本発明は、ファージ粒子を含む複合体であって、（i）ポリペプチド、（ii）（i）のポリペプチドをコードする核酸、（iii）上記ポリペプチドに結合した連結化合物を含み、上記連結化合物は、少なくとも3つの異なる共有結合により上記ポリペプチドに結合している、上記複合体に関する。本発明はまた、ライブラリー、複合体を作製する方法、及び該複合体を用いたスクリーニング方法にも関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファージ粒子を含む複合体であって、
（i）ポリペプチド、
（ii）（i）のポリペプチドをコードする核酸、
（iii）上記ポリペプチドに結合した連結化合物
を含み、上記連結化合物は、少なくとも3つの異なる共有結合により上記ポリペプチドに結合している、上記複合体。
【請求項２】
前記連結化合物が、それがポリペプチドに結合する共有結合の数に対応する分子対称を有する、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記連結化合物が、3回分子対称を有し、該連結化合物は、3つの共有結合により前記ポリペプチドに結合している、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
前記連結化合物が、構造的に剛性の化学基を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
【請求項５】
前記連結化合物が、トリス-(ブロモメチル)ベンゼン（TBMB）を含む、請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
前記ポリペプチドがシステイン残基を含み、該ポリペプチドと前記連結化合物の結合のための3つの異なる共有結合の少なくとも1つが、上記システイン残基との結合を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の複合体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の少なくとも2つの異なる複合体を含む、遺伝的にコード化されたポリペプチドライブラリー。
【請求項８】
複合体を作製する方法であって、以下のステップ：
（i）ポリペプチドを含むファージ粒子を用意するステップ、
（ii）連結化合物を用意するステップ、
（iii）上記連結化合物とポリペプチドとの間での少なくとも3つの共有結合の形成により、上記連結化合物を上記ポリペプチドに結合させるステップ
を含む、上記方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドの反応基を還元し、ステップ（iii）の前に、還元反応基を含むポリペプチドを濾過により精製する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記濾過精製ステップの後、前記連結化合物との結合のために、脱気バッファー中、キレート剤の存在下でのインキュベーションにより、前記ポリペプチドを還元状態に維持する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（iii）が、アセトニトリルを含む水性バッファーにおいて、前記ポリペプチドと連結化合物を一緒に30℃にてpH8でインキュベートすることを含む、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記連結化合物が、トリス-(ブロモメチル)ベンゼン（TBMB）を含む、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記トリス-(ブロモメチル)ベンゼンが、10μmで存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）であり、前記アセトニトリルが、20％で存在し、また、前記インキュベーションステップ（iii）を1時間にわたり実施する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチド鎖の1以上の結合を切断するさらなるステップ（iv）を含む、請求項８〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記切断ステップが、前記ポリペプチドをプロテアーゼに接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項８〜１６のいずれかに記載の方法により得られる複合体。
【請求項１８】
リガンドに結合することができる、請求項１〜１７のいずれかに記載の複合体を同定する方法であって、以下のステップ：
（i）請求項１〜１７のいずれかに記載の複合体を用意するステップ、
（ii）上記複合体をリガンドと接触させるステップ、
（iii）上記リガンドと結合する複合体を選択するステップ
を含む、上記方法。
【請求項１９】
前記複合体の核酸の配列を決定するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記リガンドに結合することができるものとして単離されるある量の複合体を製造するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
本発明の方法により単離又は同定されるある量のポリペプチド-連結化合物コンジュゲートを製造するステップをさらに含み、該製造ステップが、上記連結化合物をポリペプチドに結合させることを含み、上記ポリペプチドは、組換えにより発現されるか又は化学的に合成されたものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチドのN-末端又はC-末端の1以上で、該ポリペプチドを伸長するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチド−連結化合物コンジュゲートを別のポリペプチドに結合させるステップをさらに含む、請求項２１又は２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記コンジュゲートが、以下のステップ：
（i）連結化合物との結合後、前記ポリペプチドに別のシステインを付加するステップ、及び
（ii）別のシステインとのジスルフィルド結合により、前記ポリペプチドを該別のポリペプチドにコンジュゲートさせるステップ
により実施される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（i）少なくとも2つのポリペプチド分子、及び
（ii）少なくとも1つの連結化合物分子
を含むコンジュゲートであって、上記少なくとも2つのポリペプチド分子の各々が、少なくとも1つの共有結合により、上記連結化合物分子に結合している、上記コンジュゲート。
【請求項２６】
前記コンジュゲートが少なくとも3つのポリペプチド分子を含み、前記少なくとも3つのポリペプチド分子の各々が、少なくとも1つの共有結合により、上記連結化合物分子に結合している、請求項２５に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
前記連結化合物が、トリス-(ブロモメチル)ベンゼン（TBMB）を含む、請求項２５又は請求項２６に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
前記コンジュゲートが、請求項１５又は請求項１６に記載の方法により得られる、請求項２５〜２７のいずれかに記載のコンジュゲート。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【公表番号】特表２０１１−５１４８０３（Ｐ２０１１−５１４８０３Ａ）
【公表日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４５５４６（Ｐ２０１０−５４５５４６）
【出願日】平成２１年２月４日（２００９．２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０００３０１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９８４５０
【国際公開日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【出願人】（５０３２７６９９７）メディカル　リサーチ　カウンシル (10)
【Ｆターム（参考）】