機能改変コレステロールエステラーゼおよびその製造方法
【課題】機能性タンパク質をコレステロールエステラーゼに直接結合させずに、機能改変コレステロールエステラーゼを製造することができる方法を提供すること。
【解決手段】コレステロールエステラーゼに特異性を有するシャペロニンを用いて、機能性タンパク質をコレステロールエステラーゼに付加して機能改変ＣｈＥを製造する。具体的には、コレステロールエステラーゼと、機能性タンパク質を付加したシャペロニンとを会合させて、「コレステロールエステラーゼ−［シャペロニン−機能性タンパク質］」の構造を有する機能改変コレステロールエステラーゼを製造する。
【解決手段】コレステロールエステラーゼに特異性を有するシャペロニンを用いて、機能性タンパク質をコレステロールエステラーゼに付加して機能改変ＣｈＥを製造する。具体的には、コレステロールエステラーゼと、機能性タンパク質を付加したシャペロニンとを会合させて、「コレステロールエステラーゼ−［シャペロニン−機能性タンパク質］」の構造を有する機能改変コレステロールエステラーゼを製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能改変コレステロールエステラーゼおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然型タンパク質の機能を人工的に改変する技術として、分子生物学や遺伝子工学を応用したタンパク質工学技術が広く研究されている。タンパク質工学技術で用いられる手法としては、例えば、アミノ酸置換、進化分子工学、キメラタンパク質構築、立体構造シミュレーションなどが挙げられる。
【０００３】
これまでに医薬品、洗剤、工業原料の合成などの様々な分野において酵素が利用されている。これらの分野では、天然型酵素だけではなくタンパク質工学の手法を用いて作製した機能改変酵素も利用されている。
【０００４】
酵素の基質特異性は臨床検査分野において非常に有用な性質であり、様々な酵素が臨床検査の測定試薬として使用されている。その中で、コレステロールエステラーゼ（以下「ＣｈＥ」と略記する）は、エステル型コレステロールを特異的に加水分解する活性を有することから脂質の測定試薬として用いられており、現在は主に大型自動検査機器用の検査試薬として市販されている。現在までにＣｈＥに対して、コレステロールエステラーゼ活性以外に、さらに他のタンパク質が有する機能を付加したという酵素改変体は報告されていない。このような酵素改変体の例として、適切な部位に他のタンパク質の機能ドメインを結合させたＣｈＥなどが考えられる。以下、本明細書において「酵素改変体」とは、親酵素が有する活性以外に、さらに他のタンパク質が有する機能を付加した酵素を意味する。
【０００５】
酵素の触媒機能を改良した改変体を作製した例としては、例えば、基質特異性、構造安定性および触媒活性の向上を目的として、アミノ酸置換法を用いてグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸置換体を作製した例が知られている。また、汎用性の高い機能改変グルコースデヒドロゲナーゼを作製することを目的として、グルコースデヒドロゲナーゼとストレプトアビジンのビオチン結合部位とを結合させた融合タンパク質を構築する技術が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
また、熱、強酸、強アルカリ、有機溶剤に対する安定性を向上させることを目的として、酵素とシャペロニンとを結合させた融合タンパク質を構築する技術が開示されている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−１２５６８９号公報
【特許文献２】特開２００４−２６７１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来の酵素改変体の製造方法では、機能性タンパク質を酵素に直接結合させるため、酵素自身の触媒活性や特異性、安定性などが変化してしまうことがあった。
【０００９】
また、従来の酵素改変体の製造方法では、単独でフォールディング可能な酵素（例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ）については触媒活性を有する酵素改変体を製造できたが、フォールディングにシャペロニンが必要な酵素（例えば、ＣｈＥ）については正しくフォールディングさせることができず、触媒活性を有する酵素改変体を製造できなかった。
【００１０】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、酵素に機能性タンパク質を直接結合させなくても酵素改変体を製造することができる機能改変酵素の製造方法、およびその製造方法により製造された機能改変酵素を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、フォールディングにシャペロニンが必要な酵素であっても、触媒活性を有する酵素改変体を製造することができる機能改変酵素の製造方法、およびその製造方法により製造された機能改変酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、機能改変を目的とする酵素（ＣｈＥ）に特異性を有するシャペロニンを用いることで、上記課題を解決できることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明の第一は、以下の機能改変ＣｈＥの製造方法に関する。
【００１４】
［１］ＣｈＥを用意するステップと、前記ＣｈＥに特異性を有するシャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質を用意するステップと、前記ＣｈＥと前記融合タンパク質との複合体を形成させるステップと、を含む、機能改変ＣｈＥの製造方法。
［２］ＣｈＥを用意するステップと、前記ＣｈＥに特異性を有するシャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質を用意するステップと、前記ＣｈＥと前記融合タンパク質との複合体を形成させるステップと、を含み、前記ＣｈＥは触媒活性を発揮するために前記シャペロニンによるフォールディングを必要とする、機能改変ＣｈＥの製造方法。
［３］前記機能性タンパク質は、分子認識機能を有するタンパク質、触媒活性を有するタンパク質または分子標識機能を有するタンパク質である、［１］または［２］に記載の製造方法。
【００１５】
また、本発明の第二は、以下の融合タンパク質に関する。
［４］［１］〜［３］に記載の製造方法で使用される融合タンパク質であって、ＣｈＥに特異性を有するシャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質。
【００１６】
また、本発明の第三は、以下の機能改変ＣｈＥに関する。
［５］ＣｈＥと、前記ＣｈＥに特異性を有するシャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質と、を含む、機能改変ＣｈＥ。
［６］前記機能性タンパク質は、分子認識機能を有するタンパク質、触媒活性を有するタンパク質または分子標識機能を有するタンパク質である、［５］に記載の機能改変ＣｈＥ。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、機能性タンパク質をＣｈＥに直接結合させないため、ＣｈＥ自身の触媒活性や特異性、安定性などを変化させずに機能改変ＣｈＥを製造することができる。また、本発明によれば、フォールディングにシャペロニンが必要なＣｈＥであっても、触媒活性を有する機能改変ＣｈＥを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の機能改変ＣｈＥの製造方法の手順を示す模式図
【図２】実施例１におけるゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラム
【図３】実施例１における各フラクションのリパーゼ活性の測定結果を示すグラフ
【図４】実施例１におけるリパーゼ活性の測定結果を示すグラフ
【図５】実施例２で作製した機能改変ＣｈＥのＣｈＥ活性とＧＦＰの蛍光強度を示すグラフ
【図６】実施例３で作製した機能改変ＣｈＥのＣｈＥ活性を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の機能改変ＣｈＥの製造方法は、ＣｈＥに機能性タンパク質を付加して酵素改変体である機能改変ＣｈＥを製造する方法であって、ＣｈＥに特異性を有するシャペロニンを介して機能性タンパク質をＣｈＥに付加することを特徴とする。具体的には、本発明の製造方法は、機能性タンパク質を付加したシャペロニン（融合タンパク質）とＣｈＥとを会合させて、「ＣｈＥ−［シャペロニン−機能性タンパク質］」の構造を有する機能改変ＣｈＥを製造する。
【００２０】
本明細書において「シャペロニン」とは、他のタンパク質に会合して当該タンパク質をフォールディング（リフォールディング）させるタンパク質を意味する。したがって、「ＣｈＥに特異性を有するシャペロニン」とは、ＣｈＥと特異的に会合して、ＣｈＥをフォールディングさせるタンパク質を意味する。
【００２１】
［コレステロールエステラーゼおよびシャペロニン］
コレステロールエステラーゼ（ＣｈＥ）は、多くの生物において脂質代謝に関わる重要な酵素であり、哺乳類や微生物などのＣｈＥについて多数報告されている。ＣｈＥは、エステル型コレステロールを加水分解して、遊離型コレステロールおよび脂肪酸を生成する反応を触媒する。ＣｈＥは、脂質を分解する活性を有することからリパーゼに分類されることもある。
【００２２】
微生物由来のＣｈＥには、その種に特有の発現機構を経て細胞外部に分泌されるものが存在する。このときに重要な役割を果たすのが、ＣｈＥに対して特異的なフォールディング活性を有するシャペロニンである。例えば、グラム陰性細菌のシュードモナス・アルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）では、次に説明するように、ＣｈＥである「ＬｉｐＡ」の発現において、ＬｉｐＡに特異的なシャペロニンである「ＬｉｐＢ」が重要な役割を果たしている。
【００２３】
まず、細胞内においてＬｉｐＡ遺伝子が転写、翻訳され、ポリペプチド鎖が合成される。ポリペプチド鎖（ＣｈＥ活性を有しない）は、Ｓｅｃシステム（Sec system）と呼ばれるペリプラズム輸送システムを経てペリプラズム空間に移送される。ポリペプチド鎖は、ペリプラズム空間においてＬｉｐＢにより折りたたまれ、ＣｈＥ活性を有するＬｉｐＡとなる。ＬｉｐＡは、Ｄｓｂシステム（Dsb system）により分子内ジスルフィド結合を形成され、Ｘｃｐ機構（Xcp machinery）を経て細胞外に分泌される。Ｘｃｐ機構を通過するときに、ＬｉｐＡはＬｉｐＢタンパク質から遊離する。
【００２４】
本発明の製造方法では、ＣｈＥとシャペロニンとを会合させることにより機能改変ＣｈＥを製造する。本発明の製造方法で使用するＣｈＥは、シャペロニンと会合しうるもの、すなわち触媒活性を発揮するためにはシャペロニンによるフォールディングを必要とするものであれば特に限定されない。また、本発明の製造方法で使用するシャペロニンは、使用するＣｈＥに特異的に会合するものであれば特に限定されない。
【００２５】
本発明の製造方法で使用するＣｈＥとシャペロニンとの組み合わせは、シャペロニンがＣｈＥに対して特異的に会合しうる組み合わせであれば特に限定されない。同一の種（さらに言えば、同一のオペロン）に由来するＣｈＥとシャペロニンには、この条件を満たすものが多い。このような種が属する属の例には、シュードモナス（Pseudomonas）属、バークホルデリア（Burkholderia）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、カンジダ（Candida）属などが含まれる。表１に、これらの種におけるＣｈＥと当該ＣｈＥに特異性を有するシャペロニンとの組み合わせの例を示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
シュードモナス属の種（Pseudomonas sp.）、バークホルデリア属の種（Burkholderia sp.）由来のＣｈＥは、α／βヒドロラーゼフォールド（hydrolase fold）酵素に分類され、ＧＸＳＸＧモチーフを有している。これらのＣｈＥでは、活性部位において触媒機能に関与する３つのアミノ酸（セリン、酸性アミノ酸、ヒスチジン）が高度に保存されている。立体構造から考察すると、活性部位近傍のαへリックスが蓋のような機能を有し、このαへリックスが動くことによって基質が活性中心に接近することができるようになると考えられている。なお、ストレプトミセス属の種（Streptomyces sp.）由来のＣｈＥでは、ＧＸＳＸＧモチーフは見られない。
【００２８】
本発明の製造方法で使用するＣｈＥは、もちろん天然型のＣｈＥであってもよいが、ＣｈＥ活性を有し、かつシャペロニンと会合可能であれば、改変されたＣｈＥであってもよい。例えば、本発明の製造方法で使用するＣｈＥは、ＣｈＥ遺伝子のアミノ酸翻訳領域の全領域の翻訳産物であってもよいが、一部領域の翻訳産物（例えば、分泌のためのシグナルペプチド領域を除去した翻訳産物）であってもよい。また、本発明の製造方法で使用するＣｈＥは、ＣｈＥ活性やフォールディング効率などの向上などを目的とした、ＣｈＥのアミノ酸置換体であってもよい。
【００２９】
同様に、本発明の製造方法で使用するシャペロニンは、もちろん天然型のシャペロニンであってもよいが、ＣｈＥと会合可能であれば、改変されたシャペロニンであってもよい。例えば、本発明の製造方法で使用するシャペロニンは、シャペロニン遺伝子のアミノ酸翻訳領域の全領域の翻訳産物であってもよいが、一部領域の翻訳産物（例えば、膜結合領域を除去した翻訳産物）であってもよい。また、本発明の製造方法で使用するシャペロニンは、フォールディング効率の向上などを目的とした、シャペロニンのアミノ酸置換体であってもよい。
【００３０】
ＣｈＥの基質となるエステル型コレステロールを構成する脂肪酸には、リノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ブチル酸、酢酸などがあり、エステル型コレステロールは、結合する脂肪酸によって分子構造が多様である。ヒトの血中にはリノール酸コレステリルおよびオレイン酸コレステリルが多く含まれるため、本発明の方法により製造される機能改変ＣｈＥを脂質の測定試薬として利用する場合は、リノール酸コレステリルおよびオレイン酸コレステリルに対する基質特異性が高いＣｈＥを用いて機能改変ＣｈＥを製造することが好ましい。このようなＣｈＥの例には、シュードモナス・アルギノーサのＬｉｐＡが含まれる（実施例参照）。
【００３１】
［機能性タンパク質］
機能性タンパク質は、ＣｈＥに付与する機能を担うタンパク質である。ＣｈＥに付与する機能としては、例えば分子認識機能、触媒機能、分子標識機能などが挙げられる。
【００３２】
機能性タンパク質は、特定の分子を認識（捕捉）する分子認識機能を有するタンパク質であってもよい。例えば、ハプトグロビンやレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（Lecithin-cholesterol acyltransferase；以下「ＬＣＡＴ」と略記する）、コレステロールエステル転送タンパク（Cholesteryl Ester Transfer Protein；以下「ＣＥＴＰ」と略記する）などの高比重リポタンパク質を選択的に認識（捕捉）するタンパク質を機能性タンパク質として使用することで、高比重リポタンパク質に含まれるエステル型コレステロール（基質）をＣｈＥの周囲に局在化させてＣｈＥの触媒反応の効率を向上させることができる（実施例１で後述）。また、アビジンやストレプトアビジン、ビオチン、プロテインＡ、プロテインＧなどの汎用性の高い結合分子を機能性タンパク質として使用することで、他の機能性物質を付加するための汎用性の高い結合部位を設けることができる。分子認識機能を有する機能性タンパク質の例には、ハプトグロビン、ＬＣＡＴ、ＣＥＴＰ、イムノグロブリン、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、プロテインＡ、プロテインＧ、ＣＤ抗原、Ｇタンパク質共役受容体が含まれる。
【００３３】
また、機能性タンパク質は、触媒活性を有するタンパク質（酵素）であってもよい。例えば、コレステロールオキシダーゼやコレステロールデヒドロゲナーゼなどのコレステロールを基質とする酵素を機能性タンパク質として使用することで、本発明の機能改変コレステロールエステラーゼは、コレステロールエステラーゼ活性に加えて、１または２以上の他の酵素活性を同時に保有することができる。触媒活性を有する機能性タンパク質の例には、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、リパーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＡＴＰアーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼが含まれる。
【００３４】
また、機能性タンパク質は、分子標識機能を有するタンパク質であってもよい。例えば、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein；以下「ＧＦＰ」と略記する）などの蛍光タンパク質を機能性タンパク質として使用することで、機能改変コレステロールエステラーゼの精製度の確認を容易に行うことができる。触媒活性を有する機能性タンパク質の例には、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質や、エクオリンなどの発光タンパク質が含まれる。
【００３５】
本発明の製造方法で使用する機能性タンパク質は、もちろん天然型の機能性タンパク質であってもよいが、所望の機能を発現可能であれば、改変されたものであってもよい。例えば、本発明の製造方法で使用する機能性タンパク質は、対応する遺伝子のアミノ酸翻訳領域の全領域の翻訳産物であってもよいが、一部領域の翻訳産物（例えば、ＡｐｏＡＩ認識ドメイン以外の配列を除去したハプトグロビン）であってもよい。また、本発明の製造方法で使用する機能性タンパク質は、アミノ酸置換体であってもよい。
【００３６】
［製造手順］
本発明の機能改変ＣｈＥの製造方法は、（１）ＣｈＥを用意するステップと、（２）前記ＣｈＥに特異性を有するシャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質を用意するステップと、（３）前記ＣｈＥと、前記融合タンパク質との複合体を形成するステップと、を含む。
【００３７】
第一のステップでは、ＣｈＥを用意する。ＣｈＥは、自ら調製したものを用いてもよいし、市販のものを用いてもよい。また、ＣｈＥは、正しく折りたたまれたものであってもよいが、折りたたまれていないものや誤って折りたたまれたもの（不溶性封入体）であってもよい。ＣｈＥを調製する方法は、特に限定されず、当業者に公知の遺伝子工学的手法を用いればよい。例えば、ＣｈＥをコードする遺伝子を発現ベクターにクローニングし、大腸菌で発現させることでＣｈＥを調製することができる（実施例参照）。図１（Ａ）は、折りたたまれていないＣｈＥ１００を用意した様子を示す模式図である。
【００３８】
第二のステップでは、シャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質を用意する。融合タンパク質を調製する方法は、特に限定されず、当業者に公知の遺伝子工学的手法を用いればよい。例えば、シャペロニンをコードする遺伝子と機能性タンパク質をコードする遺伝子を同一の発現ベクターにクローニングし、大腸菌で発現させることで融合タンパク質を調製することができる（実施例参照）。図１（Ｂ）は、シャペロニン１１０に機能性タンパク質１２０を付加した融合タンパク質１３０を用意した様子を示す図である。
【００３９】
融合タンパク質を調製する際には、シャペロニンおよび機能性タンパク質が共に機能を十分に発揮できるように、シャペロニンと機能性タンパク質との位置関係を調整することが好ましい。例えば、ハプトグロビンを機能性タンパク質として利用する場合は、ハプトグロビンが高比重リポタンパク質に含まれるＡｐｏＡＩと会合した状態で、ＣｈＥが高比重リポタンパク質に含まれるコレステロールエステルを加水分解できるように、シャペロニンとハプトグロビンとの位置関係を調整することが好ましい。一方、ＧＦＰを機能性タンパク質として利用する場合は、シャペロニンがＣｈＥと会合可能であれば、ＧＦＰの結合位置は特に限定されない。ＧＦＰは、位置に影響されること無く蛍光を発することができるからである。
【００４０】
第三のステップでは、第一のステップで用意したＣｈＥと、第二のステップで用意した融合タンパク質との複合体を形成する。より正確には、ＣｈＥと融合タンパク質のシャペロニンとを会合させて複合体を形成する。ＣｈＥとシャペロニンとを会合させる方法は、特に限定されず、当業者に公知のインビトロ・リフォールディング手法を用いればよい。例えば、第一のステップで用意したＣｈＥを変性剤（例えば、尿素）を用いて変性させて可溶化し、可溶化したＣｈＥと第二のステップで用意した融合タンパク質とを含む混合液（変性剤を含む）を調製し、段階的に変性剤を除去することで、ＣｈＥと融合タンパク質のシャペロニンとを会合させることができる（実施例３参照）。細菌のペリプラズム空間には、フォールディングを終えた後、ＣｈＥからシャペロニンを遊離させる機構（例えば、前述のＸｃｐ機構）が存在するが、本発明の製造方法では複合体を維持するべくこの遊離機構をインビトロの系に含ませないことが好ましい。
【００４１】
ＣｈＥと融合タンパク質とを会合させた後、架橋試薬を用いて分子間会合を補強することが好ましい。架橋試薬の例には、グルタルアルデヒド、グリオキサール、二価性架橋試薬が含まれる。処理時間は、ＣｈＥおよびシャペロニンに含まれるリジン残基の数や、架橋試薬の濃度などに応じて適宜設定すればよい。
【００４２】
図１（Ｃ）および（Ｄ）は、第一のステップで用意したＣｈＥ１００と、第二のステップで用意した融合タンパク質１３０とを会合させて、正しく折りたたまれたＣｈＥ１０２と融合タンパク質１３０とを含む機能改変ＣｈＥ１４０を作製した様子を示す図である。図１（Ｄ）に示されるように、本発明の機能改変ＣｈＥ１４０は、ＣｈＥ１０２と、前記ＣｈＥ１０２に特異性を有するシャペロニン１１０と機能性タンパク質１２０とを含む融合タンパク質１３０とを含む。
【００４３】
以上の手順により、ＣｈＥに機能性タンパク質を付加して酵素改変体である機能改変ＣｈＥを製造することができる。
【００４４】
本発明の製造方法では、従来の方法のように機能性タンパク質をＣｈＥに直接融合させないため、ＣｈＥ自身の触媒活性や特異性、安定性などを変化させずに機能改変ＣｈＥを製造することができる。
【００４５】
また、本発明の製造方法では、ＣｈＥとシャペロニンとを会合させるため、フォールディングにシャペロニンが必要なＣｈＥであっても、触媒活性を有する機能改変ＣｈＥを製造することができる。
【００４６】
本発明の製造方法は、キットを用いて実施することが可能である。そのようなキットとして、例えば、ＣｈＥの不溶性封入体と、シャペロニンおよび特定の機能性タンパク質からなる融合タンパク質とをそれぞれ別個の容器に入れたキットが考えられる。キットを入手したユーザは、ＣｈＥの不溶性封入体と融合タンパク質とを混合し、第３のステップ（インビトロ・リフォールディング）のみを実施することで、所望の機能を付加した機能改変ＣｈＨを調製することができる。
【００４７】
以下、本発明を実施例を参照してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【００４８】
［実施例１］
実施例１では、機能性タンパク質としてハプトグロビン（Haptoglibin；以下「Ｈｐｔ」と略記する）を用いて機能改変ＣｈＥを作製した例を示す。
【００４９】
Ｈｐｔは、高比重リポタンパク質に含まれるアポタンパク質ＡｐｏＡＩに対する結合能を有する。リポタンパク質は、血漿中に存在し、アポタンパク質、エステル型コレステロール、トリグリセリド、リン脂質などから構成される。本実施の形態の機能改変ＣｈＥを様々なリポタンパク質を含む血漿に添加した場合、機能改変ＣｈＥに含まれるＨｐｔが高比重リポタンパク質に選択的に結合して、高比重リポタンパク質に含まれるエステル型コレステロールをＣｈＥの周囲に局在化させるため、機能改変ＣｈＥに含まれるＣｈＥは高比重リポタンパク質に含まれるエステル型コレステロールを選択的に加水分解することができる。したがって、本実施例の機能改変ＣｈＥは、高比重リポタンパク質に含まれるコレステロールの測定試薬に好適である。
【００５０】
本実施例では、ヒトの血中に多く含まれるリノール酸コレステリルおよびオレイン酸コレステリルに対する基質特異性が高いこと、インビトロ・リフォールディングの技術が確立していること、ならびに発現ベクターが市販されていることから、シュードモナス・アルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）ＮＢＲＣ３４４５株由来のＬｉｐＡをＣｈＥとして使用した。また、このＬｉｐＡに特異性を有するシャペロニンとして、同じＮＢＲＣ３４４５株由来のＬｉｐＢを使用した。
【００５１】
１．ＬｉｐＡの調製
ＮＢＲＣ３４４５株由来のＬｉｐＡ遺伝子（配列番号１（塩基配列），配列番号２（アミノ酸配列））をｐＥＴベクターにクローニングした発現ベクターｐＥＴｌｉｐＡを構築し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ）に導入した。発現ベクターを導入した形質転換体を３７℃で６時間培養した。培養液のＯＤ６００が０.６に達したときに、ＩＰＴＧを終濃度が１ｍＭとなるように培養液に添加してＬｉｐＡの発現を誘導し、３０℃で４時間培養した。
【００５２】
得られた菌体を緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８.０）に懸濁し、超音波破砕した。得られた破砕液を２００００ｇで遠心分離し、ＬｉｐＡの不溶性封入体を含むペレットを得た。ペレットを溶解緩衝液で洗浄した後、尿素を含む緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，８Ｍ 尿素，ｐＨ８.０）に懸濁し、可溶化したＬｉｐＡを調製した。
【００５３】
２．ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ融合タンパク質の調製
ＮＢＲＣ３４４５株由来のＬｉｐＢ遺伝子（配列番号３（塩基配列），配列番号４（アミノ酸配列））のＮ末端側６１残基に対応する配列（膜に結合するための配列）を除去したＬｉｐＢΔ６１遺伝子をｐＥＴベクターにクローニングした発現ベクターｐＥＴＬｉｐＢΔ６１−ＨｉｓＮを構築した。この発現ベクターのＬｉｐＢΔ６１遺伝子の上流にヒトのＨｐｔ遺伝子（配列番号５（塩基配列），配列番号６（アミノ酸配列））のタンパク質コード領域を挿入し、発現ベクターｐＥＴｈｐｔＬｉｐＢΔ６１−ＨｉｓＮを構築した。配列番号７の塩基配列は、ｐＥＴｈｐｔＬｉｐＢΔ６１−ＨｉｓＮ中のＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ融合タンパク質をコーディングする領域の塩基配列である。また、配列番号８のアミノ酸配列は、ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号８のアミノ酸配列（５２７残基）は、Ｎ末端側から、Ｈｐｔのアミノ酸配列（２４６残基）、リンカー（２残基）、ＬｉｐＢΔ６１のアミノ酸配列（２７９残基）から構成される。得られた発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。発現ベクターを導入した形質転換体を３７℃で６時間培養した。培養液のＯＤ６００が０.６に達したときに、ＩＰＴＧを終濃度が１ｍＭとなるように添加してＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ融合タンパク質の発現を誘導し、３０℃で４時間培養した。
【００５４】
得られた菌体を緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８.０）に懸濁し、超音波破砕した。得られた破砕液を２００００ｇで遠心分離し、可溶性のＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ融合タンパク質を含む上清を得た。この上清から、一般的なヒスタグ精製法を用いてＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ融合タンパク質を精製した。
【００５５】
３．ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体の調製
（１）インビトロ・リフォールディング
１で得られた可溶化したＬｉｐＡと、２で得られたＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ融合タンパク質とを尿素を含まない緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＣａＣｌ２，ｐＨ８.０）中に溶解させ、室温で３時間静置し、ＬｉｐＡとＬｉｐＢΔ６１とを会合させた（インビトロ・リフォールディング）。
【００５６】
（２）ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体の精製
（１）で生成されたＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体を含む混合溶液から、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いてＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体を精製した。
【００５７】
まず、ゲルろ過クロマトグラフィーカラム（superdex 200 10/300 GL；ＧＥヘルスケア）を緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＣａＣｌ２，ｐＨ８.０）で平衡化した。次いで、平衡化したカラムを用いてＬｉｐＡ（分子量約３０ｋＤａ）を単独で分画した。流速は０.５ｍｌ／分とし、１フラクションにつき１ｍｌずつ回収した。その結果、図２（Ａ）のクロマトグラムに示されるように、フラクション２０付近にＬｉｐＡが溶出した。同様に、ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ融合タンパク質（分子量約６０ｋＤａ）を単独で分画すると、図２（Ｂ）のクロマトグラムに示されるように、フラクション９付近にＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ融合タンパク質が溶出した。
【００５８】
次に、同じカラムを用いて、（１）で得られた混合溶液（ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体を含む）を溶出分離した。流速は０.５ｍｌ／分とし、１フラクションにつき１ｍｌずつ回収した。その結果、図２（Ｃ）のクロマトグラムに示されるように、フラクション８付近およびフラクション２０付近にピークが見られた。このことから、フラクション８付近にＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体が分画されている可能性が高いと考えられる。
【００５９】
４．ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体のリパーゼ活性の測定
ゲルろ過クロマトグラフィーで得られたフラクションのうち、２８０ｎｍの吸収がみられたフラクション（フラクション７，８，１３，１４，２０，２１，２２，２３，２５）についてリパーゼの活性を測定した。
【００６０】
その結果、図３のグラフに示されるように、フラクション７は１９２ｍＵ、フラクション８は５９０５ｍＵ、フラクション９は７８５ｍＵであった。このことから、フラクション８にＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体が分画されていることがわかる。
【００６１】
５．ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体のＡｐｏＡＩに対する特異性の評価
（１）標識ビーズの作製
３ｍｇの磁性ビーズ（粒径０.１〜０.４μｍ，アミノ基修飾）に１００μｌの緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝溶液，２.５％グルタルアルデヒド，ｐＨ７.０）を添加し、室温で振とうしながら２時間インキュベートした。２０ｍＭリン酸緩衝液で１５分間の洗浄を３回行った。得られたビーズに、ＡｐｏＡＩ溶液（２２５μｇ／ｍｌ）、ＡｐｏＢ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）または２０ｍＭリン酸緩衝液（コントロール）を１００μｌ添加し、室温で１時間振とうしながらインキュベートして、タンパク質をビーズに固定化した。この後、未固定のタンパク質を含む上清を回収し、タンパク質濃度を測定することで固定化量を推測した。
【００６２】
次いで、２０ｍＭリン酸緩衝液で１５分間の洗浄を３回行った後、得られたビーズに緩衝液（１ｍＭ Ｔｒｉｓ，２０ｍＭリン酸緩衝液）を２００μｌ添加し、２０分間インキュベートして、未反応のグルタルアルデヒドのブロッキングを行った。３回洗浄し、Ｔｒｉｓを除去した後に、ビーズへのタンパク質の非特異的な吸着を防ぐため、ブロッキング溶液（２％スキムミルク，２０ｍＭリン酸緩衝液）を添加し、１５分間インキュベートしてブロッキングした。２０ｍＭリン酸緩衝液で３回洗浄し、ＡｐｏＡＩ固定化ビーズ、ＡｐｏＢ固定化ビーズおよび非標識ビーズ（コントロール）を作製した。
【００６３】
（２）リパーゼ活性の測定
３．（１）で調製された混合溶液（ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体を含む）２００μｌをＡｐｏＡＩ固定化ビーズに添加し、室温で１時間インキュベートした。リフォールディングバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＣａＣｌ２，ｐＨ８.０）で４回洗浄した後、ビーズを１００μｌのリフォールディングバッファーに懸濁し、リパーゼの活性を測定した。このリパーゼ活性の測定結果から、ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体のＡｐｏＡＩへの結合を評価した。また、ＡｐｏＢ固定化ビーズおよび非標識ビーズ（コントロール）を用いて同様の実験を行い、ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体がＡｐｏＡＩに特異的に結合している否かを評価した。
【００６４】
リパーゼ活性は、ＢＡＬＢ（2,3-dimercaptopropan-1-ol tributyrate）の加水分解生成物とＤＴＮＢ（5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)）とがカップリングして生成するＴＮＢ（5-thio-2-nitrobenzoate）アニオンの４１２ｎｍの吸光度の変化を測定することにより評価した。具体的には、次の手順によりリパーゼ活性を測定した。
【００６５】
まず、ＢＡＬＢを終濃度が２０ｍＭになるように１００％エタノールに溶解し、ＢＡＬＢ溶液を調製した。また、ＤＴＮＢを終濃度が０.３ｍＭになるように０.１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.５）に溶解し、ＤＴＮＢ溶液を調製した。次いで、１００μｌのＤＴＮＢ溶液に５μｌのビーズ溶液と１０μｌのＢＡＬＢ溶液を添加し、３０℃で３０分間インキュベートした。その後、さらに２００μｌのアセトンを添加して、反応を停止させた。反応液を混和した後、遠心分離（２０００×ｇ，１０分間）し、上清の４１２ｎｍにおける吸光度を測定した。ブランクには、反応開始直後にアセトンを添加し、３０℃で３０分間インキュベートした後の吸光度を測定値を用いた。ＴＮＢアニオンのモル吸光係数は、１５.０６ｍＭ−１ｃｍ−１を用いた。
【数１】
【００６６】
図４は、各ビーズのリパーゼ活性測定の結果を示すグラフである。横軸はビーズの標識分子の種類、縦軸はリパーゼ比活性である。
【００６７】
図４に示されるように、ＡｐｏＡＩ標識ビーズは１０３Ｕ／ｍｇビーズ、ＡｐｏＢ標識ビーズは１２Ｕ／ｍｇビーズ、非標識ビーズ（コントロール）は７Ｕ／ｍｇビーズであった。このことから、ＨｐｔとＡｐｏＡＩとの親和性によってＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体が他の標識ビーズよりも、ＡｐｏＡＩ標識ビーズに特異的に結合していることがわかる。したがって、本発明の機能改変ＣｈＥはＡｐｏＡＩを含有する高比重リポタンパク質を混合物の中から特異的に認識できることがわかる。
【００６８】
［実施例２］
実施例２では、機能性タンパク質として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用いて機能改変ＣｈＥを作製した例を示す。
【００６９】
ＧＦＰはオワンクラゲ由来の分子量２７ｋＤａのタンパク質であり、励起光を受けると強い蛍光を発する。ＧＦＰは基質などを必要としないため、ＧＦＰを他のタンパク質と融合させるだけで本来蛍光を発しないタンパク質が強い蛍光を発するようになる。
【００７０】
本実施例でも、実施例１と同様にシュードモナス・アルギノーサＮＢＲＣ３４４５株由来のＬｉｐＡおよびＬｉｐＢを使用した。
【００７１】
１．ＬｉｐＡの調製
実施例１と同様にして、可溶化したＬｉｐＡを調製した。
【００７２】
２．ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質の調製
実施例１と同様にして、発現ベクターｐＥＴＬｉｐＢΔ６１−ＨｉｓＮを構築した。この発現ベクターのＬｉｐＢΔ６１遺伝子の上流にＧＦＰ遺伝子を挿入し、発現ベクターｐＥＴＧＦＰＬｉｐＢΔ６１−ＨｉｓＮを構築した。配列番号９の塩基配列は、ｐＥＴＧＦＰＬｉｐＢΔ６１−ＨｉｓＮ中のＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質をコーディングする領域の塩基配列である。また、配列番号１０のアミノ酸配列は、ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１０のアミノ酸配列（５２４残基）は、Ｎ末端側から、ＧＦＰのアミノ酸配列（２３８残基）、リンカー（２残基）、ＬｉｐＢΔ６１のアミノ酸配列（２７９残基）から構成される。得られた発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。発現ベクターを導入した形質転換体を３７℃で６時間培養した。培養液のＯＤ６００が０.６に達したときに、ＩＰＴＧを終濃度が１ｍＭとなるように添加してＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質の発現を誘導し、３０℃で４時間培養した。
【００７３】
得られた菌体を緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８.０）に懸濁し、超音波破砕した。得られた破砕液を２００００ｇで遠心分離し、可溶性のＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質を含む上清を得た。この上清から、一般的なヒスタグ精製法を用いてＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質を精製した。
【００７４】
３．ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ］複合体の調製
１で得られた可溶化したＬｉｐＡと、２で得られたＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質とを１：３のモル比で尿素を含まない緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＣａＣｌ２，ｐＨ８.０）中に溶解させ、室温で３時間静置し、ＬｉｐＡとＬｉｐＢΔ６１とを会合させた（インビトロ・リフォールディング）。３時間後、混合溶液からゲルろ過法を用いてＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ］複合体を精製した。
【００７５】
４．ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ］複合体のＣｈＥ活性およびＧＦＰ活性
図５は、ゲルろ過精製により得られた各フラクションについて、ＣｈＥ活性とＧＦＰの蛍光強度を測定した結果を示すグラフである。横軸は精製サンプルのフラクション番号を示し、縦軸はＣｈＥの比活性（ｍＵ／ｍｇタンパク質）またはＧＦＰの蛍光強度（arbitrary unit；Ａ．Ｕ．）を示す。
【００７６】
フラクション７，８は、溶出時間から約９０ｋＤａの大きさと考えられ、ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ］複合体の予測分子量と一致しているフラクションである。フラクション７は、ＣｈＥ活性が２７ｍＵ／ｍｇ、ＧＦＰの蛍光強度が２５０Ａ．Ｕ．であった。フラクション８は、ＣｈＥ活性が３３ｍＵ／ｍｇ、ＧＦＰの蛍光強度が３００Ａ．Ｕ．であった。フラクション１３，１４で観察された蛍光は、ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質によるものだと考えられる。
【００７７】
以上の結果より、本実施例で作製した機能改変ＣｈＥは、インビトロ・リフォールディングの後もＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ］複合体の構造を維持していることがわかる。また、本実施例で作製した機能改変ＣｈＥは、ＣｈＥ活性だけでなくＧＦＰ活性も有していることがわかる。
【００７８】
［実施例３］
実施例３では、機能性タンパク質としてＧＦＰを用いて機能改変ＣｈＥを作製した例を示す。本実施例では、実施例２と異なる手順でインビトロ・リフォールディングを行った。
【００７９】
本実施例でも、実施例１と同様にシュードモナス・アルギノーサＮＢＲＣ３４４５株由来のＬｉｐＡおよびＬｉｐＢを使用した。
【００８０】
１．ＬｉｐＡの調製
実施例１と同様にして、可溶化したＬｉｐＡを調製した。
【００８１】
２．ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質の調製
実施例２と同様にして、ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質を精製した。
【００８２】
３．ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ］複合体の調製
１で得られた可溶化したＬｉｐＡを尿素を含む緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＣａＣｌ２，１Ｍ 尿素，ｐＨ８.０）で一晩透析した。２で得られたＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質を透析後のＬｉｐＡ溶液に加え、室温で３時間静置した。表２は、混合溶液中のＬｉｐＡおよびＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質の濃度を示す表である。さらに尿素を含まない緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＣａＣｌ２，ｐＨ８.０）で一晩透析して、ＬｉｐＡとＬｉｐＢΔ６１とを会合させた（インビトロ・リフォールディング）。混合溶液からゲルろ過法を用いてＬｉｐＡ−「ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ」複合体を精製した。
【表２】
【００８３】
４．ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ］複合体のＣｈＥ活性
図６は、ＬｉｐＡおよびＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質の濃度（上記表参照）と、ＬｉｐＡ−「ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ」複合体のＣｈＥ活性との関係を示すグラフである。横軸はＬｉｐＡの濃度（上記表参照）を示し、縦軸はＣｈＥの比活性（ｍＵ／ｍｇタンパク質）を示す。
【００８４】
このグラフより、ＬｉｐＡおよびＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質の濃度に比例して、ＬｉｐＡ−「ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ」複合体のＣｈＥ活性も上昇していることがわかる。この結果から、インビトロ・リフォールディングの後に尿素を完全に除去してもＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢ−ＧＦＰ］複合体の構造が維持されていることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明により製造される機能改変ＣｈＥは、例えば脂質の検査試薬や有機合成の触媒として有用である。
【符号の説明】
【００８６】
１００ 折りたたまれていないＣｈＥ
１０２ 折りたたまれたＣｈＥ
１１０ シャペロニン
１２０ 機能性タンパク質
１３０ 融合タンパク質
１４０ 機能改変ＣｈＥ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能改変コレステロールエステラーゼおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然型タンパク質の機能を人工的に改変する技術として、分子生物学や遺伝子工学を応用したタンパク質工学技術が広く研究されている。タンパク質工学技術で用いられる手法としては、例えば、アミノ酸置換、進化分子工学、キメラタンパク質構築、立体構造シミュレーションなどが挙げられる。
【０００３】
これまでに医薬品、洗剤、工業原料の合成などの様々な分野において酵素が利用されている。これらの分野では、天然型酵素だけではなくタンパク質工学の手法を用いて作製した機能改変酵素も利用されている。
【０００４】
酵素の基質特異性は臨床検査分野において非常に有用な性質であり、様々な酵素が臨床検査の測定試薬として使用されている。その中で、コレステロールエステラーゼ（以下「ＣｈＥ」と略記する）は、エステル型コレステロールを特異的に加水分解する活性を有することから脂質の測定試薬として用いられており、現在は主に大型自動検査機器用の検査試薬として市販されている。現在までにＣｈＥに対して、コレステロールエステラーゼ活性以外に、さらに他のタンパク質が有する機能を付加したという酵素改変体は報告されていない。このような酵素改変体の例として、適切な部位に他のタンパク質の機能ドメインを結合させたＣｈＥなどが考えられる。以下、本明細書において「酵素改変体」とは、親酵素が有する活性以外に、さらに他のタンパク質が有する機能を付加した酵素を意味する。
【０００５】
酵素の触媒機能を改良した改変体を作製した例としては、例えば、基質特異性、構造安定性および触媒活性の向上を目的として、アミノ酸置換法を用いてグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸置換体を作製した例が知られている。また、汎用性の高い機能改変グルコースデヒドロゲナーゼを作製することを目的として、グルコースデヒドロゲナーゼとストレプトアビジンのビオチン結合部位とを結合させた融合タンパク質を構築する技術が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
また、熱、強酸、強アルカリ、有機溶剤に対する安定性を向上させることを目的として、酵素とシャペロニンとを結合させた融合タンパク質を構築する技術が開示されている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−１２５６８９号公報
【特許文献２】特開２００４−２６７１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来の酵素改変体の製造方法では、機能性タンパク質を酵素に直接結合させるため、酵素自身の触媒活性や特異性、安定性などが変化してしまうことがあった。
【０００９】
また、従来の酵素改変体の製造方法では、単独でフォールディング可能な酵素（例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ）については触媒活性を有する酵素改変体を製造できたが、フォールディングにシャペロニンが必要な酵素（例えば、ＣｈＥ）については正しくフォールディングさせることができず、触媒活性を有する酵素改変体を製造できなかった。
【００１０】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、酵素に機能性タンパク質を直接結合させなくても酵素改変体を製造することができる機能改変酵素の製造方法、およびその製造方法により製造された機能改変酵素を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、フォールディングにシャペロニンが必要な酵素であっても、触媒活性を有する酵素改変体を製造することができる機能改変酵素の製造方法、およびその製造方法により製造された機能改変酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、機能改変を目的とする酵素（ＣｈＥ）に特異性を有するシャペロニンを用いることで、上記課題を解決できることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明の第一は、以下の機能改変ＣｈＥの製造方法に関する。
【００１４】
［１］ＣｈＥを用意するステップと、前記ＣｈＥに特異性を有するシャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質を用意するステップと、前記ＣｈＥと前記融合タンパク質との複合体を形成させるステップと、を含む、機能改変ＣｈＥの製造方法。
［２］ＣｈＥを用意するステップと、前記ＣｈＥに特異性を有するシャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質を用意するステップと、前記ＣｈＥと前記融合タンパク質との複合体を形成させるステップと、を含み、前記ＣｈＥは触媒活性を発揮するために前記シャペロニンによるフォールディングを必要とする、機能改変ＣｈＥの製造方法。
［３］前記機能性タンパク質は、分子認識機能を有するタンパク質、触媒活性を有するタンパク質または分子標識機能を有するタンパク質である、［１］または［２］に記載の製造方法。
【００１５】
また、本発明の第二は、以下の融合タンパク質に関する。
［４］［１］〜［３］に記載の製造方法で使用される融合タンパク質であって、ＣｈＥに特異性を有するシャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質。
【００１６】
また、本発明の第三は、以下の機能改変ＣｈＥに関する。
［５］ＣｈＥと、前記ＣｈＥに特異性を有するシャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質と、を含む、機能改変ＣｈＥ。
［６］前記機能性タンパク質は、分子認識機能を有するタンパク質、触媒活性を有するタンパク質または分子標識機能を有するタンパク質である、［５］に記載の機能改変ＣｈＥ。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、機能性タンパク質をＣｈＥに直接結合させないため、ＣｈＥ自身の触媒活性や特異性、安定性などを変化させずに機能改変ＣｈＥを製造することができる。また、本発明によれば、フォールディングにシャペロニンが必要なＣｈＥであっても、触媒活性を有する機能改変ＣｈＥを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の機能改変ＣｈＥの製造方法の手順を示す模式図
【図２】実施例１におけるゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラム
【図３】実施例１における各フラクションのリパーゼ活性の測定結果を示すグラフ
【図４】実施例１におけるリパーゼ活性の測定結果を示すグラフ
【図５】実施例２で作製した機能改変ＣｈＥのＣｈＥ活性とＧＦＰの蛍光強度を示すグラフ
【図６】実施例３で作製した機能改変ＣｈＥのＣｈＥ活性を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の機能改変ＣｈＥの製造方法は、ＣｈＥに機能性タンパク質を付加して酵素改変体である機能改変ＣｈＥを製造する方法であって、ＣｈＥに特異性を有するシャペロニンを介して機能性タンパク質をＣｈＥに付加することを特徴とする。具体的には、本発明の製造方法は、機能性タンパク質を付加したシャペロニン（融合タンパク質）とＣｈＥとを会合させて、「ＣｈＥ−［シャペロニン−機能性タンパク質］」の構造を有する機能改変ＣｈＥを製造する。
【００２０】
本明細書において「シャペロニン」とは、他のタンパク質に会合して当該タンパク質をフォールディング（リフォールディング）させるタンパク質を意味する。したがって、「ＣｈＥに特異性を有するシャペロニン」とは、ＣｈＥと特異的に会合して、ＣｈＥをフォールディングさせるタンパク質を意味する。
【００２１】
［コレステロールエステラーゼおよびシャペロニン］
コレステロールエステラーゼ（ＣｈＥ）は、多くの生物において脂質代謝に関わる重要な酵素であり、哺乳類や微生物などのＣｈＥについて多数報告されている。ＣｈＥは、エステル型コレステロールを加水分解して、遊離型コレステロールおよび脂肪酸を生成する反応を触媒する。ＣｈＥは、脂質を分解する活性を有することからリパーゼに分類されることもある。
【００２２】
微生物由来のＣｈＥには、その種に特有の発現機構を経て細胞外部に分泌されるものが存在する。このときに重要な役割を果たすのが、ＣｈＥに対して特異的なフォールディング活性を有するシャペロニンである。例えば、グラム陰性細菌のシュードモナス・アルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）では、次に説明するように、ＣｈＥである「ＬｉｐＡ」の発現において、ＬｉｐＡに特異的なシャペロニンである「ＬｉｐＢ」が重要な役割を果たしている。
【００２３】
まず、細胞内においてＬｉｐＡ遺伝子が転写、翻訳され、ポリペプチド鎖が合成される。ポリペプチド鎖（ＣｈＥ活性を有しない）は、Ｓｅｃシステム（Sec system）と呼ばれるペリプラズム輸送システムを経てペリプラズム空間に移送される。ポリペプチド鎖は、ペリプラズム空間においてＬｉｐＢにより折りたたまれ、ＣｈＥ活性を有するＬｉｐＡとなる。ＬｉｐＡは、Ｄｓｂシステム（Dsb system）により分子内ジスルフィド結合を形成され、Ｘｃｐ機構（Xcp machinery）を経て細胞外に分泌される。Ｘｃｐ機構を通過するときに、ＬｉｐＡはＬｉｐＢタンパク質から遊離する。
【００２４】
本発明の製造方法では、ＣｈＥとシャペロニンとを会合させることにより機能改変ＣｈＥを製造する。本発明の製造方法で使用するＣｈＥは、シャペロニンと会合しうるもの、すなわち触媒活性を発揮するためにはシャペロニンによるフォールディングを必要とするものであれば特に限定されない。また、本発明の製造方法で使用するシャペロニンは、使用するＣｈＥに特異的に会合するものであれば特に限定されない。
【００２５】
本発明の製造方法で使用するＣｈＥとシャペロニンとの組み合わせは、シャペロニンがＣｈＥに対して特異的に会合しうる組み合わせであれば特に限定されない。同一の種（さらに言えば、同一のオペロン）に由来するＣｈＥとシャペロニンには、この条件を満たすものが多い。このような種が属する属の例には、シュードモナス（Pseudomonas）属、バークホルデリア（Burkholderia）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、カンジダ（Candida）属などが含まれる。表１に、これらの種におけるＣｈＥと当該ＣｈＥに特異性を有するシャペロニンとの組み合わせの例を示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
シュードモナス属の種（Pseudomonas sp.）、バークホルデリア属の種（Burkholderia sp.）由来のＣｈＥは、α／βヒドロラーゼフォールド（hydrolase fold）酵素に分類され、ＧＸＳＸＧモチーフを有している。これらのＣｈＥでは、活性部位において触媒機能に関与する３つのアミノ酸（セリン、酸性アミノ酸、ヒスチジン）が高度に保存されている。立体構造から考察すると、活性部位近傍のαへリックスが蓋のような機能を有し、このαへリックスが動くことによって基質が活性中心に接近することができるようになると考えられている。なお、ストレプトミセス属の種（Streptomyces sp.）由来のＣｈＥでは、ＧＸＳＸＧモチーフは見られない。
【００２８】
本発明の製造方法で使用するＣｈＥは、もちろん天然型のＣｈＥであってもよいが、ＣｈＥ活性を有し、かつシャペロニンと会合可能であれば、改変されたＣｈＥであってもよい。例えば、本発明の製造方法で使用するＣｈＥは、ＣｈＥ遺伝子のアミノ酸翻訳領域の全領域の翻訳産物であってもよいが、一部領域の翻訳産物（例えば、分泌のためのシグナルペプチド領域を除去した翻訳産物）であってもよい。また、本発明の製造方法で使用するＣｈＥは、ＣｈＥ活性やフォールディング効率などの向上などを目的とした、ＣｈＥのアミノ酸置換体であってもよい。
【００２９】
同様に、本発明の製造方法で使用するシャペロニンは、もちろん天然型のシャペロニンであってもよいが、ＣｈＥと会合可能であれば、改変されたシャペロニンであってもよい。例えば、本発明の製造方法で使用するシャペロニンは、シャペロニン遺伝子のアミノ酸翻訳領域の全領域の翻訳産物であってもよいが、一部領域の翻訳産物（例えば、膜結合領域を除去した翻訳産物）であってもよい。また、本発明の製造方法で使用するシャペロニンは、フォールディング効率の向上などを目的とした、シャペロニンのアミノ酸置換体であってもよい。
【００３０】
ＣｈＥの基質となるエステル型コレステロールを構成する脂肪酸には、リノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ブチル酸、酢酸などがあり、エステル型コレステロールは、結合する脂肪酸によって分子構造が多様である。ヒトの血中にはリノール酸コレステリルおよびオレイン酸コレステリルが多く含まれるため、本発明の方法により製造される機能改変ＣｈＥを脂質の測定試薬として利用する場合は、リノール酸コレステリルおよびオレイン酸コレステリルに対する基質特異性が高いＣｈＥを用いて機能改変ＣｈＥを製造することが好ましい。このようなＣｈＥの例には、シュードモナス・アルギノーサのＬｉｐＡが含まれる（実施例参照）。
【００３１】
［機能性タンパク質］
機能性タンパク質は、ＣｈＥに付与する機能を担うタンパク質である。ＣｈＥに付与する機能としては、例えば分子認識機能、触媒機能、分子標識機能などが挙げられる。
【００３２】
機能性タンパク質は、特定の分子を認識（捕捉）する分子認識機能を有するタンパク質であってもよい。例えば、ハプトグロビンやレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（Lecithin-cholesterol acyltransferase；以下「ＬＣＡＴ」と略記する）、コレステロールエステル転送タンパク（Cholesteryl Ester Transfer Protein；以下「ＣＥＴＰ」と略記する）などの高比重リポタンパク質を選択的に認識（捕捉）するタンパク質を機能性タンパク質として使用することで、高比重リポタンパク質に含まれるエステル型コレステロール（基質）をＣｈＥの周囲に局在化させてＣｈＥの触媒反応の効率を向上させることができる（実施例１で後述）。また、アビジンやストレプトアビジン、ビオチン、プロテインＡ、プロテインＧなどの汎用性の高い結合分子を機能性タンパク質として使用することで、他の機能性物質を付加するための汎用性の高い結合部位を設けることができる。分子認識機能を有する機能性タンパク質の例には、ハプトグロビン、ＬＣＡＴ、ＣＥＴＰ、イムノグロブリン、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、プロテインＡ、プロテインＧ、ＣＤ抗原、Ｇタンパク質共役受容体が含まれる。
【００３３】
また、機能性タンパク質は、触媒活性を有するタンパク質（酵素）であってもよい。例えば、コレステロールオキシダーゼやコレステロールデヒドロゲナーゼなどのコレステロールを基質とする酵素を機能性タンパク質として使用することで、本発明の機能改変コレステロールエステラーゼは、コレステロールエステラーゼ活性に加えて、１または２以上の他の酵素活性を同時に保有することができる。触媒活性を有する機能性タンパク質の例には、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、リパーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＡＴＰアーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼが含まれる。
【００３４】
また、機能性タンパク質は、分子標識機能を有するタンパク質であってもよい。例えば、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein；以下「ＧＦＰ」と略記する）などの蛍光タンパク質を機能性タンパク質として使用することで、機能改変コレステロールエステラーゼの精製度の確認を容易に行うことができる。触媒活性を有する機能性タンパク質の例には、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質や、エクオリンなどの発光タンパク質が含まれる。
【００３５】
本発明の製造方法で使用する機能性タンパク質は、もちろん天然型の機能性タンパク質であってもよいが、所望の機能を発現可能であれば、改変されたものであってもよい。例えば、本発明の製造方法で使用する機能性タンパク質は、対応する遺伝子のアミノ酸翻訳領域の全領域の翻訳産物であってもよいが、一部領域の翻訳産物（例えば、ＡｐｏＡＩ認識ドメイン以外の配列を除去したハプトグロビン）であってもよい。また、本発明の製造方法で使用する機能性タンパク質は、アミノ酸置換体であってもよい。
【００３６】
［製造手順］
本発明の機能改変ＣｈＥの製造方法は、（１）ＣｈＥを用意するステップと、（２）前記ＣｈＥに特異性を有するシャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質を用意するステップと、（３）前記ＣｈＥと、前記融合タンパク質との複合体を形成するステップと、を含む。
【００３７】
第一のステップでは、ＣｈＥを用意する。ＣｈＥは、自ら調製したものを用いてもよいし、市販のものを用いてもよい。また、ＣｈＥは、正しく折りたたまれたものであってもよいが、折りたたまれていないものや誤って折りたたまれたもの（不溶性封入体）であってもよい。ＣｈＥを調製する方法は、特に限定されず、当業者に公知の遺伝子工学的手法を用いればよい。例えば、ＣｈＥをコードする遺伝子を発現ベクターにクローニングし、大腸菌で発現させることでＣｈＥを調製することができる（実施例参照）。図１（Ａ）は、折りたたまれていないＣｈＥ１００を用意した様子を示す模式図である。
【００３８】
第二のステップでは、シャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質を用意する。融合タンパク質を調製する方法は、特に限定されず、当業者に公知の遺伝子工学的手法を用いればよい。例えば、シャペロニンをコードする遺伝子と機能性タンパク質をコードする遺伝子を同一の発現ベクターにクローニングし、大腸菌で発現させることで融合タンパク質を調製することができる（実施例参照）。図１（Ｂ）は、シャペロニン１１０に機能性タンパク質１２０を付加した融合タンパク質１３０を用意した様子を示す図である。
【００３９】
融合タンパク質を調製する際には、シャペロニンおよび機能性タンパク質が共に機能を十分に発揮できるように、シャペロニンと機能性タンパク質との位置関係を調整することが好ましい。例えば、ハプトグロビンを機能性タンパク質として利用する場合は、ハプトグロビンが高比重リポタンパク質に含まれるＡｐｏＡＩと会合した状態で、ＣｈＥが高比重リポタンパク質に含まれるコレステロールエステルを加水分解できるように、シャペロニンとハプトグロビンとの位置関係を調整することが好ましい。一方、ＧＦＰを機能性タンパク質として利用する場合は、シャペロニンがＣｈＥと会合可能であれば、ＧＦＰの結合位置は特に限定されない。ＧＦＰは、位置に影響されること無く蛍光を発することができるからである。
【００４０】
第三のステップでは、第一のステップで用意したＣｈＥと、第二のステップで用意した融合タンパク質との複合体を形成する。より正確には、ＣｈＥと融合タンパク質のシャペロニンとを会合させて複合体を形成する。ＣｈＥとシャペロニンとを会合させる方法は、特に限定されず、当業者に公知のインビトロ・リフォールディング手法を用いればよい。例えば、第一のステップで用意したＣｈＥを変性剤（例えば、尿素）を用いて変性させて可溶化し、可溶化したＣｈＥと第二のステップで用意した融合タンパク質とを含む混合液（変性剤を含む）を調製し、段階的に変性剤を除去することで、ＣｈＥと融合タンパク質のシャペロニンとを会合させることができる（実施例３参照）。細菌のペリプラズム空間には、フォールディングを終えた後、ＣｈＥからシャペロニンを遊離させる機構（例えば、前述のＸｃｐ機構）が存在するが、本発明の製造方法では複合体を維持するべくこの遊離機構をインビトロの系に含ませないことが好ましい。
【００４１】
ＣｈＥと融合タンパク質とを会合させた後、架橋試薬を用いて分子間会合を補強することが好ましい。架橋試薬の例には、グルタルアルデヒド、グリオキサール、二価性架橋試薬が含まれる。処理時間は、ＣｈＥおよびシャペロニンに含まれるリジン残基の数や、架橋試薬の濃度などに応じて適宜設定すればよい。
【００４２】
図１（Ｃ）および（Ｄ）は、第一のステップで用意したＣｈＥ１００と、第二のステップで用意した融合タンパク質１３０とを会合させて、正しく折りたたまれたＣｈＥ１０２と融合タンパク質１３０とを含む機能改変ＣｈＥ１４０を作製した様子を示す図である。図１（Ｄ）に示されるように、本発明の機能改変ＣｈＥ１４０は、ＣｈＥ１０２と、前記ＣｈＥ１０２に特異性を有するシャペロニン１１０と機能性タンパク質１２０とを含む融合タンパク質１３０とを含む。
【００４３】
以上の手順により、ＣｈＥに機能性タンパク質を付加して酵素改変体である機能改変ＣｈＥを製造することができる。
【００４４】
本発明の製造方法では、従来の方法のように機能性タンパク質をＣｈＥに直接融合させないため、ＣｈＥ自身の触媒活性や特異性、安定性などを変化させずに機能改変ＣｈＥを製造することができる。
【００４５】
また、本発明の製造方法では、ＣｈＥとシャペロニンとを会合させるため、フォールディングにシャペロニンが必要なＣｈＥであっても、触媒活性を有する機能改変ＣｈＥを製造することができる。
【００４６】
本発明の製造方法は、キットを用いて実施することが可能である。そのようなキットとして、例えば、ＣｈＥの不溶性封入体と、シャペロニンおよび特定の機能性タンパク質からなる融合タンパク質とをそれぞれ別個の容器に入れたキットが考えられる。キットを入手したユーザは、ＣｈＥの不溶性封入体と融合タンパク質とを混合し、第３のステップ（インビトロ・リフォールディング）のみを実施することで、所望の機能を付加した機能改変ＣｈＨを調製することができる。
【００４７】
以下、本発明を実施例を参照してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【００４８】
［実施例１］
実施例１では、機能性タンパク質としてハプトグロビン（Haptoglibin；以下「Ｈｐｔ」と略記する）を用いて機能改変ＣｈＥを作製した例を示す。
【００４９】
Ｈｐｔは、高比重リポタンパク質に含まれるアポタンパク質ＡｐｏＡＩに対する結合能を有する。リポタンパク質は、血漿中に存在し、アポタンパク質、エステル型コレステロール、トリグリセリド、リン脂質などから構成される。本実施の形態の機能改変ＣｈＥを様々なリポタンパク質を含む血漿に添加した場合、機能改変ＣｈＥに含まれるＨｐｔが高比重リポタンパク質に選択的に結合して、高比重リポタンパク質に含まれるエステル型コレステロールをＣｈＥの周囲に局在化させるため、機能改変ＣｈＥに含まれるＣｈＥは高比重リポタンパク質に含まれるエステル型コレステロールを選択的に加水分解することができる。したがって、本実施例の機能改変ＣｈＥは、高比重リポタンパク質に含まれるコレステロールの測定試薬に好適である。
【００５０】
本実施例では、ヒトの血中に多く含まれるリノール酸コレステリルおよびオレイン酸コレステリルに対する基質特異性が高いこと、インビトロ・リフォールディングの技術が確立していること、ならびに発現ベクターが市販されていることから、シュードモナス・アルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）ＮＢＲＣ３４４５株由来のＬｉｐＡをＣｈＥとして使用した。また、このＬｉｐＡに特異性を有するシャペロニンとして、同じＮＢＲＣ３４４５株由来のＬｉｐＢを使用した。
【００５１】
１．ＬｉｐＡの調製
ＮＢＲＣ３４４５株由来のＬｉｐＡ遺伝子（配列番号１（塩基配列），配列番号２（アミノ酸配列））をｐＥＴベクターにクローニングした発現ベクターｐＥＴｌｉｐＡを構築し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ）に導入した。発現ベクターを導入した形質転換体を３７℃で６時間培養した。培養液のＯＤ６００が０.６に達したときに、ＩＰＴＧを終濃度が１ｍＭとなるように培養液に添加してＬｉｐＡの発現を誘導し、３０℃で４時間培養した。
【００５２】
得られた菌体を緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８.０）に懸濁し、超音波破砕した。得られた破砕液を２００００ｇで遠心分離し、ＬｉｐＡの不溶性封入体を含むペレットを得た。ペレットを溶解緩衝液で洗浄した後、尿素を含む緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，８Ｍ 尿素，ｐＨ８.０）に懸濁し、可溶化したＬｉｐＡを調製した。
【００５３】
２．ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ融合タンパク質の調製
ＮＢＲＣ３４４５株由来のＬｉｐＢ遺伝子（配列番号３（塩基配列），配列番号４（アミノ酸配列））のＮ末端側６１残基に対応する配列（膜に結合するための配列）を除去したＬｉｐＢΔ６１遺伝子をｐＥＴベクターにクローニングした発現ベクターｐＥＴＬｉｐＢΔ６１−ＨｉｓＮを構築した。この発現ベクターのＬｉｐＢΔ６１遺伝子の上流にヒトのＨｐｔ遺伝子（配列番号５（塩基配列），配列番号６（アミノ酸配列））のタンパク質コード領域を挿入し、発現ベクターｐＥＴｈｐｔＬｉｐＢΔ６１−ＨｉｓＮを構築した。配列番号７の塩基配列は、ｐＥＴｈｐｔＬｉｐＢΔ６１−ＨｉｓＮ中のＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ融合タンパク質をコーディングする領域の塩基配列である。また、配列番号８のアミノ酸配列は、ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号８のアミノ酸配列（５２７残基）は、Ｎ末端側から、Ｈｐｔのアミノ酸配列（２４６残基）、リンカー（２残基）、ＬｉｐＢΔ６１のアミノ酸配列（２７９残基）から構成される。得られた発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。発現ベクターを導入した形質転換体を３７℃で６時間培養した。培養液のＯＤ６００が０.６に達したときに、ＩＰＴＧを終濃度が１ｍＭとなるように添加してＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ融合タンパク質の発現を誘導し、３０℃で４時間培養した。
【００５４】
得られた菌体を緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８.０）に懸濁し、超音波破砕した。得られた破砕液を２００００ｇで遠心分離し、可溶性のＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ融合タンパク質を含む上清を得た。この上清から、一般的なヒスタグ精製法を用いてＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ融合タンパク質を精製した。
【００５５】
３．ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体の調製
（１）インビトロ・リフォールディング
１で得られた可溶化したＬｉｐＡと、２で得られたＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ融合タンパク質とを尿素を含まない緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＣａＣｌ２，ｐＨ８.０）中に溶解させ、室温で３時間静置し、ＬｉｐＡとＬｉｐＢΔ６１とを会合させた（インビトロ・リフォールディング）。
【００５６】
（２）ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体の精製
（１）で生成されたＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体を含む混合溶液から、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いてＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体を精製した。
【００５７】
まず、ゲルろ過クロマトグラフィーカラム（superdex 200 10/300 GL；ＧＥヘルスケア）を緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＣａＣｌ２，ｐＨ８.０）で平衡化した。次いで、平衡化したカラムを用いてＬｉｐＡ（分子量約３０ｋＤａ）を単独で分画した。流速は０.５ｍｌ／分とし、１フラクションにつき１ｍｌずつ回収した。その結果、図２（Ａ）のクロマトグラムに示されるように、フラクション２０付近にＬｉｐＡが溶出した。同様に、ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ融合タンパク質（分子量約６０ｋＤａ）を単独で分画すると、図２（Ｂ）のクロマトグラムに示されるように、フラクション９付近にＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ融合タンパク質が溶出した。
【００５８】
次に、同じカラムを用いて、（１）で得られた混合溶液（ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体を含む）を溶出分離した。流速は０.５ｍｌ／分とし、１フラクションにつき１ｍｌずつ回収した。その結果、図２（Ｃ）のクロマトグラムに示されるように、フラクション８付近およびフラクション２０付近にピークが見られた。このことから、フラクション８付近にＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体が分画されている可能性が高いと考えられる。
【００５９】
４．ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体のリパーゼ活性の測定
ゲルろ過クロマトグラフィーで得られたフラクションのうち、２８０ｎｍの吸収がみられたフラクション（フラクション７，８，１３，１４，２０，２１，２２，２３，２５）についてリパーゼの活性を測定した。
【００６０】
その結果、図３のグラフに示されるように、フラクション７は１９２ｍＵ、フラクション８は５９０５ｍＵ、フラクション９は７８５ｍＵであった。このことから、フラクション８にＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体が分画されていることがわかる。
【００６１】
５．ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体のＡｐｏＡＩに対する特異性の評価
（１）標識ビーズの作製
３ｍｇの磁性ビーズ（粒径０.１〜０.４μｍ，アミノ基修飾）に１００μｌの緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝溶液，２.５％グルタルアルデヒド，ｐＨ７.０）を添加し、室温で振とうしながら２時間インキュベートした。２０ｍＭリン酸緩衝液で１５分間の洗浄を３回行った。得られたビーズに、ＡｐｏＡＩ溶液（２２５μｇ／ｍｌ）、ＡｐｏＢ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）または２０ｍＭリン酸緩衝液（コントロール）を１００μｌ添加し、室温で１時間振とうしながらインキュベートして、タンパク質をビーズに固定化した。この後、未固定のタンパク質を含む上清を回収し、タンパク質濃度を測定することで固定化量を推測した。
【００６２】
次いで、２０ｍＭリン酸緩衝液で１５分間の洗浄を３回行った後、得られたビーズに緩衝液（１ｍＭ Ｔｒｉｓ，２０ｍＭリン酸緩衝液）を２００μｌ添加し、２０分間インキュベートして、未反応のグルタルアルデヒドのブロッキングを行った。３回洗浄し、Ｔｒｉｓを除去した後に、ビーズへのタンパク質の非特異的な吸着を防ぐため、ブロッキング溶液（２％スキムミルク，２０ｍＭリン酸緩衝液）を添加し、１５分間インキュベートしてブロッキングした。２０ｍＭリン酸緩衝液で３回洗浄し、ＡｐｏＡＩ固定化ビーズ、ＡｐｏＢ固定化ビーズおよび非標識ビーズ（コントロール）を作製した。
【００６３】
（２）リパーゼ活性の測定
３．（１）で調製された混合溶液（ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体を含む）２００μｌをＡｐｏＡＩ固定化ビーズに添加し、室温で１時間インキュベートした。リフォールディングバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＣａＣｌ２，ｐＨ８.０）で４回洗浄した後、ビーズを１００μｌのリフォールディングバッファーに懸濁し、リパーゼの活性を測定した。このリパーゼ活性の測定結果から、ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体のＡｐｏＡＩへの結合を評価した。また、ＡｐｏＢ固定化ビーズおよび非標識ビーズ（コントロール）を用いて同様の実験を行い、ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体がＡｐｏＡＩに特異的に結合している否かを評価した。
【００６４】
リパーゼ活性は、ＢＡＬＢ（2,3-dimercaptopropan-1-ol tributyrate）の加水分解生成物とＤＴＮＢ（5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)）とがカップリングして生成するＴＮＢ（5-thio-2-nitrobenzoate）アニオンの４１２ｎｍの吸光度の変化を測定することにより評価した。具体的には、次の手順によりリパーゼ活性を測定した。
【００６５】
まず、ＢＡＬＢを終濃度が２０ｍＭになるように１００％エタノールに溶解し、ＢＡＬＢ溶液を調製した。また、ＤＴＮＢを終濃度が０.３ｍＭになるように０.１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.５）に溶解し、ＤＴＮＢ溶液を調製した。次いで、１００μｌのＤＴＮＢ溶液に５μｌのビーズ溶液と１０μｌのＢＡＬＢ溶液を添加し、３０℃で３０分間インキュベートした。その後、さらに２００μｌのアセトンを添加して、反応を停止させた。反応液を混和した後、遠心分離（２０００×ｇ，１０分間）し、上清の４１２ｎｍにおける吸光度を測定した。ブランクには、反応開始直後にアセトンを添加し、３０℃で３０分間インキュベートした後の吸光度を測定値を用いた。ＴＮＢアニオンのモル吸光係数は、１５.０６ｍＭ−１ｃｍ−１を用いた。
【数１】
【００６６】
図４は、各ビーズのリパーゼ活性測定の結果を示すグラフである。横軸はビーズの標識分子の種類、縦軸はリパーゼ比活性である。
【００６７】
図４に示されるように、ＡｐｏＡＩ標識ビーズは１０３Ｕ／ｍｇビーズ、ＡｐｏＢ標識ビーズは１２Ｕ／ｍｇビーズ、非標識ビーズ（コントロール）は７Ｕ／ｍｇビーズであった。このことから、ＨｐｔとＡｐｏＡＩとの親和性によってＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−Ｈｐｔ］複合体が他の標識ビーズよりも、ＡｐｏＡＩ標識ビーズに特異的に結合していることがわかる。したがって、本発明の機能改変ＣｈＥはＡｐｏＡＩを含有する高比重リポタンパク質を混合物の中から特異的に認識できることがわかる。
【００６８】
［実施例２］
実施例２では、機能性タンパク質として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用いて機能改変ＣｈＥを作製した例を示す。
【００６９】
ＧＦＰはオワンクラゲ由来の分子量２７ｋＤａのタンパク質であり、励起光を受けると強い蛍光を発する。ＧＦＰは基質などを必要としないため、ＧＦＰを他のタンパク質と融合させるだけで本来蛍光を発しないタンパク質が強い蛍光を発するようになる。
【００７０】
本実施例でも、実施例１と同様にシュードモナス・アルギノーサＮＢＲＣ３４４５株由来のＬｉｐＡおよびＬｉｐＢを使用した。
【００７１】
１．ＬｉｐＡの調製
実施例１と同様にして、可溶化したＬｉｐＡを調製した。
【００７２】
２．ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質の調製
実施例１と同様にして、発現ベクターｐＥＴＬｉｐＢΔ６１−ＨｉｓＮを構築した。この発現ベクターのＬｉｐＢΔ６１遺伝子の上流にＧＦＰ遺伝子を挿入し、発現ベクターｐＥＴＧＦＰＬｉｐＢΔ６１−ＨｉｓＮを構築した。配列番号９の塩基配列は、ｐＥＴＧＦＰＬｉｐＢΔ６１−ＨｉｓＮ中のＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質をコーディングする領域の塩基配列である。また、配列番号１０のアミノ酸配列は、ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１０のアミノ酸配列（５２４残基）は、Ｎ末端側から、ＧＦＰのアミノ酸配列（２３８残基）、リンカー（２残基）、ＬｉｐＢΔ６１のアミノ酸配列（２７９残基）から構成される。得られた発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。発現ベクターを導入した形質転換体を３７℃で６時間培養した。培養液のＯＤ６００が０.６に達したときに、ＩＰＴＧを終濃度が１ｍＭとなるように添加してＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質の発現を誘導し、３０℃で４時間培養した。
【００７３】
得られた菌体を緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８.０）に懸濁し、超音波破砕した。得られた破砕液を２００００ｇで遠心分離し、可溶性のＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質を含む上清を得た。この上清から、一般的なヒスタグ精製法を用いてＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質を精製した。
【００７４】
３．ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ］複合体の調製
１で得られた可溶化したＬｉｐＡと、２で得られたＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質とを１：３のモル比で尿素を含まない緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＣａＣｌ２，ｐＨ８.０）中に溶解させ、室温で３時間静置し、ＬｉｐＡとＬｉｐＢΔ６１とを会合させた（インビトロ・リフォールディング）。３時間後、混合溶液からゲルろ過法を用いてＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ］複合体を精製した。
【００７５】
４．ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ］複合体のＣｈＥ活性およびＧＦＰ活性
図５は、ゲルろ過精製により得られた各フラクションについて、ＣｈＥ活性とＧＦＰの蛍光強度を測定した結果を示すグラフである。横軸は精製サンプルのフラクション番号を示し、縦軸はＣｈＥの比活性（ｍＵ／ｍｇタンパク質）またはＧＦＰの蛍光強度（arbitrary unit；Ａ．Ｕ．）を示す。
【００７６】
フラクション７，８は、溶出時間から約９０ｋＤａの大きさと考えられ、ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ］複合体の予測分子量と一致しているフラクションである。フラクション７は、ＣｈＥ活性が２７ｍＵ／ｍｇ、ＧＦＰの蛍光強度が２５０Ａ．Ｕ．であった。フラクション８は、ＣｈＥ活性が３３ｍＵ／ｍｇ、ＧＦＰの蛍光強度が３００Ａ．Ｕ．であった。フラクション１３，１４で観察された蛍光は、ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質によるものだと考えられる。
【００７７】
以上の結果より、本実施例で作製した機能改変ＣｈＥは、インビトロ・リフォールディングの後もＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ］複合体の構造を維持していることがわかる。また、本実施例で作製した機能改変ＣｈＥは、ＣｈＥ活性だけでなくＧＦＰ活性も有していることがわかる。
【００７８】
［実施例３］
実施例３では、機能性タンパク質としてＧＦＰを用いて機能改変ＣｈＥを作製した例を示す。本実施例では、実施例２と異なる手順でインビトロ・リフォールディングを行った。
【００７９】
本実施例でも、実施例１と同様にシュードモナス・アルギノーサＮＢＲＣ３４４５株由来のＬｉｐＡおよびＬｉｐＢを使用した。
【００８０】
１．ＬｉｐＡの調製
実施例１と同様にして、可溶化したＬｉｐＡを調製した。
【００８１】
２．ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質の調製
実施例２と同様にして、ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質を精製した。
【００８２】
３．ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ］複合体の調製
１で得られた可溶化したＬｉｐＡを尿素を含む緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＣａＣｌ２，１Ｍ 尿素，ｐＨ８.０）で一晩透析した。２で得られたＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質を透析後のＬｉｐＡ溶液に加え、室温で３時間静置した。表２は、混合溶液中のＬｉｐＡおよびＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質の濃度を示す表である。さらに尿素を含まない緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＣａＣｌ２，ｐＨ８.０）で一晩透析して、ＬｉｐＡとＬｉｐＢΔ６１とを会合させた（インビトロ・リフォールディング）。混合溶液からゲルろ過法を用いてＬｉｐＡ−「ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ」複合体を精製した。
【表２】
【００８３】
４．ＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ］複合体のＣｈＥ活性
図６は、ＬｉｐＡおよびＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質の濃度（上記表参照）と、ＬｉｐＡ−「ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ」複合体のＣｈＥ活性との関係を示すグラフである。横軸はＬｉｐＡの濃度（上記表参照）を示し、縦軸はＣｈＥの比活性（ｍＵ／ｍｇタンパク質）を示す。
【００８４】
このグラフより、ＬｉｐＡおよびＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ融合タンパク質の濃度に比例して、ＬｉｐＡ−「ＬｉｐＢΔ６１−ＧＦＰ」複合体のＣｈＥ活性も上昇していることがわかる。この結果から、インビトロ・リフォールディングの後に尿素を完全に除去してもＬｉｐＡ−［ＬｉｐＢ−ＧＦＰ］複合体の構造が維持されていることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明により製造される機能改変ＣｈＥは、例えば脂質の検査試薬や有機合成の触媒として有用である。
【符号の説明】
【００８６】
１００ 折りたたまれていないＣｈＥ
１０２ 折りたたまれたＣｈＥ
１１０ シャペロニン
１２０ 機能性タンパク質
１３０ 融合タンパク質
１４０ 機能改変ＣｈＥ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレステロールエステラーゼを用意するステップと、
前記コレステロールエステラーゼに特異性を有するシャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質を用意するステップと、
前記コレステロールエステラーゼと前記融合タンパク質との複合体を形成させるステップと、
を含む、機能改変コレステロールエステラーゼの製造方法。
【請求項２】
コレステロールエステラーゼを用意するステップと、
前記コレステロールエステラーゼに特異性を有するシャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質を用意するステップと、
前記コレステロールエステラーゼと前記融合タンパク質との複合体を形成させるステップと、を含み、
前記コレステロールエステラーゼは、触媒活性を発揮するために前記シャペロニンによるフォールディングを必要とする、機能改変コレステロールエステラーゼの製造方法。
【請求項３】
前記コレステロールエステラーゼおよび前記シャペロニンのそれぞれは、その遺伝子のアミノ酸翻訳領域の全部または一部の翻訳産物である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記コレステロールエステラーゼまたは前記シャペロニンは、天然型のタンパク質である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項５】
前記コレステロールエステラーゼまたは前記シャペロニンは、天然型のタンパク質のアミノ酸置換体である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項６】
前記機能性タンパク質は、分子認識機能を有するタンパク質、触媒活性を有するタンパク質または分子標識機能を有するタンパク質である、請求項１または請求項２に記載の製造方法。
【請求項７】
前記分子認識機能を有するタンパク質は、高比重リポタンパク質を選択的に捕捉するタンパク質である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記分子認識機能を有するタンパク質は、ハプトグロビン、ＬＣＡＴ、ＣＥＴＰ、イムノグロブリン、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、プロテインＡ、プロテインＧ、ＣＤ抗原、Ｇタンパク質共役受容体からなる群から選択される、請求項６に記載の製造方法。
【請求項９】
前記触媒活性を有するタンパク質は、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、リパーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＡＴＰアーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項６に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記分子標識機能を有するタンパク質は蛍光タンパク質である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記機能性タンパク質はその遺伝子のアミノ酸翻訳領域の全部または一部の翻訳産物である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記機能性タンパク質は天然型のタンパク質である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記機能性タンパク質は天然型のタンパク質のアミノ酸置換体である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項１または請求項２に記載の製造方法で使用される融合タンパク質であって、
コレステロールエステラーゼに特異性を有するシャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質。
【請求項１５】
コレステロールエステラーゼと、
前記コレステロールエステラーゼに特異性を有するシャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質と、
を含む、機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項１６】
前記コレステロールエステラーゼおよび前記シャペロニンのそれぞれは、その遺伝子のアミノ酸翻訳領域の全部または一部の翻訳産物である、請求項１５に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項１７】
前記コレステロールエステラーゼまたは前記シャペロニンは、天然型のタンパク質である、請求項１５に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項１８】
前記コレステロールエステラーゼまたは前記シャペロニンは、天然型のタンパク質のアミノ酸置換体である、請求項１５に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項１９】
前記機能性タンパク質は、分子認識機能を有するタンパク質、触媒活性を有するタンパク質または分子標識機能を有するタンパク質である、請求項１５に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項２０】
前記分子認識機能を有するタンパク質は、高比重リポタンパク質を選択的に捕捉するタンパク質である、請求項１９に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項２１】
前記分子認識機能を有するタンパク質は、ハプトグロビン、ＬＣＡＴ、ＣＥＴＰ、イムノグロブリン、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、プロテインＡ、プロテインＧ、ＣＤ抗原、Ｇタンパク質共役受容体からなる群から選択される、請求項１９に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項２２】
前記触媒活性を有するタンパク質は、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、リパーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＡＴＰアーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１９に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項２３】
前記分子標識機能を有するタンパク質は蛍光タンパク質である、請求項１９に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項２４】
前記機能性タンパク質はその遺伝子のアミノ酸翻訳領域の全部または一部の翻訳産物である、請求項１９に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項２５】
前記機能性タンパク質は天然型のタンパク質である、請求項１９に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項２６】
前記機能性タンパク質は天然型のタンパク質のアミノ酸置換体である、請求項１９に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項１】
コレステロールエステラーゼを用意するステップと、
前記コレステロールエステラーゼに特異性を有するシャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質を用意するステップと、
前記コレステロールエステラーゼと前記融合タンパク質との複合体を形成させるステップと、
を含む、機能改変コレステロールエステラーゼの製造方法。
【請求項２】
コレステロールエステラーゼを用意するステップと、
前記コレステロールエステラーゼに特異性を有するシャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質を用意するステップと、
前記コレステロールエステラーゼと前記融合タンパク質との複合体を形成させるステップと、を含み、
前記コレステロールエステラーゼは、触媒活性を発揮するために前記シャペロニンによるフォールディングを必要とする、機能改変コレステロールエステラーゼの製造方法。
【請求項３】
前記コレステロールエステラーゼおよび前記シャペロニンのそれぞれは、その遺伝子のアミノ酸翻訳領域の全部または一部の翻訳産物である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記コレステロールエステラーゼまたは前記シャペロニンは、天然型のタンパク質である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項５】
前記コレステロールエステラーゼまたは前記シャペロニンは、天然型のタンパク質のアミノ酸置換体である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項６】
前記機能性タンパク質は、分子認識機能を有するタンパク質、触媒活性を有するタンパク質または分子標識機能を有するタンパク質である、請求項１または請求項２に記載の製造方法。
【請求項７】
前記分子認識機能を有するタンパク質は、高比重リポタンパク質を選択的に捕捉するタンパク質である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記分子認識機能を有するタンパク質は、ハプトグロビン、ＬＣＡＴ、ＣＥＴＰ、イムノグロブリン、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、プロテインＡ、プロテインＧ、ＣＤ抗原、Ｇタンパク質共役受容体からなる群から選択される、請求項６に記載の製造方法。
【請求項９】
前記触媒活性を有するタンパク質は、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、リパーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＡＴＰアーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項６に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記分子標識機能を有するタンパク質は蛍光タンパク質である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記機能性タンパク質はその遺伝子のアミノ酸翻訳領域の全部または一部の翻訳産物である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記機能性タンパク質は天然型のタンパク質である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記機能性タンパク質は天然型のタンパク質のアミノ酸置換体である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項１または請求項２に記載の製造方法で使用される融合タンパク質であって、
コレステロールエステラーゼに特異性を有するシャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質。
【請求項１５】
コレステロールエステラーゼと、
前記コレステロールエステラーゼに特異性を有するシャペロニンと機能性タンパク質とを含む融合タンパク質と、
を含む、機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項１６】
前記コレステロールエステラーゼおよび前記シャペロニンのそれぞれは、その遺伝子のアミノ酸翻訳領域の全部または一部の翻訳産物である、請求項１５に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項１７】
前記コレステロールエステラーゼまたは前記シャペロニンは、天然型のタンパク質である、請求項１５に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項１８】
前記コレステロールエステラーゼまたは前記シャペロニンは、天然型のタンパク質のアミノ酸置換体である、請求項１５に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項１９】
前記機能性タンパク質は、分子認識機能を有するタンパク質、触媒活性を有するタンパク質または分子標識機能を有するタンパク質である、請求項１５に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項２０】
前記分子認識機能を有するタンパク質は、高比重リポタンパク質を選択的に捕捉するタンパク質である、請求項１９に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項２１】
前記分子認識機能を有するタンパク質は、ハプトグロビン、ＬＣＡＴ、ＣＥＴＰ、イムノグロブリン、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、プロテインＡ、プロテインＧ、ＣＤ抗原、Ｇタンパク質共役受容体からなる群から選択される、請求項１９に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項２２】
前記触媒活性を有するタンパク質は、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、リパーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＡＴＰアーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１９に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項２３】
前記分子標識機能を有するタンパク質は蛍光タンパク質である、請求項１９に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項２４】
前記機能性タンパク質はその遺伝子のアミノ酸翻訳領域の全部または一部の翻訳産物である、請求項１９に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項２５】
前記機能性タンパク質は天然型のタンパク質である、請求項１９に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【請求項２６】
前記機能性タンパク質は天然型のタンパク質のアミノ酸置換体である、請求項１９に記載の機能改変コレステロールエステラーゼ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−２９１８５（Ｐ２０１０−２９１８５Ａ）
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１５５８７５（Ｐ２００９−１５５８７５）
【出願日】平成２１年６月３０日（２００９．６．３０）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月３０日（２００９．６．３０）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【Ｆターム（参考）】
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