核酸増殖装置及び温度制御方法
【課題】増殖反応の検出精度を向上し得る核酸増殖装置及び温度制御方法を提案する。
【解決手段】核酸の増殖反応の場として基板に形成される複数の容器が収容される反応室に対して外部であって、大気に触れる位置に設けられる外部感温素子を用いて外気温を検出し、温度と、熱源素子での発熱に要する信号量とを示す一次関数の切片を、外気温に応じて決定し、該決定した切片でなる一次関数を用いて、熱源素子に与えるべき信号量を決定する。
【解決手段】核酸の増殖反応の場として基板に形成される複数の容器が収容される反応室に対して外部であって、大気に触れる位置に設けられる外部感温素子を用いて外気温を検出し、温度と、熱源素子での発熱に要する信号量とを示す一次関数の切片を、外気温に応じて決定し、該決定した切片でなる一次関数を用いて、熱源素子に与えるべき信号量を決定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸増殖装置及び温度制御方法に関し、ＰＣＲ (Polymerase Chain reaction) 装置に好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸の増殖反応の場となる複数の微小容器に対する熱源として、薄膜トランジスタを用いるようにしたリアルタイムＰＣＲ装置が本出願人により提案されている（例えば特許文献１）。
【０００３】
このリアルタイムＰＣＲ装置における増殖反応の検出系として、微小容器に入れられる蛍光物質の励起光を照射する光源と、該励起光によって励起される蛍光物質の蛍光を受光する受光素子とが、微小容器ごとに設けられている。
【特許文献１】特開２００３−２９８０６８公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、各光源には一般に製造上のばらつきがあるため、当該光源に対する制御を同一としても、このばらつきに起因して各微小容器に対する励起光量が相違する。この相違は、受光素子から微小容器での増殖反応結果として出力される信号に反映されるため、該信号に示される核酸量の信頼性が乏しいものとなってしまう。
【０００５】
本発明は以上の点を考慮してなされたもので、増殖反応の検出精度を向上し得る核酸増殖装置及び温度制御方法を提案しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる課題を解決するため本発明は、核酸増殖装置であって、核酸の増殖反応の場として基板に形成される複数の容器にそれぞれ対応付けられる熱源素子と、複数の容器が収容される反応室に対して外部の大気に触れる位置に設けられる外部感温素子と、温度と、熱源素子での発熱に要する信号量とを示す一次関数の切片を、外部感温素子から得られる外気温に応じて決定し、該切片でなる一次関数を用いて、熱源素子に与えるべき信号量を決定する決定部とをもつ。
【０００７】
また本発明は、温度制御方法であって、核酸の増殖反応の場として基板に形成される複数の容器が収容される反応室に対して外部であって、大気に触れる位置に設けられる外部感温素子を用いて外気温を検出する検出ステップと、温度と、熱源素子とでの発熱に要する信号量とを示す一次関数の切片を、外気温に応じて決定する外気温決定ステップと、決定ステップで決定される切片でなる一次関数を用いて、熱源素子に与えるべき信号量を決定する信号量決定ステップとを経る。
【発明の効果】
【０００８】
本発明では、外気温に応じた切片でなる一次関数を用いて熱源素子に与えるべき信号量を決定することにより、該外気温を基準として、使用環境に依存させずに増殖反応の場の発熱を制御することが可能となる。したがって、使用環境にかかわらず増殖反応の検出精度を維持できるので、その分だけ検出精度を向上することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下図面について、本発明を適用した一実施の形態を詳述する。
【００１０】
（１）リアルタイムＰＣＲ装置の構造
図１において、本実施の形態によるリアルタイムＰＣＲ装置１の構造を示す。このリアルタイムＰＣＲ装置１は、反応室１１に対して、複数の基板１１〜１７を所定間隔で層状に配置した構造を有する。
【００１１】
反応基板１２は、基準層となる基板であり、該基板には、核酸の増殖反応の場とされる容器（以下、これをウェルとも呼ぶ）ＵＬが高密度に形成される。これらウェルＵＬには、増殖対象の標的核酸及びその標的核酸の増殖に要する各種物質（プライマー、緩衝液、酵素、ｄＮＴＰ、蛍光色素等）が与えられる。
【００１２】
例えば６［ｃｍ］四方の反応基板１２を用いた場合、１［μＬ］以下の容量でなる４万個程度のウェルＵＬを形成することが可能となる。したがってこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、反応室１１を小型化した場合であっても、同種又は異種でなる多くの標的核酸を取り扱うことが可能となる。
【００１３】
発熱基板１３は、反応基板１２に対して下側の層として配される基板であり、該基板のうち、反応基板１２と対向する面には、各ウェルＵＬにそれぞれ対応付けて熱源素子ＨＤが配され、これら熱源素子ＨＤの周囲には複数の感温素子ＴＤが配される。この熱源素子ＨＤには例えばＴＦＴ(Thin Film Transistor)等が用いられ、感温素子ＴＤには例えばピンダイオード等が用いられる。
【００１４】
このリアルタイムＰＣＲ装置１では、各ウェルＵＬに対応する熱源素子ＨＤが、該熱源素子ＨＤを囲む複数の感温素子ＴＤからセンシングされる温度に応じて個別に制御される。
【００１５】
これによりこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、例えば各ウェルＵＬに与えられる標的核酸の種が異なる等に起因して温度条件が異なる場合であっても、高密度に配される各ウェルＵＬの温度を、増殖サイクルとして規定される変性ステージ、アニーリングステージ、伸長ステージの各ステージに要する温度を基準として高精度で調整することができる。この結果、リアルタイムＰＣＲ装置１は、温度に起因する増殖反応結果の誤り率を低減して検出精度を向上し得るようになされている。
【００１６】
発熱補助基板１４は、発熱基板１３に対して下側の層として配される基板である。この発熱補助基板１４は、反応室１１全体における熱を吸収又は発散することで、該反応室１１を設定温度に維持する。
【００１７】
したがってこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、現ステージで設定される温度から次ステージで設定すべき温度にウェルＵＬの温度を移行させるまでの時間（温度勾配の時間）を高速化できるようになされている。ちなみに、発熱補助基板１４には例えばペルチェ素子等が用いられる。
【００１８】
発光基板１５は、反応基板１２に対して上側の層として配される基板であり、該基板のうち、反応基板１２と対向する面には、各ウェルＵＬにそれぞれ対応させて、インターカレータ等の蛍光物に対する励起光を照射する光源素子ＬＳが配される。この光源素子ＬＳには例えばＬＥＤ(Light Emitting Diode)が用いられる。
【００１９】
励起光透過基板１６は、反応基板１２と発光基板１５との中間層として配される基板であり、光源素子ＬＳから照射される励起光を透過し、該励起光以外の光を反射する。この励起光透過基板１６には例えばダイクロイックミラーが用いられる。
【００２０】
この励起光透過基板１６のうち発光基板１５と対向する面には、該発光基板１５の各光源素子ＬＳの光軸に対応する位置を基準とする周囲に対して、当該光源素子ＬＳから照射される励起光の散乱光を受光する受光素子ＬＤＢが配される。
【００２１】
このリアルタイムＰＣＲ装置１では、１回の増殖サイクルが終了した時点で直ちに次の増殖サイクルを開始するのではなく、図２に示すように、各回の増殖サイクルの終了時点から、光源素子ＬＳの光量を調整するための期間（以下、これをキャリブレーション期間とも呼ぶ）ＣＦが設けられている。そしてこのキャリブレーション期間ＣＦごとに、各受光素子ＬＤＢで受光される散乱光量が一定となるように、各ウェルＵＬに対応する光源素子ＬＳの光量が個別に制御される。
【００２２】
これによりこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、各光源素子ＬＳにおける製造上のばらつきのみならず、当該光源素子ＬＳの経時的変動があっても、各ウェルＵＬに到達される励起光量を一定とすることができる。この結果、リアルタイムＰＣＲ装置１は、励起光によって励起される蛍光量を、各ウェルＵＬでの核酸量自体を反映したものとして検出精度を向上し得るようになされている。
【００２３】
蛍光透過基板１７は、発熱基板１３と発熱補助基板１４との中間層として配される基板であり、励起光によって励起される蛍光物の蛍光を透過し、該蛍光以外の光を反射する。また発熱補助基板１４と対向する面には、各ウェルＵＬにそれぞれ対応させて、当該ウェルで励起される蛍光を受光する受光素子ＬＤＡが配される。リアルタイムＰＣＲ装置１では、これら受光素子ＬＤＡで受光される蛍光量に応じた標的核酸量が、増殖サイクル単位で算出される。
【００２４】
またこのリアルタイムＰＣＲ装置１では、現在と前回のキャリブレーション期間で得られた散乱光量に差がある場合、その差を有する散乱光量を照射する光源素子ＬＳに対応付けられるウェルＵＬでの標的核酸量が、該差に応じて調整される。
【００２５】
これによりこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、光源素子ＬＳに経時的変動があったとしても標的核酸量を、励起光量を基準として均一化できるようになされている。
【００２６】
（２）温度制御ユニットの構成
次に、このリアルタイムＰＣＲ装置１における温度制御ユニットの構成について説明する。温度制御ユニットは、図３に示すように、ウェル数に対応する複数対の発熱回路２０１及び温度センシング回路３０１……発熱回路２０ｎ及び温度センシング回路３０ｎと、環境温度センシング回路４０と、温度制御部５０とを含む構成とされる。
【００２７】
（２−１）発熱回路及び温度センシング回路の構成
発熱回路２０１〜２０ｎ及び温度センシング回路３０１〜３０ｎは、励起光が透過可能な例えばガラス等でなる発熱基板１３（図１）に設けられる。
【００２８】
各発熱回路２０１〜２０ｎはそれぞれ１つのＴＦＴ２０Ｘを有し、これらＴＦＴ２０Ｘは、図４に示すように、発熱基板１３の一面に対して、反応基板１２（図１）に形成される各ウェルにそれぞれ対応させてマトリクス状に配される。
【００２９】
一方、各温度センシング回路３０はそれぞれ複数のピンダイオード（以下、これをピンダイオード群とも呼ぶ）３０Ｘを有し、これらピンダイオード群３０Ｘは、図４に示したように、各発熱回路２０１〜２０ｎがもつＴＦＴ２０Ｘの周囲に一定の距離をもって所定間隔ごとに配される。
【００３０】
ここで、発熱回路２０及び温度センシング回路３０における具体的な回路構成例を挙げる。ただし、各対の発熱回路２０１及び温度センシング回路３０１……発熱回路２０ｎ及び温度センシング回路３０ｎはそれぞれ同一の構成であるため、１対の発熱回路２０１及び温度センシング回路３０１に着目して説明する。
【００３１】
図５に示すように、発熱回路２０１は、熱源素子ＨＤ（図１）として機能するＴＦＴ２０Ｘと、スイッチング素子として機能するトランジスタＴ１，Ｔ２，Ｔ３と、発熱制御素子として機能するコンデンサＣ１とを有する。
【００３２】
一方、温度センシング回路３０１は、感温素子ＴＤ（図１）として機能するピンダイオード群３０Ｘと、スイッチング素子として機能するトランジスタＴ４，Ｔ５と、電圧計ＶＰとを有する。
【００３３】
発熱回路２０１におけるトランジスタＴ１，Ｔ２，Ｔ３のゲートには、パルス信号ＰＳ１が温度制御部５０における走査駆動部５１（図３）から与えられ、温度センシング回路３０１におけるトランジスタＴ３，Ｔ４のゲートには、パルス信号ＰＳ１とは反転した関係にあるパルス信号ＰＳ２が走査駆動部５１から与えられる。
【００３４】
例えば、パルス信号ＰＳ１が「Ｈｉｇｈ」状態にある場合（発熱回路２０１が駆動状態にある場合）、パルス信号ＰＳ２が「Ｌｏｗ」状態にある（温度センシング回路３０１が非駆動状態にある）。この状態では、発熱回路２０１におけるトランジスタＴ１，Ｔ２はオン状態にあり、発熱回路２０１におけるトランジスタＴ３と、温度センシング回路３０１におけるトランジスタＴ４，Ｔ５はオフ状態にある。
【００３５】
この状態の場合、発熱回路２０１には、発熱に要する信号（以下、これを発熱制御信号とも呼ぶ）Ｉｓｉｇが温度制御部５０における制御信号送出部５３（図３）から与えられる。発熱回路２０１では、ＴＦＴ２０ＸにおけるドレインとゲートがトランジスタＴ２により短絡されているため、発熱制御信号ＩｓｉｇはトランジスタＴ１を介してＴＦＴ２０Ｘに流れる。
【００３６】
この結果、ＴＦＴ２０Ｘには、発熱制御信号Ｉｓｉｇに応じたゲート・ソース間電圧が発生し、この電圧が、ＴＦＴ２０Ｘに発生させるべき熱源要素として、コンデンサＣ１に保持されることとなる。
【００３７】
ＴＦＴ２０Ｘがエンハンスメント型トランジスタ（すなわち閾値Ｖｔｈ＞０）である場合、該ＴＦＴ２０Ｘは飽和領域で動作することになるので、ＴＦＴ２０Ｘにおけるゲート・ソース間電圧をＶｇｓとすると、該電圧Ｖｇｓと発熱制御信号Ｉｓｉｇとの間には、次式
【００３８】
【数１】
【００３９】
の関係が成立する。ちなみにこの（１）式における「μ」はキャリアの移動度を、「Ｃｏｘ」は単位面積当たりのゲート容量を、「Ｗ」はチャネルの幅を、「Ｌ」はチャネルの長さを示す記号である。
【００４０】
これに対して、パルス信号ＰＳ１が「Ｌｏｗ」状態にある場合（発熱回路２０１が非駆動状態にある場合）、パルス信号ＰＳ２が「Ｈｉｇｈ」状態にある（温度センシング回路３０１が非駆動状態にある）。この状態における発熱回路２０１では、トランジスタＴ１，Ｔ２はオフ状態にあり、トランジスタＴ３がオン状態にあるため、電源電圧ＶＤＤからＴＦＴ２０Ｘにおけるソース端のグランドに向かって電流が流れる。
【００４１】
電源電圧ＶＤＤからＴＦＴ２０Ｘに与えられる電圧は、該ＴＦＴ２０Ｘが飽和領域で動作する電圧よりも高く設定される。つまり、ＴＦＴ２０Ｘが飽和領域で動作するように、該ＴＦＴ２０Ｘに対する電源電圧ＶＤＤは十分に高く、トランジスタＴ３のオン抵抗は十分に低く設定される。
【００４２】
したがって、ＴＦＴ２０Ｘに流れる電流Ｉｄｒｖはドレイン・ソース間電圧Ｖｄｓには依存せず、次式
【００４３】
【数２】
【００４４】
によって与えられる。
【００４５】
一般に、ＴＦＴでは（１）式及び（２）式の右辺に現れる各パラメータがばらつくものであるが、この発熱回路２０１では、ＴＦＴ２０Ｘが飽和領域で動作するので、該パラメータの値に関係なく、電流Ｉｄｒｖと発熱制御信号Ｉｓｉｇとは一致することとなる。
【００４６】
したがって、ＴＦＴ２０Ｘでの発熱量は、該ＴＦＴ２０Ｘの特性ばらつきによらず、温度制御部５０（図３）から与えられる発熱制御信号Ｉｓｉｇの電流値と、電源電圧ＶＤＤとの積で決まる正確なものとなる。
【００４７】
また発熱制御信号Ｉｓｉｇは、発熱調整部５２（図３）において、その電流値を正確に可変することができるものである。したがって、この発熱回路２０１は、温度制御部５０（図３）での電流制御によって、ＴＦＴ２０Ｘを通じてウェルに対する温度を正確に可変することが可能となる。
【００４８】
一方、温度センシング回路３０１には、パルス信号ＰＳ１が「Ｌｏｗ」状態（発熱回路２０１が非駆動状態）、かつ、パルス信号ＰＳ２が「Ｈｉｇｈ」状態（温度センシング回路３０１が駆動状態）にある場合、固定値の側温制御信号Ｉｄｅｔが温度制御部５０における制御信号送出部５３（図３）から与えられる。
【００４９】
この場合、温度センシング回路３０では、側温制御信号ＩｄｅｔはトランジスタＴ４を介して直列に接続された複数のピンダイオード群３０Ｘに流れる。この結果、これらピンダイオード群３０Ｘには電圧が加わり、該電圧が電圧計ＶＰによって計測されることになる。
【００５０】
この電圧計３２における計測値は、温度制御部５０（図３）によってＴＦＴ２０Ｘ周囲における平均的な温度を示すパラメータとして取り込まれ、該温度制御部５０（図３）において、発熱制御信号Ｉｓｉｇの電流値を決定するために用いられる。
【００５１】
このようにして各対の発熱回路２０及び温度センシング回路３０は、温度制御部５０（図２）の制御のもとで動作するようになされている。
【００５２】
（２−２）環境温度センシング回路の構成
一方、環境温度センシング回路４０（図２）は、図６に示すように、電源電圧ＶＤＤに接続されるブリッジ回路４１と、該ブリッジ回路４１の後段に接続される差動増幅器４２とを有する。
【００５３】
このブリッジ回路４１を構成する４つの抵抗４１Ａ〜４１Ｄのうち１つの抵抗４１Ａは感温素子とされ、例えばこのリアルタイムＰＣＲ装置１における筐体等のように、反応室１１の外部における大気に触れる位置に設けられる。したがって、抵抗４１Ａは外気温に応じて可変する。一方、抵抗４１Ｂ〜４１Ｄは固定抵抗とされる。
【００５４】
この環境温度センシング回路４０では、感温素子として機能する抵抗４１Ａの抵抗値が外気温に応じて可変すると、この可変量に応じた電圧差Ｖｍが差動増幅器４２に生じる。この結果、この環境温度センシング回路４０から出力される信号は、外気温に応じた値の信号として得られることとなる。
【００５５】
ちなみにこの図６における抵抗Ｒ４２は差動増幅器４２に対するゲインを調整するための抵抗である。例えば、ＡＤ８２２４の差動ハイインピーダンスアンプを用いた場合、抵抗Ｒ４２を１００［ｋΩ］とすると、差動増幅器４２全体としてのゲインを１．５［Ω］とすることができる。
【００５６】
（２−３）温度制御部の構成
他方、温度制御部５０は、図３に示したように、走査駆動部５１、発熱調整部５２、制御信号送出部５３及びＡ／Ｄ(Analog/Digital)変換部５４を含む構成とされる。
【００５７】
走査駆動部５１は、各発熱回路２０１〜２０ｎに対して、所定間隔ごとに駆動期間をもつ同位相又は異位相のパルス信号（ＰＳ１（図５））を送出する一方、各温度センシング回路３０１〜３０ｎに対して、対とされる発熱回路２０に送出されるパルス信号とは反転した関係にあるパルス信号（ＰＳ２（図５））を送出する。これにより走査駆動部５１は、各発熱回路２０１及び温度センシング回路３０１……発熱回路２０ｎ及び温度センシング回路３０ｎを対ごとに循環駆動させるようになされている。
【００５８】
発熱調整部５２には、各温度センシング回路３０から、ＴＦＴ２０Ｘ周囲における平均的な温度（以下、これを熱源周囲平均温とも呼ぶ）を示す信号が、Ａ／Ｄ変換部５５を介してデータとして与えられる。また発熱調整部５２には、環境温度センシング回路４０から、外気温を示す信号が、Ａ／Ｄ変換部５５を介してデータとして与えられる。
【００５９】
発熱調整部５２は、ＣＰＵ(Central Processing Unit)、発熱調整プログラムが格納されるＲＯＭ(Read Only Memory) 、該ＣＰＵのワークメモリとしてのＲＡＭ(Random Access Memory)を含む構成とされる。
【００６０】
この発熱調整部５２は、発熱調整プログラムと、熱源周囲平均温及び外気温とに基づいて、各発熱回路２０１〜２０ｎに対する発熱制御信号Ｉｓｉｇの電流値を決定することによって、各発熱回路２０１〜２０ｎにおけるＴＦＴ２０Ｘでの発熱量を調整する。
【００６１】
制御信号送出部５３は、発熱調整部５２により決定される電流値の信号（発熱制御信号Ｉｓｉｇ（図５））を生成し、これを該当する発熱回路に対して、該発熱回路が駆動対象にあるときに送出する。
【００６２】
また制御信号送出部５３は、固定値の信号（側温制御信号Ｉｄｅｔ（図５））を、各温度センシング回路３０１〜３０ｎに対して駆動状態となった際にそれぞれ送出する。
【００６３】
（３）温度制御処理の具体的な処理内容
次に、発熱調整部５２における温度制御処理の具体的な処理内容を、図７に示すフローチャートを用いて説明する。
【００６４】
すなわち発熱調整部５２は、増殖反応を実行すべき命令が与えられた場合、この温度制御処理手順を開始し、第１のステップＳＰ１として、外気温を検出する。具体的には、環境温度センシング回路４０から、Ａ／Ｄ変換部５５を介して与えられるデータの値に比例する温度を外気温として演算により検出する。
【００６５】
発熱調整部５２は、第２のステップＳＰ２として、温度と、ＴＦＴ２０Ｘでの発熱に要する信号量（電流量）との比（傾き）を一定とする一次関数（以下、これを電流温度一次関数とも呼ぶ）に対する切片を、ステップＳＰ１で検出した外気温との関係で決定する。具体的には、例えば、図８に示すように、電流温度一次関数（ｙ＝ａｘ＋ｂ）の切片（ｂ）が「０」となるときの外気温度を基準とし、ステップＳＰ１で検出した外気温との差に比例する値とする。
【００６６】
発熱調整部５２は、第３のステップＳＰ３として、各ウェルが達すべき目標温度を、増殖サイクルのステージと、当該ウェルにおける標的核酸の種との関係でそれぞれ決定する。具体的には、各ステージに要する温度（変性ステージでは９５［℃］、アニーリングステージでは５５［℃］、伸長ステージでは７２［℃］）に対して、標的核酸の種に割り当てられる比率分を増減する。
【００６７】
発熱調整部５２は、第４のステップＳＰ４として、駆動対象の温度センシング回路３０に対の発熱回路２０での熱源周囲平均温を算出する。例えば、温度センシング回路３０１が駆動対象となる場合、該温度センシング回路３０１に対して１００［μＡ］の側温制御信号Ｉｄｅｔ１と、１０［μＡ］の側温制御信号Ｉｄｅｔ２とを与え、これらを与えたときの電圧計ＶＰ（図５）の計測値をΔＶとすると、次式
【００６８】
【数３】
【００６９】
により発熱回路２０１での熱源周囲平均温を算出する。ちなみに、ΔＶは、側温制御信号Ｉｄｅｔ１を与えたときの電圧値と、側温制御信号Ｉｄｅｔ２を与えたときの電圧値との差であり、また（３）式における「５．００７２」はボルツマン定数である。
【００７０】
発熱調整部５２は、第５のステップＳＰ５として、第４のステップＳＰ４で算出した熱源周囲平均温と、第３のステップＳＰ３で決定した目標温度との温度差を求める。そして発熱調整部５２は、この温度差に相当する電流値を、第２のステップＳＰ２で決定した切片でなる電流温度一次関数を用いて算出する。
【００７１】
この結果、ステップＳＰ３で算出対象とされた温度センシング回路３０に対の発熱回路２０に対して、該発熱回路２０が駆動対象となったときに、その熱源周囲平均温と目標温度との温度差に応じた電流値の発熱制御信号Ｉｓｉｇ（図５）が、使用環境に依存することなく与えられることとなる。
【００７２】
このようにして発熱調整部５２は、第４，第５のステップＳＰ４，ＳＰ５において、発熱回路２０に対の温度センシング回路３０で測定した熱源周囲平均温と目標温度との温度差に応じて、発熱回路２０に対する発熱量を個別に調整し得るようになされている。
【００７３】
発熱調整部５２は、第６のステップＳＰ６として、増殖サイクルにおける変性ステージ，アニーリングステージ又は伸長ステージへの移行タイミングであるか否かを判定する。ちなみに、移行タイミングの計測は、１回目の増殖サイクルにおける変性ステージの開始時点に同期して行われる。
【００７４】
ここで、移行タイミングであると判定した場合、発熱調整部５２は、第７のステップＳＰ７として、ウェルが達すべき目標温度を、その移行すべきステージに要する温度（９５℃、５５℃又は７２℃）に対して、標的核酸の種に割り当てられる比率分を増減した温度に変更した後、次の第８のステップＳＰ８に進む。
【００７５】
一方、移行タイミングではないと判定した場合、発熱調整部５２は、第７のステップＳＰ７を経ることなく、次の第８のステップＳＰ８に進む。
【００７６】
発熱調整部５２は、第８のステップＳＰ８として、規定された回数分の増殖サイクルを終えたか否かを判定し、該増殖サイクルを終えたと判定するまで、上述の各ステップＳＰ４〜ＳＰ７での処理を繰り返す。また発熱調整部５２は、規定された回数分の増殖サイクルを終えたと判定した場合には、この温度制御処理手順を終了するようになされている。
【００７７】
（４）動作及び効果
以上の構成において、このリアルタイムＰＣＲ装置１では、反応室１１（図１）の外部に対して、該リアルタイムＰＣＲ装置１が使用される大気中の温度を感温する外部感温素子（抵抗４１Ａ）が配される（図６）。
【００７８】
そしてこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、温度と、ＴＦＴ２０Ｘ（図３）での発熱に要する信号量とを示す一次関数（電流温度一次関数）の切片を、外部感温素子（抵抗４１Ａ）から得られる外気温に応じて決定し、該切片でなる電流温度一次関数を用いて、ＴＦＴ２０Ｘに与えるべき信号量を決定する。
【００７９】
したがって、このリアルタイムＰＣＲ装置１は、外部感温素子（抵抗４１Ａ）から得られる外気温を基準として、使用環境に依存させずに各ウェルＵＬの発熱を制御することが可能となる。
【００８０】
従来、リアルタイムＰＣＲ装置１は実験室等に据え置き型とされ、該実験室の温度を一定に管理していた。このリアルタイムＰＣＲ装置１のように、熱源素子にＴＦＴ２０Ｘ等を適用すると、１［μＬ］以下の容量でなる４万個程度のウェルＵＬを形成することが可能となり、この結果、リアルタイムＰＣＲ装置１全体の小型化も可能となる。そうすると、リアルタイムＰＣＲ装置１は実験室等に据え置きすることなく実験場所に搬送し、その場で使用されることが想定される。
【００８１】
したがって、その場の温度を検温して入力するといったこともなく、当該雰囲気中の外気温を基準として、使用環境に依存させずに各ウェルＵＬの発熱を自動的に制御可能となるということは、使用環境にかかわらず検出精度を維持できる点で有用となる。
【００８２】
かかる構成に加えてこの実施の形態におけるリアルタイムＰＣＲ装置１では、各熱源素子（ＴＦＴ２０Ｘ）の周囲に設けられる感温素子ＴＤ（図１）を用いて、当該熱源素子での温度が温度センシング回路３０（図３）でそれぞれ求められる。
【００８３】
そしてリアルタイムＰＣＲ装置１は、ウェルＵＬが達すべき目標温度と、温度センシング回路３０で求められた温度差と、外気温に応じた切片でなる一次関数（電流温度一次関数）とを用いて、熱源素子（ＴＦＴ２０Ｘ）ごとに、当該熱源素子に与えるべき信号量を決定する。
【００８４】
したがって、リアルタイムＰＣＲ装置１は、反応室１１に対して外部での温度と、該反応室１１に対して内部での温度との変動にかかわらず、各ウェルＵＬに対する発熱量を適応的に制御することができる。この結果、このリアルタイムＰＣＲ装置１では、ウェル温度に至るまでそのウェル温度に応じた固定の電流値でなる発熱制御信号を与え続ける場合に比して、温度勾配を滑らかに（一定に）推移させることができ、急激な温度変化に起因する標的核酸等の劣化を回避することもできる。
【００８５】
以上の構成によれば、外部感温素子から得られる外気温を基準として、使用環境に依存させずに各ウェルＵＬの発熱を制御できるようにしたことにより、該外部感温素子の変動による増殖反応での影響を回避することができ、この結果、増殖反応の検出精度を向上し得るリアルタイムＰＣＲ装置１を実現できる。
【００８６】
（５）他の実施の形態
上述の実施の形態では、発熱回路２０として図３に示す回路構成が適用された。しかしながら、回路構成はこの実施の形態に限定されるものではない。例えば、温度センシング回路３０とは独立した回路として構成する、あるいは、電圧値の可変により加熱量を制御する回路構成とする等、種々の回路構成を適用することができる。
【００８７】
上述の実施の形態では、環境温度センシング回路４０の構成として図６示す回路構成が適用された。しかしながら、回路構成はこの実施の形態に限定されるものではない。例えば、温度センシング回路３０と同じ回路構成とする等、種々の回路構成を適用することができる。
【００８８】
また上述の実施の形態ＰＣＲ法を適用したがこれ以外の増殖反応法を適用することができる。例えば、ｄｓＤＮＡからＲＮＡを得るＩＶＴ(In Vitro Transcription)法、逆転写酵素のＲＮａｓｅ活性を用いてＲＮＡをトリミングしてＲＮＡを得るＴＲＣ(Transcription Reverse transcription Concerted amplification)法、ＲＮＡポリメラ−ゼを用いてＲＮＡプロモーターが組み込まれたｄｓＤＮＡからＲＮＡを得るＮＡＳＢＡ(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)法、ＲＮＡとＤＮＡのキメラ構造からなるプライマーを利用し、ＲＮＡからｓｓＤＮＡを得るＳＰＩＡ法、ＤＮＡのループ形成を利用し、一定の温度でＤＮＡをＲＮＡからｄｓＤＮＡを得るＬＡＭＰ(Loop-Mediated Isothermal Amplification)法、複数の酵素を組み合わせて一塩基多型（ＳＮＰ(Single Nucleotide Polymorphism)）を識別しながらｄｓＤＮＡを得るＳＭＡＰ(SMart Amplification Process)法、ＤＮＡとＲＮＡが結合したキメラプライマーを用いてｄｓＤＮＡを得るＩＣＡＮ法(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification)法などが挙げられる。
【００８９】
また上述の実施の形態では、リアルタイムＰＣＲ装置１として、いわゆる透過型のものが適用された。しかしながら、これに代えて、例えば、図１との対応部分に同一符号を付した図９に示すように、いわゆる反射型のリアルタイムＰＣＲ装置１００を適用するようにしてもよい。
【００９０】
このリアルタイムＰＣＲ装置１００における反応基板１２１には、側壁の底面がＲ状に形成された複数のウェルＵＬが形成され、これらウェルＵＬに対応させて受光素子ＬＤＡが一面に配される。各光源素子ＬＳから照射される励起光は、励起光透過基板１６を介して反応基板１２１に形成される対応するウェルＵＬに導光される。各ウェルＵＬでは、励起光によって励起される蛍光物の蛍光はウェルＵＬの壁面で反射し、反応基板１２１の一面に受光素子ＬＤＡに入射する。
【００９１】
このような反射型のリアルタイムＰＣＲ装置１００を適用した場合であっても、上述の実施の形態と同様の効果を得ることができる。
【００９２】
なお、リアルタイムＰＣＲ装置１又は１００の構成要素は図示した場合に限らず、適宜設計変更することができる。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明は、遺伝子解析、遺伝子診断又は医薬の創製などのバイオ産業上において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】リアルタイムＰＣＲ装置の概略構造を示す断面図である。
【図２】キャリブレーション期間の説明に供する略線図である。
【図３】温度制御ユニットの構成を示す概略図である。
【図４】発熱回路及び温度センシング回路の配置状態を示す概略図である。
【図５】発熱回路及び温度センシング回路の構成を示す図である。
【図６】環境温度センシング回路の構成を示す図である。
【図７】温度制御処理手順を示すフローチャートである。
【図８】電流温度一次関数の切片の決定の説明に供する略線図である。
【図９】他の実施の形態によるリアルタイムＰＣＲ装置の概略構造を示す断面図である。
【符号の説明】
【００９５】
１，１００……リアルタイムＰＣＲ装置、１１……反応室、１２，１１１……反応基板、１３……発熱基板、１４……発熱補助基板、１５……発光基板、１６……励起光透過基板、１７……蛍光透過基板、２０１〜２０ｎ……発熱回路、２０Ｘ……ＴＦＴ、Ｃ１……コンデンサ、３０１〜３０ｎ……温度センシング回路、３０Ｘ……ピンダイオード群、ＶＰ……電圧計、４０……環境温度センシング回路、４１……ブリッジ回路、４１Ａ……抵抗、４２……差動増幅器、５０……温度制御部、５１……走査駆動部、５２……発熱調整部、５３……制御信号送出部、５４……Ａ／Ｄ変換部。
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸増殖装置及び温度制御方法に関し、ＰＣＲ (Polymerase Chain reaction) 装置に好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸の増殖反応の場となる複数の微小容器に対する熱源として、薄膜トランジスタを用いるようにしたリアルタイムＰＣＲ装置が本出願人により提案されている（例えば特許文献１）。
【０００３】
このリアルタイムＰＣＲ装置における増殖反応の検出系として、微小容器に入れられる蛍光物質の励起光を照射する光源と、該励起光によって励起される蛍光物質の蛍光を受光する受光素子とが、微小容器ごとに設けられている。
【特許文献１】特開２００３−２９８０６８公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、各光源には一般に製造上のばらつきがあるため、当該光源に対する制御を同一としても、このばらつきに起因して各微小容器に対する励起光量が相違する。この相違は、受光素子から微小容器での増殖反応結果として出力される信号に反映されるため、該信号に示される核酸量の信頼性が乏しいものとなってしまう。
【０００５】
本発明は以上の点を考慮してなされたもので、増殖反応の検出精度を向上し得る核酸増殖装置及び温度制御方法を提案しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる課題を解決するため本発明は、核酸増殖装置であって、核酸の増殖反応の場として基板に形成される複数の容器にそれぞれ対応付けられる熱源素子と、複数の容器が収容される反応室に対して外部の大気に触れる位置に設けられる外部感温素子と、温度と、熱源素子での発熱に要する信号量とを示す一次関数の切片を、外部感温素子から得られる外気温に応じて決定し、該切片でなる一次関数を用いて、熱源素子に与えるべき信号量を決定する決定部とをもつ。
【０００７】
また本発明は、温度制御方法であって、核酸の増殖反応の場として基板に形成される複数の容器が収容される反応室に対して外部であって、大気に触れる位置に設けられる外部感温素子を用いて外気温を検出する検出ステップと、温度と、熱源素子とでの発熱に要する信号量とを示す一次関数の切片を、外気温に応じて決定する外気温決定ステップと、決定ステップで決定される切片でなる一次関数を用いて、熱源素子に与えるべき信号量を決定する信号量決定ステップとを経る。
【発明の効果】
【０００８】
本発明では、外気温に応じた切片でなる一次関数を用いて熱源素子に与えるべき信号量を決定することにより、該外気温を基準として、使用環境に依存させずに増殖反応の場の発熱を制御することが可能となる。したがって、使用環境にかかわらず増殖反応の検出精度を維持できるので、その分だけ検出精度を向上することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下図面について、本発明を適用した一実施の形態を詳述する。
【００１０】
（１）リアルタイムＰＣＲ装置の構造
図１において、本実施の形態によるリアルタイムＰＣＲ装置１の構造を示す。このリアルタイムＰＣＲ装置１は、反応室１１に対して、複数の基板１１〜１７を所定間隔で層状に配置した構造を有する。
【００１１】
反応基板１２は、基準層となる基板であり、該基板には、核酸の増殖反応の場とされる容器（以下、これをウェルとも呼ぶ）ＵＬが高密度に形成される。これらウェルＵＬには、増殖対象の標的核酸及びその標的核酸の増殖に要する各種物質（プライマー、緩衝液、酵素、ｄＮＴＰ、蛍光色素等）が与えられる。
【００１２】
例えば６［ｃｍ］四方の反応基板１２を用いた場合、１［μＬ］以下の容量でなる４万個程度のウェルＵＬを形成することが可能となる。したがってこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、反応室１１を小型化した場合であっても、同種又は異種でなる多くの標的核酸を取り扱うことが可能となる。
【００１３】
発熱基板１３は、反応基板１２に対して下側の層として配される基板であり、該基板のうち、反応基板１２と対向する面には、各ウェルＵＬにそれぞれ対応付けて熱源素子ＨＤが配され、これら熱源素子ＨＤの周囲には複数の感温素子ＴＤが配される。この熱源素子ＨＤには例えばＴＦＴ(Thin Film Transistor)等が用いられ、感温素子ＴＤには例えばピンダイオード等が用いられる。
【００１４】
このリアルタイムＰＣＲ装置１では、各ウェルＵＬに対応する熱源素子ＨＤが、該熱源素子ＨＤを囲む複数の感温素子ＴＤからセンシングされる温度に応じて個別に制御される。
【００１５】
これによりこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、例えば各ウェルＵＬに与えられる標的核酸の種が異なる等に起因して温度条件が異なる場合であっても、高密度に配される各ウェルＵＬの温度を、増殖サイクルとして規定される変性ステージ、アニーリングステージ、伸長ステージの各ステージに要する温度を基準として高精度で調整することができる。この結果、リアルタイムＰＣＲ装置１は、温度に起因する増殖反応結果の誤り率を低減して検出精度を向上し得るようになされている。
【００１６】
発熱補助基板１４は、発熱基板１３に対して下側の層として配される基板である。この発熱補助基板１４は、反応室１１全体における熱を吸収又は発散することで、該反応室１１を設定温度に維持する。
【００１７】
したがってこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、現ステージで設定される温度から次ステージで設定すべき温度にウェルＵＬの温度を移行させるまでの時間（温度勾配の時間）を高速化できるようになされている。ちなみに、発熱補助基板１４には例えばペルチェ素子等が用いられる。
【００１８】
発光基板１５は、反応基板１２に対して上側の層として配される基板であり、該基板のうち、反応基板１２と対向する面には、各ウェルＵＬにそれぞれ対応させて、インターカレータ等の蛍光物に対する励起光を照射する光源素子ＬＳが配される。この光源素子ＬＳには例えばＬＥＤ(Light Emitting Diode)が用いられる。
【００１９】
励起光透過基板１６は、反応基板１２と発光基板１５との中間層として配される基板であり、光源素子ＬＳから照射される励起光を透過し、該励起光以外の光を反射する。この励起光透過基板１６には例えばダイクロイックミラーが用いられる。
【００２０】
この励起光透過基板１６のうち発光基板１５と対向する面には、該発光基板１５の各光源素子ＬＳの光軸に対応する位置を基準とする周囲に対して、当該光源素子ＬＳから照射される励起光の散乱光を受光する受光素子ＬＤＢが配される。
【００２１】
このリアルタイムＰＣＲ装置１では、１回の増殖サイクルが終了した時点で直ちに次の増殖サイクルを開始するのではなく、図２に示すように、各回の増殖サイクルの終了時点から、光源素子ＬＳの光量を調整するための期間（以下、これをキャリブレーション期間とも呼ぶ）ＣＦが設けられている。そしてこのキャリブレーション期間ＣＦごとに、各受光素子ＬＤＢで受光される散乱光量が一定となるように、各ウェルＵＬに対応する光源素子ＬＳの光量が個別に制御される。
【００２２】
これによりこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、各光源素子ＬＳにおける製造上のばらつきのみならず、当該光源素子ＬＳの経時的変動があっても、各ウェルＵＬに到達される励起光量を一定とすることができる。この結果、リアルタイムＰＣＲ装置１は、励起光によって励起される蛍光量を、各ウェルＵＬでの核酸量自体を反映したものとして検出精度を向上し得るようになされている。
【００２３】
蛍光透過基板１７は、発熱基板１３と発熱補助基板１４との中間層として配される基板であり、励起光によって励起される蛍光物の蛍光を透過し、該蛍光以外の光を反射する。また発熱補助基板１４と対向する面には、各ウェルＵＬにそれぞれ対応させて、当該ウェルで励起される蛍光を受光する受光素子ＬＤＡが配される。リアルタイムＰＣＲ装置１では、これら受光素子ＬＤＡで受光される蛍光量に応じた標的核酸量が、増殖サイクル単位で算出される。
【００２４】
またこのリアルタイムＰＣＲ装置１では、現在と前回のキャリブレーション期間で得られた散乱光量に差がある場合、その差を有する散乱光量を照射する光源素子ＬＳに対応付けられるウェルＵＬでの標的核酸量が、該差に応じて調整される。
【００２５】
これによりこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、光源素子ＬＳに経時的変動があったとしても標的核酸量を、励起光量を基準として均一化できるようになされている。
【００２６】
（２）温度制御ユニットの構成
次に、このリアルタイムＰＣＲ装置１における温度制御ユニットの構成について説明する。温度制御ユニットは、図３に示すように、ウェル数に対応する複数対の発熱回路２０１及び温度センシング回路３０１……発熱回路２０ｎ及び温度センシング回路３０ｎと、環境温度センシング回路４０と、温度制御部５０とを含む構成とされる。
【００２７】
（２−１）発熱回路及び温度センシング回路の構成
発熱回路２０１〜２０ｎ及び温度センシング回路３０１〜３０ｎは、励起光が透過可能な例えばガラス等でなる発熱基板１３（図１）に設けられる。
【００２８】
各発熱回路２０１〜２０ｎはそれぞれ１つのＴＦＴ２０Ｘを有し、これらＴＦＴ２０Ｘは、図４に示すように、発熱基板１３の一面に対して、反応基板１２（図１）に形成される各ウェルにそれぞれ対応させてマトリクス状に配される。
【００２９】
一方、各温度センシング回路３０はそれぞれ複数のピンダイオード（以下、これをピンダイオード群とも呼ぶ）３０Ｘを有し、これらピンダイオード群３０Ｘは、図４に示したように、各発熱回路２０１〜２０ｎがもつＴＦＴ２０Ｘの周囲に一定の距離をもって所定間隔ごとに配される。
【００３０】
ここで、発熱回路２０及び温度センシング回路３０における具体的な回路構成例を挙げる。ただし、各対の発熱回路２０１及び温度センシング回路３０１……発熱回路２０ｎ及び温度センシング回路３０ｎはそれぞれ同一の構成であるため、１対の発熱回路２０１及び温度センシング回路３０１に着目して説明する。
【００３１】
図５に示すように、発熱回路２０１は、熱源素子ＨＤ（図１）として機能するＴＦＴ２０Ｘと、スイッチング素子として機能するトランジスタＴ１，Ｔ２，Ｔ３と、発熱制御素子として機能するコンデンサＣ１とを有する。
【００３２】
一方、温度センシング回路３０１は、感温素子ＴＤ（図１）として機能するピンダイオード群３０Ｘと、スイッチング素子として機能するトランジスタＴ４，Ｔ５と、電圧計ＶＰとを有する。
【００３３】
発熱回路２０１におけるトランジスタＴ１，Ｔ２，Ｔ３のゲートには、パルス信号ＰＳ１が温度制御部５０における走査駆動部５１（図３）から与えられ、温度センシング回路３０１におけるトランジスタＴ３，Ｔ４のゲートには、パルス信号ＰＳ１とは反転した関係にあるパルス信号ＰＳ２が走査駆動部５１から与えられる。
【００３４】
例えば、パルス信号ＰＳ１が「Ｈｉｇｈ」状態にある場合（発熱回路２０１が駆動状態にある場合）、パルス信号ＰＳ２が「Ｌｏｗ」状態にある（温度センシング回路３０１が非駆動状態にある）。この状態では、発熱回路２０１におけるトランジスタＴ１，Ｔ２はオン状態にあり、発熱回路２０１におけるトランジスタＴ３と、温度センシング回路３０１におけるトランジスタＴ４，Ｔ５はオフ状態にある。
【００３５】
この状態の場合、発熱回路２０１には、発熱に要する信号（以下、これを発熱制御信号とも呼ぶ）Ｉｓｉｇが温度制御部５０における制御信号送出部５３（図３）から与えられる。発熱回路２０１では、ＴＦＴ２０ＸにおけるドレインとゲートがトランジスタＴ２により短絡されているため、発熱制御信号ＩｓｉｇはトランジスタＴ１を介してＴＦＴ２０Ｘに流れる。
【００３６】
この結果、ＴＦＴ２０Ｘには、発熱制御信号Ｉｓｉｇに応じたゲート・ソース間電圧が発生し、この電圧が、ＴＦＴ２０Ｘに発生させるべき熱源要素として、コンデンサＣ１に保持されることとなる。
【００３７】
ＴＦＴ２０Ｘがエンハンスメント型トランジスタ（すなわち閾値Ｖｔｈ＞０）である場合、該ＴＦＴ２０Ｘは飽和領域で動作することになるので、ＴＦＴ２０Ｘにおけるゲート・ソース間電圧をＶｇｓとすると、該電圧Ｖｇｓと発熱制御信号Ｉｓｉｇとの間には、次式
【００３８】
【数１】
【００３９】
の関係が成立する。ちなみにこの（１）式における「μ」はキャリアの移動度を、「Ｃｏｘ」は単位面積当たりのゲート容量を、「Ｗ」はチャネルの幅を、「Ｌ」はチャネルの長さを示す記号である。
【００４０】
これに対して、パルス信号ＰＳ１が「Ｌｏｗ」状態にある場合（発熱回路２０１が非駆動状態にある場合）、パルス信号ＰＳ２が「Ｈｉｇｈ」状態にある（温度センシング回路３０１が非駆動状態にある）。この状態における発熱回路２０１では、トランジスタＴ１，Ｔ２はオフ状態にあり、トランジスタＴ３がオン状態にあるため、電源電圧ＶＤＤからＴＦＴ２０Ｘにおけるソース端のグランドに向かって電流が流れる。
【００４１】
電源電圧ＶＤＤからＴＦＴ２０Ｘに与えられる電圧は、該ＴＦＴ２０Ｘが飽和領域で動作する電圧よりも高く設定される。つまり、ＴＦＴ２０Ｘが飽和領域で動作するように、該ＴＦＴ２０Ｘに対する電源電圧ＶＤＤは十分に高く、トランジスタＴ３のオン抵抗は十分に低く設定される。
【００４２】
したがって、ＴＦＴ２０Ｘに流れる電流Ｉｄｒｖはドレイン・ソース間電圧Ｖｄｓには依存せず、次式
【００４３】
【数２】
【００４４】
によって与えられる。
【００４５】
一般に、ＴＦＴでは（１）式及び（２）式の右辺に現れる各パラメータがばらつくものであるが、この発熱回路２０１では、ＴＦＴ２０Ｘが飽和領域で動作するので、該パラメータの値に関係なく、電流Ｉｄｒｖと発熱制御信号Ｉｓｉｇとは一致することとなる。
【００４６】
したがって、ＴＦＴ２０Ｘでの発熱量は、該ＴＦＴ２０Ｘの特性ばらつきによらず、温度制御部５０（図３）から与えられる発熱制御信号Ｉｓｉｇの電流値と、電源電圧ＶＤＤとの積で決まる正確なものとなる。
【００４７】
また発熱制御信号Ｉｓｉｇは、発熱調整部５２（図３）において、その電流値を正確に可変することができるものである。したがって、この発熱回路２０１は、温度制御部５０（図３）での電流制御によって、ＴＦＴ２０Ｘを通じてウェルに対する温度を正確に可変することが可能となる。
【００４８】
一方、温度センシング回路３０１には、パルス信号ＰＳ１が「Ｌｏｗ」状態（発熱回路２０１が非駆動状態）、かつ、パルス信号ＰＳ２が「Ｈｉｇｈ」状態（温度センシング回路３０１が駆動状態）にある場合、固定値の側温制御信号Ｉｄｅｔが温度制御部５０における制御信号送出部５３（図３）から与えられる。
【００４９】
この場合、温度センシング回路３０では、側温制御信号ＩｄｅｔはトランジスタＴ４を介して直列に接続された複数のピンダイオード群３０Ｘに流れる。この結果、これらピンダイオード群３０Ｘには電圧が加わり、該電圧が電圧計ＶＰによって計測されることになる。
【００５０】
この電圧計３２における計測値は、温度制御部５０（図３）によってＴＦＴ２０Ｘ周囲における平均的な温度を示すパラメータとして取り込まれ、該温度制御部５０（図３）において、発熱制御信号Ｉｓｉｇの電流値を決定するために用いられる。
【００５１】
このようにして各対の発熱回路２０及び温度センシング回路３０は、温度制御部５０（図２）の制御のもとで動作するようになされている。
【００５２】
（２−２）環境温度センシング回路の構成
一方、環境温度センシング回路４０（図２）は、図６に示すように、電源電圧ＶＤＤに接続されるブリッジ回路４１と、該ブリッジ回路４１の後段に接続される差動増幅器４２とを有する。
【００５３】
このブリッジ回路４１を構成する４つの抵抗４１Ａ〜４１Ｄのうち１つの抵抗４１Ａは感温素子とされ、例えばこのリアルタイムＰＣＲ装置１における筐体等のように、反応室１１の外部における大気に触れる位置に設けられる。したがって、抵抗４１Ａは外気温に応じて可変する。一方、抵抗４１Ｂ〜４１Ｄは固定抵抗とされる。
【００５４】
この環境温度センシング回路４０では、感温素子として機能する抵抗４１Ａの抵抗値が外気温に応じて可変すると、この可変量に応じた電圧差Ｖｍが差動増幅器４２に生じる。この結果、この環境温度センシング回路４０から出力される信号は、外気温に応じた値の信号として得られることとなる。
【００５５】
ちなみにこの図６における抵抗Ｒ４２は差動増幅器４２に対するゲインを調整するための抵抗である。例えば、ＡＤ８２２４の差動ハイインピーダンスアンプを用いた場合、抵抗Ｒ４２を１００［ｋΩ］とすると、差動増幅器４２全体としてのゲインを１．５［Ω］とすることができる。
【００５６】
（２−３）温度制御部の構成
他方、温度制御部５０は、図３に示したように、走査駆動部５１、発熱調整部５２、制御信号送出部５３及びＡ／Ｄ(Analog/Digital)変換部５４を含む構成とされる。
【００５７】
走査駆動部５１は、各発熱回路２０１〜２０ｎに対して、所定間隔ごとに駆動期間をもつ同位相又は異位相のパルス信号（ＰＳ１（図５））を送出する一方、各温度センシング回路３０１〜３０ｎに対して、対とされる発熱回路２０に送出されるパルス信号とは反転した関係にあるパルス信号（ＰＳ２（図５））を送出する。これにより走査駆動部５１は、各発熱回路２０１及び温度センシング回路３０１……発熱回路２０ｎ及び温度センシング回路３０ｎを対ごとに循環駆動させるようになされている。
【００５８】
発熱調整部５２には、各温度センシング回路３０から、ＴＦＴ２０Ｘ周囲における平均的な温度（以下、これを熱源周囲平均温とも呼ぶ）を示す信号が、Ａ／Ｄ変換部５５を介してデータとして与えられる。また発熱調整部５２には、環境温度センシング回路４０から、外気温を示す信号が、Ａ／Ｄ変換部５５を介してデータとして与えられる。
【００５９】
発熱調整部５２は、ＣＰＵ(Central Processing Unit)、発熱調整プログラムが格納されるＲＯＭ(Read Only Memory) 、該ＣＰＵのワークメモリとしてのＲＡＭ(Random Access Memory)を含む構成とされる。
【００６０】
この発熱調整部５２は、発熱調整プログラムと、熱源周囲平均温及び外気温とに基づいて、各発熱回路２０１〜２０ｎに対する発熱制御信号Ｉｓｉｇの電流値を決定することによって、各発熱回路２０１〜２０ｎにおけるＴＦＴ２０Ｘでの発熱量を調整する。
【００６１】
制御信号送出部５３は、発熱調整部５２により決定される電流値の信号（発熱制御信号Ｉｓｉｇ（図５））を生成し、これを該当する発熱回路に対して、該発熱回路が駆動対象にあるときに送出する。
【００６２】
また制御信号送出部５３は、固定値の信号（側温制御信号Ｉｄｅｔ（図５））を、各温度センシング回路３０１〜３０ｎに対して駆動状態となった際にそれぞれ送出する。
【００６３】
（３）温度制御処理の具体的な処理内容
次に、発熱調整部５２における温度制御処理の具体的な処理内容を、図７に示すフローチャートを用いて説明する。
【００６４】
すなわち発熱調整部５２は、増殖反応を実行すべき命令が与えられた場合、この温度制御処理手順を開始し、第１のステップＳＰ１として、外気温を検出する。具体的には、環境温度センシング回路４０から、Ａ／Ｄ変換部５５を介して与えられるデータの値に比例する温度を外気温として演算により検出する。
【００６５】
発熱調整部５２は、第２のステップＳＰ２として、温度と、ＴＦＴ２０Ｘでの発熱に要する信号量（電流量）との比（傾き）を一定とする一次関数（以下、これを電流温度一次関数とも呼ぶ）に対する切片を、ステップＳＰ１で検出した外気温との関係で決定する。具体的には、例えば、図８に示すように、電流温度一次関数（ｙ＝ａｘ＋ｂ）の切片（ｂ）が「０」となるときの外気温度を基準とし、ステップＳＰ１で検出した外気温との差に比例する値とする。
【００６６】
発熱調整部５２は、第３のステップＳＰ３として、各ウェルが達すべき目標温度を、増殖サイクルのステージと、当該ウェルにおける標的核酸の種との関係でそれぞれ決定する。具体的には、各ステージに要する温度（変性ステージでは９５［℃］、アニーリングステージでは５５［℃］、伸長ステージでは７２［℃］）に対して、標的核酸の種に割り当てられる比率分を増減する。
【００６７】
発熱調整部５２は、第４のステップＳＰ４として、駆動対象の温度センシング回路３０に対の発熱回路２０での熱源周囲平均温を算出する。例えば、温度センシング回路３０１が駆動対象となる場合、該温度センシング回路３０１に対して１００［μＡ］の側温制御信号Ｉｄｅｔ１と、１０［μＡ］の側温制御信号Ｉｄｅｔ２とを与え、これらを与えたときの電圧計ＶＰ（図５）の計測値をΔＶとすると、次式
【００６８】
【数３】
【００６９】
により発熱回路２０１での熱源周囲平均温を算出する。ちなみに、ΔＶは、側温制御信号Ｉｄｅｔ１を与えたときの電圧値と、側温制御信号Ｉｄｅｔ２を与えたときの電圧値との差であり、また（３）式における「５．００７２」はボルツマン定数である。
【００７０】
発熱調整部５２は、第５のステップＳＰ５として、第４のステップＳＰ４で算出した熱源周囲平均温と、第３のステップＳＰ３で決定した目標温度との温度差を求める。そして発熱調整部５２は、この温度差に相当する電流値を、第２のステップＳＰ２で決定した切片でなる電流温度一次関数を用いて算出する。
【００７１】
この結果、ステップＳＰ３で算出対象とされた温度センシング回路３０に対の発熱回路２０に対して、該発熱回路２０が駆動対象となったときに、その熱源周囲平均温と目標温度との温度差に応じた電流値の発熱制御信号Ｉｓｉｇ（図５）が、使用環境に依存することなく与えられることとなる。
【００７２】
このようにして発熱調整部５２は、第４，第５のステップＳＰ４，ＳＰ５において、発熱回路２０に対の温度センシング回路３０で測定した熱源周囲平均温と目標温度との温度差に応じて、発熱回路２０に対する発熱量を個別に調整し得るようになされている。
【００７３】
発熱調整部５２は、第６のステップＳＰ６として、増殖サイクルにおける変性ステージ，アニーリングステージ又は伸長ステージへの移行タイミングであるか否かを判定する。ちなみに、移行タイミングの計測は、１回目の増殖サイクルにおける変性ステージの開始時点に同期して行われる。
【００７４】
ここで、移行タイミングであると判定した場合、発熱調整部５２は、第７のステップＳＰ７として、ウェルが達すべき目標温度を、その移行すべきステージに要する温度（９５℃、５５℃又は７２℃）に対して、標的核酸の種に割り当てられる比率分を増減した温度に変更した後、次の第８のステップＳＰ８に進む。
【００７５】
一方、移行タイミングではないと判定した場合、発熱調整部５２は、第７のステップＳＰ７を経ることなく、次の第８のステップＳＰ８に進む。
【００７６】
発熱調整部５２は、第８のステップＳＰ８として、規定された回数分の増殖サイクルを終えたか否かを判定し、該増殖サイクルを終えたと判定するまで、上述の各ステップＳＰ４〜ＳＰ７での処理を繰り返す。また発熱調整部５２は、規定された回数分の増殖サイクルを終えたと判定した場合には、この温度制御処理手順を終了するようになされている。
【００７７】
（４）動作及び効果
以上の構成において、このリアルタイムＰＣＲ装置１では、反応室１１（図１）の外部に対して、該リアルタイムＰＣＲ装置１が使用される大気中の温度を感温する外部感温素子（抵抗４１Ａ）が配される（図６）。
【００７８】
そしてこのリアルタイムＰＣＲ装置１は、温度と、ＴＦＴ２０Ｘ（図３）での発熱に要する信号量とを示す一次関数（電流温度一次関数）の切片を、外部感温素子（抵抗４１Ａ）から得られる外気温に応じて決定し、該切片でなる電流温度一次関数を用いて、ＴＦＴ２０Ｘに与えるべき信号量を決定する。
【００７９】
したがって、このリアルタイムＰＣＲ装置１は、外部感温素子（抵抗４１Ａ）から得られる外気温を基準として、使用環境に依存させずに各ウェルＵＬの発熱を制御することが可能となる。
【００８０】
従来、リアルタイムＰＣＲ装置１は実験室等に据え置き型とされ、該実験室の温度を一定に管理していた。このリアルタイムＰＣＲ装置１のように、熱源素子にＴＦＴ２０Ｘ等を適用すると、１［μＬ］以下の容量でなる４万個程度のウェルＵＬを形成することが可能となり、この結果、リアルタイムＰＣＲ装置１全体の小型化も可能となる。そうすると、リアルタイムＰＣＲ装置１は実験室等に据え置きすることなく実験場所に搬送し、その場で使用されることが想定される。
【００８１】
したがって、その場の温度を検温して入力するといったこともなく、当該雰囲気中の外気温を基準として、使用環境に依存させずに各ウェルＵＬの発熱を自動的に制御可能となるということは、使用環境にかかわらず検出精度を維持できる点で有用となる。
【００８２】
かかる構成に加えてこの実施の形態におけるリアルタイムＰＣＲ装置１では、各熱源素子（ＴＦＴ２０Ｘ）の周囲に設けられる感温素子ＴＤ（図１）を用いて、当該熱源素子での温度が温度センシング回路３０（図３）でそれぞれ求められる。
【００８３】
そしてリアルタイムＰＣＲ装置１は、ウェルＵＬが達すべき目標温度と、温度センシング回路３０で求められた温度差と、外気温に応じた切片でなる一次関数（電流温度一次関数）とを用いて、熱源素子（ＴＦＴ２０Ｘ）ごとに、当該熱源素子に与えるべき信号量を決定する。
【００８４】
したがって、リアルタイムＰＣＲ装置１は、反応室１１に対して外部での温度と、該反応室１１に対して内部での温度との変動にかかわらず、各ウェルＵＬに対する発熱量を適応的に制御することができる。この結果、このリアルタイムＰＣＲ装置１では、ウェル温度に至るまでそのウェル温度に応じた固定の電流値でなる発熱制御信号を与え続ける場合に比して、温度勾配を滑らかに（一定に）推移させることができ、急激な温度変化に起因する標的核酸等の劣化を回避することもできる。
【００８５】
以上の構成によれば、外部感温素子から得られる外気温を基準として、使用環境に依存させずに各ウェルＵＬの発熱を制御できるようにしたことにより、該外部感温素子の変動による増殖反応での影響を回避することができ、この結果、増殖反応の検出精度を向上し得るリアルタイムＰＣＲ装置１を実現できる。
【００８６】
（５）他の実施の形態
上述の実施の形態では、発熱回路２０として図３に示す回路構成が適用された。しかしながら、回路構成はこの実施の形態に限定されるものではない。例えば、温度センシング回路３０とは独立した回路として構成する、あるいは、電圧値の可変により加熱量を制御する回路構成とする等、種々の回路構成を適用することができる。
【００８７】
上述の実施の形態では、環境温度センシング回路４０の構成として図６示す回路構成が適用された。しかしながら、回路構成はこの実施の形態に限定されるものではない。例えば、温度センシング回路３０と同じ回路構成とする等、種々の回路構成を適用することができる。
【００８８】
また上述の実施の形態ＰＣＲ法を適用したがこれ以外の増殖反応法を適用することができる。例えば、ｄｓＤＮＡからＲＮＡを得るＩＶＴ(In Vitro Transcription)法、逆転写酵素のＲＮａｓｅ活性を用いてＲＮＡをトリミングしてＲＮＡを得るＴＲＣ(Transcription Reverse transcription Concerted amplification)法、ＲＮＡポリメラ−ゼを用いてＲＮＡプロモーターが組み込まれたｄｓＤＮＡからＲＮＡを得るＮＡＳＢＡ(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)法、ＲＮＡとＤＮＡのキメラ構造からなるプライマーを利用し、ＲＮＡからｓｓＤＮＡを得るＳＰＩＡ法、ＤＮＡのループ形成を利用し、一定の温度でＤＮＡをＲＮＡからｄｓＤＮＡを得るＬＡＭＰ(Loop-Mediated Isothermal Amplification)法、複数の酵素を組み合わせて一塩基多型（ＳＮＰ(Single Nucleotide Polymorphism)）を識別しながらｄｓＤＮＡを得るＳＭＡＰ(SMart Amplification Process)法、ＤＮＡとＲＮＡが結合したキメラプライマーを用いてｄｓＤＮＡを得るＩＣＡＮ法(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification)法などが挙げられる。
【００８９】
また上述の実施の形態では、リアルタイムＰＣＲ装置１として、いわゆる透過型のものが適用された。しかしながら、これに代えて、例えば、図１との対応部分に同一符号を付した図９に示すように、いわゆる反射型のリアルタイムＰＣＲ装置１００を適用するようにしてもよい。
【００９０】
このリアルタイムＰＣＲ装置１００における反応基板１２１には、側壁の底面がＲ状に形成された複数のウェルＵＬが形成され、これらウェルＵＬに対応させて受光素子ＬＤＡが一面に配される。各光源素子ＬＳから照射される励起光は、励起光透過基板１６を介して反応基板１２１に形成される対応するウェルＵＬに導光される。各ウェルＵＬでは、励起光によって励起される蛍光物の蛍光はウェルＵＬの壁面で反射し、反応基板１２１の一面に受光素子ＬＤＡに入射する。
【００９１】
このような反射型のリアルタイムＰＣＲ装置１００を適用した場合であっても、上述の実施の形態と同様の効果を得ることができる。
【００９２】
なお、リアルタイムＰＣＲ装置１又は１００の構成要素は図示した場合に限らず、適宜設計変更することができる。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明は、遺伝子解析、遺伝子診断又は医薬の創製などのバイオ産業上において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】リアルタイムＰＣＲ装置の概略構造を示す断面図である。
【図２】キャリブレーション期間の説明に供する略線図である。
【図３】温度制御ユニットの構成を示す概略図である。
【図４】発熱回路及び温度センシング回路の配置状態を示す概略図である。
【図５】発熱回路及び温度センシング回路の構成を示す図である。
【図６】環境温度センシング回路の構成を示す図である。
【図７】温度制御処理手順を示すフローチャートである。
【図８】電流温度一次関数の切片の決定の説明に供する略線図である。
【図９】他の実施の形態によるリアルタイムＰＣＲ装置の概略構造を示す断面図である。
【符号の説明】
【００９５】
１，１００……リアルタイムＰＣＲ装置、１１……反応室、１２，１１１……反応基板、１３……発熱基板、１４……発熱補助基板、１５……発光基板、１６……励起光透過基板、１７……蛍光透過基板、２０１〜２０ｎ……発熱回路、２０Ｘ……ＴＦＴ、Ｃ１……コンデンサ、３０１〜３０ｎ……温度センシング回路、３０Ｘ……ピンダイオード群、ＶＰ……電圧計、４０……環境温度センシング回路、４１……ブリッジ回路、４１Ａ……抵抗、４２……差動増幅器、５０……温度制御部、５１……走査駆動部、５２……発熱調整部、５３……制御信号送出部、５４……Ａ／Ｄ変換部。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の増殖反応の場として基板に形成される複数の容器にそれぞれ対応付けられる熱源素子と、
上記複数の容器が収容される反応室に対して外部の大気に触れる位置に設けられる外部感温素子と、
温度と、上記熱源素子での発熱に要する信号量とを示す一次関数の切片を、上記外部感温素子から得られる外気温に応じて決定し、該切片でなる一次関数を用いて、上記熱源素子に与えるべき信号量を決定する決定部と
を有する核酸増殖装置。
【請求項２】
上記熱源素子ごとに、該熱源素子の周囲に設けられる感温素子と、
各上記熱源素子での温度を、当該熱源素子の周囲に設けられる感温素子を用いて求める測温部と
をさらに有し、
上記決定部は、
上記容器が達すべき目標温度と、上記測温部で求められる温度との温度差と、上記切片でなる一次関数とを用いて、上記熱源素子ごとに、当該熱源素子に与えるべき信号量を決定する、請求項１に記載の核酸増殖装置。
【請求項３】
上記目標温度は、移行すべきフェーズに要する温度に対して標的核酸の種に割り当てられる比率分を増減した温度でなる、請求項２に記載の標的核酸装置。
【請求項４】
核酸の増殖反応の場として基板に形成される複数の容器が収容される反応室に対して外部であって、大気に触れる位置に設けられる外部感温素子を用いて外気温を検出する検出ステップと、
温度と、上記熱源素子での発熱に要する信号量とを示す一次関数の切片を、上記外気温に応じて決定する外気温決定ステップと、
上記決定ステップで決定される切片でなる一次関数を用いて、上記熱源素子に与えるべき信号量を決定する信号量決定ステップと
を有する温度制御方法。
【請求項１】
核酸の増殖反応の場として基板に形成される複数の容器にそれぞれ対応付けられる熱源素子と、
上記複数の容器が収容される反応室に対して外部の大気に触れる位置に設けられる外部感温素子と、
温度と、上記熱源素子での発熱に要する信号量とを示す一次関数の切片を、上記外部感温素子から得られる外気温に応じて決定し、該切片でなる一次関数を用いて、上記熱源素子に与えるべき信号量を決定する決定部と
を有する核酸増殖装置。
【請求項２】
上記熱源素子ごとに、該熱源素子の周囲に設けられる感温素子と、
各上記熱源素子での温度を、当該熱源素子の周囲に設けられる感温素子を用いて求める測温部と
をさらに有し、
上記決定部は、
上記容器が達すべき目標温度と、上記測温部で求められる温度との温度差と、上記切片でなる一次関数とを用いて、上記熱源素子ごとに、当該熱源素子に与えるべき信号量を決定する、請求項１に記載の核酸増殖装置。
【請求項３】
上記目標温度は、移行すべきフェーズに要する温度に対して標的核酸の種に割り当てられる比率分を増減した温度でなる、請求項２に記載の標的核酸装置。
【請求項４】
核酸の増殖反応の場として基板に形成される複数の容器が収容される反応室に対して外部であって、大気に触れる位置に設けられる外部感温素子を用いて外気温を検出する検出ステップと、
温度と、上記熱源素子での発熱に要する信号量とを示す一次関数の切片を、上記外気温に応じて決定する外気温決定ステップと、
上記決定ステップで決定される切片でなる一次関数を用いて、上記熱源素子に与えるべき信号量を決定する信号量決定ステップと
を有する温度制御方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−４１９５８（Ｐ２０１０−４１９５８Ａ）
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０７９８８（Ｐ２００８−２０７９８８）
【出願日】平成２０年８月１２日（２００８．８．１２）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１２日（２００８．８．１２）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
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