標的核酸の検出方法
【課題】核酸増幅法及び核酸ハイブリダイゼーション法の利点を活かしながら、より簡易、迅速、特異的且つ目視判定性に優れた、いわゆるラテラルフロータイプの標的核酸の検出方法、並びに該方法を実施するためのキットの提供。
【解決手段】試料中の標的核酸を検出する方法であって、以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とする標的核酸の検出方法。
（１）ビオチン標識された一本鎖標的核酸を増幅する工程
（２）該一本鎖標的核酸をストリップ上に展開し、予め固定された相補核酸プローブとハイブリダイズさせてこれを捕捉する工程
（３）金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液をストリップ上に展開し、前記捕捉核酸を可視化する工程
（４）洗浄液をストリップ上に展開する工程
【解決手段】試料中の標的核酸を検出する方法であって、以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とする標的核酸の検出方法。
（１）ビオチン標識された一本鎖標的核酸を増幅する工程
（２）該一本鎖標的核酸をストリップ上に展開し、予め固定された相補核酸プローブとハイブリダイズさせてこれを捕捉する工程
（３）金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液をストリップ上に展開し、前記捕捉核酸を可視化する工程
（４）洗浄液をストリップ上に展開する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物試料中の標的核酸、特にウイルス核酸を特異的に検出するための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、核酸の検出に関する研究や診断技術が急速に進歩し、検査試料中の特定遺伝子を検出する方法として、遺伝子増幅法及びハイブリダイゼーション法等いくつかの方法が知られている。
中でも、ＰＣＲ法（polymerase chain reaction method）やＲＴ−ＰＣＲ法（reverse transcriptase polymerase chain reaction method）に代表される遺伝子増幅法は、検出感度が高い方法として広く研究及び利用されている。
【０００３】
また、標的核酸と相補的な塩基配列をもつ単鎖又は二本鎖を放射性あるいは非放射性の標識物質で標識し、標的配列との相補性を利用して標的配列を検出するハイブリダイゼーション法も、標的核酸又は標的核酸増幅物の存在を検出するための方法として広く用いられている。また、プローブを担体に固定する液相−固相ハイブリダイゼーション法やサンドイッチ型の液相−液相ハイブリダイゼーション法も考案されている。
【０００４】
また最近では、検出感度の向上と操作の簡便性を目的として、ＰＣＲ法などの遺伝子増幅法とハイブリダイゼーション法を組み合わせた方法、例えば増幅した１本鎖核酸を予めストリップ上に固定（或いは半固定）させておいた第１のオリゴヌクレオチドプローブ及び標識した第２のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせて検出する方法が報告されている（特許文献１）。
しかし、当該検出法は、第２の標識オリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ標的核酸毎に作成する必要があり手間がかかる、或いはストリップ上に半固定化作業を行う必要があるという問題があった。
【０００５】
一方、インフルエンザウイルスは、インフルエンザの原因であるオルソミキソウイルス科に属し、エンベロープで包まれたマイナス鎖の一本鎖RNAを含むウイルスであり、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型の３属が存在する。Ａ型インフルエンザウイルスは鳥類やヒトを含む哺乳動物に感染するが、Ｂ及びＣ型はヒトのみに感染する。
インフルエンザウイルスのエンベロープには、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）が存在し、ＨＡ及びＮＡの亜型の組み合わせは、ウイルス分離株の特定に用いられる。Ａ型インフルエンザウイルスにはＨＡとＮＡの変異が特に多く、これまでＨＡに１６種類、ＮＡに９種類の大きな変異が見つかっており、その組み合わせの数の亜型が存在しうる。亜型の違いはＨ１Ｎ１〜Ｈ１６Ｎ９といった略称で表現されている。
【０００６】
これまでに、ヒトのインフルエンザの原因になることが明らかになっているのは、「Ａソ連型」として知られているＨ１Ｎ１、「Ａ香港型」として知られているＨ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、の４種類であったが、2009年4月、メキシコにおいて、豚のあいだで流行していたウイルスが農場などで豚から人に直接感染し、それから人の間で流行が認知された。当該インフルエンザウイルスは、Ａ型、Ｈ１Ｎ１であり、２００９年６月１２日に世界的流行病（パンデミック）であることが宣言された。また、この他にＨ９Ｎ１、高病原性トリインフルエンザとして知られたＨ５Ｎ１などのいくつかの種類がヒトに感染した例が報告されている。
【０００７】
従って、当該インフルエンザウイルスを遺伝子レベルで、正確で、且つ簡易・迅速に検出・判定できる方法が強く求めてられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４２６８９４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、核酸増幅法及び核酸ハイブリダイゼーション法の利点を活かしながら、より簡易、迅速、特異的且つ目視判定性に優れた、いわゆるラテラルフロータイプの標的核酸の検出方法、並びに該方法を実施するためのキットを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、生物試料から、標識された１本鎖核酸を増幅し、これをストリップ上で、毛細管現象によって展開させて、ストリップ上に固定させた相補核酸プローブとハイブリダイズさせてこれを捕捉し、次いでこれを可視化することにより、目視判定によって、簡易・迅速に標的核酸を検出できることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の１）〜５）に係るものである。
１）試料中の標的核酸を検出する方法であって、以下の（１）〜（４）の工程を含む標的核酸の検出方法。
（１）ビオチン標識された一本鎖標的核酸を増幅する工程
（２）該一本鎖標的核酸をストリップ上に展開し、予め固定された相補核酸プローブとハイブリダイズさせてこれを捕捉する工程
（３）金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液をストリップ上に展開し、前記捕捉核酸を可視化する工程
（４）洗浄液をストリップ上に展開する工程
２）一本鎖標的核酸を増幅が、非対照ＰＣＲ法により行われるものである請求項１記載の標的核酸の検出方法。
３）非対照ＰＣＲ法が、以下に示されるプライマーセットを単独又は複数用いて行われる上記２）の標的核酸の検出方法。
ａ）配列番号１の塩基配列からなるプライマー、配列番号２の塩基配列からなるプライマー
ｂ）配列番号３の塩基配列からなるプライマー、配列番号４の塩基配列からなるプライマー
４）複数のストリップ上に捕捉された標的核酸を一つの金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液を用いて同時に可視化する、上記１）〜３）の標的核酸の検出方法。
５）ＰＣＲ増幅プライマー、相補核酸プローブ固定化ストリップ及び金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液を少なくとも含有する、上記１）の方法を実施するための標的核酸の検出キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の標的核酸の検出方法及びキットによれば、生物試料中の標的核酸、特にインフルエンザウイルスを遺伝子レベルで、高感度で、且つ簡易・迅速に目視で検出・判定できる。また、本発明の方法によれば、複数のストリップ上に捕捉された標的核酸を一つの金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液を用いて同時に可視化することができ、一の可視化操作により、一度に複数の標的核酸の検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ストリップの構成例を示した図
【図２】標的核酸の検出手順を示した図（Ａ：ハイブリダイゼーション、Ｂ：可視化、Ｃ：洗浄）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（１）ビオチン標識された一本鎖標的核酸を増幅する工程
本工程では、公知の核酸増幅反応を用いて、生物材料中の核酸から、ビオチン標識された一本鎖標的核酸を増幅する。
【００１５】
ビオチン標識された一本鎖標的核酸の増幅は、生物材料に含まれる核酸のうち、標的核酸を含む一本鎖核酸を選択的に増幅することが可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ビオチン標識され、標的核酸配列を増幅可能なプライマーを用いた非対称ＰＣＲにより行うことが好ましい。
非対称ＰＣＲは、１本鎖として得たい方のプライマーを、片方のプライマーに対して１０〜１００倍程度の濃度にしてＰＣＲを行う方法である。使用するプライマーの設計、プライマー比率は適宜調製すればよいが、１本鎖形成の効率の点から、例えば、ビオチン標識プライマーをフォワードプライマーとする場合、非標識のリバースプライマーとのプライマー濃度比（フォワードプライマー：リバースプライマー）は、３〜６：１が好ましく、５：1とするのがより好ましい。
また、ＰＣＲのサイクル数は、４０〜６０が好ましく、連続的に６０サイクルのＰＣＲをかけることにより効率的に一本鎖を形成できる。
【００１６】
また、上記非対称ＰＣＲは、複数、例えば、３〜１０組程度のプライマーセットを用いて一度にＰＣＲを行う、所謂マルチプレックスＰＣＲ（ＭＰＣＲ）を採用することもできる。これを用いることにより様々な長短の塩基配列を一度に増幅することができ、また、一本鎖核酸が取得されやすいという利点もある。
【００１７】
標的核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、原核生物にのみ存在する塩基配列の一部、真核生物（但し、ヒトを除く）にのみ存在する塩基配列の一部、及びヒトにのみ存在する塩基配列の一部のいずれかから選択される核酸であることが好ましい。具体的には、ウイルス遺伝子、細菌遺伝子、癌関連遺伝子、遺伝病関連遺伝子等が挙げられる。このうち、ウイルス及び細菌遺伝子としては、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ＨＩＶウイルス、マイコプラズマ、リケッチア、レンサ球菌、サルモネラ菌等の遺伝子が挙げられる。
【００１８】
インフルエンザウイルスについては、例えば、Influenza A virus (A/Narita/1/2009(H1N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) 遺伝子（ACCESSION ：GQ165815）、Influenza A virus (A/New Jersey/8/76(H1N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) 遺伝子（ACCESSION ：VR-897）、Influenza A virus (A/Aichi/2/68(H3N2)) segment 4 hemagglutinin (HA) 遺伝子（ACCESSION ：VR-547）、Influenza A virus (A/Duck/PA/10218/84(H5N2)) segment 4 hemagglutinin (HA) 遺伝子（ACCESSION ：VR-1331）、Influenza B virus (B/Taiwan/2/62) segment 4 hemagglutinin (HA) 遺伝子（ACCESSION ：VR-295）等が挙げられる。
また、Influenza A virus (A/Narita/1/2009(H1N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) 遺伝子を増幅するためのプライマーとしては、後記〔表１〕に示すものが例示できる。
【００１９】
標的核酸を含む生体材料（検体）としては、例えば、細菌、ウイルス等の病原体、生体から分離された血液、唾液、組織病片等、或いは糞尿等の排泄物が挙げられる。また、これらの検体は直接、又は必要に応じて遠心分離操作等により沈渣として濃縮した後、目的とする組織由来のＤＮＡを顕在化させる目的で、例えば酵素処理、熱処理、界面活性剤処理、超音波処理等による細胞破壊処理を予め施したものを使用することができる。
【００２０】
（２）該一本鎖増幅核酸を、ストリップ上に展開し、予め固定された相補核酸プローブとハイブリダイズさせて捕捉する工程
本工程では、工程（１）で増幅された核酸を、クロマトグラフィーの原理に基づいてストリップ上で展開し、ストリップ上に予め固定化された標的核酸と相補的な核酸プローブに接触させこれを捕捉する。
【００２１】
ストリップは、捕捉用オリゴヌクレオチドプローブを結合できる固相担体であればよいが、ニトロセルロース、ナイロン等の多孔性メンブレンが好適に挙げられ、カルボキシル基等を化学修飾した共有結合活性修飾ナイロンメンブレンでもよい。
【００２２】
相補核酸プローブは、検出対象となる１本鎖標的核酸（増幅産物）に相補的な配列を有する１本鎖オリゴヌクレオチドである。このような核酸は、上記同様にＰＣＲ法、化学合成法などにより作製することができる。核酸の長さは、通常のハイブリダイゼーション条件下で安定に標的分子とハイブリダイズできる限り、制限されないが、必要以上に長くないことが好ましく、１０〜５０塩基、より好ましくは１０〜３０塩基、更に好ましくは１５〜２５塩基である。
【００２３】
相補核酸プローブのストリップへの固定は、核酸プローブが直接ストリップと結合を形成することにより固定されていてもよいし、間接的に固定されていてもよい。例えば、化学修飾したメンブレンを用いる場合、相補核酸プローブはこれに反応する官能基を有す事が望ましく、例えばカルボキシル基で修飾されたメンブレンに対しては、５’あるいは３’末端をアミノ化した合成オリゴヌクレオチドが好ましい。
【００２４】
ストリップへの捕捉用オリゴヌクレオチドプローブの結合形態は特に限定されず、ライン状あるいは円形スポット状等の何れでもよいが、ライン状が好ましい。さらに、標的核酸と内部標準核酸由来の増幅産物を同時に捕捉するため、同一のストリップ上の異なる位置に各捕捉オリゴヌクレオチドプローブを結合しておくこともできる。
【００２５】
（３）金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液をストリップ上に展開し、前記捕捉核酸を可視化する工程
本工程では、前記で捕捉された一本鎖標的核酸のビオチンに対して、金属コロイド標識ストレプトアビジンを結合させることによって、標的核酸の捕捉位置が可視化される。
金属コロイド標識ストレプトアビジンにおける金属コロイド標識としては、視覚的に検知し得るシグナルが得られるものであって、毛管現象により移動可能であれば特に限定されないが、具体的には例えば金コロイド、鉄コロイド、銀コロイド等が挙げられ、取扱易さや感度等の点から金コロイドが好ましい。さらには、金と白金からなる合金コロイドも好適に用いることができる。ストレプトアビジンに代えてアビジンを用いてもよい。
【００２６】
金属コロイド標識ストレプトアビジンを調製する方法としては、公知の物理的吸着法、化学的結合法等を用いて調製すればよく、市販品を使用することもできる。
【００２７】
金属コロイド標識ストレプトアビジンは、例えば、金コロイド標識ストレプトアビジン40nm(50 O.D.)を１％BSA溶液で適当に希釈して金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液とし、ストリップ上に展開することによって使用される。
尚、金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液は一つ用意すればよく、一つのコンジュゲート液で、複数のストリップ上に捕捉された標的核酸を同時に可視化することも可能である。
【００２８】
（４）洗浄液をストリップ上に展開する工程
本工程は、洗浄液をストリップ上に展開し、残存する金属コロイド標識ストレプトアビジンを除去する工程は、試験管或いはプレートのウエル等に洗浄液を毛管現象にて吸い上げ洗浄する。
ここで用いられる洗浄液は、金属コロイド標識ストレプトアビジンを除去できるものであれば限定されないが、例えば、２×PBS溶液に0.1％Tween20を加えた溶液等が挙げられる。
【００２９】
上記（１）〜（４）の工程を行い、可視化されたバンドを確認することにより、標的核酸の存在を目視により判定することができる。
【００３０】
本発明の方法において、内部標準核酸を用いる場合は、標的核酸と内部標準核酸はそれぞれ別々に検出してもよいが、同一のストリップで同時に検出する共検出方法が好ましい。
検出における結果判定は、具体的には以下のように行われる事が望ましい。予想される標的核酸量と同等あるいは以下に設定され、競合あるいは非競合的に共増幅され、共検出された内部標準核酸の発色量を対照として、標的核酸量が同等、以下あるいは以上であると目視で判定を行う。例えば、標的核酸と競合増幅され得る内部標準核酸を用いた場合、標的核酸から得た増幅産物の発色量が、対照となる内部標準核酸由来の増幅産物と同等の発色量を呈した場合に同等量であると判定し、対照となる内部標準核酸の発色が微かに認められるあるいは認められず標的核酸の発色のみである場合、内部標準核酸に比べ標的核酸量が多いと判定する。一方、対照となる内部標準核酸の発色のみあるいは標的核酸の発色量が非常に微かである、という場合は標的核酸量が少ないと判定する。
【００３１】
本発明の標的核酸の検出キットは、上記の（１）〜（４）の一連の工程を実施するための手段を備えたものであり、具体的には、逆転写酵素、PCR増幅プライマー、PCR酵素液、dNTP、UNG試薬、陽性コントロール、dH2O等を含む「増幅試薬セット」と、相補核酸プローブ固定化ストリップ、増幅反応停止液、変性液、金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液等を含む「検出試薬セット」、更には、96 ウェル平底マイクロタイタープレート、マイクロピペット等の器具、洗浄液等の試薬が挙げられる。
【実施例】
【００３２】
参考例１．プライマー及びプローブの設計
（１）プライマー
【００３３】
【表１】
【００３４】
（２）プローブ
【００３５】
【表２】
【００３６】
参考例２．核酸試料の調製
以下に示す手順で核酸試料を調製した。
１．25μｌのProteaseを1.5ｍｌのマイクロ遠心チューブにピッペト或いはエクセルにて加える。
２．チューブに200μｌのサンプルを加える。
３．200μｌ抽出試薬を加え、ボルテックスにて15秒間混和する。
４．ヒートブロックで56℃、15分間インキュベート後、スピンダウンする。
５．250μｌ純エタノールを加え、ボルテックス15秒間混和し、スピンダウンする。
６．カラムに全量を移す。6,000ｇ 1分間遠心する。
７．カラムに500μｌBuffer１を加え、6,000ｇ 1分間遠心する。ろ液を捨てる。
８．カラムに500μｌBuffer２を加え、6,000ｇ 1分間遠心する。ろ液を捨てる。
９．カラムに500μｌエタノールを加え、6,000ｇ 1分間遠心する。ろ液を捨てる。
１０．カラムを20,000ｇ３分間遠心し、乾燥させる。
１１．カラムを56℃３分間インキュベートする。
１２．50μｌRNase Free H2Oを加え、20,000ｇ１分間遠心する。
【００３７】
実施例１．非対称ＰＣＲ
非対称ＰＣＲは、以下の条件により行った。
（１）ＰＣＲマスター混合溶液の調製
dH2O 32.5μｌ、10×RT-PCR buffer 10μｌ,ｄNTPｓ２μｌ、20μM FLAsw-R la 0.5μｌ,25μM FLAsw-F la bio 2μｌ,Enzyme mix 2μｌをそれぞれ加える。
（２）（１）で調製したＰＣＲマスター混合溶液４９μｌに、上記参考例２で調製した核酸試料１μｌをＰＣＲ用チューブに入れ、ABI9700（アプライドバイオシステムズ）にて、９５℃で１５分間加熱後、９５℃,３０秒、６０℃,３０秒、７２℃,３０秒のサイクルで６０回繰り返し、７２℃,３分間加熱した後、４℃、１時間放置した。
【００３８】
実施例２．マルチプレックス非対称ＰＣＲ
（１）ＰＣＲマスター混合溶液の調製
dH2O 29.5μｌ、10×RT-PCR buffer 10μｌ,ｄNTPｓ２μｌ、20μM FLAsw-R la 0.5μｌ,25μM FLAsw-F la bio 2μｌ, 20μM β354-F la 0.5μｌ,25μM β455-R la bio 2μｌEnzyme mix 2μｌをそれぞれ加える。
（２）（１）で調製したＰＣＲマスター混合溶液４９μｌに、上記参考例２で調製した核酸試料２μｌをＰＣＲ用チューブに入れ、ABI9700（アプライドバイオシステムズ）にて、９５℃で１５分間加熱後、９５℃,３０秒、６０℃,３０秒、７２℃,３０秒のサイクルで６０回繰り返し、７２℃,３分間加熱した後、４℃、１時間放置した。
【００３９】
実施例３．マルチプレックス非対称ＰＣＲ
(１) ＰＣＲマスター混合溶液の調製
dH2O 14.5μｌ、２×RT-PCR Master buffer 25μｌ,10×Primer Mix 5μｌ(20μM FLAsw-R la 0.5μｌ,25μM FLAsw-F la bio 2μｌ, 20μM β354-F la 0.5μｌ,25μM β455-R la bio 2μｌ）RT Enzyme mix 0.5μｌをそれぞれ加える。
（２）（１）で調製したＰＣＲマスター混合溶液４９μｌに、上記参考例２で調製した核酸試料２μｌをＰＣＲ用チューブに入れ、ABI9700（アプライドバイオシステムズ）にて、５０℃20分、９５℃で１５分間加熱後、９４℃,４５秒、５４℃,７５秒、のサイクルで４０回繰り返し、７２℃,３分間加熱した後、４℃、１時間放置した。
この方法でも、上記実施例２と同等かそれ以上の性能を有する。
【００４０】
参考例３ 金コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液の調製
金標識ストレプトアビジン40nm(50 O.D.)を１％BSA溶液にて８倍希釈して室温に静置した。
【００４１】
参考例４ 捕捉プローブ固定化ストリップの作成
以下の手順により、捕捉プローブ固定化ストリップを作成した（図１）
１）10xSSCでプローブを100μMに溶解する。
２）10xSSCでビオチン標識プライマーを50μMに溶解する。
３）Schleicher & Schuell PRIMA60 membraneに、水彩画用の筆でコントロールラインとプローブラインを引き、80℃5分間放置する。これを5回繰り返した後、80℃ 30分間放置し、固定化する。
４）1xPBS; 0.1% Tween20溶液で洗浄（15分）した後、滅菌水で洗浄し(10分）、membraneを風乾する（37℃、O/N）。
５）固相化したメンブレンをArcare 9020 precut cardsに貼り付ける。
ろ紙（Whatman 17Chr）を貼り付け、ラミネートフィルムを貼り付ける。出来上がったカードを2mm幅に切断する。
【００４２】
実施例３ 標的核酸の検出
以下の１）〜６）の操作を行い、インフルエンザウイルス（Influenza A virus (A/Narita/1/2009(H1N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) 遺伝子）を検出した。
１）ポリプロピレンプレートにPCR産物（プライマー：配列番号１〜４）50μLを入れる。
２）その隣のウェルに8μLの金コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液（金コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲートをTBS;1%BSA溶液で8倍に希釈）を入れる。
３）その隣のウェルに100μLの洗浄液（2xPBS 0.1% Tween20）を入れる。
４）捕捉プローブを固定化したストリップをPCR産物50μL に浸漬し（図２Ａ）、10分間放置する。
５）ストリップを金コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲートウェルに移動させ（図２Ｂ）、3分間放置する。
６）ストリップを洗浄液ウェルに移動させ（図２Ｃ）、2分間放置後、ストリップを取り出してバンドを確認する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物試料中の標的核酸、特にウイルス核酸を特異的に検出するための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、核酸の検出に関する研究や診断技術が急速に進歩し、検査試料中の特定遺伝子を検出する方法として、遺伝子増幅法及びハイブリダイゼーション法等いくつかの方法が知られている。
中でも、ＰＣＲ法（polymerase chain reaction method）やＲＴ−ＰＣＲ法（reverse transcriptase polymerase chain reaction method）に代表される遺伝子増幅法は、検出感度が高い方法として広く研究及び利用されている。
【０００３】
また、標的核酸と相補的な塩基配列をもつ単鎖又は二本鎖を放射性あるいは非放射性の標識物質で標識し、標的配列との相補性を利用して標的配列を検出するハイブリダイゼーション法も、標的核酸又は標的核酸増幅物の存在を検出するための方法として広く用いられている。また、プローブを担体に固定する液相−固相ハイブリダイゼーション法やサンドイッチ型の液相−液相ハイブリダイゼーション法も考案されている。
【０００４】
また最近では、検出感度の向上と操作の簡便性を目的として、ＰＣＲ法などの遺伝子増幅法とハイブリダイゼーション法を組み合わせた方法、例えば増幅した１本鎖核酸を予めストリップ上に固定（或いは半固定）させておいた第１のオリゴヌクレオチドプローブ及び標識した第２のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせて検出する方法が報告されている（特許文献１）。
しかし、当該検出法は、第２の標識オリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ標的核酸毎に作成する必要があり手間がかかる、或いはストリップ上に半固定化作業を行う必要があるという問題があった。
【０００５】
一方、インフルエンザウイルスは、インフルエンザの原因であるオルソミキソウイルス科に属し、エンベロープで包まれたマイナス鎖の一本鎖RNAを含むウイルスであり、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型の３属が存在する。Ａ型インフルエンザウイルスは鳥類やヒトを含む哺乳動物に感染するが、Ｂ及びＣ型はヒトのみに感染する。
インフルエンザウイルスのエンベロープには、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）が存在し、ＨＡ及びＮＡの亜型の組み合わせは、ウイルス分離株の特定に用いられる。Ａ型インフルエンザウイルスにはＨＡとＮＡの変異が特に多く、これまでＨＡに１６種類、ＮＡに９種類の大きな変異が見つかっており、その組み合わせの数の亜型が存在しうる。亜型の違いはＨ１Ｎ１〜Ｈ１６Ｎ９といった略称で表現されている。
【０００６】
これまでに、ヒトのインフルエンザの原因になることが明らかになっているのは、「Ａソ連型」として知られているＨ１Ｎ１、「Ａ香港型」として知られているＨ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、の４種類であったが、2009年4月、メキシコにおいて、豚のあいだで流行していたウイルスが農場などで豚から人に直接感染し、それから人の間で流行が認知された。当該インフルエンザウイルスは、Ａ型、Ｈ１Ｎ１であり、２００９年６月１２日に世界的流行病（パンデミック）であることが宣言された。また、この他にＨ９Ｎ１、高病原性トリインフルエンザとして知られたＨ５Ｎ１などのいくつかの種類がヒトに感染した例が報告されている。
【０００７】
従って、当該インフルエンザウイルスを遺伝子レベルで、正確で、且つ簡易・迅速に検出・判定できる方法が強く求めてられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４２６８９４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、核酸増幅法及び核酸ハイブリダイゼーション法の利点を活かしながら、より簡易、迅速、特異的且つ目視判定性に優れた、いわゆるラテラルフロータイプの標的核酸の検出方法、並びに該方法を実施するためのキットを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、生物試料から、標識された１本鎖核酸を増幅し、これをストリップ上で、毛細管現象によって展開させて、ストリップ上に固定させた相補核酸プローブとハイブリダイズさせてこれを捕捉し、次いでこれを可視化することにより、目視判定によって、簡易・迅速に標的核酸を検出できることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の１）〜５）に係るものである。
１）試料中の標的核酸を検出する方法であって、以下の（１）〜（４）の工程を含む標的核酸の検出方法。
（１）ビオチン標識された一本鎖標的核酸を増幅する工程
（２）該一本鎖標的核酸をストリップ上に展開し、予め固定された相補核酸プローブとハイブリダイズさせてこれを捕捉する工程
（３）金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液をストリップ上に展開し、前記捕捉核酸を可視化する工程
（４）洗浄液をストリップ上に展開する工程
２）一本鎖標的核酸を増幅が、非対照ＰＣＲ法により行われるものである請求項１記載の標的核酸の検出方法。
３）非対照ＰＣＲ法が、以下に示されるプライマーセットを単独又は複数用いて行われる上記２）の標的核酸の検出方法。
ａ）配列番号１の塩基配列からなるプライマー、配列番号２の塩基配列からなるプライマー
ｂ）配列番号３の塩基配列からなるプライマー、配列番号４の塩基配列からなるプライマー
４）複数のストリップ上に捕捉された標的核酸を一つの金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液を用いて同時に可視化する、上記１）〜３）の標的核酸の検出方法。
５）ＰＣＲ増幅プライマー、相補核酸プローブ固定化ストリップ及び金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液を少なくとも含有する、上記１）の方法を実施するための標的核酸の検出キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の標的核酸の検出方法及びキットによれば、生物試料中の標的核酸、特にインフルエンザウイルスを遺伝子レベルで、高感度で、且つ簡易・迅速に目視で検出・判定できる。また、本発明の方法によれば、複数のストリップ上に捕捉された標的核酸を一つの金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液を用いて同時に可視化することができ、一の可視化操作により、一度に複数の標的核酸の検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ストリップの構成例を示した図
【図２】標的核酸の検出手順を示した図（Ａ：ハイブリダイゼーション、Ｂ：可視化、Ｃ：洗浄）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（１）ビオチン標識された一本鎖標的核酸を増幅する工程
本工程では、公知の核酸増幅反応を用いて、生物材料中の核酸から、ビオチン標識された一本鎖標的核酸を増幅する。
【００１５】
ビオチン標識された一本鎖標的核酸の増幅は、生物材料に含まれる核酸のうち、標的核酸を含む一本鎖核酸を選択的に増幅することが可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ビオチン標識され、標的核酸配列を増幅可能なプライマーを用いた非対称ＰＣＲにより行うことが好ましい。
非対称ＰＣＲは、１本鎖として得たい方のプライマーを、片方のプライマーに対して１０〜１００倍程度の濃度にしてＰＣＲを行う方法である。使用するプライマーの設計、プライマー比率は適宜調製すればよいが、１本鎖形成の効率の点から、例えば、ビオチン標識プライマーをフォワードプライマーとする場合、非標識のリバースプライマーとのプライマー濃度比（フォワードプライマー：リバースプライマー）は、３〜６：１が好ましく、５：1とするのがより好ましい。
また、ＰＣＲのサイクル数は、４０〜６０が好ましく、連続的に６０サイクルのＰＣＲをかけることにより効率的に一本鎖を形成できる。
【００１６】
また、上記非対称ＰＣＲは、複数、例えば、３〜１０組程度のプライマーセットを用いて一度にＰＣＲを行う、所謂マルチプレックスＰＣＲ（ＭＰＣＲ）を採用することもできる。これを用いることにより様々な長短の塩基配列を一度に増幅することができ、また、一本鎖核酸が取得されやすいという利点もある。
【００１７】
標的核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、原核生物にのみ存在する塩基配列の一部、真核生物（但し、ヒトを除く）にのみ存在する塩基配列の一部、及びヒトにのみ存在する塩基配列の一部のいずれかから選択される核酸であることが好ましい。具体的には、ウイルス遺伝子、細菌遺伝子、癌関連遺伝子、遺伝病関連遺伝子等が挙げられる。このうち、ウイルス及び細菌遺伝子としては、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ＨＩＶウイルス、マイコプラズマ、リケッチア、レンサ球菌、サルモネラ菌等の遺伝子が挙げられる。
【００１８】
インフルエンザウイルスについては、例えば、Influenza A virus (A/Narita/1/2009(H1N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) 遺伝子（ACCESSION ：GQ165815）、Influenza A virus (A/New Jersey/8/76(H1N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) 遺伝子（ACCESSION ：VR-897）、Influenza A virus (A/Aichi/2/68(H3N2)) segment 4 hemagglutinin (HA) 遺伝子（ACCESSION ：VR-547）、Influenza A virus (A/Duck/PA/10218/84(H5N2)) segment 4 hemagglutinin (HA) 遺伝子（ACCESSION ：VR-1331）、Influenza B virus (B/Taiwan/2/62) segment 4 hemagglutinin (HA) 遺伝子（ACCESSION ：VR-295）等が挙げられる。
また、Influenza A virus (A/Narita/1/2009(H1N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) 遺伝子を増幅するためのプライマーとしては、後記〔表１〕に示すものが例示できる。
【００１９】
標的核酸を含む生体材料（検体）としては、例えば、細菌、ウイルス等の病原体、生体から分離された血液、唾液、組織病片等、或いは糞尿等の排泄物が挙げられる。また、これらの検体は直接、又は必要に応じて遠心分離操作等により沈渣として濃縮した後、目的とする組織由来のＤＮＡを顕在化させる目的で、例えば酵素処理、熱処理、界面活性剤処理、超音波処理等による細胞破壊処理を予め施したものを使用することができる。
【００２０】
（２）該一本鎖増幅核酸を、ストリップ上に展開し、予め固定された相補核酸プローブとハイブリダイズさせて捕捉する工程
本工程では、工程（１）で増幅された核酸を、クロマトグラフィーの原理に基づいてストリップ上で展開し、ストリップ上に予め固定化された標的核酸と相補的な核酸プローブに接触させこれを捕捉する。
【００２１】
ストリップは、捕捉用オリゴヌクレオチドプローブを結合できる固相担体であればよいが、ニトロセルロース、ナイロン等の多孔性メンブレンが好適に挙げられ、カルボキシル基等を化学修飾した共有結合活性修飾ナイロンメンブレンでもよい。
【００２２】
相補核酸プローブは、検出対象となる１本鎖標的核酸（増幅産物）に相補的な配列を有する１本鎖オリゴヌクレオチドである。このような核酸は、上記同様にＰＣＲ法、化学合成法などにより作製することができる。核酸の長さは、通常のハイブリダイゼーション条件下で安定に標的分子とハイブリダイズできる限り、制限されないが、必要以上に長くないことが好ましく、１０〜５０塩基、より好ましくは１０〜３０塩基、更に好ましくは１５〜２５塩基である。
【００２３】
相補核酸プローブのストリップへの固定は、核酸プローブが直接ストリップと結合を形成することにより固定されていてもよいし、間接的に固定されていてもよい。例えば、化学修飾したメンブレンを用いる場合、相補核酸プローブはこれに反応する官能基を有す事が望ましく、例えばカルボキシル基で修飾されたメンブレンに対しては、５’あるいは３’末端をアミノ化した合成オリゴヌクレオチドが好ましい。
【００２４】
ストリップへの捕捉用オリゴヌクレオチドプローブの結合形態は特に限定されず、ライン状あるいは円形スポット状等の何れでもよいが、ライン状が好ましい。さらに、標的核酸と内部標準核酸由来の増幅産物を同時に捕捉するため、同一のストリップ上の異なる位置に各捕捉オリゴヌクレオチドプローブを結合しておくこともできる。
【００２５】
（３）金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液をストリップ上に展開し、前記捕捉核酸を可視化する工程
本工程では、前記で捕捉された一本鎖標的核酸のビオチンに対して、金属コロイド標識ストレプトアビジンを結合させることによって、標的核酸の捕捉位置が可視化される。
金属コロイド標識ストレプトアビジンにおける金属コロイド標識としては、視覚的に検知し得るシグナルが得られるものであって、毛管現象により移動可能であれば特に限定されないが、具体的には例えば金コロイド、鉄コロイド、銀コロイド等が挙げられ、取扱易さや感度等の点から金コロイドが好ましい。さらには、金と白金からなる合金コロイドも好適に用いることができる。ストレプトアビジンに代えてアビジンを用いてもよい。
【００２６】
金属コロイド標識ストレプトアビジンを調製する方法としては、公知の物理的吸着法、化学的結合法等を用いて調製すればよく、市販品を使用することもできる。
【００２７】
金属コロイド標識ストレプトアビジンは、例えば、金コロイド標識ストレプトアビジン40nm(50 O.D.)を１％BSA溶液で適当に希釈して金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液とし、ストリップ上に展開することによって使用される。
尚、金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液は一つ用意すればよく、一つのコンジュゲート液で、複数のストリップ上に捕捉された標的核酸を同時に可視化することも可能である。
【００２８】
（４）洗浄液をストリップ上に展開する工程
本工程は、洗浄液をストリップ上に展開し、残存する金属コロイド標識ストレプトアビジンを除去する工程は、試験管或いはプレートのウエル等に洗浄液を毛管現象にて吸い上げ洗浄する。
ここで用いられる洗浄液は、金属コロイド標識ストレプトアビジンを除去できるものであれば限定されないが、例えば、２×PBS溶液に0.1％Tween20を加えた溶液等が挙げられる。
【００２９】
上記（１）〜（４）の工程を行い、可視化されたバンドを確認することにより、標的核酸の存在を目視により判定することができる。
【００３０】
本発明の方法において、内部標準核酸を用いる場合は、標的核酸と内部標準核酸はそれぞれ別々に検出してもよいが、同一のストリップで同時に検出する共検出方法が好ましい。
検出における結果判定は、具体的には以下のように行われる事が望ましい。予想される標的核酸量と同等あるいは以下に設定され、競合あるいは非競合的に共増幅され、共検出された内部標準核酸の発色量を対照として、標的核酸量が同等、以下あるいは以上であると目視で判定を行う。例えば、標的核酸と競合増幅され得る内部標準核酸を用いた場合、標的核酸から得た増幅産物の発色量が、対照となる内部標準核酸由来の増幅産物と同等の発色量を呈した場合に同等量であると判定し、対照となる内部標準核酸の発色が微かに認められるあるいは認められず標的核酸の発色のみである場合、内部標準核酸に比べ標的核酸量が多いと判定する。一方、対照となる内部標準核酸の発色のみあるいは標的核酸の発色量が非常に微かである、という場合は標的核酸量が少ないと判定する。
【００３１】
本発明の標的核酸の検出キットは、上記の（１）〜（４）の一連の工程を実施するための手段を備えたものであり、具体的には、逆転写酵素、PCR増幅プライマー、PCR酵素液、dNTP、UNG試薬、陽性コントロール、dH2O等を含む「増幅試薬セット」と、相補核酸プローブ固定化ストリップ、増幅反応停止液、変性液、金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液等を含む「検出試薬セット」、更には、96 ウェル平底マイクロタイタープレート、マイクロピペット等の器具、洗浄液等の試薬が挙げられる。
【実施例】
【００３２】
参考例１．プライマー及びプローブの設計
（１）プライマー
【００３３】
【表１】
【００３４】
（２）プローブ
【００３５】
【表２】
【００３６】
参考例２．核酸試料の調製
以下に示す手順で核酸試料を調製した。
１．25μｌのProteaseを1.5ｍｌのマイクロ遠心チューブにピッペト或いはエクセルにて加える。
２．チューブに200μｌのサンプルを加える。
３．200μｌ抽出試薬を加え、ボルテックスにて15秒間混和する。
４．ヒートブロックで56℃、15分間インキュベート後、スピンダウンする。
５．250μｌ純エタノールを加え、ボルテックス15秒間混和し、スピンダウンする。
６．カラムに全量を移す。6,000ｇ 1分間遠心する。
７．カラムに500μｌBuffer１を加え、6,000ｇ 1分間遠心する。ろ液を捨てる。
８．カラムに500μｌBuffer２を加え、6,000ｇ 1分間遠心する。ろ液を捨てる。
９．カラムに500μｌエタノールを加え、6,000ｇ 1分間遠心する。ろ液を捨てる。
１０．カラムを20,000ｇ３分間遠心し、乾燥させる。
１１．カラムを56℃３分間インキュベートする。
１２．50μｌRNase Free H2Oを加え、20,000ｇ１分間遠心する。
【００３７】
実施例１．非対称ＰＣＲ
非対称ＰＣＲは、以下の条件により行った。
（１）ＰＣＲマスター混合溶液の調製
dH2O 32.5μｌ、10×RT-PCR buffer 10μｌ,ｄNTPｓ２μｌ、20μM FLAsw-R la 0.5μｌ,25μM FLAsw-F la bio 2μｌ,Enzyme mix 2μｌをそれぞれ加える。
（２）（１）で調製したＰＣＲマスター混合溶液４９μｌに、上記参考例２で調製した核酸試料１μｌをＰＣＲ用チューブに入れ、ABI9700（アプライドバイオシステムズ）にて、９５℃で１５分間加熱後、９５℃,３０秒、６０℃,３０秒、７２℃,３０秒のサイクルで６０回繰り返し、７２℃,３分間加熱した後、４℃、１時間放置した。
【００３８】
実施例２．マルチプレックス非対称ＰＣＲ
（１）ＰＣＲマスター混合溶液の調製
dH2O 29.5μｌ、10×RT-PCR buffer 10μｌ,ｄNTPｓ２μｌ、20μM FLAsw-R la 0.5μｌ,25μM FLAsw-F la bio 2μｌ, 20μM β354-F la 0.5μｌ,25μM β455-R la bio 2μｌEnzyme mix 2μｌをそれぞれ加える。
（２）（１）で調製したＰＣＲマスター混合溶液４９μｌに、上記参考例２で調製した核酸試料２μｌをＰＣＲ用チューブに入れ、ABI9700（アプライドバイオシステムズ）にて、９５℃で１５分間加熱後、９５℃,３０秒、６０℃,３０秒、７２℃,３０秒のサイクルで６０回繰り返し、７２℃,３分間加熱した後、４℃、１時間放置した。
【００３９】
実施例３．マルチプレックス非対称ＰＣＲ
(１) ＰＣＲマスター混合溶液の調製
dH2O 14.5μｌ、２×RT-PCR Master buffer 25μｌ,10×Primer Mix 5μｌ(20μM FLAsw-R la 0.5μｌ,25μM FLAsw-F la bio 2μｌ, 20μM β354-F la 0.5μｌ,25μM β455-R la bio 2μｌ）RT Enzyme mix 0.5μｌをそれぞれ加える。
（２）（１）で調製したＰＣＲマスター混合溶液４９μｌに、上記参考例２で調製した核酸試料２μｌをＰＣＲ用チューブに入れ、ABI9700（アプライドバイオシステムズ）にて、５０℃20分、９５℃で１５分間加熱後、９４℃,４５秒、５４℃,７５秒、のサイクルで４０回繰り返し、７２℃,３分間加熱した後、４℃、１時間放置した。
この方法でも、上記実施例２と同等かそれ以上の性能を有する。
【００４０】
参考例３ 金コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液の調製
金標識ストレプトアビジン40nm(50 O.D.)を１％BSA溶液にて８倍希釈して室温に静置した。
【００４１】
参考例４ 捕捉プローブ固定化ストリップの作成
以下の手順により、捕捉プローブ固定化ストリップを作成した（図１）
１）10xSSCでプローブを100μMに溶解する。
２）10xSSCでビオチン標識プライマーを50μMに溶解する。
３）Schleicher & Schuell PRIMA60 membraneに、水彩画用の筆でコントロールラインとプローブラインを引き、80℃5分間放置する。これを5回繰り返した後、80℃ 30分間放置し、固定化する。
４）1xPBS; 0.1% Tween20溶液で洗浄（15分）した後、滅菌水で洗浄し(10分）、membraneを風乾する（37℃、O/N）。
５）固相化したメンブレンをArcare 9020 precut cardsに貼り付ける。
ろ紙（Whatman 17Chr）を貼り付け、ラミネートフィルムを貼り付ける。出来上がったカードを2mm幅に切断する。
【００４２】
実施例３ 標的核酸の検出
以下の１）〜６）の操作を行い、インフルエンザウイルス（Influenza A virus (A/Narita/1/2009(H1N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) 遺伝子）を検出した。
１）ポリプロピレンプレートにPCR産物（プライマー：配列番号１〜４）50μLを入れる。
２）その隣のウェルに8μLの金コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液（金コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲートをTBS;1%BSA溶液で8倍に希釈）を入れる。
３）その隣のウェルに100μLの洗浄液（2xPBS 0.1% Tween20）を入れる。
４）捕捉プローブを固定化したストリップをPCR産物50μL に浸漬し（図２Ａ）、10分間放置する。
５）ストリップを金コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲートウェルに移動させ（図２Ｂ）、3分間放置する。
６）ストリップを洗浄液ウェルに移動させ（図２Ｃ）、2分間放置後、ストリップを取り出してバンドを確認する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸を検出する方法であって、以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とする標的核酸の検出方法。
（１）ビオチン標識された一本鎖標的核酸を増幅する工程
（２）該一本鎖標的核酸をストリップ上に展開し、予め固定された相補核酸プローブとハイブリダイズさせてこれを捕捉する工程
（３）金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液をストリップ上に展開し、前記捕捉核酸を可視化する工程
（４）洗浄液をストリップ上に展開する工程
【請求項２】
一本鎖標的核酸を増幅が、非対照ＰＣＲ法により行われるものである請求項１記載の標的核酸の検出方法。
【請求項３】
非対照ＰＣＲ法が、以下に示されるプライマーセットを単独又は複数用いて行われる請求項２記載の標的核酸の検出方法。
ａ）配列番号１の塩基配列からなるプライマー、配列番号２の塩基配列からなるプライマー
ｂ）配列番号３の塩基配列からなるプライマー、配列番号４の塩基配列からなるプライマー
【請求項４】
複数のストリップ上に捕捉された標的核酸を一つの金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液を用いて同時に可視化する、請求項１〜３の何れか１項記載の標的核酸の検出方法。
【請求項５】
ＰＣＲ増幅プライマー、相補核酸プローブ固定化ストリップ及び金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液を少なくとも含有する、請求項１記載の方法を実施するための標的核酸の検出キット。
【請求項１】
試料中の標的核酸を検出する方法であって、以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とする標的核酸の検出方法。
（１）ビオチン標識された一本鎖標的核酸を増幅する工程
（２）該一本鎖標的核酸をストリップ上に展開し、予め固定された相補核酸プローブとハイブリダイズさせてこれを捕捉する工程
（３）金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液をストリップ上に展開し、前記捕捉核酸を可視化する工程
（４）洗浄液をストリップ上に展開する工程
【請求項２】
一本鎖標的核酸を増幅が、非対照ＰＣＲ法により行われるものである請求項１記載の標的核酸の検出方法。
【請求項３】
非対照ＰＣＲ法が、以下に示されるプライマーセットを単独又は複数用いて行われる請求項２記載の標的核酸の検出方法。
ａ）配列番号１の塩基配列からなるプライマー、配列番号２の塩基配列からなるプライマー
ｂ）配列番号３の塩基配列からなるプライマー、配列番号４の塩基配列からなるプライマー
【請求項４】
複数のストリップ上に捕捉された標的核酸を一つの金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液を用いて同時に可視化する、請求項１〜３の何れか１項記載の標的核酸の検出方法。
【請求項５】
ＰＣＲ増幅プライマー、相補核酸プローブ固定化ストリップ及び金属コロイド標識ストレプトアビジンコンジュゲート液を少なくとも含有する、請求項１記載の方法を実施するための標的核酸の検出キット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−７２２２２（Ｐ２０１１−７２２２２Ａ）
【公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２２５２５５（Ｐ２００９−２２５２５５）
【出願日】平成２１年９月２９日（２００９．９．２９）
【出願人】（５０９２７１５４３）株式会社北里大塚バイオメディカルアッセイ研究所 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月２９日（２００９．９．２９）
【出願人】（５０９２７１５４３）株式会社北里大塚バイオメディカルアッセイ研究所 (2)
【Ｆターム（参考）】
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