核酸解析方法
【課題】核酸での一部の塩基配列の違いを明確に識別し、野生型と変異型の両者、あるいはどちらか一方のみが含まれる場合においても明確にそれぞれの場合を識別することができる核酸解析方法を提供する。
【解決手段】野生型及び／又は変異型を有する特定配列領域を含む１本鎖核酸にその電気泳動速度を遅らせる電気非泳動物質を結合させたコンジュゲート核酸を作製し、前記野生型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し第１の標識剤により修飾された第１のプローブ核酸と前記第１のプローブ核酸と同じ塩基長であり前記変異型の一部と相補的な塩基配列を有し第２の標識剤により修飾された第２のプローブ核酸とをさらに作製し、前記コンジュゲート核酸を流路に充填した後、前記第１及び前記第２のプローブ核酸を前記流路の中に注入し、前記流路の両端に電圧を印加して前記第１及び前記第２のプローブ核酸を電気泳動させ、前記第１及び前記第２の標識剤を検出する。
【解決手段】野生型及び／又は変異型を有する特定配列領域を含む１本鎖核酸にその電気泳動速度を遅らせる電気非泳動物質を結合させたコンジュゲート核酸を作製し、前記野生型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し第１の標識剤により修飾された第１のプローブ核酸と前記第１のプローブ核酸と同じ塩基長であり前記変異型の一部と相補的な塩基配列を有し第２の標識剤により修飾された第２のプローブ核酸とをさらに作製し、前記コンジュゲート核酸を流路に充填した後、前記第１及び前記第２のプローブ核酸を前記流路の中に注入し、前記流路の両端に電圧を印加して前記第１及び前記第２のプローブ核酸を電気泳動させ、前記第１及び前記第２の標識剤を検出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の配列を解析する核酸解析方法に関するものである。さらに本発明は、核酸解析方法に関し、より詳細には、核酸における一部の塩基配列の違いを明確に識別する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＳＮＰｓ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）と呼ばれる、遺伝子における１塩基の違いが注目されている。その理由としては、ＳＮＰｓの存在が多くの疾患や薬剤に対する感受性に関連していると言われており、ＳＮＰｓの有無を調べることで上記の様々な情報を得ることができる。ＳＮＰｓの検出は塩基内の１塩基の違いを見分ける必要があることから、より確実にＳＮＰｓの有無を検出することが望まれている。
【０００３】
ＳＮＰｓを調べる一つの方法として、核酸同士の親和力の違いを利用した方法がある（非特許文献１参照）。この方法について図８を用いて説明する。目的試料を用意し、蛍光標識したプライマーを用いて測定したい特定領域をＰＣＲ反応によって増幅する。測定する特定領域が変異していない場合（野生型）、蛍光標識された目的核酸１０１が生成される。一方、特定領域が１塩基変異している場合（変異型）、目的核酸１０１に対し１塩基異なり且つ蛍光標識されたＳＮＰｓ核酸１０２が生成される。
【０００４】
生成された目的核酸１０１とＳＮＰｓ核酸１０２はキャピラリー管１００内で電気泳動される。キャピラリー管１００の内部にはコンジュゲート核酸１０３が充填されている（図８（Ａ））。コンジュゲート核酸１０３とは目的核酸１０１の一部の配列と完全に相補な配列を有する核酸と、電気泳動によって移動されない高分子化合物が結合されたものである。
【０００５】
目的核酸１０１とＳＮＰｓ核酸１０２の電気泳動を行うと、コンジュゲート核酸１０３と完全相補な配列を持つ目的核酸１０１はコンジュゲート核酸１０３との親和性が強く、ＳＮＰｓ核酸１０２はコンジュゲート核酸１０３と完全相補な配列を持たないことから親和性が弱い。これらの結果、ＳＮＰｓ核酸１０２は目的核酸１０１よりも泳動速度が早く、泳動速度に差が生じる（図８（Ｂ））。その後ＳＮＰｓ核酸１０２及び目的核酸１０１に修飾した蛍光物質の蛍光検出を行うとそれぞれの蛍光信号ピークが現れる。このように、各核酸の電気泳動速度の違いを蛍光検出し、蛍光信号ピークを解析することでＳＮＰｓ核酸１０２を検出している。
【非特許文献１】Ｋａｅ Ｓａｔｏ，Ａｋｉｒａ Ｉｎｏｕｅ，Ｋａｚｕｏ Ｈｏｓｏｋａｗａ，Ｍｉｚｕｏ Ｍａｅｄａ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２６，３０７６−３０８０（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記従来の方法では、目的試料中に野生型と変異型が存在する場合には目的核酸とＳＮＰｓ核酸が生成され、これらの２つの蛍光信号ピークが現れることでＳＮＰｓ核酸の存在がわかるが、目的試料中に野生型のみ存在する場合、あるいは変異型のみ存在する場合では蛍光信号ピークが一つしか現れないことから、どちらの場合かを明確に識別することが困難である課題を有していた。
【０００７】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、核酸における１塩基配列の違いを明確に識別し、野生型と変異型の両者、あるいはどちらか一方のみが含まれる場合においても明確にそれぞれの場合を識別することができる核酸解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記従来の課題を解決するために、本発明の核酸解析方法は、目的試料中の特定配列領域に含まれる野生型及び／又は変異型を検出する核酸解析方法において、前記特定配列領域を含む１本鎖核酸に電気非泳動物質を結合させたコンジュゲート核酸を作製するコンジュゲート核酸作製ステップと、前記野生型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し第１の標識剤により修飾された第１のプローブ核酸と前記第１のプローブ核酸と同じ塩基長であり前記変異型の一部と相補的な塩基配列を有し第２の標識剤により修飾された第２のプローブ核酸とを作製するプローブ核酸作製ステップと、前記コンジュゲート核酸を流路に充填した後、前記第１のプローブ核酸及び前記第２のプローブ核酸を前記流路の中に注入し、前記流路の両端に電圧を印加して前記第１のプローブ核酸及び前記第２のプローブ核酸を電気泳動させ、前記第１の標識剤及び前記第２の標識剤を検出する電気泳動ステップと、を含むことを特徴としたものである。
【０００９】
また、本発明は、目的試料中の特定配列領域に含まれる野生型及び／又は変異型を検出する核酸解析方法において、前記特定配列領域を含む1本鎖核酸を作製するサンプル核酸作製ステップと、前記１本鎖核酸に遅らせる電気非泳動物質を結合させたコンジュゲート核酸を作製するコンジュゲート核酸作製ステップと、前記野生型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し第１の標識剤により修飾された第１のプローブ核酸と前記第１のプローブ核酸と同じ塩基長であり前記変異型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し第２の標識剤により修飾された第２のプローブ核酸とを作製するプローブ核酸作製ステップと、前記コンジュゲート核酸を流路に充填した後、前記第１のプローブ核酸及び前記第２のプローブ核酸を前記流路の中に注入し、前記流路の両端に電圧を印加して前記第１のプローブ核酸及び前記第２のプローブ核酸を電気泳動させ、前記第１の標識剤及び前記第２の標識剤を検出する電気泳動ステップと、を含むことを特徴としたものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の核酸解析方法によれば、核酸における一部の塩基配列の違いを明確に識別することができる。また、目的試料中に野生型と変異型の両者、あるいはどちらか一方のみが含まれる場合においても明確にそれぞれの場合を識別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明の核酸解析方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。まず、本発明の原理について説明し、次に、具体的な実施の形態について説明する。
（実施の形態１）
（サンプル核酸作製ステップ）
まず、本発明で用いるサンプル核酸を作製するサンプル核酸作製ステップについて説明する。本実施の形態で解析するサンプル核酸は植物、動物、または人の細胞や血液等から入手した核酸を用いる。
【００１２】
これらの核酸を鋳型にしてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）等の方法を利用して特定の配列領域を増幅する。ＰＣＲの増幅領域は４０塩基以上２００塩基以下が好ましい。これは、短すぎるとプライマーの試料に結合する際の特異性が得られず、２００塩基を超えるとそれ自体が高次構造をとることでプローブ核酸との特異性が得られない場合があるためである。ＰＣＲを用いる場合、プライマーはＳＮＰ部位を挟んだ領域でフォワード側及びリバース側の設計を行う。これにより、ＳＮＰ部位を有する配列領域を増幅することができる。ＰＣＲ産物は２本鎖核酸であるため、測定に用いない相補鎖はカラム等で捕捉し、除去することもできる。
【００１３】
サンプル核酸から得られる１本鎖核酸は、次のコンジュゲート核酸作製ステップでプローブ核酸遅延用のコンジュゲート核酸として用いる為、１本鎖核酸の末端にはプローブ核酸に対するコンジュゲート核酸の電気泳動速度を十分に遅らせる物質（以下電気非泳動物質）を結合させるための化学種を導入させておく。化学種は例えばアミノ基やイミド基などをＰＣＲプライマーの末端に修飾させておくことで１本鎖核酸に導入させることができ、また、電気非泳動物質に応じて選択可能である。
【００１４】
さらに、ＰＣＲ反応によって１本鎖核酸を得る場合はプライマーのフォワード側若しくはリバース側のいずれか一方にのみ化学種を結合させておくことで測定に必要な１本鎖核酸のみを電気非泳動物質に結合させることができる。また、ＲＮＡをサンプル核酸に用いる場合は逆転写反応の際に化学種を取り込ませることで化学種が結合した１本鎖核酸を得ることも可能である。
【００１５】
本ステップによって得られた１本鎖核酸は測定したい特定配列領域を含み、特定配列領域中の検出部位は野生型及び／又は変異型となっている。
【００１６】
（コンジュゲート核酸作製ステップ）
次に、コンジュゲート核酸作製ステップについて説明する。コンジュゲート核酸は前記サンプル核酸作製ステップで得られた１本鎖核酸と電気非泳動物質からなる。電気非泳動物質は、この一本鎖核酸の電気泳動速度を遅らせるためのものであり、好ましくは電荷を持たず、また高分子化合物であれば良い。例えば、一般的に使用されるリニアポリマーであるアクリルアミドやポリエチレングリコールが適応可能である。また、マイクロビーズであるガラスビーズや磁気ビーズ等も適応可能である。これらの電気非泳動物質を１本鎖核酸の化学種と結合させることでコンジュゲート核酸を作製する。
【００１７】
（プローブ核酸作製ステップ）
次に、プローブ核酸作製ステップについて説明する。まず、それぞれのプローブ核酸について説明する。第１のプローブ核酸の配列は、野生型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し、第２のプローブ核酸の配列は、変異型の一部と相補的な塩基配列を有するように設定される。
【００１８】
このため、サンプル核酸作製ステップにおける特定配列領域の増幅反応において、サンプル核酸が野生型の場合は目的核酸が、変異型の場合はＳＮＰｓ核酸が生成される。このとき、野生型及び変異型の配列は既知であり、この配列をもとに第１及び第２のプローブ核酸の配列設計が行われる。
【００１９】
第１のプローブ核酸には蛍光物質Ｆ１が修飾され、第２のプローブ核酸には蛍光物質Ｆ１とは蛍光波長の異なる蛍光物質Ｆ２が修飾される。蛍光物質はＦＩＴＣ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、ＦＡＭ等公知の物質が適応可能である。また、それぞれのプローブ核酸は化学合成等の公知の方法で作製される。
【００２０】
第１及び第２のプローブ核酸の塩基長は同じ長さに設定する。これは、それぞれのプローブ核酸の電気泳動速度を合わせるためであり、この結果、第１及び第２のプローブ核酸の電気泳動速度はコンジュゲート核酸の配列に依存した親和力のみに影響されることになる。また、第１及び第２のプローブ核酸の濃度は蛍光信号ピークを揃えるために同程度の終濃度にすることが好ましい。
【００２１】
野生型の配列と第１のプローブ核酸の配列との相補的な部分をａ塩基、変異型の配列と第２のプローブ核酸の配列との相補的な部分をｂ塩基とすると、前記ａ及びｂはａ＝ｂ及び６≦ａ≦３０の式を満たすように設計される。これは、相補な部分の長さを同じにすることで塩基長による核酸同士の親和力の影響を等しくし、さらに、相補的な部分が５塩基以下だとコンジュゲート核酸とプローブ核酸の親和力が弱い為に第１のプローブ核酸と第２のプローブ核酸の時間的な分離能が得られない場合があり、３１塩基以上だとコンジュゲート核酸とプローブ核酸の親和力が強すぎるために、それぞれのプローブ核酸の配列に関わらず非特異的にコンジュゲート核酸に結合するためである。
【００２２】
さらに、核酸同士の親和力は電気泳動を行う環境温度や電気泳動時の緩衝液に含まれる変性剤の濃度によって変わるため、ａ及びｂは温度、変性剤によってより詳細に最適化することが好ましい。例えば室温で且つ変性剤を含まない緩衝液で電気泳動を行う際は、ａ及びｂはａ＝ｂ及び６≦ａ≦１２であることが好ましい。
【００２３】
それぞれのプローブ核酸の全長は前記ａ及びｂの条件を満たすように設計されるが、プローブ核酸自体が高次構造を形成しないような塩基長にすることが好ましく、特に高次構造をとりにくい６塩基から２００塩基が好ましい。
【００２４】
また、コンジュゲート核酸の濃度は第１及び第２のプローブ核酸の濃度に対して濃いほど良い。これは、第１及び第２のプローブ核酸に対して確実に親和力を働かせることで確実に第１のプローブ核酸と第２のプローブ核酸を時間分離させるためである。しかしながら、コンジュゲート核酸に用いる１本鎖核酸はサンプル核酸作製ステップでのＰＣＲ等の増幅産物であるために、１本鎖核酸の終濃度は増幅反応限界で決まる。このため、それぞれのプローブ核酸の濃度は生成されるコンジュゲート核酸の濃度に応じて調製されるが、本発明者の実験によれば、プローブ核酸の濃度はコンジュゲート核酸の濃度に対し１／１０〜１／１００倍にすることが好ましい。
【００２５】
ここで、目的試料中の野生型及び変異型の存在に応じた第１及び第２のプローブ核酸の電気泳動時の挙動について詳細に説明する。
【００２６】
目的試料中に野生型のみが存在する場合、コンジュゲート核酸は野生型の配列を有するコンジュゲート核酸３０３のみ生成される（図１（Ａ））。このため、密閉流路３００内において電気泳動すると、野生型の配列の一部と相補的な塩基配列を有している第１のプローブ核酸３０１は第２のプローブ核酸３０２よりも結合力が強くなるために泳動速度が遅くなる。この結果、第１のプローブ核酸３０１が有する蛍光物質Ｆ１は第２のプローブ核酸３０２が有する蛍光物質Ｆ２に対して時間的に遅く検出される（図１（Ｂ））。
【００２７】
また、目的試料中に変異型のみが存在する場合、コンジュゲート核酸は変異型の配列を有するコンジュゲート核酸３０４のみ生成される（図２（Ａ））。このため、密閉流路３００内において電気泳動すると、変異型の配列の一部と相補的な塩基配列を有している第２のプローブ核酸３０２は第１のプローブ核酸３０１よりも結合力が強くなるために泳動速度が遅くなる。この結果、第１のプローブ核酸３０１が有する蛍光物質Ｆ１は第２のプローブ核酸３０２が有する蛍光物質Ｆ２に対して時間的に早く検出される（図２（Ｂ））。
【００２８】
さらに、目的試料中に野生型及び変異型が混在して存在する場合、コンジュゲート核酸は存在に応じて野生型の配列を有するコンジュゲート核酸３０３及び変異型の配列を有するコンジュゲート核酸３０４が生成される（図３（Ａ））。このため、密閉流路３００内において電気泳動すると、この存在に応じて第１プローブ核酸及び第２のプローブ核酸の時間的な位置関係が変化する。例えば、野生型が変異型よりも多い場合は、野生型の配列を有するコンジュゲート核酸３０３が変異型の配列を有するコンジュゲート核酸３０４よりも多く生成されることから第１のプローブ核酸３０１の蛍光物質Ｆ１は第２のプローブ核酸３０４の蛍光物質Ｆ２よりも時間的に遅く検出される。また、野生型が変異型よりも少ない場合は変異型の配列を有するコンジュゲート核酸３０４が野生型の配列を有するコンジュゲート核酸３０３よりも多く生成されることから、第２のプローブ核酸３０２の蛍光物質Ｆ２は第１のプローブ核酸３０１の蛍光物質Ｆ１よりも時間的に遅く検出される。さらに、野生型と変異型が同量存在する場合は第１のプローブ核酸３０１及び第２のプローブ核酸にはそれぞれのコンジュゲート核酸から同程度の親和力が働く為に蛍光物質Ｆ１とＦ２はほぼ同時に検出される（図３（Ｂ））。
【００２９】
このように、蛍光物質Ｆ１及びＦ２の時間的な位置関係を測定、解析することで、目的試料中に含まれる野生型及び変異型の存在を正確に検出することができる。
【００３０】
（電気泳動ステップ）
最後に、電気泳動ステップについて説明する。図４は、本実施の形態で用いる電気泳動装置の構成について示している。
【００３１】
白色光源２０１から励起された白色光はスリット２０２、コリメートレンズ２０３を通過し、可変励起フィルター２０４を通過する。可変励起フィルター２０４は蛍光物質の励起波長を有する波長帯のみを通過させるバンドパスフィルターが用いられ、測定する蛍光物質に応じて選択される。この可変励起フィルター２０４を瞬時に切り替えることで測定したい蛍光物質の励起光を選択的に透過できることから、複数の蛍光物質を同時に測定できる。可変励起フィルター２０４を通過した励起光はビームスプリッタ２０５によって分けられ、分岐した励起光の一部はモニタ用レンズ２０６を通過し、モニタ用検出器２０７に入射する。モニタ用検出器２０７は検出部２２３への照射パワーを一定にするように白色光源２０１にフィードバックする為のものである。ビームスプリッタ２０５を通過した励起光は投光レンズ２０８を通過し、ダイクロイックミラー２０９に到達する。
【００３２】
ダイクロイックミラー２０９はマルチバンドのダイクロイックミラーを用いた。マルチバンドのダイクロイックミラーとは複数のバンドパス領域を持つ波長フィルターであり、蛍光物質の励起波長及び蛍光波長によって選ばれ、可変励起フィルターによって通過してきた励起光を反射し、この励起光によって得られる蛍光物質からの蛍光信号を透過する性能を有する。可変励起フィルター２０４、ダイクロイックミラー２０９、蛍光フィルターは測定する蛍光物質によって選択される。ダイクロイックミラー２０９で反射された励起光は対物レンズ２１３によって密閉流路２１４の検出部２２３で集光され、蛍光物質に照射される。
【００３３】
励起光によって得られる蛍光物質からの蛍光信号は、対物レンズ２１３、ダイクロイックミラー２０９、蛍光フィルター２１０を透過し、集光レンズ２１１によって集光され検出素子２１２にて検出される。検出素子２１２はフォトダイオードや光電子増倍管等の光検出器が適応可能である。蛍光フィルター２１０は複数の蛍光物質がそれぞれ発する蛍光信号の波長帯のみを透過するマルチバンドのバンドパスフィルターが用いられる。得られた蛍光信号はプリアンプ２２０で増幅され、Ａ／Ｄコンバータ２２１でデジタル変換された後、制御部２２２でデータ解析される。
【００３４】
次に、電気泳動部周辺について詳細に説明する。緩衝液で満たされ、正電極２１６を配置した第１容器２１８と、緩衝液で満たされ、負電極２１７を配置した第２容器２１９との間に介する密閉流路２１４とからなり、この密閉流路２１４にコンジュゲート核酸を充填した後、測定すべき第１のプローブ核酸と第２のプローブ核酸を含む溶液を第２容器２１９側の密閉流路２１４に注入し、密閉流路２１４の両端を第１容器２１８及び第２容器２１９に入れて電気泳動を行う為の電圧を可変電源２１５によって正電極２１６及び負電極２１７に与える。
【００３５】
ここで、密閉流路２１４はアクリルアミドでコーティングされた内径５０〜３００μｍのキャピラリー管やプレート上に設けられた微細流路等が適応可能である。本実施例では内径１００μｍ、長さ２５ｃｍのキャピラリー管を用いた。本実施例のキャピラリー管で測定した場合、可変電源２１５より６ｋＶの電圧を印加し、およそ３〜１６μＡの電流を流してそれぞれのプローブ核酸の電気泳動を行った。
【００３６】
このように第１のプローブ核酸及び第２のプローブ核酸の電気泳動を行い、それぞれのプローブ核酸に標識された蛍光物質Ｆ１及びＦ２を検出部２２３で蛍光検出することで、それぞれのプローブ核酸の時間的な位置関係を検出することができ、この位置関係から野生型と変異型の両者、あるいはどちらか一方のみが含まれる場合においても明確に識別することが可能となる。
【００３７】
次に、本発明における核酸解析方法の具体的な実施例を説明する。測定の流れは、（１）サンプル核酸作製ステップ、（２）コンジュゲート核酸作製ステップ、（３）プローブ核酸作製ステップ、（４）電気泳動ステップからなる。各ステップの詳細については以下に示す。
【００３８】
（１）サンプル核酸作製ステップ
サンプル核酸作製ステップにおいて、次の実施例１から実施例３に挙げる方法を用いて測定に用いる試料を調製した。本実施例では、検出モデルとして癌遺伝子の1つであるヒトｃ−Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子の野生型及び変異型の検出を行った。
【００３９】
上記遺伝子の野生型は１２番目のアミノ酸コドンがＧＧＴであり、変異型はＧＧＴがＣＧＴに置き換わったものである。
【００４０】
本実施例の目的核酸として、上記遺伝子の野生型である５’−ＧＣＴＧＧＴＧＧ−３’の配列を有し５’末端にアミノ基を修飾した８塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。
【００４１】
また、ＳＮＰｓ核酸として、上記遺伝子の変異型である５’−ＧＣＴＣＧＴＧＧ−３’の配列を有し５’末端にアミノ基を修飾した８塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。
【００４２】
＜実施例１＞
これらの目的核酸及びＳＮＰｓ核酸をそれぞれ終濃度１ｍＭになるように緩衝液（Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ、ｐＨ７．４）で混合し、調製した。
【００４３】
＜実施例２＞
上記目的核酸のみを１ｍＭになるように緩衝液で調製した。
【００４４】
＜実施例３＞
上記ＳＮＰｓ核酸のみを１ｍＭになるように緩衝液で調製した。
【００４５】
（２）コンジュゲート核酸作製ステップ
分子量２０，０００のＰＥＧ−ＮＨＳ（日本油脂）にＤＭＳＯを４４５μＬ加え、攪拌した。溶かしたＰＥＧ−ＮＨＳに実施例１から実施例３で得られた１本鎖核酸溶液をそれぞれ５０μＬと１Ｍの炭酸水素ナトリウムを５μＬ加え、２０℃で３時間振とう後、分子量１０，０００を分画する透析膜を用いて1晩透析した後、乾燥させた。このようにして得られた実施例１から実施例３のコンジュゲート核酸を１００μＭになるように緩衝液で調製した。
【００４６】
（３）プローブ核酸作製ステップ
第１のプローブ核酸には、目的核酸と相補な配列を有し５’末端に蛍光物質であるＦＩＴＣを修飾した３０塩基の５’− ＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣ ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴ ＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡ −３’の配列を有するオリゴデオキシヌクレオチド（配列番号１）を使用した。
【００４７】
第２のプローブ核酸には、ＳＮＰｓ核酸と相補な配列を有し５’末端に蛍光物質であるＣｙ３．５を修飾した３０塩基の５’− ＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣ ＧＣＣＡＣＧＡＧＣＴ ＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡ −３’の配列を有するオリゴデオキシヌクレオチド（配列番号２）を使用した。
【００４８】
第１及び第２のプローブ核酸をそれぞれ終濃度５μＭになるように緩衝液で調製し、第１及び第２のプローブ核酸が混合されたプローブ核酸溶液を作製した。
【００４９】
（４）電気泳動ステップ
次に、図４で示した電気泳動装置によって核酸解析を行った。白色光源（ＭＡＸ３０２、朝日分光）から励起された白色光はスリット、コリメートレンズを通過し、可変励起フィルターを通過する。可変励起フィルター、ダイクロイックミラー、蛍光フィルターは市販のフィルターセット（ＧＦＰ／ＤｓＲｅｄ−２Ｘ−Ａ、Ｓｅｍｒｏｃｋ）を用いた。また、可変励起フィルターを制御用ＰＣで切り替えることで２つの蛍光物質を同時に測定した。ビームスプリッタで分岐された励起光はモニタ用検出器（Ｓ１２２６−４４ＢＱ、浜松ホトニクス）でモニタし、照射パワーが一定になるように白色光源の励起光量の調整を行った。ダイクロイックミラーで反射した励起光はキャピラリー管の検出部に照射された。
【００５０】
キャピラリー管は内径１００μｍ、長さ２５ｃｍであり、アクリルアミドで内側をコーティングしたものを用いた。キャピラリー管内にコンジュゲート核酸を充填した後、プローブ核酸調製ステップで作製したプローブ核酸溶液を負電極側のキャピラリー管の端から注入する。その後、正電極、及び負電極間に可変電源により６ｋＶの電圧を印加してそれぞれのプローブ核酸を電気泳動させた。測定はそれぞれ実施例１から実施例３から得られたコンジュゲート核酸毎にそれぞれ用いて行った。
【００５１】
検出部で得られた蛍光信号は蛍光フィルターを透過して検出素子（Ｓ１２２６−４４ＢＱ、浜松ホトニクス）に入射する。蛍光信号はプリアンプで増幅され、Ａ／Ｄコンバータでデジタル変換されて制御用ＰＣに取り込まれる。
【００５２】
図５、図６、図７は実施例１、２、３の結果をそれぞれ示している。図５に示す様に、ＦＩＴＣとＣｙ３．５の蛍光ピークがほぼ同時に現れている。これは、第１のプローブ核酸と第２のプローブ核酸が第１及び第２のコンジュゲート核酸から同程度の親和力を受けた結果、電気泳動速度が等しくなった結果を示している。また、ＦＩＴＣとＣｙ３．５との蛍光波長は、それぞれ５２０ｎｍと６００ｎｍと異なるので、両者の区分を容易に行うことが出来る。この結果から、サンプル核酸中には同程度の量の目的核酸とＳＮＰｓ核酸が含まれていることがわかる。
【００５３】
また、図６に示すように、Ｃｙ３．５を修飾した第２のプローブ核酸がＦＩＴＣを修飾した第１のプローブ核酸よりも時間的に早く検出される。これは、第１のプローブ核酸のコンジュゲート核酸に対する親和力が第２のプローブ核酸のそれよりも強く働き、この結果第１のプローブ核酸が第２のプローブ核酸よりも電気泳動速度が遅れた結果を示している。また、図５で説明したようにＦＩＴＣとＣｙ３．５との蛍光波長は、それぞれ異なるので、両者の区分を容易に行うことが出来る。この結果から、サンプル核酸中には目的核酸がＳＮＰｓ核酸よりも多量に含まれていることがわかる。
【００５４】
また、図７に示すように、ＦＩＴＣを修飾した第１のプローブ核酸がＣｙ３．５を修飾した第２のプローブ核酸よりも時間的に早く検出される。これは、第２のプローブ核酸のコンジュゲート核酸に対する親和力が第１のプローブ核酸のそれよりも強く働き、この結果第２のプローブ核酸が第１のプローブ核酸よりも電気泳動速度が遅れた結果を示している。この結果から、サンプル核酸中にはＳＮＰｓ核酸が目的核酸よりも多量に含まれていることになる。
【００５５】
これらの場合の結果から、検出したい配列部位の変異型、野生型に応じて波長の異なる標識剤を修飾させたプローブ核酸を用いることで、目的試料中に野生型と変異型の両者、あるいはどちらか一方のみが含まれる場合においても、それぞれの蛍光物質の時間的な位置関係とその蛍光波長を測定することで、それぞれの配列部位の場合を明確に識別することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明にかかる核酸解析方法は、核酸の塩基配列の１塩基の違いを明確に識別することが可能であることから、食品の遺伝子による産地判定や薬物代謝は遺伝病など医療分野に関わるＳＮＰｓ検出技術に広く有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の実施の形態において、サンプル核酸中に野生型のみが含まれる場合の概略図
【図２】本発明の実施の形態において、サンプル核酸中に変異型のみが含まれる場合の概略図
【図３】本発明の実施の形態において、サンプル核酸中に野生型及び変異型が含まれる場合の概略図
【図４】本発明の実施の形態における電気泳動装置の構成図
【図５】実施例１における測定結果を示したグラフ
【図６】実施例２における測定結果を示したグラフ
【図７】実施例３における測定結果を示したグラフ
【図８】従来の核酸解析方法の概略図
【符号の説明】
【００５８】
１００ キャピラリー管
１０１ 目的核酸
１０２ ＳＮＰｓ核酸
１０３ コンジュゲート核酸
２０１ 白色光源
２０２ スリット
２０３ コリメートレンズ
２０４ 可変励起フィルター
２０５ ビームスプリッタ
２０６ モニタ用レンズ
２０７ モニタ用検出器
２０８ 投光レンズ
２０９ ダイクロイックミラー
２１０ 蛍光フィルター
２１１ 集光レンズ
２１２ 検出素子
２１３ 対物レンズ
２１４、３００ 密閉流路
２１５ 可変電源
２１６ 正電極
２１７ 負電極
２１８ 第１容器
２１９ 第２容器
２２０ プリアンプ
２２１ Ａ／Ｄコンバータ
２２２ 制御部
２２３ 検出部
３０１ 第１のプローブ核酸
３０２ 第２のプローブ核酸
３０３ 野生型の配列を有するコンジュゲート核酸
３０４ 変異型の配列を有するコンジュゲート核酸
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の配列を解析する核酸解析方法に関するものである。さらに本発明は、核酸解析方法に関し、より詳細には、核酸における一部の塩基配列の違いを明確に識別する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＳＮＰｓ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）と呼ばれる、遺伝子における１塩基の違いが注目されている。その理由としては、ＳＮＰｓの存在が多くの疾患や薬剤に対する感受性に関連していると言われており、ＳＮＰｓの有無を調べることで上記の様々な情報を得ることができる。ＳＮＰｓの検出は塩基内の１塩基の違いを見分ける必要があることから、より確実にＳＮＰｓの有無を検出することが望まれている。
【０００３】
ＳＮＰｓを調べる一つの方法として、核酸同士の親和力の違いを利用した方法がある（非特許文献１参照）。この方法について図８を用いて説明する。目的試料を用意し、蛍光標識したプライマーを用いて測定したい特定領域をＰＣＲ反応によって増幅する。測定する特定領域が変異していない場合（野生型）、蛍光標識された目的核酸１０１が生成される。一方、特定領域が１塩基変異している場合（変異型）、目的核酸１０１に対し１塩基異なり且つ蛍光標識されたＳＮＰｓ核酸１０２が生成される。
【０００４】
生成された目的核酸１０１とＳＮＰｓ核酸１０２はキャピラリー管１００内で電気泳動される。キャピラリー管１００の内部にはコンジュゲート核酸１０３が充填されている（図８（Ａ））。コンジュゲート核酸１０３とは目的核酸１０１の一部の配列と完全に相補な配列を有する核酸と、電気泳動によって移動されない高分子化合物が結合されたものである。
【０００５】
目的核酸１０１とＳＮＰｓ核酸１０２の電気泳動を行うと、コンジュゲート核酸１０３と完全相補な配列を持つ目的核酸１０１はコンジュゲート核酸１０３との親和性が強く、ＳＮＰｓ核酸１０２はコンジュゲート核酸１０３と完全相補な配列を持たないことから親和性が弱い。これらの結果、ＳＮＰｓ核酸１０２は目的核酸１０１よりも泳動速度が早く、泳動速度に差が生じる（図８（Ｂ））。その後ＳＮＰｓ核酸１０２及び目的核酸１０１に修飾した蛍光物質の蛍光検出を行うとそれぞれの蛍光信号ピークが現れる。このように、各核酸の電気泳動速度の違いを蛍光検出し、蛍光信号ピークを解析することでＳＮＰｓ核酸１０２を検出している。
【非特許文献１】Ｋａｅ Ｓａｔｏ，Ａｋｉｒａ Ｉｎｏｕｅ，Ｋａｚｕｏ Ｈｏｓｏｋａｗａ，Ｍｉｚｕｏ Ｍａｅｄａ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２６，３０７６−３０８０（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記従来の方法では、目的試料中に野生型と変異型が存在する場合には目的核酸とＳＮＰｓ核酸が生成され、これらの２つの蛍光信号ピークが現れることでＳＮＰｓ核酸の存在がわかるが、目的試料中に野生型のみ存在する場合、あるいは変異型のみ存在する場合では蛍光信号ピークが一つしか現れないことから、どちらの場合かを明確に識別することが困難である課題を有していた。
【０００７】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、核酸における１塩基配列の違いを明確に識別し、野生型と変異型の両者、あるいはどちらか一方のみが含まれる場合においても明確にそれぞれの場合を識別することができる核酸解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記従来の課題を解決するために、本発明の核酸解析方法は、目的試料中の特定配列領域に含まれる野生型及び／又は変異型を検出する核酸解析方法において、前記特定配列領域を含む１本鎖核酸に電気非泳動物質を結合させたコンジュゲート核酸を作製するコンジュゲート核酸作製ステップと、前記野生型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し第１の標識剤により修飾された第１のプローブ核酸と前記第１のプローブ核酸と同じ塩基長であり前記変異型の一部と相補的な塩基配列を有し第２の標識剤により修飾された第２のプローブ核酸とを作製するプローブ核酸作製ステップと、前記コンジュゲート核酸を流路に充填した後、前記第１のプローブ核酸及び前記第２のプローブ核酸を前記流路の中に注入し、前記流路の両端に電圧を印加して前記第１のプローブ核酸及び前記第２のプローブ核酸を電気泳動させ、前記第１の標識剤及び前記第２の標識剤を検出する電気泳動ステップと、を含むことを特徴としたものである。
【０００９】
また、本発明は、目的試料中の特定配列領域に含まれる野生型及び／又は変異型を検出する核酸解析方法において、前記特定配列領域を含む1本鎖核酸を作製するサンプル核酸作製ステップと、前記１本鎖核酸に遅らせる電気非泳動物質を結合させたコンジュゲート核酸を作製するコンジュゲート核酸作製ステップと、前記野生型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し第１の標識剤により修飾された第１のプローブ核酸と前記第１のプローブ核酸と同じ塩基長であり前記変異型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し第２の標識剤により修飾された第２のプローブ核酸とを作製するプローブ核酸作製ステップと、前記コンジュゲート核酸を流路に充填した後、前記第１のプローブ核酸及び前記第２のプローブ核酸を前記流路の中に注入し、前記流路の両端に電圧を印加して前記第１のプローブ核酸及び前記第２のプローブ核酸を電気泳動させ、前記第１の標識剤及び前記第２の標識剤を検出する電気泳動ステップと、を含むことを特徴としたものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の核酸解析方法によれば、核酸における一部の塩基配列の違いを明確に識別することができる。また、目的試料中に野生型と変異型の両者、あるいはどちらか一方のみが含まれる場合においても明確にそれぞれの場合を識別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明の核酸解析方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。まず、本発明の原理について説明し、次に、具体的な実施の形態について説明する。
（実施の形態１）
（サンプル核酸作製ステップ）
まず、本発明で用いるサンプル核酸を作製するサンプル核酸作製ステップについて説明する。本実施の形態で解析するサンプル核酸は植物、動物、または人の細胞や血液等から入手した核酸を用いる。
【００１２】
これらの核酸を鋳型にしてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）等の方法を利用して特定の配列領域を増幅する。ＰＣＲの増幅領域は４０塩基以上２００塩基以下が好ましい。これは、短すぎるとプライマーの試料に結合する際の特異性が得られず、２００塩基を超えるとそれ自体が高次構造をとることでプローブ核酸との特異性が得られない場合があるためである。ＰＣＲを用いる場合、プライマーはＳＮＰ部位を挟んだ領域でフォワード側及びリバース側の設計を行う。これにより、ＳＮＰ部位を有する配列領域を増幅することができる。ＰＣＲ産物は２本鎖核酸であるため、測定に用いない相補鎖はカラム等で捕捉し、除去することもできる。
【００１３】
サンプル核酸から得られる１本鎖核酸は、次のコンジュゲート核酸作製ステップでプローブ核酸遅延用のコンジュゲート核酸として用いる為、１本鎖核酸の末端にはプローブ核酸に対するコンジュゲート核酸の電気泳動速度を十分に遅らせる物質（以下電気非泳動物質）を結合させるための化学種を導入させておく。化学種は例えばアミノ基やイミド基などをＰＣＲプライマーの末端に修飾させておくことで１本鎖核酸に導入させることができ、また、電気非泳動物質に応じて選択可能である。
【００１４】
さらに、ＰＣＲ反応によって１本鎖核酸を得る場合はプライマーのフォワード側若しくはリバース側のいずれか一方にのみ化学種を結合させておくことで測定に必要な１本鎖核酸のみを電気非泳動物質に結合させることができる。また、ＲＮＡをサンプル核酸に用いる場合は逆転写反応の際に化学種を取り込ませることで化学種が結合した１本鎖核酸を得ることも可能である。
【００１５】
本ステップによって得られた１本鎖核酸は測定したい特定配列領域を含み、特定配列領域中の検出部位は野生型及び／又は変異型となっている。
【００１６】
（コンジュゲート核酸作製ステップ）
次に、コンジュゲート核酸作製ステップについて説明する。コンジュゲート核酸は前記サンプル核酸作製ステップで得られた１本鎖核酸と電気非泳動物質からなる。電気非泳動物質は、この一本鎖核酸の電気泳動速度を遅らせるためのものであり、好ましくは電荷を持たず、また高分子化合物であれば良い。例えば、一般的に使用されるリニアポリマーであるアクリルアミドやポリエチレングリコールが適応可能である。また、マイクロビーズであるガラスビーズや磁気ビーズ等も適応可能である。これらの電気非泳動物質を１本鎖核酸の化学種と結合させることでコンジュゲート核酸を作製する。
【００１７】
（プローブ核酸作製ステップ）
次に、プローブ核酸作製ステップについて説明する。まず、それぞれのプローブ核酸について説明する。第１のプローブ核酸の配列は、野生型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し、第２のプローブ核酸の配列は、変異型の一部と相補的な塩基配列を有するように設定される。
【００１８】
このため、サンプル核酸作製ステップにおける特定配列領域の増幅反応において、サンプル核酸が野生型の場合は目的核酸が、変異型の場合はＳＮＰｓ核酸が生成される。このとき、野生型及び変異型の配列は既知であり、この配列をもとに第１及び第２のプローブ核酸の配列設計が行われる。
【００１９】
第１のプローブ核酸には蛍光物質Ｆ１が修飾され、第２のプローブ核酸には蛍光物質Ｆ１とは蛍光波長の異なる蛍光物質Ｆ２が修飾される。蛍光物質はＦＩＴＣ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、ＦＡＭ等公知の物質が適応可能である。また、それぞれのプローブ核酸は化学合成等の公知の方法で作製される。
【００２０】
第１及び第２のプローブ核酸の塩基長は同じ長さに設定する。これは、それぞれのプローブ核酸の電気泳動速度を合わせるためであり、この結果、第１及び第２のプローブ核酸の電気泳動速度はコンジュゲート核酸の配列に依存した親和力のみに影響されることになる。また、第１及び第２のプローブ核酸の濃度は蛍光信号ピークを揃えるために同程度の終濃度にすることが好ましい。
【００２１】
野生型の配列と第１のプローブ核酸の配列との相補的な部分をａ塩基、変異型の配列と第２のプローブ核酸の配列との相補的な部分をｂ塩基とすると、前記ａ及びｂはａ＝ｂ及び６≦ａ≦３０の式を満たすように設計される。これは、相補な部分の長さを同じにすることで塩基長による核酸同士の親和力の影響を等しくし、さらに、相補的な部分が５塩基以下だとコンジュゲート核酸とプローブ核酸の親和力が弱い為に第１のプローブ核酸と第２のプローブ核酸の時間的な分離能が得られない場合があり、３１塩基以上だとコンジュゲート核酸とプローブ核酸の親和力が強すぎるために、それぞれのプローブ核酸の配列に関わらず非特異的にコンジュゲート核酸に結合するためである。
【００２２】
さらに、核酸同士の親和力は電気泳動を行う環境温度や電気泳動時の緩衝液に含まれる変性剤の濃度によって変わるため、ａ及びｂは温度、変性剤によってより詳細に最適化することが好ましい。例えば室温で且つ変性剤を含まない緩衝液で電気泳動を行う際は、ａ及びｂはａ＝ｂ及び６≦ａ≦１２であることが好ましい。
【００２３】
それぞれのプローブ核酸の全長は前記ａ及びｂの条件を満たすように設計されるが、プローブ核酸自体が高次構造を形成しないような塩基長にすることが好ましく、特に高次構造をとりにくい６塩基から２００塩基が好ましい。
【００２４】
また、コンジュゲート核酸の濃度は第１及び第２のプローブ核酸の濃度に対して濃いほど良い。これは、第１及び第２のプローブ核酸に対して確実に親和力を働かせることで確実に第１のプローブ核酸と第２のプローブ核酸を時間分離させるためである。しかしながら、コンジュゲート核酸に用いる１本鎖核酸はサンプル核酸作製ステップでのＰＣＲ等の増幅産物であるために、１本鎖核酸の終濃度は増幅反応限界で決まる。このため、それぞれのプローブ核酸の濃度は生成されるコンジュゲート核酸の濃度に応じて調製されるが、本発明者の実験によれば、プローブ核酸の濃度はコンジュゲート核酸の濃度に対し１／１０〜１／１００倍にすることが好ましい。
【００２５】
ここで、目的試料中の野生型及び変異型の存在に応じた第１及び第２のプローブ核酸の電気泳動時の挙動について詳細に説明する。
【００２６】
目的試料中に野生型のみが存在する場合、コンジュゲート核酸は野生型の配列を有するコンジュゲート核酸３０３のみ生成される（図１（Ａ））。このため、密閉流路３００内において電気泳動すると、野生型の配列の一部と相補的な塩基配列を有している第１のプローブ核酸３０１は第２のプローブ核酸３０２よりも結合力が強くなるために泳動速度が遅くなる。この結果、第１のプローブ核酸３０１が有する蛍光物質Ｆ１は第２のプローブ核酸３０２が有する蛍光物質Ｆ２に対して時間的に遅く検出される（図１（Ｂ））。
【００２７】
また、目的試料中に変異型のみが存在する場合、コンジュゲート核酸は変異型の配列を有するコンジュゲート核酸３０４のみ生成される（図２（Ａ））。このため、密閉流路３００内において電気泳動すると、変異型の配列の一部と相補的な塩基配列を有している第２のプローブ核酸３０２は第１のプローブ核酸３０１よりも結合力が強くなるために泳動速度が遅くなる。この結果、第１のプローブ核酸３０１が有する蛍光物質Ｆ１は第２のプローブ核酸３０２が有する蛍光物質Ｆ２に対して時間的に早く検出される（図２（Ｂ））。
【００２８】
さらに、目的試料中に野生型及び変異型が混在して存在する場合、コンジュゲート核酸は存在に応じて野生型の配列を有するコンジュゲート核酸３０３及び変異型の配列を有するコンジュゲート核酸３０４が生成される（図３（Ａ））。このため、密閉流路３００内において電気泳動すると、この存在に応じて第１プローブ核酸及び第２のプローブ核酸の時間的な位置関係が変化する。例えば、野生型が変異型よりも多い場合は、野生型の配列を有するコンジュゲート核酸３０３が変異型の配列を有するコンジュゲート核酸３０４よりも多く生成されることから第１のプローブ核酸３０１の蛍光物質Ｆ１は第２のプローブ核酸３０４の蛍光物質Ｆ２よりも時間的に遅く検出される。また、野生型が変異型よりも少ない場合は変異型の配列を有するコンジュゲート核酸３０４が野生型の配列を有するコンジュゲート核酸３０３よりも多く生成されることから、第２のプローブ核酸３０２の蛍光物質Ｆ２は第１のプローブ核酸３０１の蛍光物質Ｆ１よりも時間的に遅く検出される。さらに、野生型と変異型が同量存在する場合は第１のプローブ核酸３０１及び第２のプローブ核酸にはそれぞれのコンジュゲート核酸から同程度の親和力が働く為に蛍光物質Ｆ１とＦ２はほぼ同時に検出される（図３（Ｂ））。
【００２９】
このように、蛍光物質Ｆ１及びＦ２の時間的な位置関係を測定、解析することで、目的試料中に含まれる野生型及び変異型の存在を正確に検出することができる。
【００３０】
（電気泳動ステップ）
最後に、電気泳動ステップについて説明する。図４は、本実施の形態で用いる電気泳動装置の構成について示している。
【００３１】
白色光源２０１から励起された白色光はスリット２０２、コリメートレンズ２０３を通過し、可変励起フィルター２０４を通過する。可変励起フィルター２０４は蛍光物質の励起波長を有する波長帯のみを通過させるバンドパスフィルターが用いられ、測定する蛍光物質に応じて選択される。この可変励起フィルター２０４を瞬時に切り替えることで測定したい蛍光物質の励起光を選択的に透過できることから、複数の蛍光物質を同時に測定できる。可変励起フィルター２０４を通過した励起光はビームスプリッタ２０５によって分けられ、分岐した励起光の一部はモニタ用レンズ２０６を通過し、モニタ用検出器２０７に入射する。モニタ用検出器２０７は検出部２２３への照射パワーを一定にするように白色光源２０１にフィードバックする為のものである。ビームスプリッタ２０５を通過した励起光は投光レンズ２０８を通過し、ダイクロイックミラー２０９に到達する。
【００３２】
ダイクロイックミラー２０９はマルチバンドのダイクロイックミラーを用いた。マルチバンドのダイクロイックミラーとは複数のバンドパス領域を持つ波長フィルターであり、蛍光物質の励起波長及び蛍光波長によって選ばれ、可変励起フィルターによって通過してきた励起光を反射し、この励起光によって得られる蛍光物質からの蛍光信号を透過する性能を有する。可変励起フィルター２０４、ダイクロイックミラー２０９、蛍光フィルターは測定する蛍光物質によって選択される。ダイクロイックミラー２０９で反射された励起光は対物レンズ２１３によって密閉流路２１４の検出部２２３で集光され、蛍光物質に照射される。
【００３３】
励起光によって得られる蛍光物質からの蛍光信号は、対物レンズ２１３、ダイクロイックミラー２０９、蛍光フィルター２１０を透過し、集光レンズ２１１によって集光され検出素子２１２にて検出される。検出素子２１２はフォトダイオードや光電子増倍管等の光検出器が適応可能である。蛍光フィルター２１０は複数の蛍光物質がそれぞれ発する蛍光信号の波長帯のみを透過するマルチバンドのバンドパスフィルターが用いられる。得られた蛍光信号はプリアンプ２２０で増幅され、Ａ／Ｄコンバータ２２１でデジタル変換された後、制御部２２２でデータ解析される。
【００３４】
次に、電気泳動部周辺について詳細に説明する。緩衝液で満たされ、正電極２１６を配置した第１容器２１８と、緩衝液で満たされ、負電極２１７を配置した第２容器２１９との間に介する密閉流路２１４とからなり、この密閉流路２１４にコンジュゲート核酸を充填した後、測定すべき第１のプローブ核酸と第２のプローブ核酸を含む溶液を第２容器２１９側の密閉流路２１４に注入し、密閉流路２１４の両端を第１容器２１８及び第２容器２１９に入れて電気泳動を行う為の電圧を可変電源２１５によって正電極２１６及び負電極２１７に与える。
【００３５】
ここで、密閉流路２１４はアクリルアミドでコーティングされた内径５０〜３００μｍのキャピラリー管やプレート上に設けられた微細流路等が適応可能である。本実施例では内径１００μｍ、長さ２５ｃｍのキャピラリー管を用いた。本実施例のキャピラリー管で測定した場合、可変電源２１５より６ｋＶの電圧を印加し、およそ３〜１６μＡの電流を流してそれぞれのプローブ核酸の電気泳動を行った。
【００３６】
このように第１のプローブ核酸及び第２のプローブ核酸の電気泳動を行い、それぞれのプローブ核酸に標識された蛍光物質Ｆ１及びＦ２を検出部２２３で蛍光検出することで、それぞれのプローブ核酸の時間的な位置関係を検出することができ、この位置関係から野生型と変異型の両者、あるいはどちらか一方のみが含まれる場合においても明確に識別することが可能となる。
【００３７】
次に、本発明における核酸解析方法の具体的な実施例を説明する。測定の流れは、（１）サンプル核酸作製ステップ、（２）コンジュゲート核酸作製ステップ、（３）プローブ核酸作製ステップ、（４）電気泳動ステップからなる。各ステップの詳細については以下に示す。
【００３８】
（１）サンプル核酸作製ステップ
サンプル核酸作製ステップにおいて、次の実施例１から実施例３に挙げる方法を用いて測定に用いる試料を調製した。本実施例では、検出モデルとして癌遺伝子の1つであるヒトｃ−Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子の野生型及び変異型の検出を行った。
【００３９】
上記遺伝子の野生型は１２番目のアミノ酸コドンがＧＧＴであり、変異型はＧＧＴがＣＧＴに置き換わったものである。
【００４０】
本実施例の目的核酸として、上記遺伝子の野生型である５’−ＧＣＴＧＧＴＧＧ−３’の配列を有し５’末端にアミノ基を修飾した８塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。
【００４１】
また、ＳＮＰｓ核酸として、上記遺伝子の変異型である５’−ＧＣＴＣＧＴＧＧ−３’の配列を有し５’末端にアミノ基を修飾した８塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。
【００４２】
＜実施例１＞
これらの目的核酸及びＳＮＰｓ核酸をそれぞれ終濃度１ｍＭになるように緩衝液（Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ、ｐＨ７．４）で混合し、調製した。
【００４３】
＜実施例２＞
上記目的核酸のみを１ｍＭになるように緩衝液で調製した。
【００４４】
＜実施例３＞
上記ＳＮＰｓ核酸のみを１ｍＭになるように緩衝液で調製した。
【００４５】
（２）コンジュゲート核酸作製ステップ
分子量２０，０００のＰＥＧ−ＮＨＳ（日本油脂）にＤＭＳＯを４４５μＬ加え、攪拌した。溶かしたＰＥＧ−ＮＨＳに実施例１から実施例３で得られた１本鎖核酸溶液をそれぞれ５０μＬと１Ｍの炭酸水素ナトリウムを５μＬ加え、２０℃で３時間振とう後、分子量１０，０００を分画する透析膜を用いて1晩透析した後、乾燥させた。このようにして得られた実施例１から実施例３のコンジュゲート核酸を１００μＭになるように緩衝液で調製した。
【００４６】
（３）プローブ核酸作製ステップ
第１のプローブ核酸には、目的核酸と相補な配列を有し５’末端に蛍光物質であるＦＩＴＣを修飾した３０塩基の５’− ＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣ ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴ ＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡ −３’の配列を有するオリゴデオキシヌクレオチド（配列番号１）を使用した。
【００４７】
第２のプローブ核酸には、ＳＮＰｓ核酸と相補な配列を有し５’末端に蛍光物質であるＣｙ３．５を修飾した３０塩基の５’− ＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣ ＧＣＣＡＣＧＡＧＣＴ ＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡ −３’の配列を有するオリゴデオキシヌクレオチド（配列番号２）を使用した。
【００４８】
第１及び第２のプローブ核酸をそれぞれ終濃度５μＭになるように緩衝液で調製し、第１及び第２のプローブ核酸が混合されたプローブ核酸溶液を作製した。
【００４９】
（４）電気泳動ステップ
次に、図４で示した電気泳動装置によって核酸解析を行った。白色光源（ＭＡＸ３０２、朝日分光）から励起された白色光はスリット、コリメートレンズを通過し、可変励起フィルターを通過する。可変励起フィルター、ダイクロイックミラー、蛍光フィルターは市販のフィルターセット（ＧＦＰ／ＤｓＲｅｄ−２Ｘ−Ａ、Ｓｅｍｒｏｃｋ）を用いた。また、可変励起フィルターを制御用ＰＣで切り替えることで２つの蛍光物質を同時に測定した。ビームスプリッタで分岐された励起光はモニタ用検出器（Ｓ１２２６−４４ＢＱ、浜松ホトニクス）でモニタし、照射パワーが一定になるように白色光源の励起光量の調整を行った。ダイクロイックミラーで反射した励起光はキャピラリー管の検出部に照射された。
【００５０】
キャピラリー管は内径１００μｍ、長さ２５ｃｍであり、アクリルアミドで内側をコーティングしたものを用いた。キャピラリー管内にコンジュゲート核酸を充填した後、プローブ核酸調製ステップで作製したプローブ核酸溶液を負電極側のキャピラリー管の端から注入する。その後、正電極、及び負電極間に可変電源により６ｋＶの電圧を印加してそれぞれのプローブ核酸を電気泳動させた。測定はそれぞれ実施例１から実施例３から得られたコンジュゲート核酸毎にそれぞれ用いて行った。
【００５１】
検出部で得られた蛍光信号は蛍光フィルターを透過して検出素子（Ｓ１２２６−４４ＢＱ、浜松ホトニクス）に入射する。蛍光信号はプリアンプで増幅され、Ａ／Ｄコンバータでデジタル変換されて制御用ＰＣに取り込まれる。
【００５２】
図５、図６、図７は実施例１、２、３の結果をそれぞれ示している。図５に示す様に、ＦＩＴＣとＣｙ３．５の蛍光ピークがほぼ同時に現れている。これは、第１のプローブ核酸と第２のプローブ核酸が第１及び第２のコンジュゲート核酸から同程度の親和力を受けた結果、電気泳動速度が等しくなった結果を示している。また、ＦＩＴＣとＣｙ３．５との蛍光波長は、それぞれ５２０ｎｍと６００ｎｍと異なるので、両者の区分を容易に行うことが出来る。この結果から、サンプル核酸中には同程度の量の目的核酸とＳＮＰｓ核酸が含まれていることがわかる。
【００５３】
また、図６に示すように、Ｃｙ３．５を修飾した第２のプローブ核酸がＦＩＴＣを修飾した第１のプローブ核酸よりも時間的に早く検出される。これは、第１のプローブ核酸のコンジュゲート核酸に対する親和力が第２のプローブ核酸のそれよりも強く働き、この結果第１のプローブ核酸が第２のプローブ核酸よりも電気泳動速度が遅れた結果を示している。また、図５で説明したようにＦＩＴＣとＣｙ３．５との蛍光波長は、それぞれ異なるので、両者の区分を容易に行うことが出来る。この結果から、サンプル核酸中には目的核酸がＳＮＰｓ核酸よりも多量に含まれていることがわかる。
【００５４】
また、図７に示すように、ＦＩＴＣを修飾した第１のプローブ核酸がＣｙ３．５を修飾した第２のプローブ核酸よりも時間的に早く検出される。これは、第２のプローブ核酸のコンジュゲート核酸に対する親和力が第１のプローブ核酸のそれよりも強く働き、この結果第２のプローブ核酸が第１のプローブ核酸よりも電気泳動速度が遅れた結果を示している。この結果から、サンプル核酸中にはＳＮＰｓ核酸が目的核酸よりも多量に含まれていることになる。
【００５５】
これらの場合の結果から、検出したい配列部位の変異型、野生型に応じて波長の異なる標識剤を修飾させたプローブ核酸を用いることで、目的試料中に野生型と変異型の両者、あるいはどちらか一方のみが含まれる場合においても、それぞれの蛍光物質の時間的な位置関係とその蛍光波長を測定することで、それぞれの配列部位の場合を明確に識別することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明にかかる核酸解析方法は、核酸の塩基配列の１塩基の違いを明確に識別することが可能であることから、食品の遺伝子による産地判定や薬物代謝は遺伝病など医療分野に関わるＳＮＰｓ検出技術に広く有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の実施の形態において、サンプル核酸中に野生型のみが含まれる場合の概略図
【図２】本発明の実施の形態において、サンプル核酸中に変異型のみが含まれる場合の概略図
【図３】本発明の実施の形態において、サンプル核酸中に野生型及び変異型が含まれる場合の概略図
【図４】本発明の実施の形態における電気泳動装置の構成図
【図５】実施例１における測定結果を示したグラフ
【図６】実施例２における測定結果を示したグラフ
【図７】実施例３における測定結果を示したグラフ
【図８】従来の核酸解析方法の概略図
【符号の説明】
【００５８】
１００ キャピラリー管
１０１ 目的核酸
１０２ ＳＮＰｓ核酸
１０３ コンジュゲート核酸
２０１ 白色光源
２０２ スリット
２０３ コリメートレンズ
２０４ 可変励起フィルター
２０５ ビームスプリッタ
２０６ モニタ用レンズ
２０７ モニタ用検出器
２０８ 投光レンズ
２０９ ダイクロイックミラー
２１０ 蛍光フィルター
２１１ 集光レンズ
２１２ 検出素子
２１３ 対物レンズ
２１４、３００ 密閉流路
２１５ 可変電源
２１６ 正電極
２１７ 負電極
２１８ 第１容器
２１９ 第２容器
２２０ プリアンプ
２２１ Ａ／Ｄコンバータ
２２２ 制御部
２２３ 検出部
３０１ 第１のプローブ核酸
３０２ 第２のプローブ核酸
３０３ 野生型の配列を有するコンジュゲート核酸
３０４ 変異型の配列を有するコンジュゲート核酸
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的試料中の特定配列領域に含まれる野生型及び／又は変異型を検出する核酸解析方法において、
前記特定配列領域を含む１本鎖核酸に電気非泳動物質を結合させたコンジュゲート核酸を作製するコンジュゲート核酸作製ステップと、
前記野生型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し第１の標識剤により修飾された第１のプローブ核酸と前記第１のプローブ核酸と同じ塩基長であり前記変異型の一部と相補的な塩基配列を有し第２の標識剤により修飾された第２のプローブ核酸とを作製するプローブ核酸作製ステップと、
前記コンジュゲート核酸を流路に充填した後、前記第１のプローブ核酸及び前記第２のプローブ核酸を前記流路の中に注入し、前記流路の両端に電圧を印加して前記第１のプローブ核酸及び前記第２のプローブ核酸を電気泳動させ、前記第１の標識剤及び前記第２の標識剤を検出する電気泳動ステップと、を含む核酸解析方法。
【請求項２】
目的試料中の特定配列領域に含まれる野生型及び／又は変異型を検出する核酸解析方法において、
前記特定配列領域を含む1本鎖核酸を作製するサンプル核酸作製ステップと、
前記１本鎖核酸に電気非泳動物質を結合させたコンジュゲート核酸を作製するコンジュゲート核酸作製ステップと、
前記野生型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し第１の標識剤により修飾された第１のプローブ核酸と前記第１のプローブ核酸と同じ塩基長であり前記変異型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し第２の標識剤により修飾された第２のプローブ核酸とを作製するプローブ核酸作製ステップと、
前記コンジュゲート核酸を流路に充填した後、前記第１のプローブ核酸及び前記第２のプローブ核酸を前記流路の中に注入し、前記流路の両端に電圧を印加して前記第１のプローブ核酸及び前記第２のプローブ核酸を電気泳動させ、前記第１の標識剤及び前記第２の標識剤を検出する電気泳動ステップと、を含む核酸解析方法。
【請求項３】
前記１本鎖核酸は、前記特定配列領域を増幅させることで得られる請求項１又は請求項２記載の核酸解析方法。
【請求項４】
前記増幅はＰＣＲ反応を用いて行う請求項３記載の核酸解析方法。
【請求項５】
前記野生型の配列と前記第１のプローブ核酸の配列との相補的な部分をａ塩基、前記変異型の配列と前記第２のプローブ核酸の配列との相補的な部分をｂ塩基とすると、前記ａ及びｂは以下の式を満たす請求項１又は請求項２記載の核酸解析方法。
ａ＝ｂ
６≦ａ≦３０
【請求項６】
前記電気非泳動物質は、アクリルアミド、もしくはエチレングリコールのいずれかで作製されたリニアポリマーである請求項１又は請求項２記載の核酸解析方法。
【請求項７】
前記第１の標識剤及び前記第２の標識剤は、互いに蛍光波長の異なる蛍光物質である請求項１又は請求項２記載の核酸解析方法。
【請求項１】
目的試料中の特定配列領域に含まれる野生型及び／又は変異型を検出する核酸解析方法において、
前記特定配列領域を含む１本鎖核酸に電気非泳動物質を結合させたコンジュゲート核酸を作製するコンジュゲート核酸作製ステップと、
前記野生型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し第１の標識剤により修飾された第１のプローブ核酸と前記第１のプローブ核酸と同じ塩基長であり前記変異型の一部と相補的な塩基配列を有し第２の標識剤により修飾された第２のプローブ核酸とを作製するプローブ核酸作製ステップと、
前記コンジュゲート核酸を流路に充填した後、前記第１のプローブ核酸及び前記第２のプローブ核酸を前記流路の中に注入し、前記流路の両端に電圧を印加して前記第１のプローブ核酸及び前記第２のプローブ核酸を電気泳動させ、前記第１の標識剤及び前記第２の標識剤を検出する電気泳動ステップと、を含む核酸解析方法。
【請求項２】
目的試料中の特定配列領域に含まれる野生型及び／又は変異型を検出する核酸解析方法において、
前記特定配列領域を含む1本鎖核酸を作製するサンプル核酸作製ステップと、
前記１本鎖核酸に電気非泳動物質を結合させたコンジュゲート核酸を作製するコンジュゲート核酸作製ステップと、
前記野生型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し第１の標識剤により修飾された第１のプローブ核酸と前記第１のプローブ核酸と同じ塩基長であり前記変異型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し第２の標識剤により修飾された第２のプローブ核酸とを作製するプローブ核酸作製ステップと、
前記コンジュゲート核酸を流路に充填した後、前記第１のプローブ核酸及び前記第２のプローブ核酸を前記流路の中に注入し、前記流路の両端に電圧を印加して前記第１のプローブ核酸及び前記第２のプローブ核酸を電気泳動させ、前記第１の標識剤及び前記第２の標識剤を検出する電気泳動ステップと、を含む核酸解析方法。
【請求項３】
前記１本鎖核酸は、前記特定配列領域を増幅させることで得られる請求項１又は請求項２記載の核酸解析方法。
【請求項４】
前記増幅はＰＣＲ反応を用いて行う請求項３記載の核酸解析方法。
【請求項５】
前記野生型の配列と前記第１のプローブ核酸の配列との相補的な部分をａ塩基、前記変異型の配列と前記第２のプローブ核酸の配列との相補的な部分をｂ塩基とすると、前記ａ及びｂは以下の式を満たす請求項１又は請求項２記載の核酸解析方法。
ａ＝ｂ
６≦ａ≦３０
【請求項６】
前記電気非泳動物質は、アクリルアミド、もしくはエチレングリコールのいずれかで作製されたリニアポリマーである請求項１又は請求項２記載の核酸解析方法。
【請求項７】
前記第１の標識剤及び前記第２の標識剤は、互いに蛍光波長の異なる蛍光物質である請求項１又は請求項２記載の核酸解析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−２１９４５５（Ｐ２００９−２１９４５５Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−６９０３９（Ｐ２００８−６９０３９）
【出願日】平成２０年３月１８日（２００８．３．１８）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月１８日（２００８．３．１８）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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