植物の病気を制御するためのＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ菌株
【課題】インビボで広い範囲の真菌による植物の病気を阻害し得る新規菌株、および抗生物質およびこの菌株の精製および未精製画分を含む殺真菌性の組成物を提供することを課題とする。
【解決手段】上記課題は、ある特定の植物病原体に対してのみ抗真菌活性を示し、そして抗細菌活性を示さない、新規な抗生物質産生Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、ならびに、この菌株を同定する特徴全てを有する菌株の生物学的に純粋な培養物を提供することにより解決された。また、これらの菌株、これらの菌株によって産生される上清またはこれらの菌株から単離される代謝物の有効量を施用することによって、植物、果実、および根の真菌感染を処置または真菌感染から保護する方法が提供される。本発明はさらに、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の菌株をＢ−２１６６１（ＡＱ７１３）と共に用いることの相乗的な殺真菌効果を包含する。
【解決手段】上記課題は、ある特定の植物病原体に対してのみ抗真菌活性を示し、そして抗細菌活性を示さない、新規な抗生物質産生Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、ならびに、この菌株を同定する特徴全てを有する菌株の生物学的に純粋な培養物を提供することにより解決された。また、これらの菌株、これらの菌株によって産生される上清またはこれらの菌株から単離される代謝物の有効量を施用することによって、植物、果実、および根の真菌感染を処置または真菌感染から保護する方法が提供される。本発明はさらに、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の菌株をＢ−２１６６１（ＡＱ７１３）と共に用いることの相乗的な殺真菌効果を包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
この出願は、１９９９年３月３０日に提出された米国特許出願番号第０９／２８１，３６０号の一部係属出願、および１９９９年１２月１４日に提出された米国特許出願番号第０９／４６１，７００号の一部継続出願であり、これらの内容は本明細書中において本開示の参考文献に組み込まれる。
【０００２】
（本発明の分野）
本発明は、バイオ農薬の分野である。より具体的には、本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓの新規菌株、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号は、インビボで広い範囲の真菌による植物の病気を阻害し得るという発見に関連する。本発明はまた、この新規Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌株、および抗生物質およびこの菌株の精製および未精製画分を単独で、または他の化学的および生物学的農薬と組み合せて含む殺真菌性の組成物に関連する。本発明はさらに、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号とＮＲＲＬ登録番号Ｂ−２１６６１号、（ＣＣＲＣ９１０１０６）を共に用いた相乗的な殺真菌効果に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
一般的に、様々な微生物が植物の疾患を制御するのに有用な生物学的活性を示すことが知られている。作物学および園芸学的に重要な様々な植物の病気を制御することが、生物学的農薬を同定および開発する分野において進歩したが、使用されているほとんどの農薬は未だ合成化合物である。これら化学的殺真菌剤の多くは、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ（ＥＰＡ）によって発癌性物質として分類され、そして野生生物および他の非標的種に対して毒性である。それに加えて、病原体は化学的農薬に対して抵抗性を発達させ得る。例えば、非特許文献１を参照のこと。
【０００４】
生物学的な制御は、合成化学的殺真菌剤の魅力的な代替を提供する。バイオ農薬（生存生物体およびこれら生物体によって産生される天然に産生された化合物）はより安全で、より生物分解性で、そして開発するのがより安価であり得る。
【０００５】
通常使用されるバイオ農薬の１つは、グラム陽性細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓである。農薬性Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株は、胞子形成の間に結晶性タンパク質を産生することが知られており、それは特定の状態および特定の種の昆虫および線虫に特に毒性である（例えば米国特許第４，９９９，１９２号、および米国特許第５，２０８，０１７号を参照のこと）。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓによって産生されるタンパク質様のエンドトキシンはまた、キュウリヒゲナガハムシ属の数種のハムシおよび他の甲虫に対する殺虫剤として作用する（例えば、米国特許第５，１８７，０９号および非特許文献２）。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンドトキシンは、精製結晶、洗浄細胞ペレット、および発現したタンパク質として有効であることが示された。Ｗａｒｒｅｎら、第ＷＯ９６／１００８３号は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓおよびＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの生長期の間に産生される非エンドトキシンタンパク質を開示している。Ｖｉｐ１およびＶｉｐ２と呼ばれるこれらの生長期タンパク質は、キュウリヒゲナガハムシ属の数種のハムシ（北部および西部）に対して強力な活性を有する。例えば、非特許文献３を参照のこと。
【０００６】
ベータ外毒素と呼ばれる１つのＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの熱安定性代謝物も、農薬の性質を有することが示された。非特許文献４は、コロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）に対して活性であるベータ外毒素を報告している。それに加えて、公知のＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのベータ外毒素は、線虫だけでなく、ハエ、ガの幼虫、ダニ、およびキュウリヒゲナガハムシ属の数種のハムシを殺す、非特異的な農薬活性を示す。シグマ外毒素は、ベータ外毒素と類似の構造を有し、そしてコロラドハムシに対して活性である。非特許文献５を参照のこと。アルファ外毒素は、Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａの幼生に毒性である（非特許文献６）。ガンマ外毒素は、種々のタンパク質溶解酵素、キチナーゼ、およびプロテアーゼである。ガンマ外毒素の毒性効果は、ベータ外毒素またはデルタエンドトキシンと組み合せてのみ発現される。Ｆｏｒｓｂｅｒｇ，Ｃ．、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ：Ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ Ｑｕａｌｉｔｙ」 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｃａｎａｄａ、公開番号第ＮＲＣＣ１５３８５号、９１〜１０９頁（１９７６）を参照のこと。非特許文献７は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ菌株の上清における、キュウリヒゲナガハムシ属の数種のハムシに対して活性な、水溶性の２次代謝物を報告している。
【０００７】
ツヴィッターマイシン（ｚｗｉｔｔｅｒｍｉｃｉｎ）Ａは、多くの真菌および細菌性の植物病原体に対して広いスペクトルの活性を有する、水溶性の酸に安定な直鎖状アミノポリオール分子である（非特許文献８を参照のこと）。ツヴィッターマイシンＡはまた、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの活性を増強することが知られている。Ｍａｎｋｅｒら（ＷＯ９６／３９０３７号）が、最初にツヴィッターマイシンＡのＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ−増強能力および性質を決定した。続いて、Ｓｃｈｎｅｐｆらもまた、ツヴィッターマイシンＡがＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを増強することを報告した（米国特許第５，７０２，７０３号）。
【０００８】
バチルスは、抗真菌および抗細菌性の２次代謝物を産生することが知られている。非特許文献９、および非特許文献１０を参照のこと。Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓによって産生される化合物は、ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉｎ Ｐ、ｐｕｍｉｌｉｎ、およびｔｅｔａｉｎを含む。
【０００９】
Ｋａｗａｇｕｃｈｉらは、米国特許第４，２５０，１７０号において、Ｂａｃｉｌｌｕｓから、広い範囲のグラム陽性およびグラム陰性細菌に対する活性を有する、新規水溶性抗生物質を単離した。非特許文献１１は、抗真菌活性を示す特定のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを含む）菌株を同定した。これらの菌株は、ツヴィッターマイシンＡおよび／またはカノサミン（ｋａｎｏｓａｍｉｎｅ）を産生することが示された。非特許文献１２を参照のこと。これらは、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｒａ ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ｐ．ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍまたはＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｍｉｎｏｒによって起こる、土壌伝播性の病気である立枯れ病に対して有効である抗生物質である（非特許文献１１、前出を参照のこと）。ツヴィッターマイシンＡは、水溶性の、酸に安定な直鎖状アミノポリオール分子である。非特許文献８を参照のこと。それは多くの真菌および細菌性植物病原体に対して広いスペクトルの活性を有する。カノサミン（Ｍｉｌｎｅｒら、１９９６）もまた、広い範囲の真菌性植物病原体および少数の細菌種を阻害する。
【００１０】
Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎらは、米国特許第５，０４９，３７９号において、ツヴィッターマイシンＡ−産生Ｂ．ｃｅｒｅｕｓが、アルファルファおよびダイズの立枯れ病を制御する方法を記載している。種がＢ．ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ５３５２２でコートされた場合、根腐れ真菌の病原性活性が阻害された。同様に、特定のＢ．ｃｅｒｅｕｓ菌株の胞子に基づく処方を、ダイズの種または種の周りの土壌に適用すると、畑でのダイズの収量が改善されることが示された。非特許文献１３を参照のこと。バイオ農薬の適用方法は、当該分野で周知であり、そして例えば微生物の可溶性の粉末、乾燥流動可能性（ｆｌｏｗａｂｌｅｓ）、マイクロカプセル封入、および液体処方、適当な培養物からの培養液全体または抗生物質画分を含む。例えば、Ｒｏｓｓａｌｌの米国特許第５，０６１，４９５号、およびＨａｎｄｅｌｓｍａｎの米国特許第５，０４９，３７９号を参照のこと。
【００１１】
非特許文献１４は、インビトロにおいて広い範囲の細菌に対する活性を有する、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ由来の新規アミノ糖抗生物質を報告している。
【００１２】
Ｋｈｍｅｌ，Ｉ．Ａ．ら（１９９５）は、ＳＵ１８１７８７５において、真菌性の植物病原体および細菌を制御するのに使用される、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓの新規菌株ＶＫＭ ＣＲ−３３３Ｄを開示している。
【００１３】
非特許文献１５は、２つのＢａｃｉｌｌｕｓ菌株、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＣＬ２７およびＢ．ｐｕｍｉｌｕｓ ＣＬ４５による、抗Ｂｏｔｒｙｔｉｓおよび抗Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ抗生物質の産生を報告している。培養液全体および細胞がない濾液が、インビトロにおける試験でＢｏｔｒｙｔｉｓおよびＡｌｔｅｒｎａｒｉａに対して活性であり、そしてＡｓｔｉｌｂｅに対するインビボ小植物試験においてＢｏｔｒｙｔｉｓに対して活性である。Ｌｅｉｆｅｒｔら（１９９７）米国特許第５，５９７，５６５号は、収穫後の病気を引き起こす真菌、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａおよびＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａを阻害するのに特に有効な、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、およびＢ．ｐｏｌｙｍｙｘａを開示している。彼らはまた、細胞がない培養濾液において産生された抗生物質の存在、および異なるｐＨ値でのその活性を開示しているが、彼らはこれらの化合物を同定していない。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の化合物は、低いｐＨで活性を失うが、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ抽出物由来の活性は、５．６より低いｐＨ値でのみ起こる。Ｌｅｉｆｅｒｔら（１９９８）米国特許第５，７８０，０８０号は、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａおよびＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａを阻害するために、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、およびＢ．ｐｏｌｙｍｙｘａ菌株で治療し得るキャベツを開示している。
【００１４】
非特許文献１６は、抗真菌および抗細菌活性を有する種々の抗生物質を産生するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、およびＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ菌株を開示している。Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓはｂａｃｉｌｙｓｉｎおよびｉｔｕｒｉｎ Ａを産生した。ｂａｃｉｌｙｓｉｎは、分子量２７０の非常に小さい化合物であり、酵母のみを阻害する。ｉｔｕｒｉｎは、極性溶媒に可溶性であり、広い抗真菌および抗細菌活性を有する。
【００１５】
米国特許第５，３４４，６４７号において、Ｒｏｓｓａｌｌは、広い抗真菌活性を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株を開示している。さらに、Ｒｏｓｓａｌｌの米国特許第５，０６１，４９５号は、６３，５００ダルトン、５より低いｐＨで沈殿し、そしてグラム陽性細菌および真菌（ＢｏｔｒｙｔｉｓおよびＥｒｙｓｉｐｈｅ）に対して活性を有する、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の新規抗生物質を提供する。非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０、および非特許文献２１。全てＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの、真菌植物病原体の生物学的制御薬剤としての使用を開示している。非特許文献２２、Ｐｕｓｅｙら、米国特許第５，０４７，２３９号、および非特許文献２３は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを用いた収穫後の果実腐敗の制御を開示している。Ｍｃｋｅｅｎら、前出は、低分子量ｉｔｕｒｉｎ環状ポリペプチドと類似の抗生物質が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのこの殺真菌活性に寄与していることを示した。
【００１６】
Ｌｉｕらは、米国特許第５，４０３，５８３号において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．（ＡＴＣＣ ５５０００）および真菌植物病原体、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉを制御する方法を開示している。非特許文献２４は、コメの褐色斑点（ｒｉｃｅ ｂｒｏｗｎ ｓｐｏｔ）の原因であるＤｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｏｒｙｚａｅに拮抗するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．を開示している。同じ著者ら、非特許文献２５はまた、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｏｒｙｚａｅ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍに対するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．のインビトロにおける拮抗を開示している。彼らは、培養濾液中の３つの成分について議論している。最も活性な抗生物質は、水およびメタノールに高度に可溶性であり、２５５ｎｍにＵＶピーク、および２６０ｎｍに肩を有し、ポリオキシン様のリポペプチドであることが証明された。非特許文献２６は、ワタの根腐れの原因であるＰｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｍｎｉｖｏｒｕｍによって死滅するワタの数を抑制するための、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．の懸濁液の使用を開示している。
【００１７】
非特許文献２７は、線虫捕獲真菌を刺激してその線虫を捕獲する能力を増加させるＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓについて報告している。非特許文献２８は、真菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）およびカンキツ属で感染を引き起こす線虫の細胞相互作用を論じている。その真菌はＢ．ｐｕｍｉｌｕｓと結合しており（それらは共に存在する）、そして線虫もそこに存在する場合、真菌はより重症である。Ｂ．ｐｕｍｍｉｌｕｓは、線虫の食料を供給しているようである。非特許文献２９は、抗線虫薬であるＢ．ｐｕｍｉｌｕｓについて報告しているが、彼らは抗真菌活性を報告していない。非特許文献３０は、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓを含む多くの異なるＢａｃｉｌｌｕｓを、キチナーゼを産生する能力に関して比較しているが、彼らは植物病原体に対する活性は報告していない。Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓは、最も低いキチナーゼレベルを産生する。非特許文献３１は、植物の幹および根中の内生植物である、多くのＢａｃｉｌｌｕｓおよびＢ．ｐｕｍｉｌｕｓを含む多くの型の細菌を調査した。しかし、彼らは、これらの内生植物菌株が抗真菌性であるという証拠は示していない。Ｃｈｅｒｎｉｎら（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓは、植物の疾患を引き起こす細菌（例えばＸａｎｔｈｏｍａｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ）および真菌に対する広いスペクトルの活性を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓを発見した。Ｆｅｙら（１９９１）Ａｋａｄ Ｌａｎｄｗｉｒｔｓ Ｋａｒｔは、種イモをＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉからある程度守るＢ．ｐｕｍｉｌｕｓ菌株について報告している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｓｃｈｗｉｎｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、Ｔｈｅ Ｃａｕｓｅ ｏｆ Ｌａｔｅ Ｂｌｉｇｈｔ ｏｆ Ｐｏｔａｔｏ、２４４頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９１）
【非特許文献２】Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．ら（１９９３）、Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．、８６：３３０−３３３
【非特許文献３】Ｅｓｔｒｕｃｈら（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１３７−１４１
【非特許文献４】ＢｕｒｇｊｅｒｏｎおよびＢｉａｃｈｅ（１９７９）、Ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ １１：２７９−２８４
【非特許文献５】Ａｒｇａｕｅｒら（１９９１）、Ｊ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．２６：２０６−２１３
【非特許文献６】Ｃｌｕｔｈｙ（１９８０）、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．８：１−７
【非特許文献７】Ｓｔｏｎａｒｄら（１９９４）、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５５１：２５
【非特許文献８】Ｈｅら（１９９４）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３５（１６）：２４９９−２５０２
【非特許文献９】Ｋｏｒｚｙｂｓｋｉら、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ科（バチルス科）から単離された抗生物質」、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−Ｏｒｉｇｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．第ＩＩＩ巻（１９７８）
【非特許文献１０】Ｂｅｒｄｙ、ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、第Ｉ−ＸＩＶ巻、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９８０−８７）
【非特許文献１１】Ｓｔａｂｂら（１９９０）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：４４０４−４４１２
【非特許文献１２】Ｍｉｌｎｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．６２：３０６１−３０６６（１９９６）
【非特許文献１３】Ｏｓｂｕｒｎｅら（１９９５）Ａｍ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．Ｓｏｃ．７９（６）：５５１−５５６
【非特許文献１４】Ｔｓｕｎｏら（１９８６）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ＸＸＸＩＸ（７）：１００１−１００３
【非特許文献１５】Ｌｅｉｆｅｒｔら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７８：９７−１０８（１９９５）
【非特許文献１６】Ｌｏｅｆｆｌｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ １１５：２０４−２１３
【非特許文献１７】Ｓｈｏｌｂｅｒｇら（１９９５）Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：２４７−２５２
【非特許文献１８】Ｓｗｉｎｂｕｒｎｅら（１９７５）Ｔｒａｎｓ．Ｂｒｉｔ．Ｍｙｃｏｌ．Ｓｏｃ．６５：２１１−２１７
【非特許文献１９】ＳｉｎｇｈおよびＤｅｖｅｒａｌｌ（１９８４）Ｔｒａｎｓ．Ｂｒ．Ｍｙｃｏｌ．Ｓｏｃ．８３：４８７−４９０
【非特許文献２０】Ｆｅｒｒｅｉｒａら（１９９１）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８１：２８３−２８７
【非特許文献２１】Ｂａｋｅｒら（１９８３）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ７３：１１４８−１１５２
【非特許文献２２】Ｐｕｓｅｙら（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓ．７２：６２２−６２６
【非特許文献２３】ＭｃＫｅｅｎら（１９８６）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ７６：１３６−１３９
【非特許文献２４】ＩｓｌａｍおよびＮａｎｄｉ（１９８５）Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓ．Ｐｒｏｔｅｃｔ．９２（３）：２４１−２４６
【非特許文献２５】ＩｓｌａｍおよびＮａｎｄｉ（１９８５）Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓ．Ｐｒｏｔｅｃｔ．９２（３）：２３３−２４０
【非特許文献２６】Ｃｏｏｋら（１９８７）Ｂｅｌｔｗｉｄｅ Ｃｏｔｔｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ、４３−４５頁
【非特許文献２７】Ｂ’ＣｈｉｒおよびＮａｍｏｕｃｈｉ（１９８８）Ｒｅｖｕｅ Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｉｑｕｅ １１（２）：２６３−２６６
【非特許文献２８】Ｂ’ＣｈｉｒおよびＢｅｌｋａｄｈｉ（１９８６）Ｍｅｄ．Ｆａｃ．Ｌａｎｄｂｏｕｗｗ．Ｒｉｊｋｓｕｎｉｖ．Ｇｅｎｔ ５１／３ｂ：１２９５−１３１０
【非特許文献２９】ＧｏｋｔｅおよびＳｗａｒｕｐ（１９８８）Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｎｅｍａｔｏｌ．１８（２）：３１３−３１８
【非特許文献３０】Ｓｌａｂｏｓｐｉｔｓｋａｙａら（１９９２）Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ Ｚｈ（Ｋｉｅｖ）５４（６）：１６−２２
【非特許文献３１】ＭｃＩｎｒｏｙら（１９９５）Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｓｏｉｌ １７３（２）：３３７−３４２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（本発明の開示）
特定の特異的な植物病原体に対してのみ抗真菌活性を示し、そして抗細菌活性を示さない、新規抗生物質産生Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．が提供される。有効な量の抗生物質産生Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．を適用する工程を含む、真菌の感染から植物、果実および根を処置または保護する方法も提供される。抗生物質産生Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．は、培養液全体の懸濁液として、または抗生物質産生Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．の培養液全体から得た、部分的に精製された抗生物質を含む上清として提供され得る。特異的な抗真菌活性を示し、そして抗細菌活性を示さない新規水溶性抗生物質も提供される。
【００２０】
本発明はまた、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強する新規化合物も提供する。その化合物は、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓの培養液全体または上清から単離され、そしてＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓと組み合せた場合、その殺虫活性を増強する。本発明はまた、Ｂａｃｉｌｌｕｓの細菌懸濁液またはＢａｃｉｌｌｕｓの培養液の代謝物を含む上清または精製した代謝物を用いて、植物の上、または中への昆虫の侵入を制御するための植物を治療する方法を含む。
【００２１】
本発明はさらに、殺真菌剤として使用するために菌株Ｂ−３００８７と菌株Ｂ−２１６６１（ＡＱ７１３）の組み合せを提供する。ここでその菌株を共に使用することは、いずれかを単独で使用する場合よりも高い有効性を提供する。
【００２２】
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１） 殺真菌活性を有する、ＮＲＲＬ番号Ｂ−３００８７と命名されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ菌株、またはその変異体の、全ての同定す特徴を有する菌株の生物学的に純粋な培養物。
（項目２） ＮＲＲＬ番号Ｂ−３００８７と命名されたＢａｃｉｌｌｕｓ
ｐｕｍｉｌｕｓ菌株の生物学的に純粋な培養物。
（項目３） 項目１に記載の生物学的に純粋な培養物と担体とを含む組成物。
（項目４） 組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、および乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、項目１に記載の組成物。
（項目５） 殺真菌活性を有する、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７と命名されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ菌株、またはその変異体の、全ての同定する特徴を有する菌株の生物学的に純粋な培養物から分離される、単離された代謝物。
（項目６） 殺真菌活性を有する、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７と命名されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ菌株、またはその変異体の、全ての同定する特徴を有する菌株の生物学的に純粋な培養物から分離される上清。
（項目７） 項目６に記載の上清から分離される、部分的に精製された画分。
（項目８） 項目５に記載の代謝物と担体とを含む、組成物。
（項目９） 項目６に記載の上清と担体とを含む、組成物。
（項目１０） 項目７に記載の部分的に精製された画分と担体とを含む、組成物。
（項目１１） 組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、項目８に記載の組成物。
（項目１２） 組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、項目９に記載の組成物。
（項目１３） 組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、項目１０に記載の組成物。
（項目１４） 項目１に記載の代謝物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目１５） 項目６に記載の上清の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目１６） 項目７に記載の部分的に精製された画分の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目１７） 項目８に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目１８） 項目９に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目１９） 項目１０に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目２０） 項目１１に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目２１） 項目１２に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目２２） 項目１３に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目２３） 前記真菌感染が、Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅ；Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ；Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒおよびＵｒｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｓｅｏｌｉからなる群から選択される少なくとも１つの微生物によって引き起こされる、項目１７に記載の方法。
（項目２４） 前記真菌感染が、Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅ；Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ；Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒおよびＵｒｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｓｅｏｌｉからなる群から選択される少なくとも１つの微生物によって引き起こされる、項目１８に記載の方法。
（項目２５） 前記真菌感染が、Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅ；Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ；Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒおよびＵｒｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｓｅｏｌｉからなる群から選択される少なくとも１つの微生物によって引き起こされる、項目１９に記載の方法。
（項目２６） 前記真菌感染が、Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅ；Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ；Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒおよびＵｒｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｓｅｏｌｉからなる群から選択される少なくとも１つの微生物によって引き起こされる、項目２０に記載の方法。
（項目２７） 前記真菌感染が、Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅ；Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ；Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒおよびＵｒｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｓｅｏｌｉからなる群から選択される少なくとも１つの微生物によって引き起こされる、項目２１または２２に記載の方法。
（項目２８） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬を含む、項目１に記載の組成物。
（項目２９） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬を含む、項目７に記載の組成物
（項目３０） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬を含む、項目８に記載の組成物
（項目３１） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬の有効量を施用する工程をさらに包含する、項目１４に記載の方法。
（項目３２） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬の有効量を施用する工程をさらに包含する、項目１５に記載の方法。
（項目３３） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬の有効量を施用する工程をさらに包含する、項目１７に記載の方法。
（項目３４） ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の生物学的に純粋な培養を増殖させる工程、および上清から抗真菌性代謝物を単離する工程を包含する、抗真菌上清の生成のためのプロセス。
（項目３５） 項目３４に記載の上清の部分的精製のためのプロセスであって、該プロセスが該上清を分画する工程、および該画分に対してバイオアッセイを行って抗真菌画分を同定する工程を包含する、プロセス。
（項目３６） 項目３４に記載のプロセスによって生成された上清。
（項目３７） 前記画分が、植物病原性真菌に対する活性を示し、水性画分中に見いだされ、わずかに熱に対して不安定であり、酸／塩基およびプロテアーゼに対して安定であり、正に荷電し、そして１０，０００ダルトン未満の分子量を有する、項目７に記載の部分的に精製された画分。
（項目３８） 前記代謝物が、植物病原性真菌に対する活性を示し、水性画分中に見いだされ、わずかに熱に対して不安定であり、酸／塩基およびプロテアーゼに対して安定であり、正に荷電し、そして１０，０００ダルトン未満の分子量を有する、項目５に記載の単離された代謝物。
（項目３９） 水溶性化合物であって、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強し、そして該化合物の分子量が１０，０００ダルトン未満であり、かつ該化合物がツヴィッターマイシンＡではない、化合物。
（項目４０） さらにＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを含む、項目３９に記載の化合物。
（項目４１） 項目３９に記載の化合物と担体とを含む、組成物。
（項目４２） 項目４０に記載の組成物と担体とを含む、組成物。
（項目４３） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓが、微生物菌株、市販製品、遺伝子工学で作られた植物またはデルタエンドトキシンの形態である、項目４０に記載の組成物。
（項目４４） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬をさらに含む、項目４０〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４５） 組成物が、水和剤、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される処方物である、項目４４に記載の組成物。
（項目４６） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強し、かつツヴィッターマイシンＡまたはβ−外毒素ではないＢａｃｉｌｌｕｓの、ブロス培養物全体の部分的に精製された画分。
（項目４７） ＢａｃｉｌｌｕｓがＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓである、項目４６に記載の部分的に精製された画分。
（項目４８） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓが、ＮＲＲＬ登録番号ＮＲＲＬ Ｂ−３００８７の下に寄託されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓである、項目４７に記載の部分的に精製された画分。
（項目４９） 項目４６〜４８のいずれか一項に記載の画分と担体とを含む、組成物。
（項目５０） さらにＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを含む、項目４６〜４９のいずれか一項に記載の画分。
（項目５１） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓが、微生物菌株、市販製品、遺伝子工学で作られた植物またはデルタエンドトキシンの形態である、項目５０に記載の画分。
（項目５２） 項目４９に記載の組成物およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓとを含む、組成物。
（項目５３） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬をさらに含む、項目４６〜４８のいずれか一項に記載の画分。
（項目５４） 組成物が、水和剤、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される処方物である、項目４９に記載の組成物。
（項目５５） 組成物が、水和剤、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される処方物である、項目５２に記載の組成物。
（項目５６） 組成物が、水和剤、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される処方物である、項目５３に記載の組成物。
（項目５７） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強するための方法であって、項目３９に記載の化合物の有効量を植物または根に、そしてＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの有効量を該植物または根に施用する工程を包含する、方法。
（項目５８） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強する方法であって、項目４６に記載の化合物の有効量を植物または根に、そしてＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの有効量を該植物または根に施用する工程を包含する、方法。
（項目５９） 植物または根を昆虫の侵襲から保護または処置するための方法であって、項目４０に記載の化合物の有効量を植物または根に施用する工程を包含する、方法。
（項目６０） 植物または根を昆虫の侵襲から保護または処置するための方法であって、項目４４に記載の組成物の有効量を植物または根に施用する工程を包含する、方法。
（項目６１） 植物または根を昆虫の侵襲から保護または処置するための方法であって、項目５０に記載の画分の有効量を植物または根に施用する工程を包含する、方法。
（項目６２） 植物または根を昆虫の侵襲から保護または処置するための方法であって、項目５２に記載の組成物の有効量を植物または根に施用する工程を包含する、方法。
（項目６３） 植物または根を昆虫の侵襲から保護または処置するための方法であって、項目５３に記載の画分の有効量を植物または根に施用する工程を包含する、方法。
（項目６４） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬をさらに含む、項目５１に記載の方法。
（項目６５） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬をさらに含む、項目４９または５０に記載の方法。
（項目６６） ａ）ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７と命名されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ菌株、またはその変異体の、全ての同定する特徴を有する菌株のブロス培養物全体；および
ｂ）ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−２１６６１と命名されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株、またはその変異体の、全ての同定する特徴を有する菌株のブロス培養物全体、
を含む組成物であって、該菌株は相乗的な殺真菌活性を有する、組成物。
（項目６７） 前記殺真菌活性が、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａに対する、項目６６に記載の組成物。
（項目６８） 前記菌株が、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−２１６６１およびＢ−３００８７について１：２の比率で組み合わされる、項目６６に記載の組成物。
（項目６９） 前記菌株が、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−２１６６１およびＢ−３００８７について１：４の比率で組み合わされる、項目６６に記載の組成物。
（項目７０） 前記菌株が、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａまたはＰｅｒｅｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａに対して、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−２１６６１およびＢ−３００８７について１：２の比率で組み合わされる、項目６６に記載の組成物。
（項目７１） 前記菌株が、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａまたはＰｅｒｅｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａに対して、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−２１６６１およびＢ−３００８７について１：４の比率で組み合わされる、項目６６に記載の組成物。
（項目７２） 項目６６に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目７３） 項目６７に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目７４） 項目６８に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目７５） 項目６９に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目７６） 項目７０に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目７７） 項目７１に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目７８） 項目６６に記載の培養物から分離される、上清。
（項目７９） 項目７８に記載の上清と担体とを含む、組成物。
（項目８０） 組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、項目７９に記載の組成物。
（項目８１） 少なくとも１つの生物学的または化学的殺虫剤をさらに含む、項目６６に記載の組成物。
（項目８２） 少なくとも１つの生物学的または化学的殺虫剤をさらに含む、項目７９に記載の組成物。
（項目８３） 組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、項目８１に記載の組成物。
（項目８４） 組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、項目８２に記載の組成物。
（項目８５） 項目６９に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号で寄託された、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．の部分的に精製した殺真菌性画分の、Ｄ2Ｏ中４００ＭＨｚで記録したＮＭＲスペクトルである。
【図２】図２は、Ｄ2Ｏ中４００ＭＨｚで記録した、ツヴィッターマイシンＡの1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、実施例９で記載されたようにＢａｃｉｌｌｕｓから単離された上清のキャピラリー電気泳動図である。電気泳動の条件は：コートされていない５６ｃｍのキャピラリーを４０Ｃ、３０ｋＶ、陽性の極性、ｐＨ５．８のリン酸ナトリウム緩衝液で１００μＡ、２００ｎｍでのＵＶ検出で使用した。図３Ａは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ Ｂ−３００８７の培養液全体のキャピラリー電気泳動図である。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｃは、実施例９で記載されたようにＢａｃｉｌｌｕｓから単離された上清のキャピラリー電気泳動図である。電気泳動の条件は：コートされていない５６ｃｍのキャピラリーを４０Ｃ、３０ｋＶ、陽性の極性、ｐＨ５．８のリン酸ナトリウム緩衝液で１００μＡ、２００ｎｍでのＵＶ検出で使用した。図３Ｂは、ツヴィッターマイシンＡスタンダードを加えたＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ Ｂ−３００８７の培養液全体のキャピラリー電気泳動図である。ツヴィッターマイシンＡのピークは３．２５分の実行時間付近に現れ、培養液全体のいずれのピークとも共に溶出しない。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、実施例９で記載されたようにＢａｃｉｌｌｕｓから単離された上清のキャピラリー電気泳動図である。電気泳動の条件は：コートされていない５６ｃｍのキャピラリーを４０Ｃ、３０ｋＶ、陽性の極性、ｐＨ５．８のリン酸ナトリウム緩衝液で１００μＡ、２００ｎｍでのＵＶ検出で使用した。図３Ｃは、約３．２８分の実行時間におけるツヴィッターマイシンＡスタンダードを示す。
【図４Ａ】図４は、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号単独の部分的に精製した画分（図４Ａ）、ツヴィッターマイシンＡを含むＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号の部分的に精製した画分（図４Ｂ）、およびツヴィッターマイシンＡ単独（図４Ｃ）のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分析からの、３つの電気泳動図を比較する。
【図４Ｂ】図４は、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号単独の部分的に精製した画分（図４Ａ）、ツヴィッターマイシンＡを含むＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号の部分的に精製した画分（図４Ｂ）、およびツヴィッターマイシンＡ単独（図４Ｃ）のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分析からの、３つの電気泳動図を比較する。
【図４Ｃ】図４は、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号単独の部分的に精製した画分（図４Ａ）、ツヴィッターマイシンＡを含むＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号の部分的に精製した画分（図４Ｂ）、およびツヴィッターマイシンＡ単独（図４Ｃ）のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分析からの、３つの電気泳動図を比較する。
【図５】図５は、Ｄ2Ｏ中４００ＭＨｚで記録した、Ｂ−３００８７から単離したＢ＋エンハンサーとしての活性を有する、部分的に精製した活性画分の1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（本発明の実施方法）
本発明は、サビ菌、ウドンコ病菌、およびべと病菌のような、特定の植物病原体に対してのみ抗真菌活性を有する、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．の新規菌株およびその変異体または改変体の、全ての識別する特徴を有する菌株の生物学的に純粋な培養物を提供する。このＢ．ｐｕｍｉｌｕｓの新規菌株は、１９９９年１月１４日に、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、１８１５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ Ｉｌｌ、６１６０４、ＵＳＡに供託され、そして特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定のもとに、受け入れ番号第ＮＲＲＬ Ｂ−３００８７号を与えられた。ＮＲＲＬ Ｂ−２１６６１号と呼ばれる菌株が、同じ組織に１９９７年３月７日に供託された。それはその後Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）によってＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓとして同定された。
【００２５】
本発明はまた、そのような細菌菌株、またはそのような細菌菌株から得た抗生物質を含む上清または純粋な抗生物質を用いて、植物の根を含む植物における真菌性の病気を予防および治療する方法も含む。本発明はまた、１０，０００ダルトンより小さい分子量を有し、わずかに熱不安定性、陽性に荷電、そしてＵＶ吸収によるＨＰＬＣピークが２８０ｎｍで最大、そして２３０ｎｍに肩がある、水溶性抗真菌性抗生物質も含む。その抗生物質はツヴィッターマイシンＡではない。
【００２６】
本発明のさらなる局面は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓと組み合せた場合にＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強する、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓの培養液全体または上清を含む。本発明はまた、Ｂａｃｉｌｌｕｓの細菌懸濁液、またはＢａｃｉｌｌｕｓの培養物の代謝物を含む上清、または精製した代謝物を用いて、植物の上または中への昆虫の侵入を制御するために、植物を治療する方法を含む。
【００２７】
本発明のさらなる局面は、殺真菌剤としてＢ．ｐｕｍｉｌｕｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−３００８７）とＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−２１６６１）の菌株を組み合せて使用することの、予想外の相乗効果である。本発明はその組成物およびそれらを殺真菌剤として用いる方法を含む。
【００２８】
（定義）
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に文脈が明らかに指図しなければ、複数の表示を含む。例えば、「ａ ｃｅｌｌ」という用語は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「含む」という用語は、その組成物および方法は、列挙した成分を含むが、他を除外しないことを意味するように意図される。「本質的に〜からなる」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、その組み合せに本質的に重要な他の成分を除外することを意味する。従って、本質的に本明細書中で定義されたような要素からなる組成物は、単離および精製方法からの痕跡混入物および、リン酸緩衝化生理食塩水、保存剤等のような薬剤学的に許容できる担体を除外しない。「〜からなる」は、他の成分および本発明の組成物を投与する重要な方法工程の痕跡要素以上のものを除外することを意味する。これら変化（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）用語のそれぞれによって定義された実施形態は、本発明の範囲内である。
【００３０】
「単離された」という用語は、「生物学的に純粋な」と交換可能に使用され、そしてその菌株または代謝物が通常天然に結合している成分、細胞および他から分離されたことを意味する。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「生物学的制御」は、２番目の生物体を用いることによる、病原体または昆虫の制御として定義される。生物学的制御の公知のメカニズムは、根の表面の空間に関して真菌をアウトコンピーティング（ｏｕｔ−ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ）することによって根腐れを制御する腸の細菌を含む。抗生物質のような細菌の毒素が、病原体を制御するために使用されてきた。その毒素を、単離および植物に直接適用し得、またはインサイチュで毒素を産生するように細菌種を投与し得る。
【００３２】
「真菌（ｆｕｎｇｕｓ）」または「真菌（ｆｕｎｇｉ）」という用語は、クロロフィルを欠く、広範に種々の有核の胞子を有する生物体を含む。真菌の例は、酵母、カビ、ウドンコ病、錆菌類、およびキノコを含む。
【００３３】
「細菌」という用語は、明確な核を有さないあらゆる原核生物を含む。
【００３４】
「殺真菌性」は、真菌の死亡率を増加させる、または増殖速度を阻害する物質の能力を意味する。
【００３５】
「抗生物質」は、微生物を殺すまたは阻害することができるあらゆる物質を含む。抗生物質は、微生物によって、または合成過程によって、もしくは半合成過程によって産生され得る。従って、その用語は、真菌を阻害するまたは殺す物質、例えばツヴィッターマイシンＡまたはカノサミンを含む。
【００３６】
「抗真菌剤」は、真菌を殺すまたは増殖を阻害できるあらゆる物質を含む。
【００３７】
「培養」という用語は、様々な種類の培地上または中での生物体の増殖を指す。
【００３８】
「ブロス培養物全体」とは、細胞および培地を両方含む液体培地をいう。
【００３９】
「上清」とは、培養液中で増殖した細胞を遠心、ろ過、沈降、または当該分野で周知の他の方法によって除去した場合に残る液体培養液をいう。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「昆虫」という用語は、「昆虫綱」の全ての生物体を含む。「前成虫」昆虫とは、例えば卵、幼生、および若虫を含む、成虫期より前のあらゆる形態の生物体を指す。「殺虫性」とは、昆虫の死亡率を増加させる、または増殖速度を阻害する物質の能力をいう。「抗線虫性」とは、線虫の死亡率を増加させるか、または増殖速度を阻害する物質の能力をいう。「農薬の」は、昆虫、線虫、およびダニの死亡率を増加させるまたは増殖速度を阻害する物質の能力をいう。
【００４１】
「ポジティブコントロール」は、農薬活性を有することが知られている化合物を意味する。「ポジティブコントロール」は、市販で入手可能な化学的農薬を含むがこれに限らない。「ネガティブコントロール」という用語は、農薬活性を有さないことが公知の化合物を意味する。ネガティブコントロールの例は、水または酢酸エチルである。
【００４２】
「溶媒」という用語は、溶液中に別の物質を保持するあらゆる液体を含む。「溶媒抽出可能」とは、溶媒に溶解し、そして次いで溶媒から単離し得るあらゆる化合物をいう。溶媒の例は、酢酸エチルのような有機溶媒を含むがこれに限らない。
【００４３】
「代謝物」という用語は、農薬活性を有する微生物の発酵のあらゆる化合物、物質または副産物を指す。上記で定義した抗生物質は、微生物に対して特に活性な代謝物である。
【００４４】
「組成物」は、活性薬剤および、不活性（例えば検出可能な薬剤または標識）、またはアジュバントのように活性な、別の化合物または組成物との組み合せを意味することを意図する。
【００４５】
「画分」は、上清の分子を大きさ、極性、または電荷によって分離するために使用される分画アッセイからのアリコートを意味することを意図する。
【００４６】
「部分的に精製した画分」は、バイオアッセイで発芽を阻害、またはｌｅｐｉｏｌｏｐｌａｕｓに対するＢ＋活性を増強し得る、分画アッセイで回収されたアリコートの１つである。
【００４７】
「有効な量」は、有益なまたは望ましい結果を得るのに十分な量である。有効な量を、１つ以上の用途において適用し得る。治療および防御に関して、「有効な量」は、昆虫の外寄生の進行を改善、安定化、逆行、遅延（ｓｌｏｗ）、または遅延（ｄｅｌａｙ）させるのに十分な量である。
【００４８】
本発明者らは、特定の植物病原体にのみ抗真菌活性を有し、そして抗細菌活性を有さない、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号で寄託されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．の新規抗生物質産生菌株、およびその変異体の、全ての同定する性質を有する菌株の生物学的に純粋な培養を記載する。１つの局面において、その菌株はＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号で寄託されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、およびその菌株の変異体である。
【００４９】
他の局面では、その菌株は、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号で寄託された菌株の全ての同定する性質（下記で提供されるような）を有する、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号の変異体または改変体である。変異体または改変体は、本開示中で相互交換可能に使用され、そしてさらに、高いストリンジェンシーの条件下でＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号のゲノムとハイブリダイズするゲノムを有するものとして同定され得る。「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化される複合体を形成する反応をいう。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対形成、フーグスティーン結合、またはあらゆる他の配列特異的な様式によって起こり得る。その複合体は、二本鎖構造を形成する２本の鎖、複数鎖の複合体を形成する３本以上の鎖、１本の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらのあらゆる組み合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行い得る。一般的に、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、１０×ＳＳＣ中約４０℃で、または同等のイオン強度／温度の溶液で行われる。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、代表的には６×ＳＳＣ中約５０℃で、そして高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、一般的に１×ＳＳＣ中約６０℃で行われる。
【００５０】
ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号の変異体または改変体はまた、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号のゲノムと、８５％より多い、より好ましくは９０％より多い、またはより好ましくは９５％より多い配列が同一であるゲノム配列を有する菌株として定義され得る。ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）が、別の配列に対して特定の割合（例えば８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を有することは、整列した場合、２つの配列を比較してその塩基（またはアミノ酸）の割合が同一であることを意味する。この整列および相同性の割合または配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム、例えばＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）補遺３０、第７．７．１８節、表７．７．１で記載されているものを用いて決定し得る。好ましくは、整列のためにデフォルトパラメーターを使用する。好ましい整列プログラムは、デフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝コード＝標準；フィルター＝無し；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予期＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；分類＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複性、Ｇｅｎｂａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細を、以下のインターネットアドレスにおいて見出し得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００５１】
本発明はさらに、上記で述べた培養から得た上清を提供する。その上清を、遠心；ろ過；沈降等を含む、当該分野で周知の方法によって得ることができる。
【００５２】
別の局面において、本発明は、水溶性抗真菌性抗生物質である単離された代謝物を含む。その代謝物は、本発明の菌株から単離され、そして上記で記載される。それは、特定の植物病原体に対して活性を有するが細菌には活性を有さず、１０，０００ダルトンより小さい、ＵＶ吸収のピークが２８０ｎｍ、および肩が２３０ｎｍ、酸および塩基に安定、８０℃より上でわずかに熱不安定性、そして陽性に荷電した化学的性質を有する。本発明はさらに、この代謝物を産生する過程、本発明の菌株を培養する工程、および下記で記載する方法を用いて活性代謝物を単離する工程を包含する方法を提供する。
【００５３】
本発明のさらなる局面は、殺真菌活性を有する、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号の、部分的に精製された活性画分である。活性画分は、ツヴィッターマイシンＡと同一ではない。
【００５４】
本発明によってさらに、あらゆる上記の菌株（その変異体または改変体を含む）、上清、画分および代謝物を、単独または、お互いにおよび担体と組み合せて含む組成物が提供される。これらの組成物は、さらに少なくとも１つの化学的または生物学的農薬を加えることによって補充され得る。これらの組成物は、水和剤、顆粒処方、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物（ｅｍｕｌｓｉｆｉａｂｌｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）またはマイクロカプセル化を含むがこれらに限定されない、種々の処方の形態を取り得る。
【００５５】
本発明の範囲内で組成物のよい分散および接着を達成するために、培養液全体、上清、画分および／または代謝物／抗生物質を、分散および接着を助ける成分とともに処方することが有利であり得る。よって、適当な処方が当業者に公知である（水和剤、顆粒等、または適当な媒体等中にマイクロカプセル化され得る処方、液体（例えば水性の流動可能物（ｆｌｏｗａｂｌｅｓ）および水性懸濁液）ならびに乳化可能な濃縮物）。他の適当な処方が、当業者に公知である。
【００５６】
上記で述べたあらゆる菌株、代謝物、画分、上清およびこれら活性成分を含む組成物を、植物、根または果実を真菌感染から処置または保護する方法を提供するために使用し得る。その方法は、有効な量の菌株、代謝物、画分、上清またはこれら活性成分を含む組成物を、単独で、またはお互いにおよび／または他の生物学的または化学的農薬と組み合せて、感染した根、植物、または果実に適用することを含む。有効な量のこれら組成物をまた、そのような外寄生を予防するために、植物、根、または果実に適用し得る。
【００５７】
さらなる局面において、本発明は、新規菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号の同定する性質を全て有する菌株またはその改変体によって産生された、有効な量の抗生物質を適用することを含む、真菌性の病気から植物、根、または果実を処置または保護する方法を含む。１つの実施形態において、その菌株はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号である。
【００５８】
本発明はさらに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強する、水溶性化合物を提供する。ここでその化合物は、１０，０００ダルトン未満の分子量を有し、そしてその化合物はツヴィッターマイシンＡではない。その化合物は、ベータ外毒素または他のＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ産生外毒素ではない。
【００５９】
その化合物を、陰イオン交換樹脂、アセトニトリル沈殿、およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって単離する。本発明はまた、その新規化合物を含むＢａｃｉｌｌｕｓの上清の、部分的に精製された画分を提供する。その新規化合物および活性画分を、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ、およびＢ．ｐｕｍｉｌｕｓを含むがこれに限らないＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．の群から選択されるＢａｃｉｌｌｕｓから単離し得る。
【００６０】
当該分野の化学者（ｃｈｅｍｉｓｔ ｓｋｉｌｌｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｒｔ）が、化合物が完全に精製されたかどうか決定することを可能にする、その1ＨＮＭＲ（またはプロトンＮＭＲ）スペクトルによって、部分的に精製された活性画分を同定し得る。化合物が純粋な場合、１つのプロトンを示すピークが１の任意の値に統合する。次いで、２つのプロトン、例えばメチレン基を示すピークは、２の値に統合する。３つのプロトン、例えばメチル基を示すピークは、３に統合する。これは図３、純粋なツヴィッターマイシンＡスタンダードの場合である。しかし、活性な部分的に精製されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンハンサーの1Ｈ ＮＭＲスペクトルは、１より小さく統合するピークの群を有し、そして従ってスペクトル中のより大きなピーク由来の、別の化合物に属する。
【００６１】
単離において、その化合物は殺虫活性を示さない。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓとの組み合せが、植物および植物の根に適用した場合にＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫効果を増強する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓは、微生物菌株、市販製品、遺伝子工学で作られた植物（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｌａｎｔ）、殺虫的に活性な代謝物、殺虫的に活性な上清またはデルタエンドトキシンの形態であり得る。
【００６２】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓは、パラ胞子（ｐａｒａｓｐｏｒａｌ）結晶性タンパク質を含むことによって特徴付けられる、グラム陽性、胞子形成細菌である。そのタンパク質は、害虫に対して高度に毒性であり得、そしてその毒性活性において特異的であり得る。上記の特許請求の範囲で使用される場合、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ」という用語は、微生物菌株、そのような菌株またはその菌株から単離された活性代謝物または画分を含む単離物を含む市販製品、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫性タンパク質または遺伝子産物またはデルタエンドトキシンをコードする遺伝子を発現する、遺伝的に改変された、または遺伝子操作された植物を含む。毒素遺伝子が単離および配列決定され、そして組換えＤＮＡに基づくＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ産物が産生および使用が認可された。遺伝子工学技術および、これらのＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンドトキシンを農業環境に伝達する新しいアプローチが、開発中であり、そして商業生産されている。これらは、害虫抵抗性のためにエンドトキシン遺伝子を用いて遺伝子操作された植物の使用、および安定化したインタクトな微生物細胞の、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンドトキシン伝達媒体としての使用を含む（Ｇａｅｒｔｎｅｒら（１９８８）ＴＩＢＴＥＣＨ ６：Ｓ４−Ｓ７）。標的害虫を、天然に毒素を発現する野生型Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓに曝露することによって、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを、標的害虫に対して使用可能にし得る。あるいは、望ましい毒素をコードする遺伝子を、適当な組換え宿主中で形質転換および発現させ得る。殺虫活性を保持するＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素のフラグメントも使用し得る。
【００６３】
以下の米国特許は、農薬性のＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ単離物またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素を発現する組換え微生物を開示している：米国特許第５，００６，３３５号；同第５，１０６，６２０号；同第５，０４５，４６９号；同第５，１３５，８６７号；同第４，９９０，３３２号；同第５，１６４，１８０号；同第５，１２６，１３３号；同第５，０９３，１１９号；同第５，２０８，０１７号；同第５，１８６，９３４号；同第５，１８５，１４８号；同第５，２１１，９４６号；同第４，９４８，７３４号；同第４，８４９，２１７号；同第４，９９６，１５５号；同第４，９９９，１９２号；同第４，９６６，７６５号；同第５，０７３，６３２号；同第５，１９６，３４２号；同第５，０６３，０５５号；同第５，０８０，８９７号；同第５，０２４，８３７号；同第５，１４７，６４０号；同第５，１７３，４０９号；および同第５，１８６，９３４号。
【００６４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｋｕｒｓｔａｋｉの胞子および結晶の調製物が、鱗翅目害虫に対する市販の農薬として、長年使用されてきた。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｖａｒ．ｋｕｒｓｔａｋｉ ＨＤ−１は、多くの鱗翅目昆虫の幼生に対して毒性である、デルタエンドトキシンと呼ばれる結晶を産生する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのさらなる種、すなわちｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓおよびｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓが、昆虫を制御するために市販で使用されてきた。
【００６５】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ結晶タンパク質遺伝子のクローニングおよび発現は、Ｓｃｈｎｅｐｆ，Ｈ．ら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２８９３−２８９７において記載された。米国特許第４，４４８，８８５号、および米国特許第４，４６７，０３６号はいずれも、Ｅ．ｃｏｌｉにおける結晶タンパク質の発現を開示している。増加した毒性を示し、そして標的害虫に対する拡大した宿主範囲を示す、ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ結晶タンパク質遺伝子が構築された。米国特許第５，１２８，１３０号、および同第５，０５５，２９４号を参照のこと。米国特許第４，７９７，２７６号および第４，８５３，３３１号は、様々な環境において鞘翅目害虫を制御するために使用し得る、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（Ｂ．ｔ．ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓとしても知られる、Ｍ−７としても知られる）を開示している。米国特許第４，９１８，００６号は、双翅類に対する活性を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを開示している。米国特許第４，８４９，２１７号は、アルファルファゾウリムシに対する活性を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ単離物を開示している。米国特許第５，１５１，３６３号および米国特許第４，９４８，７３４号は、線虫に対する活性を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの特定の単離物を開示している。
【００６６】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ培養物はまた、Ｂｒｏｗｎｓｖｉｌｌｅ、Ｔｅｘ．のＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＵＳＤＡ）から入手可能である。依頼は、ＵＳＤＡ、ＡＲＳ、Ｃｏｔｔｏｎ Ｉｎｓｅｃｔｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｕｎｉｔ、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１０３３、Ｂｒｏｗｎｓｖｉｌｌｅ、Ｔｅｘ．７８５２０ ＵＳＡ、またはＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、１８１５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌ．ＵＳＡに対してなされるべきである。
【００６７】
従って、その化合物および活性画分は、線虫、ハエ、ガの幼虫、ダニ、コロラドハムシ、トウモロコシの根を食べる昆虫の幼虫を含むがこれに限らない昆虫に対するＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強する。
【００６８】
当業者に周知であるように、その活性成分を、組成物の形態で適用し得る。よって、本発明はまた、新規化合物および溶媒または農業的に適当なキャリアのようなキャリアを含む組成物を提供する。さらなる実施形態において、組成物はさらに、上記で記載したような有効な量のＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを含む。またさらなる実施形態において、組成物は、当該分野で伝統的に使用されているような、少なくとも１つの化学的または生物学的農薬を含む。本発明の範囲内で組成物のよい分散および接着を達成するために、培養液全体、上清および／または代謝物を、分散および接着を助ける成分と共に処方することが有利であり得る。植物または植物の根への適用を容易にするために、その処方は、水和剤、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物およびマイクロカプセル化処方からなる群から選択される処方へ処理され得る。
【００６９】
新規化合物、活性画分、またはそれらを含む組成物を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強するために使用し得る。従って、本発明はまた、有効な増強量の新規化合物、活性画分またはそれらを含む組成物を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓと組み合わせることによって、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強する方法を提供する。さらなる局面において、有効な量の少なくとも１つのバイオ農薬または化学的農薬をその処方に加える。
【００７０】
本発明はさらに、殺真菌剤として使用するために、培養液全体として植物、根、または果実に適用する、新規化合物ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号をＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−２１６６１号と組み合わせて使用することを含み、その殺真菌剤は化合物の組み合せの予期しない相乗効果の結果として、より強力な効果を有する。より好ましくは、その組み合せは、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａまたはＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａに対して１：２（Ｂ−２１６６１：Ｂ−３００８７）の比で適用される。さらにより好ましくは、その組み合せはＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａまたはＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａに対して１：４の比で適用される。またさらなる実施形態において、組成物は当該分野で伝統的に使用されるような、少なくとも１つの化学的または生物学的農薬を含む。本発明の範囲内で組成物のよい分散および接着を達成するために、培養液全体、上清および／または代謝物を、分散および接着を助ける成分と共に処方することが有利であり得る。植物または植物の根への適用を容易にするために、その処方は、水和剤、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物およびマイクロカプセル化処方からなる群から選択される処方へ処理され得る。
【００７１】
本開示を通して、種々の出版物、特許および公開された特許明細書が、識別する引用によって言及される。これらの出版物、特許および公開された特許明細書の開示は、これによって本発明が属する技術分野の状態をより充分に説明するために本開示に参考として援用される。
【実施例】
【００７２】
以下の実施例は、本発明を例示することを意図するが、限定することは意図されない。
【００７３】
（実施例１）
（菌株ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の特徴づけ）
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７を、メチルエステルへと誘導体化した全細胞の細胞性脂肪酸−ＦＡＭＳに基づいて同定し（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｔ．（１９８２）「Ｓｉｎｇｌｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒｏｕｔｉｎｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｈｙｄｒｏｘｙ ａｃｉｄｓ」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：５８４〜５８６）、そしてＭＩＤＩシステム（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）を使用するガスクロマトグラフィーにより分析した。細菌培養物を増殖するために使用される手順およびプロトコル、ならびに装置仕様は、ＭＩＤＩにより記載されている（細胞性脂肪酸のガスクロマトグラフィーによる細菌の同定。Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｎｏｔｅ＃１０１．ＭＩＤＩ，Ｉｎｃ．、１１５ Ｂａｒｋｓｄａｌｅ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）。単離物をＴＳＡ（ＢＢＬ）プレート上で２８℃にて２４時間増殖させ、そして細胞を収集した。１ｍｌのメタノール性ＮａＯＨ（５０％（容量／容量）メタノール中１５％（重量／容量）ＮａＯＨ）を添加し、そして細胞を１００℃にて３０分間けん化した。脂肪酸のエステル化を、４６％（容量／容量）メタノール中３．２５Ｎ ＨＣｌ ２ｍｌを８０℃にて１０分間用いて実施した。ＦＡＭＥを、１：１（容量／容量）メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル−ヘキサン１．２５ｍｌ中に抽出し、そしてその有機抽出物を、３ｍｌの１．２％（重量／容量）ＮａＯＨで洗浄し、その後、ガスクロマトグラフィーにより分析した。このガスクロマトグラフ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ５８９０Ａ）は、水素炎イオン化検出器およびキャピラリーカラム（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １９０９１Ｂ−１０２、架橋型５％フェニルメチルシリコン；２５ｍ×０．２２ｍｍ内径；フィルム厚０．３３ １ｌｍ；相比１５０）を備え、水素をキャリアガスとして用いた。Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ３３９２積分器が自動的にＦＡＭＥピークを積分した。そして細菌単離物を、ＭＩＤＩ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｈｅｒｌｏｃｋ ＴＳＢＡ Ｌｉｂｒａｒｙ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．８０）を使用して命名した。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌａ ＡＴＣＣ １３６３７のＦＡＭＥプロフィールを、ＭＩＤＩ決定のための参照チェックとして使用した。
【００７４】
別個の３連のＭＩＤＩプロフィールの結果は、類似性指標スコア０．８７５にて、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７をＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓとして同定した。
【００７５】
（実施例２）
（インビトロ培養における植物病原体に対するＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の活性（ゾーンアッセイ））
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７が広範囲の植物病原性真菌に対して有効であるか否かを決定するために、以下の実験を、以下のこれらの植物病原体を使用して実施した：Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ａｃｕｔａｔｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｏｐｈｙｌｕｍ、Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ、Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｔａｐｈｒｉｎａ ｄｅｆｏｒｍａｎｓおよびＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ。
【００７６】
寒天拡散（ゾーン）アッセイにおいてＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の活性を決定するために、植物病原体胞子（胞子は、ペトリ皿の表面から掻き落とし、そして約１×１０5胞子／ｍｌ（病原体に依存する）に希釈した）を、１０ｃｍペトリ皿中のジャガイモデキストロース寒天の表面上にスプレッディングした。Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉおよびＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍについては、胞子の代わりに菌糸断片をプレート上にスプレッディングした。約７．０ｍｍの環状ウェルを寒天から除去し、そして２５０ｍｌ振盪フラスコ中でダイズ、酵母抽出物培地にて７２時間増殖させたＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の上清１２５ ｌサンプルを、ウェル中に配置した。
【００７７】
上清を、１２，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離することによって調製した。代表的な結果は、ウェルの周囲の、増殖していない病原体のゾーンおよび／または増殖が減少した病原体のゾーンからなり得るか、あるいは全くゾーンが存在しない状態からなり得る。ゾーンのサイズをミリメートルにて測定し、そしてゾーンが存在するか否かを記録した。結果を、下記の表１に示す。
【００７８】
【表１】
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７上清は、ゾーン試験においてほとんどの真菌性植物病原体に対して活性を示さなかった。
【００７９】
（実施例３）
（細菌性植物病原体に対するＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の活性）
標準的寒天拡散アッセイを、実施例２のように設定した。各細菌病原体のローンを、ジャガイモデキストロース寒天の表面上にスプレッディングした。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７上清の１２５ ｌのサンプルを、上記のように各ウェルに配置した。ゾーンの存在またはゾーンのサイズを、ミリメートルにて測定した。
【００８０】
【表２】
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７は、インビトロにて試験した細菌性植物病原体のいかなる種に対しても活性ではなかった。
【００８１】
(実施例４）
（植物試験における植物病原体に対するＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の活性）
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の活性を、マメサビ菌Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｓｅｏｌｉに対してサヤマメにおいて、そして灰色カビ菌Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａに対してコショウ植物において、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉに対してトマト植物において、そしてレタスのべと病菌Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅに対して；アブラナのべと病菌に対して、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａに対して、トマトの疫病Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓに対して、そしてブドウウドン粉病菌Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒに対して、試験した。
【００８２】
（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ）
病原体Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉを、ＰＤＡを含む標準的ペトリ皿（１０ｃｍ）上で増殖させた。真菌コロニーをプレートから切断し、そして胞子形成培地（１ｌの滅菌水あたり、２０ｇスクロース、３０ｇ炭酸カルシウム、および２０ｇ寒天）上に配置した。滅菌水を菌糸ブロックを部分的に覆うようにプレートに添加し、そしてプレートを２２〜２６℃にて２日間、１４時間の光周期でインキュベートする。菌糸ブロックをビーカーの滅菌水中に掻き落とすことによって胞子を収集する。胞子懸濁物を、２×１０4胞
子／ｍｌに調整する。
【００８３】
２インチポットに植えそして平箱に配置した３〜４葉齢のトマト種子（ＵＣ８２−Ｂ）に、２５０ｍｌ振盪フラスコにおいて７２時間ダイズ粉末、酵母抽出物培地にて増殖させたＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７のブロス全体を、画家用エアブラシ（ａｒｔｉｓｔｓ ａｉｒ ｂｒｕｓｈ）を用いて噴霧して溢れ出させた（ｒｕｎｏｆｆ）。噴霧後、実生を最低２時間乾燥させた。接種された実生を２２℃のＰｅｒｃｉｖａｌ露チャンバ（ｄｅｗ ｃｈａｍｂｅｒ）にて、限定はしないが最初の４０時間配置した。各平箱中の植物をプラスチックドームで覆い、そして１４時間の光周期で、Ｐｅｒｃｉｖａｌインキュベーターにて２０〜２２℃で４８時間維持した。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７を含まず病原体の胞子を含む水、ならびにＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７を含まず病原体の胞子を含まない水を、ネガティブコントロールおよびポジティブ病原体コントロールとして使用した。また、化学殺真菌剤（例えば、Ａｚｏｘｙｓｔｒｏｂｉｎ、Ａｂｏｕｎｄ（登録商標））を、１００〜２５０ｐｐｍの率にて比較のために使用した。植物を、０〜５のスケールにスコア付けした。ここで、５は、１００％感染であり、そして０は症状が存在しない。水Ａ．ｓｏｌａｎｉコントロールにおいて、すべての葉にわたって均一な病変が存在し、そして子葉が剥離し、そして重篤に感染した（評点５＝完全感染、制御なし）。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７で処理した植物は、水コントロールと異ならないように見えた。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７による病原体の制御は存在しなかった（これもまた、評点５）。ネガティブコントロールは感染しなかった。化学処理した植物は、０と１との間のスコアを有した。
【００８４】
（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）
病原体Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａを、ＰＤＡを含む標準的ペトリ皿（１０ｃｍ）上で増殖させ、そして胞子を、麦芽（０．５ｇ／Ｌ）および酵母抽出物（０．５ｇ／Ｌ）を補充したジャガイモデキストロースブロス（ＰＤＢ）を使用して収集し、そして１×１０6胞子／ｍｌに調整した。使用した植物は、３〜５本葉期まで２インチポットにて生長させたコショウ（Ｙｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒ）であった。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７および病原体の適用は、上記と同じであった。ポットが入った平箱を、限定しないが２０℃一定にてインキュベートした。この平箱をプラスチックドームで覆い、そして胞子形成するまで２．５日間（６０〜６５時間）放置した。
【００８５】
化学殺真菌剤（例えば、Ｉｐｒｏｄｉｏｎｅ、Ｒｏｖｒａｌ（登録商標））を、２０〜１００ｐｐｍの率で比較のために使用した。植物を、０〜５のスケールにてスコア付けした。ここで、５は、１００％感染であり、そして０は症状が存在しない。水Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａコントロールにおいて、すべての葉にわたって均一な病変が存在した（評点５＝完全感染、制御なし）。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７で処理した植物は、水コントロールと異ならないように見えた。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７による病原体の制御は存在しなかった（これもまた、評点５）。ネガティブコントロールは感染しなかった。化学処理した植物は、０と１との間のスコアを有した。
【００８６】
（Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅ）
Ｂｒｅｍｉａ試験について、レタス種子を、約８センチメートルの高さおよび正方形である小さく透明なプラスチックの植物箱において、ピート、パーライトおよびバーミキュライトを含む滅菌培養土混合物の層に植えた。植付けの１週間後、レタス実生に、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロスまたは上清サンプルを噴霧した。この植物を乾燥させ、次いで感染したレタス実生から収集したべと病菌胞子懸濁物（２×１０4胞子／ｍｌ）を
実生に噴霧した。Ａｌｉｅｔｔｅ（ｆｏｓｅｔｙｌ−ａｌ）およびＲｉｄｏｍｉ（ｍｅｔａｌａｘｙｌ）からなる化学物質スタンダードもまた、適用した。しかし、これらの試験において使用したＢｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅの単離物は、商業的に使用されるこれらの２つの化学物質スタンダードに非感受性であることが以前に示された。プラスチックの箱をきつくフィットするフタで覆い、そして制限しないが１６時間Ｐｅｒｃｉｖａｌインキュベーターにて１５〜１６℃にてインキュベートした。次いで、プラスチックの箱を６日間、光の下で室温（２０〜２６℃）に配置した。実生の覆いを取り、水を噴霧し、再び覆い、そして胞子形成が生じるように１５〜１６℃にて一晩インキュベーターに戻した。レタスべと病菌の化学物質耐性菌に対するＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の効果を、下記表３に示す。
【００８７】
【表３】
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７は、レタスべと病菌に対する優れた活性を有し、種子において病原体の胞子形成がほとんどないかまたは全くなかったが、コントロール（水チェック）植物は、べと病菌により完全に胞子形成された。化学物質スタンダードは、病原体を効果的には制御しなかった。
【００８８】
（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌株ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７を、２５０ｍｌ振盪フラスコにて、上記のように増殖させた。１×強度のブロス培養物全体を、完全子葉期の１週齢のカリフラワー植物または芽キャベツ植物に、圧縮空気を動力源とする画家用エアーブラシを用いて噴霧した。１処理あたり３連の１５〜２５実生／ポットに噴霧した。１〜５×１０4胞子／ｍｌのべと病菌Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａの胞子懸濁物を、まずＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７を適用した後に、Ｂｒａｓｓｉｃａ植物に噴霧した。Ａｌｉｅｔｔｅ（ｆｏｓｅｔｙｌ−ａｌ）およびＲｉｄｏｍｉｌ（ｍｅｔａｌａｘｙｌ）からなる化学物質スタンダードもまた、適用した。しかし、これらの試験において使用したＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａの単離物は、商業的に使用されるこれら２つの化学物質スタンダードに非感受性であることが以前に示された。
【００８９】
感染のために植物を１５〜１７℃で１６時間保持し、次いで実生を２０〜２４℃で６日間インキュベートした。病原体の胞子形成が生じるように、ポットを１５〜１７℃に一晩戻した。各植物を、０〜５のスケールに基づいて疾患制御パーセントを評価することによって、評価した。評点０は、胞子形成病変を伴わない植物である。レプリカポットすべてにわたって平均した結果を、以下表４に示す。
【００９０】
【表４】
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７は、未処理チェックおよび化学物質スタンダードと比較した場合に、より有効にＢｒａｓｓｉｃａべと病菌を制御した。
【００９１】
（Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒ）
ブドウ実生（Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ）を、６〜９本葉期まで２インチポットにて生長させた。ウドン粉病菌の培養物を、１４時間光周期のもとで２２〜２６℃にてブドウ実生上に維持した。ほとんど最も若い２〜４つの葉を除去する。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７、化学殺真菌剤（Ｒａｌｌｙ（登録商標）、２５ｐｐｍのミクロブタニル（ｍｙｃｌｏｂｕｔａｎｉｌ））および水チェックを、試験した他の病原体についての上記の通りに、適用して溢れ出させる。４〜５つのレプリカを、各処理に使用する。ウドン粉病菌を接種するために、維持実生（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｓｅｅｄｉｎｇ）上にカビを有する葉をかみそりで除去し、そして各植物に個別に接種する。維持実生の表面を絵の具刷毛でおだやかにブラッシングして、胞子が試験植物の上側表面上に堆積するようにする。この手順は、すべての植物が等価な接種物を得るのを確実にするように、ライト付３×拡大レンズを使用して実施する。ポットが入った平箱を、２０〜２４℃にて１６〜２４時間暗所に配置する。平箱を、試験を判断するまでさらに９〜１１日間、１４時間の光周期で２２〜２６℃に維持する。上記のように、植物に、０〜５のスコアを与える。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７を使用する結果を、以下の表５に示す。
【００９２】
【表５】
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７は、未処理チェックと比較して有効に、そして化学物質スタンダードＲａｌｌｙとほとんど同様に、Ｕｎｃｉｎｕｌａウドン粉病菌を制御した。
【００９３】
（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）
トマト疫病Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓの試験を、２インチ四方のプラスチックポットにて生長させた４〜６本葉期のトマト実生（ＵＣ８２−Ｂ）を使用して実施した。以前に記載されたように増殖させたＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の適用を、トマト実生に行った。Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓの接種物を、ライムギ種子寒天上に増殖した胞子形成コロニーを掻き落とし、そして０．７×１０4〜１．０×１０4胞子嚢／ｍｌの間に接種濃度を調整することによって、生成した。Ａ．ｓｏｌａｎｉ試験について上記した通りに正確に、接種した実生を平箱中に配置し、そしてインキュベートした。実生を、０〜５スケールにて評価した。Ｑｕａｄｒｉｓ（登録商標）（アゾキシストロビン（ａｚｏｘｙｓｔｒｏｂｉｎ））を、６２．５〜１２５ｐｐｍの率にて、比較のために使用した。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７を使用する結果を、以下の表６に示す。
【００９４】
【表６】
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７は、接種の４日後に、化学物質スタンダードＱｕａｄｒｉｓとほぼ同様に、疫病を制御した。
【００９５】
（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｓｅｏｌｉ）
マメサビ菌Ｕ．ｐｈａｓｅｏｌｉの試験を、第一葉が３／４拡大するまで、サヤマメ実生（供給者の変種）を使用して実行した。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の適用を、他の宿主／病原体の組み合わせについて以前に記載した通りに実行した。サビ病病原体の接種物を、−２０℃のバイアル中に乾燥サビ菌胞子として貯蔵した。接種物を、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む水に乾燥サビ菌胞子を添加することにより調製し、そして少なくとも１時間磁気攪拌器上で激しく攪拌した。接種物を、２×１０5〜４×１０5胞子／ｍｌに調整する。第一葉に接種し、そして実生を平箱中に配置し、そしてＰｅｒｃｉｖａｌ露チャンバにて２０℃にて一晩インキュベートする。次いで実生を、室温（２０〜２６℃）でさらに８〜１０日間インキュベートする。実生を、存在する胞子形成サビ菌いぼの発生率および重篤度に基づいて、０〜５のスケールにて評価する。
【００９６】
化学殺真菌剤Ｂｒｅａｋ（登録商標）（プロピコナゾール）を、４０ｐｐｍの率で比較のために使用した。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロス全体を使用する結果を、以下表７に示す。
【００９７】
【表７】
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７は、マメサビ菌を、化学物質スタンダードＢｒｅａｋ（登録商標）とほぼ同様に制御した。
【００９８】
（実施例５）
（ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７により生成される抗真菌代謝産物）
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７のブロス全体を、酢酸エチル画分、ブタノール画分、および水性画分に分割した。各画分を、胞子発芽アッセイにおいてキンギョソウサビ菌に対して試験した。キンギョソウサビ菌胞子を、４０ ｌのサンプルおよび２０ ｌの病原体胞子を含む、凹部付き（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）顕微鏡スライドにて各サンプルの存在下で発芽させた。約１６時間後、胞子を顕微鏡下で観察して、胞子が発芽したかを観察する。水コントロール（１００％発芽および増殖＝スコア５）と比較しての発芽なし（スコア０）は、試験するサンプルの活性を示す。異なるＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７画分を用いたサビ菌発芽アッセイの結果を、以下表８に示す（上記のような０〜５の評点に基づくスコア）。
【００９９】
【表８】
代謝産物は、明らかに水可溶性画分中にあり、そしてブタノールまたは酢酸エチル中に容易には抽出可能ではない。
【０１００】
この代謝産物の他の特徴を決定した。この分子は、１０，０００分子量カットオフフィルターを通ることが示された。このことは、この代謝産物が１０，０００ダルトン未満であることを示す。この活性は、プロテアーゼでの処理後に失われず、酸で処理した場合でも塩基で処理した場合でも失われなかった。この活性は、８０℃まで１時間加熱した際にわずかに失われた（キンギョソウサビ菌に対するスコアは、０から１．５に増加した）。この活性は、カチオン樹脂にて吸収されたが、アニオン樹脂には吸収されなかった（この代謝産物は、正に荷電している）。
【０１０１】
（実施例６）
（ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の殺真菌画分の部分精製）
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７由来のブロス培養物全体（８５０ｍｌ）を、４２００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、そして上清を収集した。活性炭（３０ｇ）をこの上清に添加し、そしてこれを十分に振盪した後、１１，５００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清をロータリーエバポレーターにて乾燥し、次いで１５ｍｌの水に再溶解した。次いで、サンプルを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに精製して、分子量によって成分を分離した。
【０１０２】
Ｐ−２樹脂（１３０ｇ、ＢｉｏＲａｄ）を、ミリＱ脱イオン水で膨張させて、カラム２．５ｃｍ×８０ｃｍに充填した。１５ｍｌの濃縮物をこのＰ−２カラム上にローディングし、このカラムを重力によって水を用いて溶出し、そして１０ｍｌ画分を収集した。Ｐ−２カラムについてのパラメーター：範囲＝２、ｎｍ＝２２６ｎｍ、１６ｍｖ。
【０１０３】
溶出した画分を、実施例５に記載したキンギョソウサビ菌発芽アッセイを使用してアッセイした。画分１８〜２４が、発芽を完全に阻害することを見出した。これらの画分を混合し、そしてロータリーエバポレーターにて乾燥し、次いで、８ｍｌの水に再溶解し、そして０．２ｍｌフィルターに通して濾過した。これを、第２のＰ−２カラムにローディングし、そして上記のように流したが、ただし、７ｍｌ画分を収集した。
【０１０４】
画分２９〜３８が、バイオアッセイにおいて発芽を阻害することを見出した。これらの画分を乾燥し、次いで水に再溶解した。小アリコート（５ｍｇ）を、アミノカラム（４．６ｍｍ×１５ｃｍ、５ｍ、１００Å）を使用するＨＰＬＣによりさらに分離した。このカラムを、０．０１Ｍ ＫＨ2ＰＯ4中で平衡化し、そして４％〜４４％アセトニトリル／０．０１Ｍ ＫＨ2ＰＯ4勾配を、２００ｎｍのＵＶにより検出して、１ｍｌ／分で３０分間流した。
【０１０５】
３つのピークを収集し、そしてピーク１を、サイズ排除ＨＰＬＣカラム（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ、Ｇ１０００ ＰＷ、７．５ｍｍ×３０ｃｍ、１０ｍ）上にて脱塩し、２００ｎｍのＵＶにより検出して、１ｍｌ／分の水で溶出した。１つのピークを、サイズ排除カラムから収集し、そして発芽アッセイにおいて活性であることを見出した。この半純粋の（ｓｅｍｉ−ｐｕｒｅ）活性物質の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、図１に示すようにＤ2Ｏにおいて４００ＭＨｚにて記録した。
【０１０６】
（実施例７）
（殺真菌成分の化学的特徴は、ツウィッターマイシン（ｚｗｉｔｔｅｒｍｉｃｉｎ）Ａと異なる）
本発明の殺真菌活性画分は、キャピラリー電気泳動において、ツウィッターマイシンＡと異なることが示された。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロス全体を、ダイズ粉末、デキストロース、酵母抽出物、ＫＨ2ＰＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4、ＮａＣｌおよびＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏを含む、Ｂａｃｉｌｌｕｓ培養培地において増殖させた。画線培養物を使用して、２５０ｍｌ振盪フラスコに接種した。フラスコを、２１０ｒｐｍにて３０℃で４日間振盪した。
【０１０７】
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロス全体に、精製ツウィッターマイシンＡを加え、そしてキャピラリー電気泳動（ＣＥ）において泳動した。３０μｌのＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロス全体に、１０μｌのツヴィッターマイシンＡを加えた。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロス全体、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロス全体＋ツウィッターマイシンＡ、およびツヴィッターマイシンＡ単独のうちの１つのサンプル各々を、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）を使用してＣＥ上で泳動した。各サンプルについて生じた電気泳動図を図３に示す。
【０１０８】
次いで、部分精製画分を、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を使用して、ツヴィッターマイシンＡと比較した。図４は、Ｂ−３００８７の部分精製殺真菌成分の電気泳動図、２５μｌのツヴィッターマイシンＡを加えたＢ−３００８７の部分精製殺真菌成分の電気泳動図、およびツヴィッターマイシンＡ単独の電気泳動図を示す。
【０１０９】
図２に示されるツヴィッターマイシンＡの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよび図１に示されるＢ−３００８７の部分精製殺真菌代謝産物の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、４００ＭＨｚにてＤ2Ｏにおいて記録した。図１および図２に示されるようなこれらのスペクトルは、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７からの殺真菌代謝産物は、ツウィッターマイシンＡと異なることを示す。
【０１１０】
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７からの殺真菌代謝産物はまた、1Ｈ−ＮＭＲにより−体外毒素と区別され得る。−体外毒素の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｌ．Ａ．ＨｉｃｋｌｅおよびＷ．Ｌ．Ｆｉｔｃｈ編、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ４３２、１３１頁（１９９０）に示されるように、５ｐｐｍを超える７つの共鳴を有する。対照的に、図１は、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７サンプルについて、５ｐｐｍを超える陽子共鳴は出現しないことを示す。
【０１１１】
（実施例８）
（エンハンサーの精製）
エンハンサーを、以下のようにＢ−３００８７ブロス全体から半精製した。これは、アニオン交換樹脂、アセトニトリル沈殿およびサイズ排除クロマトグラフィーでの４３５ｍＬブロス全体の処理によって、半精製した。このブロス全体を遠心分離して細胞を除去し、そして１４．５ｇアニオン樹脂（ＡＧ１−Ｘ８、１００〜２００メッシュ、アセテート形態）を上清に添加し、そして混合物を１分間振盪した。これを５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、そして上清をデカントし、そして次の工程にて使用した。アセトニトリルを上清に添加して、５０％溶液を得、そしてこれを１分間振盪し、そして５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。下部の暗褐色層が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンハンサーを含んだ。
【０１１２】
上記からのこの褐色の層を、さらにサイズ排除クロマトグラフィーによって二工程で精製した。最初に、１３０ｇのＰ−２樹脂（ＢｉｏＲａｄ）をカラム２．５ｃｍ×８０ｃｍを充填するためにミリＱ脱イオン水で膨潤させた。褐色の層を、約４×、回転エバポレーターを使用して濃縮し、１５ｍｌの濃縮物をＰ２カラムに置いた。このカラムを、重力下でＭＱ水を用いて溶出し、そして１０分の画分を１２時間集めた（２８０ｎｍでのＵＶ検出、吸収範囲２．０、１０ｍＶ）。画分２６〜２８のさらなる精製を、回転エバポレーターを使用して画分を３×まで濃縮し、そしてこれらをもとのＰ２カラムに適用することによって行った。カラムをＭＱ水を用いて溶出した。１０分の画分を最初の８０分間集め、次いで、２分の画分を次の２時間集めた。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンハンサー活性は、画分１６〜２０で溶出した（２２０ｎｍでのＵＶ検出、吸収範囲２．０、１０ｍＶ）。
【０１１３】
（実施例９）
エンハンサーの化学的特徴は、ツヴィッターマイシンＡとは異なる。
【０１１４】
本発明のエンハンサーは、キャピラリー電気泳動においてツヴィッターマイシンＡとは異なることが示された。Ｂ−３００８７のブロス全体は、ダイズ粉、ブドウ糖、酵母抽出物、ＫＨ2ＰＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4、ＮａＣｌおよびＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏを含むＢａｃｉｌｌｕｓ培養培地で増殖された。画線培養を使用して２５０ｍｌ振盪フラスコに播種した。フラスコを２１０ｒｐｍ、３０℃、４日間振盪した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｂ−３００８７ブロス全体を、精製したツヴィッターマイシンＡを加え、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を行った。３０μＬのＢ−３００８７ブロス全体を、１０μＬツヴィッターマイシンＡを加えた。Ｂ−３００８７ブロス全体（図３Ａ）、Ｂ−３００８７ブロス全体およびツヴィッターマイシンＡ（図３Ｂ）ならびにツヴィッターマイシンＡのみ（図３Ｃ）を、ｐＨ５．８のリン酸ナトリウム緩衝液を使用してＣＥで電気泳動を行った。ＣＥの電気泳動図が図４に示される。
【０１１５】
ツヴィッターマイシンＡおよびＢ−３００８７半精製エンハンサーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、Ｄ2Ｏ中、４００ＭＨｚで記録した。スペクトルは、エンハンサーがツヴィッターマイシンＡとは異なることを示す。
【０１１６】
（実施例１０）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを用いる殺虫性増強の決定
Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ増強を、シロイチモンジヨトウ（ｂｅｅｔ ａｒｍｙ ｗｏｒｍ）（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）相乗アッセイにおける試験によって、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７のブロス全体を使用して示した。アッセイを９６ウェルマイクロプレートで行った。各ウェルは固体寒天基質を含んだ。２０μＬのＢ−３００８７ブロス全体を、バイオアッセイにおいて、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｊａｖｅｌｉｎ（０．２５〜１．５０μｇ／ウェル）の市販の調製物を用いて試験した。Ｊａｖｅｌｉｎ濃縮物のみの一連の希釈物を、同様に行った。
【０１１７】
殺虫活性をアッセイするために、寒天基質を、Ｍａｒｒｏｎｅら、（１９８５）、Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．７８：２９０−２９３に従ってマイクロプレートのウェルに対して調製した。脱イオン水を、ネガティブコントロールとして使用した。試験サンプルまたはコントロールの２つの複製を各アッセイのために使用した。次いで、プレートを換気フード内におき、約２〜３時間乾燥させた。
【０１１８】
１〜３匹のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａの第１齢（ｆｉｒｓｔ ｉｎｓｔａｒ）幼虫を各ウェルに加えた。マイクロプレートをＭｙｌａｒ（登録商標）のような気密な物質を用いて密封し、そして各ウェルをピン圧力によって通気した。プレートを２７℃で７日間までインキュベートした。
【０１１９】
インキュベーション後、ウェルを、新生児死亡率または幼虫の発達の程度に注意することによってスコア付した。死亡した幼虫の数を記録した。発育阻止された幼虫を１〜４の評点でスコア付した。発育阻止スコアは、以下である：４＝コントロールサイズ；３＝コントロールサイズの７５％；２＝コントロールサイズの５０％；１＝コントロールサイズの２５％。結果を以下の表９に要約する。
【０１２０】
【表９】
第２の試験を、上記手順を使用して行った。結果を以下の表１０に要約する。
【０１２１】
【表１０】
半精製画分の殺虫増強性質を決定するために、サンプルを上記にように、０．１μｇ／ウェルＪａｖｅｌｉｎを使用して試験し、そして４０μｌ／ウェルの画分を試験した。結果を以下の表１１に示す。
【０１２２】
【表１１】
（実施例１１）
Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ（Ｂ−３００８７）およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｂ−２１６６１）を殺真菌剤として一緒に使用した。
【０１２３】
Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、ＮＲＲＬ Ｂ−３００８７の菌株を、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＮＲＲＬ Ｂ−２１６６１を用いて試験し、一緒に使用した場合、それぞれの菌株が単独で使用された場合よりも殺真菌効果が大きいか否かを決定した。各菌株を、１０リットルまたは５，０００リットルの発酵槽において、ダイズ粉ベースの培地中で約５０時間増殖させた。各菌株を、コショウ上のＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ灰色カビ菌、およびＢｒａｓｓｉｃａ上のＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａべと病菌に対するブロス培養物全体として試験した。ブロス全体を、１×、１／２×および１／８×で試験した。次いで、２つの菌株を、１／２×、１／４×、および１／８×にて互いに種々の組み合わせで試験した。水チェック（コントロール）および化学殺真菌剤（２０ｐｐｍのＢＲＥＡＫ（登録商標））もまた比較のために試験した。植物を０〜５のスケールに基づいてスコア付した（ここで、５＝１００％疾患、制御なし；および０＝１００％制御、疾患なし）。この結果は以下の表１２に示される。
【０１２４】
【表１２】
Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ試験結果は、菌株が単独で使用される場合と比較した、その菌株が組み合わせて使用される場合の統計的な差を示す。例えば、Ｂ−２１６６１ １／４×およびＢ−３００８７ １／２×についてのスコア０．７は、単独で使用されたＢ−２１６６１ １／４×についてのスコア１．２とは統計的に異なる。また、Ｂ−２１６６１ １／８×およびＢ−３００８７ １／２×のスコア１．４は、Ｂ−２１６６１ １／８×のみについてのスコア１．７またはＢ−３００８７ １／２×のみについてのスコア２．３とは統計的に異なる。一緒のスコアは、単独で使用される各菌株についての予期される平均よりも低い。これは、殺菌剤としての効力の増加について一緒に菌株を使用することの相乗効果を示す。
【０１２５】
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ試験結果は、Ｂ−２１６６１ １／８×およびＢ−３００８７ １／２×の組み合わせについてのスコアが、添加効果から予期されるよりもはるかに良いことを示す。スコア２．０５は、菌株の組合せからの添加効果のみが存在する場合、予期される。しかし、実際のスコアは、０．３であり、これは、組み合わせて菌株を使用することによる明確な相乗効果が存在することを示す。他のスコアもまた、予期される結果よりも良いことを示し、例えば、Ｂ−２１６６１ １／４×およびＢ−３００８７ １／４×が、スコア０．５を有し、これは、個々の菌株の添加効果のみから予想される（２．３５の推定されるスコア）よりもずっと良い。この同じ相乗作用はまた、Ｂ−２１６６１ １／２×およびＢ−３００８７ １／２×（スコア０．３）、Ｂ−２１６６１ １／２×およびＢ−３００８７ １／４×（スコア０．３）、ならびにＢ−２１６６１ １／２×およびＢ−３００８７ １／８×（スコア０．５）の組み合わせにおいて示される。これらの試験は、菌株を組み合わせて使用する場合、相乗効果が存在し、そして予期されない効果が存在することを示す。
【０１２６】
本発明が上記実施形態とともに記載されているが、先の記載および実施例は、例示を意図し、本発明の範囲を限定しないことが理解される。本発明の範囲内の他の局面、利点および改変は、本発明が関係する当業者に明らかである。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
この出願は、１９９９年３月３０日に提出された米国特許出願番号第０９／２８１，３６０号の一部係属出願、および１９９９年１２月１４日に提出された米国特許出願番号第０９／４６１，７００号の一部継続出願であり、これらの内容は本明細書中において本開示の参考文献に組み込まれる。
【０００２】
（本発明の分野）
本発明は、バイオ農薬の分野である。より具体的には、本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓの新規菌株、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号は、インビボで広い範囲の真菌による植物の病気を阻害し得るという発見に関連する。本発明はまた、この新規Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌株、および抗生物質およびこの菌株の精製および未精製画分を単独で、または他の化学的および生物学的農薬と組み合せて含む殺真菌性の組成物に関連する。本発明はさらに、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号とＮＲＲＬ登録番号Ｂ−２１６６１号、（ＣＣＲＣ９１０１０６）を共に用いた相乗的な殺真菌効果に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
一般的に、様々な微生物が植物の疾患を制御するのに有用な生物学的活性を示すことが知られている。作物学および園芸学的に重要な様々な植物の病気を制御することが、生物学的農薬を同定および開発する分野において進歩したが、使用されているほとんどの農薬は未だ合成化合物である。これら化学的殺真菌剤の多くは、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ（ＥＰＡ）によって発癌性物質として分類され、そして野生生物および他の非標的種に対して毒性である。それに加えて、病原体は化学的農薬に対して抵抗性を発達させ得る。例えば、非特許文献１を参照のこと。
【０００４】
生物学的な制御は、合成化学的殺真菌剤の魅力的な代替を提供する。バイオ農薬（生存生物体およびこれら生物体によって産生される天然に産生された化合物）はより安全で、より生物分解性で、そして開発するのがより安価であり得る。
【０００５】
通常使用されるバイオ農薬の１つは、グラム陽性細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓである。農薬性Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株は、胞子形成の間に結晶性タンパク質を産生することが知られており、それは特定の状態および特定の種の昆虫および線虫に特に毒性である（例えば米国特許第４，９９９，１９２号、および米国特許第５，２０８，０１７号を参照のこと）。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓによって産生されるタンパク質様のエンドトキシンはまた、キュウリヒゲナガハムシ属の数種のハムシおよび他の甲虫に対する殺虫剤として作用する（例えば、米国特許第５，１８７，０９号および非特許文献２）。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンドトキシンは、精製結晶、洗浄細胞ペレット、および発現したタンパク質として有効であることが示された。Ｗａｒｒｅｎら、第ＷＯ９６／１００８３号は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓおよびＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの生長期の間に産生される非エンドトキシンタンパク質を開示している。Ｖｉｐ１およびＶｉｐ２と呼ばれるこれらの生長期タンパク質は、キュウリヒゲナガハムシ属の数種のハムシ（北部および西部）に対して強力な活性を有する。例えば、非特許文献３を参照のこと。
【０００６】
ベータ外毒素と呼ばれる１つのＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの熱安定性代謝物も、農薬の性質を有することが示された。非特許文献４は、コロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）に対して活性であるベータ外毒素を報告している。それに加えて、公知のＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのベータ外毒素は、線虫だけでなく、ハエ、ガの幼虫、ダニ、およびキュウリヒゲナガハムシ属の数種のハムシを殺す、非特異的な農薬活性を示す。シグマ外毒素は、ベータ外毒素と類似の構造を有し、そしてコロラドハムシに対して活性である。非特許文献５を参照のこと。アルファ外毒素は、Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａの幼生に毒性である（非特許文献６）。ガンマ外毒素は、種々のタンパク質溶解酵素、キチナーゼ、およびプロテアーゼである。ガンマ外毒素の毒性効果は、ベータ外毒素またはデルタエンドトキシンと組み合せてのみ発現される。Ｆｏｒｓｂｅｒｇ，Ｃ．、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ：Ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ Ｑｕａｌｉｔｙ」 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｃａｎａｄａ、公開番号第ＮＲＣＣ１５３８５号、９１〜１０９頁（１９７６）を参照のこと。非特許文献７は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ菌株の上清における、キュウリヒゲナガハムシ属の数種のハムシに対して活性な、水溶性の２次代謝物を報告している。
【０００７】
ツヴィッターマイシン（ｚｗｉｔｔｅｒｍｉｃｉｎ）Ａは、多くの真菌および細菌性の植物病原体に対して広いスペクトルの活性を有する、水溶性の酸に安定な直鎖状アミノポリオール分子である（非特許文献８を参照のこと）。ツヴィッターマイシンＡはまた、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの活性を増強することが知られている。Ｍａｎｋｅｒら（ＷＯ９６／３９０３７号）が、最初にツヴィッターマイシンＡのＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ−増強能力および性質を決定した。続いて、Ｓｃｈｎｅｐｆらもまた、ツヴィッターマイシンＡがＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを増強することを報告した（米国特許第５，７０２，７０３号）。
【０００８】
バチルスは、抗真菌および抗細菌性の２次代謝物を産生することが知られている。非特許文献９、および非特許文献１０を参照のこと。Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓによって産生される化合物は、ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉｎ Ｐ、ｐｕｍｉｌｉｎ、およびｔｅｔａｉｎを含む。
【０００９】
Ｋａｗａｇｕｃｈｉらは、米国特許第４，２５０，１７０号において、Ｂａｃｉｌｌｕｓから、広い範囲のグラム陽性およびグラム陰性細菌に対する活性を有する、新規水溶性抗生物質を単離した。非特許文献１１は、抗真菌活性を示す特定のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを含む）菌株を同定した。これらの菌株は、ツヴィッターマイシンＡおよび／またはカノサミン（ｋａｎｏｓａｍｉｎｅ）を産生することが示された。非特許文献１２を参照のこと。これらは、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｒａ ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ｐ．ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍまたはＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｍｉｎｏｒによって起こる、土壌伝播性の病気である立枯れ病に対して有効である抗生物質である（非特許文献１１、前出を参照のこと）。ツヴィッターマイシンＡは、水溶性の、酸に安定な直鎖状アミノポリオール分子である。非特許文献８を参照のこと。それは多くの真菌および細菌性植物病原体に対して広いスペクトルの活性を有する。カノサミン（Ｍｉｌｎｅｒら、１９９６）もまた、広い範囲の真菌性植物病原体および少数の細菌種を阻害する。
【００１０】
Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎらは、米国特許第５，０４９，３７９号において、ツヴィッターマイシンＡ−産生Ｂ．ｃｅｒｅｕｓが、アルファルファおよびダイズの立枯れ病を制御する方法を記載している。種がＢ．ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ５３５２２でコートされた場合、根腐れ真菌の病原性活性が阻害された。同様に、特定のＢ．ｃｅｒｅｕｓ菌株の胞子に基づく処方を、ダイズの種または種の周りの土壌に適用すると、畑でのダイズの収量が改善されることが示された。非特許文献１３を参照のこと。バイオ農薬の適用方法は、当該分野で周知であり、そして例えば微生物の可溶性の粉末、乾燥流動可能性（ｆｌｏｗａｂｌｅｓ）、マイクロカプセル封入、および液体処方、適当な培養物からの培養液全体または抗生物質画分を含む。例えば、Ｒｏｓｓａｌｌの米国特許第５，０６１，４９５号、およびＨａｎｄｅｌｓｍａｎの米国特許第５，０４９，３７９号を参照のこと。
【００１１】
非特許文献１４は、インビトロにおいて広い範囲の細菌に対する活性を有する、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ由来の新規アミノ糖抗生物質を報告している。
【００１２】
Ｋｈｍｅｌ，Ｉ．Ａ．ら（１９９５）は、ＳＵ１８１７８７５において、真菌性の植物病原体および細菌を制御するのに使用される、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓの新規菌株ＶＫＭ ＣＲ−３３３Ｄを開示している。
【００１３】
非特許文献１５は、２つのＢａｃｉｌｌｕｓ菌株、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＣＬ２７およびＢ．ｐｕｍｉｌｕｓ ＣＬ４５による、抗Ｂｏｔｒｙｔｉｓおよび抗Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ抗生物質の産生を報告している。培養液全体および細胞がない濾液が、インビトロにおける試験でＢｏｔｒｙｔｉｓおよびＡｌｔｅｒｎａｒｉａに対して活性であり、そしてＡｓｔｉｌｂｅに対するインビボ小植物試験においてＢｏｔｒｙｔｉｓに対して活性である。Ｌｅｉｆｅｒｔら（１９９７）米国特許第５，５９７，５６５号は、収穫後の病気を引き起こす真菌、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａおよびＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａを阻害するのに特に有効な、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、およびＢ．ｐｏｌｙｍｙｘａを開示している。彼らはまた、細胞がない培養濾液において産生された抗生物質の存在、および異なるｐＨ値でのその活性を開示しているが、彼らはこれらの化合物を同定していない。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の化合物は、低いｐＨで活性を失うが、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ抽出物由来の活性は、５．６より低いｐＨ値でのみ起こる。Ｌｅｉｆｅｒｔら（１９９８）米国特許第５，７８０，０８０号は、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａおよびＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａを阻害するために、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、およびＢ．ｐｏｌｙｍｙｘａ菌株で治療し得るキャベツを開示している。
【００１４】
非特許文献１６は、抗真菌および抗細菌活性を有する種々の抗生物質を産生するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、およびＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ菌株を開示している。Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓはｂａｃｉｌｙｓｉｎおよびｉｔｕｒｉｎ Ａを産生した。ｂａｃｉｌｙｓｉｎは、分子量２７０の非常に小さい化合物であり、酵母のみを阻害する。ｉｔｕｒｉｎは、極性溶媒に可溶性であり、広い抗真菌および抗細菌活性を有する。
【００１５】
米国特許第５，３４４，６４７号において、Ｒｏｓｓａｌｌは、広い抗真菌活性を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株を開示している。さらに、Ｒｏｓｓａｌｌの米国特許第５，０６１，４９５号は、６３，５００ダルトン、５より低いｐＨで沈殿し、そしてグラム陽性細菌および真菌（ＢｏｔｒｙｔｉｓおよびＥｒｙｓｉｐｈｅ）に対して活性を有する、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の新規抗生物質を提供する。非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０、および非特許文献２１。全てＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの、真菌植物病原体の生物学的制御薬剤としての使用を開示している。非特許文献２２、Ｐｕｓｅｙら、米国特許第５，０４７，２３９号、および非特許文献２３は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを用いた収穫後の果実腐敗の制御を開示している。Ｍｃｋｅｅｎら、前出は、低分子量ｉｔｕｒｉｎ環状ポリペプチドと類似の抗生物質が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのこの殺真菌活性に寄与していることを示した。
【００１６】
Ｌｉｕらは、米国特許第５，４０３，５８３号において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．（ＡＴＣＣ ５５０００）および真菌植物病原体、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉを制御する方法を開示している。非特許文献２４は、コメの褐色斑点（ｒｉｃｅ ｂｒｏｗｎ ｓｐｏｔ）の原因であるＤｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｏｒｙｚａｅに拮抗するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．を開示している。同じ著者ら、非特許文献２５はまた、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｏｒｙｚａｅ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍに対するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．のインビトロにおける拮抗を開示している。彼らは、培養濾液中の３つの成分について議論している。最も活性な抗生物質は、水およびメタノールに高度に可溶性であり、２５５ｎｍにＵＶピーク、および２６０ｎｍに肩を有し、ポリオキシン様のリポペプチドであることが証明された。非特許文献２６は、ワタの根腐れの原因であるＰｈｙｍａｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｍｎｉｖｏｒｕｍによって死滅するワタの数を抑制するための、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．の懸濁液の使用を開示している。
【００１７】
非特許文献２７は、線虫捕獲真菌を刺激してその線虫を捕獲する能力を増加させるＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓについて報告している。非特許文献２８は、真菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）およびカンキツ属で感染を引き起こす線虫の細胞相互作用を論じている。その真菌はＢ．ｐｕｍｉｌｕｓと結合しており（それらは共に存在する）、そして線虫もそこに存在する場合、真菌はより重症である。Ｂ．ｐｕｍｍｉｌｕｓは、線虫の食料を供給しているようである。非特許文献２９は、抗線虫薬であるＢ．ｐｕｍｉｌｕｓについて報告しているが、彼らは抗真菌活性を報告していない。非特許文献３０は、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓを含む多くの異なるＢａｃｉｌｌｕｓを、キチナーゼを産生する能力に関して比較しているが、彼らは植物病原体に対する活性は報告していない。Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓは、最も低いキチナーゼレベルを産生する。非特許文献３１は、植物の幹および根中の内生植物である、多くのＢａｃｉｌｌｕｓおよびＢ．ｐｕｍｉｌｕｓを含む多くの型の細菌を調査した。しかし、彼らは、これらの内生植物菌株が抗真菌性であるという証拠は示していない。Ｃｈｅｒｎｉｎら（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓは、植物の疾患を引き起こす細菌（例えばＸａｎｔｈｏｍａｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ）および真菌に対する広いスペクトルの活性を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓを発見した。Ｆｅｙら（１９９１）Ａｋａｄ Ｌａｎｄｗｉｒｔｓ Ｋａｒｔは、種イモをＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉからある程度守るＢ．ｐｕｍｉｌｕｓ菌株について報告している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｓｃｈｗｉｎｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、Ｔｈｅ Ｃａｕｓｅ ｏｆ Ｌａｔｅ Ｂｌｉｇｈｔ ｏｆ Ｐｏｔａｔｏ、２４４頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９１）
【非特許文献２】Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．ら（１９９３）、Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．、８６：３３０−３３３
【非特許文献３】Ｅｓｔｒｕｃｈら（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１３７−１４１
【非特許文献４】ＢｕｒｇｊｅｒｏｎおよびＢｉａｃｈｅ（１９７９）、Ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ １１：２７９−２８４
【非特許文献５】Ａｒｇａｕｅｒら（１９９１）、Ｊ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．２６：２０６−２１３
【非特許文献６】Ｃｌｕｔｈｙ（１９８０）、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．８：１−７
【非特許文献７】Ｓｔｏｎａｒｄら（１９９４）、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５５１：２５
【非特許文献８】Ｈｅら（１９９４）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３５（１６）：２４９９−２５０２
【非特許文献９】Ｋｏｒｚｙｂｓｋｉら、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ科（バチルス科）から単離された抗生物質」、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−Ｏｒｉｇｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．第ＩＩＩ巻（１９７８）
【非特許文献１０】Ｂｅｒｄｙ、ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、第Ｉ−ＸＩＶ巻、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９８０−８７）
【非特許文献１１】Ｓｔａｂｂら（１９９０）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：４４０４−４４１２
【非特許文献１２】Ｍｉｌｎｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．６２：３０６１−３０６６（１９９６）
【非特許文献１３】Ｏｓｂｕｒｎｅら（１９９５）Ａｍ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．Ｓｏｃ．７９（６）：５５１−５５６
【非特許文献１４】Ｔｓｕｎｏら（１９８６）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ＸＸＸＩＸ（７）：１００１−１００３
【非特許文献１５】Ｌｅｉｆｅｒｔら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７８：９７−１０８（１９９５）
【非特許文献１６】Ｌｏｅｆｆｌｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ １１５：２０４−２１３
【非特許文献１７】Ｓｈｏｌｂｅｒｇら（１９９５）Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：２４７−２５２
【非特許文献１８】Ｓｗｉｎｂｕｒｎｅら（１９７５）Ｔｒａｎｓ．Ｂｒｉｔ．Ｍｙｃｏｌ．Ｓｏｃ．６５：２１１−２１７
【非特許文献１９】ＳｉｎｇｈおよびＤｅｖｅｒａｌｌ（１９８４）Ｔｒａｎｓ．Ｂｒ．Ｍｙｃｏｌ．Ｓｏｃ．８３：４８７−４９０
【非特許文献２０】Ｆｅｒｒｅｉｒａら（１９９１）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８１：２８３−２８７
【非特許文献２１】Ｂａｋｅｒら（１９８３）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ７３：１１４８−１１５２
【非特許文献２２】Ｐｕｓｅｙら（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓ．７２：６２２−６２６
【非特許文献２３】ＭｃＫｅｅｎら（１９８６）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ７６：１３６−１３９
【非特許文献２４】ＩｓｌａｍおよびＮａｎｄｉ（１９８５）Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓ．Ｐｒｏｔｅｃｔ．９２（３）：２４１−２４６
【非特許文献２５】ＩｓｌａｍおよびＮａｎｄｉ（１９８５）Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓ．Ｐｒｏｔｅｃｔ．９２（３）：２３３−２４０
【非特許文献２６】Ｃｏｏｋら（１９８７）Ｂｅｌｔｗｉｄｅ Ｃｏｔｔｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ、４３−４５頁
【非特許文献２７】Ｂ’ＣｈｉｒおよびＮａｍｏｕｃｈｉ（１９８８）Ｒｅｖｕｅ Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｉｑｕｅ １１（２）：２６３−２６６
【非特許文献２８】Ｂ’ＣｈｉｒおよびＢｅｌｋａｄｈｉ（１９８６）Ｍｅｄ．Ｆａｃ．Ｌａｎｄｂｏｕｗｗ．Ｒｉｊｋｓｕｎｉｖ．Ｇｅｎｔ ５１／３ｂ：１２９５−１３１０
【非特許文献２９】ＧｏｋｔｅおよびＳｗａｒｕｐ（１９８８）Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｎｅｍａｔｏｌ．１８（２）：３１３−３１８
【非特許文献３０】Ｓｌａｂｏｓｐｉｔｓｋａｙａら（１９９２）Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ Ｚｈ（Ｋｉｅｖ）５４（６）：１６−２２
【非特許文献３１】ＭｃＩｎｒｏｙら（１９９５）Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｓｏｉｌ １７３（２）：３３７−３４２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（本発明の開示）
特定の特異的な植物病原体に対してのみ抗真菌活性を示し、そして抗細菌活性を示さない、新規抗生物質産生Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．が提供される。有効な量の抗生物質産生Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．を適用する工程を含む、真菌の感染から植物、果実および根を処置または保護する方法も提供される。抗生物質産生Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．は、培養液全体の懸濁液として、または抗生物質産生Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．の培養液全体から得た、部分的に精製された抗生物質を含む上清として提供され得る。特異的な抗真菌活性を示し、そして抗細菌活性を示さない新規水溶性抗生物質も提供される。
【００２０】
本発明はまた、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強する新規化合物も提供する。その化合物は、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓの培養液全体または上清から単離され、そしてＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓと組み合せた場合、その殺虫活性を増強する。本発明はまた、Ｂａｃｉｌｌｕｓの細菌懸濁液またはＢａｃｉｌｌｕｓの培養液の代謝物を含む上清または精製した代謝物を用いて、植物の上、または中への昆虫の侵入を制御するための植物を治療する方法を含む。
【００２１】
本発明はさらに、殺真菌剤として使用するために菌株Ｂ−３００８７と菌株Ｂ−２１６６１（ＡＱ７１３）の組み合せを提供する。ここでその菌株を共に使用することは、いずれかを単独で使用する場合よりも高い有効性を提供する。
【００２２】
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１） 殺真菌活性を有する、ＮＲＲＬ番号Ｂ−３００８７と命名されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ菌株、またはその変異体の、全ての同定す特徴を有する菌株の生物学的に純粋な培養物。
（項目２） ＮＲＲＬ番号Ｂ−３００８７と命名されたＢａｃｉｌｌｕｓ
ｐｕｍｉｌｕｓ菌株の生物学的に純粋な培養物。
（項目３） 項目１に記載の生物学的に純粋な培養物と担体とを含む組成物。
（項目４） 組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、および乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、項目１に記載の組成物。
（項目５） 殺真菌活性を有する、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７と命名されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ菌株、またはその変異体の、全ての同定する特徴を有する菌株の生物学的に純粋な培養物から分離される、単離された代謝物。
（項目６） 殺真菌活性を有する、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７と命名されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ菌株、またはその変異体の、全ての同定する特徴を有する菌株の生物学的に純粋な培養物から分離される上清。
（項目７） 項目６に記載の上清から分離される、部分的に精製された画分。
（項目８） 項目５に記載の代謝物と担体とを含む、組成物。
（項目９） 項目６に記載の上清と担体とを含む、組成物。
（項目１０） 項目７に記載の部分的に精製された画分と担体とを含む、組成物。
（項目１１） 組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、項目８に記載の組成物。
（項目１２） 組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、項目９に記載の組成物。
（項目１３） 組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、項目１０に記載の組成物。
（項目１４） 項目１に記載の代謝物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目１５） 項目６に記載の上清の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目１６） 項目７に記載の部分的に精製された画分の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目１７） 項目８に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目１８） 項目９に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目１９） 項目１０に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目２０） 項目１１に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目２１） 項目１２に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目２２） 項目１３に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目２３） 前記真菌感染が、Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅ；Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ；Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒおよびＵｒｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｓｅｏｌｉからなる群から選択される少なくとも１つの微生物によって引き起こされる、項目１７に記載の方法。
（項目２４） 前記真菌感染が、Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅ；Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ；Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒおよびＵｒｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｓｅｏｌｉからなる群から選択される少なくとも１つの微生物によって引き起こされる、項目１８に記載の方法。
（項目２５） 前記真菌感染が、Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅ；Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ；Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒおよびＵｒｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｓｅｏｌｉからなる群から選択される少なくとも１つの微生物によって引き起こされる、項目１９に記載の方法。
（項目２６） 前記真菌感染が、Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅ；Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ；Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒおよびＵｒｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｓｅｏｌｉからなる群から選択される少なくとも１つの微生物によって引き起こされる、項目２０に記載の方法。
（項目２７） 前記真菌感染が、Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅ；Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ；Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒおよびＵｒｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｓｅｏｌｉからなる群から選択される少なくとも１つの微生物によって引き起こされる、項目２１または２２に記載の方法。
（項目２８） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬を含む、項目１に記載の組成物。
（項目２９） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬を含む、項目７に記載の組成物
（項目３０） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬を含む、項目８に記載の組成物
（項目３１） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬の有効量を施用する工程をさらに包含する、項目１４に記載の方法。
（項目３２） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬の有効量を施用する工程をさらに包含する、項目１５に記載の方法。
（項目３３） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬の有効量を施用する工程をさらに包含する、項目１７に記載の方法。
（項目３４） ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の生物学的に純粋な培養を増殖させる工程、および上清から抗真菌性代謝物を単離する工程を包含する、抗真菌上清の生成のためのプロセス。
（項目３５） 項目３４に記載の上清の部分的精製のためのプロセスであって、該プロセスが該上清を分画する工程、および該画分に対してバイオアッセイを行って抗真菌画分を同定する工程を包含する、プロセス。
（項目３６） 項目３４に記載のプロセスによって生成された上清。
（項目３７） 前記画分が、植物病原性真菌に対する活性を示し、水性画分中に見いだされ、わずかに熱に対して不安定であり、酸／塩基およびプロテアーゼに対して安定であり、正に荷電し、そして１０，０００ダルトン未満の分子量を有する、項目７に記載の部分的に精製された画分。
（項目３８） 前記代謝物が、植物病原性真菌に対する活性を示し、水性画分中に見いだされ、わずかに熱に対して不安定であり、酸／塩基およびプロテアーゼに対して安定であり、正に荷電し、そして１０，０００ダルトン未満の分子量を有する、項目５に記載の単離された代謝物。
（項目３９） 水溶性化合物であって、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強し、そして該化合物の分子量が１０，０００ダルトン未満であり、かつ該化合物がツヴィッターマイシンＡではない、化合物。
（項目４０） さらにＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを含む、項目３９に記載の化合物。
（項目４１） 項目３９に記載の化合物と担体とを含む、組成物。
（項目４２） 項目４０に記載の組成物と担体とを含む、組成物。
（項目４３） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓが、微生物菌株、市販製品、遺伝子工学で作られた植物またはデルタエンドトキシンの形態である、項目４０に記載の組成物。
（項目４４） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬をさらに含む、項目４０〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４５） 組成物が、水和剤、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される処方物である、項目４４に記載の組成物。
（項目４６） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強し、かつツヴィッターマイシンＡまたはβ−外毒素ではないＢａｃｉｌｌｕｓの、ブロス培養物全体の部分的に精製された画分。
（項目４７） ＢａｃｉｌｌｕｓがＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓである、項目４６に記載の部分的に精製された画分。
（項目４８） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓが、ＮＲＲＬ登録番号ＮＲＲＬ Ｂ−３００８７の下に寄託されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓである、項目４７に記載の部分的に精製された画分。
（項目４９） 項目４６〜４８のいずれか一項に記載の画分と担体とを含む、組成物。
（項目５０） さらにＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを含む、項目４６〜４９のいずれか一項に記載の画分。
（項目５１） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓが、微生物菌株、市販製品、遺伝子工学で作られた植物またはデルタエンドトキシンの形態である、項目５０に記載の画分。
（項目５２） 項目４９に記載の組成物およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓとを含む、組成物。
（項目５３） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬をさらに含む、項目４６〜４８のいずれか一項に記載の画分。
（項目５４） 組成物が、水和剤、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される処方物である、項目４９に記載の組成物。
（項目５５） 組成物が、水和剤、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される処方物である、項目５２に記載の組成物。
（項目５６） 組成物が、水和剤、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される処方物である、項目５３に記載の組成物。
（項目５７） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強するための方法であって、項目３９に記載の化合物の有効量を植物または根に、そしてＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの有効量を該植物または根に施用する工程を包含する、方法。
（項目５８） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強する方法であって、項目４６に記載の化合物の有効量を植物または根に、そしてＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの有効量を該植物または根に施用する工程を包含する、方法。
（項目５９） 植物または根を昆虫の侵襲から保護または処置するための方法であって、項目４０に記載の化合物の有効量を植物または根に施用する工程を包含する、方法。
（項目６０） 植物または根を昆虫の侵襲から保護または処置するための方法であって、項目４４に記載の組成物の有効量を植物または根に施用する工程を包含する、方法。
（項目６１） 植物または根を昆虫の侵襲から保護または処置するための方法であって、項目５０に記載の画分の有効量を植物または根に施用する工程を包含する、方法。
（項目６２） 植物または根を昆虫の侵襲から保護または処置するための方法であって、項目５２に記載の組成物の有効量を植物または根に施用する工程を包含する、方法。
（項目６３） 植物または根を昆虫の侵襲から保護または処置するための方法であって、項目５３に記載の画分の有効量を植物または根に施用する工程を包含する、方法。
（項目６４） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬をさらに含む、項目５１に記載の方法。
（項目６５） 少なくとも１つの化学的または生物学的農薬をさらに含む、項目４９または５０に記載の方法。
（項目６６） ａ）ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７と命名されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ菌株、またはその変異体の、全ての同定する特徴を有する菌株のブロス培養物全体；および
ｂ）ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−２１６６１と命名されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株、またはその変異体の、全ての同定する特徴を有する菌株のブロス培養物全体、
を含む組成物であって、該菌株は相乗的な殺真菌活性を有する、組成物。
（項目６７） 前記殺真菌活性が、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａに対する、項目６６に記載の組成物。
（項目６８） 前記菌株が、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−２１６６１およびＢ−３００８７について１：２の比率で組み合わされる、項目６６に記載の組成物。
（項目６９） 前記菌株が、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−２１６６１およびＢ−３００８７について１：４の比率で組み合わされる、項目６６に記載の組成物。
（項目７０） 前記菌株が、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａまたはＰｅｒｅｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａに対して、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−２１６６１およびＢ−３００８７について１：２の比率で組み合わされる、項目６６に記載の組成物。
（項目７１） 前記菌株が、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａまたはＰｅｒｅｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａに対して、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−２１６６１およびＢ−３００８７について１：４の比率で組み合わされる、項目６６に記載の組成物。
（項目７２） 項目６６に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目７３） 項目６７に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目７４） 項目６８に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目７５） 項目６９に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目７６） 項目７０に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目７７） 項目７１に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
（項目７８） 項目６６に記載の培養物から分離される、上清。
（項目７９） 項目７８に記載の上清と担体とを含む、組成物。
（項目８０） 組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、項目７９に記載の組成物。
（項目８１） 少なくとも１つの生物学的または化学的殺虫剤をさらに含む、項目６６に記載の組成物。
（項目８２） 少なくとも１つの生物学的または化学的殺虫剤をさらに含む、項目７９に記載の組成物。
（項目８３） 組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、項目８１に記載の組成物。
（項目８４） 組成物が、水和剤、顆粒、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物、およびマイクロカプセル化処方物からなる群から処方される、項目８２に記載の組成物。
（項目８５） 項目６９に記載の組成物の有効量を施用する工程を包含する、植物、根または果実を真菌感染から予防または処置するための方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号で寄託された、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．の部分的に精製した殺真菌性画分の、Ｄ2Ｏ中４００ＭＨｚで記録したＮＭＲスペクトルである。
【図２】図２は、Ｄ2Ｏ中４００ＭＨｚで記録した、ツヴィッターマイシンＡの1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、実施例９で記載されたようにＢａｃｉｌｌｕｓから単離された上清のキャピラリー電気泳動図である。電気泳動の条件は：コートされていない５６ｃｍのキャピラリーを４０Ｃ、３０ｋＶ、陽性の極性、ｐＨ５．８のリン酸ナトリウム緩衝液で１００μＡ、２００ｎｍでのＵＶ検出で使用した。図３Ａは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ Ｂ−３００８７の培養液全体のキャピラリー電気泳動図である。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｃは、実施例９で記載されたようにＢａｃｉｌｌｕｓから単離された上清のキャピラリー電気泳動図である。電気泳動の条件は：コートされていない５６ｃｍのキャピラリーを４０Ｃ、３０ｋＶ、陽性の極性、ｐＨ５．８のリン酸ナトリウム緩衝液で１００μＡ、２００ｎｍでのＵＶ検出で使用した。図３Ｂは、ツヴィッターマイシンＡスタンダードを加えたＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ Ｂ−３００８７の培養液全体のキャピラリー電気泳動図である。ツヴィッターマイシンＡのピークは３．２５分の実行時間付近に現れ、培養液全体のいずれのピークとも共に溶出しない。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、実施例９で記載されたようにＢａｃｉｌｌｕｓから単離された上清のキャピラリー電気泳動図である。電気泳動の条件は：コートされていない５６ｃｍのキャピラリーを４０Ｃ、３０ｋＶ、陽性の極性、ｐＨ５．８のリン酸ナトリウム緩衝液で１００μＡ、２００ｎｍでのＵＶ検出で使用した。図３Ｃは、約３．２８分の実行時間におけるツヴィッターマイシンＡスタンダードを示す。
【図４Ａ】図４は、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号単独の部分的に精製した画分（図４Ａ）、ツヴィッターマイシンＡを含むＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号の部分的に精製した画分（図４Ｂ）、およびツヴィッターマイシンＡ単独（図４Ｃ）のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分析からの、３つの電気泳動図を比較する。
【図４Ｂ】図４は、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号単独の部分的に精製した画分（図４Ａ）、ツヴィッターマイシンＡを含むＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号の部分的に精製した画分（図４Ｂ）、およびツヴィッターマイシンＡ単独（図４Ｃ）のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分析からの、３つの電気泳動図を比較する。
【図４Ｃ】図４は、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号単独の部分的に精製した画分（図４Ａ）、ツヴィッターマイシンＡを含むＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号の部分的に精製した画分（図４Ｂ）、およびツヴィッターマイシンＡ単独（図４Ｃ）のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分析からの、３つの電気泳動図を比較する。
【図５】図５は、Ｄ2Ｏ中４００ＭＨｚで記録した、Ｂ−３００８７から単離したＢ＋エンハンサーとしての活性を有する、部分的に精製した活性画分の1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（本発明の実施方法）
本発明は、サビ菌、ウドンコ病菌、およびべと病菌のような、特定の植物病原体に対してのみ抗真菌活性を有する、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．の新規菌株およびその変異体または改変体の、全ての識別する特徴を有する菌株の生物学的に純粋な培養物を提供する。このＢ．ｐｕｍｉｌｕｓの新規菌株は、１９９９年１月１４日に、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、１８１５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ Ｉｌｌ、６１６０４、ＵＳＡに供託され、そして特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定のもとに、受け入れ番号第ＮＲＲＬ Ｂ−３００８７号を与えられた。ＮＲＲＬ Ｂ−２１６６１号と呼ばれる菌株が、同じ組織に１９９７年３月７日に供託された。それはその後Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）によってＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓとして同定された。
【００２５】
本発明はまた、そのような細菌菌株、またはそのような細菌菌株から得た抗生物質を含む上清または純粋な抗生物質を用いて、植物の根を含む植物における真菌性の病気を予防および治療する方法も含む。本発明はまた、１０，０００ダルトンより小さい分子量を有し、わずかに熱不安定性、陽性に荷電、そしてＵＶ吸収によるＨＰＬＣピークが２８０ｎｍで最大、そして２３０ｎｍに肩がある、水溶性抗真菌性抗生物質も含む。その抗生物質はツヴィッターマイシンＡではない。
【００２６】
本発明のさらなる局面は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓと組み合せた場合にＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強する、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓの培養液全体または上清を含む。本発明はまた、Ｂａｃｉｌｌｕｓの細菌懸濁液、またはＢａｃｉｌｌｕｓの培養物の代謝物を含む上清、または精製した代謝物を用いて、植物の上または中への昆虫の侵入を制御するために、植物を治療する方法を含む。
【００２７】
本発明のさらなる局面は、殺真菌剤としてＢ．ｐｕｍｉｌｕｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−３００８７）とＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−２１６６１）の菌株を組み合せて使用することの、予想外の相乗効果である。本発明はその組成物およびそれらを殺真菌剤として用いる方法を含む。
【００２８】
（定義）
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に文脈が明らかに指図しなければ、複数の表示を含む。例えば、「ａ ｃｅｌｌ」という用語は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「含む」という用語は、その組成物および方法は、列挙した成分を含むが、他を除外しないことを意味するように意図される。「本質的に〜からなる」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、その組み合せに本質的に重要な他の成分を除外することを意味する。従って、本質的に本明細書中で定義されたような要素からなる組成物は、単離および精製方法からの痕跡混入物および、リン酸緩衝化生理食塩水、保存剤等のような薬剤学的に許容できる担体を除外しない。「〜からなる」は、他の成分および本発明の組成物を投与する重要な方法工程の痕跡要素以上のものを除外することを意味する。これら変化（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）用語のそれぞれによって定義された実施形態は、本発明の範囲内である。
【００３０】
「単離された」という用語は、「生物学的に純粋な」と交換可能に使用され、そしてその菌株または代謝物が通常天然に結合している成分、細胞および他から分離されたことを意味する。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「生物学的制御」は、２番目の生物体を用いることによる、病原体または昆虫の制御として定義される。生物学的制御の公知のメカニズムは、根の表面の空間に関して真菌をアウトコンピーティング（ｏｕｔ−ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ）することによって根腐れを制御する腸の細菌を含む。抗生物質のような細菌の毒素が、病原体を制御するために使用されてきた。その毒素を、単離および植物に直接適用し得、またはインサイチュで毒素を産生するように細菌種を投与し得る。
【００３２】
「真菌（ｆｕｎｇｕｓ）」または「真菌（ｆｕｎｇｉ）」という用語は、クロロフィルを欠く、広範に種々の有核の胞子を有する生物体を含む。真菌の例は、酵母、カビ、ウドンコ病、錆菌類、およびキノコを含む。
【００３３】
「細菌」という用語は、明確な核を有さないあらゆる原核生物を含む。
【００３４】
「殺真菌性」は、真菌の死亡率を増加させる、または増殖速度を阻害する物質の能力を意味する。
【００３５】
「抗生物質」は、微生物を殺すまたは阻害することができるあらゆる物質を含む。抗生物質は、微生物によって、または合成過程によって、もしくは半合成過程によって産生され得る。従って、その用語は、真菌を阻害するまたは殺す物質、例えばツヴィッターマイシンＡまたはカノサミンを含む。
【００３６】
「抗真菌剤」は、真菌を殺すまたは増殖を阻害できるあらゆる物質を含む。
【００３７】
「培養」という用語は、様々な種類の培地上または中での生物体の増殖を指す。
【００３８】
「ブロス培養物全体」とは、細胞および培地を両方含む液体培地をいう。
【００３９】
「上清」とは、培養液中で増殖した細胞を遠心、ろ過、沈降、または当該分野で周知の他の方法によって除去した場合に残る液体培養液をいう。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「昆虫」という用語は、「昆虫綱」の全ての生物体を含む。「前成虫」昆虫とは、例えば卵、幼生、および若虫を含む、成虫期より前のあらゆる形態の生物体を指す。「殺虫性」とは、昆虫の死亡率を増加させる、または増殖速度を阻害する物質の能力をいう。「抗線虫性」とは、線虫の死亡率を増加させるか、または増殖速度を阻害する物質の能力をいう。「農薬の」は、昆虫、線虫、およびダニの死亡率を増加させるまたは増殖速度を阻害する物質の能力をいう。
【００４１】
「ポジティブコントロール」は、農薬活性を有することが知られている化合物を意味する。「ポジティブコントロール」は、市販で入手可能な化学的農薬を含むがこれに限らない。「ネガティブコントロール」という用語は、農薬活性を有さないことが公知の化合物を意味する。ネガティブコントロールの例は、水または酢酸エチルである。
【００４２】
「溶媒」という用語は、溶液中に別の物質を保持するあらゆる液体を含む。「溶媒抽出可能」とは、溶媒に溶解し、そして次いで溶媒から単離し得るあらゆる化合物をいう。溶媒の例は、酢酸エチルのような有機溶媒を含むがこれに限らない。
【００４３】
「代謝物」という用語は、農薬活性を有する微生物の発酵のあらゆる化合物、物質または副産物を指す。上記で定義した抗生物質は、微生物に対して特に活性な代謝物である。
【００４４】
「組成物」は、活性薬剤および、不活性（例えば検出可能な薬剤または標識）、またはアジュバントのように活性な、別の化合物または組成物との組み合せを意味することを意図する。
【００４５】
「画分」は、上清の分子を大きさ、極性、または電荷によって分離するために使用される分画アッセイからのアリコートを意味することを意図する。
【００４６】
「部分的に精製した画分」は、バイオアッセイで発芽を阻害、またはｌｅｐｉｏｌｏｐｌａｕｓに対するＢ＋活性を増強し得る、分画アッセイで回収されたアリコートの１つである。
【００４７】
「有効な量」は、有益なまたは望ましい結果を得るのに十分な量である。有効な量を、１つ以上の用途において適用し得る。治療および防御に関して、「有効な量」は、昆虫の外寄生の進行を改善、安定化、逆行、遅延（ｓｌｏｗ）、または遅延（ｄｅｌａｙ）させるのに十分な量である。
【００４８】
本発明者らは、特定の植物病原体にのみ抗真菌活性を有し、そして抗細菌活性を有さない、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号で寄託されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．の新規抗生物質産生菌株、およびその変異体の、全ての同定する性質を有する菌株の生物学的に純粋な培養を記載する。１つの局面において、その菌株はＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号で寄託されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、およびその菌株の変異体である。
【００４９】
他の局面では、その菌株は、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号で寄託された菌株の全ての同定する性質（下記で提供されるような）を有する、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号の変異体または改変体である。変異体または改変体は、本開示中で相互交換可能に使用され、そしてさらに、高いストリンジェンシーの条件下でＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号のゲノムとハイブリダイズするゲノムを有するものとして同定され得る。「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化される複合体を形成する反応をいう。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対形成、フーグスティーン結合、またはあらゆる他の配列特異的な様式によって起こり得る。その複合体は、二本鎖構造を形成する２本の鎖、複数鎖の複合体を形成する３本以上の鎖、１本の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらのあらゆる組み合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行い得る。一般的に、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、１０×ＳＳＣ中約４０℃で、または同等のイオン強度／温度の溶液で行われる。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、代表的には６×ＳＳＣ中約５０℃で、そして高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、一般的に１×ＳＳＣ中約６０℃で行われる。
【００５０】
ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号の変異体または改変体はまた、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号のゲノムと、８５％より多い、より好ましくは９０％より多い、またはより好ましくは９５％より多い配列が同一であるゲノム配列を有する菌株として定義され得る。ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）が、別の配列に対して特定の割合（例えば８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を有することは、整列した場合、２つの配列を比較してその塩基（またはアミノ酸）の割合が同一であることを意味する。この整列および相同性の割合または配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム、例えばＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）補遺３０、第７．７．１８節、表７．７．１で記載されているものを用いて決定し得る。好ましくは、整列のためにデフォルトパラメーターを使用する。好ましい整列プログラムは、デフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝コード＝標準；フィルター＝無し；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予期＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；分類＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複性、Ｇｅｎｂａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細を、以下のインターネットアドレスにおいて見出し得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００５１】
本発明はさらに、上記で述べた培養から得た上清を提供する。その上清を、遠心；ろ過；沈降等を含む、当該分野で周知の方法によって得ることができる。
【００５２】
別の局面において、本発明は、水溶性抗真菌性抗生物質である単離された代謝物を含む。その代謝物は、本発明の菌株から単離され、そして上記で記載される。それは、特定の植物病原体に対して活性を有するが細菌には活性を有さず、１０，０００ダルトンより小さい、ＵＶ吸収のピークが２８０ｎｍ、および肩が２３０ｎｍ、酸および塩基に安定、８０℃より上でわずかに熱不安定性、そして陽性に荷電した化学的性質を有する。本発明はさらに、この代謝物を産生する過程、本発明の菌株を培養する工程、および下記で記載する方法を用いて活性代謝物を単離する工程を包含する方法を提供する。
【００５３】
本発明のさらなる局面は、殺真菌活性を有する、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号の、部分的に精製された活性画分である。活性画分は、ツヴィッターマイシンＡと同一ではない。
【００５４】
本発明によってさらに、あらゆる上記の菌株（その変異体または改変体を含む）、上清、画分および代謝物を、単独または、お互いにおよび担体と組み合せて含む組成物が提供される。これらの組成物は、さらに少なくとも１つの化学的または生物学的農薬を加えることによって補充され得る。これらの組成物は、水和剤、顆粒処方、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物（ｅｍｕｌｓｉｆｉａｂｌｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）またはマイクロカプセル化を含むがこれらに限定されない、種々の処方の形態を取り得る。
【００５５】
本発明の範囲内で組成物のよい分散および接着を達成するために、培養液全体、上清、画分および／または代謝物／抗生物質を、分散および接着を助ける成分とともに処方することが有利であり得る。よって、適当な処方が当業者に公知である（水和剤、顆粒等、または適当な媒体等中にマイクロカプセル化され得る処方、液体（例えば水性の流動可能物（ｆｌｏｗａｂｌｅｓ）および水性懸濁液）ならびに乳化可能な濃縮物）。他の適当な処方が、当業者に公知である。
【００５６】
上記で述べたあらゆる菌株、代謝物、画分、上清およびこれら活性成分を含む組成物を、植物、根または果実を真菌感染から処置または保護する方法を提供するために使用し得る。その方法は、有効な量の菌株、代謝物、画分、上清またはこれら活性成分を含む組成物を、単独で、またはお互いにおよび／または他の生物学的または化学的農薬と組み合せて、感染した根、植物、または果実に適用することを含む。有効な量のこれら組成物をまた、そのような外寄生を予防するために、植物、根、または果実に適用し得る。
【００５７】
さらなる局面において、本発明は、新規菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号の同定する性質を全て有する菌株またはその改変体によって産生された、有効な量の抗生物質を適用することを含む、真菌性の病気から植物、根、または果実を処置または保護する方法を含む。１つの実施形態において、その菌株はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号である。
【００５８】
本発明はさらに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強する、水溶性化合物を提供する。ここでその化合物は、１０，０００ダルトン未満の分子量を有し、そしてその化合物はツヴィッターマイシンＡではない。その化合物は、ベータ外毒素または他のＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ産生外毒素ではない。
【００５９】
その化合物を、陰イオン交換樹脂、アセトニトリル沈殿、およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって単離する。本発明はまた、その新規化合物を含むＢａｃｉｌｌｕｓの上清の、部分的に精製された画分を提供する。その新規化合物および活性画分を、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ、およびＢ．ｐｕｍｉｌｕｓを含むがこれに限らないＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．の群から選択されるＢａｃｉｌｌｕｓから単離し得る。
【００６０】
当該分野の化学者（ｃｈｅｍｉｓｔ ｓｋｉｌｌｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｒｔ）が、化合物が完全に精製されたかどうか決定することを可能にする、その1ＨＮＭＲ（またはプロトンＮＭＲ）スペクトルによって、部分的に精製された活性画分を同定し得る。化合物が純粋な場合、１つのプロトンを示すピークが１の任意の値に統合する。次いで、２つのプロトン、例えばメチレン基を示すピークは、２の値に統合する。３つのプロトン、例えばメチル基を示すピークは、３に統合する。これは図３、純粋なツヴィッターマイシンＡスタンダードの場合である。しかし、活性な部分的に精製されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンハンサーの1Ｈ ＮＭＲスペクトルは、１より小さく統合するピークの群を有し、そして従ってスペクトル中のより大きなピーク由来の、別の化合物に属する。
【００６１】
単離において、その化合物は殺虫活性を示さない。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓとの組み合せが、植物および植物の根に適用した場合にＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫効果を増強する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓは、微生物菌株、市販製品、遺伝子工学で作られた植物（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｌａｎｔ）、殺虫的に活性な代謝物、殺虫的に活性な上清またはデルタエンドトキシンの形態であり得る。
【００６２】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓは、パラ胞子（ｐａｒａｓｐｏｒａｌ）結晶性タンパク質を含むことによって特徴付けられる、グラム陽性、胞子形成細菌である。そのタンパク質は、害虫に対して高度に毒性であり得、そしてその毒性活性において特異的であり得る。上記の特許請求の範囲で使用される場合、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ」という用語は、微生物菌株、そのような菌株またはその菌株から単離された活性代謝物または画分を含む単離物を含む市販製品、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫性タンパク質または遺伝子産物またはデルタエンドトキシンをコードする遺伝子を発現する、遺伝的に改変された、または遺伝子操作された植物を含む。毒素遺伝子が単離および配列決定され、そして組換えＤＮＡに基づくＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ産物が産生および使用が認可された。遺伝子工学技術および、これらのＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンドトキシンを農業環境に伝達する新しいアプローチが、開発中であり、そして商業生産されている。これらは、害虫抵抗性のためにエンドトキシン遺伝子を用いて遺伝子操作された植物の使用、および安定化したインタクトな微生物細胞の、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンドトキシン伝達媒体としての使用を含む（Ｇａｅｒｔｎｅｒら（１９８８）ＴＩＢＴＥＣＨ ６：Ｓ４−Ｓ７）。標的害虫を、天然に毒素を発現する野生型Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓに曝露することによって、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを、標的害虫に対して使用可能にし得る。あるいは、望ましい毒素をコードする遺伝子を、適当な組換え宿主中で形質転換および発現させ得る。殺虫活性を保持するＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素のフラグメントも使用し得る。
【００６３】
以下の米国特許は、農薬性のＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ単離物またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素を発現する組換え微生物を開示している：米国特許第５，００６，３３５号；同第５，１０６，６２０号；同第５，０４５，４６９号；同第５，１３５，８６７号；同第４，９９０，３３２号；同第５，１６４，１８０号；同第５，１２６，１３３号；同第５，０９３，１１９号；同第５，２０８，０１７号；同第５，１８６，９３４号；同第５，１８５，１４８号；同第５，２１１，９４６号；同第４，９４８，７３４号；同第４，８４９，２１７号；同第４，９９６，１５５号；同第４，９９９，１９２号；同第４，９６６，７６５号；同第５，０７３，６３２号；同第５，１９６，３４２号；同第５，０６３，０５５号；同第５，０８０，８９７号；同第５，０２４，８３７号；同第５，１４７，６４０号；同第５，１７３，４０９号；および同第５，１８６，９３４号。
【００６４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｋｕｒｓｔａｋｉの胞子および結晶の調製物が、鱗翅目害虫に対する市販の農薬として、長年使用されてきた。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｖａｒ．ｋｕｒｓｔａｋｉ ＨＤ−１は、多くの鱗翅目昆虫の幼生に対して毒性である、デルタエンドトキシンと呼ばれる結晶を産生する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのさらなる種、すなわちｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓおよびｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓが、昆虫を制御するために市販で使用されてきた。
【００６５】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ結晶タンパク質遺伝子のクローニングおよび発現は、Ｓｃｈｎｅｐｆ，Ｈ．ら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２８９３−２８９７において記載された。米国特許第４，４４８，８８５号、および米国特許第４，４６７，０３６号はいずれも、Ｅ．ｃｏｌｉにおける結晶タンパク質の発現を開示している。増加した毒性を示し、そして標的害虫に対する拡大した宿主範囲を示す、ハイブリッドＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ結晶タンパク質遺伝子が構築された。米国特許第５，１２８，１３０号、および同第５，０５５，２９４号を参照のこと。米国特許第４，７９７，２７６号および第４，８５３，３３１号は、様々な環境において鞘翅目害虫を制御するために使用し得る、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（Ｂ．ｔ．ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓとしても知られる、Ｍ−７としても知られる）を開示している。米国特許第４，９１８，００６号は、双翅類に対する活性を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを開示している。米国特許第４，８４９，２１７号は、アルファルファゾウリムシに対する活性を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ単離物を開示している。米国特許第５，１５１，３６３号および米国特許第４，９４８，７３４号は、線虫に対する活性を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの特定の単離物を開示している。
【００６６】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ培養物はまた、Ｂｒｏｗｎｓｖｉｌｌｅ、Ｔｅｘ．のＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＵＳＤＡ）から入手可能である。依頼は、ＵＳＤＡ、ＡＲＳ、Ｃｏｔｔｏｎ Ｉｎｓｅｃｔｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｕｎｉｔ、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１０３３、Ｂｒｏｗｎｓｖｉｌｌｅ、Ｔｅｘ．７８５２０ ＵＳＡ、またはＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、１８１５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌ．ＵＳＡに対してなされるべきである。
【００６７】
従って、その化合物および活性画分は、線虫、ハエ、ガの幼虫、ダニ、コロラドハムシ、トウモロコシの根を食べる昆虫の幼虫を含むがこれに限らない昆虫に対するＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強する。
【００６８】
当業者に周知であるように、その活性成分を、組成物の形態で適用し得る。よって、本発明はまた、新規化合物および溶媒または農業的に適当なキャリアのようなキャリアを含む組成物を提供する。さらなる実施形態において、組成物はさらに、上記で記載したような有効な量のＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを含む。またさらなる実施形態において、組成物は、当該分野で伝統的に使用されているような、少なくとも１つの化学的または生物学的農薬を含む。本発明の範囲内で組成物のよい分散および接着を達成するために、培養液全体、上清および／または代謝物を、分散および接着を助ける成分と共に処方することが有利であり得る。植物または植物の根への適用を容易にするために、その処方は、水和剤、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物およびマイクロカプセル化処方からなる群から選択される処方へ処理され得る。
【００６９】
新規化合物、活性画分、またはそれらを含む組成物を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強するために使用し得る。従って、本発明はまた、有効な増強量の新規化合物、活性画分またはそれらを含む組成物を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓと組み合わせることによって、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫活性を増強する方法を提供する。さらなる局面において、有効な量の少なくとも１つのバイオ農薬または化学的農薬をその処方に加える。
【００７０】
本発明はさらに、殺真菌剤として使用するために、培養液全体として植物、根、または果実に適用する、新規化合物ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３００８７号をＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−２１６６１号と組み合わせて使用することを含み、その殺真菌剤は化合物の組み合せの予期しない相乗効果の結果として、より強力な効果を有する。より好ましくは、その組み合せは、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａまたはＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａに対して１：２（Ｂ−２１６６１：Ｂ−３００８７）の比で適用される。さらにより好ましくは、その組み合せはＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａまたはＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａに対して１：４の比で適用される。またさらなる実施形態において、組成物は当該分野で伝統的に使用されるような、少なくとも１つの化学的または生物学的農薬を含む。本発明の範囲内で組成物のよい分散および接着を達成するために、培養液全体、上清および／または代謝物を、分散および接着を助ける成分と共に処方することが有利であり得る。植物または植物の根への適用を容易にするために、その処方は、水和剤、水性懸濁液、乳化可能な濃縮物およびマイクロカプセル化処方からなる群から選択される処方へ処理され得る。
【００７１】
本開示を通して、種々の出版物、特許および公開された特許明細書が、識別する引用によって言及される。これらの出版物、特許および公開された特許明細書の開示は、これによって本発明が属する技術分野の状態をより充分に説明するために本開示に参考として援用される。
【実施例】
【００７２】
以下の実施例は、本発明を例示することを意図するが、限定することは意図されない。
【００７３】
（実施例１）
（菌株ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の特徴づけ）
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７を、メチルエステルへと誘導体化した全細胞の細胞性脂肪酸−ＦＡＭＳに基づいて同定し（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｔ．（１９８２）「Ｓｉｎｇｌｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒｏｕｔｉｎｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｈｙｄｒｏｘｙ ａｃｉｄｓ」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：５８４〜５８６）、そしてＭＩＤＩシステム（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）を使用するガスクロマトグラフィーにより分析した。細菌培養物を増殖するために使用される手順およびプロトコル、ならびに装置仕様は、ＭＩＤＩにより記載されている（細胞性脂肪酸のガスクロマトグラフィーによる細菌の同定。Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｎｏｔｅ＃１０１．ＭＩＤＩ，Ｉｎｃ．、１１５ Ｂａｒｋｓｄａｌｅ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）。単離物をＴＳＡ（ＢＢＬ）プレート上で２８℃にて２４時間増殖させ、そして細胞を収集した。１ｍｌのメタノール性ＮａＯＨ（５０％（容量／容量）メタノール中１５％（重量／容量）ＮａＯＨ）を添加し、そして細胞を１００℃にて３０分間けん化した。脂肪酸のエステル化を、４６％（容量／容量）メタノール中３．２５Ｎ ＨＣｌ ２ｍｌを８０℃にて１０分間用いて実施した。ＦＡＭＥを、１：１（容量／容量）メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル−ヘキサン１．２５ｍｌ中に抽出し、そしてその有機抽出物を、３ｍｌの１．２％（重量／容量）ＮａＯＨで洗浄し、その後、ガスクロマトグラフィーにより分析した。このガスクロマトグラフ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ５８９０Ａ）は、水素炎イオン化検出器およびキャピラリーカラム（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １９０９１Ｂ−１０２、架橋型５％フェニルメチルシリコン；２５ｍ×０．２２ｍｍ内径；フィルム厚０．３３ １ｌｍ；相比１５０）を備え、水素をキャリアガスとして用いた。Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ３３９２積分器が自動的にＦＡＭＥピークを積分した。そして細菌単離物を、ＭＩＤＩ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｈｅｒｌｏｃｋ ＴＳＢＡ Ｌｉｂｒａｒｙ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．８０）を使用して命名した。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌａ ＡＴＣＣ １３６３７のＦＡＭＥプロフィールを、ＭＩＤＩ決定のための参照チェックとして使用した。
【００７４】
別個の３連のＭＩＤＩプロフィールの結果は、類似性指標スコア０．８７５にて、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７をＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓとして同定した。
【００７５】
（実施例２）
（インビトロ培養における植物病原体に対するＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の活性（ゾーンアッセイ））
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７が広範囲の植物病原性真菌に対して有効であるか否かを決定するために、以下の実験を、以下のこれらの植物病原体を使用して実施した：Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ａｃｕｔａｔｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｏｐｈｙｌｕｍ、Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ、Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｔａｐｈｒｉｎａ ｄｅｆｏｒｍａｎｓおよびＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ。
【００７６】
寒天拡散（ゾーン）アッセイにおいてＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の活性を決定するために、植物病原体胞子（胞子は、ペトリ皿の表面から掻き落とし、そして約１×１０5胞子／ｍｌ（病原体に依存する）に希釈した）を、１０ｃｍペトリ皿中のジャガイモデキストロース寒天の表面上にスプレッディングした。Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉおよびＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍについては、胞子の代わりに菌糸断片をプレート上にスプレッディングした。約７．０ｍｍの環状ウェルを寒天から除去し、そして２５０ｍｌ振盪フラスコ中でダイズ、酵母抽出物培地にて７２時間増殖させたＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の上清１２５ ｌサンプルを、ウェル中に配置した。
【００７７】
上清を、１２，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離することによって調製した。代表的な結果は、ウェルの周囲の、増殖していない病原体のゾーンおよび／または増殖が減少した病原体のゾーンからなり得るか、あるいは全くゾーンが存在しない状態からなり得る。ゾーンのサイズをミリメートルにて測定し、そしてゾーンが存在するか否かを記録した。結果を、下記の表１に示す。
【００７８】
【表１】
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７上清は、ゾーン試験においてほとんどの真菌性植物病原体に対して活性を示さなかった。
【００７９】
（実施例３）
（細菌性植物病原体に対するＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の活性）
標準的寒天拡散アッセイを、実施例２のように設定した。各細菌病原体のローンを、ジャガイモデキストロース寒天の表面上にスプレッディングした。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７上清の１２５ ｌのサンプルを、上記のように各ウェルに配置した。ゾーンの存在またはゾーンのサイズを、ミリメートルにて測定した。
【００８０】
【表２】
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７は、インビトロにて試験した細菌性植物病原体のいかなる種に対しても活性ではなかった。
【００８１】
(実施例４）
（植物試験における植物病原体に対するＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の活性）
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の活性を、マメサビ菌Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｓｅｏｌｉに対してサヤマメにおいて、そして灰色カビ菌Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａに対してコショウ植物において、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉに対してトマト植物において、そしてレタスのべと病菌Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅに対して；アブラナのべと病菌に対して、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａに対して、トマトの疫病Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓに対して、そしてブドウウドン粉病菌Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒに対して、試験した。
【００８２】
（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ）
病原体Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉを、ＰＤＡを含む標準的ペトリ皿（１０ｃｍ）上で増殖させた。真菌コロニーをプレートから切断し、そして胞子形成培地（１ｌの滅菌水あたり、２０ｇスクロース、３０ｇ炭酸カルシウム、および２０ｇ寒天）上に配置した。滅菌水を菌糸ブロックを部分的に覆うようにプレートに添加し、そしてプレートを２２〜２６℃にて２日間、１４時間の光周期でインキュベートする。菌糸ブロックをビーカーの滅菌水中に掻き落とすことによって胞子を収集する。胞子懸濁物を、２×１０4胞
子／ｍｌに調整する。
【００８３】
２インチポットに植えそして平箱に配置した３〜４葉齢のトマト種子（ＵＣ８２−Ｂ）に、２５０ｍｌ振盪フラスコにおいて７２時間ダイズ粉末、酵母抽出物培地にて増殖させたＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７のブロス全体を、画家用エアブラシ（ａｒｔｉｓｔｓ ａｉｒ ｂｒｕｓｈ）を用いて噴霧して溢れ出させた（ｒｕｎｏｆｆ）。噴霧後、実生を最低２時間乾燥させた。接種された実生を２２℃のＰｅｒｃｉｖａｌ露チャンバ（ｄｅｗ ｃｈａｍｂｅｒ）にて、限定はしないが最初の４０時間配置した。各平箱中の植物をプラスチックドームで覆い、そして１４時間の光周期で、Ｐｅｒｃｉｖａｌインキュベーターにて２０〜２２℃で４８時間維持した。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７を含まず病原体の胞子を含む水、ならびにＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７を含まず病原体の胞子を含まない水を、ネガティブコントロールおよびポジティブ病原体コントロールとして使用した。また、化学殺真菌剤（例えば、Ａｚｏｘｙｓｔｒｏｂｉｎ、Ａｂｏｕｎｄ（登録商標））を、１００〜２５０ｐｐｍの率にて比較のために使用した。植物を、０〜５のスケールにスコア付けした。ここで、５は、１００％感染であり、そして０は症状が存在しない。水Ａ．ｓｏｌａｎｉコントロールにおいて、すべての葉にわたって均一な病変が存在し、そして子葉が剥離し、そして重篤に感染した（評点５＝完全感染、制御なし）。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７で処理した植物は、水コントロールと異ならないように見えた。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７による病原体の制御は存在しなかった（これもまた、評点５）。ネガティブコントロールは感染しなかった。化学処理した植物は、０と１との間のスコアを有した。
【００８４】
（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）
病原体Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａを、ＰＤＡを含む標準的ペトリ皿（１０ｃｍ）上で増殖させ、そして胞子を、麦芽（０．５ｇ／Ｌ）および酵母抽出物（０．５ｇ／Ｌ）を補充したジャガイモデキストロースブロス（ＰＤＢ）を使用して収集し、そして１×１０6胞子／ｍｌに調整した。使用した植物は、３〜５本葉期まで２インチポットにて生長させたコショウ（Ｙｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒ）であった。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７および病原体の適用は、上記と同じであった。ポットが入った平箱を、限定しないが２０℃一定にてインキュベートした。この平箱をプラスチックドームで覆い、そして胞子形成するまで２．５日間（６０〜６５時間）放置した。
【００８５】
化学殺真菌剤（例えば、Ｉｐｒｏｄｉｏｎｅ、Ｒｏｖｒａｌ（登録商標））を、２０〜１００ｐｐｍの率で比較のために使用した。植物を、０〜５のスケールにてスコア付けした。ここで、５は、１００％感染であり、そして０は症状が存在しない。水Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａコントロールにおいて、すべての葉にわたって均一な病変が存在した（評点５＝完全感染、制御なし）。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７で処理した植物は、水コントロールと異ならないように見えた。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７による病原体の制御は存在しなかった（これもまた、評点５）。ネガティブコントロールは感染しなかった。化学処理した植物は、０と１との間のスコアを有した。
【００８６】
（Ｂｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅ）
Ｂｒｅｍｉａ試験について、レタス種子を、約８センチメートルの高さおよび正方形である小さく透明なプラスチックの植物箱において、ピート、パーライトおよびバーミキュライトを含む滅菌培養土混合物の層に植えた。植付けの１週間後、レタス実生に、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロスまたは上清サンプルを噴霧した。この植物を乾燥させ、次いで感染したレタス実生から収集したべと病菌胞子懸濁物（２×１０4胞子／ｍｌ）を
実生に噴霧した。Ａｌｉｅｔｔｅ（ｆｏｓｅｔｙｌ−ａｌ）およびＲｉｄｏｍｉ（ｍｅｔａｌａｘｙｌ）からなる化学物質スタンダードもまた、適用した。しかし、これらの試験において使用したＢｒｅｍｉａ ｌａｃｔｕｃａｅの単離物は、商業的に使用されるこれらの２つの化学物質スタンダードに非感受性であることが以前に示された。プラスチックの箱をきつくフィットするフタで覆い、そして制限しないが１６時間Ｐｅｒｃｉｖａｌインキュベーターにて１５〜１６℃にてインキュベートした。次いで、プラスチックの箱を６日間、光の下で室温（２０〜２６℃）に配置した。実生の覆いを取り、水を噴霧し、再び覆い、そして胞子形成が生じるように１５〜１６℃にて一晩インキュベーターに戻した。レタスべと病菌の化学物質耐性菌に対するＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の効果を、下記表３に示す。
【００８７】
【表３】
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７は、レタスべと病菌に対する優れた活性を有し、種子において病原体の胞子形成がほとんどないかまたは全くなかったが、コントロール（水チェック）植物は、べと病菌により完全に胞子形成された。化学物質スタンダードは、病原体を効果的には制御しなかった。
【００８８】
（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌株ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７を、２５０ｍｌ振盪フラスコにて、上記のように増殖させた。１×強度のブロス培養物全体を、完全子葉期の１週齢のカリフラワー植物または芽キャベツ植物に、圧縮空気を動力源とする画家用エアーブラシを用いて噴霧した。１処理あたり３連の１５〜２５実生／ポットに噴霧した。１〜５×１０4胞子／ｍｌのべと病菌Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａの胞子懸濁物を、まずＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７を適用した後に、Ｂｒａｓｓｉｃａ植物に噴霧した。Ａｌｉｅｔｔｅ（ｆｏｓｅｔｙｌ−ａｌ）およびＲｉｄｏｍｉｌ（ｍｅｔａｌａｘｙｌ）からなる化学物質スタンダードもまた、適用した。しかし、これらの試験において使用したＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａの単離物は、商業的に使用されるこれら２つの化学物質スタンダードに非感受性であることが以前に示された。
【００８９】
感染のために植物を１５〜１７℃で１６時間保持し、次いで実生を２０〜２４℃で６日間インキュベートした。病原体の胞子形成が生じるように、ポットを１５〜１７℃に一晩戻した。各植物を、０〜５のスケールに基づいて疾患制御パーセントを評価することによって、評価した。評点０は、胞子形成病変を伴わない植物である。レプリカポットすべてにわたって平均した結果を、以下表４に示す。
【００９０】
【表４】
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７は、未処理チェックおよび化学物質スタンダードと比較した場合に、より有効にＢｒａｓｓｉｃａべと病菌を制御した。
【００９１】
（Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒ）
ブドウ実生（Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ）を、６〜９本葉期まで２インチポットにて生長させた。ウドン粉病菌の培養物を、１４時間光周期のもとで２２〜２６℃にてブドウ実生上に維持した。ほとんど最も若い２〜４つの葉を除去する。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７、化学殺真菌剤（Ｒａｌｌｙ（登録商標）、２５ｐｐｍのミクロブタニル（ｍｙｃｌｏｂｕｔａｎｉｌ））および水チェックを、試験した他の病原体についての上記の通りに、適用して溢れ出させる。４〜５つのレプリカを、各処理に使用する。ウドン粉病菌を接種するために、維持実生（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｓｅｅｄｉｎｇ）上にカビを有する葉をかみそりで除去し、そして各植物に個別に接種する。維持実生の表面を絵の具刷毛でおだやかにブラッシングして、胞子が試験植物の上側表面上に堆積するようにする。この手順は、すべての植物が等価な接種物を得るのを確実にするように、ライト付３×拡大レンズを使用して実施する。ポットが入った平箱を、２０〜２４℃にて１６〜２４時間暗所に配置する。平箱を、試験を判断するまでさらに９〜１１日間、１４時間の光周期で２２〜２６℃に維持する。上記のように、植物に、０〜５のスコアを与える。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７を使用する結果を、以下の表５に示す。
【００９２】
【表５】
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７は、未処理チェックと比較して有効に、そして化学物質スタンダードＲａｌｌｙとほとんど同様に、Ｕｎｃｉｎｕｌａウドン粉病菌を制御した。
【００９３】
（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）
トマト疫病Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓの試験を、２インチ四方のプラスチックポットにて生長させた４〜６本葉期のトマト実生（ＵＣ８２−Ｂ）を使用して実施した。以前に記載されたように増殖させたＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の適用を、トマト実生に行った。Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓの接種物を、ライムギ種子寒天上に増殖した胞子形成コロニーを掻き落とし、そして０．７×１０4〜１．０×１０4胞子嚢／ｍｌの間に接種濃度を調整することによって、生成した。Ａ．ｓｏｌａｎｉ試験について上記した通りに正確に、接種した実生を平箱中に配置し、そしてインキュベートした。実生を、０〜５スケールにて評価した。Ｑｕａｄｒｉｓ（登録商標）（アゾキシストロビン（ａｚｏｘｙｓｔｒｏｂｉｎ））を、６２．５〜１２５ｐｐｍの率にて、比較のために使用した。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７を使用する結果を、以下の表６に示す。
【００９４】
【表６】
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７は、接種の４日後に、化学物質スタンダードＱｕａｄｒｉｓとほぼ同様に、疫病を制御した。
【００９５】
（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｓｅｏｌｉ）
マメサビ菌Ｕ．ｐｈａｓｅｏｌｉの試験を、第一葉が３／４拡大するまで、サヤマメ実生（供給者の変種）を使用して実行した。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の適用を、他の宿主／病原体の組み合わせについて以前に記載した通りに実行した。サビ病病原体の接種物を、−２０℃のバイアル中に乾燥サビ菌胞子として貯蔵した。接種物を、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む水に乾燥サビ菌胞子を添加することにより調製し、そして少なくとも１時間磁気攪拌器上で激しく攪拌した。接種物を、２×１０5〜４×１０5胞子／ｍｌに調整する。第一葉に接種し、そして実生を平箱中に配置し、そしてＰｅｒｃｉｖａｌ露チャンバにて２０℃にて一晩インキュベートする。次いで実生を、室温（２０〜２６℃）でさらに８〜１０日間インキュベートする。実生を、存在する胞子形成サビ菌いぼの発生率および重篤度に基づいて、０〜５のスケールにて評価する。
【００９６】
化学殺真菌剤Ｂｒｅａｋ（登録商標）（プロピコナゾール）を、４０ｐｐｍの率で比較のために使用した。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロス全体を使用する結果を、以下表７に示す。
【００９７】
【表７】
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７は、マメサビ菌を、化学物質スタンダードＢｒｅａｋ（登録商標）とほぼ同様に制御した。
【００９８】
（実施例５）
（ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７により生成される抗真菌代謝産物）
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７のブロス全体を、酢酸エチル画分、ブタノール画分、および水性画分に分割した。各画分を、胞子発芽アッセイにおいてキンギョソウサビ菌に対して試験した。キンギョソウサビ菌胞子を、４０ ｌのサンプルおよび２０ ｌの病原体胞子を含む、凹部付き（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）顕微鏡スライドにて各サンプルの存在下で発芽させた。約１６時間後、胞子を顕微鏡下で観察して、胞子が発芽したかを観察する。水コントロール（１００％発芽および増殖＝スコア５）と比較しての発芽なし（スコア０）は、試験するサンプルの活性を示す。異なるＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７画分を用いたサビ菌発芽アッセイの結果を、以下表８に示す（上記のような０〜５の評点に基づくスコア）。
【００９９】
【表８】
代謝産物は、明らかに水可溶性画分中にあり、そしてブタノールまたは酢酸エチル中に容易には抽出可能ではない。
【０１００】
この代謝産物の他の特徴を決定した。この分子は、１０，０００分子量カットオフフィルターを通ることが示された。このことは、この代謝産物が１０，０００ダルトン未満であることを示す。この活性は、プロテアーゼでの処理後に失われず、酸で処理した場合でも塩基で処理した場合でも失われなかった。この活性は、８０℃まで１時間加熱した際にわずかに失われた（キンギョソウサビ菌に対するスコアは、０から１．５に増加した）。この活性は、カチオン樹脂にて吸収されたが、アニオン樹脂には吸収されなかった（この代謝産物は、正に荷電している）。
【０１０１】
（実施例６）
（ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７の殺真菌画分の部分精製）
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７由来のブロス培養物全体（８５０ｍｌ）を、４２００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、そして上清を収集した。活性炭（３０ｇ）をこの上清に添加し、そしてこれを十分に振盪した後、１１，５００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清をロータリーエバポレーターにて乾燥し、次いで１５ｍｌの水に再溶解した。次いで、サンプルを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに精製して、分子量によって成分を分離した。
【０１０２】
Ｐ−２樹脂（１３０ｇ、ＢｉｏＲａｄ）を、ミリＱ脱イオン水で膨張させて、カラム２．５ｃｍ×８０ｃｍに充填した。１５ｍｌの濃縮物をこのＰ−２カラム上にローディングし、このカラムを重力によって水を用いて溶出し、そして１０ｍｌ画分を収集した。Ｐ−２カラムについてのパラメーター：範囲＝２、ｎｍ＝２２６ｎｍ、１６ｍｖ。
【０１０３】
溶出した画分を、実施例５に記載したキンギョソウサビ菌発芽アッセイを使用してアッセイした。画分１８〜２４が、発芽を完全に阻害することを見出した。これらの画分を混合し、そしてロータリーエバポレーターにて乾燥し、次いで、８ｍｌの水に再溶解し、そして０．２ｍｌフィルターに通して濾過した。これを、第２のＰ−２カラムにローディングし、そして上記のように流したが、ただし、７ｍｌ画分を収集した。
【０１０４】
画分２９〜３８が、バイオアッセイにおいて発芽を阻害することを見出した。これらの画分を乾燥し、次いで水に再溶解した。小アリコート（５ｍｇ）を、アミノカラム（４．６ｍｍ×１５ｃｍ、５ｍ、１００Å）を使用するＨＰＬＣによりさらに分離した。このカラムを、０．０１Ｍ ＫＨ2ＰＯ4中で平衡化し、そして４％〜４４％アセトニトリル／０．０１Ｍ ＫＨ2ＰＯ4勾配を、２００ｎｍのＵＶにより検出して、１ｍｌ／分で３０分間流した。
【０１０５】
３つのピークを収集し、そしてピーク１を、サイズ排除ＨＰＬＣカラム（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ、Ｇ１０００ ＰＷ、７．５ｍｍ×３０ｃｍ、１０ｍ）上にて脱塩し、２００ｎｍのＵＶにより検出して、１ｍｌ／分の水で溶出した。１つのピークを、サイズ排除カラムから収集し、そして発芽アッセイにおいて活性であることを見出した。この半純粋の（ｓｅｍｉ−ｐｕｒｅ）活性物質の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、図１に示すようにＤ2Ｏにおいて４００ＭＨｚにて記録した。
【０１０６】
（実施例７）
（殺真菌成分の化学的特徴は、ツウィッターマイシン（ｚｗｉｔｔｅｒｍｉｃｉｎ）Ａと異なる）
本発明の殺真菌活性画分は、キャピラリー電気泳動において、ツウィッターマイシンＡと異なることが示された。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロス全体を、ダイズ粉末、デキストロース、酵母抽出物、ＫＨ2ＰＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4、ＮａＣｌおよびＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏを含む、Ｂａｃｉｌｌｕｓ培養培地において増殖させた。画線培養物を使用して、２５０ｍｌ振盪フラスコに接種した。フラスコを、２１０ｒｐｍにて３０℃で４日間振盪した。
【０１０７】
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロス全体に、精製ツウィッターマイシンＡを加え、そしてキャピラリー電気泳動（ＣＥ）において泳動した。３０μｌのＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロス全体に、１０μｌのツヴィッターマイシンＡを加えた。ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロス全体、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７ブロス全体＋ツウィッターマイシンＡ、およびツヴィッターマイシンＡ単独のうちの１つのサンプル各々を、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）を使用してＣＥ上で泳動した。各サンプルについて生じた電気泳動図を図３に示す。
【０１０８】
次いで、部分精製画分を、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を使用して、ツヴィッターマイシンＡと比較した。図４は、Ｂ−３００８７の部分精製殺真菌成分の電気泳動図、２５μｌのツヴィッターマイシンＡを加えたＢ−３００８７の部分精製殺真菌成分の電気泳動図、およびツヴィッターマイシンＡ単独の電気泳動図を示す。
【０１０９】
図２に示されるツヴィッターマイシンＡの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよび図１に示されるＢ−３００８７の部分精製殺真菌代謝産物の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、４００ＭＨｚにてＤ2Ｏにおいて記録した。図１および図２に示されるようなこれらのスペクトルは、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７からの殺真菌代謝産物は、ツウィッターマイシンＡと異なることを示す。
【０１１０】
ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７からの殺真菌代謝産物はまた、1Ｈ−ＮＭＲにより−体外毒素と区別され得る。−体外毒素の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｌ．Ａ．ＨｉｃｋｌｅおよびＷ．Ｌ．Ｆｉｔｃｈ編、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ４３２、１３１頁（１９９０）に示されるように、５ｐｐｍを超える７つの共鳴を有する。対照的に、図１は、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７サンプルについて、５ｐｐｍを超える陽子共鳴は出現しないことを示す。
【０１１１】
（実施例８）
（エンハンサーの精製）
エンハンサーを、以下のようにＢ−３００８７ブロス全体から半精製した。これは、アニオン交換樹脂、アセトニトリル沈殿およびサイズ排除クロマトグラフィーでの４３５ｍＬブロス全体の処理によって、半精製した。このブロス全体を遠心分離して細胞を除去し、そして１４．５ｇアニオン樹脂（ＡＧ１−Ｘ８、１００〜２００メッシュ、アセテート形態）を上清に添加し、そして混合物を１分間振盪した。これを５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、そして上清をデカントし、そして次の工程にて使用した。アセトニトリルを上清に添加して、５０％溶液を得、そしてこれを１分間振盪し、そして５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。下部の暗褐色層が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンハンサーを含んだ。
【０１１２】
上記からのこの褐色の層を、さらにサイズ排除クロマトグラフィーによって二工程で精製した。最初に、１３０ｇのＰ−２樹脂（ＢｉｏＲａｄ）をカラム２．５ｃｍ×８０ｃｍを充填するためにミリＱ脱イオン水で膨潤させた。褐色の層を、約４×、回転エバポレーターを使用して濃縮し、１５ｍｌの濃縮物をＰ２カラムに置いた。このカラムを、重力下でＭＱ水を用いて溶出し、そして１０分の画分を１２時間集めた（２８０ｎｍでのＵＶ検出、吸収範囲２．０、１０ｍＶ）。画分２６〜２８のさらなる精製を、回転エバポレーターを使用して画分を３×まで濃縮し、そしてこれらをもとのＰ２カラムに適用することによって行った。カラムをＭＱ水を用いて溶出した。１０分の画分を最初の８０分間集め、次いで、２分の画分を次の２時間集めた。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンハンサー活性は、画分１６〜２０で溶出した（２２０ｎｍでのＵＶ検出、吸収範囲２．０、１０ｍＶ）。
【０１１３】
（実施例９）
エンハンサーの化学的特徴は、ツヴィッターマイシンＡとは異なる。
【０１１４】
本発明のエンハンサーは、キャピラリー電気泳動においてツヴィッターマイシンＡとは異なることが示された。Ｂ−３００８７のブロス全体は、ダイズ粉、ブドウ糖、酵母抽出物、ＫＨ2ＰＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4、ＮａＣｌおよびＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏを含むＢａｃｉｌｌｕｓ培養培地で増殖された。画線培養を使用して２５０ｍｌ振盪フラスコに播種した。フラスコを２１０ｒｐｍ、３０℃、４日間振盪した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｂ−３００８７ブロス全体を、精製したツヴィッターマイシンＡを加え、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を行った。３０μＬのＢ−３００８７ブロス全体を、１０μＬツヴィッターマイシンＡを加えた。Ｂ−３００８７ブロス全体（図３Ａ）、Ｂ−３００８７ブロス全体およびツヴィッターマイシンＡ（図３Ｂ）ならびにツヴィッターマイシンＡのみ（図３Ｃ）を、ｐＨ５．８のリン酸ナトリウム緩衝液を使用してＣＥで電気泳動を行った。ＣＥの電気泳動図が図４に示される。
【０１１５】
ツヴィッターマイシンＡおよびＢ−３００８７半精製エンハンサーの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、Ｄ2Ｏ中、４００ＭＨｚで記録した。スペクトルは、エンハンサーがツヴィッターマイシンＡとは異なることを示す。
【０１１６】
（実施例１０）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを用いる殺虫性増強の決定
Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ増強を、シロイチモンジヨトウ（ｂｅｅｔ ａｒｍｙ ｗｏｒｍ）（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）相乗アッセイにおける試験によって、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３００８７のブロス全体を使用して示した。アッセイを９６ウェルマイクロプレートで行った。各ウェルは固体寒天基質を含んだ。２０μＬのＢ−３００８７ブロス全体を、バイオアッセイにおいて、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｊａｖｅｌｉｎ（０．２５〜１．５０μｇ／ウェル）の市販の調製物を用いて試験した。Ｊａｖｅｌｉｎ濃縮物のみの一連の希釈物を、同様に行った。
【０１１７】
殺虫活性をアッセイするために、寒天基質を、Ｍａｒｒｏｎｅら、（１９８５）、Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．７８：２９０−２９３に従ってマイクロプレートのウェルに対して調製した。脱イオン水を、ネガティブコントロールとして使用した。試験サンプルまたはコントロールの２つの複製を各アッセイのために使用した。次いで、プレートを換気フード内におき、約２〜３時間乾燥させた。
【０１１８】
１〜３匹のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａの第１齢（ｆｉｒｓｔ ｉｎｓｔａｒ）幼虫を各ウェルに加えた。マイクロプレートをＭｙｌａｒ（登録商標）のような気密な物質を用いて密封し、そして各ウェルをピン圧力によって通気した。プレートを２７℃で７日間までインキュベートした。
【０１１９】
インキュベーション後、ウェルを、新生児死亡率または幼虫の発達の程度に注意することによってスコア付した。死亡した幼虫の数を記録した。発育阻止された幼虫を１〜４の評点でスコア付した。発育阻止スコアは、以下である：４＝コントロールサイズ；３＝コントロールサイズの７５％；２＝コントロールサイズの５０％；１＝コントロールサイズの２５％。結果を以下の表９に要約する。
【０１２０】
【表９】
第２の試験を、上記手順を使用して行った。結果を以下の表１０に要約する。
【０１２１】
【表１０】
半精製画分の殺虫増強性質を決定するために、サンプルを上記にように、０．１μｇ／ウェルＪａｖｅｌｉｎを使用して試験し、そして４０μｌ／ウェルの画分を試験した。結果を以下の表１１に示す。
【０１２２】
【表１１】
（実施例１１）
Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ（Ｂ−３００８７）およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｂ−２１６６１）を殺真菌剤として一緒に使用した。
【０１２３】
Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、ＮＲＲＬ Ｂ−３００８７の菌株を、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＮＲＲＬ Ｂ−２１６６１を用いて試験し、一緒に使用した場合、それぞれの菌株が単独で使用された場合よりも殺真菌効果が大きいか否かを決定した。各菌株を、１０リットルまたは５，０００リットルの発酵槽において、ダイズ粉ベースの培地中で約５０時間増殖させた。各菌株を、コショウ上のＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ灰色カビ菌、およびＢｒａｓｓｉｃａ上のＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａべと病菌に対するブロス培養物全体として試験した。ブロス全体を、１×、１／２×および１／８×で試験した。次いで、２つの菌株を、１／２×、１／４×、および１／８×にて互いに種々の組み合わせで試験した。水チェック（コントロール）および化学殺真菌剤（２０ｐｐｍのＢＲＥＡＫ（登録商標））もまた比較のために試験した。植物を０〜５のスケールに基づいてスコア付した（ここで、５＝１００％疾患、制御なし；および０＝１００％制御、疾患なし）。この結果は以下の表１２に示される。
【０１２４】
【表１２】
Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ試験結果は、菌株が単独で使用される場合と比較した、その菌株が組み合わせて使用される場合の統計的な差を示す。例えば、Ｂ−２１６６１ １／４×およびＢ−３００８７ １／２×についてのスコア０．７は、単独で使用されたＢ−２１６６１ １／４×についてのスコア１．２とは統計的に異なる。また、Ｂ−２１６６１ １／８×およびＢ−３００８７ １／２×のスコア１．４は、Ｂ−２１６６１ １／８×のみについてのスコア１．７またはＢ−３００８７ １／２×のみについてのスコア２．３とは統計的に異なる。一緒のスコアは、単独で使用される各菌株についての予期される平均よりも低い。これは、殺菌剤としての効力の増加について一緒に菌株を使用することの相乗効果を示す。
【０１２５】
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ試験結果は、Ｂ−２１６６１ １／８×およびＢ−３００８７ １／２×の組み合わせについてのスコアが、添加効果から予期されるよりもはるかに良いことを示す。スコア２．０５は、菌株の組合せからの添加効果のみが存在する場合、予期される。しかし、実際のスコアは、０．３であり、これは、組み合わせて菌株を使用することによる明確な相乗効果が存在することを示す。他のスコアもまた、予期される結果よりも良いことを示し、例えば、Ｂ−２１６６１ １／４×およびＢ−３００８７ １／４×が、スコア０．５を有し、これは、個々の菌株の添加効果のみから予想される（２．３５の推定されるスコア）よりもずっと良い。この同じ相乗作用はまた、Ｂ−２１６６１ １／２×およびＢ−３００８７ １／２×（スコア０．３）、Ｂ−２１６６１ １／２×およびＢ−３００８７ １／４×（スコア０．３）、ならびにＢ−２１６６１ １／２×およびＢ−３００８７ １／８×（スコア０．５）の組み合わせにおいて示される。これらの試験は、菌株を組み合わせて使用する場合、相乗効果が存在し、そして予期されない効果が存在することを示す。
【０１２６】
本発明が上記実施形態とともに記載されているが、先の記載および実施例は、例示を意図し、本発明の範囲を限定しないことが理解される。本発明の範囲内の他の局面、利点および改変は、本発明が関係する当業者に明らかである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−２００７６５（Ｐ２０１０−２００７６５Ａ）
【公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１８７４２（Ｐ２０１０−１１８７４２）
【出願日】平成２２年５月２４日（２０１０．５．２４）
【分割の表示】特願２０００−６０８７２３（Ｐ２０００−６０８７２３）の分割
【原出願日】平成１２年３月２１日（２０００．３．２１）
【出願人】（５００２８１００６）アグラクエスト インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月２４日（２０１０．５．２４）
【分割の表示】特願２０００−６０８７２３（Ｐ２０００−６０８７２３）の分割
【原出願日】平成１２年３月２１日（２０００．３．２１）
【出願人】（５００２８１００６）アグラクエスト インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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