核酸検出方法
（ａ）増幅された標的核酸を、固相担体に結合させた第１のプローブと接触させ、増幅された標的核酸を第１のプローブに結合させる工程、（ｂ）結合しなかった標的核酸を除去する工程、（ｃ）蛍光分子で標識された第２のプローブを、第１のプローブに結合した標的核酸と接触させ、該第２のプローブを標的核酸に結合させる工程（ｄ）結合しなかった第２のプローブを除去する工程、及び（ｅ）標的核酸に結合した第２のプローブの蛍光を検出する工程を含む標的核酸を検出するための方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＴ−ＰＣＲは、増幅対象塩基配列がＲＮＡである場合に、逆転写酵素を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに転写し、その後ＰＣＲを行うものである。したがって、ＳＡＲＳウイルス、インフルエンザウイルス、ＨＣＶウイルス等のヒトに対して重篤な影響を与えるＲＮＡウイルスの検出には、ＲＴ−ＰＣＲ法が用いてｃＤＮＡを増幅し、増幅されたｃＤＮＡをプローブで検出する方法が利用されてきた。
しかし、検出用プローブは、ＤＮＡであるため、ＤＮＡ分解酵素に感受性であり、室温での管理が困難である等のＤＮＡの有する性質に由来する欠点を有していた。
この欠点を解消する方法として、ＤＮＡ分解酵素に耐性であるＰＮＡを用いる方法が提唱されている（特許文献１及び２）。
また、ＲＴ−ＰＣＲ法によるＳＡＲＳコロナウイルス遺伝子の検出におけるＲＴ−ＰＣＲの感度は、使用する酵素のメーカーやＰＣＲチューブの材質、サーマルサイクラーの機種によって大きく影響を受けることが知られている（非特許文献１）。
したがって、優れた検出感度を有するウイルス検出方法及び検出用キットの開発が望まれている。
【特許文献１】特許２７５８９８８号公報
【特許文献２】特表平１１−５１２６１７号公報
【非特許文献１】国立感染症研究所ウイルス第三部第１室、ＲＴ−ＰＣＲ法によるＳＡＲＳコロナウイルス遺伝子の検出、［ｏｎｌｉｎｅ］、平成１５年５月１６日、［平成１５年７月１４日検索］、インターネット、ｈｔｔｐ：／／ｉｄｓｃ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／ｏｔｈｅｒｓ／ｕｒｇｅｎｔ／ｕｐｄａｔｅ５６−ｂ．ｈｔｍｌ
【発明の開示】
【０００３】
したがって、本発明は、生物学的試料中において、優れた検出感度を有する核酸検出方法及び検出用キットを提供することを目的とする。
【０００４】
本発明者らは、従来技術の上記課題を解消すべく研究を重ねた結果、驚くべきことに、ペプチド核酸を利用することによって、従来のウイルス検出法に比べて著しく優れた検出感度を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、この発明は、
下記工程：
（ａ）増幅された標的核酸を、固相担体に結合させた第１のプローブと接触させ、増幅された標的核酸を第１のプローブに結合させる工程、
（ｂ）結合しなかった標的核酸を除去する工程、
（ｃ）蛍光分子で標識された第２のプローブを、第１のプローブに結合した標的核酸と接触させ、該第２のプローブを標的核酸に結合させる工程
（ｄ）結合しなかった第２のプローブを除去する工程、及び
（ｅ）標的核酸に結合した第２のプローブの蛍光を検出する工程
を含む標的核酸を検出するための方法である。
【０００６】
また、この発明は、第１のプローブ及び第２のプローブが、ペプチド核酸である、標的核酸を検出するための方法である。
【０００７】
また、この発明は、固相担体が、メチルベンズヒドリルアミン樹脂である、標的核酸を検出するための方法である。
【０００８】
また、この発明は、固相担体の形状が、球状である、標的核酸を検出するための方法である。
【０００９】
また、この発明は、固相担体当たりの第１のプローブ数が、１〜１００個である、標的核酸を検出するための方法である。
【００１０】
また、この発明は、蛍光分子が、Ｑｄｏｔ（登録商標）である、標的核酸を検出するための方法である。
【００１１】
また、この発明は、上記工程（ａ）の前に、さらに、標的核酸を増幅する工程を含む、標的核酸を検出するための方法である。
【００１２】
また、この発明は、標的核酸が、生物学的試料中に存在する、標的核酸を検出するための方法である。
【００１３】
また、この発明は、標的核酸が、ウイルスである、標的核酸を検出するための方法である。
【００１４】
また、この発明は、ウイルスが、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＳＡＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスである、標的核酸を検出するための方法である。
【００１５】
また、この発明は、標的核酸当たりの第２のプローブの数が、１〜２０個である、標的核酸を検出するための方法である。
【００１６】
また、この発明は、固相担体に結合させた第１のプローブ及び蛍光分子で標識された第２のプローブを含む、核酸検出用キットである。
【００１７】
本発明のウイルス検出方法は、生物学的試料において、従来のウイルス検出法に比べて著しく優れた検出感度を有するという効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
この発明において、標的核酸は、特に制限されることなく、公知のいずれのＤＮＡ及びＲＮＡを用いることができる。好ましくは、標的核酸は、ウイルスであり、より好ましくは、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＳＡＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスのようなヒトに重篤な影響を与える外来性ウイルスである。
【００１９】
核酸の増幅は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用することができ、例えば、ＤＮＡやｃＤＮＡの増幅には、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号公報）やＩＣＡＮ法（特開２００１−１３６９６５）を用いることができる。
【００２０】
本発明でＰＣＲ（ポリメラーゼチェイン反応）とは、２本鎖のＤＮＡの特定領域のみを繰り返し複製し、増幅する方法をいい、また、ＲＴ−ＰＣＲとは、増幅対象塩基配列がＲＮＡである場合に、逆転写酵素を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに転写し、その後ＰＣＲを行い、増幅対象塩基配列の増幅を行うものをいう。
【００２１】
ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲに用いる酵素、バッファー等は、市販のＲＴ−ＰＣＲキット、例えば、プロメガ社製ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩＴＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いることができる。また、ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲの実施条件は、製造業者の指示にしたがって行うことができる。
【００２２】
ＰＣＲの反応液は、通常、バッファー、ＭｇＣｌ２やＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、及び耐熱性ポリメラーゼを含む。上記塩類は、適宜、他の塩類に変更して使用することができる。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質、ジメチルスルホキシドや界面活性剤等を添加することもできる。
【００２３】
本発明でプローブとは、標的核酸の一部又は全部の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列を有する核酸をいい、標的核酸と特異的に結合することができるものをいう。プローブは、ペプチド核酸であることが好ましい。
【００２４】
本発明で第１のプローブとは、標的核酸の一部又は全部の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸であり、好ましくは、標的核酸の末端部分の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸である。固相担体当たりの第１のプローブの数は、好ましくは、１〜１００個であり、より好ましくは、１〜１０個であり、最も好ましくは、４〜６個である。
【００２５】
本発明で第２のプローブとは、蛍光分子で標識された、標的核酸の一部又は全部の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸であり、上記第１のプローブの塩基配列と相互に重複しないことが望ましい。標的核酸当たりの第２のプローブの数は、好ましくは、１〜２０個であり、より好ましくは、１〜１０個であり、最も好ましくは、３〜５個である。
【００２６】
本発明の蛍光標識としては、公知の任意の蛍光標識を用いることができ、好ましくは、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、Ｑｄｏｔ（登録商標）であり、より好ましくはＱｄｏｔ（登録商標）である。
【００２７】
本発明における固相担体としては、任意の樹脂を用いることができ、好ましくは、メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ラテックス樹脂又は磁性粒子であり、より好ましくは、メチルベンズヒドリルアミン樹脂である。
【００２８】
固相担体は、任意の形状であることができ、好ましくは、球状である。大きさ（粒径）は、好ましくは２０ｎｍ〜２０００μｍ、より好ましくは２０〜３０μｍである。
【００２９】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ニールセンによって開発されたペプチド骨格に核酸塩基を有する分子であり（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ ａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，（１９９１）、１４９７−１５００頁）、具体的には、２−アミノエチルグリシンを骨格単位とし、これにメチレンカルボニル基を介して核酸塩基を結合させた構造を有する化合物である（特許第２７５８９８８号公報）。
【００３０】
ＰＮＡは、ＤＮＡやＲＮＡにはない下記の利点を有する：
（ａ）ＤＮＡやＲＮＡの糖リン酸骨格は、中性条件で負電荷を帯びていて相補鎖間の静電的な反発があるが、ＰＮＡの背骨構造は、もともと電荷を有さないので静電的な反発がない。そのため、ハイブリダイゼーション時のｐＨや塩濃度に依存しない。
（ｂ）ＰＮＡやＰＮＡ／ＤＮＡは、核酸分解酵素やタンパク質分解酵素に対して耐性を示すため、保存が容易であり、また、細胞内で用いることができる。
（ｃ）ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体は、ＤＮＡ／ＤＮＡ複合体に比べてより安定であるので、ＤＮＡに比べてより短い長さのプライマーを用いることができる。
（ｄ）ＰＮＡは、相補的な塩基配列を有するＤＮＡやＲＮＡに対して従来の核酸に比べて非常に高い融解温度（Ｔｍ）を示し、この融点は、ミスマッチと呼ばれる非相補的な塩基が１つ導入されるだけで大きく低下することから、きわめて優れた塩基特異性を有する。
【００３１】
ＰＮＡの合成は、ＤＮＡ又はＲＮＡを構成する４種の塩基（Ａ、Ｔ（Ｕ）、Ｃ及びＧ）のいずれかを導入したアミノ酸（特にグリシン）誘導体（モノマーユニット）を、目的とする塩基配列にしたがって、通常の固相ペプチド合成法を用いて順次結合していくことによって行うことができる。
【００３２】
また、合成ペプチドと同様に、ペプチド合成機を用いて、従来のＦｍｏｃ法又はｔＢｏｃ法で合成することができる。
【００３３】
蛍光色素のような機能性分子を導入したＰＮＡは、例えば、特願２００２−１２１６６７に記載の方法にしたがって製造することができる。
【００３４】
即ち、保護基によって保護されたアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを有するＰＮＡモノマーユニットを、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨと反応させてＰＮＡオリゴマーを合成した後、ピペリジン処理によってＦｍｏｃ−ω−アミノ酸部位の脱保護を行って末端アミノ基を有するω−アミノ酸へと変換し、該ＰＮＡオリゴマー一に遊離カルボン酸を有する機能性分子を縮合導入し、さらに前記保護基の脱保護を超強酸処理によって行うことで、機能性ＰＮＡオリゴマーを製造することができる。
【００３５】
プローブの標的となる塩基配列としては、例えば、早期診断を目指すウイルス中の比較的安定な塩基配列である。その配列の中から、Ｔｍ、ＧＣ含量、同一塩基の繰り返し数、設計対象領域、ハイブリダイゼーション時の塩濃度等の条件を考慮して、約１５塩基対の長さを有する塩基配列を１箇所又は複数箇所を標的配列として選択することができる。プローブの配列は、標的配列と相補的であるが、お互いが重ならないように設計することが好ましい。
【００３６】
本発明の生物学的試料としては、動植物組織、体液、排泄物等の生体にゆらいする任意の試料を用いることができる。
【実施例１】
【００３７】
ＳＡＲＳ検出用ＰＮＡの合成
（塩基配列認識領域の選択）
検出対象ウイルスとして、ＳＡＲＳウイルスを選択した。ＳＡＲＳウイルスのゲノムは、一本鎖、＋鎖のＲＮＡからなる。ＳＡＲＳウイルスの全ゲノム配列は、２００３年４月１７日に受入番号ＡＹ２７８７４１でＧｅｎＢａｎｋに登録されている。プローブは、ＳＡＲＳウイルスの全ゲノム配列の中の比較的安定な領域である塩基配列１５２７１〜１５４００の中から、３箇所の連続する１５塩基対からなる配列をプローブとして選択した（ｐＳＡＲ１ｓ１（１５）、ｐＳＡＲ１ｓ２（１５）、ｐＳＡＲ１ｓ３（１５））。また、これらの配列に相補的な配列もプローブとして選択した（ｐＳＡＲ１ａｓ１（１５）、ｐＳＡＲ１ａｓ２（１５）、ｐＳＡＲ１ａｓ３（１５））。さらに、これらの配列の中から連続する１２塩基対からなる配列をプローブとして選択した。プローブとして選択した配列を下記に示す。
【００３８】
ＡＡＡＣＡＴＡＡＣＡＣＴＴＧＣ ｐＳＡＲ１ｓ１（１５）
ＴＣＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＣ ｐＳＡＲ１ｓ２（１５）
ＣＴＡＡＣＧＡＧＴＧＴＧＣＧＣ ｐＳＡＲ１ｓ３（１５）
ＧＣＡＡＧＴＧＴＴＡＴＧＴＴＴ ｐＳＡＲ１ａｓ１（１５）
ＧＴＡＧＡＡＡＣＧＧＴＧＴＧＡ ｐＳＡＲ１ａｓ２（１５）
ＧＣＧＣＡＣＡＣＴＣＧＴＴＡＧ ｐＳＡＲ１ａｓ３（１５）
ＣＡＴＡＡＣＡＣＴＴＧＣ ｐＳＡＲ１ｓ１（１２）
ＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＣ ｐＳＡＲ１ｓ２（１２）
ＡＣＧＡＧＴＧＴＧＣＧＣ ｐＳＡＲ１ｓ３（１２）
ＡＧＴＧＴＴＡＴＧＴＴＴ ｐＳＡＲ１ａｓ１（１２）
ＧＡＡＡＣＧＧＴＧＴＧＡ ｐＳＡＲ１ａｓ２（１２）
ＣＡＣＡＣＴＣＧＴＴＡＧ ｐＳＡＲ１ａｓ３（１２）
【００３９】
（塩基配列認識領域：ｐＳＡＲ１ｓ１（１５）の調製）
固相Ｆｍｏｃ法（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．Ａ．；Ｊｏｓｅｙ，Ｊ．Ａ．；Ｃａｄｉｌｌａ，Ｒ．；Ｇａｕｌ，Ｍ．Ｄ．；Ｈａｓｓｍａｍ，Ｃ．Ｆ．；Ｌｕｓｓｉｏ，Ｍ．Ｊ．；Ｐｉｐｅ，Ａ．Ｊ．；Ｒｅｅｄ，Ｋ．Ｌ．；Ｒｉｃｃａ，Ｄ．Ｊ．；Ｗｉｅｔｈｅ，Ｒ．Ｗ．；Ｎｏｂｌｅ，Ｓ．Ａ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９５，５１，６１７９−９４）に従い、固相担体ＭＢＨＡ（５０ｍｇ、２４．５μｍｏｌ）に各塩基のＰＮＡモノマーユニット（チミン１０．１ｍｇ、シトシン１４．０ｍｇ、アデニン１４．０ｍｇ、グアニン１４．８ｍｇ；各２０μｍｏｌ；アプライドバイオシステムズ社から購入）と縮合剤ＨＡＴＵ（７．６ｍｇ、２０μｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．０μＬ、２０μｍｏｌ）を用いて逐次伸長反応を行った。
【００４０】
（アミノリンカー部位の調製）
次いで、アミノリンカー用ω−アミノ酸−Ｂｏｃ−７−アミノヘプタン酸（５．２ｍｇ、２０μｍｏｌ）を、縮合剤ＨＢＴＵ（７．６ｍｇ、２０μｍｏｌ）とＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン；７．６ｍｇ、２０μｍｏｌ）を用いて縮合させた。
【００４１】
（ｐＳＡＲ１ｓ１（１５，ＮＨ２）の精製）
ユニットを逐次縮合したあと、常法（ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）／ｐ−クレゾール／チオアニソール＝６０／２５／１０／１０）により固相担体からの切り出しとＢｏｃ基の脱保護を同時に行い、後処理して、目的とするｐＳＡＲ１ｓ１（１５，ＮＨ２）を得た。分子量（Ｃ１６９Ｈ２１６Ｎ９０Ｏ４２の計算値）は、４１８０．１０であり、ＵＶ・ｍａｘ（Ｈ２Ｏ）は、３０３及び５４８（ｎｍ）であった。
【００４２】
また、同様な手法を用いて、異なった塩基配列を有する１１種類のＳＡＲＳ検出用ＰＮＡをさらに合成した。
【実施例２】
【００４３】
ＳＡＲＳ検出用ＰＮＡであるｐＳＡＲ１ｓ１（１５，ビオチン）（構造式：ビオチン−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯＮＨ−ＡＡＡＣＡＴＡＡＣＡＣＴＴＧＣ−ＣＯＮＨ２、ビオチンは、ビタミンＨのことである。）の合成
【００４４】
精製したｐＳＡＲ１ｓ１（１５，ＮＨ２）（１ｍｇ、０．２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（ジメチルホルムアミド；１００μＬ）、ビオチンＯＳｕ（１ｍｇ、３μｍｏｌ）とＤＩＥＡ（１ｍｇ）を用いて縮合させた。後処理して、ＨＰＬＣで精製して、目的とするｐＳＡＲ１ｓ１（１５，ビオチン）を得た。分子量（Ｃ１７９Ｈ２３０Ｎ９２Ｏ４４Ｓの計算値）は、４４０６．４１であった。
【００４５】
また、同様な手法を用いて、異なった塩基配列を有する１１種類のＳＡＲＳ検出用ＰＮＡをさらに合成した。
【実施例３】
【００４６】
ＳＡＲＳ検出用ＰＮＡであるｐＳＡＲ１ｓ２（１５，ＦＩＴＣ）（構造式：フルオレセイン−ＣＳＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯＮＨ−ＴＣＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＣ−ＣＯＮＨ２）の合成
【００４７】
精製したｐＳＡＲ１ｓ２（１５，ＮＨ２）（１ｍｇ、０．２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（ジメチルホルムアミド；１００μＬ）に溶解し、ＦＩＴＣ（１ｍｇ、３μｍｏｌ）とＤＩＥＡ（１ｍｇ）を用いて縮合させた。後処理して、ＨＰＬＣで精製して、目的とするｐＳＡＲ１ｓ２（１５，ＦＩＴＣ）を得た。分子量（Ｃ１７９Ｈ２３０Ｎ９２Ｏ４４Ｓの計算値）は、４４０６．４１であった。
【００４８】
また、同様な手法を用いて、異なった塩基配列を有するｐＳＡＲ１ｓ３（１５，ＦＩＴＣ）（構造式：フルオレセイン−ＣＳＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯＮＨ−ＣＴＡＡＣＧＡＧＴＧＴＧＣＧＣ−ＣＯＮＨ２）をさらに合成した。
【実施例４】
【００４９】
ＳＡＲＳ検出用ＰＮＡを結合したマイクロビーズの調製（その１）
ｐＳＡＲ１ａｓ３（１５，ＮＨ２）（最終濃度１００μＭ）の５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）溶液に１％Ｅｓｔａｐｏｒ（Ｄｕｋｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製磁性粒子）を加え、２０分撹拌した後、ＷＳＣＩ塩酸塩（最終濃度１００μＭ）を加えて、縮合反応を室温で３時間行った。反応終了後、磁石にて磁性粒子を固定した後、残りの反応溶液を捨て、次いで５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）溶液で２回洗浄した。乾燥させた後、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）溶液を加え、懸濁液として４℃で保存した。
【実施例５】
【００５０】
ＳＡＲＳ検出用ＰＮＡを結合したマイクロビーズの調製（その２）
ｐＳＡＲ１ａｓ３（１５，ＮＨ２）（最終濃度１００μＭ）の５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）溶液に１％試薬用ラテックス（Ｌｏｔ．＃Ｃ９７Ｄ０７Ｃ，粒径０．３０４μｍ）を加え、２０分撹拌した後、ＷＳＣＩ塩酸塩（最終濃度１００μＭ）を加えて、縮合反応を室温で３時間行った。反応終了後、遠心操作（１０００ｒｐｍ，５分）して、ペレットを回収し、次いで５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）溶液で２回洗浄した。乾燥させた後、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）溶液を加え、懸濁液として４℃で保存した。
【実施例６】
【００５１】
ＳＡＲＳ検出用ＰＮＡを結合したマイクロプレートの調製
ｐＳＡＲ１ｓ１（１２，ビオチン）、ｐＳＡＲ１ａｓ３（１２，ビオチン）、ｐＳＡＲ１ｓ１（１５，ビオチン）及びｐＳＡＲ１ａｓ３（１５，ビオチン）（各最終濃度３２０ｎＭ）の１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０の混合溶液をストレプトアビジン塗布９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに５０μＬを注ぎ、室温で３時間撹拌した。各ウェルを１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０の混合溶液を用いて３回洗浄した。
【実施例７】
【００５２】
ＰＮＡマイクロビーズを用いたＳＡＲＳ検出擬似実験（その１）
ｐＳＡＲ１ｓ１を結合したＥｓｔａｐｏｒ型磁性粒子懸濁液５ｍＬとＳＡＲＳウイルス由来ｃＤＮＡ断片ＳＡＲ１ａｓ（５’−ＧＣＧＣＡＣＡＣＴＣＧＴＴＡＧＣＴＡＡＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＣＧＧＴＧＴＧＡＴＡＡＧＴＴＡＣＡＧＣＡＡＧＴＧＴＴＡＴＧＴＴＴ−３’）（最終濃度１０ｎＭ）の反応溶液５０ｍＬを９４℃で５分間アニーリングし、１０分間放冷した。その後磁石で磁性粒子を引き寄せた後、５０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．２）で洗浄した。その後、ｐＳＡＲ１ｓ２（１５，ＦＩＴＣ）とｐＳＡＲ１ｓ３（１５，ＦＩＴＣ）（各最終濃度１０ｎＭ）を加え、１０分撹拌して、同様に洗浄した。対象群として、Ｅｓｔａｐｏｒ型磁性粒子のみの群を設けた。
【００５３】
その結果、対象群においては、蛍光が検出されなかったのに対し、ｐＳＡＲ１ｓ１処理群では、強度の蛍光が目視によって観察された。
【実施例８】
【００５４】
ＰＮＡマイクロビーズを用いたＳＡＲＳ検出擬似実験（その２）
ｐＳＡＲ１ｓ１を結合したセキスイ試薬用ラテックス粒子懸濁液５ｍＬとＳＡＲＳウィルス由来ｃＤＮＡ断片ＳＡＲ１ａｓ（５’−ＧＣＧＣＡＣＡＣＴＣＧＴＴＡＧＣＴＡＡＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＣＧＧＴＧＴＧＡＴＡＡＧＴＴＡＣＡＧＣＡＡＧＴＧＴＴＡＴＧＴＴＴ−３’）（最終濃度１０ｎＭ）の反応溶液５０ｍＬを９４℃で５分間アニーリングし、１０分放冷した。その後磁石で磁性粒子を引き寄せた後、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）で洗浄した。その後、ｐＳＡＲ１ｓ２（１５，ＦＩＴＣ）とｐＳＡＲ１ｓ３（１５，ＦＩＴＣ）（各最終濃度１０ｎＭ）を加え、１０分撹拌して、同様に洗浄した。対象群として、ラテックス粒子懸濁液のみの群を設けた。
【００５５】
その結果、対象群においては、蛍光が検出されなかったのに対し、ｐＳＡＲ１ｓ１処理群では、強度の蛍光が目視によって観察された。
【実施例９】
【００５６】
ＰＮＡマイクロプレートを用いたＳＡＲＳ検出擬似実験
Ｎｕｎｃ社製アビジン固定プレートにｐＳＡＲ１ｓ２を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、ビオチンのＰＢＳ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、さらに各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄し、未反応のアビジンを処理した。本反応プレートにＳＡＲＳウイルス由来ＤＮＡ断片ＳＡＲ１ａｓ（５’−ＧＣＡＡＧＴＧＴＴＡＴＧＴＴＡＡＡＧＴＡＧＡＡＡＣＧＧＴＧＴＧＡＴＴＴＧＣＧＣＡＣＡＣＴＣＧＴＴＡＧ−３’）のＰＢＳ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、ＳＡＲＳ検出用ＰＮＡであるｐＳＡＲ１ｓ１（１５，ビオチン）（構造式：ビオチン−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯＮＨ−ＡＡＡＣＡＴＡＡＣＡＣＴＴＧＣ−ＣＯＮＨ２、ビオチンは、ビタミンＨのことである。）のＰＢＳ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、アビジン標識ＨＲＰのＰＢＳ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、Ｈ２Ｏ２含有ＴＭＢ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分間発色反応を行った。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、２ＮＨ２ＳＯ４を１ウェル当たり５０μｌ添加し、反応を停止し、分光光度計にて波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００５７】
その結果、ＳＡＲＳウイルス由来ＤＮＡ断片ＳＡＲ１ａｓの濃度依存的に、蛍光強度の増大が観察された。
ＤＮＡ（ｎＭ） 吸光度（４５０ｎｍ）
０．００ ０．０５３８
０．２５ ０．０６００
０．７４ ０．１９９０
２．２２ ０．５１２０
６．６７ ０．８６００
２０．００ １．２２４９
６０．００ １．７３８８
【実施例１０】
【００５８】
ＰＮＡマイクロプレートを用いたＳＡＲＳ検出擬似実験（その２）
Ｎｕｎｃ社製化学結合用カルボン酸固定プレートにｐＳＡＲ１ｓ３（１５，ＮＨ２）のＥＤＣ含有溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、本反応プレートにＳＡＲＳウイルス由来ＤＮＡ断片ＳＡＲ１ａｓ（５’−ＧＣＡＡＧＴＧＴＴＡＴＧＴＴＡＡＡＧＴＡＧＡＡＡＣＧＧＴＧＴＧＡＴＴＴＧＣＧＣＡＣＡＣＴＣＧＴＴＡＧ−３’）のＰＢＳ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、ＳＡＲＳ検出用ＰＮＡであるｐＳＡＲ１ｓ２（１５，ビオチン）のＰＢＳ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、アビジン標識ＨＲＰのＰＢＳ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、Ｈ２Ｏ２含有ＴＭＢ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分間発色反応を行った。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、２ＮＨ２ＳＯ４を１ウェル当たり５０μｌ添加し、反応を停止し、分光光度計にて波長４９０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００５９】
その結果、ＳＡＲＳウイルス由来ＤＮＡ断片ＳＡＲ１ａｓの濃度依存的に、蛍光強度の増大が観察された。
ＤＮＡ（ｎＭ） 吸光度（４５０ｎｍ）
０．００ ０．０８
０．０８ ０．１０
０．２５ ０．１２
０．７４ ０．２５
２．２２ ０．５９
６．６７ ２．４７
２０．００ 測定範囲超過
６０．００ 測定範囲超過
【００６０】
また、ｐＳＡＲ１ｓ２（１５，ビオチン）を固定したＮｕｎｃ社製アビジン固定プレートと比較した場合、ＤＮＡの検出感度の１０倍程度の増大が認められた。
【００６１】
実施例１０において、反応プレート上にＳＡＲＳウイルス由来ＤＮＡ断片ＳＡＲ１ａｓ、ＳＡＲＳ検出用ＰＮＡであるｐＳＡＲ１ｓ２（１５，ビオチン）を段階的にハイブリダイゼーションさせたが、反応プレート上にＳＡＲＳウイルス由来ＤＮＡ断片ＳＡＲ１ａｓとＳＡＲＳ検出用ｐＳＡＲ１ｓ２（１５，ビオチン）を同時にハイブリダイゼーションさせた場合も、実施例１０と同様な感度の高い検出能が得られた。
【００６２】
以上の結果から、生体内ウイルスの、複数の検出用ＰＮＡによる同時検出が可能であることが示された。これは、複数のハイブリダイゼーションを一括して行うことができることを意味し、迅速且つ高感度な標的核酸検出が可能であることを示した。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本標的核酸の検出方法を用いることにより、第２プローブ集積に伴った検出感度の著しい増加が予想される。このことは、従来の検出方法では検出できなかった極微量にしか存在しない生体内ウイルスの有無を、ＰＣＲ法等の増幅方法をとらなくても、確認できることを示す。極微量ウイルスの検出は人類の感染症問題を解決する手段として、また、感染症予防の観点からも、必須な事柄であり、今後この検出方法は新規産業創出のシーズとなり得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＴ−ＰＣＲは、増幅対象塩基配列がＲＮＡである場合に、逆転写酵素を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに転写し、その後ＰＣＲを行うものである。したがって、ＳＡＲＳウイルス、インフルエンザウイルス、ＨＣＶウイルス等のヒトに対して重篤な影響を与えるＲＮＡウイルスの検出には、ＲＴ−ＰＣＲ法が用いてｃＤＮＡを増幅し、増幅されたｃＤＮＡをプローブで検出する方法が利用されてきた。
しかし、検出用プローブは、ＤＮＡであるため、ＤＮＡ分解酵素に感受性であり、室温での管理が困難である等のＤＮＡの有する性質に由来する欠点を有していた。
この欠点を解消する方法として、ＤＮＡ分解酵素に耐性であるＰＮＡを用いる方法が提唱されている（特許文献１及び２）。
また、ＲＴ−ＰＣＲ法によるＳＡＲＳコロナウイルス遺伝子の検出におけるＲＴ−ＰＣＲの感度は、使用する酵素のメーカーやＰＣＲチューブの材質、サーマルサイクラーの機種によって大きく影響を受けることが知られている（非特許文献１）。
したがって、優れた検出感度を有するウイルス検出方法及び検出用キットの開発が望まれている。
【特許文献１】特許２７５８９８８号公報
【特許文献２】特表平１１−５１２６１７号公報
【非特許文献１】国立感染症研究所ウイルス第三部第１室、ＲＴ−ＰＣＲ法によるＳＡＲＳコロナウイルス遺伝子の検出、［ｏｎｌｉｎｅ］、平成１５年５月１６日、［平成１５年７月１４日検索］、インターネット、ｈｔｔｐ：／／ｉｄｓｃ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／ｏｔｈｅｒｓ／ｕｒｇｅｎｔ／ｕｐｄａｔｅ５６−ｂ．ｈｔｍｌ
【発明の開示】
【０００３】
したがって、本発明は、生物学的試料中において、優れた検出感度を有する核酸検出方法及び検出用キットを提供することを目的とする。
【０００４】
本発明者らは、従来技術の上記課題を解消すべく研究を重ねた結果、驚くべきことに、ペプチド核酸を利用することによって、従来のウイルス検出法に比べて著しく優れた検出感度を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、この発明は、
下記工程：
（ａ）増幅された標的核酸を、固相担体に結合させた第１のプローブと接触させ、増幅された標的核酸を第１のプローブに結合させる工程、
（ｂ）結合しなかった標的核酸を除去する工程、
（ｃ）蛍光分子で標識された第２のプローブを、第１のプローブに結合した標的核酸と接触させ、該第２のプローブを標的核酸に結合させる工程
（ｄ）結合しなかった第２のプローブを除去する工程、及び
（ｅ）標的核酸に結合した第２のプローブの蛍光を検出する工程
を含む標的核酸を検出するための方法である。
【０００６】
また、この発明は、第１のプローブ及び第２のプローブが、ペプチド核酸である、標的核酸を検出するための方法である。
【０００７】
また、この発明は、固相担体が、メチルベンズヒドリルアミン樹脂である、標的核酸を検出するための方法である。
【０００８】
また、この発明は、固相担体の形状が、球状である、標的核酸を検出するための方法である。
【０００９】
また、この発明は、固相担体当たりの第１のプローブ数が、１〜１００個である、標的核酸を検出するための方法である。
【００１０】
また、この発明は、蛍光分子が、Ｑｄｏｔ（登録商標）である、標的核酸を検出するための方法である。
【００１１】
また、この発明は、上記工程（ａ）の前に、さらに、標的核酸を増幅する工程を含む、標的核酸を検出するための方法である。
【００１２】
また、この発明は、標的核酸が、生物学的試料中に存在する、標的核酸を検出するための方法である。
【００１３】
また、この発明は、標的核酸が、ウイルスである、標的核酸を検出するための方法である。
【００１４】
また、この発明は、ウイルスが、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＳＡＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスである、標的核酸を検出するための方法である。
【００１５】
また、この発明は、標的核酸当たりの第２のプローブの数が、１〜２０個である、標的核酸を検出するための方法である。
【００１６】
また、この発明は、固相担体に結合させた第１のプローブ及び蛍光分子で標識された第２のプローブを含む、核酸検出用キットである。
【００１７】
本発明のウイルス検出方法は、生物学的試料において、従来のウイルス検出法に比べて著しく優れた検出感度を有するという効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
この発明において、標的核酸は、特に制限されることなく、公知のいずれのＤＮＡ及びＲＮＡを用いることができる。好ましくは、標的核酸は、ウイルスであり、より好ましくは、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＳＡＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスのようなヒトに重篤な影響を与える外来性ウイルスである。
【００１９】
核酸の増幅は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用することができ、例えば、ＤＮＡやｃＤＮＡの増幅には、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号公報）やＩＣＡＮ法（特開２００１−１３６９６５）を用いることができる。
【００２０】
本発明でＰＣＲ（ポリメラーゼチェイン反応）とは、２本鎖のＤＮＡの特定領域のみを繰り返し複製し、増幅する方法をいい、また、ＲＴ−ＰＣＲとは、増幅対象塩基配列がＲＮＡである場合に、逆転写酵素を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに転写し、その後ＰＣＲを行い、増幅対象塩基配列の増幅を行うものをいう。
【００２１】
ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲに用いる酵素、バッファー等は、市販のＲＴ−ＰＣＲキット、例えば、プロメガ社製ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩＴＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いることができる。また、ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲの実施条件は、製造業者の指示にしたがって行うことができる。
【００２２】
ＰＣＲの反応液は、通常、バッファー、ＭｇＣｌ２やＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、及び耐熱性ポリメラーゼを含む。上記塩類は、適宜、他の塩類に変更して使用することができる。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質、ジメチルスルホキシドや界面活性剤等を添加することもできる。
【００２３】
本発明でプローブとは、標的核酸の一部又は全部の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列を有する核酸をいい、標的核酸と特異的に結合することができるものをいう。プローブは、ペプチド核酸であることが好ましい。
【００２４】
本発明で第１のプローブとは、標的核酸の一部又は全部の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸であり、好ましくは、標的核酸の末端部分の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸である。固相担体当たりの第１のプローブの数は、好ましくは、１〜１００個であり、より好ましくは、１〜１０個であり、最も好ましくは、４〜６個である。
【００２５】
本発明で第２のプローブとは、蛍光分子で標識された、標的核酸の一部又は全部の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸であり、上記第１のプローブの塩基配列と相互に重複しないことが望ましい。標的核酸当たりの第２のプローブの数は、好ましくは、１〜２０個であり、より好ましくは、１〜１０個であり、最も好ましくは、３〜５個である。
【００２６】
本発明の蛍光標識としては、公知の任意の蛍光標識を用いることができ、好ましくは、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、Ｑｄｏｔ（登録商標）であり、より好ましくはＱｄｏｔ（登録商標）である。
【００２７】
本発明における固相担体としては、任意の樹脂を用いることができ、好ましくは、メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ラテックス樹脂又は磁性粒子であり、より好ましくは、メチルベンズヒドリルアミン樹脂である。
【００２８】
固相担体は、任意の形状であることができ、好ましくは、球状である。大きさ（粒径）は、好ましくは２０ｎｍ〜２０００μｍ、より好ましくは２０〜３０μｍである。
【００２９】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ニールセンによって開発されたペプチド骨格に核酸塩基を有する分子であり（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ ａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，（１９９１）、１４９７−１５００頁）、具体的には、２−アミノエチルグリシンを骨格単位とし、これにメチレンカルボニル基を介して核酸塩基を結合させた構造を有する化合物である（特許第２７５８９８８号公報）。
【００３０】
ＰＮＡは、ＤＮＡやＲＮＡにはない下記の利点を有する：
（ａ）ＤＮＡやＲＮＡの糖リン酸骨格は、中性条件で負電荷を帯びていて相補鎖間の静電的な反発があるが、ＰＮＡの背骨構造は、もともと電荷を有さないので静電的な反発がない。そのため、ハイブリダイゼーション時のｐＨや塩濃度に依存しない。
（ｂ）ＰＮＡやＰＮＡ／ＤＮＡは、核酸分解酵素やタンパク質分解酵素に対して耐性を示すため、保存が容易であり、また、細胞内で用いることができる。
（ｃ）ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体は、ＤＮＡ／ＤＮＡ複合体に比べてより安定であるので、ＤＮＡに比べてより短い長さのプライマーを用いることができる。
（ｄ）ＰＮＡは、相補的な塩基配列を有するＤＮＡやＲＮＡに対して従来の核酸に比べて非常に高い融解温度（Ｔｍ）を示し、この融点は、ミスマッチと呼ばれる非相補的な塩基が１つ導入されるだけで大きく低下することから、きわめて優れた塩基特異性を有する。
【００３１】
ＰＮＡの合成は、ＤＮＡ又はＲＮＡを構成する４種の塩基（Ａ、Ｔ（Ｕ）、Ｃ及びＧ）のいずれかを導入したアミノ酸（特にグリシン）誘導体（モノマーユニット）を、目的とする塩基配列にしたがって、通常の固相ペプチド合成法を用いて順次結合していくことによって行うことができる。
【００３２】
また、合成ペプチドと同様に、ペプチド合成機を用いて、従来のＦｍｏｃ法又はｔＢｏｃ法で合成することができる。
【００３３】
蛍光色素のような機能性分子を導入したＰＮＡは、例えば、特願２００２−１２１６６７に記載の方法にしたがって製造することができる。
【００３４】
即ち、保護基によって保護されたアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを有するＰＮＡモノマーユニットを、Ｆｍｏｃ−ω−アミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨと反応させてＰＮＡオリゴマーを合成した後、ピペリジン処理によってＦｍｏｃ−ω−アミノ酸部位の脱保護を行って末端アミノ基を有するω−アミノ酸へと変換し、該ＰＮＡオリゴマー一に遊離カルボン酸を有する機能性分子を縮合導入し、さらに前記保護基の脱保護を超強酸処理によって行うことで、機能性ＰＮＡオリゴマーを製造することができる。
【００３５】
プローブの標的となる塩基配列としては、例えば、早期診断を目指すウイルス中の比較的安定な塩基配列である。その配列の中から、Ｔｍ、ＧＣ含量、同一塩基の繰り返し数、設計対象領域、ハイブリダイゼーション時の塩濃度等の条件を考慮して、約１５塩基対の長さを有する塩基配列を１箇所又は複数箇所を標的配列として選択することができる。プローブの配列は、標的配列と相補的であるが、お互いが重ならないように設計することが好ましい。
【００３６】
本発明の生物学的試料としては、動植物組織、体液、排泄物等の生体にゆらいする任意の試料を用いることができる。
【実施例１】
【００３７】
ＳＡＲＳ検出用ＰＮＡの合成
（塩基配列認識領域の選択）
検出対象ウイルスとして、ＳＡＲＳウイルスを選択した。ＳＡＲＳウイルスのゲノムは、一本鎖、＋鎖のＲＮＡからなる。ＳＡＲＳウイルスの全ゲノム配列は、２００３年４月１７日に受入番号ＡＹ２７８７４１でＧｅｎＢａｎｋに登録されている。プローブは、ＳＡＲＳウイルスの全ゲノム配列の中の比較的安定な領域である塩基配列１５２７１〜１５４００の中から、３箇所の連続する１５塩基対からなる配列をプローブとして選択した（ｐＳＡＲ１ｓ１（１５）、ｐＳＡＲ１ｓ２（１５）、ｐＳＡＲ１ｓ３（１５））。また、これらの配列に相補的な配列もプローブとして選択した（ｐＳＡＲ１ａｓ１（１５）、ｐＳＡＲ１ａｓ２（１５）、ｐＳＡＲ１ａｓ３（１５））。さらに、これらの配列の中から連続する１２塩基対からなる配列をプローブとして選択した。プローブとして選択した配列を下記に示す。
【００３８】
ＡＡＡＣＡＴＡＡＣＡＣＴＴＧＣ ｐＳＡＲ１ｓ１（１５）
ＴＣＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＣ ｐＳＡＲ１ｓ２（１５）
ＣＴＡＡＣＧＡＧＴＧＴＧＣＧＣ ｐＳＡＲ１ｓ３（１５）
ＧＣＡＡＧＴＧＴＴＡＴＧＴＴＴ ｐＳＡＲ１ａｓ１（１５）
ＧＴＡＧＡＡＡＣＧＧＴＧＴＧＡ ｐＳＡＲ１ａｓ２（１５）
ＧＣＧＣＡＣＡＣＴＣＧＴＴＡＧ ｐＳＡＲ１ａｓ３（１５）
ＣＡＴＡＡＣＡＣＴＴＧＣ ｐＳＡＲ１ｓ１（１２）
ＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＣ ｐＳＡＲ１ｓ２（１２）
ＡＣＧＡＧＴＧＴＧＣＧＣ ｐＳＡＲ１ｓ３（１２）
ＡＧＴＧＴＴＡＴＧＴＴＴ ｐＳＡＲ１ａｓ１（１２）
ＧＡＡＡＣＧＧＴＧＴＧＡ ｐＳＡＲ１ａｓ２（１２）
ＣＡＣＡＣＴＣＧＴＴＡＧ ｐＳＡＲ１ａｓ３（１２）
【００３９】
（塩基配列認識領域：ｐＳＡＲ１ｓ１（１５）の調製）
固相Ｆｍｏｃ法（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．Ａ．；Ｊｏｓｅｙ，Ｊ．Ａ．；Ｃａｄｉｌｌａ，Ｒ．；Ｇａｕｌ，Ｍ．Ｄ．；Ｈａｓｓｍａｍ，Ｃ．Ｆ．；Ｌｕｓｓｉｏ，Ｍ．Ｊ．；Ｐｉｐｅ，Ａ．Ｊ．；Ｒｅｅｄ，Ｋ．Ｌ．；Ｒｉｃｃａ，Ｄ．Ｊ．；Ｗｉｅｔｈｅ，Ｒ．Ｗ．；Ｎｏｂｌｅ，Ｓ．Ａ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９５，５１，６１７９−９４）に従い、固相担体ＭＢＨＡ（５０ｍｇ、２４．５μｍｏｌ）に各塩基のＰＮＡモノマーユニット（チミン１０．１ｍｇ、シトシン１４．０ｍｇ、アデニン１４．０ｍｇ、グアニン１４．８ｍｇ；各２０μｍｏｌ；アプライドバイオシステムズ社から購入）と縮合剤ＨＡＴＵ（７．６ｍｇ、２０μｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．０μＬ、２０μｍｏｌ）を用いて逐次伸長反応を行った。
【００４０】
（アミノリンカー部位の調製）
次いで、アミノリンカー用ω−アミノ酸−Ｂｏｃ−７−アミノヘプタン酸（５．２ｍｇ、２０μｍｏｌ）を、縮合剤ＨＢＴＵ（７．６ｍｇ、２０μｍｏｌ）とＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン；７．６ｍｇ、２０μｍｏｌ）を用いて縮合させた。
【００４１】
（ｐＳＡＲ１ｓ１（１５，ＮＨ２）の精製）
ユニットを逐次縮合したあと、常法（ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）／ｐ−クレゾール／チオアニソール＝６０／２５／１０／１０）により固相担体からの切り出しとＢｏｃ基の脱保護を同時に行い、後処理して、目的とするｐＳＡＲ１ｓ１（１５，ＮＨ２）を得た。分子量（Ｃ１６９Ｈ２１６Ｎ９０Ｏ４２の計算値）は、４１８０．１０であり、ＵＶ・ｍａｘ（Ｈ２Ｏ）は、３０３及び５４８（ｎｍ）であった。
【００４２】
また、同様な手法を用いて、異なった塩基配列を有する１１種類のＳＡＲＳ検出用ＰＮＡをさらに合成した。
【実施例２】
【００４３】
ＳＡＲＳ検出用ＰＮＡであるｐＳＡＲ１ｓ１（１５，ビオチン）（構造式：ビオチン−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯＮＨ−ＡＡＡＣＡＴＡＡＣＡＣＴＴＧＣ−ＣＯＮＨ２、ビオチンは、ビタミンＨのことである。）の合成
【００４４】
精製したｐＳＡＲ１ｓ１（１５，ＮＨ２）（１ｍｇ、０．２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（ジメチルホルムアミド；１００μＬ）、ビオチンＯＳｕ（１ｍｇ、３μｍｏｌ）とＤＩＥＡ（１ｍｇ）を用いて縮合させた。後処理して、ＨＰＬＣで精製して、目的とするｐＳＡＲ１ｓ１（１５，ビオチン）を得た。分子量（Ｃ１７９Ｈ２３０Ｎ９２Ｏ４４Ｓの計算値）は、４４０６．４１であった。
【００４５】
また、同様な手法を用いて、異なった塩基配列を有する１１種類のＳＡＲＳ検出用ＰＮＡをさらに合成した。
【実施例３】
【００４６】
ＳＡＲＳ検出用ＰＮＡであるｐＳＡＲ１ｓ２（１５，ＦＩＴＣ）（構造式：フルオレセイン−ＣＳＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯＮＨ−ＴＣＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＣ−ＣＯＮＨ２）の合成
【００４７】
精製したｐＳＡＲ１ｓ２（１５，ＮＨ２）（１ｍｇ、０．２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（ジメチルホルムアミド；１００μＬ）に溶解し、ＦＩＴＣ（１ｍｇ、３μｍｏｌ）とＤＩＥＡ（１ｍｇ）を用いて縮合させた。後処理して、ＨＰＬＣで精製して、目的とするｐＳＡＲ１ｓ２（１５，ＦＩＴＣ）を得た。分子量（Ｃ１７９Ｈ２３０Ｎ９２Ｏ４４Ｓの計算値）は、４４０６．４１であった。
【００４８】
また、同様な手法を用いて、異なった塩基配列を有するｐＳＡＲ１ｓ３（１５，ＦＩＴＣ）（構造式：フルオレセイン−ＣＳＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯＮＨ−ＣＴＡＡＣＧＡＧＴＧＴＧＣＧＣ−ＣＯＮＨ２）をさらに合成した。
【実施例４】
【００４９】
ＳＡＲＳ検出用ＰＮＡを結合したマイクロビーズの調製（その１）
ｐＳＡＲ１ａｓ３（１５，ＮＨ２）（最終濃度１００μＭ）の５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）溶液に１％Ｅｓｔａｐｏｒ（Ｄｕｋｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製磁性粒子）を加え、２０分撹拌した後、ＷＳＣＩ塩酸塩（最終濃度１００μＭ）を加えて、縮合反応を室温で３時間行った。反応終了後、磁石にて磁性粒子を固定した後、残りの反応溶液を捨て、次いで５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）溶液で２回洗浄した。乾燥させた後、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）溶液を加え、懸濁液として４℃で保存した。
【実施例５】
【００５０】
ＳＡＲＳ検出用ＰＮＡを結合したマイクロビーズの調製（その２）
ｐＳＡＲ１ａｓ３（１５，ＮＨ２）（最終濃度１００μＭ）の５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）溶液に１％試薬用ラテックス（Ｌｏｔ．＃Ｃ９７Ｄ０７Ｃ，粒径０．３０４μｍ）を加え、２０分撹拌した後、ＷＳＣＩ塩酸塩（最終濃度１００μＭ）を加えて、縮合反応を室温で３時間行った。反応終了後、遠心操作（１０００ｒｐｍ，５分）して、ペレットを回収し、次いで５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）溶液で２回洗浄した。乾燥させた後、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）溶液を加え、懸濁液として４℃で保存した。
【実施例６】
【００５１】
ＳＡＲＳ検出用ＰＮＡを結合したマイクロプレートの調製
ｐＳＡＲ１ｓ１（１２，ビオチン）、ｐＳＡＲ１ａｓ３（１２，ビオチン）、ｐＳＡＲ１ｓ１（１５，ビオチン）及びｐＳＡＲ１ａｓ３（１５，ビオチン）（各最終濃度３２０ｎＭ）の１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０の混合溶液をストレプトアビジン塗布９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに５０μＬを注ぎ、室温で３時間撹拌した。各ウェルを１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０の混合溶液を用いて３回洗浄した。
【実施例７】
【００５２】
ＰＮＡマイクロビーズを用いたＳＡＲＳ検出擬似実験（その１）
ｐＳＡＲ１ｓ１を結合したＥｓｔａｐｏｒ型磁性粒子懸濁液５ｍＬとＳＡＲＳウイルス由来ｃＤＮＡ断片ＳＡＲ１ａｓ（５’−ＧＣＧＣＡＣＡＣＴＣＧＴＴＡＧＣＴＡＡＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＣＧＧＴＧＴＧＡＴＡＡＧＴＴＡＣＡＧＣＡＡＧＴＧＴＴＡＴＧＴＴＴ−３’）（最終濃度１０ｎＭ）の反応溶液５０ｍＬを９４℃で５分間アニーリングし、１０分間放冷した。その後磁石で磁性粒子を引き寄せた後、５０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．２）で洗浄した。その後、ｐＳＡＲ１ｓ２（１５，ＦＩＴＣ）とｐＳＡＲ１ｓ３（１５，ＦＩＴＣ）（各最終濃度１０ｎＭ）を加え、１０分撹拌して、同様に洗浄した。対象群として、Ｅｓｔａｐｏｒ型磁性粒子のみの群を設けた。
【００５３】
その結果、対象群においては、蛍光が検出されなかったのに対し、ｐＳＡＲ１ｓ１処理群では、強度の蛍光が目視によって観察された。
【実施例８】
【００５４】
ＰＮＡマイクロビーズを用いたＳＡＲＳ検出擬似実験（その２）
ｐＳＡＲ１ｓ１を結合したセキスイ試薬用ラテックス粒子懸濁液５ｍＬとＳＡＲＳウィルス由来ｃＤＮＡ断片ＳＡＲ１ａｓ（５’−ＧＣＧＣＡＣＡＣＴＣＧＴＴＡＧＣＴＡＡＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＣＧＧＴＧＴＧＡＴＡＡＧＴＴＡＣＡＧＣＡＡＧＴＧＴＴＡＴＧＴＴＴ−３’）（最終濃度１０ｎＭ）の反応溶液５０ｍＬを９４℃で５分間アニーリングし、１０分放冷した。その後磁石で磁性粒子を引き寄せた後、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）で洗浄した。その後、ｐＳＡＲ１ｓ２（１５，ＦＩＴＣ）とｐＳＡＲ１ｓ３（１５，ＦＩＴＣ）（各最終濃度１０ｎＭ）を加え、１０分撹拌して、同様に洗浄した。対象群として、ラテックス粒子懸濁液のみの群を設けた。
【００５５】
その結果、対象群においては、蛍光が検出されなかったのに対し、ｐＳＡＲ１ｓ１処理群では、強度の蛍光が目視によって観察された。
【実施例９】
【００５６】
ＰＮＡマイクロプレートを用いたＳＡＲＳ検出擬似実験
Ｎｕｎｃ社製アビジン固定プレートにｐＳＡＲ１ｓ２を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、ビオチンのＰＢＳ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、さらに各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄し、未反応のアビジンを処理した。本反応プレートにＳＡＲＳウイルス由来ＤＮＡ断片ＳＡＲ１ａｓ（５’−ＧＣＡＡＧＴＧＴＴＡＴＧＴＴＡＡＡＧＴＡＧＡＡＡＣＧＧＴＧＴＧＡＴＴＴＧＣＧＣＡＣＡＣＴＣＧＴＴＡＧ−３’）のＰＢＳ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、ＳＡＲＳ検出用ＰＮＡであるｐＳＡＲ１ｓ１（１５，ビオチン）（構造式：ビオチン−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯＮＨ−ＡＡＡＣＡＴＡＡＣＡＣＴＴＧＣ−ＣＯＮＨ２、ビオチンは、ビタミンＨのことである。）のＰＢＳ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、アビジン標識ＨＲＰのＰＢＳ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、Ｈ２Ｏ２含有ＴＭＢ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分間発色反応を行った。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、２ＮＨ２ＳＯ４を１ウェル当たり５０μｌ添加し、反応を停止し、分光光度計にて波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００５７】
その結果、ＳＡＲＳウイルス由来ＤＮＡ断片ＳＡＲ１ａｓの濃度依存的に、蛍光強度の増大が観察された。
ＤＮＡ（ｎＭ） 吸光度（４５０ｎｍ）
０．００ ０．０５３８
０．２５ ０．０６００
０．７４ ０．１９９０
２．２２ ０．５１２０
６．６７ ０．８６００
２０．００ １．２２４９
６０．００ １．７３８８
【実施例１０】
【００５８】
ＰＮＡマイクロプレートを用いたＳＡＲＳ検出擬似実験（その２）
Ｎｕｎｃ社製化学結合用カルボン酸固定プレートにｐＳＡＲ１ｓ３（１５，ＮＨ２）のＥＤＣ含有溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、本反応プレートにＳＡＲＳウイルス由来ＤＮＡ断片ＳＡＲ１ａｓ（５’−ＧＣＡＡＧＴＧＴＴＡＴＧＴＴＡＡＡＧＴＡＧＡＡＡＣＧＧＴＧＴＧＡＴＴＴＧＣＧＣＡＣＡＣＴＣＧＴＴＡＧ−３’）のＰＢＳ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、ＳＡＲＳ検出用ＰＮＡであるｐＳＡＲ１ｓ２（１５，ビオチン）のＰＢＳ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、アビジン標識ＨＲＰのＰＢＳ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分インキュベートした。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、Ｈ２Ｏ２含有ＴＭＢ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で３０分間発色反応を行った。各ウェルをＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、２ＮＨ２ＳＯ４を１ウェル当たり５０μｌ添加し、反応を停止し、分光光度計にて波長４９０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００５９】
その結果、ＳＡＲＳウイルス由来ＤＮＡ断片ＳＡＲ１ａｓの濃度依存的に、蛍光強度の増大が観察された。
ＤＮＡ（ｎＭ） 吸光度（４５０ｎｍ）
０．００ ０．０８
０．０８ ０．１０
０．２５ ０．１２
０．７４ ０．２５
２．２２ ０．５９
６．６７ ２．４７
２０．００ 測定範囲超過
６０．００ 測定範囲超過
【００６０】
また、ｐＳＡＲ１ｓ２（１５，ビオチン）を固定したＮｕｎｃ社製アビジン固定プレートと比較した場合、ＤＮＡの検出感度の１０倍程度の増大が認められた。
【００６１】
実施例１０において、反応プレート上にＳＡＲＳウイルス由来ＤＮＡ断片ＳＡＲ１ａｓ、ＳＡＲＳ検出用ＰＮＡであるｐＳＡＲ１ｓ２（１５，ビオチン）を段階的にハイブリダイゼーションさせたが、反応プレート上にＳＡＲＳウイルス由来ＤＮＡ断片ＳＡＲ１ａｓとＳＡＲＳ検出用ｐＳＡＲ１ｓ２（１５，ビオチン）を同時にハイブリダイゼーションさせた場合も、実施例１０と同様な感度の高い検出能が得られた。
【００６２】
以上の結果から、生体内ウイルスの、複数の検出用ＰＮＡによる同時検出が可能であることが示された。これは、複数のハイブリダイゼーションを一括して行うことができることを意味し、迅速且つ高感度な標的核酸検出が可能であることを示した。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本標的核酸の検出方法を用いることにより、第２プローブ集積に伴った検出感度の著しい増加が予想される。このことは、従来の検出方法では検出できなかった極微量にしか存在しない生体内ウイルスの有無を、ＰＣＲ法等の増幅方法をとらなくても、確認できることを示す。極微量ウイルスの検出は人類の感染症問題を解決する手段として、また、感染症予防の観点からも、必須な事柄であり、今後この検出方法は新規産業創出のシーズとなり得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
（ａ）増幅された標的核酸を、固相担体に結合させた第１のプローブと接触させ、増幅された標的核酸を第１のプローブに結合させる工程、
（ｂ）結合しなかった標的核酸を除去する工程、
（ｃ）蛍光分子で標識された第２のプローブを、第１のプローブに結合した標的核酸と接触させ、該第２のプローブを標的核酸に結合させる工程
（ｄ）結合しなかった第２のプローブを除去する工程、及び
（ｅ）標的核酸に結合した第２のプローブの蛍光を検出する工程
を含む標的核酸を検出するための方法。
【請求項２】
第１のプローブ及び第２のプローブが、ペプチド核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固相担体が、メチルベンズヒドリルアミン樹脂である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
固相担体の形状が、球状である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
固相担体当たりの第１のプローブ数が、１〜１００個である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
蛍光分子が、Ｑｄｏｔ（登録商標）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）の前に、さらに、標的核酸を増幅する工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
標的核酸が、生物学的試料中に存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
標的核酸が、ウイルスである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ウイルスが、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＳＡＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
標的核酸当たりの第２のプローブの数が、１〜２０個である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
固相担体に結合させた第１のプローブ及び蛍光分子で標識された第２のプローブを含む、核酸検出用キット。
【請求項１】
下記工程：
（ａ）増幅された標的核酸を、固相担体に結合させた第１のプローブと接触させ、増幅された標的核酸を第１のプローブに結合させる工程、
（ｂ）結合しなかった標的核酸を除去する工程、
（ｃ）蛍光分子で標識された第２のプローブを、第１のプローブに結合した標的核酸と接触させ、該第２のプローブを標的核酸に結合させる工程
（ｄ）結合しなかった第２のプローブを除去する工程、及び
（ｅ）標的核酸に結合した第２のプローブの蛍光を検出する工程
を含む標的核酸を検出するための方法。
【請求項２】
第１のプローブ及び第２のプローブが、ペプチド核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固相担体が、メチルベンズヒドリルアミン樹脂である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
固相担体の形状が、球状である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
固相担体当たりの第１のプローブ数が、１〜１００個である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
蛍光分子が、Ｑｄｏｔ（登録商標）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）の前に、さらに、標的核酸を増幅する工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
標的核酸が、生物学的試料中に存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
標的核酸が、ウイルスである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ウイルスが、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＳＡＲＳウイルス又はインフルエンザウイルスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
標的核酸当たりの第２のプローブの数が、１〜２０個である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
固相担体に結合させた第１のプローブ及び蛍光分子で標識された第２のプローブを含む、核酸検出用キット。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１０１８１
【国際公開日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【発行日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１２０２８（Ｐ２００５−５１２０２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１０４７７
【国際出願日】平成１６年７月２３日（２００４．７．２３）
【出願人】（５０３２８０９６１）株式会社クレディアジャパン (10)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【発行日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１０４７７
【国際出願日】平成１６年７月２３日（２００４．７．２３）
【出願人】（５０３２８０９６１）株式会社クレディアジャパン (10)
【Ｆターム（参考）】
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