有用酵母のスクリーニング方法
【課題】目的の表現型を有する有用酵母のスクリーニング方法、特に、香味に優れた酒類を製造し得る醸造酵母のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】本発明は、目的とする表現型を有する酵母のスクリーニング方法であって、被験酵母に変異を誘導する工程、及び、前記変異誘導後の酵母を、プロトン非解離状態で酵母細胞内に拡散し得る有機酸の存在下で培養する工程を含む方法である。
【解決手段】本発明は、目的とする表現型を有する酵母のスクリーニング方法であって、被験酵母に変異を誘導する工程、及び、前記変異誘導後の酵母を、プロトン非解離状態で酵母細胞内に拡散し得る有機酸の存在下で培養する工程を含む方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異導入による有用酵母のスクリーニング方法に関する。例えば、本発明は、酒類等の製品のオフフレーバーとなるビシナルジケトン類の低生産型酵母のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類の香気成分のうち、ダイアセチル（以下「DA」ともいう）臭は、ビール、清酒及びワイン等の醸造酒における代表的オフフレーバーのひとつである。DA臭（ビールではムレ臭またはバター臭、清酒ではツワリ香とも表現される）は、DAを主とするビシナルジケトン類（以下「VDK」ともいう）が製品中にある閾値以上存在することによって発生する。ビールにおける閾値は、0.1 ppmといわれている（非特許文献１）。
酒類中のVDKは、DAと2,3-ペンタンジオン（以下「PD」ともいう）とに大別される。DA及びPDは、それぞれバリン及びイソロイシン生合成系中間産物のα-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸を前駆体として、酵母の関与しない非酵素的反応によって生成されるものである。
以上のことから、VDK（DA及びPD）及びその前駆体α-アセトヒドロキシ酸類（α-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸）などが、製品にDA臭をもたらし得る化合物として考えられている。したがって、これらの化合物を安定的に低減させる酵母の育種は酒類の製造管理を容易にするばかりでなく、新商品開発の可能性を広げることになる。
【０００３】
清酒製造では、例えば、α-アセトヒドロキシ酸類の前駆体となるピルビン酸濃度の低い酒母を用いることでDAの生成を抑制する方法が報告されている（特許文献１）。ビール製造についても、バリン・ロイシン・イソロイシン要求性酵母でVDK生成量が低減することが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、栄養要求性株では増殖及び発酵遅延が生じやすいことから、この酵母は未だ実用化には至っていない。一方、上記分岐アミノ酸（バリン・ロイシン・イソロイシン）のアナログに対して感受性となる変異株を取得し、それらの中からDA低蓄積株を選抜するという方法が開示されている（特許文献２）。さらに、実験室酵母に由来するILV5遺伝子の発現量を調節した遺伝子操作酵母や（非特許文献３）、同様に、ILV3遺伝子の発現量を調節した遺伝子操作酵母（非特許文献４）がそれぞれ報告されている。この場合、ILV5遺伝子がコードするアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの酵素活性は5〜7倍増加し、VDK生成量は4割程度まで減少した。また、ILV3遺伝子がコードするジヒドロキシ酸デヒドラターゼの酵素活性は5〜6倍増加したが、VDK生成量に有意な減少はみられなかった。ただし、上記2報告とも合成培地を用いており、実際のビール醸造への影響は解析されていない。Dulieuらは、α-アセト乳酸脱炭酸酵素を使用することでDAの前駆体となるα-アセト乳酸をアセトインに迅速に変換する方法を提案した（非特許文献５）。しかしながら、日本では、税制上、発酵中の醪に酵素を添加することはできない。これに対し、α-アセト乳酸脱炭酸酵素をコードするDNA鎖を用いた遺伝子操作酵母が報告されている（特許文献３、４）。
【０００４】
先にも述べた通り、VDK低生産株を選抜する方法として、上記分枝アミノ酸のアナログに対して感受性となる変異株を取得し、それらの中からVDK低生産株を選抜するという方法が開示されている（特許文献２）。しかしながら、この方法は分枝アミノ酸のアナログを含む培地で増殖が遅い株を取得しなければならないので、変異株の取得効率が良くないという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2001-204457号公報
【特許文献２】特開2002-291465号公報
【特許文献３】特開平2-265488号公報
【特許文献４】特開平7-171号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Journal of the Institute of Brewing, vol. 76、p. 48, 1970
【非特許文献２】Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, p. 94-99, 1973
【非特許文献３】Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, p. 81-84, 1987
【非特許文献４】European Brewery Convention, Proceedings of the 21st EBC congress, Madrid, p. 553-560, 1987
【非特許文献５】European Brewery Convention, Proceedings of the 26th EBC congress, Maastricht, p. 455-460, 1997
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、目的の表現型を有する有用酵母のスクリーニング方法を提供することにある。例えば、本発明は、目的の表現型として、ビシナルジケトン類の低生産型酵母のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、目的とする表現型の酵母を選択するにあたり、被験酵母に変異導入をした上で、特定の選択条件下で培養することによるスクリーニングを行えば、前述した課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）目的とする表現型を有する酵母のスクリーニング方法であって、被験酵母に変異を誘導する工程、及び、前記変異誘導後の酵母を、プロトン非解離状態で酵母細胞内に拡散し得る有機酸の存在下で培養する工程を含む、前記スクリーニング方法。
当該(1)の方法において、前記有機酸としては、例えば、ソルビン酸、安息香酸、デヒドロ酢酸及びプロピオン酸が挙げられる。
当該(1)の方法において、前記変異の誘導としては、例えば、好気条件下での培養により行われるものが挙げられる。ここで、当該培養としては、例えば、継代培養により行われるものが挙げられる。
当該(1)の方法において、前記目的とする表現型としては、例えば、ビシナルジケトン類の低生産型、発酵速度増加型、エキス消費速度増加型、有機酸高生産型、pH低下型、遊離アミノ態窒素消費速度増加型、アンモニア消費速度増加型、低沸点化合物低生産型、低沸点化合物高生産型、及び、連醸において次発酵までのタイムラグの少ない高活性型が挙げられる。ここで、当該ビシナルジケトン類としては、例えば、ダイアセチル及び２，３−ペンタンジオンが挙げられる。
【００１０】
（２）目的とする表現型を有する酵母のスクリーニング方法であって、被験酵母を好気条件下で培養する工程、及び、前記培養後の酵母を、前記表現型を有する酵母を選択可能な条件下で培養する工程を含む、前記スクリーニング方法。
当該(2)の方法において、前記培養としては、例えば、継代培養により行われるものが挙げられる。
当該(2)の方法において、前記目的とする表現型としては、例えば、ビシナルジケトン類の低生産型、発酵速度増加型、エキス消費速度増加型、有機酸高生産型、pH低下型、遊離アミノ態窒素消費速度増加型、アンモニア消費速度増加型、低沸点化合物低生産型、低沸点化合物高生産型、及び、連醸において次発酵までのタイムラグの少ない高活性型が挙げられる。ここで、当該ビシナルジケトン類としては、例えば、ダイアセチル及び２，３−ペンタンジオンが挙げられる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、目的の表現型を有する有用酵母のスクリーニング方法を提供することができる。例えば、本発明は、酒類等の製品のオフフレーバーとなるビシナルジケトン類の低生産型酵母を効率的にスクリーニングし得る方法を提供することができる。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、酒類等の製品及びその製造方法の改良のために用い得る有用酵母を提供することができる点で、極めて実用的かつ有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】SA4-4、SA3-7、SA2-5を用いたビール試験醸造におけるVDK濃度の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はVDK濃度（ppm）を示している。
【図２】SA4-4、SA3-7、SA2-5を用いたビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w %）を示している。
【図３】SA4-4、SA3-7、SA2-5を用いたビール試験醸造におけるFAN濃度の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸はFAN濃度（mg/100mL）を示している。
【図４】SA2-1を用いたビール試験醸造におけるVDK濃度の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はVDK濃度（ppm）を示している。
【図５】SA2-1を用いたビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w %）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００１４】
１．有用酵母のスクリーニング方法
1-1. 第1のスクリーニング方法
本発明の第1のスクリーニング方法は、目的とする表現型を有する酵母（所望の用途に有用な酵母等）のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法である。
(a) 被験酵母に変異を誘導する工程
(b) 上記変異誘導後の酵母を、プロトン非解離状態で酵母細胞内に拡散し得る有機酸の存在下で培養する工程
【００１５】
当該スクリーニング法は、選択培地としてソルビン酸等の特定の有機酸を含有する培地を用い、有用な変異株の取得効率の向上を達成し得るものである。ソルビン酸等の有機酸は、保存料として使われる有機酸の一種であり、プロトン非解離状態（低pH下）で酵母の細胞内へ拡散する。拡散したソルビン酸はよりpHの高い細胞内でプロトンが解離し、生成したアニオン及びプロトンにより酵母の増殖は阻害される。酵母はATPを使ってプロトン及びアニオンを外部へ排出するので、ソルビン酸等の有機酸耐性株の中には、ATP高生産株が存在すると考えられる。ATP高生産株は比較的多くのピルビン酸を呼吸に導くので、分枝アミノ酸経路は細くなりVDKの生産量は減少すると考えられる。さらに、ATP高生産株の中には、ATPを高生産するために麦汁中のエキスや遊離アミノ酸（FAN）の消費速度が速くなる株が存在すると考えられる。当該第1のスクリーニング法は、このような検討に基づいて完成されたものである。
【００１６】
1-1-1. 変異誘導工程
上記(a)の工程は、いわゆる変異誘導工程であり、目的とする表現型を有する酵母を取得するための前段階として、被験酵母から様々なバリエーションの変異酵母を得る工程である。ここで、変異とは、起源を同一にする細胞又はその集団間で見られる表現形質の相違のことを意味し、具体的には、遺伝子の点突然変異、転座、重複若しくは欠失又は染色体の増減等の染色体異常を含む遺伝子構成の相違により生じる表現形質を意味する。遺伝子変異は、１つの遺伝子に変異が生じたものには限定されず、２つ以上の遺伝子に変異が生じた多重変異も含まれる。なお、染色体の増減等の染色体異常の確認は、例えば、DNAマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション等の公知の手法を用いて行うことができる。
【００１７】
上記(a)工程における変異誘導の方法は、限定はされず、薬剤処理、紫外線（UV）照射、放射線照射、遺伝子組換え及び自然変異等による公知の種々の方法が適用され得る。これら変異誘導方法の中でも、操作が簡便で、安全・安心イメージの高い点で、自然変異による方法がより好ましい。自然変異による変異導入法としては、限定はされないが、例えば、好気条件下での培養が好ましい。当該培養としては、具体的には、振盪培養が好ましいが、その他にも、自然変異を誘発させ得る条件を満たす培養方法であれば本発明に適用することができ、例えば、酸素バブリング処理下での培養法や、好気条件下での静置培養法等が挙げられる。なお、本発明に適用可能な各種培養方法は、培地中の酸素分圧が、通常の好気培養条件下（37℃、1気圧）での培地中の酸素分圧より高く調整されていることが望ましい。ここで、自然変異をより多く誘発させ目的の表現型の酵母が得られる可能性を高める点で、上述した好気条件下での培養は継代培養であることが好ましく、具体的には、1代以上、好ましくは2代以上、より好ましくは3代以上の継代を行うことが好適である。
【００１８】
また、上記薬剤処理に用いられる薬剤としては、例えば、エチルメタンスルホネート（EMS）、N-メチル-N-ニトロソ尿素（MNU）、N-エチル-N-ニトロソ尿素（ENU）、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、ヒドロキシアミン、ニトロソアミン、N-メチル-N'-ニトロソグアニジン（MNNG）、ブロモデオキシウリジン（BrdU）、シスプラチン及びマイトマイシンC等が挙げられる。さらに、上記遺伝子組換えによる変異導入は、例えば、"Sambrook & Russell， Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol． 3， Cold Spring Harbor， Laboratory Press 2001"、"Ausubel， Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons 1987-1997"、"Nuc. Acids. Res., vol. 10, p. 6487, 1982"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 79, p. 6409, 1982"、"Gene, vol. 34, p. 315, 1985"、"Nuc. Acids. Res., vol. 13, p. 4431, 1985"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 82, p. 488, 1985"等に記載の部位特異的変異導入法等に準じて行うことができる。具体的には、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いて調製することができ、当該キットとしては、例えば、QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等が好ましく挙げられる。
【００１９】
1-1-2. 選択工程
上記(b)の工程は、いわゆる選択工程であり、上記(a)工程により得られた様々なバリエーションの変異酵母から目的の表現型を有する酵母を選択する工程である。本発明においては、特定の有機酸の存在下、すなわちプロトン非解離状態で酵母細胞内に拡散し得る有機酸の存在下で、培養を行うことにより、目的の表現型を有する酵母の選択を行うことが重要である。当該有機酸としては、例えば、ソルビン酸、安息香酸、デヒドロ酢酸及びプロピオン酸等を好ましく挙げることができ、中でもソルビン酸がより好ましい。これら有機酸は、１種のみ用いてもよいし２種以上を適宜併用してもよい。培地中における上記有機酸の濃度は、各々の有機酸が薬剤選択能を発揮し得る範囲で設定すればよく、限定はされないが、例えばソルビン酸を用いる場合は、0.1〜1.0mMであることが好ましい。また、上記(b)工程で使用する培地（選択培地）の形態は、限定はされないが、プレート培地及び液体培地等が好ましく挙げられ、中でもプレート培地がより好ましい。
【００２０】
本発明のスクリーニング方法においては、少なくとも上記(b)工程の培養で生育可能な変異酵母、好ましくは相対的に生育速度が大きい変異酵母が、目的とする表現型を有する酵母として取得され得る。ここで、目的とする酵母の表現型としては、ビシナルジケトン類の低生産型、発酵速度増加型、エキス消費速度増加型、有機酸高生産型、pH低下型、遊離アミノ態窒素（FAN）消費速度増加型、アンモニア消費速度増加型、低沸点化合物低生産型、低沸点化合物高生産型、及び、連醸において次発酵までのタイムラグの少ない高活性型等、並びにこれら表現型を組合せたものが好ましく挙げられ、中でも、ビシナルジケトン類の低生産型及び発酵速度増加型がより好ましい。ビシナルジケトン類の低生産型とは、酒類等の醸造時に発生する代表的なオフフレーバーの一つであるダイアセチル臭を効果的に低減することができる表現型である。ビシナルジケトン類としては、例えば、ダイアセチル及び２，３−ペンタンジオン等が好ましく挙げられる。また、上記有機酸高生産型における有機酸としては、例えば、クエン酸、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸等が好ましく挙げられ、上記低沸点化合物としては、例えば、酢酸イソアミル及び酢酸イソアルコール等が好ましく挙げられる。
【００２１】
本発明のスクリーニング方法において、目的とする表現型を有するかどうかの判断手法は、限定はされず、例えば、上記(b)工程後に得られた酵母株のうち相対的に発酵速度が大きいものを選択する方法や、ビシナルジケトン類の濃度が基準酵母を用いた場合に比べて低いものを選択する方法が挙げられる。基準酵母としては、例えば、本発明のスクリーニング方法に供する前の被験酵母そのものを用いることができる。
【００２２】
1-1-3. その他
本発明のスクリーニング方法に供する被験酵母（基準酵母も同様）としては、限定はされないが、任意の酵母（実用酵母）、例えば麦芽飲料（ビール等）、ワイン、蒸留酒（ウイスキーや焼酎等）及び清酒等の醸造用酵母やパン酵母、工業用アルコール生産酵母や有用タンパク質生産酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母（例えば、サッカロマイセス パストリアヌス、サッカロマイセス セレビシエ及びサッカロマイセス カールスベルゲンシス）が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisia）NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらに、ウイスキー酵母（例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等）、ワイン酵母（例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等）、清酒酵母（例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等）、パン酵母（例えばNBRC 0555、NBRC 1346、NBRC 2043等）も用いることができるが、限定はされない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（より具体的には、下面ビール醸造用酵母Saccharomyces pastorianus weihenstephan Nr. 164等）が好ましく用いられる。被験酵母や基準酵母は、上記酵母群から任意の組み合わせで選択してもよい。
なお、本発明は、上述した本発明のスクリーニング方法により得られる酵母も包含するものであり、例えば、ビシナルジケトン類の生産性が低下した酵母等が好ましく挙げられる。
【００２３】
1-2. 第2のスクリーニング方法
本発明の第2のスクリーニング方法は、目的とする表現型を有する酵母のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法である。
(c) 被験酵母を好気条件下で培養する工程
(d) 上記培養後の酵母を、前記表現型を有する酵母を選択可能な条件下で培養する工程
【００２４】
従来より、DNAを変異させる薬剤を用いて酵母を処理した後、目的形質を有する株を分離及び育種する方法が知られている。例えば、酵母を変異剤エチルメタンスルホネート（EMS）で処理した後、セルレニンやロイシンアナログを含有する培地でカプロン酸エチルと酢酸イソアミルを高生産する酵母を分離する方法（特開2002-253211号公報）や、EMSで変異処理を行った後、高濃度アルコール含有大麦麹汁において培養することにより、大麦焼酎もろみにおいて増殖速度が速くアルコール耐性を有する株を分離する方法（特開平6-62838号公報）が知られている。しかしながら、使用後の薬剤の処理など困難な作業を要し、また、前培養条件の検討や薬剤の濃度及び処理時間の検討など、非常に複雑な操作が必要であった。一方、薬剤に変わる変異導入法としてUV照射法知られているが、予め死滅率を酵母菌株毎に測定し、照射時間やその際の菌濃度、UV管からの距離等の設定を要するなど、困難な作業が多いのは薬剤処理と同様である。近年、消費者の安全意識及び安心意識の向上により、発癌性物質や発癌を誘導する紫外線照射等を用いた手法によるDNA変異は消費者にとって理解が得られにくく、当該手法により有用酵母を用いた製品は、消費者にとって好ましくないイメージを与える懸念がある。そのため、安全・安心イメージの高い手法による有用酵母の分離及び育種技術が求められており、この点で、当該第2のスクリーニング方法は好適な方法である。
【００２５】
1-2-1. 変異誘導工程
上記(c)の工程は、前記(a)工程と同様に、いわゆる変異誘導工程であり、目的とする表現型を有する酵母を取得するための前段階として、被験酵母から様々なバリエーションの表現形質の変異酵母を得る工程である。ここで、変異等の定義説明については、前記1-1-1.項における説明が同様に適用できる。
上記(c)工程では、自然変異による変異誘導を行うことが重要であり、具体的には好気条件下での培養法が適用されるが、当該培養法の詳細についても前記1-1-1.項における説明が同様に適用できる。
【００２６】
1-2-2. 選択工程
上記(d)工程は、前記(b)工程と同様に、いわゆる選択工程であり、上記(c)工程により得られた様々なバリエーションの変異酵母から目的の表現型を有する酵母を選択する工程である。上記(d)工程では、目的の表現型を有する酵母を選択可能なように適宜条件設定をした培養法を採用すればよく、当該培養法の種類等は特に限定はされない。目的とする酵母の表現型としては、例えば、ビシナルジケトン類の低生産型、発酵速度増加型、エキス消費速度増加型、有機酸高生産型、pH低下型、遊離アミノ態窒素（FAN）消費速度増加型、アンモニア消費速度増加型、低沸点化合物低生産型、低沸点化合物高生産型、及び、連醸において次発酵までのタイムラグの少ない高活性型等が好ましく挙げられる。ここで、上記ビシナルジケトン類、上記有機酸高生産型における有機酸、及び上記低沸点化合物の具体例としては、例えば、前記1-1-2.項における説明が同様に適用できる。
目的とする表現型を有するかどうかの判断手法は、限定はされず、例えば、上記(d)工程後に得られた酵母株のうち相対的に所望の特性が顕著に現れているものを選択する方法や、所望の特性が基準酵母を用いた場合に比べて顕著に現れているものを選択する方法が挙げられる。基準酵母としては、例えば、本発明のスクリーニング方法に供する前の被験酵母そのものを用いることができる。
【００２７】
1-2-3. その他
上述した本発明のスクリーニング方法に供する被験酵母（基準酵母も同様）については、前記1-1-3.項における説明が同様に適用できる。
なお、本発明は、上述した本発明のスクリーニング方法により得られる酵母も包含するものである。
【００２８】
２．酒類の製造方法
上述した本発明のスクリーニング方法により得られる酵母を用いることによって、例えば、所望の酒類でビシナルジケトン類（VDK）、特にダイアセチル（DA）の濃度を低く抑えることが可能となり、香味を増した酒類を製造することができる。対象となる酒類としては、例えば、麦芽飲料（ビール等）、ビールテイストドリンク、ワイン、蒸留酒（ウイスキー及び焼酎等）並びに清酒等が挙げられる。すなわち、上述した本発明のスクリーニング方法によって選択された酵母を用いて酒類製造のための発酵・醸造を行い、全ビシナルジケトン類（全ダイアセチル等）の生産量を低減することにより、所望の酒類において、全ビシナルジケトン類（全ダイアセチル等）の濃度が低減された酒類を製造することができる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明のスクリーニング方法により得られる酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。従って、原料、製造設備及び製造管理等は、従来法と同様でよく、VDK濃度、特にDA濃度を低く抑えた酒類を製造するためのコストを増加させる必要はない。すなわち、本発明によれば、香味安定性等に優れた酒類を、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。
なお、本発明は、上述した酒類の製造方法により得られる酒類も含むものである。
【００２９】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
下面ビール醸造用酵母Saccharomyces pastorianus weihenstephan Nr. 164を10mLのYPD培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース）に植菌し、好気的に振盪培養を8日間行い、その培養液1 mLを新しいYPD培地（10 mL）に植継ぎ、継代培養を4代続けた。振盪培養は1代目：7日間、2代目：6日間、3代目：6日間、4代目：8日間それぞれ行った。
0〜4代目の継代培養サンプルを100倍に希釈して、ソルビン酸（0.5 mM）を含むYPDプレート培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）に植菌し、30 ℃で培養した。約3週間後にソルビン酸培地上で良好に生育したと考えられる比較的大きなコロニーをピックアップした。この際のソルビン酸培地上における比較的大きなコロニー数および各継代サンプル中の酵母数を、下記表1に示した。サンプル中の酵母はメチレンブルーによって染色されないものをカウントした。表１に示すように、継代を重ねるほど特異的なコロニー数は増加した。
【００３１】
【表１】
【００３２】
ソルビン酸培地でピックアップされた選抜株（27株）を、下記表２の条件で麦汁発酵試験に供した。
【００３３】
【表２】
【００３４】
発酵液を経時的にサンプリングし、VDK濃度、酵母増殖量、外観エキス濃度の経時変化を観察した。また、発酵エンドの醪における低沸点化合物（LVC）と有機酸の濃度を測定した。醪中の全VDKの定量は、VDK（DA及びPD）をヒドロキシルアミンと反応させ、生成したグリオキシム誘導体と2価鉄イオンが反応して生じる錯体の吸光度を測定することによって行った（Drews et al., Mon. fur Brau., vol. 19, 34-36, 1966）。この際、前駆体であるα-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸をあらかじめガス洗い法（酸化的脱炭酸反応）によって、それぞれDA、PDに変換しておくことにより、これらを含めた全VDK量とした。
麦汁発酵試験の結果、3株（SA4-4、SA3-7、SA2-5）が親株と比較して低いVDK生成量を再現良く示した（図１）。SA4-4とSA2-5は親株の7割程度のVDK最大生成量であった。SA3-7は親株よりもVDK消費速度が速いので、短い発酵期間でVDKの閾値（約0.1ppm）へ到達した。これらVDK低生産株はエキスおよびFANの消費速度が速くなる傾向にあった（図２及び図３）。また、発酵試験を行った27株の中には、LVCを多く生産する株等、様々な発酵特性を示す株が含まれていた。
【００３５】
以下の手順で比較ゲノムハイブリダイゼーションにより、SA4-4、SA3-7、SA2-5の各株とS. pastorianus weihenstephan Nr. 164の染色体コピー数を比較した。まず、各株からゲノムDNAをQIAGEN Genomic Tip 100/G (#10243)およびQIAGEN Genomic DNA buffer set (#19060)を用いて、キットに添付のマニュアルに従って行った。このDNA 10μgをWinzelerらの方法“Science, vol. 281, p. 1194-1197, 1998”に従ってDNaseI（インビトロジェン社製）で消化し、ターミナルトランスフェラーゼ （ロッシュ社製）でビオチン化して、DNAマイクロアレイ（Affymetrix Gene Chip Yeast Genome S98 Array）にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションおよびアレイの輝度の検出はアフィメトリクス社製Gene Chip解析基本システムを用いて行った。それぞれから得たプローブの輝度を発現解析用ソフト（マイクロアレイスィート5.0）を用いて比較し、輝度の差をS. pastorianus weihenstephan Nr. 164を基準としたシグナル比(Signal log ratio)として算出した。次に各プローブのシグナル比を表計算ソフト（マイクロソフトExcel 2000）を用いて染色体ごとに整列させシグナル比を解析し、下記表３の通り、S. pastorianus weihenstephan Nr. 164と比較したコピー数の増減を＋と−で示した。表３の結果、各選抜株はS. pastorianus weihenstephan Nr. 164と比較して一部の染色体にコピー数の増減が見られた。
【００３６】
【表３】
【００３７】
更に、ソルビン酸培地でピックアップされた選抜株（27株）の中で、図３及び図４に示すように、親株と比較してVDK生産能にそれほど差異はないが、エキス消費が速くなった株であるSA2-1について、上述と同様に染色体コピー数の解析を行った。下記表４の通り、SA2-1は親株と比較して一部の染色体にコピー数の増減が見られた。
【００３８】
【表４】
【００３９】
以上の結果から、好気的振盪培養により酵母の染色体構造が変化し、育種技術として有効であることが示された。また、好気的振盪培養サンプルからソルビン酸培地によりVDK低生産株、エキス消費の速い株等の有能株が取得できることが示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異導入による有用酵母のスクリーニング方法に関する。例えば、本発明は、酒類等の製品のオフフレーバーとなるビシナルジケトン類の低生産型酵母のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類の香気成分のうち、ダイアセチル（以下「DA」ともいう）臭は、ビール、清酒及びワイン等の醸造酒における代表的オフフレーバーのひとつである。DA臭（ビールではムレ臭またはバター臭、清酒ではツワリ香とも表現される）は、DAを主とするビシナルジケトン類（以下「VDK」ともいう）が製品中にある閾値以上存在することによって発生する。ビールにおける閾値は、0.1 ppmといわれている（非特許文献１）。
酒類中のVDKは、DAと2,3-ペンタンジオン（以下「PD」ともいう）とに大別される。DA及びPDは、それぞれバリン及びイソロイシン生合成系中間産物のα-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸を前駆体として、酵母の関与しない非酵素的反応によって生成されるものである。
以上のことから、VDK（DA及びPD）及びその前駆体α-アセトヒドロキシ酸類（α-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸）などが、製品にDA臭をもたらし得る化合物として考えられている。したがって、これらの化合物を安定的に低減させる酵母の育種は酒類の製造管理を容易にするばかりでなく、新商品開発の可能性を広げることになる。
【０００３】
清酒製造では、例えば、α-アセトヒドロキシ酸類の前駆体となるピルビン酸濃度の低い酒母を用いることでDAの生成を抑制する方法が報告されている（特許文献１）。ビール製造についても、バリン・ロイシン・イソロイシン要求性酵母でVDK生成量が低減することが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、栄養要求性株では増殖及び発酵遅延が生じやすいことから、この酵母は未だ実用化には至っていない。一方、上記分岐アミノ酸（バリン・ロイシン・イソロイシン）のアナログに対して感受性となる変異株を取得し、それらの中からDA低蓄積株を選抜するという方法が開示されている（特許文献２）。さらに、実験室酵母に由来するILV5遺伝子の発現量を調節した遺伝子操作酵母や（非特許文献３）、同様に、ILV3遺伝子の発現量を調節した遺伝子操作酵母（非特許文献４）がそれぞれ報告されている。この場合、ILV5遺伝子がコードするアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの酵素活性は5〜7倍増加し、VDK生成量は4割程度まで減少した。また、ILV3遺伝子がコードするジヒドロキシ酸デヒドラターゼの酵素活性は5〜6倍増加したが、VDK生成量に有意な減少はみられなかった。ただし、上記2報告とも合成培地を用いており、実際のビール醸造への影響は解析されていない。Dulieuらは、α-アセト乳酸脱炭酸酵素を使用することでDAの前駆体となるα-アセト乳酸をアセトインに迅速に変換する方法を提案した（非特許文献５）。しかしながら、日本では、税制上、発酵中の醪に酵素を添加することはできない。これに対し、α-アセト乳酸脱炭酸酵素をコードするDNA鎖を用いた遺伝子操作酵母が報告されている（特許文献３、４）。
【０００４】
先にも述べた通り、VDK低生産株を選抜する方法として、上記分枝アミノ酸のアナログに対して感受性となる変異株を取得し、それらの中からVDK低生産株を選抜するという方法が開示されている（特許文献２）。しかしながら、この方法は分枝アミノ酸のアナログを含む培地で増殖が遅い株を取得しなければならないので、変異株の取得効率が良くないという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2001-204457号公報
【特許文献２】特開2002-291465号公報
【特許文献３】特開平2-265488号公報
【特許文献４】特開平7-171号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Journal of the Institute of Brewing, vol. 76、p. 48, 1970
【非特許文献２】Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, p. 94-99, 1973
【非特許文献３】Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, p. 81-84, 1987
【非特許文献４】European Brewery Convention, Proceedings of the 21st EBC congress, Madrid, p. 553-560, 1987
【非特許文献５】European Brewery Convention, Proceedings of the 26th EBC congress, Maastricht, p. 455-460, 1997
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、目的の表現型を有する有用酵母のスクリーニング方法を提供することにある。例えば、本発明は、目的の表現型として、ビシナルジケトン類の低生産型酵母のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、目的とする表現型の酵母を選択するにあたり、被験酵母に変異導入をした上で、特定の選択条件下で培養することによるスクリーニングを行えば、前述した課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）目的とする表現型を有する酵母のスクリーニング方法であって、被験酵母に変異を誘導する工程、及び、前記変異誘導後の酵母を、プロトン非解離状態で酵母細胞内に拡散し得る有機酸の存在下で培養する工程を含む、前記スクリーニング方法。
当該(1)の方法において、前記有機酸としては、例えば、ソルビン酸、安息香酸、デヒドロ酢酸及びプロピオン酸が挙げられる。
当該(1)の方法において、前記変異の誘導としては、例えば、好気条件下での培養により行われるものが挙げられる。ここで、当該培養としては、例えば、継代培養により行われるものが挙げられる。
当該(1)の方法において、前記目的とする表現型としては、例えば、ビシナルジケトン類の低生産型、発酵速度増加型、エキス消費速度増加型、有機酸高生産型、pH低下型、遊離アミノ態窒素消費速度増加型、アンモニア消費速度増加型、低沸点化合物低生産型、低沸点化合物高生産型、及び、連醸において次発酵までのタイムラグの少ない高活性型が挙げられる。ここで、当該ビシナルジケトン類としては、例えば、ダイアセチル及び２，３−ペンタンジオンが挙げられる。
【００１０】
（２）目的とする表現型を有する酵母のスクリーニング方法であって、被験酵母を好気条件下で培養する工程、及び、前記培養後の酵母を、前記表現型を有する酵母を選択可能な条件下で培養する工程を含む、前記スクリーニング方法。
当該(2)の方法において、前記培養としては、例えば、継代培養により行われるものが挙げられる。
当該(2)の方法において、前記目的とする表現型としては、例えば、ビシナルジケトン類の低生産型、発酵速度増加型、エキス消費速度増加型、有機酸高生産型、pH低下型、遊離アミノ態窒素消費速度増加型、アンモニア消費速度増加型、低沸点化合物低生産型、低沸点化合物高生産型、及び、連醸において次発酵までのタイムラグの少ない高活性型が挙げられる。ここで、当該ビシナルジケトン類としては、例えば、ダイアセチル及び２，３−ペンタンジオンが挙げられる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、目的の表現型を有する有用酵母のスクリーニング方法を提供することができる。例えば、本発明は、酒類等の製品のオフフレーバーとなるビシナルジケトン類の低生産型酵母を効率的にスクリーニングし得る方法を提供することができる。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、酒類等の製品及びその製造方法の改良のために用い得る有用酵母を提供することができる点で、極めて実用的かつ有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】SA4-4、SA3-7、SA2-5を用いたビール試験醸造におけるVDK濃度の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はVDK濃度（ppm）を示している。
【図２】SA4-4、SA3-7、SA2-5を用いたビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w %）を示している。
【図３】SA4-4、SA3-7、SA2-5を用いたビール試験醸造におけるFAN濃度の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸はFAN濃度（mg/100mL）を示している。
【図４】SA2-1を用いたビール試験醸造におけるVDK濃度の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はVDK濃度（ppm）を示している。
【図５】SA2-1を用いたビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w %）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００１４】
１．有用酵母のスクリーニング方法
1-1. 第1のスクリーニング方法
本発明の第1のスクリーニング方法は、目的とする表現型を有する酵母（所望の用途に有用な酵母等）のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法である。
(a) 被験酵母に変異を誘導する工程
(b) 上記変異誘導後の酵母を、プロトン非解離状態で酵母細胞内に拡散し得る有機酸の存在下で培養する工程
【００１５】
当該スクリーニング法は、選択培地としてソルビン酸等の特定の有機酸を含有する培地を用い、有用な変異株の取得効率の向上を達成し得るものである。ソルビン酸等の有機酸は、保存料として使われる有機酸の一種であり、プロトン非解離状態（低pH下）で酵母の細胞内へ拡散する。拡散したソルビン酸はよりpHの高い細胞内でプロトンが解離し、生成したアニオン及びプロトンにより酵母の増殖は阻害される。酵母はATPを使ってプロトン及びアニオンを外部へ排出するので、ソルビン酸等の有機酸耐性株の中には、ATP高生産株が存在すると考えられる。ATP高生産株は比較的多くのピルビン酸を呼吸に導くので、分枝アミノ酸経路は細くなりVDKの生産量は減少すると考えられる。さらに、ATP高生産株の中には、ATPを高生産するために麦汁中のエキスや遊離アミノ酸（FAN）の消費速度が速くなる株が存在すると考えられる。当該第1のスクリーニング法は、このような検討に基づいて完成されたものである。
【００１６】
1-1-1. 変異誘導工程
上記(a)の工程は、いわゆる変異誘導工程であり、目的とする表現型を有する酵母を取得するための前段階として、被験酵母から様々なバリエーションの変異酵母を得る工程である。ここで、変異とは、起源を同一にする細胞又はその集団間で見られる表現形質の相違のことを意味し、具体的には、遺伝子の点突然変異、転座、重複若しくは欠失又は染色体の増減等の染色体異常を含む遺伝子構成の相違により生じる表現形質を意味する。遺伝子変異は、１つの遺伝子に変異が生じたものには限定されず、２つ以上の遺伝子に変異が生じた多重変異も含まれる。なお、染色体の増減等の染色体異常の確認は、例えば、DNAマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション等の公知の手法を用いて行うことができる。
【００１７】
上記(a)工程における変異誘導の方法は、限定はされず、薬剤処理、紫外線（UV）照射、放射線照射、遺伝子組換え及び自然変異等による公知の種々の方法が適用され得る。これら変異誘導方法の中でも、操作が簡便で、安全・安心イメージの高い点で、自然変異による方法がより好ましい。自然変異による変異導入法としては、限定はされないが、例えば、好気条件下での培養が好ましい。当該培養としては、具体的には、振盪培養が好ましいが、その他にも、自然変異を誘発させ得る条件を満たす培養方法であれば本発明に適用することができ、例えば、酸素バブリング処理下での培養法や、好気条件下での静置培養法等が挙げられる。なお、本発明に適用可能な各種培養方法は、培地中の酸素分圧が、通常の好気培養条件下（37℃、1気圧）での培地中の酸素分圧より高く調整されていることが望ましい。ここで、自然変異をより多く誘発させ目的の表現型の酵母が得られる可能性を高める点で、上述した好気条件下での培養は継代培養であることが好ましく、具体的には、1代以上、好ましくは2代以上、より好ましくは3代以上の継代を行うことが好適である。
【００１８】
また、上記薬剤処理に用いられる薬剤としては、例えば、エチルメタンスルホネート（EMS）、N-メチル-N-ニトロソ尿素（MNU）、N-エチル-N-ニトロソ尿素（ENU）、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、ヒドロキシアミン、ニトロソアミン、N-メチル-N'-ニトロソグアニジン（MNNG）、ブロモデオキシウリジン（BrdU）、シスプラチン及びマイトマイシンC等が挙げられる。さらに、上記遺伝子組換えによる変異導入は、例えば、"Sambrook & Russell， Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol． 3， Cold Spring Harbor， Laboratory Press 2001"、"Ausubel， Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons 1987-1997"、"Nuc. Acids. Res., vol. 10, p. 6487, 1982"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 79, p. 6409, 1982"、"Gene, vol. 34, p. 315, 1985"、"Nuc. Acids. Res., vol. 13, p. 4431, 1985"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 82, p. 488, 1985"等に記載の部位特異的変異導入法等に準じて行うことができる。具体的には、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いて調製することができ、当該キットとしては、例えば、QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等が好ましく挙げられる。
【００１９】
1-1-2. 選択工程
上記(b)の工程は、いわゆる選択工程であり、上記(a)工程により得られた様々なバリエーションの変異酵母から目的の表現型を有する酵母を選択する工程である。本発明においては、特定の有機酸の存在下、すなわちプロトン非解離状態で酵母細胞内に拡散し得る有機酸の存在下で、培養を行うことにより、目的の表現型を有する酵母の選択を行うことが重要である。当該有機酸としては、例えば、ソルビン酸、安息香酸、デヒドロ酢酸及びプロピオン酸等を好ましく挙げることができ、中でもソルビン酸がより好ましい。これら有機酸は、１種のみ用いてもよいし２種以上を適宜併用してもよい。培地中における上記有機酸の濃度は、各々の有機酸が薬剤選択能を発揮し得る範囲で設定すればよく、限定はされないが、例えばソルビン酸を用いる場合は、0.1〜1.0mMであることが好ましい。また、上記(b)工程で使用する培地（選択培地）の形態は、限定はされないが、プレート培地及び液体培地等が好ましく挙げられ、中でもプレート培地がより好ましい。
【００２０】
本発明のスクリーニング方法においては、少なくとも上記(b)工程の培養で生育可能な変異酵母、好ましくは相対的に生育速度が大きい変異酵母が、目的とする表現型を有する酵母として取得され得る。ここで、目的とする酵母の表現型としては、ビシナルジケトン類の低生産型、発酵速度増加型、エキス消費速度増加型、有機酸高生産型、pH低下型、遊離アミノ態窒素（FAN）消費速度増加型、アンモニア消費速度増加型、低沸点化合物低生産型、低沸点化合物高生産型、及び、連醸において次発酵までのタイムラグの少ない高活性型等、並びにこれら表現型を組合せたものが好ましく挙げられ、中でも、ビシナルジケトン類の低生産型及び発酵速度増加型がより好ましい。ビシナルジケトン類の低生産型とは、酒類等の醸造時に発生する代表的なオフフレーバーの一つであるダイアセチル臭を効果的に低減することができる表現型である。ビシナルジケトン類としては、例えば、ダイアセチル及び２，３−ペンタンジオン等が好ましく挙げられる。また、上記有機酸高生産型における有機酸としては、例えば、クエン酸、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸等が好ましく挙げられ、上記低沸点化合物としては、例えば、酢酸イソアミル及び酢酸イソアルコール等が好ましく挙げられる。
【００２１】
本発明のスクリーニング方法において、目的とする表現型を有するかどうかの判断手法は、限定はされず、例えば、上記(b)工程後に得られた酵母株のうち相対的に発酵速度が大きいものを選択する方法や、ビシナルジケトン類の濃度が基準酵母を用いた場合に比べて低いものを選択する方法が挙げられる。基準酵母としては、例えば、本発明のスクリーニング方法に供する前の被験酵母そのものを用いることができる。
【００２２】
1-1-3. その他
本発明のスクリーニング方法に供する被験酵母（基準酵母も同様）としては、限定はされないが、任意の酵母（実用酵母）、例えば麦芽飲料（ビール等）、ワイン、蒸留酒（ウイスキーや焼酎等）及び清酒等の醸造用酵母やパン酵母、工業用アルコール生産酵母や有用タンパク質生産酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母（例えば、サッカロマイセス パストリアヌス、サッカロマイセス セレビシエ及びサッカロマイセス カールスベルゲンシス）が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisia）NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらに、ウイスキー酵母（例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等）、ワイン酵母（例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等）、清酒酵母（例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等）、パン酵母（例えばNBRC 0555、NBRC 1346、NBRC 2043等）も用いることができるが、限定はされない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（より具体的には、下面ビール醸造用酵母Saccharomyces pastorianus weihenstephan Nr. 164等）が好ましく用いられる。被験酵母や基準酵母は、上記酵母群から任意の組み合わせで選択してもよい。
なお、本発明は、上述した本発明のスクリーニング方法により得られる酵母も包含するものであり、例えば、ビシナルジケトン類の生産性が低下した酵母等が好ましく挙げられる。
【００２３】
1-2. 第2のスクリーニング方法
本発明の第2のスクリーニング方法は、目的とする表現型を有する酵母のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法である。
(c) 被験酵母を好気条件下で培養する工程
(d) 上記培養後の酵母を、前記表現型を有する酵母を選択可能な条件下で培養する工程
【００２４】
従来より、DNAを変異させる薬剤を用いて酵母を処理した後、目的形質を有する株を分離及び育種する方法が知られている。例えば、酵母を変異剤エチルメタンスルホネート（EMS）で処理した後、セルレニンやロイシンアナログを含有する培地でカプロン酸エチルと酢酸イソアミルを高生産する酵母を分離する方法（特開2002-253211号公報）や、EMSで変異処理を行った後、高濃度アルコール含有大麦麹汁において培養することにより、大麦焼酎もろみにおいて増殖速度が速くアルコール耐性を有する株を分離する方法（特開平6-62838号公報）が知られている。しかしながら、使用後の薬剤の処理など困難な作業を要し、また、前培養条件の検討や薬剤の濃度及び処理時間の検討など、非常に複雑な操作が必要であった。一方、薬剤に変わる変異導入法としてUV照射法知られているが、予め死滅率を酵母菌株毎に測定し、照射時間やその際の菌濃度、UV管からの距離等の設定を要するなど、困難な作業が多いのは薬剤処理と同様である。近年、消費者の安全意識及び安心意識の向上により、発癌性物質や発癌を誘導する紫外線照射等を用いた手法によるDNA変異は消費者にとって理解が得られにくく、当該手法により有用酵母を用いた製品は、消費者にとって好ましくないイメージを与える懸念がある。そのため、安全・安心イメージの高い手法による有用酵母の分離及び育種技術が求められており、この点で、当該第2のスクリーニング方法は好適な方法である。
【００２５】
1-2-1. 変異誘導工程
上記(c)の工程は、前記(a)工程と同様に、いわゆる変異誘導工程であり、目的とする表現型を有する酵母を取得するための前段階として、被験酵母から様々なバリエーションの表現形質の変異酵母を得る工程である。ここで、変異等の定義説明については、前記1-1-1.項における説明が同様に適用できる。
上記(c)工程では、自然変異による変異誘導を行うことが重要であり、具体的には好気条件下での培養法が適用されるが、当該培養法の詳細についても前記1-1-1.項における説明が同様に適用できる。
【００２６】
1-2-2. 選択工程
上記(d)工程は、前記(b)工程と同様に、いわゆる選択工程であり、上記(c)工程により得られた様々なバリエーションの変異酵母から目的の表現型を有する酵母を選択する工程である。上記(d)工程では、目的の表現型を有する酵母を選択可能なように適宜条件設定をした培養法を採用すればよく、当該培養法の種類等は特に限定はされない。目的とする酵母の表現型としては、例えば、ビシナルジケトン類の低生産型、発酵速度増加型、エキス消費速度増加型、有機酸高生産型、pH低下型、遊離アミノ態窒素（FAN）消費速度増加型、アンモニア消費速度増加型、低沸点化合物低生産型、低沸点化合物高生産型、及び、連醸において次発酵までのタイムラグの少ない高活性型等が好ましく挙げられる。ここで、上記ビシナルジケトン類、上記有機酸高生産型における有機酸、及び上記低沸点化合物の具体例としては、例えば、前記1-1-2.項における説明が同様に適用できる。
目的とする表現型を有するかどうかの判断手法は、限定はされず、例えば、上記(d)工程後に得られた酵母株のうち相対的に所望の特性が顕著に現れているものを選択する方法や、所望の特性が基準酵母を用いた場合に比べて顕著に現れているものを選択する方法が挙げられる。基準酵母としては、例えば、本発明のスクリーニング方法に供する前の被験酵母そのものを用いることができる。
【００２７】
1-2-3. その他
上述した本発明のスクリーニング方法に供する被験酵母（基準酵母も同様）については、前記1-1-3.項における説明が同様に適用できる。
なお、本発明は、上述した本発明のスクリーニング方法により得られる酵母も包含するものである。
【００２８】
２．酒類の製造方法
上述した本発明のスクリーニング方法により得られる酵母を用いることによって、例えば、所望の酒類でビシナルジケトン類（VDK）、特にダイアセチル（DA）の濃度を低く抑えることが可能となり、香味を増した酒類を製造することができる。対象となる酒類としては、例えば、麦芽飲料（ビール等）、ビールテイストドリンク、ワイン、蒸留酒（ウイスキー及び焼酎等）並びに清酒等が挙げられる。すなわち、上述した本発明のスクリーニング方法によって選択された酵母を用いて酒類製造のための発酵・醸造を行い、全ビシナルジケトン類（全ダイアセチル等）の生産量を低減することにより、所望の酒類において、全ビシナルジケトン類（全ダイアセチル等）の濃度が低減された酒類を製造することができる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明のスクリーニング方法により得られる酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。従って、原料、製造設備及び製造管理等は、従来法と同様でよく、VDK濃度、特にDA濃度を低く抑えた酒類を製造するためのコストを増加させる必要はない。すなわち、本発明によれば、香味安定性等に優れた酒類を、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。
なお、本発明は、上述した酒類の製造方法により得られる酒類も含むものである。
【００２９】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
下面ビール醸造用酵母Saccharomyces pastorianus weihenstephan Nr. 164を10mLのYPD培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース）に植菌し、好気的に振盪培養を8日間行い、その培養液1 mLを新しいYPD培地（10 mL）に植継ぎ、継代培養を4代続けた。振盪培養は1代目：7日間、2代目：6日間、3代目：6日間、4代目：8日間それぞれ行った。
0〜4代目の継代培養サンプルを100倍に希釈して、ソルビン酸（0.5 mM）を含むYPDプレート培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）に植菌し、30 ℃で培養した。約3週間後にソルビン酸培地上で良好に生育したと考えられる比較的大きなコロニーをピックアップした。この際のソルビン酸培地上における比較的大きなコロニー数および各継代サンプル中の酵母数を、下記表1に示した。サンプル中の酵母はメチレンブルーによって染色されないものをカウントした。表１に示すように、継代を重ねるほど特異的なコロニー数は増加した。
【００３１】
【表１】
【００３２】
ソルビン酸培地でピックアップされた選抜株（27株）を、下記表２の条件で麦汁発酵試験に供した。
【００３３】
【表２】
【００３４】
発酵液を経時的にサンプリングし、VDK濃度、酵母増殖量、外観エキス濃度の経時変化を観察した。また、発酵エンドの醪における低沸点化合物（LVC）と有機酸の濃度を測定した。醪中の全VDKの定量は、VDK（DA及びPD）をヒドロキシルアミンと反応させ、生成したグリオキシム誘導体と2価鉄イオンが反応して生じる錯体の吸光度を測定することによって行った（Drews et al., Mon. fur Brau., vol. 19, 34-36, 1966）。この際、前駆体であるα-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸をあらかじめガス洗い法（酸化的脱炭酸反応）によって、それぞれDA、PDに変換しておくことにより、これらを含めた全VDK量とした。
麦汁発酵試験の結果、3株（SA4-4、SA3-7、SA2-5）が親株と比較して低いVDK生成量を再現良く示した（図１）。SA4-4とSA2-5は親株の7割程度のVDK最大生成量であった。SA3-7は親株よりもVDK消費速度が速いので、短い発酵期間でVDKの閾値（約0.1ppm）へ到達した。これらVDK低生産株はエキスおよびFANの消費速度が速くなる傾向にあった（図２及び図３）。また、発酵試験を行った27株の中には、LVCを多く生産する株等、様々な発酵特性を示す株が含まれていた。
【００３５】
以下の手順で比較ゲノムハイブリダイゼーションにより、SA4-4、SA3-7、SA2-5の各株とS. pastorianus weihenstephan Nr. 164の染色体コピー数を比較した。まず、各株からゲノムDNAをQIAGEN Genomic Tip 100/G (#10243)およびQIAGEN Genomic DNA buffer set (#19060)を用いて、キットに添付のマニュアルに従って行った。このDNA 10μgをWinzelerらの方法“Science, vol. 281, p. 1194-1197, 1998”に従ってDNaseI（インビトロジェン社製）で消化し、ターミナルトランスフェラーゼ （ロッシュ社製）でビオチン化して、DNAマイクロアレイ（Affymetrix Gene Chip Yeast Genome S98 Array）にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションおよびアレイの輝度の検出はアフィメトリクス社製Gene Chip解析基本システムを用いて行った。それぞれから得たプローブの輝度を発現解析用ソフト（マイクロアレイスィート5.0）を用いて比較し、輝度の差をS. pastorianus weihenstephan Nr. 164を基準としたシグナル比(Signal log ratio)として算出した。次に各プローブのシグナル比を表計算ソフト（マイクロソフトExcel 2000）を用いて染色体ごとに整列させシグナル比を解析し、下記表３の通り、S. pastorianus weihenstephan Nr. 164と比較したコピー数の増減を＋と−で示した。表３の結果、各選抜株はS. pastorianus weihenstephan Nr. 164と比較して一部の染色体にコピー数の増減が見られた。
【００３６】
【表３】
【００３７】
更に、ソルビン酸培地でピックアップされた選抜株（27株）の中で、図３及び図４に示すように、親株と比較してVDK生産能にそれほど差異はないが、エキス消費が速くなった株であるSA2-1について、上述と同様に染色体コピー数の解析を行った。下記表４の通り、SA2-1は親株と比較して一部の染色体にコピー数の増減が見られた。
【００３８】
【表４】
【００３９】
以上の結果から、好気的振盪培養により酵母の染色体構造が変化し、育種技術として有効であることが示された。また、好気的振盪培養サンプルからソルビン酸培地によりVDK低生産株、エキス消費の速い株等の有能株が取得できることが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とする表現型を有する酵母のスクリーニング方法であって、
被験酵母に変異を誘導する工程、及び
前記変異誘導後の酵母を、プロトン非解離状態で酵母細胞内に拡散し得る有機酸の存在下で培養する工程
を含む、前記スクリーニング方法。
【請求項２】
前記有機酸が、ソルビン酸、安息香酸、デヒドロ酢酸及びプロピオン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記変異の誘導が、好気条件下での培養により行われるものである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
目的とする表現型を有する酵母のスクリーニング方法であって、
被験酵母を好気条件下で培養する工程、及び
前記培養後の酵母を、前記表現型を有する酵母を選択可能な条件下で培養する工程
を含む、前記スクリーニング方法。
【請求項５】
前記培養が継代培養により行われるものである、請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
前記目的とする表現型が、ビシナルジケトン類の低生産型、発酵速度増加型、エキス消費速度増加型、有機酸高生産型、pH低下型、遊離アミノ態窒素消費速度増加型、アンモニア消費速度増加型、低沸点化合物低生産型、低沸点化合物高生産型、及び、連醸において次発酵までのタイムラグの少ない高活性型からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ビシナルジケトン類が、ダイアセチル及び／又は２，３−ペンタンジオンである、請求項６記載の方法。
【請求項１】
目的とする表現型を有する酵母のスクリーニング方法であって、
被験酵母に変異を誘導する工程、及び
前記変異誘導後の酵母を、プロトン非解離状態で酵母細胞内に拡散し得る有機酸の存在下で培養する工程
を含む、前記スクリーニング方法。
【請求項２】
前記有機酸が、ソルビン酸、安息香酸、デヒドロ酢酸及びプロピオン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記変異の誘導が、好気条件下での培養により行われるものである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
目的とする表現型を有する酵母のスクリーニング方法であって、
被験酵母を好気条件下で培養する工程、及び
前記培養後の酵母を、前記表現型を有する酵母を選択可能な条件下で培養する工程
を含む、前記スクリーニング方法。
【請求項５】
前記培養が継代培養により行われるものである、請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
前記目的とする表現型が、ビシナルジケトン類の低生産型、発酵速度増加型、エキス消費速度増加型、有機酸高生産型、pH低下型、遊離アミノ態窒素消費速度増加型、アンモニア消費速度増加型、低沸点化合物低生産型、低沸点化合物高生産型、及び、連醸において次発酵までのタイムラグの少ない高活性型からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ビシナルジケトン類が、ダイアセチル及び／又は２，３−ペンタンジオンである、請求項６記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−１９３８５９（Ｐ２０１０−１９３８５９Ａ）
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４５９１５（Ｐ２００９−４５９１５）
【出願日】平成２１年２月２７日（２００９．２．２７）
【出願人】（３０９００７９１１）サントリーホールディングス株式会社 (307)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２７日（２００９．２．２７）
【出願人】（３０９００７９１１）サントリーホールディングス株式会社 (307)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]