核酸のハイブリッド形成における修飾塩基を含むオリゴヌクレオチドの使用
本発明は、核酸のハイブリッド形成、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシング（ＲＮＡｉ）に用いられる特異的に修飾されたＤＮＡ塩基を含有するオリゴヌクレオチド類似体の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、それぞれをその全体として参照により本明細書に組み込まれている、２００７年１１月５日に出願した先の米国仮出願第６０／９８５，５５２号の恩典を主張するものである。
【０００２】
本発明は、核酸のハイブリッド形成、核酸の増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による）及びｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシング（ＲＮＡｉ）に用いられる特異的に修飾されたＤＮＡ塩基を含有する修飾オリゴヌクレオチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
オリゴヌクレオチド及び修飾オリゴヌクレオチドの使用は、現代の療法において極めて重要であり、十分に実証されている（Ｕｈｌｍａｎｎら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９９０、９０、５４３〜５８４頁、Ｃｒｏｏｋｅら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、Ｍｅｓｍａｅｋａｒら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５、２８、３６６〜３７４頁、Ｓｔｅｉｎ、「Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｕｓｅ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｅｒｐｌｅｘｅｄ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００１、１０８、６４１〜６４４頁）。ＤＮＡ又はＲＮＡ標的に対するアンチセンス・ポリヌクレオチドの特異的結合により、核酸の複製、転写又は翻訳を不活性化し、それにより、癌及びウイルス感染などの疾患をコントロールするためのメカニズムを提供することができる。したがって、標的に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドの結合は、例えば、ウイルスのライフサイクル又は癌細胞の成長を妨げるために、様々な環境における遺伝子発現を変化させるのに用いることができる。
【０００４】
結合性オリゴヌクレオチドのアレイは、バイオテクノロジー産業及び関連分野においてますます重要なツールになっている。固体担体表面上に固着させたこれらのアレイは、薬物スクリーニング、核酸配列決定、突然変異分析などを含む多くの分野で適用されている。
【０００５】
例えば、核酸ハイブリッド形成は、所定の試料中の特定の核酸の同定、測定及び存在の検出のますます重要な手段になっている。したがって、医学診断、法医学、環境及び食品試験すべてにおいて、試料中の所定の生物学的混入物又は微生物の存否について試験する急速、簡単且つ正確な方法として核酸ハイブリッド形成を用いることが有効であった。メカニズムの面では、核酸ハイブリッド形成は、相補的ヌクレオチド配列を有する核酸鎖の対応する領域と安定なハイブリッドを形成する１本鎖核酸の能力を利用するものである。そのようなハイブリッドは、３本鎖構造も知られているが、通常、２本鎖二重らせんからなっている。核酸二重らせんにおいて、各塩基対が安定性に寄与している。したがって、二重らせんが短いほど、二重らせんの安定性に対する個々の塩基対の相対的な寄与は大きくなる。結果として、完全な対合と誤対合との安定性の差は、オリゴヌクレオチドが短いほど、大きくなる。しかし、短いオリゴヌクレオチドは弱くハイブリッド形成するので、より強い結合性の分子を用いることにより、それを強くすることができる可能性がある。
【０００６】
核酸の指数関数的増幅のための多くの方法が開発された。これらは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自己持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）及びＱ−Ｂｅｔａリプリカーゼを用いる増幅などである。ＰＣＲの成功は、ＤＮＡの１本鎖にプライマーが結合する効率に依存する。再び、結合が強いほど、所定のサイクルにおいて増幅されるＤＮＡが多くなる。
【０００７】
哺乳動物細胞におけるＲＮＡ誘発性遺伝子サイレンシングは、最小限３つの異なるレベルのコントロール、すなわち、（ｉ）転写の不活性化（ｓｉＲＮＡ誘導ＤＮＡ及びヒストンメチル化）、（ｉｉ）小干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）誘発性ｍＲＮＡ分解、及び（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ誘発性転写減弱を意味すると現在のところ考えられている。ｓｉＲＮＡによってもたらされるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、長時間持続させることができ、多細胞分裂より有効である。したがって、過剰発現遺伝子に対する療法を開発することに加えて、ｓｉＲＮＡを媒介とする方法により遺伝子機能を評価する能力は、遺伝子機能分析、薬物標的のバリデーション及びゲノム全体の研究を促進する刺激的且つ有用なツールである。
【０００８】
上のすべての分野において、修飾ヌクレオチドを用いることにより効率を高める試みがなされた。したがって、プリンを生成させるための水素によるアデノシンの６位におけるアミノ基の置換、２−アミノプリンを生成させるための水素による、又は６−チオグアノシンを生成させるための硫黄による、グアノシンの６−ケト酸素の置換、及び４−チオチミジン又は４−ヒドロチミジンをそれぞれ生成させるための硫黄又は水素によるチミジンの４−ケト酸素の置換を含む、含窒素塩基における修飾を有する多くのオリゴヌクレオチド誘導体が構築された。これらのすべてのヌクレオチド類似体は、オリゴヌクレオチドの合成のための反応物として用いることができる。同様に、リボフラノシル又はデオキシリボフラノシル部分の修飾を有する多くのヌクレオチド誘導体が報告された。そのような修飾塩基を含むほとんどのオリゴヌクレオチドは、高い細胞取り込み、ヌクレアーゼ抵抗性及び／又は高い物質結合性を念頭において考案された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国仮出願第６０／９８５，５５２号
【特許文献２】米国特許公開第２００７０２５９８３０号
【特許文献３】国際特許公開ＷＯ２００７／１２５１７３
【特許文献４】米国特許第３，６８７，８０８号
【特許文献５】米国特許第４，４６９，８６３号
【特許文献６】米国特許第４，４７６，３０１号
【特許文献７】米国特許第５，０２３，２４３号
【特許文献８】米国特許第５，１７７，１９６号
【特許文献９】米国特許第５，１８８，８９７号
【特許文献１０】米国特許第５，２６４，４２３号
【特許文献１１】米国特許第５，２７６，０１９号
【特許文献１２】米国特許第５，２７８，３０２号
【特許文献１３】米国特許第５，２８６，７１７号
【特許文献１４】米国特許第５，３２１，１３１号
【特許文献１５】米国特許第５，３９９，６７６号
【特許文献１６】米国特許第５，４０５，９３９号
【特許文献１７】米国特許第５，４５３，４９６号
【特許文献１８】米国特許第５，４５５，２３３号
【特許文献１９】米国特許第５，４６６，６７７号
【特許文献２０】米国特許第５，４７６，９２５号
【特許文献２１】米国特許第５，５１９，１２６号
【特許文献２２】米国特許第５，５３６，８２１号
【特許文献２３】米国特許第５，５４１，３０６号
【特許文献２４】米国特許第５，５５０，１１１号
【特許文献２５】米国特許第５，５６３，２５３号
【特許文献２６】米国特許第５，５７１，７９９号
【特許文献２７】米国特許第５，５８７，３６１号
【特許文献２８】米国特許第５，１９４，５９９号
【特許文献２９】米国特許第５，５６５，５５５号
【特許文献３０】米国特許第５，５２７，８９９号
【特許文献３１】米国特許第５，７２１，２１８号
【特許文献３２】米国特許第５，６７２，６９７号
【特許文献３３】米国特許第５，６２５，０５０号
【特許文献３４】米国特許第５，０３４，５０６号
【特許文献３５】米国特許第５，１６６，３１５号
【特許文献３６】米国特許第５，１８５，４４４号
【特許文献３７】米国特許第５，２１４，１３４号
【特許文献３８】米国特許第５，２１６，１４１号
【特許文献３９】米国特許第５，２３５，０３３号
【特許文献４０】米国特許第５，２６４，５６２号
【特許文献４１】米国特許第５，２６４，５６４号
【特許文献４２】米国特許第５，４０５，９３８号
【特許文献４３】米国特許第５，４３４，２５７号
【特許文献４４】米国特許第５，４７０，９６７号
【特許文献４５】米国特許第５，４８９，６７７号
【特許文献４６】米国特許第５，５４１，３０７号
【特許文献４７】米国特許第５，５６１，２２５号
【特許文献４８】米国特許第５，５９６，０８６号
【特許文献４９】米国特許第５，６０２，２４０号
【特許文献５０】米国特許第５，６１０，２８９号
【特許文献５１】米国特許第５，６０８，０４６号
【特許文献５２】米国特許第５，６１８，７０４号
【特許文献５３】米国特許第５，６２３，０７０号
【特許文献５４】米国特許第５，６６３，３１２号
【特許文献５５】米国特許第５，６３３，３６０号
【特許文献５６】米国特許第５，６７７，４３７号
【特許文献５７】米国特許第５，７９２，６０８号
【特許文献５８】米国特許第５，６４６，２６９号
【特許文献５９】米国特許第５，６７７，４３９号
【特許文献６０】米国特許第５，５３９，０８２号
【特許文献６１】米国特許第５，７１４，３３１号
【特許文献６２】米国特許第５，７１９，２６２号
【特許文献６３】米国特許第４，９８１，９５７号
【特許文献６４】米国特許第５，１１８，８００号
【特許文献６５】米国特許第５，３１９，０８０号
【特許文献６６】米国特許第５，３５９，０４４号
【特許文献６７】米国特許第５，３９３，８７８号
【特許文献６８】米国特許第５，４４６，１３７号
【特許文献６９】米国特許第５，４６６，７８６号
【特許文献７０】米国特許第５，５１４，７８５号
【特許文献７１】米国特許第５，５１９，１３４号
【特許文献７２】米国特許第５，５６７，８１１号
【特許文献７３】米国特許第５，５７６，４２７号
【特許文献７４】米国特許第５，５９１，７２２号
【特許文献７５】米国特許第５，５９７，９０９号
【特許文献７６】米国特許第５，６１０，３００号
【特許文献７７】米国特許第５，６２７，０５３号
【特許文献７８】米国特許第５，６３９，８７３号
【特許文献７９】米国特許第５，６４６，２６５号
【特許文献８０】米国特許第５，６５８，８７３号
【特許文献８１】米国特許第５，６７０，６３３号
【特許文献８２】米国特許第５，７９２，７４７号
【特許文献８３】米国特許第５，７００，９２０号
【特許文献８４】ＷＯ９８／３９３５２
【特許文献８５】ＷＯ９９／１４２２６
【特許文献８６】米国特許第４，８４５，２０５号
【特許文献８７】米国特許第５，１３０，３０２号
【特許文献８８】米国特許第５，１３４，０６６号
【特許文献８９】米国特許第５，１７５，２７３号
【特許文献９０】米国特許第５，３６７，０６６号
【特許文献９１】米国特許第５，４３２，２７２号
【特許文献９２】米国特許第５，４５７，１８７号
【特許文献９３】米国特許第５，４５９，２５５号
【特許文献９４】米国特許第５，４８４，９０８号
【特許文献９５】米国特許第５，５０２，１７７号
【特許文献９６】米国特許第５，５２５，７１１号
【特許文献９７】米国特許第５，５５２，５４０号
【特許文献９８】米国特許第５，５８７，４６９号
【特許文献９９】米国特許第５，５９４，１２１号
【特許文献１００】米国特許第５，５９６，０９１号
【特許文献１０１】米国特許第５，６１４，６１７号
【特許文献１０２】米国特許第５，６４５，９８５号
【特許文献１０３】米国特許第５，８３０，６５３号
【特許文献１０４】米国特許第５，７６３，５８８号
【特許文献１０５】米国特許第６，００５，０９６号
【特許文献１０６】米国特許第５，６８１，９４１号
【特許文献１０７】米国特許第５，７５０，６９２号
【特許文献１０８】米国仮出願第６０／９８５，５４８号
【特許文献１０９】米国仮出願第６１／０５７，６８５号
【特許文献１１０】米国仮出願第６０／７９７，４４８号
【特許文献１１１】米国仮出願第１１／７４２，３８４号
【特許文献１１２】米国特許出願公開第２００７／０２５９８３０号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｕｈｌｍａｎｎら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９９０、９０、５４３〜５８４頁
【非特許文献２】Ｃｒｏｏｋｅら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）
【非特許文献３】Ｍｅｓｍａｅｋａｒら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５、２８、３６６〜３７４頁
【非特許文献４】Ｓｔｅｉｎ、「Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｕｓｅ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｅｒｐｌｅｘｅｄ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００１、１０８、６４１〜６４４頁
【非特許文献５】Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：Ｔｈｅ Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ」、増刊１、第１６巻、編集者Ｄ．Ｊ．Ｂｒｏｗｎ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９７０、２０２〜２２９頁
【非特許文献６】Ｋｈａｌｙｕｌｌｉｎら、「Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ ｐｕｒｉｎｅｓ」、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９２、２６、２７０〜２８４頁
【非特許文献７】Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７〜１５００頁
【非特許文献８】Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６〜５０４頁
【非特許文献９】Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５９〜８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０
【非特許文献１０】Ｅｎｇｌｉｓｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３頁
【非特許文献１１】Ｓａｎｇｈｖｉ、第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９〜３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ及びＬｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３
【非特許文献１２】Ａｕｓｂｅｌら（編）、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９４）、６．０．３〜６．４．１０頁
【非特許文献１３】Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、９．４７〜９．５１頁
【非特許文献１４】Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９９、２１５、４０３〜４１０頁
【非特許文献１５】Ｚｈａｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１９９７、７、６４９〜６５６頁
【非特許文献１６】Ｇｕｏら、Ｃｅｌｌ、１９９５、８１、６１１〜６２０頁
【非特許文献１７】Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、１５５０２〜１５５０７頁
【非特許文献１８】Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９１、８０６〜８１１頁
【非特許文献１９】Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２、２９５、６９４〜６９７頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、相補的核酸に対するそれらの結合能力を増大させ、核酸相補鎖とのそれらのハイブリッド形成を増加させることができる、修飾核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドに関する。開示化合物のオリゴヌクレオチド部分における修飾核酸塩基の数の性質によって、相補的標的核酸に対する化合物の結合能力を、一般的な相補的オリゴヌクレオチドと比べて数倍も増加させることができる。
【００１２】
核酸のハイブリッド形成、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシング（ＲＮＡｉ）におけるそのような修飾オリゴヌクレオチド類似体の使用が本発明の主題である。本発明の１つの態様は、核酸ハイブリッド形成の標識プローブとして用いるオリゴヌクレオチド類似体である。このハイブリッド形成としては、とりわけ、プローブのＤＮＡとのハイブリッド形成（例えば、サザン・ハイブリッド形成）、ＲＮＡとのハイブリッド形成（例えば、ノーザン・ハイブリッド形成）、プローブのチップに結合した核酸配列とのハイブリッド形成などが挙げられる。本発明の他の態様は、ＰＣＲ反応時にＰＣＲプライマーとして用いる１つのオリゴヌクレオチド類似体又は１対若しくは複数対のオリゴヌクレオチド類似体である。これらのＰＣＲ反応は、例として、通常のＰＣＲ、実時間ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲなどがあり、ホスホジエステル結合の反復触媒合成が起こる一般的にすべての各種反応が、以前に合成された２本鎖核酸鎖の高温による変性により中断される。本発明の他の態様は、オリゴヌクレオチド類似体を非修飾オリゴヌクレオチドともに、或いは他の修飾オリゴヌクレオチドともに用いて、小干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をアニーリングし、アニーリングしたｓｉＲＮＡを用いて、対応するｓｉＲＮＡに対して相補的な核酸配列をサイレンシングすることである。言及したｓｉＲＮＡは、トランスフェクション、マイクロインジェクション、ボンバードメント、ウイルスベクター又は他の技術を用いて細胞内に導入することができる。言及したサイレンシングは、例えば、標的核酸の配列特異的分解又は標的核酸の配列特異的翻訳阻害を意味する。
【００１３】
本発明の修飾オリゴヌクレオチドの例外的な結合力を考慮して、本発明の１つの態様は、標的核酸の鎖との修飾オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を可能にする条件下で、既知の配列の標的核酸を前記標的核酸の鎖と少なくとも部分的に相補的である１配列の核酸塩基を有する修飾オリゴヌクレオチドと接触させることを含み、ハイブリッド形成修飾オリゴヌクレオチドが標的核酸の発現を阻害し、修飾オリゴヌクレオチドが５〜１５０個の核酸塩基を含み、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基の少なくとも１つが５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシトシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニン及び８−ヒドロキシグアニンらなる群から選択される、標的核酸の発現を阻害する方法である。
【００１４】
１つの態様において、標的核酸の発現を少なくとも２０％阻害する。いくつかの態様において、標的核酸は、ＲＮＡであり、さらなる態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、本質的に１本鎖である。いくつかの態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドとともに用い、２本の鎖の少なくとも１本の鎖が少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む修飾オリゴヌクレオチドである、２本鎖である。
【００１５】
本発明の他の態様は、細胞内に存在する標的核酸に関し、修飾オリゴヌクレオチドと標的核酸との接触が細胞内への修飾オリゴヌクレオチドの導入を含む。これらの態様のいくつかにおいて、接触は、修飾オリゴヌクレオチドによる細胞の形質転換及びトランスフェクションからなる群から選択される。
【００１６】
他の態様において、標的核酸は、生物の細胞内に存在し、接触は、修飾オリゴヌクレオチド及び製薬上許容される担体を含む組成物を生物に投与することを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、リポソームなどの送達媒体をさらに含む。種々の態様における生物は、哺乳動物であり、他の態様においてヒトである。
【００１７】
前述のことに加えて、本発明は、さらなる態様として、標的核酸の鎖（１、２本又はそれ以上の鎖、通常１又は２本を有していてよい）との修飾オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を可能にする条件下で、標的核酸を修飾オリゴヌクレオチドと接触させること、及び標的核酸の鎖とハイブリッド形成した修飾オリゴヌクレオチドを検出することによって標的核酸を検出することを含み、修飾オリゴヌクレオチドが標的核酸の鎖の配列と少なくとも部分的に相補的である１配列の核酸塩基を含み、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基の少なくとも１つが５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシトシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニン及び８−ヒドロキシグアニンからなる群から選択される、標的核酸を修飾オリゴヌクレオチドにより検出する方法を含む。
【００１８】
いくつかの態様において、標的核酸は、固体担体に固定化されている。さらなる態様において、固定化標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。前述の態様のいくつかにおいて、検出は、本質的に定量的である。例えば、ハイブリッド形成の測定は、標的核酸の量の絶対的又は相対的尺度を提供する。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、鋳型核酸を、ＰＣＲアニーリング条件下における鋳型核酸との修飾オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を可能にするのに十分に、鋳型核酸の一部と相補的である配列を含む修飾オリゴヌクレオチドと接触させることを含み、ハイブリッド形成修飾オリゴヌクレオチドが第１の鎖のＰＣＲ生成物を生成させるＰＣＲ増幅条件下でＰＣＲプライマーとしての役割を果たし、修飾オリゴヌクレオチドが５〜１５０個の核酸塩基を含み、核酸塩基の少なくとも１つが５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシトシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニン及び８−ヒドロキシグアニンらなる群から選択される修飾核酸塩基である、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法である。
【００２０】
いくつかの態様において、ＰＣＲは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型核酸、修飾オリゴヌクレオチド及びヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を含有する反応混合物を調製することを含む。ＭｇＣｌ２、緩衝剤などを含む、ＰＣＲ反応に用いる試薬がよく知られている。
【００２１】
他の態様において、ＰＣＲ反応混合物は、標的核酸の鎖の一部又は第１の鎖のＰＣＲ生成物の一部の１つと相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドをさらに含む。種々の態様において、第２のオリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドであり、修飾オリゴヌクレオチドが５〜１５０個の核酸塩基を含み、核酸塩基の少なくとも１つが５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシトシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニン及び８−ヒドロキシグアニンらなる群から選択される修飾核酸塩基である。いくつかの態様において、鋳型核酸はＤＮＡであるが、他の態様において、鋳型核酸はＲＮＡである。
【００２２】
本発明は、増幅生成物を実時間で定量する、方法も提供する。
【００２３】
さらなる態様において、ポリメラーゼ連鎖反応は、鋳型核酸を変性するステップと、修飾オリゴヌクレオチドと鋳型核酸とをアニーリング条件下でアニーリングするステップと、アニーリングした修飾オリゴヌクレオチドを伸長させることにより、ポリメラーゼ連鎖反応生成物を合成するステップの繰り返しを含む。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、検出可能な標識を含む。
【００２５】
本発明の方法は、いくつかの態様において、ハイブリッド形成条件が４〜１０のｐＨを含むことを提供する。他の態様において、ハイブリッド形成条件は、４〜６のｐＨを含む。
【００２６】
本発明のいくつかの変形形態において、本発明により提供される修飾オリゴヌクレオチドは、１０〜１００核酸塩基の長さを有することが企図される。種々の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、１０〜５０核酸塩基の長さを有する。さらなる態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、２０〜３０核酸塩基の長さを有する。
【００２７】
いくつかの態様において、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基の０．５％〜４０％は、メルカプト核酸塩基又はヒドロキシ核酸塩基を含む。
【００２８】
前述のことに加えて、本発明は、上で具体的に述べた変形形態より多少とも範囲が狭い本発明のすべての実施形態を追加の態様として含む。例えば、本発明の態様を簡潔のために属又は値の範囲に言及することにより記述した場合があるが、属の各メンバー及び範囲内の各値若しくは部分的な範囲は、本発明の態様であるものとされることを理解すべきである。同様に、本発明の各種態様及び特徴を組み合わせて、本発明の範囲内にあることが意図される追加の態様を作ることができる。
【００２９】
単数形（冠詞「ａ」又は「ａｎ」の使用を含む）で記述した本発明の態様は、文脈上より狭い解釈が明らかに必要でない限り、１つ又は複数を含む実施形態を含むと理解すべきである。「含む」という用語は、付加的な要素又は特徴が許容されることを意味する。
【００３０】
本出願人（１又は複数人）は本明細書に添付した特許請求の範囲の全範囲を発明したが、本明細書に添付した特許請求の範囲は、それらの範囲内に他者の従来技術の仕事を含まないものとする。特許請求の範囲の範囲内の法定の従来技術が特許局又は他の団体又は個人により本出願人に知らされる場合、本出願人（１又は複数人）は、そのような特許請求の範囲の範囲からそのような法定の従来技術又は法定の従来技術の明らかな変形形態を具体的に除外するためにそのような特許請求の範囲の内容を再定義するように適用特許法の下に補正権を行使する権利を有する。そのような補正された特許請求の範囲により定義された発明の変形形態も本発明の態様であるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】１ｐｍｏｌ濃度の修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の多項式フィッティングを示す図である。
【図２】５ｐｍｏｌ濃度の修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の多項式フィッティングを示す図である。
【図３】１ｎｇのＤＮＡに対する修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の多項式フィッティングを示す図である。
【図４】５ｎｇのＤＮＡに対する修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の多項式フィッティングを示す図である。
【図５】ハイブリッド形成における修飾オリゴヌクレオチドの効率を示す図である。
【図６】１．２５ｎｇの相補的ｍＲＮＡに対する修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の多項式フィッティングを示す図である。
【図７】２．５ｎｇの相補的ｍＲＮＡに対する修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の多項式フィッティングを示す図である。
【図８】種々の標的濃度について様々なｐＨ値のオリゴヌクレオチドｆ１の相対的結合効率の多項式フィッティングを示す図である。
【図９】種々の標的濃度について様々なｐＨ値のオリゴヌクレオチドｆ２の相対的結合効率の多項式フィッティングを示す図である。
【図１０】ＰＣＲにおける修飾オリゴヌクレオチドの使用を示す図である。ＰＣＲにおけるアニーリング温度の上昇に対する、修飾塩基を有するオリゴヌクレオチドの適用性及び効率を示す。
【図１１】ｅＧＦＰトランス遺伝子発現に対する修飾ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、オリゴヌクレオチドを用いるアンチセンス及び他の方法に用いられる特性を有するオリゴヌクレオチドを含む新規な組成物を提供する。本発明の化合物は、天然核酸塩基に対する高い結合効率を有する１つ又は複数の修飾核酸塩基を有するアンチセンス及び他のオリゴヌクレオチドを含む。修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物は、核酸のハイブリッド形成、ＰＣＲ及びｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシング（ＲＮＡｉ）に有用である。
【００３３】
オリゴヌクレオチド
本発明に関連して、「オリゴヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマー若しくはポリマー又はリボ核酸（ＲＮＡ）又はその擬似体、キメラ、類似体及び相同体を意味する。この用語は、天然核酸塩基、糖及び共有結合性ヌクレオシド内（主鎖）結合並びに例えば、標的核酸とハイブリッド形成又は相補的オリゴヌクレオチドと相互作用するとき、天然オリゴヌクレオチドと同様に機能する非天然部分を有するオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾又は置換オリゴヌクレオチドは、例えば、高い細胞取り込み、標的核酸に対する高い親和性及びヌクレアーゼの存在下での高い安定性のような望ましい特性があるため、天然形よりしばしば好ましい。
【００３４】
本発明の化合物の生物学的対応物（例えば、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ）に対する結合の有効性の増大は、両性イオン性又はイオン性互変異性体を有する修飾核酸塩基又は他の類似体の組み込みにより達成される。本発明の化合物は、両性イオン又はイオン性互変異性体を有する修飾核酸塩基又は他の類似体を有する、少なくとも１つの核酸塩基を有する。好ましい実施形態において、修飾核酸塩基は、５−ヒドロキシシトシン及び８−ヒドロキシグアニンから選択されるヒドロキシ核酸塩基又は５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン及び８−メルカプトアデニンから選択されるメルカプト核酸塩基である。両方とも参照により本明細書に組み込まれている米国特許公開第２００７０２５９８３０号及び国際特許公開ＷＯ２００７／１２５１７３に示されているように、ヒドロキシ核酸塩基又はメルカプト核酸塩基と標的核酸の核酸塩基とのより安定な水素結合が起こり得る。したがって、それらは、相補的核酸鎖に対してより有効に結合するとみなすことができる。
【００３５】
修飾核酸塩基における酸性互変異性基は、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３Ｈ等などの他の酸性基であってよい。
【００３６】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５−ヒドロキシウラシル陰イオンの１つ又は複数の互変異性形を含む。他の実施形態において、本発明の化合物は、ヒドロキシ塩基５−ヒドロキシシトシンを含む。他の実施形態において、ヒドロキシ塩基は、８−ヒドロキシアデニン及びその陰イオンの互変異性形である。本発明の他の実施形態は、８−ヒドロキシグアニン及びその陰イオンの互変異性形により修飾された本発明の化合物を提供する。これらの核酸塩基の互変異性形は、参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２００７／１２５１７３にさらに詳細に記載されている。
【００３７】
本明細書で企図されるさらなる修飾核酸塩基としては、メルカプト修飾核酸塩基などがある。メルカプト修飾ピリミジン及びプリンの合成は、当技術分野で知られている（例えば、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：Ｔｈｅ Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ」、増刊１、第１６巻、編集者Ｄ．Ｊ．Ｂｒｏｗｎ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９７０、２０２〜２２９頁及びＫｈａｌｙｕｌｌｉｎら、「Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ ｐｕｒｉｎｅｓ」、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９２、２６、２７０〜２８４頁を参照）。企図されたメルカプト核酸塩基としては、５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン及び８−メルカプトアデニンなどがある。
【００３８】
本明細書で用いているように、ヒドロキシ核酸塩基のそれぞれは、対向核酸塩基に安定に水素結合しているとき、核酸塩基と相補的とみなされる。したがって、場合によって、５−ヒドロキシウラシルはアデニンと相補的であり、５−ヒドロキシシトシンはグアニンと相補的であり、８−ヒドロキシアデニンはウラシル及び／又はチミンと相補的であり、８−ヒドロキシグアニンはシトシンと相補的である。ヒドロキシ核酸塩基と標的核酸の核酸塩基との他の安定な水素結合は起こり得る。したがって、ヒドロキシ核酸塩基は、安定な水素結合が起こる標的核酸の核酸塩基と相補的とみなされる。
【００３９】
本発明の所定の化合物におけるヒドロキシ核酸塩基及び／又はメルカプト核酸塩基の数は、化合物のオリゴヌクレオチド部分の核酸塩基の総数の少なくとも１％から１００％までである。本発明の化合物に複数のヒドロキシ核酸塩基又はメルカプト核酸塩基が存在する場合、ヒドロキシ核酸塩基又はメルカプト核酸塩基は、同じ又は異なって（異なる塩基及び／又は修飾の種類のいずれかの組合せ）いてよい。本明細書で述べるオリゴヌクレオチドにおける核酸塩基の１０％〜９０％、２０％〜８０％、３０％〜７０％、４０％〜６０％又は５０％が修飾核酸塩基であると予測される。核酸塩基の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％が修飾核酸塩基であると企図される。
【００４０】
本発明による化合物は、好ましくは約５〜約１５０核酸塩基（すなわち、約５〜約１５０個の結合ヌクレオシド）を含む。当業者は、本発明が長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、及び１５０核酸塩基の化合物を含むことを十分認識するであろう。
【００４１】
１つの好ましい実施形態において、本発明の化合物は、長さが１０〜１００核酸塩基である。当業者は、これが長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００核酸塩基の化合物を含むことを十分認識するであろう。
【００４２】
他の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、長さが１０〜５０核酸塩基である。当業者は、これが長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０核酸塩基の化合物を含むことを十分認識するであろう。
【００４３】
他の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、長さが２０〜３０核酸塩基である。当業者は、これが長さが２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０核酸塩基の化合物を含むことを十分認識するであろう。
【００４４】
特に好ましい化合物は、約１０〜約５０核酸塩基のオリゴヌクレオチドであり、より好ましくは約２０〜約３０核酸塩基を含むものであり、抗ウイルス薬として実例試験で用いた化合物は、２１又は２３核酸塩基から構成されていた。
【００４５】
上述のように、オリゴヌクレオチドは、１００％修飾核酸塩基を含んでいてよい。したがって、オリゴヌクレオチドの長さによって、オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、又は１５０修飾核酸塩基を含んでいてよく、修飾塩基は、メルカプト核酸塩基又はヒドロキシ核酸塩基である。
【００４６】
本発明の化合物は、キレート化部分を場合によってさらに含む。キレート化部分は、金属リガンドとして機能する。それらは、金属イオンを安定的にキレート化する。特定の金属−リガンド錯体は、ホスホジエステル結合を切断するのに有効であることが示された。キレート化部分をアンチセンス活性を示す能力のあるオリゴヌクレオチドに組み込んだ状態では、標的核酸の１つ又は複数のホスホジエステル結合を分解又は切断する能力がそれにあるため、標的核酸を阻害するオリゴヌクレオチドの効力は増加する。したがって、本発明の化合物は、金属イオンをキレート化することができるキレート化部分をさらに含む。金属イオンは、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム及びルテチウムからなる群から選択される。１つの態様において、好ましいイオンは、ユウロピウム又はランタンのイオンである。金属のイオンは、＋１、＋２、＋３、＋４又は＋５などの安定なイオンであってよい。好ましいイオンは、Ｌａ（ＩＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）、Ｈｏ（ＩＩＩ）及びＣｅ（ＩＶ）である。
【００４７】
企図されるキレート化部分としては、下記のような式により表されるものが挙げられる。
【化１】
【００４８】
ここでＲは、オリゴヌクレオチドの残部である。
【００４９】
Ｒ１は、水素、Ｃ１〜８アルカン、Ｃ２〜８アルケン、Ｃ２〜８アルキン、アシルＣ１〜８アルカン、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１〜８アルキルアリール及びＣ１〜８アルキルヘテロアリールから選択される。
【００５０】
Ｒ２は、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ２〜８アルケン、Ｃ２〜８アルキン、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１〜８アルキルアリール、Ｃ１〜８アルキルヘテロアリール及びアシルＣ１〜８アルカンから独立に選択される。また、
【００５１】
Ｒ３は、水素、Ｃ１〜８アルカン、Ｃ２〜８アルケン、Ｃ２〜８アルキン、アシルＣ１〜８アルカン、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１〜８アルキルアリール及びＣ１〜８アルキルヘテロアリールからなる群から独立に選択される。
【００５２】
「アルキル」という用語は、示される炭素原子数を含む直鎖及び分枝炭化水素基、一般的にメチル、エチル並びに直鎖及び分枝プロピル及びブチル基を含む。炭化水素基は、１６個までの炭素原子を含んでいてよい。「アルキル」という用語は、「架橋アルキル」、例えば、Ｃ６〜Ｃ１６二環式又は多環式炭化水素基、例えば、ノルボルニル、アダマンチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［３．２．１］オクチル及びデカヒドロナフチルを含む。「アルキル」という用語はまた、例えば、１つ又は複数のハロゲン原子、１つ又は複数のヒドロキシル基、或いは１つ又は複数のチオール基で場合によって置換されているアルキル基を含む。「シクロアルキル」という用語は、環状Ｃ３〜Ｃ８炭化水素基、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシル及びシクロペンチルと定義される。「ヘテロシクロアルキル」は、少なくとも１つのヘテロ原子が環状構造に存在することを除いて、シクロアルキルと同様に定義される。適切なヘテロ原子は、Ｎ、Ｓ及びＯなどである。
【００５３】
「アルケニル」及び「アルキニル」という用語は、それぞれ炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素三重結合を含むことを除いて、「アルキル」と同様に定義される。「シクロアルケニル」は、炭素−炭素二重結合が環に存在することを除いて、シクロアルキルと同様に定義される。
【００５４】
「アルキレン」という用語は、置換基を有するアルキル基を意味する。例えば、「Ｃ１〜３アルキレンアリール」という用語は、１〜３個の炭素原子を含み、アリール基で置換されたアルキル基を意味する。
【００５５】
「ハロ」又は「ハロゲン」という用語は、本明細書においてフッ素、臭素、塩素及びヨウ素を含むと定義する。
【００５６】
単独又は組み合わされた「アリール」という用語は、本明細書において単環式又は多環式芳香族基、好ましくは単環式又は二環式芳香族基、例えば、フェニル又はナフチルと定義する。特に示さない限り、「アリール」基は、非置換であるか、又は、例えば、１つ又は複数の、また特に１つから３つのハロ、アルキル、ヒドロキシ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル及びアルキルスルホニルで置換されていてよい。具体例としてのアリール基としては、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、２−クロロフェニル、３−クロロフェニル、４−クロロフェニル、２−メチルフェニル、４−メトキシフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル、４−ニトロフェニルなどがある。「アリールＣ１〜３アルキル」及び「ヘテロアリールＣ１〜３アルキル」という用語は、Ｃ１〜３アルキル置換基を有するアリール又はヘテロアリール基と定義される。
【００５７】
「ヘテロアリール」という用語は、本明細書において１つ又は２つの芳香環を含み、芳香環に少なくとも１つの窒素、酸素又は硫黄原子を含み、非置換であるか、又は、例えば、ハロ、アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル及びアルキルスルホニルのような１つ又は複数の、また特に１つから３つの置換基で置換され得る、単環式又は二環式環系と定義する。ヘテロアリール基の例としては、チエニル、フリル、ピリジル、オキサゾリル、キノリル、イソキノニル、インドリル、チアゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、イミジゾリル、ベンゾチアゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、チアゾリル及びチアジアゾリルなどがある。
【００５８】
「Ｈｅｔ」という用語は、酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される１つ又は複数のヘテロ原子を含む単環式、二環式及び三環式基と定義される。「Ｈｅｔ」基は、環に結合したオキソ基（＝Ｏ）も含み得る。Ｈｅｔ基の非限定的な例としては、１，３−ジオキソラニル、２−ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、ピロリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、モルホリニル、チオホリニル、ピペリジニル、１，４−ジチアニル及び１，４−ジオキサンなどがある。
【００５９】
「ヒドロキシ」という用語は、−ＯＨと定義される。
【００６０】
「アルコキシ」という用語は、Ｒがアルキルである、−ＯＲと定義される。
【００６１】
「アルコキシアルキル」という用語は、水素がアルコキシ基により置換された、アルキル基と定義される。「（アルキルチオ）アルキル」という用語は、酸素原子でなく硫黄原子が存在することを除いて、アルコキシアルキルと同様に定義される。
【００６２】
「ヒドロキシアルキル」という用語は、アルキル基に付加したヒドロキシ基と定義される。
【００６３】
「アミノ」という用語は、−ＮＨ２と定義され、「アルキルアミノ」という用語は、少なくとも１つのＲがアルキルであり、第２のＲがアルキル又は水素である、−ＮＲ２と定義される。
【００６４】
「アシルアミノ」という用語は、Ｒがアルキル又はアリールである、ＲＣ（＝Ｏ）Ｎ−と定義される。
【００６５】
「アルキルチオ」という用語は、Ｒがアルキルである、−ＳＲと定義される。
【００６６】
「アルキルスルフィニル」という用語は、Ｒがアルキルである、ＲＳＯ２−と定義される。
【００６７】
「アルキルスルホニル」という用語は、Ｒがアルキルである、ＲＳＯ３−と定義される。
【００６８】
「ニトロ」という用語は、−ＮＯ２と定義される。
【００６９】
「トリフルオロメチル」という用語は、−ＣＦ３と定義される。
【００７０】
「トリフルオロメトキシ」という用語は、−ＯＣＦ３と定義される。
【００７１】
「シアノ」という用語は、−ＣＮと定義される。
【００７２】
金属イオンと錯体を形成したキレート化部分を含む本発明の化合物の計算ヌクレアーゼ有効性は、天然ヌクレアーゼと比較して、修飾核酸塩基の数の性質によって最大１０３〜１０９倍増加し、有効濃度の対応する低下と同時に化合物の高い特異性を維持することを可能にする。
【００７３】
本発明の化合物の他の修飾も企図される。オリゴヌクレオチドは本発明の化合物の好ましい形であるが、本発明は、オリゴヌクレオチド類似体及び擬似体を含むが、これらに限定されない他のファミリーの化合物を含む。
【００７４】
本発明の組成物及び方法における使用が企図されるさらなるアンチセンス化合物は、修飾主鎖（例えば、リン原子を含む又は含まない）又は非天然ヌクレオシド間結合、オリゴヌクレオシド、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル・ヌクレオシド間結合、混合へテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキル・ヌクレオシド間結合、或いは１つ又は複数の短鎖へテロ原子又は複素環式ヌクレオシド間結合により形成された主鎖を有する、リン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド主鎖（例えば、モルホリノ結合；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル主鎖、アルケン含有主鎖、スルファメート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネート及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他のもの）を含むオリゴヌクレオチド、逆極性を有するオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合（すなわち主鎖）が場合によって新規な基で置換されているオリゴヌクレオチド擬似体、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、２’位に次の１つを含むが、それらに限定されない１つ又は複数の置換糖部分を有するオリゴヌクレオチド：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここでアルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る）、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’又は４’炭素原子に連結され、それにより二環式糖部分を形成しているロックト核酸（ＬＮＡｓ）、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンを含むが、これらに限定されない合成及び天然核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。さらなる修飾核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）などの三環式ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリミド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などのＧクランプ（Ｇ−ｃｌａｍｐｓ）などである。修飾核酸塩基は、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環で置換されたもの、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドン、キレート化部分、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を向上させる基、及びオリゴマーの薬物動態特性を向上させる基を含む（これらに限定されないが）、第一級若しくは第二級ヒドロキシル基に化学的に結合したオリゴヌクレオチドを含んでいてよい。上述の修飾は、参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２００７／１２５１７３にさらに記載されている。
【００７５】
一般的な結合体基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、ヒルオレセイン、ローダミン、クマリン及び色素などがある。本発明の状況において、薬力学的特性を向上させる基は、取り込みを改善する、分解に対する抵抗性を増大させ、且つ／又は標的核酸との配列特異的ハイブリッド形成を強くする基などである。
【００７６】
本発明の化合物のさらなる修飾
本発明の化合物の他の修飾も企図される。オリゴヌクレオチドは本発明の化合物の好ましい形であるが、本発明は、他のファミリーの化合物も包含し、これらは本明細書で述べるようなオリゴヌクレオチド類似体及び擬似体を含むが、それらに限定されない。
【００７７】
当技術分野で知られているように、ヌクレオシドは、塩基と糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常は複素環式塩基である。そのような複素環式塩基の最も一般的なクラスは、プリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシルフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基を糖の２’、３’又は５’ヒドロキシル部分に結合させることができる。オリゴヌクレオチドを形成するに際して、リン酸基が隣接ヌクレオシドと互いに共有結合して、線状ポリマー化合物を形成する。そして次に、この線状ポリマー化合物の各末端をさらに結合させて環状化合物を生成させることができるが、線状化合物が一般的に好ましい。さらに、線状化合物は、内部核酸塩基相補性を有していてよく、したがって、完全又は部分的に２本鎖の化合物を生成するような仕方で折り重なっていてよい。オリゴヌクレオチド内において、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成するものと一般的に言われている。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常の結合又はバックボーンは、３’−５’ホスホジエステル結合である。
【００７８】
修飾ヌクレオシド間結合（主鎖）
企図される、本発明で有用なアンチセンス化合物の特定の例は、修飾主鎖又は非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドなどである。本明細書で定義したように、修飾主鎖を有するオリゴヌクレオチドとしては、主鎖にリン原子を保持するもの及び主鎖にリン原子を有さないものなどがある。本明細書の目的のために、また当技術分野で時として言及されるように、それらのヌクレオシド間主鎖にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドとみなすことができる。
【００７９】
企図される、リン原子をその中に含有する修飾オリゴヌクレオチド主鎖としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル並びに３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の３’−５’結合を有するセレノホスフェート及びボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、並びに１つ又は複数のヌクレオチド間結合が３’−３’、５’−５’又は２’−２’結合である、逆極性を有するものなどがある。企図される、逆極性を有するオリゴヌクレオチドは、最も３’側のヌクレオチド間結合における単一３’−３’結合、すなわち無塩基（核酸塩基が欠失しているか、又はその代わりにヒドロキシル基を有する）であってよい単一逆ヌクレオシド残基を含む。様々な塩、混合塩及び遊離酸形も含まれる。
【００８０】
上のリンを含む結合の調製を教示している代表的な米国特許は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、同第５，１９４，５９９号、同第５，５６５，５５５号、同第５，５２７，８９９号、同第５，７２１，２１８号、同第５，６７２，６９７号及び同第５，６２５，０５０号を含むが、これらに限定されない。
【００８１】
企図される、リン原子をその中に含有しない修飾オリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル・ヌクレオシド間結合、混合へテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキル・ヌクレオシド間結合、或いは１つ若しくは複数の短鎖へテロ原子又は複素環式ヌクレオシド間結合により形成される主鎖を有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成された）を有するもの、シロキサン主鎖、スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖、リボアセチル主鎖、アルケン含有主鎖、スルファメート主鎖、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖、スルホネート及びスルホンアミド主鎖、アミド主鎖並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有するその他のものを含む。
【００８２】
上のオリゴヌクレオシドの調製を教示している代表的な米国特許は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、同第５，７９２，６０８号、同第５，６４６，２６９号及び同第５，６７７，４３９号を含むが、これらに限定されない。
【００８３】
修飾糖及びヌクレオシド間結合擬似体
他の予測されるオリゴヌクレオチド擬似体において、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合（すなわち、主鎖）の両方が新規な基で置換されている。核酸塩基単位は、適切な標的核酸とのハイブリッド形成が維持される。そのような化合物において、優れたハイブリッド形成特性を有することが示されたオリゴヌクレオチド擬似体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−主鎖は、主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖を含むアミドで置換されている。核酸塩基は、保持されており、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示している代表的な米国特許は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号及び同第５，７１９，２６２号を含むが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７〜１５００頁に見出すことができる。
【００８４】
本発明の特定の実施形態は、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子主鎖を有するオリゴヌクレオシド、並びに特に上に記載した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ主鎖として知られている］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（天然ホスホジエステル主鎖は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−と表される）、並びに上に記載した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド主鎖である。上に記載した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドも企図される。
【００８５】
修飾糖
修飾オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の置換糖部分も含んでいてよい。企図されるオリゴヌクレオチドは、２’位に次の１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここでアルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであってよい）。特に好ましいものはＯ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、ｎ及びｍは１〜約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に次の１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル若しくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、並びに同様な特性を有する他の置換基。企図される修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られている）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６〜５０４頁）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。企図される、さらなる修飾は、下文の実施例で述べる２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び下文の実施例でも述べる２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥ）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
【００８６】
他の企図される修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。２’−修飾は、アラビノ（上）位置又はリボ（下）位置であってよい。好ましい２’アラビノ修飾は、２’−Ｆである。同様な修飾は、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上又は２’−５’結合オリゴヌクレオチドにおける糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位においても行うことができる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖擬似体も有していてよい。そのような修飾糖構造の調製を教示している代表的な米国特許は、それぞれが参照によりその全体において本明細書に組み込まれている、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、同第５，７９２，７４７号及び同第５，７００，９２０号を含むが、これらに限定されない。
【００８７】
糖のさらなる好ましい修飾は、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’又は４’炭素原子に連結され、それにより二環式糖部分を形成しているロックト核酸（ＬＮＡｓ）を含む。連結は、好ましくは２’酸素原子と４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であり、ｎは１又は２である。ＬＮＡｓ及びその調製は、ＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６に記載されている。
【００８８】
天然及び修飾核酸塩基
オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（当技術分野でしばしば単に「塩基」と呼ばれている）の修飾又は置換を含んでいてもよい。本明細書で用いているように、「非修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノ−アデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなどの他の合成及び天然核酸塩基を含む。さらなる修飾核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）などの三環式ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などのＧクランプなどである。修飾核酸塩基は、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環で置換されたもの、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンを含んでいてもよい。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５９〜８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３頁に開示されているもの、並びにＳａｎｇｈｖｉ、第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９〜３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ及びＬｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３に開示されているものなどである。
【００８９】
上記の修飾核酸塩基並びに他の修飾核酸塩基の特定のものの調製を教示している代表的な米国特許は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、並びに米国特許第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，８３０，６５３号、同第５，７６３，５８８号、同第６，００５，０９６号及び同第５，６８１，９４１号を含むが、これらに限定されず、米国特許第５，７５０，６９２号も参照により本明細書に組み込まれている。
【００９０】
修飾核酸塩基は、全体として参照により本明細書に組み込まれている、共有及び同時係属の特許出願第＿号（整理番号２８１１３／４３４３４Ｂ）並びに２００７年１１月５日に出願された米国仮出願第６０／９８５，５４８号及び２００８年５月３０日に出願された米国仮出願第６１／０５７，６８５号において抗ウイルス薬としての使用が企図されている。
【００９１】
アンチセンス阻害
本発明の化合物の標的核酸とのハイブリッド形成は、一般的に「アンチセンス」と呼ばれる。そのようなハイブリッド形成は、標的核酸の翻訳の阻害をもたらし得るものであり、本明細書では「アンチセンス阻害」と呼ぶ。そのようなアンチセンス阻害は、一般的に、少なくとも１本の鎖若しくはセグメントが開裂し、分解し、又は別の仕方で機能しなくするような、オリゴヌクレオチド鎖若しくはセグメントの水素結合に基づくハイブリッド形成に基づいている。この点に関して、そのようなアンチセンス阻害のために特定の核酸分子及びそれらの機能を標的にすることが現在のところ好ましい。
【００９２】
阻害すべきＤＮＡの機能は、複製及び転写などである。複製及び転写は、例えば、内因性細胞鋳型、ベクター、プラスミド構成体又は他のものによるものであってよい。妨害すべきＲＮＡの機能は、タンパク質の翻訳の部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡ合成の部位から遠い細胞内の部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ又は複数のＲＮＡ種を生成するためのＲＮＡのスプライシング、及び関与する可能性があるＲＮＡに関係する又はＲＮＡにより促進される触媒活性又は複合体形成などの機能を含み得る。本発明の状況において、「調節」及び「発現の調節」は、遺伝子をエンコードする核酸分子、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡの量又はレベルの増加（刺激）又は減少（阻害）を意味する。阻害は、発現の調節のしばしば好ましい形であり、ｍＲＮＡがしばしば好ましい標的核酸である。
【００９３】
本発明の状況において、「ハイブリッド形成」は、オリゴマー化合物の相補鎖の対合を意味し、「アニーリング」という用語と相互に置き換えて使用される。本発明において、対合の好ましいメカニズムは、オリゴマー化合物の鎖の相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基（核酸塩基）間のワトソン・クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合であってよい水素結合に関係する。例えば、アデニン及びチミンは、水素結合の形成により対になる相補的核酸塩基である。ハイブリッド形成は、様々な状況下で起こり得る。
【００９４】
標的核酸への化合物の結合が標的核酸の正常な機能を妨害して活性の喪失をもたらし、特異的結合が望ましい条件下、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ又は治療的処置の場合の生理的条件下、及びｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合にアッセイを実施する条件下で非標的核酸配列に対するアンチセンス化合物の非特異的結合を避けるのに十分な相補性の程度が存在する場合に、アンチセンス化合物は、特異的にハイブリッド形成できる。
【００９５】
本発明の１つの態様において、標的核酸の発現は、２０％阻害される。他の態様において、標的核酸の発現は、少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９９％又はそれ以上阻害される。
【００９６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件の場合、ハイブリッド形成が起こるｐＨは重要である。下に開示するように、本発明の修飾オリゴヌクレオチドがそれらの標的に結合する効率は、ｐＨによる影響を受ける。標的核酸に対する修飾オリゴヌクレオチドの高度に効率のよい結合は、約４〜１０のｐＨ範囲で起こる。１つの態様で、高度に効率のよい結合が起こるｐＨは４である。種々の態様において、標的核酸に対する修飾オリゴヌクレオチドの高度に効率のよい結合が起こるｐＨは、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、約９、約９．１、約９．２、約９．３、約９．４、約９．５、約９．６、約９．７、約９．８、約９．９又は約１０である。これらの具体例としてのｐＨにより定義されている全範囲は、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ実施形態を定義する代替の方法として明示的に企図される。
【００９７】
本発明において、「緊縮ハイブリッド形成条件」又は「緊縮条件」という語句は、本発明の化合物がその標的配列とハイブリッド形成するが、最小限の数の他の配列とハイブリッド形成する条件を意味する。緊縮条件は、配列依存的であり、異なる状況で異なり、本発明の状況において、オリゴマー化合物が標的配列とハイブリッド形成する「緊縮条件」は、オリゴマー化合物の性質及び組成並びにそれらが検討されるアッセイによって決定される。１つの具体例としての条件の組は次の通りである。５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、２０ｍＭＮａ・ＰＯ４、ｐＨ６．８中４２℃でのハイブリッド形成；及び１ＸＳＳＣで５５℃で３０分間洗浄。同等のハイブリッド形成条件を計算するための式及び／又は所望のレベルの緊縮性を達成するための他の条件の選択は、よく知られている。同等の緊縮性の条件は、Ａｕｓｂｅｌら（編）、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９４）、６．０．３〜６．４．１０頁に記載されているように温度及び緩衝液又は塩濃度の変形形態により達成することができることは当技術分野で理解されている。ハイブリッド形成条件の修正は、プローブのグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対合の長さ及びパーセントに基づいて経験的に決定又は精密に計算することができる。ハイブリッド形成条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、９．４７〜９．５１頁に記載されているように計算することができる。
【００９８】
「相補的」は、本明細書で用いているように、オリゴマー化合物の２つの核酸塩基間の正確な対合の能力を意味する。例えば、オリゴヌクレオチド（オリゴマー化合物）の特定の位置における核酸塩基が標的核酸の特定の位置における核酸塩基と水素結合することができ、前記標的核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ又はオリゴヌクレオチド分子である場合、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置は、相補的位置であるとみなされる。各分子における十分な数の相補的位置が互いに水素結合することができる核酸塩基によって占有されている場合、オリゴヌクレオチドとさらなるＤＮＡ、ＲＮＡ又はオリゴヌクレオチド分子は互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリッド形成可能」及び「相補的」は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に安定且つ特異的な結合が起こるような十分な数の核酸塩基にわたる十分な程度の正確な対合又は相補性を示すのに用いる用語である。
【００９９】
特異的にハイブリッド形成するためにアンチセンス化合物の配列がその標的核酸の配列と１００％相補的である必要はないことが当技術分野で理解されている。さらに、オリゴヌクレオチドは、介在又は隣接セグメントがハイブリッド形成事象に関与しないように１つ又は複数のセグメントにわたってハイブリッド形成していてよい（例えば、ループ構造又はヘアピン構造）。本発明の化合物のオリゴヌクレオチド部分が標的核酸内の標的領域との少なくとも７０％の配列相補性を含むことが好ましく、より好ましくはそれらが、それらが標的とする標的核酸配列内の標的領域との少なくとも８５％又は９０％の配列相補性を含み、また少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相補性を含み得る。例えば、化合物の２０個の核酸塩基のうちの１８個が標的領域と相補的であり、したがって特異的にハイブリッド形成する本発明の化合物は、９０％の相補性を示すこととなる。この例において、残りの非相補的核酸塩基は、密集しているか、又は相補的核酸塩基の間に散在していてよく、互いに又は相補的核酸塩基に隣接している必要はない。したがって、標的核酸との完全な相補性の２つの領域が両側に隣接している４個の非相補的核酸塩基を有する長さが１８個の核酸塩基である化合物は、標的核酸との７７．８％の総相補性を有し、したがって、本発明の範囲内に入ることとなる。標的核酸の領域を含む化合物の相補性のパーセントは、当技術分野で知られているＢＬＡＳＴプログラム（基本局所アライメント検索ツール（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌｓ）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９９、２１５、４０３〜４１０頁；Ｚｈａｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１９９７、７、６４９〜６５６頁）を用いてルーチンに求めることができる。ヒドロキシ核酸塩基及び／又は合成類似体（他の合成核酸塩基など）を有する本発明の化合物については、相補性は、標的核酸の個々の核酸塩基に対する合成類似体の特異性によって評価することができる。
【０１００】
アンチセンス化合物の好ましい形は１本鎖アンチセンス・オリゴヌクレオチドであるが、多くの種において２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子のような２本鎖構造の導入は、遺伝子又はその関連遺伝子産物の機能の強く、特異的なアンチセンス媒介性の低減を引き起こすことが示された。この現象は、植物及び動物の両方において起こり、ウイルス防御及びトランスポゾンサイレンシングとの進化上の関連性を有すると考えられている。
【０１０１】
ｄｓＲＮＡが動物における遺伝子サイレンシングをもたらし得るという最初の証拠は、１９９５年に線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓにおける研究から出現した（Ｇｕｏら、Ｃｅｌｌ、１９９５、８１、６１１〜６２０頁）。Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙらは、ｄｓＲＮＡの主要な干渉効果は転写後であることを示した（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、１５５０２〜１５５０７頁）。２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）への曝露に起因するＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓにおいて定義された転写後アンチセンス・メカニズムは、それ以来ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれている。この用語は、内因性標的ｍＲＮＡレベルの配列特異的低下につながるｄｓＲＮＡの導入に伴うアンチセンス媒介性遺伝子サイレンシングを意味するように一般化された（Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９１、８０６〜８１１頁）。最近、それは、実際には、ＲＮＡｉの強力なインデューサーであるｄｓＲＮＡｓのアンチセンス極性の１本鎖ＲＮＡオリゴマーであることが示された（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２、２９５、６９４〜６９７頁）。
【０１０２】
標的核酸に特異的に結合し、切断するようにデザインされた、小干渉性ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）、それらの前駆体及び類似体並びにリボザイムなどの、オリゴヌクレオチドと類似しているが、異なる作用機序を有する物質の使用に関するさらなる知識が当技術分野に存在する。
【０１０３】
ハイブリッド形成のための標識オリゴヌクレオチド類似体の使用
本明細書で述べるオリゴヌクレオチド及び化合物は、場合によって標識することができる。当業者は、多くの手段のいずれかにより本発明のオリゴヌクレオチドを標識することができる。オリゴヌクレオチドは、３２Ｐ、３５Ｓ又は当業者に知られている他のいずれかの放射性核種により放射性標識することができる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、蛍光標識することができる。用いることができる蛍光標識は、次のものを含むが、それらに限定されない：フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ＣＹ−５、ＣＹ−５．５、ＣＹ−３、ＣＹ−２、ＣＹ−７、テキサス・レッド、ローダミン等。
【０１０４】
これらの標識オリゴヌクレオチドは、サザン及びノーザン・ブロッティングなどの当技術分野でよく知られているアッセイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））に用いられることが企図される。本発明の他の態様は、チップなどの固体担体上に固定化した核酸とのハイブリッド形成における標識修飾オリゴヌクレオチドの使用である。当業者は、これらのチップをマイクロアレイ試験に用いることができることを理解するであろう。修飾核酸塩基を含む標識オリゴヌクレオチドは、それら自体本発明の態様である。
【０１０５】
本発明のさらなる態様は、ＰＣＲ用のプライマーとして用いられる本発明の修飾オリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチドの１対若しくは複数の対である。プライマーは、通常のＰＣＲ、実時間ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）などを含むが、これらに限定されない当業者に知られているＰＣＲのいずれかの方法に用いることができる。
【０１０６】
ＰＣＲが、標的核酸を変性するステップと、その後にオリゴヌクレオチド・プライマーを変性標的核酸の鎖にアニーリングするステップの繰り返しとを含むことは当業者によってよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されているように）。このハイブリッド形成複合体は、次に熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの作用により伸長される（すなわち、標的核酸鎖の配列に従ってヌクレオチドが連続して加えられる）。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、当技術分野で知られており、Ｔａｑ、Ｐｆｘ及びＴａＫａＲａポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
【０１０７】
アニーリングを行う温度及び伸長の時間などのＰＣＲのパラメーターは、本質的に経験的なものであり、十分に当業者の決定能力内にある。
【０１０８】
本発明の化合物の使用
本明細書で述べる化合物は、ＤＮＡゲノム、ＲＮＡゲノムを有するウイルス及び逆転写を用いるウイルスを含む、ウイルスのような病原体の遺伝子発現及び増殖を制限するためにｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで用いる。また全体として参照により本明細書に組み込まれている、共有及び同時係属の特許出願第＿号（整理番号２８１１３／４３４３４Ｂ）並びに２００７年１１月５日に出願された米国仮出願第６０／９８５，５４８号及び２００８年５月３０日に出願された米国仮出願第６１／０５７，６８５号も参照のこと。したがって、化合物は、疾患状態になりやすい、又は疾患状態にある生物に投与することができる。生物に投与するとき、化合物は、様々な病原体による感染を処置するために用いることができる。本明細書で用いているように、「処置する」は、被検体の健康状態、病状及び疾患に対して所望の結果をもたらすのに十分な用量／量での必要とする被検体への、又は診断目的のための本発明のオリゴヌクレオチドの投与を意味する。所望の結果は、投与の受容者における主観的又は客観的改善を含んでいてよい。「処置（治療）」は、予防処置又は治療処置又は診断処置を意味する。診断又は処置の「対象」は、哺乳類又は霊長類を含む、ヒト又は非ヒト動物である。「治療上有効な量」は、健康に対する意図される有益な効果をもたらす有効な組成物の量を意味する。
【０１０９】
化合物は、特定のＢ細胞、ヘルパー細胞、サプレッサー細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｃ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの特定のＴ細胞などの免疫系細胞の機能を調節するために用いることができる。本発明の化合物を用いる免疫機能の調節は、ウイルス性病原体により引き起こされる慢性疾患のような様々な疾患の治療に有用であり得る。
【０１１０】
化合物のオリゴヌクレオチドのその標的配列に対する結合に関係するメカニズムのいずれかによりタンパク質の転写及び／又は発現を妨げることができる化合物を選択することができる。これらのメカニズムは、プロセシングの妨害、核膜を通しての輸送の阻害、エンドヌクレアーゼによる開裂、レプリカーゼ複合体の形成などを含むが、これらに限定されない。
【０１１１】
本明細書で述べる化合物は、感染性疾患の治療に用いることができる。標的核酸配列は、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＳＶ、ＨＣＶ等の病原性ウイルスの遺伝子、並びにこれらのウイルスに対する、或いは疾患発現及び／又は進行に関与する宿主因子をエンコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【０１１２】
癌の治療において、標的核酸配列は、腫瘍遺伝子又は腫瘍形成特性を有するウイルスに関連するＤＮＡ若しくはＲＮＡ、腫瘍サプレッサー遺伝子、及び関連遺伝子であってよい。さらに、本発明の化合物は、薬物耐性に関連する遺伝子及びそれらの遺伝子産物を標的とすることもできる。
【０１１３】
標的を定める過程は、所望の効果、例えば、発現の調節が生じるように、アンチセンス相互作用が起こる標的核酸内の少なくとも１つの標的領域、セグメント又は部位の決定も通常含む。本発明の状況において、「領域」は、少なくとも１つの識別できる構造、機能又は特性を有する標的核酸の部分を意味する。標的核酸の領域内にセグメントがある。「セグメント」は、標的核酸内の領域のより小さい部分又は小部分を意味する。「部位」は、本発明で用いているように、標的核酸内の位置を意味する。
【０１１４】
本明細書で述べる組成物は、同じウイルスゲノム内の２つの異なる領域又はセグメントとハイブリッド形成するために併用することがさらに企図される。標的を選択するために、考慮事項は、ウイルス増殖に重要であるウイルスゲノムの領域における標的の局在化などである（標的は必須の領域でなければならない）。可能な場合、好ましい標的は、ウイルスの異なる株及び遺伝子型間に保存されている領域にあるべきである（しばしばこれは配列の機能の意義も示している）。タンパク質の高度に保存されたドメインをエンコードする領域は良好な標的であり、重複機能要素（シス活性要素と重複したコーディング配列）を含む領域も良好な標的である。
【０１１５】
標的部位は、望ましいヌクレオチド含量及び／又は修飾核酸塩基の組成を有するオリゴヌクレオチド阻害剤の構築を可能にするヌクレオチド組成を有するべきであり、好ましくは標的は強い二次構造要素を含まないことがさらに企図される。さらに、標的の配列は、必須の宿主遺伝子、特に宿主ｍＲＮＡｓの配列と重複すべきでない。さらに、修飾核酸塩基の位置は、宿主配列と一致すべきでない。Ｃ又はＧヌクレオチドのクラスター（３つ又はそれ以上）は、避けるべきである。実験でコーディング領域内の標的部位は非コーディング領域におけるものよりよいこと、またＲＮＡウイルスの場合、プラス鎖はマイナス鎖よりよい標的であることが示された。核酸の破壊（例えば、ＲＮＡｓｅ又はＤＮＡｓｅ複合体による）の特有のメカニズムのため、翻訳開始配列を修飾オリゴヌクレオチドの標的にすることは必要でない。これは、ＲＮＡ分解を開始することができず、翻訳の開始コドンを含む領域を標的とする場合に最も（又はもっぱら）有効である、モルホリノ・オリゴヌクレオチドの場合と対照的である。そのような制約は、ここで述べる修飾オリゴヌクレオチドについては存在しない。
【０１１６】
２つ又はそれ以上の部位を標的とするために、各部位は、上で述べた基準のいくつかを満たさなければならない。標的の配列は、オリゴヌクレオチドの集合を避けるために異なっており、互いに相補的でないものであるべきであり、標的は、１つ及び同じ機能単位、例えば、同じ酵素と、又は異なる単位と異なる配列を示すことができる。ほとんどの場合、耐性突然変異体の発生の可能性を最小限にするために、第２の選択肢が好ましい。本明細書で用いているように、「機能単位」という用語は、ウイルスの複製又は遺伝子発現の機能を有するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列、例えば、各種複製因子、転写因子等を意味する。同じ機能単位に結合するオリゴヌクレオチドは、例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質内の同じポリペプチド又はポリヌクレオチド機能単位における異なる標的配列に結合する。異なる機能単位に結合する本発明により企図されるオリゴヌクレオチドは、ウイルス複製又は遺伝子発現の異なる機能を有するポリペプチド又はポリヌクレオチド、例えば、ＨＩＶ Ｔａｔ及びＲｅｖ遺伝子又はタンパク質に結合する。当業者は、ウイルス複製又は遺伝子発現に関連する機能単位の意味を容易に理解することができる。
【０１１７】
翻訳開始コドンは、一般的に５’ＡＵＧ（転写ｍＲＮＡ分子における；対応するＤＮＡ分子における５’ＡＴＧ）であり、翻訳開始コドンは、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」又は「ＡＵＧ開始コドン」とも呼ばれている。少数の遺伝子がＲＮＡ配列５’ＧＵＧ、５’ＵＵＧ又は５’ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、５’ＡＵＡ、５’ＡＣＧ及び５’ＣＵＧは、ｉｎ ｖｉｖｏで機能することが示された。したがって、「翻訳開始コドン」及び「開始コドン」という用語は、各場合におけるイニシエーターアミノ酸は一般的にメチオニン（真核生物において）又はホルミルメチオニン（原核生物において）であるが、多くのコドン配列を含むことができる。真核生物及び原核生物遺伝子は、いずれか１つが、特定の細胞型若しくは組織において、又は特定の条件の組のもとで翻訳開始に優先的に用いられる可能性がある、２つ又はそれ以上の代替開始コドンを有する可能性があることも当技術分野で知られている。本発明の状況において、「開始コドン」及び「翻訳開始コドン」は、そのようなコドンの配列（単数又は複数）にかかわらず、インターロイキン１８をエンコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を開始するためにｉｎ ｖｉｖｏで用いられるコドン又は（複数の）コドンを意味する。遺伝子の翻訳終止コドン（又は「停止コドン」は、３つの配列、すなわち、５’ＵＡＡ、５’ＵＡＧ及び５’ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列はそれぞれ５’ＴＡＡ、５’ＴＡＧ及び５’ＴＧＡである）の１つを有する可能性があることも当技術分野で知られている。
【０１１８】
「開始コドン領域」及び「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５’又は３’）の約２５〜約５０の連続したヌクレオチドを含むそのようなｍＲＮＡ又は遺伝子の部分を意味する。同様に、「停止コドン領域」及び「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち、５’又は３’）の約２５〜約５０の連続したヌクレオチドを含むそのようなｍＲＮＡ又は遺伝子の部分を意味する。したがって、「開始コドン領域」（又は「翻訳開始コドン領域」）及び「停止コドン領域」（又は「翻訳終止コドン領域」）は、本発明のアンチセンス化合物が効果的に標的にすることができるすべての領域である。
【０１１９】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を意味することが当技術分野で知られている読み取り枠（ＯＲＦ）又は「コーディング領域」は、効果的に標的にすることができる領域でもある。本発明の状況において、好ましい領域は、遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）の翻訳開始又は終止コドンを含む遺伝子内領域である。
【０１２０】
他の標的領域は、当技術分野で翻訳開始コドンから５’方向のｍＲＮＡの部分を意味することが知られ、したがってｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチド（又は遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、及び当技術分野で翻訳終止コドンから３’方向のｍＲＮＡの部分を意味することが知られ、したがってｍＲＮＡの翻訳終止コドンと３’端との間のヌクレオチド（又は遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ部位は、５’−５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡの最も５’側の残基に連結されたＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造自体並びにキャップ部位に隣接する最初の５０ヌクレオチドを含むとみなされる。５’キャップ領域を標的とすることもまた好ましい。
【０１２１】
一部の真核生物ｍＲＮＡ転写物は直接翻訳されるが、多くは、それが翻訳される前に転写物から切除される「イントロン」として知られている１つ又は複数の領域を含む。残りの（またしたがって翻訳される）領域は、「エキソン」として知られており、一緒にスプライスされて、連続ｍＲＮＡ配列を形成する。標的スプライス部位、すなわち、イントロン−エキソン連結部又はエキソン−イントロン連結部も、異常なスプライシングが疾患に関連づけられる、或いは特定のスプライス産物の過剰産生が疾患に関連づけられる状況においては特に有用であり得る。再配列又は欠失に起因する異常な融合連結も好ましい標的部位である。異なる遺伝子源からの２つ（又はそれ以上）のｍＲＮＡｓのスプライシングの過程を経て産生されるｍＲＮＡ転写物は、「融合転写物」として知られている。イントロンは、例えば、ＤＮＡ又は前ｍＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物を用いて効果的に標的にすることができることも知られている。
【０１２２】
代替のＲＮＡ転写物は、ＤＮＡの同じゲノム領域から産生させることができる。これらの代替転写物は、一般的に「変異体」として知られている。より具体的には、「前ｍＲＮＡ変異体」は、同じゲノムＤＮＡから産生される他の転写物とそれらの開始又は停止位置が異なる同じゲノムＤＮＡから産生され、イントロン及びエキソン配列を含む転写物である。
【０１２３】
スプライシング時の１つ又は複数のエキソン又はイントロン領域或いはその一部の切除により、前ｍＲＮＡ変異体はより小さい「ｍＲＮＡ変異体」を生ずる。したがって、ｍＲＮＡ変異体は、処理された前ｍＲＮＡ変異体であり、各特有の前ｍＲＮＡ変異体は、スプライシングの結果として特有のｍＲＮＡ変異体を常に生じなければならない。これらのｍＲＮＡ変異体は、「選択的スプライス変異体」としても知られている。前ｍＲＮＡ変異体のスプライシングが起らない場合、前ｍＲＮＡ変異体は、ｍＲＮＡ変異体と同じである。
【０１２４】
変異体は、転写を開始又は停止するための選択的シグナルを用いることによって産生させることができ、前ｍＲＮＡｓ及びｍＲＮＡｓは、複数の開始コドン又は停止コドンを有することができる。選択的開始コドンを使用する前ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡが起源である変異体は、当該前ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの「選択的開始変異体」として知られている。選択的停止コドンを使用する転写物は、当該前ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの「選択的停止変異体」として知られている。選択的停止変異体の１つの特定のタイプは、複数の転写物が転写装置による「ポリＡ停止シグナル」の１つの代替選択により産生され、それにより、特有のポリＡ部位で終結する転写物を産生する、「ポリＡ変異体」である。本発明の状況において、本明細書で述べる変異体のタイプも好ましい標的核酸である。
【０１２５】
本開示のさらなる態様及び詳細は、限定するのではなく、例示することを意図する以下の実施例から明らかであろう。
【実施例１】
【０１２６】
相補的なメンブレン結合未修飾センスオリゴヌクレオチドへの修飾／未修飾アンチセンス・オリゴヌクレオチドの結合
以下の特許出願：２００６年５月３日に出願した米国仮出願第６０／７９７，４４８号、及び２００７年４月３０日に出願した米国仮出願第１１／７４２，３８４号（米国特許出願公開第２００７／０２５９８３０号として公開された）の各々は、参照により全体として組み込まれる。
【０１２７】
１以上の修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの相補的結合効率を比較するために、修飾オリゴヌクレオチドを作製し、未修飾オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成効率と比較した。結合効率は、ハイブリッド形成反応のｐＨに対して決定された。
【０１２８】
オリゴヌクレオチドは、修飾塩基５−ヒドロキシシトシン（Ｃ＊）及び８−ヒドロキシグアニン（Ｇ＊）のうちの１つ又はその両方を含む。未修飾オリゴヌクレオチドを対照として使用した。オリゴヌクレオチドを表１に示す。
【０１２９】
【表１】
【０１３０】
修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率のｐＨ依存性を様々な標的量／濃度で試験した。メンブレン上の相補的オリゴヌクレオチド濃度１ｐｍｏｌにおける天然オリゴヌクレオチドの結合効率に対する修飾オリゴヌクレオチド結合効率に関するデータは、４次多項式を用いてフィッティングさせ、それぞれのグラフを図１に与える。相対的結合は
【数１】
として定義される効率である。
【０１３１】
ここで、Ｄｍｏｄは、修飾核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドの結合効率であり、Ｄｎａｔは天然オリゴヌクレオチドの結合効率を示す。
【０１３２】
図１に示されるデータは、ｐＨへの修飾オリゴヌクレオチドの結合効率の強い依存性を示す。これは、いくつかの主要なプロトトロピック（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｉｃ）互変異性形態（スキーム１及び２）で存在する修飾塩基５−ヒドロキシシトシン及び８−ヒドロキシグアニンの陰イオンとして互変異性平衡が存在することに起因し、それらの比率は、周辺の媒質（溶液）のｐＨに実質的に依存し得る。異なる互変異性形態の結合効率は顕著に異なることができ、ｐＨへの観察できる結合効率の強力な依存性をもたらす。
【化２】
【０１３３】
５−ヒドロキシシトシン陰イオンの場合では、互変異性形態１ｂは、シトシンそれ自体よりも約１０７倍高い相補的グアニン塩基に対する結合効率を有する。互変異性形態１ａは、シトシンと類似した結合効率を有することが予測されが、互変異性形態１ｃは相補的塩基との結合低下を有する。
【化３】
【０１３４】
また、８−ヒドロキシグアニンの場合では、互変異性形態２ｂは、グアニンそれ自体よりも、相補的シトシン塩基に対して非常に高い（約１０７〜１０８倍高い）結合効率を有する。互変異性形態２ａ及び２ｃは、グアニンと比較して類似の結合効率を有することが期待される。
【０１３５】
修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率のｐＨ依存性は、５．０〜６．０近辺のｐＨ値で明確に最大となり、約ｐＨ＝７．５ではっきりと最小となる。また、ｐＨのさらなる増加は、修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の実質的な増加をもたらす。最大効率は、修飾（５−ヒドロキシシトシン又は８−ヒドロキシシトシングアニン）の性質、及びオリゴマーにおける置換の位置（オリゴヌクレオチドｆ１とｆ２を比較する）の両方に依存する。最高効率は、修飾オリゴヌクレオチドｆ１について観察された（１．３７）。
【０１３６】
修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の類似したｐＨ依存性は、５ｐｍｏｌ（図２）と２５ｐｍｏｌ（データ示さず）のオリゴヌクレオチド濃度で得られた。
【実施例２】
【０１３７】
相補的なメンブレンに結合したＤＮＡへの修飾／未修飾アンチセンス・オリゴヌクレオチドの結合
ＤＮＡを有するオリゴヌクレオチドの相対的結合効率を測定するための類似の実験は、同じ手順を用いて行われた。また、各々の修飾オリゴヌクレオチドについてのデータは、４次多項式を用いてフィッティングされ、それぞれのグラフを図３に与える。
【０１３８】
オリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオチド結合とは対照的に、この場合には、ｐＨ依存性は３つの最大を有するが、しかしながら、最高のものはこの場合も低ｐＨ値（ｐＨ＝４．５〜５．０近辺）である。また、この最大は、オリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオチド結合に対する最大よりも有意に高い。修飾オリゴヌクレオチドｆ２及びｆ１については、相対的結合効率は、それぞれ２．９及び２．１である。修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率のｐＨ依存性における他の２つの最大は、それぞれｐＨ＝７．５及びｐＨ＝１０近辺で局在化される（図３）。
【０１３９】
顕著には、２つの修飾（５−ヒドロキシシトシン及び８−ヒドロキシグアニン関与）を有するオリゴヌクレオチドｆ＊は、ｐＨへの相対的結合効率の非常に平滑な依存性を有する（図３及び４）。
【０１４０】
相対的結合効率の類似のｐＨ依存性は、メンブレン上のＤＮＡ量が５ｎｇで観察された（図４）。
【実施例３】
【０１４１】
ハイブリッド形成における修飾オリゴヌクレオチドの使用
図５のパネルＡでは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉｎａ）ＲＬＩ２遺伝子の、長さが２ｋｂであるｃＤＮＡ５ｎｇ及び１ｎｇを、ＴＢＥ緩衝液中の５％ポリアクリルアミドゲル上で変性条件下での電気泳動によって解析した。ゲルをナイロンメンブレン上に電気ブロットし、ＵＶ架橋によりＤＮＡを固定化した。メンブレンは、一晩４５℃で、６×ＳＳＣ、２×デンハーツ溶液、０．１％ＳＤＳ及びｐＨ５．０中で、すべてが同一である５つの３２Ｐ５’標識したオリゴヌクレオチドと順番にハイブリダイズした。プローブは、ｆ、ｆ１、ｆ２、ｆ３及びｆ＊であった（表１参照）。メンブレンを２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、ｐＨ５．０を用いて、１０分間４５℃で２回洗浄した。放射性シグナルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌ ＦＸ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて検出された。パネルＢ、Ａにおいて示された検出されたシグナルは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ソフトウェアを用いて定量された。それぞれのデータを図５に与える。
【実施例４】
【０１４２】
相補的なメンブレンに結合したｍＲＮＡへの修飾／未修飾アンチセンス・オリゴヌクレオチドの結合
メンブレンに固相化された相補的な天然ｍＲＮＡを有する修飾核酸塩基（５−ヒドロキシシトシン及び５−ヒドロキシグアニン）を含むオリゴヌクレオチドの相対的結合効率を測定するための実験は、同じ手順を用いて行われた。修飾ヌクレオチドを有するｍＲＮＡの相対的結合効率のｐＨ依存性に関するデータは、２つの区別される最大を有し、その最高はｐＨ＝５．８〜６．２近辺に局在化される（図５）。
【０１４３】
この場合において、最大の最高の効率は修飾グアニン核酸塩基（８−ヒドロキシグアニン）を含むオリゴヌクレオチドによって示され、未修飾オリゴヌクレオチドよりも１．５倍高い効率である。
【０１４４】
修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の類似したｐＨ依存性は、メンブレン上のｍＲＮＡ量が２．５ｎｇである場合について観察され、最大はよりアルカリ側に幾分シフトしている（図７）。
【実施例５】
【０１４５】
標的濃度に対する修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の依存性
オリゴヌクレオチドにおいて、より高い結合効率を有する互変異性形態の存在は、低濃度でそれらのより高い相対的結合効率をもたすことができる。オリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオチド実験では、センス及びアンチセンスの濃度が類似している場合、このような挙動が観察される。図８では、修飾オリゴヌクレオチドｆ１の相対的結合効率のｐＨ依存性は、種々の標的濃度（１ｐｍｏｌ、５ｐｍｏｌ、２５ｐｍｏｌ）で示される。結果として、相対的結合効率は、標的濃度の低下とともに増加する。
【０１４６】
類似の依存性は、修飾オリゴヌクレオチドｆ２の場合に観察される（図９）。
【０１４７】
ハイブリッド形成実験の結果
天然オリゴヌクレオチドと比較した、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ及びｍＲＮＡにおける相補的配列への互変異性修飾核酸塩基（５−ヒドロキシシトシン及び／又は８−ヒドロキシグアニン）を含むオリゴヌクレオチドの結合はｐＨに対する複雑な依存性を有する。典型的には、相対的結合効率Ｄにおいて２又は３個の区別できる最大が存在する。最高の相対的効率は、ｐＨ＝４．８〜６．２近辺の酸性ｐＨ値に局在化され、使用されるシステムに依存する。
【０１４８】
相対的結合効率は、修飾の性質、及び対応物（オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ又はＲＮＡ）の性質の両方に依存する。現在見出された最高の相対的結合効率は、未修飾オリゴヌクレオチドの結合効率と比較して、１．５〜３の間である。
【実施例６】
【０１４９】
様々なアニーリング温度のＰＣＲプライマーとしての修飾オリゴヌクレオチド
シロイヌナズナＲＬＩ２ ＤＮＡ配列の長さが３８３ｂｐである断片は、アニーリング温度４７、４８．７、５１．３、５８．４、６１．７、６４．３、６６．１、６７．５ 及び６８℃でＰＣＲ反応により増幅された。この断片は、未修飾オリゴヌクレオチドＦ（５’−ＴＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＡＡＣＴＡＣＴＴＣ（配列番号１）、ＡｔＲＬＩ２コーディング配列のｎｔ１６３８〜１６５８に対応する）及びＲ（５’−ＴＴＣＡＴＣＡＡＡＣＡＴＧＴＡＡＡＴＣＴＣ（配列番号６）、逆の相補的配向であるＡｔＲＬＩ２コーディング配列のｎｔ２００１〜２０２１に対応する）を用いて増幅され、同時にｆ＊（５’−ＴＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＡＡＣＴＡＣＴＴＣ（配列番号５）、修飾塩基に下線を付す）及びｒ＊（５’−ＴＴＣＡＴＣＡＡＡＣＡＴＧＴＡＡＡＴＣＴＣ（配列番号７）、修飾塩基に下線を付す）を用いて増幅された。ＰＣＲ混合物は２０ｐｍｏｌの各プライマーを含み、最終のＭｇ２＋濃度２．５ｍＭ、２５ｎｇの同じ長さ３８３ｂｐの断片を鋳型として使用した。ＰＣＲプログラムは、初期変性ステップ（９５℃で２分）と、それに続く３０サイクルの変性（９５℃で４０秒）、アニーリング（４７〜６８℃で４０秒）、及び重合（７２℃で４０秒）からなっていた。ＰＣＲの最終ステップは７２℃で１０分であった。生成物は、ＴＡＥ緩衝液中の１．７％アガロースゲルにおける電気泳動によって分離され、臭化エチジウム染色及びＵＶ光によって可視化された。
【０１５０】
図１０に与えられた結果は、ＰＣＲにおける修飾塩基を有するオリゴヌクレオチドの適用性及び効率を示す。
【実施例７】
【０１５１】
トランスフェクトされた細胞におけるｓｉＲＮＡとしての修飾オリゴヌクレオチド
ｅＧＦＰトランス遺伝子発現に対する修飾ｓｉＲＮＡの効果を以下のように測定した。ＨｅＬａ−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）安定トランスジェニック株は、５％血清及び４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭで増殖させた。ＧＦＰ ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションは、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭの代わりにＤＭＥＭを用いて、２４ウェルプレート（７５，０００細胞／ウェル）においてリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プロトコールに記載されるように行われた。トランスフェクションの３日後、細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、蛍光レベル（５３５ｎｍで発光）をＧＥＮｉｏｓ Ｐｒｏ ＴＥＣＡＮによって解析した。ｅＧＦＰ発光は、ＨｅＬａ−ＧＦＰ模擬トランスフェクトされた株（陰性対照のｓｉＲＮＡ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ｑｉａｇｅｎを有する）の蛍光レベルのパーセンテージとして示される（図１１）。ＧＦＰ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた非トランスジェニックＨｅＬａ細胞を陰性対照として使用した。パーセンテージ及びＳＤは、４つの並行したトランスフェクションから計算される。下線を付したヌクレオチドを修飾した。
【０１５２】
【表２】
【実施例８】
【０１５３】
ハイブリッド形成動態に対する修飾の効果
修飾と未修飾オリゴヌクレオチドの間のハイブリッド形成動態における可能性のある相違を以下のように試験した。０．５、１、２．５、５及び１０ｎｇの標的ＤＮＡ（２×ＳＳＣ中）をナイロンメンブレン上にドットブロットし、一晩４５℃、６×ＳＳＣ、２×デンハーツ溶液、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ５．０中で、すべてが同一である５つの３２Ｐ５’標識したオリゴヌクレオチドと順番にハイブリダイズした。プローブは、ｆ、ｆ１、ｆ２、ｆ３及びｆ＊であった（表１参照）。プローブの添加後、時間点を１０分から６０分まで１０分間隔でとった。メンブレンは、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、ｐＨ５．０を用いて１０分間室温で２回洗浄された。放射性シグナルはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌ ＦＸ（ＢｉｏＲａｄ）で検出された。擬一次ハイブリッド形成速度定数は、ｌｎＶ−ｔ法を用いて計算された。結果（平滑化した相対速度定数）を表２に与える。すべての修飾オリゴヌクレオチドは、特により小さな基質量で、未修飾オリゴヌクレオチドよりも高いハイブリッド形成速度を有する。
【０１５４】
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、それぞれをその全体として参照により本明細書に組み込まれている、２００７年１１月５日に出願した先の米国仮出願第６０／９８５，５５２号の恩典を主張するものである。
【０００２】
本発明は、核酸のハイブリッド形成、核酸の増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による）及びｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシング（ＲＮＡｉ）に用いられる特異的に修飾されたＤＮＡ塩基を含有する修飾オリゴヌクレオチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
オリゴヌクレオチド及び修飾オリゴヌクレオチドの使用は、現代の療法において極めて重要であり、十分に実証されている（Ｕｈｌｍａｎｎら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９９０、９０、５４３〜５８４頁、Ｃｒｏｏｋｅら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、Ｍｅｓｍａｅｋａｒら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５、２８、３６６〜３７４頁、Ｓｔｅｉｎ、「Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｕｓｅ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｅｒｐｌｅｘｅｄ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００１、１０８、６４１〜６４４頁）。ＤＮＡ又はＲＮＡ標的に対するアンチセンス・ポリヌクレオチドの特異的結合により、核酸の複製、転写又は翻訳を不活性化し、それにより、癌及びウイルス感染などの疾患をコントロールするためのメカニズムを提供することができる。したがって、標的に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドの結合は、例えば、ウイルスのライフサイクル又は癌細胞の成長を妨げるために、様々な環境における遺伝子発現を変化させるのに用いることができる。
【０００４】
結合性オリゴヌクレオチドのアレイは、バイオテクノロジー産業及び関連分野においてますます重要なツールになっている。固体担体表面上に固着させたこれらのアレイは、薬物スクリーニング、核酸配列決定、突然変異分析などを含む多くの分野で適用されている。
【０００５】
例えば、核酸ハイブリッド形成は、所定の試料中の特定の核酸の同定、測定及び存在の検出のますます重要な手段になっている。したがって、医学診断、法医学、環境及び食品試験すべてにおいて、試料中の所定の生物学的混入物又は微生物の存否について試験する急速、簡単且つ正確な方法として核酸ハイブリッド形成を用いることが有効であった。メカニズムの面では、核酸ハイブリッド形成は、相補的ヌクレオチド配列を有する核酸鎖の対応する領域と安定なハイブリッドを形成する１本鎖核酸の能力を利用するものである。そのようなハイブリッドは、３本鎖構造も知られているが、通常、２本鎖二重らせんからなっている。核酸二重らせんにおいて、各塩基対が安定性に寄与している。したがって、二重らせんが短いほど、二重らせんの安定性に対する個々の塩基対の相対的な寄与は大きくなる。結果として、完全な対合と誤対合との安定性の差は、オリゴヌクレオチドが短いほど、大きくなる。しかし、短いオリゴヌクレオチドは弱くハイブリッド形成するので、より強い結合性の分子を用いることにより、それを強くすることができる可能性がある。
【０００６】
核酸の指数関数的増幅のための多くの方法が開発された。これらは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自己持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）及びＱ−Ｂｅｔａリプリカーゼを用いる増幅などである。ＰＣＲの成功は、ＤＮＡの１本鎖にプライマーが結合する効率に依存する。再び、結合が強いほど、所定のサイクルにおいて増幅されるＤＮＡが多くなる。
【０００７】
哺乳動物細胞におけるＲＮＡ誘発性遺伝子サイレンシングは、最小限３つの異なるレベルのコントロール、すなわち、（ｉ）転写の不活性化（ｓｉＲＮＡ誘導ＤＮＡ及びヒストンメチル化）、（ｉｉ）小干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）誘発性ｍＲＮＡ分解、及び（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ誘発性転写減弱を意味すると現在のところ考えられている。ｓｉＲＮＡによってもたらされるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、長時間持続させることができ、多細胞分裂より有効である。したがって、過剰発現遺伝子に対する療法を開発することに加えて、ｓｉＲＮＡを媒介とする方法により遺伝子機能を評価する能力は、遺伝子機能分析、薬物標的のバリデーション及びゲノム全体の研究を促進する刺激的且つ有用なツールである。
【０００８】
上のすべての分野において、修飾ヌクレオチドを用いることにより効率を高める試みがなされた。したがって、プリンを生成させるための水素によるアデノシンの６位におけるアミノ基の置換、２−アミノプリンを生成させるための水素による、又は６−チオグアノシンを生成させるための硫黄による、グアノシンの６−ケト酸素の置換、及び４−チオチミジン又は４−ヒドロチミジンをそれぞれ生成させるための硫黄又は水素によるチミジンの４−ケト酸素の置換を含む、含窒素塩基における修飾を有する多くのオリゴヌクレオチド誘導体が構築された。これらのすべてのヌクレオチド類似体は、オリゴヌクレオチドの合成のための反応物として用いることができる。同様に、リボフラノシル又はデオキシリボフラノシル部分の修飾を有する多くのヌクレオチド誘導体が報告された。そのような修飾塩基を含むほとんどのオリゴヌクレオチドは、高い細胞取り込み、ヌクレアーゼ抵抗性及び／又は高い物質結合性を念頭において考案された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国仮出願第６０／９８５，５５２号
【特許文献２】米国特許公開第２００７０２５９８３０号
【特許文献３】国際特許公開ＷＯ２００７／１２５１７３
【特許文献４】米国特許第３，６８７，８０８号
【特許文献５】米国特許第４，４６９，８６３号
【特許文献６】米国特許第４，４７６，３０１号
【特許文献７】米国特許第５，０２３，２４３号
【特許文献８】米国特許第５，１７７，１９６号
【特許文献９】米国特許第５，１８８，８９７号
【特許文献１０】米国特許第５，２６４，４２３号
【特許文献１１】米国特許第５，２７６，０１９号
【特許文献１２】米国特許第５，２７８，３０２号
【特許文献１３】米国特許第５，２８６，７１７号
【特許文献１４】米国特許第５，３２１，１３１号
【特許文献１５】米国特許第５，３９９，６７６号
【特許文献１６】米国特許第５，４０５，９３９号
【特許文献１７】米国特許第５，４５３，４９６号
【特許文献１８】米国特許第５，４５５，２３３号
【特許文献１９】米国特許第５，４６６，６７７号
【特許文献２０】米国特許第５，４７６，９２５号
【特許文献２１】米国特許第５，５１９，１２６号
【特許文献２２】米国特許第５，５３６，８２１号
【特許文献２３】米国特許第５，５４１，３０６号
【特許文献２４】米国特許第５，５５０，１１１号
【特許文献２５】米国特許第５，５６３，２５３号
【特許文献２６】米国特許第５，５７１，７９９号
【特許文献２７】米国特許第５，５８７，３６１号
【特許文献２８】米国特許第５，１９４，５９９号
【特許文献２９】米国特許第５，５６５，５５５号
【特許文献３０】米国特許第５，５２７，８９９号
【特許文献３１】米国特許第５，７２１，２１８号
【特許文献３２】米国特許第５，６７２，６９７号
【特許文献３３】米国特許第５，６２５，０５０号
【特許文献３４】米国特許第５，０３４，５０６号
【特許文献３５】米国特許第５，１６６，３１５号
【特許文献３６】米国特許第５，１８５，４４４号
【特許文献３７】米国特許第５，２１４，１３４号
【特許文献３８】米国特許第５，２１６，１４１号
【特許文献３９】米国特許第５，２３５，０３３号
【特許文献４０】米国特許第５，２６４，５６２号
【特許文献４１】米国特許第５，２６４，５６４号
【特許文献４２】米国特許第５，４０５，９３８号
【特許文献４３】米国特許第５，４３４，２５７号
【特許文献４４】米国特許第５，４７０，９６７号
【特許文献４５】米国特許第５，４８９，６７７号
【特許文献４６】米国特許第５，５４１，３０７号
【特許文献４７】米国特許第５，５６１，２２５号
【特許文献４８】米国特許第５，５９６，０８６号
【特許文献４９】米国特許第５，６０２，２４０号
【特許文献５０】米国特許第５，６１０，２８９号
【特許文献５１】米国特許第５，６０８，０４６号
【特許文献５２】米国特許第５，６１８，７０４号
【特許文献５３】米国特許第５，６２３，０７０号
【特許文献５４】米国特許第５，６６３，３１２号
【特許文献５５】米国特許第５，６３３，３６０号
【特許文献５６】米国特許第５，６７７，４３７号
【特許文献５７】米国特許第５，７９２，６０８号
【特許文献５８】米国特許第５，６４６，２６９号
【特許文献５９】米国特許第５，６７７，４３９号
【特許文献６０】米国特許第５，５３９，０８２号
【特許文献６１】米国特許第５，７１４，３３１号
【特許文献６２】米国特許第５，７１９，２６２号
【特許文献６３】米国特許第４，９８１，９５７号
【特許文献６４】米国特許第５，１１８，８００号
【特許文献６５】米国特許第５，３１９，０８０号
【特許文献６６】米国特許第５，３５９，０４４号
【特許文献６７】米国特許第５，３９３，８７８号
【特許文献６８】米国特許第５，４４６，１３７号
【特許文献６９】米国特許第５，４６６，７８６号
【特許文献７０】米国特許第５，５１４，７８５号
【特許文献７１】米国特許第５，５１９，１３４号
【特許文献７２】米国特許第５，５６７，８１１号
【特許文献７３】米国特許第５，５７６，４２７号
【特許文献７４】米国特許第５，５９１，７２２号
【特許文献７５】米国特許第５，５９７，９０９号
【特許文献７６】米国特許第５，６１０，３００号
【特許文献７７】米国特許第５，６２７，０５３号
【特許文献７８】米国特許第５，６３９，８７３号
【特許文献７９】米国特許第５，６４６，２６５号
【特許文献８０】米国特許第５，６５８，８７３号
【特許文献８１】米国特許第５，６７０，６３３号
【特許文献８２】米国特許第５，７９２，７４７号
【特許文献８３】米国特許第５，７００，９２０号
【特許文献８４】ＷＯ９８／３９３５２
【特許文献８５】ＷＯ９９／１４２２６
【特許文献８６】米国特許第４，８４５，２０５号
【特許文献８７】米国特許第５，１３０，３０２号
【特許文献８８】米国特許第５，１３４，０６６号
【特許文献８９】米国特許第５，１７５，２７３号
【特許文献９０】米国特許第５，３６７，０６６号
【特許文献９１】米国特許第５，４３２，２７２号
【特許文献９２】米国特許第５，４５７，１８７号
【特許文献９３】米国特許第５，４５９，２５５号
【特許文献９４】米国特許第５，４８４，９０８号
【特許文献９５】米国特許第５，５０２，１７７号
【特許文献９６】米国特許第５，５２５，７１１号
【特許文献９７】米国特許第５，５５２，５４０号
【特許文献９８】米国特許第５，５８７，４６９号
【特許文献９９】米国特許第５，５９４，１２１号
【特許文献１００】米国特許第５，５９６，０９１号
【特許文献１０１】米国特許第５，６１４，６１７号
【特許文献１０２】米国特許第５，６４５，９８５号
【特許文献１０３】米国特許第５，８３０，６５３号
【特許文献１０４】米国特許第５，７６３，５８８号
【特許文献１０５】米国特許第６，００５，０９６号
【特許文献１０６】米国特許第５，６８１，９４１号
【特許文献１０７】米国特許第５，７５０，６９２号
【特許文献１０８】米国仮出願第６０／９８５，５４８号
【特許文献１０９】米国仮出願第６１／０５７，６８５号
【特許文献１１０】米国仮出願第６０／７９７，４４８号
【特許文献１１１】米国仮出願第１１／７４２，３８４号
【特許文献１１２】米国特許出願公開第２００７／０２５９８３０号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｕｈｌｍａｎｎら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９９０、９０、５４３〜５８４頁
【非特許文献２】Ｃｒｏｏｋｅら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）
【非特許文献３】Ｍｅｓｍａｅｋａｒら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５、２８、３６６〜３７４頁
【非特許文献４】Ｓｔｅｉｎ、「Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｕｓｅ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｅｒｐｌｅｘｅｄ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００１、１０８、６４１〜６４４頁
【非特許文献５】Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：Ｔｈｅ Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ」、増刊１、第１６巻、編集者Ｄ．Ｊ．Ｂｒｏｗｎ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９７０、２０２〜２２９頁
【非特許文献６】Ｋｈａｌｙｕｌｌｉｎら、「Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ ｐｕｒｉｎｅｓ」、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９２、２６、２７０〜２８４頁
【非特許文献７】Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７〜１５００頁
【非特許文献８】Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６〜５０４頁
【非特許文献９】Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５９〜８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０
【非特許文献１０】Ｅｎｇｌｉｓｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３頁
【非特許文献１１】Ｓａｎｇｈｖｉ、第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９〜３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ及びＬｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３
【非特許文献１２】Ａｕｓｂｅｌら（編）、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９４）、６．０．３〜６．４．１０頁
【非特許文献１３】Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、９．４７〜９．５１頁
【非特許文献１４】Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９９、２１５、４０３〜４１０頁
【非特許文献１５】Ｚｈａｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１９９７、７、６４９〜６５６頁
【非特許文献１６】Ｇｕｏら、Ｃｅｌｌ、１９９５、８１、６１１〜６２０頁
【非特許文献１７】Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、１５５０２〜１５５０７頁
【非特許文献１８】Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９１、８０６〜８１１頁
【非特許文献１９】Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２、２９５、６９４〜６９７頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、相補的核酸に対するそれらの結合能力を増大させ、核酸相補鎖とのそれらのハイブリッド形成を増加させることができる、修飾核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドに関する。開示化合物のオリゴヌクレオチド部分における修飾核酸塩基の数の性質によって、相補的標的核酸に対する化合物の結合能力を、一般的な相補的オリゴヌクレオチドと比べて数倍も増加させることができる。
【００１２】
核酸のハイブリッド形成、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシング（ＲＮＡｉ）におけるそのような修飾オリゴヌクレオチド類似体の使用が本発明の主題である。本発明の１つの態様は、核酸ハイブリッド形成の標識プローブとして用いるオリゴヌクレオチド類似体である。このハイブリッド形成としては、とりわけ、プローブのＤＮＡとのハイブリッド形成（例えば、サザン・ハイブリッド形成）、ＲＮＡとのハイブリッド形成（例えば、ノーザン・ハイブリッド形成）、プローブのチップに結合した核酸配列とのハイブリッド形成などが挙げられる。本発明の他の態様は、ＰＣＲ反応時にＰＣＲプライマーとして用いる１つのオリゴヌクレオチド類似体又は１対若しくは複数対のオリゴヌクレオチド類似体である。これらのＰＣＲ反応は、例として、通常のＰＣＲ、実時間ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲなどがあり、ホスホジエステル結合の反復触媒合成が起こる一般的にすべての各種反応が、以前に合成された２本鎖核酸鎖の高温による変性により中断される。本発明の他の態様は、オリゴヌクレオチド類似体を非修飾オリゴヌクレオチドともに、或いは他の修飾オリゴヌクレオチドともに用いて、小干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をアニーリングし、アニーリングしたｓｉＲＮＡを用いて、対応するｓｉＲＮＡに対して相補的な核酸配列をサイレンシングすることである。言及したｓｉＲＮＡは、トランスフェクション、マイクロインジェクション、ボンバードメント、ウイルスベクター又は他の技術を用いて細胞内に導入することができる。言及したサイレンシングは、例えば、標的核酸の配列特異的分解又は標的核酸の配列特異的翻訳阻害を意味する。
【００１３】
本発明の修飾オリゴヌクレオチドの例外的な結合力を考慮して、本発明の１つの態様は、標的核酸の鎖との修飾オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を可能にする条件下で、既知の配列の標的核酸を前記標的核酸の鎖と少なくとも部分的に相補的である１配列の核酸塩基を有する修飾オリゴヌクレオチドと接触させることを含み、ハイブリッド形成修飾オリゴヌクレオチドが標的核酸の発現を阻害し、修飾オリゴヌクレオチドが５〜１５０個の核酸塩基を含み、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基の少なくとも１つが５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシトシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニン及び８−ヒドロキシグアニンらなる群から選択される、標的核酸の発現を阻害する方法である。
【００１４】
１つの態様において、標的核酸の発現を少なくとも２０％阻害する。いくつかの態様において、標的核酸は、ＲＮＡであり、さらなる態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、本質的に１本鎖である。いくつかの態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドとともに用い、２本の鎖の少なくとも１本の鎖が少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む修飾オリゴヌクレオチドである、２本鎖である。
【００１５】
本発明の他の態様は、細胞内に存在する標的核酸に関し、修飾オリゴヌクレオチドと標的核酸との接触が細胞内への修飾オリゴヌクレオチドの導入を含む。これらの態様のいくつかにおいて、接触は、修飾オリゴヌクレオチドによる細胞の形質転換及びトランスフェクションからなる群から選択される。
【００１６】
他の態様において、標的核酸は、生物の細胞内に存在し、接触は、修飾オリゴヌクレオチド及び製薬上許容される担体を含む組成物を生物に投与することを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、リポソームなどの送達媒体をさらに含む。種々の態様における生物は、哺乳動物であり、他の態様においてヒトである。
【００１７】
前述のことに加えて、本発明は、さらなる態様として、標的核酸の鎖（１、２本又はそれ以上の鎖、通常１又は２本を有していてよい）との修飾オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を可能にする条件下で、標的核酸を修飾オリゴヌクレオチドと接触させること、及び標的核酸の鎖とハイブリッド形成した修飾オリゴヌクレオチドを検出することによって標的核酸を検出することを含み、修飾オリゴヌクレオチドが標的核酸の鎖の配列と少なくとも部分的に相補的である１配列の核酸塩基を含み、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基の少なくとも１つが５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシトシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニン及び８−ヒドロキシグアニンからなる群から選択される、標的核酸を修飾オリゴヌクレオチドにより検出する方法を含む。
【００１８】
いくつかの態様において、標的核酸は、固体担体に固定化されている。さらなる態様において、固定化標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。前述の態様のいくつかにおいて、検出は、本質的に定量的である。例えば、ハイブリッド形成の測定は、標的核酸の量の絶対的又は相対的尺度を提供する。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、鋳型核酸を、ＰＣＲアニーリング条件下における鋳型核酸との修飾オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を可能にするのに十分に、鋳型核酸の一部と相補的である配列を含む修飾オリゴヌクレオチドと接触させることを含み、ハイブリッド形成修飾オリゴヌクレオチドが第１の鎖のＰＣＲ生成物を生成させるＰＣＲ増幅条件下でＰＣＲプライマーとしての役割を果たし、修飾オリゴヌクレオチドが５〜１５０個の核酸塩基を含み、核酸塩基の少なくとも１つが５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシトシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニン及び８−ヒドロキシグアニンらなる群から選択される修飾核酸塩基である、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法である。
【００２０】
いくつかの態様において、ＰＣＲは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型核酸、修飾オリゴヌクレオチド及びヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を含有する反応混合物を調製することを含む。ＭｇＣｌ２、緩衝剤などを含む、ＰＣＲ反応に用いる試薬がよく知られている。
【００２１】
他の態様において、ＰＣＲ反応混合物は、標的核酸の鎖の一部又は第１の鎖のＰＣＲ生成物の一部の１つと相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドをさらに含む。種々の態様において、第２のオリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドであり、修飾オリゴヌクレオチドが５〜１５０個の核酸塩基を含み、核酸塩基の少なくとも１つが５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシトシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニン及び８−ヒドロキシグアニンらなる群から選択される修飾核酸塩基である。いくつかの態様において、鋳型核酸はＤＮＡであるが、他の態様において、鋳型核酸はＲＮＡである。
【００２２】
本発明は、増幅生成物を実時間で定量する、方法も提供する。
【００２３】
さらなる態様において、ポリメラーゼ連鎖反応は、鋳型核酸を変性するステップと、修飾オリゴヌクレオチドと鋳型核酸とをアニーリング条件下でアニーリングするステップと、アニーリングした修飾オリゴヌクレオチドを伸長させることにより、ポリメラーゼ連鎖反応生成物を合成するステップの繰り返しを含む。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、検出可能な標識を含む。
【００２５】
本発明の方法は、いくつかの態様において、ハイブリッド形成条件が４〜１０のｐＨを含むことを提供する。他の態様において、ハイブリッド形成条件は、４〜６のｐＨを含む。
【００２６】
本発明のいくつかの変形形態において、本発明により提供される修飾オリゴヌクレオチドは、１０〜１００核酸塩基の長さを有することが企図される。種々の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、１０〜５０核酸塩基の長さを有する。さらなる態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、２０〜３０核酸塩基の長さを有する。
【００２７】
いくつかの態様において、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基の０．５％〜４０％は、メルカプト核酸塩基又はヒドロキシ核酸塩基を含む。
【００２８】
前述のことに加えて、本発明は、上で具体的に述べた変形形態より多少とも範囲が狭い本発明のすべての実施形態を追加の態様として含む。例えば、本発明の態様を簡潔のために属又は値の範囲に言及することにより記述した場合があるが、属の各メンバー及び範囲内の各値若しくは部分的な範囲は、本発明の態様であるものとされることを理解すべきである。同様に、本発明の各種態様及び特徴を組み合わせて、本発明の範囲内にあることが意図される追加の態様を作ることができる。
【００２９】
単数形（冠詞「ａ」又は「ａｎ」の使用を含む）で記述した本発明の態様は、文脈上より狭い解釈が明らかに必要でない限り、１つ又は複数を含む実施形態を含むと理解すべきである。「含む」という用語は、付加的な要素又は特徴が許容されることを意味する。
【００３０】
本出願人（１又は複数人）は本明細書に添付した特許請求の範囲の全範囲を発明したが、本明細書に添付した特許請求の範囲は、それらの範囲内に他者の従来技術の仕事を含まないものとする。特許請求の範囲の範囲内の法定の従来技術が特許局又は他の団体又は個人により本出願人に知らされる場合、本出願人（１又は複数人）は、そのような特許請求の範囲の範囲からそのような法定の従来技術又は法定の従来技術の明らかな変形形態を具体的に除外するためにそのような特許請求の範囲の内容を再定義するように適用特許法の下に補正権を行使する権利を有する。そのような補正された特許請求の範囲により定義された発明の変形形態も本発明の態様であるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】１ｐｍｏｌ濃度の修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の多項式フィッティングを示す図である。
【図２】５ｐｍｏｌ濃度の修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の多項式フィッティングを示す図である。
【図３】１ｎｇのＤＮＡに対する修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の多項式フィッティングを示す図である。
【図４】５ｎｇのＤＮＡに対する修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の多項式フィッティングを示す図である。
【図５】ハイブリッド形成における修飾オリゴヌクレオチドの効率を示す図である。
【図６】１．２５ｎｇの相補的ｍＲＮＡに対する修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の多項式フィッティングを示す図である。
【図７】２．５ｎｇの相補的ｍＲＮＡに対する修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の多項式フィッティングを示す図である。
【図８】種々の標的濃度について様々なｐＨ値のオリゴヌクレオチドｆ１の相対的結合効率の多項式フィッティングを示す図である。
【図９】種々の標的濃度について様々なｐＨ値のオリゴヌクレオチドｆ２の相対的結合効率の多項式フィッティングを示す図である。
【図１０】ＰＣＲにおける修飾オリゴヌクレオチドの使用を示す図である。ＰＣＲにおけるアニーリング温度の上昇に対する、修飾塩基を有するオリゴヌクレオチドの適用性及び効率を示す。
【図１１】ｅＧＦＰトランス遺伝子発現に対する修飾ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、オリゴヌクレオチドを用いるアンチセンス及び他の方法に用いられる特性を有するオリゴヌクレオチドを含む新規な組成物を提供する。本発明の化合物は、天然核酸塩基に対する高い結合効率を有する１つ又は複数の修飾核酸塩基を有するアンチセンス及び他のオリゴヌクレオチドを含む。修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物は、核酸のハイブリッド形成、ＰＣＲ及びｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシング（ＲＮＡｉ）に有用である。
【００３３】
オリゴヌクレオチド
本発明に関連して、「オリゴヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマー若しくはポリマー又はリボ核酸（ＲＮＡ）又はその擬似体、キメラ、類似体及び相同体を意味する。この用語は、天然核酸塩基、糖及び共有結合性ヌクレオシド内（主鎖）結合並びに例えば、標的核酸とハイブリッド形成又は相補的オリゴヌクレオチドと相互作用するとき、天然オリゴヌクレオチドと同様に機能する非天然部分を有するオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾又は置換オリゴヌクレオチドは、例えば、高い細胞取り込み、標的核酸に対する高い親和性及びヌクレアーゼの存在下での高い安定性のような望ましい特性があるため、天然形よりしばしば好ましい。
【００３４】
本発明の化合物の生物学的対応物（例えば、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ）に対する結合の有効性の増大は、両性イオン性又はイオン性互変異性体を有する修飾核酸塩基又は他の類似体の組み込みにより達成される。本発明の化合物は、両性イオン又はイオン性互変異性体を有する修飾核酸塩基又は他の類似体を有する、少なくとも１つの核酸塩基を有する。好ましい実施形態において、修飾核酸塩基は、５−ヒドロキシシトシン及び８−ヒドロキシグアニンから選択されるヒドロキシ核酸塩基又は５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン及び８−メルカプトアデニンから選択されるメルカプト核酸塩基である。両方とも参照により本明細書に組み込まれている米国特許公開第２００７０２５９８３０号及び国際特許公開ＷＯ２００７／１２５１７３に示されているように、ヒドロキシ核酸塩基又はメルカプト核酸塩基と標的核酸の核酸塩基とのより安定な水素結合が起こり得る。したがって、それらは、相補的核酸鎖に対してより有効に結合するとみなすことができる。
【００３５】
修飾核酸塩基における酸性互変異性基は、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３Ｈ等などの他の酸性基であってよい。
【００３６】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５−ヒドロキシウラシル陰イオンの１つ又は複数の互変異性形を含む。他の実施形態において、本発明の化合物は、ヒドロキシ塩基５−ヒドロキシシトシンを含む。他の実施形態において、ヒドロキシ塩基は、８−ヒドロキシアデニン及びその陰イオンの互変異性形である。本発明の他の実施形態は、８−ヒドロキシグアニン及びその陰イオンの互変異性形により修飾された本発明の化合物を提供する。これらの核酸塩基の互変異性形は、参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２００７／１２５１７３にさらに詳細に記載されている。
【００３７】
本明細書で企図されるさらなる修飾核酸塩基としては、メルカプト修飾核酸塩基などがある。メルカプト修飾ピリミジン及びプリンの合成は、当技術分野で知られている（例えば、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：Ｔｈｅ Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ」、増刊１、第１６巻、編集者Ｄ．Ｊ．Ｂｒｏｗｎ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９７０、２０２〜２２９頁及びＫｈａｌｙｕｌｌｉｎら、「Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ ｐｕｒｉｎｅｓ」、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９２、２６、２７０〜２８４頁を参照）。企図されたメルカプト核酸塩基としては、５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン及び８−メルカプトアデニンなどがある。
【００３８】
本明細書で用いているように、ヒドロキシ核酸塩基のそれぞれは、対向核酸塩基に安定に水素結合しているとき、核酸塩基と相補的とみなされる。したがって、場合によって、５−ヒドロキシウラシルはアデニンと相補的であり、５−ヒドロキシシトシンはグアニンと相補的であり、８−ヒドロキシアデニンはウラシル及び／又はチミンと相補的であり、８−ヒドロキシグアニンはシトシンと相補的である。ヒドロキシ核酸塩基と標的核酸の核酸塩基との他の安定な水素結合は起こり得る。したがって、ヒドロキシ核酸塩基は、安定な水素結合が起こる標的核酸の核酸塩基と相補的とみなされる。
【００３９】
本発明の所定の化合物におけるヒドロキシ核酸塩基及び／又はメルカプト核酸塩基の数は、化合物のオリゴヌクレオチド部分の核酸塩基の総数の少なくとも１％から１００％までである。本発明の化合物に複数のヒドロキシ核酸塩基又はメルカプト核酸塩基が存在する場合、ヒドロキシ核酸塩基又はメルカプト核酸塩基は、同じ又は異なって（異なる塩基及び／又は修飾の種類のいずれかの組合せ）いてよい。本明細書で述べるオリゴヌクレオチドにおける核酸塩基の１０％〜９０％、２０％〜８０％、３０％〜７０％、４０％〜６０％又は５０％が修飾核酸塩基であると予測される。核酸塩基の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％が修飾核酸塩基であると企図される。
【００４０】
本発明による化合物は、好ましくは約５〜約１５０核酸塩基（すなわち、約５〜約１５０個の結合ヌクレオシド）を含む。当業者は、本発明が長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、及び１５０核酸塩基の化合物を含むことを十分認識するであろう。
【００４１】
１つの好ましい実施形態において、本発明の化合物は、長さが１０〜１００核酸塩基である。当業者は、これが長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００核酸塩基の化合物を含むことを十分認識するであろう。
【００４２】
他の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、長さが１０〜５０核酸塩基である。当業者は、これが長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０核酸塩基の化合物を含むことを十分認識するであろう。
【００４３】
他の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、長さが２０〜３０核酸塩基である。当業者は、これが長さが２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０核酸塩基の化合物を含むことを十分認識するであろう。
【００４４】
特に好ましい化合物は、約１０〜約５０核酸塩基のオリゴヌクレオチドであり、より好ましくは約２０〜約３０核酸塩基を含むものであり、抗ウイルス薬として実例試験で用いた化合物は、２１又は２３核酸塩基から構成されていた。
【００４５】
上述のように、オリゴヌクレオチドは、１００％修飾核酸塩基を含んでいてよい。したがって、オリゴヌクレオチドの長さによって、オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、又は１５０修飾核酸塩基を含んでいてよく、修飾塩基は、メルカプト核酸塩基又はヒドロキシ核酸塩基である。
【００４６】
本発明の化合物は、キレート化部分を場合によってさらに含む。キレート化部分は、金属リガンドとして機能する。それらは、金属イオンを安定的にキレート化する。特定の金属−リガンド錯体は、ホスホジエステル結合を切断するのに有効であることが示された。キレート化部分をアンチセンス活性を示す能力のあるオリゴヌクレオチドに組み込んだ状態では、標的核酸の１つ又は複数のホスホジエステル結合を分解又は切断する能力がそれにあるため、標的核酸を阻害するオリゴヌクレオチドの効力は増加する。したがって、本発明の化合物は、金属イオンをキレート化することができるキレート化部分をさらに含む。金属イオンは、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム及びルテチウムからなる群から選択される。１つの態様において、好ましいイオンは、ユウロピウム又はランタンのイオンである。金属のイオンは、＋１、＋２、＋３、＋４又は＋５などの安定なイオンであってよい。好ましいイオンは、Ｌａ（ＩＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）、Ｈｏ（ＩＩＩ）及びＣｅ（ＩＶ）である。
【００４７】
企図されるキレート化部分としては、下記のような式により表されるものが挙げられる。
【化１】
【００４８】
ここでＲは、オリゴヌクレオチドの残部である。
【００４９】
Ｒ１は、水素、Ｃ１〜８アルカン、Ｃ２〜８アルケン、Ｃ２〜８アルキン、アシルＣ１〜８アルカン、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１〜８アルキルアリール及びＣ１〜８アルキルヘテロアリールから選択される。
【００５０】
Ｒ２は、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ２〜８アルケン、Ｃ２〜８アルキン、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１〜８アルキルアリール、Ｃ１〜８アルキルヘテロアリール及びアシルＣ１〜８アルカンから独立に選択される。また、
【００５１】
Ｒ３は、水素、Ｃ１〜８アルカン、Ｃ２〜８アルケン、Ｃ２〜８アルキン、アシルＣ１〜８アルカン、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１〜８アルキルアリール及びＣ１〜８アルキルヘテロアリールからなる群から独立に選択される。
【００５２】
「アルキル」という用語は、示される炭素原子数を含む直鎖及び分枝炭化水素基、一般的にメチル、エチル並びに直鎖及び分枝プロピル及びブチル基を含む。炭化水素基は、１６個までの炭素原子を含んでいてよい。「アルキル」という用語は、「架橋アルキル」、例えば、Ｃ６〜Ｃ１６二環式又は多環式炭化水素基、例えば、ノルボルニル、アダマンチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［３．２．１］オクチル及びデカヒドロナフチルを含む。「アルキル」という用語はまた、例えば、１つ又は複数のハロゲン原子、１つ又は複数のヒドロキシル基、或いは１つ又は複数のチオール基で場合によって置換されているアルキル基を含む。「シクロアルキル」という用語は、環状Ｃ３〜Ｃ８炭化水素基、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシル及びシクロペンチルと定義される。「ヘテロシクロアルキル」は、少なくとも１つのヘテロ原子が環状構造に存在することを除いて、シクロアルキルと同様に定義される。適切なヘテロ原子は、Ｎ、Ｓ及びＯなどである。
【００５３】
「アルケニル」及び「アルキニル」という用語は、それぞれ炭素−炭素二重結合又は炭素−炭素三重結合を含むことを除いて、「アルキル」と同様に定義される。「シクロアルケニル」は、炭素−炭素二重結合が環に存在することを除いて、シクロアルキルと同様に定義される。
【００５４】
「アルキレン」という用語は、置換基を有するアルキル基を意味する。例えば、「Ｃ１〜３アルキレンアリール」という用語は、１〜３個の炭素原子を含み、アリール基で置換されたアルキル基を意味する。
【００５５】
「ハロ」又は「ハロゲン」という用語は、本明細書においてフッ素、臭素、塩素及びヨウ素を含むと定義する。
【００５６】
単独又は組み合わされた「アリール」という用語は、本明細書において単環式又は多環式芳香族基、好ましくは単環式又は二環式芳香族基、例えば、フェニル又はナフチルと定義する。特に示さない限り、「アリール」基は、非置換であるか、又は、例えば、１つ又は複数の、また特に１つから３つのハロ、アルキル、ヒドロキシ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル及びアルキルスルホニルで置換されていてよい。具体例としてのアリール基としては、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、２−クロロフェニル、３−クロロフェニル、４−クロロフェニル、２−メチルフェニル、４−メトキシフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル、４−ニトロフェニルなどがある。「アリールＣ１〜３アルキル」及び「ヘテロアリールＣ１〜３アルキル」という用語は、Ｃ１〜３アルキル置換基を有するアリール又はヘテロアリール基と定義される。
【００５７】
「ヘテロアリール」という用語は、本明細書において１つ又は２つの芳香環を含み、芳香環に少なくとも１つの窒素、酸素又は硫黄原子を含み、非置換であるか、又は、例えば、ハロ、アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル及びアルキルスルホニルのような１つ又は複数の、また特に１つから３つの置換基で置換され得る、単環式又は二環式環系と定義する。ヘテロアリール基の例としては、チエニル、フリル、ピリジル、オキサゾリル、キノリル、イソキノニル、インドリル、チアゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、イミジゾリル、ベンゾチアゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、チアゾリル及びチアジアゾリルなどがある。
【００５８】
「Ｈｅｔ」という用語は、酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される１つ又は複数のヘテロ原子を含む単環式、二環式及び三環式基と定義される。「Ｈｅｔ」基は、環に結合したオキソ基（＝Ｏ）も含み得る。Ｈｅｔ基の非限定的な例としては、１，３−ジオキソラニル、２−ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、ピロリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、モルホリニル、チオホリニル、ピペリジニル、１，４−ジチアニル及び１，４−ジオキサンなどがある。
【００５９】
「ヒドロキシ」という用語は、−ＯＨと定義される。
【００６０】
「アルコキシ」という用語は、Ｒがアルキルである、−ＯＲと定義される。
【００６１】
「アルコキシアルキル」という用語は、水素がアルコキシ基により置換された、アルキル基と定義される。「（アルキルチオ）アルキル」という用語は、酸素原子でなく硫黄原子が存在することを除いて、アルコキシアルキルと同様に定義される。
【００６２】
「ヒドロキシアルキル」という用語は、アルキル基に付加したヒドロキシ基と定義される。
【００６３】
「アミノ」という用語は、−ＮＨ２と定義され、「アルキルアミノ」という用語は、少なくとも１つのＲがアルキルであり、第２のＲがアルキル又は水素である、−ＮＲ２と定義される。
【００６４】
「アシルアミノ」という用語は、Ｒがアルキル又はアリールである、ＲＣ（＝Ｏ）Ｎ−と定義される。
【００６５】
「アルキルチオ」という用語は、Ｒがアルキルである、−ＳＲと定義される。
【００６６】
「アルキルスルフィニル」という用語は、Ｒがアルキルである、ＲＳＯ２−と定義される。
【００６７】
「アルキルスルホニル」という用語は、Ｒがアルキルである、ＲＳＯ３−と定義される。
【００６８】
「ニトロ」という用語は、−ＮＯ２と定義される。
【００６９】
「トリフルオロメチル」という用語は、−ＣＦ３と定義される。
【００７０】
「トリフルオロメトキシ」という用語は、−ＯＣＦ３と定義される。
【００７１】
「シアノ」という用語は、−ＣＮと定義される。
【００７２】
金属イオンと錯体を形成したキレート化部分を含む本発明の化合物の計算ヌクレアーゼ有効性は、天然ヌクレアーゼと比較して、修飾核酸塩基の数の性質によって最大１０３〜１０９倍増加し、有効濃度の対応する低下と同時に化合物の高い特異性を維持することを可能にする。
【００７３】
本発明の化合物の他の修飾も企図される。オリゴヌクレオチドは本発明の化合物の好ましい形であるが、本発明は、オリゴヌクレオチド類似体及び擬似体を含むが、これらに限定されない他のファミリーの化合物を含む。
【００７４】
本発明の組成物及び方法における使用が企図されるさらなるアンチセンス化合物は、修飾主鎖（例えば、リン原子を含む又は含まない）又は非天然ヌクレオシド間結合、オリゴヌクレオシド、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル・ヌクレオシド間結合、混合へテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキル・ヌクレオシド間結合、或いは１つ又は複数の短鎖へテロ原子又は複素環式ヌクレオシド間結合により形成された主鎖を有する、リン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド主鎖（例えば、モルホリノ結合；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル主鎖、アルケン含有主鎖、スルファメート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネート及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他のもの）を含むオリゴヌクレオチド、逆極性を有するオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合（すなわち主鎖）が場合によって新規な基で置換されているオリゴヌクレオチド擬似体、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、２’位に次の１つを含むが、それらに限定されない１つ又は複数の置換糖部分を有するオリゴヌクレオチド：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここでアルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る）、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’又は４’炭素原子に連結され、それにより二環式糖部分を形成しているロックト核酸（ＬＮＡｓ）、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンを含むが、これらに限定されない合成及び天然核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。さらなる修飾核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）などの三環式ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリミド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などのＧクランプ（Ｇ−ｃｌａｍｐｓ）などである。修飾核酸塩基は、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環で置換されたもの、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドン、キレート化部分、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を向上させる基、及びオリゴマーの薬物動態特性を向上させる基を含む（これらに限定されないが）、第一級若しくは第二級ヒドロキシル基に化学的に結合したオリゴヌクレオチドを含んでいてよい。上述の修飾は、参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２００７／１２５１７３にさらに記載されている。
【００７５】
一般的な結合体基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、ヒルオレセイン、ローダミン、クマリン及び色素などがある。本発明の状況において、薬力学的特性を向上させる基は、取り込みを改善する、分解に対する抵抗性を増大させ、且つ／又は標的核酸との配列特異的ハイブリッド形成を強くする基などである。
【００７６】
本発明の化合物のさらなる修飾
本発明の化合物の他の修飾も企図される。オリゴヌクレオチドは本発明の化合物の好ましい形であるが、本発明は、他のファミリーの化合物も包含し、これらは本明細書で述べるようなオリゴヌクレオチド類似体及び擬似体を含むが、それらに限定されない。
【００７７】
当技術分野で知られているように、ヌクレオシドは、塩基と糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常は複素環式塩基である。そのような複素環式塩基の最も一般的なクラスは、プリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシルフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基を糖の２’、３’又は５’ヒドロキシル部分に結合させることができる。オリゴヌクレオチドを形成するに際して、リン酸基が隣接ヌクレオシドと互いに共有結合して、線状ポリマー化合物を形成する。そして次に、この線状ポリマー化合物の各末端をさらに結合させて環状化合物を生成させることができるが、線状化合物が一般的に好ましい。さらに、線状化合物は、内部核酸塩基相補性を有していてよく、したがって、完全又は部分的に２本鎖の化合物を生成するような仕方で折り重なっていてよい。オリゴヌクレオチド内において、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成するものと一般的に言われている。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常の結合又はバックボーンは、３’−５’ホスホジエステル結合である。
【００７８】
修飾ヌクレオシド間結合（主鎖）
企図される、本発明で有用なアンチセンス化合物の特定の例は、修飾主鎖又は非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドなどである。本明細書で定義したように、修飾主鎖を有するオリゴヌクレオチドとしては、主鎖にリン原子を保持するもの及び主鎖にリン原子を有さないものなどがある。本明細書の目的のために、また当技術分野で時として言及されるように、それらのヌクレオシド間主鎖にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドとみなすことができる。
【００７９】
企図される、リン原子をその中に含有する修飾オリゴヌクレオチド主鎖としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル並びに３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の３’−５’結合を有するセレノホスフェート及びボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、並びに１つ又は複数のヌクレオチド間結合が３’−３’、５’−５’又は２’−２’結合である、逆極性を有するものなどがある。企図される、逆極性を有するオリゴヌクレオチドは、最も３’側のヌクレオチド間結合における単一３’−３’結合、すなわち無塩基（核酸塩基が欠失しているか、又はその代わりにヒドロキシル基を有する）であってよい単一逆ヌクレオシド残基を含む。様々な塩、混合塩及び遊離酸形も含まれる。
【００８０】
上のリンを含む結合の調製を教示している代表的な米国特許は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、同第５，１９４，５９９号、同第５，５６５，５５５号、同第５，５２７，８９９号、同第５，７２１，２１８号、同第５，６７２，６９７号及び同第５，６２５，０５０号を含むが、これらに限定されない。
【００８１】
企図される、リン原子をその中に含有しない修飾オリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル・ヌクレオシド間結合、混合へテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキル・ヌクレオシド間結合、或いは１つ若しくは複数の短鎖へテロ原子又は複素環式ヌクレオシド間結合により形成される主鎖を有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成された）を有するもの、シロキサン主鎖、スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖、リボアセチル主鎖、アルケン含有主鎖、スルファメート主鎖、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖、スルホネート及びスルホンアミド主鎖、アミド主鎖並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有するその他のものを含む。
【００８２】
上のオリゴヌクレオシドの調製を教示している代表的な米国特許は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、同第５，７９２，６０８号、同第５，６４６，２６９号及び同第５，６７７，４３９号を含むが、これらに限定されない。
【００８３】
修飾糖及びヌクレオシド間結合擬似体
他の予測されるオリゴヌクレオチド擬似体において、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合（すなわち、主鎖）の両方が新規な基で置換されている。核酸塩基単位は、適切な標的核酸とのハイブリッド形成が維持される。そのような化合物において、優れたハイブリッド形成特性を有することが示されたオリゴヌクレオチド擬似体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−主鎖は、主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖を含むアミドで置換されている。核酸塩基は、保持されており、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示している代表的な米国特許は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号及び同第５，７１９，２６２号を含むが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７〜１５００頁に見出すことができる。
【００８４】
本発明の特定の実施形態は、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子主鎖を有するオリゴヌクレオシド、並びに特に上に記載した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ主鎖として知られている］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（天然ホスホジエステル主鎖は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−と表される）、並びに上に記載した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド主鎖である。上に記載した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドも企図される。
【００８５】
修飾糖
修飾オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の置換糖部分も含んでいてよい。企図されるオリゴヌクレオチドは、２’位に次の１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここでアルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであってよい）。特に好ましいものはＯ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、ｎ及びｍは１〜約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に次の１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル若しくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、並びに同様な特性を有する他の置換基。企図される修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られている）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６〜５０４頁）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。企図される、さらなる修飾は、下文の実施例で述べる２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び下文の実施例でも述べる２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥ）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
【００８６】
他の企図される修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。２’−修飾は、アラビノ（上）位置又はリボ（下）位置であってよい。好ましい２’アラビノ修飾は、２’−Ｆである。同様な修飾は、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上又は２’−５’結合オリゴヌクレオチドにおける糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位においても行うことができる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖擬似体も有していてよい。そのような修飾糖構造の調製を教示している代表的な米国特許は、それぞれが参照によりその全体において本明細書に組み込まれている、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、同第５，７９２，７４７号及び同第５，７００，９２０号を含むが、これらに限定されない。
【００８７】
糖のさらなる好ましい修飾は、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’又は４’炭素原子に連結され、それにより二環式糖部分を形成しているロックト核酸（ＬＮＡｓ）を含む。連結は、好ましくは２’酸素原子と４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であり、ｎは１又は２である。ＬＮＡｓ及びその調製は、ＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６に記載されている。
【００８８】
天然及び修飾核酸塩基
オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（当技術分野でしばしば単に「塩基」と呼ばれている）の修飾又は置換を含んでいてもよい。本明細書で用いているように、「非修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノ−アデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなどの他の合成及び天然核酸塩基を含む。さらなる修飾核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）などの三環式ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などのＧクランプなどである。修飾核酸塩基は、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環で置換されたもの、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンを含んでいてもよい。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５９〜８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３頁に開示されているもの、並びにＳａｎｇｈｖｉ、第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９〜３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ及びＬｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３に開示されているものなどである。
【００８９】
上記の修飾核酸塩基並びに他の修飾核酸塩基の特定のものの調製を教示している代表的な米国特許は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、並びに米国特許第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，８３０，６５３号、同第５，７６３，５８８号、同第６，００５，０９６号及び同第５，６８１，９４１号を含むが、これらに限定されず、米国特許第５，７５０，６９２号も参照により本明細書に組み込まれている。
【００９０】
修飾核酸塩基は、全体として参照により本明細書に組み込まれている、共有及び同時係属の特許出願第＿号（整理番号２８１１３／４３４３４Ｂ）並びに２００７年１１月５日に出願された米国仮出願第６０／９８５，５４８号及び２００８年５月３０日に出願された米国仮出願第６１／０５７，６８５号において抗ウイルス薬としての使用が企図されている。
【００９１】
アンチセンス阻害
本発明の化合物の標的核酸とのハイブリッド形成は、一般的に「アンチセンス」と呼ばれる。そのようなハイブリッド形成は、標的核酸の翻訳の阻害をもたらし得るものであり、本明細書では「アンチセンス阻害」と呼ぶ。そのようなアンチセンス阻害は、一般的に、少なくとも１本の鎖若しくはセグメントが開裂し、分解し、又は別の仕方で機能しなくするような、オリゴヌクレオチド鎖若しくはセグメントの水素結合に基づくハイブリッド形成に基づいている。この点に関して、そのようなアンチセンス阻害のために特定の核酸分子及びそれらの機能を標的にすることが現在のところ好ましい。
【００９２】
阻害すべきＤＮＡの機能は、複製及び転写などである。複製及び転写は、例えば、内因性細胞鋳型、ベクター、プラスミド構成体又は他のものによるものであってよい。妨害すべきＲＮＡの機能は、タンパク質の翻訳の部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡ合成の部位から遠い細胞内の部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ又は複数のＲＮＡ種を生成するためのＲＮＡのスプライシング、及び関与する可能性があるＲＮＡに関係する又はＲＮＡにより促進される触媒活性又は複合体形成などの機能を含み得る。本発明の状況において、「調節」及び「発現の調節」は、遺伝子をエンコードする核酸分子、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡの量又はレベルの増加（刺激）又は減少（阻害）を意味する。阻害は、発現の調節のしばしば好ましい形であり、ｍＲＮＡがしばしば好ましい標的核酸である。
【００９３】
本発明の状況において、「ハイブリッド形成」は、オリゴマー化合物の相補鎖の対合を意味し、「アニーリング」という用語と相互に置き換えて使用される。本発明において、対合の好ましいメカニズムは、オリゴマー化合物の鎖の相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基（核酸塩基）間のワトソン・クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合であってよい水素結合に関係する。例えば、アデニン及びチミンは、水素結合の形成により対になる相補的核酸塩基である。ハイブリッド形成は、様々な状況下で起こり得る。
【００９４】
標的核酸への化合物の結合が標的核酸の正常な機能を妨害して活性の喪失をもたらし、特異的結合が望ましい条件下、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ又は治療的処置の場合の生理的条件下、及びｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合にアッセイを実施する条件下で非標的核酸配列に対するアンチセンス化合物の非特異的結合を避けるのに十分な相補性の程度が存在する場合に、アンチセンス化合物は、特異的にハイブリッド形成できる。
【００９５】
本発明の１つの態様において、標的核酸の発現は、２０％阻害される。他の態様において、標的核酸の発現は、少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９９％又はそれ以上阻害される。
【００９６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件の場合、ハイブリッド形成が起こるｐＨは重要である。下に開示するように、本発明の修飾オリゴヌクレオチドがそれらの標的に結合する効率は、ｐＨによる影響を受ける。標的核酸に対する修飾オリゴヌクレオチドの高度に効率のよい結合は、約４〜１０のｐＨ範囲で起こる。１つの態様で、高度に効率のよい結合が起こるｐＨは４である。種々の態様において、標的核酸に対する修飾オリゴヌクレオチドの高度に効率のよい結合が起こるｐＨは、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、約９、約９．１、約９．２、約９．３、約９．４、約９．５、約９．６、約９．７、約９．８、約９．９又は約１０である。これらの具体例としてのｐＨにより定義されている全範囲は、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ実施形態を定義する代替の方法として明示的に企図される。
【００９７】
本発明において、「緊縮ハイブリッド形成条件」又は「緊縮条件」という語句は、本発明の化合物がその標的配列とハイブリッド形成するが、最小限の数の他の配列とハイブリッド形成する条件を意味する。緊縮条件は、配列依存的であり、異なる状況で異なり、本発明の状況において、オリゴマー化合物が標的配列とハイブリッド形成する「緊縮条件」は、オリゴマー化合物の性質及び組成並びにそれらが検討されるアッセイによって決定される。１つの具体例としての条件の組は次の通りである。５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、２０ｍＭＮａ・ＰＯ４、ｐＨ６．８中４２℃でのハイブリッド形成；及び１ＸＳＳＣで５５℃で３０分間洗浄。同等のハイブリッド形成条件を計算するための式及び／又は所望のレベルの緊縮性を達成するための他の条件の選択は、よく知られている。同等の緊縮性の条件は、Ａｕｓｂｅｌら（編）、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９４）、６．０．３〜６．４．１０頁に記載されているように温度及び緩衝液又は塩濃度の変形形態により達成することができることは当技術分野で理解されている。ハイブリッド形成条件の修正は、プローブのグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対合の長さ及びパーセントに基づいて経験的に決定又は精密に計算することができる。ハイブリッド形成条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、９．４７〜９．５１頁に記載されているように計算することができる。
【００９８】
「相補的」は、本明細書で用いているように、オリゴマー化合物の２つの核酸塩基間の正確な対合の能力を意味する。例えば、オリゴヌクレオチド（オリゴマー化合物）の特定の位置における核酸塩基が標的核酸の特定の位置における核酸塩基と水素結合することができ、前記標的核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ又はオリゴヌクレオチド分子である場合、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置は、相補的位置であるとみなされる。各分子における十分な数の相補的位置が互いに水素結合することができる核酸塩基によって占有されている場合、オリゴヌクレオチドとさらなるＤＮＡ、ＲＮＡ又はオリゴヌクレオチド分子は互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリッド形成可能」及び「相補的」は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に安定且つ特異的な結合が起こるような十分な数の核酸塩基にわたる十分な程度の正確な対合又は相補性を示すのに用いる用語である。
【００９９】
特異的にハイブリッド形成するためにアンチセンス化合物の配列がその標的核酸の配列と１００％相補的である必要はないことが当技術分野で理解されている。さらに、オリゴヌクレオチドは、介在又は隣接セグメントがハイブリッド形成事象に関与しないように１つ又は複数のセグメントにわたってハイブリッド形成していてよい（例えば、ループ構造又はヘアピン構造）。本発明の化合物のオリゴヌクレオチド部分が標的核酸内の標的領域との少なくとも７０％の配列相補性を含むことが好ましく、より好ましくはそれらが、それらが標的とする標的核酸配列内の標的領域との少なくとも８５％又は９０％の配列相補性を含み、また少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相補性を含み得る。例えば、化合物の２０個の核酸塩基のうちの１８個が標的領域と相補的であり、したがって特異的にハイブリッド形成する本発明の化合物は、９０％の相補性を示すこととなる。この例において、残りの非相補的核酸塩基は、密集しているか、又は相補的核酸塩基の間に散在していてよく、互いに又は相補的核酸塩基に隣接している必要はない。したがって、標的核酸との完全な相補性の２つの領域が両側に隣接している４個の非相補的核酸塩基を有する長さが１８個の核酸塩基である化合物は、標的核酸との７７．８％の総相補性を有し、したがって、本発明の範囲内に入ることとなる。標的核酸の領域を含む化合物の相補性のパーセントは、当技術分野で知られているＢＬＡＳＴプログラム（基本局所アライメント検索ツール（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌｓ）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９９、２１５、４０３〜４１０頁；Ｚｈａｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１９９７、７、６４９〜６５６頁）を用いてルーチンに求めることができる。ヒドロキシ核酸塩基及び／又は合成類似体（他の合成核酸塩基など）を有する本発明の化合物については、相補性は、標的核酸の個々の核酸塩基に対する合成類似体の特異性によって評価することができる。
【０１００】
アンチセンス化合物の好ましい形は１本鎖アンチセンス・オリゴヌクレオチドであるが、多くの種において２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子のような２本鎖構造の導入は、遺伝子又はその関連遺伝子産物の機能の強く、特異的なアンチセンス媒介性の低減を引き起こすことが示された。この現象は、植物及び動物の両方において起こり、ウイルス防御及びトランスポゾンサイレンシングとの進化上の関連性を有すると考えられている。
【０１０１】
ｄｓＲＮＡが動物における遺伝子サイレンシングをもたらし得るという最初の証拠は、１９９５年に線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓにおける研究から出現した（Ｇｕｏら、Ｃｅｌｌ、１９９５、８１、６１１〜６２０頁）。Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙらは、ｄｓＲＮＡの主要な干渉効果は転写後であることを示した（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、１５５０２〜１５５０７頁）。２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）への曝露に起因するＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓにおいて定義された転写後アンチセンス・メカニズムは、それ以来ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれている。この用語は、内因性標的ｍＲＮＡレベルの配列特異的低下につながるｄｓＲＮＡの導入に伴うアンチセンス媒介性遺伝子サイレンシングを意味するように一般化された（Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９１、８０６〜８１１頁）。最近、それは、実際には、ＲＮＡｉの強力なインデューサーであるｄｓＲＮＡｓのアンチセンス極性の１本鎖ＲＮＡオリゴマーであることが示された（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２、２９５、６９４〜６９７頁）。
【０１０２】
標的核酸に特異的に結合し、切断するようにデザインされた、小干渉性ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）、それらの前駆体及び類似体並びにリボザイムなどの、オリゴヌクレオチドと類似しているが、異なる作用機序を有する物質の使用に関するさらなる知識が当技術分野に存在する。
【０１０３】
ハイブリッド形成のための標識オリゴヌクレオチド類似体の使用
本明細書で述べるオリゴヌクレオチド及び化合物は、場合によって標識することができる。当業者は、多くの手段のいずれかにより本発明のオリゴヌクレオチドを標識することができる。オリゴヌクレオチドは、３２Ｐ、３５Ｓ又は当業者に知られている他のいずれかの放射性核種により放射性標識することができる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、蛍光標識することができる。用いることができる蛍光標識は、次のものを含むが、それらに限定されない：フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ＣＹ−５、ＣＹ−５．５、ＣＹ−３、ＣＹ−２、ＣＹ−７、テキサス・レッド、ローダミン等。
【０１０４】
これらの標識オリゴヌクレオチドは、サザン及びノーザン・ブロッティングなどの当技術分野でよく知られているアッセイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））に用いられることが企図される。本発明の他の態様は、チップなどの固体担体上に固定化した核酸とのハイブリッド形成における標識修飾オリゴヌクレオチドの使用である。当業者は、これらのチップをマイクロアレイ試験に用いることができることを理解するであろう。修飾核酸塩基を含む標識オリゴヌクレオチドは、それら自体本発明の態様である。
【０１０５】
本発明のさらなる態様は、ＰＣＲ用のプライマーとして用いられる本発明の修飾オリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチドの１対若しくは複数の対である。プライマーは、通常のＰＣＲ、実時間ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）などを含むが、これらに限定されない当業者に知られているＰＣＲのいずれかの方法に用いることができる。
【０１０６】
ＰＣＲが、標的核酸を変性するステップと、その後にオリゴヌクレオチド・プライマーを変性標的核酸の鎖にアニーリングするステップの繰り返しとを含むことは当業者によってよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されているように）。このハイブリッド形成複合体は、次に熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの作用により伸長される（すなわち、標的核酸鎖の配列に従ってヌクレオチドが連続して加えられる）。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、当技術分野で知られており、Ｔａｑ、Ｐｆｘ及びＴａＫａＲａポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
【０１０７】
アニーリングを行う温度及び伸長の時間などのＰＣＲのパラメーターは、本質的に経験的なものであり、十分に当業者の決定能力内にある。
【０１０８】
本発明の化合物の使用
本明細書で述べる化合物は、ＤＮＡゲノム、ＲＮＡゲノムを有するウイルス及び逆転写を用いるウイルスを含む、ウイルスのような病原体の遺伝子発現及び増殖を制限するためにｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで用いる。また全体として参照により本明細書に組み込まれている、共有及び同時係属の特許出願第＿号（整理番号２８１１３／４３４３４Ｂ）並びに２００７年１１月５日に出願された米国仮出願第６０／９８５，５４８号及び２００８年５月３０日に出願された米国仮出願第６１／０５７，６８５号も参照のこと。したがって、化合物は、疾患状態になりやすい、又は疾患状態にある生物に投与することができる。生物に投与するとき、化合物は、様々な病原体による感染を処置するために用いることができる。本明細書で用いているように、「処置する」は、被検体の健康状態、病状及び疾患に対して所望の結果をもたらすのに十分な用量／量での必要とする被検体への、又は診断目的のための本発明のオリゴヌクレオチドの投与を意味する。所望の結果は、投与の受容者における主観的又は客観的改善を含んでいてよい。「処置（治療）」は、予防処置又は治療処置又は診断処置を意味する。診断又は処置の「対象」は、哺乳類又は霊長類を含む、ヒト又は非ヒト動物である。「治療上有効な量」は、健康に対する意図される有益な効果をもたらす有効な組成物の量を意味する。
【０１０９】
化合物は、特定のＢ細胞、ヘルパー細胞、サプレッサー細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｃ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの特定のＴ細胞などの免疫系細胞の機能を調節するために用いることができる。本発明の化合物を用いる免疫機能の調節は、ウイルス性病原体により引き起こされる慢性疾患のような様々な疾患の治療に有用であり得る。
【０１１０】
化合物のオリゴヌクレオチドのその標的配列に対する結合に関係するメカニズムのいずれかによりタンパク質の転写及び／又は発現を妨げることができる化合物を選択することができる。これらのメカニズムは、プロセシングの妨害、核膜を通しての輸送の阻害、エンドヌクレアーゼによる開裂、レプリカーゼ複合体の形成などを含むが、これらに限定されない。
【０１１１】
本明細書で述べる化合物は、感染性疾患の治療に用いることができる。標的核酸配列は、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＳＶ、ＨＣＶ等の病原性ウイルスの遺伝子、並びにこれらのウイルスに対する、或いは疾患発現及び／又は進行に関与する宿主因子をエンコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【０１１２】
癌の治療において、標的核酸配列は、腫瘍遺伝子又は腫瘍形成特性を有するウイルスに関連するＤＮＡ若しくはＲＮＡ、腫瘍サプレッサー遺伝子、及び関連遺伝子であってよい。さらに、本発明の化合物は、薬物耐性に関連する遺伝子及びそれらの遺伝子産物を標的とすることもできる。
【０１１３】
標的を定める過程は、所望の効果、例えば、発現の調節が生じるように、アンチセンス相互作用が起こる標的核酸内の少なくとも１つの標的領域、セグメント又は部位の決定も通常含む。本発明の状況において、「領域」は、少なくとも１つの識別できる構造、機能又は特性を有する標的核酸の部分を意味する。標的核酸の領域内にセグメントがある。「セグメント」は、標的核酸内の領域のより小さい部分又は小部分を意味する。「部位」は、本発明で用いているように、標的核酸内の位置を意味する。
【０１１４】
本明細書で述べる組成物は、同じウイルスゲノム内の２つの異なる領域又はセグメントとハイブリッド形成するために併用することがさらに企図される。標的を選択するために、考慮事項は、ウイルス増殖に重要であるウイルスゲノムの領域における標的の局在化などである（標的は必須の領域でなければならない）。可能な場合、好ましい標的は、ウイルスの異なる株及び遺伝子型間に保存されている領域にあるべきである（しばしばこれは配列の機能の意義も示している）。タンパク質の高度に保存されたドメインをエンコードする領域は良好な標的であり、重複機能要素（シス活性要素と重複したコーディング配列）を含む領域も良好な標的である。
【０１１５】
標的部位は、望ましいヌクレオチド含量及び／又は修飾核酸塩基の組成を有するオリゴヌクレオチド阻害剤の構築を可能にするヌクレオチド組成を有するべきであり、好ましくは標的は強い二次構造要素を含まないことがさらに企図される。さらに、標的の配列は、必須の宿主遺伝子、特に宿主ｍＲＮＡｓの配列と重複すべきでない。さらに、修飾核酸塩基の位置は、宿主配列と一致すべきでない。Ｃ又はＧヌクレオチドのクラスター（３つ又はそれ以上）は、避けるべきである。実験でコーディング領域内の標的部位は非コーディング領域におけるものよりよいこと、またＲＮＡウイルスの場合、プラス鎖はマイナス鎖よりよい標的であることが示された。核酸の破壊（例えば、ＲＮＡｓｅ又はＤＮＡｓｅ複合体による）の特有のメカニズムのため、翻訳開始配列を修飾オリゴヌクレオチドの標的にすることは必要でない。これは、ＲＮＡ分解を開始することができず、翻訳の開始コドンを含む領域を標的とする場合に最も（又はもっぱら）有効である、モルホリノ・オリゴヌクレオチドの場合と対照的である。そのような制約は、ここで述べる修飾オリゴヌクレオチドについては存在しない。
【０１１６】
２つ又はそれ以上の部位を標的とするために、各部位は、上で述べた基準のいくつかを満たさなければならない。標的の配列は、オリゴヌクレオチドの集合を避けるために異なっており、互いに相補的でないものであるべきであり、標的は、１つ及び同じ機能単位、例えば、同じ酵素と、又は異なる単位と異なる配列を示すことができる。ほとんどの場合、耐性突然変異体の発生の可能性を最小限にするために、第２の選択肢が好ましい。本明細書で用いているように、「機能単位」という用語は、ウイルスの複製又は遺伝子発現の機能を有するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列、例えば、各種複製因子、転写因子等を意味する。同じ機能単位に結合するオリゴヌクレオチドは、例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質内の同じポリペプチド又はポリヌクレオチド機能単位における異なる標的配列に結合する。異なる機能単位に結合する本発明により企図されるオリゴヌクレオチドは、ウイルス複製又は遺伝子発現の異なる機能を有するポリペプチド又はポリヌクレオチド、例えば、ＨＩＶ Ｔａｔ及びＲｅｖ遺伝子又はタンパク質に結合する。当業者は、ウイルス複製又は遺伝子発現に関連する機能単位の意味を容易に理解することができる。
【０１１７】
翻訳開始コドンは、一般的に５’ＡＵＧ（転写ｍＲＮＡ分子における；対応するＤＮＡ分子における５’ＡＴＧ）であり、翻訳開始コドンは、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」又は「ＡＵＧ開始コドン」とも呼ばれている。少数の遺伝子がＲＮＡ配列５’ＧＵＧ、５’ＵＵＧ又は５’ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、５’ＡＵＡ、５’ＡＣＧ及び５’ＣＵＧは、ｉｎ ｖｉｖｏで機能することが示された。したがって、「翻訳開始コドン」及び「開始コドン」という用語は、各場合におけるイニシエーターアミノ酸は一般的にメチオニン（真核生物において）又はホルミルメチオニン（原核生物において）であるが、多くのコドン配列を含むことができる。真核生物及び原核生物遺伝子は、いずれか１つが、特定の細胞型若しくは組織において、又は特定の条件の組のもとで翻訳開始に優先的に用いられる可能性がある、２つ又はそれ以上の代替開始コドンを有する可能性があることも当技術分野で知られている。本発明の状況において、「開始コドン」及び「翻訳開始コドン」は、そのようなコドンの配列（単数又は複数）にかかわらず、インターロイキン１８をエンコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を開始するためにｉｎ ｖｉｖｏで用いられるコドン又は（複数の）コドンを意味する。遺伝子の翻訳終止コドン（又は「停止コドン」は、３つの配列、すなわち、５’ＵＡＡ、５’ＵＡＧ及び５’ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列はそれぞれ５’ＴＡＡ、５’ＴＡＧ及び５’ＴＧＡである）の１つを有する可能性があることも当技術分野で知られている。
【０１１８】
「開始コドン領域」及び「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５’又は３’）の約２５〜約５０の連続したヌクレオチドを含むそのようなｍＲＮＡ又は遺伝子の部分を意味する。同様に、「停止コドン領域」及び「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち、５’又は３’）の約２５〜約５０の連続したヌクレオチドを含むそのようなｍＲＮＡ又は遺伝子の部分を意味する。したがって、「開始コドン領域」（又は「翻訳開始コドン領域」）及び「停止コドン領域」（又は「翻訳終止コドン領域」）は、本発明のアンチセンス化合物が効果的に標的にすることができるすべての領域である。
【０１１９】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を意味することが当技術分野で知られている読み取り枠（ＯＲＦ）又は「コーディング領域」は、効果的に標的にすることができる領域でもある。本発明の状況において、好ましい領域は、遺伝子の読み取り枠（ＯＲＦ）の翻訳開始又は終止コドンを含む遺伝子内領域である。
【０１２０】
他の標的領域は、当技術分野で翻訳開始コドンから５’方向のｍＲＮＡの部分を意味することが知られ、したがってｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチド（又は遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、及び当技術分野で翻訳終止コドンから３’方向のｍＲＮＡの部分を意味することが知られ、したがってｍＲＮＡの翻訳終止コドンと３’端との間のヌクレオチド（又は遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ部位は、５’−５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡの最も５’側の残基に連結されたＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造自体並びにキャップ部位に隣接する最初の５０ヌクレオチドを含むとみなされる。５’キャップ領域を標的とすることもまた好ましい。
【０１２１】
一部の真核生物ｍＲＮＡ転写物は直接翻訳されるが、多くは、それが翻訳される前に転写物から切除される「イントロン」として知られている１つ又は複数の領域を含む。残りの（またしたがって翻訳される）領域は、「エキソン」として知られており、一緒にスプライスされて、連続ｍＲＮＡ配列を形成する。標的スプライス部位、すなわち、イントロン−エキソン連結部又はエキソン−イントロン連結部も、異常なスプライシングが疾患に関連づけられる、或いは特定のスプライス産物の過剰産生が疾患に関連づけられる状況においては特に有用であり得る。再配列又は欠失に起因する異常な融合連結も好ましい標的部位である。異なる遺伝子源からの２つ（又はそれ以上）のｍＲＮＡｓのスプライシングの過程を経て産生されるｍＲＮＡ転写物は、「融合転写物」として知られている。イントロンは、例えば、ＤＮＡ又は前ｍＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物を用いて効果的に標的にすることができることも知られている。
【０１２２】
代替のＲＮＡ転写物は、ＤＮＡの同じゲノム領域から産生させることができる。これらの代替転写物は、一般的に「変異体」として知られている。より具体的には、「前ｍＲＮＡ変異体」は、同じゲノムＤＮＡから産生される他の転写物とそれらの開始又は停止位置が異なる同じゲノムＤＮＡから産生され、イントロン及びエキソン配列を含む転写物である。
【０１２３】
スプライシング時の１つ又は複数のエキソン又はイントロン領域或いはその一部の切除により、前ｍＲＮＡ変異体はより小さい「ｍＲＮＡ変異体」を生ずる。したがって、ｍＲＮＡ変異体は、処理された前ｍＲＮＡ変異体であり、各特有の前ｍＲＮＡ変異体は、スプライシングの結果として特有のｍＲＮＡ変異体を常に生じなければならない。これらのｍＲＮＡ変異体は、「選択的スプライス変異体」としても知られている。前ｍＲＮＡ変異体のスプライシングが起らない場合、前ｍＲＮＡ変異体は、ｍＲＮＡ変異体と同じである。
【０１２４】
変異体は、転写を開始又は停止するための選択的シグナルを用いることによって産生させることができ、前ｍＲＮＡｓ及びｍＲＮＡｓは、複数の開始コドン又は停止コドンを有することができる。選択的開始コドンを使用する前ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡが起源である変異体は、当該前ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの「選択的開始変異体」として知られている。選択的停止コドンを使用する転写物は、当該前ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの「選択的停止変異体」として知られている。選択的停止変異体の１つの特定のタイプは、複数の転写物が転写装置による「ポリＡ停止シグナル」の１つの代替選択により産生され、それにより、特有のポリＡ部位で終結する転写物を産生する、「ポリＡ変異体」である。本発明の状況において、本明細書で述べる変異体のタイプも好ましい標的核酸である。
【０１２５】
本開示のさらなる態様及び詳細は、限定するのではなく、例示することを意図する以下の実施例から明らかであろう。
【実施例１】
【０１２６】
相補的なメンブレン結合未修飾センスオリゴヌクレオチドへの修飾／未修飾アンチセンス・オリゴヌクレオチドの結合
以下の特許出願：２００６年５月３日に出願した米国仮出願第６０／７９７，４４８号、及び２００７年４月３０日に出願した米国仮出願第１１／７４２，３８４号（米国特許出願公開第２００７／０２５９８３０号として公開された）の各々は、参照により全体として組み込まれる。
【０１２７】
１以上の修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの相補的結合効率を比較するために、修飾オリゴヌクレオチドを作製し、未修飾オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成効率と比較した。結合効率は、ハイブリッド形成反応のｐＨに対して決定された。
【０１２８】
オリゴヌクレオチドは、修飾塩基５−ヒドロキシシトシン（Ｃ＊）及び８−ヒドロキシグアニン（Ｇ＊）のうちの１つ又はその両方を含む。未修飾オリゴヌクレオチドを対照として使用した。オリゴヌクレオチドを表１に示す。
【０１２９】
【表１】
【０１３０】
修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率のｐＨ依存性を様々な標的量／濃度で試験した。メンブレン上の相補的オリゴヌクレオチド濃度１ｐｍｏｌにおける天然オリゴヌクレオチドの結合効率に対する修飾オリゴヌクレオチド結合効率に関するデータは、４次多項式を用いてフィッティングさせ、それぞれのグラフを図１に与える。相対的結合は
【数１】
として定義される効率である。
【０１３１】
ここで、Ｄｍｏｄは、修飾核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドの結合効率であり、Ｄｎａｔは天然オリゴヌクレオチドの結合効率を示す。
【０１３２】
図１に示されるデータは、ｐＨへの修飾オリゴヌクレオチドの結合効率の強い依存性を示す。これは、いくつかの主要なプロトトロピック（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｉｃ）互変異性形態（スキーム１及び２）で存在する修飾塩基５−ヒドロキシシトシン及び８−ヒドロキシグアニンの陰イオンとして互変異性平衡が存在することに起因し、それらの比率は、周辺の媒質（溶液）のｐＨに実質的に依存し得る。異なる互変異性形態の結合効率は顕著に異なることができ、ｐＨへの観察できる結合効率の強力な依存性をもたらす。
【化２】
【０１３３】
５−ヒドロキシシトシン陰イオンの場合では、互変異性形態１ｂは、シトシンそれ自体よりも約１０７倍高い相補的グアニン塩基に対する結合効率を有する。互変異性形態１ａは、シトシンと類似した結合効率を有することが予測されが、互変異性形態１ｃは相補的塩基との結合低下を有する。
【化３】
【０１３４】
また、８−ヒドロキシグアニンの場合では、互変異性形態２ｂは、グアニンそれ自体よりも、相補的シトシン塩基に対して非常に高い（約１０７〜１０８倍高い）結合効率を有する。互変異性形態２ａ及び２ｃは、グアニンと比較して類似の結合効率を有することが期待される。
【０１３５】
修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率のｐＨ依存性は、５．０〜６．０近辺のｐＨ値で明確に最大となり、約ｐＨ＝７．５ではっきりと最小となる。また、ｐＨのさらなる増加は、修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の実質的な増加をもたらす。最大効率は、修飾（５−ヒドロキシシトシン又は８−ヒドロキシシトシングアニン）の性質、及びオリゴマーにおける置換の位置（オリゴヌクレオチドｆ１とｆ２を比較する）の両方に依存する。最高効率は、修飾オリゴヌクレオチドｆ１について観察された（１．３７）。
【０１３６】
修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の類似したｐＨ依存性は、５ｐｍｏｌ（図２）と２５ｐｍｏｌ（データ示さず）のオリゴヌクレオチド濃度で得られた。
【実施例２】
【０１３７】
相補的なメンブレンに結合したＤＮＡへの修飾／未修飾アンチセンス・オリゴヌクレオチドの結合
ＤＮＡを有するオリゴヌクレオチドの相対的結合効率を測定するための類似の実験は、同じ手順を用いて行われた。また、各々の修飾オリゴヌクレオチドについてのデータは、４次多項式を用いてフィッティングされ、それぞれのグラフを図３に与える。
【０１３８】
オリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオチド結合とは対照的に、この場合には、ｐＨ依存性は３つの最大を有するが、しかしながら、最高のものはこの場合も低ｐＨ値（ｐＨ＝４．５〜５．０近辺）である。また、この最大は、オリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオチド結合に対する最大よりも有意に高い。修飾オリゴヌクレオチドｆ２及びｆ１については、相対的結合効率は、それぞれ２．９及び２．１である。修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率のｐＨ依存性における他の２つの最大は、それぞれｐＨ＝７．５及びｐＨ＝１０近辺で局在化される（図３）。
【０１３９】
顕著には、２つの修飾（５−ヒドロキシシトシン及び８−ヒドロキシグアニン関与）を有するオリゴヌクレオチドｆ＊は、ｐＨへの相対的結合効率の非常に平滑な依存性を有する（図３及び４）。
【０１４０】
相対的結合効率の類似のｐＨ依存性は、メンブレン上のＤＮＡ量が５ｎｇで観察された（図４）。
【実施例３】
【０１４１】
ハイブリッド形成における修飾オリゴヌクレオチドの使用
図５のパネルＡでは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉｎａ）ＲＬＩ２遺伝子の、長さが２ｋｂであるｃＤＮＡ５ｎｇ及び１ｎｇを、ＴＢＥ緩衝液中の５％ポリアクリルアミドゲル上で変性条件下での電気泳動によって解析した。ゲルをナイロンメンブレン上に電気ブロットし、ＵＶ架橋によりＤＮＡを固定化した。メンブレンは、一晩４５℃で、６×ＳＳＣ、２×デンハーツ溶液、０．１％ＳＤＳ及びｐＨ５．０中で、すべてが同一である５つの３２Ｐ５’標識したオリゴヌクレオチドと順番にハイブリダイズした。プローブは、ｆ、ｆ１、ｆ２、ｆ３及びｆ＊であった（表１参照）。メンブレンを２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、ｐＨ５．０を用いて、１０分間４５℃で２回洗浄した。放射性シグナルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌ ＦＸ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて検出された。パネルＢ、Ａにおいて示された検出されたシグナルは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ソフトウェアを用いて定量された。それぞれのデータを図５に与える。
【実施例４】
【０１４２】
相補的なメンブレンに結合したｍＲＮＡへの修飾／未修飾アンチセンス・オリゴヌクレオチドの結合
メンブレンに固相化された相補的な天然ｍＲＮＡを有する修飾核酸塩基（５−ヒドロキシシトシン及び５−ヒドロキシグアニン）を含むオリゴヌクレオチドの相対的結合効率を測定するための実験は、同じ手順を用いて行われた。修飾ヌクレオチドを有するｍＲＮＡの相対的結合効率のｐＨ依存性に関するデータは、２つの区別される最大を有し、その最高はｐＨ＝５．８〜６．２近辺に局在化される（図５）。
【０１４３】
この場合において、最大の最高の効率は修飾グアニン核酸塩基（８−ヒドロキシグアニン）を含むオリゴヌクレオチドによって示され、未修飾オリゴヌクレオチドよりも１．５倍高い効率である。
【０１４４】
修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の類似したｐＨ依存性は、メンブレン上のｍＲＮＡ量が２．５ｎｇである場合について観察され、最大はよりアルカリ側に幾分シフトしている（図７）。
【実施例５】
【０１４５】
標的濃度に対する修飾オリゴヌクレオチドの相対的結合効率の依存性
オリゴヌクレオチドにおいて、より高い結合効率を有する互変異性形態の存在は、低濃度でそれらのより高い相対的結合効率をもたすことができる。オリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオチド実験では、センス及びアンチセンスの濃度が類似している場合、このような挙動が観察される。図８では、修飾オリゴヌクレオチドｆ１の相対的結合効率のｐＨ依存性は、種々の標的濃度（１ｐｍｏｌ、５ｐｍｏｌ、２５ｐｍｏｌ）で示される。結果として、相対的結合効率は、標的濃度の低下とともに増加する。
【０１４６】
類似の依存性は、修飾オリゴヌクレオチドｆ２の場合に観察される（図９）。
【０１４７】
ハイブリッド形成実験の結果
天然オリゴヌクレオチドと比較した、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ及びｍＲＮＡにおける相補的配列への互変異性修飾核酸塩基（５−ヒドロキシシトシン及び／又は８−ヒドロキシグアニン）を含むオリゴヌクレオチドの結合はｐＨに対する複雑な依存性を有する。典型的には、相対的結合効率Ｄにおいて２又は３個の区別できる最大が存在する。最高の相対的効率は、ｐＨ＝４．８〜６．２近辺の酸性ｐＨ値に局在化され、使用されるシステムに依存する。
【０１４８】
相対的結合効率は、修飾の性質、及び対応物（オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ又はＲＮＡ）の性質の両方に依存する。現在見出された最高の相対的結合効率は、未修飾オリゴヌクレオチドの結合効率と比較して、１．５〜３の間である。
【実施例６】
【０１４９】
様々なアニーリング温度のＰＣＲプライマーとしての修飾オリゴヌクレオチド
シロイヌナズナＲＬＩ２ ＤＮＡ配列の長さが３８３ｂｐである断片は、アニーリング温度４７、４８．７、５１．３、５８．４、６１．７、６４．３、６６．１、６７．５ 及び６８℃でＰＣＲ反応により増幅された。この断片は、未修飾オリゴヌクレオチドＦ（５’−ＴＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＡＡＣＴＡＣＴＴＣ（配列番号１）、ＡｔＲＬＩ２コーディング配列のｎｔ１６３８〜１６５８に対応する）及びＲ（５’−ＴＴＣＡＴＣＡＡＡＣＡＴＧＴＡＡＡＴＣＴＣ（配列番号６）、逆の相補的配向であるＡｔＲＬＩ２コーディング配列のｎｔ２００１〜２０２１に対応する）を用いて増幅され、同時にｆ＊（５’−ＴＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＡＡＣＴＡＣＴＴＣ（配列番号５）、修飾塩基に下線を付す）及びｒ＊（５’−ＴＴＣＡＴＣＡＡＡＣＡＴＧＴＡＡＡＴＣＴＣ（配列番号７）、修飾塩基に下線を付す）を用いて増幅された。ＰＣＲ混合物は２０ｐｍｏｌの各プライマーを含み、最終のＭｇ２＋濃度２．５ｍＭ、２５ｎｇの同じ長さ３８３ｂｐの断片を鋳型として使用した。ＰＣＲプログラムは、初期変性ステップ（９５℃で２分）と、それに続く３０サイクルの変性（９５℃で４０秒）、アニーリング（４７〜６８℃で４０秒）、及び重合（７２℃で４０秒）からなっていた。ＰＣＲの最終ステップは７２℃で１０分であった。生成物は、ＴＡＥ緩衝液中の１．７％アガロースゲルにおける電気泳動によって分離され、臭化エチジウム染色及びＵＶ光によって可視化された。
【０１５０】
図１０に与えられた結果は、ＰＣＲにおける修飾塩基を有するオリゴヌクレオチドの適用性及び効率を示す。
【実施例７】
【０１５１】
トランスフェクトされた細胞におけるｓｉＲＮＡとしての修飾オリゴヌクレオチド
ｅＧＦＰトランス遺伝子発現に対する修飾ｓｉＲＮＡの効果を以下のように測定した。ＨｅＬａ−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）安定トランスジェニック株は、５％血清及び４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭで増殖させた。ＧＦＰ ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションは、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭの代わりにＤＭＥＭを用いて、２４ウェルプレート（７５，０００細胞／ウェル）においてリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プロトコールに記載されるように行われた。トランスフェクションの３日後、細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、蛍光レベル（５３５ｎｍで発光）をＧＥＮｉｏｓ Ｐｒｏ ＴＥＣＡＮによって解析した。ｅＧＦＰ発光は、ＨｅＬａ−ＧＦＰ模擬トランスフェクトされた株（陰性対照のｓｉＲＮＡ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ｑｉａｇｅｎを有する）の蛍光レベルのパーセンテージとして示される（図１１）。ＧＦＰ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた非トランスジェニックＨｅＬａ細胞を陰性対照として使用した。パーセンテージ及びＳＤは、４つの並行したトランスフェクションから計算される。下線を付したヌクレオチドを修飾した。
【０１５２】
【表２】
【実施例８】
【０１５３】
ハイブリッド形成動態に対する修飾の効果
修飾と未修飾オリゴヌクレオチドの間のハイブリッド形成動態における可能性のある相違を以下のように試験した。０．５、１、２．５、５及び１０ｎｇの標的ＤＮＡ（２×ＳＳＣ中）をナイロンメンブレン上にドットブロットし、一晩４５℃、６×ＳＳＣ、２×デンハーツ溶液、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ５．０中で、すべてが同一である５つの３２Ｐ５’標識したオリゴヌクレオチドと順番にハイブリダイズした。プローブは、ｆ、ｆ１、ｆ２、ｆ３及びｆ＊であった（表１参照）。プローブの添加後、時間点を１０分から６０分まで１０分間隔でとった。メンブレンは、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、ｐＨ５．０を用いて１０分間室温で２回洗浄された。放射性シグナルはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌ ＦＸ（ＢｉｏＲａｄ）で検出された。擬一次ハイブリッド形成速度定数は、ｌｎＶ−ｔ法を用いて計算された。結果（平滑化した相対速度定数）を表２に与える。すべての修飾オリゴヌクレオチドは、特により小さな基質量で、未修飾オリゴヌクレオチドよりも高いハイブリッド形成速度を有する。
【０１５４】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
既知の配列の標的核酸を、前記標的核酸の鎖と少なくとも部分的に相補的である１配列の核酸塩基を有する修飾オリゴヌクレオチドとを、標的核酸の鎖との修飾オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を可能にする条件下で接触させることを含み、
ハイブリッド形成修飾オリゴヌクレオチドが標的核酸の発現を阻害し、
修飾オリゴヌクレオチドが５〜１５０個の核酸塩基を含み、
修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基の少なくとも１つが５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシトシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニン及び８−ヒドロキシグアニンらなる群から選択される、
標的核酸の発現を阻害する方法。
【請求項２】
発現が少なくとも２０％阻害される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
修飾オリゴヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＲＮＡが１本鎖である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＲＮＡが２本鎖であり、ＲＮＡの少なくとも１本の鎖が少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
標的核酸が細胞内に存在し、接触させることが修飾オリゴヌクレオチドの細胞内への導入を含む、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
接触させることが、修飾オリゴヌクレオチドによる細胞の形質転換及びトランスフェクションからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
標的核酸が生物の細胞内に存在し、接触させることが、修飾オリゴヌクレオチド及び製薬上許容される担体を含む組成物を生物に投与することを含む、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
生物が哺乳動物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
生物がヒトである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
標的核酸を、前記標的核酸の鎖との修飾オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を可能にする条件下で、修飾オリゴヌクレオチドと接触させること、及び、
標的核酸の鎖とハイブリッド形成した修飾オリゴヌクレオチドを検出することによって標的核酸を検出することを含み、
修飾オリゴヌクレオチドが標的核酸の鎖の配列と少なくとも部分的に相補的である１配列の核酸塩基を含んでおり、
修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基の少なくとも１つが５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシトシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニン及び８−ヒドロキシグアニンらなる群から選択される、
標的核酸を修飾オリゴヌクレオチドにより検出する方法。
【請求項１２】
標的核酸が固体担体に固定化されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
固定化標的核酸がＤＮＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
固定化標的核酸がＲＮＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
検出が定量的である、請求項１１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＣＲアニーリング条件下における鋳型核酸との修飾オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を可能にするのに十分に、鋳型核酸の一部と相補的である配列を含む修飾オリゴヌクレオチドと鋳型核酸を接触させることを含み、
ハイブリッド形成修飾オリゴヌクレオチドが、第１の鎖のＰＣＲ生成物を生成させるＰＣＲ増幅条件下でＰＣＲプライマーとしての役割を果たし、
修飾オリゴヌクレオチドが５〜１５０個の核酸塩基を含み、核酸塩基の少なくとも１つが５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシトシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニン及び８−ヒドロキシグアニンらなる群から選択される修飾核酸塩基である、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法。
【請求項１７】
ＰＣＲが
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型核酸、修飾オリゴヌクレオチド及びヌクレオチドを含有する反応混合物を調製することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＣＲ反応混合物が、標的核酸の鎖の一部又は第１の鎖のＰＣＲ生成物の一部の１つと相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
第２のオリゴヌクレオチドが修飾オリゴヌクレオチドであり、修飾オリゴヌクレオチドが５〜１５０個の核酸塩基を含み、核酸塩基の少なくとも１つが５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシトシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニン及び８−ヒドロキシグアニンらなる群から選択される修飾核酸塩基である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
鋳型核酸がＤＮＡである、請求項１６乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
鋳型核酸がＲＮＡである、請求項１６乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
増幅生成物を実時間で定量する、請求項１６乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ポリメラーゼ連鎖反応が、鋳型核酸を変性するステップ、修飾オリゴヌクレオチドと鋳型核酸とをアニーリング条件下でアニーリングするステップ、及び、アニーリングした修飾オリゴヌクレオチドを伸長させることにより、ポリメラーゼ連鎖反応生成物を合成するステップの繰り返しを含む、請求項１６乃至２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
修飾オリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む、請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ハイブリッド形成条件が４〜１０のｐＨを含む、請求項１乃至２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ｐＨが４〜６である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
修飾オリゴヌクレオチドが１０〜１００核酸塩基の長さを有する、請求項１乃至２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
修飾オリゴヌクレオチドが１０〜５０核酸塩基の長さを有する、請求項１乃至２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
修飾オリゴヌクレオチドが２０〜３０核酸塩基の長さを有する、請求項１乃至２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基の０．５％〜４０％がメルカプト核酸塩基又はヒドロキシ核酸塩基を含む、請求項１乃至２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
標的核酸の少なくとも一部と相補的であるオリゴヌクレオチド・プライマーを標的核酸にアニーリングすることを含む、標的核酸の増幅の方法において、オリゴヌクレオチド・プライマーとして修飾オリゴヌクレオチドを用い、修飾オリゴヌクレオチドが５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシトシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニン及び８−ヒドロキシグアニンらなる群から選択される１つ又は複数の修飾核酸塩基を含むことを含む改良。
【請求項３２】
増幅の方法が指数関数的増幅方法である、請求項３１に記載の改良。
【請求項３３】
増幅の方法がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項３１に記載の改良。
【請求項１】
既知の配列の標的核酸を、前記標的核酸の鎖と少なくとも部分的に相補的である１配列の核酸塩基を有する修飾オリゴヌクレオチドとを、標的核酸の鎖との修飾オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を可能にする条件下で接触させることを含み、
ハイブリッド形成修飾オリゴヌクレオチドが標的核酸の発現を阻害し、
修飾オリゴヌクレオチドが５〜１５０個の核酸塩基を含み、
修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基の少なくとも１つが５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシトシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニン及び８−ヒドロキシグアニンらなる群から選択される、
標的核酸の発現を阻害する方法。
【請求項２】
発現が少なくとも２０％阻害される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
修飾オリゴヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＲＮＡが１本鎖である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＲＮＡが２本鎖であり、ＲＮＡの少なくとも１本の鎖が少なくとも１つの修飾核酸塩基を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
標的核酸が細胞内に存在し、接触させることが修飾オリゴヌクレオチドの細胞内への導入を含む、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
接触させることが、修飾オリゴヌクレオチドによる細胞の形質転換及びトランスフェクションからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
標的核酸が生物の細胞内に存在し、接触させることが、修飾オリゴヌクレオチド及び製薬上許容される担体を含む組成物を生物に投与することを含む、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
生物が哺乳動物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
生物がヒトである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
標的核酸を、前記標的核酸の鎖との修飾オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を可能にする条件下で、修飾オリゴヌクレオチドと接触させること、及び、
標的核酸の鎖とハイブリッド形成した修飾オリゴヌクレオチドを検出することによって標的核酸を検出することを含み、
修飾オリゴヌクレオチドが標的核酸の鎖の配列と少なくとも部分的に相補的である１配列の核酸塩基を含んでおり、
修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基の少なくとも１つが５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシトシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニン及び８−ヒドロキシグアニンらなる群から選択される、
標的核酸を修飾オリゴヌクレオチドにより検出する方法。
【請求項１２】
標的核酸が固体担体に固定化されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
固定化標的核酸がＤＮＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
固定化標的核酸がＲＮＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
検出が定量的である、請求項１１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＣＲアニーリング条件下における鋳型核酸との修飾オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を可能にするのに十分に、鋳型核酸の一部と相補的である配列を含む修飾オリゴヌクレオチドと鋳型核酸を接触させることを含み、
ハイブリッド形成修飾オリゴヌクレオチドが、第１の鎖のＰＣＲ生成物を生成させるＰＣＲ増幅条件下でＰＣＲプライマーとしての役割を果たし、
修飾オリゴヌクレオチドが５〜１５０個の核酸塩基を含み、核酸塩基の少なくとも１つが５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシトシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニン及び８−ヒドロキシグアニンらなる群から選択される修飾核酸塩基である、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法。
【請求項１７】
ＰＣＲが
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型核酸、修飾オリゴヌクレオチド及びヌクレオチドを含有する反応混合物を調製することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＣＲ反応混合物が、標的核酸の鎖の一部又は第１の鎖のＰＣＲ生成物の一部の１つと相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
第２のオリゴヌクレオチドが修飾オリゴヌクレオチドであり、修飾オリゴヌクレオチドが５〜１５０個の核酸塩基を含み、核酸塩基の少なくとも１つが５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシトシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニン及び８−ヒドロキシグアニンらなる群から選択される修飾核酸塩基である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
鋳型核酸がＤＮＡである、請求項１６乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
鋳型核酸がＲＮＡである、請求項１６乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
増幅生成物を実時間で定量する、請求項１６乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ポリメラーゼ連鎖反応が、鋳型核酸を変性するステップ、修飾オリゴヌクレオチドと鋳型核酸とをアニーリング条件下でアニーリングするステップ、及び、アニーリングした修飾オリゴヌクレオチドを伸長させることにより、ポリメラーゼ連鎖反応生成物を合成するステップの繰り返しを含む、請求項１６乃至２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
修飾オリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む、請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ハイブリッド形成条件が４〜１０のｐＨを含む、請求項１乃至２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ｐＨが４〜６である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
修飾オリゴヌクレオチドが１０〜１００核酸塩基の長さを有する、請求項１乃至２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
修飾オリゴヌクレオチドが１０〜５０核酸塩基の長さを有する、請求項１乃至２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
修飾オリゴヌクレオチドが２０〜３０核酸塩基の長さを有する、請求項１乃至２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基の０．５％〜４０％がメルカプト核酸塩基又はヒドロキシ核酸塩基を含む、請求項１乃至２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
標的核酸の少なくとも一部と相補的であるオリゴヌクレオチド・プライマーを標的核酸にアニーリングすることを含む、標的核酸の増幅の方法において、オリゴヌクレオチド・プライマーとして修飾オリゴヌクレオチドを用い、修飾オリゴヌクレオチドが５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシトシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニン及び８−ヒドロキシグアニンらなる群から選択される１つ又は複数の修飾核酸塩基を含むことを含む改良。
【請求項３２】
増幅の方法が指数関数的増幅方法である、請求項３１に記載の改良。
【請求項３３】
増幅の方法がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項３１に記載の改良。
【図５】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【公表番号】特表２０１１−５０２５０２（Ｐ２０１１−５０２５０２Ａ）
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３２６３０（Ｐ２０１０−５３２６３０）
【出願日】平成２０年１１月５日（２００８．１１．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００８／０５０６３５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６０１２４
【国際公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【出願人】（５０８３２８５８９）バルティック テクロノジー デヴェロプメント，リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月５日（２００８．１１．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００８／０５０６３５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６０１２４
【国際公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【出願人】（５０８３２８５８９）バルティック テクロノジー デヴェロプメント，リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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