核酸抽出方法
【課題】本発明は、より安定的かつ容易に核酸を抽出可能な核酸抽出方法を提供する。
【解決手段】本発明による核酸抽出方法は、管状のチューブ内にヒドロゲルカラムを形成するヒドロゲルカラムの作製ステップと、細胞を破壊して細胞溶解物を得る細胞溶解物の作製ステップと、核酸をヒドロゲルカラムを通過して排出させる核酸のフィルタリングステップと、ヒドロゲルカラムを通過した核酸を外部に抽出する核酸の抽出ステップとを含むことができる。
【解決手段】本発明による核酸抽出方法は、管状のチューブ内にヒドロゲルカラムを形成するヒドロゲルカラムの作製ステップと、細胞を破壊して細胞溶解物を得る細胞溶解物の作製ステップと、核酸をヒドロゲルカラムを通過して排出させる核酸のフィルタリングステップと、ヒドロゲルカラムを通過した核酸を外部に抽出する核酸の抽出ステップとを含むことができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸抽出方法に関し、より詳細には、カラムとしてヒドロゲルカラムを用いた核酸抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトゲノム研究の結果に基づいて遺伝子レベルで病気の原因を解析することにより、人の病気を治療または予防する目的で生体試料の操作および生化学的分析に対する要求が次第に高まっている。また、病気の診断以外にも、新薬の開発、ウイルスやバクテリア感染の有無の事前検査および法医学などの多様な分野において、生体試料や細胞を含む試料から核酸を抽出および分析する技術が求められている。
【０００３】
核酸の抽出時に、低純度の核酸は、サザンブロット法（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）のようなハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応、酵素反応のような化学反応を抑制したり妨害し、核酸汚染物質は、被検核酸を分解し、核酸の定量に誤りをもたらす。このような汚染物質には、脂肪のような低分子物質、酵素阻害剤のみならず、蛋白質のような酵素、多糖体、およびポリヌクレオチドなどがある。
【０００４】
分子生物学方法の応用に適した高純度の核酸を得るために、前記問題を解決するための方法が種々開発されている。
【０００５】
細胞から核酸を抽出するための方法として、細胞を含む試料をＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）やプロテイナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）で処理して可溶化した後、フェノールで蛋白質を変性除去して核酸を精製する方法がある。しかし、フェノール抽出法では、多くのステップを経なければならず、時間が長くかかる上に、核酸の抽出効率は作業者の熟練度に大きく左右される。
【０００６】
最近では、このような問題を減らすために、カラムを用いたキットが核酸の抽出における基本となっている。これは、核酸と特異的に結合するシリカやガラス繊維を用いた方法であり、細胞をカオトロピック試薬（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ ｒｅａｇｅｎｔ）で処理して細胞を溶解し、水分子と核酸との構造的な相互作用の原理を利用して核酸分子を蛋白質およびその他の細胞内物質から精製する方法である。
【０００７】
ガラス繊維やシリカ膜は、細胞代謝物質との結合比率が低いため、相対的に高濃度の核酸を得ることができる。この方法は、フェノール法に比べて簡便ではあるが、ＰＣＲなどの酵素反応を強く阻害するカオトロピック試薬やエタノールを使用しているため、これらの物質を完全に除去しなければならず、このため、操作が複雑で、時間がかかるという欠点がある。
【０００８】
最近、フィルタを用いて核酸を直接精製する方法が開示されている（国際公開ＷＯ００／２１９７３号）。この方法では、試料をフィルタに通過させて細胞をフィルタに吸着させた後、フィルタに吸着した細胞を溶解し、フィルタでろ過させた後、フィルタに吸着した核酸を洗浄および溶出する。しかし、細胞をフィルタに吸着させた後、核酸を溶出させるためには、細胞の種類によってフィルタを選択しなければならないという問題がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明は、上記の問題を解決するためになされたものであって、その目的は、より安定的かつ容易に核酸を抽出可能な核酸抽出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するために、本発明の一実施例による核酸抽出方法は、管状のチューブ内にヒドロゲルカラムを形成するヒドロゲルカラムの作製ステップと、細胞を破壊して細胞溶解物を得る細胞溶解物の作製ステップと、核酸をヒドロゲルカラムを通過して排出させる核酸のフィルタリングステップと、ヒドロゲルカラムを通過した核酸を外部に抽出する核酸の抽出ステップとを含むことができる。
【００１１】
前記ヒドロゲルカラムは、アガロースゲルからなり得、前記アガロースゲルは、１％〜２％のアガロースを含むことができる。また、前記アガロースゲルは、０．５％〜５％のアガロースを含むことができる。
【００１２】
また、前記ヒドロゲルカラムの作製ステップは、蒸溜水にアガロースを添加し、加熱してアガロースを溶解するステップを含むことができ、前記ヒドロゲルカラムの作製ステップは、蒸溜水とアガロースとの混合液をチューブに注入した後、硬化させるステップをさらに含むことができる。
【００１３】
前記ヒドロゲルカラムには、前記チューブの長手方向につながった注入溝を形成するステップをさらに含むことができ、前記注入溝は、前記ヒドロゲルカラムの中央に形成可能である。また、前記チューブの外周には、前記ヒドロゲルカラムと当接する複数の減圧孔を形成するステップをさらに含むことができる。
【００１４】
一方、前記細胞溶解物の作製ステップは、細胞に溶解バッファ（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）とプロテイナーゼＫを添加するステップを含むことができ、前記細胞溶解物の作製ステップは、細胞にＲＮアーゼ（ＲＮａｓｅ）を添加するステップをさらに含むことができる。また、前記ヒドロゲルカラムは、回転体形状からなり得る。
【００１５】
前記核酸のフィルタリングステップは、遠心分離方法により核酸をフィルタリングすることができ、遠心分離方法は、１０００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍの範囲で前記ヒドロゲルカラムを回転させるステップを含むことができる。また、前記核酸のフィルタリングステップは、電気または圧力を用いて核酸をフィルタリングすることもできる。一方、前記細胞は、生体試料であり得、動物試料、植物試料、または微生物試料からなり得る。
【００１６】
前記核酸は、ＤＮＡからなり得る。また、本発明による核酸抽出方法は、抽出された核酸を遺伝子検査に用いるステップ、あるいは抽出された核酸をＤＮＡチップ検査に用いるステップを含むことができる。また、本発明による核酸抽出方法は、抽出された核酸をポイントオブケア検査（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇ）に用いるステップをさらに含むことができる。
【００１７】
また、本発明による核酸抽出方法は、血液、血清、血漿、骨髄、尿、糞便、痰、細胞穿刺液（ｃｅｌｌ ａｓｐｉｒａｔｅ）、組織、および組織由来物質を含むヒト由来検体を検査するための核酸の抽出に適用可能である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の一実施例によれば、ヒドロゲルカラムをフィルタとして用いることにより、不純物なく、より容易に核酸を抽出することができる。
【００１９】
また、ヒドロゲルカラムとしてアガロースゲルを用いることにより、純粋な核酸を得ることができる。
【００２０】
さらに、ヒドロゲルカラムに注入溝を形成することにより、核酸の回収効率が向上する。
【００２１】
なお、チューブに減圧孔を形成することにより、核酸の損傷を減らし、かつ、より容易に抽出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の第１実施例による核酸抽出方法を説明するためのフローチャートである。
【図２】本発明の第１実施例による核酸抽出装置を示す断面図である。
【図３】本発明の第１実施例による核酸抽出方法により分離したＭＣ３Ｔ３骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）のゲノムＤＮＡの電気泳動結果を示す写真である。
【図４】本発明の第１実施例による核酸抽出方法により分離したＭＣ３Ｔ３骨芽細胞のゲノムＤＮＡのＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）結果を示す写真である。
【図５】本発明の第１実施例による核酸抽出方法により抽出したヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａ Ｖｉｒｕｓ）（以下、「ＨＰＶ」という）細胞ＤＮＡのＰＣＲ検査後における電気泳動結果を示す写真である。
【図６】本発明の第１実施例による核酸抽出方法により抽出したＨＰＶ細胞核酸の核酸チップ検査結果を示す写真である。
【図７】本発明の第２実施例による核酸抽出方法に用いられた核酸抽出装置を示す断面図である。
【図８】本発明の第３実施例による核酸抽出方法に用いられた核酸抽出装置を示す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、添付した図面を参照して、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように本発明の実施例を詳細に説明する。ただし、本発明は、様々な異なる形態で実現可能であり、後述する実施例に限定されない。そして、図面において、本発明を明確に説明するために、説明において不要な部分は省略しており、明細書の全体にわたって同一または類似の構成要素については、同一の参照符号を付している。
【００２４】
図１は、本発明の第１実施例による核酸抽出方法を示すフローチャートであり、図２は、本発明の第１実施例による核酸抽出装置を示す断面図である。図１および図２に示すように、本発明の一実施例による核酸抽出方法は、ヒドロゲルカラム１６の作製ステップ（Ｓ１０１）と、細胞溶解物の作製ステップ（Ｓ１０２）と、核酸のフィルタリングステップ（Ｓ１０３）と、核酸の抽出ステップ（Ｓ１０４）とを含む。
【００２５】
まず、ヒドロゲルカラム１６の作製ステップ（Ｓ１０１）について説明すると、ヒドロゲルカラム１６は、核酸抽出装置の内部に設けられる管状のチューブ１４に形成される。ヒドロゲルカラム１６は、核酸抽出装置の内部に形成されるが、核酸抽出装置は、外形をなすハウジング１２と、ハウジング１２の内部に嵌設されたチューブ１４と、チューブ１４を密閉する蓋１３とを備える。
【００２６】
ハウジング１２は、内部に空間を有する円筒状の管からなり、下部が詰まっている。そして、ハウジング１２の下端は、抽出された核酸またはＤＮＡが集められるように、下方に行くほど内径が小さくなる。
【００２７】
チューブ１４は、ハウジング１２の内部に嵌設されるが、内側に細胞溶解物を収容できるように空間が形成される。チューブ１４の下端には、核酸がハウジングへ移動可能に下向きに開放された排出口２４が形成される。排出口２４は、蛋白質などを除く核酸のみが排出できるように、他の部分よりも内径が小さくなるように形成される。
【００２８】
チューブ１４にはヒドロゲルカラム１６が設けられる。ヒドロゲルカラム１６は、チューブ１４の内部形状に対応する形状からなるが、略回転体形状の柱からなる。
【００２９】
本実施例において、ヒドロゲルカラム１６は、作製が容易で、人体に無害なアガロースゲルからなる。本実施例では、アガロースゲルを適用することを例示しているが、本発明は、これに限定されるものではなく、多様なヒドロゲルが適用可能である。
【００３０】
ヒドロゲルカラム１６の作製過程をより詳細に説明すると、アガロースを蒸溜水に添加した後、混合液を加熱してアガロースを完全に溶解し、アガロース水溶液を調製する。以後、チューブ１４にアガロース水溶液を注入し、常温で十分に放置し、カラム状のヒドロゲルカラム１６を形成する。
【００３１】
ヒドロゲルカラム１６は、濃度が１．０％〜２．０％のアガロースを含み、体積は３００μｌ〜６００μｌとなる。
【００３２】
遠心分離方法を適用するにあたり、ヒドロゲルカラム１６において、アガロースの濃度が１．０％より小さければ、遠心分離過程でヒドロゲルカラム１６が壊れやすい問題があり、アガロースの濃度が２．０％より大きければ、空隙が小さいために核酸を適切に抽出できない問題が発生する。
【００３３】
ヒドロゲルは、水分を含有できる高分子材料であり、化学的・物理的な結合により分子が互いに連結され、３次元網状構造を有する。また、親水性官能基および毛細管現象と浸透圧により水分を含む。これにより、ヒドロゲルは、空気透過性と滲出液吸収性に優れているだけでなく、血液、体液、および生体組織に対して親和性を有する。
【００３４】
次に、細胞溶解物の作製ステップ（Ｓ１０２）について説明する。ここで、細胞溶解物とは、細胞を破壊して得られる細胞の構成成分を含む混合物をいう。
【００３５】
細胞は、生体試料からなり得、動物試料、植物試料、または微生物試料からなり得る。
【００３６】
細胞溶解物は、細胞の入った容器に溶解バッファを添加して調製できる。溶解バッファは、商用化された製品など、多様な物質からなり得る。また、溶解バッファのほか、蛋白質加水分解酵素のプロテイナーゼＫや、リボＤＮＡ分解酵素のＲＮアーゼをさらに添加することもできる。
【００３７】
本実施例では、核酸抽出検体に、溶解バッファ１８０μｌとプロテイナーゼＫ２０μｌを添加した混合液を、５５℃で２０分間放置し、細胞を破砕した。以後、ＲＮアーゼ２０μｌを添加し、常温で２分間さらに放置し、細胞溶解物を作製した。
【００３８】
次に、核酸のフィルタリングステップ（Ｓ１０３）についてより詳細に説明する。
【００３９】
細胞溶解物をヒドロゲルカラム１６が形成されたチューブ１４に入れた後、遠心分離を行う。ここで、遠心分離は、マイクロ遠心分離機により、２０００ｒｐｍ／２００ｒｃｆで回転させるステップを含み、回転ステップは、５分ずつ、３回行われる。
【００４０】
遠心分離過程における回転は、ヒドロゲルカラム１６が損傷しないように低速で行われる。回転速度は、１０００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍの範囲となり得る。回転速度が１０００ｒｐｍより小さければ、遠心分離が適切に行われないため、核酸がヒドロゲルカラム１６を通過できない問題があり、回転速度が３０００ｒｐｍより大きければ、ヒドロゲルカラム１６が損傷する問題が発生する。
【００４１】
遠心分離過程において、核酸は、ヒドロゲルカラム１６を通過し、排出口２４を介してハウジング１２に排出され、蛋白質などの異物は、ヒドロゲルカラム１６を通過せずに残留する。
【００４２】
本実施例では、遠心分離を用いてＤＮＡを抽出することを例示しているが、本発明はこれに限定されない。したがって、ヒドロゲルカラム１６をフィルタとして用い、圧力や電気的な方法により核酸をフィルタリングすることもできる。
【００４３】
圧力や電気的な方法を用いる場合、ヒドロゲルカラム１６は、０．５％〜５．０％のアガロースを含むことができる。圧力を用いて核酸を抽出する場合は、高い圧力でもヒドロゲルカラム１６が壊れてはならないことから、アガロースを５．０％以下として含むことが好ましい。アガロースを５．０％より多く含む場合は、気孔が小さくなり、核酸がヒドロゲルカラム１６を通過しない問題がある。
【００４４】
また、電気的な方法を用いる場合は、気孔が相対的に大きいことが有利であるため、０．５％以上のアガロースを含むことが好ましい。ヒドロゲルカラム１６が０．５％より小さいアガロースを含む場合は、気孔が過度に大きくなる問題があり、ヒドロゲルカラム１６が圧力で壊れたり、異物がアガロースゲルカラムを通して離脱する問題が発生する。
【００４５】
ヒドロゲルカラム１６は、親水性で、かつ、３次元網状構造を有するため、遠心分離工程において核酸フィルタとして作用することができる。つまり、遠心分離過程で細胞溶解物に含まれている核酸は、サイズが小さく、親水性であるため、ヒドロゲルカラム１６に形成された気孔を通過して排出口２４に排出できるのに対し、サイズが相対的に大きく、疎水性である蛋白質などの不純物は、ヒドロゲルを通過せずにチューブ１４に残留するようになる。
【００４６】
次に、核酸の抽出ステップについて説明すると、ヒドロゲルカラム１６を通過した核酸は、チューブ１４の排出口２４を介して排出され、ハウジング１２の底に移動する。
【００４７】
このように抽出された核酸は、遺伝子検査に使用可能であり、ＤＮＡチップ検査にも使用可能である。したがって、本実施例による核酸抽出方法は、抽出された核酸を遺伝子検査に用いるステップ、あるいは抽出された核酸をＤＮＡチップ検査に用いるステップを含むことができる。
【００４８】
また、このように抽出された核酸は、ポイントオブケア検査（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇ、以下、「ＰＯＣ検査」という）に用いることができる。したがって、本実施例による核酸抽出方法は、抽出された核酸をＰＯＣ検査に用いるステップをさらに含むことができる。
【００４９】
ＰＯＣ検査とは、医師の診療現場や、患者の家庭で病気の診断を可能にする検査方式である。本実施例による核酸抽出方法は、簡単な構造の装置を用いて核酸を抽出することができるので、抽出された核酸をＰＯＣ検査に容易に適用することができる。
【００５０】
また、本実施例による核酸抽出方法は、血液、血清、血漿、骨髄、尿、糞便、痰、細胞穿刺液、組織、および組織由来物質を含むヒト由来検体を検査するための核酸の抽出に適用可能である。
【００５１】
ハウジング１２の底に貯まった核酸を抽出して電気泳動結果を図２に示している。
【００５２】
図２は、本発明の第１実施例による核酸抽出方法により分離したＭＣ３Ｔ３骨芽細胞のゲノム核酸の電気泳動結果を示す写真である。図２において、レーンＭは、標準ＤＮＡマーカーであり、レーン１およびレーン２は、本発明の方法で得られたＭＣ３Ｔ３骨芽細胞のゲノムＤＮＡの電気泳動結果である。
【００５３】
図４は、本発明の第１実施例による核酸抽出方法により分離したＭＣ３Ｔ３骨芽細胞のゲノム核酸の純度を確認するために、ＰＣＲ結果を示す写真である。
【００５４】
図４において、レーンＭは、標準ＤＮＡマーカーであり、レーン１は、本発明の方法で得られたＭＣ３Ｔ３骨芽細胞のゲノムＤＮＡにおいてＧ３ＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を増幅した後の電気泳動結果を示す。レーン２および３は、商用化されたゲノムＤＮＡ抽出装置を用いて骨芽細胞のゲノムＤＮＡを抽出した後、Ｇ３ＰＤＨを増幅した後の電気泳動結果を示す。
【００５５】
本実施例では、核酸としてＤＮＡを適用することを例示しているが、本発明は、これに限定されるものではなく、ＲＮＡなど、多様な種類の核酸の分離に適用可能である。
【００５６】
臨床検体からアガロースゲルカラムを用いてＤＮＡを抽出する可能性および適正なゲル濃度を測定するための実験を行った。
【００５７】
結果物に混在し得るＰＣＲ反応抑制剤の影響を最大限に排除するために、ＤＮＡを用いた検査のうち、ハイブリダイゼーション過程を含む検査を選択した。
【００５８】
ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）ＤＮＡチップ検査が行われた頸部スワブ（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓｗａｂ）検体から選別し、アガロースゲルカラムを用いた核酸抽出方法によりＤＮＡの抽出を行い、結果物に対してＨＰＶ ＤＮＡチップ検査を行った。敏感度を推定するために、通常のＰＣＲ検査後、電気泳動結果の読み取りを併行した。検体は、ＨＰＶ−５８であって、プロテイナーゼＫ２０μｌ、ＨＰＶ検査用検体４００μｌ、溶解バッファ２００μｌを、アガロースゲルカラムが挿入されたチューブに入れ、２０００ｒｐｍ／２００ｒｃｆで、５分ずつ、３回遠心分離を行った。アガロースゲルカラムは、体積が０．３ｍｌのカラムと、体積が０．６ｍｌのカラムの２種を使用した。
【００５９】
通常のＰＣＲ検査後、その結果を電気泳動で読み取る場合、０．３ｍｌおよび０．６ｍｌのカラムとも、２％のアガロースゲル濃度でのみ結果を読み取ることができた。一方、ＤＮＡコピー数が低くても結果が得られるＤＮＡチップ検査では、０．３ｍｌのカラムにおいて１％、１．５％、２％のアガロースゲル濃度で、０．６ｍｌのカラムにおいては２％の濃度で正確なＨＰＶタイプ結果を得ることができた。
【００６０】
本実験の結果によれば、２％のアガロースゲルを用いた場合、０．３ｍｌおよび０．６ｍｌのカラムとも、ＨＰＶタイプ情報を得るための通常のＰＣＲ検査とＤＮＡチップ検査が可能であることがわかった。
【００６１】
下記の表１は、各レーンの実験条件を示す。
【表１】
【００６２】
図５は、本発明の第１実施例による核酸抽出方法により抽出したＨＰＶ細胞ＤＮＡのＰＣＲ検査後における電気泳動結果を示す写真であり、図６は、本発明の第１実施例による核酸抽出方法により抽出したＨＰＶ細胞核酸の核酸チップ検査結果を示す写真である。
【００６３】
図５および図６に示すように、通常のＰＣＲ検査後の結果を電気泳動で読み取る場合、０．３ｍｌおよび０．６ｍｌのカラムとも、２％のアガロースゲル濃度でのみ結果を読み取ることができた。一方、ＤＮＡコピー数が低くても結果が得られるＤＮＡチップ検査では、０．３ｍｌのカラムにおいて１％、１．５％、２％のアガロースゲル濃度で、０．６ｍｌのカラムにおいては２％の濃度で正確なＨＰＶタイプ結果を得ることができた。
【００６４】
本実験の結果によれば、２％のアガロースゲルを用いた場合、０．３ｍｌおよび０．６ｍｌのカラムとも、ＨＰＶタイプ情報を得るための通常のＰＣＲ検査とＤＮＡチップ検査が可能であることがわかった。
【００６５】
本実施例による核酸抽出方法の核酸の抽出効率を判定するために、従来の核酸抽出方法と比較する実験を行った。
【００６６】
核酸の抽出状態で保管されていた臨床検体の核酸抽出物に対し、従来の核酸抽出装置と本実施例による核酸抽出方法を用いてそれぞれ核酸の抽出を行った後、核酸の濃度を測定して回収率を比較した。
【００６７】
検体としてはＨＰＶ−１８を使用し、プロテイナーゼＫ２０μｌ、ＤＮＡ抽出検体２００μｌ、溶解バッファ２００μｌを入れ、２０００ｒｐｍ／２００ｒｃｆで、１５分間、遠心分離を行った。２．０％のアガロースゲル濃度で、０．３ｍｌおよび０．６ｍｌの体積を有するヒドロゲルカラムで実験を行った。検査に用いられたＤＮＡ抽出物のＤＮＡ酸濃度６５μｇ／ｍｌを基準とする従来の核酸抽出方法では、１４μｇ／ｍｌ、約２１．５％の回収率を示し、２％のアガロース濃度を有する０．３ｍｌおよび０．６ｍｌのカラムでは、それぞれ１９μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ、約２９．２％および１５．４％の回収率を示している。したがって、本実施例による核酸抽出方法の効率は、従来の核酸抽出装置に比べて臨床適用可能な範囲に属していることがわかる。このように、本実施例による核酸抽出方法は、生体試料のＤＮＡを抽出するのに特に有利である。
【００６８】
図７は、本発明の第２実施例による核酸抽出方法に用いられた核酸抽出装置を示す断面図である。
【００６９】
図７に示すように、本実施例による核酸抽出装置は、円筒状のハウジング１２と、ハウジング１２の内部に嵌設されたチューブ１４と、チューブ１４に設けられたヒドロゲルカラム１７と、チューブ１４を密閉する蓋１９とを備える。
【００７０】
本実施例による核酸抽出方法は、ヒドロゲルカラム１７の内側に注入溝１８を形成するステップをさらに含む。注入溝１８は、ヒドロゲルカラム１７の中央に形成され、円筒状となり得る。この注入溝１８は、細胞溶解物を収容可能であり、排出口２４と細胞溶解物との距離を減少させ、核酸の回収効率を向上させる。ヒドロゲルカラム１７には複数の微細な気孔が形成されるが、これらの気孔を介して遠心分離過程で核酸が排出口２４に排出される。したがって、細胞溶解物と排出口２４との距離が減少すると、核酸がより容易にヒドロゲルカラム１７を通過できるため、核酸の回収効率が向上する。
【００７１】
図８は、本発明の第３実施例による核酸抽出方法に用いられた核酸抽出装置を示す断面図である。
【００７２】
図８に示すように、本実施例による核酸抽出装置は、円筒状のハウジング１２と、ハウジング１２の内部に嵌設されたチューブ１４と、チューブ１４に設けられたヒドロゲルカラム１７と、チューブ１４を密閉する蓋１９とを備える。
【００７３】
また、本実施例による核酸抽出方法は、ヒドロゲルカラム１７が位置するチューブ１４の外周には減圧孔１５を形成するステップを含む。
【００７４】
減圧孔１５は、複数個がチューブ１４の外周に沿って離隔配置されるが、減圧孔１５は、遠心力によって発生する圧力を減少させる役割を果たす。また、ヒドロゲルカラム１７には注入溝１８が形成され、減圧孔１５は注入溝の横側に形成される。これにより、注入溝１８に位置する核酸が減圧孔１５を介してハウジング１２に排出できるため、核酸の回収効率がさらに向上する。
【００７５】
以上、本発明の好ましい実施例について説明したが、本発明は、これに限定されるものではなく、特許請求の範囲と発明の詳細な説明および添付した図面の範囲内で多様な変形が実施可能であり、これもまた、本発明の範囲に属するのはいうまでもない。
【符号の説明】
【００７６】
１２：ハウジング
１３、１９：蓋
１４：チューブ
１５：減圧孔
１６、１７：ヒドロゲルカラム
１８：注入溝
２４：排出口
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸抽出方法に関し、より詳細には、カラムとしてヒドロゲルカラムを用いた核酸抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトゲノム研究の結果に基づいて遺伝子レベルで病気の原因を解析することにより、人の病気を治療または予防する目的で生体試料の操作および生化学的分析に対する要求が次第に高まっている。また、病気の診断以外にも、新薬の開発、ウイルスやバクテリア感染の有無の事前検査および法医学などの多様な分野において、生体試料や細胞を含む試料から核酸を抽出および分析する技術が求められている。
【０００３】
核酸の抽出時に、低純度の核酸は、サザンブロット法（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）のようなハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応、酵素反応のような化学反応を抑制したり妨害し、核酸汚染物質は、被検核酸を分解し、核酸の定量に誤りをもたらす。このような汚染物質には、脂肪のような低分子物質、酵素阻害剤のみならず、蛋白質のような酵素、多糖体、およびポリヌクレオチドなどがある。
【０００４】
分子生物学方法の応用に適した高純度の核酸を得るために、前記問題を解決するための方法が種々開発されている。
【０００５】
細胞から核酸を抽出するための方法として、細胞を含む試料をＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）やプロテイナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）で処理して可溶化した後、フェノールで蛋白質を変性除去して核酸を精製する方法がある。しかし、フェノール抽出法では、多くのステップを経なければならず、時間が長くかかる上に、核酸の抽出効率は作業者の熟練度に大きく左右される。
【０００６】
最近では、このような問題を減らすために、カラムを用いたキットが核酸の抽出における基本となっている。これは、核酸と特異的に結合するシリカやガラス繊維を用いた方法であり、細胞をカオトロピック試薬（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ ｒｅａｇｅｎｔ）で処理して細胞を溶解し、水分子と核酸との構造的な相互作用の原理を利用して核酸分子を蛋白質およびその他の細胞内物質から精製する方法である。
【０００７】
ガラス繊維やシリカ膜は、細胞代謝物質との結合比率が低いため、相対的に高濃度の核酸を得ることができる。この方法は、フェノール法に比べて簡便ではあるが、ＰＣＲなどの酵素反応を強く阻害するカオトロピック試薬やエタノールを使用しているため、これらの物質を完全に除去しなければならず、このため、操作が複雑で、時間がかかるという欠点がある。
【０００８】
最近、フィルタを用いて核酸を直接精製する方法が開示されている（国際公開ＷＯ００／２１９７３号）。この方法では、試料をフィルタに通過させて細胞をフィルタに吸着させた後、フィルタに吸着した細胞を溶解し、フィルタでろ過させた後、フィルタに吸着した核酸を洗浄および溶出する。しかし、細胞をフィルタに吸着させた後、核酸を溶出させるためには、細胞の種類によってフィルタを選択しなければならないという問題がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明は、上記の問題を解決するためになされたものであって、その目的は、より安定的かつ容易に核酸を抽出可能な核酸抽出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するために、本発明の一実施例による核酸抽出方法は、管状のチューブ内にヒドロゲルカラムを形成するヒドロゲルカラムの作製ステップと、細胞を破壊して細胞溶解物を得る細胞溶解物の作製ステップと、核酸をヒドロゲルカラムを通過して排出させる核酸のフィルタリングステップと、ヒドロゲルカラムを通過した核酸を外部に抽出する核酸の抽出ステップとを含むことができる。
【００１１】
前記ヒドロゲルカラムは、アガロースゲルからなり得、前記アガロースゲルは、１％〜２％のアガロースを含むことができる。また、前記アガロースゲルは、０．５％〜５％のアガロースを含むことができる。
【００１２】
また、前記ヒドロゲルカラムの作製ステップは、蒸溜水にアガロースを添加し、加熱してアガロースを溶解するステップを含むことができ、前記ヒドロゲルカラムの作製ステップは、蒸溜水とアガロースとの混合液をチューブに注入した後、硬化させるステップをさらに含むことができる。
【００１３】
前記ヒドロゲルカラムには、前記チューブの長手方向につながった注入溝を形成するステップをさらに含むことができ、前記注入溝は、前記ヒドロゲルカラムの中央に形成可能である。また、前記チューブの外周には、前記ヒドロゲルカラムと当接する複数の減圧孔を形成するステップをさらに含むことができる。
【００１４】
一方、前記細胞溶解物の作製ステップは、細胞に溶解バッファ（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）とプロテイナーゼＫを添加するステップを含むことができ、前記細胞溶解物の作製ステップは、細胞にＲＮアーゼ（ＲＮａｓｅ）を添加するステップをさらに含むことができる。また、前記ヒドロゲルカラムは、回転体形状からなり得る。
【００１５】
前記核酸のフィルタリングステップは、遠心分離方法により核酸をフィルタリングすることができ、遠心分離方法は、１０００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍの範囲で前記ヒドロゲルカラムを回転させるステップを含むことができる。また、前記核酸のフィルタリングステップは、電気または圧力を用いて核酸をフィルタリングすることもできる。一方、前記細胞は、生体試料であり得、動物試料、植物試料、または微生物試料からなり得る。
【００１６】
前記核酸は、ＤＮＡからなり得る。また、本発明による核酸抽出方法は、抽出された核酸を遺伝子検査に用いるステップ、あるいは抽出された核酸をＤＮＡチップ検査に用いるステップを含むことができる。また、本発明による核酸抽出方法は、抽出された核酸をポイントオブケア検査（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇ）に用いるステップをさらに含むことができる。
【００１７】
また、本発明による核酸抽出方法は、血液、血清、血漿、骨髄、尿、糞便、痰、細胞穿刺液（ｃｅｌｌ ａｓｐｉｒａｔｅ）、組織、および組織由来物質を含むヒト由来検体を検査するための核酸の抽出に適用可能である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の一実施例によれば、ヒドロゲルカラムをフィルタとして用いることにより、不純物なく、より容易に核酸を抽出することができる。
【００１９】
また、ヒドロゲルカラムとしてアガロースゲルを用いることにより、純粋な核酸を得ることができる。
【００２０】
さらに、ヒドロゲルカラムに注入溝を形成することにより、核酸の回収効率が向上する。
【００２１】
なお、チューブに減圧孔を形成することにより、核酸の損傷を減らし、かつ、より容易に抽出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の第１実施例による核酸抽出方法を説明するためのフローチャートである。
【図２】本発明の第１実施例による核酸抽出装置を示す断面図である。
【図３】本発明の第１実施例による核酸抽出方法により分離したＭＣ３Ｔ３骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）のゲノムＤＮＡの電気泳動結果を示す写真である。
【図４】本発明の第１実施例による核酸抽出方法により分離したＭＣ３Ｔ３骨芽細胞のゲノムＤＮＡのＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）結果を示す写真である。
【図５】本発明の第１実施例による核酸抽出方法により抽出したヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａ Ｖｉｒｕｓ）（以下、「ＨＰＶ」という）細胞ＤＮＡのＰＣＲ検査後における電気泳動結果を示す写真である。
【図６】本発明の第１実施例による核酸抽出方法により抽出したＨＰＶ細胞核酸の核酸チップ検査結果を示す写真である。
【図７】本発明の第２実施例による核酸抽出方法に用いられた核酸抽出装置を示す断面図である。
【図８】本発明の第３実施例による核酸抽出方法に用いられた核酸抽出装置を示す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、添付した図面を参照して、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように本発明の実施例を詳細に説明する。ただし、本発明は、様々な異なる形態で実現可能であり、後述する実施例に限定されない。そして、図面において、本発明を明確に説明するために、説明において不要な部分は省略しており、明細書の全体にわたって同一または類似の構成要素については、同一の参照符号を付している。
【００２４】
図１は、本発明の第１実施例による核酸抽出方法を示すフローチャートであり、図２は、本発明の第１実施例による核酸抽出装置を示す断面図である。図１および図２に示すように、本発明の一実施例による核酸抽出方法は、ヒドロゲルカラム１６の作製ステップ（Ｓ１０１）と、細胞溶解物の作製ステップ（Ｓ１０２）と、核酸のフィルタリングステップ（Ｓ１０３）と、核酸の抽出ステップ（Ｓ１０４）とを含む。
【００２５】
まず、ヒドロゲルカラム１６の作製ステップ（Ｓ１０１）について説明すると、ヒドロゲルカラム１６は、核酸抽出装置の内部に設けられる管状のチューブ１４に形成される。ヒドロゲルカラム１６は、核酸抽出装置の内部に形成されるが、核酸抽出装置は、外形をなすハウジング１２と、ハウジング１２の内部に嵌設されたチューブ１４と、チューブ１４を密閉する蓋１３とを備える。
【００２６】
ハウジング１２は、内部に空間を有する円筒状の管からなり、下部が詰まっている。そして、ハウジング１２の下端は、抽出された核酸またはＤＮＡが集められるように、下方に行くほど内径が小さくなる。
【００２７】
チューブ１４は、ハウジング１２の内部に嵌設されるが、内側に細胞溶解物を収容できるように空間が形成される。チューブ１４の下端には、核酸がハウジングへ移動可能に下向きに開放された排出口２４が形成される。排出口２４は、蛋白質などを除く核酸のみが排出できるように、他の部分よりも内径が小さくなるように形成される。
【００２８】
チューブ１４にはヒドロゲルカラム１６が設けられる。ヒドロゲルカラム１６は、チューブ１４の内部形状に対応する形状からなるが、略回転体形状の柱からなる。
【００２９】
本実施例において、ヒドロゲルカラム１６は、作製が容易で、人体に無害なアガロースゲルからなる。本実施例では、アガロースゲルを適用することを例示しているが、本発明は、これに限定されるものではなく、多様なヒドロゲルが適用可能である。
【００３０】
ヒドロゲルカラム１６の作製過程をより詳細に説明すると、アガロースを蒸溜水に添加した後、混合液を加熱してアガロースを完全に溶解し、アガロース水溶液を調製する。以後、チューブ１４にアガロース水溶液を注入し、常温で十分に放置し、カラム状のヒドロゲルカラム１６を形成する。
【００３１】
ヒドロゲルカラム１６は、濃度が１．０％〜２．０％のアガロースを含み、体積は３００μｌ〜６００μｌとなる。
【００３２】
遠心分離方法を適用するにあたり、ヒドロゲルカラム１６において、アガロースの濃度が１．０％より小さければ、遠心分離過程でヒドロゲルカラム１６が壊れやすい問題があり、アガロースの濃度が２．０％より大きければ、空隙が小さいために核酸を適切に抽出できない問題が発生する。
【００３３】
ヒドロゲルは、水分を含有できる高分子材料であり、化学的・物理的な結合により分子が互いに連結され、３次元網状構造を有する。また、親水性官能基および毛細管現象と浸透圧により水分を含む。これにより、ヒドロゲルは、空気透過性と滲出液吸収性に優れているだけでなく、血液、体液、および生体組織に対して親和性を有する。
【００３４】
次に、細胞溶解物の作製ステップ（Ｓ１０２）について説明する。ここで、細胞溶解物とは、細胞を破壊して得られる細胞の構成成分を含む混合物をいう。
【００３５】
細胞は、生体試料からなり得、動物試料、植物試料、または微生物試料からなり得る。
【００３６】
細胞溶解物は、細胞の入った容器に溶解バッファを添加して調製できる。溶解バッファは、商用化された製品など、多様な物質からなり得る。また、溶解バッファのほか、蛋白質加水分解酵素のプロテイナーゼＫや、リボＤＮＡ分解酵素のＲＮアーゼをさらに添加することもできる。
【００３７】
本実施例では、核酸抽出検体に、溶解バッファ１８０μｌとプロテイナーゼＫ２０μｌを添加した混合液を、５５℃で２０分間放置し、細胞を破砕した。以後、ＲＮアーゼ２０μｌを添加し、常温で２分間さらに放置し、細胞溶解物を作製した。
【００３８】
次に、核酸のフィルタリングステップ（Ｓ１０３）についてより詳細に説明する。
【００３９】
細胞溶解物をヒドロゲルカラム１６が形成されたチューブ１４に入れた後、遠心分離を行う。ここで、遠心分離は、マイクロ遠心分離機により、２０００ｒｐｍ／２００ｒｃｆで回転させるステップを含み、回転ステップは、５分ずつ、３回行われる。
【００４０】
遠心分離過程における回転は、ヒドロゲルカラム１６が損傷しないように低速で行われる。回転速度は、１０００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍの範囲となり得る。回転速度が１０００ｒｐｍより小さければ、遠心分離が適切に行われないため、核酸がヒドロゲルカラム１６を通過できない問題があり、回転速度が３０００ｒｐｍより大きければ、ヒドロゲルカラム１６が損傷する問題が発生する。
【００４１】
遠心分離過程において、核酸は、ヒドロゲルカラム１６を通過し、排出口２４を介してハウジング１２に排出され、蛋白質などの異物は、ヒドロゲルカラム１６を通過せずに残留する。
【００４２】
本実施例では、遠心分離を用いてＤＮＡを抽出することを例示しているが、本発明はこれに限定されない。したがって、ヒドロゲルカラム１６をフィルタとして用い、圧力や電気的な方法により核酸をフィルタリングすることもできる。
【００４３】
圧力や電気的な方法を用いる場合、ヒドロゲルカラム１６は、０．５％〜５．０％のアガロースを含むことができる。圧力を用いて核酸を抽出する場合は、高い圧力でもヒドロゲルカラム１６が壊れてはならないことから、アガロースを５．０％以下として含むことが好ましい。アガロースを５．０％より多く含む場合は、気孔が小さくなり、核酸がヒドロゲルカラム１６を通過しない問題がある。
【００４４】
また、電気的な方法を用いる場合は、気孔が相対的に大きいことが有利であるため、０．５％以上のアガロースを含むことが好ましい。ヒドロゲルカラム１６が０．５％より小さいアガロースを含む場合は、気孔が過度に大きくなる問題があり、ヒドロゲルカラム１６が圧力で壊れたり、異物がアガロースゲルカラムを通して離脱する問題が発生する。
【００４５】
ヒドロゲルカラム１６は、親水性で、かつ、３次元網状構造を有するため、遠心分離工程において核酸フィルタとして作用することができる。つまり、遠心分離過程で細胞溶解物に含まれている核酸は、サイズが小さく、親水性であるため、ヒドロゲルカラム１６に形成された気孔を通過して排出口２４に排出できるのに対し、サイズが相対的に大きく、疎水性である蛋白質などの不純物は、ヒドロゲルを通過せずにチューブ１４に残留するようになる。
【００４６】
次に、核酸の抽出ステップについて説明すると、ヒドロゲルカラム１６を通過した核酸は、チューブ１４の排出口２４を介して排出され、ハウジング１２の底に移動する。
【００４７】
このように抽出された核酸は、遺伝子検査に使用可能であり、ＤＮＡチップ検査にも使用可能である。したがって、本実施例による核酸抽出方法は、抽出された核酸を遺伝子検査に用いるステップ、あるいは抽出された核酸をＤＮＡチップ検査に用いるステップを含むことができる。
【００４８】
また、このように抽出された核酸は、ポイントオブケア検査（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇ、以下、「ＰＯＣ検査」という）に用いることができる。したがって、本実施例による核酸抽出方法は、抽出された核酸をＰＯＣ検査に用いるステップをさらに含むことができる。
【００４９】
ＰＯＣ検査とは、医師の診療現場や、患者の家庭で病気の診断を可能にする検査方式である。本実施例による核酸抽出方法は、簡単な構造の装置を用いて核酸を抽出することができるので、抽出された核酸をＰＯＣ検査に容易に適用することができる。
【００５０】
また、本実施例による核酸抽出方法は、血液、血清、血漿、骨髄、尿、糞便、痰、細胞穿刺液、組織、および組織由来物質を含むヒト由来検体を検査するための核酸の抽出に適用可能である。
【００５１】
ハウジング１２の底に貯まった核酸を抽出して電気泳動結果を図２に示している。
【００５２】
図２は、本発明の第１実施例による核酸抽出方法により分離したＭＣ３Ｔ３骨芽細胞のゲノム核酸の電気泳動結果を示す写真である。図２において、レーンＭは、標準ＤＮＡマーカーであり、レーン１およびレーン２は、本発明の方法で得られたＭＣ３Ｔ３骨芽細胞のゲノムＤＮＡの電気泳動結果である。
【００５３】
図４は、本発明の第１実施例による核酸抽出方法により分離したＭＣ３Ｔ３骨芽細胞のゲノム核酸の純度を確認するために、ＰＣＲ結果を示す写真である。
【００５４】
図４において、レーンＭは、標準ＤＮＡマーカーであり、レーン１は、本発明の方法で得られたＭＣ３Ｔ３骨芽細胞のゲノムＤＮＡにおいてＧ３ＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を増幅した後の電気泳動結果を示す。レーン２および３は、商用化されたゲノムＤＮＡ抽出装置を用いて骨芽細胞のゲノムＤＮＡを抽出した後、Ｇ３ＰＤＨを増幅した後の電気泳動結果を示す。
【００５５】
本実施例では、核酸としてＤＮＡを適用することを例示しているが、本発明は、これに限定されるものではなく、ＲＮＡなど、多様な種類の核酸の分離に適用可能である。
【００５６】
臨床検体からアガロースゲルカラムを用いてＤＮＡを抽出する可能性および適正なゲル濃度を測定するための実験を行った。
【００５７】
結果物に混在し得るＰＣＲ反応抑制剤の影響を最大限に排除するために、ＤＮＡを用いた検査のうち、ハイブリダイゼーション過程を含む検査を選択した。
【００５８】
ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）ＤＮＡチップ検査が行われた頸部スワブ（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓｗａｂ）検体から選別し、アガロースゲルカラムを用いた核酸抽出方法によりＤＮＡの抽出を行い、結果物に対してＨＰＶ ＤＮＡチップ検査を行った。敏感度を推定するために、通常のＰＣＲ検査後、電気泳動結果の読み取りを併行した。検体は、ＨＰＶ−５８であって、プロテイナーゼＫ２０μｌ、ＨＰＶ検査用検体４００μｌ、溶解バッファ２００μｌを、アガロースゲルカラムが挿入されたチューブに入れ、２０００ｒｐｍ／２００ｒｃｆで、５分ずつ、３回遠心分離を行った。アガロースゲルカラムは、体積が０．３ｍｌのカラムと、体積が０．６ｍｌのカラムの２種を使用した。
【００５９】
通常のＰＣＲ検査後、その結果を電気泳動で読み取る場合、０．３ｍｌおよび０．６ｍｌのカラムとも、２％のアガロースゲル濃度でのみ結果を読み取ることができた。一方、ＤＮＡコピー数が低くても結果が得られるＤＮＡチップ検査では、０．３ｍｌのカラムにおいて１％、１．５％、２％のアガロースゲル濃度で、０．６ｍｌのカラムにおいては２％の濃度で正確なＨＰＶタイプ結果を得ることができた。
【００６０】
本実験の結果によれば、２％のアガロースゲルを用いた場合、０．３ｍｌおよび０．６ｍｌのカラムとも、ＨＰＶタイプ情報を得るための通常のＰＣＲ検査とＤＮＡチップ検査が可能であることがわかった。
【００６１】
下記の表１は、各レーンの実験条件を示す。
【表１】
【００６２】
図５は、本発明の第１実施例による核酸抽出方法により抽出したＨＰＶ細胞ＤＮＡのＰＣＲ検査後における電気泳動結果を示す写真であり、図６は、本発明の第１実施例による核酸抽出方法により抽出したＨＰＶ細胞核酸の核酸チップ検査結果を示す写真である。
【００６３】
図５および図６に示すように、通常のＰＣＲ検査後の結果を電気泳動で読み取る場合、０．３ｍｌおよび０．６ｍｌのカラムとも、２％のアガロースゲル濃度でのみ結果を読み取ることができた。一方、ＤＮＡコピー数が低くても結果が得られるＤＮＡチップ検査では、０．３ｍｌのカラムにおいて１％、１．５％、２％のアガロースゲル濃度で、０．６ｍｌのカラムにおいては２％の濃度で正確なＨＰＶタイプ結果を得ることができた。
【００６４】
本実験の結果によれば、２％のアガロースゲルを用いた場合、０．３ｍｌおよび０．６ｍｌのカラムとも、ＨＰＶタイプ情報を得るための通常のＰＣＲ検査とＤＮＡチップ検査が可能であることがわかった。
【００６５】
本実施例による核酸抽出方法の核酸の抽出効率を判定するために、従来の核酸抽出方法と比較する実験を行った。
【００６６】
核酸の抽出状態で保管されていた臨床検体の核酸抽出物に対し、従来の核酸抽出装置と本実施例による核酸抽出方法を用いてそれぞれ核酸の抽出を行った後、核酸の濃度を測定して回収率を比較した。
【００６７】
検体としてはＨＰＶ−１８を使用し、プロテイナーゼＫ２０μｌ、ＤＮＡ抽出検体２００μｌ、溶解バッファ２００μｌを入れ、２０００ｒｐｍ／２００ｒｃｆで、１５分間、遠心分離を行った。２．０％のアガロースゲル濃度で、０．３ｍｌおよび０．６ｍｌの体積を有するヒドロゲルカラムで実験を行った。検査に用いられたＤＮＡ抽出物のＤＮＡ酸濃度６５μｇ／ｍｌを基準とする従来の核酸抽出方法では、１４μｇ／ｍｌ、約２１．５％の回収率を示し、２％のアガロース濃度を有する０．３ｍｌおよび０．６ｍｌのカラムでは、それぞれ１９μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ、約２９．２％および１５．４％の回収率を示している。したがって、本実施例による核酸抽出方法の効率は、従来の核酸抽出装置に比べて臨床適用可能な範囲に属していることがわかる。このように、本実施例による核酸抽出方法は、生体試料のＤＮＡを抽出するのに特に有利である。
【００６８】
図７は、本発明の第２実施例による核酸抽出方法に用いられた核酸抽出装置を示す断面図である。
【００６９】
図７に示すように、本実施例による核酸抽出装置は、円筒状のハウジング１２と、ハウジング１２の内部に嵌設されたチューブ１４と、チューブ１４に設けられたヒドロゲルカラム１７と、チューブ１４を密閉する蓋１９とを備える。
【００７０】
本実施例による核酸抽出方法は、ヒドロゲルカラム１７の内側に注入溝１８を形成するステップをさらに含む。注入溝１８は、ヒドロゲルカラム１７の中央に形成され、円筒状となり得る。この注入溝１８は、細胞溶解物を収容可能であり、排出口２４と細胞溶解物との距離を減少させ、核酸の回収効率を向上させる。ヒドロゲルカラム１７には複数の微細な気孔が形成されるが、これらの気孔を介して遠心分離過程で核酸が排出口２４に排出される。したがって、細胞溶解物と排出口２４との距離が減少すると、核酸がより容易にヒドロゲルカラム１７を通過できるため、核酸の回収効率が向上する。
【００７１】
図８は、本発明の第３実施例による核酸抽出方法に用いられた核酸抽出装置を示す断面図である。
【００７２】
図８に示すように、本実施例による核酸抽出装置は、円筒状のハウジング１２と、ハウジング１２の内部に嵌設されたチューブ１４と、チューブ１４に設けられたヒドロゲルカラム１７と、チューブ１４を密閉する蓋１９とを備える。
【００７３】
また、本実施例による核酸抽出方法は、ヒドロゲルカラム１７が位置するチューブ１４の外周には減圧孔１５を形成するステップを含む。
【００７４】
減圧孔１５は、複数個がチューブ１４の外周に沿って離隔配置されるが、減圧孔１５は、遠心力によって発生する圧力を減少させる役割を果たす。また、ヒドロゲルカラム１７には注入溝１８が形成され、減圧孔１５は注入溝の横側に形成される。これにより、注入溝１８に位置する核酸が減圧孔１５を介してハウジング１２に排出できるため、核酸の回収効率がさらに向上する。
【００７５】
以上、本発明の好ましい実施例について説明したが、本発明は、これに限定されるものではなく、特許請求の範囲と発明の詳細な説明および添付した図面の範囲内で多様な変形が実施可能であり、これもまた、本発明の範囲に属するのはいうまでもない。
【符号の説明】
【００７６】
１２：ハウジング
１３、１９：蓋
１４：チューブ
１５：減圧孔
１６、１７：ヒドロゲルカラム
１８：注入溝
２４：排出口
【特許請求の範囲】
【請求項１】
管状のチューブ内にヒドロゲルカラムを形成するヒドロゲルカラムの作製ステップと、
細胞を破壊して細胞溶解物を得る細胞溶解物の作製ステップと、
核酸をヒドロゲルカラムを通過して排出させる核酸のフィルタリングステップと、
ヒドロゲルカラムを通過した核酸を外部に抽出する核酸の抽出ステップとを含むことを特徴とする核酸抽出方法。
【請求項２】
前記ヒドロゲルカラムは、アガロースゲルからなることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項３】
前記アガロースゲルは、１％〜２％のアガロースを含むことを特徴とする請求項２に記載の核酸抽出方法。
【請求項４】
前記アガロースゲルは、０．５％〜５％のアガロースを含むことを特徴とする請求項２に記載の核酸抽出方法。
【請求項５】
前記ヒドロゲルカラムの作製ステップは、蒸溜水にアガロースを添加し、加熱してアガロースを溶解させるステップを含むことを特徴とする請求項２に記載の核酸抽出方法。
【請求項６】
前記ヒドロゲルカラムの作製ステップは、蒸溜水とアガロースとの混合液をチューブに注入した後、硬化させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の核酸抽出方法。
【請求項７】
前記ヒドロゲルカラムには、前記チューブの長手方向につながった注入溝を形成するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項８】
前記注入溝は、前記ヒドロゲルカラムの中央に形成されていることを特徴とする請求項７に記載の核酸抽出方法。
【請求項９】
前記チューブの外周には、前記ヒドロゲルカラムと当接する複数の減圧孔を形成するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１０】
前記細胞溶解物の作製ステップは、細胞に溶解バッファとプロテイナーゼＫを添加するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１１】
前記細胞溶解物の作製ステップは、細胞にＲＮアーゼを添加するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１２】
前記ヒドロゲルカラムは、回転体形状からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１３】
前記核酸のフィルタリングステップは、遠心分離方法により核酸をフィルタリングすることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１４】
前記遠心分離方法は、１０００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍの範囲で前記ヒドロゲルカラムを回転させるステップを含むことを特徴とする請求項１３に記載の核酸抽出方法。
【請求項１５】
前記核酸のフィルタリングステップは、電気または圧力を用いてフィルタリングすることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１６】
前記細胞は、生体試料であることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１７】
前記細胞は、動物試料、植物試料、または微生物試料からなる群より選択されるいずれか一つからなることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１８】
前記核酸は、ＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１９】
抽出された核酸を遺伝子検査に用いるステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項２０】
抽出された核酸をＤＮＡチップ検査に用いるステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項２１】
抽出された核酸をポイントオブケア検査（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇ）に用いるステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項２２】
血液、血清、血漿、骨髄、尿、糞便、痰、細胞穿刺液、組織、および組織由来物質を含むヒト由来検体を検査するための核酸の抽出に適用されることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１】
管状のチューブ内にヒドロゲルカラムを形成するヒドロゲルカラムの作製ステップと、
細胞を破壊して細胞溶解物を得る細胞溶解物の作製ステップと、
核酸をヒドロゲルカラムを通過して排出させる核酸のフィルタリングステップと、
ヒドロゲルカラムを通過した核酸を外部に抽出する核酸の抽出ステップとを含むことを特徴とする核酸抽出方法。
【請求項２】
前記ヒドロゲルカラムは、アガロースゲルからなることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項３】
前記アガロースゲルは、１％〜２％のアガロースを含むことを特徴とする請求項２に記載の核酸抽出方法。
【請求項４】
前記アガロースゲルは、０．５％〜５％のアガロースを含むことを特徴とする請求項２に記載の核酸抽出方法。
【請求項５】
前記ヒドロゲルカラムの作製ステップは、蒸溜水にアガロースを添加し、加熱してアガロースを溶解させるステップを含むことを特徴とする請求項２に記載の核酸抽出方法。
【請求項６】
前記ヒドロゲルカラムの作製ステップは、蒸溜水とアガロースとの混合液をチューブに注入した後、硬化させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の核酸抽出方法。
【請求項７】
前記ヒドロゲルカラムには、前記チューブの長手方向につながった注入溝を形成するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項８】
前記注入溝は、前記ヒドロゲルカラムの中央に形成されていることを特徴とする請求項７に記載の核酸抽出方法。
【請求項９】
前記チューブの外周には、前記ヒドロゲルカラムと当接する複数の減圧孔を形成するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１０】
前記細胞溶解物の作製ステップは、細胞に溶解バッファとプロテイナーゼＫを添加するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１１】
前記細胞溶解物の作製ステップは、細胞にＲＮアーゼを添加するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１２】
前記ヒドロゲルカラムは、回転体形状からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１３】
前記核酸のフィルタリングステップは、遠心分離方法により核酸をフィルタリングすることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１４】
前記遠心分離方法は、１０００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍの範囲で前記ヒドロゲルカラムを回転させるステップを含むことを特徴とする請求項１３に記載の核酸抽出方法。
【請求項１５】
前記核酸のフィルタリングステップは、電気または圧力を用いてフィルタリングすることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１６】
前記細胞は、生体試料であることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１７】
前記細胞は、動物試料、植物試料、または微生物試料からなる群より選択されるいずれか一つからなることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１８】
前記核酸は、ＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１９】
抽出された核酸を遺伝子検査に用いるステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項２０】
抽出された核酸をＤＮＡチップ検査に用いるステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項２１】
抽出された核酸をポイントオブケア検査（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇ）に用いるステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項２２】
血液、血清、血漿、骨髄、尿、糞便、痰、細胞穿刺液、組織、および組織由来物質を含むヒト由来検体を検査するための核酸の抽出に適用されることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１１−５２５８０６（Ｐ２０１１−５２５８０６Ａ）
【公表日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１６１１９（Ｐ２０１１−５１６１１９）
【出願日】平成２１年６月２２日（２００９．６．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００３３４１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５７６８０
【国際公開日】平成２１年１２月３０日（２００９．１２．３０）
【出願人】（５０６３７６４５８）ポステック アカデミー−インダストリー ファンデーション (28)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２２日（２００９．６．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００３３４１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５７６８０
【国際公開日】平成２１年１２月３０日（２００９．１２．３０）
【出願人】（５０６３７６４５８）ポステック アカデミー−インダストリー ファンデーション (28)
【Ｆターム（参考）】
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