検出システム
核酸の検出又は特徴付けに用いられる様々な方法における赤色核酸染色試薬、特に赤色蛍光性ＳＹＴＯ（登録商標）染料の使用を記載している。具体的には、赤色核酸染色試薬は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と特に適合可能であることが見出され、したがって、強化された検出法の基礎を形成する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を検出又は特徴付けるための方法における試薬の使用、例えば、増幅反応を定量的にモニターすることによって、試料中の標的ポリヌクレオチドを検出するための方法、並びにこれらの方法において使用するためのキットを提供する。この方法は、特に、多型又は対立遺伝子変異の検出に適しており、そのため診断方法に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
既知の蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）モニタリング技術には、いくつかの第二世代のＰＣＲ熱サイクル装置上で使用することができる鎖特異的及び包括的ＤＮＡインターカレーター技術が含まれる。これらの反応は、サーマルサイクラーの密封したチューブフォーマット中で均質に実行される。反応は、蛍光光度計を用いてモニターされる。このアッセイの正確な形式は変更されるが、多くの場合、増幅産物の存在を示すシグナルを生じさせるために、システム内で２つの蛍光部分間の蛍光エネルギー移動、即ちＦＥＴに依存する。
【０００３】
包括的方法は、二本鎖ＤＮＡ種に結合した場合、蛍光増加を示すＤＮＡインターカレーティング染料（ｄｙｅ）を利用する。増幅中のＤＮＡのバルク濃度の上昇による蛍光増加は、反応進行を測定し、標的分子のコピー数を決定するために用いることができる。さらに、制御された温度変化を用いて蛍光をモニターすることによって、ＤＮＡ融解曲線は、例えば、ＰＣＲ熱サイクルの終端で生じさせ得る。
【０００４】
包括的ＤＮＡ法は、核酸のバルク濃度の上昇をモニターするために用いられる場合、これらのプロセスは、（下記で検討したいくつかの他の既知のアッセイと比較して）最小時間ペナルティを用いてモニターすることができる。１つの蛍光読み取りは、全ての反応において同じ点で行われ得る。エンドポイント融解曲線分析は、アンプリコンからの人為的な影響を選別し、アンプリコンを識別するために用いることができる。産物の融解ピークは、アガロースゲル電気泳動によって視覚化することができない濃度について測定することができる。
【０００５】
例えば複数の試料に対して高分解能の融解データを得るために、融解実験は、最大５分を要する既存のハードウェアでゆっくりと実行しなければならない。しかしながら、蛍光増幅を連続的にモニターすることによって、融解及びハイブリダイゼーションの履歴現象の３Ｄイメージが生じ得る。この３Ｄイメージは、アンプリコン依存的であり、産物の選別のために十分な情報を提供することができる。
【０００６】
ＤＮＡ融解曲線分析は、概して、ＰＣＲ熱サイクルの最適化に力強いツールであることが判明している。アンプリコンの融解温度を測定することによって、この温度までその後のＰＣＲサイクルの変性温度を下げることが可能となる。標的ＤＮＡというよりはむしろ第一世代の反応産物由来の増幅についての最適化は、その後のサイクルに生じる人為的な影響の形成を減少させる。プライマーオリゴヌクレオチド及びそれらの相補体の融解温度は、それらのアニーリング温度を決定するために使用可能であり、実証的な最適化に対する必要性を減少させる。
【０００７】
しかしながら、包括的なインターカレーター法は、擬似的な鎖特異的に過ぎず、したがって、鎖特異的な検出が必要である場合、あまり有用ではない。
【０００８】
鎖特異的な方法は、増幅反応の進行をモニターするために追加の核酸反応成分を利用する。これらの方法は、多くの場合、検出の基礎として、蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）を用いる。１以上の核酸プローブは、蛍光分子で標識され、その１つは、エネルギードナーとして作用し得て、その他は、エネルギーアクセプター分子である。これらは、ある場合には、それぞれレポーター分子及びクエンチャー分子として知られている。ドナー分子は、その励起スペクトル範囲内にある光の特定の波長で励起され、その後、その蛍光放出波長内で光を発光する。アクセプター分子はまた、種々の距離依存的なエネルギー移動メカニズムによって、ドナー分子からのエネルギーを受け入れることによりこの波長で励起される。生じる可能性のある蛍光エネルギー移動の特別な例は、蛍光共鳴エネルギー移動、即ち「ＦＲＥＴ」である。一般に、アクセプター分子は、近接近（例えば、同じ又は隣接する分子）である場合、ドナー分子の励起エネルギーを受け入れる。蛍光エネルギー移動検出の基礎は、ドナーでの変化をモニターし、励起波長を受け入れることである。
【０００９】
ＦＥＴ又はＦＲＥＴプローブの共通に用いられる２つのタイプがあり、アクセプターからドナーを分離するための核酸プローブの加水分解を用いるものであり、ドナー及びアクセプター分子の空間的関係を変更するためにハイブリダイゼーションを用いるものである。
【００１０】
加水分解プローブは、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブとして市販されている。これらは、ドナー及びアクセプター分子で標識されるＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる。プローブは、ＰＣＲ産物の一本鎖上の特定領域に結合するように設計される。ＰＣＲプライマーのこの鎖へのアニーリング後、Ｔａｑ酵素は、５’→３’ポリメラーゼ活性を用いてＤＮＡを伸長する。Ｔａｑ酵素はまた、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示す。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、Ｔａｑ伸長をプライミングすることからそれらを避けるためにリン酸化によって３’末端で保護される。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、産物鎖へハイブリダイズすると、伸長しているＴａｑ分子はまた、プローブを加水分解し、検出の基礎として、アクセプターからドナーを遊離させることができる。この場合のシグナルは累積的であり、遊離したドナー及びアクセプター分子の濃度は、増幅反応の各サイクルに伴って増加する。
【００１１】
シグナル発生は、プローブの加水分解反応の発生に依存するという事実は、この方法と関連した時間ペナルティがあることを意味する。さらに、プローブの存在は、ＰＣＲプロセスの円滑な証左を妨害する場合がある。
【００１２】
さらに、加水分解は、例えば、多数の増幅サイクル、例えば５０を超えるサイクルを必要とする場合、非特異的となり得ることが見出されている。これらの場合において、プローブの非特異的な加水分解は、シグナルの過度の上昇をもたらす。
【００１３】
これは、このような技術がＩｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．のＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ（商標）及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）などの迅速な熱風サーモサイクラーの開発に伴ってより著名となっている急速ＰＣＲ法とあまり適合しないことを意味する。他の急速ＰＣＲ装置は、例えば、同時係属の英国特許出願第９６２５４４２．０号及び第９７１６０５２．７号に記載されている。従来のサーマルサイクルと比較して急速サイクルの利点は、他に報告されている。死亡又は重篤な傷害が回避されるべきで場合に、結果の迅速性が重要である場合、このような技術は、例えば生物兵器に対する検出システムに特に有用である。
【００１４】
さらに、加水分解プローブは、融解の履歴現象に関して有意な情報を提供しない。これは、シグナル発生は、概して、アンプリコンの融解温度というよりはむしろプローブの加水分解に依存しているためである。
【００１５】
米国特許第５，４９１，０６３号は、ＤＮＡ結合剤によって、標識した一本鎖オリゴヌクレオチドからのシグナルの修飾に依存する蛍光標識したプローブの溶液中でクエンチング方法を記載している。ポリメラーゼ連鎖反応中のプローブ開裂（加水分解）後のプローブの鎖長の減少の結果として生じるこのシグナルの相違は、標的核酸の存在を検出する手段を提供することが示唆される。
【００１６】
ハイブリダイゼーションプローブは、多くの形体で利用可能である。分子指標は、ヘアピンループを形成するように相補的な５’及び３’配列を有するオリゴヌクレオチドである。末端蛍光標識は、ヘアピン構造が形成されるとＦＲＥＴが生じる近接近の状態にある。分子指標の相補配列のハイブリダイゼーション後、蛍光標識は分離され、このため、ＦＲＥＴは生じず、これは検出の基礎を形成する。
【００１７】
標識したオリゴヌクレオチド対はまた用いることができる。これらは、ＦＲＥＴが生じ得るようにドナー及びアクセプター分子を一緒にするＰＣＲ産物鎖上の近接近な状態でハイブリダイズする。ＦＲＥＴの増加は、検出の基礎である。このタイプの変形は、１つの隣接プローブを用いた標識した増幅プライマーを用いることを含む。
【００１８】
２つのプローブ、又は２つの標識分子を含む分子指標方のプローブの使用は、このプロセスに関係する費用を増やす。さらに、この方法は、互いに近接近な状態で特異的に結合するのに十分な長さである２つのプローブが知られるように合理的に長い既知の配列の存在を要する。これは、いくつか診断用途における問題となり得て、この場合、ＨＩＶウイルスなどの、効果的なプローブを設計するために用いることができる生物において保存された配列の長さが相対的に短くてもよい。
【００１９】
さらに、プローブ対の使用は、より複雑な実験的設計を伴う。例えば、プローブの融解によって与えられるシグナルは、両方のプローブの融解脱落の作用である。小さなミスマッチの研究、又はプローブの１つが（例えばイントロンのどちらかの側の配列がプローブ部位として利用され得る試料中のＤＮＡと比較してＲＮＡを検出するために）スプライス領域を横断して結合するために要求される研究は、他のプローブが即座に溶解する場合には誤った結果を生じ得る。
【００２０】
ＷＯ９９／２８５００は、試料中の標的核酸配列の存在を検出するために非常に成功したアッセイについて記載している。この方法では、ＤＮＡ二重鎖結合剤及び該標的配列に特異的なプローブが試料に添加される。プローブは、該ＤＮＡ二重鎖結合剤から蛍光を吸収するか又は該ＤＮＡ二重鎖結合剤に蛍光エネルギーを与えることができる反応分子を含む。次に、この混合物は、標的核酸が増幅され、条件は、プローブが標的配列にハイブリダイズする増幅プロセス中又はその後のいずれかに誘導される増幅反応に晒される。該試料からの蛍光をモニターする。
【００２１】
プローブは標的配列にハイブリダイズするので、インターカレーティング染料などのＤＮＡ二重鎖結合剤は、鎖間にトラップされる。一般に、これは、該染料と関連した波長の蛍光を増加する。しかしながら、反応分子が染料（即ち、それはアクセプター分子である）からの蛍光を吸収し得る場合、ＦＥＴ、特にＦＲＥＴを用いて該染料から発光エネルギーを受け入れ、そのため、その特徴的な波長で蛍光を放出する。アクセプター分子からの蛍光の増加は、染料の蛍光とは異なる波長であり、二重鎖形成におけるプローブの結合を指示する。
【００２２】
同様に、反応分子は、染料（即ち、それはドナー分子である）に蛍光を与えることができる場合、ドナー分子からの発光は、ＦＲＥＴの結果として減少し、この減少が検出され得る。この染料の蛍光は、これらの環境下で期待されるものよりも増加する。
【００２３】
プローブ上の反応分子からのシグナルは、鎖特異的なシグナルであって、試料内の標的の存在を指示する。このようにして、反応分子からの蛍光のシグナル変化は、プローブを含む二重鎖の形成又は不安定化を示し、好ましくはモニターされる。
【００２４】
ＤＮＡ二重鎖結合剤は、プロセスにおいて用いることができ、それ自体、二重鎖形体でＤＮＡに付着又は関連付けられ、エネルギードナー又はアクセプターとして作用することができるいずれかの実体である。特定の例は、当該技術分野において周知であるようなインターカレーティング染料である。
【００２５】
インターカレーティング染料及び単独で標識されているプローブなどのＤＮＡ二重鎖結合剤の使用は、これらの成分が、二重に標識されたプローブを要求する他のアッセイよりも非常に経済的であるという点で有利である。たった１つのプローブを用いることによって、プローブの基礎を形成するのに必要な既知の配列の長さは、相対的に短くてもよく、したがって、この方法は、困難な診断状況でさえ用いることができる。この場合のアッセイは、ＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅ（登録商標）として知られている。
【００２６】
ＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅ（登録商標）アッセイに用いられるＤＮＡ二重鎖結合剤は、典型的には、インターカレーティング染料、例えばＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、例えばＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、エチジウムブロミド及びＹＯＰＲＯ−１であり、それ自体が蛍光性である。
【００２７】
反応分子と染料との間にＦＥＴ、例えばＦＲＥＴが生じるためには、（インターカレーティング染料又はプローブ上の反応分子のいずれかであってもよい）ドナーの蛍光放出は、アクセプター（即ち、染料又は反応分子以外のもの）よりも短い波長でなければならない。ドナー及び／又はアクセプターとして用いられる分子によって発生される蛍光シグナルは、可視スペクトル内のピークとして表すことができる。ＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅ（登録商標）の特定の既知の態様は、光（約４７０ｎｍ）がＤＮＡ結合剤であるＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ又はＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ−１を励起するために用いられる普遍的なドナーシステムを利用する。エネルギーは、Ｃｙ５及びＣｙ５．５などの特定のシアニン染料に移動する。
【００２８】
一般に、発光の波長における少なくともいくらかの重複部分がある。シグナルは鋭いピークである場合でさえ、蛍光分子からのシグナルのある種の「漏れ」があり、そのため、一般には、ＤＮＡ二重結合剤シグナルからのプローブによって与えられる鎖特異的なピークを解消するために必要とされる。これは、例えば、ドナーのスペクトルとアクセプターのスペクトルとの間の関係を経験的に決定すること、及びこの関係を用いて、ドナー及びアクセプターからのシグナルを標準化することによって行うことができる。ＳＹＢＲ染料は、発光の特にブロードなスペクトルを有し、したがって、カラー・デコンボリューションアルゴリズムは、アプリケーションに必要である。それらは、一般に本来は緑色である。
【００２９】
さらに、ＳＹＢＲ染料は、複数の反応において、プローブシグナルが増幅の増加とともに減少するように反応において制限となり得て、これにより、１つのプローブシグナルは他のものと競合し得る。
【００３０】
しかしながら、ＳＹＢＲ染料は、核酸検出及び融点分析を含む種々のアプリケーションにおいて幅広く用いられ、それは、大部分は、それらの蛍光特性が、フルオレセインなどの通常他に用いられる蛍光色素のものと「適合する」ためであり、これは、同じ光学（青色ダイオード／約５２０ｎＭフィルター）をそれらの検出に用いられるようにするためである。
【００３１】
リアルタイムＰＣＲにおいて、特にＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ及び関連染料のｐｉｃｏ ｇｒｅｅｎの使用は、米国特許第５，５６９，６２７号及び欧州特許第１１７９６００Ｂ号に記載されている。
【００３２】
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎは、この染料を効果的に用いるために、リアルタイムＰＣＲで幅広く用いられているが、一般に、条件の注意深い最適化を行うことが必要である。これは、ＤＭＳＯ、ウシ血清アルブミン及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの特定の試薬の封入を必要とする場合がある。濃度依存的にＰＣＲそれ自体の阻害はまた、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎが封入され、これが頻繁に塩化マグネシウムの添加を必要とする場合に観察される。
【００３３】
異なる染料である、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの代替物としての緑色染料であるＳＹＴＯ９の使用は、Ｍｏｎｉｓら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４０（２００５）２４−３４に検討されている。
【００３４】
ＷＯ２００４／０３３７２６は、プローブ上の蛍光標識からの蛍光エネルギーを吸収することができるが、シグナルと干渉するように、可視光を発光しないＤＮＡ二重鎖結合剤を用いるＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅ（登録商標）方法の変形を記載している。ＷＯ０２／０９７１３２は、特定のプローブタイプが利用される更なる変形を記載している。
【００３５】
しかしながら、本出願人は、このタイプの方法における使用のための特に有利な組合せを見出した。
【発明の開示】
【００３６】
本発明によれば、ＰＣＲ反応、特にリアルタイムＰＣＲ反応において核酸の検出における核酸染色試薬（ｓｔａｉｎ）の使用、特に赤色核酸染色試薬の使用を提供する。本明細書中では、ＰＣＲ反応は、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、及びＤＮＡ増幅反応を含む。
【００３７】
本明細書中で使用するとき、表現「核酸染色試薬」は、細胞又はそれらの内容物の染色に優先的に用いるために使用され、又は提案される製造物及び化合物を意味する。それらは、ＳＹＢＲ（登録商標）ｇｒｅｅｎ又はＳＹＢＲ（登録商標）ｇｏｌｄ並びにエチジウムブロミドなどの染料を除く。
【００３８】
特に、使用される核酸染色試薬は、一般式（Ａ）：
【００３９】
【化１】
【００４０】
で表されるチアゾールオレンジ部分を含むか又はそれから誘導されるものである。
【００４１】
赤色核酸染色試薬は、一般に、６００ｎｍを超える、例えば６１０〜６９０ｎｍの波長で蛍光は放出する。それらは、細胞透過性であり得て、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから市販されているＳＹＴＯ（登録商標）赤色蛍光核酸染色試薬であり、それらが細胞に入り、特に細胞核を染色する場合に、多くの生物学研究において知られており、使用に推奨されている。結果として、それらは、核小体及びミトコンドリアを示し得る。赤色ＳＹＴＯ染料は、以前には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅反応との関連で、インビトロでは核酸の検出に関連して利用されなかった。
【００４２】
このタイプの染色試薬は、一般に、例えば、ＷＯ９４／０２４２１３、ＷＯ９６／０１３５５２、ＷＯ００／０６６６６４、ＷＯ０２／０２８８４１、ＷＯ０４／０２５２５９、ＷＯ０５／０３８４６０、ＷＯ０５／０４７２４２、ＷＯ０５／０４７９０１、ＷＯ０５／０５６６８７及びＷＯ０５／０６４３３６、及び特にＷＯ００／６６６６４に記載されるようなシアニン染料であり、これらの文献は、参照により本明細書中に援用される。特に、この染色試薬は、米国特許第５，６５８，７５１号に記載されるような、色が赤色であるシアニン染料である。
【００４３】
これらの染料は、一般に、場合により置換されてもよい２種のヘテロ環式環系を含む不斉化学構造を含み、サブ式（ｉ）：
−（ＣＲ32＝ＣＲ31）n−ＣＲ30＝ （ｉ）
で表される架橋メチンによって連結される。
【００４４】
式中、ｎは、０、１又は２であり、Ｒ30、Ｒ31及びＲ32は、独立して、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-10シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールから選択される。特にＲ30、Ｒ31及びＲ32の少なくとも１つ、及び好ましくは全部は水素である。
【００４５】
本明細書中で使用するとき、用語「アリール」は、芳香族炭素環式基、例えばフェニル又はナフチルを意味する。用語「ヘテロアリール」は、例えば５〜２０原子の芳香族環式基を意味し、そのうち少なくとも１つは、酸素、窒素又は硫黄から選択されるヘテロ原子である。ヘテロアリール基は、本来は、適切には単環式又は二環式である。
【００４６】
一般に、本発明に有用な赤色染色試薬では、ｎは１であるが、ヘテロ環式環が赤系統の色域に発光をシフトする効果がある場合は、他の値のｎが許容され得る。
【００４７】
例えば、赤色染色試薬は、ｎがゼロである化合物を含むことができ、これらの場合において、それらは、概して、例えば、ヘテロ原子、例えば窒素などの環に電子密度を与えることによって、エネルギーレベルを低下することができる緑色染料と比較して、環構造における修飾を含む。
【００４８】
上述したサブ式（ｉ）のメタン基のいずれかの側での結合のための具体的なヘテロ環式環系は、ＷＯ９４／０２４２１３、ＷＯ９６／０１３５５２、ＷＯ００／０６６６６４、ＷＯ０２／０２８８４１、ＷＯ０４／０２５２５９、ＷＯ０５／０３８４６０、ＷＯ０５／０４７２４２、ＷＯ０５／０４７９０１、ＷＯ０５／０５６６８７及びＷＯ０５／０６４３３６、及び特にＷＯ００／６６６６４に例示されている。
【００４９】
特に、塩基性ベンゾチアゾリル及びキノリニウム環を含むこれらの参考文献に記載されている化合物が調製されてもよい。
【００５０】
したがって、例えば、核酸染色試薬は、置換されたアザ−ベンゾリウム環である第１へテロ環式環を有し、それは、ピリジン、キノリン、ピリジニウム又はキノリニウム基である第２ヘテロ環式環に上述したサブ式（ｉ）のメチンリンカーを介して連結されてもよい。
【００５１】
特に、このような化合物は、一般式（Ｉ）：
【００５２】
【化２】
【００５３】
に含まれ得て、式中、Ａは、各環において、６原子を有する１又は２個の縮合した芳香族環を形成し、そのうちの少なくとも１つは、場合により、窒素であり、該環（単数または複数）は、場合によりさらに、１回以上、１〜６個の炭素を有するアルキル、１〜６個の炭素を有するアルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、若しくは−Ｌ−Ｒ．；又は−Ｌ−Ｓによって置換される。
【００５４】
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ15、又はＣＲ16Ｒ17であって、ここで、Ｒ15は、Ｈ又は１〜６個の炭素を有するアルキル基であり；Ｒ16及びＲ1７は、同一であるか又は異なっていてもよく、独立して、１〜６個の炭素を有するアルキル基であり、又はＲ16及びＲ17は、一緒になって、５若しくは６員の飽和した環を形成し；ａは、０又は１である。
【００５５】
Ｒ2は、水素、場合により、スルホン酸塩、カルボキシ又はアミノによって置換される１〜６個の炭素を有するアルキル基であり；又は、Ｒ2は、−Ｌ−Ｒ．若しくは−Ｌ−Ｓ；又はテール；又はブリッジ−染料である。
【００５６】
ｎは、０、１又は２であり、好ましくは１である。
Ｙは、−ＣＲ3＝ＣＲ4−である。
ｐ及びｍは、ｐ＋ｍ＝１となるように、０又は１である。
【００５７】
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6、及びＲ7は、独立して、Ｈ；飽和若しくは不飽和の直鎖状又は分岐状の１〜６個の炭素を有するアルキル；又はハロゲン；又は環状基（アリール、ヘテロアリール、若しくは３〜１０個の炭素を有するシクロアルキルから選択され、それらのいずれかは、場合により、ハロゲン、アミノ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ又はカルボキシアルキル（ここで、各アルキル基は、１〜６個の炭素を有する）によって置換されてもよく、又はテール部分によって置換されてもよい）；又は−ＯＲ8、−ＳＲ8、−（ＮＲ8Ｒ9）；又はテール；又はＢブリッジ−染料；又は−Ｌ−Ｒx；又は−Ｌ−Ｓcであり、ここで、Ｒ8及びＲ9は、同じであるか又は異なっていてもよく、独立して、１〜６個の炭素を有するアルキル基；又は１〜２個の脂環式環若しくは芳香族環であり；あるいは、Ｒ8及びＲ9は、一緒になって、−（ＣＨ2）2−Ｖ−（ＣＨ2）2−であり、Ｖは、単結合、−Ｏ−、−ＣＨ2−、又は−ＮＲ10−であり、ここで、Ｒ10は、Ｈ又は１〜６個の炭素を有するアルキルである。
【００５８】
あるいは、Ｒ6及びＲ7は、縮合した芳香族環−Ｒ11＝Ｒ12−Ｒ13＝Ｒ14−を形成し、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、及びＲ14は、場合により、独立して、飽和若しくは不飽和の直鎖状又は分岐状の１〜６個の炭素を有するアルキル；又は−ＯＲ8、−ＳＲ8又は−（ＮＲ8Ｒ9）；又は環状基（アリール、ヘテロアリール、又は３〜１０個の炭素を有するシクロアルキルから選択され、それらのいずれかは、場合により、ハロゲン、アミノ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ又はカルボキシアルキル（ここで、各アルキル基は、１〜６個の炭素を有する）によって置換されてもよく、又はテール部分によって置換されてもよい）；又はテール；又はブリッジ−染料；又は−Ｌ−Ｒx；又は−Ｌ−Ｓcであり；Ｒ5は、飽和若しくは不飽和の直鎖状又は分岐状の１〜６個の炭素を有するアルキルであり；又は、Ｒ5は、環状基（例えば、３〜８原子の炭素環式基又は複素環式基）であり；又は、Ｒ5は、テール；若しくはブリッジ−染料；又は−Ｌ−Ｒx；若しくは−Ｌ−Ｓcであり；又は、Ｒ5は、電子対であり；Ｒ30、Ｒ31、及びＲ32は、独立して、Ｈ、１〜６個の炭素を有するアルキル、３〜１０個の炭素を有するシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり；ここで、Ｌ及びブリッジは、独立して、１つの共有結合、又は直鎖状若しくは分岐状の環式又はヘテロ環式の飽和又は不飽和のＣ、Ｎ、Ｐ、Ｏ及びＳからなる群から選択される１〜６個の水素以外の原子を有する共有連結であり、これによりこの連結は、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、アミド結合；又は、一重、二重、三重若しくは芳香族炭素−炭素結合；又は、リン−酸素、リン−硫黄結合、窒素−窒素又は窒素−酸素結合；又は、芳香族若しくはヘテロ芳香族結合のいずれかの組合せを含む。
【００５９】
Ｒxは、反応基であり；
Ｓcは、結合した（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）基であり；
テールは、ヘテロ原子含有部分である。
【００６０】
染料は、式（ＩＡ）：
【００６１】
【化３】
【００６２】
で表される化合物であり、式中、Ａ、Ｘ、Ｒ2、ｎ、Ｙ、ｍ、ｐ、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ７、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17、Ｒ18、Ｒ19、Ｒ20、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ24、Ｒ30、Ｒ31、Ｒ32、テール、又は環式基（アリール、へテロアリール又は３〜１０個の炭素を有するシクロアルキルから選択され、そのいずれかは、場合により、ハロゲン、アミノ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ又はカルボキシアルキル（ここで、各アルキル基は、１〜６個の炭素を有する）によって、又はテール部分によって置換されてもよい）は、上記で定義される通りであり；Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6又はＲ7の１つでブリッジに結合される。
【００６３】
反応基Ｒx及び結合した基Ｓcの具体例は、ＷＯ００／６６６６４に記載される通りである。これらの場合において、環Ａは、窒素原子を含む。
【００６４】
この一般的なタイプの化合物の他の例は、上記の式（Ａ）のチアゾールオレンジの環エレメントを含む化合物であって、したがって、式（ＩＢ）：
【００６５】
【化４】
【００６６】
（式中、ｎ、Ｒ2、Ｒ5、Ｒ30、Ｒ31及びＲ32は上記で定義される通りである）
で表される化合物である。
【００６７】
このような化合物には、式（ＩＡ）で表される化合物に関して、上述される置換基が含まれ得る。したがって、さらに一連の化合物は、赤色である式（ＩＩ）：
【００６８】
【化５】
【００６９】
で表される化合物であって、式中、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ30、Ｒ31、Ｒ32及びｎは、上記で定義される通りであり、Ｒ2は、水素、場合によりスルホン酸塩、カルボキシ、又はアミノによって置換される１〜６個の炭素を有するアルキル基であり；ただし、前記化合物は、ＳＹＢＲグリーン及びピコグリーン以外である。［ＳＹＢＲグリーン及びピコグリーンの構造は、それぞれＡ及びＢとして表される。］
【００７０】
【化６】
【００７１】
この場合において、ｎは０であり、Ｒ32、Ｒ31、Ｒ30は全て水素であり、Ｒ3は水素であり、Ｒ4はテール基であり、Ｒ5はフェニル以外に適切なものである。
【００７２】
具体的には、Ｒ2は、メチルなどの１〜６個の炭素原子を有するアルキル基である。
さらに、ｎの具体例は、０又は１であり、例えば０である。
【００７３】
ｎが１である場合、Ｒ32及びＲ33は、適切には水素である。
Ｒ30の具体例は、水素である。
【００７４】
適切には、Ｒ5は、テール基又はアリール若しくはピリジルなどの芳香族である複素環式基である。式（ＩＩ）（Ｒ5がヘテロアリールである）で表される化合物は、本発明の特定の態様を形成し、（ＩＩＡ）と称される。特に、ｎが０である場合、Ｒ5は、ピリジルなどのヘテロアリール基である。
【００７５】
テール基の具体例には、式：
リンク−スペーサー−キャップ
で表される基が含まれ、ここで、リンクは、本発明の染料のコア構造にテールが結合する連結部分である。スペーサーは、リンクをキャップに結びつける共有結合的連結であり、キャップは、ヘテロ原子成分を有するテールの部分である。
【００７６】
特に、リンクは、一重共有結合、エーテル連結（−Ｏ−）、チオエーテル連結（−Ｓ−）又はアミン連結（−ＮＲ20−−）（Ｒ20は、水素、Ｃ1-8アルキル基若しくは基−スペーサー’−キャップ’（スペーサー’及びキャップ’は、それぞれスペーサー及びキャップについて下記に定義される基である）から選択される）である。
【００７７】
適切には、リンク基は、基ＮＲ20（Ｒ20は、上記で定義されるとおりである）である。
【００７８】
スペーサー基の例は、１〜１６個のＣ、Ｎ、Ｐ、Ｏ若しくはＳ原子の直鎖状、分岐状、環状、複素環式、飽和又は不飽和配列の整列の直接的な結合である。あるいは、スペーサーは、一重共有結合であり、ただし、リンク及びスペーサーの両方が同時に一重共有結合ではない。好ましくは、スペーサー連結は、炭素原子で開始しかつ終了しなければならない。典型的には、スペーサーが１個の原子からなる場合、それは炭素原子であることが必要であり、それにより、スペーサー中の最初と最後の原子（この特別な例では、それら同じ原子である）は炭素である。スペーサーを作る１〜１６個の原子は、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル若しくはアミド結合；又は、一重、二重、三重若しくは芳香族炭素−炭素結合；又は、リン−酸素結合；又はリン−硫黄結合；又は、窒素−窒素結合；又は、窒素−酸素結合；又は、芳香族若しくはヘテロ芳香族結合のいずれかの適切な組合せを用いて合わせられる。スペーサーは、スペーサーの各原子の原子価状態を調整するために水素によってさらに置換される。
【００７９】
一般に、スペーサーの原子は、スペーサーの直鎖状の骨格における全てのヘテロ原子が、少なくとも１個の炭素原子によって分離され、好ましくは少なくとも２個の炭素原子によって分離されるように整列されている。典型的には、スペーサーは、直鎖状又は分岐状の飽和した鎖の１〜６個の炭素原子である。本発明の一態様では、スペーサーは、６員の芳香族環（フェニレン連結）を組み入れる。本発明の別の態様では、スペーサーは、５又は６員のヘテロ芳香族環を組み入れ、ここで、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ又はＳである。あるいは、スペーサーは、アミド連結、エステル連結、単純なエーテルおよびチオエーテル、及びアミンを直線な整列に組み入れ、例えば、−ＣＨ2ＣＨ2（Ｃ＝Ｏ）ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2である。好ましくは、スペーサーは、アルキレン−（ＣＨ2）k−（ｋ＝１〜８）であり、特にプロピレン基である。
【００８０】
リンク及びスペーサーは、組み合わせて、染料コア構造にヘテロ原子含有基であるキャップを結合させるために使用される。キャップは、式−ＯＲ21、−ＳＲ21、−ＮＲ21Ｒ22、又は−Ｎ+Ｒ21Ｒ22Ｒ23．ＰＳＩ-．に従って、酸素、硫黄又は窒素を含むことができ、ここで、Ｒ21、Ｒ22、及びＲ23は、独立して、Ｈであり、又は場合により置換された直鎖状若しくは分岐状の１〜８個の炭素を有するアルキル又はシクロアルキル基であり、ＰＳＩ-は、下記に記載されるように、適切に生物学的に適合可能な対イオンである。
【００８１】
Ｒ21、Ｒ22及びＲ23のいずれかがアルキル又はシクロアルキルである場合、それらは、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、１〜８個の炭素を有するアルコキシ、アミノ、カルボキシ又はフェニルから選択される１以上の基によって置換され、ここで、フェニルは、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、１〜８個の炭素を有するアルコキシ、アミノ、１〜８個の炭素を有するアミノアルキル又は１〜８個の炭素を有するカルボキシアルキルによってさらに置換される。
【００８２】
本発明の別の態様では、１以上のＲ21、Ｒ22及びＲ23は、スペーサーと一緒になって、芳香族、ヘテロ芳香族、脂環式又はヘテロ脂環式環である５又は６員環を形成する。５又は６員環がヘテロ原子又はヘテロ脂環式である場合、この環は、Ｏ、Ｎ又はＳである１〜３個のヘテロ原子を含む。あるいは、１以上のＲ21、Ｒ22、及びＲ23は、Ｒ20及びスペーサーと一緒になって、上記に記載される芳香族、ヘテロ芳香族、脂環式又はヘテロ脂環式環である５又は６員環を形成する。好ましくは、Ｒ21、Ｒ22は水素、又は１〜８個の炭素を有するアルキルである。Ｒ23は、典型的には、Ｈ又は１〜８個の炭素を有するアルキルである。
【００８３】
キャップが−Ｎ+Ｒ21Ｒ22Ｒ23．ＰＳＩ．-である場合、生物学的に適合可能な対イオンである．ＰＳＩ-は、第４級アンモニウム塩であるキャップ窒素に存在する正電荷の均衡を保つ。本明細書中で使用するとき、生物学的に適合可能である基質は、使用される場合に毒性でなく、生体分子に実質的に悪影響を有しない。．ＰＳＩ-の例には、とりわけ、塩素、臭素、ヨウ素、硫酸塩、アルカンスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩、テトラフルオロホウ酸塩、テトラアリールホウ化物、硝酸塩、及び芳香族又は脂環式カルボン酸のアニオンが含まれる。好ましい．ＰＳＩ-対イオンは、塩素、ヨウ素、過塩素酸塩及び種々のスルホン酸塩である。
【００８４】
さらに、本発明のいくつかの態様では、キャップは、環構造を組み入れる。これらの態様では、キャップは、典型的には、５又は６員の窒素含有環を組み入れ、場合により追加のヘテロ原子（典型的には酸素）を含み、ここで、環窒素は、場合により、Ｒ23によって置換され、アンモニウム塩が得られる。キャップの特定バージョンには、限定されないが、その内容が参照により本明細書中に援用される米国特許第５，６５８，７５１号の表１に列挙されているものが含まれる。
【００８５】
テール基の具体例は、−ＮＲ20（Ｃ1-8アルキレン）ＮＲ21Ｒ22であり、ここで、Ｒ20、Ｒ21及びＲ22は、上記で定義される通りである。例えば、テール基は、サブ式（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）で表される基である。
【００８６】
【化７】
【００８７】
適切には、Ｒ3は水素であり、Ｒ4はテール基である。
特定の態様では、式（ＩＩ）で表される化合物は、式（ＩＩＩ）で表される化合物である。
【００８８】
【化８】
【００８９】
一態様では、式（ＩＩＩ）の化合物は、式（ＩＩＩＡ）で表される化合物である。
【００９０】
【化９】
【００９１】
別の態様では、式（ＩＩＩ）で表される化合物は、式（ＩＩＩＢ）で表される化合物である。
【００９２】
【化１０】
【００９３】
さらに別の態様では、式（ＩＩＩ）で表される化合物は、式（ＩＩＩＣ）で表される化合物である。
【００９４】
【化１１】
【００９５】
適切な赤色核酸染色試薬の特定の例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから市販されているＳＹＴＯ赤色核酸染色試薬であり、例えば、ＳＹＴＯ（登録商標）１７、ＳＹＴＯ（登録商標）５９、ＳＹＴＯ（登録商標）６０、ＳＹＴＯ（登録商標）６１、ＳＹＴＯ（登録商標）６２、ＳＹＴＯ（登録商標）６３及びＳＹＴＯ（登録商標）６４である。これらの染色試薬のスペクトル特性を表１に例証する。
【００９６】
【表１】
【００９７】
本出願人は、これらの染色試薬がリアルタイムＰＣＲ検出法との関連で特に有益であることを見出した。それらは、反応を阻害せず、ＳＹＢＴ（登録商標）染料よりも有意に少ない制限である広い濃度範囲で添加することができることが見出されている。（ＳＹＴＯ緑色核酸染色試薬を含むＳＹＴＯファミリーの他のメンバーはまた、これらの利点を有してもよいが、それらのシグナルが測定されるために必要とされない反応における使用にあまり適切ではない。）
【００９８】
結果として、それらは、核酸含量、したがってＰＣＲの進行のモニター、及び包括的な検出、内部対照の封入、融点分析などに利用することができる。
【００９９】
それらは、ＦＥＴ又はＦＲＥＴによって、フルオレセイン及びその誘導体、例えばＪＯＥを含む多種の最も容易に利用できる染料分子と相互作用することが見出されている。
【０１００】
したがって、これらの核酸染色試薬は、フルオレセインのモニターが必要とされる増幅反応、特にＰＣＲ増幅に利用可能である様々な蛍光色素に非常に有益な付加を与える。
【０１０１】
このようにして、更なる局面では、本発明は、増幅中の生物試料の核酸配列を検出する方法を提供し、下記：
熱安定性ポリメラーゼ及び標的核酸配列の増幅のために設定したプライマーを生物試料に添加する工程；
上記で定義される核酸染色試薬及び場合により追加のシグナル蛍光色素の存在下で、ポリメラーゼ連鎖反応によって標的核酸配列を増幅する工程；
核酸染色試薬又は任意の追加の蛍光色素のいずれかによって吸収される波長の光で生物試料を照射する工程；及び
該試料中の増幅された標的核酸配列の存在又は量に関連した試料からの蛍光放出を検出する工程
を含む。
【０１０２】
核酸染色試薬は、例えば、その内容が参照により本明細書に援用される米国特許第６，５６９，６２７号に記載される方法に類似した方法を用いて、特にリアルタイムで、反応を測定するために単独で用いることができ、それは、それらの阻害の欠如がこれに関連して有用だからである。
【０１０３】
しかしながら、一般に、それらは、これらの染色試薬の発光の波長がこれらの多くと適合可能であるため、別の蛍光色素との組合せで用いられる。
【０１０４】
特に、それらは、リアルタイムＰＣＲ反応において利用可能であり、その場合、増幅の進行がモニターされる。これらの反応は、ＴＡＱＭＡＮ（商標）アッセイ、及び二重ハイブリダイゼーションプローブを利用するアッセイを含む、上述したリアルタイム蛍光アッセイのいずれかを含むことができる。しかしながら、特に、それらは、ＲｅａｓｏｎＳｅｎｓｅ（登録商標）アッセイ、又はＷＯ０２／０９７１３２に記載されるこのアッセイの変形に利用される。
【０１０５】
したがって、特定の態様では、本発明は、試料中の標的核酸配列の存在を検出するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）標的核酸配列を含むことが疑われる試料に、ＤＮＡ二重結合剤、及び該標的配列に特異的なプローブを添加し、該プローブは、該ＤＮＡ二重結合剤からの蛍光を吸収するか又は該ＤＮＡ二重結合剤に蛍光エネルギーを与えることができる反応分子を含み、ここで、該反応分子又は該ＤＮＡ二重結合剤の１つは、上述される核酸染色試薬であり、他方は、蛍光色素、例えばフルオレセイン又はその誘導体である、
（ｂ）このように形成した混合物を標的核酸が増幅される増幅反応に供すること、
（ｃ）該プローブが標的配列にハイブリダイズする条件に該試料を供すること、及び
（ｄ）該試料からの蛍光をモニターすること
を含む。
【０１０６】
適切には、核酸染色試薬は、ＤＮＡ二重結合剤として用いられる。
上述したタイプの核酸染色試薬を用いることによって、非常に多数の従来の利用可能な蛍光色素であり得る、システムの他のシグナルエレメントのシグナルを重複するシグナルを供給するという問題を避けるか又は最小化することができる。特に、様々な波長を有する核酸染色試薬が利用可能であり、既知の蛍光色素、特にレポーター染料の中から適切な組合せ、並びに励起源を選択できることを意味し、結果として、シグナルの重複を最小化させるか又は発生しないようする。このようにして、ＤＮＡ二重結合剤からのシグナルからプローブからのシグナルを解明する必要性を排除することができ、意味のあるシグナルが測定される広いバンド幅が利用可能である。これは、装置、又は少なくとも装置に設置されたコンピュータ機器を単純化することができる。
【０１０７】
当該技術分野において理解されているように、蛍光をモニターするために、システム内の蛍光色素によって吸収される光の波長で試料を照射し、次に、適切な発光波長で蛍光の放出をモニターすることが必要である。１を超える蛍光色素は、このようにしてモニターされ得るが、光の１を越える波長で試料を照射し、様々な波長でも発光をモニターされる。本方法の特定の態様では、試料は、反応分子によって吸収される波長の光によって照射され、反応分子からの発光シグナルがモニターされる。核酸染色試薬からのシグナルをモニターする必要性はなく、それは、これがＪＯＥ及びＦＡＭなどの従来の蛍光色素からのシグナルと干渉しそうもないからである。
【０１０８】
したがって、このアッセイは、より広い範囲の機器で実行することができる。
あるいは、可視スペクトルでの自由なバンド幅のいずれかの領域は、追加のプローブを組み入れることによって引き出すことができ、このプローブは、異なった波長で蛍光を発する異なった標識を含み、それにより、１つの標的を同時にモニターすることができる。これは、複数のＰＣＲ反応の場合に特に有用であり得る。
【０１０９】
上述される核酸染色試薬は、例えば、従来の方法を用いて、特定の又は種々の従来の蛍光色素から蛍光エネルギーを吸収するかどうかを見るために試験可能である。特に、それらは、クエンチング特性を試験するための標識プローブ又は蛍光インターカレート剤であってもよい。この試験を実行するための適したプロトコールは、以下の実施例１に記載されている。
【０１１０】
反応混合物に添加される核酸染色試薬の量は、適切には、例えば、システム内の他の蛍光色素からのシグナルをクエンチし、測定可能なシグナルを引き起こすには十分であるが、増幅を阻害するには十分でない。これを達成する濃度範囲は、使用される正確な核酸染色試薬に依存して変化し、以下に例示される日常的な方法によって測定可能である。しかしながら、一般に、核酸染色試薬の濃度は、１〜１０μＭ、概して約５μＭである。
【０１１１】
特定のＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅ（登録商標）法は、その用途に非常に多目的である。それは、例えばＷＯ２００４／０３３７２６に検討されているように、試料中の標的核酸配列に関する定量的及び定性的データを生じさせるように用いることができる。特に、定性的な増幅に与えられる方法だけでなく、二重の不安定化温度又は融点などの特徴的なデータを得るために、追加して又はそれに代えて用いることもできる。
【０１１２】
ＲｅａｓｏｎＳｅｎｓｅ（登録商標）アッセイでは、試料は、増幅反応前、反応中又は反応後に試料にプローブをハイブリダイズする条件に晒されてもよい。したがって、このプロセスは、増幅及びモニタリングが初期に添加された全ての試薬を含む１個の容器内で実行することができるという点で、均質なように検出を達成することが可能である。その後の試薬の添加工程は不要である。（これはオプションであるが）固体支持体の存在下でこの方法を達成するのにいかなる必要性もない。
【０１１３】
プローブは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸分子を含むことができ、後者が一本鎖形体である場合、標的核酸配列にハイブリダイズする。この例では、工程（ｃ）は、標的核酸が一本鎖を与える条件の使用を伴う。
【０１１４】
プローブは、溶液中で遊離しているか、又は、例えば生成物の分離に有用な磁気ビーズの表面又は表面プラズモン共鳴検出器若しくは全内部反射蛍光検出器の導波管などの検出装置の表面などの固体支持体に固相化されていてもよい。選択は、観察される特定のアッセイの性質及び採用される特定の検出手段に依存する。
【０１１５】
特に、使用される増幅反応は、試料中に存在する標的核酸配列のいずれかが一本鎖となる条件に試料を供する工程を伴う。このような増幅反応には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が含まれるが、好ましくはＰＣＲ反応である。
【０１１６】
次に、適切なハイブリダイゼーション条件が与えられるという条件で増幅反応の経過中に、プローブはハイブリダイズすることができる。
【０１１７】
好ましい態様では、プローブは、これらの条件が増幅反応の各サイクル中に与えられるように設計されてもよい。このようにして、増幅反応の各サイクル中のある点では、プローブは標的配列にハイブリダイズし、そうすると直に蛍光シグナルがプローブと標的配列との間にトラップされたＤＮＡ二重結合剤に近接近の結果としてクエンチされる。増幅が進行するにつれて、プローブは、標的配列から分離されるか又は融解し、そのため、それによって発生したシグナルが回復する。ゆえに、増幅の各サイクルでは、プローブがアニールされる点で蛍光標識から蛍光ピークが生じる。ピーク強度は、より多くの標的配列がプローブへの結合に利用可能となるため、増幅が進行するにつれて減少する。
【０１１８】
各サイクル中の試料の蛍光標識の蛍光をモニターすることによって、増幅反応の進行は、種々の方法でモニターされ得る。例えば、融点ピークによって与えられるデータは、融点ピーク下の面積を計算し、サイクル数に対してプロットしたこのデータによって分析可能である。
【０１１９】
蛍光は、既知の蛍光光度計を用いて適切にモニターされる。これらからのシグナルは、例えば、光電子増倍管電流の形態で、データ処理装置ボードに送られ、各試料チューブと関連したスペクトルに返還される。複数のチューブ、例えば９６チューブは、同時に評価することができる。データは、このようにして、反応全体で周期的な間隔、例えば１０分に１回ごとに回収されもよい。
【０１２０】
このデータは、試料中に存在する標的核酸の量を定量するための機会を提供する。
さらに、プローブハイブリダイゼーションの動力学は、絶対的に標的配列の濃度の測定を可能にする。試料からの蛍光の変化は、試料に対するプローブのハイブリダイゼーションの比率の計算を可能にする。ハイブリダイゼーションの比率における増加は、試料中に存在する標的配列の量に関連する。標的配列の濃度は増幅反応が進むにつれて増加するので、プローブのハイブリダイゼーションはより迅速に行われる。したがって、このパラメータはまた、定量の基礎として用いることができる。データ処理のこのモードは、情報を提供するためのシグナル強度に依存しないという点で有用である。
【０１２１】
適切な他の蛍光色素は、特定の蛍光プローブラベルに含まれ、ローダミン染料又はＣｙ５、Ｃｙ３、Ｃｙ５．５、フルオレセイン若しくはその誘導体などの他の染料である。具体的な誘導体は、商品名ＦＡＭ又はＪＯＥであるカルボキシフルオレセイン、例えば５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン又はそれらのスクシンイミジルエステル類である。しかしながら、上記で検討したように、これらの正確な選択は、利用される核酸染色試薬に依存する。しかしながら、特に赤色核酸染色試薬を用いることによって、使用するために利用可能な蛍光色素の範囲が拡張される。
【０１２２】
いずれかの標識は、伝統的な方法でプローブに結合されてもよい。プローブに沿った蛍光標識の位置は中間であるが、一般にはそれらがプローブの末端領域で位置される。
【０１２３】
好ましくは、それらは、プローブの３’端に位置され、次に増幅中のポリメラーゼによるプローブ伸長を阻害するために、それらは、立体的又は化学的ブロック剤として作用するためである。これは、増幅反応中にプローブの３’末端をブロックするために、リン酸化などの他の測定を採用するという必要性を回避することができる。
【０１２４】
プローブが増幅反応中に用いられるＤＮＡポリメラーゼによって加水分解され、それによって蛍光標識を放出するようなプローブ及びアッセイ条件を設計することは可能である。この場合、プローブは、ＰＣＲ反応のアニーリング及び伸長時期の間に結合するように設計され、このアッセイ中に用いられるポリメラーゼは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するものである。放出された蛍光標識は、ＤＮＡ二重鎖結合剤によってもはやクエンチされないので、シグナル増加を生じさせる。したがって、この場合には、反応は、遊離した蛍光標識のシグナル増加を観察することによってモニターすることができる。シグナルは、プローブが標的又は生成物と相互作用する上記のものである。しかしながら、この場合、シグナルは、遊離した結合プローブ及びそのままの結合プローブの量の間の相違を測定するためにアニーリング段階中にモニターすることができる。
【０１２５】
しかしながら、このアッセイでは、プローブは、シグナル産生がプローブを分離せずに達成し得るので、このように消費されることは必要でない。
【０１２６】
反応の各段階で存在する増幅産物の量に直接関連し、及び／又は、例えば急速ＰＣＲにおいて、反応速度が最も重要である完全に可逆的であるシグナルを達成するために、プローブは、標的配列から無傷で放出されるように設計されることが好ましい。これは、例えば、増幅反応の伸長期の間であってもよい。しかしながら、シグナルは、プローブの加水分解に依存しないので、プローブは、増幅サイクル中のいずれかの段階で標的配列とハイブリダイズし融解するように設計されてもよい。例えば、サイクルの伸長期以外の段階で最も強力にハイブリダイズするプローブは、増幅反応との干渉が最小化することを確実にする。
【０１２７】
伸長温度で又はそれ以下で強力に結合するプローブが用いられる場合、標的配列から無傷でのそれらの放出は、増幅反応中のポリメラーゼのようなＴａｑ又はＰｗｏのＳｔｏｆｆｌｅ断片などの酵素を欠損している５’−３’エキソヌクレアーゼを用いることによって達成することができる。
【０１２８】
次に、プローブはこの反応に再度参加してもよく、それによりプローブの経済的な用途を示す。
【０１２９】
標的に可逆的にハイブリダイズし、加水分解されないプローブを用いたこの方法で生じたデータは、種々の方法で解釈可能である。その最も簡単な形態で、増幅反応の経過又は終端でプローブのアニーリング温度での蛍光標識の蛍光の減少は、存在する標的配列の量の増加を指示し、増幅反応が進行し、したがって、実際に標的配列が試料中に存在するという事実を示唆している。
【０１３０】
しかしながら、上記で概説したように、全体を通して増幅反応をモニターすることによって定量も可能である。
【０１３１】
最後に、下記にさらに検討されるように、配列に関する情報を得るために、終点測定又は全体のいずれかで特徴付けデータ、特に特定の融点分析を得ることが可能である。
【０１３２】
このようにして、本発明の好ましい態様には、核酸増幅を検出する方法が含まれ、該方法は、（ａ）核酸ポリメラーゼ、（ｂ）該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプライマー、（ｃ）該標的ポリヌクレオチド配列に結合することができ、蛍光標識を含むオリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｄ）該蛍光標識からの蛍光エネルギーを吸収することができる核酸染色試薬、特に上述される赤色核酸染色試薬の存在下で標的ポリヌクレオチドに対して核酸増幅を行うこと；及び、増幅反応中に蛍光の変化をモニターすることを含む。
【０１３３】
増幅は、当該技術分野において十分に理解されているように、ＤＮＡ鎖中の標的ヌクレオチド配列だけが増幅されるように設計されるプライマー対を用いて適切に実行される。核酸ポリメラーゼは、適切には、Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼである。
【０１３４】
増幅反応が実行され得る適切な条件は、当該技術分野において周知である。最適条件は、関連する特定のアンプリコン、使用されるプライマーの性質、及び採用される酵素に依存して、各場合で利用可能である。最適な条件は、当業者によって各場合において決定することができる。典型的な変性温度は９５℃のオーダーであり、典型的なアニーリング温度は５５℃の温度であり、伸長温度は７２℃のオーダーである。
【０１３５】
前述のように、特定の態様では、試料は、オリゴヌクレオチドプローブの蛍光標識によって吸収される波長の光によって照射され、蛍光標識からの発光シグナルは、反応の進行を測定するためにモニターされる。このシステムにおける他の蛍光色素はまた、例えば、複数のアッセイで所望によりモニターされてもよく、これらは、従来の方法を用いて解析される必要がある場合がある。しかしながら、核酸染色からのシグナルをモニターする必要はない場合があるが、ただし、これは、蛍光標識からのシグナルと重複せず、かつ、顕著に干渉しないという条件である。
【０１３６】
適切には、蛍光は、増幅プロセスを通じて、好ましくは各増幅サイクル中の同じ点でモニターされる。特に、蛍光は、プローブが標的にアニールする温度でモニターすることが必要である。例えば、これは、約６０℃の温度であってもよい。
【０１３７】
標的が形成されるにつれて、プローブはそれにアニールされるようになり、核酸染色試薬に近接近してもたらされる結果としてクエンチされる。この蛍光の減少は、増幅の進行を指示している。
【０１３８】
試料に存在するＴａｑポリメラーゼなどのポリメラーゼは、プローブを標的から取り除く効果を有する。この効果は、プローブのアニーリング温度などのポリメラーゼに対する次善の温度で低レベルで起こる。したがって、この温度で、これらの２つの反応、アニーリング温度でのプローブの結合及びプローブを標的から取り除くためのポリメラーゼの効果は競合する。一般に、前者の反応は、かなりの数の反応サイクルに対して優勢であり、増幅反応をモニターすることが可能である。しかしながら、最終的に、バランスシフト及びポリメラーゼの効果がより優勢になると、蛍光の上昇が観察される場合がある。したがって、これらの結果は、「フック（ｈｏｏｋ）」効果を表すことができ、生成物の再アニーリングがプローブ／生成物アニーリングよりも好適である場合に生じると考えられ、増幅反応の終了での蛍光曲線の方向に変化を生じさせる。本発明の方法を用いて得られるデータは、増幅反応の進行をモニターするために処理することができ、したがって、試料中に存在する標的の量を定量するために用いることができる。
【０１３９】
得られたデータを解釈するために、ある種の調整が必要となる場合がある。例えば、伝統的なＰＣＲモニタリング反応、例えばＷＯ９９／２８５００に記載されているものでは、ＰＣＲ反応は、蛍光の指数関数的な上昇をもたらし、そのため、バックグランド蛍光の基準調整は得られた最低値から誘導されることが必要である。
【０１４０】
対照的に、本出願の方法では、ＰＣＲ反応の進行は、進行的により多くの標識されたプローブがＤＮＡ二重結合剤、及び特に核酸染色によってクエンチされるので、最終的には指数関数的な減少となる。したがって、基本調整は、達成される蛍光の最高レベルに基づくことが必要である。
【０１４１】
これは、試料反応からデータを採取し、全てのデータポイントに下記の方程式：
ｙ＝１／ｘ
ｚ＝ｙ−ＭＩＮ
を適用することによって適切になされる。式中、ｘは、ＬｉｇｈｔＣｙｌｅｒなどのＰＣＲ機器からのデータポイントであり、ｚは、基本調整されたデータポイントであり、ＭＩＮは、全データセットと比較したｙについての最小値である。Ｚ対サイクル数のプロットは、適切な基準調整が計算されるのを可能にする。
【０１４２】
この方法は、特定の配列の特徴を決定するためにハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いることができる。
【０１４３】
したがって、更なる局面では、本発明は、配列の特徴を決定するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）該配列を含むことが疑われる試料に、該標的配列に特異的な蛍光標識したプローブ、及びプローブ上の蛍光標識からの蛍光を吸収可能なＤＮＡ二重結合剤を添加すること、ここで、プローブ又はＤＮＡ二重結合剤の標識の１つは核酸染色試薬であり、特に上述される赤色核酸染色試薬である；
（ｂ）該プローブが標的配列にハイブリダイズする最中の可変セットの反応条件に該試料を供すること；
（ｃ）該試料からの蛍光をモニターし、プローブの試料へのハイブリダイゼーション、又はプローブと標的核酸配列との間に形成される二重鎖の不安定化の結果として蛍光が変化する、該配列に特徴的な特定の反応条件を決定すること
を含む。
【０１４４】
適切な反応条件には、温度、電気化学的なもの、又は特定の酵素若しくは化学物質の存在に対する応答が含まれる。これらの特性は変化するので、蛍光の変化をモニターすることによって、配列の正確な性質の情報特徴付けを決定することができる。例えば、温度の場合では、プローブが標的配列から分離又は「融解する」温度が決定され得る。これは、例えば、遺伝子診断における対立遺伝子変異を含む配列における多形を検出し、所望により定量するためにも非常に有用であり得る。「多形」によって、配列、特に天然において生じる場合がある転位、トランスバージョン、挿入、欠失又は反転が含まれる。
【０１４５】
プローブの融解の履歴現象は、標的配列がたった１つの塩基対によって変化する場合に異なっている。したがって、試料がたった１つの対立遺伝子変異を含む場合、プローブの融解の温度は、たった１つの別の対立遺伝子変異を含む試料に観られるものとは異なっている特定の値となる。試料は、対立遺伝子変異のそれぞれに対応する２つの融点を示す対立遺伝子の両方を含む。
【０１４６】
類似の考察は、電気化学的特性に関して、又はある種の酵素若しくは化学物質の存在下で適用する。プローブは、電気化学ポテンシャルが適用され得る固体表面に固相化することができる。標的配列は、表面の正確な性質に依存して特定の電気化学的値でプローブに結合するか又は取り除かれる。
【０１４７】
この態様は、上述したＰＣＲ反応などの増幅反応と連動して作用することができ、又は個別に採用することができる。
【０１４８】
本発明の更なる側面には、本発明の方法に用いられるキットが含まれる。これらのキットは、核酸染色試薬、特に、上述したような赤色核酸染色試薬を含む。キットの他の潜在的な成分は、増幅反応に用いられる試薬、例えばＤＮＡポリメラーゼ（「ホットスタート」反応用の化学的に修飾したＴＡＱを含む）、プライマー、バッファー、及び抗Ｔａｑ抗体などの「ホットスタート」試薬などのＰＣＲプロセスを改善することで知られている添加物、又は同時係属の国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ０２／０１８６１に記載されるピロリン酸塩及びピロホスファターゼを含む。キットには、付加的に又は代替的に、蛍光標識される標的配列に対するプローブが含まれてもよい。特に、核酸染色試薬は、プローブの蛍光標識から蛍光を吸収することである。
【０１４９】
キットは、単一の容器に全ての試薬が一緒に含まれてもよく、又はその場で混合するために別々の容器に入っていてもよい。
【０１５０】
上述したような核酸染色試薬の使用は、ユニバーサル・アクセプター・アレンジメント（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ａｃｃｅｐｔｏｒ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を提供し、その場合、複数の光源を用いて、１個のＤＮＡ結合染料にエネルギーを移すことが可能である。これは、多数の利点を生じ、アッセイが多重で良好に実行されるという事実が含まれる。それは多くのプラットフォームで行うことができ、アクセプター染料のモニタリングを必要としない。
【０１５１】
さらに、染料の波長の範囲は、新規の可能性を提供する。同じ反応において、ユニバーサル・ドナー及びユニバーサル・アクセプターの両方のメカニズムを有するようにアレンジすることが可能である。短い波長（例えば、ＵＶダイオード）は、上述される二重結合剤として用いられると、より長い波長の核酸染色試薬へのエネルギー移動のために標識を励起することができる。第２のダイオードは、蛍光標識を用いて第２のプローブへの更なるエネルギー移動用に同じ核酸染色試薬を励起するために用いることができる。
【０１５２】
ＰＣＲを実行するようにアレンジされた市販されている大部分の機器は、複数の光源を有するが、ＳＹＢＲ染料は業界標準となっている。しかしながら、別の波長を用いれば、プローブ標識発光と干渉しないＤＮＡ結合染料は容易に利用可能な技術オプションである。
本発明は、ここで、添付の図面に関する例証として具体的に記載される。
【実施例】
【０１５３】
実施例１
本出願人は、核酸染色試薬のＳＹＴＯ（登録商標）赤色ファミリーから蛍光標識したプローブ及び様々な核酸染色試薬を利用して実験を行った。これらの染料は、阻害なしにＰＣＲに添加することができ、高濃度で添加され得ることが見出された。それらは、プローブ上の多数の蛍光色素と組み合わせることができるように広範囲の波長で利用可能である。
【０１５４】
バシラス・グロビイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｏｂｉｉ）遺伝子配列のためにＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅ（登録商標）フォーマットのＰＣＲは、下記の実験プロトコールを用いて実行した。
【０１５５】
水性ＰＣＲ混合調合物を調製し、下記の成分：
Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８ ５０ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） ２５０ｎｇ／μｌ
塩化マグネシウム ３ｍＭ
ｄＵＴＰヌクレオチド ２００μＭ
Ｔａｑポリメラーゼ ０．０４ユニット／μｌ
抗Ｔａｑ抗体 ０．０４ユニット／μｌ
フォワード・プライマー １μＭ
リバース・プライマー １μＭ
ＳＹＴＯ（登録商標）染料 ５μＭ
蛍光標識したプローブ ０．２μＭ
を含んでいた。
【０１５６】
フルオレセイン標識したプローブ又はＳＹＴＯ（登録商標）染料のいずれかを含まない負の対照反応も行った。
【０１５７】
試験したＳＹＴＯ染料には、ＳＹＴＯ（登録商標）６０、ＳＹＴＯ（登録商標）６１及びＳＹＴＯ（登録商標）６３が含まれる。次に、反応混合物を遠沈させ、下記のサイクルプログラムに基づいてＲｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒで実行した：
【０１５８】
変性
９５℃、５分間
サイクル×５０
９５℃、５秒
５５℃、２０秒
７４℃、５秒
融解分析×１
５５℃、１５秒
【０１５９】
０．１℃／秒で９５℃まで傾斜してゆっくり上昇させる。この工程全体で蛍光を回収した。
試験した染料は、この手法を通じてフルオレセインシグナルを首尾よくクエンチした。
【０１６０】
これらの実験の結果は図１〜６に示される。図１〜４において、Ｆ１チャネルは、２つのＤＮＡ希釈剤の増幅とともに蛍光の減少を示す。Ｆ３チャネルは、インターカレーターの赤色発光における減少を示す。
【０１６１】
グラフ（図５及び６）は、ＳＹＴＯ６３／フルオレセイン実験に関して蛍光の逆数プロットを示す。ＳＹＴＯ６３／フルオレセインの比率も提供される。しかしながら、Ｓｙｔｏ６３（Ｆ３チャネル）からフルオレセインＦ１チャネルのスペクトルの重複がないため、結果を分析するためにこれらのエネルギーをモニターし、スペクトル的に解析する必要はない。
【０１６２】
実施例２
口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）遺伝子配列のためのＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅ（登録商標）フォーマットにおけるＰＣＲは、下記の実験プロトコールを用いて実行される。標的のためのプライマー及びプローブは、従来の方法を用いて設計した。プローブをＦＡＭ分子で標識した。内部対照核酸をそのためのＪＯＥ標識したプローブとともに添加した。
【０１６３】
下記のプロトコールを用いた。
【０１６４】
【表２】
【０１６５】
【表３】
【０１６６】
反応中、ＦＡＭは、ＬＣ２．０装置の青色ＬＥＤによって励起した。
【０１６７】
読み取りパラメータ
ＦＡＭ−ＪＯＥ−Ｓｙｔｏ６３色補正：
ＦＭＤＶ特異的なテンプレート ５３０ｎｍ（ＦＡＭ ５２１ｎｍ）
ＦＭＤＶ−λ競合内部対照 ５６０ｎｍ（ＪＯＥ ５４８ｎｍ）
【０１６８】
試料の１０-3〜１０-6の希釈範囲全体での結果をそれぞれ図７〜９に示す。
【０１６９】
アンプリコンはＰＣＲ中に蓄積されるので、プローブ上のＦＡＭ標識は、ＳＹＴＯ６３はそこからのエネルギーを受け入れるためクエンチされるようになることは図７から明確である。ＦＡＭシグナルは、サイクル数の増加及び様々な量の開始テンプレートとともに減少していることが明確に観察され、これは、増幅をモニターするための確実なシグナルシステムであることを指示している。
【０１７０】
同様のシグナルは、内部対照配列からのＪＯＥシグナルで見られる（図８）。ＦＡＭ及びＪＯＥシグナルは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ２．０ソフトウェアの色補正アルゴリズムを用いて解析された。
【０１７１】
対照的に、図９に示されるように、ＦＡＭ配列からの発光は６７０ｎｍで測定され、サイクル数の増加及び様々な量の開始テンプレートとともに増加する。したがって、ＦＡＭ及びＪＯＥシグナルからのエネルギーを吸収している。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１ａ】ＳＹＴＯ６３を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図１ｂ】ＳＹＴＯ６３を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図１ｃ】ＳＹＴＯ６３を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図１ｄ】ＳＹＴＯ６３を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図２ａ】ＳＹＴＯ６２を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図２ｂ】ＳＹＴＯ６２を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図２ｃ】ＳＹＴＯ６２を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図２ｄ】ＳＹＴＯ６２を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図３ａ】ＳＹＴＯ６１を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図３ｂ】ＳＹＴＯ６１を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図３ｃ】ＳＹＴＯ６１を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図３ｄ】ＳＹＴＯ６１を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図４ａ】ＳＹＴＯ６０を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図４ｂ】ＳＹＴＯ６０を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図４ｃ】ＳＹＴＯ６０を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図４ｄ】ＳＹＴＯ６０を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図５ａ】ＳＹＴＯ６３／フルオレセイン実験に関連した蛍光の逆数プロットを示す。
【図５ｂ】ＳＹＴＯ６３／フルオレセイン実験に関連した蛍光の逆数プロットを示す。
【図５ｃ】ＳＹＴＯ６３／フルオレセイン実験に関連した蛍光の逆数プロットを示す。
【図５ｄ】ＳＹＴＯ６３／フルオレセイン実験に関連した蛍光の逆数プロットを示す。
【図６ａ】ＳＹＴＯ６３／フルオレセイン実験に関連した蛍光の逆数プロットを示す。
【図６ｂ】ＳＹＴＯ６３／フルオレセイン実験に関連した蛍光の逆数プロットを示す。
【図７】本アッセイで使用される標的核酸用のオリゴヌクレオチドプローブに結合した蛍光色素（ＦＡＭ）からの発光シグナルを示す。
【図８】本アッセイで使用される内部対照の蛍光色素（ＪＯＥ）からの発光シグナルを示す。
【図９】図７及び８に示されるようなＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅ（商標）アッセイとの関連で用いた場合のＳＹＴＯ６３からの発光シグナルを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を検出又は特徴付けるための方法における試薬の使用、例えば、増幅反応を定量的にモニターすることによって、試料中の標的ポリヌクレオチドを検出するための方法、並びにこれらの方法において使用するためのキットを提供する。この方法は、特に、多型又は対立遺伝子変異の検出に適しており、そのため診断方法に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
既知の蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）モニタリング技術には、いくつかの第二世代のＰＣＲ熱サイクル装置上で使用することができる鎖特異的及び包括的ＤＮＡインターカレーター技術が含まれる。これらの反応は、サーマルサイクラーの密封したチューブフォーマット中で均質に実行される。反応は、蛍光光度計を用いてモニターされる。このアッセイの正確な形式は変更されるが、多くの場合、増幅産物の存在を示すシグナルを生じさせるために、システム内で２つの蛍光部分間の蛍光エネルギー移動、即ちＦＥＴに依存する。
【０００３】
包括的方法は、二本鎖ＤＮＡ種に結合した場合、蛍光増加を示すＤＮＡインターカレーティング染料（ｄｙｅ）を利用する。増幅中のＤＮＡのバルク濃度の上昇による蛍光増加は、反応進行を測定し、標的分子のコピー数を決定するために用いることができる。さらに、制御された温度変化を用いて蛍光をモニターすることによって、ＤＮＡ融解曲線は、例えば、ＰＣＲ熱サイクルの終端で生じさせ得る。
【０００４】
包括的ＤＮＡ法は、核酸のバルク濃度の上昇をモニターするために用いられる場合、これらのプロセスは、（下記で検討したいくつかの他の既知のアッセイと比較して）最小時間ペナルティを用いてモニターすることができる。１つの蛍光読み取りは、全ての反応において同じ点で行われ得る。エンドポイント融解曲線分析は、アンプリコンからの人為的な影響を選別し、アンプリコンを識別するために用いることができる。産物の融解ピークは、アガロースゲル電気泳動によって視覚化することができない濃度について測定することができる。
【０００５】
例えば複数の試料に対して高分解能の融解データを得るために、融解実験は、最大５分を要する既存のハードウェアでゆっくりと実行しなければならない。しかしながら、蛍光増幅を連続的にモニターすることによって、融解及びハイブリダイゼーションの履歴現象の３Ｄイメージが生じ得る。この３Ｄイメージは、アンプリコン依存的であり、産物の選別のために十分な情報を提供することができる。
【０００６】
ＤＮＡ融解曲線分析は、概して、ＰＣＲ熱サイクルの最適化に力強いツールであることが判明している。アンプリコンの融解温度を測定することによって、この温度までその後のＰＣＲサイクルの変性温度を下げることが可能となる。標的ＤＮＡというよりはむしろ第一世代の反応産物由来の増幅についての最適化は、その後のサイクルに生じる人為的な影響の形成を減少させる。プライマーオリゴヌクレオチド及びそれらの相補体の融解温度は、それらのアニーリング温度を決定するために使用可能であり、実証的な最適化に対する必要性を減少させる。
【０００７】
しかしながら、包括的なインターカレーター法は、擬似的な鎖特異的に過ぎず、したがって、鎖特異的な検出が必要である場合、あまり有用ではない。
【０００８】
鎖特異的な方法は、増幅反応の進行をモニターするために追加の核酸反応成分を利用する。これらの方法は、多くの場合、検出の基礎として、蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）を用いる。１以上の核酸プローブは、蛍光分子で標識され、その１つは、エネルギードナーとして作用し得て、その他は、エネルギーアクセプター分子である。これらは、ある場合には、それぞれレポーター分子及びクエンチャー分子として知られている。ドナー分子は、その励起スペクトル範囲内にある光の特定の波長で励起され、その後、その蛍光放出波長内で光を発光する。アクセプター分子はまた、種々の距離依存的なエネルギー移動メカニズムによって、ドナー分子からのエネルギーを受け入れることによりこの波長で励起される。生じる可能性のある蛍光エネルギー移動の特別な例は、蛍光共鳴エネルギー移動、即ち「ＦＲＥＴ」である。一般に、アクセプター分子は、近接近（例えば、同じ又は隣接する分子）である場合、ドナー分子の励起エネルギーを受け入れる。蛍光エネルギー移動検出の基礎は、ドナーでの変化をモニターし、励起波長を受け入れることである。
【０００９】
ＦＥＴ又はＦＲＥＴプローブの共通に用いられる２つのタイプがあり、アクセプターからドナーを分離するための核酸プローブの加水分解を用いるものであり、ドナー及びアクセプター分子の空間的関係を変更するためにハイブリダイゼーションを用いるものである。
【００１０】
加水分解プローブは、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブとして市販されている。これらは、ドナー及びアクセプター分子で標識されるＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる。プローブは、ＰＣＲ産物の一本鎖上の特定領域に結合するように設計される。ＰＣＲプライマーのこの鎖へのアニーリング後、Ｔａｑ酵素は、５’→３’ポリメラーゼ活性を用いてＤＮＡを伸長する。Ｔａｑ酵素はまた、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示す。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、Ｔａｑ伸長をプライミングすることからそれらを避けるためにリン酸化によって３’末端で保護される。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、産物鎖へハイブリダイズすると、伸長しているＴａｑ分子はまた、プローブを加水分解し、検出の基礎として、アクセプターからドナーを遊離させることができる。この場合のシグナルは累積的であり、遊離したドナー及びアクセプター分子の濃度は、増幅反応の各サイクルに伴って増加する。
【００１１】
シグナル発生は、プローブの加水分解反応の発生に依存するという事実は、この方法と関連した時間ペナルティがあることを意味する。さらに、プローブの存在は、ＰＣＲプロセスの円滑な証左を妨害する場合がある。
【００１２】
さらに、加水分解は、例えば、多数の増幅サイクル、例えば５０を超えるサイクルを必要とする場合、非特異的となり得ることが見出されている。これらの場合において、プローブの非特異的な加水分解は、シグナルの過度の上昇をもたらす。
【００１３】
これは、このような技術がＩｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．のＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ（商標）及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）などの迅速な熱風サーモサイクラーの開発に伴ってより著名となっている急速ＰＣＲ法とあまり適合しないことを意味する。他の急速ＰＣＲ装置は、例えば、同時係属の英国特許出願第９６２５４４２．０号及び第９７１６０５２．７号に記載されている。従来のサーマルサイクルと比較して急速サイクルの利点は、他に報告されている。死亡又は重篤な傷害が回避されるべきで場合に、結果の迅速性が重要である場合、このような技術は、例えば生物兵器に対する検出システムに特に有用である。
【００１４】
さらに、加水分解プローブは、融解の履歴現象に関して有意な情報を提供しない。これは、シグナル発生は、概して、アンプリコンの融解温度というよりはむしろプローブの加水分解に依存しているためである。
【００１５】
米国特許第５，４９１，０６３号は、ＤＮＡ結合剤によって、標識した一本鎖オリゴヌクレオチドからのシグナルの修飾に依存する蛍光標識したプローブの溶液中でクエンチング方法を記載している。ポリメラーゼ連鎖反応中のプローブ開裂（加水分解）後のプローブの鎖長の減少の結果として生じるこのシグナルの相違は、標的核酸の存在を検出する手段を提供することが示唆される。
【００１６】
ハイブリダイゼーションプローブは、多くの形体で利用可能である。分子指標は、ヘアピンループを形成するように相補的な５’及び３’配列を有するオリゴヌクレオチドである。末端蛍光標識は、ヘアピン構造が形成されるとＦＲＥＴが生じる近接近の状態にある。分子指標の相補配列のハイブリダイゼーション後、蛍光標識は分離され、このため、ＦＲＥＴは生じず、これは検出の基礎を形成する。
【００１７】
標識したオリゴヌクレオチド対はまた用いることができる。これらは、ＦＲＥＴが生じ得るようにドナー及びアクセプター分子を一緒にするＰＣＲ産物鎖上の近接近な状態でハイブリダイズする。ＦＲＥＴの増加は、検出の基礎である。このタイプの変形は、１つの隣接プローブを用いた標識した増幅プライマーを用いることを含む。
【００１８】
２つのプローブ、又は２つの標識分子を含む分子指標方のプローブの使用は、このプロセスに関係する費用を増やす。さらに、この方法は、互いに近接近な状態で特異的に結合するのに十分な長さである２つのプローブが知られるように合理的に長い既知の配列の存在を要する。これは、いくつか診断用途における問題となり得て、この場合、ＨＩＶウイルスなどの、効果的なプローブを設計するために用いることができる生物において保存された配列の長さが相対的に短くてもよい。
【００１９】
さらに、プローブ対の使用は、より複雑な実験的設計を伴う。例えば、プローブの融解によって与えられるシグナルは、両方のプローブの融解脱落の作用である。小さなミスマッチの研究、又はプローブの１つが（例えばイントロンのどちらかの側の配列がプローブ部位として利用され得る試料中のＤＮＡと比較してＲＮＡを検出するために）スプライス領域を横断して結合するために要求される研究は、他のプローブが即座に溶解する場合には誤った結果を生じ得る。
【００２０】
ＷＯ９９／２８５００は、試料中の標的核酸配列の存在を検出するために非常に成功したアッセイについて記載している。この方法では、ＤＮＡ二重鎖結合剤及び該標的配列に特異的なプローブが試料に添加される。プローブは、該ＤＮＡ二重鎖結合剤から蛍光を吸収するか又は該ＤＮＡ二重鎖結合剤に蛍光エネルギーを与えることができる反応分子を含む。次に、この混合物は、標的核酸が増幅され、条件は、プローブが標的配列にハイブリダイズする増幅プロセス中又はその後のいずれかに誘導される増幅反応に晒される。該試料からの蛍光をモニターする。
【００２１】
プローブは標的配列にハイブリダイズするので、インターカレーティング染料などのＤＮＡ二重鎖結合剤は、鎖間にトラップされる。一般に、これは、該染料と関連した波長の蛍光を増加する。しかしながら、反応分子が染料（即ち、それはアクセプター分子である）からの蛍光を吸収し得る場合、ＦＥＴ、特にＦＲＥＴを用いて該染料から発光エネルギーを受け入れ、そのため、その特徴的な波長で蛍光を放出する。アクセプター分子からの蛍光の増加は、染料の蛍光とは異なる波長であり、二重鎖形成におけるプローブの結合を指示する。
【００２２】
同様に、反応分子は、染料（即ち、それはドナー分子である）に蛍光を与えることができる場合、ドナー分子からの発光は、ＦＲＥＴの結果として減少し、この減少が検出され得る。この染料の蛍光は、これらの環境下で期待されるものよりも増加する。
【００２３】
プローブ上の反応分子からのシグナルは、鎖特異的なシグナルであって、試料内の標的の存在を指示する。このようにして、反応分子からの蛍光のシグナル変化は、プローブを含む二重鎖の形成又は不安定化を示し、好ましくはモニターされる。
【００２４】
ＤＮＡ二重鎖結合剤は、プロセスにおいて用いることができ、それ自体、二重鎖形体でＤＮＡに付着又は関連付けられ、エネルギードナー又はアクセプターとして作用することができるいずれかの実体である。特定の例は、当該技術分野において周知であるようなインターカレーティング染料である。
【００２５】
インターカレーティング染料及び単独で標識されているプローブなどのＤＮＡ二重鎖結合剤の使用は、これらの成分が、二重に標識されたプローブを要求する他のアッセイよりも非常に経済的であるという点で有利である。たった１つのプローブを用いることによって、プローブの基礎を形成するのに必要な既知の配列の長さは、相対的に短くてもよく、したがって、この方法は、困難な診断状況でさえ用いることができる。この場合のアッセイは、ＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅ（登録商標）として知られている。
【００２６】
ＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅ（登録商標）アッセイに用いられるＤＮＡ二重鎖結合剤は、典型的には、インターカレーティング染料、例えばＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、例えばＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、エチジウムブロミド及びＹＯＰＲＯ−１であり、それ自体が蛍光性である。
【００２７】
反応分子と染料との間にＦＥＴ、例えばＦＲＥＴが生じるためには、（インターカレーティング染料又はプローブ上の反応分子のいずれかであってもよい）ドナーの蛍光放出は、アクセプター（即ち、染料又は反応分子以外のもの）よりも短い波長でなければならない。ドナー及び／又はアクセプターとして用いられる分子によって発生される蛍光シグナルは、可視スペクトル内のピークとして表すことができる。ＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅ（登録商標）の特定の既知の態様は、光（約４７０ｎｍ）がＤＮＡ結合剤であるＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ又はＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ−１を励起するために用いられる普遍的なドナーシステムを利用する。エネルギーは、Ｃｙ５及びＣｙ５．５などの特定のシアニン染料に移動する。
【００２８】
一般に、発光の波長における少なくともいくらかの重複部分がある。シグナルは鋭いピークである場合でさえ、蛍光分子からのシグナルのある種の「漏れ」があり、そのため、一般には、ＤＮＡ二重結合剤シグナルからのプローブによって与えられる鎖特異的なピークを解消するために必要とされる。これは、例えば、ドナーのスペクトルとアクセプターのスペクトルとの間の関係を経験的に決定すること、及びこの関係を用いて、ドナー及びアクセプターからのシグナルを標準化することによって行うことができる。ＳＹＢＲ染料は、発光の特にブロードなスペクトルを有し、したがって、カラー・デコンボリューションアルゴリズムは、アプリケーションに必要である。それらは、一般に本来は緑色である。
【００２９】
さらに、ＳＹＢＲ染料は、複数の反応において、プローブシグナルが増幅の増加とともに減少するように反応において制限となり得て、これにより、１つのプローブシグナルは他のものと競合し得る。
【００３０】
しかしながら、ＳＹＢＲ染料は、核酸検出及び融点分析を含む種々のアプリケーションにおいて幅広く用いられ、それは、大部分は、それらの蛍光特性が、フルオレセインなどの通常他に用いられる蛍光色素のものと「適合する」ためであり、これは、同じ光学（青色ダイオード／約５２０ｎＭフィルター）をそれらの検出に用いられるようにするためである。
【００３１】
リアルタイムＰＣＲにおいて、特にＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ及び関連染料のｐｉｃｏ ｇｒｅｅｎの使用は、米国特許第５，５６９，６２７号及び欧州特許第１１７９６００Ｂ号に記載されている。
【００３２】
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎは、この染料を効果的に用いるために、リアルタイムＰＣＲで幅広く用いられているが、一般に、条件の注意深い最適化を行うことが必要である。これは、ＤＭＳＯ、ウシ血清アルブミン及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの特定の試薬の封入を必要とする場合がある。濃度依存的にＰＣＲそれ自体の阻害はまた、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎが封入され、これが頻繁に塩化マグネシウムの添加を必要とする場合に観察される。
【００３３】
異なる染料である、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの代替物としての緑色染料であるＳＹＴＯ９の使用は、Ｍｏｎｉｓら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４０（２００５）２４−３４に検討されている。
【００３４】
ＷＯ２００４／０３３７２６は、プローブ上の蛍光標識からの蛍光エネルギーを吸収することができるが、シグナルと干渉するように、可視光を発光しないＤＮＡ二重鎖結合剤を用いるＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅ（登録商標）方法の変形を記載している。ＷＯ０２／０９７１３２は、特定のプローブタイプが利用される更なる変形を記載している。
【００３５】
しかしながら、本出願人は、このタイプの方法における使用のための特に有利な組合せを見出した。
【発明の開示】
【００３６】
本発明によれば、ＰＣＲ反応、特にリアルタイムＰＣＲ反応において核酸の検出における核酸染色試薬（ｓｔａｉｎ）の使用、特に赤色核酸染色試薬の使用を提供する。本明細書中では、ＰＣＲ反応は、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、及びＤＮＡ増幅反応を含む。
【００３７】
本明細書中で使用するとき、表現「核酸染色試薬」は、細胞又はそれらの内容物の染色に優先的に用いるために使用され、又は提案される製造物及び化合物を意味する。それらは、ＳＹＢＲ（登録商標）ｇｒｅｅｎ又はＳＹＢＲ（登録商標）ｇｏｌｄ並びにエチジウムブロミドなどの染料を除く。
【００３８】
特に、使用される核酸染色試薬は、一般式（Ａ）：
【００３９】
【化１】
【００４０】
で表されるチアゾールオレンジ部分を含むか又はそれから誘導されるものである。
【００４１】
赤色核酸染色試薬は、一般に、６００ｎｍを超える、例えば６１０〜６９０ｎｍの波長で蛍光は放出する。それらは、細胞透過性であり得て、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから市販されているＳＹＴＯ（登録商標）赤色蛍光核酸染色試薬であり、それらが細胞に入り、特に細胞核を染色する場合に、多くの生物学研究において知られており、使用に推奨されている。結果として、それらは、核小体及びミトコンドリアを示し得る。赤色ＳＹＴＯ染料は、以前には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅反応との関連で、インビトロでは核酸の検出に関連して利用されなかった。
【００４２】
このタイプの染色試薬は、一般に、例えば、ＷＯ９４／０２４２１３、ＷＯ９６／０１３５５２、ＷＯ００／０６６６６４、ＷＯ０２／０２８８４１、ＷＯ０４／０２５２５９、ＷＯ０５／０３８４６０、ＷＯ０５／０４７２４２、ＷＯ０５／０４７９０１、ＷＯ０５／０５６６８７及びＷＯ０５／０６４３３６、及び特にＷＯ００／６６６６４に記載されるようなシアニン染料であり、これらの文献は、参照により本明細書中に援用される。特に、この染色試薬は、米国特許第５，６５８，７５１号に記載されるような、色が赤色であるシアニン染料である。
【００４３】
これらの染料は、一般に、場合により置換されてもよい２種のヘテロ環式環系を含む不斉化学構造を含み、サブ式（ｉ）：
−（ＣＲ32＝ＣＲ31）n−ＣＲ30＝ （ｉ）
で表される架橋メチンによって連結される。
【００４４】
式中、ｎは、０、１又は２であり、Ｒ30、Ｒ31及びＲ32は、独立して、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-10シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールから選択される。特にＲ30、Ｒ31及びＲ32の少なくとも１つ、及び好ましくは全部は水素である。
【００４５】
本明細書中で使用するとき、用語「アリール」は、芳香族炭素環式基、例えばフェニル又はナフチルを意味する。用語「ヘテロアリール」は、例えば５〜２０原子の芳香族環式基を意味し、そのうち少なくとも１つは、酸素、窒素又は硫黄から選択されるヘテロ原子である。ヘテロアリール基は、本来は、適切には単環式又は二環式である。
【００４６】
一般に、本発明に有用な赤色染色試薬では、ｎは１であるが、ヘテロ環式環が赤系統の色域に発光をシフトする効果がある場合は、他の値のｎが許容され得る。
【００４７】
例えば、赤色染色試薬は、ｎがゼロである化合物を含むことができ、これらの場合において、それらは、概して、例えば、ヘテロ原子、例えば窒素などの環に電子密度を与えることによって、エネルギーレベルを低下することができる緑色染料と比較して、環構造における修飾を含む。
【００４８】
上述したサブ式（ｉ）のメタン基のいずれかの側での結合のための具体的なヘテロ環式環系は、ＷＯ９４／０２４２１３、ＷＯ９６／０１３５５２、ＷＯ００／０６６６６４、ＷＯ０２／０２８８４１、ＷＯ０４／０２５２５９、ＷＯ０５／０３８４６０、ＷＯ０５／０４７２４２、ＷＯ０５／０４７９０１、ＷＯ０５／０５６６８７及びＷＯ０５／０６４３３６、及び特にＷＯ００／６６６６４に例示されている。
【００４９】
特に、塩基性ベンゾチアゾリル及びキノリニウム環を含むこれらの参考文献に記載されている化合物が調製されてもよい。
【００５０】
したがって、例えば、核酸染色試薬は、置換されたアザ−ベンゾリウム環である第１へテロ環式環を有し、それは、ピリジン、キノリン、ピリジニウム又はキノリニウム基である第２ヘテロ環式環に上述したサブ式（ｉ）のメチンリンカーを介して連結されてもよい。
【００５１】
特に、このような化合物は、一般式（Ｉ）：
【００５２】
【化２】
【００５３】
に含まれ得て、式中、Ａは、各環において、６原子を有する１又は２個の縮合した芳香族環を形成し、そのうちの少なくとも１つは、場合により、窒素であり、該環（単数または複数）は、場合によりさらに、１回以上、１〜６個の炭素を有するアルキル、１〜６個の炭素を有するアルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲン、若しくは−Ｌ−Ｒ．；又は−Ｌ−Ｓによって置換される。
【００５４】
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ15、又はＣＲ16Ｒ17であって、ここで、Ｒ15は、Ｈ又は１〜６個の炭素を有するアルキル基であり；Ｒ16及びＲ1７は、同一であるか又は異なっていてもよく、独立して、１〜６個の炭素を有するアルキル基であり、又はＲ16及びＲ17は、一緒になって、５若しくは６員の飽和した環を形成し；ａは、０又は１である。
【００５５】
Ｒ2は、水素、場合により、スルホン酸塩、カルボキシ又はアミノによって置換される１〜６個の炭素を有するアルキル基であり；又は、Ｒ2は、−Ｌ−Ｒ．若しくは−Ｌ−Ｓ；又はテール；又はブリッジ−染料である。
【００５６】
ｎは、０、１又は２であり、好ましくは１である。
Ｙは、−ＣＲ3＝ＣＲ4−である。
ｐ及びｍは、ｐ＋ｍ＝１となるように、０又は１である。
【００５７】
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6、及びＲ7は、独立して、Ｈ；飽和若しくは不飽和の直鎖状又は分岐状の１〜６個の炭素を有するアルキル；又はハロゲン；又は環状基（アリール、ヘテロアリール、若しくは３〜１０個の炭素を有するシクロアルキルから選択され、それらのいずれかは、場合により、ハロゲン、アミノ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ又はカルボキシアルキル（ここで、各アルキル基は、１〜６個の炭素を有する）によって置換されてもよく、又はテール部分によって置換されてもよい）；又は−ＯＲ8、−ＳＲ8、−（ＮＲ8Ｒ9）；又はテール；又はＢブリッジ−染料；又は−Ｌ−Ｒx；又は−Ｌ−Ｓcであり、ここで、Ｒ8及びＲ9は、同じであるか又は異なっていてもよく、独立して、１〜６個の炭素を有するアルキル基；又は１〜２個の脂環式環若しくは芳香族環であり；あるいは、Ｒ8及びＲ9は、一緒になって、−（ＣＨ2）2−Ｖ−（ＣＨ2）2−であり、Ｖは、単結合、−Ｏ−、−ＣＨ2−、又は−ＮＲ10−であり、ここで、Ｒ10は、Ｈ又は１〜６個の炭素を有するアルキルである。
【００５８】
あるいは、Ｒ6及びＲ7は、縮合した芳香族環−Ｒ11＝Ｒ12−Ｒ13＝Ｒ14−を形成し、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、及びＲ14は、場合により、独立して、飽和若しくは不飽和の直鎖状又は分岐状の１〜６個の炭素を有するアルキル；又は−ＯＲ8、−ＳＲ8又は−（ＮＲ8Ｒ9）；又は環状基（アリール、ヘテロアリール、又は３〜１０個の炭素を有するシクロアルキルから選択され、それらのいずれかは、場合により、ハロゲン、アミノ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ又はカルボキシアルキル（ここで、各アルキル基は、１〜６個の炭素を有する）によって置換されてもよく、又はテール部分によって置換されてもよい）；又はテール；又はブリッジ−染料；又は−Ｌ−Ｒx；又は−Ｌ−Ｓcであり；Ｒ5は、飽和若しくは不飽和の直鎖状又は分岐状の１〜６個の炭素を有するアルキルであり；又は、Ｒ5は、環状基（例えば、３〜８原子の炭素環式基又は複素環式基）であり；又は、Ｒ5は、テール；若しくはブリッジ−染料；又は−Ｌ−Ｒx；若しくは−Ｌ−Ｓcであり；又は、Ｒ5は、電子対であり；Ｒ30、Ｒ31、及びＲ32は、独立して、Ｈ、１〜６個の炭素を有するアルキル、３〜１０個の炭素を有するシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり；ここで、Ｌ及びブリッジは、独立して、１つの共有結合、又は直鎖状若しくは分岐状の環式又はヘテロ環式の飽和又は不飽和のＣ、Ｎ、Ｐ、Ｏ及びＳからなる群から選択される１〜６個の水素以外の原子を有する共有連結であり、これによりこの連結は、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、アミド結合；又は、一重、二重、三重若しくは芳香族炭素−炭素結合；又は、リン−酸素、リン−硫黄結合、窒素−窒素又は窒素−酸素結合；又は、芳香族若しくはヘテロ芳香族結合のいずれかの組合せを含む。
【００５９】
Ｒxは、反応基であり；
Ｓcは、結合した（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）基であり；
テールは、ヘテロ原子含有部分である。
【００６０】
染料は、式（ＩＡ）：
【００６１】
【化３】
【００６２】
で表される化合物であり、式中、Ａ、Ｘ、Ｒ2、ｎ、Ｙ、ｍ、ｐ、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ７、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17、Ｒ18、Ｒ19、Ｒ20、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ24、Ｒ30、Ｒ31、Ｒ32、テール、又は環式基（アリール、へテロアリール又は３〜１０個の炭素を有するシクロアルキルから選択され、そのいずれかは、場合により、ハロゲン、アミノ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ又はカルボキシアルキル（ここで、各アルキル基は、１〜６個の炭素を有する）によって、又はテール部分によって置換されてもよい）は、上記で定義される通りであり；Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6又はＲ7の１つでブリッジに結合される。
【００６３】
反応基Ｒx及び結合した基Ｓcの具体例は、ＷＯ００／６６６６４に記載される通りである。これらの場合において、環Ａは、窒素原子を含む。
【００６４】
この一般的なタイプの化合物の他の例は、上記の式（Ａ）のチアゾールオレンジの環エレメントを含む化合物であって、したがって、式（ＩＢ）：
【００６５】
【化４】
【００６６】
（式中、ｎ、Ｒ2、Ｒ5、Ｒ30、Ｒ31及びＲ32は上記で定義される通りである）
で表される化合物である。
【００６７】
このような化合物には、式（ＩＡ）で表される化合物に関して、上述される置換基が含まれ得る。したがって、さらに一連の化合物は、赤色である式（ＩＩ）：
【００６８】
【化５】
【００６９】
で表される化合物であって、式中、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ30、Ｒ31、Ｒ32及びｎは、上記で定義される通りであり、Ｒ2は、水素、場合によりスルホン酸塩、カルボキシ、又はアミノによって置換される１〜６個の炭素を有するアルキル基であり；ただし、前記化合物は、ＳＹＢＲグリーン及びピコグリーン以外である。［ＳＹＢＲグリーン及びピコグリーンの構造は、それぞれＡ及びＢとして表される。］
【００７０】
【化６】
【００７１】
この場合において、ｎは０であり、Ｒ32、Ｒ31、Ｒ30は全て水素であり、Ｒ3は水素であり、Ｒ4はテール基であり、Ｒ5はフェニル以外に適切なものである。
【００７２】
具体的には、Ｒ2は、メチルなどの１〜６個の炭素原子を有するアルキル基である。
さらに、ｎの具体例は、０又は１であり、例えば０である。
【００７３】
ｎが１である場合、Ｒ32及びＲ33は、適切には水素である。
Ｒ30の具体例は、水素である。
【００７４】
適切には、Ｒ5は、テール基又はアリール若しくはピリジルなどの芳香族である複素環式基である。式（ＩＩ）（Ｒ5がヘテロアリールである）で表される化合物は、本発明の特定の態様を形成し、（ＩＩＡ）と称される。特に、ｎが０である場合、Ｒ5は、ピリジルなどのヘテロアリール基である。
【００７５】
テール基の具体例には、式：
リンク−スペーサー−キャップ
で表される基が含まれ、ここで、リンクは、本発明の染料のコア構造にテールが結合する連結部分である。スペーサーは、リンクをキャップに結びつける共有結合的連結であり、キャップは、ヘテロ原子成分を有するテールの部分である。
【００７６】
特に、リンクは、一重共有結合、エーテル連結（−Ｏ−）、チオエーテル連結（−Ｓ−）又はアミン連結（−ＮＲ20−−）（Ｒ20は、水素、Ｃ1-8アルキル基若しくは基−スペーサー’−キャップ’（スペーサー’及びキャップ’は、それぞれスペーサー及びキャップについて下記に定義される基である）から選択される）である。
【００７７】
適切には、リンク基は、基ＮＲ20（Ｒ20は、上記で定義されるとおりである）である。
【００７８】
スペーサー基の例は、１〜１６個のＣ、Ｎ、Ｐ、Ｏ若しくはＳ原子の直鎖状、分岐状、環状、複素環式、飽和又は不飽和配列の整列の直接的な結合である。あるいは、スペーサーは、一重共有結合であり、ただし、リンク及びスペーサーの両方が同時に一重共有結合ではない。好ましくは、スペーサー連結は、炭素原子で開始しかつ終了しなければならない。典型的には、スペーサーが１個の原子からなる場合、それは炭素原子であることが必要であり、それにより、スペーサー中の最初と最後の原子（この特別な例では、それら同じ原子である）は炭素である。スペーサーを作る１〜１６個の原子は、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル若しくはアミド結合；又は、一重、二重、三重若しくは芳香族炭素−炭素結合；又は、リン−酸素結合；又はリン−硫黄結合；又は、窒素−窒素結合；又は、窒素−酸素結合；又は、芳香族若しくはヘテロ芳香族結合のいずれかの適切な組合せを用いて合わせられる。スペーサーは、スペーサーの各原子の原子価状態を調整するために水素によってさらに置換される。
【００７９】
一般に、スペーサーの原子は、スペーサーの直鎖状の骨格における全てのヘテロ原子が、少なくとも１個の炭素原子によって分離され、好ましくは少なくとも２個の炭素原子によって分離されるように整列されている。典型的には、スペーサーは、直鎖状又は分岐状の飽和した鎖の１〜６個の炭素原子である。本発明の一態様では、スペーサーは、６員の芳香族環（フェニレン連結）を組み入れる。本発明の別の態様では、スペーサーは、５又は６員のヘテロ芳香族環を組み入れ、ここで、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ又はＳである。あるいは、スペーサーは、アミド連結、エステル連結、単純なエーテルおよびチオエーテル、及びアミンを直線な整列に組み入れ、例えば、−ＣＨ2ＣＨ2（Ｃ＝Ｏ）ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2である。好ましくは、スペーサーは、アルキレン−（ＣＨ2）k−（ｋ＝１〜８）であり、特にプロピレン基である。
【００８０】
リンク及びスペーサーは、組み合わせて、染料コア構造にヘテロ原子含有基であるキャップを結合させるために使用される。キャップは、式−ＯＲ21、−ＳＲ21、−ＮＲ21Ｒ22、又は−Ｎ+Ｒ21Ｒ22Ｒ23．ＰＳＩ-．に従って、酸素、硫黄又は窒素を含むことができ、ここで、Ｒ21、Ｒ22、及びＲ23は、独立して、Ｈであり、又は場合により置換された直鎖状若しくは分岐状の１〜８個の炭素を有するアルキル又はシクロアルキル基であり、ＰＳＩ-は、下記に記載されるように、適切に生物学的に適合可能な対イオンである。
【００８１】
Ｒ21、Ｒ22及びＲ23のいずれかがアルキル又はシクロアルキルである場合、それらは、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、１〜８個の炭素を有するアルコキシ、アミノ、カルボキシ又はフェニルから選択される１以上の基によって置換され、ここで、フェニルは、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ、１〜８個の炭素を有するアルコキシ、アミノ、１〜８個の炭素を有するアミノアルキル又は１〜８個の炭素を有するカルボキシアルキルによってさらに置換される。
【００８２】
本発明の別の態様では、１以上のＲ21、Ｒ22及びＲ23は、スペーサーと一緒になって、芳香族、ヘテロ芳香族、脂環式又はヘテロ脂環式環である５又は６員環を形成する。５又は６員環がヘテロ原子又はヘテロ脂環式である場合、この環は、Ｏ、Ｎ又はＳである１〜３個のヘテロ原子を含む。あるいは、１以上のＲ21、Ｒ22、及びＲ23は、Ｒ20及びスペーサーと一緒になって、上記に記載される芳香族、ヘテロ芳香族、脂環式又はヘテロ脂環式環である５又は６員環を形成する。好ましくは、Ｒ21、Ｒ22は水素、又は１〜８個の炭素を有するアルキルである。Ｒ23は、典型的には、Ｈ又は１〜８個の炭素を有するアルキルである。
【００８３】
キャップが−Ｎ+Ｒ21Ｒ22Ｒ23．ＰＳＩ．-である場合、生物学的に適合可能な対イオンである．ＰＳＩ-は、第４級アンモニウム塩であるキャップ窒素に存在する正電荷の均衡を保つ。本明細書中で使用するとき、生物学的に適合可能である基質は、使用される場合に毒性でなく、生体分子に実質的に悪影響を有しない。．ＰＳＩ-の例には、とりわけ、塩素、臭素、ヨウ素、硫酸塩、アルカンスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩、テトラフルオロホウ酸塩、テトラアリールホウ化物、硝酸塩、及び芳香族又は脂環式カルボン酸のアニオンが含まれる。好ましい．ＰＳＩ-対イオンは、塩素、ヨウ素、過塩素酸塩及び種々のスルホン酸塩である。
【００８４】
さらに、本発明のいくつかの態様では、キャップは、環構造を組み入れる。これらの態様では、キャップは、典型的には、５又は６員の窒素含有環を組み入れ、場合により追加のヘテロ原子（典型的には酸素）を含み、ここで、環窒素は、場合により、Ｒ23によって置換され、アンモニウム塩が得られる。キャップの特定バージョンには、限定されないが、その内容が参照により本明細書中に援用される米国特許第５，６５８，７５１号の表１に列挙されているものが含まれる。
【００８５】
テール基の具体例は、−ＮＲ20（Ｃ1-8アルキレン）ＮＲ21Ｒ22であり、ここで、Ｒ20、Ｒ21及びＲ22は、上記で定義される通りである。例えば、テール基は、サブ式（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）で表される基である。
【００８６】
【化７】
【００８７】
適切には、Ｒ3は水素であり、Ｒ4はテール基である。
特定の態様では、式（ＩＩ）で表される化合物は、式（ＩＩＩ）で表される化合物である。
【００８８】
【化８】
【００８９】
一態様では、式（ＩＩＩ）の化合物は、式（ＩＩＩＡ）で表される化合物である。
【００９０】
【化９】
【００９１】
別の態様では、式（ＩＩＩ）で表される化合物は、式（ＩＩＩＢ）で表される化合物である。
【００９２】
【化１０】
【００９３】
さらに別の態様では、式（ＩＩＩ）で表される化合物は、式（ＩＩＩＣ）で表される化合物である。
【００９４】
【化１１】
【００９５】
適切な赤色核酸染色試薬の特定の例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから市販されているＳＹＴＯ赤色核酸染色試薬であり、例えば、ＳＹＴＯ（登録商標）１７、ＳＹＴＯ（登録商標）５９、ＳＹＴＯ（登録商標）６０、ＳＹＴＯ（登録商標）６１、ＳＹＴＯ（登録商標）６２、ＳＹＴＯ（登録商標）６３及びＳＹＴＯ（登録商標）６４である。これらの染色試薬のスペクトル特性を表１に例証する。
【００９６】
【表１】
【００９７】
本出願人は、これらの染色試薬がリアルタイムＰＣＲ検出法との関連で特に有益であることを見出した。それらは、反応を阻害せず、ＳＹＢＴ（登録商標）染料よりも有意に少ない制限である広い濃度範囲で添加することができることが見出されている。（ＳＹＴＯ緑色核酸染色試薬を含むＳＹＴＯファミリーの他のメンバーはまた、これらの利点を有してもよいが、それらのシグナルが測定されるために必要とされない反応における使用にあまり適切ではない。）
【００９８】
結果として、それらは、核酸含量、したがってＰＣＲの進行のモニター、及び包括的な検出、内部対照の封入、融点分析などに利用することができる。
【００９９】
それらは、ＦＥＴ又はＦＲＥＴによって、フルオレセイン及びその誘導体、例えばＪＯＥを含む多種の最も容易に利用できる染料分子と相互作用することが見出されている。
【０１００】
したがって、これらの核酸染色試薬は、フルオレセインのモニターが必要とされる増幅反応、特にＰＣＲ増幅に利用可能である様々な蛍光色素に非常に有益な付加を与える。
【０１０１】
このようにして、更なる局面では、本発明は、増幅中の生物試料の核酸配列を検出する方法を提供し、下記：
熱安定性ポリメラーゼ及び標的核酸配列の増幅のために設定したプライマーを生物試料に添加する工程；
上記で定義される核酸染色試薬及び場合により追加のシグナル蛍光色素の存在下で、ポリメラーゼ連鎖反応によって標的核酸配列を増幅する工程；
核酸染色試薬又は任意の追加の蛍光色素のいずれかによって吸収される波長の光で生物試料を照射する工程；及び
該試料中の増幅された標的核酸配列の存在又は量に関連した試料からの蛍光放出を検出する工程
を含む。
【０１０２】
核酸染色試薬は、例えば、その内容が参照により本明細書に援用される米国特許第６，５６９，６２７号に記載される方法に類似した方法を用いて、特にリアルタイムで、反応を測定するために単独で用いることができ、それは、それらの阻害の欠如がこれに関連して有用だからである。
【０１０３】
しかしながら、一般に、それらは、これらの染色試薬の発光の波長がこれらの多くと適合可能であるため、別の蛍光色素との組合せで用いられる。
【０１０４】
特に、それらは、リアルタイムＰＣＲ反応において利用可能であり、その場合、増幅の進行がモニターされる。これらの反応は、ＴＡＱＭＡＮ（商標）アッセイ、及び二重ハイブリダイゼーションプローブを利用するアッセイを含む、上述したリアルタイム蛍光アッセイのいずれかを含むことができる。しかしながら、特に、それらは、ＲｅａｓｏｎＳｅｎｓｅ（登録商標）アッセイ、又はＷＯ０２／０９７１３２に記載されるこのアッセイの変形に利用される。
【０１０５】
したがって、特定の態様では、本発明は、試料中の標的核酸配列の存在を検出するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）標的核酸配列を含むことが疑われる試料に、ＤＮＡ二重結合剤、及び該標的配列に特異的なプローブを添加し、該プローブは、該ＤＮＡ二重結合剤からの蛍光を吸収するか又は該ＤＮＡ二重結合剤に蛍光エネルギーを与えることができる反応分子を含み、ここで、該反応分子又は該ＤＮＡ二重結合剤の１つは、上述される核酸染色試薬であり、他方は、蛍光色素、例えばフルオレセイン又はその誘導体である、
（ｂ）このように形成した混合物を標的核酸が増幅される増幅反応に供すること、
（ｃ）該プローブが標的配列にハイブリダイズする条件に該試料を供すること、及び
（ｄ）該試料からの蛍光をモニターすること
を含む。
【０１０６】
適切には、核酸染色試薬は、ＤＮＡ二重結合剤として用いられる。
上述したタイプの核酸染色試薬を用いることによって、非常に多数の従来の利用可能な蛍光色素であり得る、システムの他のシグナルエレメントのシグナルを重複するシグナルを供給するという問題を避けるか又は最小化することができる。特に、様々な波長を有する核酸染色試薬が利用可能であり、既知の蛍光色素、特にレポーター染料の中から適切な組合せ、並びに励起源を選択できることを意味し、結果として、シグナルの重複を最小化させるか又は発生しないようする。このようにして、ＤＮＡ二重結合剤からのシグナルからプローブからのシグナルを解明する必要性を排除することができ、意味のあるシグナルが測定される広いバンド幅が利用可能である。これは、装置、又は少なくとも装置に設置されたコンピュータ機器を単純化することができる。
【０１０７】
当該技術分野において理解されているように、蛍光をモニターするために、システム内の蛍光色素によって吸収される光の波長で試料を照射し、次に、適切な発光波長で蛍光の放出をモニターすることが必要である。１を超える蛍光色素は、このようにしてモニターされ得るが、光の１を越える波長で試料を照射し、様々な波長でも発光をモニターされる。本方法の特定の態様では、試料は、反応分子によって吸収される波長の光によって照射され、反応分子からの発光シグナルがモニターされる。核酸染色試薬からのシグナルをモニターする必要性はなく、それは、これがＪＯＥ及びＦＡＭなどの従来の蛍光色素からのシグナルと干渉しそうもないからである。
【０１０８】
したがって、このアッセイは、より広い範囲の機器で実行することができる。
あるいは、可視スペクトルでの自由なバンド幅のいずれかの領域は、追加のプローブを組み入れることによって引き出すことができ、このプローブは、異なった波長で蛍光を発する異なった標識を含み、それにより、１つの標的を同時にモニターすることができる。これは、複数のＰＣＲ反応の場合に特に有用であり得る。
【０１０９】
上述される核酸染色試薬は、例えば、従来の方法を用いて、特定の又は種々の従来の蛍光色素から蛍光エネルギーを吸収するかどうかを見るために試験可能である。特に、それらは、クエンチング特性を試験するための標識プローブ又は蛍光インターカレート剤であってもよい。この試験を実行するための適したプロトコールは、以下の実施例１に記載されている。
【０１１０】
反応混合物に添加される核酸染色試薬の量は、適切には、例えば、システム内の他の蛍光色素からのシグナルをクエンチし、測定可能なシグナルを引き起こすには十分であるが、増幅を阻害するには十分でない。これを達成する濃度範囲は、使用される正確な核酸染色試薬に依存して変化し、以下に例示される日常的な方法によって測定可能である。しかしながら、一般に、核酸染色試薬の濃度は、１〜１０μＭ、概して約５μＭである。
【０１１１】
特定のＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅ（登録商標）法は、その用途に非常に多目的である。それは、例えばＷＯ２００４／０３３７２６に検討されているように、試料中の標的核酸配列に関する定量的及び定性的データを生じさせるように用いることができる。特に、定性的な増幅に与えられる方法だけでなく、二重の不安定化温度又は融点などの特徴的なデータを得るために、追加して又はそれに代えて用いることもできる。
【０１１２】
ＲｅａｓｏｎＳｅｎｓｅ（登録商標）アッセイでは、試料は、増幅反応前、反応中又は反応後に試料にプローブをハイブリダイズする条件に晒されてもよい。したがって、このプロセスは、増幅及びモニタリングが初期に添加された全ての試薬を含む１個の容器内で実行することができるという点で、均質なように検出を達成することが可能である。その後の試薬の添加工程は不要である。（これはオプションであるが）固体支持体の存在下でこの方法を達成するのにいかなる必要性もない。
【０１１３】
プローブは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸分子を含むことができ、後者が一本鎖形体である場合、標的核酸配列にハイブリダイズする。この例では、工程（ｃ）は、標的核酸が一本鎖を与える条件の使用を伴う。
【０１１４】
プローブは、溶液中で遊離しているか、又は、例えば生成物の分離に有用な磁気ビーズの表面又は表面プラズモン共鳴検出器若しくは全内部反射蛍光検出器の導波管などの検出装置の表面などの固体支持体に固相化されていてもよい。選択は、観察される特定のアッセイの性質及び採用される特定の検出手段に依存する。
【０１１５】
特に、使用される増幅反応は、試料中に存在する標的核酸配列のいずれかが一本鎖となる条件に試料を供する工程を伴う。このような増幅反応には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が含まれるが、好ましくはＰＣＲ反応である。
【０１１６】
次に、適切なハイブリダイゼーション条件が与えられるという条件で増幅反応の経過中に、プローブはハイブリダイズすることができる。
【０１１７】
好ましい態様では、プローブは、これらの条件が増幅反応の各サイクル中に与えられるように設計されてもよい。このようにして、増幅反応の各サイクル中のある点では、プローブは標的配列にハイブリダイズし、そうすると直に蛍光シグナルがプローブと標的配列との間にトラップされたＤＮＡ二重結合剤に近接近の結果としてクエンチされる。増幅が進行するにつれて、プローブは、標的配列から分離されるか又は融解し、そのため、それによって発生したシグナルが回復する。ゆえに、増幅の各サイクルでは、プローブがアニールされる点で蛍光標識から蛍光ピークが生じる。ピーク強度は、より多くの標的配列がプローブへの結合に利用可能となるため、増幅が進行するにつれて減少する。
【０１１８】
各サイクル中の試料の蛍光標識の蛍光をモニターすることによって、増幅反応の進行は、種々の方法でモニターされ得る。例えば、融点ピークによって与えられるデータは、融点ピーク下の面積を計算し、サイクル数に対してプロットしたこのデータによって分析可能である。
【０１１９】
蛍光は、既知の蛍光光度計を用いて適切にモニターされる。これらからのシグナルは、例えば、光電子増倍管電流の形態で、データ処理装置ボードに送られ、各試料チューブと関連したスペクトルに返還される。複数のチューブ、例えば９６チューブは、同時に評価することができる。データは、このようにして、反応全体で周期的な間隔、例えば１０分に１回ごとに回収されもよい。
【０１２０】
このデータは、試料中に存在する標的核酸の量を定量するための機会を提供する。
さらに、プローブハイブリダイゼーションの動力学は、絶対的に標的配列の濃度の測定を可能にする。試料からの蛍光の変化は、試料に対するプローブのハイブリダイゼーションの比率の計算を可能にする。ハイブリダイゼーションの比率における増加は、試料中に存在する標的配列の量に関連する。標的配列の濃度は増幅反応が進むにつれて増加するので、プローブのハイブリダイゼーションはより迅速に行われる。したがって、このパラメータはまた、定量の基礎として用いることができる。データ処理のこのモードは、情報を提供するためのシグナル強度に依存しないという点で有用である。
【０１２１】
適切な他の蛍光色素は、特定の蛍光プローブラベルに含まれ、ローダミン染料又はＣｙ５、Ｃｙ３、Ｃｙ５．５、フルオレセイン若しくはその誘導体などの他の染料である。具体的な誘導体は、商品名ＦＡＭ又はＪＯＥであるカルボキシフルオレセイン、例えば５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン又はそれらのスクシンイミジルエステル類である。しかしながら、上記で検討したように、これらの正確な選択は、利用される核酸染色試薬に依存する。しかしながら、特に赤色核酸染色試薬を用いることによって、使用するために利用可能な蛍光色素の範囲が拡張される。
【０１２２】
いずれかの標識は、伝統的な方法でプローブに結合されてもよい。プローブに沿った蛍光標識の位置は中間であるが、一般にはそれらがプローブの末端領域で位置される。
【０１２３】
好ましくは、それらは、プローブの３’端に位置され、次に増幅中のポリメラーゼによるプローブ伸長を阻害するために、それらは、立体的又は化学的ブロック剤として作用するためである。これは、増幅反応中にプローブの３’末端をブロックするために、リン酸化などの他の測定を採用するという必要性を回避することができる。
【０１２４】
プローブが増幅反応中に用いられるＤＮＡポリメラーゼによって加水分解され、それによって蛍光標識を放出するようなプローブ及びアッセイ条件を設計することは可能である。この場合、プローブは、ＰＣＲ反応のアニーリング及び伸長時期の間に結合するように設計され、このアッセイ中に用いられるポリメラーゼは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するものである。放出された蛍光標識は、ＤＮＡ二重鎖結合剤によってもはやクエンチされないので、シグナル増加を生じさせる。したがって、この場合には、反応は、遊離した蛍光標識のシグナル増加を観察することによってモニターすることができる。シグナルは、プローブが標的又は生成物と相互作用する上記のものである。しかしながら、この場合、シグナルは、遊離した結合プローブ及びそのままの結合プローブの量の間の相違を測定するためにアニーリング段階中にモニターすることができる。
【０１２５】
しかしながら、このアッセイでは、プローブは、シグナル産生がプローブを分離せずに達成し得るので、このように消費されることは必要でない。
【０１２６】
反応の各段階で存在する増幅産物の量に直接関連し、及び／又は、例えば急速ＰＣＲにおいて、反応速度が最も重要である完全に可逆的であるシグナルを達成するために、プローブは、標的配列から無傷で放出されるように設計されることが好ましい。これは、例えば、増幅反応の伸長期の間であってもよい。しかしながら、シグナルは、プローブの加水分解に依存しないので、プローブは、増幅サイクル中のいずれかの段階で標的配列とハイブリダイズし融解するように設計されてもよい。例えば、サイクルの伸長期以外の段階で最も強力にハイブリダイズするプローブは、増幅反応との干渉が最小化することを確実にする。
【０１２７】
伸長温度で又はそれ以下で強力に結合するプローブが用いられる場合、標的配列から無傷でのそれらの放出は、増幅反応中のポリメラーゼのようなＴａｑ又はＰｗｏのＳｔｏｆｆｌｅ断片などの酵素を欠損している５’−３’エキソヌクレアーゼを用いることによって達成することができる。
【０１２８】
次に、プローブはこの反応に再度参加してもよく、それによりプローブの経済的な用途を示す。
【０１２９】
標的に可逆的にハイブリダイズし、加水分解されないプローブを用いたこの方法で生じたデータは、種々の方法で解釈可能である。その最も簡単な形態で、増幅反応の経過又は終端でプローブのアニーリング温度での蛍光標識の蛍光の減少は、存在する標的配列の量の増加を指示し、増幅反応が進行し、したがって、実際に標的配列が試料中に存在するという事実を示唆している。
【０１３０】
しかしながら、上記で概説したように、全体を通して増幅反応をモニターすることによって定量も可能である。
【０１３１】
最後に、下記にさらに検討されるように、配列に関する情報を得るために、終点測定又は全体のいずれかで特徴付けデータ、特に特定の融点分析を得ることが可能である。
【０１３２】
このようにして、本発明の好ましい態様には、核酸増幅を検出する方法が含まれ、該方法は、（ａ）核酸ポリメラーゼ、（ｂ）該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプライマー、（ｃ）該標的ポリヌクレオチド配列に結合することができ、蛍光標識を含むオリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｄ）該蛍光標識からの蛍光エネルギーを吸収することができる核酸染色試薬、特に上述される赤色核酸染色試薬の存在下で標的ポリヌクレオチドに対して核酸増幅を行うこと；及び、増幅反応中に蛍光の変化をモニターすることを含む。
【０１３３】
増幅は、当該技術分野において十分に理解されているように、ＤＮＡ鎖中の標的ヌクレオチド配列だけが増幅されるように設計されるプライマー対を用いて適切に実行される。核酸ポリメラーゼは、適切には、Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼである。
【０１３４】
増幅反応が実行され得る適切な条件は、当該技術分野において周知である。最適条件は、関連する特定のアンプリコン、使用されるプライマーの性質、及び採用される酵素に依存して、各場合で利用可能である。最適な条件は、当業者によって各場合において決定することができる。典型的な変性温度は９５℃のオーダーであり、典型的なアニーリング温度は５５℃の温度であり、伸長温度は７２℃のオーダーである。
【０１３５】
前述のように、特定の態様では、試料は、オリゴヌクレオチドプローブの蛍光標識によって吸収される波長の光によって照射され、蛍光標識からの発光シグナルは、反応の進行を測定するためにモニターされる。このシステムにおける他の蛍光色素はまた、例えば、複数のアッセイで所望によりモニターされてもよく、これらは、従来の方法を用いて解析される必要がある場合がある。しかしながら、核酸染色からのシグナルをモニターする必要はない場合があるが、ただし、これは、蛍光標識からのシグナルと重複せず、かつ、顕著に干渉しないという条件である。
【０１３６】
適切には、蛍光は、増幅プロセスを通じて、好ましくは各増幅サイクル中の同じ点でモニターされる。特に、蛍光は、プローブが標的にアニールする温度でモニターすることが必要である。例えば、これは、約６０℃の温度であってもよい。
【０１３７】
標的が形成されるにつれて、プローブはそれにアニールされるようになり、核酸染色試薬に近接近してもたらされる結果としてクエンチされる。この蛍光の減少は、増幅の進行を指示している。
【０１３８】
試料に存在するＴａｑポリメラーゼなどのポリメラーゼは、プローブを標的から取り除く効果を有する。この効果は、プローブのアニーリング温度などのポリメラーゼに対する次善の温度で低レベルで起こる。したがって、この温度で、これらの２つの反応、アニーリング温度でのプローブの結合及びプローブを標的から取り除くためのポリメラーゼの効果は競合する。一般に、前者の反応は、かなりの数の反応サイクルに対して優勢であり、増幅反応をモニターすることが可能である。しかしながら、最終的に、バランスシフト及びポリメラーゼの効果がより優勢になると、蛍光の上昇が観察される場合がある。したがって、これらの結果は、「フック（ｈｏｏｋ）」効果を表すことができ、生成物の再アニーリングがプローブ／生成物アニーリングよりも好適である場合に生じると考えられ、増幅反応の終了での蛍光曲線の方向に変化を生じさせる。本発明の方法を用いて得られるデータは、増幅反応の進行をモニターするために処理することができ、したがって、試料中に存在する標的の量を定量するために用いることができる。
【０１３９】
得られたデータを解釈するために、ある種の調整が必要となる場合がある。例えば、伝統的なＰＣＲモニタリング反応、例えばＷＯ９９／２８５００に記載されているものでは、ＰＣＲ反応は、蛍光の指数関数的な上昇をもたらし、そのため、バックグランド蛍光の基準調整は得られた最低値から誘導されることが必要である。
【０１４０】
対照的に、本出願の方法では、ＰＣＲ反応の進行は、進行的により多くの標識されたプローブがＤＮＡ二重結合剤、及び特に核酸染色によってクエンチされるので、最終的には指数関数的な減少となる。したがって、基本調整は、達成される蛍光の最高レベルに基づくことが必要である。
【０１４１】
これは、試料反応からデータを採取し、全てのデータポイントに下記の方程式：
ｙ＝１／ｘ
ｚ＝ｙ−ＭＩＮ
を適用することによって適切になされる。式中、ｘは、ＬｉｇｈｔＣｙｌｅｒなどのＰＣＲ機器からのデータポイントであり、ｚは、基本調整されたデータポイントであり、ＭＩＮは、全データセットと比較したｙについての最小値である。Ｚ対サイクル数のプロットは、適切な基準調整が計算されるのを可能にする。
【０１４２】
この方法は、特定の配列の特徴を決定するためにハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いることができる。
【０１４３】
したがって、更なる局面では、本発明は、配列の特徴を決定するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）該配列を含むことが疑われる試料に、該標的配列に特異的な蛍光標識したプローブ、及びプローブ上の蛍光標識からの蛍光を吸収可能なＤＮＡ二重結合剤を添加すること、ここで、プローブ又はＤＮＡ二重結合剤の標識の１つは核酸染色試薬であり、特に上述される赤色核酸染色試薬である；
（ｂ）該プローブが標的配列にハイブリダイズする最中の可変セットの反応条件に該試料を供すること；
（ｃ）該試料からの蛍光をモニターし、プローブの試料へのハイブリダイゼーション、又はプローブと標的核酸配列との間に形成される二重鎖の不安定化の結果として蛍光が変化する、該配列に特徴的な特定の反応条件を決定すること
を含む。
【０１４４】
適切な反応条件には、温度、電気化学的なもの、又は特定の酵素若しくは化学物質の存在に対する応答が含まれる。これらの特性は変化するので、蛍光の変化をモニターすることによって、配列の正確な性質の情報特徴付けを決定することができる。例えば、温度の場合では、プローブが標的配列から分離又は「融解する」温度が決定され得る。これは、例えば、遺伝子診断における対立遺伝子変異を含む配列における多形を検出し、所望により定量するためにも非常に有用であり得る。「多形」によって、配列、特に天然において生じる場合がある転位、トランスバージョン、挿入、欠失又は反転が含まれる。
【０１４５】
プローブの融解の履歴現象は、標的配列がたった１つの塩基対によって変化する場合に異なっている。したがって、試料がたった１つの対立遺伝子変異を含む場合、プローブの融解の温度は、たった１つの別の対立遺伝子変異を含む試料に観られるものとは異なっている特定の値となる。試料は、対立遺伝子変異のそれぞれに対応する２つの融点を示す対立遺伝子の両方を含む。
【０１４６】
類似の考察は、電気化学的特性に関して、又はある種の酵素若しくは化学物質の存在下で適用する。プローブは、電気化学ポテンシャルが適用され得る固体表面に固相化することができる。標的配列は、表面の正確な性質に依存して特定の電気化学的値でプローブに結合するか又は取り除かれる。
【０１４７】
この態様は、上述したＰＣＲ反応などの増幅反応と連動して作用することができ、又は個別に採用することができる。
【０１４８】
本発明の更なる側面には、本発明の方法に用いられるキットが含まれる。これらのキットは、核酸染色試薬、特に、上述したような赤色核酸染色試薬を含む。キットの他の潜在的な成分は、増幅反応に用いられる試薬、例えばＤＮＡポリメラーゼ（「ホットスタート」反応用の化学的に修飾したＴＡＱを含む）、プライマー、バッファー、及び抗Ｔａｑ抗体などの「ホットスタート」試薬などのＰＣＲプロセスを改善することで知られている添加物、又は同時係属の国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ０２／０１８６１に記載されるピロリン酸塩及びピロホスファターゼを含む。キットには、付加的に又は代替的に、蛍光標識される標的配列に対するプローブが含まれてもよい。特に、核酸染色試薬は、プローブの蛍光標識から蛍光を吸収することである。
【０１４９】
キットは、単一の容器に全ての試薬が一緒に含まれてもよく、又はその場で混合するために別々の容器に入っていてもよい。
【０１５０】
上述したような核酸染色試薬の使用は、ユニバーサル・アクセプター・アレンジメント（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ａｃｃｅｐｔｏｒ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を提供し、その場合、複数の光源を用いて、１個のＤＮＡ結合染料にエネルギーを移すことが可能である。これは、多数の利点を生じ、アッセイが多重で良好に実行されるという事実が含まれる。それは多くのプラットフォームで行うことができ、アクセプター染料のモニタリングを必要としない。
【０１５１】
さらに、染料の波長の範囲は、新規の可能性を提供する。同じ反応において、ユニバーサル・ドナー及びユニバーサル・アクセプターの両方のメカニズムを有するようにアレンジすることが可能である。短い波長（例えば、ＵＶダイオード）は、上述される二重結合剤として用いられると、より長い波長の核酸染色試薬へのエネルギー移動のために標識を励起することができる。第２のダイオードは、蛍光標識を用いて第２のプローブへの更なるエネルギー移動用に同じ核酸染色試薬を励起するために用いることができる。
【０１５２】
ＰＣＲを実行するようにアレンジされた市販されている大部分の機器は、複数の光源を有するが、ＳＹＢＲ染料は業界標準となっている。しかしながら、別の波長を用いれば、プローブ標識発光と干渉しないＤＮＡ結合染料は容易に利用可能な技術オプションである。
本発明は、ここで、添付の図面に関する例証として具体的に記載される。
【実施例】
【０１５３】
実施例１
本出願人は、核酸染色試薬のＳＹＴＯ（登録商標）赤色ファミリーから蛍光標識したプローブ及び様々な核酸染色試薬を利用して実験を行った。これらの染料は、阻害なしにＰＣＲに添加することができ、高濃度で添加され得ることが見出された。それらは、プローブ上の多数の蛍光色素と組み合わせることができるように広範囲の波長で利用可能である。
【０１５４】
バシラス・グロビイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｏｂｉｉ）遺伝子配列のためにＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅ（登録商標）フォーマットのＰＣＲは、下記の実験プロトコールを用いて実行した。
【０１５５】
水性ＰＣＲ混合調合物を調製し、下記の成分：
Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８ ５０ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） ２５０ｎｇ／μｌ
塩化マグネシウム ３ｍＭ
ｄＵＴＰヌクレオチド ２００μＭ
Ｔａｑポリメラーゼ ０．０４ユニット／μｌ
抗Ｔａｑ抗体 ０．０４ユニット／μｌ
フォワード・プライマー １μＭ
リバース・プライマー １μＭ
ＳＹＴＯ（登録商標）染料 ５μＭ
蛍光標識したプローブ ０．２μＭ
を含んでいた。
【０１５６】
フルオレセイン標識したプローブ又はＳＹＴＯ（登録商標）染料のいずれかを含まない負の対照反応も行った。
【０１５７】
試験したＳＹＴＯ染料には、ＳＹＴＯ（登録商標）６０、ＳＹＴＯ（登録商標）６１及びＳＹＴＯ（登録商標）６３が含まれる。次に、反応混合物を遠沈させ、下記のサイクルプログラムに基づいてＲｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒで実行した：
【０１５８】
変性
９５℃、５分間
サイクル×５０
９５℃、５秒
５５℃、２０秒
７４℃、５秒
融解分析×１
５５℃、１５秒
【０１５９】
０．１℃／秒で９５℃まで傾斜してゆっくり上昇させる。この工程全体で蛍光を回収した。
試験した染料は、この手法を通じてフルオレセインシグナルを首尾よくクエンチした。
【０１６０】
これらの実験の結果は図１〜６に示される。図１〜４において、Ｆ１チャネルは、２つのＤＮＡ希釈剤の増幅とともに蛍光の減少を示す。Ｆ３チャネルは、インターカレーターの赤色発光における減少を示す。
【０１６１】
グラフ（図５及び６）は、ＳＹＴＯ６３／フルオレセイン実験に関して蛍光の逆数プロットを示す。ＳＹＴＯ６３／フルオレセインの比率も提供される。しかしながら、Ｓｙｔｏ６３（Ｆ３チャネル）からフルオレセインＦ１チャネルのスペクトルの重複がないため、結果を分析するためにこれらのエネルギーをモニターし、スペクトル的に解析する必要はない。
【０１６２】
実施例２
口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）遺伝子配列のためのＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅ（登録商標）フォーマットにおけるＰＣＲは、下記の実験プロトコールを用いて実行される。標的のためのプライマー及びプローブは、従来の方法を用いて設計した。プローブをＦＡＭ分子で標識した。内部対照核酸をそのためのＪＯＥ標識したプローブとともに添加した。
【０１６３】
下記のプロトコールを用いた。
【０１６４】
【表２】
【０１６５】
【表３】
【０１６６】
反応中、ＦＡＭは、ＬＣ２．０装置の青色ＬＥＤによって励起した。
【０１６７】
読み取りパラメータ
ＦＡＭ−ＪＯＥ−Ｓｙｔｏ６３色補正：
ＦＭＤＶ特異的なテンプレート ５３０ｎｍ（ＦＡＭ ５２１ｎｍ）
ＦＭＤＶ−λ競合内部対照 ５６０ｎｍ（ＪＯＥ ５４８ｎｍ）
【０１６８】
試料の１０-3〜１０-6の希釈範囲全体での結果をそれぞれ図７〜９に示す。
【０１６９】
アンプリコンはＰＣＲ中に蓄積されるので、プローブ上のＦＡＭ標識は、ＳＹＴＯ６３はそこからのエネルギーを受け入れるためクエンチされるようになることは図７から明確である。ＦＡＭシグナルは、サイクル数の増加及び様々な量の開始テンプレートとともに減少していることが明確に観察され、これは、増幅をモニターするための確実なシグナルシステムであることを指示している。
【０１７０】
同様のシグナルは、内部対照配列からのＪＯＥシグナルで見られる（図８）。ＦＡＭ及びＪＯＥシグナルは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ２．０ソフトウェアの色補正アルゴリズムを用いて解析された。
【０１７１】
対照的に、図９に示されるように、ＦＡＭ配列からの発光は６７０ｎｍで測定され、サイクル数の増加及び様々な量の開始テンプレートとともに増加する。したがって、ＦＡＭ及びＪＯＥシグナルからのエネルギーを吸収している。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１ａ】ＳＹＴＯ６３を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図１ｂ】ＳＹＴＯ６３を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図１ｃ】ＳＹＴＯ６３を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図１ｄ】ＳＹＴＯ６３を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図２ａ】ＳＹＴＯ６２を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図２ｂ】ＳＹＴＯ６２を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図２ｃ】ＳＹＴＯ６２を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図２ｄ】ＳＹＴＯ６２を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図３ａ】ＳＹＴＯ６１を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図３ｂ】ＳＹＴＯ６１を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図３ｃ】ＳＹＴＯ６１を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図３ｄ】ＳＹＴＯ６１を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図４ａ】ＳＹＴＯ６０を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図４ｂ】ＳＹＴＯ６０を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図４ｃ】ＳＹＴＯ６０を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図４ｄ】ＳＹＴＯ６０を用いたフルオレセインプローブのクエンチングの結果を示す。
【図５ａ】ＳＹＴＯ６３／フルオレセイン実験に関連した蛍光の逆数プロットを示す。
【図５ｂ】ＳＹＴＯ６３／フルオレセイン実験に関連した蛍光の逆数プロットを示す。
【図５ｃ】ＳＹＴＯ６３／フルオレセイン実験に関連した蛍光の逆数プロットを示す。
【図５ｄ】ＳＹＴＯ６３／フルオレセイン実験に関連した蛍光の逆数プロットを示す。
【図６ａ】ＳＹＴＯ６３／フルオレセイン実験に関連した蛍光の逆数プロットを示す。
【図６ｂ】ＳＹＴＯ６３／フルオレセイン実験に関連した蛍光の逆数プロットを示す。
【図７】本アッセイで使用される標的核酸用のオリゴヌクレオチドプローブに結合した蛍光色素（ＦＡＭ）からの発光シグナルを示す。
【図８】本アッセイで使用される内部対照の蛍光色素（ＪＯＥ）からの発光シグナルを示す。
【図９】図７及び８に示されるようなＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅ（商標）アッセイとの関連で用いた場合のＳＹＴＯ６３からの発光シグナルを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）での核酸の検出における赤色核酸染色試薬（ｓｔａｉｎ）の使用。
【請求項２】
ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
核酸染料が、６００ｎｍを超える波長で蛍光を発する、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
核酸染色試薬が、６１０〜６９０ｎｍの波長で蛍光を発する、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
染料（ｄｙｅ）が、ＳＹＴＯ（登録商標）赤色蛍光核酸染色試薬である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
ＳＹＴＯ（登録商標）染料が、ＳＹＴＯ（登録商標）１７、ＳＹＴＯ（登録商標）５９、ＳＹＴＯ（登録商標）６０、ＳＹＴＯ（登録商標）６１、ＳＹＴＯ（登録商標）６２、ＳＹＴＯ（登録商標）６３及びＳＹＴＯ（登録商標）６４から選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
核酸染色試薬が、式（ＩＩＡ）：
【化１】
（式中、
ｎは、０、１又は２であり、Ｒ30、Ｒ31及びＲ32は、独立して、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-10シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールから選択され；
Ｒ2は、水素、場合によりスルホン酸塩、カルボキシ又はアミノによって置換される１〜６個の炭素を有するアルキル基であり；
Ｒ3及びＲ4は、独立して、Ｈ；飽和若しくは不飽和の直鎖状又は分岐状であって、１〜６個の炭素を有するアルキル；又はハロゲン；又はアリール、ヘテロアリール、若しくは３〜１０個の炭素を有し、そのいずれかが場合によりハロゲン、アミノ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ若しくはカルボキシアルキルによって置換されてもよく、ここで、各アルキル基が１〜６個の炭素を有し、又はテール部分によって置換されてもよいシクロアルキルから選択される環式基；又は−ＯＲ8、−ＳＲ8、−（ＮＲ8Ｒ9）；又はテールであり；ここで、Ｒ8及びＲ9は、同一であるか又は異なっていてもよく、独立して、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基；又は１〜２個の脂環式環若しくは芳香族環であり；あるいは、Ｒ8及びＲ9は、一緒になって、−(ＣＨ2）2−Ｖ−（ＣＨ2）2−であり、ここで、Ｖは、一重結合、−Ｏ−、−ＣＨ2−、又は−ＮＲ10−であり、Ｒ10は、Ｈ又は１〜６個の炭素を有するアルキルであり；
Ｒ5は、ヘテロアリール基であり；
Ｒ30、Ｒ31、及びＲ32は、独立して、Ｈ、１〜６個の炭素を有するアルキル、３〜１０個の炭素を有するシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり；ここで、Ｌ及びブリッジは、独立して、１つの共有結合又は直鎖状若しくは分岐状の環式若しくはヘテロ環式の飽和若しくは不飽和である共有連結であって、Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｏ及びＳからなる群から選択される１〜１６個の水素でない原子を有し、該連結が、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、アミド結合；又は一重、二重、三重若しくは芳香族炭素−炭素結合；又はリン−酸素、リン−硫黄結合、窒素−窒素若しくは窒素−酸素結合；又は芳香族結合若しくはヘテロ芳香族結合のいずれかの組合せを含むようにし；テールがヘテロ原子含有部分である）
である赤色染色試薬である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
Ｒ2が、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ｎが０である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
Ｒ5がピリジルである、請求項６〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
Ｒ3が水素であり、Ｒ4がテールである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
テール基が、基：
リンク−スペーサー−キャップ
（式中、リンクはＮＲ20であり、ここで、Ｒ20は、水素、Ｃ1-8アルキル基又は基−スペーサー’−キャップ’から選択され、スペーサー’及びキャップ’は、それぞれスペーサー及びキャップについて下記に定義される基であり、
スペーサーは、直鎖状又は分岐状の飽和鎖における１〜６個の炭素原子であり、キャップは、基ＯＲ21、−ＳＲ21、−ＮＲ21Ｒ22又は−Ｎ+Ｒ21Ｒ22Ｒ23．ＰＳＩ-であり、Ｒ21、Ｒ22、及びＲ23は、独立して、Ｈ、又は場合により置換された直鎖状若しくは分岐状の１〜８個の炭素を有するアルキル又はシクロアルキルであり、ＰＳＩ-は対イオンである）
である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
テール基が、サブ式（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）：
【化２】
で表される基である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
式（ＩＩＡ）で表される化合物が、式（ＩＩＩ）：
【化３】
で表される化合物である、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
増幅中の生物試料の核酸配列を検出する方法であって、
熱安定性ポリメラーゼ及び標的核酸配列の増幅用に設定されているプライマーを生物試料に添加する工程；
請求項１〜１４のいずれか１項に定義される核酸染色試薬及び場合により追加のシグナル蛍光色素（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）の存在下でポリメラーゼ連鎖反応によって標的核酸配列を増幅する工程；
核酸染色試薬又は任意の追加のシグナル蛍光色素のいずれかによって吸収される波長の光を用いて生物試料を照射する工程；及び
該試料中の増幅した標的核酸配列の存在又は量に関連した該試料からの蛍光放出を検出する工程
を含む前記方法。
【請求項１６】
試料中の標的核酸配列の存在を検出するための請求項１５に記載の方法であって、
（ａ）該標的核酸配列を含むことが疑われる試料にＤＮＡ二重鎖結合剤、及び該標的配列に特異的なプローブを添加すること、ここで、該プローブは、該ＤＮＡ二重鎖結合剤から蛍光を吸収し、又は該ＤＮＡ二重鎖結合剤に蛍光エネルギーを与えることができる反応分子を含み、ここで、該反応分子又は該ＤＮＡ二重鎖結合剤の１つは、請求項１〜１４のいずれか１項に定義される核酸染色試薬であり、その他は、フルオレセイン又はその誘導体などの蛍光色素である；
（ｂ）このように形成した混合物を標的核酸が増幅される増幅反応に晒すこと；
（ｃ）該試料を該プローブが標的配列にハイブリダイズする条件に晒すこと；及び
（ｄ）前記試料から蛍光をモニターすること
を含む前記方法。
【請求項１７】
前記試料が、反応分子により吸収される波長の光によって照射され、該反応分子からの発光シグナルがモニターされる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
核酸染色試薬がＤＮＡ二重鎖結合剤として使用される、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）核酸ポリメラーゼ、（ｂ）標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプライマー、（ｃ）該標的ポリヌクレオチド配列に結合することができ、蛍光標識を含むオリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｄ）該蛍光標識から蛍光エネルギーを吸収することができる請求項１〜１４のいずれか１項に定義される核酸染色試薬の存在下で該標的ポリヌクレオチドに基づいて核酸増幅を行うこと；及び、増幅反応中に蛍光の変化をモニターすることを含む核酸増幅を検出する方法。
【請求項２１】
前記試料が蛍光標識により吸収される波長の光によって照射され、蛍光分子からの発光シグナルがモニターされる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
データが試料反応から採取され、下記の方程式：
ｙ＝１／ｘ
ｚ＝ｙ−ＭＩＮ
（ここで、ｘは、ＬｉｇｈｔＣｙｌｅｒなどのＰＣＲ機器からのデータポイントであり、ｚは、基準に調整したデータポイントであり、ＭＩＮは、全データセットに対してｙについての最小値である）
が全てのデータポイントに適用される、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
配列の特徴を決定するための方法であって、
ａ）該配列を含むことが疑われる試料に、該標的配列に特異的な蛍光標識したプローブ、及びプローブ上の蛍光標識からの蛍光を吸収することができるＤＮＡ二重鎖結合剤を添加すること、ここで、プローブ上のラベル又はＤＮＡ二重鎖結合剤の１つが請求項１〜１４のいずれか１項に定義される核酸染色試薬である；
ｂ）該プローブが標的配列にハイブリダイズする可変反応条件に該試料を晒すこと；
ｃ）該試料からの蛍光をモニターし、プローブによる試料へのハイブリダイゼーションの結果、又は該プローブと標的核酸配列との間に形成される二重鎖の不安定化の結果として蛍光が変化する該配列に特徴的な特定の反応条件を決定すること
を含む前記方法。
【請求項２４】
核酸の検出、核酸増幅の進行の検出に使用されるか、又は核酸配列の特徴を決定するためのキットであって、請求項１〜１４のいずれか１項に定義される赤色核酸染色試薬を含む前記キット。
【請求項２５】
核酸増幅反応に用いられる１以上の試薬をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
核酸標的配列に特異的な蛍光標識したプローブをさらに含み、該核酸染色試薬がプローブ上の蛍光標識からの蛍光を吸収する、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）での核酸の検出における赤色核酸染色試薬（ｓｔａｉｎ）の使用。
【請求項２】
ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
核酸染料が、６００ｎｍを超える波長で蛍光を発する、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
核酸染色試薬が、６１０〜６９０ｎｍの波長で蛍光を発する、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
染料（ｄｙｅ）が、ＳＹＴＯ（登録商標）赤色蛍光核酸染色試薬である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
ＳＹＴＯ（登録商標）染料が、ＳＹＴＯ（登録商標）１７、ＳＹＴＯ（登録商標）５９、ＳＹＴＯ（登録商標）６０、ＳＹＴＯ（登録商標）６１、ＳＹＴＯ（登録商標）６２、ＳＹＴＯ（登録商標）６３及びＳＹＴＯ（登録商標）６４から選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
核酸染色試薬が、式（ＩＩＡ）：
【化１】
（式中、
ｎは、０、１又は２であり、Ｒ30、Ｒ31及びＲ32は、独立して、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-10シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールから選択され；
Ｒ2は、水素、場合によりスルホン酸塩、カルボキシ又はアミノによって置換される１〜６個の炭素を有するアルキル基であり；
Ｒ3及びＲ4は、独立して、Ｈ；飽和若しくは不飽和の直鎖状又は分岐状であって、１〜６個の炭素を有するアルキル；又はハロゲン；又はアリール、ヘテロアリール、若しくは３〜１０個の炭素を有し、そのいずれかが場合によりハロゲン、アミノ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ若しくはカルボキシアルキルによって置換されてもよく、ここで、各アルキル基が１〜６個の炭素を有し、又はテール部分によって置換されてもよいシクロアルキルから選択される環式基；又は−ＯＲ8、−ＳＲ8、−（ＮＲ8Ｒ9）；又はテールであり；ここで、Ｒ8及びＲ9は、同一であるか又は異なっていてもよく、独立して、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基；又は１〜２個の脂環式環若しくは芳香族環であり；あるいは、Ｒ8及びＲ9は、一緒になって、−(ＣＨ2）2−Ｖ−（ＣＨ2）2−であり、ここで、Ｖは、一重結合、−Ｏ−、−ＣＨ2−、又は−ＮＲ10−であり、Ｒ10は、Ｈ又は１〜６個の炭素を有するアルキルであり；
Ｒ5は、ヘテロアリール基であり；
Ｒ30、Ｒ31、及びＲ32は、独立して、Ｈ、１〜６個の炭素を有するアルキル、３〜１０個の炭素を有するシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり；ここで、Ｌ及びブリッジは、独立して、１つの共有結合又は直鎖状若しくは分岐状の環式若しくはヘテロ環式の飽和若しくは不飽和である共有連結であって、Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｏ及びＳからなる群から選択される１〜１６個の水素でない原子を有し、該連結が、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、アミド結合；又は一重、二重、三重若しくは芳香族炭素−炭素結合；又はリン−酸素、リン−硫黄結合、窒素−窒素若しくは窒素−酸素結合；又は芳香族結合若しくはヘテロ芳香族結合のいずれかの組合せを含むようにし；テールがヘテロ原子含有部分である）
である赤色染色試薬である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
Ｒ2が、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ｎが０である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
Ｒ5がピリジルである、請求項６〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
Ｒ3が水素であり、Ｒ4がテールである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
テール基が、基：
リンク−スペーサー−キャップ
（式中、リンクはＮＲ20であり、ここで、Ｒ20は、水素、Ｃ1-8アルキル基又は基−スペーサー’−キャップ’から選択され、スペーサー’及びキャップ’は、それぞれスペーサー及びキャップについて下記に定義される基であり、
スペーサーは、直鎖状又は分岐状の飽和鎖における１〜６個の炭素原子であり、キャップは、基ＯＲ21、−ＳＲ21、−ＮＲ21Ｒ22又は−Ｎ+Ｒ21Ｒ22Ｒ23．ＰＳＩ-であり、Ｒ21、Ｒ22、及びＲ23は、独立して、Ｈ、又は場合により置換された直鎖状若しくは分岐状の１〜８個の炭素を有するアルキル又はシクロアルキルであり、ＰＳＩ-は対イオンである）
である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
テール基が、サブ式（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）：
【化２】
で表される基である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
式（ＩＩＡ）で表される化合物が、式（ＩＩＩ）：
【化３】
で表される化合物である、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
増幅中の生物試料の核酸配列を検出する方法であって、
熱安定性ポリメラーゼ及び標的核酸配列の増幅用に設定されているプライマーを生物試料に添加する工程；
請求項１〜１４のいずれか１項に定義される核酸染色試薬及び場合により追加のシグナル蛍光色素（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）の存在下でポリメラーゼ連鎖反応によって標的核酸配列を増幅する工程；
核酸染色試薬又は任意の追加のシグナル蛍光色素のいずれかによって吸収される波長の光を用いて生物試料を照射する工程；及び
該試料中の増幅した標的核酸配列の存在又は量に関連した該試料からの蛍光放出を検出する工程
を含む前記方法。
【請求項１６】
試料中の標的核酸配列の存在を検出するための請求項１５に記載の方法であって、
（ａ）該標的核酸配列を含むことが疑われる試料にＤＮＡ二重鎖結合剤、及び該標的配列に特異的なプローブを添加すること、ここで、該プローブは、該ＤＮＡ二重鎖結合剤から蛍光を吸収し、又は該ＤＮＡ二重鎖結合剤に蛍光エネルギーを与えることができる反応分子を含み、ここで、該反応分子又は該ＤＮＡ二重鎖結合剤の１つは、請求項１〜１４のいずれか１項に定義される核酸染色試薬であり、その他は、フルオレセイン又はその誘導体などの蛍光色素である；
（ｂ）このように形成した混合物を標的核酸が増幅される増幅反応に晒すこと；
（ｃ）該試料を該プローブが標的配列にハイブリダイズする条件に晒すこと；及び
（ｄ）前記試料から蛍光をモニターすること
を含む前記方法。
【請求項１７】
前記試料が、反応分子により吸収される波長の光によって照射され、該反応分子からの発光シグナルがモニターされる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
核酸染色試薬がＤＮＡ二重鎖結合剤として使用される、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）核酸ポリメラーゼ、（ｂ）標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプライマー、（ｃ）該標的ポリヌクレオチド配列に結合することができ、蛍光標識を含むオリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｄ）該蛍光標識から蛍光エネルギーを吸収することができる請求項１〜１４のいずれか１項に定義される核酸染色試薬の存在下で該標的ポリヌクレオチドに基づいて核酸増幅を行うこと；及び、増幅反応中に蛍光の変化をモニターすることを含む核酸増幅を検出する方法。
【請求項２１】
前記試料が蛍光標識により吸収される波長の光によって照射され、蛍光分子からの発光シグナルがモニターされる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
データが試料反応から採取され、下記の方程式：
ｙ＝１／ｘ
ｚ＝ｙ−ＭＩＮ
（ここで、ｘは、ＬｉｇｈｔＣｙｌｅｒなどのＰＣＲ機器からのデータポイントであり、ｚは、基準に調整したデータポイントであり、ＭＩＮは、全データセットに対してｙについての最小値である）
が全てのデータポイントに適用される、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
配列の特徴を決定するための方法であって、
ａ）該配列を含むことが疑われる試料に、該標的配列に特異的な蛍光標識したプローブ、及びプローブ上の蛍光標識からの蛍光を吸収することができるＤＮＡ二重鎖結合剤を添加すること、ここで、プローブ上のラベル又はＤＮＡ二重鎖結合剤の１つが請求項１〜１４のいずれか１項に定義される核酸染色試薬である；
ｂ）該プローブが標的配列にハイブリダイズする可変反応条件に該試料を晒すこと；
ｃ）該試料からの蛍光をモニターし、プローブによる試料へのハイブリダイゼーションの結果、又は該プローブと標的核酸配列との間に形成される二重鎖の不安定化の結果として蛍光が変化する該配列に特徴的な特定の反応条件を決定すること
を含む前記方法。
【請求項２４】
核酸の検出、核酸増幅の進行の検出に使用されるか、又は核酸配列の特徴を決定するためのキットであって、請求項１〜１４のいずれか１項に定義される赤色核酸染色試薬を含む前記キット。
【請求項２５】
核酸増幅反応に用いられる１以上の試薬をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
核酸標的配列に特異的な蛍光標識したプローブをさらに含み、該核酸染色試薬がプローブ上の蛍光標識からの蛍光を吸収する、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載のキット。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図５ｄ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図５ｄ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５２６５４２（Ｐ２００９−５２６５４２Ａ）
【公表日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５４８５０（Ｐ２００８−５５４８５０）
【出願日】平成１９年２月１６日（２００７．２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／０００５５９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９３８１６
【国際公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５０６０７２０５５）エニグマ ディアグノスティックス リミテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１６日（２００７．２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／０００５５９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９３８１６
【国際公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５０６０７２０５５）エニグマ ディアグノスティックス リミテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
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