核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤及びスクリーニング方法
【課題】核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤及びスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー又はその誘導体からなる群から選択される化合物からなる、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤、及び、被検物質の存在下及び非存在下で、固相化されたＨＭＧＢタンパクを放置するステップと、ＨＭＧＢタンパクに標識核酸を接触させるステップと、ＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸を定量するステップと、被検物質の存在下で放置したＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸が、被検物質の非存在下で放置したＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸よりも少ない場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定し、多い場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤であると判定する判定ステップと、を含む、スクリーニング方法。
【解決手段】塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー又はその誘導体からなる群から選択される化合物からなる、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤、及び、被検物質の存在下及び非存在下で、固相化されたＨＭＧＢタンパクを放置するステップと、ＨＭＧＢタンパクに標識核酸を接触させるステップと、ＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸を定量するステップと、被検物質の存在下で放置したＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸が、被検物質の非存在下で放置したＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸よりも少ない場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定し、多い場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤であると判定する判定ステップと、を含む、スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤、及び、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫応答とその制御において、自己と非自己の識別はその根幹を担っている。自然免疫系及び適応免疫系は、それぞれに特有の機構によってこの識別を担うとともに、自己に応答しない仕組み、いわゆる免疫寛容を確立・維持している。
【０００３】
適応免疫系においては、ランダムな抗原受容体を発現するリンパ球レパートリーを構築後、ほとんどの自己反応性リンパ球が中枢性寛容機構によって排除され、末梢になお残存する自己反応性リンパ球は、末梢性寛容機構によって抑制されることが明らかにされてきた。
【０００４】
一方、自然免疫系には不明な点が多く、核酸により活性化される自然免疫応答を担う分子群として、Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＩＧ−Ｉ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＤＡＩ、ＡＩＭ２などの受容体分子群が同定されてきたが、未だにその全貌は不明である（例えば非特許文献１〜３を参照）。
【０００５】
ＨＭＧＢ（ｈｉｇｈ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏｘ）タンパクには、ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２及びＨＭＧＢ３が存在することが知られている。これらのＨＭＧＢタンパクは、核内に多く存在し、クロマチン構造や転写の制御に関わっていると考えられている。また、細胞質や細胞外にも存在することが知られている。
【０００６】
特許文献１には、細胞外に分泌されたＨＭＧＢ１タンパクと、細胞表面の最終糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）との結合を阻害する、合成二本鎖核酸又は核酸アナログ分子が記載されている。
特許文献２には、細胞外に分泌されたＨＭＧＢ１タンパクとＲＡＧＥの相互作用を阻害する、ＨＭＧＢ１アンタゴニストが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００８−５０４３３５号広報
【特許文献２】特表２００９−５１７４０４号広報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋａｗａｉ Ｔ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：１３１−１３７，２００６．
【非特許文献２】Ｙｏｎｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２８２：１５３１５−１５３１８，２００７．
【非特許文献３】Ｂｕｒｃｋｓｔｕｍｍｅｒ Ｔ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２６６−２７２，２００９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、核酸による自然免疫系の活性化機構を解明し、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤及びそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー又はその誘導体からなる、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤を提供する。
実施例で示すように、発明者は、核酸により活性化される自然免疫応答にはＨＭＧＢタンパクが必須であることを明らかにした。発明者はさらに、上記の化合物（塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー又はその誘導体）が、ＨＭＧＢタンパクに強く結合することによって、他の核酸による自然免疫応答の活性化を強力に抑制することを明らかにした。したがって、上記の化合物は、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤として有用である。
【００１１】
本発明の抑制剤は、細胞内において、自然免疫応答を活性化する核酸とＨＭＧＢタンパクとの結合を阻害することにより、核酸による自然免疫応答の活性化を強力に抑制する。すなわち、本発明の抑制剤は、従来知られていた細胞外のＨＭＧＢタンパクによる免疫応答の活性化を抑制するものではなく、発明者が今回初めて明らかにした機構に基づいて、細胞内のＨＭＧＢタンパクを介した、核酸による自然免疫応答の活性化を抑制するものである。
【００１２】
核酸により活性化される自然免疫応答としては、死細胞による過剰な免疫応答、移植臓器拒絶反応、自己免疫疾患、アレルギー、敗血症、炎症による腫瘍の増殖、核酸含有病原体により引き起こされる炎症性疾患などが例示される。したがって、本発明の抑制剤を投与することにより、ヒト及び動物において、これらの症状を改善することができる。
【００１３】
別の態様において、本発明は、被検物質の存在下及び非存在下で、ＨＭＧＢタンパクと、標識核酸とを混合する混合ステップと、標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクを定量する定量ステップと、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも少ない場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも多い場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含む、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法を提供する。
このスクリーニング方法により、発明者が今回初めて明らかにした、核酸による自然免疫応答の活性化の新たな機構に基づいた、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニングが可能となる。
【００１４】
別の態様において、本発明は、被検物質の存在下及び非存在下で、固相化されたＨＭＧＢタンパクを放置する放置（インキュベーション）ステップと、放置ステップ後の固相化されたＨＭＧＢタンパクに、標識核酸を接触させる、標識核酸接触ステップと、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸を定量する定量ステップと、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも少ない場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも多い場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含む、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法を提供する。
このスクリーニング方法により、より簡便に、効率よく、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニングを行うことができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、核酸により活性化される自然免疫応答、すなわち、死細胞による過剰な免疫応答、移植臓器拒絶反応、自己免疫疾患、アレルギー、敗血症、炎症による腫瘍の増殖、核酸含有病原体により引き起こされる炎症性疾患などの新たな原理に基づいた抑制剤が提供される。本発明の別の態様において、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１の結果を示すグラフである。
【図２】実施例２の結果を示すグラフである。
【図３】実施例３の結果を示すグラフである。
【図４】実施例４の結果を示すグラフである。
【図５】実施例５の結果を示す写真である。
【図６】実施例６の結果を示す写真である。
【図７】実施例７の結果を示すグラフである。
【図８】実施例８の結果を示すグラフである。
【図９】実施例９の結果を示すグラフである。
【図１０】実施例１０の結果を示すグラフである。
【図１１】実施例１１の結果を示すグラフである。
【図１２】実施例１２の結果を示す写真である。
【図１３】実施例１３の結果を示す写真である。
【図１４】実施例１４の結果を示す写真である。
【図１５】実施例１５の結果を示す写真である。
【図１６】実施例１６の結果を示すグラフである。
【図１７】実施例１７の結果を示すグラフである。
【図１８】実施例１８の結果を示すグラフである。
【図１９】実施例１９の結果を示すグラフである。
【図２０】実施例２０の結果を示すグラフである。
【図２１】実施例２１の結果を示す写真である。
【図２２】実施例２２の結果を示すグラフである。
【図２３】実施例２３の結果を示す写真である。
【図２４】実施例２４の結果を示すグラフである。
【図２５】実施例２５の結果を示すグラフである。
【図２６】実施例２６の結果を示すグラフである。
【図２７】実施例２７の結果を示すグラフである。
【図２８】実施例２８の結果を示す写真である。
【図２９】実施例２９の結果を示すグラフである。
【図３０】実施例３０の結果を示すグラフである。
【図３１】実施例３１の結果を示すグラフである。
【図３２】実施例３２の結果を示すグラフである。
【図３３】実施例３３の結果を示すグラフである。
【図３４】実施例３４の結果を示すグラフである。
【図３５】実施例３５の結果を示すグラフである。
【図３６】実施例３６の結果を示すグラフである。
【図３７】実施例３７の結果を示すグラフである。
【図３８】実施例３８の結果を示すグラフである。
【図３９】実施例３９の結果を示すグラフである。
【図４０】実施例４０の結果を示すグラフである。
【図４１】実施例４１の結果を示す写真である。
【図４２】実施例４２の結果を示す写真である。
【図４３】核酸により活性化される自然免疫応答の概略図である。
【図４４】核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤のスクリーニング方法の一つの態様を示す図である。
【図４５】実施例４３の結果を示す写真（ａ）及びグラフ（ｂ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、発明者が新たに解明した機構に基づいた、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤を提供する。この抑制剤は、塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー（以下、ＰＳという場合がある。）又はその誘導体からなるものである。
【００１８】
ＰＳとは、化学式（Ｃ５Ｈ８Ｏ４ＰＳ）ｎで表される化合物であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体から塩基部分を除いた構造を持つ。ｎは１０〜１００であることが好ましく、１５〜２５であることがより好ましい。
ＰＳ又はその誘導体は、核酸合成装置などを用いて合成したものでもよく、北海道システムサイエンスやファスマックなどのメーカーから購入したものでもよい。
ＰＳの誘導体とは、ＰＳのデオキシリボースをリボースに変換したものや、塩基を有する通常のオリゴヌクレオチドであって、免疫原性を有しないものを意味する。免疫原性を有しないオリゴヌクレオチドとは、例えば、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない１５〜２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。１００ｍｅｒを超える長さのオリゴヌクレオチドは免疫源性を有する場合がある。
【００１９】
実施例に示すように、ＰＳは、インビトロにおいて、０．１〜５０μＭ、より好ましくは１〜１０μＭ、特に好ましくは５μＭの濃度で投与することにより、核酸により活性化される自然免疫応答を抑制することができる。この結果は、そのままインビボにも適用することができる。
ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮについても、実施例に示すように、インビトロにおいて、０．１〜１０μＭ、より好ましくは０．３〜３μＭ、特に好ましくは１μＭの濃度で投与することにより、核酸により活性化される自然免疫応答を抑制することができる。この結果は、そのままインビボにも適用することができる。
【００２０】
核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤を臨床で使用する際には、抑制剤に、賦形剤、安定化剤、保存剤、緩衝剤、溶解補助剤、乳化剤、希釈剤、等張化剤などの添加剤が適宜混合されていてもよい。投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などによる経口剤、注射剤、坐剤、液剤などによる非経口剤、あるいは軟膏剤、クリーム剤、貼付剤などによる局所投与などを挙げることができる。抑制剤の使用量は症状、年齢、体重、投与方法等に応じて適宜選択される。
【００２１】
自然免疫応答を活性化する核酸とは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ）、５’三リン酸化ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ウイルスＤＮＡ、微生物ＤＮＡ（微生物由来のＤＮＡ）、真核生物ＤＮＡ、Ｂ−ＤＮＡ（通常のＤＮＡの立体構造をとった合成ＤＮＡ、Ｂ型ＤＮＡ）ＩＳＤ（ＩＦＮ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ＤＮＡ）、非メチル化オリゴヌクレオチドなどを意味する。ＩＳＤとは、４５塩基の合成ＤＮＡであり、ＩＳＤを細胞内に導入するとＩ型ＩＦＮ誘導が起こるが、これはＴＬＲ非依存性に、ＩＲＦ−３の活性化を介して行われることが知られている。
本明細書において、これらの自然免疫応答を活性化する核酸を総称して「全ての免疫性核酸」と呼ぶ場合がある。
【００２２】
核酸により活性化される自然免疫応答としては、死細胞による過剰な免疫応答、移植臓器拒絶反応、自己免疫疾患、アレルギー、敗血症、炎症による腫瘍の増殖、核酸含有病原体により引き起こされる炎症性疾患が例示される。これらの自然免疫応答は不利益をもたらす例である。ここで、過剰な免疫応答とは、例えば肝臓の壊死性炎症のように、ウイルス感染、循環異常や代謝異常、単純炎症反応などの外的要因で壊死した細胞が炎症を誘発し、さらにこの炎症が新たな細胞の壊死を引き起こすという負の連鎖反応を意味する。また、死細胞は、壊死細胞であることが好ましい。また、核酸含有病原体とは、ウイルス、微生物、寄生虫などを意味する。
【００２３】
これらの核酸をリポフェクトアミン（商品名、インビトロジェン社）やＤＯＴＡＰ（商品名、ロシュ社）などの陽イオン性脂質を用いて細胞の細胞質内に投与すると、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α１、ＩＦＮ−α４などのＩ型ＩＦＮ（インターフェロン）やケモカイン、炎症性サイトカインの遺伝子発現を誘導し、免疫応答が惹起されることが知られている。
【００２４】
インビトロ実験においては、非メチル化オリゴヌクレオチドとしてＣｐＧ オリゴデオキシリボヌクレオチド（以下、ＣｐＧ ＯＤＮという場合がある。）が、ｄｓＲＮＡとしてｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）が、ｓｓＲＮＡとしてｐｏｌｙ（Ｕ）が、Ｂ−ＤＮＡとしてｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）・（ｄＴ：ｄＡ）などが用いられる場合がある。
ＣｐＧ ＯＤＮとは、細菌ＤＮＡに出現頻度の高い、非メチル化シトシン・グアニンジヌクレオチド（５’−ＣｐＧ−３’）モチーフを含む合成オリゴヌクレオチドである。ＣｐＧ ＯＤＮにはポリＧテールを有するＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ（Ｄ型とも言われる。）や、Ｂ細胞を強力に活性化し、Ｔｈ１型サイトカインの産生を誘導するＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ（Ｋ型とも言われる。）などが存在する。ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮとしては、例えば、５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’（配列番号１）などの配列を有するものが使用可能である。また、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮとしては、例えば、５’−ＧＧＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＧＧ−３’（配列番号２）などの配列を有するものが使用可能である。これらのＣｐＧ ＯＤＮは、部分的にリン酸ジエステル結合をホスホロチオエート結合などに変換した構造を持つものであってもよい。
ＣｐＧ ＯＤＮは１０〜３０ｍｅｒのものが好ましく、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は１０〜１００００ｍｅｒのものが好ましく、ｐｏｌｙ（Ｕ）は１０〜１００００ｍｅｒのものが好ましく、ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）・（ｄＴ：ｄＡ）は１０〜１００００ｍｅｒのものが好ましい。
【００２５】
別の態様において、本発明は、被検物質の存在下及び非存在下で、ＨＭＧＢタンパクと、標識核酸とを混合する混合ステップと、標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクを定量する定量ステップと、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量と、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量とを比較し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下における標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも少ない場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも多い場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含む、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法を提供する。
【００２６】
混合ステップにおいて、ＨＭＧＢタンパクとしては、ＨＭＧＢ１、２又は３の組換え体をいずれも好適に使用できる。発明者は、ＨＭＧＢタンパクが、全ての免疫性核酸に結合することを初めて明らかにした。
【００２７】
標識核酸としては特に制限はないが、ＣｐＧ ＯＤＮ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ｐｏｌｙ（Ｕ）、Ｂ−ＤＮＡ、５’三リン酸化ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡなどの合成核酸、ＨＳＶ−１やワクシニアウイルスＤＮＡなどのウイルスＤＮＡ、微生物ＤＮＡ、ウシ胸腺ＤＮＡなどが例示できる。しかしながら、より均質であることから合成核酸であることがより好ましい。上記の合成核酸は１０〜１００ｍｅｒであることが好ましく、１５〜２５ｍｅｒであることがより好ましい。標識には特に制限はなく、ビオチン、ＦＩＴＣなどの蛍光色素、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、放射性同位元素などで行われてよい。
【００２８】
被検物質としては、特に制限はなく、核酸、核酸類似体、タンパク、低分子化合物などを使用できる。混合ステップにおいて、被検物質の濃度は、０．１〜１００μＭであることが好ましい。また、ＨＭＧＢタンパクの濃度は１〜２００μｇ／ｍｌであることが好ましい。また、標識核酸の濃度は０．１〜１００μＭであることが好ましい。これらを適切なプロテアーゼ阻害剤を含むバッファーなどの溶媒中で混合し、０．５〜２４時間反応させることが好ましい。
【００２９】
定量ステップは、ストレプトアビジン結合磁性ビーズや、抗ＦＩＴＣ抗体結合磁性ビーズなどを用いたプルダウンアッセイによって行ってもよいし、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ（ＥＭＳＡ）などによって行ってもよい。
例えば、標識核酸にビオチン標識核酸を用い、ストレプトアビジン結合磁性ビーズを用いたプルダウンアッセイを行う場合、混合ステップにより得られたサンプルにストレプトアビジン結合磁性ビーズを添加し、サンプル中のビオチン標識核酸をストレプトアビジン結合磁性ビーズに結合させる。続いて、磁性ビーズの磁気を利用して、標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクを回収する。回収したサンプルを、例えばＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した後、ゲル上のＨＭＢＧタンパクを、例えばＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＨＭＧＢ抗体を用いて染色した後、デンシトメトリー解析などにより定量することができる。
【００３０】
判定ステップにおいて、被検物質の存在下及び非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量を比較し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下における標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも少ない場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定する。また、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下における標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも多い場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤であると判定する。
【００３１】
別の態様において、本発明は、被検物質の存在下及び非存在下で、固相化されたＨＭＧＢタンパクを放置する放置（インキュベーション）ステップと、放置ステップ後の固相化されたＨＭＧＢタンパクに、標識核酸を接触させる、標識核酸接触ステップと、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸を定量する定量ステップと、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも少ない場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも多い場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含む、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法を提供する。
このスクリーニング方法により、より簡便に、効率よく、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニングを行うことができる。
【００３２】
放置ステップでは、固相化されたＨＭＧＢタンパクを被検物質の存在下及び非存在下で放置する。ＨＭＧＢタンパクとしては、ＨＭＧＢ１、２又は３の組換え体をいずれも好適に使用できる。
【００３３】
ＨＭＧＢタンパクは固相担体にあらかじめ固相化して使用する。固相担体としては、特に制限されないが、例えば、ガラス、セラミックス、金属酸化物等の無機物質、天然高分子、合成高分子等からなり、マイクロプレート、マイクロチップ、ビーズ、フィルム、シートなどの形態のものが利用できる。固相担体は、表面がアミノ基（−ＮＨ2）やカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）等の官能基で修飾されていてもよい。
【００３４】
例えば、固相担体として、９６ウェルマイクロプレートを用いる場合、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液に１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で溶解したＨＭＧＢタンパクの溶液を、マイクロプレートの各ウェルに分注し、４〜３７℃で０．５〜２４時間放置することにより、ＨＭＧＢタンパクを固相化することができる。このマイクロプレートは、使用前にＰＢＳなどの緩衝液で洗浄し、結合しなかったＨＭＧＢタンパクを除去することが好ましい。また、非特異的な吸着を抑制するために、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ（２％ＢＳＡ−ＰＢＳ）などの緩衝液を添加してブロッキングすることが好ましい。
【００３５】
被検物質としては、特に制限はなく、核酸、核酸類似体、タンパク、低分子化合物などを使用できる。被検物質の溶媒としては、ＰＢＳなどの緩衝液を用いることができる。被検物質の非存在下で放置ステップを行う場合には、被検物質を含まない緩衝液のみを用いればよい。放置ステップにおける被検物質の濃度は、０．１〜１００μＭであることが好ましい。また、放置ステップにおいて、対照物質の存在下で放置ステップを行う試験群を設けてもよい。対照物質としては、ＨＭＧＢタンパクに結合することが分かっている核酸や、結合しないことが分かっている化合物などを用いることができ、例えば、ＨＭＧＢタンパクに結合することが分かっているものとしてＢ−ＤＮＡを用いることができる。放置ステップは、４〜３７℃で０．５〜２４時間行うことが好ましい。放置ステップの後にＰＢＳなどの緩衝液で洗浄し、未反応の被検物質や対照物質を除去することが好ましい。
【００３６】
標識核酸接触ステップにおいて、放置ステップ後の固相化されたＨＭＧＢタンパクに、標識核酸を接触させる。標識核酸としては特に制限はないが、ＣｐＧ ＯＤＮ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ｐｏｌｙ（Ｕ）、Ｂ−ＤＮＡ、５’三リン酸化ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡなどの合成核酸、ＨＳＶ−１やワクシニアウイルスＤＮＡなどのウイルスＤＮＡ、微生物ＤＮＡ、ウシ胸腺ＤＮＡなどが例示できる。しかしながら、より均質であることから合成核酸であることがより好ましい。上記の合成核酸は１０〜１００ｍｅｒであることが好ましく、１５〜２５ｍｅｒであることがより好ましい。ＨＭＧＢタンパクがＨＭＧＢ１である場合には、標識核酸はＲＮＡであってもよい。標識には特に制限はなく、ビオチン、ＦＩＴＣなどの蛍光色素、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、放射性同位元素などで行われてよい。標識核酸接触ステップの後にＰＢＳなどの緩衝液で洗浄し、未反応の標識核酸を除去することが好ましい。ここで、放置ステップで添加した被検物質が、標識核酸のＨＭＧＢタンパクへの結合を阻害する場合があり、このような阻害を行う被検物質は、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤である。
【００３７】
定量ステップにおいて、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸を定量する。標識核酸の定量方法には特に制限はない。例えば、標識核酸がビオチンで標識されていた場合には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）などで標識された、抗ビオチン抗体を反応させ、未反応の抗体を洗浄した後、抗体に結合していたＨＲＰやＡＰなどの酵素に対応した基質を反応させて、発光や発色を得る。得られた発光や発色を、プレートリーダーなどを用いて定量する。
あるいは、標識核酸がビオチンで標識されていた場合には、抗ビオチン抗体の代わりにＨＲＰやＡＰで標識されたストレプトアビジンを用いてもよい。
例えば、標識核酸がＦＩＴＣで標識されていた場合には、抗ＦＩＴＣ抗体を反応させて標識核酸を定量してもよいし、標識核酸のＦＩＴＣに励起光を照射し、発生する蛍光を、蛍光プレートリーダーなどを用いて定量してもよい。
例えば、標識核酸が放射性同位元素で標識されていた場合には、マイクロプレートシンチレーションカウンターなどを用いて標識核酸を定量してもよい。
【００３８】
判定ステップにおいて、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量と、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量とを比較し、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも少ない場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定する。また、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも多い場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤であると判定する。
【００３９】
図４４に、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法の一つの態様を示す。放置ステップ（図４４ａ）において、被検物質３の存在下及び非存在下並びに陽性対照物質２の存在下で、固相化されたＨＭＧＢタンパク１を放置する。続いて標識核酸接触ステップ（図４４ｂ）において、ビオチン標識Ｂ−ＤＮＡ ４を接触させる。続いて定量ステップ（図４４ｃ及び図４４ｄ）において、固相化されたＨＭＧＢタンパク１に結合したビオチン標識Ｂ−ＤＮＡ ４を定量する。図４４ｃでは、酵素標識された抗ビオチン抗体５を反応させている。続いて酵素の基質６を添加し（図４４ｄ）、発光又は発色をプレートリーダーなどを用いて定量する。被検物質３の非存在下（陰性対照）で放置ステップを行ったサンプルにおいては、固相化されたＨＭＧＢタンパク１に標識核酸が結合する。これに対し、陽性対照物質２の存在下で放置ステップを行ったサンプルにおいては、固相化されたＨＭＧＢタンパク１への標識核酸の結合が阻害される。図４４の被検物質３の場合は、被検物質３の存在下で放置ステップを行ったサンプルにおいて、固相化されたＨＭＧＢタンパク１へのビオチン標識Ｂ−ＤＮＡ ４（標識核酸）の結合が阻害されている。そして、被検物質３の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパク１に結合したビオチン標識Ｂ−ＤＮＡ ４の量よりも、被検物質３の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパク１に結合したビオチン標識Ｂ−ＤＮＡ ４の量が少ないため、被検物質３が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定される。
【００４０】
上記のスクリーニング方法により得られた、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤は、ウイルス、微生物、寄生虫などによる感染症の防御機構の活性化、抗ウイルス活性の増大、免疫細胞の分化のバランスを制御してアレルギーの病状を改善する、抗腫瘍応答を活性化するなどの目的で使用することができる。これらの自然免疫応答は有利な効果をもたらす例である。
【実施例】
【００４１】
（プルダウンアッセイ）
質量分析の前に、マウス胎児繊維芽細胞（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＭＥＦｓ）をｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）・（ｄＴ：ｄＡ）（Ｂ−ＤＮＡ、１０μｇ／ｍｌ）で４時間刺激した。刺激後、細胞をダウンスホモジナイザー（Ｗｈｅａｔｏｎ ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてホモジナイザーションバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、２０％グリセロール、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン）中でホモジナイズした。細胞質タンパク抽出物は、ホモジナイズしたサンプルを１４５００ｒｐｍで３０分遠心して調製した。細胞質タンパク抽出物を、５’末端をビオチン標識したＢ−ＤＮＡ １．４μｇ／ｍｌとともにインキュベートした後、ストレプトアビジン結合磁気ビーズ（インビトロジェン社）を添加して４℃で１５分間インキュベートした。プルダウンしたサンプルをＤＮａｓｅ Ｉ（インビトロジェン社）と反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．４、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ）中で反応させ、上清を銀染色（インビトロジェン社）又は質量分析に供した。
インビトロプルダウンアッセイは、次のようにして行った。ＨＭＧＢ１、２又は３の組換え体を、まず、競合物質の存在下及び非存在下で室温で３０分処理した。上清をビオチン標識Ｂ−ＤＮＡと４℃で３０分混合した後、ストレプトアビジン結合磁気ビーズ（インビトロジェン社）を添加して結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１００μｇ／ｍｌ ロイペプチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４）中でインキュベーションした。続いて混合物を結合バッファーでよく洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、抗ＨＭＧＢ１、２又は３抗体を用いてイムノブロットした。
【００４２】
（マウス、細胞、試薬）
Ｂａｌｂ／ｃの遺伝的背景を持つＴｌｒ９−／−マウス以外は、Ｃ５７ＢＬ／６の遺伝的背景を持つマウスを用いた。Ｔｌｒ９−／−、Ｈｍｇｂ１−／−、Ｈｍｇｂ２−／−マウスの作成は常法により行った。ＭＥＦｓ、ＲＡＷ２６４．７、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｔｌｒ９−／−マウスの骨髄由来ｃＤＣｓ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）及びｐＤＣｓ（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）の維持は常法により行った。Ｈｍｇｂ１−／−マクロファージ、ｃＤＣｓ及びｐＤＣｓは、胎児肝臓造血前駆細胞（分化マーカーのない細胞をミルテニー社のＭＡＣＳ Ｌｉｎｅａｇｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｋｉｔで精製したもの）を、ＳＣＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で２日間培養した後、２０ｎｇ／ｍｌＭ−ＣＳＦ（マクロファージ）、２０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ（ｃＤＣｓ）、１００ｎｇ／ｍｌヒトＦｌｔ３Ｌ（ｐＤＣｓ）の存在下で６日間培養することにより調製した。ＳＣＦ、ＩＬ−３及びＩＬ−６はペプロテック社から購入した。ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αはＲ＆Ｄシステムズから購入した。ＩＦＮ−βは東レ株式会社から親切にも提供された。Ｂ−ＤＮＡ及びウシ胸腺ＤＮＡはシグマ社から購入した。ビオチン標識ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）・（ｄＴ：ｄＡ）は北海道システムサイエンス社から購入した。ＩＳＤ（ＩＦＮ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ＤＮＡ）、ＣｐＧ ＯＤＮ、ＦＩＴＣ標識塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー（ＰＳ、２０ｍｅｒ）及びＦＩＴＣ標識塩基フリーナチュラルデオキシリボースホモポリマー（ＰＤ、２０ｍｅｒ）はファスマック社から購入した。ＰＤとは、ＰＳのホスホロチオエート結合をホスホジエステル結合に変換したものである。精製ワクシニアウイルスＤＮＡ（ＭＯ株）はＡ．Ｋａｔｏ及びＭ．Ｋｉｄｏｋｏｒｏより提供された。ＨＳＶ ＤＮＡはＹ．Ｋａｗａｇｕｃｈｉから親切にも提供された。５’−三リン酸ＲＮＡはＣ．Ｒｅｉｓ ｅ Ｓｏｕｓａ及びＪ．Ｒｅｈｗｉｎｋｅｌから提供された。大腸菌ＤＮＡ（微生物ＤＮＡ）及びＲ８３７はインビボジェン社から購入した。ｐｏｌｙ（Ｕ）及びリポポリサッカライド（ＬＰＳ）はシグマ社から購入した。ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）はＧＥヘルスケアバイオサイエンス社から購入した。Ｂ−ＤＮＡ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びその他の核酸リガンドは、特記しない限り１０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮとＤＯＴＡＰ（ロシュ社）の複合体形成は常法により行った。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ６３３はインビトロジェン社から購入した。抗ＨＭＧＢ１抗体及び抗ＨＭＧＢ２抗体はアブカム社から購入した。抗ＨＭＧＢ３抗体はトランスジェニック社から購入した。抗ＩＲＦ３抗体（ＺＭ３）はＺｙｍｅｄ社から購入した。抗β−アクチン抗体（ＡＣ−１５）はシグマ社から購入した。抗ＮＦ−κＢ ｐ６５抗体（Ｃ２０）はサンタクルズバイオテクノロジー社から購入した。抗リン酸化ＳＴＡＴ１抗体（５８Ｄ６）はセルシグナリング社から購入した。
【００４３】
（プラスミド構築）
マウスＨＭＧＢ ｃＤＮＡはＭＥＦｓ由来の全ＲＮＡをもとに、ＲＴ−ＰＣＲにより得て、ｐＧＥＸ４Ｔ３ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のＳａｌ Ｉ及びＮｏｔ Ｉサイトにクローニングした。グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ付きＨＭＧＢタンパクは、グルタチオンセファロースビーズ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて精製した。ＨＭＧＢタンパク及びＧＳＴタンパクはトロンビンプロテアーゼ（ノバジェン社）処理によって分離した。
マウスＲＩＧ−Ｉ（配列番号３）、ＨＭＧＢ１（配列番号４）及びＲａｂ５（配列番号５）のｃＤＮＡは、ＭＥＦ由来の全ＲＮＡに対する、逆転写を伴うポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＲＴ−ＰＣＲという場合がある）により得られ、ｐＣＡＧＧＳ−ＣＦＰ、ｐＣＡＧＧＳ−ＹＦＰ及びｐＣＡＧＧＳ−ＲＦＰベクター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１、１５４１６−１５４２１、２００４を参照）のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ認識部位にそれぞれクローニングし、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ、ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１及びＲＦＰ−Ｒａｂ５を得た。
【００４４】
（イムノブロット解析）
細胞溶解及びイムノブロット解析は常法により行った。ＩＲＦダイマーはネイティブＰＡＧＥ及び後に続く抗マウスＩＲＦ３抗体を使用したイムノブロット解析により行った。ＩＲＦ３ダイマーの定量はＮＩＨ Ｉｍａｇｅソフトウエアにより行った。３回の独立した実験により同様の結果が得られた。
【００４５】
（ＲＮＡ解析）
ＲＮＡ抽出及び逆転写反応は常法により行った。定量的ＲＴ−ＰＣＲはライトサイクラー４８０（商品名、ロシュ社）及びＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎシステム（ロシュ社）を用いて行った。全データはグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子について得られた結果を用いて標準化した、相対的発現単位で表示した。データは３重に測定し、平均±標準偏差として表示した。全てのデータについて、２回以上の独立した実験において同様の結果が得られた。
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析のためのプライマー配列は次のとおりであった。ＨＭＧＢ１ センス ５’−ＣＣＡＡＡＧＧＧＧＡＧＡＣＣＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号６）、ＨＭＧＢ１ アンチセンス ５’−ＴＣＡＴＡＧＧＧＣＴＧＣＴＴＧＴＣＡＴＣＴ−３’（配列番号７）、ＨＭＧＢ２ センス ５’−ＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴ−３’（配列番号８）、ＨＭＧＢ２ アンチセンス ５’−ＧＧＡＣＣＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＴＴＣ−３’（配列番号９）、ＨＭＧＢ３ センス ５’−ＧＧＡＧＡＴＧＡＡＡＧＡＴＴＡＴＧＧＡＣＣＡＧ−３’（配列番号１０）、ＨＭＧＢ３ アンチセンス ５’−ＣＴＴＴＧＣＴＧＣＣＴＴＧＧＴＧ−３’（配列番号１１）、ＧＢＰ１ センス ５’−ＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＧＣＡＡＡＡＧＧ−３’（配列番号１２）、ＧＢＰ１ アンチセンス ５’−ＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＣＴＧＴＧ−３’（配列番号１３）、ＩＲＦ７ センス ５’−ＧＣＡＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＣＡＣＴＡ−３’（配列番号１４）、ＩＲＦ７ アンチセンス ５’−ＣＡＡＧＣＡＣＡＡＧＣＣＧＡＧＡＣＴ−３’（配列番号１５）、ＩＬ−１２ｐ４０ センス ５’−ＧＡＣＡＣＧＣＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣ−３’（配列番号１６）、ＩＬ−１２ｐ４０ アンチセンス ５’−ＴＡＧＴＣＣＣＴＴＴＧＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧ−３’（配列番号１７）、ＧＡＰＤＨ センス ５’−ＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号１８）、ＧＡＰＤＨ アンチセンス ５’−ＣＡＣＡＴＴＧＧＧＧＧＴＡＧＧＡＡＣＡＣ−３’（配列番号１９）、ＩＬ−６ センス ５’−ＡＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＡＡＧＡＧＡＣＴ−３’（配列番号２０）、ＩＬ−６ アンチセンス ５’−ＣＡＣＴＡＧＧＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴＡＧＡＴＣＴＣ−３’（配列番号２１）、ＲＡＮＴＥＳ センス ５’−ＡＣＧＴＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣ−３’（配列番号２２）、ＲＡＮＴＥＳ アンチセンス ５’−ＧＡＴＧＴＡＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＣＴ−３’（配列番号２３）、ＩκＢ−α センス ５’−ＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴ−３’（配列番号２４）、ＩκＢ−α アンチセンス ５’−ＴＧＡＣＡＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣＡＴＴＴ−３’（配列番号２５）、ＩＦＮ−α１ センス ５’−ＧＣＣＴＴＧＡＣＡＣＴＣＣＴＧＧＴＡＣＡＡＡＴＧＡＧ−３’（配列番号２６）、ＩＦＮ−α１ アンチセンス ５’−ＣＡＧＣＡＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号２７）、ＩＦＮ−α４ センス ５’−ＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＡＡＡＧＡＡＧＴＧＡ−３’（配列番号２８）、ＩＦＮ−α４ アンチセンス ５’−ＧＡＧＣＴＡＴＧＴＣＴＴＧＧＣＣＴＴＣＣ−３’（配列番号２９）、ＩＦＮ−β センス ５’−ＣＡＧＣＡＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号３０）、ＩＦＮ−β アンチセンス ５’−ＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＣＴＣＴＣＣＡＴＣＡＡＣＴＡＴ−３’（配列番号３１）
【００４６】
（統計解析）
対照群及び試験群の結果はスチューデントのｔ検定により評価した。
【００４７】
（ＥＬＩＳＡ）
マウスＩＦＮ−β、ＩＬ−６及びＩＬ−１βはＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＦＮ−β ＥＬＩＳＡキットはＰＢＬバイオメディカルラボラトリーズ社から購入した。ＩＬ−６及びＩＬ−１β ＥＬＩＳＡキットはＲ＆Ｄシステムズ社から購入した。全データについて、追加の独立した２回の試験において同様の結果が得られた。
【００４８】
（ＲＮＡ干渉）
ｓｉＲＮＡベクターは、オリゴヌクレオチドをｐＳＵＰＥＲ．ｒｅｔｒｏ．ｐｕｒｏ レトロウイルスベクターのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入することにより構築した。マウスＨＭＧＢ１、２及び３（ｐａｎ−ＨＭＧＢ−ｓｉＲＮＡ、以下、ＨＭＢＧ−ｓｉという場合がある。）；ＨＭＧＢ２；及びレニラルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）（対照、以下、Ｃｔｒｌ−ｓｉという場合がある。）のｓｉＲＮＡの標的配列は、それぞれ５’−ＧＴＡＴＧＡＧＡＡＧＧＡＴＡＴＴＧＣＴ−３’（配列番号３２）、５’−ＧＣＧＴＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＣＡＧＴＴ−３’（配列番号３３）及び５’−ＧＴＡＧＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＴＡＣＡ−３’（配列番号３４）であった。遺伝子導入されたＭＥＦｓ細胞はピューロマイシン（シグマ社）２μｇ／ｍｌで、ＲＡＷ２６４．７細胞はピューロマイシン４μｇ／ｍｌで４８時間選択した。
【００４９】
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ （ＥＭＳＡ）
ＥＭＳＡは常法により行った。ＮＦ−κＢのコンセンサス配列（５’−ＴＣＧＡＣＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧ−３’、配列番号３５）を用いた。ＮＦ−κＢ−ＤＮＡ複合体中に存在するｐ６５の存在は、抗ｐ６５抗体を用いたスーパーシフトバンドの検出により確認した。
【００５０】
（ウイルス感染）
ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）１．０のＨＳＶ−１又はＶＳＶを１２時間細胞に感染させた。ＨＳＶ−１及びＶＳＶの収率を測定する場合には、常法によりプラーク形成アッセイを行った。全データについて、追加の独立した２回の試験において同様の結果が得られた。ウイルスの調製は常法により行った。
【００５１】
（蛍光顕微鏡観察）
ＨｅＬａ細胞（５×１０４）を、底面がガラス製の３５ｍｍ組織培養ディッシュ（松浪硝子工業株式会社）上で培養した。蛍光顕微鏡観察は、レーザー走査型共焦点顕微鏡ＩＸ８１（オリンパス株式会社）を用いて行った。二重及び三重カラーイメージは連続取得モードにより撮影し、交差励起を防いだ。
【００５２】
（ＲＮＡ解析）
【００５３】
（細胞質ＤＮＡ又はＲＮＡにより活性化される自然免疫応答におけるＨＭＧＢの役割）
（実施例１）
Ｈｍｇｂ１＋／＋ＭＥＦ細胞又はＨｍｇｂ１−／−ＭＥＦ細胞を、Ｂ−ＤＮＡ（図１ａ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図１ｂ）で６時間、又はリポポリサッカライド（ＬＰＳ）（２００ｎｇ／ｍｌ）（図１ｃ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β ｍＲＮＡの誘導レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１に示す。「＊」はＨｍｇｂ１＋／＋ＭＥＦ細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。
Ｈｍｇｂ１−／−ＭＥＦ細胞では、細胞質へのＤＮＡ又はＲＮＡの送達によるＩＦＮ−β誘導が低下した。
【００５４】
（実施例２）
Ｈｍｇｂ２＋／＋ＭＥＦ細胞又はＨｍｇｂ２−／−ＭＥＦ細胞をＢ−ＤＮＡ（図２ａ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図２ｂ）で６時間、又はＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）（図２ｃ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β ｍＲＮＡの誘導レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図２に示す。「＊」はＨｍｇｂ２＋／＋ＭＥＦ細胞と比較した場合にｐ＜０．００１であることを示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。
Ｈｍｇｂ２−／−ＭＥＦ細胞における、ＩＦＮ−β誘導の低下は、細胞質へのＤＮＡの送達により観察されたが、ＲＮＡの送達によっては観察されなかった。
【００５５】
（実施例３）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換したＭＥＦに、Ｂ−ＤＮＡ又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を脂質導入（リポフェクション）した。続いて、ＩＦＮ−β（図３ａ及びｅ）、ＩＦＮ−α４（図３ｂ及びｆ）、ＩＬ−６（図３ｃ及びｇ）、ＲＡＮＴＥＳ（図３ｄ及びｈ）のｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図３に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ−ＭＥＦと比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。
全てのＨＭＧＢを欠失したＭＥＦは、細胞質ＤＮＡ又はＲＮＡに対する自然免疫応答が欠損していた。
【００５６】
（実施例４）
全てのＨＭＧＢを欠失したＭＥＦに、様々な供給源から調製された核酸、すなわち、ＨＳＶ−１ ＤＮＡ（図４ａ）、ワクシニアウイルスＤＮＡ（図４ｂ）、５’−三リン酸ＲＮＡ（図４ｃ）、微生物ＤＮＡ（図４ｄ）、ウシ胸腺ＤＮＡ（図４ｅ）、ＩＳＤ（図４ｆ）を、脂質導入により、細胞質に送達した。ＩＳＤの塩基配列は５’−ＴＡＣＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＧＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＣＴＧＡＴＣＴＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＴＡＣＡ−３’（配列番号３６）である。対照としてＬＰＳによる刺激も行った（図４ｇ）。脂質導入から６時間後におけるＩＦＮ−β ｍＲＮＡの発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図４に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ−ＭＥＦと比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。
全てのＨＭＧＢを欠失したＭＥＦを、ＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）により２時間刺激した結果、ＩＦＮ−βが誘導された（図４ｇ）。これに対し、全てのＨＭＧＢを欠失したＭＥＦは、様々な供給源から調製された核酸の細胞質への送達から６時間後におけるＩＦＮ−β誘導が欠損していた（図４ａ〜ｈ）。
【００５７】
（細胞質核酸受容体に媒介されたシグナル経路の活性化、及び抗ウイルス自然免疫応答におけるＨＭＧＢの必要性）
（実施例５）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換したＭＥＦに、Ｂ−ＤＮＡ又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を脂質導入（リポフェクション）した。ＩＲＦ３の二量体化をネイティブＰＡＧＥ及びそれに続くイムノブロットにより評価した。結果を図５に示す。
【００５８】
（実施例６）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換したＭＥＦに、Ｂ−ＤＮＡ又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を脂質導入（リポフェクション）した。ＮＦ−κＢの活性化をＥＭＳＡにより評価した。結果を図６に示す。
【００５９】
（実施例７）
ウイルス感染によるＩ型ＩＦＮの誘導を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換したＭＥＦに、ＶＳＶ又はＨＳＶ−１を感染させた。Ｉ型ＩＦＮ、すなわち、ＩＦＮ−β（図７ａ及びｂ）、ＩＦＮ−α１（図７ｃ及びｄ）、ＩＦＮ−α４（図７ｅ及びｆ）のｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図７に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ−ＭＥＦと比較した場合にｐ＜０．０１であることを示し、「＊＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ−ＭＥＦと比較した場合にｐ＜０．０５であることを示す。
【００６０】
（実施例８）
樹状細胞（ＤＣｓ）のサブセットの１つである形質細胞様樹状細胞の前駆細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ、ｐＤＣｓ）においては、ＴＬＲ９を介して大量のＩ型ＩＦＮの産生が誘導されることが知られている。脾臓由来のｐＤＣｓにおいては、ＤＮＡウイルスである１型単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓｔｙｐｅ １、ＨＳＶ−１）により感染を受けると、ＴＬＲ９を介してＩ型ＩＦＮの発現が誘導されるが、骨髄由来のｐＤＣｓやｃＤＣｓ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＤＣｓ）においては、ＨＳＶ−ＩによるＩ型ＩＦＮの発現誘導に、ＴＬＲ９非依存性の経路も存在することが報告されている。
Ｈｍｇｂ１＋／＋又はＨｍｇｂ１−／−ｃＤＣｓを、ＴＬＲリガンド、すなわち、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図８ａ及びｂ）、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ（図８ｃ及びｄ）で刺激した。対照としてＬＰＳによる刺激も行った（図８ｅ及びｆ）。続いて、ＩＬ−６（図８ａ、ｃ、ｅ）及びＴＮＦ−α（図８ｂ、ｄ、ｆ）のｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図８に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。「＊」は野生型細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００６１】
（実施例９）
Ｈｍｇｂ１＋／＋又はＨｍｇｂ１−／−ｐＤＣｓを、ＴＬＲリガンド、すなわち、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ（図９ａ）及びｐｏｌｙ（Ｕ）（図９ｂ）で刺激した。対照としてＲ８３７による刺激も行った（図９ｃ）。続いて、ＩＦＮ−βのｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図９に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」は野生型細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００６２】
（ＨＭＧＢへの高結合親和性核酸類似体を用いた、核酸により活性化される自然免疫応答の干渉）
（実施例１０）
ＭＥＦを、１μＭのＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮによる３０分間の前処理の有無の後に、Ｂ−ＤＮＡ（図１０ａ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図１０ｂ）又はＬＰＳ（図１０ｃ）の細胞質への送達により刺激した。ＩＦＮ−β ｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１０に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。「＊」は前処理された細胞の結果が、前処理されなかった細胞の結果に対してｐ＜０．０１であることを示す。
【００６３】
（実施例１１）
骨髄由来のＴｌｒ９−／− ｐＤＣｓを、５μＭ ＰＳ又は１μＭ ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮによる３０分間の前処理の有無の後に、１μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｕ）（図１１ａ）の脂質導入又は２５μｇ／ｍｌのＲ８３７（図１１ｂ）のいずれかにより８時間刺激した。ＩＦＮ−β ｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１１に示す。「＊」は前処理された細胞の結果が、前処理されなかった細胞の結果に対してｐ＜０．０１であることを示す。
【００６４】
（ＨＭＧＢの同定とそのＤＮＡ及びＲＮＡへの結合）
（実施例１２）
ＨＭＧＢを同定した。Ｂ−ＤＮＡで４時間刺激したＭＥＦの細胞質抽出物を、ビオチン結合Ｂ−ＤＮＡ及びストレプトアビジン結合磁性ビーズを用いたプルダウンアッセイに供した。Ｂ−ＤＮＡに結合したタンパクをＤＮａｓｅ Ｉ処理により溶出した。溶出されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びそれに続く銀染色により可視化され（図１２ａ）、続いて質量分析により解析された。図１２ａに銀染色の結果を示す。図１２ｂにＨＭＧＢ１、２及び３に対する抗体を用いたイムノブロット解析の結果を示す。
【００６５】
（実施例１３）
ＨＭＧＢのＤＮＡ、ＲＮＡ及び塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー（ＰＳ）への結合を検討した。図１３に結果を示す。組換えＨＭＧＢ１又は２並びにビオチン結合Ｂ−ＤＮＡを用いたインビトロプルダウンアッセイを、１、３、１０、３０、１００μｇ／ｍｌの非標識核酸（Ｂ−ＤＮＡ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ｐｏｌｙ（Ｕ）、ウシ胸腺ＤＮＡ、微生物ＤＮＡ）、Ｒ８３７（１、３、１０、３０、１００μｇ／ｍｌ）（上及び中段パネル）、塩基フリーナチュラルデオキシリボースホモポリマー（ＰＤ；０．０１、０．１、０．３、１、３μｇ／ｍｌ；下段パネル）、及び塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー（ＰＳ；０．０１、０．１、０．３、１、３μｇ／ｍｌ；下段パネル）の存在下で行った。下段パネルでは、段階的に増加する非標識Ｂ−ＤＮＡ又はＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ（０．１、０．３、１、３μｇ／ｍｌ）も使用した。ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ及びＰＳの半数阻害濃度（ＩＣ５０）は非標識Ｂ−ＤＮＡのそれよりも、それぞれ１５０分の１及び１００分の１であった。
【００６６】
（実施例１４）
組換えＨＭＧＢ１及びビオチン結合ｐｏｌｙ（Ｕ）を用いて、段階的に増加する非標識ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ、ＰＳ又はＲ８３７（０．１、１又は１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、インビトロプルダウンアッセイを行った。結果を図１４に示す。
【００６７】
（実施例１５）
組換えＨＭＧＢ３及びビオチン結合Ｂ−ＤＮＡを用いて、１又は１０μｇ／ｍｌの非標識Ｂ−ＤＮＡ又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の存在下又は非存在下で、インビトロプルダウンアッセイを行った。結果を図１５に示す。
【００６８】
（核酸により活性化される自然免疫応答におけるＨＭＧＢの必須の役割。）
（実施例１６）
Ｈｍｇｂ１＋／＋又はＨｍｇｂ１−／−ＭＥＦにＢ−ＤＮＡ（図１６ａ、ｂ、ｃ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図１６ｄ、ｅ、ｆ）を脂質導入（リポフェクション）した。続いて、ＩＦＮ−α４（図１６ａ及びｄ）、ＩＬ−６（図１６ｂ及びｅ）、ＲＡＮＴＥＳ（図１６ｃ及びｆ）のｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１６に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。「＊」はＨｍｇｂ１＋／＋ＭＥＦ細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
ＨＭＧＢ１の非存在下では、様々なサイトカイン及びケモカイン遺伝子の誘導が低下した。
【００６９】
（実施例１７）
野生型及び同腹仔由来のＨｍｇｂ１−／−ＭＥＦを段階的に増加するＢ−ＤＮＡ（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図１７ａ及びｂ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図１７ｃ及びｄ）で６時間刺激、又はＬＰＳ（１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌ）（図１７ｅ及びｆ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β（図１７ａ、ｃ、ｅ）及びＩＬ−６（図１７ｂ、ｄ、ｆ）のｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１７に示す。
【００７０】
（実施例１８）
Ｈｍｇｂ１＋／＋又はＨｍｇｂ１−／−ｃＤＣｓ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）にＢ−ＤＮＡ（図１８ａ、ｂ、ｃ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図１８ｄ、ｅ、ｆ）を脂質導入（リポフェクション）した。続いて、ＩＦＮ−β（図１８ａ及びｄ）、ＩＦＮ−α４（図１８ｂ及びｅ）、ＩＬ−６（図１８ｃ及びｆ）のｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１８に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。「＊」はＨｍｇｂ１＋／＋ｃＤＣｓ細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
ＨＭＧＢ１の非存在下では、様々なサイトカイン及びケモカイン遺伝子の誘導が低下した。ｃＤＣｓにおけるｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）に対する応答はＲＬＲ及びＴＬＲ３の双方により媒介されていると考えられる。
【００７１】
（実施例１９）
ＨＭＧＢ２の非存在下でのサイトカイン遺伝子の誘導を検討した。野生型及び同腹仔由来のＨｍｇｂ２−／−ＭＥＦを段階的に増加するＢ−ＤＮＡ（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図１９ａ及びｂ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図１９ｃ及びｄ）で６時間刺激、又はＬＰＳ（１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌ）（図１９ｅ及びｆ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β（図１９ａ、ｃ、ｅ）及びＩＬ−６（図１９ｂ、ｄ、ｆ）のｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１９に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。
【００７２】
（実施例２０）
Ｈｍｇｂ１−／−ＭＥＦにおけるＨＭＧＢ２のノックダウンの影響を検討した。ＨＭＧＢ２を標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ２−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換したＨｍｇｂ１−／−ＭＥＦを、Ｂ−ＤＮＡ（図２０ａ及びｂ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図２０ｃ及びｄ）で刺激し、ＩＦＮ−β（図２０ａ及びｃ）又はＩＦＮ−α４（図２０ｂ及びｄ）のｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＨｍｇｂ１＋／＋についても、比較のために解析した。結果を図２０に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現する細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００７３】
（実施例２１）
ＨＭＧＢ２を標的としたｓｉＲＮＡの効果を検討した。野生型のＭＥＦを、示されたｓｉＲＮＡレトロウイルスで形質転換し、各ＨＭＧＢタンパクの発現をイムノブロット解析により解析した。結果を図２１に示す。
【００７４】
（実施例２２）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡの効果を検討した。野生型のＭＥＦを、全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換し、ＨＭＧＢ１（図２２ａ）、ＨＭＧＢ２（図２２ｂ）及びＨＭＧＢ３（図２２ｃ）タンパクの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。結果を図２２に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉを導入したＭＥＦと比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００７５】
（実施例２３）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡの効果を検討した。野生型のＭＥＦを、全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換し、各ＨＭＧＢタンパクの発現をイムノブロット解析により解析した。結果を図２３に示す。
【００７６】
（実施例２４）
ＨＭＧＢ欠失細胞における、様々な核酸による細胞質の刺激に対する、自然免疫応答の欠損を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換したＭＥＦを、ＨＳＶ−１ ＤＮＡ（図２４ａ）、ワクシニアウイルスＤＮＡ（図２４ｂ）、５’−三リン酸ＲＮＡ（図２４ｃ）、微生物ＤＮＡ（図２４ｄ）、ウシ胸腺ＤＮＡ（図２４ｅ）、ＩＳＤ（図２４ｆ）示された核酸で６時間、又はＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）（図２４ｇ）で２時間刺激した。ＩＬ−６遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図２４に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉを導入したＭＥＦと比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００７７】
（実施例２５）
ＨＭＧＢ欠失細胞における、様々な濃度の核酸リガンドに対する自然免疫応答の欠損を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＭＥＦを、段階的に増加するＢ−ＤＮＡ（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図２５ａ、ｄ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図２５ｂ、ｅ）で６時間刺激、又はＬＰＳ（１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌ）（図２５ｃ、ｆ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β（図２５ａ、ｂ、ｃ）又はＩＬ−６（図２５ｄ、ｅ、ｆ）のｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図２５に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。
【００７８】
（実施例２６）
ＨＭＧＢ欠失細胞における、様々な濃度の核酸リガンドに対する自然免疫応答の欠損を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＭＥＦを、段階的に増加するＢ−ＤＮＡ（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図２６ａ、ｃ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図２６ｂ、ｄ）で６時間刺激、又はＬＰＳ（１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌ）（図２６ｅ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β（図２６ａ及びｂ）又はＩＬ−６（図２６ｃ、ｄ、ｅ）の発現をＥＬＩＳＡで測定した。結果を図２６に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。
【００７９】
（実施例２７）
ＨＭＧＢ欠失細胞の、様々なサイトカイン刺激への応答を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＭＥＦを、Ｂ−ＤＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）で６時間（図２７ａ）、ＩＦＮ−β（５００ユニット／ｍｌ）で６時間（図２７ｂ）、ＩＦＮ−γ（１ユニット／ｍｌ）で２時間（図２７ｃ）又はＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）で２時間（図２７ｄ）刺激した。ＩＦＮ−β（図２７ａ）、ＩＲＦ７（図２７ｂ）、ＧＢＰ１（図２７ｃ）及びＩκＢ−α（図２７ｄ）のｍＲＮＡ発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図２７に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。基本的に、これらのリガンドの異なる量においても同じ結果が得られた。
【００８０】
（実施例２８）
ＨＭＧＢ欠失細胞における、ＩＦＮ−γに誘導されたＳＴＡＴ１の活性化を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＭＥＦをＩＦＮ−γ（１又は１０ユニット／ｍｌ）で３０分間刺激した。リン酸化されたＳＴＡＴ１及びβ−アクチンを、抗リン酸化ＳＴＡＴ１（ｐ−ＳＴＡＴ１）及び抗β−アクチン抗体でそれぞれ検出した。結果を図２８に示す。
【００８１】
（実施例２９）
ＨＭＧＢ欠失ＲＡＷ２６４．７細胞における、核酸による細胞質刺激に対する自然免疫応答の欠損を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、Ｂ−ＤＮＡ（図２９ａ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図２９ｂ）で示された時間刺激した。ＩＦＮ−β遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図２９に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００８２】
（実施例３０）
ＨＭＢＧ−ｓｉ又はＣｔｒｌ−ｓｉを発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、段階的に増加するＢ−ＤＮＡ（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図３０ａ及びｄ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図３０ｂ及びｅ）で６時間刺激、又はＬＰＳ（１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌ）（図３０ｃ及びｆ）で２時間刺激した。示されたサイトカイン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図３０に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。
【００８３】
（実施例３１）
ＨＭＧＢ欠失ＮＩＨ３Ｔ３細胞における、核酸による細胞質刺激に対する自然免疫応答を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を、Ｂ−ＤＮＡ（図３１ａ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図３１ｂ）で示された時間刺激した。ＩＦＮ−β遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図３１に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００８４】
（実施例３２）
ＨＭＢＧ−ｓｉ又はＣｔｒｌ−ｓｉを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を、段階的に増加するＢ−ＤＮＡ（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図３２ａ及びｃ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図３２ｂ及びｄ）で９時間刺激、又はＬＰＳ（１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌ）（図３２ｅ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β（図３２ａ及びｂ）又はＩＬ−６（図３２ｃ、ｄ、ｅ）のｍＲＮＡ発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図３２に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。
【００８５】
（実施例３３）
Ｂ−ＤＮＡ刺激によるインフラマソーム（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）経路の活性化と細胞死におけるＨＭＧＢの関与を検討した。
Ｈｍｇｂ１＋／＋又はＨｍｇｂ１−／−胎児肝臓造血前駆細胞由来マクロファージ（図３３ａ）、及び全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞（図３３ｂ）にＢ−ＤＮＡを脂質導入し、１２時間後に分泌された成熟ＩＬ−１βの量をＥＬＩＳＡで測定した。ＲＡＷ２６４．７細胞は５０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで１６時間刺激し、インフラマソームを活性化させた。結果を図３３に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。図３３に結果を示す。「＊」は野生型細胞又はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。ＮＤは検出されなかったことを意味する。
ＨＭＢＧ−ｓｉ又はＣｔｒｌ−ｓｉを発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、段階的に増加するＢ−ＤＮＡで刺激した。細胞は２４時間の刺激後に回収し、トリパンブルーで染色した。未処理細胞に対する生細胞の百分率を計算した。結果を図３３ｃに示す。ＨＭＧＢ−ｓｉを発現しているＲＡＷ２６４．７細胞は、ＤＮＡに誘導される細胞死に対して、より耐性であった。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。
【００８６】
（実施例３４）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＭＥＦに、ＶＳＶ（図３４ａ）又はＨＳＶ−１（図３４ｂ）を感染させ、２４時間後にウイルスタイターを測定した。結果を図３４に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００８７】
（実施例３５）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞に、ＶＳＶ（図３５ａ、ｂ、ｃ）又はＨＳＶ−１（図３５ｄ、ｅ、ｆ）を感染させた。続いて、ＩＦＮ−β（図３５ａ及びｄ）、ＩＦＮ−α１（図３５ｂ及びｅ）及びＩＦＮ−α４（ｃ及びｆ）のｍＲＮＡ発現量を測定した。結果を図３５に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示し、「＊＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０５であることを示す。ＮＤは検出されなかったことを意味する。
【００８８】
（実施例３６）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞に、ＶＳＶ又はＨＳＶ−１を感染させた。続いて、ウイルスタイターを測定した。結果を図３６に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００８９】
（核酸に媒介されたＴＬＲの活性化にはＨＭＧＢが必要である）
（実施例３７）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図３７ａ及びｂ）又はＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ（図３７ｃ及びｄ）で刺激し、ＩＬ−６（図３７ａ及びｃ）及びＴＮＦ−α（図３７ｂ及びｄ）のｍＲＮＡの発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図３７に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。ＮＤは検出されなかったことを意味する。
【００９０】
（実施例３８）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ、並びにＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ及びＤＯＴＡＰで刺激し、ＩＦＮ−β（図３８ａ）及びＩＦＮ−α４（図３８ｂ）のｍＲＮＡの発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。ＤＯＴＡＰ（商品名、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）はＤＮＡ、ＲＮＡなどの負に帯電した分子を真核細胞中にカチオンリポソームを介して導入するための試薬である。結果を図３８に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００９１】
（実施例３９）
核酸類似体を用いた刺激による、核酸により活性化される自然免疫応答の阻害を検討した。
ＭＥＦにＢ−ＤＮＡを脂質導入した後、１μＭ ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮで０、１、２、３時間共刺激し、ＩＦＮ−βの誘導をＥＬＩＳＡで測定した。結果を図３９に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」はＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮでの刺激を伴わない、Ｂ−ＤＮＡによる刺激と比較した場合に、ｐ＜０．０１であることを示す。
【００９２】
（実施例４０）
骨髄由来Ｔｌｒ９−／−ｃＤＣｓを、５μＭ ＰＳ又は１μＭ ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮで３０分の前処理の有無の後に、５０μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（脂質導入なし）（図４０ａ）、又は２５μｇ／ｍｌのＲ８３７（図４０ｂ）で４時間刺激した。ＩＬ−１２ｐ４０ ｍＲＮＡの発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図４０に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」は、前処理された細胞の結果に対する、前処理されなかった細胞の結果がｐ＜０．０１であることを示す。ＮＤは検出されなかったことを意味する。
【００９３】
（実施例４１）
ＨＭＧＢ１及びＲＩＧ−Ｉの細胞内局在を検討した。ＨｅＬａ細胞に、ＣＦＰタグを付けたＲＩＧ−Ｉ（ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ）及びＹＦＰタグを付けたＨＭＧＢ１（ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１）の発現ベクターを、ＲＦＰタグを付けたＲａｂ５（ＲＦＰ−Ｒａｂ５）と共に又はＲＦＰ−Ｒａｂ５なしで導入した。遺伝子導入から１６時間後、細胞をｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で２時間刺激し、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて蛍光顕微鏡観察を行った。 図４１に発現ベクター（ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ、ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１、ＲＦＰ−Ｒａｂ５）を共導入された細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。図４１の上段及び下段は、それぞれ単独（左から右に、ＲＩＧ−Ｉ、ＨＭＧＢ１、Ｒａｂ５）及び重ね合わせ（左から右に、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ＋ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ＋ＲＦＰ−Ｒａｂ５、ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１＋ＲＦＰ−Ｒａｂ５、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ＋ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１＋ＲＦＰ−Ｒａｂ５）の写真を示す。スケールバーは５μｍを示す。多くの細胞で観察された、代表的な結果を示す。ＲＩＧ−Ｉ及びＨＭＧＢ１の双方が部分的にＲａｂ５と重なっており、これは、ＲＩＧ−Ｉ及びＨＭＧＢ１のエンドソーム膜への動員、及びおそらくはＨＭＧＢによるＲＩＧ−Ｉの活性化を示している。
【００９４】
（実施例４２）
ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ及びＹＦＰ−ＨＭＧＢ１発現ベクターを共導入した細胞を、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激後に、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ６３３（ｍｉｔｏＴＲ、インビトロジェン社）で染色し、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて蛍光顕微鏡観察を行った。図４２に細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。図４２の上段及び下段は、それぞれ単独（左から右に、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ、ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１、ｍｉｔｏＴＲ）及び重ね合わせ（左から右に、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ＋ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ＋ｍｉｔｏＴＲ、ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１＋ｍｉｔｏＴＲ、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ＋ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１＋ｍｉｔｏＴＲ）の写真をそれぞれ示す。スケールバーは５μｍを示す。
ここで示されるように、ＲＩＧ−ＩはｍｉｔｏＴＲと重なっており、ＨＭＧＢ１及びｍｉｔｏＴＲの間には、重なりは全く見られなかった。実施例４１で示された結果と共に、この結果は、次のように解釈される。ＨＭＧＢ１によるｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）認識の後、ＲＩＧ−Ｉが活性化されてミトコンドリアに局在化し、そこでＩＰＳ−１／ＭＡＶＳと相互作用する。
これらの観察は、核酸認識及び免疫応答の活性化の一連の活動における「スナップショット」であり、この観察においては、ＲＩＧ−Ｉの一部の画分がＨＭＧＢ１と相互作用し、一方で他の画分がＨＭＧＢ１から解離してＩＰＳ−１／ＭＡＶＳと結合している。
【００９５】
図４３に、上記の実施例の結果に基づいて作成した、核酸により活性化される自然免疫応答の概略図を示す。全ての免疫原性核酸はＨＭＧＢに結合し（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ｓｅｎｓｉｎｇ、広範な認識）、これは後に続く自然免疫応答を活性化するための特異的パターン認識受容体による認識（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ ｓｅｎｓｉｎｇ、特異的な認識）に必要である。
【００９６】
（実施例４３）
マイクロプレートを用いて、固相化されたＨＭＧＢタンパクを用いた、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤のスクリーニング方法を評価した。５μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解した組換えＨＭＧＢ１タンパクを、１００μｌずつ、９６ウェルマイクロプレートに分注し、２５℃で１時間放置して固相化した。各ウェルをＰＢＳ溶液で２回洗浄後、２％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を１００μｌずつ加え、２５℃で１時間放置してブロッキングした。各ウェルをＰＢＳ溶液で２回洗浄後、ＰＢＳ溶液のみ、７５μｇ／ｍｌのＢ−ＤＮＡ、１００μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ及び２５μｇ／ｍｌのＲ８３７を溶解したＰＢＳ溶液を１００μｌずつ添加し、２５℃で１時間放置した。続いて、各ウェルをＰＢＳ溶液で２回洗浄後、１μＭの５’末端をビオチン標識したＢ−ＤＮＡ又はＰＢＳ溶液のみを１００μｌずつ加え、２５℃で１時間放置した。続いて、各ウェルをＰＢＳ溶液で２回洗浄後、ＰＢＳ溶液で２００倍希釈したＨＲＰ標識抗ビオチン抗体（Ｒ＆Ｄ社）を１００μｌずつ加え、２５℃で１時間放置した。各ウェルをＰＢＳ溶液で２回洗浄後、ＨＲＰの基質溶液（ＢＤ バイオサイエンス社）を１００μｌずつ加え、２５℃で１５分間発色させた。各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ ６８０、バイオラッド社）で定量した。図４５（ａ）に発色後のマイクロプレートの写真を示し、図４５（ｂ）に各サンプルの吸光度のグラフを示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明により、核酸により活性化される自然免疫応答、すなわち、死細胞による過剰な免疫応答、移植臓器拒絶反応、自己免疫疾患、アレルギー、敗血症、炎症による腫瘍の増殖、核酸含有病原体により引き起こされる炎症性疾患などの新たな原理に基づいた抑制剤が提供される。本発明の別の態様において、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法が提供される。
【符号の説明】
【００９８】
１…ＨＭＧＢタンパク、２…陽性対照物質、３…被検物質、４…ビオチン標識Ｂ−ＤＮＡ、５…抗ビオチン抗体、６…基質。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤、及び、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫応答とその制御において、自己と非自己の識別はその根幹を担っている。自然免疫系及び適応免疫系は、それぞれに特有の機構によってこの識別を担うとともに、自己に応答しない仕組み、いわゆる免疫寛容を確立・維持している。
【０００３】
適応免疫系においては、ランダムな抗原受容体を発現するリンパ球レパートリーを構築後、ほとんどの自己反応性リンパ球が中枢性寛容機構によって排除され、末梢になお残存する自己反応性リンパ球は、末梢性寛容機構によって抑制されることが明らかにされてきた。
【０００４】
一方、自然免疫系には不明な点が多く、核酸により活性化される自然免疫応答を担う分子群として、Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＩＧ−Ｉ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＤＡＩ、ＡＩＭ２などの受容体分子群が同定されてきたが、未だにその全貌は不明である（例えば非特許文献１〜３を参照）。
【０００５】
ＨＭＧＢ（ｈｉｇｈ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ｂｏｘ）タンパクには、ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２及びＨＭＧＢ３が存在することが知られている。これらのＨＭＧＢタンパクは、核内に多く存在し、クロマチン構造や転写の制御に関わっていると考えられている。また、細胞質や細胞外にも存在することが知られている。
【０００６】
特許文献１には、細胞外に分泌されたＨＭＧＢ１タンパクと、細胞表面の最終糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）との結合を阻害する、合成二本鎖核酸又は核酸アナログ分子が記載されている。
特許文献２には、細胞外に分泌されたＨＭＧＢ１タンパクとＲＡＧＥの相互作用を阻害する、ＨＭＧＢ１アンタゴニストが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００８−５０４３３５号広報
【特許文献２】特表２００９−５１７４０４号広報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋａｗａｉ Ｔ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：１３１−１３７，２００６．
【非特許文献２】Ｙｏｎｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２８２：１５３１５−１５３１８，２００７．
【非特許文献３】Ｂｕｒｃｋｓｔｕｍｍｅｒ Ｔ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２６６−２７２，２００９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、核酸による自然免疫系の活性化機構を解明し、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤及びそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー又はその誘導体からなる、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤を提供する。
実施例で示すように、発明者は、核酸により活性化される自然免疫応答にはＨＭＧＢタンパクが必須であることを明らかにした。発明者はさらに、上記の化合物（塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー又はその誘導体）が、ＨＭＧＢタンパクに強く結合することによって、他の核酸による自然免疫応答の活性化を強力に抑制することを明らかにした。したがって、上記の化合物は、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤として有用である。
【００１１】
本発明の抑制剤は、細胞内において、自然免疫応答を活性化する核酸とＨＭＧＢタンパクとの結合を阻害することにより、核酸による自然免疫応答の活性化を強力に抑制する。すなわち、本発明の抑制剤は、従来知られていた細胞外のＨＭＧＢタンパクによる免疫応答の活性化を抑制するものではなく、発明者が今回初めて明らかにした機構に基づいて、細胞内のＨＭＧＢタンパクを介した、核酸による自然免疫応答の活性化を抑制するものである。
【００１２】
核酸により活性化される自然免疫応答としては、死細胞による過剰な免疫応答、移植臓器拒絶反応、自己免疫疾患、アレルギー、敗血症、炎症による腫瘍の増殖、核酸含有病原体により引き起こされる炎症性疾患などが例示される。したがって、本発明の抑制剤を投与することにより、ヒト及び動物において、これらの症状を改善することができる。
【００１３】
別の態様において、本発明は、被検物質の存在下及び非存在下で、ＨＭＧＢタンパクと、標識核酸とを混合する混合ステップと、標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクを定量する定量ステップと、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも少ない場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも多い場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含む、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法を提供する。
このスクリーニング方法により、発明者が今回初めて明らかにした、核酸による自然免疫応答の活性化の新たな機構に基づいた、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニングが可能となる。
【００１４】
別の態様において、本発明は、被検物質の存在下及び非存在下で、固相化されたＨＭＧＢタンパクを放置する放置（インキュベーション）ステップと、放置ステップ後の固相化されたＨＭＧＢタンパクに、標識核酸を接触させる、標識核酸接触ステップと、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸を定量する定量ステップと、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも少ない場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも多い場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含む、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法を提供する。
このスクリーニング方法により、より簡便に、効率よく、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニングを行うことができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、核酸により活性化される自然免疫応答、すなわち、死細胞による過剰な免疫応答、移植臓器拒絶反応、自己免疫疾患、アレルギー、敗血症、炎症による腫瘍の増殖、核酸含有病原体により引き起こされる炎症性疾患などの新たな原理に基づいた抑制剤が提供される。本発明の別の態様において、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１の結果を示すグラフである。
【図２】実施例２の結果を示すグラフである。
【図３】実施例３の結果を示すグラフである。
【図４】実施例４の結果を示すグラフである。
【図５】実施例５の結果を示す写真である。
【図６】実施例６の結果を示す写真である。
【図７】実施例７の結果を示すグラフである。
【図８】実施例８の結果を示すグラフである。
【図９】実施例９の結果を示すグラフである。
【図１０】実施例１０の結果を示すグラフである。
【図１１】実施例１１の結果を示すグラフである。
【図１２】実施例１２の結果を示す写真である。
【図１３】実施例１３の結果を示す写真である。
【図１４】実施例１４の結果を示す写真である。
【図１５】実施例１５の結果を示す写真である。
【図１６】実施例１６の結果を示すグラフである。
【図１７】実施例１７の結果を示すグラフである。
【図１８】実施例１８の結果を示すグラフである。
【図１９】実施例１９の結果を示すグラフである。
【図２０】実施例２０の結果を示すグラフである。
【図２１】実施例２１の結果を示す写真である。
【図２２】実施例２２の結果を示すグラフである。
【図２３】実施例２３の結果を示す写真である。
【図２４】実施例２４の結果を示すグラフである。
【図２５】実施例２５の結果を示すグラフである。
【図２６】実施例２６の結果を示すグラフである。
【図２７】実施例２７の結果を示すグラフである。
【図２８】実施例２８の結果を示す写真である。
【図２９】実施例２９の結果を示すグラフである。
【図３０】実施例３０の結果を示すグラフである。
【図３１】実施例３１の結果を示すグラフである。
【図３２】実施例３２の結果を示すグラフである。
【図３３】実施例３３の結果を示すグラフである。
【図３４】実施例３４の結果を示すグラフである。
【図３５】実施例３５の結果を示すグラフである。
【図３６】実施例３６の結果を示すグラフである。
【図３７】実施例３７の結果を示すグラフである。
【図３８】実施例３８の結果を示すグラフである。
【図３９】実施例３９の結果を示すグラフである。
【図４０】実施例４０の結果を示すグラフである。
【図４１】実施例４１の結果を示す写真である。
【図４２】実施例４２の結果を示す写真である。
【図４３】核酸により活性化される自然免疫応答の概略図である。
【図４４】核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤のスクリーニング方法の一つの態様を示す図である。
【図４５】実施例４３の結果を示す写真（ａ）及びグラフ（ｂ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、発明者が新たに解明した機構に基づいた、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤を提供する。この抑制剤は、塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー（以下、ＰＳという場合がある。）又はその誘導体からなるものである。
【００１８】
ＰＳとは、化学式（Ｃ５Ｈ８Ｏ４ＰＳ）ｎで表される化合物であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体から塩基部分を除いた構造を持つ。ｎは１０〜１００であることが好ましく、１５〜２５であることがより好ましい。
ＰＳ又はその誘導体は、核酸合成装置などを用いて合成したものでもよく、北海道システムサイエンスやファスマックなどのメーカーから購入したものでもよい。
ＰＳの誘導体とは、ＰＳのデオキシリボースをリボースに変換したものや、塩基を有する通常のオリゴヌクレオチドであって、免疫原性を有しないものを意味する。免疫原性を有しないオリゴヌクレオチドとは、例えば、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない１５〜２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。１００ｍｅｒを超える長さのオリゴヌクレオチドは免疫源性を有する場合がある。
【００１９】
実施例に示すように、ＰＳは、インビトロにおいて、０．１〜５０μＭ、より好ましくは１〜１０μＭ、特に好ましくは５μＭの濃度で投与することにより、核酸により活性化される自然免疫応答を抑制することができる。この結果は、そのままインビボにも適用することができる。
ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮについても、実施例に示すように、インビトロにおいて、０．１〜１０μＭ、より好ましくは０．３〜３μＭ、特に好ましくは１μＭの濃度で投与することにより、核酸により活性化される自然免疫応答を抑制することができる。この結果は、そのままインビボにも適用することができる。
【００２０】
核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤を臨床で使用する際には、抑制剤に、賦形剤、安定化剤、保存剤、緩衝剤、溶解補助剤、乳化剤、希釈剤、等張化剤などの添加剤が適宜混合されていてもよい。投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などによる経口剤、注射剤、坐剤、液剤などによる非経口剤、あるいは軟膏剤、クリーム剤、貼付剤などによる局所投与などを挙げることができる。抑制剤の使用量は症状、年齢、体重、投与方法等に応じて適宜選択される。
【００２１】
自然免疫応答を活性化する核酸とは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ）、５’三リン酸化ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ウイルスＤＮＡ、微生物ＤＮＡ（微生物由来のＤＮＡ）、真核生物ＤＮＡ、Ｂ−ＤＮＡ（通常のＤＮＡの立体構造をとった合成ＤＮＡ、Ｂ型ＤＮＡ）ＩＳＤ（ＩＦＮ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ＤＮＡ）、非メチル化オリゴヌクレオチドなどを意味する。ＩＳＤとは、４５塩基の合成ＤＮＡであり、ＩＳＤを細胞内に導入するとＩ型ＩＦＮ誘導が起こるが、これはＴＬＲ非依存性に、ＩＲＦ−３の活性化を介して行われることが知られている。
本明細書において、これらの自然免疫応答を活性化する核酸を総称して「全ての免疫性核酸」と呼ぶ場合がある。
【００２２】
核酸により活性化される自然免疫応答としては、死細胞による過剰な免疫応答、移植臓器拒絶反応、自己免疫疾患、アレルギー、敗血症、炎症による腫瘍の増殖、核酸含有病原体により引き起こされる炎症性疾患が例示される。これらの自然免疫応答は不利益をもたらす例である。ここで、過剰な免疫応答とは、例えば肝臓の壊死性炎症のように、ウイルス感染、循環異常や代謝異常、単純炎症反応などの外的要因で壊死した細胞が炎症を誘発し、さらにこの炎症が新たな細胞の壊死を引き起こすという負の連鎖反応を意味する。また、死細胞は、壊死細胞であることが好ましい。また、核酸含有病原体とは、ウイルス、微生物、寄生虫などを意味する。
【００２３】
これらの核酸をリポフェクトアミン（商品名、インビトロジェン社）やＤＯＴＡＰ（商品名、ロシュ社）などの陽イオン性脂質を用いて細胞の細胞質内に投与すると、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α１、ＩＦＮ−α４などのＩ型ＩＦＮ（インターフェロン）やケモカイン、炎症性サイトカインの遺伝子発現を誘導し、免疫応答が惹起されることが知られている。
【００２４】
インビトロ実験においては、非メチル化オリゴヌクレオチドとしてＣｐＧ オリゴデオキシリボヌクレオチド（以下、ＣｐＧ ＯＤＮという場合がある。）が、ｄｓＲＮＡとしてｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）が、ｓｓＲＮＡとしてｐｏｌｙ（Ｕ）が、Ｂ−ＤＮＡとしてｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）・（ｄＴ：ｄＡ）などが用いられる場合がある。
ＣｐＧ ＯＤＮとは、細菌ＤＮＡに出現頻度の高い、非メチル化シトシン・グアニンジヌクレオチド（５’−ＣｐＧ−３’）モチーフを含む合成オリゴヌクレオチドである。ＣｐＧ ＯＤＮにはポリＧテールを有するＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ（Ｄ型とも言われる。）や、Ｂ細胞を強力に活性化し、Ｔｈ１型サイトカインの産生を誘導するＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ（Ｋ型とも言われる。）などが存在する。ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮとしては、例えば、５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’（配列番号１）などの配列を有するものが使用可能である。また、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮとしては、例えば、５’−ＧＧＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＧＧ−３’（配列番号２）などの配列を有するものが使用可能である。これらのＣｐＧ ＯＤＮは、部分的にリン酸ジエステル結合をホスホロチオエート結合などに変換した構造を持つものであってもよい。
ＣｐＧ ＯＤＮは１０〜３０ｍｅｒのものが好ましく、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は１０〜１００００ｍｅｒのものが好ましく、ｐｏｌｙ（Ｕ）は１０〜１００００ｍｅｒのものが好ましく、ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）・（ｄＴ：ｄＡ）は１０〜１００００ｍｅｒのものが好ましい。
【００２５】
別の態様において、本発明は、被検物質の存在下及び非存在下で、ＨＭＧＢタンパクと、標識核酸とを混合する混合ステップと、標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクを定量する定量ステップと、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量と、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量とを比較し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下における標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも少ない場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも多い場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含む、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法を提供する。
【００２６】
混合ステップにおいて、ＨＭＧＢタンパクとしては、ＨＭＧＢ１、２又は３の組換え体をいずれも好適に使用できる。発明者は、ＨＭＧＢタンパクが、全ての免疫性核酸に結合することを初めて明らかにした。
【００２７】
標識核酸としては特に制限はないが、ＣｐＧ ＯＤＮ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ｐｏｌｙ（Ｕ）、Ｂ−ＤＮＡ、５’三リン酸化ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡなどの合成核酸、ＨＳＶ−１やワクシニアウイルスＤＮＡなどのウイルスＤＮＡ、微生物ＤＮＡ、ウシ胸腺ＤＮＡなどが例示できる。しかしながら、より均質であることから合成核酸であることがより好ましい。上記の合成核酸は１０〜１００ｍｅｒであることが好ましく、１５〜２５ｍｅｒであることがより好ましい。標識には特に制限はなく、ビオチン、ＦＩＴＣなどの蛍光色素、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、放射性同位元素などで行われてよい。
【００２８】
被検物質としては、特に制限はなく、核酸、核酸類似体、タンパク、低分子化合物などを使用できる。混合ステップにおいて、被検物質の濃度は、０．１〜１００μＭであることが好ましい。また、ＨＭＧＢタンパクの濃度は１〜２００μｇ／ｍｌであることが好ましい。また、標識核酸の濃度は０．１〜１００μＭであることが好ましい。これらを適切なプロテアーゼ阻害剤を含むバッファーなどの溶媒中で混合し、０．５〜２４時間反応させることが好ましい。
【００２９】
定量ステップは、ストレプトアビジン結合磁性ビーズや、抗ＦＩＴＣ抗体結合磁性ビーズなどを用いたプルダウンアッセイによって行ってもよいし、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ（ＥＭＳＡ）などによって行ってもよい。
例えば、標識核酸にビオチン標識核酸を用い、ストレプトアビジン結合磁性ビーズを用いたプルダウンアッセイを行う場合、混合ステップにより得られたサンプルにストレプトアビジン結合磁性ビーズを添加し、サンプル中のビオチン標識核酸をストレプトアビジン結合磁性ビーズに結合させる。続いて、磁性ビーズの磁気を利用して、標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクを回収する。回収したサンプルを、例えばＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した後、ゲル上のＨＭＢＧタンパクを、例えばＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＨＭＧＢ抗体を用いて染色した後、デンシトメトリー解析などにより定量することができる。
【００３０】
判定ステップにおいて、被検物質の存在下及び非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量を比較し、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下における標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも少ない場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定する。また、被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下における標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも多い場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤であると判定する。
【００３１】
別の態様において、本発明は、被検物質の存在下及び非存在下で、固相化されたＨＭＧＢタンパクを放置する放置（インキュベーション）ステップと、放置ステップ後の固相化されたＨＭＧＢタンパクに、標識核酸を接触させる、標識核酸接触ステップと、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸を定量する定量ステップと、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも少ない場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定し、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも多い場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤であると判定する、判定ステップと、を含む、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法を提供する。
このスクリーニング方法により、より簡便に、効率よく、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニングを行うことができる。
【００３２】
放置ステップでは、固相化されたＨＭＧＢタンパクを被検物質の存在下及び非存在下で放置する。ＨＭＧＢタンパクとしては、ＨＭＧＢ１、２又は３の組換え体をいずれも好適に使用できる。
【００３３】
ＨＭＧＢタンパクは固相担体にあらかじめ固相化して使用する。固相担体としては、特に制限されないが、例えば、ガラス、セラミックス、金属酸化物等の無機物質、天然高分子、合成高分子等からなり、マイクロプレート、マイクロチップ、ビーズ、フィルム、シートなどの形態のものが利用できる。固相担体は、表面がアミノ基（−ＮＨ2）やカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）等の官能基で修飾されていてもよい。
【００３４】
例えば、固相担体として、９６ウェルマイクロプレートを用いる場合、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液に１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で溶解したＨＭＧＢタンパクの溶液を、マイクロプレートの各ウェルに分注し、４〜３７℃で０．５〜２４時間放置することにより、ＨＭＧＢタンパクを固相化することができる。このマイクロプレートは、使用前にＰＢＳなどの緩衝液で洗浄し、結合しなかったＨＭＧＢタンパクを除去することが好ましい。また、非特異的な吸着を抑制するために、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ（２％ＢＳＡ−ＰＢＳ）などの緩衝液を添加してブロッキングすることが好ましい。
【００３５】
被検物質としては、特に制限はなく、核酸、核酸類似体、タンパク、低分子化合物などを使用できる。被検物質の溶媒としては、ＰＢＳなどの緩衝液を用いることができる。被検物質の非存在下で放置ステップを行う場合には、被検物質を含まない緩衝液のみを用いればよい。放置ステップにおける被検物質の濃度は、０．１〜１００μＭであることが好ましい。また、放置ステップにおいて、対照物質の存在下で放置ステップを行う試験群を設けてもよい。対照物質としては、ＨＭＧＢタンパクに結合することが分かっている核酸や、結合しないことが分かっている化合物などを用いることができ、例えば、ＨＭＧＢタンパクに結合することが分かっているものとしてＢ−ＤＮＡを用いることができる。放置ステップは、４〜３７℃で０．５〜２４時間行うことが好ましい。放置ステップの後にＰＢＳなどの緩衝液で洗浄し、未反応の被検物質や対照物質を除去することが好ましい。
【００３６】
標識核酸接触ステップにおいて、放置ステップ後の固相化されたＨＭＧＢタンパクに、標識核酸を接触させる。標識核酸としては特に制限はないが、ＣｐＧ ＯＤＮ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ｐｏｌｙ（Ｕ）、Ｂ−ＤＮＡ、５’三リン酸化ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡなどの合成核酸、ＨＳＶ−１やワクシニアウイルスＤＮＡなどのウイルスＤＮＡ、微生物ＤＮＡ、ウシ胸腺ＤＮＡなどが例示できる。しかしながら、より均質であることから合成核酸であることがより好ましい。上記の合成核酸は１０〜１００ｍｅｒであることが好ましく、１５〜２５ｍｅｒであることがより好ましい。ＨＭＧＢタンパクがＨＭＧＢ１である場合には、標識核酸はＲＮＡであってもよい。標識には特に制限はなく、ビオチン、ＦＩＴＣなどの蛍光色素、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、放射性同位元素などで行われてよい。標識核酸接触ステップの後にＰＢＳなどの緩衝液で洗浄し、未反応の標識核酸を除去することが好ましい。ここで、放置ステップで添加した被検物質が、標識核酸のＨＭＧＢタンパクへの結合を阻害する場合があり、このような阻害を行う被検物質は、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤である。
【００３７】
定量ステップにおいて、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸を定量する。標識核酸の定量方法には特に制限はない。例えば、標識核酸がビオチンで標識されていた場合には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）などで標識された、抗ビオチン抗体を反応させ、未反応の抗体を洗浄した後、抗体に結合していたＨＲＰやＡＰなどの酵素に対応した基質を反応させて、発光や発色を得る。得られた発光や発色を、プレートリーダーなどを用いて定量する。
あるいは、標識核酸がビオチンで標識されていた場合には、抗ビオチン抗体の代わりにＨＲＰやＡＰで標識されたストレプトアビジンを用いてもよい。
例えば、標識核酸がＦＩＴＣで標識されていた場合には、抗ＦＩＴＣ抗体を反応させて標識核酸を定量してもよいし、標識核酸のＦＩＴＣに励起光を照射し、発生する蛍光を、蛍光プレートリーダーなどを用いて定量してもよい。
例えば、標識核酸が放射性同位元素で標識されていた場合には、マイクロプレートシンチレーションカウンターなどを用いて標識核酸を定量してもよい。
【００３８】
判定ステップにおいて、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量と、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量とを比較し、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも少ない場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定する。また、被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも多い場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤であると判定する。
【００３９】
図４４に、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法の一つの態様を示す。放置ステップ（図４４ａ）において、被検物質３の存在下及び非存在下並びに陽性対照物質２の存在下で、固相化されたＨＭＧＢタンパク１を放置する。続いて標識核酸接触ステップ（図４４ｂ）において、ビオチン標識Ｂ−ＤＮＡ ４を接触させる。続いて定量ステップ（図４４ｃ及び図４４ｄ）において、固相化されたＨＭＧＢタンパク１に結合したビオチン標識Ｂ−ＤＮＡ ４を定量する。図４４ｃでは、酵素標識された抗ビオチン抗体５を反応させている。続いて酵素の基質６を添加し（図４４ｄ）、発光又は発色をプレートリーダーなどを用いて定量する。被検物質３の非存在下（陰性対照）で放置ステップを行ったサンプルにおいては、固相化されたＨＭＧＢタンパク１に標識核酸が結合する。これに対し、陽性対照物質２の存在下で放置ステップを行ったサンプルにおいては、固相化されたＨＭＧＢタンパク１への標識核酸の結合が阻害される。図４４の被検物質３の場合は、被検物質３の存在下で放置ステップを行ったサンプルにおいて、固相化されたＨＭＧＢタンパク１へのビオチン標識Ｂ−ＤＮＡ ４（標識核酸）の結合が阻害されている。そして、被検物質３の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパク１に結合したビオチン標識Ｂ−ＤＮＡ ４の量よりも、被検物質３の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパク１に結合したビオチン標識Ｂ−ＤＮＡ ４の量が少ないため、被検物質３が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定される。
【００４０】
上記のスクリーニング方法により得られた、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤は、ウイルス、微生物、寄生虫などによる感染症の防御機構の活性化、抗ウイルス活性の増大、免疫細胞の分化のバランスを制御してアレルギーの病状を改善する、抗腫瘍応答を活性化するなどの目的で使用することができる。これらの自然免疫応答は有利な効果をもたらす例である。
【実施例】
【００４１】
（プルダウンアッセイ）
質量分析の前に、マウス胎児繊維芽細胞（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＭＥＦｓ）をｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）・（ｄＴ：ｄＡ）（Ｂ−ＤＮＡ、１０μｇ／ｍｌ）で４時間刺激した。刺激後、細胞をダウンスホモジナイザー（Ｗｈｅａｔｏｎ ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてホモジナイザーションバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、２０％グリセロール、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン）中でホモジナイズした。細胞質タンパク抽出物は、ホモジナイズしたサンプルを１４５００ｒｐｍで３０分遠心して調製した。細胞質タンパク抽出物を、５’末端をビオチン標識したＢ−ＤＮＡ １．４μｇ／ｍｌとともにインキュベートした後、ストレプトアビジン結合磁気ビーズ（インビトロジェン社）を添加して４℃で１５分間インキュベートした。プルダウンしたサンプルをＤＮａｓｅ Ｉ（インビトロジェン社）と反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．４、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ）中で反応させ、上清を銀染色（インビトロジェン社）又は質量分析に供した。
インビトロプルダウンアッセイは、次のようにして行った。ＨＭＧＢ１、２又は３の組換え体を、まず、競合物質の存在下及び非存在下で室温で３０分処理した。上清をビオチン標識Ｂ−ＤＮＡと４℃で３０分混合した後、ストレプトアビジン結合磁気ビーズ（インビトロジェン社）を添加して結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１００μｇ／ｍｌ ロイペプチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４）中でインキュベーションした。続いて混合物を結合バッファーでよく洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、抗ＨＭＧＢ１、２又は３抗体を用いてイムノブロットした。
【００４２】
（マウス、細胞、試薬）
Ｂａｌｂ／ｃの遺伝的背景を持つＴｌｒ９−／−マウス以外は、Ｃ５７ＢＬ／６の遺伝的背景を持つマウスを用いた。Ｔｌｒ９−／−、Ｈｍｇｂ１−／−、Ｈｍｇｂ２−／−マウスの作成は常法により行った。ＭＥＦｓ、ＲＡＷ２６４．７、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｔｌｒ９−／−マウスの骨髄由来ｃＤＣｓ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）及びｐＤＣｓ（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）の維持は常法により行った。Ｈｍｇｂ１−／−マクロファージ、ｃＤＣｓ及びｐＤＣｓは、胎児肝臓造血前駆細胞（分化マーカーのない細胞をミルテニー社のＭＡＣＳ Ｌｉｎｅａｇｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｋｉｔで精製したもの）を、ＳＣＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で２日間培養した後、２０ｎｇ／ｍｌＭ−ＣＳＦ（マクロファージ）、２０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ（ｃＤＣｓ）、１００ｎｇ／ｍｌヒトＦｌｔ３Ｌ（ｐＤＣｓ）の存在下で６日間培養することにより調製した。ＳＣＦ、ＩＬ−３及びＩＬ−６はペプロテック社から購入した。ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αはＲ＆Ｄシステムズから購入した。ＩＦＮ−βは東レ株式会社から親切にも提供された。Ｂ−ＤＮＡ及びウシ胸腺ＤＮＡはシグマ社から購入した。ビオチン標識ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）・（ｄＴ：ｄＡ）は北海道システムサイエンス社から購入した。ＩＳＤ（ＩＦＮ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ＤＮＡ）、ＣｐＧ ＯＤＮ、ＦＩＴＣ標識塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー（ＰＳ、２０ｍｅｒ）及びＦＩＴＣ標識塩基フリーナチュラルデオキシリボースホモポリマー（ＰＤ、２０ｍｅｒ）はファスマック社から購入した。ＰＤとは、ＰＳのホスホロチオエート結合をホスホジエステル結合に変換したものである。精製ワクシニアウイルスＤＮＡ（ＭＯ株）はＡ．Ｋａｔｏ及びＭ．Ｋｉｄｏｋｏｒｏより提供された。ＨＳＶ ＤＮＡはＹ．Ｋａｗａｇｕｃｈｉから親切にも提供された。５’−三リン酸ＲＮＡはＣ．Ｒｅｉｓ ｅ Ｓｏｕｓａ及びＪ．Ｒｅｈｗｉｎｋｅｌから提供された。大腸菌ＤＮＡ（微生物ＤＮＡ）及びＲ８３７はインビボジェン社から購入した。ｐｏｌｙ（Ｕ）及びリポポリサッカライド（ＬＰＳ）はシグマ社から購入した。ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）はＧＥヘルスケアバイオサイエンス社から購入した。Ｂ−ＤＮＡ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びその他の核酸リガンドは、特記しない限り１０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮとＤＯＴＡＰ（ロシュ社）の複合体形成は常法により行った。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ６３３はインビトロジェン社から購入した。抗ＨＭＧＢ１抗体及び抗ＨＭＧＢ２抗体はアブカム社から購入した。抗ＨＭＧＢ３抗体はトランスジェニック社から購入した。抗ＩＲＦ３抗体（ＺＭ３）はＺｙｍｅｄ社から購入した。抗β−アクチン抗体（ＡＣ−１５）はシグマ社から購入した。抗ＮＦ−κＢ ｐ６５抗体（Ｃ２０）はサンタクルズバイオテクノロジー社から購入した。抗リン酸化ＳＴＡＴ１抗体（５８Ｄ６）はセルシグナリング社から購入した。
【００４３】
（プラスミド構築）
マウスＨＭＧＢ ｃＤＮＡはＭＥＦｓ由来の全ＲＮＡをもとに、ＲＴ−ＰＣＲにより得て、ｐＧＥＸ４Ｔ３ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のＳａｌ Ｉ及びＮｏｔ Ｉサイトにクローニングした。グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ付きＨＭＧＢタンパクは、グルタチオンセファロースビーズ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて精製した。ＨＭＧＢタンパク及びＧＳＴタンパクはトロンビンプロテアーゼ（ノバジェン社）処理によって分離した。
マウスＲＩＧ−Ｉ（配列番号３）、ＨＭＧＢ１（配列番号４）及びＲａｂ５（配列番号５）のｃＤＮＡは、ＭＥＦ由来の全ＲＮＡに対する、逆転写を伴うポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＲＴ−ＰＣＲという場合がある）により得られ、ｐＣＡＧＧＳ−ＣＦＰ、ｐＣＡＧＧＳ−ＹＦＰ及びｐＣＡＧＧＳ−ＲＦＰベクター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１、１５４１６−１５４２１、２００４を参照）のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ認識部位にそれぞれクローニングし、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ、ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１及びＲＦＰ−Ｒａｂ５を得た。
【００４４】
（イムノブロット解析）
細胞溶解及びイムノブロット解析は常法により行った。ＩＲＦダイマーはネイティブＰＡＧＥ及び後に続く抗マウスＩＲＦ３抗体を使用したイムノブロット解析により行った。ＩＲＦ３ダイマーの定量はＮＩＨ Ｉｍａｇｅソフトウエアにより行った。３回の独立した実験により同様の結果が得られた。
【００４５】
（ＲＮＡ解析）
ＲＮＡ抽出及び逆転写反応は常法により行った。定量的ＲＴ−ＰＣＲはライトサイクラー４８０（商品名、ロシュ社）及びＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎシステム（ロシュ社）を用いて行った。全データはグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子について得られた結果を用いて標準化した、相対的発現単位で表示した。データは３重に測定し、平均±標準偏差として表示した。全てのデータについて、２回以上の独立した実験において同様の結果が得られた。
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析のためのプライマー配列は次のとおりであった。ＨＭＧＢ１ センス ５’−ＣＣＡＡＡＧＧＧＧＡＧＡＣＣＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号６）、ＨＭＧＢ１ アンチセンス ５’−ＴＣＡＴＡＧＧＧＣＴＧＣＴＴＧＴＣＡＴＣＴ−３’（配列番号７）、ＨＭＧＢ２ センス ５’−ＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴ−３’（配列番号８）、ＨＭＧＢ２ アンチセンス ５’−ＧＧＡＣＣＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＴＴＣ−３’（配列番号９）、ＨＭＧＢ３ センス ５’−ＧＧＡＧＡＴＧＡＡＡＧＡＴＴＡＴＧＧＡＣＣＡＧ−３’（配列番号１０）、ＨＭＧＢ３ アンチセンス ５’−ＣＴＴＴＧＣＴＧＣＣＴＴＧＧＴＧ−３’（配列番号１１）、ＧＢＰ１ センス ５’−ＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＧＣＡＡＡＡＧＧ−３’（配列番号１２）、ＧＢＰ１ アンチセンス ５’−ＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＣＴＧＴＧ−３’（配列番号１３）、ＩＲＦ７ センス ５’−ＧＣＡＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＣＡＣＴＡ−３’（配列番号１４）、ＩＲＦ７ アンチセンス ５’−ＣＡＡＧＣＡＣＡＡＧＣＣＧＡＧＡＣＴ−３’（配列番号１５）、ＩＬ−１２ｐ４０ センス ５’−ＧＡＣＡＣＧＣＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣ−３’（配列番号１６）、ＩＬ−１２ｐ４０ アンチセンス ５’−ＴＡＧＴＣＣＣＴＴＴＧＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧ−３’（配列番号１７）、ＧＡＰＤＨ センス ５’−ＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号１８）、ＧＡＰＤＨ アンチセンス ５’−ＣＡＣＡＴＴＧＧＧＧＧＴＡＧＧＡＡＣＡＣ−３’（配列番号１９）、ＩＬ−６ センス ５’−ＡＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＡＡＧＡＧＡＣＴ−３’（配列番号２０）、ＩＬ−６ アンチセンス ５’−ＣＡＣＴＡＧＧＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴＡＧＡＴＣＴＣ−３’（配列番号２１）、ＲＡＮＴＥＳ センス ５’−ＡＣＧＴＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣ−３’（配列番号２２）、ＲＡＮＴＥＳ アンチセンス ５’−ＧＡＴＧＴＡＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＣＴ−３’（配列番号２３）、ＩκＢ−α センス ５’−ＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴ−３’（配列番号２４）、ＩκＢ−α アンチセンス ５’−ＴＧＡＣＡＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣＡＴＴＴ−３’（配列番号２５）、ＩＦＮ−α１ センス ５’−ＧＣＣＴＴＧＡＣＡＣＴＣＣＴＧＧＴＡＣＡＡＡＴＧＡＧ−３’（配列番号２６）、ＩＦＮ−α１ アンチセンス ５’−ＣＡＧＣＡＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号２７）、ＩＦＮ−α４ センス ５’−ＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＡＡＡＧＡＡＧＴＧＡ−３’（配列番号２８）、ＩＦＮ−α４ アンチセンス ５’−ＧＡＧＣＴＡＴＧＴＣＴＴＧＧＣＣＴＴＣＣ−３’（配列番号２９）、ＩＦＮ−β センス ５’−ＣＡＧＣＡＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号３０）、ＩＦＮ−β アンチセンス ５’−ＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＣＴＣＴＣＣＡＴＣＡＡＣＴＡＴ−３’（配列番号３１）
【００４６】
（統計解析）
対照群及び試験群の結果はスチューデントのｔ検定により評価した。
【００４７】
（ＥＬＩＳＡ）
マウスＩＦＮ−β、ＩＬ−６及びＩＬ−１βはＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＦＮ−β ＥＬＩＳＡキットはＰＢＬバイオメディカルラボラトリーズ社から購入した。ＩＬ−６及びＩＬ−１β ＥＬＩＳＡキットはＲ＆Ｄシステムズ社から購入した。全データについて、追加の独立した２回の試験において同様の結果が得られた。
【００４８】
（ＲＮＡ干渉）
ｓｉＲＮＡベクターは、オリゴヌクレオチドをｐＳＵＰＥＲ．ｒｅｔｒｏ．ｐｕｒｏ レトロウイルスベクターのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入することにより構築した。マウスＨＭＧＢ１、２及び３（ｐａｎ−ＨＭＧＢ−ｓｉＲＮＡ、以下、ＨＭＢＧ−ｓｉという場合がある。）；ＨＭＧＢ２；及びレニラルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）（対照、以下、Ｃｔｒｌ−ｓｉという場合がある。）のｓｉＲＮＡの標的配列は、それぞれ５’−ＧＴＡＴＧＡＧＡＡＧＧＡＴＡＴＴＧＣＴ−３’（配列番号３２）、５’−ＧＣＧＴＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＣＡＧＴＴ−３’（配列番号３３）及び５’−ＧＴＡＧＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＴＡＣＡ−３’（配列番号３４）であった。遺伝子導入されたＭＥＦｓ細胞はピューロマイシン（シグマ社）２μｇ／ｍｌで、ＲＡＷ２６４．７細胞はピューロマイシン４μｇ／ｍｌで４８時間選択した。
【００４９】
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ （ＥＭＳＡ）
ＥＭＳＡは常法により行った。ＮＦ−κＢのコンセンサス配列（５’−ＴＣＧＡＣＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧ−３’、配列番号３５）を用いた。ＮＦ−κＢ−ＤＮＡ複合体中に存在するｐ６５の存在は、抗ｐ６５抗体を用いたスーパーシフトバンドの検出により確認した。
【００５０】
（ウイルス感染）
ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）１．０のＨＳＶ−１又はＶＳＶを１２時間細胞に感染させた。ＨＳＶ−１及びＶＳＶの収率を測定する場合には、常法によりプラーク形成アッセイを行った。全データについて、追加の独立した２回の試験において同様の結果が得られた。ウイルスの調製は常法により行った。
【００５１】
（蛍光顕微鏡観察）
ＨｅＬａ細胞（５×１０４）を、底面がガラス製の３５ｍｍ組織培養ディッシュ（松浪硝子工業株式会社）上で培養した。蛍光顕微鏡観察は、レーザー走査型共焦点顕微鏡ＩＸ８１（オリンパス株式会社）を用いて行った。二重及び三重カラーイメージは連続取得モードにより撮影し、交差励起を防いだ。
【００５２】
（ＲＮＡ解析）
【００５３】
（細胞質ＤＮＡ又はＲＮＡにより活性化される自然免疫応答におけるＨＭＧＢの役割）
（実施例１）
Ｈｍｇｂ１＋／＋ＭＥＦ細胞又はＨｍｇｂ１−／−ＭＥＦ細胞を、Ｂ−ＤＮＡ（図１ａ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図１ｂ）で６時間、又はリポポリサッカライド（ＬＰＳ）（２００ｎｇ／ｍｌ）（図１ｃ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β ｍＲＮＡの誘導レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１に示す。「＊」はＨｍｇｂ１＋／＋ＭＥＦ細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。
Ｈｍｇｂ１−／−ＭＥＦ細胞では、細胞質へのＤＮＡ又はＲＮＡの送達によるＩＦＮ−β誘導が低下した。
【００５４】
（実施例２）
Ｈｍｇｂ２＋／＋ＭＥＦ細胞又はＨｍｇｂ２−／−ＭＥＦ細胞をＢ−ＤＮＡ（図２ａ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図２ｂ）で６時間、又はＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）（図２ｃ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β ｍＲＮＡの誘導レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図２に示す。「＊」はＨｍｇｂ２＋／＋ＭＥＦ細胞と比較した場合にｐ＜０．００１であることを示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。
Ｈｍｇｂ２−／−ＭＥＦ細胞における、ＩＦＮ−β誘導の低下は、細胞質へのＤＮＡの送達により観察されたが、ＲＮＡの送達によっては観察されなかった。
【００５５】
（実施例３）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換したＭＥＦに、Ｂ−ＤＮＡ又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を脂質導入（リポフェクション）した。続いて、ＩＦＮ−β（図３ａ及びｅ）、ＩＦＮ−α４（図３ｂ及びｆ）、ＩＬ−６（図３ｃ及びｇ）、ＲＡＮＴＥＳ（図３ｄ及びｈ）のｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図３に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ−ＭＥＦと比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。
全てのＨＭＧＢを欠失したＭＥＦは、細胞質ＤＮＡ又はＲＮＡに対する自然免疫応答が欠損していた。
【００５６】
（実施例４）
全てのＨＭＧＢを欠失したＭＥＦに、様々な供給源から調製された核酸、すなわち、ＨＳＶ−１ ＤＮＡ（図４ａ）、ワクシニアウイルスＤＮＡ（図４ｂ）、５’−三リン酸ＲＮＡ（図４ｃ）、微生物ＤＮＡ（図４ｄ）、ウシ胸腺ＤＮＡ（図４ｅ）、ＩＳＤ（図４ｆ）を、脂質導入により、細胞質に送達した。ＩＳＤの塩基配列は５’−ＴＡＣＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＧＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＣＴＧＡＴＣＴＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＴＡＣＡ−３’（配列番号３６）である。対照としてＬＰＳによる刺激も行った（図４ｇ）。脂質導入から６時間後におけるＩＦＮ−β ｍＲＮＡの発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図４に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ−ＭＥＦと比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。
全てのＨＭＧＢを欠失したＭＥＦを、ＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）により２時間刺激した結果、ＩＦＮ−βが誘導された（図４ｇ）。これに対し、全てのＨＭＧＢを欠失したＭＥＦは、様々な供給源から調製された核酸の細胞質への送達から６時間後におけるＩＦＮ−β誘導が欠損していた（図４ａ〜ｈ）。
【００５７】
（細胞質核酸受容体に媒介されたシグナル経路の活性化、及び抗ウイルス自然免疫応答におけるＨＭＧＢの必要性）
（実施例５）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換したＭＥＦに、Ｂ−ＤＮＡ又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を脂質導入（リポフェクション）した。ＩＲＦ３の二量体化をネイティブＰＡＧＥ及びそれに続くイムノブロットにより評価した。結果を図５に示す。
【００５８】
（実施例６）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換したＭＥＦに、Ｂ−ＤＮＡ又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を脂質導入（リポフェクション）した。ＮＦ−κＢの活性化をＥＭＳＡにより評価した。結果を図６に示す。
【００５９】
（実施例７）
ウイルス感染によるＩ型ＩＦＮの誘導を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換したＭＥＦに、ＶＳＶ又はＨＳＶ−１を感染させた。Ｉ型ＩＦＮ、すなわち、ＩＦＮ−β（図７ａ及びｂ）、ＩＦＮ−α１（図７ｃ及びｄ）、ＩＦＮ−α４（図７ｅ及びｆ）のｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図７に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ−ＭＥＦと比較した場合にｐ＜０．０１であることを示し、「＊＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ−ＭＥＦと比較した場合にｐ＜０．０５であることを示す。
【００６０】
（実施例８）
樹状細胞（ＤＣｓ）のサブセットの１つである形質細胞様樹状細胞の前駆細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ、ｐＤＣｓ）においては、ＴＬＲ９を介して大量のＩ型ＩＦＮの産生が誘導されることが知られている。脾臓由来のｐＤＣｓにおいては、ＤＮＡウイルスである１型単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓｔｙｐｅ １、ＨＳＶ−１）により感染を受けると、ＴＬＲ９を介してＩ型ＩＦＮの発現が誘導されるが、骨髄由来のｐＤＣｓやｃＤＣｓ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＤＣｓ）においては、ＨＳＶ−ＩによるＩ型ＩＦＮの発現誘導に、ＴＬＲ９非依存性の経路も存在することが報告されている。
Ｈｍｇｂ１＋／＋又はＨｍｇｂ１−／−ｃＤＣｓを、ＴＬＲリガンド、すなわち、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図８ａ及びｂ）、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ（図８ｃ及びｄ）で刺激した。対照としてＬＰＳによる刺激も行った（図８ｅ及びｆ）。続いて、ＩＬ−６（図８ａ、ｃ、ｅ）及びＴＮＦ−α（図８ｂ、ｄ、ｆ）のｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図８に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。「＊」は野生型細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００６１】
（実施例９）
Ｈｍｇｂ１＋／＋又はＨｍｇｂ１−／−ｐＤＣｓを、ＴＬＲリガンド、すなわち、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ（図９ａ）及びｐｏｌｙ（Ｕ）（図９ｂ）で刺激した。対照としてＲ８３７による刺激も行った（図９ｃ）。続いて、ＩＦＮ−βのｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図９に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」は野生型細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００６２】
（ＨＭＧＢへの高結合親和性核酸類似体を用いた、核酸により活性化される自然免疫応答の干渉）
（実施例１０）
ＭＥＦを、１μＭのＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮによる３０分間の前処理の有無の後に、Ｂ−ＤＮＡ（図１０ａ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図１０ｂ）又はＬＰＳ（図１０ｃ）の細胞質への送達により刺激した。ＩＦＮ−β ｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１０に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。「＊」は前処理された細胞の結果が、前処理されなかった細胞の結果に対してｐ＜０．０１であることを示す。
【００６３】
（実施例１１）
骨髄由来のＴｌｒ９−／− ｐＤＣｓを、５μＭ ＰＳ又は１μＭ ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮによる３０分間の前処理の有無の後に、１μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｕ）（図１１ａ）の脂質導入又は２５μｇ／ｍｌのＲ８３７（図１１ｂ）のいずれかにより８時間刺激した。ＩＦＮ−β ｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１１に示す。「＊」は前処理された細胞の結果が、前処理されなかった細胞の結果に対してｐ＜０．０１であることを示す。
【００６４】
（ＨＭＧＢの同定とそのＤＮＡ及びＲＮＡへの結合）
（実施例１２）
ＨＭＧＢを同定した。Ｂ−ＤＮＡで４時間刺激したＭＥＦの細胞質抽出物を、ビオチン結合Ｂ−ＤＮＡ及びストレプトアビジン結合磁性ビーズを用いたプルダウンアッセイに供した。Ｂ−ＤＮＡに結合したタンパクをＤＮａｓｅ Ｉ処理により溶出した。溶出されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びそれに続く銀染色により可視化され（図１２ａ）、続いて質量分析により解析された。図１２ａに銀染色の結果を示す。図１２ｂにＨＭＧＢ１、２及び３に対する抗体を用いたイムノブロット解析の結果を示す。
【００６５】
（実施例１３）
ＨＭＧＢのＤＮＡ、ＲＮＡ及び塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー（ＰＳ）への結合を検討した。図１３に結果を示す。組換えＨＭＧＢ１又は２並びにビオチン結合Ｂ−ＤＮＡを用いたインビトロプルダウンアッセイを、１、３、１０、３０、１００μｇ／ｍｌの非標識核酸（Ｂ−ＤＮＡ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ｐｏｌｙ（Ｕ）、ウシ胸腺ＤＮＡ、微生物ＤＮＡ）、Ｒ８３７（１、３、１０、３０、１００μｇ／ｍｌ）（上及び中段パネル）、塩基フリーナチュラルデオキシリボースホモポリマー（ＰＤ；０．０１、０．１、０．３、１、３μｇ／ｍｌ；下段パネル）、及び塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー（ＰＳ；０．０１、０．１、０．３、１、３μｇ／ｍｌ；下段パネル）の存在下で行った。下段パネルでは、段階的に増加する非標識Ｂ−ＤＮＡ又はＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ（０．１、０．３、１、３μｇ／ｍｌ）も使用した。ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ及びＰＳの半数阻害濃度（ＩＣ５０）は非標識Ｂ−ＤＮＡのそれよりも、それぞれ１５０分の１及び１００分の１であった。
【００６６】
（実施例１４）
組換えＨＭＧＢ１及びビオチン結合ｐｏｌｙ（Ｕ）を用いて、段階的に増加する非標識ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ、ＰＳ又はＲ８３７（０．１、１又は１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、インビトロプルダウンアッセイを行った。結果を図１４に示す。
【００６７】
（実施例１５）
組換えＨＭＧＢ３及びビオチン結合Ｂ−ＤＮＡを用いて、１又は１０μｇ／ｍｌの非標識Ｂ−ＤＮＡ又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の存在下又は非存在下で、インビトロプルダウンアッセイを行った。結果を図１５に示す。
【００６８】
（核酸により活性化される自然免疫応答におけるＨＭＧＢの必須の役割。）
（実施例１６）
Ｈｍｇｂ１＋／＋又はＨｍｇｂ１−／−ＭＥＦにＢ−ＤＮＡ（図１６ａ、ｂ、ｃ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図１６ｄ、ｅ、ｆ）を脂質導入（リポフェクション）した。続いて、ＩＦＮ−α４（図１６ａ及びｄ）、ＩＬ−６（図１６ｂ及びｅ）、ＲＡＮＴＥＳ（図１６ｃ及びｆ）のｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１６に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。「＊」はＨｍｇｂ１＋／＋ＭＥＦ細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
ＨＭＧＢ１の非存在下では、様々なサイトカイン及びケモカイン遺伝子の誘導が低下した。
【００６９】
（実施例１７）
野生型及び同腹仔由来のＨｍｇｂ１−／−ＭＥＦを段階的に増加するＢ−ＤＮＡ（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図１７ａ及びｂ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図１７ｃ及びｄ）で６時間刺激、又はＬＰＳ（１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌ）（図１７ｅ及びｆ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β（図１７ａ、ｃ、ｅ）及びＩＬ−６（図１７ｂ、ｄ、ｆ）のｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１７に示す。
【００７０】
（実施例１８）
Ｈｍｇｂ１＋／＋又はＨｍｇｂ１−／−ｃＤＣｓ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）にＢ−ＤＮＡ（図１８ａ、ｂ、ｃ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図１８ｄ、ｅ、ｆ）を脂質導入（リポフェクション）した。続いて、ＩＦＮ−β（図１８ａ及びｄ）、ＩＦＮ−α４（図１８ｂ及びｅ）、ＩＬ−６（図１８ｃ及びｆ）のｍＲＮＡの発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１８に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。ＮＤは検出されなかったことを意味する。「＊」はＨｍｇｂ１＋／＋ｃＤＣｓ細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
ＨＭＧＢ１の非存在下では、様々なサイトカイン及びケモカイン遺伝子の誘導が低下した。ｃＤＣｓにおけるｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）に対する応答はＲＬＲ及びＴＬＲ３の双方により媒介されていると考えられる。
【００７１】
（実施例１９）
ＨＭＧＢ２の非存在下でのサイトカイン遺伝子の誘導を検討した。野生型及び同腹仔由来のＨｍｇｂ２−／−ＭＥＦを段階的に増加するＢ−ＤＮＡ（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図１９ａ及びｂ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図１９ｃ及びｄ）で６時間刺激、又はＬＰＳ（１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌ）（図１９ｅ及びｆ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β（図１９ａ、ｃ、ｅ）及びＩＬ−６（図１９ｂ、ｄ、ｆ）のｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図１９に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。
【００７２】
（実施例２０）
Ｈｍｇｂ１−／−ＭＥＦにおけるＨＭＧＢ２のノックダウンの影響を検討した。ＨＭＧＢ２を標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ２−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換したＨｍｇｂ１−／−ＭＥＦを、Ｂ−ＤＮＡ（図２０ａ及びｂ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図２０ｃ及びｄ）で刺激し、ＩＦＮ−β（図２０ａ及びｃ）又はＩＦＮ−α４（図２０ｂ及びｄ）のｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＨｍｇｂ１＋／＋についても、比較のために解析した。結果を図２０に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現する細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００７３】
（実施例２１）
ＨＭＧＢ２を標的としたｓｉＲＮＡの効果を検討した。野生型のＭＥＦを、示されたｓｉＲＮＡレトロウイルスで形質転換し、各ＨＭＧＢタンパクの発現をイムノブロット解析により解析した。結果を図２１に示す。
【００７４】
（実施例２２）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡの効果を検討した。野生型のＭＥＦを、全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換し、ＨＭＧＢ１（図２２ａ）、ＨＭＧＢ２（図２２ｂ）及びＨＭＧＢ３（図２２ｃ）タンパクの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。結果を図２２に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉを導入したＭＥＦと比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００７５】
（実施例２３）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡの効果を検討した。野生型のＭＥＦを、全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換し、各ＨＭＧＢタンパクの発現をイムノブロット解析により解析した。結果を図２３に示す。
【００７６】
（実施例２４）
ＨＭＧＢ欠失細胞における、様々な核酸による細胞質の刺激に対する、自然免疫応答の欠損を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するレトロウイルスで形質転換したＭＥＦを、ＨＳＶ−１ ＤＮＡ（図２４ａ）、ワクシニアウイルスＤＮＡ（図２４ｂ）、５’−三リン酸ＲＮＡ（図２４ｃ）、微生物ＤＮＡ（図２４ｄ）、ウシ胸腺ＤＮＡ（図２４ｅ）、ＩＳＤ（図２４ｆ）示された核酸で６時間、又はＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）（図２４ｇ）で２時間刺激した。ＩＬ−６遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図２４に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉを導入したＭＥＦと比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００７７】
（実施例２５）
ＨＭＧＢ欠失細胞における、様々な濃度の核酸リガンドに対する自然免疫応答の欠損を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＭＥＦを、段階的に増加するＢ−ＤＮＡ（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図２５ａ、ｄ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図２５ｂ、ｅ）で６時間刺激、又はＬＰＳ（１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌ）（図２５ｃ、ｆ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β（図２５ａ、ｂ、ｃ）又はＩＬ−６（図２５ｄ、ｅ、ｆ）のｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図２５に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。
【００７８】
（実施例２６）
ＨＭＧＢ欠失細胞における、様々な濃度の核酸リガンドに対する自然免疫応答の欠損を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＭＥＦを、段階的に増加するＢ−ＤＮＡ（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図２６ａ、ｃ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図２６ｂ、ｄ）で６時間刺激、又はＬＰＳ（１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌ）（図２６ｅ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β（図２６ａ及びｂ）又はＩＬ−６（図２６ｃ、ｄ、ｅ）の発現をＥＬＩＳＡで測定した。結果を図２６に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。
【００７９】
（実施例２７）
ＨＭＧＢ欠失細胞の、様々なサイトカイン刺激への応答を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＭＥＦを、Ｂ−ＤＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）で６時間（図２７ａ）、ＩＦＮ−β（５００ユニット／ｍｌ）で６時間（図２７ｂ）、ＩＦＮ−γ（１ユニット／ｍｌ）で２時間（図２７ｃ）又はＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）で２時間（図２７ｄ）刺激した。ＩＦＮ−β（図２７ａ）、ＩＲＦ７（図２７ｂ）、ＧＢＰ１（図２７ｃ）及びＩκＢ−α（図２７ｄ）のｍＲＮＡ発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図２７に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。基本的に、これらのリガンドの異なる量においても同じ結果が得られた。
【００８０】
（実施例２８）
ＨＭＧＢ欠失細胞における、ＩＦＮ−γに誘導されたＳＴＡＴ１の活性化を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＭＥＦをＩＦＮ−γ（１又は１０ユニット／ｍｌ）で３０分間刺激した。リン酸化されたＳＴＡＴ１及びβ−アクチンを、抗リン酸化ＳＴＡＴ１（ｐ−ＳＴＡＴ１）及び抗β−アクチン抗体でそれぞれ検出した。結果を図２８に示す。
【００８１】
（実施例２９）
ＨＭＧＢ欠失ＲＡＷ２６４．７細胞における、核酸による細胞質刺激に対する自然免疫応答の欠損を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、Ｂ−ＤＮＡ（図２９ａ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図２９ｂ）で示された時間刺激した。ＩＦＮ−β遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図２９に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００８２】
（実施例３０）
ＨＭＢＧ−ｓｉ又はＣｔｒｌ−ｓｉを発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、段階的に増加するＢ−ＤＮＡ（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図３０ａ及びｄ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図３０ｂ及びｅ）で６時間刺激、又はＬＰＳ（１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌ）（図３０ｃ及びｆ）で２時間刺激した。示されたサイトカイン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図３０に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。
【００８３】
（実施例３１）
ＨＭＧＢ欠失ＮＩＨ３Ｔ３細胞における、核酸による細胞質刺激に対する自然免疫応答を検討した。全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を、Ｂ−ＤＮＡ（図３１ａ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図３１ｂ）で示された時間刺激した。ＩＦＮ−β遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図３１に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００８４】
（実施例３２）
ＨＭＢＧ−ｓｉ又はＣｔｒｌ−ｓｉを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を、段階的に増加するＢ−ＤＮＡ（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図３２ａ及びｃ）又はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（０．１、１、５、１０μｇ／ｍｌ）（図３２ｂ及びｄ）で９時間刺激、又はＬＰＳ（１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌ）（図３２ｅ）で２時間刺激した。ＩＦＮ−β（図３２ａ及びｂ）又はＩＬ−６（図３２ｃ、ｄ、ｅ）のｍＲＮＡ発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図３２に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。
【００８５】
（実施例３３）
Ｂ−ＤＮＡ刺激によるインフラマソーム（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）経路の活性化と細胞死におけるＨＭＧＢの関与を検討した。
Ｈｍｇｂ１＋／＋又はＨｍｇｂ１−／−胎児肝臓造血前駆細胞由来マクロファージ（図３３ａ）、及び全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞（図３３ｂ）にＢ−ＤＮＡを脂質導入し、１２時間後に分泌された成熟ＩＬ−１βの量をＥＬＩＳＡで測定した。ＲＡＷ２６４．７細胞は５０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで１６時間刺激し、インフラマソームを活性化させた。結果を図３３に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。図３３に結果を示す。「＊」は野生型細胞又はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。ＮＤは検出されなかったことを意味する。
ＨＭＢＧ−ｓｉ又はＣｔｒｌ−ｓｉを発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、段階的に増加するＢ−ＤＮＡで刺激した。細胞は２４時間の刺激後に回収し、トリパンブルーで染色した。未処理細胞に対する生細胞の百分率を計算した。結果を図３３ｃに示す。ＨＭＧＢ−ｓｉを発現しているＲＡＷ２６４．７細胞は、ＤＮＡに誘導される細胞死に対して、より耐性であった。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。
【００８６】
（実施例３４）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＭＥＦに、ＶＳＶ（図３４ａ）又はＨＳＶ−１（図３４ｂ）を感染させ、２４時間後にウイルスタイターを測定した。結果を図３４に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００８７】
（実施例３５）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞に、ＶＳＶ（図３５ａ、ｂ、ｃ）又はＨＳＶ−１（図３５ｄ、ｅ、ｆ）を感染させた。続いて、ＩＦＮ−β（図３５ａ及びｄ）、ＩＦＮ−α１（図３５ｂ及びｅ）及びＩＦＮ−α４（ｃ及びｆ）のｍＲＮＡ発現量を測定した。結果を図３５に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示し、「＊＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０５であることを示す。ＮＤは検出されなかったことを意味する。
【００８８】
（実施例３６）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞に、ＶＳＶ又はＨＳＶ−１を感染させた。続いて、ウイルスタイターを測定した。結果を図３６に示す。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００８９】
（核酸に媒介されたＴＬＲの活性化にはＨＭＧＢが必要である）
（実施例３７）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（図３７ａ及びｂ）又はＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ（図３７ｃ及びｄ）で刺激し、ＩＬ−６（図３７ａ及びｃ）及びＴＮＦ−α（図３７ｂ及びｄ）のｍＲＮＡの発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図３７に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。ＮＤは検出されなかったことを意味する。
【００９０】
（実施例３８）
全てのＨＭＧＢを標的としたｓｉＲＮＡ（ＨＭＢＧ−ｓｉ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉ）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞を、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ、並びにＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ及びＤＯＴＡＰで刺激し、ＩＦＮ−β（図３８ａ）及びＩＦＮ−α４（図３８ｂ）のｍＲＮＡの発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。ＤＯＴＡＰ（商品名、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）はＤＮＡ、ＲＮＡなどの負に帯電した分子を真核細胞中にカチオンリポソームを介して導入するための試薬である。結果を図３８に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」はＣｔｒｌ−ｓｉ発現細胞と比較した場合にｐ＜０．０１であることを示す。
【００９１】
（実施例３９）
核酸類似体を用いた刺激による、核酸により活性化される自然免疫応答の阻害を検討した。
ＭＥＦにＢ−ＤＮＡを脂質導入した後、１μＭ ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮで０、１、２、３時間共刺激し、ＩＦＮ−βの誘導をＥＬＩＳＡで測定した。結果を図３９に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」はＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮでの刺激を伴わない、Ｂ−ＤＮＡによる刺激と比較した場合に、ｐ＜０．０１であることを示す。
【００９２】
（実施例４０）
骨髄由来Ｔｌｒ９−／−ｃＤＣｓを、５μＭ ＰＳ又は１μＭ ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮで３０分の前処理の有無の後に、５０μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（脂質導入なし）（図４０ａ）、又は２５μｇ／ｍｌのＲ８３７（図４０ｂ）で４時間刺激した。ＩＬ−１２ｐ４０ ｍＲＮＡの発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。結果を図４０に示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。「＊」は、前処理された細胞の結果に対する、前処理されなかった細胞の結果がｐ＜０．０１であることを示す。ＮＤは検出されなかったことを意味する。
【００９３】
（実施例４１）
ＨＭＧＢ１及びＲＩＧ−Ｉの細胞内局在を検討した。ＨｅＬａ細胞に、ＣＦＰタグを付けたＲＩＧ−Ｉ（ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ）及びＹＦＰタグを付けたＨＭＧＢ１（ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１）の発現ベクターを、ＲＦＰタグを付けたＲａｂ５（ＲＦＰ−Ｒａｂ５）と共に又はＲＦＰ−Ｒａｂ５なしで導入した。遺伝子導入から１６時間後、細胞をｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で２時間刺激し、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて蛍光顕微鏡観察を行った。 図４１に発現ベクター（ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ、ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１、ＲＦＰ−Ｒａｂ５）を共導入された細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。図４１の上段及び下段は、それぞれ単独（左から右に、ＲＩＧ−Ｉ、ＨＭＧＢ１、Ｒａｂ５）及び重ね合わせ（左から右に、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ＋ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ＋ＲＦＰ−Ｒａｂ５、ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１＋ＲＦＰ−Ｒａｂ５、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ＋ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１＋ＲＦＰ−Ｒａｂ５）の写真を示す。スケールバーは５μｍを示す。多くの細胞で観察された、代表的な結果を示す。ＲＩＧ−Ｉ及びＨＭＧＢ１の双方が部分的にＲａｂ５と重なっており、これは、ＲＩＧ−Ｉ及びＨＭＧＢ１のエンドソーム膜への動員、及びおそらくはＨＭＧＢによるＲＩＧ−Ｉの活性化を示している。
【００９４】
（実施例４２）
ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ及びＹＦＰ−ＨＭＧＢ１発現ベクターを共導入した細胞を、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激後に、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ６３３（ｍｉｔｏＴＲ、インビトロジェン社）で染色し、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて蛍光顕微鏡観察を行った。図４２に細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。図４２の上段及び下段は、それぞれ単独（左から右に、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ、ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１、ｍｉｔｏＴＲ）及び重ね合わせ（左から右に、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ＋ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ＋ｍｉｔｏＴＲ、ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１＋ｍｉｔｏＴＲ、ＣＦＰ−ＲＩＧ−Ｉ＋ＹＦＰ−ＨＭＧＢ１＋ｍｉｔｏＴＲ）の写真をそれぞれ示す。スケールバーは５μｍを示す。
ここで示されるように、ＲＩＧ−ＩはｍｉｔｏＴＲと重なっており、ＨＭＧＢ１及びｍｉｔｏＴＲの間には、重なりは全く見られなかった。実施例４１で示された結果と共に、この結果は、次のように解釈される。ＨＭＧＢ１によるｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）認識の後、ＲＩＧ−Ｉが活性化されてミトコンドリアに局在化し、そこでＩＰＳ−１／ＭＡＶＳと相互作用する。
これらの観察は、核酸認識及び免疫応答の活性化の一連の活動における「スナップショット」であり、この観察においては、ＲＩＧ−Ｉの一部の画分がＨＭＧＢ１と相互作用し、一方で他の画分がＨＭＧＢ１から解離してＩＰＳ−１／ＭＡＶＳと結合している。
【００９５】
図４３に、上記の実施例の結果に基づいて作成した、核酸により活性化される自然免疫応答の概略図を示す。全ての免疫原性核酸はＨＭＧＢに結合し（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ｓｅｎｓｉｎｇ、広範な認識）、これは後に続く自然免疫応答を活性化するための特異的パターン認識受容体による認識（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ ｓｅｎｓｉｎｇ、特異的な認識）に必要である。
【００９６】
（実施例４３）
マイクロプレートを用いて、固相化されたＨＭＧＢタンパクを用いた、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤のスクリーニング方法を評価した。５μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解した組換えＨＭＧＢ１タンパクを、１００μｌずつ、９６ウェルマイクロプレートに分注し、２５℃で１時間放置して固相化した。各ウェルをＰＢＳ溶液で２回洗浄後、２％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を１００μｌずつ加え、２５℃で１時間放置してブロッキングした。各ウェルをＰＢＳ溶液で２回洗浄後、ＰＢＳ溶液のみ、７５μｇ／ｍｌのＢ−ＤＮＡ、１００μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ及び２５μｇ／ｍｌのＲ８３７を溶解したＰＢＳ溶液を１００μｌずつ添加し、２５℃で１時間放置した。続いて、各ウェルをＰＢＳ溶液で２回洗浄後、１μＭの５’末端をビオチン標識したＢ−ＤＮＡ又はＰＢＳ溶液のみを１００μｌずつ加え、２５℃で１時間放置した。続いて、各ウェルをＰＢＳ溶液で２回洗浄後、ＰＢＳ溶液で２００倍希釈したＨＲＰ標識抗ビオチン抗体（Ｒ＆Ｄ社）を１００μｌずつ加え、２５℃で１時間放置した。各ウェルをＰＢＳ溶液で２回洗浄後、ＨＲＰの基質溶液（ＢＤ バイオサイエンス社）を１００μｌずつ加え、２５℃で１５分間発色させた。各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ ６８０、バイオラッド社）で定量した。図４５（ａ）に発色後のマイクロプレートの写真を示し、図４５（ｂ）に各サンプルの吸光度のグラフを示す。データは全て平均±標準偏差（ｎ＝３）として表示した。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明により、核酸により活性化される自然免疫応答、すなわち、死細胞による過剰な免疫応答、移植臓器拒絶反応、自己免疫疾患、アレルギー、敗血症、炎症による腫瘍の増殖、核酸含有病原体により引き起こされる炎症性疾患などの新たな原理に基づいた抑制剤が提供される。本発明の別の態様において、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法が提供される。
【符号の説明】
【００９８】
１…ＨＭＧＢタンパク、２…陽性対照物質、３…被検物質、４…ビオチン標識Ｂ−ＤＮＡ、５…抗ビオチン抗体、６…基質。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー又はその誘導体からなる、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤。
【請求項２】
細胞内において、自然免疫応答を活性化する核酸とＨＭＧＢタンパクとの結合を阻害する、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項３】
核酸により活性化される自然免疫応答が、死細胞による過剰な免疫応答、移植臓器拒絶反応、自己免疫疾患、アレルギー、敗血症、炎症による腫瘍の増殖、及び核酸含有病原体により引き起こされる炎症性疾患からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の抑制剤。
【請求項４】
被検物質の存在下及び非存在下で、ＨＭＧＢタンパクと、標識核酸とを混合する混合ステップと、
標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクを定量する定量ステップと、
被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも少ない場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定し、
被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも多い場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤であると判定する、
判定ステップと、
を含む、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
被検物質の存在下及び非存在下で、固相化されたＨＭＧＢタンパクを放置する放置ステップと、
放置ステップ後の固相化されたＨＭＧＢタンパクに、標識核酸を接触させる、標識核酸接触ステップと、
固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸を定量する定量ステップと、
被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも少ない場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定し、
被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも多い場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤であると判定する、
判定ステップと、
を含む、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法。
【請求項１】
塩基フリーホスホロチオエートデオキシリボースホモポリマー又はその誘導体からなる、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤。
【請求項２】
細胞内において、自然免疫応答を活性化する核酸とＨＭＧＢタンパクとの結合を阻害する、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項３】
核酸により活性化される自然免疫応答が、死細胞による過剰な免疫応答、移植臓器拒絶反応、自己免疫疾患、アレルギー、敗血症、炎症による腫瘍の増殖、及び核酸含有病原体により引き起こされる炎症性疾患からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の抑制剤。
【請求項４】
被検物質の存在下及び非存在下で、ＨＭＧＢタンパクと、標識核酸とを混合する混合ステップと、
標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクを定量する定量ステップと、
被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも少ない場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定し、
被検物質の存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量が、被検物質の非存在下で標識核酸に結合したＨＭＧＢタンパクの量よりも多い場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤であると判定する、
判定ステップと、
を含む、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
被検物質の存在下及び非存在下で、固相化されたＨＭＧＢタンパクを放置する放置ステップと、
放置ステップ後の固相化されたＨＭＧＢタンパクに、標識核酸を接触させる、標識核酸接触ステップと、
固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸を定量する定量ステップと、
被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも少ない場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤であると判定し、
被検物質の存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量が、被検物質の非存在下で放置ステップを行った、固相化されたＨＭＧＢタンパクに結合した標識核酸の量よりも多い場合に、被検物質が、核酸により活性化される自然免疫応答の促進剤であると判定する、
判定ステップと、
を含む、核酸により活性化される自然免疫応答の抑制剤又は促進剤のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２２】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４３】
【図４４】
【図５】
【図６】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２１】
【図２３】
【図２８】
【図４１】
【図４２】
【図４５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２２】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４３】
【図４４】
【図５】
【図６】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２１】
【図２３】
【図２８】
【図４１】
【図４２】
【図４５】
【公開番号】特開２０１１−８４５１７（Ｐ２０１１−８４５１７Ａ）
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３８６０６（Ｐ２００９−２３８６０６）
【出願日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【出願人】（５００４４１５８５）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【出願人】（５００４４１５８５）
【Ｆターム（参考）】
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