機能性赤外蛍光粒子
【課題】 生体または生体物質等に対する透過性が高く、蛍光強度が安定で安全性の高い赤外蛍光粒子を提供すること。
【解決手段】 被検物質に結合することが可能な官能基または物質を有して成る赤外蛍光粒子であって、赤外領域の波長の励起光を照射すると赤外領域の波長の蛍光を放射する赤外蛍光粒子。
【解決手段】 被検物質に結合することが可能な官能基または物質を有して成る赤外蛍光粒子であって、赤外領域の波長の励起光を照射すると赤外領域の波長の蛍光を放射する赤外蛍光粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばイメージング等のバイオおよび生化学の分野で用いるのに適した赤外蛍光粒子（「赤外蛍光体でできている粒子」ともいう）に関しており、特に、被検物質に結合することができ、近赤外領域の波長の光で励起および発光が可能な赤外蛍光粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、生体内に入れられた蛍光物質の特定部位への集積を体外から観察するイメージングと呼ばれる技術が存在するが、かかる用途に対して蛍光物質が期待されている。イメージング用途では、特に、安全性および安定性が蛍光物質に求められるだけでなく、励起光および蛍光が生体物質に対して高い透過性を有することが求められる。従って、紫外線領域から可視領域の光を発する有機蛍光体または量子ドット等の蛍光物質は、蛍光の安定性、毒性および透過性の点で依然問題を残している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、上述の問題を解決するために為されたものである。従って、本発明の課題は、特に生体物質に対する励起光および蛍光の透過性の点で好ましい赤外蛍光粒子であって、イメージング等の用途に利用可能な赤外蛍光粒子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決すべく、本発明は、被検物質に結合することが可能な官能基または物質を有して成り、赤外領域の波長の励起光を照射すると赤外領域の波長の蛍光が放射される赤外蛍光粒子を提供する。
【０００５】
本発明の赤外蛍光粒子は、赤外領域（特に近赤外領域）の波長の励起光が照射されると赤外領域（特に近赤外領域）の波長の蛍光が放射される。また、本発明の赤外蛍光粒子は「被検物質に結合することが可能な官能基または物質」を有するため、被検物質に赤外蛍光粒子が結合できる。その結果、赤外蛍光粒子をイメージングの蛍光プローブとして用いたりすることができる。このように、本発明の赤外蛍光粒子は種々の有用な機能を有するものであるから、本発明の赤外蛍光粒子は「機能性赤外蛍光粒子」と呼ぶこともできる。
【発明の効果】
【０００６】
赤外領域の光は生体物質などに対する透過性が高いため、本発明の赤外蛍光粒子を用いると、被検物質およびその周囲に存在する物質による発光、吸収もしくは散乱の影響を小さくすることができる。従って、バックグランドを低く抑えて実質的な感度を高くすることができる。また、金属酸化物から成る赤外蛍光粒子では、光の照射によっても蛍光強度が実質的に低下せず安定した蛍光強度を得ることができるだけでなく、赤外蛍光粒子自体の毒性も低い。従って、金属酸化物から成る本発明の赤外蛍光粒子は、種々の生体物質が含まれる検体中の被検物質のイメージング用途や、生体内の特定の組織のイメージング用途に対して特に有益である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明の赤外蛍光粒子を詳細に説明する。
【０００８】
本明細書で用いる「赤外蛍光粒子」とは、赤外領域の波長を有する励起光を照射すると、赤外領域の波長を有する光のエネルギーを放射する粒子を意味している。従って、励起光の照射に際して、非常に短い時間で光のエネルギーが放射される場合は「蛍光」として光を発するが、長い時間にわたって光のエネルギーが放射される場合は「燐光」として光を発することになり、本発明の「赤外蛍光粒子」は「蛍光」または「燐光」を放射する粒子を実質的に意味する。
【０００９】
また、本明細書において、「被検物質に結合することが可能な官能基または物質」の「結合できる」とは、「被検物質」に「官能基または物質」が物理的または化学的に結合することを意味している。従って、「結合できる」という用語は、例えば「吸着」、「クーロン力」などに起因して「被検物質」が「官能基または物質」に結合する態様をも含んでいる。
【００１０】
更に、本明細書で用いる「被検物質」とは、一般的に測定対象物質を意味するものであるが、必ずしも測定対象物質に限らない。測定対象物質でなくても、種々の用途のために、本発明の赤外蛍光粒子に単に結合させる物質も「被検物質」に含まれる。
【００１１】
本発明の赤外蛍光粒子に照射する励起光および生じる蛍光は、被検物質およびその周囲に存在する物質に対して透過性が高く、それらの物質による発光、吸収または散乱が少ない赤外領域の波長を有する。好ましくは、励起光スペクトルおよび蛍光スペクトルのピーク波長は、７００〜３０００ｎｍの近赤外領域の範囲にある。かかる波長よりも短い波長域の光では、被検物質およびその周囲に存在する物質による可視領域の光の吸収や発光がより多くなるだけでなく、散乱もより多くなり、その一方、かかる波長よりも長い波長域の光では、検体による赤外吸収がより多くなるからである。特に、生体物質を含んだ検体中の被検物質のイメージングや生体内の特定箇所のイメージングに対して本発明の赤外蛍光粒子を用いる場合、周囲には水が存在することが多いので、励起光スペクトルおよび蛍光スペクトルのピーク波長は、水による光の吸収が少ない７００〜１３００ｎｍの近赤外領域の範囲にあることがより好ましい。更に、励起光の波長と蛍光の波長との差が大きい方が、本発明の赤外蛍光粒子を用いた蛍光強度測定に際して励起光の影響をカットしやすくなることをも考慮すると、励起光スペクトルのピーク波長が７００〜１１００ｎｍの近赤外領域の範囲にあり、蛍光のスペクトルのピーク波長が８５０〜１２００ｎｍの近赤外領域の範囲にあることが更に好ましい。
【００１２】
なお、励起光スペクトルのピーク波長と蛍光スペクトルのピーク波長との差が２０ｎｍ以下では、フィルタ等により、励起光と蛍光とを分離するのが難しく、仮に分離できたとしても各々の光が重なっている部分はカットせざるを得ず、光量ロスが大きくなるので、励起光スペクトルのピーク波長と蛍光スペクトルのピーク波長との差が２０ｎｍ以上であることが好ましい。より好ましくは、励起光スペクトルのピーク波長と蛍光スペクトルのピーク波長との差が、５０ｎｍ以上であり、更に好ましくは１００ｎｍ以上である。
【００１３】
本発明の実施形態において、赤外蛍光粒子を粉末形態として用いる際には各々の赤外蛍光粒子が均一の形状およびサイズを有していることが好ましい。また、かかる赤外蛍光粒子を液体中で用いた検出では、得られる結果のばらつきを抑えるため、赤外蛍光粒子が液体中に均一に分散できるものが好ましい。従って、赤外蛍光粒子の直径の上限は、好ましくは５μｍ以下であり、より好ましくは５００ｎｍ以下、更に好ましくは１００ｎｍ以下である。その一方、赤外蛍光粒子の直径の下限は、製造が可能か否か及び検出できる蛍光強度が得られるか否かによって決まるものであり、一般的には２ｎｍ以上が好ましい。以上を踏まえると、赤外蛍光粒子は、２ｎｍ〜５μｍの粒径を有していることが好ましい。ここでいう「粒径」は、例えば、電子顕微鏡や光学顕微鏡等で拡大した画像から１００個の粒子を無作為に選択し、それぞれの粒子について直径を読み取り、これらを平均することによって求めた場合の粒径をいう。ただし、直径が均一でない場合には、最大径と最小径を求めて平均したものを、各粒子の直径とする。なお、赤外蛍光粒子の好ましい粒径は、被検物質または赤外蛍光粒子の形状および種類などに応じて変わり得ることを理解されよう。
【００１４】
本発明の赤外蛍光粒子は、無機材料、有機材料、複合材料または錯体等のいずれの材料から形成されてもよい。とりわけ、無機材料から形成された赤外蛍光粒子は、励起光の照射等による蛍光強度の低下が小さく、安定性に優れているため、本発明の赤外蛍光粒子として好ましい。
【００１５】
また、本発明の実施形態では、安全面または環境面の点でも好ましい赤外蛍光粒子が望ましい。例えば、金属酸化物系の赤外蛍光粒子は一般に安定性が高く、毒性も低いので本発明の赤外蛍光粒子に好適に使用される。金属酸化物から成る赤外蛍光粒子としては、例えば、遷移金属元素、リン元素および酸素元素を含んで成る化合物が挙げられる。その代表的な化合物としては、Ｙ・Ｎｄ・Ｙｂ・ＰＯ４、Ｌｕ・Ｎｄ・Ｙｂ・ＰＯ４およびＬａ・Ｎｄ・Ｙｂ・ＰＯ４（式中、Ｙ：イットリウム元素、Ｎｄ：ネオジム元素、Ｙｂ：イッテルビウム元素、Ｌｕ：ルテチウム元素、Ｌａ：ランタン元素、Ｐ：リン元素、Ｏ：酸素元素）等の化合物が挙げられる。
【００１６】
金属酸化物から成る赤外蛍光粒子の中でも特に、一般式Ａ１−ｘ−ｙ Ｎｄｘ Ｙｂｙ ＰＯ４（式中、ＡはＹ，ＬｕおよびＬａからなる群から選択される少なくとも１種以上の元素であり；０＜ｘ≦０．５；０＜ｙ≦０．５および０＜ｘ＋ｙ＜１である）で表される化合物が好ましい。更に、上記一般式Ａ１−ｘ−ｙ Ｎｄｘ Ｙｂｙ ＰＯ４で表される化合物の中でも、１００μｓ以上の残光持続時間を有するものが特に好ましい。なお、ここでいう「残光持続時間」は、励起光照射停止後の蛍光強度が１／１０にまで低下するまでの時間を計測することによって得られる時間をいう。
【００１７】
本発明の赤外蛍光粒子は生体の一部の特定部位に吸着または結合することができるので、かかる特定部位の検出ができるだけでなく、その特定部位のイメージングが可能となる。しかも、赤外領域の励起光および蛍光は生体物質等に対して高い透過性を有しているので、ある程度深い部位であっても、または、被検物質および赤外蛍光粒子の周囲に種々の他の物質が存在する場合であっても、検出またはイメージングが可能となる。
【００１８】
このような理由から、本発明の赤外蛍光粒子には、被検物質に結合することが可能な官能基や物質が含まれている。好ましくは、「被検物質に結合することが可能な官能基や物質」が赤外蛍光粒子に固定化されている。ここでいう「固定化」とは、一般的に、赤外蛍光粒子の表面付近に「被検物質に結合することが可能な官能基や物質」が存在している態様を意味しており、必ずしも「被検物質に結合することが可能な官能基や物質」が赤外蛍光粒子の表面に直接取り付けられている態様のみを意味するものではない。
【００１９】
本発明の実施形態において、本発明の赤外蛍光粒子の「被検物質に結合することが可能な官能基」は、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、チオール基、ニトロ基、スクシンイミド基、マレイミド基、ホルミル基、ヒドラジン基およびトシル基から成る群から選択される少なくとも１種以上の官能基であることが好ましい。この場合、これらの官能基と反応性または親和性を有する官能基等を含む被検物質に、本発明の赤外蛍光粒子が結合または吸着することになる。なお、上記で例示した「被検物質に結合することが可能な官能基」を活性化したものでもよく、例えば、各種触媒や脱水化剤等を添加することによって活性化が可能であり、代表的なものとしては、カルボキシル基に対するカルボジイミド添加やカルボキシル基の酸無水物化、エポキシ基に対する３級アミンやアルコール添加等が挙げられる。
【００２０】
また、本発明の実施形態において、本発明の赤外蛍光粒子の「被検物質に結合することが可能な物質」は、シリカ、ヒドロキシアパタイト、リガンド、レセプター、抗原、抗体、ビオチン、アビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、核酸および糖鎖から成る群から選択される少なくとも１種以上の物質であることが好ましい。この場合も、このような「被検物質に結合することが可能な物質」を介して、本発明の赤外蛍光粒子が被検物質に結合または吸着することになる。
【００２１】
上記で例示したような「被検物質に結合することが可能な官能基または物質」が本発明の赤外蛍光粒子に固定化されているので、かかる官能基または物質を介して被検物質に赤外蛍光粒子が結合することになる。かかる被検物質は、いずれの種類の物質であってもかまわないが、好ましくは、生体組織、微生物および細胞から成る群から選択される物質である。かかる被検物質は、生体または混合物等として他の物質と共存している場合が多いので被検物質の周囲には他の物質が存在し得、また、本発明の赤外蛍光粒子がイメージング等で生体内に用いられる場合には、対象となる被検物質の周囲には種々の生体関連物質が存在し得る。このような「被検物質の周囲に存在する物質」としては、例えば、被検物質以外の生体組織、微生物、細胞、血液等の体液、または水等が挙げられる。
【００２２】
赤外蛍光粒子に「被検物質と結合可能な官能基」を導入させる手法としては、いかなる方法を用いてもよい。例えばシランカップリング剤を赤外蛍光粒子表面に反応させる方法が用いられる。この場合、赤外蛍光粒子表面に官能基を直接的に反応させてもよいし、予めシリカ等を固定した赤外蛍光粒子表面に官能基を反応させてもよい。シランカップリング剤で取り付けることができる官能基の種類は限定されているので、更に別の物質をシランカップリング剤により導入された官能基に反応させて、それら官能基をより活性の高い状態にしたり、または、別の官能基を赤外蛍光粒子に導入してもよい。なお、シランカップリング剤の代わりにチタンカップリング剤やシラザンを用いてもよい。
【００２３】
赤外蛍光粒子表面に吸着または結合する官能基と、導入したい官能基とを併せ持つ物質、例えば両末端アミノ基ポリエチレングリコールまたは一端がアミノ基・他端がカルボキシル基のポリエチレングリコール等の分散剤を固定化してもよい。同様に、最表部に官能基が出るようなミセルまたはリポソームの形状になるように赤外蛍光粒子を形成してもよい。更に、官能基を有するポリマー（例えばポリアリルアミンまたはキトサン等）で赤外蛍光粒子を被覆したり、または、被覆したポリマーに官能基を導入してもよい。また、液体中の赤外蛍光粒子の分散性を向上させるために界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎまたはＴｒｉｔｏｎ等）が、使用する液体に加えられてもよい。
【００２４】
同様に、赤外蛍光粒子に「被検物質と結合可能な物質」を固定化させる手法としては、いかなる方法を用いてもよい。例えば、シリカを固定化するには、ゾルゲル法を利用することができる。また、特開２００４−０３１７９２号に記載されているような被着法も好適に利用することができる。具体的には、例えば、赤外蛍光粒子を分散させた水懸濁液中に好ましい量の珪酸ナトリウムを加えて溶解させた後、酸を加えて中和することによって、赤外蛍光粒子の表面近傍に特定量のシリカを被着形成させることができる。更に、例えばヒドロキシアパタイト等のリン酸カルシウム系化合物を固定化するには、別の被着法を利用することができる。具体的には、例えば、赤外蛍光粒子を水中に分散させ、これにカルシウム塩水溶液とリン酸塩水溶液とを加え、ｐＨを調整して、赤外蛍光粒子の表面近傍にリン酸カルシウム系化合物を析出させた後、水熱処理を施す。これにより、リン酸カルシウム系化合物を赤外蛍光粒子の表面近傍に被着形成させることができる。
【００２５】
なお、金属酸化物等の表面には種々の官能基が存在していると考えられ得るので、抗原、抗体、ビオチン、アビジン、核酸および／または糖鎖等の物質が、赤外蛍光体から成る金属酸化物粒子と単に混ぜ合わされるだけで、かかる金属酸化物粒子の表面に当該物質が結合する場合があり、そのような簡易な手法によっても本発明の赤外蛍光粒子を得ることができる。
【００２６】
更には、「被検物質に結合することが可能な物質」に対して高い溶解度を有する溶液条件からその溶解度が低い溶液条件へと移行させることによっても、「被検物質に結合することが可能な物質」を赤外蛍光粒子表面に析出させることも可能である。また、ある種の官能基を赤外蛍光粒子に予め固定させておき、次いで、その官能基に対して「被検物質に結合することが可能な官能基または物質」を結合させるか、または、ある種の官能基を有すると共に赤外蛍光粒子表面に固定可能な性質を有する物質等に対して「被検物質に結合することが可能な官能基または物質」を予め結合させておき、次いで、そのような物質を赤外蛍光粒子表面に固定させると、より確実な固定化を実施できる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されない。
【００２８】
《赤外蛍光粒子の合成》
（実施例１）
特許公報３３３６５７２号の実施例１に従って、「被検物質に結合することが可能な官能基または物質」が固定化される前の赤外蛍光粒子（以下、「赤外蛍光粒子Ａ」ともいう）を合成した。具体的には、Ｎｄ2Ｏ3：３．５ｇ，Ｙｂ2Ｏ3：４．０ｇ，Ｙ2Ｏ3：１８．０ｇおよびＨ3ＰＯ4：６０．０ｇから成る原料を十分に混合し、アルミナ製の蓋付きルツボに充填した後、電気炉に入れ、室温から７００℃位まで、一定昇温速度で２時間かけて昇温し、その後、７００℃で６時間焼成した。焼成終了後、直ちに電気炉から取り出し、空気中で放冷した。次いで、ルツボに１００℃の熱湯を入れ、煮沸した。その結果得られた蛍光粒子をルツボから取り出し、１規定の硝酸で洗浄し、水洗し、乾燥を行った。以上の操作により、一般式Ｎｄ0.1Ｙｂ0.1Ｙ0.8ＰＯ4で表される赤外蛍光粒子Ａを得た。この赤外蛍光粒子Ａは、「被検物質に結合することが可能な官能基または物質」が固定化されていない。赤外蛍光粒子Ａでは、励起光スペクトルのピーク波長が約８１０ｎｍの励起光を照射すると約９８０ｎｍの蛍光スペクトルのピーク波長が得られた。
【００２９】
次いで、得られた赤外蛍光粒子Ａの５重量部を水に分散させ、テトラエトキシシラン１重量部およびアンモニア水５重量部を加えて撹拌することによって、粒子表面にシランを析出させた後、遠心分離に付して上澄みを除去した。更に、水を加えて撹拌した後、遠心分離に付して上澄みを除去する洗浄工程を５回繰り返し、最後に１００℃で乾燥させた。以上の操作によって、シリカが固定された赤外蛍光粒子を得た。
【００３０】
（実施例２）
実施例１の赤外蛍光粒子Ａの５重量部を水／エチルアルコール（体積比１／１）に分散させ、アミノ基を有するシランカップリング剤を１重量部混合して１時間撹拌した後、遠心分離に付して上澄みを除去し、次いで１２０℃で乾燥させた。これにより、アミノ基が固定された赤外蛍光粒子を得た。
【００３１】
（実施例３）
アミノ基を有するシランカップリング剤の代わりにエポキシ基を有するシランカップリング剤を用いたこと以外は、実施例２と同様の操作を行った。これにより、エポキシ基が固定された赤外蛍光粒子を得た。
【００３２】
（実施例４）
実施例３で得られたエポキシ基が固定された赤外蛍光粒子1重量部を５重量％エタノールアミン水溶液２０重量部に分散させて、一晩撹拌した後、水、アセトンによる洗浄を繰り返し、水酸基が固定された赤外蛍光粒子を得た。次いで、かかる水酸基が固定された赤外蛍光粒子１重量部をピリジン２０重量部に分散させ、トシルクロライド０．２重量部を加え一晩撹拌した後、トルエンによる洗浄を４回繰り返した。以上の操作によって、トシル基が固定された赤外蛍光粒子を得た。
【００３３】
（実施例５）
実施例２で得られた赤外蛍光粒子の１重量部を水に分散させた後、１０ｍｇ／ｍｌの水溶性カルボジイミド（１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）１００重量部を加えて撹拌した後、遠心分離に付して上澄み除去した。次いで、水を加えて撹拌・遠心分離・上澄み除去する洗浄操作を３回繰り返した。ＰＢＳバッファー（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）およびストレプトアビジン０．０６重量部を加えて３７℃にて２時間反応させた後、遠心分離に付して上澄みを除去し、その後、ＰＢＳによる洗浄工程を５回繰り返した。これにより、ストレプトアビジンが固定された赤外蛍光粒子を得た。
【００３４】
（実施例６）
実施例３で得られたエポキシ基が固定された赤外蛍光粒子の１重量部をＰＢＳ１００重量部に分散させた後、ストレプトアビジン０．０６重量部を加え一晩撹拌した。次いで、ＰＢＳによる洗浄を３回繰り返した。これにより、ストレプトアビジンが固定された赤外蛍光粒子を得た。
【００３５】
（実施例７）
実施例４で得られたトシル基が固定された赤外蛍光粒子の１重量部をＰＢＳ１００重量部に分散させた後、ストレプトアビジン０．０１重量部を加えて一晩撹拌した。次いで、ＰＢＳによる洗浄を３回繰り返した。これにより、ストレプトアビジンが固定された赤外蛍光粒子を得た。
【００３６】
（実施例８）
実施例１の赤外蛍光粒子Ａの代わりに実施例１で得られたシリカが固定された赤外蛍光粒子を用いたこと以外は、実施例２と同様な操作を行った。つまり、実施例１で得られたシリカが固定された赤外蛍光粒子５重量部を水／エチルアルコール（体積比１／１）に分散させ、アミノ基を有するシランカップリング剤を１重量部混合して１時間撹拌した後、遠心分離に付して上澄みを除去し、次いで１２０℃で乾燥させた。これにより、アミノ基が固定された赤外蛍光粒子を得た。
【００３７】
（実施例９）
実施例２で得られた赤外蛍光粒子の代わりに実施例８で得られた赤外蛍光粒子を用いたこと以外は、実施例５と同様な操作を行った。つまり、実施例８で得られたアミノ基が固定された赤外蛍光粒子を水に分散させた後、１０ｍｇ／ｍｌの水溶性カルボジイミド（１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）１００重量部を加えて撹拌した後、遠心分離に付して上澄み除去した。次いで、水を加えて撹拌・遠心分離・上澄み除去する洗浄操作を３回繰り返した。次いで、ＰＢＳバッファーおよびストレプトアビジン０．０６重量部を加えて３７℃にて２時間反応させた後、遠心分離に付して上澄み除去し、その後、ＰＢＳによる洗浄工程を５回繰り返した。これにより、ストレプトアビジンが固定された赤外蛍光粒子を得た。
【００３８】
（比較例１）
表面に何も固定されていない赤外蛍光粒子を得た。つまり、実施例１の過程で得られた赤外蛍光粒子Ａを用いた。
【００３９】
（比較例２）
表面に何も固定されていない有機系赤外蛍光体を準備した。具体的には、赤外蛍光有機色素であるＩＲＤｙｅ８００ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎをそのまま用いた。
【００４０】
（比較例３）
表面に何も固定されていない可視蛍光体を準備した。具体的には、可視蛍光顔料を含んだシンロイヒカラーベースＳＷ−１３をそのまま用いた。
【００４１】
実施例１〜９の赤外蛍光粒子および比較例１〜３の材料を用い、生体物質の吸着または結合性を調べた。
【００４２】
《結合量および吸着量の確認試験》
（核酸の吸着量の確認試験）
上記の実施例１および比較例１の赤外蛍光粒子に対する核酸（λＤＮＡ）の吸着量を確認するために、以下の試験を実施した。なお実施例１の赤外蛍光粒子を用いた場合について説明するが、比較例１の赤外蛍光粒子を用いた場合でも同様の操作となる。
（Ａ）試剤
（イ）実施例１の赤外蛍光粒子を滅菌水に分散させて、０．２ｍｇ／ｍｌの分散液を調製した。
（ロ）核酸を単離するための生物試料として、λＤＮＡ（ナカライテスク社）を滅菌水で希釈し、１０μｇ／１００μｌのλＤＮＡ溶液を調製した。
（ハ）核酸抽出用溶液として、カオトロピック物質を含む緩衝液であるバッファーＡ〔７Ｍグアニジン塩酸塩（ナカライテスク社）、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（シグマ社）、ｐＨ７．５〕を用いた。
（ニ）洗浄液として、カオトロピック物質を含んだ緩衝液であるバッファーＡ〔７Ｍグアニジン塩酸塩（ナカライテスク社）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（シグマ社）、ｐＨ７．５〕を用いた。
（ホ）高濃度の塩を除去するための試剤として、７０重量％エタノール溶液と、アセトン溶液を用いた。
（ヘ）実施例１の赤外蛍光粒子に結合した核酸を回収するための溶離液として、滅菌水を用いた。
【００４３】
（Ｂ）試験操作
（１）λＤＮＡ溶液１００μｌに、核酸抽出用溶液１，０００μｌを注入し、混合した。
（２）その後、実施例１の赤外蛍光粒子の分散液２０μｌを加えた。
（３）約２分毎に混合しながら、室温で１０分間放置した。
（４）遠心分離により、赤外蛍光粒子をチューブ底部に集めた。
（５）ピペットで溶液を吸引し、排出した。
（６）チューブにグアニジン塩酸塩を含む洗浄液を１ｃｃ注入した。
（７）実施例１の赤外蛍光粒子と十分混合したのち、再度、遠心分離を行い、上記と同様にして溶液を廃棄した。
（８）洗浄操作を再度繰り返した。
（９）１ｃｃの７０重量％エタノールで上記と同様の方法により、核酸が結合した赤外蛍光粒子を洗浄し、高濃度のグアニジン塩酸塩を取り除いた。
（１０）再度、１ｃｃの７０重量％エタノールと１ｃｃアセトンで洗浄した。
（１１）約５６℃のヒートブロックに上記チューブを設置し、約１０分間放置して、チューブ内および赤外蛍光粒子内のアセトンを完全に蒸発させて除去した。
（１２）上記方法で核酸が結合した赤外蛍光粒子に、１００μｌの滅菌水を加え、約５６℃のヒートブロックに上記チューブを設置し、２分毎に混合操作しながら１０分間放置した。
（１３）次いで、遠心分離に付し、回収する溶液をピペットで吸引し、別の新しいチューブに移した。通常、回収量は７０μｌ程度とした。
（１４）このように回収した核酸について、吸光度計（日本分光製、Ｖ−５７０）を用いることによって、その吸光度（ＯＤ ２６０ｎｍ）を測定し、核酸の濃度を求めた。そして、この濃度に回収容量をかけて、核酸回収量を求めることによって、核酸の吸着量を得た。
【００４４】
（ストレプトアビジンおよびビオチン化ＨＲＰの結合量の確認試験）
実施例５、実施例６、実施例７および実施例９で得られた、ストレプトアビジンが固定化された赤外蛍光粒子の５μｇに、２０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＨＲＰ（ホース・ラディッシュ・ペルオキシダーゼ）１００μｌを加えて３０分撹拌し、さらにテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）１００μｌを加えて３０分静置した。１Ｎ硫酸２００μｌで反応を停止させた後、発色の強さを分光光度計（日本分光製、Ｖ−５７０）を用いて波長４５０ｎｍの吸光度として計測し、濃度既知の試料との比較に基づいて、ストレプトアビジンおよびビオチン化ＨＲＰの結合量を求めた。
【００４５】
（結合量および吸着量の確認試験の結果）
実施例１〜９で得られた赤外蛍光粒子および比較例１〜３の材料に対する吸着量または結合量の結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
表１の結果に基づくと、シリカ、アミノ基またはエポキシ基等が固定された本発明の実施例１〜９に基づく赤外蛍光粒子は、これらの物質または官能基が固定化されていない比較例１および３の材料に比べて、各種特定の被検物質を結合または吸着できることが分かった。そして、このことから、本発明の赤外蛍光粒子が、生体物質に結合できること、また、生体もしくはその一部の特定の部位に結合できることが理解されよう。
【００４８】
《蛍光スペクトル測定》
次に、各種レーザーおよびＳｉフォトダイオードを組み合わせて、λＤＮＡ、ストレプトアビジンもしくはビオチン化ＨＲＰが結合または吸着した赤外蛍光粒子について蛍光強度を測定した。
【００４９】
光源には、実施例１〜９については８１０ｎｍのレーザーを用い、励起光以外の光をフィルタでカットして励起光とし、また、比較例１については８１０ｎｍ、比較例２については７８０ｎｍ、比較例３については５３２ｎｍのレーザーを用い、励起光以外の光をフィルタでカットして励起光とした。また、蛍光検出にはＳｉフォトダイオードを用い、各実施例および比較例の励起光をカットし、かつ実施例１〜９については９８０ｎｍ付近、比較例１については９８０ｎｍ付近、比較例２については８１０ｎｍ付近、比較例３については５９０ｎｍ付近の波長領域を透過するフィルタを手前に設置した。
【００５０】
実施例１〜９で得られた赤外粒子および比較例１〜３の材料を水に分散または溶解させ、メンブレンフィルタ上に滴下して乾燥させることによって蛍光測定用試料を調製した。そして、かかる試料に対して励起光を照射した。
【００５１】
その結果、実施例１〜９および比較例１〜３のいずれにおいても、強い蛍光が認められた。
【００５２】
更に、試料の上に薄い牛革を載せて同様の蛍光測定を実施したところ、実施例１〜９および比較例１については、蛍光強度が２桁程度低下するものの蛍光が観測できた。比較例２についても蛍光強度が２〜３桁程度低下したが、これについても蛍光が観測できた。比較例３については蛍光が観測できなかった。
【００５３】
また、各試料に８１０ｎｍのレーザーを照射したところ、実施例１〜９および比較例１および３の各粒子では蛍光強度の低下が認められなかったものの、比較例２の有機蛍光色素では、約５分間の照射で１／３近く蛍光強度が低下した。
【００５４】
以上の結果から、金属酸化物系の赤外蛍光粒子の実施例１〜９および比較例１の蛍光は、可視領域の蛍光物質の比較例３の蛍光に比べて透過性が高く、また、有機蛍光色素を用いた比較例２の蛍光に比べて、光照射による蛍光強度の劣化が小さいことも分かった。また、レーザーとフォトダイオードの組み合わせで蛍光強度を観測できることから、これをスキャンすることにより、イメージ画像が得られることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の赤外蛍光粒子に関連する赤外領域（特に近赤外領域）の光は生体物質などに対する透過性が高い。また、本発明の赤外蛍光粒子は、特定の物質に吸着または結合することが可能である。従って、これら特定の物質または特定の物質を有する物体のイメージング等の用途に本発明の赤外蛍光粒子を利用することができる。また、特定の物質に吸着または結合する特性を利用して、特定の物質の検出および定量分析用試薬としても本発明の赤外蛍光粒子を利用することも可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばイメージング等のバイオおよび生化学の分野で用いるのに適した赤外蛍光粒子（「赤外蛍光体でできている粒子」ともいう）に関しており、特に、被検物質に結合することができ、近赤外領域の波長の光で励起および発光が可能な赤外蛍光粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、生体内に入れられた蛍光物質の特定部位への集積を体外から観察するイメージングと呼ばれる技術が存在するが、かかる用途に対して蛍光物質が期待されている。イメージング用途では、特に、安全性および安定性が蛍光物質に求められるだけでなく、励起光および蛍光が生体物質に対して高い透過性を有することが求められる。従って、紫外線領域から可視領域の光を発する有機蛍光体または量子ドット等の蛍光物質は、蛍光の安定性、毒性および透過性の点で依然問題を残している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、上述の問題を解決するために為されたものである。従って、本発明の課題は、特に生体物質に対する励起光および蛍光の透過性の点で好ましい赤外蛍光粒子であって、イメージング等の用途に利用可能な赤外蛍光粒子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決すべく、本発明は、被検物質に結合することが可能な官能基または物質を有して成り、赤外領域の波長の励起光を照射すると赤外領域の波長の蛍光が放射される赤外蛍光粒子を提供する。
【０００５】
本発明の赤外蛍光粒子は、赤外領域（特に近赤外領域）の波長の励起光が照射されると赤外領域（特に近赤外領域）の波長の蛍光が放射される。また、本発明の赤外蛍光粒子は「被検物質に結合することが可能な官能基または物質」を有するため、被検物質に赤外蛍光粒子が結合できる。その結果、赤外蛍光粒子をイメージングの蛍光プローブとして用いたりすることができる。このように、本発明の赤外蛍光粒子は種々の有用な機能を有するものであるから、本発明の赤外蛍光粒子は「機能性赤外蛍光粒子」と呼ぶこともできる。
【発明の効果】
【０００６】
赤外領域の光は生体物質などに対する透過性が高いため、本発明の赤外蛍光粒子を用いると、被検物質およびその周囲に存在する物質による発光、吸収もしくは散乱の影響を小さくすることができる。従って、バックグランドを低く抑えて実質的な感度を高くすることができる。また、金属酸化物から成る赤外蛍光粒子では、光の照射によっても蛍光強度が実質的に低下せず安定した蛍光強度を得ることができるだけでなく、赤外蛍光粒子自体の毒性も低い。従って、金属酸化物から成る本発明の赤外蛍光粒子は、種々の生体物質が含まれる検体中の被検物質のイメージング用途や、生体内の特定の組織のイメージング用途に対して特に有益である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明の赤外蛍光粒子を詳細に説明する。
【０００８】
本明細書で用いる「赤外蛍光粒子」とは、赤外領域の波長を有する励起光を照射すると、赤外領域の波長を有する光のエネルギーを放射する粒子を意味している。従って、励起光の照射に際して、非常に短い時間で光のエネルギーが放射される場合は「蛍光」として光を発するが、長い時間にわたって光のエネルギーが放射される場合は「燐光」として光を発することになり、本発明の「赤外蛍光粒子」は「蛍光」または「燐光」を放射する粒子を実質的に意味する。
【０００９】
また、本明細書において、「被検物質に結合することが可能な官能基または物質」の「結合できる」とは、「被検物質」に「官能基または物質」が物理的または化学的に結合することを意味している。従って、「結合できる」という用語は、例えば「吸着」、「クーロン力」などに起因して「被検物質」が「官能基または物質」に結合する態様をも含んでいる。
【００１０】
更に、本明細書で用いる「被検物質」とは、一般的に測定対象物質を意味するものであるが、必ずしも測定対象物質に限らない。測定対象物質でなくても、種々の用途のために、本発明の赤外蛍光粒子に単に結合させる物質も「被検物質」に含まれる。
【００１１】
本発明の赤外蛍光粒子に照射する励起光および生じる蛍光は、被検物質およびその周囲に存在する物質に対して透過性が高く、それらの物質による発光、吸収または散乱が少ない赤外領域の波長を有する。好ましくは、励起光スペクトルおよび蛍光スペクトルのピーク波長は、７００〜３０００ｎｍの近赤外領域の範囲にある。かかる波長よりも短い波長域の光では、被検物質およびその周囲に存在する物質による可視領域の光の吸収や発光がより多くなるだけでなく、散乱もより多くなり、その一方、かかる波長よりも長い波長域の光では、検体による赤外吸収がより多くなるからである。特に、生体物質を含んだ検体中の被検物質のイメージングや生体内の特定箇所のイメージングに対して本発明の赤外蛍光粒子を用いる場合、周囲には水が存在することが多いので、励起光スペクトルおよび蛍光スペクトルのピーク波長は、水による光の吸収が少ない７００〜１３００ｎｍの近赤外領域の範囲にあることがより好ましい。更に、励起光の波長と蛍光の波長との差が大きい方が、本発明の赤外蛍光粒子を用いた蛍光強度測定に際して励起光の影響をカットしやすくなることをも考慮すると、励起光スペクトルのピーク波長が７００〜１１００ｎｍの近赤外領域の範囲にあり、蛍光のスペクトルのピーク波長が８５０〜１２００ｎｍの近赤外領域の範囲にあることが更に好ましい。
【００１２】
なお、励起光スペクトルのピーク波長と蛍光スペクトルのピーク波長との差が２０ｎｍ以下では、フィルタ等により、励起光と蛍光とを分離するのが難しく、仮に分離できたとしても各々の光が重なっている部分はカットせざるを得ず、光量ロスが大きくなるので、励起光スペクトルのピーク波長と蛍光スペクトルのピーク波長との差が２０ｎｍ以上であることが好ましい。より好ましくは、励起光スペクトルのピーク波長と蛍光スペクトルのピーク波長との差が、５０ｎｍ以上であり、更に好ましくは１００ｎｍ以上である。
【００１３】
本発明の実施形態において、赤外蛍光粒子を粉末形態として用いる際には各々の赤外蛍光粒子が均一の形状およびサイズを有していることが好ましい。また、かかる赤外蛍光粒子を液体中で用いた検出では、得られる結果のばらつきを抑えるため、赤外蛍光粒子が液体中に均一に分散できるものが好ましい。従って、赤外蛍光粒子の直径の上限は、好ましくは５μｍ以下であり、より好ましくは５００ｎｍ以下、更に好ましくは１００ｎｍ以下である。その一方、赤外蛍光粒子の直径の下限は、製造が可能か否か及び検出できる蛍光強度が得られるか否かによって決まるものであり、一般的には２ｎｍ以上が好ましい。以上を踏まえると、赤外蛍光粒子は、２ｎｍ〜５μｍの粒径を有していることが好ましい。ここでいう「粒径」は、例えば、電子顕微鏡や光学顕微鏡等で拡大した画像から１００個の粒子を無作為に選択し、それぞれの粒子について直径を読み取り、これらを平均することによって求めた場合の粒径をいう。ただし、直径が均一でない場合には、最大径と最小径を求めて平均したものを、各粒子の直径とする。なお、赤外蛍光粒子の好ましい粒径は、被検物質または赤外蛍光粒子の形状および種類などに応じて変わり得ることを理解されよう。
【００１４】
本発明の赤外蛍光粒子は、無機材料、有機材料、複合材料または錯体等のいずれの材料から形成されてもよい。とりわけ、無機材料から形成された赤外蛍光粒子は、励起光の照射等による蛍光強度の低下が小さく、安定性に優れているため、本発明の赤外蛍光粒子として好ましい。
【００１５】
また、本発明の実施形態では、安全面または環境面の点でも好ましい赤外蛍光粒子が望ましい。例えば、金属酸化物系の赤外蛍光粒子は一般に安定性が高く、毒性も低いので本発明の赤外蛍光粒子に好適に使用される。金属酸化物から成る赤外蛍光粒子としては、例えば、遷移金属元素、リン元素および酸素元素を含んで成る化合物が挙げられる。その代表的な化合物としては、Ｙ・Ｎｄ・Ｙｂ・ＰＯ４、Ｌｕ・Ｎｄ・Ｙｂ・ＰＯ４およびＬａ・Ｎｄ・Ｙｂ・ＰＯ４（式中、Ｙ：イットリウム元素、Ｎｄ：ネオジム元素、Ｙｂ：イッテルビウム元素、Ｌｕ：ルテチウム元素、Ｌａ：ランタン元素、Ｐ：リン元素、Ｏ：酸素元素）等の化合物が挙げられる。
【００１６】
金属酸化物から成る赤外蛍光粒子の中でも特に、一般式Ａ１−ｘ−ｙ Ｎｄｘ Ｙｂｙ ＰＯ４（式中、ＡはＹ，ＬｕおよびＬａからなる群から選択される少なくとも１種以上の元素であり；０＜ｘ≦０．５；０＜ｙ≦０．５および０＜ｘ＋ｙ＜１である）で表される化合物が好ましい。更に、上記一般式Ａ１−ｘ−ｙ Ｎｄｘ Ｙｂｙ ＰＯ４で表される化合物の中でも、１００μｓ以上の残光持続時間を有するものが特に好ましい。なお、ここでいう「残光持続時間」は、励起光照射停止後の蛍光強度が１／１０にまで低下するまでの時間を計測することによって得られる時間をいう。
【００１７】
本発明の赤外蛍光粒子は生体の一部の特定部位に吸着または結合することができるので、かかる特定部位の検出ができるだけでなく、その特定部位のイメージングが可能となる。しかも、赤外領域の励起光および蛍光は生体物質等に対して高い透過性を有しているので、ある程度深い部位であっても、または、被検物質および赤外蛍光粒子の周囲に種々の他の物質が存在する場合であっても、検出またはイメージングが可能となる。
【００１８】
このような理由から、本発明の赤外蛍光粒子には、被検物質に結合することが可能な官能基や物質が含まれている。好ましくは、「被検物質に結合することが可能な官能基や物質」が赤外蛍光粒子に固定化されている。ここでいう「固定化」とは、一般的に、赤外蛍光粒子の表面付近に「被検物質に結合することが可能な官能基や物質」が存在している態様を意味しており、必ずしも「被検物質に結合することが可能な官能基や物質」が赤外蛍光粒子の表面に直接取り付けられている態様のみを意味するものではない。
【００１９】
本発明の実施形態において、本発明の赤外蛍光粒子の「被検物質に結合することが可能な官能基」は、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、チオール基、ニトロ基、スクシンイミド基、マレイミド基、ホルミル基、ヒドラジン基およびトシル基から成る群から選択される少なくとも１種以上の官能基であることが好ましい。この場合、これらの官能基と反応性または親和性を有する官能基等を含む被検物質に、本発明の赤外蛍光粒子が結合または吸着することになる。なお、上記で例示した「被検物質に結合することが可能な官能基」を活性化したものでもよく、例えば、各種触媒や脱水化剤等を添加することによって活性化が可能であり、代表的なものとしては、カルボキシル基に対するカルボジイミド添加やカルボキシル基の酸無水物化、エポキシ基に対する３級アミンやアルコール添加等が挙げられる。
【００２０】
また、本発明の実施形態において、本発明の赤外蛍光粒子の「被検物質に結合することが可能な物質」は、シリカ、ヒドロキシアパタイト、リガンド、レセプター、抗原、抗体、ビオチン、アビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、核酸および糖鎖から成る群から選択される少なくとも１種以上の物質であることが好ましい。この場合も、このような「被検物質に結合することが可能な物質」を介して、本発明の赤外蛍光粒子が被検物質に結合または吸着することになる。
【００２１】
上記で例示したような「被検物質に結合することが可能な官能基または物質」が本発明の赤外蛍光粒子に固定化されているので、かかる官能基または物質を介して被検物質に赤外蛍光粒子が結合することになる。かかる被検物質は、いずれの種類の物質であってもかまわないが、好ましくは、生体組織、微生物および細胞から成る群から選択される物質である。かかる被検物質は、生体または混合物等として他の物質と共存している場合が多いので被検物質の周囲には他の物質が存在し得、また、本発明の赤外蛍光粒子がイメージング等で生体内に用いられる場合には、対象となる被検物質の周囲には種々の生体関連物質が存在し得る。このような「被検物質の周囲に存在する物質」としては、例えば、被検物質以外の生体組織、微生物、細胞、血液等の体液、または水等が挙げられる。
【００２２】
赤外蛍光粒子に「被検物質と結合可能な官能基」を導入させる手法としては、いかなる方法を用いてもよい。例えばシランカップリング剤を赤外蛍光粒子表面に反応させる方法が用いられる。この場合、赤外蛍光粒子表面に官能基を直接的に反応させてもよいし、予めシリカ等を固定した赤外蛍光粒子表面に官能基を反応させてもよい。シランカップリング剤で取り付けることができる官能基の種類は限定されているので、更に別の物質をシランカップリング剤により導入された官能基に反応させて、それら官能基をより活性の高い状態にしたり、または、別の官能基を赤外蛍光粒子に導入してもよい。なお、シランカップリング剤の代わりにチタンカップリング剤やシラザンを用いてもよい。
【００２３】
赤外蛍光粒子表面に吸着または結合する官能基と、導入したい官能基とを併せ持つ物質、例えば両末端アミノ基ポリエチレングリコールまたは一端がアミノ基・他端がカルボキシル基のポリエチレングリコール等の分散剤を固定化してもよい。同様に、最表部に官能基が出るようなミセルまたはリポソームの形状になるように赤外蛍光粒子を形成してもよい。更に、官能基を有するポリマー（例えばポリアリルアミンまたはキトサン等）で赤外蛍光粒子を被覆したり、または、被覆したポリマーに官能基を導入してもよい。また、液体中の赤外蛍光粒子の分散性を向上させるために界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎまたはＴｒｉｔｏｎ等）が、使用する液体に加えられてもよい。
【００２４】
同様に、赤外蛍光粒子に「被検物質と結合可能な物質」を固定化させる手法としては、いかなる方法を用いてもよい。例えば、シリカを固定化するには、ゾルゲル法を利用することができる。また、特開２００４−０３１７９２号に記載されているような被着法も好適に利用することができる。具体的には、例えば、赤外蛍光粒子を分散させた水懸濁液中に好ましい量の珪酸ナトリウムを加えて溶解させた後、酸を加えて中和することによって、赤外蛍光粒子の表面近傍に特定量のシリカを被着形成させることができる。更に、例えばヒドロキシアパタイト等のリン酸カルシウム系化合物を固定化するには、別の被着法を利用することができる。具体的には、例えば、赤外蛍光粒子を水中に分散させ、これにカルシウム塩水溶液とリン酸塩水溶液とを加え、ｐＨを調整して、赤外蛍光粒子の表面近傍にリン酸カルシウム系化合物を析出させた後、水熱処理を施す。これにより、リン酸カルシウム系化合物を赤外蛍光粒子の表面近傍に被着形成させることができる。
【００２５】
なお、金属酸化物等の表面には種々の官能基が存在していると考えられ得るので、抗原、抗体、ビオチン、アビジン、核酸および／または糖鎖等の物質が、赤外蛍光体から成る金属酸化物粒子と単に混ぜ合わされるだけで、かかる金属酸化物粒子の表面に当該物質が結合する場合があり、そのような簡易な手法によっても本発明の赤外蛍光粒子を得ることができる。
【００２６】
更には、「被検物質に結合することが可能な物質」に対して高い溶解度を有する溶液条件からその溶解度が低い溶液条件へと移行させることによっても、「被検物質に結合することが可能な物質」を赤外蛍光粒子表面に析出させることも可能である。また、ある種の官能基を赤外蛍光粒子に予め固定させておき、次いで、その官能基に対して「被検物質に結合することが可能な官能基または物質」を結合させるか、または、ある種の官能基を有すると共に赤外蛍光粒子表面に固定可能な性質を有する物質等に対して「被検物質に結合することが可能な官能基または物質」を予め結合させておき、次いで、そのような物質を赤外蛍光粒子表面に固定させると、より確実な固定化を実施できる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されない。
【００２８】
《赤外蛍光粒子の合成》
（実施例１）
特許公報３３３６５７２号の実施例１に従って、「被検物質に結合することが可能な官能基または物質」が固定化される前の赤外蛍光粒子（以下、「赤外蛍光粒子Ａ」ともいう）を合成した。具体的には、Ｎｄ2Ｏ3：３．５ｇ，Ｙｂ2Ｏ3：４．０ｇ，Ｙ2Ｏ3：１８．０ｇおよびＨ3ＰＯ4：６０．０ｇから成る原料を十分に混合し、アルミナ製の蓋付きルツボに充填した後、電気炉に入れ、室温から７００℃位まで、一定昇温速度で２時間かけて昇温し、その後、７００℃で６時間焼成した。焼成終了後、直ちに電気炉から取り出し、空気中で放冷した。次いで、ルツボに１００℃の熱湯を入れ、煮沸した。その結果得られた蛍光粒子をルツボから取り出し、１規定の硝酸で洗浄し、水洗し、乾燥を行った。以上の操作により、一般式Ｎｄ0.1Ｙｂ0.1Ｙ0.8ＰＯ4で表される赤外蛍光粒子Ａを得た。この赤外蛍光粒子Ａは、「被検物質に結合することが可能な官能基または物質」が固定化されていない。赤外蛍光粒子Ａでは、励起光スペクトルのピーク波長が約８１０ｎｍの励起光を照射すると約９８０ｎｍの蛍光スペクトルのピーク波長が得られた。
【００２９】
次いで、得られた赤外蛍光粒子Ａの５重量部を水に分散させ、テトラエトキシシラン１重量部およびアンモニア水５重量部を加えて撹拌することによって、粒子表面にシランを析出させた後、遠心分離に付して上澄みを除去した。更に、水を加えて撹拌した後、遠心分離に付して上澄みを除去する洗浄工程を５回繰り返し、最後に１００℃で乾燥させた。以上の操作によって、シリカが固定された赤外蛍光粒子を得た。
【００３０】
（実施例２）
実施例１の赤外蛍光粒子Ａの５重量部を水／エチルアルコール（体積比１／１）に分散させ、アミノ基を有するシランカップリング剤を１重量部混合して１時間撹拌した後、遠心分離に付して上澄みを除去し、次いで１２０℃で乾燥させた。これにより、アミノ基が固定された赤外蛍光粒子を得た。
【００３１】
（実施例３）
アミノ基を有するシランカップリング剤の代わりにエポキシ基を有するシランカップリング剤を用いたこと以外は、実施例２と同様の操作を行った。これにより、エポキシ基が固定された赤外蛍光粒子を得た。
【００３２】
（実施例４）
実施例３で得られたエポキシ基が固定された赤外蛍光粒子1重量部を５重量％エタノールアミン水溶液２０重量部に分散させて、一晩撹拌した後、水、アセトンによる洗浄を繰り返し、水酸基が固定された赤外蛍光粒子を得た。次いで、かかる水酸基が固定された赤外蛍光粒子１重量部をピリジン２０重量部に分散させ、トシルクロライド０．２重量部を加え一晩撹拌した後、トルエンによる洗浄を４回繰り返した。以上の操作によって、トシル基が固定された赤外蛍光粒子を得た。
【００３３】
（実施例５）
実施例２で得られた赤外蛍光粒子の１重量部を水に分散させた後、１０ｍｇ／ｍｌの水溶性カルボジイミド（１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）１００重量部を加えて撹拌した後、遠心分離に付して上澄み除去した。次いで、水を加えて撹拌・遠心分離・上澄み除去する洗浄操作を３回繰り返した。ＰＢＳバッファー（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）およびストレプトアビジン０．０６重量部を加えて３７℃にて２時間反応させた後、遠心分離に付して上澄みを除去し、その後、ＰＢＳによる洗浄工程を５回繰り返した。これにより、ストレプトアビジンが固定された赤外蛍光粒子を得た。
【００３４】
（実施例６）
実施例３で得られたエポキシ基が固定された赤外蛍光粒子の１重量部をＰＢＳ１００重量部に分散させた後、ストレプトアビジン０．０６重量部を加え一晩撹拌した。次いで、ＰＢＳによる洗浄を３回繰り返した。これにより、ストレプトアビジンが固定された赤外蛍光粒子を得た。
【００３５】
（実施例７）
実施例４で得られたトシル基が固定された赤外蛍光粒子の１重量部をＰＢＳ１００重量部に分散させた後、ストレプトアビジン０．０１重量部を加えて一晩撹拌した。次いで、ＰＢＳによる洗浄を３回繰り返した。これにより、ストレプトアビジンが固定された赤外蛍光粒子を得た。
【００３６】
（実施例８）
実施例１の赤外蛍光粒子Ａの代わりに実施例１で得られたシリカが固定された赤外蛍光粒子を用いたこと以外は、実施例２と同様な操作を行った。つまり、実施例１で得られたシリカが固定された赤外蛍光粒子５重量部を水／エチルアルコール（体積比１／１）に分散させ、アミノ基を有するシランカップリング剤を１重量部混合して１時間撹拌した後、遠心分離に付して上澄みを除去し、次いで１２０℃で乾燥させた。これにより、アミノ基が固定された赤外蛍光粒子を得た。
【００３７】
（実施例９）
実施例２で得られた赤外蛍光粒子の代わりに実施例８で得られた赤外蛍光粒子を用いたこと以外は、実施例５と同様な操作を行った。つまり、実施例８で得られたアミノ基が固定された赤外蛍光粒子を水に分散させた後、１０ｍｇ／ｍｌの水溶性カルボジイミド（１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）１００重量部を加えて撹拌した後、遠心分離に付して上澄み除去した。次いで、水を加えて撹拌・遠心分離・上澄み除去する洗浄操作を３回繰り返した。次いで、ＰＢＳバッファーおよびストレプトアビジン０．０６重量部を加えて３７℃にて２時間反応させた後、遠心分離に付して上澄み除去し、その後、ＰＢＳによる洗浄工程を５回繰り返した。これにより、ストレプトアビジンが固定された赤外蛍光粒子を得た。
【００３８】
（比較例１）
表面に何も固定されていない赤外蛍光粒子を得た。つまり、実施例１の過程で得られた赤外蛍光粒子Ａを用いた。
【００３９】
（比較例２）
表面に何も固定されていない有機系赤外蛍光体を準備した。具体的には、赤外蛍光有機色素であるＩＲＤｙｅ８００ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎをそのまま用いた。
【００４０】
（比較例３）
表面に何も固定されていない可視蛍光体を準備した。具体的には、可視蛍光顔料を含んだシンロイヒカラーベースＳＷ−１３をそのまま用いた。
【００４１】
実施例１〜９の赤外蛍光粒子および比較例１〜３の材料を用い、生体物質の吸着または結合性を調べた。
【００４２】
《結合量および吸着量の確認試験》
（核酸の吸着量の確認試験）
上記の実施例１および比較例１の赤外蛍光粒子に対する核酸（λＤＮＡ）の吸着量を確認するために、以下の試験を実施した。なお実施例１の赤外蛍光粒子を用いた場合について説明するが、比較例１の赤外蛍光粒子を用いた場合でも同様の操作となる。
（Ａ）試剤
（イ）実施例１の赤外蛍光粒子を滅菌水に分散させて、０．２ｍｇ／ｍｌの分散液を調製した。
（ロ）核酸を単離するための生物試料として、λＤＮＡ（ナカライテスク社）を滅菌水で希釈し、１０μｇ／１００μｌのλＤＮＡ溶液を調製した。
（ハ）核酸抽出用溶液として、カオトロピック物質を含む緩衝液であるバッファーＡ〔７Ｍグアニジン塩酸塩（ナカライテスク社）、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（シグマ社）、ｐＨ７．５〕を用いた。
（ニ）洗浄液として、カオトロピック物質を含んだ緩衝液であるバッファーＡ〔７Ｍグアニジン塩酸塩（ナカライテスク社）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（シグマ社）、ｐＨ７．５〕を用いた。
（ホ）高濃度の塩を除去するための試剤として、７０重量％エタノール溶液と、アセトン溶液を用いた。
（ヘ）実施例１の赤外蛍光粒子に結合した核酸を回収するための溶離液として、滅菌水を用いた。
【００４３】
（Ｂ）試験操作
（１）λＤＮＡ溶液１００μｌに、核酸抽出用溶液１，０００μｌを注入し、混合した。
（２）その後、実施例１の赤外蛍光粒子の分散液２０μｌを加えた。
（３）約２分毎に混合しながら、室温で１０分間放置した。
（４）遠心分離により、赤外蛍光粒子をチューブ底部に集めた。
（５）ピペットで溶液を吸引し、排出した。
（６）チューブにグアニジン塩酸塩を含む洗浄液を１ｃｃ注入した。
（７）実施例１の赤外蛍光粒子と十分混合したのち、再度、遠心分離を行い、上記と同様にして溶液を廃棄した。
（８）洗浄操作を再度繰り返した。
（９）１ｃｃの７０重量％エタノールで上記と同様の方法により、核酸が結合した赤外蛍光粒子を洗浄し、高濃度のグアニジン塩酸塩を取り除いた。
（１０）再度、１ｃｃの７０重量％エタノールと１ｃｃアセトンで洗浄した。
（１１）約５６℃のヒートブロックに上記チューブを設置し、約１０分間放置して、チューブ内および赤外蛍光粒子内のアセトンを完全に蒸発させて除去した。
（１２）上記方法で核酸が結合した赤外蛍光粒子に、１００μｌの滅菌水を加え、約５６℃のヒートブロックに上記チューブを設置し、２分毎に混合操作しながら１０分間放置した。
（１３）次いで、遠心分離に付し、回収する溶液をピペットで吸引し、別の新しいチューブに移した。通常、回収量は７０μｌ程度とした。
（１４）このように回収した核酸について、吸光度計（日本分光製、Ｖ−５７０）を用いることによって、その吸光度（ＯＤ ２６０ｎｍ）を測定し、核酸の濃度を求めた。そして、この濃度に回収容量をかけて、核酸回収量を求めることによって、核酸の吸着量を得た。
【００４４】
（ストレプトアビジンおよびビオチン化ＨＲＰの結合量の確認試験）
実施例５、実施例６、実施例７および実施例９で得られた、ストレプトアビジンが固定化された赤外蛍光粒子の５μｇに、２０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＨＲＰ（ホース・ラディッシュ・ペルオキシダーゼ）１００μｌを加えて３０分撹拌し、さらにテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）１００μｌを加えて３０分静置した。１Ｎ硫酸２００μｌで反応を停止させた後、発色の強さを分光光度計（日本分光製、Ｖ−５７０）を用いて波長４５０ｎｍの吸光度として計測し、濃度既知の試料との比較に基づいて、ストレプトアビジンおよびビオチン化ＨＲＰの結合量を求めた。
【００４５】
（結合量および吸着量の確認試験の結果）
実施例１〜９で得られた赤外蛍光粒子および比較例１〜３の材料に対する吸着量または結合量の結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
表１の結果に基づくと、シリカ、アミノ基またはエポキシ基等が固定された本発明の実施例１〜９に基づく赤外蛍光粒子は、これらの物質または官能基が固定化されていない比較例１および３の材料に比べて、各種特定の被検物質を結合または吸着できることが分かった。そして、このことから、本発明の赤外蛍光粒子が、生体物質に結合できること、また、生体もしくはその一部の特定の部位に結合できることが理解されよう。
【００４８】
《蛍光スペクトル測定》
次に、各種レーザーおよびＳｉフォトダイオードを組み合わせて、λＤＮＡ、ストレプトアビジンもしくはビオチン化ＨＲＰが結合または吸着した赤外蛍光粒子について蛍光強度を測定した。
【００４９】
光源には、実施例１〜９については８１０ｎｍのレーザーを用い、励起光以外の光をフィルタでカットして励起光とし、また、比較例１については８１０ｎｍ、比較例２については７８０ｎｍ、比較例３については５３２ｎｍのレーザーを用い、励起光以外の光をフィルタでカットして励起光とした。また、蛍光検出にはＳｉフォトダイオードを用い、各実施例および比較例の励起光をカットし、かつ実施例１〜９については９８０ｎｍ付近、比較例１については９８０ｎｍ付近、比較例２については８１０ｎｍ付近、比較例３については５９０ｎｍ付近の波長領域を透過するフィルタを手前に設置した。
【００５０】
実施例１〜９で得られた赤外粒子および比較例１〜３の材料を水に分散または溶解させ、メンブレンフィルタ上に滴下して乾燥させることによって蛍光測定用試料を調製した。そして、かかる試料に対して励起光を照射した。
【００５１】
その結果、実施例１〜９および比較例１〜３のいずれにおいても、強い蛍光が認められた。
【００５２】
更に、試料の上に薄い牛革を載せて同様の蛍光測定を実施したところ、実施例１〜９および比較例１については、蛍光強度が２桁程度低下するものの蛍光が観測できた。比較例２についても蛍光強度が２〜３桁程度低下したが、これについても蛍光が観測できた。比較例３については蛍光が観測できなかった。
【００５３】
また、各試料に８１０ｎｍのレーザーを照射したところ、実施例１〜９および比較例１および３の各粒子では蛍光強度の低下が認められなかったものの、比較例２の有機蛍光色素では、約５分間の照射で１／３近く蛍光強度が低下した。
【００５４】
以上の結果から、金属酸化物系の赤外蛍光粒子の実施例１〜９および比較例１の蛍光は、可視領域の蛍光物質の比較例３の蛍光に比べて透過性が高く、また、有機蛍光色素を用いた比較例２の蛍光に比べて、光照射による蛍光強度の劣化が小さいことも分かった。また、レーザーとフォトダイオードの組み合わせで蛍光強度を観測できることから、これをスキャンすることにより、イメージ画像が得られることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の赤外蛍光粒子に関連する赤外領域（特に近赤外領域）の光は生体物質などに対する透過性が高い。また、本発明の赤外蛍光粒子は、特定の物質に吸着または結合することが可能である。従って、これら特定の物質または特定の物質を有する物体のイメージング等の用途に本発明の赤外蛍光粒子を利用することができる。また、特定の物質に吸着または結合する特性を利用して、特定の物質の検出および定量分析用試薬としても本発明の赤外蛍光粒子を利用することも可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質に結合することが可能な官能基または物質を有して成り、赤外領域の波長の励起光を照射すると赤外領域の波長の蛍光を放射する、赤外蛍光粒子。
【請求項２】
前記赤外蛍光粒子に対する励起光スペクトルのピーク波長および蛍光スペクトルのピーク波長が近赤外領域の範囲にあることを特徴とする、請求項１に記載の赤外蛍光粒子。
【請求項３】
前記赤外蛍光粒子に対する励起光スペクトルのピーク波長が７００〜１１００ｎｍの範囲にあり、蛍光スペクトルのピーク波長が８５０〜１２００ｎｍの範囲にあることを特徴とする、請求項２に記載の赤外蛍光粒子。
【請求項４】
前記励起光スペクトルのピーク波長と前記蛍光スペクトルのピーク波長との差が、５０ｎｍ以上であることを特徴とする、請求項２または請求項３に記載の赤外蛍光粒子。
【請求項５】
前記赤外蛍光粒子が２ｎｍ〜５μｍの粒径を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の赤外蛍光粒子。
【請求項６】
前記赤外蛍光粒子が金属酸化物から形成されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の赤外蛍光粒子。
【請求項７】
前記金属酸化物が、遷移金属元素、リン元素および酸素元素から成ることを特徴とする、請求項６に記載の赤外蛍光粒子。
【請求項８】
前記赤外蛍光粒子が、一般式Ａ１−ｘ−ｙ Ｎｄｘ Ｙｂｙ ＰＯ４（式中、ＡはＹ，ＬｕおよびＬａからなる群から選択される少なくとも１種以上の元素であり；０＜ｘ≦０．５；０＜ｙ≦０．５および０＜ｘ＋ｙ＜１である）で表される金属酸化物から形成されていることを特徴とする、請求項７に記載の赤外蛍光粒子。
【請求項９】
前記被検物質が、生体組織、微生物および細胞から成る群から選択される少なくとも１種以上の被検物質であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の赤外蛍光粒子。
【請求項１０】
前記官能基が、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、チオール基、ニトロ基、スクシンイミド基、マレイミド基、ホルミル基、ヒドラジン基およびトシル基から成る群から選択される少なくとも１種以上の官能基であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の赤外蛍光粒子。
【請求項１１】
前記被検物質に結合することが可能な物質が、シリカ、ヒドロキシアパタイト、リガンド、レセプター、抗原、抗体、ビオチン、アビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、核酸および糖鎖から成る群から選択される少なくとも１種以上の物質であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の赤外蛍光粒子。
【請求項１】
被検物質に結合することが可能な官能基または物質を有して成り、赤外領域の波長の励起光を照射すると赤外領域の波長の蛍光を放射する、赤外蛍光粒子。
【請求項２】
前記赤外蛍光粒子に対する励起光スペクトルのピーク波長および蛍光スペクトルのピーク波長が近赤外領域の範囲にあることを特徴とする、請求項１に記載の赤外蛍光粒子。
【請求項３】
前記赤外蛍光粒子に対する励起光スペクトルのピーク波長が７００〜１１００ｎｍの範囲にあり、蛍光スペクトルのピーク波長が８５０〜１２００ｎｍの範囲にあることを特徴とする、請求項２に記載の赤外蛍光粒子。
【請求項４】
前記励起光スペクトルのピーク波長と前記蛍光スペクトルのピーク波長との差が、５０ｎｍ以上であることを特徴とする、請求項２または請求項３に記載の赤外蛍光粒子。
【請求項５】
前記赤外蛍光粒子が２ｎｍ〜５μｍの粒径を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の赤外蛍光粒子。
【請求項６】
前記赤外蛍光粒子が金属酸化物から形成されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の赤外蛍光粒子。
【請求項７】
前記金属酸化物が、遷移金属元素、リン元素および酸素元素から成ることを特徴とする、請求項６に記載の赤外蛍光粒子。
【請求項８】
前記赤外蛍光粒子が、一般式Ａ１−ｘ−ｙ Ｎｄｘ Ｙｂｙ ＰＯ４（式中、ＡはＹ，ＬｕおよびＬａからなる群から選択される少なくとも１種以上の元素であり；０＜ｘ≦０．５；０＜ｙ≦０．５および０＜ｘ＋ｙ＜１である）で表される金属酸化物から形成されていることを特徴とする、請求項７に記載の赤外蛍光粒子。
【請求項９】
前記被検物質が、生体組織、微生物および細胞から成る群から選択される少なくとも１種以上の被検物質であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の赤外蛍光粒子。
【請求項１０】
前記官能基が、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、チオール基、ニトロ基、スクシンイミド基、マレイミド基、ホルミル基、ヒドラジン基およびトシル基から成る群から選択される少なくとも１種以上の官能基であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の赤外蛍光粒子。
【請求項１１】
前記被検物質に結合することが可能な物質が、シリカ、ヒドロキシアパタイト、リガンド、レセプター、抗原、抗体、ビオチン、アビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、核酸および糖鎖から成る群から選択される少なくとも１種以上の物質であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の赤外蛍光粒子。
【公開番号】特開２００７−１５４０６６（Ｐ２００７−１５４０６６Ａ）
【公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３５２４０５（Ｐ２００５−３５２４０５）
【出願日】平成１７年１２月６日（２００５．１２．６）
【出願人】（０００００５８１０）日立マクセル株式会社 (2,366)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月６日（２００５．１２．６）
【出願人】（０００００５８１０）日立マクセル株式会社 (2,366)
【Ｆターム（参考）】
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