核酸解析法
【課題】検出時間の重なる標準核酸と測定核酸を同時に分離・検出することにより、複数の配列が予測される遺伝子領域を効率的かつ高精度に定量解析する方法を提供すること。
【解決手段】複数の配列が予測される遺伝子領域の定量的解析において、前記遺伝子領域中の核酸断片を、標準核酸試料と測定核酸試料でそれぞれ分子量が異なる物質で標識して同時に分離・検出することにより、前記核酸断片を定量的に解析する方法。
【解決手段】複数の配列が予測される遺伝子領域の定量的解析において、前記遺伝子領域中の核酸断片を、標準核酸試料と測定核酸試料でそれぞれ分子量が異なる物質で標識して同時に分離・検出することにより、前記核酸断片を定量的に解析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の配列が予測される遺伝子領域中の核酸断片を高い精度で定量的に解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸電気泳動法による分離・検出では、検出時間の重なる核酸断片は同じ時間で検出されるため、標準核酸と測定核酸をそれぞれ別々に分離・検出を行い、泳動間の差を補正した後、泳動波形の比較分析を行わなければならない。そのため、検出時間の重なる核酸断片を分析する場合、従来の核酸分析法では、解析の手間、時間、そして費用の面において以下のような課題があった。
・標準核酸と測定核酸中の同じ遺伝子領域の核酸断片を別々に解析するため、一つの遺伝子領域に対して最低２解析が必要であり、測定核酸毎に解析数が増え、解析効率が悪い。
・核酸電気泳動における検出時間差を補正するために、検出時間補正用の内部標準試料が必要であり、当該試料を作製する費用、添加する工程、泳動間の補正をする手間を要する。
【０００３】
こうした問題を解決する手段として、標準核酸と測定核酸中の同じ遺伝子領域に対して、標準核酸と測定核酸で異なる蛍光色素を標識した該遺伝子領域に相補的なプライマーを用いて核酸増幅し、増幅産物を混ぜ合わせて同時に検出することで、1回の核酸電気泳動法により同時に検出する方法（特許文献１〜３参照）が考えられるが、以下の理由で定量性の高い同時検出は困難であることがわかった。
【０００４】
まず、上記方法を用いた場合、標準核酸と測定核酸中の同じ遺伝子領域の核酸断片は重なって検出される。これは、検出時間の同じ2つ以上の核酸断片に異なる蛍光スペクトルを持つ蛍光体で標識した場合も同様である。従来法では、標識した各蛍光体に対応する前もって登録された蛍光スペクトルのデータを基に逆行列を用いて重なりを補正することで、標準核酸と測定核酸を異なる蛍光色素で検出し、別々に定量することを可能としている。しかし、この補正に用いる蛍光スペクトルのデータは、標準蛍光物質により決定されているため、実際に測定に用いた蛍光体の蛍光スペクトルが完全に一致しなければ、補正結果に誤差が生じる。実際、蛍光体はその保存条件等により、蛍光スペクトルにゆらぎがあるため、完全一致することはまれである。従って、異なる２つの蛍光色素が重なった場合、定量的に検出することは困難である。例えば、蛍光標識の蛍光波長が異なり、検出時間が同じである2つの波形の高さに10倍以上の差がある場合、小さい方の波形は補正により消失する現象が確認される。このため、従来と同等の定量性を維持できず、核酸量を比較するような定量性を求める解析は困難であった。
【０００５】
【特許文献１】特開平5-322771号
【特許文献２】特開2000-35432号
【特許文献３】特開平6-125797号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、検出時間の重なる標準核酸と測定核酸を同時に分離・検出することにより、複数の配列が予測される遺伝子領域を効率的かつ高精度に定量解析する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題に対して鋭意検討を重ねた結果、標的遺伝子領域に相補的なプライマーを用いた標準核酸と測定核酸を異なる蛍光色素を標識する際に、標識する蛍光色素の組合せ次第で、同じ遺伝子領域から増幅された標準核酸と測定核酸由来の核酸断片でも核酸電気泳動法における検出時間を変化させることができることを見出した。そして、この検出時間の変化を利用して、標準核酸と測定核酸中の同じ遺伝子領域から増幅された核酸断片を検出波形が重複しない条件で同時検出すれば、標的遺伝子領域を一度に定量解析することが可能になることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明の課題は次の手段により解決できる。
１）検出対象である遺伝子領域の核酸断片の検出時間が標準核酸と測定核酸とで異なるような蛍光色素を標識したプライマーを用いて、標準核酸と測定核酸中の同じ遺伝子領域を別々に増幅する。
２）標準核酸と測定核酸から増幅された核酸断片を混合する。
３）核酸電気泳動法により、混合核酸断片を分離・検出する。
４）蛍光標識由来の検出時間差を補正する。
５）波形を比較分析する。
【０００９】
以上の知見に基づき、本発明は、複数の配列が予測される遺伝子領域の定量的解析において、前記遺伝子領域中の核酸断片を、標準核酸試料と測定核酸試料でそれぞれ分子量が異なる物質で標識し、同時に分離・検出することにより、前記核酸断片を定量的に解析する方法を提供する。
【００１０】
前記方法は、さらに画像処理により各核酸断片の検出時間の差を補正する工程を含んでいてもよい。
【００１１】
核酸断片を分離・検出する手段としては、核酸電気泳動法を利用することができる。ある態様において、核酸断片の分離・検出は核酸電気泳動法を利用した１本鎖核酸高次構造多型解析法（SSCP法）である。
【００１２】
標準核酸試料と測定核酸試料の標識は、それぞれ分子量が異なる物質を含むプライマーを用いた核酸増幅法により行うことができる。
【００１３】
標識物質としては、蛍光物質、核酸結合性の蛋白質、放射性物質等の無機物質を用いることができるが、特に本発明の方法においては蛍光物質が好適である。
分子量の異なる標識物質の組合せとしては、例えば、FAMとROX、FAMとTAMRA、FITCとTexas Red、FITCとPhycoerythrin（PE）、あるいはポリAやポリTのような分子量が異なるポリヌクレオチドの組合せ等を挙げることができる。
【００１４】
本発明の核酸解析方法は、多型部位や変異部位のような複数の配列が予測される遺伝子領域の定量的解析に利用でき、特にLOHの解析やがん細胞の検出に有用である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、由来の異なる同じ遺伝子領域の核酸断片を1回の泳動で同時に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図面を参酌しながら説明する。
本発明は、標準核酸と測定核酸中の同じ遺伝子領域の分析において、高い定量性を維持したまま標準核酸と測定核酸中に含まれる同じ遺伝子領域の増幅断片を同時に検出することで、電気泳動時における解析数の低減、分析工程の簡便化を図り得る核酸試料の定量方法を提供する。
【００１７】
本発明における「試料」とは、集団検診、健康診断、ドック検診、郵送検診などの検診試料や、病院における外来・入院患者の血液、組織、尿、また、動物、植物、微生物等、特に限定されず全ての核酸を含む生物試料が対象となる。
【００１８】
本発明における「核酸」とは、上記試料から抽出されたDNA、RNAを含む全ての核酸が対象となる。核酸を抽出する方法は公知の方法によって行うことができる。
【００１９】
本発明における「測定核酸（試料）」とは測定対象になる核酸（試料）であり、「標準核酸（試料）」とは、測定核酸（試料）との比較に用いる核酸（試料）であり、好ましくは測定核酸と同じ遺伝子領域の核酸（試料）、より好ましくは、同じ個体に由来する同じ遺伝子領域の核酸（試料）である。具体的にいえば、大腸癌患者において、大腸癌組織から抽出された特定遺伝子領域の測定核酸に対して、同患者の末梢血より分離された白血球から抽出された同じ遺伝子領域の核酸が標準核酸と言える。
【００２０】
本発明に用いられる核酸分析装置は、複数の核酸断片を分子の大きさや立体構造の違いで高感度かつ定量的に分離・検出できる装置であれば特に限定されない。具体的には、ゲル板電気泳動装置、キャピラリー電気泳動装置、チップ電気泳動装置などであり、より具体的には核酸の塩基配列の決定や核酸フラグメント解析に用いられるシークジェンGT シークエンシングシステム（Bio-Lad社）やジェネティックアナライザー（ABI社）、金属イオン、核酸、蛋白等の様々な物質を電気泳動により分析できるキャピラリー電気泳動システム（Agilent Technologies Inc.）、微小流路のチップを使用するコスモアイ（日立ハイテクノロジーズ社）、Agilent2100バイオアナライザ（Agilent Technologies Inc.）等が挙げられる。特に好ましくは、キャピラリー電気泳動装置であるが、核酸断片を高い分離能を持って分離検出できる限り、上述の分析装置に限定されない。
【００２１】
従来法の場合、上記装置にはそれぞれ特有の問題がある。例えば、ゲル板を用いた装置は電気泳動時間が長く、ゲル板の作製に手間がかかりスループットに問題がある。また、同じ配列の標準核酸と増幅核酸由来の増幅断片を比較する場合、キャピラリー電気泳動装置、チップ電気泳動装置の中には、複数の蛍光色素を検出する仕様となっていないため、検出時間が重なる核酸断片、または前述した標準核酸および測定核を同じレーンまたはキャピラリ−に投入することは不可能な場合がある。また、図３に示すように同じ検出時間の核酸増幅断片をキャピラリー電気泳動装置、チップ電気泳動装置を含む幾つかの電気泳動装置を用いて、異なるレーンまたはキャピラリーで電気泳動する場合、流路が個別なため、各レーンまたはキャピラリー間で検出時間にずれが生じる。そのため、異なるレーンまたはキャピラリー間で検出時間等の検出ピークの比較をするためには必ず位置補正用の内部標準を混ぜる必要があり、コストや手間の増加へと繋がる問題がある。また、複数の蛍光標識を用いることの可能なジェネティックアナライザー（ABI社）では、異なる蛍光標識を用い、各蛍光標識に最適な蛍光波長を検出することで、検出時間の全く同じ核酸を同じレーンまたはキャピラリーより検出することが可能である。しかし、図２に示すように、異なる２つの蛍光色素が重なる場合、蛍光スペクトルの重なりを正確に補正できないため、それぞれのピーク面積や高さを基に定量的に比較するには問題がある。
【００２２】
本発明にかかる核酸解析法によれば、検出時間が重なる複数の核酸断片に対して、同じレーンまたはキャピラリー内で同時に電気泳動を行い、本来同じ検出時間である２つの核酸断片を異なる検出時間で検出し、検出時間補正用の内部標準を用いることなしに、検出時間の補正を行い、定量性のあるピーク分析をすることが可能となる。
【００２３】
本発明にかかる核酸解析法は、具体的には、検出対象である遺伝子領域を増幅する工程、標準核酸および測定核酸の増幅断片を混合する工程、増幅断片を分離検出する工程、標識分子由来の検出時間差から各増幅断片を特定する工程を含む。
【００２４】
本発明において、検出対象である遺伝子領域を増幅する方法は、特に限定されるものではないが、PCR法、鎖置換増幅法（SDA法）、等温遺伝子増幅法（ICAN法）、LAMP法などがある。特にTaq-ポリメラーゼを使用したPCRでは、増幅後、PCR産物の末端を平滑化処理し、得られた核酸断片をSSCPで解析するLOHの検出方法は、特開平９−２０１１９９等に開示されている方法が利用できる。
【００２５】
PCRの場合、増幅すべき遺伝子領域は、少なくとも１つの遺伝子多型や突然変異などの複数の配列が予測される領域を含む範囲であれば特に制限はないが、PCRで増幅し易い長さと範囲を選ぶ必要がある。好適な長さは100〜200bpであり、範囲はPCRに適したオリゴヌクレオチドプライマーの設計の点から決めればよい。
【００２６】
本発明では、標準核酸と測定核酸で核酸断片の検出時間に差を生じさせるために、標準核酸と測定核酸を分子量の異なる物質で標識する。あるいは、標準核酸と測定核酸で、一方又は両方に１塩基以上の核酸塩基をプライマーの5’末端に付加する。標識は、標準核酸と測定核酸をそれぞれ、一方又は両方を分子量の異なる物質で標識、あるいは標準核酸と測定核酸で、一方又は両方に１塩基以上の核酸塩基をプライマーの5’末端に付加した増幅プライマーを用いた増幅反応を行うことにより実施できる。
【００２７】
標識物質としては、蛍光物質、核酸結合性の蛋白質、放射性物質等の無機物質を挙げることができるが、本発明では特に蛍光物質が好ましい。分子量の異なる標識物質の組合せとしては、例えば、FAMとROX、FAMとTAMRA、FITCとTexas Red、及び、FITCとPhycoerythrin（PE）、あるいはポリAやポリTのような分子量が異なるポリヌクレオチドの組合せ等を挙げることができる。プライマーの5’末端に付加する塩基は、標準核酸と測定核酸で検出時間が変化すればよく、付加する塩基の種類、数は特に限定されない。
【００２８】
ジェネティックアナライザー（ABI社）を用いた分析では、分子量にできるだけ差のある蛍光色素で増幅プライマーを標識すると、標準核酸と測定核酸の検出と分離が同時に可能となる。しかしながら、検出時間に差が出る分子で標識し、標準核酸と測定核酸が異なる検出時間で検出できる限り、上述の例に限定されるものではない。より好ましくは、前記分子の標識による検出時間の変化量を前もって確認しておくことが望ましい。
【００２９】
増幅方法にPCR法を用いる場合、核酸増幅装置としてサーマルサイクラー、例えば、核酸増幅装置であるMJ Research (MJ Research社)、等が用いられる。これらのようなPCR法を利用した核酸増幅装置の場合、核酸増幅用試薬調整液を満たした微小容器に対して加温と冷却を繰り返して、核酸を増幅する。また、定温で行う核酸増幅法を用いる場合、具体的にはサーモヒーター、インキュベーター等が挙げられるが、核酸増幅が可能であれば如何なる装置でもよく、上述したような装置に限定されない。
【００３０】
標準核酸および測定核酸由来の増幅断片の混合は、例えば、標準核酸から増幅された増幅断片と測定核酸より増幅された測定断片を等量分取し、Voltexミキサーで混合することにより実施できる。
【００３１】
本発明において、核酸断片を分離・検出する方法としては、複数の核酸増幅断片を分子の大きさや立体構造の違いで定量性高く分離し、検出できる限り何れの方法でもよいが、好適な方法の１つとしては、１本鎖核酸高次構造多型解析法（SSCP法）を挙げることができる。SSCP法とは増幅断片を変性して一本鎖化させ、立体構造を形成させ、遺伝子配列内の一塩基以上の違いを立体構造の違いとして分離・検出する方法であり、遺伝子変異や、1塩基置換型遺伝子多型、１塩基欠失型遺伝子多型、繰り返し単位の差が１単位以上であるマイクロサテライト多型等の遺伝子多型、核酸に標識された分子の大きさの違いで核酸断片を分離・検出できる。
【００３２】
本発明の方法は、具体的には、変異した遺伝子を持つ細胞の存在率を分析する方法や、試料中の染色体のいずれか一方の少なくとも一部の欠失であるヘテロ接合性の消失（LOH）する現象に対して遺伝子多型を利用して分析する方法（以下、LOH分析法）に応用しうるが、これに限定されるものではない。
【００３３】
本発明における遺伝子の「変異（突然変異）」とは、遺伝子の一部に置換または欠失等の変化が認められる現象を意味し、例えばヒトの癌においては転写制御因子等のゲノムの複製、遺伝子の修復等に関わる遺伝子領域に多くの変異が観察されている。より具体的には、がん抑制遺伝子であるｐ53遺伝子領域や癌原遺伝子であるK-ras遺伝子領域の変異が挙げられるが、本発明における変異は上記例に限定されるものではない。
【００３４】
これらの変異した遺伝子を持つ細胞の存在率の分析では、前述の例に示すような遺伝子に変異の起こり易い遺伝子領域に対して、相補的な増幅プライマーを用いて増幅し、検査マーカを用いて検出する。
【００３５】
より具体的には、標準核酸から得られた増幅断片の検出時間と、測定核酸から得られた増幅断片の検出時間を比較し、この検出時間の比率を基準として、検出する遺伝子領域が正常な細胞と検出する遺伝子領域に変異のある細胞の混合物から抽出された、測定核酸の正常な遺伝子断片と変異を含む遺伝子断片の比率を比較する。つまり、測定核酸について、検出する遺伝子領域に変異のない正常細胞と該遺伝子領域に変異のある細胞の比率を分析することになる。従って、こうした遺伝子変異分析では、測定試料における正常な遺伝子由来の増幅断片と変異のある遺伝子由来の増幅断片との比率が、測定試料中における異常のある細胞の比率であり、この比率を高感度で分析するために、高い定量性が必要となる。
【００３６】
本発明における「遺伝子多型」とは、染色体上の遺伝的多型であり、遺伝子上の塩基配列の個体差に由来する。一塩基多型は、平均して数百塩基に１ヶ所程度そのような遺伝子多型が存在すると言われている。例えば、９番染色体上のヒトのアルドラーゼＢ遺伝子（ALDOB）のイントロン８における１塩基置換の遺伝子多型は、9q22上と同定され、Brooks等が報告している（Am. J. Hum.Genet. 52 p835-840 Brooks 等(1993)）。また、9q34上と同定されたVAV2遺伝子上のT/C置換の遺伝子多型は、コスミドクローンL196C8株の塩基配列の測定データ（Gene Bank 登録番号AC002111）に基づいており、国立がんセンター中央病院で見出されたものである。
【００３７】
本発明における「繰り返し単位の差が1単位以上であるマイクロサテライト型多型部位」とは、例えば、繰り返し単位を特定の4塩基対とすると、遺伝子上のある特定の領域に、この塩基対の単位を多数繰り返す領域が存在し、その繰り返し数がアレル毎に異なり、遺伝子多型を形成する部位である。こうしたマイクロサテライト型多型では、アレル間の繰り返しがあると、ピークの分離がシャープになり解析精度が向上し、繰り返し単位の差が１単位以上であれば解析できる。しかし、マイクロサテライト多型ではヘテロ接合体における繰り返しの長さの違いからPCRの増幅効率がアレルにより変化し標準核酸として用いる患者血液試料においてもアレルの量比に差がでることがある。また、同様に繰り返し配列の長さの違いからSSCPを行った際のアレルの出現位置が定まらないためアレルを自動検出させるような自動化を行うには不都合になるなどの幾つかの問題がある。マイクロサテライト多型は、９番染色体上では、D9S775、D9S304とD9S303などが知られており、ゲノムデータベース（インターネット上のアドレス：http://gdbwww.gdb.prg/）から情報入手できる。
【００３８】
こうした遺伝子多型を分析することにより、父方由来の染色体中の対立遺伝子（アレル）と母方由来の染色体中の対立遺伝子（アレル）を区別することができる。すなわち、ある遺伝子多型部位のヘテロ接合体（父方と母方のアレルが異なる個体）で、父方と母方のアレルを増幅し、両方のアレルの増幅量を比較し、父方および母方の染色体のいずれか一方の少なくとも一部の欠失（LOH）を測定することにより、その遺伝子自体の欠失を検出することができる。より具体的には、標準核酸から得られた父方および母方のアレル増幅量の比率を基準として、染色体が正常な細胞と、染色体に欠失のある細胞の混合物から抽出された測定核酸の父方および母方のアレル増幅量の比率を比較する。つまり、測定核酸について、染色体に欠失のない正常細胞と染色体に欠失のある異常な細胞の比率を分析することになる。従って、LOH分析において父方と母方それぞれに由来するアレルの増幅量の差は、染色体に異常のある細胞の比率であり、この比率を高感度で分析するためには高い定量性が必要となる。
【００３９】
本発明において「染色体のいずれか一方の少なくとも一部の欠失」とは、相同染色体である常染色体の一方が完全に欠失したり、部分的に欠失した場合や、相同染色体で、お互いに異なる遺伝子部位に部分的な欠失を起こした場合を含む。
【００４０】
一塩基置換型の遺伝子多型（SNP）を利用する場合は、ヘテロ接合体である頻度が最大でも50％であるため、１つの染色体の欠失を調べるためには、一塩基多型だけでなくマイクロサテライト多型等、ヘテロ接合体の出現頻度の高い複数の遺伝子多型を組み合わせる必要がある。また、このように複数の遺伝子多型を組み合わせることで、標準核酸と測定核酸の由来する個体の一致度の判定率が向上し、LOHや遺伝子変異等の分析をすることと並行して、核酸の由来する個体の一致を確認することも可能となる。
【００４１】
標識分子由来の検出時間差から各増幅断片を特定するためには、各核酸の検出時間と、異なる大きさの分子を標識することによる検出時間の違いを前もって調べ、検出時間を基に各アレルのピークを特定する。より好ましくは、画像処理によりピークを平行移動させ、標識分子由来の検出時間差を補正し、標準核酸由来ピークと測定核酸由来ピークの一致を確認する。こうして、１塩基置換遺伝子多型やマイクロサテライト多型等、遺伝子多型を含む複数の遺伝子領域に対して、そのピーク出現位置により、ホモ・ヘテロ型、マイクロサテライト多型の場合は繰返し単位の数を特定する。
【００４２】
本発明における「画像処理」とは、標識した分子由来の検出時間差に対して、電気泳動による波形画像または波形データを補正する方法である。具体的には、標準核酸由来の検出ピークと測定核酸由来の検出ピークを重ねて表示し、各ピークはそれぞれ異なる色または線で表示することにより実施する。あるいは、検出時間を基に、標準核酸由来の検出ピークと測定核酸由来の検出ピークを特定し、各ピークはそれぞれ異なる色又は線で表示する。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ LOH分析による癌細胞比率の測定
１．検体の入手
標準核酸および、測定核酸に由来される患者試料は、次のようにして入手して処理後、LOHを解析するまで保存した。標準核酸には、末梢血の白血球（PBL）を用いた。10mLの静脈血をヘパリン入りの採血管に採取し、3,000rpmで15分間遠心後、血漿を廃棄した。この採血管に、0.2 %の食塩水40mLを加えて溶血し、再度3,000rpmで15分間遠心後、上清液を捨て、同様の操作を2回繰り返した。残ったペレットは、-80℃で凍結保存した。測定核酸には切除術やバイオプシィーで入手した新鮮な組織の一部は、1.5のエッペンドルフチューブに入れ、-80℃で凍結保存した。
【００４４】
２．核酸の抽出
血液、組織からのヒトゲノム核酸の抽出は、プロテナーゼＫで消化後、フェノール・クロロフォルムで抽出するデイビスら（Basic Method in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing 社出版）や菅野ら（Lab. Invest. 68 p361-366 Sugano等(1993)）の方法で行った。要約すると、65℃で15分間処理した後に、プロテナーゼK 1mg/mL、EDTA 10mM、NaCl 150mMを含む10mMトリス−塩酸緩衝液を加えて37℃で一夜インキュベート後、この反応液に等量のフェノール：クロロフォルム＝１：１溶液を加えて遠心分離することにより核酸を抽出した。抽出液に、0.1容の3mol/L酢酸ナトリウム溶液と2.5容の冷無水エタノールを加え、-20℃で2時間冷却し、核酸を沈殿させた。尿と癌組織のサンプルには、エタノール沈殿のキャリアーとして1μgのグリコーゲンを加え、核酸の回収率を向上させた。この溶液を遠心して沈殿物を集め、さらに、1mLの80％エタノールを加えて洗浄後、真空遠心濃縮機で沈殿を乾固した。この核酸を含む沈殿物は、ＴＥ緩衝液で再溶解し、-25℃で凍結保存した。
【００４５】
３．検出遺伝子領域の増幅
本実施例で用いた、ＰＣＲ増幅の条件を表１にまとめた。
【００４６】
【表１】
【００４７】
標準核酸増幅用のPCRプライマーは、ForwardとReverseのいずれか一方の5’末端側をFAM蛍光色素（分子量：473.4、励起 495 nm／蛍光 519nm）で標識し、測定核酸増幅用のPCRプライマーは、ForwardとReverseのいずれか一方の5’末端側をROX蛍光色素（分子量：668.15、励起 576 nm／蛍光 601nm）で標識した。遺伝子変異を検出する遺伝子領域としては、ｐ53遺伝子領域とK-ras遺伝子領域を用いた。
【００４８】
【表２】
【００４９】
生体試料より抽出したゲノム核酸（鋳型）0.1μg、各プライマーを1.0pMずつ、各ヌクレオチド3リン酸（dNTP）を10nMずつ、トリス塩酸緩衝液（pH8.3）10μM、KCl 50mM、MgCl2 1.5mM、ゼラチン 0.001％(w/v) 、Taq核酸ポリメラーゼ（Perkin Elmer社）0.75unit を加え、全液量を 30μl とした。この溶液について、表１に示した条件でPCR反応を行った。PCR反応後、氷上（4℃）で保存し、標準核酸より増幅されたPCR反応液5μLと、測定核酸より増幅されたPCR反応液5μLをVoltexミキサーにより混合し、PCR反応混合液を作成した。
【００５０】
４．末端平滑処理
末端平滑処理は次に示す順に試薬とサンプルを添加したが、添加する順序はこの例に限定されない。PCR反応混合液は、Klenow fragment （TAKARA（株）製）で処理し、3’末端を平滑化した。前述のPCR反応混合液5μLに、0.5 units の Klenow fragmentを加え、37℃で30分間反応させた（Genes. Chromosomes &Cancer 15 p157-164 Sugano等(1996)）。反応後、100mM EDTAを1μL加え、酵素の失活処理を行った。
【００５１】
５．分析用サンプルの調製
分析用サンプルの調製では次に示す順と容量で試薬と末端平滑処理サンプルを添加したが、添加する順序、容量、変性条件は核酸断片が変性されればよく、この例に限定されない。具体的には、分析用の微量容器にDNAの変性剤であるFormamide 39μLにDNA増幅産物の原液を1.0μL加え、総量40μLに調整し、92℃で2分間熱変性し、氷上（4℃）で5分間急冷した。
【００５２】
６．SSCP電気泳動
分析用に調製したサンプルに対して、泳動Buffer としてTris-HCl、Glycinを、分離ポリマーとして、15％ GeneScanPolymer、サンプル導入条件：電圧20ｋV時間5秒、泳動条件：電圧15ｋV、時間70分間でSSCP電気泳動を行った。
【００５３】
７．検出時間補正
SSCP法を用いた遺伝子変異の検出においては、遺伝子変異部位が不特定多数なため、測定核酸のピークだけでは、正常核酸由来のピークと遺伝子変異核酸由来のピークを分別することは困難である。そこで、本実施例では、標準核酸を同じキャピラリー内で同時に検出することで、正常核酸由来のピークを特定し、測定試料中の変異のある核酸の比率を分析した。FAM蛍光色素で標識した標準核酸は、520nm前後の蛍光波長の標準核酸増幅断片ピークを検出し、ROX蛍光色素で標識した測定核酸は、600nm前後の蛍光波長の測定核酸増幅断片ピークを検出した。このとき、図４左に示すように、ROX標識した測定核酸はFAM標識した標準核酸よりも分子量が大きいため、検出時間が約4秒遅かった。そこで、図５右に示すように画像処理によりピークを平行移動させ、4秒分の検出時間差を補正し、各遺伝子領域において標準核酸由来ピーク（NA0）と測定核酸中の正常核酸由来ピーク（TA0）の一致を確認し、正常核酸由来のピークを特定した。
【００５４】
８．遺伝子変異細胞比率の測定
測定試料中に含まれる遺伝子変異細胞の比率は正常核酸A0を含む測定試料T中の変異核酸A１の比率を求めればよい。すなわち、下式の方法で測定できる。
測定試料中の癌細胞比率（％）＝TA0×100／（TA0+TA1）
【００５５】
TA0、TA1は各シグナルのピーク高さを示す。上述の変異細胞比率を算出する計算式を用いて、測定試料中の癌細胞比率（％）を測定した。（表３）
【００５６】
【表３】
【００５７】
このように、標準核酸と測定核酸のピークが重ならないように同じキャピラリーで検出し、検出後に検出時間の補正を行うことにより、蛍光強度の重なりを防ぎ、正常核酸由来のピークと変異核酸由来のピークを特定し、定量的に分析することが可能となった。
【００５８】
実施例２ 変異分析による遺伝子変異細胞比率の測定
１．検体の入手
実施例１と同様の方法で試料を入手し、保存した。
【００５９】
２．核酸の抽出
実施例１と同様の方法で核酸を抽出し、保存した。
【００６０】
３．検出遺伝子領域の増幅
遺伝子増幅反応の条件、試薬組成としては実施例１と同様の方法で実施した。標準核酸増幅用のPCRプライマーは、ForwardとReverseのいずれか一方の5’末端側をFAM蛍光色素（分子量：473.4、励起 495 nm／蛍光 519nm）で標識し、測定核酸増幅用のPCRプライマーは、ForwardとReverseのいずれか一方の5’末端側をROX蛍光色素（分子量：668.15、励起 576 nm／蛍光 601nm）で標識した。アレル消失を検出する遺伝子多型部位として、ALDOB、VAV2、D9S747、D9S303、D9S304を用いた。増幅反応後、実施例１と同様の方法で、標準核酸由来の増幅断片と、測定核酸由来の増幅断片を混合した。
【００６１】
【表４】
【００６２】
４．末端平滑処理とSSCP電気泳動
実施例１と同様の方法で末端平滑処理を行い、分析用サンプルを調製し、SSCP電気泳動を実施した。
【００６３】
５．検出時間補正
FAM蛍光色素で標識した標準核酸については520nm前後の蛍光波長の標準核酸増幅断片ピークを検出し、ROX蛍光色素で標識した測定核酸については600nm前後の蛍光波長の測定核酸増幅断片ピークを検出した。このとき、図５左に示すように、ROX標識した測定核酸はFAM標識した標準核酸よりも分子量が大きいため、検出時間が約3秒遅かった。そこで、図５に示すように画像処理によりピークを平行移動させ、3秒分の検出時間差を補正し、各遺伝子領域において標準核酸由来ピークと測定核酸由来ピークの一致を確認し、試料の取り違いがないことを確認した。
【００６４】
６．LOH分析による癌細胞比率の測定
癌患者血液より抽出された核酸つまり標準核酸の父方と母方アレルのシグナル（ピーク高さ）を比較して、同癌患者の癌組織より抽出された測定核酸における父方と母方のアレルのうち、一方のアレルのピーク高さが減少した場合、LOHと定義する。サンプル中の癌由来核酸の比率、即ち、癌細胞の比率は、下式により推定できる（Genes. Chromosomes & Cancer 15 p157-164 Sugano等(1996)）。
測定試料中の癌細胞比率（％）＝（NA1/NA2−TA1/TA2）×100／（NA1/NA2）
【００６５】
A1とA2アレルを持つヘテロ接合性のヒトで、Nは標準核酸、つまり同癌患者より採取された正常血液からのシグナルのピーク高さを示し、Tは測定核酸、つまり癌患者の癌組織からのシグナルのピーク高さを示す。LOH陽性・陰性の判定境界値（以下、カットオフ値）は、10％とした。上述のLOHを算出する計算式を用いて、測定試料中の癌細胞比率（％）を測定した。（表５）
【００６６】
【表５】
【００６７】
このように、標準核酸と測定核酸のピークが重ならないように核酸断片を標識することで、同じキャピラリーで検出し、癌細胞比率15％前後の試料を定量的に測定することができる。
【００６８】
以上の結果に実証されるように、本発明は以下の効果を奏する。
１）標準核酸と測定核酸中の同じ遺伝子領域から増幅した核酸断片を同時に検出しつつ、高い定量性を維持できる。
２）核酸電気泳動の後、検出時間の補正の必要がなくなり、補正用内部標準試薬の費用削減、投入工程の短縮、補正操作の省略に繋がる。
３）蛍光色素由来の検出時間の違いは常に一定のため、電気泳動の違いが原因となる補正困難な検出時間の違いがなくなり、波形比較を正確に認識できる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によれば、由来の異なる同じ遺伝子領域の核酸断片を1回の泳動で同時に検出することができる。本発明は多型や変異部位の定量的解析に利用でき、特にLOH分析や癌細胞の検出に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明における解析法の概略
【図２】SSCP法を用いた蛍光多重化解析における補正前後の比較図
【図３】SSCP法を用いた単独解析における位置補正用内部標準による補正前後の比較図
【図４】遺伝子変異解析における本発明を用いた検出波形と検出時間差補正図
【図５】LOH解析における本発明を用いた検出波形と検出時間差補正図
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
配列番号１〜２８−人工配列の説明：プライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の配列が予測される遺伝子領域中の核酸断片を高い精度で定量的に解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸電気泳動法による分離・検出では、検出時間の重なる核酸断片は同じ時間で検出されるため、標準核酸と測定核酸をそれぞれ別々に分離・検出を行い、泳動間の差を補正した後、泳動波形の比較分析を行わなければならない。そのため、検出時間の重なる核酸断片を分析する場合、従来の核酸分析法では、解析の手間、時間、そして費用の面において以下のような課題があった。
・標準核酸と測定核酸中の同じ遺伝子領域の核酸断片を別々に解析するため、一つの遺伝子領域に対して最低２解析が必要であり、測定核酸毎に解析数が増え、解析効率が悪い。
・核酸電気泳動における検出時間差を補正するために、検出時間補正用の内部標準試料が必要であり、当該試料を作製する費用、添加する工程、泳動間の補正をする手間を要する。
【０００３】
こうした問題を解決する手段として、標準核酸と測定核酸中の同じ遺伝子領域に対して、標準核酸と測定核酸で異なる蛍光色素を標識した該遺伝子領域に相補的なプライマーを用いて核酸増幅し、増幅産物を混ぜ合わせて同時に検出することで、1回の核酸電気泳動法により同時に検出する方法（特許文献１〜３参照）が考えられるが、以下の理由で定量性の高い同時検出は困難であることがわかった。
【０００４】
まず、上記方法を用いた場合、標準核酸と測定核酸中の同じ遺伝子領域の核酸断片は重なって検出される。これは、検出時間の同じ2つ以上の核酸断片に異なる蛍光スペクトルを持つ蛍光体で標識した場合も同様である。従来法では、標識した各蛍光体に対応する前もって登録された蛍光スペクトルのデータを基に逆行列を用いて重なりを補正することで、標準核酸と測定核酸を異なる蛍光色素で検出し、別々に定量することを可能としている。しかし、この補正に用いる蛍光スペクトルのデータは、標準蛍光物質により決定されているため、実際に測定に用いた蛍光体の蛍光スペクトルが完全に一致しなければ、補正結果に誤差が生じる。実際、蛍光体はその保存条件等により、蛍光スペクトルにゆらぎがあるため、完全一致することはまれである。従って、異なる２つの蛍光色素が重なった場合、定量的に検出することは困難である。例えば、蛍光標識の蛍光波長が異なり、検出時間が同じである2つの波形の高さに10倍以上の差がある場合、小さい方の波形は補正により消失する現象が確認される。このため、従来と同等の定量性を維持できず、核酸量を比較するような定量性を求める解析は困難であった。
【０００５】
【特許文献１】特開平5-322771号
【特許文献２】特開2000-35432号
【特許文献３】特開平6-125797号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、検出時間の重なる標準核酸と測定核酸を同時に分離・検出することにより、複数の配列が予測される遺伝子領域を効率的かつ高精度に定量解析する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題に対して鋭意検討を重ねた結果、標的遺伝子領域に相補的なプライマーを用いた標準核酸と測定核酸を異なる蛍光色素を標識する際に、標識する蛍光色素の組合せ次第で、同じ遺伝子領域から増幅された標準核酸と測定核酸由来の核酸断片でも核酸電気泳動法における検出時間を変化させることができることを見出した。そして、この検出時間の変化を利用して、標準核酸と測定核酸中の同じ遺伝子領域から増幅された核酸断片を検出波形が重複しない条件で同時検出すれば、標的遺伝子領域を一度に定量解析することが可能になることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明の課題は次の手段により解決できる。
１）検出対象である遺伝子領域の核酸断片の検出時間が標準核酸と測定核酸とで異なるような蛍光色素を標識したプライマーを用いて、標準核酸と測定核酸中の同じ遺伝子領域を別々に増幅する。
２）標準核酸と測定核酸から増幅された核酸断片を混合する。
３）核酸電気泳動法により、混合核酸断片を分離・検出する。
４）蛍光標識由来の検出時間差を補正する。
５）波形を比較分析する。
【０００９】
以上の知見に基づき、本発明は、複数の配列が予測される遺伝子領域の定量的解析において、前記遺伝子領域中の核酸断片を、標準核酸試料と測定核酸試料でそれぞれ分子量が異なる物質で標識し、同時に分離・検出することにより、前記核酸断片を定量的に解析する方法を提供する。
【００１０】
前記方法は、さらに画像処理により各核酸断片の検出時間の差を補正する工程を含んでいてもよい。
【００１１】
核酸断片を分離・検出する手段としては、核酸電気泳動法を利用することができる。ある態様において、核酸断片の分離・検出は核酸電気泳動法を利用した１本鎖核酸高次構造多型解析法（SSCP法）である。
【００１２】
標準核酸試料と測定核酸試料の標識は、それぞれ分子量が異なる物質を含むプライマーを用いた核酸増幅法により行うことができる。
【００１３】
標識物質としては、蛍光物質、核酸結合性の蛋白質、放射性物質等の無機物質を用いることができるが、特に本発明の方法においては蛍光物質が好適である。
分子量の異なる標識物質の組合せとしては、例えば、FAMとROX、FAMとTAMRA、FITCとTexas Red、FITCとPhycoerythrin（PE）、あるいはポリAやポリTのような分子量が異なるポリヌクレオチドの組合せ等を挙げることができる。
【００１４】
本発明の核酸解析方法は、多型部位や変異部位のような複数の配列が予測される遺伝子領域の定量的解析に利用でき、特にLOHの解析やがん細胞の検出に有用である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、由来の異なる同じ遺伝子領域の核酸断片を1回の泳動で同時に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図面を参酌しながら説明する。
本発明は、標準核酸と測定核酸中の同じ遺伝子領域の分析において、高い定量性を維持したまま標準核酸と測定核酸中に含まれる同じ遺伝子領域の増幅断片を同時に検出することで、電気泳動時における解析数の低減、分析工程の簡便化を図り得る核酸試料の定量方法を提供する。
【００１７】
本発明における「試料」とは、集団検診、健康診断、ドック検診、郵送検診などの検診試料や、病院における外来・入院患者の血液、組織、尿、また、動物、植物、微生物等、特に限定されず全ての核酸を含む生物試料が対象となる。
【００１８】
本発明における「核酸」とは、上記試料から抽出されたDNA、RNAを含む全ての核酸が対象となる。核酸を抽出する方法は公知の方法によって行うことができる。
【００１９】
本発明における「測定核酸（試料）」とは測定対象になる核酸（試料）であり、「標準核酸（試料）」とは、測定核酸（試料）との比較に用いる核酸（試料）であり、好ましくは測定核酸と同じ遺伝子領域の核酸（試料）、より好ましくは、同じ個体に由来する同じ遺伝子領域の核酸（試料）である。具体的にいえば、大腸癌患者において、大腸癌組織から抽出された特定遺伝子領域の測定核酸に対して、同患者の末梢血より分離された白血球から抽出された同じ遺伝子領域の核酸が標準核酸と言える。
【００２０】
本発明に用いられる核酸分析装置は、複数の核酸断片を分子の大きさや立体構造の違いで高感度かつ定量的に分離・検出できる装置であれば特に限定されない。具体的には、ゲル板電気泳動装置、キャピラリー電気泳動装置、チップ電気泳動装置などであり、より具体的には核酸の塩基配列の決定や核酸フラグメント解析に用いられるシークジェンGT シークエンシングシステム（Bio-Lad社）やジェネティックアナライザー（ABI社）、金属イオン、核酸、蛋白等の様々な物質を電気泳動により分析できるキャピラリー電気泳動システム（Agilent Technologies Inc.）、微小流路のチップを使用するコスモアイ（日立ハイテクノロジーズ社）、Agilent2100バイオアナライザ（Agilent Technologies Inc.）等が挙げられる。特に好ましくは、キャピラリー電気泳動装置であるが、核酸断片を高い分離能を持って分離検出できる限り、上述の分析装置に限定されない。
【００２１】
従来法の場合、上記装置にはそれぞれ特有の問題がある。例えば、ゲル板を用いた装置は電気泳動時間が長く、ゲル板の作製に手間がかかりスループットに問題がある。また、同じ配列の標準核酸と増幅核酸由来の増幅断片を比較する場合、キャピラリー電気泳動装置、チップ電気泳動装置の中には、複数の蛍光色素を検出する仕様となっていないため、検出時間が重なる核酸断片、または前述した標準核酸および測定核を同じレーンまたはキャピラリ−に投入することは不可能な場合がある。また、図３に示すように同じ検出時間の核酸増幅断片をキャピラリー電気泳動装置、チップ電気泳動装置を含む幾つかの電気泳動装置を用いて、異なるレーンまたはキャピラリーで電気泳動する場合、流路が個別なため、各レーンまたはキャピラリー間で検出時間にずれが生じる。そのため、異なるレーンまたはキャピラリー間で検出時間等の検出ピークの比較をするためには必ず位置補正用の内部標準を混ぜる必要があり、コストや手間の増加へと繋がる問題がある。また、複数の蛍光標識を用いることの可能なジェネティックアナライザー（ABI社）では、異なる蛍光標識を用い、各蛍光標識に最適な蛍光波長を検出することで、検出時間の全く同じ核酸を同じレーンまたはキャピラリーより検出することが可能である。しかし、図２に示すように、異なる２つの蛍光色素が重なる場合、蛍光スペクトルの重なりを正確に補正できないため、それぞれのピーク面積や高さを基に定量的に比較するには問題がある。
【００２２】
本発明にかかる核酸解析法によれば、検出時間が重なる複数の核酸断片に対して、同じレーンまたはキャピラリー内で同時に電気泳動を行い、本来同じ検出時間である２つの核酸断片を異なる検出時間で検出し、検出時間補正用の内部標準を用いることなしに、検出時間の補正を行い、定量性のあるピーク分析をすることが可能となる。
【００２３】
本発明にかかる核酸解析法は、具体的には、検出対象である遺伝子領域を増幅する工程、標準核酸および測定核酸の増幅断片を混合する工程、増幅断片を分離検出する工程、標識分子由来の検出時間差から各増幅断片を特定する工程を含む。
【００２４】
本発明において、検出対象である遺伝子領域を増幅する方法は、特に限定されるものではないが、PCR法、鎖置換増幅法（SDA法）、等温遺伝子増幅法（ICAN法）、LAMP法などがある。特にTaq-ポリメラーゼを使用したPCRでは、増幅後、PCR産物の末端を平滑化処理し、得られた核酸断片をSSCPで解析するLOHの検出方法は、特開平９−２０１１９９等に開示されている方法が利用できる。
【００２５】
PCRの場合、増幅すべき遺伝子領域は、少なくとも１つの遺伝子多型や突然変異などの複数の配列が予測される領域を含む範囲であれば特に制限はないが、PCRで増幅し易い長さと範囲を選ぶ必要がある。好適な長さは100〜200bpであり、範囲はPCRに適したオリゴヌクレオチドプライマーの設計の点から決めればよい。
【００２６】
本発明では、標準核酸と測定核酸で核酸断片の検出時間に差を生じさせるために、標準核酸と測定核酸を分子量の異なる物質で標識する。あるいは、標準核酸と測定核酸で、一方又は両方に１塩基以上の核酸塩基をプライマーの5’末端に付加する。標識は、標準核酸と測定核酸をそれぞれ、一方又は両方を分子量の異なる物質で標識、あるいは標準核酸と測定核酸で、一方又は両方に１塩基以上の核酸塩基をプライマーの5’末端に付加した増幅プライマーを用いた増幅反応を行うことにより実施できる。
【００２７】
標識物質としては、蛍光物質、核酸結合性の蛋白質、放射性物質等の無機物質を挙げることができるが、本発明では特に蛍光物質が好ましい。分子量の異なる標識物質の組合せとしては、例えば、FAMとROX、FAMとTAMRA、FITCとTexas Red、及び、FITCとPhycoerythrin（PE）、あるいはポリAやポリTのような分子量が異なるポリヌクレオチドの組合せ等を挙げることができる。プライマーの5’末端に付加する塩基は、標準核酸と測定核酸で検出時間が変化すればよく、付加する塩基の種類、数は特に限定されない。
【００２８】
ジェネティックアナライザー（ABI社）を用いた分析では、分子量にできるだけ差のある蛍光色素で増幅プライマーを標識すると、標準核酸と測定核酸の検出と分離が同時に可能となる。しかしながら、検出時間に差が出る分子で標識し、標準核酸と測定核酸が異なる検出時間で検出できる限り、上述の例に限定されるものではない。より好ましくは、前記分子の標識による検出時間の変化量を前もって確認しておくことが望ましい。
【００２９】
増幅方法にPCR法を用いる場合、核酸増幅装置としてサーマルサイクラー、例えば、核酸増幅装置であるMJ Research (MJ Research社)、等が用いられる。これらのようなPCR法を利用した核酸増幅装置の場合、核酸増幅用試薬調整液を満たした微小容器に対して加温と冷却を繰り返して、核酸を増幅する。また、定温で行う核酸増幅法を用いる場合、具体的にはサーモヒーター、インキュベーター等が挙げられるが、核酸増幅が可能であれば如何なる装置でもよく、上述したような装置に限定されない。
【００３０】
標準核酸および測定核酸由来の増幅断片の混合は、例えば、標準核酸から増幅された増幅断片と測定核酸より増幅された測定断片を等量分取し、Voltexミキサーで混合することにより実施できる。
【００３１】
本発明において、核酸断片を分離・検出する方法としては、複数の核酸増幅断片を分子の大きさや立体構造の違いで定量性高く分離し、検出できる限り何れの方法でもよいが、好適な方法の１つとしては、１本鎖核酸高次構造多型解析法（SSCP法）を挙げることができる。SSCP法とは増幅断片を変性して一本鎖化させ、立体構造を形成させ、遺伝子配列内の一塩基以上の違いを立体構造の違いとして分離・検出する方法であり、遺伝子変異や、1塩基置換型遺伝子多型、１塩基欠失型遺伝子多型、繰り返し単位の差が１単位以上であるマイクロサテライト多型等の遺伝子多型、核酸に標識された分子の大きさの違いで核酸断片を分離・検出できる。
【００３２】
本発明の方法は、具体的には、変異した遺伝子を持つ細胞の存在率を分析する方法や、試料中の染色体のいずれか一方の少なくとも一部の欠失であるヘテロ接合性の消失（LOH）する現象に対して遺伝子多型を利用して分析する方法（以下、LOH分析法）に応用しうるが、これに限定されるものではない。
【００３３】
本発明における遺伝子の「変異（突然変異）」とは、遺伝子の一部に置換または欠失等の変化が認められる現象を意味し、例えばヒトの癌においては転写制御因子等のゲノムの複製、遺伝子の修復等に関わる遺伝子領域に多くの変異が観察されている。より具体的には、がん抑制遺伝子であるｐ53遺伝子領域や癌原遺伝子であるK-ras遺伝子領域の変異が挙げられるが、本発明における変異は上記例に限定されるものではない。
【００３４】
これらの変異した遺伝子を持つ細胞の存在率の分析では、前述の例に示すような遺伝子に変異の起こり易い遺伝子領域に対して、相補的な増幅プライマーを用いて増幅し、検査マーカを用いて検出する。
【００３５】
より具体的には、標準核酸から得られた増幅断片の検出時間と、測定核酸から得られた増幅断片の検出時間を比較し、この検出時間の比率を基準として、検出する遺伝子領域が正常な細胞と検出する遺伝子領域に変異のある細胞の混合物から抽出された、測定核酸の正常な遺伝子断片と変異を含む遺伝子断片の比率を比較する。つまり、測定核酸について、検出する遺伝子領域に変異のない正常細胞と該遺伝子領域に変異のある細胞の比率を分析することになる。従って、こうした遺伝子変異分析では、測定試料における正常な遺伝子由来の増幅断片と変異のある遺伝子由来の増幅断片との比率が、測定試料中における異常のある細胞の比率であり、この比率を高感度で分析するために、高い定量性が必要となる。
【００３６】
本発明における「遺伝子多型」とは、染色体上の遺伝的多型であり、遺伝子上の塩基配列の個体差に由来する。一塩基多型は、平均して数百塩基に１ヶ所程度そのような遺伝子多型が存在すると言われている。例えば、９番染色体上のヒトのアルドラーゼＢ遺伝子（ALDOB）のイントロン８における１塩基置換の遺伝子多型は、9q22上と同定され、Brooks等が報告している（Am. J. Hum.Genet. 52 p835-840 Brooks 等(1993)）。また、9q34上と同定されたVAV2遺伝子上のT/C置換の遺伝子多型は、コスミドクローンL196C8株の塩基配列の測定データ（Gene Bank 登録番号AC002111）に基づいており、国立がんセンター中央病院で見出されたものである。
【００３７】
本発明における「繰り返し単位の差が1単位以上であるマイクロサテライト型多型部位」とは、例えば、繰り返し単位を特定の4塩基対とすると、遺伝子上のある特定の領域に、この塩基対の単位を多数繰り返す領域が存在し、その繰り返し数がアレル毎に異なり、遺伝子多型を形成する部位である。こうしたマイクロサテライト型多型では、アレル間の繰り返しがあると、ピークの分離がシャープになり解析精度が向上し、繰り返し単位の差が１単位以上であれば解析できる。しかし、マイクロサテライト多型ではヘテロ接合体における繰り返しの長さの違いからPCRの増幅効率がアレルにより変化し標準核酸として用いる患者血液試料においてもアレルの量比に差がでることがある。また、同様に繰り返し配列の長さの違いからSSCPを行った際のアレルの出現位置が定まらないためアレルを自動検出させるような自動化を行うには不都合になるなどの幾つかの問題がある。マイクロサテライト多型は、９番染色体上では、D9S775、D9S304とD9S303などが知られており、ゲノムデータベース（インターネット上のアドレス：http://gdbwww.gdb.prg/）から情報入手できる。
【００３８】
こうした遺伝子多型を分析することにより、父方由来の染色体中の対立遺伝子（アレル）と母方由来の染色体中の対立遺伝子（アレル）を区別することができる。すなわち、ある遺伝子多型部位のヘテロ接合体（父方と母方のアレルが異なる個体）で、父方と母方のアレルを増幅し、両方のアレルの増幅量を比較し、父方および母方の染色体のいずれか一方の少なくとも一部の欠失（LOH）を測定することにより、その遺伝子自体の欠失を検出することができる。より具体的には、標準核酸から得られた父方および母方のアレル増幅量の比率を基準として、染色体が正常な細胞と、染色体に欠失のある細胞の混合物から抽出された測定核酸の父方および母方のアレル増幅量の比率を比較する。つまり、測定核酸について、染色体に欠失のない正常細胞と染色体に欠失のある異常な細胞の比率を分析することになる。従って、LOH分析において父方と母方それぞれに由来するアレルの増幅量の差は、染色体に異常のある細胞の比率であり、この比率を高感度で分析するためには高い定量性が必要となる。
【００３９】
本発明において「染色体のいずれか一方の少なくとも一部の欠失」とは、相同染色体である常染色体の一方が完全に欠失したり、部分的に欠失した場合や、相同染色体で、お互いに異なる遺伝子部位に部分的な欠失を起こした場合を含む。
【００４０】
一塩基置換型の遺伝子多型（SNP）を利用する場合は、ヘテロ接合体である頻度が最大でも50％であるため、１つの染色体の欠失を調べるためには、一塩基多型だけでなくマイクロサテライト多型等、ヘテロ接合体の出現頻度の高い複数の遺伝子多型を組み合わせる必要がある。また、このように複数の遺伝子多型を組み合わせることで、標準核酸と測定核酸の由来する個体の一致度の判定率が向上し、LOHや遺伝子変異等の分析をすることと並行して、核酸の由来する個体の一致を確認することも可能となる。
【００４１】
標識分子由来の検出時間差から各増幅断片を特定するためには、各核酸の検出時間と、異なる大きさの分子を標識することによる検出時間の違いを前もって調べ、検出時間を基に各アレルのピークを特定する。より好ましくは、画像処理によりピークを平行移動させ、標識分子由来の検出時間差を補正し、標準核酸由来ピークと測定核酸由来ピークの一致を確認する。こうして、１塩基置換遺伝子多型やマイクロサテライト多型等、遺伝子多型を含む複数の遺伝子領域に対して、そのピーク出現位置により、ホモ・ヘテロ型、マイクロサテライト多型の場合は繰返し単位の数を特定する。
【００４２】
本発明における「画像処理」とは、標識した分子由来の検出時間差に対して、電気泳動による波形画像または波形データを補正する方法である。具体的には、標準核酸由来の検出ピークと測定核酸由来の検出ピークを重ねて表示し、各ピークはそれぞれ異なる色または線で表示することにより実施する。あるいは、検出時間を基に、標準核酸由来の検出ピークと測定核酸由来の検出ピークを特定し、各ピークはそれぞれ異なる色又は線で表示する。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ LOH分析による癌細胞比率の測定
１．検体の入手
標準核酸および、測定核酸に由来される患者試料は、次のようにして入手して処理後、LOHを解析するまで保存した。標準核酸には、末梢血の白血球（PBL）を用いた。10mLの静脈血をヘパリン入りの採血管に採取し、3,000rpmで15分間遠心後、血漿を廃棄した。この採血管に、0.2 %の食塩水40mLを加えて溶血し、再度3,000rpmで15分間遠心後、上清液を捨て、同様の操作を2回繰り返した。残ったペレットは、-80℃で凍結保存した。測定核酸には切除術やバイオプシィーで入手した新鮮な組織の一部は、1.5のエッペンドルフチューブに入れ、-80℃で凍結保存した。
【００４４】
２．核酸の抽出
血液、組織からのヒトゲノム核酸の抽出は、プロテナーゼＫで消化後、フェノール・クロロフォルムで抽出するデイビスら（Basic Method in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing 社出版）や菅野ら（Lab. Invest. 68 p361-366 Sugano等(1993)）の方法で行った。要約すると、65℃で15分間処理した後に、プロテナーゼK 1mg/mL、EDTA 10mM、NaCl 150mMを含む10mMトリス−塩酸緩衝液を加えて37℃で一夜インキュベート後、この反応液に等量のフェノール：クロロフォルム＝１：１溶液を加えて遠心分離することにより核酸を抽出した。抽出液に、0.1容の3mol/L酢酸ナトリウム溶液と2.5容の冷無水エタノールを加え、-20℃で2時間冷却し、核酸を沈殿させた。尿と癌組織のサンプルには、エタノール沈殿のキャリアーとして1μgのグリコーゲンを加え、核酸の回収率を向上させた。この溶液を遠心して沈殿物を集め、さらに、1mLの80％エタノールを加えて洗浄後、真空遠心濃縮機で沈殿を乾固した。この核酸を含む沈殿物は、ＴＥ緩衝液で再溶解し、-25℃で凍結保存した。
【００４５】
３．検出遺伝子領域の増幅
本実施例で用いた、ＰＣＲ増幅の条件を表１にまとめた。
【００４６】
【表１】
【００４７】
標準核酸増幅用のPCRプライマーは、ForwardとReverseのいずれか一方の5’末端側をFAM蛍光色素（分子量：473.4、励起 495 nm／蛍光 519nm）で標識し、測定核酸増幅用のPCRプライマーは、ForwardとReverseのいずれか一方の5’末端側をROX蛍光色素（分子量：668.15、励起 576 nm／蛍光 601nm）で標識した。遺伝子変異を検出する遺伝子領域としては、ｐ53遺伝子領域とK-ras遺伝子領域を用いた。
【００４８】
【表２】
【００４９】
生体試料より抽出したゲノム核酸（鋳型）0.1μg、各プライマーを1.0pMずつ、各ヌクレオチド3リン酸（dNTP）を10nMずつ、トリス塩酸緩衝液（pH8.3）10μM、KCl 50mM、MgCl2 1.5mM、ゼラチン 0.001％(w/v) 、Taq核酸ポリメラーゼ（Perkin Elmer社）0.75unit を加え、全液量を 30μl とした。この溶液について、表１に示した条件でPCR反応を行った。PCR反応後、氷上（4℃）で保存し、標準核酸より増幅されたPCR反応液5μLと、測定核酸より増幅されたPCR反応液5μLをVoltexミキサーにより混合し、PCR反応混合液を作成した。
【００５０】
４．末端平滑処理
末端平滑処理は次に示す順に試薬とサンプルを添加したが、添加する順序はこの例に限定されない。PCR反応混合液は、Klenow fragment （TAKARA（株）製）で処理し、3’末端を平滑化した。前述のPCR反応混合液5μLに、0.5 units の Klenow fragmentを加え、37℃で30分間反応させた（Genes. Chromosomes &Cancer 15 p157-164 Sugano等(1996)）。反応後、100mM EDTAを1μL加え、酵素の失活処理を行った。
【００５１】
５．分析用サンプルの調製
分析用サンプルの調製では次に示す順と容量で試薬と末端平滑処理サンプルを添加したが、添加する順序、容量、変性条件は核酸断片が変性されればよく、この例に限定されない。具体的には、分析用の微量容器にDNAの変性剤であるFormamide 39μLにDNA増幅産物の原液を1.0μL加え、総量40μLに調整し、92℃で2分間熱変性し、氷上（4℃）で5分間急冷した。
【００５２】
６．SSCP電気泳動
分析用に調製したサンプルに対して、泳動Buffer としてTris-HCl、Glycinを、分離ポリマーとして、15％ GeneScanPolymer、サンプル導入条件：電圧20ｋV時間5秒、泳動条件：電圧15ｋV、時間70分間でSSCP電気泳動を行った。
【００５３】
７．検出時間補正
SSCP法を用いた遺伝子変異の検出においては、遺伝子変異部位が不特定多数なため、測定核酸のピークだけでは、正常核酸由来のピークと遺伝子変異核酸由来のピークを分別することは困難である。そこで、本実施例では、標準核酸を同じキャピラリー内で同時に検出することで、正常核酸由来のピークを特定し、測定試料中の変異のある核酸の比率を分析した。FAM蛍光色素で標識した標準核酸は、520nm前後の蛍光波長の標準核酸増幅断片ピークを検出し、ROX蛍光色素で標識した測定核酸は、600nm前後の蛍光波長の測定核酸増幅断片ピークを検出した。このとき、図４左に示すように、ROX標識した測定核酸はFAM標識した標準核酸よりも分子量が大きいため、検出時間が約4秒遅かった。そこで、図５右に示すように画像処理によりピークを平行移動させ、4秒分の検出時間差を補正し、各遺伝子領域において標準核酸由来ピーク（NA0）と測定核酸中の正常核酸由来ピーク（TA0）の一致を確認し、正常核酸由来のピークを特定した。
【００５４】
８．遺伝子変異細胞比率の測定
測定試料中に含まれる遺伝子変異細胞の比率は正常核酸A0を含む測定試料T中の変異核酸A１の比率を求めればよい。すなわち、下式の方法で測定できる。
測定試料中の癌細胞比率（％）＝TA0×100／（TA0+TA1）
【００５５】
TA0、TA1は各シグナルのピーク高さを示す。上述の変異細胞比率を算出する計算式を用いて、測定試料中の癌細胞比率（％）を測定した。（表３）
【００５６】
【表３】
【００５７】
このように、標準核酸と測定核酸のピークが重ならないように同じキャピラリーで検出し、検出後に検出時間の補正を行うことにより、蛍光強度の重なりを防ぎ、正常核酸由来のピークと変異核酸由来のピークを特定し、定量的に分析することが可能となった。
【００５８】
実施例２ 変異分析による遺伝子変異細胞比率の測定
１．検体の入手
実施例１と同様の方法で試料を入手し、保存した。
【００５９】
２．核酸の抽出
実施例１と同様の方法で核酸を抽出し、保存した。
【００６０】
３．検出遺伝子領域の増幅
遺伝子増幅反応の条件、試薬組成としては実施例１と同様の方法で実施した。標準核酸増幅用のPCRプライマーは、ForwardとReverseのいずれか一方の5’末端側をFAM蛍光色素（分子量：473.4、励起 495 nm／蛍光 519nm）で標識し、測定核酸増幅用のPCRプライマーは、ForwardとReverseのいずれか一方の5’末端側をROX蛍光色素（分子量：668.15、励起 576 nm／蛍光 601nm）で標識した。アレル消失を検出する遺伝子多型部位として、ALDOB、VAV2、D9S747、D9S303、D9S304を用いた。増幅反応後、実施例１と同様の方法で、標準核酸由来の増幅断片と、測定核酸由来の増幅断片を混合した。
【００６１】
【表４】
【００６２】
４．末端平滑処理とSSCP電気泳動
実施例１と同様の方法で末端平滑処理を行い、分析用サンプルを調製し、SSCP電気泳動を実施した。
【００６３】
５．検出時間補正
FAM蛍光色素で標識した標準核酸については520nm前後の蛍光波長の標準核酸増幅断片ピークを検出し、ROX蛍光色素で標識した測定核酸については600nm前後の蛍光波長の測定核酸増幅断片ピークを検出した。このとき、図５左に示すように、ROX標識した測定核酸はFAM標識した標準核酸よりも分子量が大きいため、検出時間が約3秒遅かった。そこで、図５に示すように画像処理によりピークを平行移動させ、3秒分の検出時間差を補正し、各遺伝子領域において標準核酸由来ピークと測定核酸由来ピークの一致を確認し、試料の取り違いがないことを確認した。
【００６４】
６．LOH分析による癌細胞比率の測定
癌患者血液より抽出された核酸つまり標準核酸の父方と母方アレルのシグナル（ピーク高さ）を比較して、同癌患者の癌組織より抽出された測定核酸における父方と母方のアレルのうち、一方のアレルのピーク高さが減少した場合、LOHと定義する。サンプル中の癌由来核酸の比率、即ち、癌細胞の比率は、下式により推定できる（Genes. Chromosomes & Cancer 15 p157-164 Sugano等(1996)）。
測定試料中の癌細胞比率（％）＝（NA1/NA2−TA1/TA2）×100／（NA1/NA2）
【００６５】
A1とA2アレルを持つヘテロ接合性のヒトで、Nは標準核酸、つまり同癌患者より採取された正常血液からのシグナルのピーク高さを示し、Tは測定核酸、つまり癌患者の癌組織からのシグナルのピーク高さを示す。LOH陽性・陰性の判定境界値（以下、カットオフ値）は、10％とした。上述のLOHを算出する計算式を用いて、測定試料中の癌細胞比率（％）を測定した。（表５）
【００６６】
【表５】
【００６７】
このように、標準核酸と測定核酸のピークが重ならないように核酸断片を標識することで、同じキャピラリーで検出し、癌細胞比率15％前後の試料を定量的に測定することができる。
【００６８】
以上の結果に実証されるように、本発明は以下の効果を奏する。
１）標準核酸と測定核酸中の同じ遺伝子領域から増幅した核酸断片を同時に検出しつつ、高い定量性を維持できる。
２）核酸電気泳動の後、検出時間の補正の必要がなくなり、補正用内部標準試薬の費用削減、投入工程の短縮、補正操作の省略に繋がる。
３）蛍光色素由来の検出時間の違いは常に一定のため、電気泳動の違いが原因となる補正困難な検出時間の違いがなくなり、波形比較を正確に認識できる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によれば、由来の異なる同じ遺伝子領域の核酸断片を1回の泳動で同時に検出することができる。本発明は多型や変異部位の定量的解析に利用でき、特にLOH分析や癌細胞の検出に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明における解析法の概略
【図２】SSCP法を用いた蛍光多重化解析における補正前後の比較図
【図３】SSCP法を用いた単独解析における位置補正用内部標準による補正前後の比較図
【図４】遺伝子変異解析における本発明を用いた検出波形と検出時間差補正図
【図５】LOH解析における本発明を用いた検出波形と検出時間差補正図
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
配列番号１〜２８−人工配列の説明：プライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の配列が予測される遺伝子領域の定量的解析において、前記遺伝子領域中の核酸断片を、標準核酸試料と測定核酸試料でそれぞれ分子量が異なる物質で標識して同時に分離・検出することにより、前記核酸断片を定量的に解析する方法。
【請求項２】
核酸断片を分離・検出する手段が電気泳動法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸断片を分離・検出する手段がSSCP法である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
標準核酸試料と測定核酸試料を、それぞれ分子量が異なる物質を含むプライマーを用いて増幅する工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
分子量の異なる標識物質が分子量の異なる蛍光物質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
分子量の異なる標識物質がFAMとROX、FAMとTAMRA、FITCとTexas Red、及び、FITCとPhycoerythrinから選ばれるいずれかである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
画像処理により各核酸断片の検出時間の差を補正する工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
複数の配列が予測される遺伝子領域が多型部位又は変異部位である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法を利用したLOHの解析方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法を利用した癌細胞の検出方法。
【請求項１】
複数の配列が予測される遺伝子領域の定量的解析において、前記遺伝子領域中の核酸断片を、標準核酸試料と測定核酸試料でそれぞれ分子量が異なる物質で標識して同時に分離・検出することにより、前記核酸断片を定量的に解析する方法。
【請求項２】
核酸断片を分離・検出する手段が電気泳動法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸断片を分離・検出する手段がSSCP法である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
標準核酸試料と測定核酸試料を、それぞれ分子量が異なる物質を含むプライマーを用いて増幅する工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
分子量の異なる標識物質が分子量の異なる蛍光物質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
分子量の異なる標識物質がFAMとROX、FAMとTAMRA、FITCとTexas Red、及び、FITCとPhycoerythrinから選ばれるいずれかである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
画像処理により各核酸断片の検出時間の差を補正する工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
複数の配列が予測される遺伝子領域が多型部位又は変異部位である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法を利用したLOHの解析方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法を利用した癌細胞の検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−１２４９７７（Ｐ２００７−１２４９７７Ａ）
【公開日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３２２２２４（Ｐ２００５−３２２２２４）
【出願日】平成１７年１１月７日（２００５．１１．７）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月７日（２００５．１１．７）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
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