核酸を修飾するためのトランスポゾン末端組成物及び方法
本発明は、トランスポザーゼ及びトランスポゾン末端を用いて二本鎖標的ＤＮＡをインビトロで広範に断片化及び５’タグ化し、次いで、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ増幅反応を行わずに５’及び３’がタグ化された一本鎖ＤＮＡ断片を作製する、方法、組成物、及びキットであって、５’末端の第１のタグが転移トランスポゾン末端の配列及び必要に応じて更なる任意配列を示し、３’末端の第２のタグが第１のタグが示す配列とは異なる配列を示す、方法、組成物、及びキットを提供する。方法は、環境試料中のＤＮＡのメタゲノム分析、ＤＮＡのコピー数変化（ＣＮＶ）分析、及び大規模並列ＤＮＡシークエンシング（いわゆる「次世代シークエンシング）等の比較ゲノムシークエンシング（ＣＧＳ）のプロセスを初めとする種々のプロセスで使用するための５’及び３’タグ化ＤＮＡ断片の作製に有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡのタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する方法であって、
ｉ）前記標的ＤＮＡを、トランスポザーゼ及びトランスポゾン末端又は５’部分にタグドメインを有する転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物と、前記トランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程であって、
ａ）前記標的ＤＮＡが断片化されて複数の標的ＤＮＡ断片が生成され、
ｂ）前記トランスポゾン末端又は前記トランスポゾン末端組成物の転移鎖が前記複数の標的ＤＮＡ断片のそれぞれの５’末端に連結されて、
複数の５’タグ化標的ＤＮＡ断片が生成される、工程；及び
ｉｉ）前記複数の５’タグ化標的ＤＮＡ断片を、少なくとも１つの核酸修飾酵素と、３’タグが前記５’タグ化標的ＤＮＡ断片の３’末端に連結されてジタグ化標的ＤＮＡ断片を含むが生成される条件下でインキュベートする工程と
を含む、方法。
【請求項２】
標的ＤＮＡの断片をタグ化する方法であって、
ｉ）標的ＤＮＡを、トランスポザーゼ及びトランスポゾン末端又は５’部分にタグドメインを含む転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物と、前記トランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程であって、
ａ）前記標的ＤＮＡが断片化され；
ｂ）前記トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物の前記転移鎖が前記標的ＤＮＡの断片の５’末端に連結されて、
５’タグ化標的ＤＮＡ断片が生成される工程；及び
ｉｉ）前記５’タグ化標的ＤＮＡ断片を、核酸修飾酵素と、前記５’タグ化標的ＤＮＡの３’末端に３’タグが連結されてジタグ化標的ＤＮＡ断片が生成される条件下でインキュベートする工程と
を含む、方法。
【請求項３】
前記核酸修飾酵素がＤＮＡポリメラーゼであり、前記３’タグが前記５’タグ化標的ＤＮＡ断片の前記３’末端の伸張により形成され、前記ＤＮＡポリメラーゼが鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ及び鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性及び／又は５’ヌクレアーゼ活性を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸修飾酵素がリガーゼであり、前記３’タグが前記５’タグ化標的ＤＮＡ断片の前記３’末端へのオリゴヌクレオチドのライゲーションにより形成され、前記リガーゼが鋳型依存性リガーゼ及び鋳型非依存性リガーゼからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記転移末端が、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの１又は複数を含むタグドメインを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記タグドメインが、ロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグ、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグドメインである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
１又は複数の前記５’タグ化標的ＤＮＡ断片及び／又は前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の増幅を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記増幅が、ＰＣＲ増幅反応、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、リガーゼ連鎖反応、転写仲介増幅反応、又はループ仲介増幅反応の１又は複数の使用を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅が、前記ＤＮＡ断片ライブラリーを含む前記５’タグ化標的ＤＮＡ断片又は前記ＤＮＡ断片ライブラリーを含む前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の非選択的増幅を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記トランスポゾン末端組成物が、核酸配列の少なくとも１つのヌクレオチドが異なる複数の転移鎖を含み、前記増幅が、前記５’末端のタグ又はタグドメインの核酸配列に基づく前記ジタグ化ＤＮＡ断片の選択的増幅を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記選択的増幅が、少なくとも１つのヌクレオチドが異なる複数の５’末端タグ又はタグドメインを含む前記ジタグ化ＤＮＡ断片の選択的増幅を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅が、前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の前記３’タグに相補的な１種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記増幅が、１種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる鎖置換増幅反応を含み、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、リボヌクレオチドのみからなるか、プリンリボヌクレオチドのみからなるか、ピリミジン２’−Ｆ−２’−デオキシリボヌクレオチドのみからなり、前記鎖置換増幅反応が鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及びリボヌクレアーゼＨを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記増幅が、３’末端部分をそれぞれが含む第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を含み、前記第１のＰＣＲプライマーの少なくとも前記３’末端部分が前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の前記３’タグに相補的であり、前記第２のＰＣＲプライマーの少なくとも前記３’末端部分が前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の前記５’タグ又はタグドメインの少なくとも一部の配列を示す、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１又は第２のオリゴヌクレオチドプライマーが５’末端部分を含み、前記第１のプライマーの少なくとも前記５’末端部分が前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の前記３’タグに相補的でないか、前記第２のプライマーの前記５’部分が前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の前記５’タグ又はタグドメインの少なくとも一部の配列を示さない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーがそれぞれ５’末端部分を含み、前記第１のＰＣＲプライマーの少なくとも前記５’末端部分が前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の前記３’タグに相補的でなく且つ／又は前記第２のＰＣＲプライマーの前記５’末端部分が前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の前記５’タグドメインの少なくとも一部の配列を示さない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
標的ＤＮＡからタグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片の集合を作製する方法であって、
ｉ）標的ＤＮＡと、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端又は５’部分にタグドメインを有し３’部分にトランスポゾン末端を有する転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物とを、前記トランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程であって、
ａ）前記標的ＤＮＡが断片化されて複数の標的ＤＮＡ断片が生成され、
ｂ）前記トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物の前記転移鎖が前記複数の前記標的ＤＮＡ断片のそれぞれの５’末端に連結されて
５’タグ化標的ＤＮＡ断片の集合が生成される、工程と；
ｉｉ）前記５’タグ化標的ＤＮＡ断片を変性させて一本鎖５’タグ化標的ＤＮＡ断片を生成する工程と；
ｉｉｉ）前記一本鎖５’タグ化標的ＤＮＡ断片と核酸リガーゼを、前記一本鎖５’タグ化標的ＤＮＡ断片が分子内ライゲーションしてそれぞれが前記転移鎖の配列及び前記標的ＤＮＡの一部の配列を示すタグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片を形成する条件下でインキュベートする工程と
を含む、方法。
【請求項１９】
前記タグドメインが切断部位の配列を示し、方法が更に、前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片を、切断酵素組成物を含む少なくとも１つの酵素とインキュベートする工程を含み、前記切断酵素組成物により前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片が切断されてジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片が生成される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記タグドメインが制限部位の配列を示し、方法が更に、
ｉｖ）前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片に、前記タグドメインに相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングさせる工程；
ｖ）前記制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼと前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片をインキュベートする工程であって、
前記制限エンドヌクレアーゼにより前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片が切断されてジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片が生成される工程
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片及び／又は前記ジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片の１又は複数の増幅を更に含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記増幅が、３’末端をそれぞれが含む第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を含み、前記第１のＰＣＲプライマーの少なくとも前記３’末端部分が前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片又は前記ジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片中の前記転移鎖の前記配列の少なくとも一部に相補的であり、前記第２のＰＣＲプライマーの少なくとも前記３’末端部分が前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片又は前記ジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片中の前記転移鎖の相補体の少なくとも一部に相補的である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーのそれぞれが５’末端部分を含み、前記第１のＰＣＲプライマーの前記５’末端部分が前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片中又は前記ジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片中の前記転移鎖の前記配列に相補的でなく、前記第２のＰＣＲプライマーの５’末端部分が前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片中又は前記ジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片中の前記転移鎖の相補体に相補的でない、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
標的ＤＮＡからタグ化環状ＤＮＡ断片の集合を作製する方法であって、
ｉ）標的ＤＮＡと、トランスポザーゼと、５’末端に非転移鎖配列を示し且つ３’末端に転移鎖配列を示し且つタグドメインを含む介在ループ配列を示すオリゴヌクレオチドを含むヘアピントランスポゾン末端組成物とを、前記オリゴヌクレオチドが分子内ステムループを形成でき且つ前記トランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程であって、
ａ）前記標的ＤＮＡが断片化されて複数の標的ＤＮＡ断片が生成され、
ｂ）前記ヘアピントランスポゾン末端組成物の前記オリゴヌクレオチドが前記複数の標的ＤＮＡ断片のそれぞれの５’末端に連結され、
５’タグ化標的ＤＮＡ断片の集合が生成される工程と、
ｉｉ）前記５’タグ化標的ＤＮＡ断片の集合と、鋳型依存性リガーゼと、
ａ）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性、及び鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ；又は
ｂ）前記トランスポザーゼ及び前記ヘアピントランスポゾン末端組成物を用いた転位反応後に生じる前記５’タグ化ＤＮＡ断片中の一本鎖ギャップと同じ長さを単独又は組合せで有する１又は複数のサイズのランダム配列オリゴヌクレオチドとを、
前記５’タグ化標的ＤＮＡ断片中の一本鎖ギャップが埋められ且つ各前記５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端が前記標的ＤＮＡの相補的部分を含む別の前記５’タグ化ＤＮＡ断片の５’末端に連結される条件下で
インキュベートする工程であって、ループ構造中に前記タグドメインを含み且つ前記標的ＤＮＡの一部の両方の鎖を含むタグ化環状ＤＮＡ断片が形成される工程と
を含む方法。
【請求項２５】
前記ステップｉｉ）の連結が、
Ｉ）ステップｉ）で得られた前記５’タグ化ＤＮＡ断片と前記ＤＮＡポリメラーゼを各前記５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端が伸張されて５’タグ化ＤＮＡ断片伸張産物の集合が形成される条件下でインキュベートする工程；及び
ＩＩ）前記５’タグ化ＤＮＡ断片伸張産物と前記鋳型依存性リガーゼを前記５’タグ化ＤＮＡ断片伸張産物がライゲーションされる条件下でインキュベートすることで前記タグ化環状ＤＮＡ断片を作製する工程
を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＤＮＡポリメラーゼ及び前記リガーゼが混合物中に提供され、前記ステップＩ）及びＩＩ）が単一の反応混合物中で行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ステップｉｉ）の連結が、前記ステップｉ）で得られた前記５’タグ化ＤＮＡ断片と、前記１又は複数のサイズのランダム配列オリゴヌクレオチド及び前記鋳型依存性リガーゼとを、前記ランダム配列オリゴヌクレオチドがアニーリングして一本鎖ギャップを埋め、互いに又は隣接する前記５’タグ化ＤＮＡ断片の末端にライゲーションされる条件下でインキュベートすることでタグ化環状ＤＮＡ断片を形成する工程を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
直鎖ＤＮＡ、ライゲーションされていないランダム配列オリゴヌクレオチド、及び／又は標的ＤＮＡに連結されていないヘアピントランスポゾン末端組成物からの前記タグ化環状ＤＮＡ断片の分離を更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記タグ化環状ＤＮＡ断片を含む前記反応混合物をＴ５エキソヌクレアーゼで処理して直鎖ＤＮＡを除去する工程を更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記タグ化環状ＤＮＡ断片を前記ループ構造のそれぞれで切断し、それぞれの鎖が５’末端に前記タグの一部を有し且つ３’末端に前記タグの一部を有する扇形二本鎖ＤＮＡ断片を作製する工程を更に含む、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ループ構造中の前記タグ配列が制限部位を含み、
ｉｖ）前記タグ化環状ＤＮＡ断片に、前記タグ配列中の前記制限部位に相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングさせる工程；
ｖ）前記タグ化環状ＤＮＡ断片を、前記制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼとインキュベートする工程；
を更に含み、
前記制限エンドヌクレアーゼにより前記タグ化環状ＤＮＡ断片が切断されて前記扇形二本鎖ＤＮＡ断片が生成される
請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ループ構造中の前記タグドメインが、切断酵素組成物を用いて切断可能な１又は複数の部位を含み、前記タグ化環状ＤＮＡ断片と前記切断酵素組成物を、前記タグ化環状ＤＮＡ断片が前記切断可能な部位で切断されて前記扇形二本鎖ＤＮＡ断片が生成される条件下でインキュベートする工程を更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記切断酵素組成物がＮ−グリコシラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼを含む、請求項１９又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｎ−グリコシラーゼが、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ、及びＦＰＧタンパク質から選択され、前記ＡＰエンドヌクレアーゼが大腸菌エンドヌクレアーゼＩＩＩ又はエンドヌクレアーゼＩＶから選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記扇形二本鎖ＤＮＡ断片を変性させてジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片を作製することを更に含む、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ＤＮＡシークエンシング法又は増幅反応の鋳型として前記ＤＮＡ断片を使用することを更に含む、請求項２４〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記タグ化環状ＤＮＡ断片、前記扇形二本鎖ＤＮＡ断片、及び／又は前記ジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片の増幅を更に含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記増幅が、ＰＣＲ増幅反応、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、リガーゼ連鎖反応、転写仲介増幅反応、又はループ仲介増幅反応の１又は複数の使用を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記増幅が、３’末端部分をそれぞれが含む第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を含み、前記第１のＰＣＲプライマーの少なくとも前記３’末端部分が前記タグドメインの少なくとも一部に相補的であり、前記第２のＰＣＲプライマーの少なくとも前記３’末端部分が前記タグドメインの少なくとも一部の配列を示す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーのそれぞれが５’末端部分を含み、前記第１のＰＣＲプライマーの前記５’末端部分が前記タグ配列に相補的でなく、前記第２のＰＣＲプライマーの前記５’末端部分が前記タグドメインの配列を示さない、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１及び／又は前記第２のＰＣＲプライマーの前記５’末端部分がタグドメインを示す、請求項１６、１７、２３、又は４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記タグドメインが、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの１又は複数を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記タグドメインが、ロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグ、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグドメインである、請求項２０に記載の方法。
【請求項４４】
標的ＤＮＡをタグ化及び断片化する方法であって、
ｉ）標的ＤＮＡと、トランスポザーゼと、５’部分にトランスポゾン末端ではないタグドメインの配列を示し且つ３’部分に転移トランスポゾン末端の配列を示す転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物とをインキュベートする工程であって、
ａ）前記標的ＤＮＡが断片化され、
ｂ）前記トランスポゾン末端組成物の前記転移鎖が前記標的ＤＮＡの断片の５’末端に連結される
工程
を含み、５’タグ化標的ＤＮＡ断片が生成される、方法。
【請求項４５】
標的ＤＮＡの５’タグ化断片のライブラリーを作製する方法であって、
ｉ）標的ＤＮＡと、トランスポザーゼと、特定の目的のための１又は複数のタグドメインの配列を５’部分に示し且つ転移トランスポゾン末端の配列を３’部分に示す転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物とを、前記トランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程であって、
ａ）前記標的ＤＮＡが断片化され、
ｂ）前記トランスポゾン末端組成物の前記転移鎖が前記標的ＤＮＡの断片の５’末端に連結されて５’タグ化標的ＤＮＡ断片が生成される
工程を
含み、前記転位反応により、前記標的ＤＮＡに由来するＤＮＡ断片ライブラリーを含む複数の５’タグ化標的ＤＮＡ断片が生成される、方法。
【請求項４６】
タグドメインを含む５’部分及びトランスポゾン末端の転移鎖を含む３’部分を有する合成核酸分子を含む組成物。
【請求項４７】
複数の合成核酸分子を含む組成物であって、前記核酸分子が、少なくとも１つのヌクレオチドが異なるタグドメインを含む５’部分及びトランスポゾン末端の転移鎖を含む３’部分を含む、組成物。
【請求項４８】
少なくとも前記３’部分が二本鎖ＤＮＡである、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４９】
前記トランスポゾン末端がＴｎ５トランスポゾン末端である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５０】
前記トランスポゾン末端がＭｕトランスポゾン末端である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５１】
前記タグドメインが、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの１又は複数を含む、請求項４６又は４７に記載の組成物。
【請求項５２】
前記タグドメインが、ロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグ、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグを含む、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５３】
精製されたトランスポザーゼを含む、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５４】
前記トランスポザーゼがＴｎ５トランスポザーゼ及びＭｕトランスポザーゼから選択される、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５５】
前記核酸分子及び前記トランスポザーゼが混合物中に提供される、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５６】
非イオン性界面活性剤を更に含む、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
前記非イオン性界面活性剤がＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０及び／又はＴｗｅｅｎ−２０を含む、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５８】
請求項４６〜６１のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。
【請求項５９】
ＤＮＡリガーゼを更に含む、請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
ＤＮＡポリメラーゼを更に含む、請求項５８に記載のキット。
【請求項６１】
増幅反応のための試薬を更に含む、請求項５８に記載のキット。
【請求項６２】
前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
前記増幅反応のための前記試薬が少なくとも１つのプライマーを含む、請求項６２に記載のキット。
【請求項６４】
前記少なくとも１つのプライマーが、前記核酸分子の前記５’部分の前記タグドメインの相補体に相補的な３’部分を含むプライマーを含む、請求項６３に記載のキット。
【請求項６５】
前記タグドメインが、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの１又は複数を含む、請求項５８に記載のキット。
【請求項６６】
前記タグドメインが、ロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグ、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグドメインを含む、請求項６９に記載のキット。
【請求項６７】
ＤＮＡシークエンシング反応のための試薬を更に含む、請求項６５に記載のキット。
【請求項６８】
二本鎖標的ＤＮＡ及び請求項４６〜５７のいずれか一項に記載の組成物を含む反応混合物。
【請求項６９】
精製されたトランスポザーゼ及び複数の合成トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物を含む組成物。
【請求項７０】
前記トランスポゾン末端組成物がヘアピントランスポゾン末端を含む、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７１】
前記合成トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物が転移鎖及び非転移鎖を含む、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記転移鎖が５’タグドメインを含む、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７３】
前記タグドメインが、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの１又は複数を含む、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
前記タグドメインが、ロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグ、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグを含む、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
前記複数の合成トランスポゾン末端が、少なくとも１つのヌクレオチドが互いに異なる少なくとも２つの転移鎖を含む、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７６】
前記転移鎖が５’部分及び３’部分を含み、前記転移鎖の前記５’部分の少なくとも２つが、少なくとも１つのヌクレオチドが互いに異なるタグを含み、前記転移鎖の前記３’部分が同じトランスポゾン末端配列を含む、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７７】
前記トランスポゾン末端がＭｕトランスポゾン末端を含み、前記トランスポザーゼがＭｕトランスポザーゼである、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７８】
前記転移鎖の前記３’部分がＭｕトランスポゾン末端由来の配列を含み、前記転移鎖の前記５’部分がＭｕトランスポゾンに由来しない、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７９】
前記トランスポゾン末端がＴｎ５トランスポゾン末端を含み、前記トランスポザーゼがＴｎ５トランスポザーゼである、請求項６９に記載の組成物。
【請求項８０】
前記転移鎖の前記３’部分がＴｎ５トランスポゾン末端由来の配列を含み、前記転移鎖の前記５’部分がＴｎ５トランスポゾンに由来しない、請求項７５に記載の組成物。
【請求項８１】
ＤＮＡ断片ライブラリーを含む組成物であって、前記ＤＮＡ断片ライブラリーが、トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物の転移鎖に由来する配列を含む５’末端を有する前記標的ＤＮＡの断片を含む、組成物。
【請求項８２】
前記転移鎖に由来する前記配列が５’タグドメインを含む、請求項８１に記載の組成物。
【請求項８３】
前記ＤＮＡ断片ライブラリーが前記標的ＤＮＡの二本鎖断片を含む、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８４】
前記ＤＮＡ断片ライブラリーが、トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物の転移鎖に相補的な３’タグを含む標的ＤＮＡの断片を含む、請求項８１に記載の組成物。
【請求項８５】
標的ＤＮＡのタグ化環状ＤＮＡ断片を含む組成物であって、前記タグ化環状ＤＮＡ断片に含まれる部分が、前記部分の５’末端に非転移鎖配列と、前記部分の３’末端に転移鎖配列と、タグ配列を含む介在ループ配列と、標的ＤＮＡの一部の両方の鎖の配列とを含む、組成物。
【請求項８６】
標的ＤＮＡのタグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片を含む組成物であって、トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物に由来する転移鎖配列及び標的ＤＮＡの一本鎖部分を含む、組成物。
【請求項８７】
前記転移鎖配列がタグドメインを含む、請求項８６に記載の組成物。
【請求項８８】
標的ＤＮＡの扇形二本鎖ＤＮＡ断片を含む組成物であって、標的ＤＮＡの二本鎖部分を含み、各鎖が、転移鎖配列の少なくとも一部を含む５’末端及び非転移鎖配列の少なくとも一部を含む３’末端を有する、組成物。
【請求項１】
標的ＤＮＡのタグ化ＤＮＡ断片のライブラリーを作製する方法であって、
ｉ）前記標的ＤＮＡを、トランスポザーゼ及びトランスポゾン末端又は５’部分にタグドメインを有する転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物と、前記トランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程であって、
ａ）前記標的ＤＮＡが断片化されて複数の標的ＤＮＡ断片が生成され、
ｂ）前記トランスポゾン末端又は前記トランスポゾン末端組成物の転移鎖が前記複数の標的ＤＮＡ断片のそれぞれの５’末端に連結されて、
複数の５’タグ化標的ＤＮＡ断片が生成される、工程；及び
ｉｉ）前記複数の５’タグ化標的ＤＮＡ断片を、少なくとも１つの核酸修飾酵素と、３’タグが前記５’タグ化標的ＤＮＡ断片の３’末端に連結されてジタグ化標的ＤＮＡ断片を含むが生成される条件下でインキュベートする工程と
を含む、方法。
【請求項２】
標的ＤＮＡの断片をタグ化する方法であって、
ｉ）標的ＤＮＡを、トランスポザーゼ及びトランスポゾン末端又は５’部分にタグドメインを含む転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物と、前記トランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程であって、
ａ）前記標的ＤＮＡが断片化され；
ｂ）前記トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物の前記転移鎖が前記標的ＤＮＡの断片の５’末端に連結されて、
５’タグ化標的ＤＮＡ断片が生成される工程；及び
ｉｉ）前記５’タグ化標的ＤＮＡ断片を、核酸修飾酵素と、前記５’タグ化標的ＤＮＡの３’末端に３’タグが連結されてジタグ化標的ＤＮＡ断片が生成される条件下でインキュベートする工程と
を含む、方法。
【請求項３】
前記核酸修飾酵素がＤＮＡポリメラーゼであり、前記３’タグが前記５’タグ化標的ＤＮＡ断片の前記３’末端の伸張により形成され、前記ＤＮＡポリメラーゼが鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ及び鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性及び／又は５’ヌクレアーゼ活性を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸修飾酵素がリガーゼであり、前記３’タグが前記５’タグ化標的ＤＮＡ断片の前記３’末端へのオリゴヌクレオチドのライゲーションにより形成され、前記リガーゼが鋳型依存性リガーゼ及び鋳型非依存性リガーゼからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記転移末端が、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの１又は複数を含むタグドメインを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記タグドメインが、ロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグ、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグドメインである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
１又は複数の前記５’タグ化標的ＤＮＡ断片及び／又は前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の増幅を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記増幅が、ＰＣＲ増幅反応、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、リガーゼ連鎖反応、転写仲介増幅反応、又はループ仲介増幅反応の１又は複数の使用を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅が、前記ＤＮＡ断片ライブラリーを含む前記５’タグ化標的ＤＮＡ断片又は前記ＤＮＡ断片ライブラリーを含む前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の非選択的増幅を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記トランスポゾン末端組成物が、核酸配列の少なくとも１つのヌクレオチドが異なる複数の転移鎖を含み、前記増幅が、前記５’末端のタグ又はタグドメインの核酸配列に基づく前記ジタグ化ＤＮＡ断片の選択的増幅を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記選択的増幅が、少なくとも１つのヌクレオチドが異なる複数の５’末端タグ又はタグドメインを含む前記ジタグ化ＤＮＡ断片の選択的増幅を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅が、前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の前記３’タグに相補的な１種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記増幅が、１種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる鎖置換増幅反応を含み、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、リボヌクレオチドのみからなるか、プリンリボヌクレオチドのみからなるか、ピリミジン２’−Ｆ−２’−デオキシリボヌクレオチドのみからなり、前記鎖置換増幅反応が鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及びリボヌクレアーゼＨを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記増幅が、３’末端部分をそれぞれが含む第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を含み、前記第１のＰＣＲプライマーの少なくとも前記３’末端部分が前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の前記３’タグに相補的であり、前記第２のＰＣＲプライマーの少なくとも前記３’末端部分が前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の前記５’タグ又はタグドメインの少なくとも一部の配列を示す、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１又は第２のオリゴヌクレオチドプライマーが５’末端部分を含み、前記第１のプライマーの少なくとも前記５’末端部分が前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の前記３’タグに相補的でないか、前記第２のプライマーの前記５’部分が前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の前記５’タグ又はタグドメインの少なくとも一部の配列を示さない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーがそれぞれ５’末端部分を含み、前記第１のＰＣＲプライマーの少なくとも前記５’末端部分が前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の前記３’タグに相補的でなく且つ／又は前記第２のＰＣＲプライマーの前記５’末端部分が前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の前記５’タグドメインの少なくとも一部の配列を示さない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
標的ＤＮＡからタグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片の集合を作製する方法であって、
ｉ）標的ＤＮＡと、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端又は５’部分にタグドメインを有し３’部分にトランスポゾン末端を有する転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物とを、前記トランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程であって、
ａ）前記標的ＤＮＡが断片化されて複数の標的ＤＮＡ断片が生成され、
ｂ）前記トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物の前記転移鎖が前記複数の前記標的ＤＮＡ断片のそれぞれの５’末端に連結されて
５’タグ化標的ＤＮＡ断片の集合が生成される、工程と；
ｉｉ）前記５’タグ化標的ＤＮＡ断片を変性させて一本鎖５’タグ化標的ＤＮＡ断片を生成する工程と；
ｉｉｉ）前記一本鎖５’タグ化標的ＤＮＡ断片と核酸リガーゼを、前記一本鎖５’タグ化標的ＤＮＡ断片が分子内ライゲーションしてそれぞれが前記転移鎖の配列及び前記標的ＤＮＡの一部の配列を示すタグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片を形成する条件下でインキュベートする工程と
を含む、方法。
【請求項１９】
前記タグドメインが切断部位の配列を示し、方法が更に、前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片を、切断酵素組成物を含む少なくとも１つの酵素とインキュベートする工程を含み、前記切断酵素組成物により前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片が切断されてジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片が生成される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記タグドメインが制限部位の配列を示し、方法が更に、
ｉｖ）前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片に、前記タグドメインに相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングさせる工程；
ｖ）前記制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼと前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片をインキュベートする工程であって、
前記制限エンドヌクレアーゼにより前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片が切断されてジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片が生成される工程
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片及び／又は前記ジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片の１又は複数の増幅を更に含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記増幅が、３’末端をそれぞれが含む第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を含み、前記第１のＰＣＲプライマーの少なくとも前記３’末端部分が前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片又は前記ジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片中の前記転移鎖の前記配列の少なくとも一部に相補的であり、前記第２のＰＣＲプライマーの少なくとも前記３’末端部分が前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片又は前記ジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片中の前記転移鎖の相補体の少なくとも一部に相補的である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーのそれぞれが５’末端部分を含み、前記第１のＰＣＲプライマーの前記５’末端部分が前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片中又は前記ジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片中の前記転移鎖の前記配列に相補的でなく、前記第２のＰＣＲプライマーの５’末端部分が前記タグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片中又は前記ジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片中の前記転移鎖の相補体に相補的でない、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
標的ＤＮＡからタグ化環状ＤＮＡ断片の集合を作製する方法であって、
ｉ）標的ＤＮＡと、トランスポザーゼと、５’末端に非転移鎖配列を示し且つ３’末端に転移鎖配列を示し且つタグドメインを含む介在ループ配列を示すオリゴヌクレオチドを含むヘアピントランスポゾン末端組成物とを、前記オリゴヌクレオチドが分子内ステムループを形成でき且つ前記トランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程であって、
ａ）前記標的ＤＮＡが断片化されて複数の標的ＤＮＡ断片が生成され、
ｂ）前記ヘアピントランスポゾン末端組成物の前記オリゴヌクレオチドが前記複数の標的ＤＮＡ断片のそれぞれの５’末端に連結され、
５’タグ化標的ＤＮＡ断片の集合が生成される工程と、
ｉｉ）前記５’タグ化標的ＤＮＡ断片の集合と、鋳型依存性リガーゼと、
ａ）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性、及び鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ；又は
ｂ）前記トランスポザーゼ及び前記ヘアピントランスポゾン末端組成物を用いた転位反応後に生じる前記５’タグ化ＤＮＡ断片中の一本鎖ギャップと同じ長さを単独又は組合せで有する１又は複数のサイズのランダム配列オリゴヌクレオチドとを、
前記５’タグ化標的ＤＮＡ断片中の一本鎖ギャップが埋められ且つ各前記５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端が前記標的ＤＮＡの相補的部分を含む別の前記５’タグ化ＤＮＡ断片の５’末端に連結される条件下で
インキュベートする工程であって、ループ構造中に前記タグドメインを含み且つ前記標的ＤＮＡの一部の両方の鎖を含むタグ化環状ＤＮＡ断片が形成される工程と
を含む方法。
【請求項２５】
前記ステップｉｉ）の連結が、
Ｉ）ステップｉ）で得られた前記５’タグ化ＤＮＡ断片と前記ＤＮＡポリメラーゼを各前記５’タグ化ＤＮＡ断片の３’末端が伸張されて５’タグ化ＤＮＡ断片伸張産物の集合が形成される条件下でインキュベートする工程；及び
ＩＩ）前記５’タグ化ＤＮＡ断片伸張産物と前記鋳型依存性リガーゼを前記５’タグ化ＤＮＡ断片伸張産物がライゲーションされる条件下でインキュベートすることで前記タグ化環状ＤＮＡ断片を作製する工程
を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＤＮＡポリメラーゼ及び前記リガーゼが混合物中に提供され、前記ステップＩ）及びＩＩ）が単一の反応混合物中で行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ステップｉｉ）の連結が、前記ステップｉ）で得られた前記５’タグ化ＤＮＡ断片と、前記１又は複数のサイズのランダム配列オリゴヌクレオチド及び前記鋳型依存性リガーゼとを、前記ランダム配列オリゴヌクレオチドがアニーリングして一本鎖ギャップを埋め、互いに又は隣接する前記５’タグ化ＤＮＡ断片の末端にライゲーションされる条件下でインキュベートすることでタグ化環状ＤＮＡ断片を形成する工程を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
直鎖ＤＮＡ、ライゲーションされていないランダム配列オリゴヌクレオチド、及び／又は標的ＤＮＡに連結されていないヘアピントランスポゾン末端組成物からの前記タグ化環状ＤＮＡ断片の分離を更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記タグ化環状ＤＮＡ断片を含む前記反応混合物をＴ５エキソヌクレアーゼで処理して直鎖ＤＮＡを除去する工程を更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記タグ化環状ＤＮＡ断片を前記ループ構造のそれぞれで切断し、それぞれの鎖が５’末端に前記タグの一部を有し且つ３’末端に前記タグの一部を有する扇形二本鎖ＤＮＡ断片を作製する工程を更に含む、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ループ構造中の前記タグ配列が制限部位を含み、
ｉｖ）前記タグ化環状ＤＮＡ断片に、前記タグ配列中の前記制限部位に相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングさせる工程；
ｖ）前記タグ化環状ＤＮＡ断片を、前記制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼとインキュベートする工程；
を更に含み、
前記制限エンドヌクレアーゼにより前記タグ化環状ＤＮＡ断片が切断されて前記扇形二本鎖ＤＮＡ断片が生成される
請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ループ構造中の前記タグドメインが、切断酵素組成物を用いて切断可能な１又は複数の部位を含み、前記タグ化環状ＤＮＡ断片と前記切断酵素組成物を、前記タグ化環状ＤＮＡ断片が前記切断可能な部位で切断されて前記扇形二本鎖ＤＮＡ断片が生成される条件下でインキュベートする工程を更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記切断酵素組成物がＮ−グリコシラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼを含む、請求項１９又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｎ−グリコシラーゼが、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ、及びＦＰＧタンパク質から選択され、前記ＡＰエンドヌクレアーゼが大腸菌エンドヌクレアーゼＩＩＩ又はエンドヌクレアーゼＩＶから選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記扇形二本鎖ＤＮＡ断片を変性させてジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片を作製することを更に含む、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ＤＮＡシークエンシング法又は増幅反応の鋳型として前記ＤＮＡ断片を使用することを更に含む、請求項２４〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記タグ化環状ＤＮＡ断片、前記扇形二本鎖ＤＮＡ断片、及び／又は前記ジタグ化直鎖一本鎖ＤＮＡ断片の増幅を更に含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記増幅が、ＰＣＲ増幅反応、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、リガーゼ連鎖反応、転写仲介増幅反応、又はループ仲介増幅反応の１又は複数の使用を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記増幅が、３’末端部分をそれぞれが含む第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を含み、前記第１のＰＣＲプライマーの少なくとも前記３’末端部分が前記タグドメインの少なくとも一部に相補的であり、前記第２のＰＣＲプライマーの少なくとも前記３’末端部分が前記タグドメインの少なくとも一部の配列を示す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーのそれぞれが５’末端部分を含み、前記第１のＰＣＲプライマーの前記５’末端部分が前記タグ配列に相補的でなく、前記第２のＰＣＲプライマーの前記５’末端部分が前記タグドメインの配列を示さない、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１及び／又は前記第２のＰＣＲプライマーの前記５’末端部分がタグドメインを示す、請求項１６、１７、２３、又は４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記タグドメインが、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの１又は複数を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記タグドメインが、ロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグ、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグドメインである、請求項２０に記載の方法。
【請求項４４】
標的ＤＮＡをタグ化及び断片化する方法であって、
ｉ）標的ＤＮＡと、トランスポザーゼと、５’部分にトランスポゾン末端ではないタグドメインの配列を示し且つ３’部分に転移トランスポゾン末端の配列を示す転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物とをインキュベートする工程であって、
ａ）前記標的ＤＮＡが断片化され、
ｂ）前記トランスポゾン末端組成物の前記転移鎖が前記標的ＤＮＡの断片の５’末端に連結される
工程
を含み、５’タグ化標的ＤＮＡ断片が生成される、方法。
【請求項４５】
標的ＤＮＡの５’タグ化断片のライブラリーを作製する方法であって、
ｉ）標的ＤＮＡと、トランスポザーゼと、特定の目的のための１又は複数のタグドメインの配列を５’部分に示し且つ転移トランスポゾン末端の配列を３’部分に示す転移鎖を含むトランスポゾン末端組成物とを、前記トランスポザーゼにより転位反応が触媒される条件下でインキュベートする工程であって、
ａ）前記標的ＤＮＡが断片化され、
ｂ）前記トランスポゾン末端組成物の前記転移鎖が前記標的ＤＮＡの断片の５’末端に連結されて５’タグ化標的ＤＮＡ断片が生成される
工程を
含み、前記転位反応により、前記標的ＤＮＡに由来するＤＮＡ断片ライブラリーを含む複数の５’タグ化標的ＤＮＡ断片が生成される、方法。
【請求項４６】
タグドメインを含む５’部分及びトランスポゾン末端の転移鎖を含む３’部分を有する合成核酸分子を含む組成物。
【請求項４７】
複数の合成核酸分子を含む組成物であって、前記核酸分子が、少なくとも１つのヌクレオチドが異なるタグドメインを含む５’部分及びトランスポゾン末端の転移鎖を含む３’部分を含む、組成物。
【請求項４８】
少なくとも前記３’部分が二本鎖ＤＮＡである、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４９】
前記トランスポゾン末端がＴｎ５トランスポゾン末端である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５０】
前記トランスポゾン末端がＭｕトランスポゾン末端である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５１】
前記タグドメインが、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの１又は複数を含む、請求項４６又は４７に記載の組成物。
【請求項５２】
前記タグドメインが、ロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグ、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグを含む、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５３】
精製されたトランスポザーゼを含む、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５４】
前記トランスポザーゼがＴｎ５トランスポザーゼ及びＭｕトランスポザーゼから選択される、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５５】
前記核酸分子及び前記トランスポザーゼが混合物中に提供される、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５６】
非イオン性界面活性剤を更に含む、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
前記非イオン性界面活性剤がＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０及び／又はＴｗｅｅｎ−２０を含む、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５８】
請求項４６〜６１のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。
【請求項５９】
ＤＮＡリガーゼを更に含む、請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
ＤＮＡポリメラーゼを更に含む、請求項５８に記載のキット。
【請求項６１】
増幅反応のための試薬を更に含む、請求項５８に記載のキット。
【請求項６２】
前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
前記増幅反応のための前記試薬が少なくとも１つのプライマーを含む、請求項６２に記載のキット。
【請求項６４】
前記少なくとも１つのプライマーが、前記核酸分子の前記５’部分の前記タグドメインの相補体に相補的な３’部分を含むプライマーを含む、請求項６３に記載のキット。
【請求項６５】
前記タグドメインが、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの１又は複数を含む、請求項５８に記載のキット。
【請求項６６】
前記タグドメインが、ロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグ、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグドメインを含む、請求項６９に記載のキット。
【請求項６７】
ＤＮＡシークエンシング反応のための試薬を更に含む、請求項６５に記載のキット。
【請求項６８】
二本鎖標的ＤＮＡ及び請求項４６〜５７のいずれか一項に記載の組成物を含む反応混合物。
【請求項６９】
精製されたトランスポザーゼ及び複数の合成トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物を含む組成物。
【請求項７０】
前記トランスポゾン末端組成物がヘアピントランスポゾン末端を含む、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７１】
前記合成トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物が転移鎖及び非転移鎖を含む、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記転移鎖が５’タグドメインを含む、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７３】
前記タグドメインが、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、及び転写プロモータードメインの１又は複数を含む、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
前記タグドメインが、ロシュ社の４５４Ａ及び４５４Ｂシークエンシングタグ、イルミナ（商標）社のＳＯＬＥＸＡ（商標）シークエンシングタグ、アプライドバイオシステムズ社のＳＯＬＩＤ（商標）シークエンシングタグ、パシフィックバイオサイエンス社のＳＭＲＴ（商標）シークエンシングタグ、ポロネイター・ポロニー社のシークエンシングタグ、又はコンプリート・ゲノミクス社のシークエンシングタグから選択されるシークエンシングタグを含む又はからなるシークエンシングタグを含む、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
前記複数の合成トランスポゾン末端が、少なくとも１つのヌクレオチドが互いに異なる少なくとも２つの転移鎖を含む、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７６】
前記転移鎖が５’部分及び３’部分を含み、前記転移鎖の前記５’部分の少なくとも２つが、少なくとも１つのヌクレオチドが互いに異なるタグを含み、前記転移鎖の前記３’部分が同じトランスポゾン末端配列を含む、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７７】
前記トランスポゾン末端がＭｕトランスポゾン末端を含み、前記トランスポザーゼがＭｕトランスポザーゼである、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７８】
前記転移鎖の前記３’部分がＭｕトランスポゾン末端由来の配列を含み、前記転移鎖の前記５’部分がＭｕトランスポゾンに由来しない、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７９】
前記トランスポゾン末端がＴｎ５トランスポゾン末端を含み、前記トランスポザーゼがＴｎ５トランスポザーゼである、請求項６９に記載の組成物。
【請求項８０】
前記転移鎖の前記３’部分がＴｎ５トランスポゾン末端由来の配列を含み、前記転移鎖の前記５’部分がＴｎ５トランスポゾンに由来しない、請求項７５に記載の組成物。
【請求項８１】
ＤＮＡ断片ライブラリーを含む組成物であって、前記ＤＮＡ断片ライブラリーが、トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物の転移鎖に由来する配列を含む５’末端を有する前記標的ＤＮＡの断片を含む、組成物。
【請求項８２】
前記転移鎖に由来する前記配列が５’タグドメインを含む、請求項８１に記載の組成物。
【請求項８３】
前記ＤＮＡ断片ライブラリーが前記標的ＤＮＡの二本鎖断片を含む、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８４】
前記ＤＮＡ断片ライブラリーが、トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物の転移鎖に相補的な３’タグを含む標的ＤＮＡの断片を含む、請求項８１に記載の組成物。
【請求項８５】
標的ＤＮＡのタグ化環状ＤＮＡ断片を含む組成物であって、前記タグ化環状ＤＮＡ断片に含まれる部分が、前記部分の５’末端に非転移鎖配列と、前記部分の３’末端に転移鎖配列と、タグ配列を含む介在ループ配列と、標的ＤＮＡの一部の両方の鎖の配列とを含む、組成物。
【請求項８６】
標的ＤＮＡのタグ化環状一本鎖ＤＮＡ断片を含む組成物であって、トランスポゾン末端又はトランスポゾン末端組成物に由来する転移鎖配列及び標的ＤＮＡの一本鎖部分を含む、組成物。
【請求項８７】
前記転移鎖配列がタグドメインを含む、請求項８６に記載の組成物。
【請求項８８】
標的ＤＮＡの扇形二本鎖ＤＮＡ断片を含む組成物であって、標的ＤＮＡの二本鎖部分を含み、各鎖が、転移鎖配列の少なくとも一部を含む５’末端及び非転移鎖配列の少なくとも一部を含む３’末端を有する、組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公表番号】特表２０１２−５０６７０４（Ｐ２０１２−５０６７０４Ａ）
【公表日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３３４０１（Ｐ２０１１−５３３４０１）
【出願日】平成２１年１０月２４日（２００９．１０．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１９８３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４８６０５
【国際公開日】平成２２年４月２９日（２０１０．４．２９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５１１１０３６１６）エピセンター テクノロジーズ コーポレイション (2)
【氏名又は名称原語表記】ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２４日（２００９．１０．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１９８３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４８６０５
【国際公開日】平成２２年４月２９日（２０１０．４．２９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５１１１０３６１６）エピセンター テクノロジーズ コーポレイション (2)
【氏名又は名称原語表記】ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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