ５３１３５−０５の効果を示す。
【図１０】ＴＮＦ−アルファの存在下でのＳＷ１３５３細胞中のＰｒｏ−ＭＭＰ産生に対するＣＧ５３１３５−０５の効果を示す。
【図１１】ＳＷ１３５３細胞内のＴＩＭＰ産生に対するＣＧ５３１３５−０５の効果を示す。
【図１２】ラット骨関節炎の半月板裂傷モデル内のＣＧ５３１３５−０５の関節内注射の効果（予防的投薬）対内側脛骨軟骨変性の関係を示す。
【図１３】ラット骨関節炎の半月板裂傷モデル内のＣＧ５３１３５−０５の関節内注射の結果：（予防的投薬）対全軟骨変性幅の関係を示す。
【図１４】ラット骨関節炎の半月板裂傷モデル内のＣＧ５３１３５−０５の関節内注射の結果：（予防的投薬）対有意な脛骨軟骨変性幅の関係を示す。
【図１５】ラット骨関節炎の半月板裂傷モデル内のＣＧ５３１３５−０５の関節内注射の結果（治療的投薬）対内側脛骨変性の関係を示す。
【図１６】ラット骨関節炎の半月板裂傷モデル内のＣＧ５３１３５−０５の関節内注射の結果（治療的投薬）対全軟骨変性幅の関係を示す。
【図１７】ラット骨関節炎の半月板裂傷モデル内のＣＧ５３１３５−０５の関節内注射の結果（治療的投薬）対有意な脛骨軟骨変性幅の関係を示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、全体が本明細書に参考により援用されている２００３年５月９日付けの米国仮出願第６０／４６９，３５３号明細書の利益を請求している。
【０００２】
技術分野
本発明は、卒中、創傷治ゆ及び関節疾患（例えば骨関節炎及び関節リウマチ）を含む（ただしこれらに限定されるわけではない）さまざまな症状の治療用の組成物及び方法に関する。より詳細には、本発明は、線維芽細胞成長因子ファミリーの成員、ＦＧＦ−ＣＸ（ＣＧ５３１３５−０５又はＦＧＦ−２０としても知られている）、その関連ポリペプチド、かかるポリペプチドをコードする核酸を含む組成物、及び卒中、創傷治ゆ及び関節疾患（例えば骨関節炎及び関節リウマチといった（ただしこれらに限定されるわけではない）症状を治療するためのそれらの使用に関する。
【０００３】
背景技術
その原型的成員として酸性ＦＧＦ（ＦＧＦ−１）及び塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ−２）が含まれるＦＧＦタンパク質ファミリーは、４つの関連するレセプタチロシンキナーゼに結合する。これらのＦＧＦレセプタは、組織培養中の細胞の大部分のタイプの中で発現される。リガンド結合時点でのＦＧＦレセプタ単量体の２量体化が、レセプタトランスリン酸化反応を導くキナーゼドメインの活性化にとっての１つの必要条件であることが報告されてきた。４つのＦＧＦレセプタの中で最も広い発現パターンを示すＦＧＦレセプタ−１（ＦＧＦＲ−１）は少なくとも７つのチロシンリン酸化反応部位を含んでいる。これらのリン酸化反応部位に対し異なる親和力で結合することによって数多くのシグナル変換分子が影響を受ける。
【０００４】
周産期の及び成体のマウスの脳内におけるＦＧＦ及びそのレセプタの発現が調査されてきた。ＦＧＦ−４を除いて全てのＦＧＦ遺伝子のメッセンジャＲＮＡがこれらの組織内で検出され、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７及びＦＧＦ−８遺伝子が、出生後期よりも後期胚形成期においてさらに高い発現を示し、これらの成員が脳の発達の後期に関与していることを示唆している。これとは対照的に、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−５の発現は、出生後に増大した。特に、周産期マウスにおけるＦＧＦ−６の発現は、中枢神経系及び骨格筋に限定されており、生後５日目の新生児の小脳を除き胚内の発達中の大脳において強力なシグナルを伴うことが報告されてきた。ＦＧＦ−６の同族レセプタであるＦＧＦ−レセプタ−（ＦＧＦＲ）−４は、類似の時空的発現を示し、ＦＧＦ−６Ｒ及びＦＧＦＲ−４が、リガンド−レセプタ系として神経系の成熟において有意な役割を果たすことを示唆している。オザワ（Ｏｚａｗａ）らによると、これらの結果はさまざまなＦＧＦ及びそのレセプタが、ニューロン前駆細胞の増殖及び遊走、ニューロン及びグリア分化、神経突起拡張及びシナプス形成といったような脳のさまざまな発達プロセスの調節に関与するということを強く示唆している。例えばオザワ（Ｏｚａｗａ）ら、脳研究、分子的脳研究（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）１９９６、４１（１−２）：２７９−８８を参照のこと。
【０００５】
ＦＧＦポリペプチドファミリーのその他の成員としては、ＦＧＦレセプタチロシンキナーゼ（ＦＧＦＲＴＫ）ファミリー及びＦＧＦレセプタヘパラン硫酸プロチオグリカン（ＦＧＦＲＨＳ）ファミリーが含まれている。これらの成員は、活性でかつ特異的なＦＧＦＲシグナル変換複合体を調節するように相互作用する。これらの調節活性は、哺乳動物の体内で広範囲の器官及び組織全体を通して、かつ正常な組織と腫瘍組織の両方において多様化する。変異体サブドメインの調節された代替的メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）スプライシング及び組合せは、多種多様なＦＧＦＲＴＫ単量体を発生させる。２価のカチオンがＦＧＦＲＨＳと協同してＦＧＦＲＴＫトランス−リン酸化反応を立体配座的に限定し、これがキナーゼ活性の不振をひき起こし、ＦＧＦによるＦＧＦＲの適切な活性化を容易にする。例えば、ＦＧＦＲＴＫ内の異なる点突然変異が一般に全ＦＧＦＲ複合体のＦＧＦ非依存性活性の段階的増大による段階的重度の頭がい顔面及び骨格の異常をひき起こすことがわかっている。ＦＧＦファミリーが重大な効果を及ぼすその他のプロセスとしては、肝臓の成長及び機能、及び前立腺腫瘍の進行がある。
【０００６】
もう１つのＦＧＦファミリー成員であるグリア活性化因子（ＧＡＦ）は、ヒトグリオーマ細胞系列の培養上清から精製されたヘパリン結合成長因子である。ミヤモト（Ｍｉｙａｍｏｔｏ）ら、１９９３、分子細胞生物学（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）１３（７）：４２５１−４２５９を参照のこと。ＧＡＦは、その他の既知の成長因子のものとはわずかに異なる活性スペクトルを示し、ＦＧＦ−９と呼称される。ヒトＦＧＦ−９ｃＤＮＡは、２０８個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。ＦＧＦファミリーのその他の成員との配列類似性は、３０％前後と推定された。その他のファミリー成員内で発見された２つのシステイン残基及びその他のコンセンサス配列は、ＦＧＦ−９配列内でも充分保存されていた。ＦＧＦ−９は、酸性ＦＧＦ及び塩基性ＦＧＦ内のものと同様、そのＮ末端にいかなる標準的シグナル配列ももたないことがわかった。酸性ＦＧＦ及び塩基性ＦＧＦは、細胞から従来の要領では分泌されないものとして知られている。しかしながら、ＦＧＦ−９は、標準的シグナル配列の欠如にもかかわらずｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞から効率良く分泌されることがわかった。それは、細胞の培地内でのみ専ら検出できた。分泌されたタンパク質は、開始メチオニンを除いて、ｃＤＮＡ配列によって予測されるものに比べてＮ末端でいかなるアミノ酸残基も欠如していなかった。ラットのＦＧＦ−９ｃＤＮＡも同じくクローニングされ、構造分析はＦＧＦ−９遺伝子が高度に保存されていることを示した。
【０００７】
ＦＧＦは、ニューロンの萌芽を誘発することが示されてきた。米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）１９９７、９４（１５）：８１７９−８４を参照のこと。カワマタ（Ｋａｗａｍａｔａ）ら、脳血流及び代謝ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、１６：５４２−５４７、１９９６は、１８ｋＤａで１５４アミノ酸の長さのポリペプチドである塩基性ＦＧＦが多種多様な脳ニューロンの生存及び増生を支持するということを提案した。米国特許出願第２００２／０１５１４９６Ａ１号明細書は、ＦＧＦ−２０が神経栄養性因子であり、ニューロン由来の細胞の生存を刺激することを示唆している。
【０００８】
２．１． 炎症：骨関節炎及び関節リウマチ
骨関節炎（「ＯＡ」）は、退行変性関節疾患であり、広範かつ増大する集団が罹患している関節痛の原因となることが多い。ＯＡは、成人における身体障害の最も一般的な原因であると推定されている。該疾患は標準的に、２０代〜３０代で現われ、４０代を超える大部分の人が体重支持関節の病的変化を幾分か示すものの、変化は無症候であり得る。英国における５５才を超える人々についての膝のＯＡの発生率及び有病率の系統的な再調査は、一年に２５パーセントの発生率、１０パーセントの身体障害有病率及び約２〜３パーセントの重症身体障害を報告した。The National Health and Nutrition Examination Survey (Center for Health Statistics, Centers for Disease Control and Prevention)は、この疾病の有病率が、２５才〜３４才では０．１パーセント未満であったのに対し、５５才を超える人々においては８０パーセントを上回ることを発見した。ＯＡは、関節無欠性、遺伝的特徴、局所的炎症、機械力及び細胞及び生化学プロセスを含めた多数の因子の複雑な相互作用の結果である。該疾病に特徴的な特長は、関節軟骨の劣化、周縁部での骨の肥大及び標準的に関節の疼痛と剛化を伴う滑膜の変化である。大部分の患者について、ＯＡは加齢、職業、外傷及び経時的な反復的で小さい損傷といったような１つ以上の因子に結びつけられる。ＯＡの病態生理学的プロセスはほぼつねに進行性である。
【０００９】
ＣＧ５３１３５−０５及びその変異体は、増殖を調節するＦＧＦファミリーに属する（全体が本明細書に参考により援用されている米国特許出願第１０／１７４，３９４号明細書を参照のこと）。ヒトの体内でのＦＧＦ２０様のタンパク質、ＣＧ５３１３５−０１をコードする遺伝子内の多型（ＣＧ５３１３５−１２）の同定及びＯＡについての遺伝的リスク改変因子のキャリヤである個体を同定する方法が、全体が本明細書に参考により援用されている米国特許出願第１０／７０２，１２６号明細書（「’１２６出願」）の中で記述されてきた。’１２６出願は、ＯＡ及び結果としての筋骨格合併症のリスクが増加した個体を同定するためのＤＮＡベースの診断試験について記述している。
【００１０】
ＯＡの充分に立証済みの治療様式は、非薬学的な介入から薬学的介入に至るまで複数存在している。非薬学的介入としては、行動修正、減量、運動、歩行補助、悪化させる活動の回避ならびに関節洗浄及び関節鏡視下手術及び外科手術がある。現行の薬学的介入としては、非ステロイド系抗炎症薬、関節内注射によるコルチコステロイド及びコルヒチンがある。さらに、ＦＧＦ−１８は、ＯＡ用のラット半月板裂傷モデルにおいて損傷した軟骨を修復することが示されてきた（論文第０１９９号、整形外科研究会第５０回年次総会（５０ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、カリフォルニア州サンフランシスコ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）、２００４）を参照のこと）。
【００１１】
しかしながら、既存の治療法は、疾病の発生率又は重症度を抑えるのに成功していないことから、ＯＡの満足のいく治療は、また満たされていない医療上のニーズである。従って、骨関節炎をうまく治療できる治療法は、観血的外科手術、身体障害及び補足的な介助サービスに付随するコスト中何百万ドルもの金額を健康医療制度に潜在的に節約させる一方で罹患率を減少させるという有利な効果を有する。
【００１２】
本明細書中の引用又は論述は、それが本発明に対する先行技術であるということの是認としてみなされるべきものではない。
【００１３】
発明の開示
本発明は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）タンパク質に対して相同性をもつＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを、それを必要としている対象に投与することを含む、疾病（例えば卒中、関節疾患及び外傷）を予防又は治療する方法を提供する。本発明は同様に、ＦＧＦ−ＣＸポリヌクレオチド配列及びこれらの核酸配列によりコードされるＦＧＦ−ＣＸポリペプチド及びそのフラグメント、相同体、類似体及び誘導体をも包含する。
【００１４】
本発明に従うと、予防又は治療すべき疾病としては、関節疾患（限定的な意味のない例は、関節炎、骨関節炎、関節病変、靭帯及び腱の損傷及び半月板損傷である）、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、外傷、脊髄損傷、重金属又は毒素中毒、及び神経変性疾患（限定的な意味のない例はアルツハイマー、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病である）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００１５】
１つの態様においては、該発明は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドをコードする単離されたＦＧＦ−ＣＸ核酸（表Ａに示されている通りの配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５）又はそのフラグメント、相同体、類似体又は誘導体を包含する。該核酸には、表Ａのアミノ酸配列（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６）を含むポリペプチドと少なくとも８５％の同一性をもつポリペプチドをコードする核酸配列が含まれ得るがこれらに限定されるわけではない。該発明は、同様に、配列番号３７、３８、３９、４０を含むＣＧ５３１３−０５（配列番号２）のタンパク質開裂の結果としてもたらされるポリペプチドをも包含する。該核酸は、ゲノムＤＮＡフラグメント及びｃＤＮＡ分子であり得るがこれらに限定されるわけではない。
【００１６】
本発明は同様に、本書に記述されている核酸のうちの１つ以上のものを含有するベクター、及び本書で記述されるベクター又は核酸を含有する細胞をも包含する。
【００１７】
本発明はさらに、上述の核酸分子のいずれかを含む組換え型発現ベクターで形質転換された宿主細胞を包含する。
【００１８】
一実施形態においては、該発明は、ＦＧＦ−ＣＸ核酸及び薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。もう１つの実施形態においては、該発明は、実質的に精製されたＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、例えばＦＧＦ−ＣＸ核酸によりコードされたＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのいずれか及びそのフラグメント、相同体、類似体及び誘導体を提供する。該発明は同様に、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド及び薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物をも提供する。
【００１９】
もう１つの実施形態においては、該発明は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。該抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体又はそのフラグメント、相同体、類似体及び誘導体であり得るがこれらに限定されるわけではない。該発明は同様にＦＧＦ−ＣＸ抗体及び薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物をも提供する。該発明は同様に、上述に核酸分子のいずれかによりコードされるポリペプチド上のエピトープに結合する単離された抗体をも包含する。
【００２０】
本発明はさらに、上述の核酸分子のいずれによってコードされるポリペプチドに結合する抗体及び負の対照抗体を含むキットを提供している。
【００２１】
該発明は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを産生するための方法を包含する。該方法は、例えばＦＧＦ−ＣＸ核酸を含むベクターといったＦＧＦ−ＣＸ核酸を含有する細胞を提供すること、及び核酸によりコードされるＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを発現するのに充分な条件下で細胞を培養することを含む。該発現されたＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは、次に細胞から回収される。好ましくは、該細胞は内因性ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドをほとんど又は全く産生しない。該細胞は、例えば、原核細胞又は真核細胞であり得る。
【００２２】
本発明は、免疫応答を誘発するのに充分な量のポリペプチドを哺乳動物に投与することによって以上で開示した核酸分子のいずれかによりコードされるポリペプチドに対する対象の中での免疫応答を誘発する方法を提供する。
【００２３】
本発明は同様に、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを１つの化合物と接触させ、その化合物がＦＧＦ−ＣＸポリペプチドに結合するか否かを判定することによってＦＧＦ−ＣＸポリペプチドに結合する化合物を同定する方法をも提供している。
【００２４】
該発明は、該対象を骨関節炎にかかりやすくする傷害が発生しても軟骨を無傷にする、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドでの予防的処置を提供する。
【００２５】
該発明は同様に、内在性又は外在性因子（それぞれ例えば遺伝的素因又は半月板損傷）が骨関節炎的変化及び軟骨損傷をひき起こした場合の、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドでの治療的処置をも提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は、対象の体内の関節疾患（例えば、骨関節炎、その他の関連する関節病変、例えば限定的な意味なく、靭帯及び腱自体の内部又はそれぞれの挿入部位内の靭帯及び腱の傷害、半月板裂傷、マトリクス被着が発生するその他の関節障害、リモデリング及び修復が必要とされる関節障害及び炎症性疾患の結果として発生した軟骨及び関節病変（例えば関節リウマチ））を予防又は治療する方法において、該対象に対しＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを含む組成物を投与することを含む方法を提供している。
【００２７】
本発明は同様に、ラットの体内での中大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞後の機能的回復を改善するべくＦＧＦ−ＣＸを使用する方法をも包含している。卒中は、運動力及び運動神経、感覚分別、視覚機能、言語、記憶又はその他の知的能力の混乱を結果としてもたらす可能性があることから、本発明は、これらのパラメータを評価する１つのモデルにおいてＦＧＦ−ＣＸの効能及び安全性を評価している。本発明に従うと、ＦＧＦ−ＣＸの投与は、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、外傷、脊髄損傷、重金属又は毒素中毒、及び神経変性疾患（例えばアルツハイマー、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化性、ハンチントン病）を含む（ただしこれらに限定されるわけではない）病的条件の治療において有利なものとなる。
【００２８】
ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、及びかかるポリペプチドを作る方法が、共に全体が本明細書に参考により援用されている米国特許出願第０９／４９４，５８５号明細書及び同第１０／１７４，３９４号明細書の中で記述されている。ＦＧＦ−ＣＸは「ＣＧ５３１８５」、「ＣＧ５３１３５−０５」及び「ＦＧＦ−２０」といった語と互換的に使用される。
【００２９】
該発明中に含まれているのは、ＦＧＦ−ＣＸ核酸、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド又はその一部分をコードする単離された核酸、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、これらの核酸を含有するベクター、ＦＧＦ−ＣＸ核酸で形質転換された宿主細胞、抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体及び医薬組成物である。同様に開示されているのは、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを作る方法ならびにこれらの化合物を用いて症状をスクリーニング、診断及び治療する方法、及びＦＧＦ−ＣＸポリペプチド活性を変調させる化合物のスクリーニング方法である。表Ａは、ＦＧＦ−ＣＸ核酸及びそのコード化されたポリペプチドの要約を提供している。
【００３０】
【表１】
【００３１】
本書で使用されている該「対象」という用語は、動物好ましくは非霊長類（例えば乳牛、ブタ、馬、ネコ、イヌ、ラット及びマウス）及び霊長類（例えばカニクイザルなどのサル、チンパンジー及びヒト）を含む哺乳動物、より好ましくはヒトを意味する。いくつかの実施形態においては、該対象は、関節疾患（例えば骨関節炎、その他の骨関節炎関連障害）、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、外傷、脊髄損傷、重金属又は毒素中毒、及び神経変性疾患（非限定的な例はアルツハイマー、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化性、ハンチントン病）を患う哺乳動物、好ましくはヒトである。もう１つの実施形態においては、該対象は、関節疾患、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、外傷、脊髄損傷、重金属又は毒素中毒、又は神経変性疾患のリスクのある哺乳動物、好ましくはヒトである。一実施形態においては、該対象は、関節疾患を患うものの卒中又は神経変性疾患は患っていない哺乳動物、好ましくはヒトである。該「対象」という用語は、本発明では「患者」と互換的に用いられる。
【００３２】
本書で使用されるように、該「治療上有効な量」という用語は、疾病（例えば関節疾患、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、外傷、脊髄損傷、重金属又は毒素中毒、又は神経変性疾患）の重症度を低減させ、疾病の持続時間を削減し、疾病の進行を防ぎ、疾病の退行をひき起こし、疾病に付随する１つ以上の症候を改善するか又はもう１つの療法の治療効果を増強又は改善させるのに充分な療法（例えばＦＧＦ−ＣＸポリペプチド）の量を意味する。
【００３３】
ＦＧＦ−ＣＸを含む組成物は、疾病（例えば関節疾患、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、外傷、脊髄損傷、重金属又は毒素中毒、又は神経変性疾患）又はその１つ以上の症候を防止、治療又は改善するため１つ以上のその他の療法と組合せて投与することもできる。好ましい実施形態においては、ＦＧＦ−ＣＸを含む組成物は、関節疾患、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、外傷、脊髄損傷、重金属又は毒素中毒、又は神経変性疾患といった疾病又はその１つ以上の症候を防止、治療又は改善する上で使用されるものとして知られている１つ以上のその他の療法と組合わせて投与される。
【００３４】
一実施形態においては、組合せ療法の間、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド及び／又はもう１つの療法は、例え当該技術分野において既知の方法により決定される通り、単独で投与された場合検出可能な治療上の利点を示さない量といった最適より少ない量で投与される。かかる方法においては、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドともう１つの療法の同時投与は結果として治療の有効性の全体的改善をもたらす。
【００３５】
一実施形態においては、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド及び１つ以上のその他の療法は、患者の同一診察時に投与される。もう１つの実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは１つ以上のその他の療法の投与に先立って投与される。さらにもう１つの態様では、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは１つ以上のその他の療法の投与の後に投与される。特定の一実施形態においては、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド及び１つ以上のその他の療法は、１人の対象に対し周期的に投与される。周期療法には、一定の期間のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの投与とそれに続く一定期間の１つ以上のその他の療法の投与及びこの逐次的投与の反復が関与する。周期療法は、１つ以上の療法に対する耐性の発生を低減させ、療法の１つに付随する副作用を回避又は低減させかつ／又は治療の効能を改善することができる。
【００３６】
該発明の組成物の毒性的及び治療的効能（例えばＦＧＦ−ＣＸポリペプチド）は、例えばＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効である用量）を判定するための細胞培養又は実験動物内における、標準的な薬学的手順により判定可能である。毒性及び治療効果の間の該用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表わすことができる。大きい治療指数を示す組成物が好ましい。毒性副作用を示す組成物も使用し得るが、感染を受けていない細胞に対する潜在的損傷を最小限におさえかくして副作用を低減させるため、感染を受けた組織の部位にかかる組成物をターゲティングする送達系を設計するよう配慮すべきである。
【００３７】
１つの実施形態においては、細胞培養検定及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための一投薬量範囲を処方する上で使用することができる。複合体の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんど又は全く無いＥＤ５０を含む一範囲の循環濃度内にある。該投薬量は、利用される剤形、利用される投与経路、疾病の重症度、対象の年令及び体重及び医療専門家（例えば医師）が通常考慮に入れるその他の因子に応じて、この範囲内で変動し得る。該発明の方法において使用されるあらゆる組成物について、最初に細胞培養検定から、治療上有効な用量を推定することができる。細胞培養中で判定される通りのＩＣ５０（すなわち症状の半最大阻害を達成するテスト化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデル内で１用量を処方することができる。かかる情報は、ヒトの体内での有用な用量をより正確に判定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば高性能液体クロマトグラフィによって測定することができる。［ここに好ましい投薬量範囲を挿入する］。
【００３８】
化学療法剤、放射線療法及び生物剤／免疫療法剤例えばサイトカインといったような治療方法用の適切な及び推奨される投薬量、処方及び投与経路は当該技術分野において既知であり、医師用卓上参考書（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）（第５８版、２００４年）といったような文献において記述されている。
【００３９】
さまざまな送達系が知られており、該発明の組成物を投与するために使用することができる。かかる送達系には、リポゾーム、マイクロ粒子、マイクロカプセル内への封入、組換え型細胞による発現、レセプタを媒介としたエンドサイトーシス、レトロウイルス又はその他のベクターなどの一部としての該発明の核酸の構築などが含まれるがこれらに限定されるわけではない。導入方法には、皮内、筋内、腹腔内、髄腔内、脳室内、硬膜外、静脈内、皮下、鼻腔内、腫瘍内、経皮、直腸内及び経口投与が含まれるがこれらに限定されるわけではない。該発明の組成物は、例えば輸液又はボーラス注入法、上皮層又は皮膚粘膜層（例えば口腔粘膜、膣粘膜、直腸及び腸粘膜など）を通した吸収などのあらゆる便利な経路によって投与され得、その他の生物学的に活性な作用物質と合わせて投与可能である。投与は全身的でも局所的でもあり得る。
【００４０】
いくつかの実施形態においては、治療を必要とする部域に局所的に該発明の医薬組成物を投与することが望ましい可能性がある。これは、例えば外科手術中の局所的輸液によってか又は例えば外科手術後の創傷包帯剤と併用した局所施用によって、又は注入によって、又はカテーテル、坐薬又はインプラント（このインプラントは、シラスチック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜といった膜又は繊維を含む多孔質、非多孔質又はゼラチン様材料でできている）を用いて達成可能である。一実施形態においては、投与は、放射線、化学療法又は化学兵器といったような傷害に最も敏感な急速に増殖する組織の部位（又は元の部位）での直接的注射によるものであり得る。
【００４１】
該発明の組成物が予防又は治療剤をコードする核酸であるいくつかの実施形態において、核酸は、適切な核酸発現ベクターの一部として核酸を構築しそれが細胞内のものとなるような形で例えばレトロウイルスベクタの使用によってか又は直接注入によってか又は微粒子ボンバード（例えば遺伝子銃）の使用によってか又は脂質又は細胞表面レセプタ又はトランスフェクション剤でのコーティングによってそれを投与するか、又は核内などに進入するものとして知られているホメオボックス様のペプチドに対する連結においてそれを投与することによって、そのコードされたタンパク質（例えばＦＧＦ−ＣＸポリペプチド）の発現を促進するべくインビボで投与することができる。代替的には、本発明の核酸は、相同的組換えにより、細胞内に導入され発現のため宿主細胞ＤＮＡ内に取込まれ得る。
【００４２】
該発明の組成物には、単位剤形の調製のために使用可能である医薬組成物の製造において有用なバルク製剤組成物が含まれる。好ましい実施形態においては、該発明の組成物は医薬組成物である。かかる組成物は、該発明の１つ以上の組成物（例えばＦＧＦ−ＣＸポリペプチド）を予防上又は治療上有効な量と、薬学的に受容可能な担体を含んでいる。好ましくは、該医薬組成物は、対象に対する投与経路にとって適切であるように処方される。
【００４３】
一実施形態においては、「薬学的に受容可能な」という語は、動物そしてより詳細にはヒトの体内で使用するため連邦又は州政府の管理機関により承認されているか又は、米国薬局方又はその他の一般的に認識された薬局方に列挙されていることを意味する。「担体」という語は、予防又は治療用作用物質と共に投与される希釈剤、アシュバント（例えばフロインドアシュバンド（完全及び不完全）、賦形剤又はビヒクルを意味する。かかる薬学的担体は、水又は油といった無菌液体（例えば、石油、動物、植物又は合成由来の油例えばピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）又は希釈剤、芳香剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁剤、結合剤、錠剤崩壊剤又はカプセル封入材料としても作用しうる１つ以上の物質といったような固体担体であり得る。医薬組成物が静脈内投与される場合には、水が好ましい担体である。食塩溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液も同様に、特に注射剤のための液体担体としても利用可能である。適切な薬学賦形剤としては、でんぷん、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール又はその組合せが含まれるがこれらに限定されるわけではない。該組成物は、望まれる場合、少量の湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝剤をも含有し得る。
【００４４】
本発明の組成物は、液状シロップ、錠剤、カプセル、ジェルカプセル、ソフトジェル、ピル、粉剤、浣腸剤、持続放出製剤などを含む（ただしこれらに限定されるわけではない）数多くの考えられる剤形のいずれかの形に処方され得る。本発明の組成物は同様に、水性、非水性又は混合培地中の懸濁液としても処方可能である。水性懸濁液はさらに、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランなどを含む懸濁液の粘度を増大させる物質をさらに含有し得る。懸濁液は同様に安定化剤も含有し得る。組成物は同様に、トリグリセリドといった従来の結合剤及び担体と共に坐薬として処方することもできる。経口処方は、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどといった標準的な担体を含み得る。
【００４５】
いくつかの実施形態においては、本発明の組成物は、発泡体として処方され使用されてよい。薬学的発泡体には、例えばエマルジョン、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリー及びリポゾームといったような（ただしこれらに限定されるわけではない）処方が含まれる。性質的に基本的に類似しているものの、これらの処方は、最終生成物の成分及びコンシステンシーという点で異なっている。かかる組成物及び製剤の調製は、薬学及び処方技術の当業者にとっては一般に既知であり、本発明の組成物の処方に適用可能である。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路と相容性のあるものとなるように処方されている。特定の実施形態においては、該組成物は、ヒトへの静脈内、皮下、筋内、経口、鼻腔内、腫瘍内又は局所投与に適合された医薬組成物として、規定通りの手順に従って処方される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、該組成物は同様に、注入部位における痛みを和げるためリドカインといったような局所麻酔剤及び可溶化剤も含み得る。
【００４７】
該発明の組成物を局所施用する場合には、該組成物を経皮性パッチ、軟こう、ローション、クリーム、ジェル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体及び粉末の形で処方することができる。従来の薬学的担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが必要であるか又は望ましい可能性がある。コーティングされたコンドーム、手袋なども有用であり得る。好ましい局所的処方には、該発明のポリペプチドが、脂質、リポゾーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤及び界面活性剤といった（ただしこれらに限定されるわけではない）局所送達剤との混和状態にある処方が含まれる。好ましい脂質及びリポゾームには、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、マイナス（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）、及び陽イオン（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。該発明のポリペプチドはリポゾーム内にカプセル封入されていてもよいし、或いは又リポゾーム特にカチオン性リポゾームに対する複合体を形成してもよい。代替的には、ポリペプチドは脂質特にカチオン脂質に対し複合体形成され得る。好ましい脂肪酸及びエステルには、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノレイン酸、リノレン酸、ジカプラート、トリカプラート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプラート、ｌ−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はＣ１−１０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリスタートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、又はその薬学的に受容可能な塩が含まれるがこれらに限定されるわけではない。非噴霧局所用剤形については、局所施用と相容性ある１つ以上の賦形剤又は担体を含み、好ましくは水より高い動的粘度を有する、粘性乃至半固体又は固体形態が標準的に利用される。その他の適切な局所的剤形としては、好ましくは固体又は液体不活性担体と組合せた形の活性成分が、加圧揮発性物質（例えばフレオンといったような気体高圧ガス）との混合物中又はスクイズボトル中に包装されている噴霧可能なエアゾル調製物が含まれる。所望の場合には、医薬組成物及び剤形に付して、保湿剤又は湿潤剤も添加することができる。かかる添加成分の例は、当該技術分野において周知である。
【００４８】
該発明の方法に１つの組成物の鼻腔内投与が含まれている場合、該組成物は、エアゾル形態、スプレー、霧又は液滴の形で処方可能である。特に、本発明に従った使用のための予防又は治療剤は、適切な高圧ガス（例えばジクロロジフルオロロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又はその他の適切な気体）を使用して、加圧パック又はネブライザからエアゾルスプレーの体裁で適切に送達され得る。加圧エアゾルの場合、投薬量単位は、計算された量を送達するためのバルブを具備することによって決定可能である。ラクトース又はでんぷんといったような適切な粉末と該化合物の粉末混合物を収納する、吸入器又は吸気器内で使用するための（例えばゼラチンで構成された）カプセル及びカートリッジを処方することが可能である。
【００４９】
該発明の方法が経口投与を含む場合、組成物は、粉末、顆粒、微粒子、ナノ粒子、懸濁液又は水溶液又は非水性媒質中溶液、カプセル、ジェルカプセル、小袋、錠剤又はミニ錠剤の形で処方可能である。増粘剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましいかもしれない。錠剤又はカプセルは、結合剤（例えば、アルファー化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、又はヒドキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、又はリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、又はシリカ）；錠剤分割物質（例えば、ジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えば、ラウリルリン酸ナトリウム）といった薬学的に受容可能な賦形剤と共に従来の手段により調製可能である。錠剤は、当該技術分野において周知の方法によりコーティングされ得る。経口投与のための液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、又は水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチン、又はアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、又は精留植物油）；及び防腐剤（例えば、メチル又はプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアート又はソルビン酸）といったような薬学的に受容可能添加剤と共に従来の手段によって調製され得る。該調製物は同様に、緩衝塩、芳香剤、着色剤及び甘味料を適宜含有し得る。経口投与のための調製物は、予防用又は治療用作用物質の徐放、制御放出又は持続放出のために適切に処方可能である。
【００５０】
一実施形態においては、本発明の組成物は、例えば界面活性剤及びキレート剤といった１つ以上の浸透エンハンサと併用して経口投与される。好ましい界面活性剤としては、脂肪酸及びそのエステル又は塩、胆汁酸及びその塩が含まれるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態においては、浸透エンハンサの組合せ、例えば胆汁酸／塩と組合せた形の脂肪酸／塩が用いられる。特定の一実施形態においては、ラウリン酸、カプリン酸のナトリウム塩が、ＵＤＣＡと組合わせて用いられる。さらなる浸透エンハンサとしては、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが含まれるがこれらに限定されるわけではない。該発明の組成物は、噴霧された乾燥粒子を含む（ただしこれに限定されるわけではない）顆粒形態で経口投与されてもよいし、又は、複合体化して微粒子又はナノ粒子を形成することもできる。該発明のペプチド（例えばＦＧＦ−ＣＸポリペプチド）と複合体化するのに用いることのできる複合体化剤としては、ポリ−アミノ酸、ポリイミン、ポリアクリラート、ポリアルキルアクリラート、ポリオキシエタン（ｐｏｌｙｏｘｅｔｈａｎｅｓ）、ポリアルキルシアノアクリラート、カチオン化ゼラチン、アルブミン、アクリラート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアルキルシアノアクリラート、ＤＥＡＥ−誘導体化ポリイミン、ポルラン、セルロース、及びデンプンが含まれるがこれらに限定されるわけではない。特に好ましい複合体化剤としては、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノ−メチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリラート）、ポリ（エチルシアノアクリラート）、ポリ（ブチルシアノアクリラート）、ポリ（イソブチルシアノアクリラート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリラート）、ＤＥＡＥ−メタクリラート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリラート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミン及びＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリラート、ポリヘキシルアクリラート、ポリ（ＤＬ−乳酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギナート、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００５１】
該発明の方法は、エアゾル化剤と共に処方された組成物の、例えば吸入器又はネブライザを用いた肺投与を含み得る。
【００５２】
該発明の方法は、（例えばボーラス注入又は持続注入といった）注入による非経口投与用に処方された組成物の投与を含み得る。注入用処方は、付加された防腐剤を伴う単位剤形（例えばアンプル又は多重用量容器）の体裁をとり得る。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンといった形態をとり得、又懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤といった処方剤を含有し得る。代替的には、活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば無菌で発熱物質を含まない水）で構成するように粉末形態をしていてよい。
【００５３】
好ましい実施形態においては、該組成物は、ヒトに対する静脈投与のために適合された医薬組成物として規定通りの手順に従って処方される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、該組成物は同様に、注入の部位における痛みを和げるためリグノカインといったような局所麻酔剤及び可溶化剤も含み得る。一般に、成分は、例えば活性作用物質の数量を示すアンプル又は小袋といった密封した容器に入った凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として単位剤形の形で混合された状態で又は別々に供給される。組成物を輸液により投与する場合には、それを無菌の薬学グレードの水又は食塩水の入った輸液びんで送り出すことができる。組成物を注射により投与する場合、投与に先立って成分を混合できるように注射用滅菌水又は食塩水のアンプルが提供され得る。
【００５４】
該発明の組成物は、中性形態又は塩形態として処方可能である。薬学的に受容可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されたものといった遊離アミノ酸で形成されたもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されたものといったような遊離カルボキシル基で形成されたものが含まれるがこれらに限定されるわけではない。薬学的に受容可能な塩の非限定的な例としては、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重酒石酸塩、臭化物、酢酸カルシウム、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストラート、エシラート、フマル酸塩、グルカプタート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グルコリルアルサニル酸塩、ヘキシルレソルシナート、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩化水素酸塩、ヒドロキシナフトアート、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩メシル酸塩、臭化メチル、窒化メチル、硫化メチル、ムカート、ナプシル酸、硝酸塩、パモアート（エンボナート)、パントテン酸塩、ホスファテルジホスファート、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トリエチオジド、ベンザチン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、プロカイン、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛がある。
【００５５】
上述の処方に加えて、該組成物は同様に、デポー製剤としても処方可能である。かかる長時間作用性処方は、移植（例えば皮下又は筋内）又は筋内注射により投与可能である。かくして例えば、該組成物を適切な重合体又は疎水性材料（例えば受容可能な油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂と共に、又は例えばやや溶けにくい塩といったようなやや溶けにくい誘導体として処方することができる。リポゾーム及びエマルジョンは、親水性薬物のための送達ビヒクル又は担体の周知の例である。
【００５６】
１つの実施形態においては、該発明の組成物（例えばＦＧＦ−ＣＸ）の成分は、かかる組成物のレシピエントと同じ種の起源又は種の反応性である対象から誘導される。
【００５７】
該発明は同様に、該発明の治療計画を実施するためのキットをも提供する。かかるキットは、薬学的に受容可能な形態で予防上又は治療上有効な量の該発明の組成物（例えばＦＧＦ−ＣＸポリペプチド）を１つ以上の容器内に収納している。該発明のキットの小びん中に入った組成物は、例えば無菌生理食塩水、デキストロース溶液又は緩衝溶液又はその他の薬学的に受容可能な無菌流体と組合せた状態の薬学的に受容可能な溶液の形をとり得る。代替的には、該組成物を凍結乾燥又は乾燥させることができる。この場合、キットは、任意にはさらに、注入目的の溶液を形成するため組成物を再構成するべく、好ましくは無菌である、薬学的に受容可能な溶液（例えば生理食塩水、デキストロース溶液等）を容器内に含んでいる。
【００５８】
もう１つの実施形態では、該発明のキットはさらに、処方を注入するための好ましくは無菌形態で包装された針又は注射器及び／又は包装されたアルコールパッドを含む。臨床医又は患者による該発明の処方の投与のための使用説明書が任意に含まれている。
【００５９】
いくつかの実施形態においては、本発明は、単回投与に充分な該発明の組成物（例えばＦＧＦ−ＣＸポリペプチド）の用量を含む薬学的処方又は組成物を各々含む複数の容器を含むキットを提供する。
【００６０】
あらゆる医薬品についてそうであるように、包装材料及び容器は、保管及び出荷中の製品の安定性を保護するように設計されている。１つの実施形態においては、該発明の組成は、レシチン、タウロコール酸及びコレステロールを含む（ただしこれらに限定されるわけではない）生体適合性のある洗浄剤；又はガンマグロブリン及び血清アルブリンを含む（ただしこれらに限定されるわけではない）その他のタンパク質と共に容器内に保管されている。さらに、該発明の製品には、使用説明書、又は医師、技師又は患者に対し問題の疾病又は障害をいかにして適切に予防又は治療するかについて助言を与えるその他の情報材料が含まれている。
【００６１】
本発明について、さらに、以下の実施例を用いて例示する。
【実施例】
【００６２】
５．１． 実施例１：配列分析
各々のＦＧＦ−ＣＸについての配列の関連性及びドメイン分析の詳細が、表１Ａに提示されている。ＦＧＦ−ＣＸ１クローンが分析され、ヌクレオチド及びコードされたポリペプチド配列が表１Ａに示されている。
【００６３】
【表２】
【００６４】
上述のタンパク質配列のクラスタルダブル（ＣｌｕｓｔａｌＷ）比較が、表１Ｂに示されている以下の配列アラインメントを生成する。
【００６５】
【表３】
【００６６】
ＦＧＦ−ＣＸ１ａタンパク質のさらなる分析が、表１Ｃに示された以下の特性を生成した。
【００６７】
【表４】
【００６８】
特許及び特許広報で公示された配列を含む専有のデータベースであるジンシーク（Ｇｅｎｅｓｅｑ）データベースに対するＦＧＦ−ＣＸ１ａタンパク質の探索は、表１Ｄに示された複数の相同性タンパク質を生成した。
【００６９】
【表５】
【００７０】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ探索において、ＦＧＦ−ＣＸ１ａタンパク質は、表１Ｅ内のＢＬＡＳＴＰデータ中に示されたタンパク質に対する相同性をもつことが発見された。
【００７１】
【表６】
【００７２】
ＰＦａｍ分析は、ＦＧＦ−ＣＸ１ａタンパク質が表１Ｆに示されたドメインを含むことを予測している。
【００７３】
【表７】
【００７４】
５．２． 実施例２：ＣＧ５３１３５−０５（ＦＧＦ−２０）のタンパク質分解による分割産物
ＣＧ５３１３５−０５の液体クロマトグラフィ、質量分析法及びＮ末端配列決定の結果、増殖検定において高い活性をもつ変異体がもたらされた。かくして、このセクションで詳述されるこれらの変異体は、ＣＧ５３１３５−０５と同じ有用性をもつものと期待されている。
【００７５】
ＣＧ５３１３５−０５の液体クロマトグラフィ（ＬＣ）及び質量分析法（ＭＳ）
精製されたＣＧ５３１３５−０５を、アセトニトリル、水及びトリフルオロ酢酸を含む移動相中の標準ＨＰＬＣシステム（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ））を用いて、フェニル−ヘキシルカラム（ルナ（Ｌｕｎａ）５ｍｍ、２５０ｍｍ×３ｍｍ、フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ））上に注入した。結果としての分析は、ＣＧ５３１３５−０５（図１）に関連する１つの大ピーク（＃３）と３つの小ピーク（＃１、２、４及び５）を示す、検出可能なレベルの微小不均一性を明らかにした。これらの種を特徴づけするため、自動化された画分収集装置（アジレント１１００）を用いて、画分を収集し、液体クロマトグラフィエレクトロスプレーイオン化イオントラップ質量分光法（ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ）、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）及びＮ末端アミノ酸配列決定を用いて画分を特徴づけした。
【００７６】
ピーク０はタンパク質ではなく、製品関連のものではなく、又、残留プロセス不純物でもない（すなわち、ＤＮＡ、内毒素、カナマイシン又はＩＰＴＧではない）。ＣＧ５３１３５−０５に関連する種（ピーク１、２、３及び４）は、３６％のアセトニトリル、６３％の水及び０．１％のトリフルオロ酢酸の移動相を溶出した。類似の画分を次にプールし、４℃の遠心機内でアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）１０，０００ダルトンカットオフフィルター（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ））を用いて試料を濃縮した。試料を２００ｍＭのアルギニン、４０ｍＭの酢酸ナトリウム及び３％のグリセロール中で１６倍に希釈し、次に約５００μｌの体積になるまで濃縮した。プールした画分の濃度を、アミノ酸分析を用いて決定した。
【００７７】
トリプシンを用いて４つのＣＧ５３１３５−０５関連種（ピーク１、２、３及び４）の全てをタンパク質分解により消化し、質量分析検出を伴う液体クロマトグラフィを用いてペプチドを分析した。究極ナノフロークロマトグラフィシステム（ＬＣパッキングス（ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ）、オランダアムステルダム（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））とインタフェースされたＸＰ ＤＥＣＡ ナノスプレー／イオントラップ器具（サーモフィンガン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）、カリフォルニア州サンノゼ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ））を用いて質量分析を実施した。自動化ＭＳ−ＭＳ／ＭＳスイッチングを用いてエクスカリバー（Ｘｃａｌｉｂｕｒ）ソフトウエア（サーモフィンガン）を介してデータを収集した。インスツルメント・メソッド（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄ）ファイル内で、４００〜１４００ｍ／ｚの間の全ＭＳ走査とそれにつづく先行ＭＳ走査からの最上位３つのイオンの４００〜２０００ｍ／ｚの間の全ＭＳ／ＭＳ走査を獲得するようにＸＰＤＥＣＡをセットした。ターボシークエスト（ＴｕｒｂｏＳｅｑｕｅｓｔ）（サーモフィンガン）を用いてデータを処理した。ＭＡＳＣＯＴ（マトリックスサイエンシーズ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、英国マンチェスター（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ））を用いてデータベース探索とタンパク質の同定を実施した。ＭＡＳＣＯＴは、ペプチドの分子質量、ＭＳ／ＭＳ配列情報、質量精度及び検出されたペプチド数に基づいて、同定されたタンパク質についての確率ベースのＭＯＷＳＥ評点及びカバレージ百分率を報告する。表２は、ＣＧ５３１３５−０５関連種についてのピーク番号、ＭＡＳＣＯＴにより提供される信頼度評点及びＭＳ／ＭＳスペクトルから得たカバレージ百分率を含んでいる。
【００７８】
【表８】
ＮＡ＝ データ入手不可
【００７９】
ＣＧ５３１３５−０５関連種の同一性を決定するため、収集された画分を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＮ末端配列決定によって分析した。精製したＣＧ５３１３５−０５のＮ末端アミノ酸を定性的に決定した。ＣＧ５３１３５−０５タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解像し、ポリフッ化ビニリデン膜に電気泳動によって移送した。膜からクマシー染色した約２３ｋＤａの主要バンドを切除し、自動エドマン（Ｅｄｍａｎ）シーケンサ（プロサイズ（Ｐｒｏｃｉｓｅ）、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスター市（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ））により分析した。表３は、各々の種について得られた分子量及びＮ末端配列決定（ここでＮ＝全長ＣＧ５３１３５）により決定された変異体を提示している。
【００８０】
【表９】
ＮＡ＝データ入手不可。タンパク質でなく製品関連でもない。
【００８１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＮ末端配列決定により決定された分子量は、４つの種を同定することができる。ピーク１については、Ｎ末端配列決定を介して４つの異なる種が検出され、そのうちの２つが同じくＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって検出された。これらの結果は同様に、ＬＣ／ＭＳを用いて得られたカバレージとも一致している。Ｎ末端配列決定により誘導された各々の種のポリペプチド配列は、表４に示されている。
【００８２】
【表１０】
【００８３】
【表１１】
多重アラインメント
【００８４】
全アミノ酸分析
ＣＧ５３１３５−０５のアミノ酸組成物を決定した。内部標準として２ｎｍｏｌのノルロイシンを含有する０．２％のフェノール、１００ｍＬの６ＮＨＣｌ中で１１５℃で１６時間ＣＧ５３１３５−０５の試料を加水分解した。試料を高速Ｖａｃ濃縮器（Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）内で乾燥させ、内部標準として２ｎｍｏｌのホモセリンを含有する試料緩衝液１００ｍＬ中に溶解させた。各試料中のアミノ酸を、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）７３００型イオン交換計器上で分離した。ＣＧ５３１３５−０５のアミノ酸組成物は、理論上のアミノ酸組成物と一貫性を有していた。
【００８５】
ＵＶ吸光度を介した濃度の推定（ブラッドフォード方法を用いたタンパク質の推定）の中で使用される消光係数を導出するために、実験用アミノ酸組成物を使用した。λｍａｘにおける消光散係数は、０．９７ｍＬ／ｍｇ・ｃｍである。
【００８６】
【表１２】
Ａ 処方中の余剰のａｒｇのため未判定。
Ｂ 分析中に酸加水分解においてｃｙｓが破壊されることから未判定。
Ｃ 分析中に酸加水分解においてｔｒｐが破壊されることから未判定。
Ｄ 酸加水分解中ａｓｎはａｓｐに、ｇｌｎはｇｌｕ酸に転換されることになる。従って、ａｓｘはａｓｎとａｓｐの和を表わし、一方ｇｌｘはｇｌｎとｇｌｕの和を表わす。
【００８７】
ペプチドマッピング
精製済みＣＧ５３１３５−０５（２５ｍｇ）を変性させ、５０℃で尿素とジチオトレイトール中で還元させ、ヨードアセタートでアルキル化させた。尿素の濃度を低下させた後、試料を２０℃で４０時間トリプシンで処理した。結果として得たペプチドフラグメントを、（トリフルオロアセテート中のアセトニトリル勾配を伴うＣ−１８カラムを用いることによって）ＲＰ−ＨＰＬＣにより分離してペプチドマップ（図２Ａ及び２Ｂ）を得た。図２Ａ中のクロマトグラムはトリプシンでのＣＧ５３１３５−０５の消化から予想された２０個のペプチドと一貫性をもつものであり、図２Ｂ中のクロマトグラムは、ＣＧ５３１３５−０５内の単一トリプトファン残基について予想された通りの単一のピークを明らかにしている。
【００８８】
生物学的検定
ＬＣ及びＭＳにより同定された４つのピークから収集されたＣＧ５３１３５−０５関連種の生物活性を、さまざまな用量の単離されたＣＧ５３１３５−０５関連種での血清欠乏培養ＮＩＨ３Ｔ３マウス胚線維芽細胞の処理及びＤＮＡ合成中のブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取込みの測定によって、測定した。この検定のためには、１０％のウシ胎児血清で補足されたダルベッコの修正イーグル培地の中で細胞を培養した。１０％ＣＯ２／空気中で３７℃で集密性に至るまで９６ウェル平板内で細胞を成長させ、次に２４〜７２時間、ダルベッコ修正イーグル培地内で欠乏させた。ＣＧ５３１３５−０５関連種を添加し、３７℃で１８時間、１０％ＣＯ２／空気中でインキュベートした。ＢｒｄＵ（１０ｍＭの最終濃度）を添加し、１０％ＣＯ２／空気中で２時間３７℃で細胞と共にインキュベートさせた。ＢｒｄＵの取込みを、メーカーの仕様書（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ））に従って、酵素免疫吸着法により測定した。
【００８９】
ピーク４は、不充分な材料しか収集されなかったため（ピーク４はＣＧ５３１３５−０５についての合計ピーク面積の３％未満である）、この検定には内含されなかった。ＣＧ５３１３５−０５及び３つの残りの画分（すなわちピーク１、２及び３）全てから収集した材料が、ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞内で用量依存的にＤＮＡ合成を誘発した（表７）。ＰＩ２００は、背景の２倍でのＢｒｄＵの取込みを結果としてもたらしたタンパク質の濃度として定義された。３つの測定可能なピーク全てから回収したＣＧ５３１３５−０５やＣＧ５３１３５−０５関連種は、０．７〜１１ｎｇ／ｍＬのＰＩ２００で類似の生物活性を実証した（表９）。
【００９０】
【表１３】
【００９１】
５．３． 実施例３：ＣＧ５３１３５のレセプタ結合特異性（研究Ｌ−１１６．０１）
ＦＧＦファミリー成員は、細胞表面免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン含有チロシンキナーゼＦＧＦレセプタ（ＦＧＦＲ）との高親和性相互作用を介して、細胞内部でシグナルを変換する。４つの全く異なるヒト遺伝子がＦＧＦＲをコードする（パワーズ（Ｐｏｗｅｒｓ）ら、エンドクリン関連癌（Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｌａｔ Ｃａｎｃｅｒ）２０００、７：１６５−９７；クリント（Ｋｌｉｎｔ）及びクリーソン・ウェルシュ（Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ）、生命科学の最先端（Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ）１９９９、４：Ｄ１６５−７７；シュー（Ｘｕ）ら、細胞及び組織研究（Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ）１９９９、２９６：３３−４３）。キナーゼドメインの欠如した関連する第５のヒト配列が最近になって同定され、ＦＧＦＲ−５と命名された（キム（Ｋｉｍ）ら、生物化学と生物物理学（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ）２００１、１５１８：１５２−６）。これらのレセプタは各々このファミリーの複数の異なる成員を結合させることができる（キムら、生物化学と生物物理学２００１、１５１８：１５２−６；オルニス（Ｏｒｎｉｔｚ）ら、生物化学ジャーナル（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ）１９９６、２７１：１５２９２−７）。ＦＧＦは同様に、低い親和性しかもたないにもかかわらず、大部分の細胞表面及び細胞外マトリクス（ＥＣＭ）上に存在するヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合する。ＦＧＦ及びＨＳＰＧの間の相互作用は、ＦＧＦ／ＦＧＦＲ相互作用を安定化させ、ＦＧＦを封鎖しそれを分離から保護するのに役立つ（パワーズら、エンドクリン関連癌２０００、７：１６５−９７；セベニ（Ｓｚｅｂｅｎｙｉ）及びファロン（Ｆａｌｌｏｎ）、国際細胞学評論（Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｃｙｔｏｌ）１９９９、１８５：４５−１０６）。レセプタトランスリン酸化を導くキナーゼドメインの活性化のためには、リガンド結合時点のＦＧＦレセプタ単量体の２量体化が必要条件であると報告されている。４つのＦＧＦレセプタの最大の発現パターンを示すＦＧＦレセプタ−１（ＦＧＦＲ−１）は、少なくとも７つのチロシンリン酸化部位を含んでいる。これらのリン酸化部位に対して異なる親和力で結合することにより、数多くのシグナル変換分子が影響を受ける。
【００９２】
ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２及びＦＧＦＲ−３は各々ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４及びＦＧＦ−８を認識する。さらに、ＦＧＦＲ−１とＦＧＦＲ−２はＦＧＦ−３、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−１０及びＦＧＦ−１７に結合する（パワーズら、エンドクリン関連癌２０００、７：１６５−９７）。さまざまなＦＧＦリガンドの結合は各々のレセプタスプライス形態と共に変動し、かくして、限定された数のレセプタコーディング遺伝子を通して広いレパートリのＦＧＦ媒介されたシグナリング事象を可能にする。組織特異的な交互のスプライシングにより、単一のＦＧＦＲ遺伝子を発現する細胞が、異なるリガンド特異性及び機能を示し得る全く異なるレセプタイソ型を生成することによってその生物学的応答を著しく多様化させることが可能となる。ＦＧＦＲ−４はＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−８及びＦＧＦ−９に結合するもののＦＧＦ−３、ＦＧＦ−５又はＦＧＦ−７に結合しない。ＦＧＦ−７つまりケラチノサイト成長因子−１（ＫＧＦ−１）は、ＦＧＦＲ−２によってのみ認識され、一方ＦＧＦ−９はＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３及びＦＧＦＲ−４に結合する。ＦＧＦ１１〜ＦＧＦ１９のレセプタ特異性は充分に理解されていない（パワーズら、エンドクリン関連癌２０００、７：１６５−９７；オルニス（Ｏｒｎｉｔｚ）ら、生物化学ジャーナル１９９６、２７１：１５２９２−７）。
【００９３】
主要な器官系由来の正常なヒト成人組織内の免疫組織学研究（ヒューズ（Ｈｕｇｈｅｓ）、組織化学及び細胞化学ジャーナル（Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ）１９９７、４５：１００５−１９）は、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２及びＦＧＦＲ−３が広く発現されることを示しており、これは、組織ホメオスタシスにおける重要な機能的役割を示唆している。組織特異的イソ型についてのタンパク質発現パターンはまだ判定されていない。ＦＧＦＲ−４は、その他の３つのレセプタの全てが主に発現されている組織である、肺、卵管、胎盤、睾丸、前立腺、甲状腺、副甲状腺及び交感神経節では著しく欠如しているより限定されたパターンを有している（ヒューズ、組織化学及び細胞化学ジャーナル１９９７、４５：１００５−１９）。
【００９４】
ＣＧ５３１３５のレセプタ結合特異性を判定するために、我々は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で産生された組換え型ＣＧ５３１３５−０１によるＮＩＨ３Ｔ３細胞内のＤＮＡ合成の誘発に対する可溶性ＦＧＦＲの効果を調査した。
【００９５】
材料と方法
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のタンパク質の精製：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の産生のためには、大腸菌発現宿主ＢＬ２１内にプラスミドｐＥＴＭＹ−ｈＦＧＦ２０Ｘを形質転換し（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））、タンパク質ＣＧ５３１３５発現の誘発をメーカーの指示事項に従って実施した。３７℃でＬＢ培地内においてｐＥＴＭＹｈＦＧＦ２０Ｘ／ＢＬ２１大腸菌の細菌を成長させた。０．６のＯＤで、最終的な感染多重度が５になるまでバクテリオファージラムダ（ＣＥ６）を添加した。３時間２７℃で、感染した培地をさらにインキュベートした。誘発の後、全細胞を収穫し、抗ＨｉｓＧｌｙ抗体（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ウェスタンブロット法によりタンパク質を分析した。低速遠心分離（４℃で１５分間ＧＳ−３回転子内で５０００ｒｐｍ）により細胞を収穫し、０．５ＭのＮａＣｌ及び１Ｍのアルギニンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁させ、ミクロフルイダイザに２回通して分断させた。細胞残屑を低速遠心分離により除去し、０．２ミクロンの低タンパク質結合膜を通したろ過により、可溶性タンパク質画分（上清）を清澄化させた。その後タンパク質試料を金属キレート化カラム（硫酸ニッケルが予め充填されているもの）上に投入した。ニッケルカラムをＰＢＳ／０．５ＭＮａＣｌ＋１ＭのＬ−アルギニンで洗浄し、結合したタンパク質をイミダゾールの線形勾配（０−０．５Ｍ）で溶出させた。ＣＧ５３１３５（１００−１５０ｍＭイミダゾール）を含有する画分をプールし、１ＭのＬ−アルギニンを含む１×１０６倍体積のＰＢＳｐＨ８．０に対して透析させた。タンパク質の試料を−８０℃で保管した。
【００９６】
レセプタ特異性：ＮＩＨ３Ｔ３細胞を９６ウェルの平板に約１００％の集密性に至るまで培養し、洗浄し、補足無しのＤＭＥＭ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補給し、２４時間インキュベートした。次に組換え型ＣＧ５３１３５−０１又は対照タンパク質を次に１８時間細胞に添加した。使用される対照タンパク質はａＦＧＦ（正の対照）及び血小板由来の成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦＢＢ）（負の対照）であった。ＣＧ５３１３５活性に対する可溶性ＦＧＦＲの効果を分析するために、組換え型ＣＧ５３１３５−０１、ａＦＧＦ、又はＰＤＧＦ−ＢＢ（それぞれ１０、５及び３ｎｇ／ｍＬの最終濃度）を可溶性レセプタ（０．２、１及び５μｇ／ｍＬの最終濃度）と混合し、血清欠乏ＮＩＨ３Ｔ３細胞への添加の前に３７℃で３０分間インキュベートした。因子濃度は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞中半値ＢｒｄＵ応答を生成するのに必要とされるリガンドの量を表わす。可溶性ＦＧＦＲは、以下のレセプタ形態（ＦＧＦＲ１β（ＩＩＩｃ）；ＦＧＦＲ２β（ＩＩＩｂ）；ＦＧＦＲ２α（ＩＩＩｂ）；ＦＧＦＲ２α（ＩＩＩｃ）；ＦＧＦＲ３α（ＩＩＩｃ）；ＦＧＦＲ４）のＦｃキメラであり、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ））から得られた。ＢｒｄＵ検定は、メーカーの仕様書（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、インディアナ州インディアナポリス)に従って、４時間のＢｒｄＵ取込み時間を用いて実施された。
【００９７】
結果と結論
ＣＧ５３１３５のレセプタ結合特異性を決定するために、我々は、大腸菌内で産生された組換え型ＣＧ５３１３５−０１によるＮＩＨ３Ｔ３細胞中でのＤＮＡ合成の誘発に対する可溶性ＦＧＦＲの効果について調査した。ＦＧＦＲ１β（ＩＩＩｃ）、ＦＧＦＲ２β（ＩＩＩｂ）、ＦＧＦＲ２α（ＩＩＩｂ）、ＦＧＦＲ２α（ＩＩＩｃ）、ＦＧＦＲ３α（ＩＩＩｃ）及びＦＧＦＲ４のための可溶性レセプタが利用された。我々は、これらのＦＧＦＲの各々の可溶性形態がＣＧ５３１３５の生物活性を特異的に阻害できるということを発見した（図３）。
【００９８】
可溶性ＦＧＦＲ２α（ＩＩＩｂ）、ＦＧＦＲ２β（ＩＩＩｂ）、ＦＧＦＲ２α（ＩＩＩｃ）及びＦＧＦＲ３α（ＩＩＩｃ）で完全又はほぼ完全な阻害が得られ、一方可溶性ＦＧＦＲ１β（ＩＩＩｃ）及びＦＧＦＲ４で部分阻害が達成された。可溶性レセプタ試薬のいずれもＰＤＧＦ−ＢＢによるＤＮＡ合成の誘発と干渉せず（図２）、かくしてそれらの特異性を実証した。分析中のＦＧＦＲの全てと相互作用するものとして知られる１つの因子であるａＦＧＦによるＤＮＡ合成の誘発を阻害するその能力を示すことにより、各々の可溶性レセプタ試薬の無欠性を実証した（図３）。
【００９９】
５．４． 実施例４：卒中の治療
３０匹の雄のスプラーグダウエルラットを、以下の表８の研究設計の中に示したとおりの治療グループに帰属た。
【０１００】
【表１４】
*投与用量及び体積は、３３０ｇの平均体重に基づくものである。
【０１０１】
実験手順
中大脳動脈（ＭＣＡ）外科手術及び槽内注入：外科手術に先立ち７日間動物を処理した。外科手術の前日及び手術直後にセファゾリンナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を投与した。外科手術の時点で、ラットを２：１のＮ２Ｏ：Ｏ２混合物中の２％ハロタンで麻酔した。体温は３７±０．５０℃に維持した。近位右側ＭＣＡを嗅索のすぐ近位から下大脳静脈まで電気凝固し、次に離断した。槽内注入のためには、上述の通りに動物を再度麻酔し、定位枠内に置いた。ラットに対しＣＧ５３１３５−０５又はビヒクル［４０ｍＭの酢酸塩、２００ｍＭマンニトール（ｐＨ５．３）］を、ＭＣＡから１日目（約２４時間）に１回と３日目（約７２時間）に１回、大槽内への皮内注射により与えた。動物にテスト品（２用量グループ）又はビヒクル処置を研究設計に従って与えた。
【０１０２】
臨床的観察事実／徴候
注射後直ちに１時間にわたり、（おりの回りの激しい動きと震えにより示される）発作、（大きな発声により示される）苦痛及び昏睡の徴候について、動物を観察した。毎日、死亡数及び頻死数についても動物を観察した。
【０１０３】
体重：動物を１日目、３日目、７日目、１４日目及び２１日目に計量した。
【０１０４】
四肢置き直し試験：四肢置き直し試験を全ての動物について、−１日目（術前）、１日目（注射直前）、３日目及びその後７日毎（７日目、１４日目、２１日目）行なった。
【０１０５】
前肢置き直し試験評価評点：前肢置き直し試験は、動物が、視覚、触覚及び自己受容刺激に応答してテーブル上面に肢を置くにつれて、各々の前肢内の感覚運動機能を測定する。前肢置き直し試験は、以下の評価及び評点から成り、ここで前肢置き直し試験についての組合せ合計評点は、０（機能障害無し）から１０（最大の機能障害）までの範囲を反映する。
視覚性置き直し（前方向、横方向）：０〜４
触覚性置き直し（背面、側面）：０〜４
自己受容的置き直し：０〜２
全前肢試験についての合計評点：０〜１０
【０１０６】
後肢置き直し試験評価評点：同様に、後肢置き直し試験は、動物が、触覚及び自己受容刺激に応答してテーブル上面に後肢を置くにつれて、後肢の感覚運動機能を測定する。後肢置き直し試験は、以下の評価及び評点から成り、ここで後肢置き直し試験についての組合せ合計評点は、０（機能障害無し）から６（最大の機能障害）までの範囲を反映する。
触覚性置き直し（背面、側面）：０〜４
自己受容的置き直し：０〜２
全後肢試験についての合計評点：０〜６
【０１０７】
ボディスイング試験：ボディスイング試験を、全ての動物について、−１日目（術前）、１日目（注射の直前）、３日目及びその後７日毎（７日目、１４日目、２１日目）に実施した。
【０１０８】
ボディスイング試験は、動物をテーブルの表面より約１インチ上に保持し右側又は左側に揺動するにつれての側方選好性を検査する。３０回の揺動を計数し、次に右への揺動の百分率に基づいて評点を計算する。（評点範囲＝約５０％の右方揺動（機能障害無し）−０％の右方揺動（最大の機能障害））。
【０１０９】
シリンダ試験：シリンダ試験を、−１日目（術前）及び術後７日目（７日目、１４日目、２１日目）に全ての動物について実施した。シリンダ試験は、前肢の自発運動活性を測定する。動物を狭いガラスシリンダ（１６．５×２５ｃｍ）の中に入れ、卒中手術の前日に５分間そしてその後毎週の間隔で５分間ビデオテープに録画する。その後ビデオテープを、１人の経験豊かなオブザーバにより独立して評定させ、最高５０回の自発運動を計数することになる（一日ラット一匹につき約５分）。自発運動には、立上がりを開始し、着地又はシリンダの壁に沿って側方に移動するため、又は立上がりの後床に着地するため各々の前肢により行なわれるものが含まれる。
【０１１０】
肉眼検査及び組織形態学：予定された終結日（３日目）において、動物を抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により安楽死させた。脳を肉眼で検査し取り出し、ホルマリン内でポストフィックスし、脱水し、パラフィン内に包埋した。ガラススライドに取りつけたマイクロトーム上で冠状断面（５ｍｍ）をカットし、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色することになる。７つのスライス（プレグマ（Ｂｒｅｇｍａ））と比べ＋４．７、＋２．７、＋０．７、−１．３、−３．３、−５．３及び−７．３ｍｍ）の各々の上の脳梗塞の部域を、処理中の脳収縮に対し補正するべく間接的方法を用いるコーピュータインタフェース撮像システムを使用して決定した（無傷の対側半球の部域−無傷の同側半球の部域）。次に、無傷の対側半球体積の百分率として、硬塞体積を表わした。これらの同じ方法を用いて別々に、皮質及び線条体中の硬塞形成体積も決定した。Ｈ＆Ｅ染色切片を、出血、膿瘍又は腫瘍形成といったような組織学的変化について検査した。
【０１１１】
統計的分析：各動物の治療帰属については、ブラインド状態にされた治験責任医師が、全ての槽内注射、行動試験及びその後の組織学的分析を行なった。このとき、データは平均±ＳＥＭとして表わされ、１つ又は２つの方法（ＡＮＯＶＡ）とそれに続く、多数の比較についての補正を伴う適切な対になったポストホック検定によって分析されることになる。
【０１１２】
結果
前肢置き直し試験：ＭＣＡ閉塞との関係において−１、１、３、７、１４及び２１日目に、視覚、触覚及び自己受容刺激に応答した前肢内の感覚運動機能を評価するため四肢置き直し試験を使用することによって動物を検査した（カワマタ（Ｋａｗａｍａｔａ）Ｔ．、ディートリッヒ（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ）Ｗ．Ｄ．、シャレート（Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ）Ｔ．、ゴッツ（Ｇｏｔｔｓ）Ｅ．、コック（Ｃｏｃｋｅ）Ｒ．Ｒ．、ベノウィッツ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ）Ｌ．Ｉ．及びフィンクルスタイン（Ｆｉｎｋｌｅｓｔｅｉｎ）Ｓ．Ｐ．（１９９７）米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９４、８１７９−８１８４；デリック（Ｄｅ Ｒｙｃｋ）Ｍ．、ファン・リンプツ（Ｖａｎ Ｒｅｅｍｐｔｓ）Ｊ．、デュイチェバー（Ｄｕｙｔｓｃｈａｅｖｅｒ）Ｈ．、ファン・デウレン（Ｖａｎ Ｄｅｕｒｅｎ）Ｂ．及びクリンケ（Ｃｌｉｎｃｋｅ）Ｇ．（１９９２）脳研究（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）５７３、４４−６０）。１２が最大機能障害を表わすものとして、０〜１２の潜在的合計評点範囲を得るべく、視覚性置き直し（０〜４で評定）、触覚性置き直し（０〜４で評定）及び自己受容置き直し（０〜２で評定）を合計した（図４）。
【０１１３】
後肢置き直し試験：ＭＣＡ閉塞との関係において−１、１、３、７、１４及び２１日目に、触覚及び自己受容刺激に応答した後肢内の感覚運動機能を評価するため四肢置き直し試験を使用することによって動物を検査した（カワマタ（Ｋａｗａｍａｔａ）Ｔ．、ディートリッヒ（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ）Ｗ．Ｄ．、シャレート（Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ）Ｔ．、ゴッツ（Ｇｏｔｔｓ）Ｅ．、コック（Ｃｏｃｋｅ）Ｒ．Ｒ．、ベノウィッツ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ）Ｌ．Ｉ．及びフィンクルスタイン（Ｆｉｎｋｌｅｓｔｅｉｎ）Ｓ．Ｐ．（１９９７）米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９４、８１７９−８１８４；デリック（Ｄｅ Ｒｙｃｋ）Ｍ．、ファン・リンプツ（Ｖａｎ Ｒｅｅｍｐｔｓ）Ｊ．、デュイチェバー（Ｄｕｙｔｓｃｈａｅｖｅｒ）Ｈ．、ファン・デウレン（Ｖａｎ Ｄｅｕｒｅｎ）Ｂ．及びクリンケ（Ｃｌｉｎｃｋｅ）Ｇ．（１９９２）脳研究（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）５７３、４４−６０）。６が最大機能障害を表わすものとして、０〜６の潜在的合計評点範囲を得るべく、触覚性置き直し（０〜４で評定）及び自己受容置き直し（０〜２で評定）を合計した（図５）。
【０１１４】
ボディスイング試験：ＭＣＡ閉塞との関係において−１、１、３、７、１４及び２１日目に、動物がテーブルの表面より上約１インチに保持され右側又は左側に揺動するにつれての側方選好性を評価するべくボディスイング試験を用いることにより動物を検査した（カワマタ（Ｋａｗａｍａｔａ）Ｔ．、ディートリッヒ（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ）Ｗ．Ｄ．、シャレート（Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ）Ｔ．、ゴッツ（Ｇｏｔｔｓ）Ｅ．、コック（Ｃｏｃｋｅ）Ｒ．Ｒ．、ベノウィッツ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ）Ｌ．Ｉ．及びフィンクルスタイン（Ｆｉｎｋｌｅｓｔｅｉｎ）Ｓ．Ｐ．（１９９７）米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９４、８１７９−８１８４；デリック（Ｄｅ Ｒｙｃｋ）Ｍ．、ファン・リンプツ（Ｖａｎ Ｒｅｅｍｐｔｓ）Ｊ．、デュイチェバー（Ｄｕｙｔｓｃｈａｅｖｅｒ）Ｈ．、ファン・デウレン（Ｖａｎ Ｄｅｕｒｅｎ）Ｂ．及びクリンケ（Ｃｌｉｎｃｋｅ）、Ｇ．（１９９２）脳研究（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）５７３、４４−６０）。３０回の揺動を計数し、右への揺動の百分率に基づいて評点を計算する（図６）。
【０１１５】
シリンダ試験：ＭＣＡ閉塞との関係において−１、１、３、７、１４及び２１日目に、前肢の自発運動活性を評価するために、シリンダ試験により動物を検査した（カワマタ（Ｋａｗａｍａｔａ）Ｔ．、ディートリッヒ（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ）Ｗ．Ｄ．、シャレート（Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ）Ｔ．、ゴッツ（Ｇｏｔｔｓ）Ｅ．、コック（Ｃｏｃｋｅ）Ｒ．Ｒ．、ベノウィッツ（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ）Ｌ．Ｉ．及びフィンクルスタイン（Ｆｉｎｋｌｅｓｔｅｉｎ）Ｓ．Ｐ．（１９９７）米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９４、８１７９−８１８４；デリック（Ｄｅ Ｒｙｃｋ）Ｍ．、ファン・リンプツ（Ｖａｎ Ｒｅｅｍｐｔｓ）Ｊ．、デュイチェバー（Ｄｕｙｔｓｃｈａｅｖｅｒ）Ｈ．、ファン・デウレン（Ｖａｎ Ｄｅｕｒｅｎ）Ｂ．及びクリンケ（Ｃｌｉｎｃｋｅ）、Ｇ．（１９９２）脳研究（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）５７３、４４−６０）。簡単にいうと、動物を狭いガラスシリンダ（１６．５×２５ｃｍ）の中に入れ、卒中手術の前日に５分間そしてその後毎週の間隔で５分間ビデオテープに録画する。その後ビデオテープを、１人の経験豊かなオブザーバにより独立して評定させ、最高５０回の自発運動を計数することになる（一日ラット一匹につき約５分）。自発運動には、立上がりを開始し、着地又はシリンダの壁に沿って側方に移動するため、又は立上がりの後床に着地するため各々の前肢により行なわれるものが含まれる（図７）。
【０１１６】
体重：ＭＣＡ閉塞との関係において、−１、１、３、７、１４及び２１日目に動物を計量した。結果は、ビヒクルとＣＧ５３１３５−０５治療の間の有意な差異を全く示していない（図８）。
【０１１７】
結論
ＭＣＡ閉塞後のＣＧ５３１３５−０５の投与は、低い及び高い用量の両方共が、対側（罹患）四肢についての前肢（図４）及び後肢（図５）置き直し試験での回復の有意な増強、及びボディスイング試験での改善（図６）を生み出すということを示唆した。このモデルにおけるその他の療法でのこの活動パターンは、それぞれ大脳皮質及び皮質下（線条体）の機能の改善を反映することが一般に示されてきた（ダイクハウゼン（Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ）ＲＭ、レン（Ｒｅｎ）Ｊ、マンデビル（Ｍａｎｄｅｖｉｌｌｅ）ＪＢ、ウー（Ｗｕ）Ｏ、オズダッグ（Ｏｚｄａｇ）ＦＭ、モスコウィツ（Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ）ＭＡ、ローゼン（Ｒｏｓｅｎ）ＢＲ、フィンックルスタイン（Ｆｉｎｋｌｅｓｔｅｉｎ）ＳＰ．２００１、米国科学アカデミー紀要９８（２２）：１２７６６−７１）。自発的四肢使用のシリンダ試験（図７）又は動物の体重（図８）については、いかなる明白な差異もみられなかった。
【０１１８】
従って、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、外傷、脊髄損傷、重金属又は毒素中毒、及び神経変性疾患（例えばアルツハイマー、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病など）を含めた病的条件の治療において、ＣＧ５３１３５−０５の投与が有用となる。
【０１１９】
５．５． 実施例５：マトリックス金属プロテイナーゼ産生検定
マトリックス金属プロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、骨及び軟骨内で細胞外マトリックスを分解させる関連酵素の１ファミリーである。これらの酵素は、組織の分化及びリモデリングにおける正常な発達中に作用する。骨関節炎（ＯＡ）及び関節リウマチ（ＲＡ）といった関節病においては、これらの酵素の発現の上昇が不可逆的マトリックス分解に貢献する。かくしてＭＭＰ産生に対するＣＧ５３１３５−０５の効果が評価された。
【０１２０】
マトリックス金属プロテイナーゼ（ＭＭＰ）の産生に対するＣＧ５３１３５の活性は、ＳＷ１３５３軟骨肉腫細胞系列（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−９４）を用いて評価された。この細胞系列は、マトリックス金属プロテイナーゼ（ＭＭＰ）のための確立した軟骨細胞モデルである。ＤＭＥＭ培地−１０％ＦＢＳ中１×１０５細胞／ｍｌ（１ｍｌ）で２４ウェルの平板中にＳＷ１３５３細胞を平板固定した。一晩のインキュベーションの後、培地をＤＭＥＭ＋０．２％のラクトアルブミン血清で置換した。０．５ｍｌの最終体積までＩＬ−１ベータ（０．１〜１ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｓシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス）、ＴＮＦ−アルファ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄシステムズ）又はビヒクル対照の不在下又は存在下で１０〜５０００ｎｇ／ｍｌの範囲内の用量でウェルに対しＣＧ５３１３５−０５を添加した。ＩＬ−１ベータ及びＴＮＦ−アルファは両方共ＭＭＰ活性の強力な刺激物質である。全ての処置は、トリプリケートウェル内で行なった。２４時間後に、上清を収集し、ＭＭＰ活性の天然の阻害物質であるプローＭＭＰ−１及び−１３ならびにＴＩＭＰ−１（マトリックス金属プロテイナーゼの組織阻害物質）をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ）により測定した。測定値をＭＴＳ検定により細胞数に正規化した。
【０１２１】
結果
ＣＧ５３１３５−０５は、それぞれ図１４及び図１５で実証されているようにＩＬ−１ベータ又はＴＮＦ−アルファのいずれかの存在下でＭＭＰ−１３産生を著しく減少させた。ＩＬ−１ベータ及びＴＮＦ−アルファは両方共、ＭＭＰ活性の強力な刺激物質である。ＯＡ内で分解される主要コラーゲンであるＩＩ型コラーゲンに対するＭＭＰ−１３親和力はＭＭＰ−１のものより１０倍高い。ＭＭＰ−１３発現はＯＡ及びＲＡ内で増大することから、ＣＧ５３１３５−０５の付加に伴って観察されるＭＭＰ−１３の減少は、ＯＡ及びＲＡ療法剤として該タンパク質を使用できるということを示している（図１０）。さらに、ＣＧ５３１３５−０５は、ＭＭＰ活性の天然の阻害物質であるＴＩＭＰ−１の産生をアップレギュレートした（図１１）。ＣＧ５３１３５−０５によるＴＩＭＰ−１産生のこの増強は、ＯＡ及びＲＡにおいて観察されたＭＭＰ−１及びＭＭＰ−１３によるマトリックス破壊を低減する上で有益である。さらに、ＣＧ５３１３５−０５は、構成的に又はＩＬ−１誘発の後（データ示さず）ＭＭＰ−３産生に対し全く効果をもたなかった。同様にして、ＣＧ５３１３５−０５（ＦＧＦ−２０）は、ＳＷ１３５３細胞内でのＭＭＰ−１の基底発現の増大を示した（データ示さず）。
【０１２２】
５．６． 実施例６：正常なラットに対するＣＧ５３１３５−０５の効果：半月板裂傷モデルに対する概念の検証
正常なラットに対するＣＧ５３１３５−０５の効果を、疾病モデル（例えば、ラットにおける骨関節炎の半月板裂傷モデル）におけるさらなる研究を押し進めるための概念の検証として研究した。滑膜及び軟骨に対するＣＧ５３１３５−０５の効果を、正常な雄のルイスラット内にタンパク質を注射することによって評価した。
【０１２３】
正常なラットにおけるＣＧ５３１３５−０５の関節内注射の効果
ビヒクル溶液（約１％のヒアルロン酸中の８ｍＭの酢酸塩、４０ｍＭのアルギニン、及び０．６％のグリセロール（ｐＨ５．３））、１０μｇのＣＧ５３１３５−０５又は１００μｇのＣＧ５３１３５−０５を２週間、１週間に３回ずつラットの関節内に注射した。
【０１２４】
研究の設計：０日目に体重２９３−３２５グラムの雄のルイスラットをハーラン・スプラーグ・ダウレイ（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）インディアナ州インディアナポリス （Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ））から入手し、８日間馴化させた。ラットを、各々３匹の動物を含む３つの処置グループに分けた。２つのグループはＣＧ５３１３５を、１つのグループはビヒクル対照のみを受けた。ラットをイソフルランで麻酔し、両膝の十字付着の部域内に膝蓋腱を通して注射した。ＣＧ５３１３５は、０．１ｍｇ／ｍｌ（関節１つあたり０．０１ｍｇ）又は１．０ｍｇ／ｍｌ（関節１つあたり０．１ｍｇ）の用量で注射した。上述の通りに、ビヒクル溶液を対照に注射した。注射は、２週間、月、水及び金曜日に行なった。１５日目に動物を処分し、その時点で、増殖中の細胞をパルス標識するべくＢＲＤＵ（１００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に注射した。
【０１２５】
病変マーカーの観察及び分析
相対的観察。異常な膨れ又は歩行変化について毎日ラットを観察し、毎週体重測定した。
【０１２６】
組織病理学的に保存し脱灰した（５％蟻酸）膝を２つのおおよそ等しい長手方向（足首）又は前方（膝）半分へとトリミングし、段階アルコール及び清浄剤を通して処理し、浸潤させてパラフィン内に包埋し、切断し、トルイジンブルー（膝）で染色した。以下で列挙する問題のパラメータに注意しながら、右膝の多数の切片（３レベル）を顕微鏡で分析した。各パラメータを正常、最小、軽度、中度、高度又は重度として段階付けした。タンパク質の反復的注射により生成される改変のタイプを理由として、骨関節炎モデル内で一般的に用いられる評定基準よりもむしろ描写的パラメータを用いて軟骨の評価を行なった。動物は処分する前にＢＲＤＵの注射を受けたものの、増殖変化は、トルイジンブルーで染色した切片内に容易に見られた。
【０１２７】
結果
【表１５】
【０１２８】
研究全体を通して、生存段階パラメータ体重は、ビヒクル及びタンパク質を注射した動物のいずれにおいても類似していた（表１２）。１００μｇのタンパク質を注射した膝は、３番目の注射で始まって注射プロセス中に臨床的に幾分かの線維症の証拠を有していた。
【０１２９】
形態学的病理ビヒクルの注射を受けたラットは、線維化した滑膜内のマトリックス被着が全く乃至は最小限しかない状態で、最小乃至は軽度の滑膜過形成、炎症、線維増殖を有していた。関節軟骨は、いかなるプロテオグリカン損失もフィブリル化も有していなかった。十字が付着しその中に関節内注射が行なわれる関節の中央部域は、全く乃至は最小限の線維増殖及び軟骨／骨損傷しか有していなかった。いかなる辺縁軟骨形成も存在しなかった。
【０１３０】
１０μｇのＣＧ５３１３５−０５の注射を受けた膝は、線維化した滑膜内のマトリックス被着が最小限乃至は中度ある状態で、最小限乃至は中度の滑膜過形成、炎症、線維増殖を有していた。関節軟骨は、いかなるプロテオグリカンの損失もフィブリル化も有していなかった。十字が付着しその中に関節内注射が行なわれる関節の中央部域は、全く乃至は最小限の線維増殖及び軟骨／骨損傷しか有していなかった。１つの膝は、辺縁帯の最小限の軟骨形成を有していた。
【０１３１】
１００μｇのＣＧ５３１３５−０５の注射を受けた膝は、線維化した滑膜内に中度のマトリックス被着ある状態で、中度乃至は高度の滑膜過形成、炎症、線維増殖を有していた。関節軟骨は、全く乃至は最小限しかプロテオグリカンの損失又はフィブリル化を有していなかった。十字が付着し中で関節内注射が行なわれる関節の中央部域は、最小限乃至は高度の線維増殖及び軟骨／骨損傷を有していた。全ての膝は、軽度乃至中度の辺縁帯軟骨形成を有していた。１匹の動物は、関節軟骨に結びつけられた部域内に軟骨形成を有していた。
【０１３２】
結論
これらの結果はＣＧ５３１３５−０５の反復的関節内注射が滑膜線維増殖を誘発することを実証している。ビヒクル注射は結果として軽度の炎症及び線維増殖をもたらし、かくして、このビヒクルが幾分かの刺激性潜在能力をもつことを示唆した。タンパク質の注射を受けた動物において、滑膜増殖性応答の濃度応答性増加と辺縁帯軟骨成分が発生した。注射が行なわれた十字付着の部域は、それ自体滑膜炎症と同様にタンパク質の濃度増加に伴って重症度が増大する骨再吸収及び線維増殖の部域を有していた。観察された滑膜線維増殖及び骨再吸収の潜在的に不利な効果は、タンパク質を処方するのに使用された非臨床等級のヒアルロン酸内部のＦＧＦ−２０活性又は内毒素レベルのいずれかに起因するものであったと考えられる。さらに関節内の炎症は骨再吸収及び辺縁帯軟骨形成を誘発し得、従ってこれらの結果は、タンパク質注射に対する炎症性応答が増殖性応答に貢献した可能性に照らし合わせて解釈される必要がある。増殖性変化及び軟骨形成の形態学的外見は、明らかに、このタンパク質（ＣＧ５３１３５−０５）の生物活性が応答を生成する上で重要であることを示している。
【０１３３】
本書で報告されている実験の結果は、ＣＧ５３１３５−０５の反復的な関節内注射が滑膜線維増殖及び軟骨形成を誘発することを示している。
【０１３４】
５．７． 実施例７：ラット骨関節炎の半月板裂傷モデルにおけるＣＧ５３１３５−０５の関節内注射：予防及び治療的投薬
実施例６は、組織形態計測解析により関連する細胞集団に対する効果を同定するため、正常なラットの関節内へのＣＧ５３１３５−０５の投与を利用した。関節１つあたり１００μｇの用量で、ＣＧ５３１３５−０５は、ＴＧＦ−ベータといったようなその他の成長因子で見られるものに類似した有意な辺縁帯軟骨形成を誘発し、辺縁帯内部での多能性幹細胞に対する効果を示唆した。関節の成熟軟骨部域内の応答の欠如により証明されるように、成熟軟骨細胞に対する明らかな効果は全く存在しなかった。観察された滑膜線維増殖及び骨再吸収の潜在的に不利な効果は、タンパク質を処方するのに使用された非臨床的等級のヒアルロン酸内部のＦＧＦ−２０活性又は内毒素レベルのいずれかに起因するものであったと考えられる。
【０１３５】
実施された骨関節炎の動物におけるさらなる研究は、以下のことに関するものであった。１）抗炎症薬との相乗効果（骨関節炎患者についての標準的アプローチ）、２）ＣＧ５３１３５−０５（ＦＧＦ−２０）が関節軟骨層の機能的修復又は保護を誘発できるか否か及び３）滑膜線維増殖及び骨再吸収がＦＧＦ−２０誘発されたか又は処方内部の汚染性内毒素に起因するものであったか。
【０１３６】
かくしてこの研究の１つの側面は、ラット骨関節炎の半月板裂傷モデル内の骨関節炎における関節損傷に対するＣＧ５３１３５−０５の関節内注射の保護的及び治療的効果を評価することにあった。ＯＡのこの比較的新しいモデルは、その他の種における突発的疾病及び外科手術によって誘発された疾病において発生する変化に似た軟骨変性及び骨棘形成の形態的改変を有することが示されてきた（ベンデーレ（Ｂｅｎｄｅｌｅ）Ａ．Ｍ．、変形性関節症の動物モデル（Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、Ｊ．Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌ．Ｎｅｕｒｏｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２００１；１：３６３−３７６、ベンデーレ（Ｂｅｎｄｅｌｅ）Ａ．Ｍ．及びハルマン（Ｈｕｌｍａｎ）Ｊ．Ｆ．、テンジクネズミにおける突発性軟骨変性（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ）、関節炎とリューマチ（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ）、１９８８；３１：５６１−５６５）。該モデルは、抗変性ならびに再生療法の潜在的に有益な効果を評価するために使用することができる。
【０１３７】
実験的設計
おり１個に２匹の割合で収容した動物（１グループにつき１０匹）をイソフルランで麻酔し、右膝部域を外科手術のために前処理した。膝の内側面全体にわたり皮膚切開を行ない、鈍的切開により内側側副靭帯を露出させ、次に離断させた。内側半月を次に細いハサミで内側対称移動させ、完全な裂傷をシミュレートするべく全厚みにわたりカットを行なった。皮膚を縫合により閉じた。
【０１３８】
予防的投薬：外科手術の日に右膝関節の関節内投薬（ＣＧ５３１３５−０５）を開始し、ラットがイソフルラン麻酔下にある状態で、外科手術後２週間にわたり木曜、土曜及び月曜（０、２、４、７、９及び１１日目）に関節内注射することによってこれを継続した。非ステロイド系抗炎症薬であるインドメタシンを、外科手術の日から始めて経口経路で毎日投薬（１ｍｇ／ｋｇ／日）して、注射に起因するあらゆる潜在的炎症を低減させた。０日、７日及び１４日目に体重を記録した。外科手術から１４日目に動物を処分した後、両方の膝を組織病理的評価のために収集した。研究設計は、表１０に示されている。
【０１３９】
【表１６】
ａ 毎週３回で２週間の投与（１００μｇ／関節、関節内）
ｂ 毎日で、２週間の投与（０．５ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ）
【０１４０】
治療的投薬：外科手術から２１日目に右膝関節の関節内投薬（ＣＧ５３１３５−０５）を開始し、ラットがイソフルラン麻酔下にある状態で、２週間にわたり金曜、日曜及び火曜（２２、２５、２７、２９、３２、及び３４日目）に関節内注射することによってこれを継続する。インドメタシンを、外科手術の日から始めて経口経路で毎日投薬する。０日、７日、１４日、２１日、２８日及び３５日目に体重を記録する。３５日目に両方の膝を組織病理的評価のために収集する。研究設計は、表１１に示されている。
【０１４１】
【表１７】
ａ 毎週３回で２週間の投与（１００μｇ／関節、関節内）
ｂ 毎日で、２週間の投与（０．５ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ）
【０１４２】
予防的投薬研究の結果：行なわれた観察には、このモデルのために従った標準が含まれている。右膝の多数の切片（３レベル）を顕微鏡により分析し、以下の方法に従って評定した。３つの切片を評定するにあたっては、３つのレベルを表わす３枚のスライドの各々の上の２個の半分について最悪の場合の筋書きを、軟骨の変性及び骨棘の形成について判定した。各スライドについての各パラメータのこの値を次に平均して、脛骨及び大腿骨についての全体的な主観的軟骨変性評点及び脛骨についての骨棘評点を決定した。
【０１４３】
以下の基準を用いて深さ及び面積（表面積を３分したもの）について無から重度（数値で０〜５）の評点で軟骨変性を評定した。
０＝変性無し
１＝表面ゾーンが関与するフィブリル化を伴う又は伴わない、最低限の変性、軟骨細胞及びプロテオグリカン損失
２＝上３分の１が関与するフィブリル化を伴うか又は伴わない軽度の変性、軟骨細胞及びプロテオグリカンの損失
３＝フィブリル化が中央ゾーン内に充分拡がり一般に全軟骨厚みの１／２に影響を与えている、中度の変性、軟骨細胞及びプロテオグリカン損失。
４＝完全なマトリックス損失（最高到達点まで）は無いが、フィブリル化が深層ゾーン内へ充分に拡がっている状態の、高度の変性、軟骨細胞及びプロテオグリカン損失、
５＝重度の変性、最高到達点までのマトリックス損失。
【０１４４】
この評定方法においては、ゾーン（外側、中央、内側の３分の１）に対する厳密な注意を遵守した。合計評点は、脛骨変性の重症度の包括的合計を反映している。
【０１４５】
軟骨変性のこの全体的な主観的分析に加えて、脛骨プラトーを横断しての特定の領域的差異に注意を払いながら、変性重症度を評価するため類似の基準を用いて付加的な主観的評価を行なった。このＯＡモデルでは、一般に、外科手術後３週間までに病巣が往々にして最高到達点まで拡がっている状態で、脛骨の外側１／３が半月板裂傷傷害を最も重症で患っている。中央の１／３は、通常、重度又は高度の変化が中度又は軽度になる遷移ゾーンであり、内部の１／３は、軽度又は最小限よりも大きい変化を有している。外側１／３の重度病巣対中間１／３及び内側１／３のより軽度の病巣について潜在的な治療の差異を判定しようとして、これらの領域を各々別々に評定した。領域の値の合計を計算し、３つのゾーンの合計として表現した。
【０１４６】
上述の主観的評定に加えて、表面を横断して接線層及び下にある軟骨が組織学的に正常に見える点に至るまでの隣接する軟骨変性（外側１／３）に伴っていかなる骨棘も存在しなかった場合、骨棘又は辺縁帯の起点から拡がるあらゆる重症度の変性を患う脛骨プラトーの全範囲のマイクロメートル測定（全脛骨軟骨変性幅μｍ）が行われた。
【０１４７】
付加的な測定（有意な軟骨変性幅μｍ）は、軟骨細胞及びマトリックスの損失が軟骨厚みの５０％超にわたって拡がっていた脛骨軟骨変性の部域を反映していた。
【０１４８】
最後に、変化した部域の深さと最高到達点までの深さの比率として表わされたあらゆるタイプの病巣のマイクロメートル深さ（細胞／プロテオグリカン損失、メタクロマジア変化、ただしコラーゲンマトリックスの優れた保持を有しフィブリル化は無いかもしれない）が含み入れられ、脛骨表面上の４つの等間隔の点全体にわたって取られた。これらの測定は（Ｎｏ．１）骨棘に隣接するマトリックス、（Ｎｏ．２）脛骨プラトーを横断する距離の１／４、（Ｎｏ．３）脛骨プラトーを横断する距離の１／２、（Ｎｏ．４）脛骨プラトーを横断する距離の３／４、のところで行われた。この測定は、存在するあらゆるタイプの顕微鏡的変化の最も重大な分析であった。最高到達点（分母）までの深さは同様に、脛骨プラトーを横断する軟骨厚みの標示をも提供し、従って、肥大又は過形成が発生したか否かを判定しようとする場合に、グループを横断した比較を可能にする。
【０１４９】
切片の非接線平面内の全体的厚みを最も良く表わすものと思われている部域内で各切片について単一の成長脛骨板測定を行なった。
【０１５０】
接眼マイクロメータを用いて、骨棘の評定及び小中大分類を行なった。
無＝０、辺縁帯に測定可能な増殖性応答は全く存在しない。
小骨棘＝１（最高２９９μｍ）
中骨棘＝２（３００〜３９９μｍ）
大骨棘＝３（＞４００μｍ）
【０１５１】
評点（０−３）は全体的関節評点の中に含み入れられた。さらに、実際の骨棘測定（平均３つの切片について）のための平均±ＳＥも同様に決定された。
【０１５２】
一般に、外科手術を行なう上で、半月板が大腿骨に向かって近位に対称移動する結果となる場所で側副靭帯を離断させる試みがなされた。その後、脛骨ではなく大腿骨に向かってハサミの先端を挿入することにより、カットを行なった。このとき大腿骨の顆状軟骨内で幾分かの機械的損傷を検出し得るものの、脛骨上には稀にしか見られず、かくして脛骨は軟骨保護の評価のための最も適切な部位となっている。
【０１５３】
大腿骨軟骨に対する物理的外傷の結果である可能性が高かったプロテオグリカン及び細胞損失の小さな焦点部域は記述されたものの、脛骨について記述された方法に従って主観的評点を受けるより大きくより広範な部域についての評点内には含み入れられなかった。これらのより大きい部域は、非外傷性変性とより強い一貫性をもっていた。大腿骨上に医原性病巣の可能性があるため、全体的関節評点は、大腿骨軟骨変性評点を伴うものと伴わないものの両方で表現された。
【０１５４】
以下の基準を用いて、石灰化された軟骨層と軟骨下骨に対する損傷を評定した。
０＝変化無し
１＝最高到達点における好塩基球増加症の増大：最高到達点の断片化又は骨髄変化無し。
２＝最高到達点における好塩基性増加症の増大：最高到達点の石灰化軟骨の最小限乃至は軽度の断片化、骨髄内の間葉変化には合計部域の１／４が関与しているが、一般に病巣下の軟骨下領域に限定されている。
３＝最高到達点における好塩基性増加症の増大：石灰化軟骨の軽度乃至高度の断片化、骨髄中の間葉変化は合計部域の最高３／４であり、骨髄軟骨形成の部域は明白であり得るが、骨端骨内への関節軟骨の崩壊は全く無い。
４＝最高到達点における好塩基性増加症の増大：石灰化軟骨の高度乃至重度の断片化、骨髄間葉変化には最高３／４の部域が関与し、関節軟骨は、骨端内に最高到達点から２５０μｍ以下の深さまで崩壊していた。
５＝最高到達点における好塩基性増加症の増大：石灰化軟骨の高度乃至重度の断片化、骨髄間葉変化には最高３／４の部域が関与し、間節軟骨は、骨端内に最高到達点から２５０μｍを超える深さまで崩壊していた。
【０１５５】
滑膜炎、滑膜線維症、辺縁帯軟骨形成、骨再吸収、軟骨形成／既存軟骨への取込みを伴うか又は伴わない線維性発育過度の度合について記述的コメントがなされた。
【０１５６】
統計的分析：組織病理学的パラメータの統計的分析が、有意性がＰ≦０．０５に設定された状態でスチューデント両側ｔ−検定を用いて、グループ平均を比較することによって行なわれた。データの性格のため、評定されたパラメータを分析するのに、非パラメトリックＡＮＯＶＡ（クラスカル・ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ）検定を使用し、測定値を分析するのにパラメトリックＡＮＯＶＡを使用した。使用された適切な事後試験は、パラメトリックデータについてのダネット多重比較検定であり、非パラメータデータについてはダン検定が用いられた。有意性は、全てのパラメータについてＰ≦０．０５に設定された。
【０１５７】
結果：同時インドメタシン投与を伴う又は伴わない１００μｇのＣＧ５３１３５−０５の間節内注射は、中間１／３上で脛骨軟骨変性の有意な阻害（３９％）（ゾーン１については４０〜４３％）、そして４１％という合計３ゾーンの全体的に有意でない阻害を結果としてもたらした（図１２）。合計軟骨変性幅は有意に３５〜３７％減少し（図１３）、有意な変性は７０〜８９％減少し、この阻害はタンパク質及びインドメタシン処理したグループ内でのみ有意である（図１４）。
【０１５８】
予防的投薬研究の結果：記述されたデータは、内側半月裂傷を伴うラットの膝関節の中に１００μｇのＣＧ５３１３５−０５を関節内投与すると、軟骨変性の阻害と軟骨修復の刺激の両方の結果としての軟骨保護効果がもたらされるということを示している。一部の関節は、既存の正常とみえる又は損傷した軟骨全体にわたる増殖した新しい軟骨の層状化を有していた。この観察事実は、それが表面再建の発生の可能性を実証することから、特に興味深いものである。
【０１５９】
これらの有益な効果はつねに、広汎性滑膜線維増殖、骨再吸収及び滑膜炎の増加と結びついていた。同時インドメタシン処置（１ｍｇ／ｋｇ／日）は、シンビスク（Ｓｙｎｖｉｓｃ）単独の注射を受けた膝における疾病プロセス又はタンパク質を含有するシンビスクの注射を受けた膝におけるタンパク質に対する反応及び疾病プロセスに対して、何らかの効果があったにせよ、それは最小限のものであった。この供述に対する単一の例外は、タンパク質及びビヒクルｐｏで処置されたグループを除いて全てのグループが類似の測定値を有していた骨棘測定についてのデータの中に反映されている。前記グループは、より大きい測定値を有し、かくして、炎症のある関節においては、普通の出来事であるより大きい辺縁帯刺激を示唆していた。
【０１６０】
このタンパク質１００μｇの注射により誘発された形態学的変化は、軟骨修復プロセスにおいてＣＧ５３１３５−０５が有効である可能性を実証している。それは、軟骨への分化を伴う線維組織の増殖と、重要なことにその新しく増殖した組織の組込みを誘発する能力を有している。増殖性プロセスは、辺縁帯及び軟骨下骨といったような部域内では幾分かまとまりがなく反生産的である。しかしながら、ゲッ歯類は、炎症性媒介を含むさまざまな刺激から辺縁帯、骨膜及び骨髄の増殖を示すはるかに大きな傾向を確実に有しており、そのためラットにおいて見られる過度の及び反生産的な応答の一部分は、イヌ又は霊長類では起こらない可能性がある。同様に、抗体応答のいくらかの誘発が存在し、かくして抗体応答をもたなかったヒト又はその他の動物においては発生しないと思われる膝の炎症の増強が導かれた可能性がある。
【０１６１】
骨関節炎におけるＣＧ５３１３５−０５の潜在的効能を描写する上で有用な付加的な研究としては、以下のものが含まれる。
【０１６２】
１． ＯＡのイヌモデルにおける評価−これはヒトにより類似している軟骨及び骨の構造を伴うより大きい関節の中で評価を可能にすると思われ、これは、ゲッ歯類において発生するものといったような超増殖性応答を示す傾向が比較的低い種である。
【０１６３】
２． 可能な場合にはより攻撃的な抗炎症性全身的療法及びそれに続く新しい組織がいかにリモデリングするかを見るための回復期間を伴う、３〜４週間の関節内注射の評価が有利であると思われる。さらなる増殖性刺激が全く無い状態で関節をリモデリングさせることが、より好ましい形態学的評価項目という結果をもたらすことになるかもしれない。リモデリング期間を伴う処置サイクルは、最も満足のいく修復を達成する方法であるかもしれない。これらのような研究は、同様に、修復組織が長期間持ちこたえるか否かの問題にも答えることになるだろう。一般に、線維軟骨はこれを行なう傾向が少ない。
【０１６４】
結果：同時経口インドメタシン投与を伴う又は伴わない１００μｇのＣＧ５３１３５−０５の関節内注射は、脛骨軟骨変性評点の有意な阻害を結果としてもたらさなかった（図１５）。合計又は有意軟骨変性幅は減少しなかった（図１６、１７）。
【０１６５】
治療的投薬研究の結果：記述されたデータは、関節内投与されたＣＧ５３１３５−０５の潜在的軟骨増殖的活性を実証した。しかしながら、タンパク質を注射した関節は著しく増大した炎症、線維増殖及び結合組織再吸収プロセスを有していた。
【０１６６】
予防的投薬と治療的投薬の間の最も重要な差異は、投薬開始時点におけるＯＡ病巣の性質であった。治療的投薬研究におけるラットは、軟骨の外側乃至中間の１／３において重度のマトリックス損失の部域を有し、かくして石灰化軟骨／軟骨下骨をタンパク質に暴露した。かくして有効な修復には、辺縁帯又は暴露された骨髄多能性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ）細胞に由来する新たに増殖した組織でこの欠陥を充填することが必要であった。予防的投薬研究においては、有益な効果には、マトリックス分解の阻害及び辺縁帯のみに由来する修復組織での変性足場上の修復の刺激が必要であった。欠陥の充填は損傷を受けた足場の修復よりもはるかにむずかしいと思われることから、有益な効果を得るためには治療的モデルにおいてより長い処置時間が必要となるかもしれない。
【０１６７】
インドメタシン処置は、炎症変化を削減する上で有効ではなく、骨の中で発生しつつある再吸収プロセスを阻害する上でも有益な効果を全くもたなかった。炎症及び組織破壊が無い状態で軟骨への有効な増殖及び分化を達成するために、治療的投薬研究に対する以下の修正を試みることができる。すなわち、投薬間隔を週１回又は２回まで増大させること及び／又は増殖性組織がこの疾病プロセスによって誘発された大きな軟骨欠陥を充填することのできる時間を与えるべく研究の持続時間を延長すること、である。イヌはゲッ歯類に比べてさまざまな刺激に応えて結合組織を増殖させ骨を再吸収する傾向が少ないことから、イヌといったようなより大きい種においてＣＧ５３１３５−０５の効果を調査することが、もう１つの可能性である。
【０１６８】
本書で詳述されている結果（予防的及び治療的の両方の投薬研究）は、ＣＧ５３１３５−０５が、関節置換術を目的とした重度の骨関節炎を患う関節において特に有用であることを示している。これらのタイプの作用物質は、わずかしか又は全く正常な軟骨が残っておらず表面再建を必要とする関節内に注射されることになる。この状況下では、修復は、辺縁帯又は骨髄内の多能性細胞を源とする可能性がある。これらの場所を出発点とする修復は、ヒアリン軟骨よりもむしろ線維軟骨の産生を結果としてもたらす確率が高くなる。しかしながら、一部の軟骨は、全く軟骨が無いよりは好ましいと思われ、修復を持続させるために経時的に治療をくり返さなくてはならない確率が高いとしても、軟骨表面を維持する注射可能な方法が受容可能であるかもしれない。注射用同化剤での処置には、持続性能動的耐負荷運動よりもむしろ連続的な受動的運動と併用した或る種の周期的プロセスが必要となる確率が高い。
【０１６９】
６． 等価物及び引用参考文献
本書で引用されている全ての参考文献は、各々個々の刊行物又は特許又は特許出願が全ての目的で全体として参考により援用されるべく特定的かつ個別に指示された場合と同じ程度で、全ての目的で全体が本明細書に参照により援用されている。
【０１７０】
当業者にとっては明白となるように、本発明の数多くの修正及び変更を、その精神及び範囲から逸脱することなく加えることが可能である。本書中に記述されている特定の実施形態は、例示のみを目的として提供されている。従って、本発明者らはここで記されている精確な用語に限定されることを望む者ではなく、本発明をさまざまな用途及び条件に適合させるために行なうことのできるような変化及び改変を利用できることを望む者である。かかる改変及び変化には、対象に対する本発明に従ったポリペプチドの投与のための異なる組成物；異なるポリペプチド量；異なる投与回数及び投与手段；例えば異なるペプチドの組合せ又は異なる生物学的に活性な化合物とペプチドの組合せを含む投与用量内に含まれる異なる材料が含まれるが、これらに限定されるわけではない。かかる変化及び改変は同様に、かかる変化がポリペプチドの機能性を変更せず、対象に投与すべき組成物中のペプチドの可溶性、身体によるペプチドの吸収、保管寿命中の又は体内でペプチドの生物学的活動が所望の効果をもたらすことのできる時までのポリペプチドの保護及びこのような類似の修飾を変更するような形で配列を改変する、本書中で記述されている特定のポリペプチドのアミノ酸配列中の修飾を含むように意図されている。従ってかかる変化及び改変は、本発明の等価物の全範囲内に入るものとして適切に意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】ＣＧ５３１３５−０５の液体クロマトグラフィ及び質量分析法を示す。ＣＧ５３１３５−０５は、９５％の水、５％のアセトニトリル及び０．１％のトリフルオロ酢酸を含有する水系移動相中のフェニル−ヘキシルカラム上に注入された。その後タンパク質を、９５％のアセトニトリル、５％の水、及び０．０８５％のトリフルオロ酢酸を含有する有機移動相での非線形勾配を用いることによって溶出させた。４つのピークの各々は、ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ及びＮ−末端アミノ酸配列決定を用いて特徴づけした。
【図２Ａ】ＣＧ５３１３５−０５のペプチドマップを表わす。各図版内の上部のトレースは、ＣＧ５３１３５−０５のペプチドマップを表し、各図版内の下部のトレースは、同様の要領で、ただしＣＧ５３１３５−０５無しで処置された同一の試料を表わしている。ＣＧ５３１３５ペプチドを監視するための２１４ｎｍでの検出。
【図２Ｂ】ＣＧ５３１３５−０５のペプチドマップを表わす。各図版内の上部のトレースは、ＣＧ５３１３５−０５のペプチドマップを表し、各図版内の下部のトレースは、同様の要領で、ただしＣＧ５３１３５−０５無しで処置された同一の試料を表わしている。トリプトファン含有ペプチドを監視するための２９５ｎｍでの検出。
【図３】ＣＧ５３１３５のレセプタ結合特異性を示す。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を血清欠乏させ、指示された因子（緑色正方形＝血小板由来の成長因子；青色三角形＝ＦＧＦ−１；赤色円＝ＣＧ５３１３５）を単独で又は指示された可溶性ＦＧＦＲと共に用いてインキュベートし、ＣＧ５３１３５に応答するＤＮＡ合成をＢｒｄＵ取込み検定の中で測定した。データの点数は、トリプリケートウェルから得た平均を表わし、因子を単独で受ける細胞に関するＢｒｄＵ取込みパーセントとして表わされている。
【図４】前肢置き直し試験の結果を示す。ビヒクル（菱形）、注射１回あたり１．０μｇのＣＧ５３１３５−０５（正方形）及び２．５μｇのＣＧ５３１３５−０５（三角形）を受けるグループについて評点の平均及び標準誤差が経時的に表わされている。アスタリスクは、一方向ＡＮＯＶＡによって評価される通りのビヒクル対照からの有意な差異を示している。
【図５】後肢置き直し試験の結果を示す。ビヒクル（菱形）、注射１回あたり１．０μｇのＣＧ５３１３５−０５（正方形）及び２．５μｇのＣＧ５３１３５−０５（三角形）を受けるグループについて評点の平均及び標準誤差が経時的に表わされている。アスタリスクは、一方向ＡＮＯＶＡによって評価される通りのビヒクル対照からの有意な差異を示している。
【図６】ボディスイング試験の結果を示す。ビヒクル（菱形）、注射１回あたり１．０μｇのＣＧ５３１３５−０５（正方形）及び２．５μｇのＣＧ５３１３５−０５（三角形）を受けるグループについて評点の平均及び標準誤差が経時的に表わされている。右方への約５０％の揺動の評点範囲は、いかなる機能障害も無いことを表し、一方右方への０％揺動は最大の機能障害を表す。アスタリスクは、一方向ＡＮＯＶＡによって評価される通りのビヒクル対照からの有意な差異を示している。
【図７】シリンダ試験の結果を示す。ビヒクル（菱形）、注射１回あたり１．０μｇのＣＧ５３１３５−０５（正方形）及び２．５μｇのＣＧ５３１３５−０５（三角形）を受けるグループについて評点の平均及び標準誤差が経時的に表わされている。
【図８】体重試験の結果を示す。ビヒクル（菱形）、注射１回あたり１．０μｇのＣＧ５３１３５−０５（正方形）及び２．５μｇのＣＧ５３１３５−０５（三角形）を受けるグループについて体重の平均及び標準誤差が経時的に表わされている。
【図９】ＩＬ−１ベータの存在下でのＳＷ１３５３細胞中のＰｒｏ−ＭＭＰ産生に対するＣＧ５３１３５−０５の効果を示す。
【図１０】ＴＮＦ−アルファの存在下でのＳＷ１３５３細胞中のＰｒｏ−ＭＭＰ産生に対するＣＧ５３１３５−０５の効果を示す。
【図１１】ＳＷ１３５３細胞内のＴＩＭＰ産生に対するＣＧ５３１３５−０５の効果を示す。
【図１２】ラット骨関節炎の半月板裂傷モデル内のＣＧ５３１３５−０５の関節内注射の効果（予防的投薬）対内側脛骨軟骨変性の関係を示す。
【図１３】ラット骨関節炎の半月板裂傷モデル内のＣＧ５３１３５−０５の関節内注射の結果：（予防的投薬）対全軟骨変性幅の関係を示す。
【図１４】ラット骨関節炎の半月板裂傷モデル内のＣＧ５３１３５−０５の関節内注射の結果：（予防的投薬）対有意な脛骨軟骨変性幅の関係を示す。
【図１５】ラット骨関節炎の半月板裂傷モデル内のＣＧ５３１３５−０５の関節内注射の結果（治療的投薬）対内側脛骨変性の関係を示す。
【図１６】ラット骨関節炎の半月板裂傷モデル内のＣＧ５３１３５−０５の関節内注射の結果（治療的投薬）対全軟骨変性幅の関係を示す。
【図１７】ラット骨関節炎の半月板裂傷モデル内のＣＧ５３１３５−０５の関節内注射の結果（治療的投薬）対有意な脛骨軟骨変性幅の関係を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＧ５３１３５−０５ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む、対象における骨関節炎関連障害の治療方法。
【請求項２】
前記対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
予防上有効な用量の前記ポリペプチドが対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
治療上有効な用量の前記ポリペプチドが対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが非経口経路により投与される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記投与経路が、関節内、静脈内、筋内、皮下、又は皮内投与から成る請求項５に記載の方法。
【請求項７】
治療上有効な量の前記ポリペプチドが医薬組成物の形で処方される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＣＧ５３１３５−０５ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む、対象の体内で軟骨変性を低減させる方法。
【請求項９】
ＣＧ５３１３５−０５ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む、対象の体内で軟骨修復を刺激する方法。
【請求項１】
ＣＧ５３１３５−０５ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む、対象における骨関節炎関連障害の治療方法。
【請求項２】
前記対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
予防上有効な用量の前記ポリペプチドが対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
治療上有効な用量の前記ポリペプチドが対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが非経口経路により投与される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記投与経路が、関節内、静脈内、筋内、皮下、又は皮内投与から成る請求項５に記載の方法。
【請求項７】
治療上有効な量の前記ポリペプチドが医薬組成物の形で処方される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＣＧ５３１３５−０５ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む、対象の体内で軟骨変性を低減させる方法。
【請求項９】
ＣＧ５３１３５−０５ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む、対象の体内で軟骨修復を刺激する方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２００７−５１６２２３（Ｐ２００７−５１６２２３Ａ）
【公表日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３２９２８（Ｐ２００６−５３２９２８）
【出願日】平成１６年５月１０日（２００４．５．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４６２３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１００８９２
【国際公開日】平成１６年１１月２５日（２００４．１１．２５）
【出願人】（３０１０６２３６３）キュラジェン コーポレイション (18)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月１０日（２００４．５．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４６２３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１００８９２
【国際公開日】平成１６年１１月２５日（２００４．１１．２５）
【出願人】（３０１０６２３６３）キュラジェン コーポレイション (18)
【Ｆターム（参考）】
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