日本産アサリ検出用プライマーセット及びアサリの産地判別方法
【課題】 アサリの産地が日本産か否かを容易に判別することができるアサリの産地判別方法及びこれに用いられる日本産アサリ検出用プライマーセットを提供すること。
【解決手段】 日本産アサリ検出用プライマーセットは、配列番号１で示される塩基配列を有する第１プライマーと、配列番号２で示される塩基配列を有する第２プライマーとを具備する。このような構成のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、日本産アサリか否かを判別することができる。
【解決手段】 日本産アサリ検出用プライマーセットは、配列番号１で示される塩基配列を有する第１プライマーと、配列番号２で示される塩基配列を有する第２プライマーとを具備する。このような構成のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、日本産アサリか否かを判別することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アサリの産地を判別するための日本産アサリ検出用プライマーセット及びアサリの産地判別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、国民の食の安心・安全に対する意識の高まりから、改正ＪＡＳ法による原材料並びに産地表示が義務付けられている。市場に流通しているアサリの半数以上は輸入品であるが、販売されているアサリの産地表示はそのほとんどが国内産地とされ、外国内産と表示されることは稀であるというのが現状である。
【０００３】
このような現状に対し、産地表示の適正化を図るため、アサリの産地を的確に判別する必要がある。例えば、貝の産地判別法としては、貝の外観による判別や、貝のアミノ酸成分比率によって産地を判別する方法がある（例えば特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００５−４９２５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、貝の外観による判別では熟練した技が必要であり、容易かつ確実に判別することは困難である。また、アミノ酸成分比率による産地判別方法では、判別に多くの時間と労力とを必要とする。
【０００５】
本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、アサリの産地が日本産か否かを容易に判別することができるアサリの産地判別方法及びこれに用いられる日本産アサリ検出用プライマーセットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の日本産アサリ検出用プライマーセットは、配列番号１で示される塩基配列を有する第１プライマーと、配列番号２で示される塩基配列を有する第２プライマーとを具備することを特徴とする。
【０００７】
本発明のこのような構成のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、アサリが日本産アサリが否かを判別することができる。すなわち、このような構成のプライマーセットを用いたＰＣＲでは、日本産アサリを試料としたＰＣＲ産物のみに増幅が確認されるため、増幅が確認できれば試料が日本産アサリであると判別でき、増幅が確認できなければ試料が日本産アサリでないことを判別することができる。
【０００８】
本発明のアサリの産地判別方法は、上述に記載のプライマーセットとアサリから抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、前記ＰＣＲで得られた産物を電気泳動することを特徴とする。
【０００９】
本発明のこのような構成によれば、日本産アサリを試料としたＰＣＲ産物のみに増幅が確認されるため、増幅が確認できれば試料が日本産アサリであると判別でき、増幅が確認できなければ試料が日本産アサリでないことを判別することができる。
【００１０】
本発明の他のアサリの産地判別方法は、上述に記載のプライマーセットとアサリから抽出したＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とする。
【００１１】
本発明のこのような構成によれば、日本産アサリを試料としたリアルタイムＰＣＲ産物のみに増幅が確認されるため、増幅が確認できれば試料が日本産アサリであると判別でき、増幅が確認できなければ試料が日本産アサリでないことを判別することができる。また、リアルタイムＰＣＲを用いることにより、安価でかつ迅速に判別を行うことができる。
【００１２】
また、前記リアルタイムＰＣＲにインターカレーター法を用いることを特徴とする。
【００１３】
このようにインターカレーター法を用いることにより、迅速性のみならず、経済性にも優れた判別を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態を図面に基づき説明する。
【００１５】
（プライマーセット）
【００１６】
本実施形態における日本産アサリ検出用プライマーセットは、配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとを具備する。
【００１７】
プライマー設計においては、アサリミトコンドリアＤＮＡの遺伝子配列から、日本産と中国産の判別を行うための標的として、配列番号３に示されるチトクロムｃII（cｙtochrome c II）の遺伝子がコードされている領域を選んだ。
【００１８】
配列番号１及び配列番号２からなるプライマーセットを用いてＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）又はリアルＰＣＲを使用することにより、日本産アサリのみ配列番号４に示される塩基配列部分が増幅される。配列番号１及び配列番号２それぞれに示されるプライマーは、配列番号３に示されるチトクロムｃII（cｙtochrome c II）遺伝子の配列を基に、その３´末端の一部を、日本産アサリに対し特異性を高めるために１塩基改変している。
【００１９】
（ＰＣＲを用いたアサリの産地判別方法）
【００２０】
試料として、２種類の産地が異なる中国産アサリと２種類の産地が異なる日本産アサリの計４種類のアサリを使用した。各アサリから貝柱（閉殻筋）を切除し、ｘｘ溶液中でこれを破砕し、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により、添付プロトコルにしたがって各ＤＮＡを抽出し溶液とした。
【００２１】
次に、滅菌蒸留水７３．５μｌ、１０ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ １０μｌ、ｄＮＴＰ ８μｌ、１０μＭ プライマー（配列番号１に示すプライマーおよび配列番号２に示すプライマー） 各２μｌ、Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）０．５μｌを混合した後、これを4本のチューブに分けた。次いで、１０倍に希釈した上記 各ＤＮＡ溶液をチューブに１μｌ加え、反応液（1反応あたり２５μｌ）を調整した。
【００２２】
調整した反応液を用いＰＣＲによる増幅を行った。ＰＣＲには、Ａｐｐｌｉｅｄ９7００（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を使用した。反応液の増幅は、９４℃で３分間熱変性をさせた後、９６℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の条件で４０サイクル行った。そして、得られたＰＣＲ産物を電気泳動することによって、増幅の確認をした。その結果、図１に示すように、日本産アサリのみ矢印で指す２３５ｂｐの位置にバンドが認められた。尚、図１において、レーン１は１００ｂｐサイズマーカーであり、レーン２、３はそれぞれ産地の異なる中国産アサリ、レーン４、５はそれぞれ産地の異なる日本産アサリの検出結果である。
【００２３】
以上のように、上述のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った後、電気泳動を行うことによって、その電気泳動パターンから、試料のアサリが日本産であるか否かを検出することができる。すなわち、産地が不明なアサリがある場合、試料のアサリから抽出したＤＮＡが上述のプライマーセットを用いてＰＣＲによって増幅されることが確認できるのであれば日本産と判別でき、増幅されることが確認できないのであれば日本産ではないと判別できる。
【００２４】
また、試料の濃度や量によって増幅量が変化するが、反応条件として４０サイクル以上行えば、確実に日本産アサリか否かが検出可能となる。
【００２５】
（リアルタイムＰＣＲを用いた産地判別方法）
【００２６】
試料として、２種類の産地が異なる中国産アサリと１０種類の産地が異なる日本産アサリの計１２種類のアサリを使用した。各アサリから、貝柱（閉殻筋）を切除し、ｘｘ溶液中でこれを破砕し、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により、添付プロトコルにしたがって各ＤＮＡを抽出し溶液とした。
【００２７】
次に、滅菌蒸留水７．２μｌ、１０ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ １０μｌ、ＳＹＢＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘ Ｔａｑ １０μｌ、１０μＭプライマー（配列番号１に示すプライマーおよび配列番号２に示すプライマー）各０．４μｌ、１０倍に希釈した上記ＤＮＡ溶液をチューブに２μｌ加え、反応液（１反応あたり２０μｌ）を調整した。
【００２８】
調整した反応液を用いリアルタイムＰＣＲによる増幅を行った。リアルタイムＰＣＲには、ＳＴ−３００（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を使用した。リアルタイムＰＣＲではＰＣＲ産物を蛍光により検出する。本実施形態においては、蛍光検出方法としてインターカレーターを用い蛍光物質としては、ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いた。尚、ハイブリダイゼーションプローブを用いることも可能である。
【００２９】
反応液の増幅は、９５℃で３０秒間の熱変性の後、９６℃で５秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で１５秒間の条件で行った。その結果、図２に示すように、３０サイクル以上の反応条件で、日本産アサリのみ増幅が確認され、中国産アサリは増幅が確認されなかった。
【００３０】
以上のように、上述のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによって、試料のアサリが日本産であるか否かを検出することができる。すなわち、産地が不明なアサリがある場合、試料のアサリから抽出したＤＮＡが上述のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲによって増幅されることが確認できるのであれば日本産と判別でき、増幅されることが確認できないのであれば日本産ではないと判別できる。
【００３１】
また、試料の濃度や量によって増幅量は変化するが、少なくとも反応条件として３０サイクル以上行えば、ほぼ確実に日本産アサリか否かが検出可能となる。
【００３２】
このようにリアルタイムＰＣＲを用いてもよく、ＰＣＲよりも安価で、迅速かつ高感度に日本産アサリか否かを判別することができる。
【００３３】
また、ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲを用いるアサリの産地判別において、１本のチューブに上述に記載したプライマーセットと増幅酵素が乾燥された状態で入ったものを検査キットとして使用することができる。ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲを行う場合には、この検査キットに規定量の水と試料を混ぜ、これをＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲにかければよい。このような検査キットにより、迅速かつ簡便にＰＣＲ操作を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】日本産及び中国産アサリを用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動パターンを示す図である。
【図２】日本産及び中国産アサリを用いて得られたリアルタイムＰＣＲの検出結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アサリの産地を判別するための日本産アサリ検出用プライマーセット及びアサリの産地判別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、国民の食の安心・安全に対する意識の高まりから、改正ＪＡＳ法による原材料並びに産地表示が義務付けられている。市場に流通しているアサリの半数以上は輸入品であるが、販売されているアサリの産地表示はそのほとんどが国内産地とされ、外国内産と表示されることは稀であるというのが現状である。
【０００３】
このような現状に対し、産地表示の適正化を図るため、アサリの産地を的確に判別する必要がある。例えば、貝の産地判別法としては、貝の外観による判別や、貝のアミノ酸成分比率によって産地を判別する方法がある（例えば特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００５−４９２５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、貝の外観による判別では熟練した技が必要であり、容易かつ確実に判別することは困難である。また、アミノ酸成分比率による産地判別方法では、判別に多くの時間と労力とを必要とする。
【０００５】
本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、アサリの産地が日本産か否かを容易に判別することができるアサリの産地判別方法及びこれに用いられる日本産アサリ検出用プライマーセットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の日本産アサリ検出用プライマーセットは、配列番号１で示される塩基配列を有する第１プライマーと、配列番号２で示される塩基配列を有する第２プライマーとを具備することを特徴とする。
【０００７】
本発明のこのような構成のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、アサリが日本産アサリが否かを判別することができる。すなわち、このような構成のプライマーセットを用いたＰＣＲでは、日本産アサリを試料としたＰＣＲ産物のみに増幅が確認されるため、増幅が確認できれば試料が日本産アサリであると判別でき、増幅が確認できなければ試料が日本産アサリでないことを判別することができる。
【０００８】
本発明のアサリの産地判別方法は、上述に記載のプライマーセットとアサリから抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、前記ＰＣＲで得られた産物を電気泳動することを特徴とする。
【０００９】
本発明のこのような構成によれば、日本産アサリを試料としたＰＣＲ産物のみに増幅が確認されるため、増幅が確認できれば試料が日本産アサリであると判別でき、増幅が確認できなければ試料が日本産アサリでないことを判別することができる。
【００１０】
本発明の他のアサリの産地判別方法は、上述に記載のプライマーセットとアサリから抽出したＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とする。
【００１１】
本発明のこのような構成によれば、日本産アサリを試料としたリアルタイムＰＣＲ産物のみに増幅が確認されるため、増幅が確認できれば試料が日本産アサリであると判別でき、増幅が確認できなければ試料が日本産アサリでないことを判別することができる。また、リアルタイムＰＣＲを用いることにより、安価でかつ迅速に判別を行うことができる。
【００１２】
また、前記リアルタイムＰＣＲにインターカレーター法を用いることを特徴とする。
【００１３】
このようにインターカレーター法を用いることにより、迅速性のみならず、経済性にも優れた判別を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態を図面に基づき説明する。
【００１５】
（プライマーセット）
【００１６】
本実施形態における日本産アサリ検出用プライマーセットは、配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとを具備する。
【００１７】
プライマー設計においては、アサリミトコンドリアＤＮＡの遺伝子配列から、日本産と中国産の判別を行うための標的として、配列番号３に示されるチトクロムｃII（cｙtochrome c II）の遺伝子がコードされている領域を選んだ。
【００１８】
配列番号１及び配列番号２からなるプライマーセットを用いてＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）又はリアルＰＣＲを使用することにより、日本産アサリのみ配列番号４に示される塩基配列部分が増幅される。配列番号１及び配列番号２それぞれに示されるプライマーは、配列番号３に示されるチトクロムｃII（cｙtochrome c II）遺伝子の配列を基に、その３´末端の一部を、日本産アサリに対し特異性を高めるために１塩基改変している。
【００１９】
（ＰＣＲを用いたアサリの産地判別方法）
【００２０】
試料として、２種類の産地が異なる中国産アサリと２種類の産地が異なる日本産アサリの計４種類のアサリを使用した。各アサリから貝柱（閉殻筋）を切除し、ｘｘ溶液中でこれを破砕し、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により、添付プロトコルにしたがって各ＤＮＡを抽出し溶液とした。
【００２１】
次に、滅菌蒸留水７３．５μｌ、１０ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ １０μｌ、ｄＮＴＰ ８μｌ、１０μＭ プライマー（配列番号１に示すプライマーおよび配列番号２に示すプライマー） 各２μｌ、Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）０．５μｌを混合した後、これを4本のチューブに分けた。次いで、１０倍に希釈した上記 各ＤＮＡ溶液をチューブに１μｌ加え、反応液（1反応あたり２５μｌ）を調整した。
【００２２】
調整した反応液を用いＰＣＲによる増幅を行った。ＰＣＲには、Ａｐｐｌｉｅｄ９7００（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を使用した。反応液の増幅は、９４℃で３分間熱変性をさせた後、９６℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の条件で４０サイクル行った。そして、得られたＰＣＲ産物を電気泳動することによって、増幅の確認をした。その結果、図１に示すように、日本産アサリのみ矢印で指す２３５ｂｐの位置にバンドが認められた。尚、図１において、レーン１は１００ｂｐサイズマーカーであり、レーン２、３はそれぞれ産地の異なる中国産アサリ、レーン４、５はそれぞれ産地の異なる日本産アサリの検出結果である。
【００２３】
以上のように、上述のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った後、電気泳動を行うことによって、その電気泳動パターンから、試料のアサリが日本産であるか否かを検出することができる。すなわち、産地が不明なアサリがある場合、試料のアサリから抽出したＤＮＡが上述のプライマーセットを用いてＰＣＲによって増幅されることが確認できるのであれば日本産と判別でき、増幅されることが確認できないのであれば日本産ではないと判別できる。
【００２４】
また、試料の濃度や量によって増幅量が変化するが、反応条件として４０サイクル以上行えば、確実に日本産アサリか否かが検出可能となる。
【００２５】
（リアルタイムＰＣＲを用いた産地判別方法）
【００２６】
試料として、２種類の産地が異なる中国産アサリと１０種類の産地が異なる日本産アサリの計１２種類のアサリを使用した。各アサリから、貝柱（閉殻筋）を切除し、ｘｘ溶液中でこれを破砕し、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により、添付プロトコルにしたがって各ＤＮＡを抽出し溶液とした。
【００２７】
次に、滅菌蒸留水７．２μｌ、１０ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ １０μｌ、ＳＹＢＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘ Ｔａｑ １０μｌ、１０μＭプライマー（配列番号１に示すプライマーおよび配列番号２に示すプライマー）各０．４μｌ、１０倍に希釈した上記ＤＮＡ溶液をチューブに２μｌ加え、反応液（１反応あたり２０μｌ）を調整した。
【００２８】
調整した反応液を用いリアルタイムＰＣＲによる増幅を行った。リアルタイムＰＣＲには、ＳＴ−３００（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を使用した。リアルタイムＰＣＲではＰＣＲ産物を蛍光により検出する。本実施形態においては、蛍光検出方法としてインターカレーターを用い蛍光物質としては、ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いた。尚、ハイブリダイゼーションプローブを用いることも可能である。
【００２９】
反応液の増幅は、９５℃で３０秒間の熱変性の後、９６℃で５秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で１５秒間の条件で行った。その結果、図２に示すように、３０サイクル以上の反応条件で、日本産アサリのみ増幅が確認され、中国産アサリは増幅が確認されなかった。
【００３０】
以上のように、上述のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによって、試料のアサリが日本産であるか否かを検出することができる。すなわち、産地が不明なアサリがある場合、試料のアサリから抽出したＤＮＡが上述のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲによって増幅されることが確認できるのであれば日本産と判別でき、増幅されることが確認できないのであれば日本産ではないと判別できる。
【００３１】
また、試料の濃度や量によって増幅量は変化するが、少なくとも反応条件として３０サイクル以上行えば、ほぼ確実に日本産アサリか否かが検出可能となる。
【００３２】
このようにリアルタイムＰＣＲを用いてもよく、ＰＣＲよりも安価で、迅速かつ高感度に日本産アサリか否かを判別することができる。
【００３３】
また、ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲを用いるアサリの産地判別において、１本のチューブに上述に記載したプライマーセットと増幅酵素が乾燥された状態で入ったものを検査キットとして使用することができる。ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲを行う場合には、この検査キットに規定量の水と試料を混ぜ、これをＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲにかければよい。このような検査キットにより、迅速かつ簡便にＰＣＲ操作を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】日本産及び中国産アサリを用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動パターンを示す図である。
【図２】日本産及び中国産アサリを用いて得られたリアルタイムＰＣＲの検出結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示される塩基配列を有する第１プライマーと、
配列番号２で示される塩基配列を有する第２プライマーと
を具備することを特徴とする日本産アサリ検出用プライマーセット。
【請求項２】
請求項１記載のプライマーセットとアサリから抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、前記ＰＣＲで得られた産物を電気泳動することを特徴とするアサリの産地判別方法。
【請求項３】
請求項１記載のプライマーセットとアサリから抽出したＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とするアサリの産地判別方法。
【請求項４】
前記リアルタイムＰＣＲにインターカレーター法を用いることを特徴とする請求項３記載のアサリの産地判別方法。
【請求項１】
配列番号１で示される塩基配列を有する第１プライマーと、
配列番号２で示される塩基配列を有する第２プライマーと
を具備することを特徴とする日本産アサリ検出用プライマーセット。
【請求項２】
請求項１記載のプライマーセットとアサリから抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、前記ＰＣＲで得られた産物を電気泳動することを特徴とするアサリの産地判別方法。
【請求項３】
請求項１記載のプライマーセットとアサリから抽出したＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことを特徴とするアサリの産地判別方法。
【請求項４】
前記リアルタイムＰＣＲにインターカレーター法を用いることを特徴とする請求項３記載のアサリの産地判別方法。
【図２】
【図１】
【図１】
【公開番号】特開２００８−２１２０９１（Ｐ２００８−２１２０９１Ａ）
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５６４１０（Ｐ２００７−５６４１０）
【出願日】平成１９年３月６日（２００７．３．６）
【出願人】（０００２２３１０４）東和科学株式会社 (9)
【出願人】（５０７０７２２７６）独立行政法人 水産総合研究センター (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月６日（２００７．３．６）
【出願人】（０００２２３１０４）東和科学株式会社 (9)
【出願人】（５０７０７２２７６）独立行政法人 水産総合研究センター (1)
【Ｆターム（参考）】
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