本発明は、樹状細胞および腫瘍もしくは癌細胞の融合に関する。養子免疫療法の方法、ならびに融合細胞および抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を用いて抗腫瘍免疫を刺激する方法を含む、これらの細胞融合の作製および使用方法も提供される。したがって、本発明は、樹状細胞、例えば、非濾胞性樹状細胞および非樹状細胞の融合産物であるハイブリッド細胞を含む。ハイブリッド細胞は、その表面にＢ７（例えばＢ７−１またはＢ７−２などの同時刺激分子のＢ７ファミリーの任意の構成員）を発現する。好ましくは、ハイブリッド細胞は、他の同時刺激分子、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子、および接着分子も発現する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００７年１１月８日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第６１／００２，５３８号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府によって資金供与された研究についての声明
本発明は、国防省助成金ＤＡＭＤ１７−０３−１−０４８７；Ｒｅｎａｌ ＳＰＯＲＥ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｒｏｊｅｃｔ助成金ＣＡ１０１９４およびＯｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ ＳＰＯＲＥ助成金ＣＡ１０５００９の下、米国政府の援助を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般に細胞免疫学に関する。
【背景技術】
【０００４】
腫瘍細胞は、宿主のＴ細胞レパートリーによって認識される可能性があり、腫瘍免疫療法のための潜在的標的の役目を果たす特異な抗原を発現する。しかし、抗原は同時刺激がないところで提示され、腫瘍細胞は、固有の抗原提示およびエフェクター細胞集団を抑制する阻害性のサイトカインを発現するので、腫瘍細胞は宿主免疫を逃れる。（非特許文献１；非特許文献２を参照）。この免疫抑制性環境における重要な要素は、悪性腫瘍を有する患者の腫瘍層、流入領域リンパ節および循環で見出される調節Ｔ細胞の存在の増加である。（非特許文献３；非特許文献４を参照）。したがって、研究の有望な領域は、腫瘍関連アネルギーを逆転させ、悪性細胞を認識して除去するようにエフェクター細胞を刺激する、癌ワクチンの開発である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｐｅｉｓｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９７年）１８６巻：６４５〜５３頁
【非特許文献２】Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９７年）３巻：４８３〜９０頁
【非特許文献３】ｖｏｎ Ｂｏｅｈｍｅｒ、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００５年）６巻：３３８〜４４頁
【非特許文献４】Ｌｉｙａｎａｇｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２年）１６９巻：２７５６〜６１頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、免疫系を刺激する組成物を特徴とする。したがって、本発明は、樹状細胞、例えば、非濾胞性樹状細胞および非樹状細胞の融合産物であるハイブリッド細胞（またはその後代）を含む。ハイブリッド細胞は、その表面にＢ７（例えばＢ７−１またはＢ７−２などの同時刺激分子のＢ７ファミリーの任意の構成員）を発現する。好ましくは、ハイブリッド細胞は、他の同時刺激分子、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子、および接着分子も発現する。樹状細胞融合パートナーおよび非樹状細胞は、同じ種に由来してもよい。例には、非樹状細胞融合パートナーが、疾患関連抗原、例えば腫瘍、細菌またはウイルスに由来するものを発現するハイブリッド細胞が含まれる。あるいは、非樹状細胞は、腫瘍細胞である。樹状細胞は、自己由来であるか同種異系である。樹状細胞および非樹状細胞は、好ましくは同じ個体、例えばヒト患者に由来する。
【０００７】
これらの免疫賦活性組成物のそれぞれは、融合細胞を含む複数の細胞を含み、融合細胞のそれぞれは、少なくとも１つの哺乳動物の樹状細胞（例えば、骨髄培養または末梢血細胞培養に由来するＤＣ）と、細胞表面抗原（例えば、癌抗原）を発現する少なくとも１つの哺乳動物の非樹状細胞（例えば、癌細胞またはトランスフェクトされた細胞）との間の融合によって生成される。「癌抗原」は、癌を有する個体の正常細胞と対照的に、主にまたは完全に癌細胞によって発現される抗原性分子を意味する。癌抗原は、その正常な対応物と比較して、悪性細胞によってより高いレベルで発現されることもできる。あるいは、癌抗原は、ある悪性細胞および正常細胞で特異的に発現させることができる（すなわち、前立腺特異抗原）。組成物中の融合細胞は、免疫系を刺激する（例えば、Ｔ細胞を活性化する）のに有効な量で、ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７および細胞表面抗原を発現する。
【０００８】
本発明は、実質的に純粋なハイブリッド細胞を代償にして培養で増殖し、教育され（ｅｄｕｃａｔｅｄ）、抗原特異性免疫エフェクター細胞集団であって、ハイブリッド細胞が、１つまたは複数の抗原を発現する細胞に融合している抗原提示細胞（ＡＰＣ）である集団も提供する。本発明は、活性化され、増殖した免疫エフェクター細胞集団も含む。例えば、細胞はエキソビボで活性化される。上記集団は、Ｔ細胞およびハイブリッド細胞を含む。細胞は、患者由来の免疫細胞およびハイブリッド細胞の共培養に由来してもよい。エフェクター細胞は、自己由来の腫瘍細胞を特異的に死滅させ、既知のまたは未知の腫瘍抗原を認識し、それによって、未知の腫瘍抗原を特定するために用いることができる。
【０００９】
実質的に純粋な、教育され、増殖した、抗原特異的な免疫エフェクター細胞集団を生成する方法であって、免疫エフェクター細胞がＴリンパ球であり、集団がＣＤ４^＋免疫エフェクター細胞および細胞毒性ＣＤ８^＋免疫エフェクター細胞の両方を含む方法も、ここで提供される。具体的には、そのような方法は、複数のハイブリッド細胞を提供する工程であって、ハイブリッド細胞のそれぞれは少なくとも１つの樹状細胞と、細胞表面抗原を発現する少なくとも１つの腫瘍細胞または癌細胞との間の融合によって生成され、樹状細胞および腫瘍細胞または癌細胞は同じ種に由来し、樹状細胞は抗原をプロセシングおよび提示することができ、ハイブリッド細胞の少なくとも半分は免疫系を刺激するのに有効な量で（ａ）ＭＨＣクラスＩＩ分子、（ｂ）Ｂ７、および（ｃ）細胞表面抗原を発現する工程と；免疫エフェクター細胞集団を複数のハイブリッド細胞と接触させ、それによって、教育され、抗原特異的な免疫エフェクター細胞集団を生成する工程と；ハイブリッド細胞または抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体単独への曝露と比較して、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞活性および／または腫瘍反応性Ｔ細胞を増加させるために、生じた集団を抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体と接触させる工程とを含む。例えば、これらの方法は、活性化されたＴ細胞の少なくとも約２倍の増加、腫瘍反応性Ｔ細胞の少なくとも約２倍の増加；および／または、Ｔ細胞増殖の少なくとも約２倍の増加をもたらすことができる。ＤＣ／腫瘍融合単独による刺激と比較したときの、ＤＣ／腫瘍融合と続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８による刺激の増加は、もう１つの特性、例えば、それらに限定されないが、Ｔ細胞増殖の程度；記憶エフェクター細胞の存在；集団中の活性Ｔ細胞の存在の増加（例えば、ＣＤ６９発現を測定することによって）；ＩＦＮγおよび／またはグランザイムＢを発現する細胞の存在；腫瘍反応性Ｔ細胞の存在（例えば四量体染色によって）；および／または集団中の調節Ｔ細胞の存在の枯渇（例えば、ＦｏｘＰ３発現を測定することによって）を調べることによって測定することができる。
【００１０】
当業者は、本発明の方法が、活性化Ｔ細胞および調節Ｔ細胞の両方の増数をもたらすことを認識するであろう。しかし、融合への曝露および抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体による増殖の後に観察される調節Ｔ細胞の数と比較したときには、より大きなパーセントの活性化されたＴ細胞が観察される。したがって、生じるＴ細胞集団は、活性化された表現型を主に表す。
【００１１】
任意選択で、本発明の方法は、教育され、増殖したＴ細胞集団を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体による増殖の後に調節Ｔ細胞の活性を除去するか、さもなければ低減させる化合物（複数可）と接触させる工程も含む。調節Ｔ細胞の活性を除去するか低減させる化合物には、例えばある種のサイトカインが含まれる。選抜方法を用いて、または、ｓｉＲＮＡを用いて調節Ｔ細胞の重要な遺伝子の発現を抑制することによって、調節Ｔ細胞の活性を達成することができる可能性もある。
【００１２】
免疫エフェクター細胞が少なくとも２４時間の間に増殖することができるように、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体は、平らな基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に、または、当技術分野で通常用いられる任意の他の適する基材もしくは表面に結合することを当業者は認識するであろう。
【００１３】
これらの方法に従って、免疫エフェクター細胞および／またはハイブリッド細胞は、遺伝子改変された細胞であってよい。例えば、遺伝的改変は、ペプチド、リボザイム、アンチセンス配列、ホルモン、酵素、成長因子および／またはインターフェロンをコードするポリヌクレオチドの細胞（複数可）への導入を含むことができる。
【００１４】
さらに、免疫エフェクター細胞は、ハイブリッド細胞と培養する前はナイーブであってよい。さらに、免疫エフェクター細胞は、１つまたは複数のサイトカインまたはアジュバントの存在下でハイブリッド細胞と培養することができる。適するサイトカインには、ＩＬ−７、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−１８が含まれるが、これらに限定されない。さらに、適するアジュバントには、ＣＰＧ ＯＤＮ、ＴＬＲ７／８アゴニストおよび／またはＴＬＲ３アゴニストを含めることができるが、これらに限定されない。
【００１５】
生じた増殖し、教育され、抗原特異的な免疫エフェクター細胞集団は、ＩＬ−７などのサイトカインを含む細胞培養培地で維持することができる。
【００１６】
当業者は、樹状細胞および１つまたは複数の抗原を発現する腫瘍もしくは癌細胞が、自己由来または同種異系であってよいことを認識するであろう。一部の実施形態では、樹状細胞および腫瘍もしくは癌細胞は、同じ個体から（すなわち同じヒトから）得られる。あるいは、樹状細胞および腫瘍もしくは癌細胞は、同じ種（すなわち、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）の異なる個体から得られる。
【００１７】
これらの方法で用いるのに適する樹状細胞は、末梢血、骨髄または皮膚に由来しても、またはそこから得てもよい。同様に、樹状細胞は、樹状細胞始原細胞から得ても、またはそれに由来してもよい。
【００１８】
これらの方法と共に使用することが企図される腫瘍もしくは癌細胞には、乳癌細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、腎臓癌細胞、肺癌細胞、尿路上皮癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞または血液癌細胞が含まれるが、これらに限定されない。例えば、血液癌細胞には、急性骨髄性白血病細胞、急性リンパ性白血病細胞、多発性骨髄腫細胞および非ホジキンリンパ腫細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
さらに、当業者は、任意の腫瘍または癌細胞を本発明の方法のいずれかで用いることができることを認識するであろう。
【００２０】
ここでは、増殖し、教育され、抗原特異的な免疫エフェクター細胞を含む実質的に純粋な集団であって、１つまたは複数の抗原を発現する腫瘍もしくは癌細胞に融合している樹状細胞を含むハイブリッド細胞によって教育された、教育された抗原特異的な免疫エフェクター細胞を含む。好ましくは、樹状細胞および腫瘍もしくは癌細胞は同じ種に由来し、樹状細胞は抗原をプロセシングおよび提示することができ、融合細胞の少なくとも半分は、免疫系を刺激するのに有効な量で（ａ）ＭＨＣクラスＩＩ分子、（ｂ）Ｂ７および（ｃ）細胞表面抗原を発現する。生じた、教育された免疫エフェクター細胞は、その後抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下の培養物で増殖し、培養でのこの増殖の後に、ハイブリッド細胞単独に曝露させた免疫エフェクター細胞と比較して、集団におけるＴ細胞の増殖が少なくとも約７倍増加しているか、集団におけるＴ細胞の活性化が少なくとも約４倍増加しているか、集団における腫瘍反応性Ｔ細胞が少なくとも約１３倍増加しているか、またはそれらの任意の組合せである。
【００２１】
樹状細胞および腫瘍もしくは癌細胞は、同じ個体（すなわち同じヒト）または同じ種（すなわち、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）の異なる個体から得られる。
【００２２】
一実施例では、腫瘍もしくは癌細胞が腎癌細胞である場合、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下の培養での増殖の後に、集団におけるＴ細胞の増殖が、ハイブリッド細胞単独に曝露させた免疫エフェクター細胞と比較して少なくとも約１３倍増加していること；集団における記憶エフェクター細胞の存在が、ハイブリッド細胞単独に曝露させた免疫エフェクター細胞と比較して少なくとも約２倍増加していること、集団におけるＴ細胞の活性化が、ハイブリッド細胞単独に曝露させた免疫エフェクター細胞と比較して少なくとも約８倍増加していること；ＩＦＮγおよびグランザイムＢを発現する細胞の集団における存在が、ハイブリッド細胞単独に曝露させた免疫エフェクター細胞と比較して、それぞれ少なくとも約２．５倍および３．７５倍増加していること；ならびに、集団における腫瘍反応性Ｔ細胞が、ハイブリッド細胞単独に曝露させた免疫エフェクター細胞と比較して少なくとも約１３倍増加していることが観察されている。
【００２３】
当業者は、集団における様々な細胞の数の増加倍率が、本発明で用いる腫瘍もしくは癌細胞のタイプによって決まることを認識するであろう。さらに、特定の癌タイプ内で患者間の変動が存在する。
【００２４】
ＤＣ／腫瘍融合単独による刺激と比較した、ＤＣ／腫瘍融合と、それに続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８とによる刺激の平均増加倍率を、下の表１に示す。
【００２５】
【表１】

生じた、増殖し、教育され、抗原特異的な免疫エフェクター細胞集団は、細胞集団および薬学的に許容される担体を含むことができるワクチンとして用いることもできる。
【００２６】
ここでは、免疫応答を誘導するために、この増殖し、教育された免疫エフェクター細胞集団を個体に投与することによって、癌を治療する方法も提供される。例えば、治療される癌は、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、肺癌、尿路上皮癌、結腸癌、直腸癌、脳癌（例えば、神経膠腫）または血液癌からなる群より選択される。例えば、適する血液癌には、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、多発性骨髄腫および非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
当業者は、そのような治療方法が、複数のハイブリッド細胞の有効量の共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）を含むこともでき、ハイブリッド細胞のそれぞれは、少なくとも１つの樹状細胞と、細胞表面抗原を発現する少なくとも１つの腫瘍細胞または癌細胞との間の融合によって生成され、樹状細胞および腫瘍細胞または癌細胞は同じ種に由来し、ハイブリッド細胞の少なくとも半分は、免疫系を刺激するのに有効な量で、（ａ）ＭＨＣクラスＩＩ分子、（ｂ）Ｂ７および（ｃ）細胞表面抗原を発現することを認識するであろう。例えば、共投与は、逐次的または同時に行われてもよい。
【００２８】
さらに、治療が必要な個体に、集団の投与の前にリンパ球を枯渇させる治療を投与することができる。具体的には、この治療は、個体においてリンパ球減少を誘導する。適する治療の例には、それらに限定されないが、フルダラビンまたは放射線の投与が含まれる。
【００２９】
増殖し、教育された免疫エフェクター細胞集団は、幹細胞移植の後に個体に投与することができる。
【００３０】
本発明は、抗原性活性についてペプチドを試験する方法も特徴とする。具体的には、そのような方法は、樹状細胞と腫瘍もしくは癌細胞との融合産物を含み、その表面にＢ７を発現するハイブリッド細胞を提供する工程と；ハイブリッド細胞を免疫エフェクター細胞と接触させ、それによって教育された免疫エフェクター細胞を生成する工程と；教育された免疫エフェクター細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体と接触させる工程と；ペプチドの存在下で標的細胞を教育された免疫エフェクター細胞と接触させる工程とを含む。当業者は、標的細胞の溶解が、前記ペプチドを抗原性ペプチドと同定することを認識するであろう。
【００３１】
抗原性活性についてペプチドを試験する方法であって、複数の細胞を提供する工程であり、前記複数の細胞の少なくとも５％が、少なくとも１つの樹状細胞と、細胞表面抗原を発現する少なくとも１つの腫瘍もしくは癌細胞との間の融合によって生成される融合細胞であり、融合細胞が、免疫応答を刺激するのに有効な量で（ａ）ＭＨＣクラスＩＩ分子、（ｉｉ）Ｂ７および（ｉｉｉ）前記細胞表面抗原を発現する工程と；ヒトＴリンパ球の集団を前記複数の細胞と接触させる工程であり、Ｔリンパ球の集団内のエフェクター細胞前駆体細胞の、細胞傷害性Ｔリンパ球を含むエフェクター細胞への分化を引き起こす工程と；細胞傷害性Ｔリンパ球を含むエフェクター細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体と接触させる工程と；複数の標的細胞を前記ペプチドの存在下でＴリンパ球を含むエフェクター細胞と接触させる工程とを含む方法も提供される。そのような方法では、複数の標的細胞またはその一部の溶解は、前記ペプチドを、細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される抗原性ペプチドと同定する。
【００３２】
最後に、本発明は、本明細書で開示される方法のいずれかによって特定される抗原性ペプチドおよび担体を含むワクチンも提供する。
【００３３】
特に定義されていない場合は、本明細書で用いるすべての技術用語および学術用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書のすべての引用文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【００３４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の図、詳細な説明および請求項から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】単球由来の樹状細胞（ＤＣ）、腎細胞癌（「ＲＣＣ」）細胞系、ＲＣＣ ７８６および融合細胞の免疫組織化学的分析の結果を示す図である。ＤＣは、正常な供与体から得られたロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｋ）コレクションから単離された、接着性単核細胞から生成された。ＤＣをＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４と５日間培養し、次に、ＴＮＦαへの４８〜７２時間の曝露によって成熟させた。ＤＣ調製物は、同時刺激分子の発現について、免疫組織化学的分析にかけた。ＣＤ８６（青色）のＤＣ発現を、図１Ａに示す（６０×）。ＲＣＣ ７８６細胞をＲＰＭＩ １６４０完全培地で培養し、腫瘍関連抗原サイトケラチンおよびＣＡＭの発現について、免疫組織化学的分析にかけた。ＣＡＭ（赤色）の腫瘍発現を、図１Ｂに示す（６０×）。ＰＥＧの存在下でのＤＣおよびＲＣＣ ７８６細胞の共培養によって、融合細胞を生成した。ＤＣ由来の同時刺激分子ＣＤ８６（青色）および腫瘍関連抗原ＣＡＭ（赤色）の同時発現について、融合細胞調製物を免疫組織化学的分析にかけた（図１Ｃ）。
【図２】Ｔ細胞増殖に及ぼす、融合細胞、抗ＣＤ３／ＣＤ２８による刺激、または融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激の影響を示す図である。Ｔ細胞を、１）１：１０の融合対Ｔ細胞の比率で、融合細胞と７日間共培養した；２）抗ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングしたプレート上で４８時間培養した；３）融合細胞と５日間、その後抗ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングしたプレートと４８時間共培養した；または４）抗ＣＤ３／ＣＤ２８と４８時間培養し、その後、融合細胞で５日間刺激した。刺激の後、終夜パルス後のトリチウムチミジンの取込みによって、Ｔ細胞増殖を測定した。図２Ａは、刺激指数（未刺激のＴ細胞の共培養／増殖の後のＴ細胞増殖）で表した結果を示す。９回の実験の平均値を、関連する平均値の標準誤差と提供する。融合細胞、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、または融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激によって刺激されたＴ細胞を、ナイーブな（ＣＤ４５ＲＡ）および記憶（ＣＤ４５ＲＯ）Ｔ細胞集団の存在について評価するために、表現型分析にかけた。刺激されたＴ細胞をＦＩＴＣ結合ＣＤ４およびＰＥ結合ＣＤ４５ＲＡもしくはＣＤ４５ＲＯとインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。４回の実験の平均値を、関連する平均値の標準誤差と図２Ｂに示す。
【図３】融合細胞、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、または融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激によって刺激されたＴ細胞の表現型分析の結果を示す図である。融合細胞、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、または融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激によって刺激されたＴ細胞を、ＣＤ４およびＣＤ２５の同時発現について評価するために、多チャネルフローサイトメトリーによる表現型分析にかけた。図３Ａは、二重発現細胞のパーセントを判定するために、ＦＩＴＣ結合ＣＤ４およびサイクローム（ｃｙｃｈｒｏｍｅ）結合ＣＤ２５で染色した刺激されたＴ細胞集団の結果を示す。１１回の実験の平均値を、関連する平均値の標準誤差と提供する。ＤＣ／ＲＣＣ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による複合刺激が、調節Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋）と比較して活性化された（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６９＋）の増殖をもたらすかを調べた。刺激されたＴ細胞調製物を、ＦＩＴＣ結合ＣＤ４、サイクローム結合ＣＤ２５およびＰＥ結合ＣＤ６９について染色した。あるいは、細胞をＣＤ４／ＣＤ２５について染色し、透過性にし、ＰＥ結合Ｆｏｘｐ３またはマッチさせたアイソタイプ対照抗体とインキュベートした。ＣＤ４／ＣＤ２５＋Ｔ細胞をＦＡＣＳゲーティングによって単離し、ＣＤ６９およびＦｏｘｐ３の発現を測定した。図３Ｂに示すように、結果を、全Ｔ細胞集団に対する活性化Ｔ細胞または調節Ｔ細胞のパーセントとして提示する。９回の実験の平均値を、関連する平均値の標準誤差と提供する。
【図４Ａ】単球由来の樹状細胞（ＤＣ）の表現型分析の結果を示す図である。ＤＣは、乳癌患者の末梢血から単離された接着性単核細胞から生成し、ロイコパックは正常な供与体から得た。細胞をＧＭ−ＣＳＦ（１０００ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１０００ＩＵ／ｍｌ）と５〜７日間培養し（未熟ＤＣ）、サブセットをＴＮＦα（２５ηｇ／ｍｌ）で４８〜７２時間成熟させた。同時刺激および成熟マーカーの発現を調べるために、未熟および成熟ＤＣをＦＡＣＳ分析にかけた。図４Ａは、代表的な未熟および成熟ＤＣ調製物のＦＡＣｓ分析を示す。図４Ｂは、１５回の実験からの、指示された表面マーカーを発現する細胞の平均パーセント（±ＳＥＭ）を示す。成熟は、同時刺激（ＣＤ８０およびＣＤ８６）および成熟（ＣＤ８３）マーカーの発現の増加をもたらす。
【図４Ｂ】単球由来の樹状細胞（ＤＣ）の表現型分析の結果を示す図である。ＤＣは、乳癌患者の末梢血から単離された接着性単核細胞から生成し、ロイコパックは正常な供与体から得た。細胞をＧＭ−ＣＳＦ（１０００ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１０００ＩＵ／ｍｌ）と５〜７日間培養し（未熟ＤＣ）、サブセットをＴＮＦα（２５ηｇ／ｍｌ）で４８〜７２時間成熟させた。同時刺激および成熟マーカーの発現を調べるために、未熟および成熟ＤＣをＦＡＣＳ分析にかけた。図４Ａは、代表的な未熟および成熟ＤＣ調製物のＦＡＣｓ分析を示す。図４Ｂは、１５回の実験からの、指示された表面マーカーを発現する細胞の平均パーセント（±ＳＥＭ）を示す。成熟は、同時刺激（ＣＤ８０およびＣＤ８６）および成熟（ＣＤ８３）マーカーの発現の増加をもたらす。
【図５Ａ】ＤＣ／乳癌融合細胞の表現型分析の結果を示す図である。腫瘍細胞を、ＰＥＧの存在下での共培養によって未熟もしくは成熟ＤＣと融合させた。図５Ａは、融合細胞をサイトケラチン（ＣＴ）およびＣＤ１１ｃ（左パネル）を同時発現する細胞の周辺をゲーティングすることによって単離した、代表的な実験の結果を示す。融合細胞によるＣＤ８６およびＣＤ８３の発現を測定した（右パネル）。図５Ｂは、ＤＲ、ＣＤ８６およびＣＤ８３を発現する未熟のおよび成熟したＤＣ／乳癌融合の平均パーセント（±ＳＥＭ）を示す。ＤＣ−腫瘍融合調製物の免疫組織化学的分析を、サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）調製に続いて実施した。未熟なＤＣ／乳癌融合を、アイソタイプをマッチさせたＩｇＧ対照（図５Ｃ）；ＭＵＣ１／ＨＬＡ−ＤＲ（図５Ｄ）；ＣＴ／ＣＤ８６（図５Ｅ）；およびＣＴ／ＣＤ８３（図５Ｆ）について染色した。
【図５Ｂ】ＤＣ／乳癌融合細胞の表現型分析の結果を示す図である。腫瘍細胞を、ＰＥＧの存在下での共培養によって未熟もしくは成熟ＤＣと融合させた。図５Ａは、融合細胞をサイトケラチン（ＣＴ）およびＣＤ１１ｃ（左パネル）を同時発現する細胞の周辺をゲーティングすることによって単離した、代表的な実験の結果を示す。融合細胞によるＣＤ８６およびＣＤ８３の発現を測定した（右パネル）。図５Ｂは、ＤＲ、ＣＤ８６およびＣＤ８３を発現する未熟のおよび成熟したＤＣ／乳癌融合の平均パーセント（±ＳＥＭ）を示す。ＤＣ−腫瘍融合調製物の免疫組織化学的分析を、サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）調製に続いて実施した。未熟なＤＣ／乳癌融合を、アイソタイプをマッチさせたＩｇＧ対照（図５Ｃ）；ＭＵＣ１／ＨＬＡ−ＤＲ（図５Ｄ）；ＣＴ／ＣＤ８６（図５Ｅ）；およびＣＴ／ＣＤ８３（図５Ｆ）について染色した。
【図５Ｃ】ＤＣ／乳癌融合細胞の表現型分析の結果を示す図である。腫瘍細胞を、ＰＥＧの存在下での共培養によって未熟もしくは成熟ＤＣと融合させた。図５Ａは、融合細胞をサイトケラチン（ＣＴ）およびＣＤ１１ｃ（左パネル）を同時発現する細胞の周辺をゲーティングすることによって単離した、代表的な実験の結果を示す。融合細胞によるＣＤ８６およびＣＤ８３の発現を測定した（右パネル）。図５Ｂは、ＤＲ、ＣＤ８６およびＣＤ８３を発現する未熟のおよび成熟したＤＣ／乳癌融合の平均パーセント（±ＳＥＭ）を示す。ＤＣ−腫瘍融合調製物の免疫組織化学的分析を、サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）調製に続いて実施した。未熟なＤＣ／乳癌融合を、アイソタイプをマッチさせたＩｇＧ対照（図５Ｃ）；ＭＵＣ１／ＨＬＡ−ＤＲ（図５Ｄ）；ＣＴ／ＣＤ８６（図５Ｅ）；およびＣＴ／ＣＤ８３（図５Ｆ）について染色した。
【図５Ｄ】ＤＣ／乳癌融合細胞の表現型分析の結果を示す図である。腫瘍細胞を、ＰＥＧの存在下での共培養によって未熟もしくは成熟ＤＣと融合させた。図５Ａは、融合細胞をサイトケラチン（ＣＴ）およびＣＤ１１ｃ（左パネル）を同時発現する細胞の周辺をゲーティングすることによって単離した、代表的な実験の結果を示す。融合細胞によるＣＤ８６およびＣＤ８３の発現を測定した（右パネル）。図５Ｂは、ＤＲ、ＣＤ８６およびＣＤ８３を発現する未熟のおよび成熟したＤＣ／乳癌融合の平均パーセント（±ＳＥＭ）を示す。ＤＣ−腫瘍融合調製物の免疫組織化学的分析を、サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）調製に続いて実施した。未熟なＤＣ／乳癌融合を、アイソタイプをマッチさせたＩｇＧ対照（図５Ｃ）；ＭＵＣ１／ＨＬＡ−ＤＲ（図５Ｄ）；ＣＴ／ＣＤ８６（図５Ｅ）；およびＣＴ／ＣＤ８３（図５Ｆ）について染色した。
【図５Ｅ】ＤＣ／乳癌融合細胞の表現型分析の結果を示す図である。腫瘍細胞を、ＰＥＧの存在下での共培養によって未熟もしくは成熟ＤＣと融合させた。図５Ａは、融合細胞をサイトケラチン（ＣＴ）およびＣＤ１１ｃ（左パネル）を同時発現する細胞の周辺をゲーティングすることによって単離した、代表的な実験の結果を示す。融合細胞によるＣＤ８６およびＣＤ８３の発現を測定した（右パネル）。図５Ｂは、ＤＲ、ＣＤ８６およびＣＤ８３を発現する未熟のおよび成熟したＤＣ／乳癌融合の平均パーセント（±ＳＥＭ）を示す。ＤＣ−腫瘍融合調製物の免疫組織化学的分析を、サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）調製に続いて実施した。未熟なＤＣ／乳癌融合を、アイソタイプをマッチさせたＩｇＧ対照（図５Ｃ）；ＭＵＣ１／ＨＬＡ−ＤＲ（図５Ｄ）；ＣＴ／ＣＤ８６（図５Ｅ）；およびＣＴ／ＣＤ８３（図５Ｆ）について染色した。
【図５Ｆ】ＤＣ／乳癌融合細胞の表現型分析の結果を示す図である。腫瘍細胞を、ＰＥＧの存在下での共培養によって未熟もしくは成熟ＤＣと融合させた。図５Ａは、融合細胞をサイトケラチン（ＣＴ）およびＣＤ１１ｃ（左パネル）を同時発現する細胞の周辺をゲーティングすることによって単離した、代表的な実験の結果を示す。融合細胞によるＣＤ８６およびＣＤ８３の発現を測定した（右パネル）。図５Ｂは、ＤＲ、ＣＤ８６およびＣＤ８３を発現する未熟のおよび成熟したＤＣ／乳癌融合の平均パーセント（±ＳＥＭ）を示す。ＤＣ−腫瘍融合調製物の免疫組織化学的分析を、サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）調製に続いて実施した。未熟なＤＣ／乳癌融合を、アイソタイプをマッチさせたＩｇＧ対照（図５Ｃ）；ＭＵＣ１／ＨＬＡ−ＤＲ（図５Ｄ）；ＣＴ／ＣＤ８６（図５Ｅ）；およびＣＴ／ＣＤ８３（図５Ｆ）について染色した。
【図６Ａ】未熟もしくは成熟ＤＣで生成したＤＣ／乳癌融合細胞における、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＣＣＲ７の発現を示す図である。未熟もしくは成熟ＤＣで生成した融合細胞調製物をＣＴおよびＣＤ１１ｃで染色し、その後、固定し、透過性にし、細胞内のＩＬ−１０およびＩＬ−１２について染色した。未固定の融合細胞を、ＣＣＲ７の表面発現のために用いた。融合細胞をＦＡＣＳゲーティングによって単離し、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＣＣＲ７の発現について分析した。ＩＬ−１０（図６Ａ）、ＩＬ−１２（図６Ｂ）およびＣＣＲ７（図６Ｃ）を発現する未熟のおよび成熟したＤＣ／乳癌細胞の平均のパーセント（±ＳＥＭ）を、１２回の実験について示す。図６Ｄは、未熟もしくは成熟ＤＣで調製したＤＣ／乳癌細胞による、Ｔ細胞増殖の誘導を示す。融合細胞をＴ細胞と共培養し、増殖を、^３［Ｈ］＝チミジン取込みによって測定した。刺激指数（ＳＩ）の計算によって結果を正規化した。
【図６Ｂ】未熟もしくは成熟ＤＣで生成したＤＣ／乳癌融合細胞における、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＣＣＲ７の発現を示す図である。未熟もしくは成熟ＤＣで生成した融合細胞調製物をＣＴおよびＣＤ１１ｃで染色し、その後、固定し、透過性にし、細胞内のＩＬ−１０およびＩＬ−１２について染色した。未固定の融合細胞を、ＣＣＲ７の表面発現のために用いた。融合細胞をＦＡＣＳゲーティングによって単離し、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＣＣＲ７の発現について分析した。ＩＬ−１０（図６Ａ）、ＩＬ−１２（図６Ｂ）およびＣＣＲ７（図６Ｃ）を発現する未熟のおよび成熟したＤＣ／乳癌細胞の平均のパーセント（±ＳＥＭ）を、１２回の実験について示す。図６Ｄは、未熟もしくは成熟ＤＣで調製したＤＣ／乳癌細胞による、Ｔ細胞増殖の誘導を示す。融合細胞をＴ細胞と共培養し、増殖を、^３［Ｈ］＝チミジン取込みによって測定した。刺激指数（ＳＩ）の計算によって結果を正規化した。
【図６Ｃ】未熟もしくは成熟ＤＣで生成したＤＣ／乳癌融合細胞における、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＣＣＲ７の発現を示す図である。未熟もしくは成熟ＤＣで生成した融合細胞調製物をＣＴおよびＣＤ１１ｃで染色し、その後、固定し、透過性にし、細胞内のＩＬ−１０およびＩＬ−１２について染色した。未固定の融合細胞を、ＣＣＲ７の表面発現のために用いた。融合細胞をＦＡＣＳゲーティングによって単離し、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＣＣＲ７の発現について分析した。ＩＬ−１０（図６Ａ）、ＩＬ−１２（図６Ｂ）およびＣＣＲ７（図６Ｃ）を発現する未熟のおよび成熟したＤＣ／乳癌細胞の平均のパーセント（±ＳＥＭ）を、１２回の実験について示す。図６Ｄは、未熟もしくは成熟ＤＣで調製したＤＣ／乳癌細胞による、Ｔ細胞増殖の誘導を示す。融合細胞をＴ細胞と共培養し、増殖を、^３［Ｈ］＝チミジン取込みによって測定した。刺激指数（ＳＩ）の計算によって結果を正規化した。
【図６Ｄ】未熟もしくは成熟ＤＣで生成したＤＣ／乳癌融合細胞における、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＣＣＲ７の発現を示す図である。未熟もしくは成熟ＤＣで生成した融合細胞調製物をＣＴおよびＣＤ１１ｃで染色し、その後、固定し、透過性にし、細胞内のＩＬ−１０およびＩＬ−１２について染色した。未固定の融合細胞を、ＣＣＲ７の表面発現のために用いた。融合細胞をＦＡＣＳゲーティングによって単離し、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＣＣＲ７の発現について分析した。ＩＬ−１０（図６Ａ）、ＩＬ−１２（図６Ｂ）およびＣＣＲ７（図６Ｃ）を発現する未熟のおよび成熟したＤＣ／乳癌細胞の平均のパーセント（±ＳＥＭ）を、１２回の実験について示す。図６Ｄは、未熟もしくは成熟ＤＣで調製したＤＣ／乳癌細胞による、Ｔ細胞増殖の誘導を示す。融合細胞をＴ細胞と共培養し、増殖を、^３［Ｈ］＝チミジン取込みによって測定した。刺激指数（ＳＩ）の計算によって結果を正規化した。
【図７Ａ】ＤＣ／乳癌融合による自己由来Ｔ細胞の刺激の後の、培養上清のサイトカイン発現を示す図である。自己由来の非接着性細胞と共培養した未熟のおよび成熟したＤＣ／乳癌融合細胞の培養上清のＴｈ１、Ｔｈ２および炎症性サイトカインのプロフィールを、サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）分析キットを用いて定量化した。図７Ａにおいて、上のパネルは、ＢＤ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアによるデータ収集と、それに続くデータフォーマットおよびその後のＢＤ ＣＢＡソフトウェアを用いての分析との後の、Ｔｈ１／Ｔｈ２および炎症性サイトカインの蛍光ビーズアレイドット−プロットアッセイディスプレイを表す、単一の実験からの代表的な実施例を示す。図７Ｂでは、培養上清中のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦαおよびＩＦＮγサイトカイン（ｐｇ／ｍｌ）の平均（±ＳＥＭ）濃度は、一連の４回（対照としてＤＣ＋自己由来非接着性細胞共培養）、および１１回（自己由来非接着性細胞と共培養した未熟および成熟ＤＣ／乳癌融合細胞）の別々の実験から提供される（ＩＭ−ＤＣ融合：未熟な樹状細胞融合；Ｍ−ＤＣ融合：成熟した樹状細胞融合）。
【図７Ｂ】ＤＣ／乳癌融合による自己由来Ｔ細胞の刺激の後の、培養上清のサイトカイン発現を示す図である。自己由来の非接着性細胞と共培養した未熟のおよび成熟したＤＣ／乳癌融合細胞の培養上清のＴｈ１、Ｔｈ２および炎症性サイトカインのプロフィールを、サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）分析キットを用いて定量化した。図７Ａにおいて、上のパネルは、ＢＤ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアによるデータ収集と、それに続くデータフォーマットおよびその後のＢＤ ＣＢＡソフトウェアを用いての分析との後の、Ｔｈ１／Ｔｈ２および炎症性サイトカインの蛍光ビーズアレイドット−プロットアッセイディスプレイを表す、単一の実験からの代表的な実施例を示す。図７Ｂでは、培養上清中のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦαおよびＩＦＮγサイトカイン（ｐｇ／ｍｌ）の平均（±ＳＥＭ）濃度は、一連の４回（対照としてＤＣ＋自己由来非接着性細胞共培養）、および１１回（自己由来非接着性細胞と共培養した未熟および成熟ＤＣ／乳癌融合細胞）の別々の実験から提供される（ＩＭ−ＤＣ融合：未熟な樹状細胞融合；Ｍ−ＤＣ融合：成熟した樹状細胞融合）。
【図８】未熟および成熟ＤＣ／乳癌融合は、腫瘍標的の溶解およびＭＵＣ−１特異的Ｔ細胞の増殖を刺激することを示す図である。図８Ａでは、未熟および成熟ＤＣ／乳癌融合細胞を、３０：１の比率で自己由来Ｔ細胞と７〜１０日間共培養した。Ｔ細胞を、^５１Ｃｒ標識自己由来乳房腫瘍細胞、または半自己由来のＤＣ／乳癌融合細胞とインキュベートした。標識細胞の溶解は、クロム放出アッセイで測定した。未熟もしくは成熟ＤＣ／乳癌融合細胞による刺激の後の、平均細胞毒性のパーセント（±ＳＥＭ）を提供する。図８Ｂは、成熟ＤＣ／乳癌融合による刺激が、ＭＵＣ１四量体に結合するＴ細胞の増殖をもたらすことを示す。ＨＬＡ^＊０２０１供与体から生成されたＤＣを乳癌細胞と融合させ、自己由来のＴ細胞と５日間培養した。融合細胞による刺激の前後におけるＭＵＣ１四量体に結合するＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを二次元ＦＡＣＳ分析で測定し、対照四量体で見られるものと比較した。
【図９Ａ】ＤＣ／乳癌融合による刺激は、活性化Ｔ細胞および調節Ｔ細胞の増殖をもたらすことを示す図である。図９Ａでは、自己由来の非接着性Ｔ細胞を、ＤＣ／乳癌融合細胞で５日間刺激した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、磁気ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて選択し、ＰＥ結合ＣＤ４およびＦＩＴＣ結合ＣＤ２５抗体で標識した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、非刺激Ｔ細胞および融合刺激Ｔ細胞について、二次元ＦＡＣＳ分析によって定量化した。データを、代表的なドットプロット実験から提供する。図９Ｂは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の平均パーセント（±ＳＥＭ）を示す。自己由来（図９Ｃ）または同種異系（図９Ｄ）のＴ細胞を、ＤＣ／乳癌融合細胞と５日間培養し、磁性ビーズ分離によってＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。ＣＤ２５／ＣＤ６９、ＣＤ２５／ＣＩＴＲおよびＣＤ２５／ＣＴＬＡ−４を同時発現する細胞の平均パーセント（±ＳＥＭ）を、二次元フローサイトメトリーで測定した。データは、５回の別々の実験を表す（平均±ＳＥＭ）。
【図９Ｂ】ＤＣ／乳癌融合による刺激は、活性化Ｔ細胞および調節Ｔ細胞の増殖をもたらすことを示す図である。図９Ａでは、自己由来の非接着性Ｔ細胞を、ＤＣ／乳癌融合細胞で５日間刺激した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、磁気ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて選択し、ＰＥ結合ＣＤ４およびＦＩＴＣ結合ＣＤ２５抗体で標識した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、非刺激Ｔ細胞および融合刺激Ｔ細胞について、二次元ＦＡＣＳ分析によって定量化した。データを、代表的なドットプロット実験から提供する。図９Ｂは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の平均パーセント（±ＳＥＭ）を示す。自己由来（図９Ｃ）または同種異系（図９Ｄ）のＴ細胞を、ＤＣ／乳癌融合細胞と５日間培養し、磁性ビーズ分離によってＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。ＣＤ２５／ＣＤ６９、ＣＤ２５／ＣＩＴＲおよびＣＤ２５／ＣＴＬＡ−４を同時発現する細胞の平均パーセント（±ＳＥＭ）を、二次元フローサイトメトリーで測定した。データは、５回の別々の実験を表す（平均±ＳＥＭ）。
【図９Ｃ】ＤＣ／乳癌融合による刺激は、活性化Ｔ細胞および調節Ｔ細胞の増殖をもたらすことを示す図である。図９Ａでは、自己由来の非接着性Ｔ細胞を、ＤＣ／乳癌融合細胞で５日間刺激した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、磁気ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて選択し、ＰＥ結合ＣＤ４およびＦＩＴＣ結合ＣＤ２５抗体で標識した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、非刺激Ｔ細胞および融合刺激Ｔ細胞について、二次元ＦＡＣＳ分析によって定量化した。データを、代表的なドットプロット実験から提供する。図９Ｂは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の平均パーセント（±ＳＥＭ）を示す。自己由来（図９Ｃ）または同種異系（図９Ｄ）のＴ細胞を、ＤＣ／乳癌融合細胞と５日間培養し、磁性ビーズ分離によってＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。ＣＤ２５／ＣＤ６９、ＣＤ２５／ＣＩＴＲおよびＣＤ２５／ＣＴＬＡ−４を同時発現する細胞の平均パーセント（±ＳＥＭ）を、二次元フローサイトメトリーで測定した。データは、５回の別々の実験を表す（平均±ＳＥＭ）。
【図９Ｄ】ＤＣ／乳癌融合による刺激は、活性化Ｔ細胞および調節Ｔ細胞の増殖をもたらすことを示す図である。図９Ａでは、自己由来の非接着性Ｔ細胞を、ＤＣ／乳癌融合細胞で５日間刺激した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、磁気ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて選択し、ＰＥ結合ＣＤ４およびＦＩＴＣ結合ＣＤ２５抗体で標識した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、非刺激Ｔ細胞および融合刺激Ｔ細胞について、二次元ＦＡＣＳ分析によって定量化した。データを、代表的なドットプロット実験から提供する。図９Ｂは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の平均パーセント（±ＳＥＭ）を示す。自己由来（図９Ｃ）または同種異系（図９Ｄ）のＴ細胞を、ＤＣ／乳癌融合細胞と５日間培養し、磁性ビーズ分離によってＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。ＣＤ２５／ＣＤ６９、ＣＤ２５／ＣＩＴＲおよびＣＤ２５／ＣＴＬＡ−４を同時発現する細胞の平均パーセント（±ＳＥＭ）を、二次元フローサイトメトリーで測定した。データは、５回の別々の実験を表す（平均±ＳＥＭ）。
【図１０Ａ】ＤＣ／乳癌融合細胞による刺激の後の、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０およびＦｏｘｐ３に続くＴ細胞の増殖を示す図である。自己由来Ｔ細胞を、ＤＣ／乳癌融合と５〜７日間共培養した。磁気ミクロビーズを用いたＣＤ４＋Ｔ細胞の選択の後に、細胞をＦＩＴＣ結合ＣＤ２５で染色し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液で透過性にし、ＰＥ結合ＩＦＮγ、ＩＬ−１０またはＦｏｘｐ３抗体で染色した。図１０Ａは、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０またはＦｏｘｐ３を発現する、未刺激の（上のパネル）および融合によって刺激されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞（下のパネル）の代表的なＦＡＣＳ分析を示す。図１０Ｂは、一連の９〜１４回の実験のスタッキングドットプロットグラフを示す。実験の各ドットプロット群を覆う影付きのヒストグラムは、その群の平均を表す。
【図１０Ｂ】ＤＣ／乳癌融合細胞による刺激の後の、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０およびＦｏｘｐ３に続くＴ細胞の増殖を示す図である。自己由来Ｔ細胞を、ＤＣ／乳癌融合と５〜７日間共培養した。磁気ミクロビーズを用いたＣＤ４＋Ｔ細胞の選択の後に、細胞をＦＩＴＣ結合ＣＤ２５で染色し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液で透過性にし、ＰＥ結合ＩＦＮγ、ＩＬ−１０またはＦｏｘｐ３抗体で染色した。図１０Ａは、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０またはＦｏｘｐ３を発現する、未刺激の（上のパネル）および融合によって刺激されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞（下のパネル）の代表的なＦＡＣＳ分析を示す。図１０Ｂは、一連の９〜１４回の実験のスタッキングドットプロットグラフを示す。実験の各ドットプロット群を覆う影付きのヒストグラムは、その群の平均を表す。
【図１１Ａ】ＣＰＧ−ＯＤＮ、ＩＬ１２およびＩＬ１８の添加が、ＤＣ／乳癌融合による調節Ｔ細胞の増殖の枯渇をもたらすことを示す図である。ＤＣ／乳癌融合細胞を、ＣｐＧ ＯＤＮ、ＩＬ−１２またはＩＬ−１８の存在下または非存在下で、自己由来Ｔ細胞と５日間共培養した。図１１Ａは、ＣＤ４＋細胞の選択の後、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋のパーセントを各条件について二次元ＦＡＣＳ分析で測定したことを示す。図１１Ｂは、細胞内ＦＡＣＳ分析によって決定された各条件について、Ｆｏｘｐ３を発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の平均パーセント（±ＳＥＭ）を示す。図１１Ｃは、細胞内ＦＡＣＳ分析によって決定された各条件について、ＩＦＮγおよびＩＬ−１０を発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の平均パーセント（±ＳＥＭ）を示す。
【図１１Ｂ】ＣＰＧ−ＯＤＮ、ＩＬ１２およびＩＬ１８の添加が、ＤＣ／乳癌融合による調節Ｔ細胞の増殖の枯渇をもたらすことを示す図である。ＤＣ／乳癌融合細胞を、ＣｐＧ ＯＤＮ、ＩＬ−１２またはＩＬ−１８の存在下または非存在下で、自己由来Ｔ細胞と５日間共培養した。図１１Ａは、ＣＤ４＋細胞の選択の後、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋のパーセントを各条件について二次元ＦＡＣＳ分析で測定したことを示す。図１１Ｂは、細胞内ＦＡＣＳ分析によって決定された各条件について、Ｆｏｘｐ３を発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の平均パーセント（±ＳＥＭ）を示す。図１１Ｃは、細胞内ＦＡＣＳ分析によって決定された各条件について、ＩＦＮγおよびＩＬ−１０を発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の平均パーセント（±ＳＥＭ）を示す。
【図１１Ｃ】ＣＰＧ−ＯＤＮ、ＩＬ１２およびＩＬ１８の添加が、ＤＣ／乳癌融合による調節Ｔ細胞の増殖の枯渇をもたらすことを示す図である。ＤＣ／乳癌融合細胞を、ＣｐＧ ＯＤＮ、ＩＬ−１２またはＩＬ−１８の存在下または非存在下で、自己由来Ｔ細胞と５日間共培養した。図１１Ａは、ＣＤ４＋細胞の選択の後、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋のパーセントを各条件について二次元ＦＡＣＳ分析で測定したことを示す。図１１Ｂは、細胞内ＦＡＣＳ分析によって決定された各条件について、Ｆｏｘｐ３を発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の平均パーセント（±ＳＥＭ）を示す。図１１Ｃは、細胞内ＦＡＣＳ分析によって決定された各条件について、ＩＦＮγおよびＩＬ−１０を発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の平均パーセント（±ＳＥＭ）を示す。
【図１２Ａ】ＤＣ／乳癌融合細胞およびＣＤ３／ＣＤ２８連結による複合刺激の結果を示す図である。自己由来のＴ細胞を、ＤＣ／乳癌融合細胞で５日間；抗ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングしたプレートで４８時間；抗ＣＤ３／ＣＤ２８と続くＤＣ／乳癌融合；またはＤＣ／乳癌融合と続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８で、培養によって刺激した。結果を、未刺激Ｔ細胞と比較した。図１２Ａは、すべての培養条件についての（ｎ＝６〜７）平均Ｔ細胞増殖を示す。Ｔ細胞を１×１０^５／ウェルで９６ウェル組織培養プレートにトリプリケートで分注し、１８〜２４時間の間、１ｕＣｉ／ｍｌの^３［Ｈ］−チミジンをパルスで加えた。刺激指数（ＳＩ）の計算によって結果を正規化した。ＰＥ結合ＭＵＣ１特異的四量体を用いたＣＤ８＋ＭＵＣ１＋Ｔ細胞（図１２Ｂ）；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ｎ＝６）（図１２Ｃ）；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞（ｎ＝６）（図１２Ｄ）；ＩＦＮγを発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ｎ＝５）（図１２Ｅ）；および、Ｆｏｘｐ３を発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（図１２Ｆ）の平均発現を、記載の各培養条件について提供する。
【図１２Ｂ】ＤＣ／乳癌融合細胞およびＣＤ３／ＣＤ２８連結による複合刺激の結果を示す図である。自己由来のＴ細胞を、ＤＣ／乳癌融合細胞で５日間；抗ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングしたプレートで４８時間；抗ＣＤ３／ＣＤ２８と続くＤＣ／乳癌融合；またはＤＣ／乳癌融合と続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８で、培養によって刺激した。結果を、未刺激Ｔ細胞と比較した。図１２Ａは、すべての培養条件についての（ｎ＝６〜７）平均Ｔ細胞増殖を示す。Ｔ細胞を１×１０^５／ウェルで９６ウェル組織培養プレートにトリプリケートで分注し、１８〜２４時間の間、１ｕＣｉ／ｍｌの^３［Ｈ］−チミジンをパルスで加えた。刺激指数（ＳＩ）の計算によって結果を正規化した。ＰＥ結合ＭＵＣ１特異的四量体を用いたＣＤ８＋ＭＵＣ１＋Ｔ細胞（図１２Ｂ）；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ｎ＝６）（図１２Ｃ）；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞（ｎ＝６）（図１２Ｄ）；ＩＦＮγを発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ｎ＝５）（図１２Ｅ）；および、Ｆｏｘｐ３を発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（図１２Ｆ）の平均発現を、記載の各培養条件について提供する。
【図１２Ｃ】ＤＣ／乳癌融合細胞およびＣＤ３／ＣＤ２８連結による複合刺激の結果を示す図である。自己由来のＴ細胞を、ＤＣ／乳癌融合細胞で５日間；抗ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングしたプレートで４８時間；抗ＣＤ３／ＣＤ２８と続くＤＣ／乳癌融合；またはＤＣ／乳癌融合と続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８で、培養によって刺激した。結果を、未刺激Ｔ細胞と比較した。図１２Ａは、すべての培養条件についての（ｎ＝６〜７）平均Ｔ細胞増殖を示す。Ｔ細胞を１×１０^５／ウェルで９６ウェル組織培養プレートにトリプリケートで分注し、１８〜２４時間の間、１ｕＣｉ／ｍｌの^３［Ｈ］−チミジンをパルスで加えた。刺激指数（ＳＩ）の計算によって結果を正規化した。ＰＥ結合ＭＵＣ１特異的四量体を用いたＣＤ８＋ＭＵＣ１＋Ｔ細胞（図１２Ｂ）；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ｎ＝６）（図１２Ｃ）；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞（ｎ＝６）（図１２Ｄ）；ＩＦＮγを発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ｎ＝５）（図１２Ｅ）；および、Ｆｏｘｐ３を発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（図１２Ｆ）の平均発現を、記載の各培養条件について提供する。
【図１２Ｄ】ＤＣ／乳癌融合細胞およびＣＤ３／ＣＤ２８連結による複合刺激の結果を示す図である。自己由来のＴ細胞を、ＤＣ／乳癌融合細胞で５日間；抗ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングしたプレートで４８時間；抗ＣＤ３／ＣＤ２８と続くＤＣ／乳癌融合；またはＤＣ／乳癌融合と続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８で、培養によって刺激した。結果を、未刺激Ｔ細胞と比較した。図１２Ａは、すべての培養条件についての（ｎ＝６〜７）平均Ｔ細胞増殖を示す。Ｔ細胞を１×１０^５／ウェルで９６ウェル組織培養プレートにトリプリケートで分注し、１８〜２４時間の間、１ｕＣｉ／ｍｌの^３［Ｈ］−チミジンをパルスで加えた。刺激指数（ＳＩ）の計算によって結果を正規化した。ＰＥ結合ＭＵＣ１特異的四量体を用いたＣＤ８＋ＭＵＣ１＋Ｔ細胞（図１２Ｂ）；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ｎ＝６）（図１２Ｃ）；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞（ｎ＝６）（図１２Ｄ）；ＩＦＮγを発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ｎ＝５）（図１２Ｅ）；および、Ｆｏｘｐ３を発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（図１２Ｆ）の平均発現を、記載の各培養条件について提供する。
【図１２Ｅ】ＤＣ／乳癌融合細胞およびＣＤ３／ＣＤ２８連結による複合刺激の結果を示す図である。自己由来のＴ細胞を、ＤＣ／乳癌融合細胞で５日間；抗ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングしたプレートで４８時間；抗ＣＤ３／ＣＤ２８と続くＤＣ／乳癌融合；またはＤＣ／乳癌融合と続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８で、培養によって刺激した。結果を、未刺激Ｔ細胞と比較した。図１２Ａは、すべての培養条件についての（ｎ＝６〜７）平均Ｔ細胞増殖を示す。Ｔ細胞を１×１０^５／ウェルで９６ウェル組織培養プレートにトリプリケートで分注し、１８〜２４時間の間、１ｕＣｉ／ｍｌの^３［Ｈ］−チミジンをパルスで加えた。刺激指数（ＳＩ）の計算によって結果を正規化した。ＰＥ結合ＭＵＣ１特異的四量体を用いたＣＤ８＋ＭＵＣ１＋Ｔ細胞（図１２Ｂ）；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ｎ＝６）（図１２Ｃ）；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞（ｎ＝６）（図１２Ｄ）；ＩＦＮγを発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ｎ＝５）（図１２Ｅ）；および、Ｆｏｘｐ３を発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（図１２Ｆ）の平均発現を、記載の各培養条件について提供する。
【図１２Ｆ】ＤＣ／乳癌融合細胞およびＣＤ３／ＣＤ２８連結による複合刺激の結果を示す図である。自己由来のＴ細胞を、ＤＣ／乳癌融合細胞で５日間；抗ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングしたプレートで４８時間；抗ＣＤ３／ＣＤ２８と続くＤＣ／乳癌融合；またはＤＣ／乳癌融合と続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８で、培養によって刺激した。結果を、未刺激Ｔ細胞と比較した。図１２Ａは、すべての培養条件についての（ｎ＝６〜７）平均Ｔ細胞増殖を示す。Ｔ細胞を１×１０^５／ウェルで９６ウェル組織培養プレートにトリプリケートで分注し、１８〜２４時間の間、１ｕＣｉ／ｍｌの^３［Ｈ］−チミジンをパルスで加えた。刺激指数（ＳＩ）の計算によって結果を正規化した。ＰＥ結合ＭＵＣ１特異的四量体を用いたＣＤ８＋ＭＵＣ１＋Ｔ細胞（図１２Ｂ）；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ｎ＝６）（図１２Ｃ）；ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞（ｎ＝６）（図１２Ｄ）；ＩＦＮγを発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ｎ＝５）（図１２Ｅ）；および、Ｆｏｘｐ３を発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（図１２Ｆ）の平均発現を、記載の各培養条件について提供する。
【図１３】Ｔ細胞増殖に及ぼす、ＤＣ／骨髄腫融合細胞による刺激、または融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激の影響を示す図である。多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する患者に由来するＴ細胞を、１：１０の融合対Ｔ細胞の比率で融合細胞と７日間共培養するか、融合細胞と５日間共培養した後、抗ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングしたプレートと４８時間共培養した。刺激の後、終夜パルスの後のトリチウムチミジンの取込みによって、Ｔ細胞増殖を測定した。
【図１４】自己由来の腫瘍標的細胞の溶解に及ぼす、ＤＣ／骨髄腫融合細胞によって刺激された、または融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８によって逐次的に刺激された自己由来のＴ細胞の影響を示す図である。ＤＣ、腫瘍およびＴ細胞は、多発性骨髄腫の患者に由来した。自己由来のＴ細胞を、抗ＣＤ３ＣＤ２８単独で４８時間、抗ＣＤ３ＣＤ２８で４８時間の後ＤＣ／ＭＭ融合刺激で５日間、ＤＣ／ＭＭ融合細胞単独で７日間、または、ＤＣ／ＭＭ融合細胞で５日間の後抗ＣＤ３ＣＤ２８への曝露によって４８時間刺激した。図１４は、標準の^５１Ｃｒ放出アッセイで測定された、自己由来の腫瘍標的の溶解率を示す。
【図１５】ＤＣ／乳癌融合細胞および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による刺激の後の、平均Ｔ細胞増殖を示す図である。
【図１６】ＩＦＮγの細胞内発現を示す図である。刺激されたＴ細胞調製物を、ＦＩＴＣ結合ＣＤ４について染色した。次に細胞を洗浄し、透過性にし、ＰＥ結合抗ヒトＩＦＮγまたはマッチさせたアイソタイプ対照抗体とインキュベートした。ＩＦＮγの細胞内発現を、フローサイトメトリー分析で測定した。８回の実験の平均値を、関連する平均値の標準誤差と提供する。
【図１７】ＭＵＣ１四量体に結合するＣＤ８＋細胞のパーセントを示す図である。ＨＬＡ^＊０２０１＋自己由来非接着性細胞を、融合細胞、抗ＣＤ３ＣＤ２８、融合と、それに続く抗ＣＤ３ＣＤ２８と、それに続く融合細胞、および抗ＣＤ３／ＣＤ２８と、それに続く融合細胞と共培養した。細胞を収集し、ＭＵＣ１特異的ＰＥ結合四量体または対照四量体を用いて、および適当なＣＤ８＋Ｔ細胞ゲーティングを用いて、ＭＵＣ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞について分析した。ＭＵＣ１四量体に結合するＣＤ８＋細胞のパーセント（対照四量体への非特異的結合を差し引いた後）を提供する。２回の実験からの平均値を提供する。
【図１８】グランザイムＢを発現する、陽性のＣＤ８＋細胞のパーセントを示す図である。Ｔ細胞を、融合細胞、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、融合細胞と、それに続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８、および抗ＣＤ３ＣＤ２８と、それに続く融合細胞と共培養した。細胞をＦＩＴＣ結合ＣＤ８抗体で染色し、固定し、透過性にし、ＰＥ結合グランザイムＢ抗体またはマッチさせたアイソタイプ対照とインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。棒グラフは、グランザイムＢを発現する、陽性のＣＤ８＋細胞のパーセントの平均増加倍率（±ＳＥＭ）を示す。
【図１９】融合細胞の免疫組織化学染色を示す図である。急性骨髄性白血病患者の骨髄穿刺液または末梢血採集物から、骨髄性白血病細胞を単離した。ＰＥＧを用いて、白血病細胞を成熟ＤＣと融合させた。融合細胞は、免疫細胞化学染色（１００×）により、腫瘍マーカーＣＤ１１７（青色）およびＤＣマーカーＣＤ１１Ｃ（赤色）の同時発現を示す。
【図２０】ＤＣ／ＡＭＬ融合、ＤＣ／ＡＭＬ融合と、それに続く抗ＣＤ３／ＣＤ２Ｋ、および抗ＣＤ３／ＣＤ２８と、それに続くＤＣ／ＡＭＬ融合で刺激したＴ細胞についての、Ｔ細胞増殖（刺激指数によって測定した）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
様々な刊行物、特許および公開特許明細書が、特定引用文献によって本明細書内で参照される。これらの刊行物、特許および公開特許明細書の開示物は、本発明が関係する最新技術をより完全に記載するために、ここに参照により本開示に組み込まれる。
【００３７】
定義
本発明の実施は、特に明記しない限り、当技術分野の範囲内である、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来の技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９年）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編、（１９８７年））；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍｉ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５年））およびＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒｄ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７年））を参照。
【００３８】
本明細書で用いるように、特定の用語は、以下の定義された意味を有する。本明細書および特許請求の範囲で用いるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の指示がない限り、複数体を含む。例えば、用語「細胞」は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
【００３９】
用語「免疫エフェクター細胞」は、例えば新生物または腫瘍細胞の上に存在する抗原を、特異的に認識する細胞を指す。本発明のために、免疫エフェクター細胞には、Ｂ細胞；単球；マクロファージ；ＮＫ細胞；ならびにＴ細胞、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、例えば腫瘍、炎症部位または他の浸潤物からのＣＴＬ系、ＣＴＬクローンおよびＣＴＬが含まれるが、これらに限定されない。「Ｔリンパ球」は、表現型的にＣＤ３＋であるリンパ球を表し、一般的に、適する標識化技術と組み合わせた抗ＣＤ３モノクローナル抗体を用いて検出される。本発明のＴリンパ球は、一般的にＣＤ４、ＣＤ８またはその両方にも陽性である。用語「ナイーブな」免疫エフェクター細胞は、抗原に遭遇していない免疫エフェクター細胞を指し、抗原刺激を受けていないおよびバージンと同義とされる。「教育された」は、抗原と相互作用した免疫エフェクター細胞を指し、したがってそれらは抗原特異的細胞に分化する。
【００４０】
用語「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」は、好ましくはクラスＩ ＭＨＣ分子と、１つまたは複数の抗原の提示を誘導することができる無傷の完全な細胞、ならびに他の分子の両方を含む。適するＡＰＣの例は以下に詳細に述べられ、例えば、完全細胞、例えばマクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞；β２−マイクログロブリンと複合体を形成した精製ＭＨＣクラスＩ分子；およびフォスター抗原提示細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
樹状細胞（ＤＣ）は、強力なＡＰＣである。ＤＣは、様々な免疫器官、例えば脾臓、胸腺、リンパ節、表皮および末梢血のマイナーな構成要素である。例えば、ＤＣは、粗脾臓（Ｓｔｅｉｎｍａｎら（１９７９年）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ１４９巻：１頁を参照）または表皮細胞懸濁液（Ｓｃｈｕｌｅｒら（１９８５年）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ１６１巻：５２６頁；ＲｏｍａｎｉらＪ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ（１９８９年）９３巻：６００頁を参照）の約１％、および末梢血中の単核細胞の０．１〜１％だけに該当する（ＦｒｅｕｄｅｎｔｈａｌらＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９０年）８７巻：７６９８頁を参照）。末梢血または骨髄前駆体からＤＣを単離する方法は、当技術分野で公知である。（Ｉｎａｂａら（１９９２年）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ１７５巻：１１５７頁；Ｉｎａｂａら（１９９２年）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ１７６巻：１６９３〜１７０２頁；Ｒｏｍａｎｉら（１９９４年）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．１８０巻：８３〜９３頁；Ｓａｌｌｕｓｔｏら（１９９４年）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ１７９巻：１１０９〜１１１８頁）を参照）。ＤＣの単離および培養のための好ましい方法は、Ｂｅｎｄｅｒら（１９９６年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ． Ｍｅｔｈ．１９６巻：１２１〜１３５頁およびＲｏｍａｎｉら（１９９６年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． Ｍｅｔｈ１９６巻：１３７〜１５１頁に記載されている。
【００４２】
樹状細胞（ＤＣ）は、主に一次免疫の開始および免疫応答の調節を担う、抗原提示細胞の複雑なネットワークである。（Ａｖｉｇａｎ、Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．１３巻：５１〜６４頁（１９９９年）；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ｎａｔｕｒｅ３９２巻：２４５〜５２頁（１９９８年）を参照）。部分的に成熟したＤＣは抗原捕捉部位に位置し、外来性抗原の内在化およびプロセシングに優れているが、Ｔ細胞応答の刺激因子としては劣る。未熟なＤＣによる抗原提示は、Ｔ細胞耐性を誘導することがある。（Ｄｈｏｄａｐｋａｒら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９３巻：２３３〜３８頁（２００１年）を参照）。活性化後、ＤＣは、同時刺激分子および、流入領域リンパ節におけるＴ細胞輸送部位への移動を促進するケモカイン受容体ＣＣＲ７の発現の増加によって特徴づけられる成熟を経る。腫瘍もしくは癌細胞は、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βおよびＶＥＧＦの分泌を通して、ＤＣの発達を阻害し、抗腫瘍応答を潜在的に抑制する腫瘍層での未熟なＤＣの蓄積をもたらす。（Ａｌｌａｖｅｎａら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８巻：３５９〜６９頁（１９９８年）；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３巻：４８３〜９０頁（１９９７年）；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈら、Ｂｌｏｏｄ９２巻：４１５０〜６６頁（１９９８年）；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ４巻：９４１〜５２頁（２００４年）を参照）。逆に言えば、活性化ＤＣは、エキソビボでＤＣ前駆体のサイトカイン媒介性の分化によって生成することができる。ＤＣの成熟および機能は、Ｔｏｌｌ様受容体９アゴニストＣＰＧ ＯＤＮへの曝露によって、さらに高めることができる。さらに、抗腫瘍免疫を強力に刺激する腫瘍抗原を提示するように、ＤＣを操作することができる。（Ａｓａｖａｒｏｅｎｈｃｈａｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９９巻：９３１〜３６頁（２００２年）；Ａｓｈｌｅｙら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ１８６巻：１１７７〜８２頁（１９９７年）を参照）。
【００４３】
「フォスター抗原提示細胞」は、それらが反応する免疫エフェクター細胞に通常接触する抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）の代わりに利用される、抗原提示能力を有する任意の改変細胞または天然の細胞（野生型または突然変異体）を指す。言い換えると、それらは、Ｔ細胞がインビボで通常遭遇しないであろう任意の機能的ＡＰＣである。
【００４４】
ＤＣは、Ｔ細胞の活性化および増殖のために必要とされるすべてのシグナルを提供することが示された。これらのシグナルを、２つの型に分類することができる。免疫応答に特異性を与える第一のタイプは、ＡＰＣ表面でのＴ細胞受容体／ＣＤ３（「ＴＣＲ／ＣＤ３」）複合体と、主要組織適合性複合体（「ＭＨＣ」）クラスＩまたはＩＩタンパク質によって提示される抗原性ペプチドとの間の相互作用を通して媒介される。この相互作用は、Ｔ細胞の活性化が起こるために必要であるが、十分でない。実際、第二のタイプのシグナルがないと、第一のタイプのシグナルは、Ｔ細胞アネルギーをもたらすことができる。同時刺激シグナルと呼ばれる第二のタイプのシグナルは、抗原特異的でもＭＨＣ限定でもなく、第一のタイプのシグナルの存在下で、Ｔ細胞の完全な増殖応答およびＴ細胞エフェクター機能の誘導をもたらすことができる。
【００４５】
したがって、用語「サイトカイン」は、細胞に対して様々な効果を発揮する、例えば成長または増殖を誘導する、多数の因子のいずれかを指す。サイトカインのそれには限定されない例には、ＩＬ−２、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＭＩＰ−１α、ＬＩＦ、ｃ−ｋｉｔリガンド、ＴＰＯおよびｆｌｔ３リガンドが含まれる。サイトカインは、いくつかの供給業者、例えばＧｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、Ｍａｓｓ．）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）およびＩｍｍｕｎｅｘ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）から市販されている。常に明示されているわけではないが、野生型のサイトカインまたは精製されたサイトカイン（例えば、組換えで生成されたサイトカイン）と類似した生物活性を有する分子は、本発明の精神および範囲の中で用いられるものとし、したがって、野生型のまたは精製されたサイトカインの代用品であるものとする。
【００４６】
「同時刺激分子」は、抗原提示細胞およびＴ細胞の表面で発現される受容体−リガンド対の間の相互作用に関与する。１つの例示的な受容体−リガンド対は、ＤＣ表面のＢ７同時刺激分子およびＴ細胞上のその反受容体ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４である。（Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２巻：９０９〜９１１頁；Ｙｏｕｎｇら（１９９２年）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ９０巻：２２９頁；ＮａｂａｖｉらＮａｔｕｒｅ３６０巻：２６６頁を参照）。他の重要な同時刺激分子には、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０およびＣＤ８６が含まれる。これらは、上で特定した供給業者から市販されている。
【００４７】
「ハイブリッド」細胞は、両方の抗原提示能力を有し、さらに１つまたは複数の特異的抗原を発現する細胞を指す。一実施形態では、これらのハイブリッド細胞は、ＡＰＣを、関心の１つまたは複数の抗原を発現することが公知である細胞とインビトロで融合することによって形成される。本明細書で用いるように、用語「ハイブリッド」細胞および「融合」細胞は、互換的に用いられる。
【００４８】
「対照」細胞は、抗原発現細胞の集団と同じ抗原を発現しない細胞を指す。
【００４９】
用語「培養する」は、様々な種類の培地の上または中での細胞または生物体のインビトロ増殖を指す。培養で増殖させた細胞の３０代子孫は、親細胞と完全に同一ではない（すなわち、形態学的、遺伝的または表現型的に）ものと理解される。「増殖した」は、細胞の任意の増殖または分裂を意味する。
【００５０】
「有効量」は、有益または所望の結果を達成するのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与、適用または投薬で投与することができる。本発明の目的のために、ハイブリッド細胞の有効量は、抗原特異的な免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の増殖を促進する量である。
【００５１】
「単離された」細胞集団は、それが本来関連している細胞および物質を「実質的に含まない」。「実質的に含まない」または「実質的に純粋な」は、集団の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％が所望の細胞タイプであることを意味する。「濃縮」細胞集団は、少なくとも５％が融合細胞である。好ましくは、濃縮集団は少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、最も好ましくは少なくとも２５％の融合細胞を含む。
【００５２】
本明細書で用いる用語「自己由来」または「自原性」は、細胞の起源を示す。したがって、個体（「レシピエント」）に投与される細胞は、その細胞がその個体（「ドナー」）または遺伝的に同一の個体（すなわち、その個体の一卵性双子）に由来するならば自原性である。自原性細胞は、自原性細胞の後代であってもよい。この用語は、異なる細胞型の細胞が、同じ供与体または遺伝的に同一の供与体に由来することも示す。したがって、エフェクター細胞および抗原提示細胞は、それらが同じ供与体もしくは供与体に遺伝的に同じ個体に由来する場合、またはそれらが同じ供与体もしくは供与体に遺伝的に同じ個体に由来する細胞の後代である場合、自原性であると言われる。
【００５３】
同様に、本明細書で用いる用語「同種異系」は、細胞の起源を示す。したがって、個体（「レシピエント」）に投与される細胞は、その細胞がレシピエントと遺伝的に同一でない個体に由来する場合、同種異系である。詳細には、この用語は発現されるＭＨＣ分子の非同一性に関する。同種異系細胞は、同種異系細胞の後代であってもよい。この用語は、異なる細胞型の細胞が遺伝的に同一でない供与体に由来すること、または、それらが遺伝的に同一でない供与体に由来する細胞の後代である場合も示す。例えば、ＡＰＣは、それらが遺伝的に同一でない供与体に由来する場合、エフェクター細胞に同種異系であると言われる。
【００５４】
「対象」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、マウス、サル、ヒト、畜産動物、スポーツ動物およびペットが含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書で用いるように、「遺伝子改変」は、細胞の内因性ヌクレオチドに対する任意の付加、欠失または破壊を指す。
【００５６】
「ウイルスベクター」は、インビボ、エキソビボまたはインビトロで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む、組換えで生成されたウイルスまたはウイルス粒子と定義される。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどが含まれる。遺伝子導入がレトロウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物は、レトロウイルスゲノムまたはその一部および治療的な遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。
【００５７】
本明細書で用いるように、用語「レトロウイルス媒介遺伝子導入」または「レトロウイルス形質導入」は同じ意味を含み、遺伝子または核酸配列が、細胞に入って宿主細胞ゲノムにそのゲノムを組み込むウイルスによって、宿主細胞に安定して導入される過程を指す。ウイルスは、その感染の正常な機構を通して宿主細胞に入ることができるように、またはそれが異なる宿主細胞表面受容体またはリガンドに結合して、細胞に入るように改変することができる。
【００５８】
レトロウイルスは、それらの遺伝情報をＲＮＡの形で運ぶ。しかし、ウイルスが細胞に感染すると、ＲＮＡは、感染細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれるＤＮＡの形態に逆転写される。組み込まれたＤＮＡの形態は、プロウイルスと呼ばれる。
【００５９】
遺伝子導入がアデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのＤＮＡウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物は、ウイルスゲノムまたはその一部および治療的な遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。アデノウイルス（Ａｄ）は、比較的よく特徴づけられた均質の群のウイルスであり、５０以上の血清型を含む。（例えば、ＷＯ９５／２７０７１を参照）。Ａｄは増殖させるのが簡単で、宿主細胞ゲノムに組み込まれない。組換え体Ａｄ由来のベクター、特に野生型ウイルスの組換えおよび生成の可能性を減少させたものも構築した。（ＷＯ９５／００６５５；ＷＯ９５／１１９８４を参照）。野生型ＡＡＶは、高い感染性および特異性を有し、宿主細胞ゲノムに組み込まれる。（Ｈｅｒｍｏｎａｔ ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９８４年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ８１巻：６４６６〜６４７０頁；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、（１９８８年）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ８巻：３９８８〜３９９６頁を参照）。
【００６０】
プロモーターおよびポリヌクレオチドを作動可能に連結することができるクローニング部位の両方を含むベクターは、当技術分野で周知である。そのようなベクターはＲＮＡをインビトロまたはインビボで転写することができ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）などの販売元から市販されている。発現および／またはインビトロ転写を最適化するために、余分の、潜在的な不適当な代替翻訳開始コドンを除去するために、または、転写または翻訳のレベルで発現を妨害または低減することができる他の配列を除去するために、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去するか、加えるか、変化させることが必要であろう。あるいは、発現を強化するために、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンの５’に直に挿入することができる。適するベクターの例は、様々な真核および原核生物の宿主での発現について記載され、遺伝子治療ならびに単なるタンパク質発現のために用いることができる、当技術分野で一般的に用いられるバキュロウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌類のベクター、および他の組換え媒体である。
【００６１】
これらには、ＤＮＡ／リポソーム複合体および標的ウイルスタンパク質ＤＮＡ複合体を含む、いくつかの非ウイルスベクターが含まれる。細胞への送達を高めるために、本発明の核酸またはタンパク質を、細胞表面抗原、例えばＴＣＲ、ＣＤ３またはＣＤ４に結合する抗体またはその結合性断片にコンジュゲートさせることができる。また、ターゲティング抗体またはその断片も含むリポソームを、本発明の方法で用いることができる。本発明は、本明細書で開示される方法で使用するための、ターゲティング複合体も提供する。
【００６２】
当技術分野で周知の方法を用いて、ポリヌクレオチドをベクターゲノムに挿入する。例えば、適する条件下で、挿入断片およびベクターＤＮＡを制限酵素と接触させて、互いと対になること、およびリガーゼで結合することができる相補的末端を各分子の上に形成することができる。あるいは、切断されたポリヌクレオチドの末端に、合成核酸リンカーを連結することができる。これらの合成リンカーは、ベクターＤＮＡの特定の制限部位に対応する核酸配列を含む。さらに、終結コドンおよび適当な制限部位を含むオリゴヌクレオチドを、例えば以下のいくつかまたは全部を含むベクターへの挿入のために連結することができる：選択可能なマーカー遺伝子、例えば哺乳動物細胞での安定したまたは一時的なトランスフェクタントの選択のためのネオマイシン遺伝子；高レベル転写のためのヒトＣＭＶの極初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０からの転写終結およびＲＮＡプロセシングシグナル；適切なエピソーム複製のためのＳＶ４０ポリオーマ複製開始点およびＣｏｌＥＩ；多用途の複数のクローニング部位；ならびに、センスおよびアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーター。他の手段が当技術分野で周知であり、利用可能である。
【００６３】
本明細書で用いるように、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳される過程を指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、適当な真核生物の宿主が選択されるならば、発現はｍＲＮＡのスプライシングを含むことができる。発現のために必要とされる調節要素には、ＲＮＡポリメラーゼに結合するためのプロモーター配列、およびリボソーム結合のための転写開始配列が含まれる。例えば、細菌発現ベクターは、ラックプロモーターなどのプロモーターを、ならびに、転写開始のために、シャイン−ダルガノ配列および開始コドンＡＵＧを含む（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、上記）。同様に、真核生物の発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための異種または同種のプロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソームの分離のための終結コドンを含む。そのようなベクターは、市場から得ること、または、当技術分野で周知の方法、例えばベクター一般を構築するために上に記載した方法に記載の配列によって組み立てることができる。
【００６４】
用語「主要組織適合複合体」または「ＭＨＣ」は、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞への抗原提示のために、および急激な移植片拒絶のために必要とされる細胞表面分子をコードする遺伝子の複合体を指す。ヒトでは、ＭＨＣ複合体は、ＨＬＡ複合体としても公知である。ＭＨＣ複合体によってコードされるタンパク質は、「ＭＨＣ分子」として公知であり、クラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ分子に分類される。クラスＩ ＭＨＣ分子は、β２−マイクログロブリンと非共有結合しているＭＨＣでコードされるα鎖で構成される膜ヘテロダイマータンパク質を含む。クラスＩ ＭＨＣ分子は、ほとんどすべての有核細胞によって発現され、ＣＤ８＋Ｔ細胞への抗原提示で機能することが示された。ヒトでは、クラスＩ分子には、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃが含まれる。ＭＨＣクラスＩＩ分子も、非共有結合しているＪ３鎖からなる膜ヘテロダイマータンパク質を含む。クラスＩＩ ＭＨＣはＣＤ４＋ Ｔ細胞で機能することが公知であり、ヒトでは、ＨＬＡ−ＤＰ、−ＤＱおよびＤＲが含まれる。用語「ＭＨＣ限定」は、それがプロセシングされた後にＴ細胞に抗原だけを認識させるＴ細胞の特徴を指し、生じた抗原性ペプチドは、クラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ分子に結合して提示される。ＭＨＣを特定して比較する方法は当技術分野で周知であり、Ａｌｌｅｎ Ｍ．ら（１９９４年）Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍ．４０巻：２５〜３２頁；Ｓａｎｔａｍａｒｉａ Ｐ．ら（１９９３年）Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍ．３７巻：３９〜５０頁；およびＨｕｒｌｅｙ Ｃ．Ｋ．ら（１９９７年）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ５０巻：４０１〜４１５頁に記載されている。
【００６５】
用語「配列モチーフ」は、１５の分子（例えば、アミノ酸またはヌクレオチド）の群に存在するパターンを指す。例えば、一実施形態では、本発明は、抗原に存在するペプチドの間で、配列モチーフの同定を可能にする。この実施形態では、一般的なパターンは、疎水性、親水性、塩基性、酸性などの特徴のあるアミノ酸残基によって同定することができる。
【００６６】
用語「ペプチド」は、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチド様物質の化合物を指すものとして、その最も広い意味で用いられる。サブユニットは、ペプチド結合によって連結することができる。別の実施形態では、サブユニットは、例えばエステル、エーテルなど、他の結合によって連結することができる。
【００６７】
本明細書で用いるように、用語「アミノ酸」は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方を含む天然および／または２５の非天然のもしくは合成されたアミノ酸、およびアミノ酸類似体およびペプチド様物質を指す。３つ以上のアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短い場合、通常オリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合、ペプチドは通常ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００６８】
本明細書で用いるように、「固相支持体」は「担体」の例として用いられ、特定のタイプの支持体に限定されない。むしろ、多数の支持体が利用可能であり、当業者に公知である。固相支持体には、シリカゲル、樹脂、誘導体化されたプラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲルが含まれる。適する固相支持体は、所望の最終使用および様々な合成プロトコルとの適合性に基づいて選択することができる。例えば、ペプチド合成のために、固相支持体は、ポリスチレン（例えば、Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られるＰＡＭ樹脂など）、ＰＯＬＹＨＩＰＥ（登録商標）樹脂（Ａｍｉｎｏｔｅｃｈ、Ｃａｎａｄａから得られる）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られる）、ポリエチレングリコールを接いだポリスチレン樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはポリジメチルアクリルアミド樹脂（ＭｉｌｌｉｇｅｎｌＢｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから得られる）などの樹脂を指すことができる。ペプチド合成のための好ましい実施形態では、固相支持体は、ポリジメチルアクリルアミド樹脂を指す。
【００６９】
用語「異常に発現される」は、同じ組織型であるかないかに関係なく異なる細胞または組織と比較して、すなわち、肺組織対肺癌組織で差別的に発現される（過剰発現または過小発現される）細胞または組織中のポリヌクレオチド配列を指す。
【００７０】
「宿主細胞」または「レシピエント細胞」には、ベクター、または外来性の核酸分子、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質の組込みのためのレシピエントであることができるか、レシピエントであった、任意の個々の細胞または細胞培養物が含まれるものとする。それには単一の細胞の後代も含まれるものとし、後代は、自然、偶然または故意の突然変異のために、元の親細胞と完全に同一（形態上、またはゲノムもしくは総ＤＮＡ補体において）でなくてもよい。細胞は原核生物または真核生物であってよく、例には、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞および哺乳動物細胞、例えばマウス、ラット、サルまたはヒトが含まれるが、これらに限定されない。
【００７１】
「抗体」は、抗原に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書で用いるように、この用語は無傷の免疫グロブリン分子だけでなく、必要とされる特異性の抗原認識部位を含む、免疫グロブリン分子の抗イディオタイプ抗体、突然変異体、断片、融合タンパク質、ヒト化タンパク質および改変形態を包含する。
【００７２】
「抗体複合体」は、抗体およびその結合パートナーまたはリガンドの組合せである。
【００７３】
「自然抗原」は、対象で免疫応答を誘導するエピトープを含むポリペプチド、タンパク質または断片である。
【００７４】
用語「単離された」は、通常、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片が本来結合する、細胞およびその他の構成要素から分離されたことを意味する。当業者に明らかであるように、非天然のポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片は、その天然の対応物からそれを区別するために「単離」を必要としない。さらに、「濃縮された」、「分離された」または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片は、容量あたりの分子の濃度または数が、その天然の対応物のそれよりも「濃縮された」もので大きく、または「分離された」もので小さい点で、その天然の対応物から識別可能である。その一次配列、または、例えばそのグリコシル化パターンがその天然の対応物から異なるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片は、それが、その一次配列、あるいは、グリコシル化パターンなどの別の特徴によってその天然の対応物から識別可能であるので、その単離された形態で存在する必要がない。本明細書で開示される本発明の各々のために明示されていないが、下でおよび適当な条件下で開示される各組成物の上記の実施形態のすべてが、本発明によって提供されることを理解すべきである。したがって、非天然のポリヌクレオチドは、単離された天然のポリヌクレオチドとは別の実施形態として提供される。細菌細胞で生成されるタンパク質は、それが本来生成される真核細胞から単離された天然のタンパク質とは別の実施形態として提供される。
【００７５】
「組成物」は、活性剤および、アジュバントなどの不活性（例えば、検出可能な剤、担体、固体支持体または標識）または活性な別の化合物または組成物の組合せを意味するものとする。
【００７６】
「医薬組成物」は、活性剤と、組成物をインビトロ、インビボまたはエキソビボでの診断上または治療上の使用に適するようにする、不活性または活性な担体との組合せを含むものとする。
【００７７】
本明細書で用いるように、用語「薬学的に許容される担体」は、リン酸緩衝食塩水溶液、水および乳剤、例えば油／水または水／油乳剤、ならびに様々なタイプの湿潤剤などの標準の薬用担体のいずれも包含する。組成物は、安定剤および防腐剤を含むこともできる。担体、安定剤およびアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭ． ＳＣＩ、第１５版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ． Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ（１９７５年））を参照。
【００７８】
本明細書で用いるように、用語「対象で免疫応答を誘導する」ことは当技術分野でよく理解されている用語であり、対象への抗原（またはエピトープ）の導入の前の免疫応答（ある場合）と比較して、抗原（またはエピトープ）を対象に導入した後に、抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答の少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、より好ましくは少なくとも約５００倍、より好ましくは少なくとも約１０００倍以上の増加を検出（測定）することができることを意味する。抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答には、抗原特異的（またはエピトープ特異的）抗体の生成、および、抗原（またはエピトープ）に特異的に結合する分子をその表面に発現する免疫細胞の生成が含まれるが、これらに限定されない。所与の抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答が誘導されているかどうかを判断する方法は、当技術分野で周知である。例えば、抗原特異的抗体は、それに限定されないが、例えば試料中の抗体の固定化抗原（またはエピトープ）への結合が、検出可能に標識された第二の抗体（例えば、酵素標識マウス抗ヒトＩｇ抗体）によって検出されるＥＬＩＳＡを含む、当技術分野で公知である様々なイムノアッセイ法のいずれかを用いて検出することができる。抗原に特異的な免疫エフェクター細胞は、それらに限定されないが、ＦＡＣＳ、またはＣＴＬの場合には^５１ＣＲ放出アッセイ、または^３Ｈ−チミジン取込みアッセイを含む、当業者に公知である様々なアッセイのいずれかで検出することができる。
【００７９】
融合
ＤＣは、当技術分野で公知であるプロトコルを用いて、哺乳動物の骨髄培養、末梢血、脾臓または他の任意の適当な組織から得ることができる。骨髄はＤＣ前駆体を含み、それは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）およびインターロイキン４（「ＩＬ−４」）などのサイトカインによる処理の後に増殖して、ＤＣに分化する。腫瘍壊死細胞因子（ＴＮＦ）は、ＤＣの成熟を促進するために、任意選択で、単独で用いられるか、またはＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＩＬ−４と併用される。骨髄から得られるＤＣは、（例えば脾臓ＤＣと比較して）比較的未熟である。ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４によって刺激されたＤＣは、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩの分子、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ、ＣＤ４０および様々なレベルのＣＤ８３を発現する。これらの未熟なＤＣは、脾臓で見られるより成熟したＤＣよりも融合（または抗原取込み）に適合するが、より成熟したＤＣは比較的より有効な抗原提示細胞である。末梢血も比較的未熟なＤＣまたはＤＣ前駆体を含み、それらは、ＧＭ−ＣＳＦなどの適当なサイトカインの存在下で増殖および分化することができ、融合で用いることもできる。
【００８０】
本発明で用いられる非樹状細胞は、任意の組織または癌（例えば、それに限定されないが、乳癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、神経癌、尿生殖器癌、血液癌、黒色腫および他の皮膚癌、胃腸癌および脳腫瘍（すなわち、神経膠腫））から周知の方法によって誘導することができ、不死化させることができる。関心の細胞表面抗原を発現する非樹状細胞は、抗原を含むポリペプチドをコードする核酸分子で所望のタイプの非樹状細胞をトランスフェクトすることによって生成することができる。例示的な細胞表面抗原は、ＭＵＣ１、α−フェトプロテイン、γ−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、胎児スルホグルコプロテイン抗原、α_２Ｈ−鉄タンパク、胎盤アルカリホスファターゼおよび白血病関連膜抗原である。トランスフェクションおよび抗原の同定のための方法は、当技術分野で周知である。
【００８１】
所与の試薬の存在下で非樹状細胞が死に至るか、少なくとも増殖することができない場合、および、この感受性をＤＣとの融合によって克服することができる場合、任意選択で、大部分の未融合細胞を除去するのに十分な時間、融合細胞ならびに親の細胞を含む融合後細胞混合物を、この試薬を含む培地でインキュベートしてもよい。例えば、いくつかの腫瘍細胞系は、機能的ヒポキサンチングアニンフォスフォリボシル転移酵素（「ＨＧＰＲＴ」）の欠如のために、ＨＡＴに感受性である。ＤＣは機能的ＨＧＰＲＴを付与するので、ＤＣおよびこれらの腫瘍細胞系によって形成される融合細胞は、ＨＡＴ耐性になる。したがって、未融合の親の細胞を除去するために、融合の後にＨＡＴ選抜を実施することができる。長期培養は融合細胞上のＭＨＣクラスＩＩタンパク質および／またはＢ７同時刺激分子の喪失をもたらすので、標準のＨＡＴ選抜技術に反し、このＨＡＴ選抜は一般に１２日を超えて持続するべきでない。融合産物は、融合工程の直後に（例えば、抗原発見スクリーニング法で、または治療法で）、または短い培養期間の後に用いられる。
【００８２】
任意選択で、融合細胞は、臨床使用の前に照射される。照射はサイトカインの発現を誘導し、それは、免疫エフェクター細胞活性を促進する。
【００８３】
融合細胞がＡＰＣ特異的Ｔ細胞刺激分子の発現などのあるＤＣ特性を失う場合、ＤＣ表現型を回復するために一次融合細胞を樹状細胞と再融合させることができる。再融合された細胞（すなわち、二次融合細胞）は、非常に強力なＡＰＣであることが分かる。融合細胞は、樹状または非樹状の親の細胞と所望の回数、再融合させることができる。
【００８４】
ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７または他の所望のＴ細胞刺激分子を発現する融合細胞は、これらの分子に対する抗体によるパニングまたはＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）によって選択することもできる。
【００８５】
細胞内の病原体に感染した細胞を、その病原体に起因する疾患の治療のための融合の非樹状パートナーとして用いることもできる。病原体の例には、ウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス；Ａ、ＢまたはＣ型肝炎ウイルス；乳頭腫ウイルス；ヘルペスウイルス；または麻疹ウイルス）、細菌（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）および細胞内真核生物寄生虫（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｉｎ種、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｉｎａ種、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ種、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒｅ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
あるいは、それぞれは１つまたは複数の同定された癌抗原または病原体からの抗原をコードする、１つまたは複数の核酸構築物でトランスフェクトした非樹状細胞を、融合の非樹状パートナーとして用いることができる。抗原が融合細胞上でＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子によって提示される限り、これらの抗原は、癌細胞または病原体の表面に発現される必要はない。
【００８７】
融合の作製方法
ＤＣと非樹状細胞との間の融合は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、センダイウイルスまたは電気融合を用いるものなどの、周知の方法で実行することができる。ＤＣは自己由来であるか、同種異系である。（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、米国特許第６，６５３，８４８号を参照）。融合の非樹状細胞に対するＤＣの比率は、１：１００〜１０００：１と異なることができ、非樹状細胞が培養で激しく増殖する１：１より高い比率が好ましい。最も好ましくは、比率は１：１、５：１または１０：１である。融合の後、未融合のＤＣは培養中で通常２、３日中に死滅するので、融合細胞は下記２つの方法によって未融合の親の非樹状細胞から分離することができ、両方法は、約５０％以上の純度の融合細胞を生成し、すなわち、融合細胞調製物は５０％未満、しばしば３０％未満の未融合細胞を含有する。
【００８８】
具体的には、未融合の細胞を融合細胞から分離する１つの方法は、融合細胞と非樹状親細胞との間で異なる接着特性に基づく。融合細胞は一般に、組織培養容器への接着性が弱いことが分かっている。したがって、非樹状親細胞がずっとより接着性である場合、例えば癌細胞の場合、融合後細胞混合物を短期間（例えば、５〜１０日）適当な培地（ＨＡＴは必要ではないが、それが未融合細胞の増殖を遅くするならば加えてもよい）で培養してもよい。その後、融合細胞を静かに剥がし、吸い出すことができるが、未融合細胞は組織培養容器に密着して増殖する。逆に、非樹状親細胞が懸濁液中で増殖する場合、培養期間の後、融合細胞を容器に弱く結合させたまま、それらを静かに吸い出すことができる。あるいは、インビトロの細胞培養工程なしで、ハイブリッドが直接用いられる。融合細胞は機能的ヒポキサンチングアニンフォスフォリボシル転移酵素（「ＨＧＰＲＴ」）酵素を欠き、したがって、化合物ＨＡＴ処理に耐性であることが示された。したがって、これらの細胞を選択するために、ＨＡＴを培地に加えてもよい。しかし、従来のＨＡＴ選抜とは異なり、ハイブリッド細胞培養物は、１２日を超えて化合物に曝露させるべきでない。
【００８９】
上記の方法によって得られる融合細胞は、ＤＣの表現型特性を一般的に保持する。例えば、これらの融合細胞は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、Ｂ７−１、Ｂ７−２および、ＩＣＡＭ−１など、ＡＰＣに特有の接着分子などのＴ細胞刺激分子を発現する。融合細胞は、親の非樹状細胞の細胞表面抗原を続けて発現し、それによって、細胞表面抗原に対する免疫を誘導するのに有用である。特に、非樹状融合パートナーが腫瘍細胞である場合、融合細胞の腫瘍形成性は親の腫瘍細胞に比較してしばしば弱められている。
【００９０】
融合細胞がＡＰＣ特異的Ｔ細胞刺激分子の発現などのあるＤＣ特性を失う場合、ＤＣ表現型を回復するために、それら（すなわち一次融合細胞）を樹状細胞と再融合させることができる。再融合された細胞（すなわち、二次融合細胞）は、非常に強力なＡＰＣであることが分かり、場合によっては一次融合細胞よりも腫瘍形成性が低いことさえある。融合細胞は、樹状または非樹状の親細胞と所望の回数、再融合させることができる。
【００９１】
あるいは、それぞれは１つまたは複数の同定された癌抗原または病原体からの抗原をコードする、１つまたは複数の核酸構築物でトランスフェクトした非樹状細胞を、融合の非樹状パートナーとして用いることができる。抗原が融合細胞上でＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子によって提示される限り、これらの抗原は、癌細胞または病原体の表面に発現される必要はない。
【００９２】
融合の使用方法
本発明の融合細胞は、疾患の治療または予防のために、哺乳動物の免疫系を刺激するために用いることができる。例えば、ヒトで原発性または転移性の腫瘍を治療するために、患者自身のＤＣおよび腫瘍細胞によって形成される融合細胞を含む組成物を患者に、例えばリンパ系組織の近くの部位に投与することができる。組成物は、適当な間隔（例えば、２〜３週間ごと）および投薬量（例えば、１投与につき約１０^５〜１０^８、例えば約０．５×１０^６〜１×１０^６個の融合細胞）で複数回（例えば、３〜５回）投与されてもよい。癌に対する予防（すなわち、ワクチン接種）のために、同系ＤＣおよび同種異系もしくは異種の癌細胞、または同種異系ＤＣおよび癌細胞によって形成されるものなどの、非同系融合細胞を投与することができる。ワクチン接種の効果を監視するために、治療される個体から得られる細胞傷害性Ｔリンパ球を、癌細胞に対するそれらの効力について細胞傷害性アッセイで試験することができる。細胞傷害性Ｔリンパ球の効力を高めるために、複数のブーストが必要かもしれない。
【００９３】
適当な融合細胞を含む組成物は、適宜当業者によって決定されるレジメンで個体（例えば、ヒト）に投与される。例えば、組成物は、適当な間隔（例えば、２〜３週間ごと）および投薬量（例えば、１投与につき約１０^５〜１０^８、好ましくは約１０^７個の融合細胞）で複数回（例えば、３〜５回）投与されてもよい。
【００９４】
ＤＣおよびこれらのトランスフェクトされた細胞によって生成される融合細胞は、癌またはその病原体に起因する疾患の治療および予防のために用いることができる。それには限定されない例として、ＭＵＣ１を発現する融合細胞は、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌、リンパ腫、ある種の白血病および骨髄腫を治療または予防するために用いることができ；α−フェトプロテインを発現する融合細胞は、肝癌または慢性肝炎を治療または予防するために用いることができ、そこで、α−フェトプロテインはしばしば高いレベルで発現され；前立腺特異抗原を発現する融合細胞は、前立腺癌を治療するために用いることができる。そのように生成された融合細胞を含む組成物の投与は、上に述べた通りである。
【００９５】
腫瘍細胞は、一部、抗原提示細胞の発達および機能を撹乱することによって、宿主免疫を抑制する。したがって、ＤＣ／腫瘍融合ワクチンの有効性に関する潜在的な問題は、腫瘍細胞融合パートナーがＤＣ分化を阻害し、融合ワクチンによる抗原提示を妨害することである。
【００９６】
ＤＣ／腫瘍融合は、ＤＣ媒介性の同時刺激との関連で提示される広範な腫瘍抗原を発現し、抗腫瘍免疫の生成において非常に有効である。ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ経路との関連で内因的および内在化された抗原が提示され、平衡したヘルパーおよび細胞傷害性Ｔリンパ球応答をもたらす。（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１７０巻：５３１７〜２５頁（２００３年）を参照）。動物モデルでは、ＤＣ／腫瘍融合によるワクチン接種は、腫瘍細胞のさもなければ致死性の攻撃からの保護をもたらし、確立された疾患を効果的に根絶する。（Ｇｏｎｇら、Ｎａｔ Ｍｅｄ３巻：５５８〜６１頁（１９９７年）；Ｇｏｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９５巻：６２７９〜８３頁（１９９８年）；Ｇｏｎｇら、Ｂｌｏｏｄ９９巻：２５１２〜１７頁（２００２年）；Ｌｅｓｐａｇｎａｒｄら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ７６巻：２５０〜５８頁（１９９８年）を参照）。実際、患者由来の乳癌細胞およびＤＣによって刺激されたＴ細胞の融合は、インビトロで自己由来の腫瘍細胞の溶解を媒介した。（Ｇｏｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９７巻：２７１５〜１８頁（２０００年）を参照）。
【００９７】
しかし、転移性乳癌患者の臨床試験では、自己由来ＤＣ／腫瘍融合によるワクチン接種は患者の大多数で抗腫瘍免疫を誘導したが、臨床応答は患者のサブセットだけで観察された。（Ａｖｉｇａｎら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ１０巻：４６９９〜７０８頁（２００４年）；Ａｖｉｇａｎら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ＡＳＣＯ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ２２巻：１６９頁（２００４年）を参照）。このＩ／ＩＩ相試験では、２３人の転移性乳癌および腎癌患者が、アクセス可能な組織部位から採取された自己由来腫瘍細胞と融合された部分的に成熟したＤＣによるワクチン接種を受けた。（Ａｖｉｇａｎら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０巻：４６９９〜７０８頁（２００４年）を参照）。融合細胞はＭＵＣ−１などの腫瘍特異抗原およびＤＣ由来の同時刺激分子の同時発現を示したが、ワクチン接種は、１８人中１０人の評価可能患者で、腫瘍溶解物へのエキソビボ曝露の後のＩＦＮγの増加が表す抗腫瘍免疫応答をもたらし、２人の患者は疾患退行を示し、６人の患者は転移性疾患が安定した。したがって、ＤＣ／乳癌融合によるワクチン接種は患者の大多数で抗腫瘍免疫応答を刺激したが、サブセットだけが臨床的に意味のある疾患応答を示した。
【００９８】
ＤＣ／乳癌融合の表現型特性を、抗原提示細胞としてのそれらの機能に関して調べた。（Ｖａｓｉｒら、Ｂｒ． Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｌ．１２９巻：６８７〜７００頁（２００５年）を参照）。具体的には、乳癌細胞とのＤＣの融合は、同時刺激マーカー、ＣＤ８０、ＣＤ８６および成熟マーカーＣＤ８３の発現を高める結果となった。未熟のおよび成熟したＤＣで生成された融合細胞は類似したレベルの成熟を示し、それによって、融合工程そのものがＤＣ活性化を促進することを示唆した。実際、ＩＬ−１２の相当な発現が両集団で観察され、一次免疫応答を刺激する能力を有する強力な抗原提示細胞としてのそれらの役割と一貫した。融合細胞集団によるＣＣＲ７の発現は、流入領域リンパ節におけるＴ細胞通行部位を刺激するそれらの能力を裏付ける。ＤＣ／乳癌融合は、高レベルのＩＦＮγの関連する分泌を伴う、自己由来Ｔ細胞増殖も強力に刺激した。
【００９９】
したがって、未熟なＤＣは乳癌細胞とのＰＥＧ媒介性融合の後に成熟を経、成熟ＤＣ／乳癌融合に類似した機能特性を示す。しかし、これらのＤＣ／腫瘍融合は、活性化および調節性Ｔ細胞の混合応答を刺激する。融合細胞による刺激は、ＣＤ４／ＣＤ２５＋細胞の増加をもたらした。この集団の免疫表現型タイピングは、活性化（ＣＤ６９＋）ならびに阻害性（ＣＴＬＡ−４＋、Ｆｏｘｐ３）Ｔ細胞の存在を明らかにした。さらに、ＩＦＮγおよびＩＬ−１０生成細胞の相対的な増加も、観察された。
【０１００】
腫瘍細胞は、無効なＴ細胞機能、ならびに、免疫性活性化を低下させ、癌ワクチンに対する応答を潜在的に制限する調節Ｔ細胞の存在の増加を特徴とする、免疫抑制環境を生成する。（Ｂａｃｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１６７巻：１２４５〜５３頁 ９２００１）；Ｄｉｅｃｋｍａｎｎら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９３巻：１３０３〜１０頁（２００１年）；Ｊｏｎｕｌｅｉｔら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９３巻：１２８５９４頁（２００１年）を参照）。調節Ｔ細胞の存在の増加は、癌患者の循環、流入領域リンパ節および腫瘍層で、疾患負担と相関するレベルで観察された。（Ｌｉｙａｎａｇｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９巻：２７５６〜６１頁（２００２年）；Ｓａｓａｄａら、Ｃａｎｃｅｒ９８巻：１０８９〜９９頁（２００３年）；Ｏｒｍａｎｄｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５巻：２４５７〜６４頁（２００５年）を参照）。
【０１０１】
癌ワクチン療法は、インビボで腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激するワクチンの能力に依存する。しばしば、悪性腫瘍を有する患者でのエフェクター細胞の機能不全は、癌ワクチンの効力および有効性を制限する。したがって、有効な癌ワクチン戦略の開発における主要な難題は、腫瘍を抱える患者で免疫応答を制限する内因性の免疫欠乏を克服することである。有効であるために、癌ワクチンは、刺激性シグナル伝達との関連で腫瘍抗原を提示し、Ｔ細胞通行部位に移動し、腫瘍標的を溶解する能力を有する活性化エフェクター細胞の増殖を誘導する能力を示さなければならない。
【０１０２】
腫瘍媒介性の免疫抑制の２つの中心的な要素には、ＤＣ成熟の阻害および調節Ｔ細胞の存在の増加が含まれる。（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ３巻：４８３〜９０頁（１９９７年）；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈら、Ｂｌｏｏｄ９２巻：４１５０〜６６頁（１９９８年）；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ４巻：９４１〜５２頁（２００４年）を参照）。
【０１０３】
ＤＣ／腫瘍もしくは癌細胞融合に関する１つの懸念は、ワクチン製剤中の腫瘍細胞が、抗原提示細胞としてのその機能を阻害することがあるということである。ワクチン接種に対する応答を制限する別の潜在的な問題は、Ｔ細胞活性化を抑制する調節Ｔ細胞の存在の増加である。
【０１０４】
調節Ｔ細胞は、正常な宿主での自己抗原に対する寛容性の媒介で重要な役割を演ずる。悪性腫瘍を有する患者では、それらの存在の増加は、宿主免疫応答の腫瘍関連抑制を媒介すると考えられる。（Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７巻：１２４５〜５３頁（２００１年）；Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｏら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１６７巻：１１３７〜４０頁（２００１年）；Ｗｏｏｄら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３巻：１９９〜２１０頁（２００３年）を参照）。ＧＩＴＲおよびＣＤ２５などの多くのマーカーが調節Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞集団で共有されているので、調節Ｔ細胞の正確な定義は複雑である。調節細胞は、ＣＤ２５^ｈｉｇｈ、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４およびＦｏｘｐ３を含む一団のマーカー；混合リンパ球反応への応答の欠如；ならびに、インビトロで自己由来Ｔ細胞応答を抑制する能力によって同定される。
【０１０５】
調節Ｔ細胞は、直接細胞接触および腫瘍関連アネルギーの媒介で役割を果たすサイトカインの放出を通して、阻害シグナルを送達する。前述のように、調節Ｔ細胞は悪性腫瘍を有する患者の循環、腫瘍層およびリンパ節で増加し、それらの存在はより悪い予後に関連付けられた。（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｎａｔ Ｍｅｄ１０巻：９４２〜４９頁（２００４年）；Ｌｉｙａｎａｇｅら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ１６９巻：２７５６〜６１（２００２年）；Ｏｒｍａｎｄｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６５巻：２４５７〜６４頁（２００５年）を参照）。
【０１０６】
逆に、複数の研究が、ＤＣ／癌細胞融合によるワクチン接種が、免疫応答を究極的に鈍らせる調節Ｔ細胞の増殖をもたらすことができることを実証している。（Ｊａｖｉａら、Ｊ Ｉｍｕｎｏｔｈｅｒ２６巻：８５〜９３頁（２００３年）を参照）。例えば、動物モデルでは、調節Ｔ細胞の除去、または、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の連結を通しての先天性免疫の活性化は、腫瘍ワクチンへの応答を高めた。（Ｐｒａｓａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１７４巻：９０〜９８頁（２００３年）；Ｃａｓａｒｅｓら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１７１巻：５９３１〜３９頁（２００３年）；Ｔａｎａｋａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２５巻：２０７〜１７頁（２００２年）；Ｄａｎｎｕｌｌら、Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ１５巻：３６２３〜３３頁（２００５年）を参照）。さらに、Ｔ細胞／同時刺激複合体（ＣＤ３／ＣＤ２８）の連結は、他の刺激性シグナルとの関連で投与されるとき、Ｔ細胞の活性化を促進することも示された。（Ｊｕｎｇら、Ｂｌｏｏｄ１０２巻：３４３９〜４５頁（２００３年）を参照）。したがって、調節Ｔ細胞の存在は、悪性腫瘍を有する患者で、活性免疫化への応答を阻止することができる。
【０１０７】
過去の研究では、抗原パルス適用未熟ＤＣによるワクチン接種は、抗原特異的Ｔ細胞で寛容性を誘導した。（Ｄｈｏｄａｐｋａｒら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９３巻：２３３〜３８頁（２００１年）を参照）。さらに、複数の骨髄腫細胞との未熟なＤＣの融合は、ＤＣ融合パートナーのさらなる成熟をもたらした。（Ｖａｓｉｒら、Ｂｒ Ｊ Ａｈｅｍａｔｏｌ．１２９巻：６８７〜７００頁（２００５年）を参照）。
【０１０８】
これらの結果は、機能的に活性なＴ細胞を生成するためのワクチンのエキソビボの使用を調べるための、強い根拠を提供する。養子Ｔ細胞移入では、調節Ｔ細胞の数を変更することができ、エフェクター細胞の抗原特異的集団を移入することができる。転移性黒色腫患者での研究は、リンパ除去の後の自己由来黒色腫反応性腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の移入が、持続する臨床応答をもたらすことを示した。（Ｚｈｏｕら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２８巻：５３〜６２頁（２００５年）を参照）。これらの研究は、腫瘍サプレッサー細胞の除去に続く腫瘍反応性Ｔ細胞の養子移入が、進行疾患を有する患者の５０％で腫瘍退行を誘導することも示した。（Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３巻：７１２５〜３０頁（２００４年）を参照）。しかし、ＴＩＬのこの使用は、それらが入手できる少数の腫瘍型に限られている。したがって、養子免疫療法のために腫瘍ワクチンによってエキソビボで増殖したＴ細胞を利用することは、今でも大きな関心の的である。
【０１０９】
教育されたＴ細胞
本発明は、ハイブリッド細胞を代償にして培養で増殖する、教育された、抗原特異的な免疫エフェクター細胞の集団も提供し、そこで、ハイブリッド細胞は、１つまたは複数の抗原を発現する細胞に融合している、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む。一実施形態では、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）であり、ハイブリッド細胞は培養で増殖する。別の実施形態では、抗原（複数可）を発現する細胞は腫瘍細胞であり、免疫エフェクター細胞は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。ＤＣは、血液、皮膚、脾臓、骨髄または腫瘍などの源から単離することができる。細胞集団を調製する方法も、本発明によって提供される。
【０１１０】
本発明の抗原特異的な免疫エフェクター細胞の一部もしくは全部、またはハイブリッド細胞は、外来性ポリヌクレオチドの挿入によって遺伝子操作することができるか、されている。例えば、細胞に導入されるポリヌクレオチドは、ペプチド、リボザイムまたはアンチセンス配列をコードする。
【０１１１】
抗原（複数可）を発現する細胞および免疫エフェクター細胞は、腫瘍から濃縮されていてもよい。さらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。本方法は、ＡＰＣおよび抗原発現細胞が同じ対象または異なる対象（すなわち、自己由来または同種異系）に由来する実施形態も提供する。
【０１１２】
この方法のさらなる変更形態では、免疫エフェクター細胞は、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２またはＧＭ−ＣＳＦおよび／または同時刺激分子の存在下で培養される。
【０１１３】
本発明で用いられるハイブリッド細胞は、当技術分野で公知である任意の適する方法によって形成することができる。一実施形態では、腫瘍生検試料を細かく切り刻み、細胞懸濁液を作製する。好ましくは、細胞懸濁液は、少なくとも２つの分画に分離される。１つは免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞について濃縮され、１つは腫瘍細胞について濃縮される。免疫エフェクター細胞は、骨髄、血液または皮膚から、当技術分野で周知である方法を用いて単離することもできる。
【０１１４】
一般に、培養の前に新生細胞から最初の接種集団を単離することが望ましい。例えば、新生細胞からの様々な細胞型の分離は、例えばセルソータ、磁気ビーズおよび充填カラムの使用を含む、任意の数の方法によって実施することができる。分離のための他の方法には、それらに限定されないが、物理的分離、抗体コーティング磁気ビーズを用いる磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、それらに限定されないが補体および細胞毒を含む、モノクローナル抗体に結合するかモノクローナル抗体と併用される細胞毒性剤、および固体マトリックス、例えばプレートに結合された抗体による「パニング」、エラトリエーション、または当業者に公知である他の任意の便利な技術が含まれる。
【０１１５】
物理的分離技術の使用には、物理的特性（密度勾配遠心法および逆流遠心エラトリエーション）、細胞表面特性（レクチンおよび抗体親和性）および生体染色特性（ミトコンドリア結合性色素ロー１２３およびＤＮＡ結合性色素Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）の差に基づくものが含まれるが、これらに限定されない。適する方法は、当業者に周知である。
【０１１６】
特定の細胞系および／または分化の段階に関連するマーカーを同定するための、別の有用な試薬であるモノクローナル抗体を用いることができる。大雑把な分離のために、抗体を固体支持体に結合することができる。使用する分離技術は、収集される分画の生存度の保持を最大にするべきである。異なる効力の様々な技術を、「比較的粗な」分離を得るために使用することができる。そのような分離では、マーカーを有しない存在総細胞数の最高１０％、通常約５％以下、好ましくは約１％以下が、保持される細胞集団に残留することができる。使用される特定の技術は、分離効率、関連細胞毒性、実施の容易性および速度、ならびに高度な機器および／または技術の必要性に依存する。
【０１１７】
細胞分画を分離する別の方法は、所望の細胞集団の優先的増殖を可能にする培養条件を用いることである。例えば、抗原発現細胞を濃縮した分画を、次にＡＰＣに、好ましくは樹状細胞に融合する。ＡＰＣと抗原発現細胞との間の融合は、任意の適する方法、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気融合またはセンダイウイルスを用いて実行することができる。ハイブリッド細胞は、Ｇｏｎｇら（１９９７年）Ｎａｔ． Ｍｅｄ３巻（５号）：５５８〜５６１頁に記載のＰＥＧ方法、または当技術分野で公知である他の方法を用いて作製される。
【０１１８】
予備コミットされたＤＣを、例えばメトリザミド勾配；非粘着／粘着技術（Ｆｒｅｄｕｅｎｔｈａｌ， ＰＳら（１９９０年）ＰＮＡＳ８７巻：７６９８〜７７０２頁を参照）；パーコール勾配分離（Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら（１９９４年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ１５３巻：９９６〜１００３頁を参照）およびＦＡＣＳ技術（Ｔｈｏｍａｓら（１９９３年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ１５１巻：６８４０〜６８５２頁を参照）を用いて単離する。一実施形態では、ＤＣは、基本的にＦＡＣＳ技術を用いてＷＯ９６／２３０６０に記載の通りに単離される。ヒトＤＣの特異的細胞表面マーカーはないが、２０個のマーカーの混合（例えばＨＬＡ−ＤＲ、Ｂ７．２、ＣＤ １３／３３その他）がＤＣの上に存在することが公知である。さらに、ＤＣは、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ５６およびＣＤ１４抗原を欠くことが公知である。したがって、陰性および陽性のＦＡＣＳ技術を組み合わせることは、ＤＣを単離する方法を提供する。
【０１１９】
１つまたは複数の抗原を発現するＡＰＣおよび細胞は、自己由来でよく、すなわち、その腫瘍生検試料が得られた同じ対象に由来してもよい。樹状細胞は一次免疫応答の生成を促進することが公知であるので、抗原を発現するＡＰＣおよび細胞は、同種異系でもよく、すなわち、異なる対象に由来してもよい。
【０１２０】
抗原特異的な免疫エフェクター細胞の増殖
本発明は、抗原特異的（すなわち、「教育された」）免疫エフェクター細胞の濃縮集団の生成を刺激するために、これらのハイブリッド細胞を利用する。抗原特異的な免疫エフェクター細胞は、培養中に死に至るハイブリッド細胞を代償にして増殖する。ナイーブな免疫エフェクター細胞が他の細胞によって教育される工程は、基本的にＣｏｕｌｉｅ、Ｍｏｌｅｃ． Ｍｅｄ Ｔｏｄａｙ２６１〜２６８頁（１９９７年）に記載されている。
【０１２１】
上に述べたように調製されるハイブリッド細胞は、ナイーブな免疫エフェクター細胞と混合される。好ましくは、免疫エフェクター細胞は腫瘍細胞を特異的に認識し、上に述べたように腫瘍生検試料から濃縮されている。任意選択で、細胞をサイトカイン、例えばＩＬ−２の存在下で培養することができる。ＤＣはＩＬ−１２などの強力な免疫賦活性サイトカインを分泌するので、初回のおよび続く増殖の間、補助的サイトカインを加える必要はないであろう。しかし、融合細胞がＩＬ−１２を形成しない場合、このサイトカインは培養に加えられる。いかなる場合でも、培養条件は、抗原特異的な免疫エフェクター細胞がハイブリッド細胞よりもずっと高い速度で拡張する（すなわち、増殖する）ような条件である。抗原特異的細胞の集団をさらに拡張するために、ハイブリッド細胞および任意選択のサイトカインの複数回の注入を実施することができる。
【０１２２】
第二の刺激性シグナルの添加は、調節Ｔ細胞の融合媒介性増殖を枯渇させ、したがって、活性化抗腫瘍免疫応答の発達を有利にする。適する二次刺激性シグナルには、ＩＬ−１２；ＩＬ−１８；ＴＬＲ９アゴニスト、ＣＰＧ−ＯＤＮ；および抗ＣＤ３／ＣＤ２８が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
例えば、動物モデルは、ＩＬ−１２の共投与がＤＣ／腫瘍融合ワクチンの効力を促進することを実証している。（Ａｋａｓａｋｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２４巻：１０６〜１１３頁（２００１年）を参照）。調節Ｔ細胞の影響を最小にする別の戦略は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の連結による先天性免疫の活性化を通したものである。動物モデルでは、ＴＬＲ９を活性化するためのＣＰＧ ＯＤＮの投与が、拡大する腫瘍の負荷から生じる免疫抑制を克服することが示された。ＣＰＧへの曝露は、調節細胞の存在を枯渇させ、ワクチン応答を促進した。さらに、ＴＬＲ７／８アゴニストへの曝露は、同時刺激マーカーおよび成熟マーカーの発現増加によって明らかにされる、ＤＣ活性化の増強をもたらした。同様に、ＴＬＲ９アゴニスト（ＣｐＧ）、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８の添加は、融合媒介刺激の後に、調節Ｔ細胞のレベルを低下させた。
【０１２４】
ＤＣ／腫瘍融合は、自己由来の腫瘍標的を溶解する能力を有する腫瘍反応性Ｔ細胞を刺激することが、前に実証されている。さらに、過去の試験は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８への最初の曝露がＴ細胞レパートリーの複合性を回復し、腫瘍反応性クローンを増殖させるＤＣ／腫瘍融合の能力を潜在的に高めることも実証している。対照的に、融合媒介刺激の後の抗ＣＤ３／ＣＤ２８への二次曝露は、活性化腫瘍反応性細胞のより特異的な増殖をもたらすことができる。
【０１２５】
ＣＤ３／ＣＤ２８の連結は、ＮＦκＢを含むシグナル伝達経路の活性化をもたらす、Ｔ細胞受容体／同時刺激複合体によって媒介される強力な抗原非依存性刺激を提供する。（Ｂｏｎｙｈａｄｉら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４巻：２３６６〜７５頁（２００５年）；Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２４巻：１６４〜７１頁（２００４年）；Ｈｅｒｎｄｏｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６巻：５６５４〜６４頁（２００１年）；Ｋｈｏｓｈｎａｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１６５巻：６９３３〜４０頁（２０００年）；およびＹａｍａｄａ−Ｏｈｎｉｓｈｉら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ１３巻：３１５〜２２頁（２００４年）を参照）。この工程は、ＨＩＶおよび悪性腫瘍を有する患者で、Ｔ細胞増殖、およびＴ細胞レパートリーの複合性の増強を誘導する、強力な活性化および増殖シグナルを送達する。（Ｂｏｎｙｈａｄｉら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４巻：２３６６〜７５頁（２００５年）；Ｋａｌａｍａｓｚら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２７巻：４０５〜１８頁（２００４年）を参照）。抗ＣＤ３／ＣＤ２８によってエキソビボで増殖したＴ細胞を、腫瘍関連の細胞性免疫機能不全を逆転させる可能性のある戦略として探究した。しかし、抗ＣＤ３／ＣＤ２８単独への曝露は、関連サイトカイン環境に依存して、活性化細胞または抑制細胞を増殖させることができる。（Ｊｕｎｇら、Ｂｌｏｏｄ１０２巻：３４３９〜４６頁（２００３年）を参照）。
【０１２６】
抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激のＴ細胞表現型に対する影響は複雑であり、調査するモデルによって多様で相反する影響をもたらす。抗ＣＤ３／ＣＤ２８への曝露は、免疫環境の性質に依存して、活性化Ｔ細胞または抑制Ｔ細胞の増殖を促進する。（Ｊｕｎｇら、Ｂｌｏｏｄ１０２巻：３４３９〜４６頁（２００３年）を参照）。例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８およびＩＬ−１５による刺激は、阻害性表現型を示す調節Ｔ細胞の増殖をもたらす。（Ｌｉｎら、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ３７巻：８８１〜８７頁（２００６年）を参照）。移植片対宿主疾患モデルでは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激の後のＴｈ１またはＴｈ２表現型への分極は、サイトカイン曝露によって決定される（Ｊｕｎｇら、Ｂｌｏｏｄ１０２巻：３４３９〜４６頁（２００３年）を参照）。抗ＣＤ３／ＣＤ２８、ＩＬ−４およびＩＬ−２と共培養されたＣＤ４＋細胞は、増加したレベルのＩＬ−４およびＩＬ−１０を分泌する。対照的に、動物モデルでは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８への抗原特異的Ｔ細胞の曝露は、抗原への曝露後にＩＦＮγを発現し、腫瘍抗原投与に対して保護的であった記憶エフェクター細胞の増殖をもたらした。（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ７巻：３９６〜４０７頁（２００５年）を参照）。
【０１２７】
したがって、ＤＣ／腫瘍融合は、腫瘍関連抗原に対して向けられた活性化Ｔ細胞を選択的に刺激することによって、抗ＣＤ３／ＣＤ２８媒介増殖のための特異なプラットホームを提供するであろうと仮定された。このように、融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激は、増殖集団中の調節Ｔ細胞の存在を最小にしつつ、腫瘍反応性Ｔ細胞のかなりの収量の生成を潜在的に可能にする。腎癌細胞（ＲＣＣ）または患者由来の骨髄性白血病細胞と融合させたＤＣによるインビトロ刺激を経たＴ細胞の、表現型特性および機能的特性を研究した。さらに、ＤＣ／乳癌と、続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激は、記憶エフェクター細胞のそれと一貫していた活性化表現型を主に表したＴ細胞集団をもたらした。
【０１２８】
したがって、ＤＣ／腫瘍融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８は、活性化表現型を有する抗腫瘍Ｔ細胞を劇的に増殖させることにおいて、相乗効果を提供する。ＲＣＣおよび乳癌の両モデルにおいて、ＤＣ／腫瘍融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激が、ＤＣ／ＲＣＣ融合または抗ＣＤ３／ＣＤ２８単独による刺激の後に観察されたものをはるかに超える記憶エフェクターＴ細胞の劇的な増殖をもたらしたことも実証されている。
【０１２９】
さらに、その後抗ＣＤ３／ＣＤ２８増殖を経た融合刺激Ｔ細胞は、ＭＵＣ１反応性Ｔ細胞クローンの著しい増加を示し、培養中に融合細胞で抗原刺激をされた腫瘍反応性クローンがその後増殖していたことを示唆する。ＤＣ／腫瘍融合と、続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激は、ＣＤ６９およびＩＦＮγを発現するＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞のかなり増加した収量から明らかなように、活性化Ｔ細胞の比較的選択的な増殖をもたらす。ＩＬ−１０およびＦｏｘｐ３を発現する細胞のより控え目な増加は、阻害性集団の増殖が起こることを示唆した。細胞溶解能力の尺度として、ＤＣ／腫瘍融合と、続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８によって刺激されたＴ細胞は、融合細胞または抗ＣＤ３／ＣＤ２８単独による刺激の後に観察されたものを超える、高レベルのグランザイムＢ発現を示した。
【０１３０】
ＤＣ／腫瘍融合と、続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激は、活性化表現型が優勢な腫瘍反応性リンパ球の劇的な増殖をもたらすので、この戦略は、養子免疫療法の理想的なプラットホームを提供する。さらに、当業者は、増殖集団で調節Ｔ細胞をさらに枯渇させる追加の手法が、癌ワクチン効力をさらに高めるかもしれないことを認識するであろう。
【０１３１】
ハイブリッド細胞を記載のように用いて、免疫エフェクター細胞の強力な抗原特異的集団を得ることができる。これらの細胞は、腫瘍特異抗原に特異的であるＴ細胞であってよい。
【０１３２】
教育されたＴ細胞を用いる方法
本明細書で記載されるように、本明細書で記載される細胞の有効な量を、養子免疫療法を提供するために対象に投与することができる。サイトカインまたは他の同時刺激分子の有効な量を、対象に共投与することもできる。
【０１３３】
本発明の抗原特異的な免疫エフェクター細胞の増殖集団は、養子免疫療法体系で、およびワクチンとして使用することもできる。
【０１３４】
養子免疫療法は、例えば、ナイーブな免疫エフェクター細胞をハイブリッド細胞と培養することによって作製される、増殖し、教育され、抗原特異的な免疫エフェクター細胞の実質的に純粋な集団の有効量を対象に投与することであって、そこで、ハイブリッド細胞は、１つまたは複数の抗原を発現する細胞に融合している、抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、教育され、抗原特異的な免疫エフェクター細胞は、ハイブリッド細胞を代償にして増殖することと、その後、生じる教育され、抗原特異的な免疫エフェクター細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体に曝露させて集団をさらに増殖させることを含む。好ましくは、ＡＰＣはＤＣである。
【０１３５】
細胞は、自己由来または同種異系であってよい。例えば、本明細書で記載される養子免疫療法方法が自己由来性の場合、ハイブリッド細胞は、単一の対象から単離される親細胞を用いて作製される。増殖集団は、その対象から単離されるＴ細胞も使用する。最後に、抗原特異的細胞の増殖集団は、同じ患者に投与される。
【０１３６】
あるいは、養子免疫療法が同種異系の場合、ハイブリッド細胞を生成し、抗原特異的細胞の生成を刺激するために、２名以上の患者からの細胞を用いる。例えば、生検試料を提供する対象から自己由来のＴ細胞および／または樹状細胞を得ることができない場合、抗原特異的細胞を生成するために、他の健康対象または有病対象からの細胞を用いることができる。増殖集団は、細胞を単離した対象、または完全に別の対象のいずれか１名に投与することができる。
【０１３７】
遺伝子改変
本発明の方法は、ハイブリッド細胞、または、刺激因子としてハイブリッド細胞を用いて誘導される細胞の抗原特異的集団に対する、遺伝子導入の任意の方法を包含するものとする。遺伝子改変の例には、ウイルス媒介遺伝子導入、リポソーム媒介導入、形質転換、トランスフェクションおよび形質導入、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルスなどのＤＮＡウイルスに基づくベクター、ならびにレトロウイルスに基づくベクターの使用などのウイルス媒介遺伝子導入が含まれるが、これらに限定されない。本方法は、核局在化要素もしくは配列を欠くので、核酸が細胞質にとどまるベクターまたは構築物に含まれる核酸の組込みに特に適している。これらの例では、核酸または治療的遺伝子は、核膜が破壊され、核酸または治療的遺伝子が宿主細胞染色体に接近することができるＭ（有糸分裂）相の間に、核に入ることができる。遺伝子改変はエキソビボで実施され、その後、組換え（すなわち、形質導入）細胞はレシピエントに投与される。したがって、本発明は、本明細書で開示される方法によってエキソビボまたはインビボで遺伝子を投与することによる、抗原特異的細胞への遺伝子導入に適合する疾患の治療を包含する。
【０１３８】
抗原特異的細胞の増殖集団は、遺伝子操作することができる。さらに、例えば、それらに限定されないが、ホルモン、酵素、インターフェロン、成長因子などを含む特定の分泌産物を供給するために、ハイブリッド細胞を遺伝子操作することもできる。適当な調節開始領域を使用することによって、欠乏するタンパク質の誘導可能な生成を達成することができ、したがって、生成がそのようなタンパク質を通常生成する細胞型とは異なる細胞型中で起こるとしても、タンパク質の生成は天然の生成に対応する。特定の遺伝子産物、または疾患、特に血リンパ系疾患への感受性を阻害するために、リボザイム、アンチセンスまたは他のメッセージを挿入することも可能である。
【０１３９】
適する発現および導入ベクターは、当技術分野で公知である。
【０１４０】
優性な阻害性オリゴヌクレオチドおよびペプチドをコードする治療的遺伝子、ならびに調節タンパク質およびオリゴヌクレオチドをコードする遺伝子も、本発明に包含される。一般に、遺伝子治療は単一の治療的遺伝子の導入を含むが、特定の疾患の治療のために複数の遺伝子が必要なこともある。治療的遺伝子は、野生型免疫抑制剤の優性な阻害性突然変異体である。あるいは、治療的遺伝子は、野生型、欠陥遺伝子のコピー、または機能的相同体でもよい。
【０１４１】
ベクターにつき複数の遺伝子を投与することができ、あるいは、いくつかの適合するベクターを用いて複数の遺伝子を送達することができる。遺伝子の欠陥次第で、治療的遺伝子は、調節配列および非翻訳配列を含むことができる。ヒト患者での遺伝子治療のために、一般に治療的遺伝子はヒト起源であるが、遺伝子産物がレシピエントで有害な免疫反応を誘導しないならば、ヒトで高い相同性および生物学的に同一のまたは同等な機能を示す、他の緊密に関連する種からの遺伝子を用いることができる。治療での使用に適する治療的遺伝子は、疾患で異なる。
【０１４２】
ＤＮＡ構築物が組み込まれていない細胞に比較して、形質導入の成果を監視するために、およびＤＮＡが組み込まれた細胞の選択のために、マーカー遺伝子がベクターに含まれてもよい。様々なマーカー遺伝子には、０４１８またはハイグロマイシンへの耐性などの抗生物質耐性マーカーが含まれるが、これらに限定されない。より不便であるが、それに限定されないが、マーカーが、細胞をアシクロビルおよびガンシクロビルなどの剤に感受性にするＨＳＶ−ｔｋ遺伝子である場合、陰性選択を用いることができる。あるいは、ＦＡＣＳ選別によって導入遺伝子発現細胞を選択するための、安定細胞表面マーカーの使用によって選択を達成することができよう。ＮｅｏＲ（ネオマイシン／０４１８耐性）遺伝子が一般に用いられるが、その配列がレシピエント細胞にまだ存在していない任意の好都合なマーカー遺伝子を用いることができる。
【０１４３】
ウイルスベクターは、粒子安定性を改善し、宿主域を拡張するか、感染中に細胞型特異的ターゲティングを可能にするために、キメラエンベロープタンパク質または非ウイルス膜タンパク質をレトロウイルス粒子に組み込むように改変することができる。宿主域を変化させたレトロウイルスベクターの生成は、例えば、ＷＯ９２／１４８２９およびＷＯ９３／１４１８８で教示されている。インビボで特異的細胞型を標的にすることができるレトロウイルスベクターも、例えば、Ｋａｓａｈａｒａら（１９９４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６巻：１３７３〜１３７６頁で教示されている。Ｋａｓａｈａｒａらは、ウイルスエンベロープタンパク質と融合しているヒトエリスロポイエチン（ＥＰＯ）からなるキメラエンベロープタンパク質を有する、モロニー白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）の構築を記載している。このハイブリッドウイルスは、ＥＰＯの受容体を運ぶヒト赤血球前駆体への組織向性を示し、したがって、鎌状赤血球貧血およびサラセミアの遺伝子治療で有用である。細胞の感染を特異的に標的にすることができるレトロウイルスベクターが、インビボ遺伝子治療のために好ましい。
【０１４４】
導入遺伝子の発現は、遺伝子導入の目的および所期の効果によって、様々な方法で制御することができる。したがって、特定の生理的条件の下でだけ、または特定の細胞型においてだけ、遺伝子が構成的に発現されるようにするプロモーターの支配下に、導入遺伝子を置くことができる。
【０１４５】
特定の細胞型で導入された配列の発現を引き起こすために用いることができるプロモーターの例には、Ｔ細胞およびＮＫ細胞での発現のためのグランザイムＡ、幹細胞および前駆体細胞での発現のためのＣＤ３４プロモーター、細胞傷害Ｔ細胞での発現のためのＣＤ８プロモーター、および骨髄細胞での発現のためのＣＤ１１ｂプロモーターが含まれる。
【０１４６】
ある生理的条件下での遺伝子発現のために、誘導可能なプロモーターを用いることができる。例えば、求電子性の分子に反応して化学療法抵抗性遺伝子の発現を誘導するために、求電子性の応答要素を用いることができる。適当な局在化配列を結合することによって適当な細胞の場所、例えば核を遺伝子産物の標的にすることによって、治療上の利点をさらに増加させることができる。
【０１４７】
ウイルス形質導入の後、形質導入細胞またはそれらの後代におけるウイルスベクターの存在は、例えばＰＣＲによって検証することができる。マーカー遺伝子、または他のウイルスによって形質導入された配列を検出するために、ＰＣＲを実施することができる。一般に、定期血液試料を採取し、例えばＮｅｏＲ遺伝子をマーカーとして用いる場合はＮｅｏＲプローブを用いて、ＰＣＲを都合よく実施する。骨髄細胞または成熟造血細胞中のウイルスによって形質導入された配列の存在は、形質導入細胞による再構成の成功の証拠である。ＰＣＲ技術および試薬は当技術分野で周知であり（一般に、ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ， Ａ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ． Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆａｎｄ、Ｓｎｉｎｓｋｙ ＆ Ｗｈｉｔｅ編（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９０年））、市販されている（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）。
【０１４８】
候補ペプチドおよび抗原活性のためのペプチドのスクリーニング方法
上記のＣＴＬおよびＨＴＬ（「エフェクター細胞」）は、本発明のエフェクター細胞を生成するために用いられる融合細胞の非樹状細胞パートナーによって発現される抗原を、当技術分野で用いられるいくつかの方法によって同定するために用いることができる。手短に言えば、エフェクター細胞を含有する細胞集団を候補ペプチドまたはポリペプチド、および、適当な標的細胞（細胞毒性をアッセイする場合）または抗原提示細胞（ＡＰＣ）（細胞増殖またはサイトカイン生成をアッセイする場合）と一緒に培養し、関連する活性を測定する。エフェクター活性を誘導するペプチドは抗原性のペプチドであり、それは、エフェクター細胞によって認識される。エフェクター活性を誘導するポリペプチドは抗原性のポリペプチドであり、そのペプチド断片はエフェクター細胞によって認識される。
【０１４９】
細胞傷害活性は、当技術分野で公知である様々な方法（例えば、実施例ＩおよびＩＩＩ〜Ｖに記載される^５１Ｃｒまたは乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出アッセイ）によって試験することができる。標的細胞は、様々な細胞型、例えば、線維芽細胞、リンパ球、レクチン（例えば、植物性凝集素（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）またはリポポリサッカライド（ＬＰＳ））活性化リンパ芽球、マクロファージ、単球または腫瘍細胞系のいずれかでよい。標的細胞は抗原活性について試験する候補抗原を本来発現するべきでないが、それらは、組換えでそれらを発現することができるであろう。しかし、標的細胞は、ＣＴＬと共通する、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の少なくとも１種類（関連するＣＴＬの制限次第で）を発現するべきである。標的細胞は適当なＭＨＣ分子を内因的に発現することができるか、または、それらは、そのような分子をコードするトランスフェクトされたポリヌクレオチドを発現することができる。選択された標的細胞集団は、アッセイの前に候補ペプチドまたはポリペプチドをパルス適用することができるか、または、候補ペプチドまたはポリペプチドを、ＣＴＬおよび標的細胞と一緒にアッセイ容器、例えばマイクロタイタープレートウェルまたは培養試験管に加えることができる。あるいは、候補ペプチドまたはポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換された標的細胞を、用いることができる。ＣＴＬ含有細胞集団、標的細胞および候補ペプチドまたはポリペプチドを、約４〜約２４時間一緒に培養する。標的細胞の溶解は、例えば標的細胞からの^５１ＣｒまたはＬＤＨの放出によって測定される。ＣＴＬによる標的細胞の溶解を引き出すペプチドは、ＣＴＬによって認識される抗原性ペプチドである。ＣＴＬによる標的細胞の溶解を引き出すポリペプチドは、抗原性ポリペプチドであり、そのペプチド断片はＣＴＬによって認識される。
【０１５０】
候補ペプチドまたはポリペプチドは、ＣＴＬおよびＨＴＬの両方で増殖応答を誘導するそれらの能力について、試験することができる。エフェクター細胞は、適当なＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子を発現するＡＰＣの存在下で、候補ペプチドまたはポリペプチドと一緒に培養される。そのようなＡＰＣは、Ｂリンパ球、単球、マクロファージまたは樹状細胞、または完全なＰＢＭＣであってよい。ＡＰＣは、Ｂリンパ球、単球、マクロファージまたは樹状細胞に由来する、不死化された細胞系であってもよい。ＡＰＣは、適当なＭＥＣ分子を内因的に発現することができるか、または、それらは、そのような分子をコードするトランスフェクトされた発現ベクターを発現することができる。すべての場合において、ＡＰＣは、アッセイの前に、例えば電離放射線またはマイトマイシンＣによる処理によって、非増殖性にされてもよい。エフェクター細胞を含有する集団は、候補ペプチドまたはポリペプチドと一緒にまたはそれなしに培養され、細胞の増殖応答は、例えばそれらのＤＮＡへの［^３Ｈ］−チミジンの組込みによって測定される。
【０１５１】
細胞増殖の測定に代わるものとして、当業者に公知である方法によってエフェクター細胞によるサイトカイン生成を測定することができる。サイトカインには、限定されずに、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＦＮ−、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＴＮＦ−、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１０（ＩＬ−ｂ）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）およびトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）が含まれ、それらを測定するアッセイには、限定されずに、ＥＬＩＳＡ、および関連するサイトカインに応答性である細胞が、試験試料の存在下で応答性（例えば、増殖）について試験されるバイオアッセイが含まれる。あるいは、エフェクター細胞によるサイトカイン生成は、細胞内免疫蛍光検査染色およびフローサイトメトリーによって直接に視覚化することができる。
【０１５２】
抗原性について試験される候補ペプチドおよびポリペプチドの選択は、融合細胞を作るために用いられた非樹状細胞によって決まる。非樹状細胞が腫瘍細胞である場合、候補ポリペプチドは、関連する腫瘍細胞によって発現されるそれらである。それらは、好ましくは、腫瘍細胞と同等の正常な細胞におけるよりもかなり高いレベルで腫瘍細胞において発現されるそれらである。候補ペプチドは、そのようなポリペプチドの断片である。したがって、例えば、黒色腫細胞については、候補ポリペプチドは、チロシナーゼ、またはＭＡＲＴファミリーの分子の構成員でよく；結腸癌については、癌胎児性抗原；前立腺癌については、前立腺特異抗原；乳癌または卵巣癌については、ＨＥＲ２／ｎｅｕ；卵巣癌については、ＣＡ−１２５；または、ほとんどの癌腫については、ムチン−１（ＭＵＣ１）でよい。
【０１５３】
他方、融合細胞を生成するために用いられる非樹状細胞が、感染細胞または病原体由来のポリペプチドを発現するように遺伝子操作された細胞であった場合、候補ポリペプチドは、それぞれ適当な感染性微生物によって発現されるもの、またはトランスフェクトされた細胞によって発現されるものである。そのようなポリペプチドの例には、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶまたはＨＴＬＶ）膜糖タンパク質（例えば、ｇｐ１６０）またはｇａｇタンパク質、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼまたは血球凝集素、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓもしくはｌｅｐｒａｅのタンパク質、または原生動物（例えば、ＰｌａｓｍｏｄｉｕｍまたはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）のタンパク質が含まれる。ポリペプチドは、本明細書に記載される他の微生物からのものであってもよい。試験されるペプチドは、例えば、関心の完全長ポリペプチドの様々な断片に相当する一連のペプチド、例えば、一団で配列全体をカバーする重複配列を有するペプチドであってよい。試験されるペプチドは、任意の長さであることができる。エフェクター細胞のＭＨＣクラスＩ制限応答を試験する場合、それらは、好ましくは長さが７〜２０個（例えば、８〜１２個）のアミノ酸である。他方、ＭＨＣクラスＩＩ制限応答の場合、ペプチドは、好ましくは長さが１０〜３０個（例えば、１２〜２５個）のアミノ酸である。
【０１５４】
あるいは、ペプチドのランダムなライブラリーを試験することができる。適当なエフェクター細胞で陽性応答を引き出すそれらの配列を、タンパク質配列データベースと比較することによって、ペプチド配列を含むポリペプチドを同定することができる。関連するポリペプチドまたは同定されたペプチド自体は、対応する疾患のための候補治療薬またはワクチン剤となるであろう（下記参照）。
【０１５５】
ポリペプチドおよびペプチドは、当技術分野で公知である様々な手段によって作製することができる。より小さなペプチド（長さが５０個未満のアミノ酸）は、標準の化学手段によって都合よく合成することができる。さらに、ポリペプチドおよびペプチドの両方は、適当なポリペプチドまたはペプチドをコードするヌクレオチド配列を用いて、標準のインビトロ組換えＤＮＡ技術、およびインビボ遺伝子改変（例えば、遺伝子導入）によって生成することができる。当業者に周知である方法を用いて、関連するコード配列および適当な転写／翻訳調節シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年）に記載の技術を参照。
【０１５６】
ペプチドおよびポリペプチドを発現させるために、様々な宿主−発現ベクター系を用いることができる。そのような宿主−発現系は、関心のポリペプチドを生成し、その後精製することができる媒体を表すだけでなく、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされると、インサイツで、関連するペプチドまたはポリペプチドを生成することができる細胞も表す。これらには、それらに限定されないが、ペプチドまたはポリペプチドコード配列を含む組換え体バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された、細菌などの微生物、例えばＥ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ；適当なコード配列を含む組換え体酵母発現ベクターで形質転換された酵母、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＰｉｃｈｉａ；組換え体ウイルス発現ベクター、例えばバキュロウイルスに感染させた昆虫細胞系；適当なコード配列を含む組換え体ウイルス発現ベクター、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）またはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に感染させたか、組換え体プラスミド発現ベクター、例えばＴｉプラスミドで形質転換された植物細胞系；または、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター、例えばメタロチオネインプロモーター、または、哺乳動物のウイルスに由来するプロモーター、例えばアデノウイルス後期プロモーターもしくはワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターを含む組換え体発現構築物を抱える哺乳動物細胞系、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３または３Ｔ３が含まれる。
【０１５７】
本発明のペプチドには、上記のものが含まれるが、関連するペプチドのインビボでの生存を促進するために、アミノ末端およびＣ末端の片方または両方でのブロッキング剤の付加によって、インビボ使用のために修飾される。これは、ペプチド末端が細胞またはミトコンドリアによる取込みの前にプロテアーゼによって分解される傾向がある状況で、有用であろう。そのようなブロッキング剤には、投与されるペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端残基に結合することができる、追加の関連するペプチドまたは無関係なペプチドの配列を含めることができるが、これらに限定されない。これは、ペプチドの合成の間に化学的に、または、当業者がなじんでいる方法による組換えＤＮＡ技術によって実行することができる。あるいは、ピログルタミン酸または当技術分野で公知である他の分子などのブロッキング剤を、アミノおよび／またはカルボキシル末端残基に結合することができるか、または、アミノ末端のアミノ基もしくはカルボキシル末端のカルボキシル基を異なる部分で置換することができる。同様に、投与の前に、ペプチドを薬学的に許容される「担体」タンパク質に、共有結合または非共有結合で結合することができる。
【０１５８】
ペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計されるペプチド様化合物にも、関心がある。ペプチド様化合物は、選択されるペプチドの三次元の立体配座と実質的に同じである三次元の立体配座を有する合成化合物（すなわち、「ペプチドモチーフ」）である。ペプチドモチーフは、そのペプチド様物質が由来するペプチドまたはポリペプチドのそれと質的に同じ方法でＴ細胞を活性化する能力を有するペプチド様化合物を提供する。ペプチド様化合物は、細胞透過性の増加および長期生物学的半減期などの、それらの治療的有用性を高める追加の特性を有することができる。
【０１５９】
一般的に、ペプチド様物質は、部分的または完全に非ペプチドであるが、そのペプチド様物質が基づくペプチドで出現するアミノ酸残基の側鎖と同一である側鎖を有する骨格を有する。数種類の化学結合、例えば、エステル、チオエステル、チオアミド、レトロアミド、還元カルボニル、ジメチレンおよびケトメチレン結合は、一般に、プロテアーゼ耐性ペプチド様物質の構築において、ペプチド結合の有用な代用法であることが当技術分野で公知である。
【０１６０】
ワクチン
本明細書で記載される教育され、増殖したＴ細胞集団および方法は、細胞ベースのワクチンを開発するために用いることもできる。本発明による抗原特異的な免疫エフェクター細胞を含むワクチンが、本発明によってさらに提供される。本明細書に記載の抗原特異的な免疫エフェクター細胞を利用する、エピトープまたは配列モチーフなどの抗原またはその断片を含むワクチンが、本発明によってさらに提供される。ワクチンの投与方法は当技術分野で公知であり、ワクチンは、許容される薬用担体と組み合わせることができる。サイトカインおよび／または同時刺激分子の有効な量も、ワクチンに加えて投与することができる。
【０１６１】
本発明によるポリヌクレオチド、遺伝子およびコードされるペプチドおよびタンパク質をさらにクローニングして、インビトロまたはインビボで発現させることができる。宿主細胞発現系から生成および単離されるタンパク質およびポリペプチドも、本発明の範囲内である。これらのポリヌクレオチドおよび遺伝子を含む発現およびクローニングベクターならびに宿主細胞、ならびに、それらを有効な量で対象に投与する方法も本明細書で請求される。これらの配列に対応するペプチドは、組換え技術によって生成することができ、それらはワクチンとして対象に投与すること、あるいは、ＡＰＣに導入し、それを今度は有効な量で対象に投与することができる。遺伝子を用いてタンパク質を生成し、それを今度はＡＰＣにパルス適用するために用いることができる。次に、ＡＰＣを用いて、ＣＴＬなどの免疫エフェクター細胞を増殖させることができる。パルス適用したＡＰＣおよび増殖したエフェクター細胞は、組成物の有効量を対象に投与することによって、免疫療法のために用いることができる。
【０１６２】
以下の実施例は、本発明の組成物および方法を例示するためのものであり、限定するものではない。
【実施例】
【０１６３】
（実施例１）：ＤＣおよび腫瘍およびＤＣ／腫瘍融合細胞調製物の生成
ＤＣは、正常な供与体から得られたロイコパックコレクションから単離された、接着性単核細胞から生成された。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）−１０７７密度勾配遠心法によって、正常な供与体からのロイコパックから単離した。ＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ １６４０完全培地に１×１０^６／ｍｌで懸濁させ、６ウェル組織培養プレートに５ｍｌの一定量で平板培養し、５％ＣＯ_２の加湿インキュベータ内において３７℃で２時間インキュベートした。単球濃縮接着性分画を、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ １６４０完全培地で５日間培養して、未熟なＤＣを生成した。ＴＮＦα（２５ηｇ／ｍｌ）の存在下で細胞をさらに４８時間培養することによって、ＤＣ調製物を成熟させた。
【０１６４】
腎癌（「ＲＣＣ」）細胞系ＲＣＣ７８６を、ＲＰＭＩ １６４０培地で維持した。施設承認のプロトコルに従って、急性骨髄性白血病患者から得た骨髄穿刺液または末梢血採取物から、骨髄性白血病細胞を得た。白血病細胞をフィコール密度遠心分離によって単離し、ＲＰＭＩ １６４０完全培地で培養した。下で概説するように、ＤＣおよび腫瘍細胞を、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学による表現型分析にかけた。
【０１６５】
融合細胞を生成するために、腫瘍細胞を１：１〜１：３（細胞収量に依存する）の比でＤＣ調製物と混合し、無血清ＲＰＭＩ １６４０培地で３回洗浄した。最終洗浄の後、細胞ペレットを１ｍｌの５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液に再懸濁させた。室温で２分後に、ＰＥＧ溶液を段々と希釈し、細胞を無血清培地で２回洗浄した。ＤＣ−腫瘍融合細胞を、ＧＭ−ＣＳＦの存在下でＲＰＭＩ完全培地で培養した。ＤＣ／腫瘍融合は、特異なＤＣおよび腫瘍抗原を発現する細胞のパーセントを免疫組織化学的分析によって測定することによって定量した。
【０１６６】
免疫組織化学的分析によるＤＣ、腫瘍および融合細胞調製物の分析
ＤＣ、腫瘍および融合細胞調製物は、腫瘍関連抗原ならびにＤＣ関連同時刺激および成熟マーカーの存在について評価するために、免疫細胞化学分析にかけた。ＲＣＣ細胞を、ＭＵＣ１（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、サイトケラチン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）およびＣＡＭ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）に対する、マウスの一次モノクローナル抗体（ｍＡｂ）による染色にかけた。骨髄性白血病細胞を、ＣＤ３４、ＣＤ１１７およびＭＵＣ１について染色した。下で概説するＤＣマーカーの非存在が、確認された。（図１Ｂを参照）。ＤＣ調製物を、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８３またはＣＤ８６（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）およびアイソタイプをマッチさせた陰性対照のための染色に６０分間かけた。（図１Ａを参照）。細胞をウマ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のビオチン化Ｆ（ａｂ’）２断片と４５分間インキュベートし、ＰＢＳで２度洗浄し、ＡＢＣ（アビジン−ビオチン複合体）試薬液、および続くＡＥＣ（３アミノ−９−エチルカルバゾール）溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と３０分間インキュベートした。融合細胞調製物では、ＡＢＣ試薬による腫瘍関連抗原の検出に続いて、ＡＢＣ−ＡＰ（アルカリホスファターゼ）キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によるＤＣ関連マーカーのための染色を行った。スライドを洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、オリンパスＡＸ７０顕微鏡を用いて分析した。融合は、特異なＤＣおよび腫瘍抗原を同時発現する細胞のパーセントを測定することによって定量した。（図１Ｃを参照）。
【０１６７】
フローサイトメトリー分析
上で概説した抗原の発現について評価するために、ＤＣ、腫瘍および融合細胞調製物をフローサイトメトリー分析にもかけた。細胞を、指示された一次ｍＡｂまたはマッチさせたアイソタイプ対照と、４℃で３０分間インキュベートした。結合した一次ｍＡｂは、二次親和性精製ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｌ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）で検出し、続いて２％パラホルムアルデヒドで固定した。二次元フローサイトメトリーのために、細胞を、腫瘍関連抗原（ＲＣＣ−ＭＵＣ１、ＣＡＭまたはサイトケラチン、ＡＭＬ−ＣＤ３４、ＣＤ１１７またはＭＵＣ１）に対する抗体、ＦＩＴＣ結合二次抗体、およびＰＥとコンジュゲートさせたＤＲまたはＣＤ８６に対する抗体とインキュベートした。分析は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で実施した。
【０１６８】
（実施例２）：ＤＣ／腫瘍融合および／または抗ＣＤ３／ＣＤ２８によるＴ細胞刺激および増殖
ＤＣ生成のために用いたロイコパックコレクションから非接着性ＰＢＭＣを単離し、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下のＲＰＭＩ完全培地において１×１０^６／ｍｌの密度で培養した。Ｔ細胞は、ナイロンウール分離によって単離した。Ｔ細胞を、固定化モノクローナル抗体、抗ＣＤ３（クローン−ＵＣＨＴ１；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および抗ＣＤ２８（クローン−ＣＤ２８．２；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；ＣＤ３ｉ／ＣＤ２８ｉ）に曝露させた。２４ウェル非組織培養処理プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｉｓｈｅｒ）を抗体（ＰＢＳに１μｇ／ｍｌ）の各々でコーティングし、３７℃で一晩放置した。Ｔ細胞を：１）抗ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングしたプレート上で４８時間培養した；２）１：１０の融合対Ｔ細胞の比率で、融合細胞と５日間共培養した；３）融合細胞、およびその後抗ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングしたプレートと４８時間共培養した；または４）抗ＣＤ３／ＣＤ２８と４８時間培養し、その後、融合で５日間刺激した。刺激の後、下で概説するように、Ｔ細胞を表現型分析にかけた。
【０１６９】
刺激されたＴ細胞集団の増殖
刺激の後、Ｔ細胞を収集し、培養期間の終わりの１８時間前に各ウェルに加えた［^３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／ウェル；３７ｋＢｑ；ＮＥＮ−ＤｕＰｏｎｔ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）の取込みで増殖を測定した。その後、自動ＴＯＭＴＥＣハーベスター（Ｍａｃｈ ＩＩ、Ｈａｍｄｅｎ ＣＴ）を用いてガラス繊維ろ紙（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）の上に細胞を収集し、乾燥させ、１０ｍｌのＳｃｉｎｔｉＶｅｒｓｅ（登録商標）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ、ＮＪ）を含むＢｅｔａＰｌａｔｅ試料バッグ（Ｗａｌｌａｃ）中に入れて密封した。細胞に結合した放射活性を、液体シンチレーション計数器（Ｗａｌｌａｃ、１２０５Ｂｅｔａｐｌａｔｅ（商標））で計数した。（図２を参照）。データを、刺激指数（「ＳＩ」）で表す。ＳＩは、未刺激Ｔ細胞集団のバックグラウンド［^３Ｈ］−チミジン取込み（トリプリケートの平均値）に対する［^３Ｈ］−チミジン取込み（トリプリケートの平均値）の比率を計算することによって測定した。Ｔ細胞は、ＤＣ／ＲＣＣ融合または抗ＣＤ３／ＣＤ２８単独への曝露の後に有意な増殖を示さず、ＳＩはそれぞれ０．９および１．０であった（Ｎ＝９）。対照的に、ＤＣ／ＲＣＣ融合による刺激とそれに続くＣＤ３／ＣＤ２８への曝露は、Ｔ細胞増殖の劇的で相乗的増加をもたらし、ＳＩは１３．２であった（融合単独による刺激と比較してｐ＝０．０３）。（図２Ａを参照）。留意すべきは、融合細胞による刺激の前の抗ＣＤ３／ＣＤ２８への曝露は、Ｔ細胞増殖を誘導しなかった（ＳＩ １．０）。
【０１７０】
融合細胞、抗ＣＤ３／ＣＤ２８または、融合とそれに続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激によって刺激したＴ細胞を、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ）、記憶（ＣＤ４５ＲＯ）、活性化（ＣＤ６９、ＩＦＮγ）または調節（Ｆｏｘｐ３、ＩＬ−１０）Ｔ細胞の存在について評価するために、多チャネルフローサイトメトリーによる表現型分析にかけた。細胞を洗浄し、ブロック緩衝剤（１０％ヒトＩｇＧ；Ｓｉｇｍａ）とインキュベートし、ＦＩＴＣ結合ＣＤ４またはＣＤ８、およびＰＥ結合ＣＤ４５ＲＡまたはＣＤ４５ＲＯとインキュベートした。Ｔ細胞調製物を、ＦＩＴＣ結合ＣＤ４、シトクロム結合ＣＤ２５およびＰＥ結合ＣＤ６９（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）について染色した。あるいは、細胞をＣＤ４／ＣＤ２５について染色し、次に、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍプラス（商標）（ホルムアルデヒドおよびサポニンを含む）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）でのインキュベーションによって透過性化した。次に、細胞をＰＥ結合抗ヒトＩＦＮγ、ＩＬ−１０またはＦｏｘｐ３（Ｃａｌｔａｇ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）、またはマッチさせたアイソタイプ対照抗体とインキュベートし、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）溶液で洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてフローサイトメトリーによって分析した。
【０１７１】
ＤＣ／ＲＣＣ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による複合刺激の、ナイーブな細胞および記憶細胞の相対的な増殖に対する効果を、その後研究した。（図２Ｂを参照）。４つの連続した研究で、未刺激Ｔ細胞は０．９のＣＤ４５ＲＯ／ＣＤＲＡ比を示し、それは、総ＣＤ４＋Ｔ細胞集団のそれぞれ２１％および２４％の平均レベルを表す。ＤＣ／ＲＣＣ融合による刺激はこの比率を変化させず、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの平均レベルはそれぞれ１７％および２２％であった（比率０．８）。抗ＣＤ３／ＣＤ２８へのＴ細胞の曝露は、ＣＤ４５ＲＡ細胞の相対的な抑制をもたらし、それはＴ細胞集団の９％に相当したが、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞はほとんど不変であった（２４％）。
【０１７２】
対照的に、ＤＣ／ＲＣＣ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激は、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞の増殖をもたらし、それはＴ細胞の４０％に相当し、ＣＤ４５ＲＡレベルはより控え目な枯渇を示した（２．９のＣＤ４５ＲＯ／ＣＤ４５ＲＡ比）。抗ＣＤ３／ＣＤ２８への最初の曝露と続くＤＣ／ＲＣＣ融合への曝露は、ＣＤ４５ＲＯ集団の増殖をもたらさなかった（２３％の平均レベル）が、ＣＤ４５ＲＡ細胞の平均レベルの低下が観察された。これらのデータは、ＤＣ／ＲＣＣ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激が、記憶エフェクター細胞を特異的に増殖させることを示唆する。
【０１７３】
調節Ｔ細胞と比較した活性化Ｔ細胞の刺激
ＤＣ／ＲＣＣ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による複合刺激が、調節Ｔ細胞と比較して活性化Ｔ細胞の増殖をもたらしたかの判定もした。これらの２つのＴ細胞集団は、ＣＤ４およびＣＤ２５を同時発現する。活性化Ｔ細胞は高レベルのＣＤ６９を特徴的に発現するが、Ｆｏｘｐ３は、調節Ｔ細胞の比較的特異的なマーカーであることが分かった。ＤＣ／ＲＣＣ融合、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、またはこれらの剤による逐次的な刺激によって刺激されたＴ細胞の表現型特性を調べた。（図３を参照）。１１回の実験で、ＤＣ／ＲＣＣ融合単独による刺激の後に、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋の控え目な増加が観察された。総Ｔ細胞集団のＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞の平均パーセントは、２．８％から６．４％に増加した。同様に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８単独によるＴ細胞の刺激の後に、ＣＤ４^＋細胞の７．８％は、ＣＤ４およびＣＤ２５の同時発現を示した。
【０１７４】
対照的に、ＤＣ／ＲＣＣ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激の後にＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞の平均パーセントの著しい増加が観察され、総Ｔ細胞集団の２５．３％のレベルに到達した（未刺激Ｔ細胞、融合によって刺激されたＴ細胞および抗ＣＤ３／ＣＤ２８単独によって刺激されたＴ細胞と比較してそれぞれｐ＝０．００１、０．０２および０．００２）。抗ＣＤ３／ＣＤ２８とそれに続く融合細胞による刺激がわずか１０％のＣＤ４＋／ＣＤ２５＋発現細胞（融合とそれに続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８による刺激と比較してｐ＝０．００８）をもたらしたという点で、曝露の順番が重要であった。
【０１７５】
ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞の性質をさらに明確にするために、ＣＤ４／ＣＤ２５集団が活性化または抑制のマーカーを発現するかどうかを判定するために、多チャネルフローサイトメトリー分析を実施した。（図３を参照）。ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞をＦＡＣＳゲーティングによって単離し、ＣＤ６９およびＦｏｘｐ３の発現を測定した。結果を、全ＣＤ４／ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団に対する活性化Ｔ細胞または調節Ｔ細胞のパーセントとして提示した。ＤＣ／ＲＣＣ融合単独または抗ＣＤ３／ＣＤ２８単独によるＴ細胞の刺激は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋細胞で定義される活性化Ｔ細胞のパーセントのそれぞれ５倍および６倍の増加をもたらした。注目すべきことに、融合細胞とそれに続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激の後に、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋細胞のパーセントの４２倍の増加が観察され、それによって、抗ＣＤ３／ＣＤ２８単独（６倍の増加、ｐ＝０．０１）、融合細胞単独（５倍の増加、ｐ＝０．０５）、または抗ＣＤ３／ＣＤ２８増殖とそれに続く融合による刺激の後（９倍の増加、ｐ＝０．０２）と比較して、統計的に有意な増加が実証された。
【０１７６】
同様に、ＤＣ／ＲＣＣ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８の複合刺激の、ＣＤ４、ＣＤ２５およびＦＯＸＰ３を同時発現する細胞によって定義される調節Ｔ細胞の増殖に対する効果も調べた。（図３を参照）。９回の実験で、ＤＣ／腫瘍融合ワクチンによる刺激とそれに続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８による増殖の組合せは、調節Ｔ細胞の１５倍の増殖をもたらし、それは、融合単独（１．９倍、ｐ＝０．００８）、抗ＣＤ３／ＣＤ２８単独（１．７倍、ｐ＝０．００４）または抗ＣＤ３／ＣＤ２８および融合による逐次的な刺激（３．４倍、ｐ＝０．０３）による刺激の後に観察されたものよりも統計学的に大きかった。これらのデータは、ＤＣ／ＲＣＣ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激が、ＤＣ／ＲＣＣ単独または抗ＣＤ３／ＣＤ２８単独で観察されたものをはるかに超えて、Ｔ細胞増殖および活性化Ｔ細胞の増殖を相乗的に誘導することを示唆する。さらに、Ｔ細胞をＤＣ／ＲＣＣ融合で最初に刺激したときにこの結果が特異的に観察され、抗ＣＤ３／ＣＤ２８複合体の連結によって生成される抗原非依存性増殖の前に、ＤＣ媒介抗原特異的刺激が重要であることが示唆された。留意すべきは、ＤＣ／ＲＣＣ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による複合刺激は、より低い程度ではあるが調節Ｔ細胞のパーセントも増加させた。
【０１７７】
ＭＵＣ１四量体への結合による腫瘍特異的免疫応答およびグランザイムＢ発現による細胞溶解能力の評価
抗原特異的ＭＵＣ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、それぞれＭＵＣ１特異的エピトープＭ１．２（ＭＵＣ１_{１２〜２０}）ＬＬＬＬＴＶＬＴＶ（配列番号１）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）に結合している４つのＨＬＡ ＭＨＣクラスＩ分子で構成される、フィコエリトリン（ＰＥ）標識ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１^＋ｉＴＡｇ（商標）ＭＨＣクラスＩヒト四量体複合体を用いて同定した。対照ＰＥ標識四量体を、平行して用いた。抗ＣＤ３／ＣＤ２８、融合、または抗ＣＤ３／ＣＤ２８および融合への逐次的な曝露によって刺激したＴ細胞を、ＭＵＣ１または対照四量体とインキュベートし、次に、ＦＩＴＣ結合ＣＤ８抗体で染色した。細胞を洗浄し、二次元ＦＡＣＳ分析によって分析した。刺激されたＴ細胞集団の細胞溶解能力を、ＦＩＴＣ結合ＣＤ８およびＰＥ結合グランザイムＢによる染色によって評価した。合計３×１０^５個の事象を、最終分析のために収集した。同様に、非接着性未刺激細胞を、平行して分析した。
【０１７８】
刺激されたＴ細胞集団の機能的特性
Ｔ細胞集団の機能的特性をさらに特徴づけるために、融合細胞、抗ＣＤ３／ＣＤ２８またはそれらの組合せによって刺激されたＴ細胞による、Ｔｈ−１およびＴｈ−２サイトカインの細胞内発現を特定した。８回の連続した検査で、ＩＦＮγの細胞内発現が、未刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の０．５％で観察された。抗ＣＤ３／ＣＤ２８またはＤＣ／ＲＣＣ融合単独による刺激の後、ＩＦＮγ発現Ｔ細胞の平均パーセントは、それぞれ１．７％および１．８％に上昇した。対照的に、ＤＣ／ＲＣＣ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激は、ＩＦＮγ発現細胞の平均レベルの統計的に有意な増加をもたらし（それぞれ抗ＣＤ３／ＣＤ２８または融合による刺激と比較して４．７％、ｐ＝０．０５）、それは、未刺激Ｔ細胞と比較して１０．５倍の増加に相当する（ｐ＝０．００８）（図１６）。抗ＣＤ３／ＣＤ２８単独によるＴ細胞の刺激は、ＩＬ−４の細胞内発現を示すＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセントの、１．０％から２．４％への増加をもたらした。対照的に、ＤＣ／ＲＣＣ融合単独への曝露またはＤＣ／ＲＣＣ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激は、ＩＬ−４発現の増加をもたらさなかった（それぞれ０．９％および０．６％）。ＩＬ−１０の平均細胞内発現は、ＤＣ／ＲＣＣ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による刺激の後、０．９から３．４％に増加した。比較では、ＤＣ／ＲＣＣ融合単独による刺激の後、ＩＬ−１０発現のいかなる増加も観察されなかった。これらのデータは、ＤＣ／ＲＣＣ融合による逐次的な刺激が、ＩＦＮγを発現する活性化エフェクター細胞の増殖を誘導し、ＩＬ−１０を発現するＴ細胞の増加は比較的より控え目であることを示唆する。
【０１７９】
細胞溶解能力を有する腫瘍反応性Ｔ細胞の増殖
ＤＣ／ＲＣＣ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激が、腫瘍反応性リンパ球の選択的な増殖をもたらしたかどうかを判断するために、腫瘍関連抗原、ＭＵＣ１に特異的なＴ細胞が増殖後に増加したかどうかを調べた（図１７）。この分析のために、ＤＣおよびＴ細胞を、ＨＬＡ−Ａ２．１供与体から単離した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８単独による刺激の後に、ＣＤ８集団のわずか０．９３％がＭＵＣ１四量体に結合した。対照的に、ＤＣ／ＲＣＣ融合との共培養は、ＭＵＣ１四量体＋細胞の増加（２．３％）をもたらした。留意すべきは、ＤＣ／ＲＣＣ融合とそれに続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激は、ＭＵＣ１四量体＋細胞の劇的な増加をもたらした（１７．３％、融合または抗ＣＤ３／ＣＤ２８単独による刺激と比較してそれぞれｐ＝０．０２および０．００４）。対照的に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８による非特異的刺激とそれに続く融合との共培養は、ＭＵＣ１四量体＋細胞の増殖を誘導しなかった（０．１９％）。これらのデータは、ＤＣ／ＲＣＣによる抗原特異的刺激剤への最初の曝露が、抗ＣＤ３／ＣＤ２８を用いる腫瘍反応性Ｔ細胞の以降の増殖のために重要であったことを示唆する。
【０１８０】
その後、ＤＣ／ＲＣＣ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８によって刺激したＴ細胞が、グランザイムＢの発現によって明示される細胞溶解能力を実証するかどうかを調べた。グランザイムの発現は、パーフォリン媒介性の標的細胞の殺傷を示す活性細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞で上方制御される。ＤＣ／ＲＣＣ融合による刺激は、グランザイムを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の５．６倍の増加をもたらした（図１８）。抗ＣＤ３／ＣＤ２８への曝露は、グランザイム＋細胞のわずか２倍の増加をもたらした。しかし、ＤＣ／ＲＣＣ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激は、グランザイム＋細胞の２１倍の増殖を誘導した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８への一次曝露とそれに続くＤＣ／ＲＣＣ融合への曝露は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８単独による刺激の後に観察されたものと比較して、グランザイム＋細胞のさらなる増殖をもたらさなかった。これらのデータは、ＤＣ／ＲＣＣ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激が、機能的に強力な細胞傷害性Ｔリンパ球の増殖において特異的に有効であることを示唆する。
【０１８１】
ＤＣ／ＡＭＬ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による刺激
その後、患者由来の急性骨髄性白血病試料を用いたＤＣ／腫瘍融合、および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激を受けたＴ細胞の表現型特性を調べた。高レベルの循環疾患を有する患者の末梢血または骨髄から骨髄性白血病細胞を得、正常なロイコパックコレクションから生成されたＤＣと融合させた。ＤＣ／ＡＭＬ融合は、ＤＣ（ＣＤ８６）および骨髄性白血病に特異な抗原（ＣＤ１１７−ｃｋｉｔリガンド、ＣＤ３４および／またはＭＵＣ１）を同時発現した細胞のパーセントの測定に従って定量化した（図１９）。平均融合効率は、総細胞集団の２８％であった。ＤＣ／ＡＭＬ融合は自己由来Ｔ細胞の控え目な増殖を誘導し、ＳＩは３．３で、記憶エフェクター細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋）は総Ｔ細胞集団の１０％を構成した。ＤＣ／ＡＭＬ融合とそれに続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激は、Ｔ細胞増殖の統計的に有意な上昇（ＳＩ８．２）をもたらし、その３９％はＣＤ４５ＲＯを発現した（図２０）。同様に、ＤＣ／ＡＭＬ融合とそれに続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激の後に、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞の上昇が観察された（９．３％に対してＤＣ／ＡＭＬ融合単独による刺激の後に２．７％）。さらに、融合細胞との共培養に続いて抗ＣＤ３／ＣＤ２８に曝露させたとき、増加したパーセントのＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞がＩＦＮγを発現した。Ｆｏｘｐ３＋細胞のパーセントの上昇も観察されたが、これは統計的有意性を満たさなかった。ＤＣ／ＡＭＬ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激は、ＣＤ８＋集団の１３％でグランザイムＢ発現を誘導した。対照的に、融合細胞単独、または抗ＣＤ３／ＣＤ２８とそれに続く融合による刺激は、ＣＤ８＋細胞の２．５％および２．７％でグランザイムＢ発現をもたらした。ＲＣＣモデルで観察された結果に類似して、これらのデータは、ＤＣ／ＡＭＬ融合による刺激とそれに続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８への曝露が、細胞溶解能力を有する活性化Ｔ細胞の有意な増加をもたらしたことを実証する。
【０１８２】
（実施例３）：乳癌との樹状細胞の融合
単球由来のＤＣの生成
施設によって承認されたプロトコルに従って、正常な供与体からのロイコパック、および乳癌患者から収集された末梢静脈血から、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。試料をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）−１０７７（Ｓｉｇｍａ）密度勾配遠心法にかけ、５％ＣＯ_２加湿インキュベータ内の組織培養フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中の、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）を含有し、熱不活性化１０％ヒトＡＢ雄血清（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（完全培地）に、３７℃で２時間平板培養した。単球濃縮接着性分画を、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）（Ｂｅｒｌｅｘ、Ｗａｙｎｅ／Ｍｏｎｔｖｉｌｌｅ、ＮＪ）およびＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を含有する完全培地で５日間培養して、未熟なＤＣを生成した。ＤＣ調製物の分画を、ＴＮＦα（２５ηｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、またはＴＮＦα（２５ηｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（１０ηｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＰＧＥ_２（１μｇ／ｍｌ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からなるサイトカインの組合せの存在下でさらなる４８時間細胞を培養することによって、さらに成熟させた。成熟は、４８〜９６時間のＴＮＦαへの曝露によって効果的に誘導され、ＣＤ８０およびＣＤ８３の発現の増加がもたらされた。（図４Ａを参照）。１５回の連続した実験で、未熟のおよび成熟したＤＣ調製物は、同時刺激分子、ＣＤ８６を強く発現し（それぞれ７５％および８４％）、ＣＤ１４の低いレベルの発現を示した。（図４Ｂを参照）。しかし、成熟したＤＣは、ＣＤ８０（２０％対９％、ｐ＝０．０５）およびＣＤ８３（３１％対７％、ｐ＝０．０００３）の平均発現の統計的に有意な増加を示した。抗原提示細胞としてのそれらの機能的能力の尺度として、ＤＣ調製物を、同種異系Ｔ細胞増殖を刺激するそれらの能力について調べた。連続した研究で、未熟なＤＣとの比較で、成熟ＤＣは同種異系Ｔ細胞の高いレベルの増殖を刺激した。
【０１８３】
Ｔ細胞の単離および培養
Ｔ細胞濃縮カラム（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはナイロンウールカラム（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）を用いて、非接着性ＰＢＭＣ分画からＴ細胞を単離した。両方の方法によるＴ細胞の純度は、ＣＤ３表面発現のＦＡＣＳ分析による測定で、９０％を超えた。Ｔ細胞は、第三者供与体に由来する場合は同種異系に、ＤＣ融合パートナーが由来するのと同じ供与体に由来する場合は自己由来に分類された。
【０１８４】
腫瘍細胞の単離および培養
施設によって承認されたプロトコルに従って、一次乳癌細胞を悪性の滲出液または切除された腫瘍病巣から得た。ヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７およびＺＲ７５−１を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。すべての腫瘍細胞系を、ＤＭＥＭ（高グルコース）、または２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を添加したＲＰＭＩ １６４０で維持した。
【０１８５】
ＤＣ／乳癌融合細胞の調製
腫瘍細胞を１：３〜１：１０（細胞収量に依存する）の比で未熟もしくは成熟ＤＣ調製物と混合し、前もって加温した無血清ＲＰＭＩ １６４０培地で３回洗浄した。細胞ペレットを、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液（分子量：１４５０）／ＤＭＳＯ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に再懸濁した。室温で３分後に、前もって加温した無血清ＲＰＭＩ培地でＰＥＧ溶液を段々と希釈し、無血清培地で２回洗浄した。融合調製物を、ＧＭ−ＣＳＦ（５００ＩＵ／ｍｌ）を含む完全培地で、５％ＣＯ２において３７℃で５〜７日間培養した。
【０１８６】
フローサイトメトリーによるＤＣ、乳癌およびＤＣ／乳癌融合調製物の特性評価
未熟および成熟ＤＣで生成された融合細胞集団の表現型特性を、調べた。未熟および成熟ＤＣ集団を、ＰＥＧとの共培養によって、患者由来の一次乳癌細胞またはＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞系と融合させた。ＤＣおよび乳癌細胞を、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＭＵＣ−１、サイトケラチン、およびマッチさせたアイソタイプ対照（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ−Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に対する一次マウス抗ヒトモノクローナル抗体とインキュベートし、洗浄し、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ_１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ−Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）と培養した。細胞を２％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で固定し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェア（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、フローサイトメトリー分析にかけた。ＤＣ／乳癌融合調製物を、特異なＤＣ（ＣＤ１１ｃ−Ｃｙｃｈｒｏｍｅ）および腫瘍抗原（ＭＵＣ−１またはサイトケラチン−ＦＩＴＣ）を同時発現した細胞のパーセントを定量化するために、二重染色にかけた。融合細胞は、特異な腫瘍（ＭＵＣ−１および／またはサイトケラチン）およびＤＣ（ＣＤ１１ｃ）抗原を同時発現した細胞のパーセントを測定することによって定量化した。
【０１８７】
約１．２×１０^４個の細胞を遠心させてスライド（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ（登録商標）、Ｓｈａｎｄｏｎ Ｌｉｐｓｈａｗ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）の上に置き、乾燥させ、アセトンで固定した。スライドを、一次マウス抗ヒトｍＡｂ ＭＵＣ−１およびサイトケラチンおよびアイソタイプをマッチさせた陰性対照と室温で１時間インキュベートし、洗浄し、ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）の１：１００のビオチン化Ｆ（ａｂ’）２断片とインキュベートし、洗浄し、ＡＢＣ（アビジン−ビオチン複合体）試薬液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とそれに続くＡＥＣ（３アミノ−９−エチルカルバゾール）溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と３０分間インキュベートした。次に、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６またはＣＤ８３のために、細胞をＡＢＣ−ＡＰ（アルカリホスファターゼ）キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色した。スライドを洗浄し、２％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で固定し、オリンパスＡＸ７０顕微鏡（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を用いて分析した。
【０１８８】
融合細胞をＦＡＣＳゲーティングにより単離し、ＣＣＲ７、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはＣＤ８３に対するＰＥ結合マウス抗ヒト抗体で染色した。これらのマーカーを発現する滲出細胞のパーセントは、多チャネルフローサイトメトリー分析によって測定した。あるいは、融合細胞の一定分量にＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（１μｇ／ｍｌ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をパルス適用し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍプラス（商標）（ホルムアルデヒドおよびサポニンを含む）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中でのインキュベーションによって透過性にし、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）溶液（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で洗浄した。次に、細胞をＰＥ結合抗ヒトＩＬ−１０またはＩＬ−１２（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ−Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）、またはマッチさせたアイソタイプ対照抗体と３０分間インキュベートし、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）溶液で２回洗浄し、２％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で固定した。分析のために、最小限で１×１０^４個の事象を得た。
【０１８９】
１２回の連続した検査で、腫瘍細胞の成熟（１１％±１．６ＳＥＭ）および未熟（７％±１．２ＳＥＭ）ＤＣとの融合の後に、同等の平均融合効率が観察された。融合細胞は、ＤＣおよび腫瘍由来の抗原を同時発現した細胞のＦＡＣＳゲーティングによって単離した。これらの研究では、未熟ＤＣ／乳癌（８９％）および成熟ＤＣ／乳癌（８２％）融合集団の両方で、ＣＤ８６の発現が一様に観察された。（図５Ａ、Ｂを参照）。成熟マーカーＣＤ８３は、未熟および成熟融合細胞集団のそれぞれ４６％および５１％で見られた（ｐ＝０．５、ＮＳ）。（図５Ａおよび５Ｂを参照）。免疫細胞化学染色は、未熟ＤＣ／腫瘍融合による、ＤＲ、ＣＤ８６およびＣＤ８３の顕著な発現を示した。（図５Ｃ〜５Ｆを参照）。これらの試験は、ＤＣおよび乳癌細胞の融合が、成熟および活性化と一貫した表現型特性をもたらすこと、および、ＤＣ分化の阻害に関連しなかったことを証明する。
【０１９０】
未熟および成熟ＤＣ／腫瘍融合によるＩＬ−１２およびＩＬ−１０の発現
抗原提示細胞としてのそれらの効力およびＴＨ１応答を刺激するそれらの能力の尺度として、融合細胞集団によるＩＬ−１２およびＩＬ−１０の発現を調べた。（図６Ａおよび６Ｂを参照）。融合細胞は、ＤＣおよび腫瘍由来の抗原を同時発現した細胞のＦＡＣＳゲーティングによって単離した。成熟および未熟ＤＣならびに乳癌で生成された融合細胞を、１２回の別々の実験で比較した。ＩＬ−１２およびＩＬ−１０を発現する融合細胞の平均パーセントは、融合細胞集団の間で異ならなかった。ＩＬ−１２は、未熟および成熟ＤＣ／乳癌融合のそれぞれ約４０％（±６．７ＳＥＭ）および４９％（±６．３ＳＥＭ）（ｐ＝０．３５、ＮＳ）で、ＩＬ−１０は、それぞれ約３６．３％（±６．４ＳＥＭ）および４０％（±６．４ＳＥＭ；ｎ＝１１）（ｐ＝ＮＳ）で発現された。
【０１９１】
未熟および成熟ＤＣ／腫瘍融合によるＣＣＲ７の発現
ケモカイン受容体ＣＣＲ７は、流入領域リンパ節内のＴ細胞通行部位に細胞移動を誘導し、成熟および活性化を受けるＤＣによって特徴的に発現される。それらの移動能力の尺度として、未熟および成熟ＤＣで生成された融合について、ＣＣＲ７の発現を測定した。（図６Ｃを参照）。ＣＣＲ７は未熟および成熟融合集団の上で顕著に発現され、腫瘍−ＤＣ融合が、成熟し、活性化された表現型の発現をもたらしたことが示唆される。１２回の実験では、平均ＣＣＲ７発現が、未熟および成熟ＤＣ／乳癌融合のそれぞれ３３％（±９ＳＥＭ）および３８％（±７．３ＳＥＭ；ｎ＝１１）で観察された。
【０１９２】
（実施例４）：ＤＣ、腫瘍およびＤＣ／乳癌融合による同種異系Ｔ細胞増殖の刺激
同種異系Ｔ細胞の増殖を刺激するそれらの能力を評価するために、未熟および成熟ＤＣならびにＤＣ／乳癌融合細胞調製物を、９６ウェルＵ底培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）内で、同種異系の正常な供与体由来のＴ細胞と１：１０、１：３０、１：１００、１：３００および１：１０００の比率で、３７℃および５％ＣＯ_２で５日間共培養した。Ｔ細胞の増殖を、培養期間の終わりの１８時間前に各ウェルに加えた［^３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／ウェル；３７ｋＢｑ；ＮＥＮ−ＤｕＰｏｎｔ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）の取込みで測定した。その後、自動ＴＯＭＴＥＣハーベスター（Ｍａｃｈ ＩＩ、Ｈａｍｄｅｎ ＣＴ）を用いてガラス繊維ろ紙（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）の上に細胞を収集し、乾燥させ、１０ｍｌのＳｃｉｎｔｉＶｅｒｓｅ（登録商標）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ、ＮＪ）を含むＢｅｔａＰｌａｔｅ試料バッグ（Ｗａｌｌａｃ）中に入れて密封した。細胞に結合した放射活性を、液体シンチレーション計数器（Ｗａｌｌａｃ、１２０５Ｂｅｔａｐｌａｔｅ（商標））で計数した。データを、刺激指数（ＳＩ）で表す。ＳＩは、未刺激Ｔ細胞集団のバックグラウンド［^３Ｈ］−チミジン取込み（トリプリケートの平均値）に対する［^３Ｈ］−チミジン取込み（トリプリケートの平均値）の比率を計算することによって測定した。
【０１９３】
未熟および成熟ＤＣ／乳癌融合によって刺激されたＴ細胞によるサイトカイン発現
未熟および成熟ＤＣ／乳癌融合と培養されたＴ細胞により分泌されたサイトカインのプロフィールを、サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）キット（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて測定した。未刺激Ｔ細胞、または未融合のＤＣおよび乳癌に曝露させた細胞からの上清は、対照の役目を果たした。上清は細胞回収の前に収集し、−８０℃で凍結させた。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−１βおよびＩＬ−８の濃度は、標準のプロトコルに従って炎症性ＣＢＡキットを用いて定量した。簡潔に、キットは各サイトカインに特異的な捕捉抗体でプレコートされている、異なる蛍光強度（ＦＬ−３）を有する６つのミクロビーズ集団の混合物を提供した。培養上清または提供された標準化サイトカイン調製物を、予備混合されたミクロビーズに加え、次に、二次ＰＥ結合抗体と培養した。個々のサイトカイン濃度をそれらの蛍光強度（ＦＬ−２）によって示し、次に、ＣｅｌｌｑｕｅｓｔおよびＣＢＡソフトウェア（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の標準参照曲線を用いて計算した。アッセイ間の再現性は、３回の別々の実験で３つの異なるレベルのヒト標準の２つの反復試料を用いて評価した。
【０１９４】
未熟ＤＣ／腫瘍融合集団と比較した成熟ＤＣ／腫瘍融合集団の機能的能力は、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン生成を刺激するそれらの能力を比較することによって分析した。融合細胞集団を自己由来のＴ細胞と５日間共培養し、増殖は、終夜パルスの後のトリチウムチミジンの取込みを測定することによって測定した。（図６Ｄを参照）。増殖は、Ｔ細胞刺激指数（ＳＩ）（刺激されたＴ細胞／未刺激Ｔ細胞）で測定した。両未熟および成熟ＤＣ／乳癌融合は自己由来Ｔ細胞の増殖を刺激し、ＳＩはそれぞれ３．３（±１．４ＳＥＭ；ｎ＝６）および３．５（±１．４ＳＥＭ；ｎ＝６）であった。刺激されたＴ細胞集団のサイトカイン分泌は、ＢＤサイトメトリックアレイビーズシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて定量した。（図７を参照）。未熟および成熟ＤＣ／乳癌融合による刺激の後のＩＦＮγの平均レベルは、それぞれ２１８８および２２５２ｐｇ／ｍｌであった。これらのレベルは、未融合の自己由来ＤＣと培養されたＴ細胞で見られるもの（６８５ｐｇ／ｍｌ）よりも、有意に高かった。融合細胞調製物は、上清中のＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２およびＴＮＦαの生成の統計的に有意な増加を誘導しなかった。
【０１９５】
未熟および成熟ＤＣ／乳癌融合による刺激の後のＣＴＬ応答
未熟および成熟ＤＣで生成したＤＣ／乳癌融合細胞調製物を、１：１０の比率で自己由来Ｔ細胞と７〜１０日間共培養した。標準の５時間^５１Ｃｒ放出アッセイで、Ｔ細胞エフェクターに自己由来であるＤＣで生成したＤＣ／乳癌融合を標的細胞として用いた。標的細胞（２×１０^４個の細胞／ウェル）を、^５１クロム（ＮＥＮ−ＤｕＰｏｎｔ）と３７℃で１時間インキュベートし、続いて反復洗浄をした。^５１Ｃｒ放出は、エフェクターおよび標的細胞集団の５時間の共培養の後に定量した。細胞毒性パーセントは、以下の通りに標準のアッセイによるトリプリケートの平均値を使用して計算した：比細胞毒性百分率＝［（試料カウント−自然発生カウント）／（最大カウント−自然発生カウント）］×１００。自然発生放出は、最大^５１Ｃｒ取込みの２５％未満であった。
【０１９６】
腫瘍特異的ＣＴＬ応答およびＭＵＣ−１特異的応答の刺激。
【０１９７】
自己由来の腫瘍または半自己由来の融合標的の溶解が証明するように、両未熟および成熟ＤＣ／腫瘍集団は、かなりのレベルの標的特異的殺滅を生成することができた。１０回の別々の実験では、ＣＴＬ活性は、融合集団の間で異ならなかった。３０：１のエフェクター：Ｔ細胞比率のための平均ＣＴＬ溶解は、成熟および未熟ＤＣ／乳癌融合で刺激されたＴ細胞では２７％であった。（図８Ａを参照）。特異的腫瘍抗原に対して誘導されるＴ細胞応答、ＤＣ／乳癌融合によるＨＬＡ−Ａ２．１＋Ｔ細胞刺激を刺激する融合ワクチンの能力を評価するために、認められたＭＵＣ１を評価した。ＭＵＣ−１四量体に結合しているＣＤ８＋Ｔ細胞の選択的な増殖が、融合細胞刺激の後に観察された。（図８Ｂを参照）。要約すると、ＤＣ／乳癌融合は、同時刺激分子、刺激性サイトカイン、および、それらがＴ活性化部位に移動するのを可能にするケモカイン受容体の強い発現を伴う、活性化表現型を実証する。ＤＣ／乳癌融合は、既定の腫瘍抗原を標的にするＴ細胞の増殖を含む、抗腫瘍ＣＴＬ応答を刺激する。
【０１９８】
四量体染色
抗原特異的ＭＵＣ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それぞれＭＵＣ１特異的エピトープＭ１．２（ＭＵＣ_{１２〜２０}）ＬＬＬＬＴＶＬＴＶ（配列番号１）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）に結合されている４つのＨＬＡ ＭＨＣクラスＩ分子で構成される、フィコエリトリン（ＰＥ）標識ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１^＋ｉＴＡｇ（商標）ＭＨＣクラスＩヒト四量体複合体を用いて同定された。対照ＰＥ標識四量体を、平行して用いた。非接着性細胞をＤＣ／乳癌融合細胞と５日間共培養し、回収し、ＭＵＣ１または対照四量体とインキュベートし、次に、ＦＩＴＣ結合ＣＤ８抗体で染色した。細胞を洗浄し、二次元ＦＡＣＳ分析によって分析した。合計３×１０^５個の事象を、最終分析のために収集した。同様に、非接着性未刺激細胞を、平行して分析した。
【０１９９】
ＤＣ／乳癌融合による刺激への調節Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞の応答の分析
自己由来および同種異系のＴ細胞調製物を、成熟ＤＣ／乳癌融合と１０：１の比率で５日間共培養した。細胞調製物を、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４、シトクロム結合抗ＣＤ２５、およびＰＥ結合抗ＣＤ６９、抗ＧＩＴＲまたは抗ＣＴＬＡ−４とインキュベートした。あるいは、細胞を透過性にし、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−４またはＦＯＸＰ３に対するＰＥ結合抗体と培養した。次に、細胞を多チャネルフローサイトメトリーによって分析した。一部の検査では、ＣＤ４＋Ｔ細胞を磁気ミクロビーズ単離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって単離し、生じた集団をＣＤ２５抗体および指示されたマーカーによる２つの染色方法にかけた。
【０２００】
活性化Ｔ細胞応答を引き出す能力を有する強力な抗原提示細胞としてＤＣ／乳癌融合を特徴付けした後、ワクチン応答を抑制するであろう阻害要素も刺激する融合細胞の能力を調べた。具体的には、ＤＣ／腫瘍融合が、活性化Ｔ細胞と比較して調節Ｔ細胞の増殖を誘導するかどうかを調べた。活性化記憶エフェクター細胞および調節Ｔ細胞の両方はＣＤ４およびＣＤ２５を同時発現するが、調節Ｔ細胞は、それらの比較的高いレベルのＣＤ２５発現、およびＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４およびＦｏｘｐ３などの他のマーカーの存在によって識別することができる。対照的に、ＣＤ６９は、活性Ｔ細胞によって特徴的に発現される。成熟ＤＣをヒト乳癌細胞系（ＭＣＦ７またはＺＲ７５−１）に融合し、自己由来または同種異系のＴ細胞と５日間共培養した。ＣＤ４／ＣＤ２５＋細胞をフローサイトメトリー分析によって定量化し、細胞表面マーカーの発現およびサイトカインプロフィールに関してさらに特徴付けした。ＣＤ４＋磁気ビーズを用いて、この集団からＣＤ４＋Ｔ細胞を積極的に選択した。生じたＣＤ４＋Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析は、９７％を超える純度を証明した。
【０２０１】
一連の１３回の別々の実験では、ＤＣ／乳癌融合による刺激は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のパーセントの増加をもたらさなかった（未刺激Ｔ細胞６．９％±１．１ＳＥＭと比較して７％±１．３ＳＥＭ）。（図９Ａを参照）。しかし、融合細胞および自己由来Ｔ細胞の共培養は、ＣＤ６９を発現したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の６．３倍の増加をもたらし（４．７％−未刺激Ｔ細胞；２９．５−融合刺激細胞、Ｎ＝５；ｐ＝０．０１）、これは活性化表現型と一貫した。成熟ＤＣ／乳癌融合による刺激は、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４を発現したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の、それぞれ９倍および５．２倍の増加ももたらした。これらの知見は、ＤＣ／乳癌融合によって、活性化および阻害性の両Ｔ細胞集団が増殖することを示唆する。（図９Ｂを参照）。留意すべきは、同種異系Ｔ細胞の融合刺激は、ＣＤ４＋２５＋６９＋Ｔ細胞で類似した増加（５倍）をもたらしたが、ＧＩＴＲ（２５倍）およびＣＴＬＡ−４（１５倍）陽性集団の有意により大きな増殖をもたらした。（図９Ｃを参照）。
【０２０２】
細胞内フローサイトメトリー分析を用いて、ＤＣ／乳癌融合による刺激の後の、ＣＤ４ ＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団でのサイトカイン発現のプロフィールも調べた。１４回の連続した研究では、融合細胞刺激の前および後の、ＩＦＮγを発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の平均パーセントは、それぞれ４０％（±６．９ＳＥＭ）および６８％（±６．１ＳＥＭ）であった（ｐ＝０．００５）。（図１０Ａおよび１０Ｂを参照）。同様に、阻害性サイトカインＩＬ−１０を発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のパーセントは（図１０Ｂを参照）は、２０％（±４．９ＳＥＭ）から５９％（±８．４ＳＥＭ）に上昇した（ｐ＝０．０００２）。
【０２０３】
最後に、調節Ｔ細胞に特異的であると考えられるマーカー、Ｆｏｘｐ３の細胞内発現に及ぼす融合細胞刺激の影響を評価した。Ｆｏｘｐ３発現は、未刺激および融合刺激のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団のそれぞれ２６．５％（±５．４ＳＥＭ；ｎ＝９）から６３％（±１０．６ＳＥＭ；ｎ＝９）（ｐ＝０．０１）に増加した。（図１０Ｂを参照）。このように、融合細胞は免疫賦活性および免疫抑制の両要素の増殖を誘導し、調節Ｔ細胞が持続的で有効な抗腫瘍免疫の発達を阻止することができる複合応答をもたらす。
【０２０４】
（実施例５）：自己由来Ｔ細胞の融合媒介刺激に対する外来性のＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＣｐＧ ＯＤＮ（ＴＬＲ９アゴニスト）の影響
二次刺激分子の添加の後に活性化Ｔ細胞の発生率の上昇があるかどうか判断するために、ＤＣ／乳癌融合および自己由来Ｔ細胞の共培養への、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＴＬＲアゴニスト、イミダゾキノロン（ＴＬＲ７／８）およびＣＰＧ−ＯＤＮ（ＴＬＲ９）の添加を調べた。ＤＣ／乳癌融合を、ＩＬ−１２（１０ηｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ−１８（１０ηｇ／ｍｌ）またはＣＰＧ ＯＤＮ（１０μｇ／ｍｌ、Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）の存在下または非存在下で、自己由来のＴ細胞と５〜７日間共培養した。ＣｐＧ ＯＤＮ２３９５は、ＴスペーサーによってＧＣに富む回文配列５’−ＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ−３’（配列番号３）に連結された、六量体ＣｐＧモチーフ、５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴ−３’（配列番号２）からなった。各実験で、刺激配列のない対照ＣｐＧ ＯＤＮを同時に試験した。調節Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞の集団を、上で概説される通りに定量した。
【０２０５】
ＤＣ成熟およびＴ細胞集団の融合媒介刺激に及ぼすＴＬＲアゴニストの影響
Ｔ細胞応答を活性化表現型に傾かせ、調節Ｔ細胞の影響を制限しようとして、ワクチン応答に及ぼすＴＬＲ９アゴニスト、ＣＰＧ ＯＤＮの影響、先天性免疫応答の要素を活性化し、ワクチン効力を増強することが示されたＴＬＲアゴニストを試験した。具体的には、ＣＤ４／ＣＤ２５＋細胞でＩＬ−１０およびＦｏｘｐ３と比較したＩＦＮγの発現を定量化することによって、活性化Ｔ細胞および阻害性Ｔ細胞の集団の融合媒介刺激を調節するＣＰＧ ＯＤＮの能力を調べた。さらに、ＤＣ／乳癌融合と共培養したＴ細胞の表現型プロフィールに及ぼす刺激性サイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−１８の添加の影響も評価した。ＣｐＧ ＯＤＮおよびＩＬ−１８の存在下で、融合刺激ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞においてそれぞれ２．５倍の増加が見られた（ｐ＝０．０００４およびｐ＝０．００６）。対照的に、ＩＬ−１２をＴ細胞およびＤＣ／乳癌融合の共培養に加えた場合、ＣＤ４／ＣＤ２５＋細胞の有意な増加は見られなかった。（図１１Ａを参照）。
【０２０６】
ＣＰＧ、ＩＬ−１２またはＩＬ−１８の添加は、Ｆｏｘｐ３発現（それぞれｐ＝０．０２４、ｐ＝０．０４２、ｐ＝０．０１６）によって明示されるように、調節Ｔ細胞の表現型特性を明示するＣＤ４／ＣＤ２５＋のパーセントを低下させた。これらの知見と一致して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞でのＩＬ−１０の発現は、ＤＣ／乳癌融合単独で刺激したＴ細胞（５９．３％±８．４、ｎ＝１４）と比較して、ＣｐＧ ＯＤＮ（１９．８％±４．１、ｎ＝７；ｐ＝０．００２）およびＩＬ−１８（１８．３％±５．１、ｎ＝４；ｐ＝０．０００４）の添加をパルス適用した共培養で有意に低下した。（図１１Ｂを参照）。留意すべきは、ＩＦＮγおよびＩＬ−１０を発現するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の平均パーセントの枯渇が、融合および自己由来Ｔ細胞の共培養へのＣｐＧおよびＩＬ−１８の添加の後にも見られた。（図１１Ｃを参照）。これらの結果は、ＩＬ−１２またはＴＬＲアゴニストの添加が、免疫抑制調節細胞の存在を制限することによって、ワクチン効力を潜在的に高めることを証明する。
【０２０７】
（実施例６）：ＤＣ／乳癌融合細胞応答に及ぼすＴ細胞の抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激の影響
ワクチン応答を免疫活性化の方に傾かせる別の戦略として、ＤＣ／乳癌融合ワクチンに対する応答に及ぼす、ＣＤ３およびＣＤ２８の抗体媒介連結の影響を調べた。抗ＣＤ３／ＣＤ２８は、周囲の免疫環境の性質によって活性化Ｔ細胞または阻害性Ｔ細胞の増殖をもたらす、抗原非依存性刺激を提供する。したがって、ＤＣ／乳癌融合とそれに続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激が、融合ワクチンによって最初に活性化されたＴ細胞の応答を増幅するであろうと仮定された。
【０２０８】
Ｔ細胞を、固定化モノクローナル抗体、抗ＣＤ３（クローン−ＵＣＨＴ１；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および抗ＣＤ２８（クローン−ＣＤ２８．２；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；ＣＤ３ｉ／ＣＤ２８ｉ）に曝露させることによって、４８時間活性化させた。２４ウェル非組織培養処理プレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｉｓｈｅｒ）を０．５ｍｌ／ウェルの各抗体（ＰＢＳに１μｇ／ｍｌ）でコーティングし、４℃で一晩放置した。プレートを１％ＢＳＡでブロックし、Ｔ細胞調製物をウェルにつき２×１０^６個の細胞密度でそれらの上に加えた。Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８（４８時間）もしくはＤＣ／乳癌融合単独（５〜７日間）、融合とそれに続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８への曝露、または、抗ＣＤ３／ＣＤ２８とそれに続く融合細胞によって刺激した。Ｔ細胞を収集し、トリチウムチミジンの取込みで増殖を測定した。ＭＵＣ１四量体に結合するＴ細胞を定量した。調節（Ｆｏｘｐ３）および活性化（ＣＤ６９、ＩＦＮγ）表現型と一貫したマーカーを発現するＴ細胞のパーセントを、定量した。
【０２０９】
一連の検査で、制限されたＴ細胞の増殖が、ＣＤ３／ＣＤ２８単独（ＳＩ１．６）またはＤＣ／乳癌融合（ＳＩ３．１）への曝露の後に観察された。（図１２Ａを参照）。対照的に、Ｔ細胞を先ずＤＣ／乳癌融合で刺激し、次に抗ＣＤ３／ＣＤ２８で増殖させたときに、Ｔ細胞増殖の顕著な増加が認められた（ＳＩ２５．９）。留意すべきは、Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８に最初に曝露させ、次にＤＣ／乳癌融合と培養したときには、増殖の増加は観察されなかった（ＳＩ１．５）。ＤＣ／乳癌融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激は、腫瘍反応性Ｔ細胞の特異的増殖をもたらした。３つの一連の研究で、融合細胞による刺激の後の抗ＣＤ３／ＣＤ２８への曝露は、ＭＵＣ１四量体結合細胞の１３．７倍の平均増加率を誘導した。（図１２Ｂを参照）。対照的に、ＭＵＣ１四量体＋細胞のパーセントは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８単独による刺激の後、ベースラインレベルにとどまった。
【０２１０】
その後、増殖集団のＴ細胞表現型を評価した。ＣＤ４／ＣＤ２５を発現するＴ細胞のパーセントは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８（１１％）または融合単独（１０％）によって刺激したＴ細胞と比較して、ＤＣ／ＲＣＣ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激の後に著しく増加した（２８％）。（図１２Ｃを参照）。抗ＣＤ３／ＣＤ２８の添加は、ＣＤ４、ＣＤ２５およびＣＤ６９を同時発現した細胞のパーセントの約５倍の増加をもたらし、これは、活性化表現型と一貫した（図１２Ｄ）。同様に、それぞれ融合または抗ＣＤ３／ＣＤ２８と比較して、融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激で、ＩＦＮγを発現した細胞のパーセントのそれぞれ４倍および３倍の増加が観察された。対照的に、Ｆｏｘｐ３を発現したＣＤ４／ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増加が明らかにするように、調節Ｔ細胞の約５倍の増加も観察された。（図１２Ｄを参照）。
【０２１１】
これらのデータは、融合媒介刺激とそれに続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８増殖が、活性化Ｔ細胞および調節Ｔ細胞の両方の上昇したレベルをもたらしたことを示唆する。
【０２１２】
（実施例７）：ＩＬ−１２と併用した樹状細胞／乳癌融合による転移性乳癌を有する患者のワクチン接種
樹状細胞（ＤＣ）／乳癌融合によるワクチン接種の安全性、免疫応答および臨床効果を検査するために、転移性乳癌を有する患者に、融合をＩＬ−１２と併用投与する。ＤＣ／乳癌融合細胞は、ＤＣ媒介同時刺激との関連で、広範囲の腫瘍関連抗原を提示する。融合細胞は、自己由来の腫瘍細胞を溶解する能力を有する、腫瘍特異的免疫を刺激する。臨床試験では、融合細胞によるワクチン接種は、良好な耐容性を示し、患者の大多数で免疫応答を誘導し、患者のサブセットで疾患退行をもたらす。ＩＬ−１２と併用したワクチンの投与は、Ｔ細胞活性化を促進することによってさらにワクチン応答を高めると仮定された。
【０２１３】
抗原提示細胞としてのそれらの表現型特性に関するＤＣ／乳癌融合の性質、および抗腫瘍免疫を刺激するそれらの能力を調べた。ＤＣ／乳癌融合は、同時刺激、接着および成熟マーカー、ならびに刺激性サイトカイン、ＩＬ−１２およびＩＦＮγを強く発現した。さらに、融合細胞は、流入領域リンパ節でのＴ細胞通行部位への細胞の移動のために必要な、ＣＣＲ７を発現した。これらの知見と一致して、未熟および成熟ＤＣで生成された融合は、自己由来の腫瘍標的のＣＴＬ媒介溶解を強力に刺激した。
【０２１４】
その後、活性化Ｔ細胞および調節Ｔ細胞の存在に関して、ＤＣ／乳癌融合に対するＴ細胞の応答の性質を調べた。ＤＣ／乳癌融合は、ＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ６９およびＣＤ４／ＣＤ２５／Ｆｏｘｐ３＋細胞を特徴とする細胞の混合集団を刺激した。調節細胞の存在の増加は、融合細胞ワクチンのインビボ効力を潜在的に阻害すると考えられた。このように、融合媒介Ｔ細胞応答を活性化細胞の方に傾かせるために、いくつかの戦略を調べた。ＩＬ−１２、ＴＬＲ７／８アゴニスト、ＣＰＧ ＯＤＮまたはＩＬ−１８の添加は、調節細胞と比較して活性化細胞の相対的な存在を増加させた。
【０２１５】
ＤＣ／乳癌融合に対するＴ細胞応答の性質をさらに明確にするために、ＣＤ４およびＣＤ２５を同時発現する増殖Ｔ細胞集団の機能的特性を調べた。融合細胞による刺激の後に、ＣＤ４／ＣＤ２５／ＦＯＸＰ３細胞の存在の増加が認められ、融合共培養の前および後に、総ＣＤ４／ＣＤ２５細胞のそれぞれ２６％および６３％の平均レベルが観察された。ＦＯＸＰ３を一様に発現するＣＤ４／ＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞をＦＡＣＳ選別によって単離し、ＣＤ４／ＣＤ２５−細胞のマイトジェンおよび抗原特異的応答を阻害するそれらの能力を分析した。ＣＤ４／ＣＤ２５−Ｔ細胞を、ＣＤ４／ＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞の存在下または非存在下で、ＰＨＡ（２μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３と１：１の比率で３日間培養した。ＣＤ４／ＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞の存在は、終夜パルスの後のチミジン取込みによって判断される、増殖のかなりの阻害をもたらした。同様に、末梢血単核細胞を、ＣＤ４／ＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞の存在下または非存在下で、破傷風トキソイド（１０μｇ／ｍｌ）と１：１の比率で５日間培養した。ＣＤ４／ＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞の存在は、刺激指数（ＰＢＭＣおよび破傷風トキソイドのチミジン取込み／ＰＢＭＣ単独のチミジン取込み）によって判断される、破傷風へのＴ細胞応答のかなりの阻害をもたらした。
【０２１６】
Ｆｏｘｐ３発現は、ＦＡＣＳおよび免疫細胞化学的分析によって選別されたＣＤ４／ＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞で確認した。これらのデータは、ＤＣ／乳癌融合が、調節Ｔ細胞の表現型および機能的特性を有するＴ細胞集団の増殖を誘導することを証明する。
【０２１７】
ＤＣ／乳癌融合とそれに続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８による活性化Ｔ細胞の選択的増殖
抗腫瘍免疫を刺激し、調節Ｔ細胞の増殖を制限するＤＣ／乳癌融合の能力を高めるために、いくつかの戦略を調べた。ＤＣ／腫瘍融合による抗原特異的刺激およびＴ細胞同時刺激複合体（ＣＤ３／ＣＤ２８）の非特異的連結の組合せが、腫瘍特異性リンパ球の活性化をもたらすであろうと仮定された。ＤＣ／乳癌融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による複合刺激は、活性化表現型が優先する腫瘍反応性Ｔ細胞の増殖をもたらすことが実証された。
【０２１８】
ＤＣ／乳癌融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激を受けたＴ細胞の、表現型特性および機能的特性を調べた（図１５）。制限されたＴ細胞増殖が、抗ＣＤ３／ＣＤ２８単独（ＳＩ：１．５±０．５ＳＥＭ；ｎ＝７）またはＤＣ／乳癌融合（ＳＩ３．１±１．２ＳＥＭ；ｎ＝７）への曝露の後に観察された。しかし、Ｔ細胞を先ずＤＣ／乳癌融合で刺激し、次に抗ＣＤ３／ＣＤ２８で増殖させたときに、Ｔ細胞増殖の顕著な増加が認められた（ＳＩ：２３±８．７３ＳＥＭ；ｎ＝７）。留意すべきは、Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８に最初に曝露させ、次にＤＣ／乳癌融合と培養したときには、増殖の増加は観察されなかった（ＳＩ：１．６±０．３ＳＥＭ；ｎ＝６）。
【０２１９】
ＤＣ／乳癌融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激は、腫瘍反応性Ｔ細胞の特異的増殖をもたらした。融合細胞による刺激の後の抗ＣＤ３／ＣＤ２８への曝露は、ＭＵＣ１四量体結合細胞（ｎ＝３）の１３．７倍の平均増加率を誘導した。ＭＵＣ１四量体＋細胞のパーセントは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８単独による刺激の後、ベースラインレベルにとどまった。
【０２２０】
増殖Ｔ細胞集団の表現型に関しては、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋表現型を発現するＴ細胞のパーセントは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８（１１％）または融合単独（１０％）（ｎ＝６）によって刺激したＴ細胞と比較して、ＤＣ／腫瘍融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激の後に著しく増加した（２８％）。融合細胞単独と比較して、ＤＣ／乳癌融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激は、ＣＤ６９およびＩＦＮγを同時発現したＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の５倍および４倍の増加をもたらした。対照的に、Ｆｏｘｐ３を発現したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増加が明らかにするように、調節Ｔ細胞の約５倍の増加も観察された。これらの結果は、融合媒介刺激とそれに続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８増殖が、活性化Ｔ細胞および調節Ｔ細胞の両方のレベルの上昇を誘導することを示唆する。
【０２２１】
将来の臨床試験は、ＩＬ−１２と併用したＤＣ／乳癌融合による転移性乳癌患者のワクチン接種を含む。
【０２２２】
（実施例８）：ＤＣ／多発性骨髄腫融合による自己由来Ｔ細胞増殖の刺激
多発性骨髄腫（ＭＭ）の患者に由来する自己由来の融合およびＴ細胞を用いる実験で、類似した知見が観察された。ＤＣを接着性単核細胞から生成し、本明細書に記載の方法を用いて自己由来の骨髄腫細胞と融合させた。自己由来のＴ細胞は、Ｔ細胞分離カラムを用いて単離した。多発性骨髄腫を有する患者に由来するＴ細胞を、１：１０の融合対Ｔ細胞の比率で融合細胞と７日間共培養するか、融合細胞と５日間共培養した後、抗ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングしたプレートと４８時間共培養した。刺激の後、一晩の適用の後のトリチウムチミジンの取込みによって、Ｔ細胞増殖を測定した。ＤＣ／骨髄腫融合とそれに続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激は、融合細胞単独によって刺激したＴ細胞と比較して、Ｔ細胞増殖のレベルを著しく増加させた（図１３）。
【０２２３】
ＤＣ／ＭＭ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋細胞によって定義される活性化Ｔ細胞のレベルの増加をもたらした。抗ＣＤ３／ＣＤ２８単独によって刺激された細胞と比較して、ＤＣ／ＭＭ融合単独による刺激またはＤＣ／ＭＭ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激の後に、ＣＤ４／２５／ＣＤ６９細胞の（総集団中の）パーセントの２７倍および３９倍の増加が観察された。その後、ＤＣ／ＭＭ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８によって刺激したＴ細胞の、自己由来のＭＭ標的を溶解する能力を調べた。患者由来のＴ細胞を、自己由来のＤＣ／ＭＭ融合単独によって７日間、またはＤＣ／ＭＭ融合で５日間と以降の抗ＣＤ３／ＣＤ２８への４８時間の曝露によって刺激した。自己由来の骨髄腫細胞の溶解は、標準のクロム放出アッセイで測定した。ＤＣ／ＭＭ融合とそれに続く抗ＣＤ３／ＣＤ２８によって刺激したＴ細胞は、自己由来の骨髄腫標的の、ＤＣ／ＭＭ融合単独で刺激したＴ細胞で観察されたものを超える、高レベルのＣＴＬ媒介性の溶解を示した（図１４）。これらの知見は、ＤＣ／ＭＭ融合および抗ＣＤ３／ＣＤ２８による逐次的な刺激が、腫瘍標的を溶解する能力を有する活性化された腫瘍特異的Ｔ細胞の選択的増殖をもたらすことを実証する。したがって、この手法は、多発性骨髄腫の養子免疫療法のための理想的なプラットホームを提供する。
【０２２４】
同等物
本発明を、その好ましい実施形態を参照して詳細に示し、記載したが、添付の請求項によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更をそこに加えることができることは、当業者によって理解されよう。当業者は、常用の実験しか用いずに、本明細書で具体的に記載した本発明の具体的な実施形態の多くの同等物を認識するか、確認することができよう。そのような同等物は、特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に純粋な、教育され、増殖した抗原特異的な免疫エフェクター細胞集団を生成する方法であって、前記免疫エフェクター細胞はＴリンパ球であり、前記集団はＣＤ４^＋免疫エフェクター細胞および細胞傷害性ＣＤ８^＋免疫エフェクター細胞を含み、
ａ）複数のハイブリッド細胞を提供する工程であり、前記ハイブリッド細胞のそれぞれは少なくとも１つの樹状細胞と、細胞表面抗原を発現する少なくとも１つの腫瘍細胞または癌細胞との間の融合によって生成され、前記樹状細胞および前記腫瘍細胞または癌細胞は同じ種に由来し、前記樹状細胞は抗原をプロセシングおよび提示することができ、前記ハイブリッド細胞の少なくとも半分は免疫系を刺激するのに有効な量で（ａ）ＭＨＣクラスＩＩ分子、（ｂ）Ｂ７、および（ｃ）前記細胞表面抗原を発現する、工程と、
ｂ）免疫エフェクター細胞集団を前記複数のハイブリッド細胞と接触させ、それによって、教育され、抗原特異的な免疫エフェクター細胞集団を生成する工程と、
ｃ）前記教育され、抗原特異的な免疫エフェクター細胞集団を抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体と接触させ、それによって前記実質的に純粋な、増殖し、教育され、抗原特異的な免疫エフェクター細胞集団を生成する工程であり、前記接触は、前記ハイブリッド細胞単独または前記抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体単独への曝露と比較して、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞活性または腫瘍反応性Ｔ細胞の増加をもたらす、工程とを含む、方法。
【請求項２】
前記集団を、増殖の後に調節Ｔ細胞の活性を除去または低減する化合物と接触させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物がサイトカインである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
選択方法の使用、またはｓｉＲＮＡを用いる重要な遺伝子のサイレンシングによって調節Ｔ細胞の活性を除去または低減する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記集団を前記抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体と接触させる工程が活性化Ｔ細胞の少なくとも２倍の増加をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記集団を前記抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体と接触させる工程が腫瘍反応性Ｔ細胞の少なくとも２倍の増加をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記集団を前記抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体と接触させる工程がＴ細胞増殖の少なくとも２倍の増加をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体が平らな基材に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫エフェクター細胞が少なくとも２４時間の間に増殖する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫エフェクター細胞が遺伝子改変細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ハイブリッド細胞が遺伝子改変細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子改変がポリヌクレオチドの導入を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドがペプチド、リボザイム、アンチセンス配列、ホルモン、酵素、成長因子またはインターフェロンをコードする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハイブリッド細胞と培養する前に前記免疫エフェクター細胞がナイーブである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
サイトカインまたはアジュバントの存在下で前記免疫エフェクター細胞が前記ハイブリッド細胞とともに培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記サイトカインがＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５またはＩＬ−１８である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アジュバントがＣＰＧ ＯＤＮ、ＴＬＲ７／８アゴニストまたはＴＬＲ３アゴニストである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記増殖し、教育され、抗原特異的な免疫エフェクター細胞集団が、サイトカインを含む細胞培養培地中で維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記サイトカインがＩＬ−７である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
１つまたは複数の抗原を発現する前記樹状細胞および前記腫瘍または癌細胞が自己由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
１つまたは複数の抗原を発現する前記樹状細胞および前記腫瘍または癌細胞が同種異系である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記樹状細胞が末梢血、骨髄または皮膚から誘導または動員される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記樹状細胞が樹状細胞前駆体細胞から誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記樹状細胞および前記腫瘍または癌細胞が同じ個体から得られる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記種がヒトである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記樹状細胞および前記腫瘍または癌細胞が同じ種の異なる個体から得られる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記種がＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記腫瘍または癌細胞が、乳癌細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、腎臓癌細胞、肺癌細胞、尿路上皮癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞または血液癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記血液癌細胞が、急性骨髄性白血病細胞、急性リンパ性白血病細胞、多発性骨髄腫細胞および非ホジキンリンパ腫細胞からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
増殖し、教育され、抗原特異的な免疫エフェクター細胞を含む実質的に純粋な集団であって、前記集団は、教育され、抗原特異的な免疫エフェクター細胞を含み、前記免疫エフェクター細胞はハイブリッド細胞によって教育され、前記ハイブリッド細胞は、１つまたは複数の抗原を発現する腫瘍もしくは癌細胞に融合している樹状細胞を含み、前記樹状細胞および前記腫瘍または癌細胞は同じ種に由来し、前記樹状細胞は抗原をプロセシングおよび提示することができ、前記融合細胞の少なくとも半分は、免疫系を刺激するのに有効な量で（ａ）ＭＨＣクラスＩＩ分子、（ｂ）Ｂ７、および（ｃ）前記細胞表面抗原を発現し、前記教育された免疫エフェクター細胞は抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下の培養で増殖し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下の培養での増殖の後に、前記集団におけるＴ細胞の増殖が、前記ハイブリッド細胞単独に曝露させた免疫エフェクター細胞と比較して少なくとも２倍増加しているか、前記集団におけるＴ細胞の活性化が、前記ハイブリッド細胞単独に曝露させた免疫エフェクター細胞と比較して少なくとも２倍増加しているか、前記集団における腫瘍反応性Ｔ細胞が、前記ハイブリッド細胞単独に曝露させた免疫エフェクター細胞と比較して少なくとも２倍増加しているか、またはそれらの任意の組合せである集団。
【請求項３１】
前記樹状細胞および前記腫瘍または癌細胞が同じ個体から得られる、請求項３０に記載の集団。
【請求項３２】
前記種がヒトである、請求項３１に記載の集団。
【請求項３３】
前記樹状細胞および前記腫瘍または癌細胞が同じ種の異なる個体から得られる、請求項３０に記載の集団。
【請求項３４】
前記種がＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓである、請求項３３に記載の集団。
【請求項３５】
前記腫瘍または癌細胞が腎癌細胞である場合、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下の培養での増殖の後に、前記集団におけるＴ細胞の増殖が、前記ハイブリッド細胞単独に曝露させた免疫エフェクター細胞と比較して少なくとも約２倍増加している、請求項３０に記載の集団。
【請求項３６】
前記腫瘍または癌細胞が腎癌細胞である場合、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下の培養での増殖の後に、前記集団における記憶エフェクター細胞の存在が、前記ハイブリッド細胞単独に曝露させた免疫エフェクター細胞と比較して少なくとも約２倍増加している、請求項３０に記載の集団。
【請求項３７】
前記腫瘍または癌細胞が腎癌細胞である場合、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下の培養での増殖の後に、前記集団におけるＴ細胞の活性化が、前記ハイブリッド細胞単独に曝露させた免疫エフェクター細胞と比較して少なくとも約２倍増加している、請求項３０に記載の集団。
【請求項３８】
前記腫瘍または癌細胞が腎癌細胞である場合、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下の培養での増殖の後に、前記集団におけるＩＦＮγおよびグランザイムＢを発現する細胞の存在が、前記ハイブリッド細胞単独に曝露させた免疫エフェクター細胞と比較して増加している、請求項３０に記載の集団。
【請求項３９】
抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下の培養での増殖の後に、前記集団におけるＩＦＮγを発現する細胞の存在が、前記ハイブリッド細胞単独に曝露させた免疫エフェクター細胞と比較して少なくとも約２倍増加している、請求項３８に記載の集団。
【請求項４０】
抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下の培養での増殖の後に、前記集団におけるグランザイムＢを発現する細胞の存在が、前記ハイブリッド細胞単独に曝露させた免疫エフェクター細胞と比較して少なくとも約２倍増加している、請求項３８に記載の集団。
【請求項４１】
前記腫瘍または癌細胞が腎癌細胞である場合、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下の培養での増殖の後に、前記集団における腫瘍反応性Ｔ細胞が、前記ハイブリッド細胞単独に曝露させた免疫エフェクター細胞と比較して少なくとも約２倍増加している、請求項３０に記載の集団。
【請求項４２】
請求項３０に記載の増殖し、教育され、抗原特異的な免疫エフェクター細胞の集団を含むワクチン。
【請求項４３】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項４２に記載のワクチン。
【請求項４４】
個体において癌を治療する方法であって、請求項３０に記載の集団を前記個体に投与する工程を含み、免疫応答が誘導され、前記癌は、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、肺癌、尿路上皮癌、結腸癌、直腸癌、神経膠腫または血液癌からなる群より選択される方法。
【請求項４５】
前記血液癌が、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、多発性骨髄腫および非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記癌が乳癌である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記樹状細胞および前記腫瘍または癌細胞が同じ個体から得られる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記種がヒトである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記樹状細胞および前記腫瘍または癌細胞が同じ種の異なる個体から得られる、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記種がＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
複数のハイブリッド細胞の有効量を共投与する工程をさらに含み、前記ハイブリッド細胞のそれぞれは、少なくとも１つの樹状細胞と、細胞表面抗原を発現する少なくとも１つの腫瘍もしくは癌細胞との間の融合によって生成され、前記樹状細胞および前記腫瘍または癌細胞は同じ種に由来し、前記ハイブリッド細胞の少なくとも半分は免疫系を刺激するのに有効な量で（ａ）ＭＨＣクラスＩＩ分子、（ｂ）Ｂ７、および（ｃ）前記細胞表面抗原を発現する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記共投与が逐次的に行われる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記共投与が同時に行われる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記個体に、前記集団の投与の前にリンパ球を枯渇させる治療が施される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５５】
前記治療が前記個体においてリンパ球減少を誘導する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記治療がフルダラビンまたは放射線の投与を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
幹細胞移植の後に前記細胞が前記個体に投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５８】
抗原活性についてペプチドを試験する方法であって、
（ａ）樹状細胞と腫瘍もしくは癌細胞との融合産物を含むハイブリッド細胞を提供する工程であり、前記ハイブリッド細胞がその表面にＢ７を発現する、工程と、
（ｂ）前記ハイブリッド細胞を免疫エフェクター細胞と接触させ、それによって教育された免疫エフェクター細胞を生成する工程と、
（ｃ）前記教育された免疫エフェクター細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体と接触させる工程と、
（ｄ）ペプチドの存在下で標的細胞を前記教育された免疫エフェクター細胞と接触させる工程であり、前記標的細胞の溶解が、前記ペプチドを抗原性ペプチドと同定する、工程とを含む、方法。
【請求項５９】
抗原活性についてペプチドを試験する方法であって、
（ａ）複数の細胞を提供する工程であり、前記複数の細胞の少なくとも５％が、少なくとも１つの樹状細胞と、細胞表面抗原を発現する少なくとも１つの腫瘍もしくは癌細胞との間の融合によって生成される融合細胞であり、前記融合細胞が、免疫応答を刺激するのに有効な量で（ａ）ＭＨＣクラスＩＩ分子、（ｉｉ）Ｂ７および（ｉｉｉ）前記細胞表面抗原を発現する、工程と、
（ｂ）ヒトＴリンパ球の集団を前記複数の細胞と接触させる工程であり、前記接触させる工程は、前記Ｔリンパ球集団内のエフェクター細胞前駆体細胞の、細胞傷害性Ｔリンパ球を含むエフェクター細胞への分化を引き起こす、工程と、
（ｃ）細胞傷害性Ｔリンパ球を含む前記エフェクター細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体と接触させる工程と、
（ｄ）複数の標的細胞を前記ペプチドの存在下で、Ｔリンパ球を含む前記エフェクター細胞と接触させる工程であり、前記複数の標的細胞またはその一部の溶解が、前記ペプチドを、前記細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される抗原性ペプチドと同定する、工程とを含む方法。
【請求項６０】
請求項５８に記載の方法によって同定されるペプチドと、担体とを含むワクチン。
【請求項６１】
請求項５９に記載の方法によって同定されるペプチドと、担体とを含むワクチン。

【図２】

【図３】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図５Ｄ】

【図５Ｅ】

【図５Ｆ】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図６Ｃ】

【図６Ｄ】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図８】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図９Ｃ】

【図９Ｄ】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１１Ａ】

【図１１Ｂ】

【図１１Ｃ】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１２Ｃ】

【図１２Ｄ】

【図１２Ｅ】

【図１２Ｆ】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【公表番号】特表２０１１−５０４１０１（Ｐ２０１１−５０４１０１Ａ）
【公表日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３３２６４（Ｐ２０１０−５３３２６４）
【出願日】平成２０年１１月７日（２００８．１１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８２７５０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６２００１
【国際公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【出願人】（５９２０９０６９２）ダナ　ファーバー　キャンサー　インスティテュート，インコーポレイテッド (20)
【出願人】（５００３４２４８８）ベス　イスラエル　デアコネス　メディカル　センター (1)
【Ｆターム（参考）】