核酸分析方法
【課題】本発明の目的は、高いハイブリ効率かつ高スループットな単分子シークエンス法の提供に関する。
【解決手段】高いハイブリ効率かつ高スループットな単分子シークエンス法のためには、総プローブ数が一定であることと、光学分解能以上の距離に最低限の数の反応場がある必要がある。従って、本発明では、複数のプローブが固定された反応場を複数備えており、１個の標的核酸が反応場のプローブのいずれかにハイブリするようにする。ただし、各反応場間の距離は、単分子計測を行うために光学分解能以上離れている必要がある。標的核酸と反応場の比を１０倍以上にすることで、全ての標的核酸がプローブとハイブリした場合でも、９０％以上の標的核酸は反応場に１個だけハイブリし、複数の標的核酸が１つの反応場にハイブリする確率は１０％以下となる。
【解決手段】高いハイブリ効率かつ高スループットな単分子シークエンス法のためには、総プローブ数が一定であることと、光学分解能以上の距離に最低限の数の反応場がある必要がある。従って、本発明では、複数のプローブが固定された反応場を複数備えており、１個の標的核酸が反応場のプローブのいずれかにハイブリするようにする。ただし、各反応場間の距離は、単分子計測を行うために光学分解能以上離れている必要がある。標的核酸と反応場の比を１０倍以上にすることで、全ての標的核酸がプローブとハイブリした場合でも、９０％以上の標的核酸は反応場に１個だけハイブリし、複数の標的核酸が１つの反応場にハイブリする確率は１０％以下となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析技術に関する。例えば、蛍光を用いた単一分子計測デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在のＤＮＡシークエンス法は、サンガー法と呼ばれるＤＮＡ断片調整法と電気泳動法を組合せたキャピラリーシークエンス方式が用いられており、ヒトゲノム解析等に用いられて大きな成果をあげている。しかしながら、テーラーメイド医療などの観点から個人のゲノム解析を考えたとき、従来法で一度に解析できるＤＮＡ断片の長さよりもはるかに長い断片を、迅速・簡便・安価に解析できる技術が強く求められている。ヒトゲノム解析では、一人のヒトゲノムを解読するのに約１０００万ドルが必要であったが、将来は１００００分の１の１０００ドルでヒトゲノム解析を行うことが期待されている。従来のキャピラリーシークエンス法の改良のみでは、これらの要求に応えることは不可能であり、新たな方式に基づくＤＮＡシークエンスが待望されている。
【０００３】
上記要求を実現するために、走査型電子顕微鏡を用いてＤＮＡを直接シーケンスする方法や、１本鎖ＤＮＡがナノメートルサイズの孔（ポア）を通過するときの電圧値を塩基に変換することを利用したナノポアを用いた方法が提案されているが、技術的課題が多く実用化は難しいと考えられている。
【０００４】
最も有望な方法として、光技術を用いた超並列解析法があり、既に数社から化学発光や蛍光の原理に基づく装置が市販されている。この方法の特徴は、マイクロビーズや微細加工技術を用いて反応場を区分けすることにより、超並列解析を可能にしたことである。従来のキャピラリーシークエンス方式では、多チャンネル化（〜３８４本）によって解析効率の向上が図られているが、本方式では１億個以上の超並列解析も可能である。従って、読み取り塩基長では１００塩基以下とキャピラリーシークエンスに劣るものの、１日当たり数十ギガ塩基と、キャピラリーシークエンス方式と比較して１０００倍以上のスループットが達成できている。また、解析コストも、ヒトゲノム一人当たり約１０万ドルと約１００分の１となっている。
【０００５】
光技術を用いた超並列解析法は、標的核酸をＰＣＲなどにより増幅してから行う方法と、標的核酸を非増幅で行う方法の２つがある。非増幅の場合には、決定した配列に誤りがある可能性があるため、一旦核酸を増幅してから蛍光検出と段階反応によって配列を決定する方法と比較して確実性に劣る。ただし、核酸増幅を行わない分コストが安く済むため、１０００ドルゲノムを達成する有力な方法である。
【０００６】
単一分子計測方式に基づく非増幅での標的核酸の塩基解読方法は、主に以下の２つである。ひとつは、１本のＤＮＡの末端からエキソヌクレアーゼを用いて、ヌクレオチドを１個ずつ順番に切断して検出するエキソヌクレアーゼ法であり、もうひとつは１本の標的核酸を用意して、その塩基配列と相補的なヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼが１個ずつ取り込むのを検出するポリメラーゼ法である。エキソヌクレアーゼ法は、標識された色素が酵素反応を妨害するという課題を解決できていないが、ポリメラーゼ法は、蛍光標識する部位を工夫することにより、標識された色素が酵素反応を妨害するという困難を解決できる。ヌクレオチドに標識する方法や、酵素とヌクレオチドをそれぞれ異なる蛍光色素で標識して、１〜１０ｎｍの極近傍でのみ共鳴エネルギー移動ＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を起こさせる方法がある。いずれの方法においてもヌクレオチド自体は蛍光量子収率が１０-4と低いため、そのままでは単一分子の検出は不可能である。従って蛍光量子収率が０.１以上の蛍光色素で標識した蛍光ヌクレオチドが必要となる。
【０００７】
核酸の増幅・非増幅の有無は、ゲノム解析や新規ゲノム解析の場合には問題とならないが、発現解析へ適用する場合には、ＰＣＲ等による増幅効率が初期鋳型量に必ずしも比例しないことから、非増幅で行う方が好ましい。
【０００８】
現状、マイクロアレイで行われている発現解析では、まず健常者・非健常者から数千個の細胞を採取して、ｍＲＮＡを抽出する。その後、ｃＤＮＡに変換してＰＣＲで増幅し、Ｃｙ３・Ｃｙ５でそれぞれ標識する。それらを混合したものをＤＮＡチップにハイブリさせて蛍光スキャナーで検出することにより、非健常者に特異的に発現している遺伝子を特定する。ただし、この方法では非健常者から採取した細胞の中にも健全な細胞が含まれること、ＰＣＲによる増幅効率が初期鋳型量に必ずしも比例しないことから、あくまでも平均値での比較でしかない。従って、これまでに得られている様々な生物学的情報は、種々の細胞や組織から得た試料のため、平均化されているのである。平均化された情報を繋ぎ合わせても本当の生命現象は見えてこない。生命システムの基本は細胞であり、細胞に含まれるゲノム，ｍＲＮＡ，タンパク質、あるいは代謝物などの分子情報，反応情報，分布情報を、時間変化も含めて解明することが望まれている。生命現象をシステムとして理解することが今後の課題であり、高精度な発現解析を行うために、究極的には、１細胞から標的核酸を非増幅でシークケンスすることが望まれる。核酸１分子を鋳型として相補鎖合成反応を行うことで、相補鎖合成の反応効率に左右されずに長い核酸配列の解読が可能になるため、１細胞から核酸を増幅することなくシークケンスする方法が期待される。特に、１細胞中の全ｍＲＮＡを非増幅でシークエンスすることにより、発現しているｍＲＮＡの個数を数えて比較するデジタルカウンティングが生命現象の理解に必要となると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】P.N.A.S. 2003, Vol. 100, pp. 3960-3964.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本願発明者が単分子シークエンサーを用いた発現解析について鋭意検討した結果、次のような知見を得た。
【００１１】
現在、単分子シークエンサーが実用化されつつあり、非増幅で標的核酸をプローブにハイブリさせ、１塩基ずつ蛍光ヌクレオチドで伸長させながらシークエンスしている。１細胞中のｍＲＮＡ全てをシークエンスする場合、ｍＲＮＡ全てをプローブとハイブリさせる必要がある。ハイブリ効率は、プローブ濃度，ｍＲＮＡ濃度，プローブ−ｍＲＮＡ複合体濃度，プローブ−ｍＲＮＡ複合体の平衡定数により決定される。１細胞中のｍＲＮＡは約４０万個であり、１μＬで抽出したと仮定した場合、ｍＲＮＡ濃度は０.６６ｐＭと極めて低い。プローブ数をｍＲＮＡの１００倍と仮定すると、プローブ濃度は６６ｐＭである。また、平衡定数は１０9とする。以上のパラメータの場合、ハイブリ効率は６.２％と計算され、１００％のｍＲＮＡをハイブリさせることはできない。従って、１細胞中の全ｍＲＮＡシークケンスは困難である。ｍＲＮＡのデジタルカウンティングを行うためには９０％以上のハイブリ効率が望まれる。
【００１２】
１細胞中のｍＲＮＡ全てをハイブリさせるためには、プローブ数を増やしてプローブ濃度を上げることが有効である。プローブ濃度を６６ｐＭの１０倍，１００倍，１０００倍と上げることにより、ハイブリ効率は３９.７％，８６.８％，９８.５％と高くなる。
【００１３】
ただし、別の制約として、単分子シーケンサーでは、単一分子を光学分解能以上の距離（＞２００ｎｍ）に置く必要がある。従って、安易にプローブ濃度（プローブ数）を上げることは、装置のスループット低下に繋がる。例えば、プローブが１μｍピッチで固定されていると仮定すると、プローブ濃度６６ｐＭ（プローブ４０００万本）では４０mm2の面積が必要となる。顕微鏡で一度に観察できる視野をφ０.５mmとすると、視野面積は約０.２mm2となり、４０mm2／０.２mm2で計８０回の視野移動が必要である。１回の視野移動に３秒とすると、全ての視野を検出するのに４分かかる。プローブ濃度を１０倍，１００倍，１０００倍と上げることで、ハイブリ効率は３９.７％，８６.８％，９８.５％と高くなるが、視野移動の回数もそれぞれ８００，８０００，８００００回となるため、スループットはプローブ濃度に比例して４０分，４００分，４０００分と悪くなる。この議論は、光学分解能以下の距離にプローブをランダムにばら撒いた後に、確率的に標的核酸が光学分解能以上の距離でハイブリするように標的核酸の濃度を調製する場合にも成立する。
【００１４】
本発明の目的は、高いハイブリ効率かつ高スループットな単分子シークエンス法の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
高いハイブリ効率かつ高スループットな単分子シークエンス法のためには、総プローブ数が一定であることと、光学分解能以上の距離に最低限の数の反応場がある必要がある。
従って、本発明では、複数のプローブが固定された反応場を複数備えており、１個の標的核酸が反応場のプローブのいずれかにハイブリするようにする。ただし、各反応場間の距離は、単分子計測を行うために光学分解能以上離れている必要がある。標的核酸と反応場の比を１０倍以上にすることで、全ての標的核酸がプローブとハイブリした場合でも、９０％以上の標的核酸は反応場に１個だけハイブリし、複数の標的核酸が１つの反応場にハイブリする確率は１０％以下となる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、短時間で高いハイブリ効率を達成でき、かつ解析のスループットが向上する。従って、１細胞中の全ｍＲＮＡシークケンスによるデジタルカウンティングが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】核酸分析デバイスの概略。
【図２】１プローブが１反応場に固定されている場合のハイブリ効率。
【図３】１０プローブが１反応場に固定されている場合のハイブリ効率。
【図４】１００プローブが１反応場に固定されている場合のハイブリ効率。
【図５】１０００プローブが１反応場に固定されている場合のハイブリ効率。
【図６】１標的核酸／反応場となる標的核酸の割合。
【図７】Ｋ＝１０9におけるハイブリ効率。
【図８】Ｋ＝１０9における有効ｍＲＮＡ捕捉率。
【図９】核酸分析装置の概略。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
実施例は、複数のプローブを固定した反応場を備え、
の条件を満足することにより、前記反応場に１個の標的核酸を捕捉する核酸分析デバイス；
ただし、
であり；
［Ｘ］はプローブと標的核酸の複合体濃度、［Ａ］は複合体形成前のプローブ濃度、［Ｂ］は複合体形成前の標的核酸濃度であり；
プローブ数をａ、標的核酸数をｂ、反応場数をｃ、プローブと標的核酸との平衡定数をＫ、アボガドロ数をＮA、反応液量をｖ（ｍｌ）とするものを説明する。
【００１９】
また、実施例は、ａが４×１０7〜４×１０11、ｂが４×１０5〜４×１０8、ｃが４×１０5〜４×１０8であることを特徴とする核酸分析デバイスを説明する。
【００２０】
また、実施例は、ａ／ｃが２〜１００００であることを特徴とする核酸分析デバイスを説明する。
【００２１】
また、実施例は、λが０.５以下であることを特徴とする核酸分析デバイスを説明する。
【００２２】
また、実施例は、各反応場間の距離が光学分解能２００ｎｍ以上であることを特徴とする核酸分析デバイスを説明する。
【００２３】
また、実施例は、プローブが捕捉した１個の標的核酸に標識ヌクレオチドを取り込ませてシークエンスすることを特徴とする核酸分析デバイスを説明する。
【００２４】
また、実施例は、標識ヌクレオチドを、蛍光または発光により検出することを特徴とする核酸分析デバイスを説明する。
【００２５】
また、実施例は、標的核酸が、ｍＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ，ｃＤＮＡ，ＤＮＡであることを特徴とする核酸分析デバイスを説明する。
【００２６】
また、実施例は、標的核酸が、非増幅の核酸であることを特徴とする核酸分析デバイスを説明する。
【００２７】
また、実施例は、プローブが、オリゴヌクレオチド，ＤＮＡ断片，ＲＮＡ断片，ＰＮＡ，抗体，ペプチドのいずれかであることを特徴とする核酸分析デバイスを説明する。
【００２８】
また、実施例は、核酸分析デバイスを利用する核酸分析装置であって、核酸分析デバイスに対して、ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段とを備えるものを説明する。
【００２９】
上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について図面を参照しながら説明する。尚、図面は説明のために用いるものであり、権利範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３０】
プローブをＡ、標的核酸をＢとすると、
【００３１】
【数１】
である。平衡定数Ｋを、
【００３２】
【数２】
とおくと、
【００３３】
【数３】
と表せる。
【００３４】
Ａ，Ｂの全濃度は、
【００３５】
【数４】
【００３６】
【数５】
であり、（３）へ代入する。
【００３７】
【数６】
【００３８】
（６）はＸに関する二次方程式であるため、Ｘは下記の式で表せる。
【００３９】
【数７】
【００４０】
１細胞中のｍＲＮＡは約４０万個であり、１μＬで抽出したと仮定した場合、ｍＲＮＡ濃度は０.６６ｐＭである。またプローブ数（１プローブ／１反応場）はｍＲＮＡの１００倍の４０００万個とする。従って、プローブ濃度は６６ｐＭである。平衡定数は温度など条件により大きく変わるが、２０塩基同士のオリゴヌクレオチドの平衡定数である１０9とする。以上の条件を（７）へ代入して、ｍＲＮＡハイブリ効率を計算すると、６.２％と計算される。従って、９０％以上のｍＲＮＡはハイブリしないため、シークエンスできない。なお平衡定数が１０10の場合のハイブリ効率は３９.７％、１０11の場合のハイブリ効率は８６.７％と計算される。
【００４１】
本実施例のデバイスの概念を、図１を用いて説明する。１０１は、１０５のプローブを固定するための基板である。１０２〜１０４は、単一分子計測を行うための反応場であり、光学分解能２００ｎｍ以下の面積が良い。ただし、光学分解能以上の面積であっても、一つの標的核酸のみがハイブリしていれば単一分子計測は可能である。反応場１０２〜１０４には、複数のプローブ１０５が固定されている。また、反応場１０２や反応場１０３などの各反応場間の距離は、光学分解能２００ｎｍ以上とする。
【００４２】
また、プローブ１０５は、標的核酸を捕捉するためのプローブであり、標的核酸がｍＲＮＡの場合は、ポリＡテールをハイブリさせるために、２０塩基程度のポリＴヌクレオチドであることが望ましい。１０６〜１０９は、標的核酸である。２つの標的核酸１０６及び標的核酸１０７が、反応場１０２に固定されたプローブ１０５にハイブリしている。複数の標的核酸が光学分解能以下の面積である１つの反応場にハイブリした場合、塩基伸長反応に伴うそれぞれの標的核酸からの信号が異なることから、単一分子シーケンスを行うことができない。同様に、反応場１０３は、一つの標的核酸もハイブリしていないことから、シーケンスを行うことができない。標的核酸１０９は、プローブにハイブリしていない未反応のｍＲＮＡである。標的核酸１０８は、反応場１０４に固定されたプローブ１０５にハイブリしている唯一の核酸のため、単一分子シーケンスが可能である。
【００４３】
全ての標的核酸に対して、１つの標的核酸が１つの反応場でハイブリする割合の計算方法を、図１を参考にして以下に概要を示す。まず、全標的核酸数とプローブ数が決まると、（７）式によりハイブリ効率が算出される。従って、全標的核酸のうち何個の標的核酸がプローブとハイブリするかが計算できる。図１では、４つの標的核酸１０６〜１０９のうち、３つの標的核酸１０６〜１０８がハイブリしていることから、ハイブリ効率は３／４である。次に、ハイブリする３つの標的核酸のうち、何個が１つの反応場に唯一の標的核酸として存在しうるかを計算する。これは、ハイブリする標的核酸数と反応場数から確率論的に算出できる。図１では、３つの標的核酸１０６〜１０８のうち、標的核酸１０８のみがハイブリしていることから、１標的核酸／反応場捕捉率は１／３である。数が多い場合には、ポアソン分布
【００４４】
【数８】
を用いてこの確率を計算できる。ここでｋは１、λはハイブリする標的核酸／反応場数である。従って、全標的核酸のうち、１標的核酸／反応場となる標的核酸の割合、つまり、有効標的核酸捕捉率は、３／４×１／３で１／４（２５％）となる。従って、（７），（８）式より、全ての標的核酸の９０％以上を単一分子シーケンスするための条件を算出できる。
【００４５】
全ての標的核酸の９０％以上を単一分子シーケンスするための条件を以下に計算するが、反応場１０２〜１０４のは、標的核酸の１０倍以上であることが望ましい。標的核酸と
反応場の比を１０倍以上にすることにより、全ての標的核酸がプローブとハイブリした場合でも、９０％以上の標的核酸は反応場に１個だけハイブリし、複数の標的核酸が１つの反応場にハイブリする確率は１０％以下となるからである。例えば、１細胞中のｍＲＮＡは４０万個であることから、反応場数は４００万個以上あると良い。仮に反応場数を４０００万個として、１反応場あたりのプローブ数を１０，１００，１０００個とすると、ハイブリ効率は３９.７％，８６.８％，９８.５％と計算される。また、１標的核酸／反応場となる標的核酸の割合、つまり有効ハイブリ効率は、それぞれ３９.５％，８６.１％，９７.５％となる。
【００４６】
図２は、（７）式に基づいて計算したｍＲＮＡハイブリ効率である。縦軸にｍＲＮＡがハイブリする割合（％）を、横軸に平衡定数をそれぞれ対数表示している。平衡定数は、温度など条件により大きく変わるが、２０塩基同士のオリゴヌクレオチドの平衡定数である１０9を基本として、１０8〜１０12の間で変化させた。計算条件は、１細胞中のｍＲＮＡ４０万個，ｍＲＮＡ濃度０.６６ｐＭ，プローブ数４０００万個、プローブ濃度は６６ｐＭ，反応場４０００万個（１プローブ／反応場）とした。
【００４７】
図３は、（７）式に基づいて計算したｍＲＮＡハイブリ効率である。縦軸にｍＲＮＡがハイブリする割合（％）を、横軸に平衡定数をそれぞれ対数表示している。平衡定数は、温度など条件により大きく変わるが、２０塩基同士のオリゴヌクレオチドの平衡定数である１０9を基本として、１０8〜１０12の間で変化させた。計算条件は、１細胞中のｍＲＮＡ４０万個，ｍＲＮＡ濃度０.６６ｐＭ，プローブ数４億個，プローブ濃度は６６０ｐＭ，反応場４０００万個（１０プローブ／反応場）とした。
【００４８】
図４は、（７）式に基づいて計算したｍＲＮＡハイブリ効率である。縦軸にｍＲＮＡがハイブリする割合（％）を、横軸に平衡定数をそれぞれ対数表示している。平衡定数は、温度など条件により大きく変わるが、２０塩基同士のオリゴヌクレオチドの平衡定数である１０9を基本として、１０8〜１０12の間で変化させた。計算条件は、１細胞中のｍＲＮＡ４０万個、ｍＲＮＡ濃度０.６６ｐＭ、プローブ数４０億個、プローブ濃度は６.６ｎＭ、反応場４０００万個（１００プローブ／反応場）とした。
【００４９】
図５は、（７）式に基づいて計算したｍＲＮＡハイブリ効率である。縦軸にｍＲＮＡがハイブリする割合（％）を、横軸に平衡定数をそれぞれ対数表示している。平衡定数は、温度など条件により大きく変わるが、２０塩基同士のオリゴヌクレオチドの平衡定数である１０9を基本として、１０8〜１０12の間で変化させた。計算条件は、１細胞中のｍＲＮＡ４０万個，ｍＲＮＡ濃度０.６６ｐＭ，プローブ数４００億個、プローブ濃度は６６ｎＭ，反応場４０００万個（１０００プローブ／反応場）とした。図２〜図５より、反応場数を４０００万個、平衡定数を１０9として、１反応場あたりのプローブ数を１，１０，１００，１０００個とすると、ハイブリ効率は６.２％，３９.７％，８６.８％，９８.５％と高くなることが理解できる。
【００５０】
ただし、１反応場あたりのプローブ数が１個の場合でも、平衡定数が１０9，１０10，１０11，１０12と上がるにつれて、ハイブリ効率は６.２％，３９.７％，８６.８％，９８.５％と高くなる。平衡定数を上げる方法として、ハイブリ温度を下げる、プローブの塩基長を長くする、ハイブリ液の塩濃度を上げる、プローブのＧＣ含量を上げるなどの方法がある。またMinor Groove Binderと呼ばれる分子は、２本鎖核酸の溝に巻きついて分子を安定させる効果を持つ。ただし、いずれの方法でも、平衡定数を３桁上げて１０12にすることは難しい。従って、１反応場あたりのプローブ数を増やすことが望ましく、また、上述の平衡定数を上げる方法との併用で、ハイブリ効率は更に高くなる。従って、１反応場あたり数百本のプローブを立てることによりハイブリ効率は９０％以上となる。
【００５１】
図６は、（８）式に基づいて計算した１ｍＲＮＡ／反応場捕捉率（％）である。１ｍＲＮＡ／反応場捕捉率（％）とは、シーケンス可能な１ｍＲＮＡ／微粒子でハイブリする確率である。この確率は、微粒子数とハイブリするｍＲＮＡ数の比のみで計算される。一方、複数ｍＲＮＡ／反応場捕捉率（％）とは、シーケンスに適さない複数ｍＲＮＡ／微粒子でハイブリする確率である。以上より、１ｍＲＮＡ／反応場捕捉率が９０％以上となるためには、反応場数／ハイブリするｍＲＮＡ数の比が１０以上である必要があり、比が１００の場合には、１ｍＲＮＡ／反応場捕捉率が９９％以上となる。
【００５２】
図７に、平衡定数１０9における反応場数と、１反応場（site）あたりのプローブ数、とを変化させたときのハイブリ効率をプロットした。また、図８に、平衡定数１０9における反応場数と、１反応場（site）あたりのプローブ数と、を変化させたときの有効ｍＲＮＡ捕捉率をプロットした。反応場に固定するプローブ数は、プローブ濃度を変えることにより調整できるため、例えば、有効ｍＲＮＡ捕捉率が９０％以上となるための条件に設定することにより、１細胞からのｍＲＮＡシークエンスが可能となる。
【００５３】
図９に、上記核酸デバイスを用いる核酸分析装置について説明する。本装置では、核酸分析デバイスに対して、ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段とを備える。より具体的には、カバープレート６０１と検出窓６０２と溶液交換用口である注入口６０３と排出口６０４から構成される反応チャンバーに前記のデバイス６０５を設置する。なお、カバープレート６０１と検出窓６０２の材質として、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。また、検出窓６０２の厚さは０.１７mmとする。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）６０６およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）６０７から発振するレーザ光６０８および６０９を、レーザ光６０９のみをλ／４板６１０によって円偏光し、ダイクロイックミラー６１１（４１０ｎｍ以下を反射）によって、２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ６１２によって集光し、その後、プリズム６１３を介してデバイス６０５へ臨界角以上で照射する。本装置によれば、レーザ照射により、デバイス６０５表面上に存在する金属体において局在型表面プラズモンが発生し、第二の金属に結合したプローブにより捕捉された標的物質の蛍光体は蛍光増強場内に存在することになる。蛍光体はレーザ光で励起され、その増強された蛍光の一部は検出窓６０２を介して出射される。また、検出窓６０２より出射される蛍光は、対物レンズ６１４（×６０，ＮＡ１.３５，作動距離０.１５mm）により平行光束とされ、光学フィルタ６１５により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ６１６により２次元ＣＣＤカメラ６１７上に結像される。
【００５４】
尚、上記実施例では、標識ヌクレオチドを蛍光により検出するものを中心に説明したが、公知の発光技術を応用し、検出してもよい。また、標的核酸がｍＲＮＡであるものを中心に説明したが、標的核酸が、ｍｉＲＮＡ，ｃＤＮＡ，ＤＮＡであってもよい。また、プローブが、オリゴヌクレオチドあるもの中心に説明したが、ＤＮＡ断片，ＲＮＡ断片，ＰＮＡ，抗体，ペプチドのいずれかであってもよい。
【符号の説明】
【００５５】
１０１ 基板
１０２〜１０４ 反応場
１０５ プローブ
１０６〜１０８ プローブにハイブリした標的核酸
１０９ プローブにハイブリしていない標的核酸
６０１ カバープレート
６０２ 検出窓
６０３ 注入口
６０４ 排出口
６０５ デバイス
６０６ ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）
６０７ ＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）
６０８，６０９ レーザ光
６１０ λ／４板
６１１ ダイクロイックミラー
６１２ レンズ
６１３ プリズム
６１４ 対物レンズ
６１５ 光学フィルタ
６１６ 結像レンズ
６１７ ２次元ＣＣＤカメラ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析技術に関する。例えば、蛍光を用いた単一分子計測デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在のＤＮＡシークエンス法は、サンガー法と呼ばれるＤＮＡ断片調整法と電気泳動法を組合せたキャピラリーシークエンス方式が用いられており、ヒトゲノム解析等に用いられて大きな成果をあげている。しかしながら、テーラーメイド医療などの観点から個人のゲノム解析を考えたとき、従来法で一度に解析できるＤＮＡ断片の長さよりもはるかに長い断片を、迅速・簡便・安価に解析できる技術が強く求められている。ヒトゲノム解析では、一人のヒトゲノムを解読するのに約１０００万ドルが必要であったが、将来は１００００分の１の１０００ドルでヒトゲノム解析を行うことが期待されている。従来のキャピラリーシークエンス法の改良のみでは、これらの要求に応えることは不可能であり、新たな方式に基づくＤＮＡシークエンスが待望されている。
【０００３】
上記要求を実現するために、走査型電子顕微鏡を用いてＤＮＡを直接シーケンスする方法や、１本鎖ＤＮＡがナノメートルサイズの孔（ポア）を通過するときの電圧値を塩基に変換することを利用したナノポアを用いた方法が提案されているが、技術的課題が多く実用化は難しいと考えられている。
【０００４】
最も有望な方法として、光技術を用いた超並列解析法があり、既に数社から化学発光や蛍光の原理に基づく装置が市販されている。この方法の特徴は、マイクロビーズや微細加工技術を用いて反応場を区分けすることにより、超並列解析を可能にしたことである。従来のキャピラリーシークエンス方式では、多チャンネル化（〜３８４本）によって解析効率の向上が図られているが、本方式では１億個以上の超並列解析も可能である。従って、読み取り塩基長では１００塩基以下とキャピラリーシークエンスに劣るものの、１日当たり数十ギガ塩基と、キャピラリーシークエンス方式と比較して１０００倍以上のスループットが達成できている。また、解析コストも、ヒトゲノム一人当たり約１０万ドルと約１００分の１となっている。
【０００５】
光技術を用いた超並列解析法は、標的核酸をＰＣＲなどにより増幅してから行う方法と、標的核酸を非増幅で行う方法の２つがある。非増幅の場合には、決定した配列に誤りがある可能性があるため、一旦核酸を増幅してから蛍光検出と段階反応によって配列を決定する方法と比較して確実性に劣る。ただし、核酸増幅を行わない分コストが安く済むため、１０００ドルゲノムを達成する有力な方法である。
【０００６】
単一分子計測方式に基づく非増幅での標的核酸の塩基解読方法は、主に以下の２つである。ひとつは、１本のＤＮＡの末端からエキソヌクレアーゼを用いて、ヌクレオチドを１個ずつ順番に切断して検出するエキソヌクレアーゼ法であり、もうひとつは１本の標的核酸を用意して、その塩基配列と相補的なヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼが１個ずつ取り込むのを検出するポリメラーゼ法である。エキソヌクレアーゼ法は、標識された色素が酵素反応を妨害するという課題を解決できていないが、ポリメラーゼ法は、蛍光標識する部位を工夫することにより、標識された色素が酵素反応を妨害するという困難を解決できる。ヌクレオチドに標識する方法や、酵素とヌクレオチドをそれぞれ異なる蛍光色素で標識して、１〜１０ｎｍの極近傍でのみ共鳴エネルギー移動ＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を起こさせる方法がある。いずれの方法においてもヌクレオチド自体は蛍光量子収率が１０-4と低いため、そのままでは単一分子の検出は不可能である。従って蛍光量子収率が０.１以上の蛍光色素で標識した蛍光ヌクレオチドが必要となる。
【０００７】
核酸の増幅・非増幅の有無は、ゲノム解析や新規ゲノム解析の場合には問題とならないが、発現解析へ適用する場合には、ＰＣＲ等による増幅効率が初期鋳型量に必ずしも比例しないことから、非増幅で行う方が好ましい。
【０００８】
現状、マイクロアレイで行われている発現解析では、まず健常者・非健常者から数千個の細胞を採取して、ｍＲＮＡを抽出する。その後、ｃＤＮＡに変換してＰＣＲで増幅し、Ｃｙ３・Ｃｙ５でそれぞれ標識する。それらを混合したものをＤＮＡチップにハイブリさせて蛍光スキャナーで検出することにより、非健常者に特異的に発現している遺伝子を特定する。ただし、この方法では非健常者から採取した細胞の中にも健全な細胞が含まれること、ＰＣＲによる増幅効率が初期鋳型量に必ずしも比例しないことから、あくまでも平均値での比較でしかない。従って、これまでに得られている様々な生物学的情報は、種々の細胞や組織から得た試料のため、平均化されているのである。平均化された情報を繋ぎ合わせても本当の生命現象は見えてこない。生命システムの基本は細胞であり、細胞に含まれるゲノム，ｍＲＮＡ，タンパク質、あるいは代謝物などの分子情報，反応情報，分布情報を、時間変化も含めて解明することが望まれている。生命現象をシステムとして理解することが今後の課題であり、高精度な発現解析を行うために、究極的には、１細胞から標的核酸を非増幅でシークケンスすることが望まれる。核酸１分子を鋳型として相補鎖合成反応を行うことで、相補鎖合成の反応効率に左右されずに長い核酸配列の解読が可能になるため、１細胞から核酸を増幅することなくシークケンスする方法が期待される。特に、１細胞中の全ｍＲＮＡを非増幅でシークエンスすることにより、発現しているｍＲＮＡの個数を数えて比較するデジタルカウンティングが生命現象の理解に必要となると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】P.N.A.S. 2003, Vol. 100, pp. 3960-3964.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本願発明者が単分子シークエンサーを用いた発現解析について鋭意検討した結果、次のような知見を得た。
【００１１】
現在、単分子シークエンサーが実用化されつつあり、非増幅で標的核酸をプローブにハイブリさせ、１塩基ずつ蛍光ヌクレオチドで伸長させながらシークエンスしている。１細胞中のｍＲＮＡ全てをシークエンスする場合、ｍＲＮＡ全てをプローブとハイブリさせる必要がある。ハイブリ効率は、プローブ濃度，ｍＲＮＡ濃度，プローブ−ｍＲＮＡ複合体濃度，プローブ−ｍＲＮＡ複合体の平衡定数により決定される。１細胞中のｍＲＮＡは約４０万個であり、１μＬで抽出したと仮定した場合、ｍＲＮＡ濃度は０.６６ｐＭと極めて低い。プローブ数をｍＲＮＡの１００倍と仮定すると、プローブ濃度は６６ｐＭである。また、平衡定数は１０9とする。以上のパラメータの場合、ハイブリ効率は６.２％と計算され、１００％のｍＲＮＡをハイブリさせることはできない。従って、１細胞中の全ｍＲＮＡシークケンスは困難である。ｍＲＮＡのデジタルカウンティングを行うためには９０％以上のハイブリ効率が望まれる。
【００１２】
１細胞中のｍＲＮＡ全てをハイブリさせるためには、プローブ数を増やしてプローブ濃度を上げることが有効である。プローブ濃度を６６ｐＭの１０倍，１００倍，１０００倍と上げることにより、ハイブリ効率は３９.７％，８６.８％，９８.５％と高くなる。
【００１３】
ただし、別の制約として、単分子シーケンサーでは、単一分子を光学分解能以上の距離（＞２００ｎｍ）に置く必要がある。従って、安易にプローブ濃度（プローブ数）を上げることは、装置のスループット低下に繋がる。例えば、プローブが１μｍピッチで固定されていると仮定すると、プローブ濃度６６ｐＭ（プローブ４０００万本）では４０mm2の面積が必要となる。顕微鏡で一度に観察できる視野をφ０.５mmとすると、視野面積は約０.２mm2となり、４０mm2／０.２mm2で計８０回の視野移動が必要である。１回の視野移動に３秒とすると、全ての視野を検出するのに４分かかる。プローブ濃度を１０倍，１００倍，１０００倍と上げることで、ハイブリ効率は３９.７％，８６.８％，９８.５％と高くなるが、視野移動の回数もそれぞれ８００，８０００，８００００回となるため、スループットはプローブ濃度に比例して４０分，４００分，４０００分と悪くなる。この議論は、光学分解能以下の距離にプローブをランダムにばら撒いた後に、確率的に標的核酸が光学分解能以上の距離でハイブリするように標的核酸の濃度を調製する場合にも成立する。
【００１４】
本発明の目的は、高いハイブリ効率かつ高スループットな単分子シークエンス法の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
高いハイブリ効率かつ高スループットな単分子シークエンス法のためには、総プローブ数が一定であることと、光学分解能以上の距離に最低限の数の反応場がある必要がある。
従って、本発明では、複数のプローブが固定された反応場を複数備えており、１個の標的核酸が反応場のプローブのいずれかにハイブリするようにする。ただし、各反応場間の距離は、単分子計測を行うために光学分解能以上離れている必要がある。標的核酸と反応場の比を１０倍以上にすることで、全ての標的核酸がプローブとハイブリした場合でも、９０％以上の標的核酸は反応場に１個だけハイブリし、複数の標的核酸が１つの反応場にハイブリする確率は１０％以下となる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、短時間で高いハイブリ効率を達成でき、かつ解析のスループットが向上する。従って、１細胞中の全ｍＲＮＡシークケンスによるデジタルカウンティングが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】核酸分析デバイスの概略。
【図２】１プローブが１反応場に固定されている場合のハイブリ効率。
【図３】１０プローブが１反応場に固定されている場合のハイブリ効率。
【図４】１００プローブが１反応場に固定されている場合のハイブリ効率。
【図５】１０００プローブが１反応場に固定されている場合のハイブリ効率。
【図６】１標的核酸／反応場となる標的核酸の割合。
【図７】Ｋ＝１０9におけるハイブリ効率。
【図８】Ｋ＝１０9における有効ｍＲＮＡ捕捉率。
【図９】核酸分析装置の概略。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
実施例は、複数のプローブを固定した反応場を備え、
の条件を満足することにより、前記反応場に１個の標的核酸を捕捉する核酸分析デバイス；
ただし、
であり；
［Ｘ］はプローブと標的核酸の複合体濃度、［Ａ］は複合体形成前のプローブ濃度、［Ｂ］は複合体形成前の標的核酸濃度であり；
プローブ数をａ、標的核酸数をｂ、反応場数をｃ、プローブと標的核酸との平衡定数をＫ、アボガドロ数をＮA、反応液量をｖ（ｍｌ）とするものを説明する。
【００１９】
また、実施例は、ａが４×１０7〜４×１０11、ｂが４×１０5〜４×１０8、ｃが４×１０5〜４×１０8であることを特徴とする核酸分析デバイスを説明する。
【００２０】
また、実施例は、ａ／ｃが２〜１００００であることを特徴とする核酸分析デバイスを説明する。
【００２１】
また、実施例は、λが０.５以下であることを特徴とする核酸分析デバイスを説明する。
【００２２】
また、実施例は、各反応場間の距離が光学分解能２００ｎｍ以上であることを特徴とする核酸分析デバイスを説明する。
【００２３】
また、実施例は、プローブが捕捉した１個の標的核酸に標識ヌクレオチドを取り込ませてシークエンスすることを特徴とする核酸分析デバイスを説明する。
【００２４】
また、実施例は、標識ヌクレオチドを、蛍光または発光により検出することを特徴とする核酸分析デバイスを説明する。
【００２５】
また、実施例は、標的核酸が、ｍＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ，ｃＤＮＡ，ＤＮＡであることを特徴とする核酸分析デバイスを説明する。
【００２６】
また、実施例は、標的核酸が、非増幅の核酸であることを特徴とする核酸分析デバイスを説明する。
【００２７】
また、実施例は、プローブが、オリゴヌクレオチド，ＤＮＡ断片，ＲＮＡ断片，ＰＮＡ，抗体，ペプチドのいずれかであることを特徴とする核酸分析デバイスを説明する。
【００２８】
また、実施例は、核酸分析デバイスを利用する核酸分析装置であって、核酸分析デバイスに対して、ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段とを備えるものを説明する。
【００２９】
上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について図面を参照しながら説明する。尚、図面は説明のために用いるものであり、権利範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３０】
プローブをＡ、標的核酸をＢとすると、
【００３１】
【数１】
である。平衡定数Ｋを、
【００３２】
【数２】
とおくと、
【００３３】
【数３】
と表せる。
【００３４】
Ａ，Ｂの全濃度は、
【００３５】
【数４】
【００３６】
【数５】
であり、（３）へ代入する。
【００３７】
【数６】
【００３８】
（６）はＸに関する二次方程式であるため、Ｘは下記の式で表せる。
【００３９】
【数７】
【００４０】
１細胞中のｍＲＮＡは約４０万個であり、１μＬで抽出したと仮定した場合、ｍＲＮＡ濃度は０.６６ｐＭである。またプローブ数（１プローブ／１反応場）はｍＲＮＡの１００倍の４０００万個とする。従って、プローブ濃度は６６ｐＭである。平衡定数は温度など条件により大きく変わるが、２０塩基同士のオリゴヌクレオチドの平衡定数である１０9とする。以上の条件を（７）へ代入して、ｍＲＮＡハイブリ効率を計算すると、６.２％と計算される。従って、９０％以上のｍＲＮＡはハイブリしないため、シークエンスできない。なお平衡定数が１０10の場合のハイブリ効率は３９.７％、１０11の場合のハイブリ効率は８６.７％と計算される。
【００４１】
本実施例のデバイスの概念を、図１を用いて説明する。１０１は、１０５のプローブを固定するための基板である。１０２〜１０４は、単一分子計測を行うための反応場であり、光学分解能２００ｎｍ以下の面積が良い。ただし、光学分解能以上の面積であっても、一つの標的核酸のみがハイブリしていれば単一分子計測は可能である。反応場１０２〜１０４には、複数のプローブ１０５が固定されている。また、反応場１０２や反応場１０３などの各反応場間の距離は、光学分解能２００ｎｍ以上とする。
【００４２】
また、プローブ１０５は、標的核酸を捕捉するためのプローブであり、標的核酸がｍＲＮＡの場合は、ポリＡテールをハイブリさせるために、２０塩基程度のポリＴヌクレオチドであることが望ましい。１０６〜１０９は、標的核酸である。２つの標的核酸１０６及び標的核酸１０７が、反応場１０２に固定されたプローブ１０５にハイブリしている。複数の標的核酸が光学分解能以下の面積である１つの反応場にハイブリした場合、塩基伸長反応に伴うそれぞれの標的核酸からの信号が異なることから、単一分子シーケンスを行うことができない。同様に、反応場１０３は、一つの標的核酸もハイブリしていないことから、シーケンスを行うことができない。標的核酸１０９は、プローブにハイブリしていない未反応のｍＲＮＡである。標的核酸１０８は、反応場１０４に固定されたプローブ１０５にハイブリしている唯一の核酸のため、単一分子シーケンスが可能である。
【００４３】
全ての標的核酸に対して、１つの標的核酸が１つの反応場でハイブリする割合の計算方法を、図１を参考にして以下に概要を示す。まず、全標的核酸数とプローブ数が決まると、（７）式によりハイブリ効率が算出される。従って、全標的核酸のうち何個の標的核酸がプローブとハイブリするかが計算できる。図１では、４つの標的核酸１０６〜１０９のうち、３つの標的核酸１０６〜１０８がハイブリしていることから、ハイブリ効率は３／４である。次に、ハイブリする３つの標的核酸のうち、何個が１つの反応場に唯一の標的核酸として存在しうるかを計算する。これは、ハイブリする標的核酸数と反応場数から確率論的に算出できる。図１では、３つの標的核酸１０６〜１０８のうち、標的核酸１０８のみがハイブリしていることから、１標的核酸／反応場捕捉率は１／３である。数が多い場合には、ポアソン分布
【００４４】
【数８】
を用いてこの確率を計算できる。ここでｋは１、λはハイブリする標的核酸／反応場数である。従って、全標的核酸のうち、１標的核酸／反応場となる標的核酸の割合、つまり、有効標的核酸捕捉率は、３／４×１／３で１／４（２５％）となる。従って、（７），（８）式より、全ての標的核酸の９０％以上を単一分子シーケンスするための条件を算出できる。
【００４５】
全ての標的核酸の９０％以上を単一分子シーケンスするための条件を以下に計算するが、反応場１０２〜１０４のは、標的核酸の１０倍以上であることが望ましい。標的核酸と
反応場の比を１０倍以上にすることにより、全ての標的核酸がプローブとハイブリした場合でも、９０％以上の標的核酸は反応場に１個だけハイブリし、複数の標的核酸が１つの反応場にハイブリする確率は１０％以下となるからである。例えば、１細胞中のｍＲＮＡは４０万個であることから、反応場数は４００万個以上あると良い。仮に反応場数を４０００万個として、１反応場あたりのプローブ数を１０，１００，１０００個とすると、ハイブリ効率は３９.７％，８６.８％，９８.５％と計算される。また、１標的核酸／反応場となる標的核酸の割合、つまり有効ハイブリ効率は、それぞれ３９.５％，８６.１％，９７.５％となる。
【００４６】
図２は、（７）式に基づいて計算したｍＲＮＡハイブリ効率である。縦軸にｍＲＮＡがハイブリする割合（％）を、横軸に平衡定数をそれぞれ対数表示している。平衡定数は、温度など条件により大きく変わるが、２０塩基同士のオリゴヌクレオチドの平衡定数である１０9を基本として、１０8〜１０12の間で変化させた。計算条件は、１細胞中のｍＲＮＡ４０万個，ｍＲＮＡ濃度０.６６ｐＭ，プローブ数４０００万個、プローブ濃度は６６ｐＭ，反応場４０００万個（１プローブ／反応場）とした。
【００４７】
図３は、（７）式に基づいて計算したｍＲＮＡハイブリ効率である。縦軸にｍＲＮＡがハイブリする割合（％）を、横軸に平衡定数をそれぞれ対数表示している。平衡定数は、温度など条件により大きく変わるが、２０塩基同士のオリゴヌクレオチドの平衡定数である１０9を基本として、１０8〜１０12の間で変化させた。計算条件は、１細胞中のｍＲＮＡ４０万個，ｍＲＮＡ濃度０.６６ｐＭ，プローブ数４億個，プローブ濃度は６６０ｐＭ，反応場４０００万個（１０プローブ／反応場）とした。
【００４８】
図４は、（７）式に基づいて計算したｍＲＮＡハイブリ効率である。縦軸にｍＲＮＡがハイブリする割合（％）を、横軸に平衡定数をそれぞれ対数表示している。平衡定数は、温度など条件により大きく変わるが、２０塩基同士のオリゴヌクレオチドの平衡定数である１０9を基本として、１０8〜１０12の間で変化させた。計算条件は、１細胞中のｍＲＮＡ４０万個、ｍＲＮＡ濃度０.６６ｐＭ、プローブ数４０億個、プローブ濃度は６.６ｎＭ、反応場４０００万個（１００プローブ／反応場）とした。
【００４９】
図５は、（７）式に基づいて計算したｍＲＮＡハイブリ効率である。縦軸にｍＲＮＡがハイブリする割合（％）を、横軸に平衡定数をそれぞれ対数表示している。平衡定数は、温度など条件により大きく変わるが、２０塩基同士のオリゴヌクレオチドの平衡定数である１０9を基本として、１０8〜１０12の間で変化させた。計算条件は、１細胞中のｍＲＮＡ４０万個，ｍＲＮＡ濃度０.６６ｐＭ，プローブ数４００億個、プローブ濃度は６６ｎＭ，反応場４０００万個（１０００プローブ／反応場）とした。図２〜図５より、反応場数を４０００万個、平衡定数を１０9として、１反応場あたりのプローブ数を１，１０，１００，１０００個とすると、ハイブリ効率は６.２％，３９.７％，８６.８％，９８.５％と高くなることが理解できる。
【００５０】
ただし、１反応場あたりのプローブ数が１個の場合でも、平衡定数が１０9，１０10，１０11，１０12と上がるにつれて、ハイブリ効率は６.２％，３９.７％，８６.８％，９８.５％と高くなる。平衡定数を上げる方法として、ハイブリ温度を下げる、プローブの塩基長を長くする、ハイブリ液の塩濃度を上げる、プローブのＧＣ含量を上げるなどの方法がある。またMinor Groove Binderと呼ばれる分子は、２本鎖核酸の溝に巻きついて分子を安定させる効果を持つ。ただし、いずれの方法でも、平衡定数を３桁上げて１０12にすることは難しい。従って、１反応場あたりのプローブ数を増やすことが望ましく、また、上述の平衡定数を上げる方法との併用で、ハイブリ効率は更に高くなる。従って、１反応場あたり数百本のプローブを立てることによりハイブリ効率は９０％以上となる。
【００５１】
図６は、（８）式に基づいて計算した１ｍＲＮＡ／反応場捕捉率（％）である。１ｍＲＮＡ／反応場捕捉率（％）とは、シーケンス可能な１ｍＲＮＡ／微粒子でハイブリする確率である。この確率は、微粒子数とハイブリするｍＲＮＡ数の比のみで計算される。一方、複数ｍＲＮＡ／反応場捕捉率（％）とは、シーケンスに適さない複数ｍＲＮＡ／微粒子でハイブリする確率である。以上より、１ｍＲＮＡ／反応場捕捉率が９０％以上となるためには、反応場数／ハイブリするｍＲＮＡ数の比が１０以上である必要があり、比が１００の場合には、１ｍＲＮＡ／反応場捕捉率が９９％以上となる。
【００５２】
図７に、平衡定数１０9における反応場数と、１反応場（site）あたりのプローブ数、とを変化させたときのハイブリ効率をプロットした。また、図８に、平衡定数１０9における反応場数と、１反応場（site）あたりのプローブ数と、を変化させたときの有効ｍＲＮＡ捕捉率をプロットした。反応場に固定するプローブ数は、プローブ濃度を変えることにより調整できるため、例えば、有効ｍＲＮＡ捕捉率が９０％以上となるための条件に設定することにより、１細胞からのｍＲＮＡシークエンスが可能となる。
【００５３】
図９に、上記核酸デバイスを用いる核酸分析装置について説明する。本装置では、核酸分析デバイスに対して、ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段とを備える。より具体的には、カバープレート６０１と検出窓６０２と溶液交換用口である注入口６０３と排出口６０４から構成される反応チャンバーに前記のデバイス６０５を設置する。なお、カバープレート６０１と検出窓６０２の材質として、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。また、検出窓６０２の厚さは０.１７mmとする。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）６０６およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）６０７から発振するレーザ光６０８および６０９を、レーザ光６０９のみをλ／４板６１０によって円偏光し、ダイクロイックミラー６１１（４１０ｎｍ以下を反射）によって、２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ６１２によって集光し、その後、プリズム６１３を介してデバイス６０５へ臨界角以上で照射する。本装置によれば、レーザ照射により、デバイス６０５表面上に存在する金属体において局在型表面プラズモンが発生し、第二の金属に結合したプローブにより捕捉された標的物質の蛍光体は蛍光増強場内に存在することになる。蛍光体はレーザ光で励起され、その増強された蛍光の一部は検出窓６０２を介して出射される。また、検出窓６０２より出射される蛍光は、対物レンズ６１４（×６０，ＮＡ１.３５，作動距離０.１５mm）により平行光束とされ、光学フィルタ６１５により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ６１６により２次元ＣＣＤカメラ６１７上に結像される。
【００５４】
尚、上記実施例では、標識ヌクレオチドを蛍光により検出するものを中心に説明したが、公知の発光技術を応用し、検出してもよい。また、標的核酸がｍＲＮＡであるものを中心に説明したが、標的核酸が、ｍｉＲＮＡ，ｃＤＮＡ，ＤＮＡであってもよい。また、プローブが、オリゴヌクレオチドあるもの中心に説明したが、ＤＮＡ断片，ＲＮＡ断片，ＰＮＡ，抗体，ペプチドのいずれかであってもよい。
【符号の説明】
【００５５】
１０１ 基板
１０２〜１０４ 反応場
１０５ プローブ
１０６〜１０８ プローブにハイブリした標的核酸
１０９ プローブにハイブリしていない標的核酸
６０１ カバープレート
６０２ 検出窓
６０３ 注入口
６０４ 排出口
６０５ デバイス
６０６ ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）
６０７ ＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）
６０８，６０９ レーザ光
６１０ λ／４板
６１１ ダイクロイックミラー
６１２ レンズ
６１３ プリズム
６１４ 対物レンズ
６１５ 光学フィルタ
６１６ 結像レンズ
６１７ ２次元ＣＣＤカメラ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の反応場を有する核酸分析デバイスに対して、ヌクレオチド、蛍光色素を有するヌクレオチド、核酸合成酵素、プローブ、及び標的核酸を供給する工程と、
核酸分析デバイスに光を照射する工程と、
ヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出工程と、を含む、核酸分析方法であって、
反応場の数は、４００万個以上であり、
反応場の数は、標的核酸の１０倍以上であり、
プローブの数は、１反応場あたり１００〜１０００個であることを特徴とする、核酸分析方法。
【請求項２】
請求項１において、
各反応場間の距離が２００ｎｍ以上であることを特徴とする核酸分析方法。
【請求項３】
請求項１において、
前記標的核酸が、ｍＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ，ｃＤＮＡ，ＤＮＡのいずれかであることを特徴とする核酸分析方法。
【請求項４】
請求項１において、
前記標的核酸が、非増幅の核酸であることを特徴とする核酸分析方法。
【請求項５】
請求項１において、
前記プローブが、オリゴヌクレオチド，ＤＮＡ断片，ＲＮＡ断片，ＰＮＡ，抗体，ペプチドのいずれかであることを特徴とする核酸分析方法。
【請求項６】
複数の反応場を有する核酸分析デバイスに対して、ヌクレオチド、発光色素を有するヌクレオチド、核酸合成酵素、プローブ、及び標的核酸を供給する工程と、
核酸分析デバイスに光を照射する工程と、
ヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により取り込まれた発光色素の発光を測定する発光検出工程と、を含む、核酸分析方法であって、
反応場の数は、４００万個以上であり、
反応場の数は、標的核酸の１０倍以上であり、
プローブの数は、１反応場あたり１００〜１０００個であることを特徴とする、核酸分析方法。
【請求項１】
複数の反応場を有する核酸分析デバイスに対して、ヌクレオチド、蛍光色素を有するヌクレオチド、核酸合成酵素、プローブ、及び標的核酸を供給する工程と、
核酸分析デバイスに光を照射する工程と、
ヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出工程と、を含む、核酸分析方法であって、
反応場の数は、４００万個以上であり、
反応場の数は、標的核酸の１０倍以上であり、
プローブの数は、１反応場あたり１００〜１０００個であることを特徴とする、核酸分析方法。
【請求項２】
請求項１において、
各反応場間の距離が２００ｎｍ以上であることを特徴とする核酸分析方法。
【請求項３】
請求項１において、
前記標的核酸が、ｍＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ，ｃＤＮＡ，ＤＮＡのいずれかであることを特徴とする核酸分析方法。
【請求項４】
請求項１において、
前記標的核酸が、非増幅の核酸であることを特徴とする核酸分析方法。
【請求項５】
請求項１において、
前記プローブが、オリゴヌクレオチド，ＤＮＡ断片，ＲＮＡ断片，ＰＮＡ，抗体，ペプチドのいずれかであることを特徴とする核酸分析方法。
【請求項６】
複数の反応場を有する核酸分析デバイスに対して、ヌクレオチド、発光色素を有するヌクレオチド、核酸合成酵素、プローブ、及び標的核酸を供給する工程と、
核酸分析デバイスに光を照射する工程と、
ヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により取り込まれた発光色素の発光を測定する発光検出工程と、を含む、核酸分析方法であって、
反応場の数は、４００万個以上であり、
反応場の数は、標的核酸の１０倍以上であり、
プローブの数は、１反応場あたり１００〜１０００個であることを特徴とする、核酸分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−２２３１９７（Ｐ２０１２−２２３１９７Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１６２２５７（Ｐ２０１２−１６２２５７）
【出願日】平成２４年７月２３日（２０１２．７．２３）
【分割の表示】特願２００８−１７５１７２（Ｐ２００８−１７５１７２）の分割
【原出願日】平成２０年７月４日（２００８．７．４）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年７月２３日（２０１２．７．２３）
【分割の表示】特願２００８−１７５１７２（Ｐ２００８−１７５１７２）の分割
【原出願日】平成２０年７月４日（２００８．７．４）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
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