機能活性抗体を誘発する髄膜炎菌性Ｂエピトープの分子模倣物
【課題】補体媒介性の殺菌活性および／またはオプソニン活性を示す抗体の産生を誘発す
る薬剤を提供すること。
【解決手段】本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（Ｍｅ
ｎＢ）Ｐ１．２血清亜型のＰｏｒＡのループ４に対する表面に露出したエピトープの分子
模倣物およびこの模倣物に対して産生される抗体を開示する。アミノ酸配列ＱＴＰを含む
ＧＮＡ３３ペプチドであって、このペプチドが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔ
ｉｄｉｓ血清型Ｂ細菌に対して、補体媒介性の殺菌活性および／またはオプソニン活性を
示す抗体の産生を誘発し得る。このような分子模倣物またはこれに対する抗体を含有する
組成物は、ＭｅｎＢ疾患を予防するため、およびＭｅｎＢ感染の診断のために使用され得
る。
る薬剤を提供すること。
【解決手段】本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（Ｍｅ
ｎＢ）Ｐ１．２血清亜型のＰｏｒＡのループ４に対する表面に露出したエピトープの分子
模倣物およびこの模倣物に対して産生される抗体を開示する。アミノ酸配列ＱＴＰを含む
ＧＮＡ３３ペプチドであって、このペプチドが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔ
ｉｄｉｓ血清型Ｂ細菌に対して、補体媒介性の殺菌活性および／またはオプソニン活性を
示す抗体の産生を誘発し得る。このような分子模倣物またはこれに対する抗体を含有する
組成物は、ＭｅｎＢ疾患を予防するため、およびＭｅｎＢ感染の診断のために使用され得
る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般的には、細菌性病原体に関する。特に、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（ＭｅｎＢ）Ｐ１．２血清亜型のＰｏｒＡのループ
４に対する表面に露出したエピトープの分子模倣物およびこの模倣物に対して産生される
抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、細菌性の髄膜炎および敗血症の原
因物質である。髄膜炎菌は、莢膜抗原および細胞壁抗原の免疫学的特徴に基づいて血清学
的な群に分類される。現在認識されている血清型は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ−１３５、Ｘ、Ｙ、
Ｚおよび２９Ｅを含む。血清型特異性の原因である多糖類は、これらの群のいくつかから
精製され、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ−１３５およびＹが挙げられる。
【０００３】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（本明細書中で「ＭｅｎＢ」または「ＮｍＢ」
と呼ばれる）は、アメリカ合衆国およびヨーロッパに居住している未成年者および小児に
おける大部分の細菌性髄膜炎の原因となる。この生物はまた、若年成人における致死的な
敗血症を引き起こす。青年では、外膜タンパク質（ＯＭＰ）小胞からなる実験的なＭｅｎ
Ｂワクチンが、幾分防御性である。しかし、ワクチン接種した未成年者（疾患の危険性が
最大の年齢層）では、防御性は、観察されていない。さらに、ＯＭＰワクチンは、血清型
特異性および亜型特異性であり、そして優性ＭｅｎＢ株は、地理的な変異および時間的な
変異の両方に制約され、このようなワクチンの有用性を制限している。
【０００４】
効果的な莢膜の多糖類に基づくワクチンは、血清型Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ１３５によって
引き起こされる髄膜炎菌性疾患に対して開発されている。しかし、ＭｅｎＢ多糖類ワクチ
ンを開発する同様な試みは、莢膜ＭｅｎＢ多糖類（本明細書中で「ＭｅｎＢ ＰＳ」と呼
ばれる）の乏しい免疫原性に起因して失敗している。ＭｅｎＢ ＰＳは、Ｎ−アセチル（
α２−＞８）ノイラミン酸のホモポリマーである。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｋ１は、同一の莢膜多糖類を有する。ＭｅｎＢ ＰＳにより誘発される抗体は、宿主のポ
リシアル酸（ＰＳＡ）と交差反応する。ＰＳＡは、胎児および新生児の組織、特に、脳組
織に見られる神経細胞接着分子（「ＮＣＡＭ」）上で大量に発現される。ＰＳＡはまた、
腎臓、心臓および嗅神経を含む成人組織で、より少ない程度に見出される。従って、ほと
んどの抗ＭｅｎＢ ＰＳ抗体はまた、自己抗体である。それゆえ、このような抗体は、胎
児の発育に悪影響を与えるか、または自己免疫疾患をもたらす可能性を有する。
【０００５】
ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体は、ＭｅｎＢ ＰＳの乏しい免疫原性を回避する試みにおいて調製されてきた。例えば、Ｃ３〜Ｃ８Ｎ−アシル置換ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体が、記載されている。Ｊｅｎｎｉｎｇｓらに対する特許文献１を参照のこと。同様に、Ｊｅｎｎｉｎｇｓらに対する特許文献２は、本明細書中で「ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ」と呼ばれるＮ−プロピオニル化ＭｅｎＢ ＰＳ分子を記載している。ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ複合糖質で免疫したマウスが、高い力価のＩｇＧ抗体を誘発することが報告された。非特許文献１。ウサギでは、２つの異なる抗体の集団（２つの異なるエピトープと結合されるといわれ、１つは、ネイティブなＭｅｎＢ ＰＳによって共有され、そして１つは共有されていない）を、誘導体を用いて作製した。殺菌活性は、ＭｅｎＢ ＰＳと交差反応しない抗体集団で見出された。非特許文献２。この結合体によって誘発される防御性抗体と反応する、細菌性表面エピトープの同一性は、未知のままである。さらに、このワクチンによって誘発される抗体の部分集合は、宿主のポリシアル酸と自己反応性を有するので（非特許文献３）、ヒトにおけるこのワクチンの安全性は、不確かなままである。
これらの試みにも関わらず、従来のアプローチは、安全かつＭｅｎＢ感染に対して広範な防御性を付与し得る抗原の同定に失敗している。
【０００６】
種々の病原体に対して防御性の免疫応答を誘発するため、ならびに癌および自己免疫疾
患の処置のために、分子模倣性抗原を使用することに、相当な関心が存在する。感染性疾
患の予防のためにワクチンを開発するこのアプローチは、名目上の抗原が毒性であるかも
しくは精製が困難である場合、または限定した数のエピトープに免疫応答を指向すること
が望ましい場合、最大の有用性を有する。それにも関わらず、病原体に対する防御性抗体
を誘発する模倣性ワクチンの成功を報告する研究は、比較的わずかしかない。
【０００７】
ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体に対して指向される多数の機能的に活性な抗体は、特許文献３に記載されている。これらの抗体は、宿主組織と、交差反応しないかまたは最小限に交差反応し、従って、自己免疫疾患を惹起する最小限の危険性をもたらす。特許文献４は、これらの抗体を使用して同定されたＭｅｎＢ ＰＳの固有なエピトープの分子模倣物を記述している。しかし、他のＭｅｎＢ抗原のペプチド模倣物の発見は、相当の関心を残している。
【０００８】
ＭｅｎＢ（ＭＣ５８株）の完全なゲノム配列は、記述されている。非特許文献４。血清殺菌性抗体応答を誘発するいくつかのタンパク質が、全体のゲノム配列決定によって同定されている。これらのタンパク質は、保存された配列を有し、そしてカプセル化されたＭｅｎＢ株上の表面に露出されているようである。非特許文献５．これらのタンパク質の１つは、ＧＮＡ３３（ゲノム由来の抗原）である。ＧＮＡ３３は、リポタンパク質であり、そして推定されたアミノ酸配列は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．由来の膜結合溶解性ムレイントランスグリコシラーゼ（ＭｌｔＡ）と相同性を示す。非特許文献６。ＧＮＡ３３は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの中で高度に保存されている。非特許文献７。組換えＧＮＡ３３で免疫したマウスは、カプセル化ＭｅｎＢ２９９６株に対して測定された場合、高い血清殺菌性抗体力価を発生した。抗体応答の大きさは、２９９６株から調製されたＯＭＰ小胞で免疫したコントロール動物の大きさと同様であった。しかし、ＧＮＡ３３が防御性抗体を誘発する機構は、同定されておらず、異なるＭｅｎＢ株に対する防御性応答の寛容も同定されていなかった。
ＭｅｎＢに対して安全かつ有効なワクチンの産生が、特に望ましいことが容易に理解さ
れる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許発明第５０４，２０２Ｂ号明細書
【特許文献２】米国特許第４，７２７，１３６号明細書
【特許文献３】米国特許第６，０４８，５２７号明細書
【特許文献４】米国特許第６，０３０，６１９号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１７０８
【非特許文献２】Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：１２０７
【非特許文献３】Ｇｒａｎｏｆｆら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５０２８
【非特許文献４】Ｔｅｔｔｅｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８０９
【非特許文献５】Ｐｉｚｚａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８１６
【非特許文献６】Ｌｏｍｍａｔｚｓｃｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９７）１７９：５４６５〜５４７０
【非特許文献７】Ｐｉｚｚａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８１６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、ＧＮＡ３３が、Ｐ１．２血清型亜型を有する株のＰｏｒＡのループ４において
、表面に露出したエピトープを模倣することによってＭｅｎＢに対する保護抗体を誘発す
るという、思いがけない発見に基づく。このような抗体の機能活性は、本明細書中に記載
されるように、ヒトにおける髄膜炎菌性疾患に対して保護する分子因子の能力を予測する
インビトロおよびインビボでの機能アッセイを用いることによって評価されている。
【００１２】
従って、一実施形態において、本発明は、ＭｅｎＢ細菌に対する機能的活性を行う抗体
の産生に有用なエピトープを含む、ＧＮＡ３３ペプチドに関する。このペプチドは、全長
未満のＧＮＡ３３配列を含む。特に好ましい実施形態において、このペプチドは、アミノ
酸配列ＱＴＰおよび、必要に応じて、ＱＴＰ配列に対してＣ末端またはＮ末端のいずれか
に生じる、さらなるＱＴＰ配列の前または後ろのフランキング配列（好ましくは１〜５０
またはそれ以上であるが全長配列ではない（例えば、１〜３、１〜５、もしくは１〜１０
または１〜２５あるいはこれらの範囲間の任意の整数値）アミノ酸）を含む。代表的なＧ
ＮＡ３３配列を図３（配列番号１）に示す。このＱＴＰは、図３の１０６〜１０８位に生
じる。この配列は、種々のＭｅｎＢ株（例えば、本明細書中に記載される）が異なるフラ
ンキング配列を有するように、図３に示されるように、ＱＴＰに隣接する配列に限定され
ないことが理解される。種々の菌株におけるＰｏｒＡ領域の配列は公知であり、そのいく
つかが、表２に示される。
【００１３】
特定の実施形態において、ＧＮＡ３３ペプチドは、以下からなる群より選択されるアミ
ノ酸配列を含む：ＦＱＴＰＶ（配列番号２）、ＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号３）、ＡＦＱＴ
ＰＶＨＳ（配列番号４）、ＱＡＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号５）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨＳ（
配列番号６）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨ（配列番号７）、ＡＱＡＦＱＴＰＶ（配列番号８）、
ＱＡＦＱＴＰＶＨＳＦ（配列番号９）、ＡＦＱＴＰＶＨＳＦＱ（配列番号１０）、ＦＱＴ
ＰＶＨＳＦＱＡ（配列番号１１）、ＱＴＰＶＨＳＦＱＡＫ（配列番号１２）、ＤＶＳＡＱ
ＡＦＱＴＰ（配列番号１２）、ＶＳＡＱＡＦＱＴＰＶ（配列番号１３）およびＳＡＱＡＦ
ＱＴＰＶＨ（配列番号１４）。
【００１４】
他の実施形態において、本発明は、血清学的に異なる外膜タンパク質の他のエピトープ
を挿入するためのキャリア、ならびに一般的なキャリアとしての、ＧＮＡ３３ポリペプチ
ドの使用に関する。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、これらのペプチドをコードするポリヌクレオチドお
よびこのポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、このベクターを含む宿主細胞、なら
びにこのペプチドを組み換え生成する方法に関する。
【００１６】
なお他の実施形態において、本発明は、ＧＮＡ３３エピトープに対する抗体に関し、こ
こで、この抗体は、ＧＮＡ３３エピトープによって結合され得、そして／またはＭｅｎＢ
細菌に対する機能活性を立証する。さらに以下に説明されるように、本明細書中に記載さ
れるアッセイを用いて決定されるように、この抗体分子がＭｅｎＢに対して補体が媒介す
る殺菌活性および／またはオプソニン活性を示す場合、抗体は、ＭｅｎＢ生物に対する機
能活性を示す。代表的なＧＮＡ３３エピトープとしては、ＱＴＰ、ＦＱＴＰＶ（配列番号
２）、ＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号３）、ＡＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号４）、ＱＡＦＱＴＰ
ＶＨＳ（配列番号５）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号６）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨ（配
列番号７）、ＡＱＡＦＱＴＰＶ（配列番号８）、ＱＡＦＱＴＰＶＨＳＦ（配列番号９）、
ＡＦＱＴＰＶＨＳＦＱ（配列番号１０）、ＦＱＴＰＶＨＳＦＱＡ（配列番号１１）、ＱＴ
ＰＶＨＳＦＱＡＫ（配列番号１２）、ＤＶＳＡＱＡＦＱＴＰ（配列番号１２）、ＶＳＡＱ
ＡＦＱＴＰＶ（配列番号１３）およびＳＡＱＡＦＱＴＰＶＨ（配列番号１４）が挙げられ
る。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、ＧＮＡ３３エピトープに対するモノクローナル抗体およびそ
れらのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。好ましくは、このモノク
ローナル抗体は、ＭｅｎＢ生物に対する機能活性を示す。
【００１８】
本発明のなおさらなる実施形態は、ＭｅｎＢのエピトープのさらなる分子模倣物（ｍｉ
ｍｅｔｉｃ）を単離するための方法およびこの方法を用いて同定される分子模倣物に関す
る。この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）ＭｅｎＢのエピトープの推定分子模倣物を含む分子集団を提供する工程；
（ｂ）存在する場合、複合体を提供するために、抗体および分子模倣物の間の免疫学的
結合を可能にする条件下で、この分子集団を、本明細書中に記載される抗体と接触させる
工程；および
（ｃ）非結合分子から複合体を分離する工程。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて、ＧＮＡ
３３、または上記のようなエピトープを含むＧＮＡ３３のペプチドを含む組成物に関する
。
【００２０】
なお別の実施形態において、本発明は、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて、Ｇ
ＮＡ３３ポリペプチドに対する抗体を含む組成物に関する。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物被験体におけるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅ
ｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂに対する免疫応答を誘発する方法に関し、この方法は、被
験体に対し、上記のようなＧＮＡ３３ペプチドを投与する工程を包含する。
【００２２】
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物被験体においてＭｅｎＢ疾患を処置または
予防するための方法に関し、この方法は、有効量の上記組成物を被験体に投与する工程を
包含する。
【００２３】
別の実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎ
ｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ抗体を検出するための方法に関し、この方法は、以下の工程
を包含する：
（ａ）生物学的サンプルを提供する工程；
（ｂ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ抗体を、上記生物学的
サンプル中に存在する場合、ＧＮＡ３３ポリペプチドに結合し得る条件下で、生物学的サ
ンプルをＧＮＡ３３ポリペプチドと反応させ、抗体／ＧＮＡ３３ポリペプチド複合体を形
成する工程；および
（ｃ）この複合体の存在または非存在を検出し、
これによって、サンプル中のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
抗体の存在または非存在を検出する工程。
【００２４】
代表的なＧＮＡ３３ポリペプチドとしては、以下からなる群より選択されるアミノ酸配
列を含む、ＧＮＡ３３ペプチドが挙げられる：ＱＴＰ、ＦＱＴＰＶ（配列番号２）、ＦＱ
ＴＰＶＨＳ（配列番号３）、ＡＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号４）、ＱＡＦＱＴＰＶＨＳ（配
列番号５）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号６）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨ（配列番号７）
、ＡＱＡＦＱＴＰＶ（配列番号８）、ＱＡＦＱＴＰＶＨＳＦ（配列番号９）、ＡＦＱＴＰ
ＶＨＳＦＱ（配列番号１０）、ＦＱＴＰＶＨＳＦＱＡ（配列番号１１）、ＱＴＰＶＨＳＦ
ＱＡＫ（配列番号１２）、ＤＶＳＡＱＡＦＱＴＰ（配列番号１２）、ＶＳＡＱＡＦＱＴＰ
Ｖ（配列番号１３）およびＳＡＱＡＦＱＴＰＶＨ（配列番号１４）。したがって、本発明
は、以下を提供する。
（１）アミノ酸配列ＱＴＰを含むＧＮＡ３３ペプチドであって、該ペプチドが、Ｎｅｉｓ
ｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ細菌に対して、補体媒介性の殺菌活性お
よび／またはオプソニン活性を示す抗体の産生を誘発し得る、ＧＮＡ３３ペプチド。
（２）項目１に記載のＧＮＡ３３ペプチドであって、該ペプチドが、ＦＱＴＰＶ（配列番
号２）、ＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号３）、ＡＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号４）、ＱＡＦＱＴ
ＰＶＨＳ（配列番号５）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号６）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨ（
配列番号７）、ＡＱＡＦＱＴＰＶ（配列番号８）、ＱＡＦＱＴＰＶＨＳＦ（配列番号９）
、ＡＦＱＴＰＶＨＳＦＱ（配列番号１０）、ＦＱＴＰＶＨＳＦＱＡ（配列番号１１）、Ｑ
ＴＰＶＨＳＦＱＡＫ（配列番号１２）、ＤＶＳＡＱＡＦＱＴＰ（配列番号１２）、ＶＳＡ
ＱＡＦＱＴＰＶ（配列番号１３）およびＳＡＱＡＦＱＴＰＶＨ（配列番号１４）からなる
群より選択されるアミノ酸配列を含む、ＧＮＡ３３ペプチド。
（３）前記ペプチドが、アミノ酸配列ＦＱＴＰＶ（配列番号２）を含む、項目２に記載の
ＧＮＡ３３ペプチド。
（４）項目１〜３のいずれか１項に記載のＧＮＡ３３ペプチド、および薬学的に受容可能
な賦形剤を含む、組成物。
（５）哺乳動物被験体において、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型
Ｂ細菌に対する免疫応答を誘発するための方法における、項目４に記載の組成物の使用。
（６）哺乳動物被験体においてＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
細菌に対する免疫応答を誘発するための方法であって、該被験体に有効量の項目４に記載
の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（７）項目１〜３のいずれか１項に記載のＧＮＡ３３ペプチドに対して指向されるモノク
ローナル抗体であって、該抗体が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清
型Ｂ細菌に対して、補体媒介性の殺菌活性および／またはオプソニン活性を示す、モノク
ローナル抗体。
（８）項目７に記載のモノクローナル抗体、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、組
成物。
（９）ＧＮＡ３３ポリペプチドに対する抗体を含む組成物であって、該抗体が、Ｎｅｉｓ
ｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ細菌に対して、補体媒介性の殺菌活性お
よび／またはオプソニン活性を示す、組成物。
（１０）前記抗体が、モノクローナル抗体である、項目９に記載の組成物。
（１１）哺乳動物被験体において、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清
型Ｂ細菌に対する免疫応答を誘発するための方法における、項目８〜１０のいずれか１項
に記載の組成物の使用。
（１２）哺乳動物被験体において、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清
型Ｂ細菌に対する免疫応答を誘発するための方法であって、該被験体に有効量の項目８〜
１０のいずれか１項に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（１３）
項目１〜３のいずれか１項に記載のペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
（１４）組換えベクターであって、以下：
（ａ）項目１３に記載のポリヌクレオチド；および
（ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結される、少なくとも１つの異種制御エレメ
ント、
を含む、組換えベクターであって、該組換えベクターによって、該ポリヌクレオチドが、
宿主細胞中で転写および翻訳され得、そして該制御エレメントの少なくとも１つが、該ポ
リヌクレオチドに対して異種である、組換えベクター。
（１５）項目１４に記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。
（１６）ＧＮＡ３３ペプチドを産生するための方法であって、該方法が、タンパク質を産
生するための条件下で、項目１５に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
（１７）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ細菌のエピトープの分
子模倣物を単離するための方法であって、該方法が、以下：
（ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ細菌のエピトープの推
定上の分子模倣物を含む分子の集団を提供する工程；
（ｂ）該分子の集団を抗ＧＮＡ３３抗体と接触させる工程であって、該抗体と該分子模
倣物（存在する場合）との間の免疫学的結合を可能にして、複合体を提供する条件下で接
触させる工程；および
（ｃ）非結合分子から該複合体を分離する工程、
を包含する、方法。
（１８）生物学的サンプル中でＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
抗体を検出するための方法における、ＧＮＡ３３ポリペプチドの使用。
（１９）生物学的サンプル中でＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
抗体を検出するための方法における、項目１〜３のいずれか１項に記載のＧＮＡ３３ペプ
チドの使用。
（２０）生物学的サンプル中でＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
抗体を検出するための方法であって、該方法が、以下：
（ａ）生物学的サンプルを提供する工程；
（ｂ）該生物学的サンプルをＧＮＡ３３ポリペプチドと反応させる工程であって、該生
物学的サンプル中に存在する場合、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清
型Ｂ抗体を、該ＧＮＡ３３ポリペプチドと結合させて、抗体／ＧＮＡ３３ポリペプチド複
合体を形成する条件下で反応させる工程、および
（ｃ）該複合体の存在または非存在を検出する工程であって、それによって、該サンプ
ル中のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ抗体の存在または非存在
を検出する工程、
を包含する、方法。
（２１）生物学的サンプル中のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
抗体を検出するための方法であって、該方法が、以下：
（ａ）生物学的サンプルを提供する工程；
（ｂ）該生物学的サンプルを項目１〜３に記載のいずれか１項に記載のＧＮＡ３３ペプ
チドと反応させる工程であって、該生物学的サンプル中に存在する場合、Ｎｅｉｓｓｅｒ
ｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ抗体を、該ＧＮＡ３３ポリペプチドと結合さ
せて、抗体／ＧＮＡ３３ポリペプチド複合体を形成する条件下で反応させる工程；および
（ｃ）該複合体の存在または非存在を検出する工程であって、それによって、該サンプ
ル中のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ抗体の存在または非存在
を検出する工程、
を包含する、方法。
本発明のこれらまたは他の実施形態は、本明細書中の開示を考慮して、当業者に容易に
なされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、抗ＧＮＡ３３抗血清（１Ａ）と生存する被包性のＮｍＢ株の表面に対する抗体との結合を示す。図１Ａは、間接性蛍光フローサイトメトリーによって決定された、ポリクローナル抗ＧＮＡ３３抗血清と、生存する被包性のＮｍＢ株２９９６、Ｍ３７３５、Ｍ４２０７、およびＭＣ５８に対するコントロールｍＡｂとの結合を示す。コントロールｍＡｂｓおよび抗血清としては、抗血清型Ｂの被膜特異的マウスｍＡｂ（ＳＥＡＭ １２，Ｇｒａｎｏｆｆら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６０：５０２８−５０３６）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清亜型ｍＡｂ抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２、およびＥ．ｃｏｌｉの外膜小胞によって免役したマウス由来のポリクローナル抗血清が挙げられる。図１Ｂは、抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂ２５とＮｍＢ株Ｍ３７３５、Ｍ４２０７、およびＭＣ５８に対するコントロールｍＡｂとの結合を示す。このマウスコントロールｍＡｂとしては、無関係の特異性を有するｍＡｂ（ＶＩＧ１０）および図１Ａについて上記と同じ抗被包性ｍＡｂおよび抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２ ｍＡｂが挙げられる。
【図２】図２は、異なるＭｅｎＢ菌株から調製され、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された総膜分画のウェスタンブロットを示す。図２Ａは、抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂ ２５との反応性を示す。レーン１、ｒＧＮＡ３３。レーン２、コントロールＥ．ｃｏｌｉ細胞から調製された総タンパク質。レーン３、４および５：それぞれ、ＭｅｎＢ菌株である、ＮＧ３／８８（Ｐｌ．１）、ＭＣ５８（Ｐ１．７，１６）、ＭＣ５８の変異体から調製された総タンパク質、ＭＣ５８変異体において、ＧＮＡ３３をコードする遺伝子が不活化されている（ＭＣ５８ΔＧＮＡ３３）。レーン６、７、８および９：それぞれ、ＭｅｎＢ菌株であるＢＺ２３２、ＢＺ２３２ΔＧＮＡ３３、ＮＭＢおよびＮＭＢΔＧＮＡ３３から調製された総タンパク質。４つの菌株全ては、血清亜型Ｐ１．５，２である。図２Ｂは、図２Ａに記載されるのと同じタンパク質サンプルのウェスタンブロットを示すが、一次検出抗体として抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２ ｍＡｂを用いている。
【図３】図３（配列番号１）は、代表的なＧＮＡ３３ポリペプチドの全長アミノ酸配列を示す。下線を引かれた１〜２１位に存在するアミノ酸は、リーダー配列に一致する。
【図４】図４は、（Ａ）ＧＮＡ３３および（Ｂ）ＰｏｒＡ Ｐ１．２（菌株２９９６）由来のセグメントに対応する連続的小ペプチドへの抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂ ２５の結合を示す。示される個々のペプチドは、各タンパク質から調製された重複する１０マーのペプチドを用いたマッピング研究から同定され、そしてｍＡｂ ２５によって認識されているエピトープを含むことが示された。
【図５】図５は、間接性蛍光フローサイトメトリーによって決定されるように、生存する被包性ＮｍＢへのマウスｍＡｂの結合を示す。試験されるｍＡｂは、図１Ｂに整列して記載されている。図５Ａは、菌株８０４７（ヒト補体を有する、ＢＣ５０＝１５μｇ／ｍｌ）およびＢＺ２３２（ヒト補体を有する、ＢＣ５０＞１５０μｇ／ｍｌ）への抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂ ２５の濃度依存性結合を示す。両方の菌株は、ウサギ（原文参照のこと）を用いて試験した場合、溶菌作用に対して感受性であった。図５Ｂは、菌株８０４７（ＰｏｒＡ ＶＲ２型Ｐ１．２−２）と比較した場合の、菌株Ｍ９８６（ＰｏｒＡ ＶＲ２型Ｐ１．２）および菌株Ｍ５６８２（ＰｏｒＡ ＶＲ２型Ｐ１．２）への抗ＧＮＡ３の濃度依存性の結合を示す。Ｍ９８６は、抗ＧＮＡ３３溶菌作用（ヒトまたはウサギ）に対して耐性であり、Ｍ５６８２は感受性であり（ウサギ補体）、そして菌株８０４７は感受性であった（ヒトまたはウサギ）。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（本発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示されなければ、免疫学、微生物学および分子生物学の慣習的な
技術を使用し、これらは当該分野の技術の範囲内である。このような技術は以下の文献で
十分説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ
およびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ（２００１）；ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＢｏｙｄ、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版、１９７３）；ＣａｒｅｙおよびＳｕｎｄｂｅｒｇ、Ａｄｖａ
ｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第２版、１９８５）；Ｓｍｉｔｈ，Ｍ
．Ｂ．，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９４）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；
およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第
Ｉ巻−第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６，Ｂ
ｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を参照のこと。
【００２７】
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形態「ａ」「ａ
ｎ」および「ｔｈｅ」は、他に指示されなければ、複数の言及を含む。
【００２８】
（Ｉ．定義）
本発明の記載において、以下の用語が使用され、そして以下に示されるように定義され
ることが意図される。
【００２９】
「ＧＮＡ３３ポリペプチド」とは、ＧＮＡ３３タンパク質由来のポリペプチドを意味し
、このポリペプチドは、ＭｅｎＢに対する免疫学的応答（例えば、以下に示すようなＭｅ
ｎＢ細菌に対する機能的活性を実証する抗体の産生）を誘発し得る。この用語は、ＧＮＡ
３３由来の個々の高分子または抗原性高分子の相同性集団もしくは異種集団を示すために
用いられ得る。本発明の目的のために、ＧＮＡ３３ポリペプチドは、種々の公知のＭｅｎ
Ｂ株のいずれかから誘導され得る。２９９６株についてのＧＮＡ３３配列を、図３（配列
番号１）に示す。しかし、他のＭｅｎＢ株由来の多数のＧＮＡ３３配列が知られている。
例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｃ８１２４４、Ｂ８２０２３、ＡＦ２２６３９５、ＡＦ
２２６３９２、ＡＦ２２６３９０、ＡＦ２２６４０３、ＡＦ２２６４１３、ＡＦ２２６４
１２、ＡＦ２２６３８７、ＡＦ２２６４０９、ＡＦ２２６４１、ＡＦ２２６３９７、ＡＦ
２２６３８９、ＡＦ２２６３９３、ＡＦ２２６４１６、ＡＦ２２６４１４、ＡＦ２２６４
０２、ＡＦ２２６４０４、ＡＦ２３５１４５、ＡＦ２３５１４４、ＡＦ２３５１４３、Ｎ
ｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；Ｅ８３４９１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰＡＯ１株）；ＡＦ３００４７１、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏ
ｂｉｌｉｓ；ＡＡＫ８５８３４、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
；ＣＡＣ４１３９６、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ；ＡＡＫ２５７０
２、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ；Ｓ７６３３４、Ｓｙｎｅｃｈｏｃ
ｙｓｔｉｓ ｓｐ．（ＰＣＣ ６８０３株）；ＡＡＫ０３０１２、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌ
ａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ；Ｑ９ＫＰＱ４、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ；ＡＡＢ４０
４６３、ＡＡＣ４５７２３、Ｐ４６８８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；Ｐ５７
５３１、Ｂｕｃｈｎｅｒａ ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ ｐｉ
ｓｕｍ）；ＮＰ１４３７１４、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉを参照のこ
と。
【００３０】
本明細書中に使用される場合、「ＧＮＡ３３ポリペプチド」はまた、シグナル配列（図
３のアミノ酸１〜２１）を有するか、またはそれを有さない、全長ＧＮＡ３３参照配列を
含む、ネイティブのＧＮＡ３３配列由来の分子、および組換え産生または化学合成された
ＧＮＡ３３ポリペプチド、ならびに下記のように免疫原性を保持するＧＮＡ３３ペプチド
を含む。
【００３１】
用語「アナログ」とは、参照分子の誘導体をいう。アナログは、上記のような、生物学
的活性（例えば、ＭｅｎＢに対する機能的活性を有する抗体の形成を誘発する能力）を保
持し得る。一般に、用語「アナログ」とは、改変が活性を損なわない限りにおける、ネイ
ティブの分子に対して１以上のアミノ酸の付加、（一般的には、性質が保存される）置換
、および／または欠失を有するネイティブのポリペプチドの配列および構造を有する化合
物をいう。好ましくは、アナログは、親分子と少なくとも同じ生物学的活性を有し、そし
て親分子よりも増強された活性さえ示し得る。ポリペプチドアナログを作製するための方
法は、当該分野において公知であり、以下にさらに記載される。
【００３２】
例えば、アナログは、一般的には、参照分子に対して少なくとも約５０％のアミノ酸同
一性を有し、より好ましくは、問題のネイティブペプチド配列の関連する部分に対して約
７５〜８５％の同一性、そして最も好ましくはそれに対して約９０〜９５％以上の同一性
を有する。そのアミノ酸配列は、約１０〜７５アミノ酸以下の置換を有するか、約５〜５
０アミノ酸以下の置換を有するか、または１、２、３もしくは５つまでの置換有するのみ
であるか、あるいは上記の範囲の間の任意の置換を有する。特に好ましい置換は、一般に
、性質を保存する（すなわち、これらの置換は、アミノ酸のファミリー内で起こり得る）
。この事について、アミノ酸は、一般的に、以下の４つのファミリーに分類される：（１
）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、
ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、
フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、；ならびに（４）非荷電極性−−グリ
シン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニ
ルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、しばしば、芳香族アミノ酸として分類
される。例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリンとの単発的置換、またはその逆；
アスパラギン酸とグルタミン酸との単発的置換またはその逆；トレオニンとセリンとの単
発的置換またはその逆；あるいは、アミノ酸と、構造的に関連するアミノ酸との類似の保
存的置換が、その活性に対する主要な効果を有さないことは、理論的に予想できる。従っ
て、参照分子と本質的に同じアミノ酸配列を有するが、そのタンパク質の免疫原性に実質
的に影響しない、主要でないアミノ酸置換を有するタンパク質は、ＧＮＡ３３ポリペプチ
ドの定義の範囲内である。当業者は、本明細書中で規定される生物学的活性を保持すると
いう理論的な見こみをもって改変され得る目的の分子の領域を容易に決定し得る。
【００３３】
「ＧＮＡ３３ペプチド」とは、全長に満たない問題の参照ＧＮＡ３３分子を含み、かつ
以下に規定される少なくとも１つのエピトープを含む、本明細書中に記載されるＧＮＡ３
３ポリペプチドである。従って、ＧＮＡ３３ペプチドを含む組成物は、全長分子の一部を
含むが、問題のＧＮＡ３３ペプチドの全ては含まない。ＧＮＡ３３ペプチドの非限定の例
としては、ＱＴＰ、ＦＱＴＰＶ（配列番号２）、ＦＱＴＲＶＨＳ（配列番号３）、ＡＦＱ
ＴＰＶＨＳ（配列番号４）、ＱＡＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号５）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨＳ
（配列番号６）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨ（配列番号７）、ＡＱＡＦＱＴＰＶ（配列番号８）
、ＱＡＦＱＴＰＶＨＳＦ（配列番号９）、ＡＦＱＴＰＶＨＳＦＱ（配列番号１０）、ＦＱ
ＴＰＶＨＳＦＱＡ（配列番号１１）、ＱＴＰＶＨＳＦＱＡＫ（配列番号１２）、ＤＶＳＡ
ＱＡＦＱＴＰ（配列番号１２）、ＶＳＡＱＡＦＱＴＰＶ（配列番号１３）およびＳＡＱＡ
ＦＱＴＰＶＨ（配列番号１４）が挙げられる。
【００３４】
ＭｅｎＢの「分子模倣物」とは、ＭｅｎＢ細菌上で発現される少なくとも１つのエピト
ープを機能的に模倣する分子である。そのような分子模倣物は、ワクチン組成物として、
および以下にさらに記載されるような、診断適用または治療適用のための抗体の誘発に有
用である。分子模倣物としては、以下：低分子有機化合物、核酸および核酸誘導体；多糖
またはオリゴ糖；ペプチド、タンパク質およびそれらの誘導体を含むペプチド模倣物（例
えば、非ペプチド有機部分を含有するペプチド、合成ペプチド（これらはアミノ酸結合お
よび／またはペプチド結合を保有していても、保有してなくてもよいが、ペプチドリガン
ドの構造的特徴および機能的特徴を保持している））；ピロリジン；ペプトイドおよびオ
リゴペプトイド（これらはＮ置換グリシン（例えば、Ｓｉｍｏｎら、（１９９２）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：９３６７により記載されるＮ置換グリシ
ン）を含む分子である）ならびに抗体（抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるが、
これらに限定されない。分子模倣物を同定および産生するための方法が、以下により詳細
に記載される。
【００３５】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体調製物およびモノクローナル抗体調製物、ならび
にハイブリッド抗体、変更された抗体、ヒト化抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（
ａｂ）分子、Ｆｖフラグメント、ファージ上に提示された単鎖フラグメント改変体（ｓｃ
Ｆｖ）、単一ドメイン抗体、キメラ抗体および本発明の抗体分子の免疫学的結合特性を示
すそれらの機能性フラグメントを含む調製物を包含する。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「モノクローナル抗体」とは、相同性抗体集団を有する
抗体組成物をいう。この用語は、それが作製される様式により限定されない。この用語は
、免疫グロブリン分子、ならびにＦａｂ分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグ
メント、ファージ上に提示された単鎖フラグメント改変体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体およ
び本発明のモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示す他の分子を包含する。ポリ
クローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は、当該分野において公知であ
り、そして以下により十分に記載される。
【００３７】
「エピトープ」とは、特異的なＢ細胞およびＴ細胞が応答する抗原上の部位を意味する
。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と互換的に使用され得る。タ
ンパク質、多糖、またはその他の生体ポリマー上のＢ細胞エピトープ部位は、折りたたみ
によって同時に送達される高分子の異なる部分由来の部分で構成され得る。この種のエピ
トープは、コンフォメーショナルエピトープまたは不連続なエピトープとして参照される
。なぜなら、この部位は、そのポリマーが直鎖状配列においては不連続だが、折りたたま
れたコンフォメーションにおいて連続的であるポリマーのセグメントからなるためである
。生体ポリマーまたは他の分子の単一セグメントからなるエピトープは、連続的エピトー
プまたは直鎖状エピトープと呼ばれる。Ｔ細胞エピトープは、一般的に、直鎖状のペプチ
ドに切断される。ペプチドエピトープは、このエピトープに特異的な空間的なコンフォメ
ーションの５以上のアミノ酸を含み得る。一般的に、エピトープは、少なくとも５〜８の
そのようなアミノ酸からなり、より一般には、少なくとも８〜１０以上のそのようなアミ
ノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該分野におい
て公知であり、例えば、Ｘ線結晶解析および二次元核磁気共鳴分光法を含む。
【００３８】
エピトープは、任意の多くの当該分野において周知のエピトープマッピング技術を用い
て同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．６６（Ｇｌｅ
ｎｎ Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ
ｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、直鎖状エピトープは、例えば、固体支持体上
に多数のペプチドを同時に合成し（これらのペプチドは、タンパク質分子の部分に対応す
る）そしてこれらのペプチドがなお、支持体に付着されている状態で、これらのペプチド
と抗体とを反応させることによって決定される。そのような技術は、当該分野において公
知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎ
ら、（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５（これらのすべて
は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載される。同様に、コンフォメ
ーショナルエピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴分光法により、ア
ミノ酸の空間的コンフォメーションを決定することによって容易に同定される。例えば、
Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（前出）を参照のこと。例えば、
Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７：１０５−１３２；ならびにＨ
ｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８１）
７８：３８２４−３８２８に記載されるように、２０のアミノ酸の各々の疎水特性および
親水特性を利用して、タンパク質のアミノ酸配列からヒドロパシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈ
ｙ）スケールを公式化するコンピュータープログラムもまた用いられて、所定の分子の抗
原性部分を決定し得る。例えば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄの技術は、各々のアミノ酸に複
数の親水性値を割り当て、次いでペプチド鎖に沿って、反復的にこれらの値を平均する。
局所的平均親水性の最も高い点は、その分子の抗原性部分を示す。
【００３９】
抗体は、その抗体分子が補体により媒介される細菌活性を示し、そして／または本明細
書中に記載されるアッセイを用いて決定されるようなＭｅｎＢに対するオプソニン活性を
示す場合に、ＭｅｎＢ生物に対する「機能的活性」を示す。
【００４０】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対していう場合、「精製された」または「単離
された」とは、同じ型の他の生体高分子の実質的非存在下で、指示された分子が存在する
ことを意味する。本明細書中で使用される場合、用語「精製された」とは、同じ型の生物
学的高分子が、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％
、なおより好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量
％が存在することを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離された」ポリヌク
レオチドとは、目的のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸
分子をいう；しかし、この分子は、その組成物の塩基特性に有害な影響を与えない幾分か
の追加の塩基または部分を含み得る。
【００４１】
「組換えＧＮＡ３３ポリペプチド」とは、上記の技術を用いて測定される生物学的活性
を有し、本明細書中に記載されるような組換えＤＮＡ技術により調製される、ＧＮＡ３３
ポリペプチドが意図される。一般的に、所望のＧＮＡ３３ポリペプチドをコードする遺伝
子は、以下でさらに記載されるように、クローニングされ、次いで形質転換された生物中
で発現される。宿主生物は、発現条件下で、外来遺伝子を発現してＧＮＡ３３ポリペプチ
ドを産生する。組換え的に調製される場合、本発明のポリペプチドは、通常細胞中に存在
する他の分子の非存在下で産生され得る。例えば、組換え非ＭｅｎＢ宿主細胞により産生
される唯一のＭｅｎＢタンパク質は、組換えＧＮＡ３３ポリペプチドであるので、Ｍｅｎ
Ｂタンパク質汚染のいかなる痕跡もないＧＮＡ３３ポリペプチド組成物は、容易に得るこ
とができる。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、任
意の長さのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、ヌクレオチ
ドの重合体形態をいう。この用語は、この分子の１次構造のみをいい、従って、二本鎖お
よび一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを含む。それはまた、公知の型の改変、例えば、当該分
野において公知の標識、メチル化、「キャップ」、天然に存在する１つ以上のヌクレオチ
ドとアナログとの置換、例えば、非荷電の連結（例えば、メチルホスフェート、ホスホト
リエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）および荷電された連結（例えば、ホス
ホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有する内部ヌクレオチド改変、例えば、タ
ンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリＬリジン等を含
む）のようなペンダント基を有する改変、インターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏ
ｒ）（例えば、アクリジン、ソラレン等）での改変、キレート（例えば、金属、放射性金
属、ホウ素、酸化金属等）を含む改変、アルキル化剤（ａｌｋｙｌａｔｏｒ）を含む改変
、改変された連結（例えば、αアノマー核酸等）での改変、ならびに改変されていない形
態のポリヌクレオチドもまた含む。
【００４３】
本明細書中で使用される用語「組換えＤＮＡ分子」または「組換えポリヌクレオチド」
は、ゲノム起源のポリヌクレオチド、ｃＤＮＡ起源のポリヌクレオチド、半合成起源ポリ
ヌクレオチド、または合成起源のポリヌクレオチドをいい、それらは、その起源または操
作によって、以下：（１）それが天然で会合するポリヌクレオチドの全てまたは一部と会
合していないか、（２）それが天然で連結するポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチド
に連結しているか、（３）天然に存在しないポリヌクレオチドである。従って、この用語
は、「合成により誘導された」核酸分子を包含する。
【００４４】
「コード配列」とは、適切な調節配列の制御下に配置される場合に、通常、ｍＲＮＡを
介して、ポリペプチドへと翻訳される核酸分子である。コード配列の境界は、５’末端の
翻訳開始コドンおよび３’末端の翻訳終結コドンにより決定され得る。コード配列として
は、ｃＤＮＡおよび組換えヌクレオチド配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００４５】
「制御配列」とは、それらが連結しているコード配列の発現をもたらすのに必要な核酸
配列をいう。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なる；原核生物におい
て、そのような制御配列は、一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写
終結配列を含む；真核生物において、そのような制御配列は、プロモーターおよび転写終
結配列を含む。用語「制御配列」とは、最小で、コード配列の発現に必要な全ての成分を
含み、そして追加の成分（例えば、リーダー配列および融合パートナー配列）も含み得る
ことが意図される。
【００４６】
制御エレメント（例えば、プロモーター）は、ＲＮＡポリメラーゼがこのプロモーター
に結合し、そしてコード配列をｍＲＮＡに転写するときに細胞内のコード配列の「転写を
指向し」、次いでこのｍＲＮＡは、そのコード配列によりコードされるポリヌクレオチド
へと翻訳される。
【００４７】
「作動可能に連結される」とは、そのように記載された成分が、それらの意図された様
式にて機能することを可能にする関係にある近位をいう。コード配列に「作動可能に連結
される」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合する条件下で達成されるよう
な方法にて連結される。制御エレメントは、そのコード配列の発現を方向づけるように機
能する限り、コード配列と連続している必要はない。従って、例えば、介在する、翻訳さ
れないが転写される配列は、プロモーターとコード配列との間に存在し得、そのプロモー
ターは、コード配列に「作動可能に連結される」と考えられ得る。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「発現カセット」とは、制御配列（これは、コード
配列のクローニングされたコピーの転写および適切な宿主細胞におけるｍＲＮＡの翻訳に
必要な全てのヌクレオチド配列を含む）に作動可能に連結される少なくとも１つのコード
配列を含む分子をいう。このような発現カセットは、細菌、藍藻類、植物細胞、酵母細胞
、昆虫細胞および動物細胞のような種々の宿主において真核生物遺伝子を発現させるため
に使用され得る。本発明において、発現カセットとしては、クローニングベクター、具体
的に指定されたプラスミド、ウイルスまたはウイルス粒子が挙げられ得るが、これらに限
定されない。このカセットは、宿主細胞中での自律複製のための複製起点、選択マーカー
、種々の制限部位、高コピー数のための能力および強いプロモーターをさらに含み得る。
【００４９】
「ベクター」とは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイ
ルスなどのような任意の遺伝エレメントを意味する。これらは、適切な制御エレメントと
関連づけられた場合に複製し得、細胞間で遺伝子配列を移動させ得る。従って、この用語
は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【００５０】
細胞は、ポリヌクレオチドが細胞膜内部に挿入された場合に外因性ポリヌクレオチドに
より「形質転換される」。この外因性ポリヌクレオチドは、細胞のゲノムを構成する染色
体ＤＮＡに組み込まれても（共有結合されても）よいし、されなくてもよい。原核生物細
胞および酵母において、例えば、外因性ＤＮＡは、エピソームエレメント（例えば、プラ
スミド）上で維持され得る。真核生物細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、外因
性ＤＮＡが染色体複製を通じて娘細胞により遺伝されるように染色体へと組み込まれた細
胞である。この安定性は、真核生物細胞が、この外因性ＤＮＡを含む細胞株または娘細胞
の集団から構成されるクローンを樹立する能力により示される。
【００５１】
「宿主細胞」は、形質転換された細胞または外因性核酸分子により形質転換され得る細
胞である。
【００５２】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチド部分間での同一
性％をいう。２つのＤＮＡ、または２つのポリペプチドの配列が、その分子の規定の長さ
にわたり、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約７５％、より好ましくは、少
なくとも約８０〜８５％、好ましくは、少なくとも約９０％、そしてもっとも好ましくは
、少なくとも約９５〜９８％の配列同一性を示すか、または特定の範囲の間で任意の同一
性％を示す場合、これら２つのＤＮＡ、または２つのポリペプチド配列は、互いに「実質
的に同じ」である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同な、はまた、特定のＤＮ
Ａ配列または特定のポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。
【００５３】
概して、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列
に、それぞれ、正確なヌクレオチド間の対応またはアミノ酸間の対応があることをいう。
同一性％は、２つの分子の配列を整列させ、この２つの整列された配列間の正確なマッチ
数を係数し、短い方の配列の長さで除し、結果に１００をかけることによるこれら分子間
の配列情報の直接比較により決定され得る。整列は、目的の配列と同一数のアミノ酸を有
する配列を用いて行われ得る。
【００５４】
好ましくは、天然に存在するタンパク質改変体または天然に存在しないタンパク質改変
体は、図３（配列番号１）に由来する特定のＧＮＡ３３ポリペプチドと、少なくとも７０
％、８０％、８５％、９０％、９２％または９５％以上同一のアミノ酸配列を有する。よ
り好ましくは、この分子は、９８％または９９％同一である。配列同一性％は、ギャップ
オープンペナルティー１２およびギャップ伸長ペナルティー２、ＢＬＯＳＵＭマトリクス
６２による、アフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索
アルゴリズムを使用して決定される。このＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アル
ゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４
８２−４８９（１９８１）において教示される。
【００５５】
あるいは、相同性は、相同領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でポリヌクレオチド
のハイブリダイゼーション、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、および消化した
フラグメントのサイズ決定により決定され得る。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、
特定の系について規定されるストリンジェントな条件下で、サザンハイブリダイゼーショ
ン実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当
該分野の技術範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ（前出）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（前出）を参照
のこと。
【００５６】
用語「有効量」または「薬学的に有効な量」とは、非毒性であるが、所望の生物学的結
果を提供するに十分な薬剤の量をいう。その結果は、本明細書中のアッセイを使用して決
定される、ＭｅｎＢに対する機能的活性を有する抗体の生成であり得る。さらに、その量
は、髄膜炎菌性疾患の症状、徴候または原因の軽減および／または改善を引き起こすに十
分であり得る。任意の個々の症例における適切な「有効」量は、慣用的な実験法を使用し
て、当業者により決定され得る。
【００５７】
「薬学的に受容可能な」または「薬理学的に受容可能な」とは、生物学的でない、さも
なければ所望でない材料を意味する。すなわち、その材料は、所望でない生物学的効果を
引き起こすことも、含まれる組成物の成分のいずれによっても有害な様式にて相互作用す
ることもなく、個体に投与され得る。
【００５８】
「生理学的ｐＨ」または「生理学的範囲のｐＨ」とは、約７．２〜８．０の範囲のｐＨ
、より代表的には、約７．２〜７．６の範囲のｐＨを意味する。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「哺乳動物」としては、哺乳動物網の任意のメンバ
ー：ヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー）、および他のサル（ａｐｅ）およびサ
ル（ｍｏｎｋｅｙ）種：家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ
、ヤギ、ブタ）；ペット（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）（例えば、ウサギ、イヌ、
およびネコ）；実験動物（ラット、マウスおよびモルモットなどのような齧歯類を含む）
が挙げられるが、これらに限定されない。この用語は、特定の年齢も性別も意味しない。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫学的に結合（する）」および「免疫学的な結
合特性」とは、免疫グロブリン分子と抗原（これに、その免疫グロブリンが特異的である
）との間に生じる、非共有結合的相互作用の型をいう。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された組織
または流体のサンプル（このサンプルとしては、例えば、血液、血漿、血清、糞便、尿、
骨髄、胆汁、髄液、リンパ液、皮膚サンプル、皮膚、呼吸管、腸管および尿生殖管の外分
泌物、涙、唾液、乳汁、血球、器官、生検が挙げられるが、これらに限定されない）そし
てまた、インビトロの細胞培養物の構成成分のサンプル（このサンプルとしては、培養培
地中の細胞および組織（例えば、組換え細胞）および細胞成分の増殖から得られた馴化培
地が挙げられるが、これらに限定されない）をいう。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、用語「標識」および「検出可能な標識」とは、検出し得
る分子をいい、これらとしては、放射活性同位体、蛍光剤（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、化
学発光剤（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素イン
ヒビター、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチンまたはハ
プテン）などが挙げられるが、これらに限定されない。用語「蛍光分子」とは、検出可能
な範囲にて蛍光を示し得る物質またはその部分をいう。本発明において使用され得る標識
の特定の例としては、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキ
サスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨ、およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。
【００６３】
（ＩＩ．本発明を実施する態様）
本発明は、ＧＮＡ３３（Ｅ．ｃｏｌｉ ムレイントランスグリコシラーゼと相同性を有
するリポタンパク質）が、血清型Ｐ１．２の株においてＰｏｒＡのループ４上のエピトー
プを模倣する結果として、防御抗体を惹起するという発見に基づく。ＧＮＡ３３は、生細
菌では表面に露出していないが、細胞質周辺腔に位置する。重複ペプチドを使用した殺菌
性抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂのエピトープマッピングにより、このｍＡｂがＧＮＡ３３由来の
ペプチドおよびＰｏｒＡ（結合に必要なＱＴＰ配列を共有する）由来のペプチドを認識す
ることが示される。フローサイトメトリーにより、抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂは、コントロー
ル抗ＰｏｒＡ（Ｐ１．２）ｍＡｂと同様に、Ｐ１．２血清型の大部分のＭｅｎＢ株の細菌
表面に結合する。抗ＧＮＡ３３抗体は、Ｐ１．２株でチャレンジした新生仔ラットにおい
て受動性防御を付与する。従って、ＧＮＡ３３は、ＰｏｒＡに対する防御抗体を惹起する
新規な模倣物である。ＰｏｒＡとは異なり、ＧＮＡ３３は、投与された場合、タンパク質
を再生する必要性なくして防御抗体を惹起する。本明細書中において本発明者らは、ＧＮ
Ａ３３が今日までに同定されたもっとも強力な模倣抗原のうちの１つであることを発見し
た。
【００６４】
ＧＮＡ３３が、ＰｏｒＡ Ｐ１．２エピトープの免疫学的模倣を示すという発見は、Ｐ
１．２株（これは、米国における血清型Ｂ単離株の約８％を示す（Ｔｏｎｄｅｌｌａら、
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）３８：３３２３−３３２８））により
引き起こされる疾患の予防のためのワクチンにおける使用についてのＧＮＡ３３の有用性
を立証する。さらに、他のＰｏｒＡループをＧＮＡ３３またはＧＮＡ３３のサブドメイン
に弛緩することにより、髄膜炎菌の多価ワクチンにおける抗原として有用な他の血清亜型
ＰｏｒＡエピトープの免疫学的模倣物を生成することが可能である。このようなワクチン
は、組換えＰｏｒＡに基づくワクチンを超える多くの利点を有する。例えば、このような
ワクチンの調製は、界面活性剤による抽出も、再折りたたみも、脂質ビヒクル中での再構
成もする必要なく、従来のように非感染性Ｅ．ｃｏｌｉにおいて大量に発現され得るｒＧ
ＮＡ３３として非常に簡単にされる。また、疾患を引き起こす新たに出現したＮｍＢ株由
来のＰｏｒＡ改変体のエピトープ含有セグメントは、必要に応じて、ＧＮＡ３３に置換さ
れ得る。
【００６５】
従って、ＧＮＡ３３ポリペプチド、ＧＮＡ３３ペプチド、ＧＮＡ３３抗体および他のＭ
ｅｎＢ模倣物は、診断試薬として、および／またはＭｅｎＢ疾患を予防するための組成物
中で使用され得る。ＧＮＡ３３に対して調製される抗体は、ＭｅｎＢ細菌に対する機能的
活性を示し、ここで、機能的活性は、ＭｅｎＢ疾患に対する防御を付与する際に重要であ
る。この抗体は、アイソタイプに関して、抗原的特異性および機能的活性が十分に特徴づ
けられ得る。
【００６６】
本発明での使用のためのＧＮＡ３３ポリペプチドは、当該分野で公知の技術を使用して
、このポリペプチドを生成する細菌から直接単離され得る。あるいは、このポリペプチド
は、ペプチド分野の当業者に公知のいくつかの技術のいずれかにより、化学合成され得る
。例えば、固相ペプチド合成技術については、Ｊ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．Ｄ．Ｙ
ｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃ
ｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，１９８４）ならびにＧ．Ｂａ
ｒａｎｙおよびＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈ
ｏｆｅｒ編，第２巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０），
ｐｐ．３−２５４、ならびに従来の溶液合成については、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅ
ｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ １９８４）ならびにＥ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏ
ｆｅｒ編，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，第１巻を参照のこと。本発明のポリペプチドはまた、同時に複数のペプチドを
合成する方法により化学的に調製され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：５１３１−５１３５；米国特許第４
，６３１，２１１号を参照のこと。
【００６７】
好ましくは、ポリペプチドは、分子生物学の標準的な技術を使用して、このポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドの発現により組換え生成される。例えば、上記の分子を
コードするポリヌクレオチド配列は、例えば、その遺伝子を発現する細菌に由来する、ｃ
ＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーをスクリーニングするか、またはこの遺伝
子を含むことが公知のベクターからこの遺伝子を得ることにより、組換え方法を使用して
得られ得る。さらに所望の遺伝子は、この遺伝子を含む細胞から、標準的な技術（例えば
、フェノール抽出およびｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲ）を使用して、直接単離さ
れ得る。例えば、ＤＮＡを獲得および単離するために使用される技術の記載については、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと。目的の遺伝子はまた、クローニングされるよ
りむしろ、合成により生成され得る。この分子は、特定の配列についての適切なコドンを
使用して設計され得る。次いで、完全な配列は、標準的な方法により調製される重複オリ
ゴヌクレオチドから組み立てられ、完全なコード配列へと組み立てられる。例えば、Ｅｄ
ｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２２３：１２９９；およびＪａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
５９：６３１１を参照のこと。
【００６８】
従って、特定のヌクレオチド配列は、所望の配列を有するベクターから得られ得るか、
または当該分野で公知の種々のオリゴヌクレオチド合成技術（例えば、適切な場合、ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術）を使用して完全にまたは一部合成され得る。例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと。特に、所望の配列をコードするヌクレオチド
配列を得る１つの方法は、従来の自動化ポリヌクレオチド合成機にて生成された重複合成
オリゴヌクレオチドの相補的なセットをアニーリングさせ、続いて、適切なＤＮＡリガー
ゼと連結し、連結したヌクレオチド配列を、ＰＣＲを介して増幅させることによる。例え
ば、Ｊａｙａｒａｍａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８８：４０８４−４０８８を参照のこと。さらに、オリゴヌクレオチド特異的合成（Ｊ
ｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ５４：７５−８２）、すでに存在するヌクレオチ
ド領域のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔ
ｕｒｅ ３３２：３２３−３２７およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２３９：１５３４−１５３６）、およびギャップ形成されたオリゴヌクレオチド（ｇ
ａｐｐｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用した
酵素的充填（Ｑｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：１００２９−１００３３）は、改変された抗原結合能力または増強された抗原結
合能力を有する分子を提供するために、本発明にて使用され得る。
【００６９】
一旦、コード配列が調製または単離されると、このような配列は、任意の適切なベクタ
ーまたはレプリコンにクローン化され得る。多数のクローニングベクターが当業者に公知
であり、そして適切なクローニングベクターの選択が可能である。適切なベクターとして
は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体または適切なコントロー
ルエレメントと会合した場合に複製し得るウイルスが挙げられるが、これらに限定されな
い。
【００７０】
次いで、コード配列は、発現のために使用される系に依存して、適切なコントロールエ
レメントの制御下に置かれる。従って、このコード配列は、プロモータ、リボソーム結合
部位（細菌の発現のため）、および必要に応じて、オペレーターの制御下に置かれ得、そ
の結果、目的のＤＮＡ配列は、適切な形質転換体によってＲＮＡに転写される。このコー
ド配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列をコードする配列（これは後に、翻訳後
プロセシングにおいて、宿主によって除去され得る）を含んでも含まなくても良い。例え
ば、米国特許第４，４３１，７３９号；同第４，４２５，４３７号；同第４，３３８，３
９７号を参照のこと。シグナル配列が存在する場合、ネイティブな配列であり得るか、ま
たは非相同的なシグナル配列のいずれかであり得る。
【００７１】
制御配列に加えて、宿主細胞の増殖に関連した配列の発現の調節を可能にする調節配列
を加えることが所望であり得る。調節配列は、当業者に公知であり、そして例としては、
調節化合物の存在を含む、化学的刺激または物理的刺激に対してオンまたはオフにされる
遺伝子の発現を引き起こすものが挙げられる。他の型の調節エレメントはまた、ベクター
中に存在し得る。例えば、エンハンサーエレメントは、構築物の発現レベルを増加するた
めに本明細書中で使用され得る。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊ
ｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１）、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復
（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６７７７）およびヒトＣＭＶに由来す
るエレメント（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１）（例えば、ＣＭ
ＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント（米国特許第５，６８８，６８８））が挙げら
れる。発現カセットはさらに、適切な宿主細胞において自律的に複製するための複製起点
、１つ以上の選択マーカー、１つ以上の制限部位、高いコピー数についての可能性および
強力なプロモーターを含む。
【００７２】
発現ベクターは、特定のコード配列が適切な制御配列と共にベクター中に位置するよう
に構築され、制御配列に対するコード配列の位置および配向は、コード配列が制御配列の
「制御」下で転写されるように存在する（すなわち、制御配列のＤＮＡ分子に結合するＲ
ＮＡポリメラーゼは、コード配列を転写する）。目的の分子をコードする配列の改変は、
この目的を達成するために所望であり得る。例えば、いくつかの場合において、適切な配
向で配列が制御配列に付着し得るように配列を改変することすなわち、リーディングフレ
ームを維持することが必要であり得る。制御配列および他の調節配列は、ベクターへの挿
入の前にコード配列に連結され得る。あるいは、コード配列は、制御配列および適切な制
限部位をすでに含む発現ベクターに直接クローニングされ得る。
【００７３】
上に説明されるように、参照ＧＮＡ３３ポリペプチドの変異体またはアナログを生成す
ることが所望であり得る。変異体またはアナログは、ＧＮＡ３３ポリペプチドをコードす
る配列の一部の欠損によって、配列の挿入によって、および／または配列内での１つ以上
のヌクレオチドの置換によって、調製され得る。ヌクレオチド配列を改変するための技術
（例えば、部位特異的変異誘発など）は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、前出；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：４４８；Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒら（１９８７）Ｂｉｏ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５：７８６；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ（１９８３）Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８；Ｄａｌｂａｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら
（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７９：６４０９を参照の
こと。
【００７４】
分子は、昆虫発現系、哺乳動物発現系、細菌発現系、ウイルス発現系および酵母発現系
を含む広範な種々の系において発現され得、これらは全て当該分野で公知である。例えば
、昆虫細胞発現系（例えば、バキュロウイルス系）は、当業者に公知であり、そして例え
ば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）にお
いて記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、特
に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ（「ＭａｘＢａｃ」キット）から
キットの形態で市販されている。同様に、細菌および哺乳動物細胞発現系は、当該分野で
周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、において記載されている。酵母
発現系はまた、当該分野で公知であり、そして例えば、Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒら編、１９８９）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄ
ｏｎにおいて記載されている。
【００７５】
上の系を用いる使用のための多数の適切な宿主細胞がまた公知である。例えば、哺乳動
物細胞株は、当該分野で公知であり、そして例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞、ＨｅＬａ細胞、乳児ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒ
ト胚腎細胞、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ
腎（「ＭＤＢＫ」）細胞、およびその他を含むがこれらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死
化細胞株を含む。同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、および
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．のような細菌宿主は、本発明の発現構築物を用い
る用途を見出す。本発明において有用な酵母宿主としては特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍ
ａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｇ
ｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げ
られる。バキュロウイルス発現ベクターを用いる使用のための昆虫細胞としては特に、Ａ
ｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂ
ｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅ
ｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉが挙げられる。
【００７６】
目的のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、当該分野で周知の種々の遺伝子送達技術を
使用して、宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれ得るか、または適切な宿主細胞中の安定な
エピソームエレメント上に維持され得る。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参
照のこと。
【００７７】
選択される発現系および宿主に依存して、分子は、タンパク質が発現される条件下で、
上記の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を増殖することによって生成される
。次いで、発現されたタンパク質は、宿主細胞から単離され、そして精製される。発現系
が、タンパク質を増殖培地中に分泌する場合、生成物は、この培地から直接精製され得る
。生成物が分泌されない場合、この生成物は細胞溶解物から単離され得る。適切な増殖条
件および回収方法の選択は、当該分野内である。
【００７８】
一旦生成されると、ＧＮＡ３３ポリペプチドを使用して抗体を生成し得る。従って、ポ
リペプチドは、哺乳動物の被験体（げっ歯類およびウサギのような標準実験動物を含む）
を免疫するための組成物中に提供される。この組成物は、ポリクローナル血清の生成を誘
発するための適切なアジュバントを含む。動物のグループは、この組成物を用いて、一般
的に免疫され、そして数回追加免疫される。免疫された動物由来の抗血清が、得られ得る
。殺菌性抗血清の形成を誘発し得るＧＮＡ３３ポリペプチドは、モノクローナル抗体の生
成においての使用のために適切である。これらの抗体を、順に使用して、抗ＭｅｎＢワク
チンに対するエピトープを提供するＭｅｎＢ抗原のさらなる模倣物を検索し得る。
【００７９】
従って、本発明の実行において、選択されたＧＮＡ３３ポリペプチドを使用して、モノ
クローナル抗体およびその機能的等価物を提供する。特定のモノクローナル抗体に対して
の用語「機能的等価物」は、本明細書中で使用される場合、以下に記載される標準アッセ
イによって決定されるように、以下のような分子を意味する：（ａ）例証されたモノクロ
ーナル抗体を相互にブロックする；（ｂ）問題のＧＮＡ３３ポリペプチドに選択的に結合
する；（ｃ）そして、必要に応じてに、ＭｅｎＢ細菌細胞に対して機能的活性（例えば、
補体媒介殺菌および／またはオプソニン活性）を示す。さらに、本発明の特定のモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマに関して本明細書中で使用される場合、用語「子孫」は、
世代または核型同一性に関係なく、親によって産生されるモノクローナル抗体を産生する
親ハイブリドーマ全ての誘導体、子孫（ｉｓｓｕｅおよびｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）を含む。
【００８０】
モノクローナル抗体は、当該分野で周知の標準技術（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉ
ｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５の方法、またはその改変、Ｂｕ
ｃｋら（１９８２）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ １８：３７７によって記載される）を用いて調製
される。代表的に、マウスまたはラットは、タンパク質キャリアに結合されたＧＮＡ３３
ポリペプチドを用いて免疫され、追加免疫され、そして脾臓（および必要であれば、いく
つかの大きさのリンパ節）は、除去されそして単一細胞へと分離される。所望である場合
、脾臓細胞は、（非特異性接着細胞の除去後）抗原でコーティングされたプレートまたは
ウェルに細胞懸濁液を適用することによって、スクリーニングされ得る。抗原に対して特
異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、プレートに結合し、そして残りの懸濁
液で洗い流されない。得られたＢ細胞または全ての分離された脾臓細胞は、次いで、骨髄
腫細胞と融合するように誘導され、ハイブリドーマを形成する。ハイブリダイゼーション
での使用のための代表的なマウス骨髄腫株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能なものを含む。
【００８１】
より特定には、体細胞ハイブリッドは、アザグアニン耐性の非分泌マウス骨髄腫細胞株
Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣから入手可能）を用いてＢｕｃｋら（前出）の方
法によって調製され得る。ハイブリドーマ細胞株は、一般に、限界希釈によってクローン
化され、そして免疫化抗原に特異的に結合し、そして無関係な抗原に結合しない抗体の産
生についてアッセイされる。次いで、選択されたモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマ
は、インビトロ（例えば、組織培養ボトルまたは中空繊維リアクター内で）か、またはイ
ンビボ（例えば、マウス中の腹水として）のいずれかで培養される。
【００８２】
ハイブリドーマの上清は、例えば、免疫ＧＮＡ３３ポリペプチドを用いた固相ＥＬＩＳ
Ａか、または標的抗原としてＭｅｎＢ細菌を用いる間接的な免疫蛍光アッセイのいずれか
を使用して抗ＭｅｎＢ反応性抗体についてアッセイされ得る。ハイブリドーマによって分
泌されるモノクローナル抗体の選択性は、競合特異的結合アッセイ（例えば、阻害ＥＬＩ
ＳＡなど）を用いてアッセイされ得る。例えば、緩衝液か、または可溶性ＧＮＡ３３ポリ
ペプチドを含む緩衝液のいずれかに希釈される抗体分子を、結合ＧＮＡ３３ポリペプチド
の存在下、ＥＬＩＳＡ容器中で反応させる。洗浄の後、結合抗体は、二次抗体としての標
識化抗Ｉｇ（抗ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ）によって決定される。可溶性ＧＮＡ３３ポ
リペプチドによって阻害される抗体は、特異的とみなされ得、従って、アイソタイピング
およびＭｅｎＢ結合および機能的活性についてのさらなるスクリーニングを含むさらなる
研究のために選択される。
【００８３】
特に、部分的に精製されたモノクローナル抗体分子は、本明細書中の実施例に記載され
るような標準アッセイを用いて、ＭｅｎＢの表面に結合するそれらの能力について個々に
評価され得る。機能的活性は、補体媒介殺菌活性および／またはオプソニン活性を評価す
ることによって決定され得る。特に、抗体の補体媒介殺菌活性は、Ｇｏｌｄら（１９７０
）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１：４７９，Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋら（１９８８）Ｉｎｆｅ
ｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５６：１１２０，Ｍａｎｄｒｅｌｌら（１９９５）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ
．Ｄｉｓ．１７２：１２７９，およびＧｒａｎｏｆｆら（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇ
ｎ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：５７４によって記載されような標準ア
ッセイを用いて評価され得る。これらのアッセイにおいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉ
ｓは、補体供給源ならびに試験されるべき抗体と反応される。細菌の計数は、種々のサン
プリング時間でなされる。抗体および相補体と共に６０分間インキュベートした後決定さ
れた、時間０でのコロニー数と比較される場合、生存可能な細菌細胞数において最少５０
％の減少によって示されるような補体媒介殺菌活性を示す抗体は、本発明の目的に対する
殺菌活性を示すと考えられ、そしてさらなる使用のために適切である。
【００８４】
補体媒介溶菌は、侵襲性髄膜炎菌性疾患に対する宿主保護を担う主要な機構であると考
えられる。しかし、証拠はまた、オプソニン作用に対する重要な保護的役割を支持する（
例えば、Ｂｊｅｒｋｎｅｓら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：１６０を参
照のこと）。従って、本明細書中で産生される抗体のオプソニン活性は、機能的活性を評
価するために、二次手段かまたは代替の手段として評価され得る。オプソニンアッセイか
らの結果を使用して、殺菌データを追加し、そして保護を与え得る抗体の選択を助ける。
オプソニン活性の評価はまた、ＩｇＧ１アイソタイプを有する本発明のマウスモノクロー
ナル抗体の評価のために本明細書中で特に有用である。マウスＩｇＧ１（ヒトＩｇＧ１と
は著しく異なる）は、補体の活性化において効果がない。従って、マウスＩｇＧ１抗体は
、上記のアッセイにおいてＭｅｎＢの補体媒介溶菌を活性化しない。しかし、ＩｇＧ１抗
ＧＮＡ３３モノクローナル抗体の機能的活性は、補体の非存在下でオプソニン作用によっ
て評価され得る。
【００８５】
種々のオプソニンアッセイ方法は、当該分野で公知であり、そして本発明のモノクロー
ナル抗体の機能的活性を評価するために使用され得る。このような標準アッセイとしては
、Ｓｊｕｒｓｅｎら（１９８７）Ａｃｔａ Ｐａｔｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｓｃａｎｄ．，Ｓｅｃ．Ｃ ９５：２８３，Ｈａｌｓｔｅｎｓｅｎら（１９８９）
Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２１：２６７，Ｌｅｈｍａｎｎら（１９９１）
ＡＰＭＩＳ ９９：７６９，Ｈａｌｓｔｅｎｓｅｎら（１９９１）ＮＩＰＨ Ａｎｎａｌ
ｓ １４：１５７，Ｆｒｅｄｌｕｎｄら（１９９２）ＡＰＭＩＳ １００：４４９，Ｇｕ
ｔｔｏｒｍｓｅｎら（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：２７７７，Ｇｕｔｔ
ｏｒｍｓｅｎら（１９９３）Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１６７：１３１４，Ｂｊｅｒｋｎ
ｅｓら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：１６０，Ｈａｙｒｉｎｅｎら（１
９９５）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７１：１４８１，ｄｅ Ｖｅｌａｓｃｏら（１９
９５）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２：２６２、およびＶｅｒｈｅｕｌ，Ａ．Ｆ．Ｍ
．（１９９１）「Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ＬＰＳ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｏｌｉｇｏｓ
ａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｉｍｍ
ｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ」、Ｔ
ｈｅｓｉｓ，Ｕｔｒｅｃｈｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
，ｐｐ．１１２−１３５によって記載されるものが挙げられる。
【００８６】
目的の選択されたモノクローナル抗体は、慣用的な組織培養方法を用いてインビトロで
、または哺乳動物の被験体を用いてインビボで、拡大され得る。例えば、プリスタンプラ
イム化マウスは、腹水産生のために、ＰＢＳ中のｌｏｇ期のハイブリドーマ細胞を播種さ
れ得る。腹水は、さらなる精製の前に−７０℃で保存され得る。
【００８７】
特に、例えば、ＭｅｎＢに対する受動的保護を提供ための予防的または治療的薬学的調
製物中ならびにＭｅｎＢ診断用調製物において、抗体が使用される場合、キメラ抗体を提
供することが所望され得る。ヒトおよび非ヒトアミノ酸配列から構成されるキメラ抗体は
、マウスモノクローナル抗体分子から形成され得、ヒトにおけるそれらの免疫原性を減少
する（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら
（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４２２０；Ｓｈａｗ
ら（１９８７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４；およびＢｒｏｗｎら（１９８７
）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：３５７７；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕ
ｒｅ ３３２：３２３；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１
５３４；およびＪｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２；１９９２年１
２月２３日に公開された欧州公開番号第５１９，５９６号；および１９９４年９月２１日
に公開された英国特許公開番号第ＧＢ ２，２７６，１６９号）。
【００８８】
親のモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を提示し得る、抗体分子フラグメント
（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｓＦｖの分子）は、公知の技術を使用して産生さ
れ得る（Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９
：２６５９；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ １５：２７０６；Ｅｈｒｌ
ｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１６）：５８７９；ならびにＨｕｓ
ｔｏｎらに対する米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号；お
よびＬａｄｎｅｒらに対する同第４，９４６，７７８号）。
【００８９】
代替的に、ファージディスプレイ系を使用して、インビトロでモノクローナル抗体分子
集団を拡大し得る。Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３；Ｓｃｈａ
ｒｆら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：１０７６；米国特許第４，６８３，１９５
および同第４，６８３，２０２号；Ｙａｎｇら（１９９５）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５
４：３９２；Ｂａｒｂａｓ，ＩＩＩら（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｃｏｍｐ．Ｍｅｔｈ
Ｅｎｚｙｍｏｌ ８：９４；Ｂａｒｂａｓ，ＩＩＩら（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：７９７８。
【００９０】
一旦作製されると、ファージディスプレイライブラリーを使用して、公知の技術を使用
して、Ｆａｂ分子の免疫学的結合アフィニティーを改善し得る。例えば、Ｆｉｇｉｎｉら
（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３９：６８を参照のこと。
【００９１】
ファージディスプレイライブラリーより選択されるＦａｂ分子の重鎖部分および軽鎖部
分のコード配列を、単離または合成し得、そして発現のために任意の適切なベクターまた
はレプリコンの中にクローニングし得る。例えば、細菌、酵母、昆虫、両生類および哺乳
動物の系を含む、任意の適切な発現系を使用し得る。細菌における発現系としては、以下
に記載される系が挙げられる：Ｃｈａｎｇら（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５
、Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４、Ｇｏｅｄｄｅｌら（１
９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７、欧州特許出願第ＥＰ３６
，７７６号、米国特許第４，５５１，４３３号、ｄｅＢｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１〜２５、およびＳｉｅｂｅｎｌｉｓｔ
ら（１９８０）Ｃｅｌｌ ２０：２６９。
【００９２】
酵母における発現系としては、以下に記載される系が挙げられる：Ｈｉｎｎｅｎら（１
９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９、Ｉｔｏら（
１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３、Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ
．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２、Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１、Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．１３２：３４５９、Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．２０２：３０２、Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１
６５、Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：
７３７、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：
１３５、Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１
、Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６、米国特許第４
，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号、Ｂｅａｃｈら（１９８１）Ｎａｔ
ｕｒｅ ３００：７０６、Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：
３８０、Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９、Ｂａ
ｌｌａｎｃｅら（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．
１１２：２８４〜２８９、Ｔｉｌｂｕｒｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ ２６：２０５−２２
１、Ｙｅｌｔｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１
：ｌ４７０〜１４７４、Ｋｅｌｌｙら（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：４７５４７９；欧
州特許出願第ＥＰ２４４，２３４号、ならびに国際公開第ＷＯ９１／００３５７号。
【００９３】
昆虫において異種性遺伝子の発現は、以下に記載されるように達成され得る：米国特許
第４，７４５，０５１号、欧州特許出願第ＥＰ１２７，８３９および同ＥＰ１５５，４７
６号、Ｖｌａｋら（１９８８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５〜７７６、Ｍｉｌ
ｌｅｒら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１７７、Ｃａｒｂｏ
ｎｅｌｌら（１９８８）Ｇｅｎｅ ７３：４０９、Ｍａｅｄａら（１９８５）Ｎａｔｕｒ
ｅ ３１５：５９２〜５９４、Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら（１９８８）Ｍｏｌ
．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９、Ｓｍｉｔｈら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：８４０４、Ｍｉｙａｊｉｍａら（１９８７）Ｇｅｎｅ
５８：２７３、ならびにＭａｒｔｉｎら（１９８８）ＤＮＡ ７：９９。多くのバキュ
ロウイルスの株および改変体、ならびに宿主由来の対応の許容な昆虫宿主細胞は、以下に
記載される：Ｌｕｃｋｏｗら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７〜５
５，Ｍｉｌｌｅｒら（１９８６）ＧＥＮＥＲＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ、Ｓｅｔｌｏ
ｗ，Ｊ．Ｋ．ら編、Ｖｏｌ．８，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２７７〜２７９
頁、およびＭａｅｄａら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５９２〜５９４。
【００９４】
哺乳動物の発現は、以下に記載されるように達成され得る：Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８
５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１、Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６７７７、Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１
：５２１、および米国特許第４，３９９，２１６号。哺乳動物の発現の他の特徴は、以下
に記載されるように容易にされ得る：Ｈａｍら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４
４、Ｂａｒｎｅｓら（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５、米国特許
第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第
４，５６０，６５５号および再登録された米国特許第ＲＥ３０，９８５、ならびに国際公
開第ＷＯ９０／１０３４３０号、同ＷＯ８７／００１９５号。
【００９５】
任意の上記抗体分子を本発明中で使用して、抗ＭｅｎＢ治療剤または抗ＭｅｎＢ予防薬
剤を提供し得る。さらに、例示のマウスモノクローナル抗体由来の抗原結合部位を含む、
「ヒト化」抗体分子を、上記に記載される技術を使用して産生し得る。
【００９６】
上記に記載の本発明のＭｅｎＢ抗体は、米国特許第６，０３０，６１９号、および同第
６，０４８，５２７号（本明細書中で参考としてそれらの全体が援用される）に記載され
るような方法を使用して、レセプターとして便利に使用して、多様な分子ライブラリーを
スクリーニングして、ＭｅｎＢ由来のエピトープの分子模倣物を同定し得る。分子ライブ
ラリーにおいて模倣物を同定する方法は、一般的に、以下の手順のうちの１つ以上の使用
を含む：（１）固定化した標的レセプターを用いたアフィニティー精製；（２）連結され
たリガンドとの可溶性レセプターの結合；および（３）可溶性化合物を直接的に抗原競合
アッセイにおいて、または生物学的活性について試験する行程。分子模倣物についてスク
リーニングされる分子としては、低分子有機化合物、有機化合物のコンビナトリアルライ
ブラリー、核酸、核酸誘導体、サッカライドもしくはオリゴサッカライド、ペプトイド、
可溶性ペプチド、固相上に連結されたペプチド、細菌ファージ表面タンパク質上に提示さ
れるペプチド、細菌表面のタンパク質もしくは抗体、および／または非ペプチド有機部分
を含むペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
例えば、コンビナトリアル有機合成を使用して、多様な分子種のライブラリーを作製し
得る。例えば、Ｇｏｒｄｏｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３３５を参
照のこと。例示としては、ピロリジン；オリゴカルバメート（Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３）；Ｎ置換されたグリシンポリマーのようなペプトイド（
Ｓｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３
６７）；およびビニル基化（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら（１
９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８）が挙げられるが、これらに限
定されない。
【００９８】
当該分野で公知の種々のアプローチを使用して、合成中に付加を受ける基礎単位を探索
して、その結果個々のライブラリーのメンバーの変遷（ｈｉｓｔｏｒｙ）を決定し得る。
これらのアプローチとしては、以下が挙げられる：フォトリトグラフのチップ上のアドレ
ス可能な位置（オリゴカルバメート）、部分的に合成された（ペプトイド、ピロリジン、
ペプチド）ライブラリーおよびヌクレオチドの分離合成によるコードのコンビナトリアル
ライブラリー（Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：９
８１２）または他の有機部分の分離合成によるコードのコンビナトリアルライブラリー（
Ｏｈｌｍｅｙｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０
：１０９２２）（「タグ（ｔａｇ）」）へのモノマーの再帰的な付加により「ヒット」を
同定する脱回旋（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）ストラテジー。次いで、模倣物を選択し
た後、各々のライブラリーのメンバーと結合するコードされるタグを、解読し得る。例え
ば、核酸タグを、ＤＮＡ配列決定法によって解読し得る。
【００９９】
ペプトイドコンビナトリアルライブラリーは、ＭｅｎＢエピトープの分子模倣物を同定
するために特に有用である。ペプトイドは、Ｎ置換されたグリシンのオリゴマーであり（
Ｓｉｍｏｎら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９
３６７）、そしてこれらを使用して、新規分子の多様なライブラリーを化学的に作製し得
る。モノマーは、ｔ−ブチルベースの側鎖保護および９−フルオレニル−メトキシ−カル
ボニルのα−アミン（ａ−ａｍｉｎｅ）保護を含み得る。例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ
ら（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０６４６らの「副モノマー方法
（ｓｕｂｍｏｎｏｍｅｒ ｍｅｔｈｏｄ）」を使用して、固相上でモノマーのペプトイド
オリゴマーへの組み立てを実施し得る。この方法において、Ｒｉｎｋアミドポリスチレン
樹脂（Ｒｉｎｋら（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８：３７８７）と
の化学合成を行い得る。ブロモ酢酸のジイソプロピロカルボジイミドとのインサイチュ活
性化によって、樹脂に結合したアミンをブロモアセチル化する。その後、この樹脂に結合
したブロモアセトアミドをアミンの付加によって置換する。このアミンは、さらなる反応
基のｔ−ブチルベースの保護を含み得る。この２工程のサイクルを、所望の数のモノマー
が付加するまで繰り返す。次いで、このオリゴペプチドを９５％トリフルオロ酢酸／５％
水での処置によって樹脂から切り離す。この合成を、好ましくはロボットの合成機を使用
して実施する。例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９２）Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｒｅｓ．４０：４９８；およびＺｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６７：４３７を参照のこと。代替的には、ベンゾトリア
ゾール−１−イルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはブロモトリス（ピロリジノ）ホスホニ
ウムヘキサフルオロホスフェートのどちらかによるインサイチュ活性化によって、ペプト
イドモノマーのオリゴマー化を実施し得る。この代替の方法において、その他は、ａ−（
９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ酸を使用して従来のペプチド合成と同じで
ある（例えば、Ｓｉｍｏｎら、（１９９２）、上述を参照のこと）。
【０１００】
一旦ペプチドライブラリーを作製すると、これらのライブラリーを、例えば、ＭｅｎＢ
ポリペプトイドまたはＭｅｎＢ細菌でコーティングされたマイクロリッタープレートのウ
ェルに、コンビナトリアルペプトイドの様々なプールと一緒に本発明のモノクローナル抗
体を添加することによって、スクリーニングし得る。インキュベーションの期間および非
結合抗体の除去のための洗浄の後、結合した抗体の存在を、標準的なＥＬＩＳＡアッセイ
によって決定する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，５５３を
参照のこと。結合した抗体を含まないウェルは、抗体に結合するペプトイド模倣物の存在
を示す。プール中のペプトイド模倣物の特定の同定を、モノマー単位をライブラリーの部
分的に合成したメンバーに再帰的に添加することによって決定する。Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ
ｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８。低分子プール中の活性化合物
を同定する他の方法は、そのプールを逆相ＨＰＬＣまたはアフィニティー選択／質量分析
によって分画する工程を包含する（Ｎｅｄｖｅｄ Ｍ．Ｌ．ら（１９９６）Ａｎａｌ．Ｃ
ｈｅｍ．６８：４２２８）。
【０１０１】
一旦、推定の分子模倣物を同定すると、上記のように、機能的に活性な（例えば、殺菌
の、および／またはオプソニンの）抗体を導く能力について、それらを試験する。これら
の特性を有する分子模倣物は、さらなる使用（例えば、ワクチン組成物における使用）に
ついて適切である。
【０１０２】
本発明の機能的に活性な抗ＭｅｎＢ抗体を使用して同定した分子模倣物、およびＧＮＡ
３３抗体をまた使用して、診断アッセイにおける使用のための抗体試薬を作製し得る。例
えば、分子模倣物と反応性のさらなる抗体、および本明細書中に記載されるＧＮＡ３３抗
体を使用して、競合アッセイ、直接反応アッセイまたはサンドイッチ型アッセイのような
免疫診断技術を使用して、生物学的サンプル中の細菌の抗原を検出し得る。このようなア
ッセイとしては、ウエスタンブロット；凝集試験；酵素標識免疫アッセイおよび酵素媒介
免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）；ビオチン／アビジン型アッセイ；放射性免疫アッ
セイ；免疫電気泳動；免疫沈殿などが挙げられる。これらの反応は、一般的に、蛍光、化
学発光、放射性、酵素性の標識分子もしくは色素分子のような標識を検出する工程、また
は模倣物とそれに反応した抗体との間の複合体形成を検出する他の方法を包含する。
【０１０３】
前述のアッセイは、一般的に、抗原−抗体複合体が結合される固体支持体からの、液相
中の非結合抗体の分離を包含する。本発明の実施において使用され得る固体支持体は、ニ
トロセルロース（例えば、膜またはマイクロタイターウェルの形態で）；ポリビニルクロ
ライド（例えば、シートまたはマイクロタイターウェルの形態で）；ポリスチレンラテッ
クス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレートの形態で）；ポリビニリジンフル
オリド；ジアゾ化ペーパー；ナイロン膜；活性化ビーズ；磁気反応ビーズなどのような、
基材を含む。
【０１０４】
代表的に、固体支持体を、最初に、適切な結合条件下で固相の成分（例えば、一つ以上
のＭｅｎＢ抗原またはＭｅｎＢ分子模倣物）と反応させて、その結果、その成分は支持体
に十分に固定化される。時々、支持体への固定化を、最初により良い結合特性を有するタ
ンパク質にカップリングすることによって増強し得る。適切なカップリングタンパク質と
して、血清アルブミン（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、鍵穴吸着（ｋｅｙｈｏｌｅ
ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オブアルブミン、
および当業者に周知の他のタンパク質のような高分子が挙げられるが、これに限定されな
い。その抗原または模倣物を支持体に固定化するために使用され得る他の分子としては、
ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリ
マーなどが挙げられる。これらの分子およびこれらの分子を抗原とカップリングさせるこ
れらの方法は、当業者に周知である。例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（１９９２）３：２−１３；ＨａｓｈｉｄａらＪ．Ａｐｐｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）６：５６−６３；ならびにＡｎｊａｎｅｙｕｌｕおよびＳ
ｔａｒｏｓ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊ．ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｒｅｓ．（１９８７）３０：１１７−１２４を参照のこと。
【０１０５】
固体支持体の固相の成分との反応の後、任意の非固定化固相成分を洗浄によってこの支
持体から除去し、次いで支持体に結合した成分を、適切な結合条件下でリガンド部分（例
えば、ＭｅｎＢ抗体）を含むと推定される生物学的サンプルと接触させる。洗浄して任意
の非結合のリガンドを除去した後、二次的な結合体部分を、適切な結合条件下で添加する
。ここで、二次的結合体は、結合したリガンドと選択的に結合し得る。次いで、二次的結
合体の存在を、当該分野で周知の技術を使用して検出し得る。
【０１０６】
さらに特定すると、ＥＬＩＳＡ方法を使用し得、ここで、マイクロタイタープレートの
ウェルを、本発明に従うＭｅｎＢエピトープまたはＭｅｎＢ模倣物でコーティングする。
次いで、抗ＭｅｎＢ免疫グロブリン分子を含む、またはこれを含むと推定される生物学的
サンプルを、コーティングされたウェルに添加する。抗体が固定化された分子に結合し得
るのに十分な期間のインキュベーションの後、そのプレートを洗浄して、非結合部分を除
去し、そして検出可能に標識された二次的な結合分子を添加する。この二次的結合分子は
、任意の捕捉されたサンプル抗体と反応し得、そのプレートを洗浄し、そして二次的結合
分子の存在を、当該分野で周知の方法を使用して検出する。
【０１０７】
従って、１つの特定の実施形態において、生物学的サンプルからのＭｅｎＢ結合リガン
ドの存在を、抗体リガンドに対して特異的な抗体を含む二次的結合体を使用して、容易に
検出し得る。当業者に公知の方法を使用して、検出可能な酵素標識（例えば、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはウレアーゼ）と容易に結合体化され
得る多くの抗ウシ免疫グロブリン（Ｉｇ）分子が、当該分野で公知である。次いで、適切
な酵素基質を使用して、検出可能なシグナルを生成する。他の関連の実施形態において、
当業者に公知の方法を使用して、競合型ＥＬＩＳＡ技術を実行し得る。
【０１０８】
アッセイはまた、溶液中で行われ得、その結果、ＭｅｎＢエピトープまたは模倣物、お
よびこれらの分子に対して特異的な抗体は、沈殿条件下で複合体を形成する。１つの特定
の実施形態において、これらの分子は、当該分野で公知のカップリング技術を使用して、
例えば、直接的な化学的カップリングまたは間接的なカップリングによって、固相粒子（
例えば、アガロースビーズなど）に結合され得る。次いでコーティングされた粒子を、適
切な結合条件下で、ＭｅｎＢに対する抗体を含むことが予想される生物学的サンプルと接
触させる。結合した抗体の間の架橋は、粒子−エピトープ−抗体または粒子−模倣物−抗
体の複合凝集体の形成を生じ、この凝集体を、洗浄および／または遠心分離を使用して、
サンプルから沈殿させ得、かつ分離させ得る。反応混合物を、任意の多くの標準的な方法
（例えば、上記に記載のそれらの免疫診断方法）を使用して分析して、複合体の存在また
は不在を決定し得る。
【０１０９】
なおさらなる実施形態において、免疫アフィニティーマトリクスを提供し得、ここで、
ＭｅｎＢ抗体を含むことが予想される生物学的サンプルから抗体のポリクローナル集団を
、基材に固定化する。これに関して、サンプルの最初のアフィニティー精製を、固定化さ
れた抗原を使用して実施し得る。従って、生じたサンプル調製物は、アフィニティー支持
中での潜在的な非特異的結合特性を回避しつつ、抗ＭｅｎＢ部分のみを含む。高収量で、
かつ抗原結合活性を良く保存して、免疫グロブリン（完全かまたは特定のフラグメントに
おいて）を固定化する多くの方法は、当該分野で公知である。任意の特定の方法に限定さ
れずに、固定化されたプロテインＡおよびプロテインＧを使用して、免疫グロブリンを固
定化し得る。
【０１１０】
従って、一旦免疫グロブリン分子を免疫アフィニティーマトリクスを提供するために固
定化すると、標識された分子は適切な結合条件下で結合した抗体と接触する。非特異的に
結合された任意のＭｅｎＢエピトープまたはその模倣物を、免疫アフィニティー支持体か
ら洗い落とした後、結合した抗原の存在を、当該分野で公知の方法を使用して、標識に対
してアッセイすることによって決定し得る。
【０１１１】
本発明のＧＮＡ３３ポリペプチドおよび／もしくはその模倣物またはそれらに対する抗
体を含む、上に記載されたアッセイ試薬は、上に記載される免疫アッセイを行うために、
適切な指示書および他の必要な試薬と共に、キットで提供され得る。このキットはまた、
使用される特定の免疫アッセイに依存して、適切な標識ならびに他の包装される試薬およ
び材料（すなわち、洗浄緩衝液など）を含み得る。標準的な免疫アッセイ（例えば、上に
記載されるアッセイ）を、これらのキットを使用して行い得る。
【０１１２】
さらに、このＧＮＡ３３ポリペプチド、分子模倣物および抗体を本明細書中で使用して
、哺乳動物の被験体においてＭｅｎＢを妨げ得る。特に、これらの分子を含むワクチン組
成物を、ワクチン接種された被験体においてＭｅｎＢ疾患の防止のために使用し得る。こ
のワクチンを、他の抗原または免疫調節因子（例えば、ＩＬ−２、改変体ＩＬ−２（ｃｙ
ｓ１２５からｓｅｒ１２５への改変体）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ｇ−インターフェ
ロン、ＩＰ−１０、ＭＩＰ１ｂおよびＲＡＮＴＥＳを含むがこれらに限定されない、免疫
グロブリン、サイトカイン、リンフォカインおよびケモカイン）と組み合わせて投与し得
る。
【０１１３】
これらワクチンは、一般的に、水、生理食塩水、グリセリン、エタノールなどのような
、１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」を含む。さらに、補助物質（
例えば、保湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など）がそのようなビヒクル中に存在し得る。
【０１１４】
また、アジュバントを使用して、ワクチンの有効性を増強し得る。アジュバントをワク
チン組成物に直接添加し得るか、またはワクチン投与の同時もしくはその直後のいずれか
で別々に投与し得る。このようなアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：（１）アルミニウム塩（ａｌｕｍ）（例えば、水酸化アルミニウム、リン
酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、など）；（２）Ｏ／Ｗのエマルジョン処方物（ムラ
ミルペプチド（以下を参照のこと）もしくは細菌細胞壁成分のような他の特異的免疫刺激
因子を含むか、または含まない）（例えば、（ａ）ＭＦ５９（国際出願公報第ＷＯ ９０
／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄ
ｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ １９９５、第１０節）、これは、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフリューダ
イザ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）のようなマイクロフリューダ
イザを使用してサブミクロンの粒子中に処方され、５％ スクアレン、０．５％ ＴＷＥ
ＥＮ ８０ＴＭ、および０．５％ ＳＰＡＮ８５ＴＭ（必要ではないが、随意に種々の量
のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含む）を含む；（ｂ）ＳＡＦ、（これは、サブミ
クロンのエマルジョン中にフリューダイズされるか、またはより大きな粒子サイズのエマ
ルジョンを生成するようボルテックスされるかのいずれかで、１０％ スクアレン、０．
４％ ＴＷＥＥＮ ８０ＴＭ、５％ プルロニックブロック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ−ｂｌｏ
ｃｋｅｄ）ポリマー Ｌ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含む）、ならびに（ｃ）ＲＩＢ
ＩＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉ
ｌｔｏｎ，ＭＴ）、これは、２％ スクアレン、０．２％ ＴＷＥＥＮ ８０ＴＭ、なら
びにモノリン脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および１つ以上の
細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの細菌細胞壁成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（
ＤＥＴＯＸＴＭ））を含む；（３）サポニンアジュバント（例えば、Ｑ２１またはＳＴＩ
ＭＵＬＯＮＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍ
Ａ）を使用し得るか、またはこれらから生成される粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激
複合体））、ここで、ＩＳＣＯＭはさらなる界面活性剤を欠き得る（例えば、国際出願公
開番号ＷＯ ００／０７６２１を参照のこと）；（４）完全フロイントアジュバント（Ｃ
ＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、
インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｉ
Ｌ−１２（国際公開番号第ＷＯ ９９／４４６３６号）など）、インターフェロン（例え
ば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死
因子（ＴＮＦ）、など；（６）細菌のＡＤＰ−リボシル化を行う毒素の無害化変異体（例
えば、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定毒素（ＬＴ
）、具体的にはＬＴ−Ｋ６３（ここで、６３位の野生型アミノ酸がリジンで置換される）
、ＬＴ−Ｒ７２（ここで、７２位の野生型アミノ酸がアルギニンで置換される）、ＣＴ−
Ｓ１０９（ここで、１０９位の野生型アミノ酸がセリンで置換される）、およびＰＴ−Ｋ
９／Ｇ１２９（ここで、９位の野生型アミノ酸がリジンで置換され、そして１２９位の野
生型アミノ酸がグリシンで置換される））（例えば、国際特許公開番号第ＷＯ９３／１３
２０２号および同第ＷＯ９２／１９２６５号を参照のこと）；（７）ＭＰＬまたは３−Ｏ
−脱アセチル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、ＧＢ ２２２０２２１を参照のこと）、
ＥＰ−Ａ−０６８９４５４、肺炎球菌のサッカライドで使用される場合、必要に応じて、
ａｌｕｍの実質的非存在下である、（例えば、国際特許公開第ＷＯ ００／５６３５８号
を参照のこと）；（８）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／またはＯ／Ｗエマルジョ
ンの組み合わせ（例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８、ＥＰ
−Ａ−０７６１２３１を参照こと）；（９）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（
例えば、Ｒｏｍａｎら（１９９７）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：８４９−８５４；Ｗｅｉｎｅｒ
ら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１０８３３−１
０８３７；Ｄａｖｉｓら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：８７０−８７６；Ｃ
ｈｕら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１６２３−１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄ
ら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２３４０−２３４４；Ｍｏｌｄｏｖ
ｅａｎｕら（１９８８）Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１２１６−１２２４；Ｋｒｉｅｇら（１
９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６−５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら（１９９６）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：２８７９−２８８３；Ｂａｌｌａｓら
（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：１８４０−１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら（１
９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４５７０−４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎら（１９９
６）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：７２−７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８８）
Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７９：８６６−８７３；Ｓｔａｃｅｙら（１９９６
）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２１１６−２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら（１９９１）Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７５９−１７６４；Ｙｉら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１５７：４９１８−４９２５；Ｙｉら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：５
３９４−５４０２；Ｙｉら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４７５５−４７６
１；Ｙｉら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５８９８−５９０６；国際公開第
ＷＯ ９６／０２５５５号，同第ＷＯ ９８／１６２４７号，同第ＷＯ ９８／１８８１
０号、同第ＷＯ ９８／４０１００同，同第ＷＯ ９８／５５４９５号，同第ＷＯ ９８
／３７９１９号および同第ＷＯ ９８／５２５８１号）、（例えば、これらを少なくとも
ＣＧジヌクレオチド上に含み、シトシンは必要に応じて５−メチルシトシンで置換される
）；（１０）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えば、
国際公開第ＷＯ ９９／５２５４９号を参照のこと）；（１１）オクトキシノールと組み
合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（例えば、国際公開第ＷＯ
０１／２１２０７号）、または少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば
、オクトキシノール）と組み合わせた、ポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤
もしくはエステル界面活性剤（例えば、国際公開第ＷＯ ０１／２１１５２号）；（１２
）ＣｐＧオリゴヌクレオチドのような、サポニンおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチド（
例えば、国際公開第ＷＯ ００／６２８００号）；（１３）免疫刺激剤および金属塩の粒
子（例えば、国際公開第ＷＯ ００／２３１０５号を参照のこと）；ならびに（１４）組
成物の有効性を増強させるための免疫刺激因子として作用する他の物質。
【０１１５】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグル
タミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグル
タミン（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｅ）（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラ
ニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ
−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＲ）などが
挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
組成物の有効性を増強させるために、活性因子をキャリア分子と結合させることが必要
であり得る。このようなキャリア分子は、それ自体は有害な抗体の産生を誘導しない。適
切なキャリアは、代表的に大きく、代謝の遅い巨大分子（例えば、タンパク質、多糖類、
ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（
例えば、油滴またはリポソーム）、不活性化ウイルス粒子、ＣＲＭ１９７（無毒な変異ジ
フテリア毒素）など）である。このようなキャリアは、当業者に周知である。
【０１１７】
代表的に、ワクチン組成物は注射可能なものとして、液体の溶液または懸濁液のいずれ
かとして調製される；注射前の液体ビヒクル中の溶液または懸濁液に適切な固体形態もま
た調製され得る。これらの調製はまた、上に記載するように、アジュバントの効果を増強
するために、エマルジョン化もしくはリポソーム中でカプセル封入され得るか、または粒
子に吸収され得る。
【０１１８】
ワクチンは、有効量の活性な因子（例えば、ＧＮＡ３３ポリペプチドまたはそれらに対
する抗体）、および必要に応じて他の任意の上述の成分およびインヒビターを含む。「有
効量」によって、ワクチンが投与される個体において免疫学的な応答を誘導する分子の量
を意味する。このような応答は、一般的に、ワクチンに対して、分泌性免疫応答、細胞性
免疫応答および／または抗体媒介性免疫応答の被験体における発達を生じる。通常は、こ
のような応答としては、以下の効果のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定され
ない：任意の免疫学的クラスの抗体の産生（例えば、免疫グロブリンＡ，免疫グロブリン
Ｄ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＭ）；Ｂリンパ球および
Ｔリンパ球の増殖；免疫学的細胞の活性化シグナル、増殖シグナルおよび分化シグナルの
提供；ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞および／もしくは細胞傷害性Ｔ細胞、ならび
に／またはｇｄＴ細胞集団の増殖。
【０１１９】
一旦処方されると、ワクチンは、皮下注射または筋肉内注射のいずれかによって、非経
口で通常通りに投与される。他の投与形態に適切なさらなる処方物としては、経口処方物
または肺の処方物、坐薬、ならびに経皮的適用が挙げられる。投薬処置は、単回投薬スケ
ジュールか、または複数回投薬スケジュールであり得る。
【０１２０】
（ＩＩＩ．実験）
本発明を実施する為の具体的な実施形態の例を以下である。これらの例は、例示目的の
みのために、提供され、そして、いかなる方法においても本発明の範囲を限定することを
意図するものではない。
【０１２１】
使用される数値（例えば、量、温度など）に関する精度を保証するための努力がなされ
ているが、実験誤差および偏差は、当然のこととして、許容されるべきである。
【０１２２】
（材料および方法）
（細菌株）
本研究に含まれるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ株を、異なる国に滞在する、
髄膜炎菌性疾患を有する患者から単離し、３６年の期間にわたって収集した。２１株が、
血清型Ｂ株であり、１株が血清型Ｃ株であった。これらの株を、表１に要約する。電気泳
動分類（ＥＴ）に基づいて、これらの収集物は、疾患を引き起こすＭｅｎＢ株についての
広範な遺伝的多様性を表す。
【０１２３】
ＭＣ５８株、ＢＺ２３２株およびＮＭＢ株の変異体（それぞれ、ＭＣ５８ΔＧＮＡ３３
、ＢＺ２３２ΔＧＮＡ３３およびＮＭＢΔＧＮＡ３３）（これらの株において、ｇｎａ３
３遺伝子が欠失され、そして、抗生物質カセットを用いた対立遺伝子交換によって置きか
えられている）を、プラスミドｐＢＳＵＤ３３ＥＲＭで親株を形質転換することによって
調製した。このプラスミドは、対立遺伝子交換のための上流および下流の隣接遺伝子領域
およびｅｒｍＣ遺伝子（エリスロマイシン耐性）を含む。簡潔には、−８６７から＋７５
の上流隣接領域（開始コドンを含む）、および＋１２６８から＋１７４４の下流隣接領域
（終止コドンを含む）を、以下のプライマーを使用して、ＭＣ５８から増幅した：
【０１２４】
【化１】
。
【０１２５】
これらのフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ，Ｍｉｌａｎ
，Ｉｔａｌｙ）にクローニングし、標準的技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅ
ｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ Ｍａｎｕａｌ
（２００１））を使用してＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５に形質転換した。一旦、全てのサブクロ
ーニングが完遂されると、天然のコンピテントＮｅｉｓｓｅｒｉａ ＭＣ５８株、Ｎｅｉ
ｓｓｅｒｉａ ＢＺ２３２株およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ＮＭＢ株を、チョコレート寒天
プレート（ｃｈｏｃｏｌａｔｅ ａｇａｒ）（Ｒｅｍｅｌ，Ｌａｚｔａｋａｓ，ＫＡ）上
で一晩増殖したいくつかのコロニーを選択し、これらを、１μｇのプラスミドＤＮＡを含
有する２０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）と混合することによって形
質転換した。この混合物をチョコレート寒天プレート上にスポティングし、５％ＣＯ２、
３７℃で、６時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ中に希釈し、そして、７μｇ／ｍｌ
のエリスロマイシンを含有するチョコレート寒天プレートに塗った。これらの３つの株の
各々についてエリスロマイシン耐性コロニーのゲノム中のｇｎａ３３遺伝子の非存在を、
以下のプライマーを使用するＰＣＲによって確認した：
【０１２６】
【化２】
。これらのプライマーは、それぞれ、ｇｎａ３３遺伝子の５’センス鎖およびｇｎａ３３
遺伝子の３’アンチセンス鎖に対応した。ＧＮＡ３３発現の欠失は、以下で説明されるよ
うなウェスタンブロット分析によって確認された。
【０１２７】
（モノクローナル抗体（ｍＡｂ）試薬）
フローサイトメトリー、殺菌剤、およびインビボ保護実験（ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｒｏｔ
ｅｃｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）に使用される抗体としては、以下が挙げられた：
Ｒｉｊｋｓｉｎｓｔｉｔｕｕｔ Ｖｏｏｒ Ｖｏｌｋｓｇｅｚｏｎｄｈｅｉｄ ｅｎ Ｍ
ｉｌｅｕ，Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、またはＷｅｎｄｅｌ
ｌ Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｗａｌｔｅｒ Ｒｅｅｄ Ａｒｍｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏ
ｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣから得られる髄膜炎菌Ｐｏｒ Ａ
Ｐ １．２特異的サブタイプｍＡｂ（ＭＮ １６Ｃ １３Ｆ４、サブクラスＩｇＧ２ａ）
；カプセル化した、血清型Ｂ，ＳＥＡＭ １２およびＳＥＡＭ ３（Ｇｒａｎｏｆｆら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６０：５０２８−５０３６），サブクラスＩｇＧ２
ａ）ならびに、血清型Ｃ（ｍＡｂ １８１．１（Ｇａｒｃｉａ−Ｏｊｅｄａら、Ｉｎｆｅ
ｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（２０００）６８：２３９−２４６，サブクラスＩｇＧ３）に特異的
である抗ポリサッカリドｍＡｂ。ＭＡｂ １８１．１は、Ｋａｔｈｒｙｎ Ｓｔｅｉｎ，
Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって提供され
た。このネガティブコントロールは、関連のない特異性のマウスＩｇＧ ｍＡｂ（ＶＩＧ
１０）、またはｒＧＮＡ３３を発現するのに使用された株由来のＥ．ｃｏｌｉタンパク質
に対して調製されたマウスポリクローナル抗血清からなった。
【０１２８】
（ＧＮＡ３３の発現および精製）
ｇｎａ３３ ＯＲＦを、プライマーとして使用される合成オリゴヌクレオチドを用いて
、２９９６株（Ｐ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｙ ａｎｄ Ｊ．Ｔ．Ｐｏｏｌｍａｎ，Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９２）６０：３１５６，１９９２）由来の染色体ＤＮＡにお
けるＰＣＲによって増幅された。増幅されたＤＮＡフラグメントを、Ｈｉｓタグ化（ＨＴ
−ＧＮＡ３３）されたタンパク質またはシグナル配列または脂質改変配列のない可溶性タ
ンパク質（ｒＧＮＡ３３）として、タンパク質を発現するためにｐＥＴ−２１ｂ＋ベクタ
ー（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローニングした。組換えタンパク質の
発現を、上述のように実施されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価
した。このＨｉｓタグ化タンパク質は、Ｎｉ２＋結合体化キレートファーストフローＳｅ
ｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａ
ｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のアフィニティクロマトグラグフィによって精製し、そして非タグ
化形態を、モノＳイオン交換樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用する
ＦＰＬＣによって精製した。
【０１２９】
（ポリクローナル抗ＧＮＡ３３抗血清の調製）
ＧＮＡ３３に対する抗血清を調製するために、２０μｇの精製した、ＨＴ−ＧＮＡ３３
または非タグ化ｒＧＮＡ３３を、６週齢のＣＤ１雌性マウス（１グループ当たり４〜１０
のマウス）を免疫するために使用された。これらのマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅ
ｒ（Ｉｔａｌｉａ Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｃａｌｃｏ，Ｉｔａｌｙ，またはＨｏｌｌｉｓｔｅｒ
，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手した。組換えタンパク質は、初回投薬について完全フ
ロイントアジュバント（ＣＦＡ）と共にｉ．ｐ．で投与し、第２回追加免疫投薬（第２１
日目）および第３回投薬（第３５日目）について不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ
）と共にｉ．ｐ．で投与した。血液サンプルを第３４日目および第４９日目に採取した。
【０１３０】
（モノクローナル抗体の調製）
４〜６週齢の雌性ＣＤ１マウスを、第３回目の投薬はアジュバントなしで投与した以外
、上述のように免疫した。３日後に、マウスを屠殺し、そして、それらの肝細胞を、１黒
色腫細胞に対して５脾臓細胞の比で黒色腫細胞Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合した。
ＨＡＴ選択培地中での２週間のインキュベーション後に、ハイブリドーマ上清は、ＥＬＩ
ＳＡによって抗体結合活性についてスクリーニングした。このＥＬＩＳＡを、このＮ．ｍ
ｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｍ７株は、０．０２５％パラホルムアルデヒドで処理すること
によって不活性化されているナノカプセル化したＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｍ７株
（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９１）５９：４０９７−４１
０２）でコートされたマイクロタイタープレート上で実施した。ＧＮＡ３３特異的抗体を
分泌するハイブリドーマを、限界希釈によって２回クローン化し、次いで、増殖し、組織
培養における次なる使用またはＢＡＬＢ／ｃマウスにおける腹水産生の為に凍結した。
【０１３１】
これらのモノクローナル抗体のサブクラスを、マウスモノクローナル抗体アイソタイピ
ングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ．）を使用して決定した。選択され
たｍＡｂの中に、１つのＩｇＧ２ａ抗ＧＮＡ３３ｍＡｂ（ｍＡｂ ２５と命名した）を、
以下に説明した、結合研究または機能研究の全てにおいて使用された。このモノクローナ
ル抗体を、Ｈｉ−Ｔｒａｐ親和性カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によ
ってマウス腹水から精製し、ＰＢＳ緩衝液での徹底的な透析の後に、精製したｍＡｂの濃
度は、基準としてＢＳＡを使用する改変Ｌｏｗｒｙ法（ＤＣ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｏｍｅ
，Ｉｔａｌｙ）を使用して決定した。ｍＡｂ ２５結合の特異性を、ＭＣ５８株、ＢＺ２
３２株およびＮＭＢ株ならびにそれぞれのＧＮＡ３３ノックアウト体（ＭＣ５８ΔＧＮＡ
３３，ＢＺ２３２ΔＧＮＡ３３およびＮＭＢΔＧＮＡ３３；以下を参照のこと）から調製
された膜タンパク質を使用するウェスタンブロットによって決定された。
【０１３２】
（生カプセル化髄膜炎菌の表面に対する抗血清の結合）
ポリクローナル抗ＧＮＡ３３抗血清およびｍＡｂ ２５の、生ＮｍＢ株の表面に結合す
る能力は、以前に記載されたように実行される（Ｍｏｅら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．
（１９９９）６７：５６６４−５６７５）、間接蛍光アッセイのフローサイトメトリー検
出を使用して決定された。図１Ａは、代表的な４つのＮｍＢ株、親株２９９６（Ｐ１．５
，２）および他の３つの株である、Ｍ３７３５（Ｐ１．５，２）、Ｍ４２０７（Ｐ１．５
）およびＭＣ５８（Ｐ１．７，１６）に対するポリクローナル抗ｒＧＮＡ３３抗血清の結
合を示す。抗ＧＮＡ３３ポリクローナル抗血清は、２９９６株およびＭ３７３５株とのみ
反応した。この抗カプセルポジティブコントロールｍＡｂは、４つ全ての株に結合した一
方、Ｅ．ｃｏｌｉのタンパク質で免疫された動物から調製されたネガティブコントロール
抗血清は、バックグラウンド結合のみを示した。図ｌＢは、３つの株（Ｍ３７３５［Ｐ１
．５，２］，Ｍ４２０７［Ｐ１．５］およびＭＣ５８［Ｐ１．７，１６］）の細菌細胞表
面への抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂ ２５の結合を測定する類似の実験の結果を示す。このｍＡ
ｂは、Ｍ３７３５（Ｐ１．５，２）株にのみ結合した。
【０１３３】
表Ｉは、２２の遺伝的に多様なカプセル化された髄膜炎菌株（２１の血清型Ｂおよび１
つの血清型Ｃ）由来の生きている細菌の表面に結合する、抗ＧＮＡ３３抗血清またはｍＡ
ｂ ２５の能力を測定するフローサイトメトリの結果をまとめている。この抗ＧＮＡ３３
抗体は、Ｐ１．５，２血清亜型またはＰ１．２血清亜型を有する株にのみ結合した（９の
うち９に対して、他のＰｏｒＡ血清亜型を有する１３株のうち０である；Ｐ＜０．００１
）。９つのポジティブ株のうちの１つである、Ｍ９８６は、他の８つの株よりも弱い結合
を示した（以下を参照のこと）。ＰｏｒＡのループ１上に存在するＰ １．５エピトープ
を発現するが、Ｐ１．２エピトープ（ループ４）を発現しない３つの株（Ｍ４２０７、１
０００およびＢＺ８３）に対して結合はなかった。ＰｏｒＡ（すなわち、Ｐ１−）を発現
しないＭ１３６株に対する結合も存在なかった。これらのデータは、細菌表面に対する抗
ＧＮＡ３３抗体の結合はＰｏｒＡ血清亜型Ｐ１．２の発現と相関することを示している。
【０１３４】
（補体依存的殺菌抗体活性）
殺菌活性を、以前に説明されたように測定された（Ｍｏｅら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕ
ｎ．（２００１）６９：３７６２−３７７１）。述べない限り、この補体供給源は、ＥＬ
ＩＳＡで試験した場合に、血清型Ｂまたは血清型Ｃのポリサッカリドに対して検出可能な
抗カプセル抗体も、２０％または４０％の最終血清濃度で、標的株に対する検出可能な内
因性の殺菌活性を有さない健康な成人（ＭＡＳ）に由来するヒト血清であった。以下のよ
うないくつかの実施形態において、未処置の無ガンマグロブリン血症の患者に由来する血
清（Ｓｔｅｅｌｅら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９８４）４４：４５２−４５８）
、仔ウサギ血清、または成体ラット血清を補体供給源として使用して、殺菌活性は測定し
た。
【０１３５】
（動物防御）
抗ＧＮＡ３３抗体が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ菌血症に対する受動的防
御を付与する能力を、腹腔内チャレンジした乳児ラットにおいて試験した。このアッセイ
を、以前に記載されるように実行した（Ｍｏｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９
９）６７：５６６４−５６７５）。簡潔には、チャレンジの開始時にコロニーを取り、ブ
ロス培養物中に接種し、そして増殖させ、殺菌アッセイについて上記したように調製した
。感受性を最大化するために株Ｍ９８６を用いて、その動物に、０時点で、約５×１０３
のチャレンジＭｅｎＢ試験株と混合した試験抗血清およびコントロール抗血清の異なる希
釈物１００μｌを、腹腔内注射した。他の試験株を用いた実験において、この抗体を、０
時点で腹腔内投与し、そして細菌チャレンジを２時間後に腹腔内で行った。使用したポジ
ティブコントロール抗莢膜ｍＡｂは、ＳＥＡＭ３であった。細菌チャレンジの１８時間後
に、針と約１０μｌのヘパリン（１０００単位／ｍｌ；Ｆｕｊｉｓａｗａ ＵＳＡ、Ｄｅ
ｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）（保存料なし）を含むシリンジとを用いて、心臓穿刺によって血
液試料を獲得した。１μＬ、１０μＬおよび１００μＬの血液アリコートを、チョコレー
ト寒天上に配置した。血液１ｍｌ当たりのＣＦＵを、このプレートを３７℃で５％ＣＯ２
中にて一晩インキュベートした後に決定した。相乗平均ＣＦＲ／ｍｌの計算のために、滅
菌培養物を受けた動物に、１ＣＦＲ／ｍｌという値を割り当てた。
【０１３６】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット）
髄膜炎菌株の総細胞抽出物を、以下のように調製した。シングルコロニーを、０．２５
％グルコースを補充したＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏ
ｉｔ、ＭＩ）７ｍｌ中で、０．５〜０．７のＡ６２０ｎｍまで増殖させた。その細菌を、
５０００×ｇで１５分間遠心分離することによって収集し、そしてＰＢＳ中に再懸濁した
。凍結−解凍後、細菌懸濁物をサンプル緩衝液（０．０６Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６
．８）、１０％（Ｖ/Ｖ）グリセロール、２％（Ｗ/Ｖ）ＳＤＳ、５％（Ｖ/Ｖ）２−メル
カプトエタノール）と混合し、そして１０分間煮沸した。髄膜炎菌株由来の精製タンパク
質（０．５μｇ／レーン）または総細胞抽出物（２５μｇ）を、１２．５％のＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル上（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ．Ｋ、Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）２２７：
６８０−６８５）にロードし、そしてニトロセルロース膜上に移した（Ｔｏｗｂｉｎら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９７９）７６：４３５０−４３５４）。ト
ランスファー緩衝液（０．３％ Ｔｒｉｓ塩基、１．４４％グリシン、２０％（ｖ／ｖ）
メタノール）を使用して、４℃にて１５０ｍＡで２時間トランスファーを実行した。この
ニトロセルロース膜を、飽和緩衝液（ＰＢＳ中１０％スキムミルク、０．１％ Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ１００）中で４℃で一晩インキュベートすることによって飽和した。この膜を洗
浄緩衝液（ＰＢＳ中の３％スキムミルク、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）で２回洗浄
し、洗浄緩衝液で２００倍希釈されたマウス抗血清、最終濃度が６μｇ／ｍｌのｍＡｂ
２５、または抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２ｍＡｂの１００倍希釈希物と共にその後、ホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼで標識された抗マウスＩｇ（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄ
ｅｎｍａｒｋ）の２０００倍希釈物と共に３７℃で２時間インキュベートした。膜を、Ｐ
ＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００で２回洗浄し、Ｏｐｔｉ−４ＣＮ Ｓｕｂｓｔ
ｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて発色させた。水を加えることによって反応
を停止させた。
【０１３７】
（ペプチドスポット合成）
ペプチドスポット合成を、モデルＡＳＰ ２２２自動スポット合成機（ＡＢＩＭＥＤ）
およびジイソプロピルカーボジイミド（ＤＩＣ）／Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（
ＨＯＢｔ）活性化（ＦｒａｎｋおよびＯｖｅｒｗｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．（１９９６）６６：１４９−１６９）を用いて、アミノ−ＰＥＧセルロース膜（ＡＢ
ＩＭＥＤ、Ｌａｎｇｅｒｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で行なった。インサイチュ調製さ
れた、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）−アミノ酸誘導体のＨＯＢｔエステ
ル（０．２Ｍ）をカップリング反応にした。スポット上の遊離アミノ官能基を、ジメチル
ホルムアミド中のブロモフェノールブルーの溶液で処理した。これにより、青色染色を生
じる、この染色により、全ての合成工程を可視的に観察することができた。最終サイクル
の後、全てのペプチドを２％無水酢酸でＮ末端をアセチル化した。合成の最後に、トリフ
ルオロ酢酸／トリイソブチルシラン／水／ジクロロメタン（５０／３／２／４５）の混合
物を用いて、側鎖保護基を取り除いた。
【０１３８】
（ペプチド結合アッセイ）
セルロース結合ペプチドを、ペプチド間の疎水性相互作用を防ぐためにエタノールに浸
した。非特異性結合を、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水
（ＴＢＳ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２７ｍＭ ＫＣｌ、ｐ
Ｈ７．０）（Ｔ−ＴＢＳ）中の２％カゼイン（１０ｍｌ）と共に、４℃で一晩セルロース
シートをインキュベートすることによって、ブロックした。このシートを、Ｔ−ＴＢＳブ
ロッキング緩衝液で１００倍希釈した、抗ＧＮＡ３３ｍＡｂ２５（６μｇ／ｍｌ）または
抗ＰｏｒＡ １．２ｍＡｂと共に３７℃で２時間インキュベートした。次にアルカリホス
フォターゼ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢｉｏＲａｄ）を、３７℃で１時間、Ｔ−ＴＢ
Ｓブロッキング緩衝液中３０００倍希釈で加えた。シートをＴ−ＴＢＳで３回洗浄し、基
質緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．９、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２）中のブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（ＢＣＩＰ）（Ｓｉｇｍ
ａ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および３−（４，５−ジメチルチアゾール−
２−イル）−２，５ジフェニル−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ；Ｓｉｇｍａ）と共に
そのシートをインキュベートすることにより、結合の検出を達成した。シグナルの定量評
価を、Ｕｍａｘ Ｓｐｅｅｄｙ ＩＩ ２２００オプティカルスキャナを用いて行なった
。
【実施例】
【０１３９】
（実施例１）
（間接蛍光フローサイトメトリーにより測定される、細菌細胞表面への抗ＧＮＡ３３抗
体の結合）
ＣＤ１マウスをｒＧＮＡ３３（２９９６株由来の遺伝子によってコードされる）を用い
て免疫化した。得られたポリクローナル抗体含有抗血清を、間接免疫蛍光結合アッセイの
フローサイトメトリー検出により測定される、様々なＭｅｎＢ株の生細菌細胞への結合能
力について試験した。図１Ａは、４つの代表的なＭｅｎＢ株、親２９９６株（Ｐ１．５，
２）および３つの他の株（Ｍ３７３５株（Ｐ１．５，２）、Ｍ４２０７株（Ｐ１．５）お
よびＭＣ５８株（Ｐ１．７，１６））へのポリクローナル抗ｒＧＮＡ３３抗血清の結合を
示す。抗ＧＮＡ３３ポリクロナール抗血清は、２９９６株およびＭ３７３５株のみと反応
した。抗莢膜ポジティブコントロールｍＡｂは４つの株全てと結合したが、Ｅ．ｃｏｌｉ
タンパク質で免疫化された動物から調製されたネガティブコントロール抗血清は、バック
グラウンド結合のみを示した。図１Ｂは、３つの株（Ｍ３７３５株（Ｐ１．５，２）、Ｍ
４２０７株（Ｐ１．５）およびＭＣ５８株（Ｐ１．７，１６）の細菌細胞表面への抗ＧＮ
Ａ３３ｍＡｂ２５の結合を測定する、同様の実験の結果を示す。ｍＡｂはＭ３７３５株（
Ｐ１．５，２）のみと結合した。
【０１４０】
表１は、２２個の遺伝的に多様な莢膜化髄膜炎菌株（２１個の血清型Ｂおよび１つの血
清型Ｃ）からの生細菌の表面に結合する、抗ＧＮＡ３３抗体またはｍＡｂ２５の能力を測
定するフローサイトメトリー実験の結果を要約したものである。抗ＧＮＡ３３抗体は、Ｐ
１．５，２血清亜型またはＰ１．２血清亜型を有する株にのみと結合した（９株中９株；
これに対して、他のＰｏｒ Ａ血清亜型を有する１３株中０株；Ｐ＜０．００１）。９個
のポジティブ株の１つであるＭ９８６株は、他の８個の株より低い結合を示した（下記参
照）。Ｐ１．５エピトープ（ＰｏｒＡのループ１上に存在、Ｓａｃｃｈｉら、Ｉｎｆｅｃ
ｔ．Ｄｉｓ．（２０００）１８２：１１６９−１１７６）を発現するが、Ｐ１．２エピト
ープ（ループ４）を発現しない、３つの株（Ｍ４２０７株、１０００株およびＢＺ８３株
）への結合はなかった。ＰｏｒＡを発現しない（すなわち、Ｐ１−）Ｍ１３６株への結合
もまたなかった。これらのデータは、細菌表面への抗ＧＮＡ−ＧＮＡ３３抗体の結合がＰ
ｏｒＡ血清亜型Ｐ１．２の発現と関連することを示している。
【０１４１】
（実施例２）
（異なるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｂ群株から調製された総膜画分のウェスタン
ブロット）
細菌表面への抗ＧＮＡ３３抗体の結合とＰ１．２血清亜型の明らか関係は、予想外であ
った。この関係を代表的な株から調製した総タンパク質のウェスタンブロットによりさら
に研究し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解決した。４つの血清亜型Ｂ株（フローサイト
メトリーで抗ＧＮＡ３３表面結合についてネガティブであった２つの株（ＮＧ３／８８株
（Ｐ１．７，１）およびＭＣ５８株（Ｐ１．１７，１６）、およびポジティブであった２
つの株（ＢＺ２３２株およびＮＭＢ株（共にＰ１．５，２））からの結果を図２に示す。
データはまた、ＧＮＡ３３をコードする遺伝子が不活性化された３つの株（ＭＣ５８株、
ＢＺ２３２株およびＮＭＢ株）からの総膜調製物について示す。
【０１４２】
図２Ａにおいて、約４８ｋＤａの見かけの質量を有する単一バンドを、２つの非Ｐ１．
２株（ＮＧ３／８８株（レーン３）およびＭＣ５８株（レーン４））からの膜調製物中の
抗ＧＮＡ３３ｍＡｂ２５によって検出した。バンドは、ｒＧＮＡ３３（レーン１）に予想
される見かけの分子量を有し、コントロールＥ．ｃｏｌｉ株（レーン２）から、およびＭ
Ｃ５８株（レーン５）中のＧＮＡ３３ノックアウトから調製された総タンパク質中に存在
しなかった。レーン６およびレーン８は、それぞれＢＺ２３２株およびＮＭＢ株から調製
される総タンパク質を含む。これらの株は共に、ＰｏｒＡ血清亜型Ｐ１．５，２を有する
。それぞれのレーンにおいて、２つの抗ＧＮＡ３３反応性バンドが存在する。より高分子
量である４８ｋＤａバンドはＢＺ２３２株およびＮＭＢ株（それぞれレーン７とレーン９
）から誘導されるＧＮＡ３３ノックアウトに存在せず、この結果はこのタンパク質がＧＮ
Ａ３３であることを確証する。より低分子量である抗ＧＮＡ３３反応性バンドは、Ｐ１．
２と反応性であるｍＡｂとの反応性に基づきＰｏｒＡであるようである（図２Ｂを参照の
こと）。
【０１４３】
図２Ｂは、図２Ａに記載されるものと同じタンパク質試料のウェスタンブロットを示す
が、一次検出抗体として抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２ｍＡｂを使用する。予想されるように、ｒ
ＧＮＡ３３（レーン１）と、ネガティブコントロールＥ．ｃｏｌｉタンパク質（レーン２
）とまたはＰｏｒＡ Ｐ１．２（レーン３，４および５）を発現しない株から調製される
総膜と、抗ＰｏｒＡ ｍＡｂとの反応性はなかった。しかしながら、ＰｏｒＡに期待され
る見かけの質量を有するタンパク質が、ＢＺ２３２株（レーン６）、ＢＺ２３２ΔＧＮＡ
３３（レーン７）、ＮＭＢ（レーン８）およびＮＭＢΔＧＮＡ３３（レーン９）からの膜
調製物中に検出された。それらはＰｏｒＡ Ｐ１．２を発現する。このタンパク質はまた
、それらのそれぞれのＧＮＡ３３ノックアウトからの調製物（それぞれレーン７およびレ
ーン９）中に存在する。これらの結果は、図２Ａの抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂと反応する４１
ｋＤａの見かけの質量を有するタンパク質がＰｏｒＡであったことを確証する。対照的に
、抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２ｍＡｂは、ウェスタンブロットでＧＮＡ３３と反応しなかった。
【０１４４】
（実施例３）
（抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂ２５によって認識される表面露出したＰｏｒＡエピトープのペ
プチドマッピング）
抗Ｐ１．２ ｍＡｂは、ループ４上に存在するＰｏｒＡ上のエピトープを認識すること
が知られている。表２は、本研究に含まれる選択されたＭｅｎＢ株についてのループ４可
変領域（ＶＲ２）アミノ酸配列の比較を示す（最近改訂されたＰｏｒＡ ＶＲ命名の慣例
会議についてＳａｃｃｈｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２０００）１８２：１１６９−
１１７６、またはｈｔｔｐ：／／ｍｌｓｔ．ｚｏｏ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／Ｍｅｎｉｎｇｏ
ｃｏｃｃｕｓを参照のこと）。表２中に、抗ＧＮＡ３３ｍＡｂによる表面結合についてネ
ガティブであった、２つの密接に関連するＶＲ２型（それぞれ、ＢＺ８３株（Ｐ１．１０
）からのＰ１．１０およびＭ４２０７株（Ｐ１．１０−１）からのＰ１．１０−１）の配
列を含む。２つのネガティブ株のループ４配列は、６個のアミノ酸ペプチドで抗ＧＮＡ３
３ポジティブ株と異なる。ポジティブＰ１．２株は、ヘキサペプチドＱＴＰＫＳＱ（配列
番号１６）またはＱＴＰＱＳＱ（配列番号１７）を含むが、ネガティブＰ１．１０株また
はＰ１．１０−１株は、ヘキサペプチドＮＫＱＮＱＲ（配列番号１８）またはＮＫＱＮＱ
Ｐ（配列番号１９）をそれぞれ含む（表２）。
【０１４５】
特に、抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂ２５によって認識される特定のアミノ酸配列を同定するた
めに、ＧＮＡ３３のアミノ酸配列全体（表３）およびＰｏｒＡ（２９９６株からのＰ１．
２−２）のループ４のアミノ酸配列全体に広がるオーバーラップ直鎖デカペプチド、Ｇｅ
ｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５７１８０）を合成した（注釈：Ｘ５７１８０中に与えられる配列
は、配列ＱＴＰＥ（配列番号２０）を有するＶＲ２をコードする）。しかしながら、この
配列はその後間違いであることが見出されている（Ｃ．Ｔ．Ｓａｃｃｈｉ、ＣＤＣ、Ａｔ
ｌａｎｔａ、ＧＡ，私信）。正しい配列はＱＴＰＱ（配列番号２１）である。ｍＡｂ２５
で８色素単位以上ポジティブであったペプチドが表３に詳述される。８個のポジティブＧ
ＮＡ３３ペプチドは全て、トリペプチドＱＴＰを共有する。ＱＴＰ配列はまた、ｍＡｂ２
５と反応した５つの全てのポジティブＰｏｒＡ Ｐ１．２ペプチドの中に存在する。しか
しながら、ＱＴＰを含むがその前のＦＶＱ配列を含まない３つのループ４ペプチドへのｍ
Ａｂ結合が存在しなかったので、ＱＴＰ配列は、抗ＧＮＡ３３結合に十分でない。
【０１４６】
抗ＧＮＡ ｍＡｂ２５結合に十分である、それぞれのタンパク質の最小ペプチド配列を
規定するために、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨＳ（図４Ａ；配列番号６）から始めて、次第に小さ
くなるペプチド、およびＴＰＡＨＦＶＱＱＴＰ（図４Ｂ；配列番号２２）で始めてＰｏｒ
Ａ Ｐ１．２ペプチドを合成した。ｍＡｂは、ＦＱＴＰＶ（配列番号２）を含むＧＮＡ３
３ペプチド、およびＦＶＱＱＴＰ（配列番号２３）を含むＰｏｒＡ Ｐ１．２ペプチドと
強く結合したが、より小さいどのペプチドとも結合しなかった。それぞれのタンパク質に
ついて同じ最小エピトープを、ＰｏｒＡのループ４の適切なペプチドおよびＧＮＡ３３内
に含まれる、アミノ酸の体系的なアラニン置換またはグリシン置換により、同定した。Ｐ
ｏｒＡループ４ＶＲ型Ｐ１．２−２についてのアラニン置換のデータの概要について、表
４を参照のこと。
【０１４７】
これらのデータは、ｒＧＮＡ３３によって惹起された抗体が、ＱＴＰ配列を含むＰｏｒ
ＡのＰ１．２エピトープとの交差反応性の結果として、Ｐ１．２エピトープを発現するＮ
ｍ株に対して殺菌作用を有することを示唆している。
【０１４８】
（実施例４）
（抗ＧＮＡ３３抗体および抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２抗体のＰ１．２ ＮｍＢ株への比較結
合）
抗ｒＧＮＡ３３抗体がＰｏｒＡ Ｐ１．２エピトープと交差反応するという予想外の発
見は、ＰｏｒＡ血清亜型Ｐ１．２．によって惹起された抗体の活性とｒＧＮＡ３３によっ
て産出された抗体の活性を比較する機会を与えた。１つの例外を除いて、試験した９個の
Ｐ１．２株について、抗ＧＮＡ３３ｍＡｂの濃度依存結合は、コントロール抗ＰｏｒＡ
Ｐ１．２ｍＡｂの濃度依存結合と類似していた（図５Ａの８０４７株およびＢＺ２３２株
についての代表的なデータを参照のこと）。例外のＭ９８６株は、他のＰ１．２株への結
合と比較した場合に、相対的に弱い抗ＧＮＡ３３抗体結合を示した（表５Ｂ）。対照的に
、抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２ｍＡｂによる結合は、Ｍ９８６を含む全てのＰ１．２株について
同様であった。
【０１４９】
Ｍ９８６株のＶＲ２配列型はＰ１．２であると報告され（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ９
２９１２）、それは、ＦＶＱＱＴＰＫセグメント（配列番号２４）を含むループ４配列に
よって定義され、８０４７株およびＢＺ２３２（ＶＲ２型Ｐ１．２−２；表１）について
のＦＶＱＱＴＰＱ（配列番号２５）と対照的である。このＶＲ２型は、特定のＰ１．２エ
ピトープのアミノ酸配列に基づく。ＶＲ２配列型Ｐ１．２（Ｍ３７３５株およびＭ５６８
２株）を有することが報告されている他の２つの株は、それぞれの株中に、コントロール
抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２ｍＡｂのそれぞれの結合と匹敵した、強い抗ＧＮＡ３３抗体結合を
示した（例えば、Ｍ３７３５株（図１Ａ）およびＭ５６８２（図５Ｂ）を用いた結合のデ
ータ）。Ｍ９８６株、Ｍ３７３５株およびＭ５６８２株中のＰｏｒＡループ４のＶＲ２配
列型は、２回目のヌクレオチド配列決定によってＰ１．２であることが確証された。従っ
て、配列の差異（Ｑに対するＫ）は、Ｍ９８６株との減少した抗ＧＮＡ３３結合活性を説
明するために十分であることが明らかではない。
【０１５０】
（実施例５）
（殺菌活性）
ＰｏｒＡ Ｐ１．２（ｒＧＮＡ３３）に対するマウスｍＡｂ（ｍＡｂ２５）ならびに血清Ｂ型に対するマウスｍＡｂ（ＳＥＡＭ１２）および血清Ｃ型に対するマウスｍＡｂ（ｍＡＢ１８１．１）多糖莢膜に対するマウスｍＡｂの補体依存殺菌活性を比較した。ＮｍＣ株Ｍ５９５４を試験するために使用した血清Ｃ型抗莢膜ｍＡｂ（サブクラスＩｇＧ３）を除いて、他のｍＡｂの全サブクラスはＩｇＧ２ａであった。ヒト補体の存在下において抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２ｍＡｂのＢＣ５０は、全ての９株について０．５μｇ／ｍｌ未満であった。血清Ｂ型抗莢膜ｍＡｂの対応するＢＣ５０値は高く（５〜１２μｇ／ｍｌの範囲）、そして血清Ｃ型ｍＡｂ（株Ｍ５９５４）については１μｇ／ｍｌ未満であった。表５にまとめたように、抗ＧＮＡ３３ｍＡｂの殺菌活性は多様であり、そして使用した補体供給源に依存した。３つの株（８０４７、ＮＭＢおよびＭ３７３５）について、ヒト補体の存在下において抗ＧＮＡ３３ｍＡｂのＢＣ５０値は、７〜１５μｇ／ｍｌの範囲であった。これらの株の値は、抗莢膜抗体の値と類似した。残りの６つの株（２９９６、ＢＺ２３２、Ｍ５５４５、Ｍ５６８２、Ｍ５９５４およびＭ９８６）について、ヒト補体の存在下において、抗ＧＮＡ３３ｍＡｂを用いて観察された殺傷は存在しなかった（内在性殺菌活性のない正常成体由来の血清を用いて試験した場合、ＢＣ５０は６０μｇ／ｍｌ未満（表５）であり、そして無γグロブリン血症を有する患者由来の血清を用いて試験した場合、３０μｇ／ｍｌ未満であった）。胎仔ウサギ血清を補体供給源として使用した場合、６株のうち１つを除いて全てが、抗ＧＮＡ３３誘導溶解に対して感受性であった。感受性株のＢＣ５０値は、１μｇ／ｍｌ以上８μｇ／ｍｌの範囲であった（表５）。一方、例外は株Ｍ９８６であり、ここで、ヒトおよびウサギ補体で試験した場合、抗ＧＮＡ３３ｍＡｂを用いて観察された殺傷は存在しなかった（ＢＣ５０値は、それぞれ１５０μｇ／ｍｌ超および３０μｇ／ｍｌ超である）。この株に対する細菌溶解の欠如は、フローサイトメトリーによって測定されるように、ｍＡｂのより低い表面結合に関連し得る（図５Ｂ）。試験した５株に対して、ヒト補体を用いたポリクローナルマウス抗ｒＧＮＡ３３抗血清のそれぞれの殺菌力価は、抗ＧＮＡ３３ｍＡｂ２５を用いて測定した結果と一致した（表５）。
【０１５１】
（実施例６）
（抗ＧＮＡ３３抗血清による受動性防御）
ＭｅｎＢ菌血症に対する受動性防御を与えるポリクローナルマウス抗ＧＮＡ３３抗体の
能力を、胎仔ラットモデルにおいて評価した。３株を使用した：８０４７、ヒトまたはウ
サギの補体の存在下で抗ＧＮＡ３３細菌溶解に感受性である株；ＢＺ２３２、すなわちヒ
ト補体での抗ＧＮＡ３３細菌溶解に耐性であるが、ウサギまたはラットの補体に感受性で
ある株；およびＭ９８６、すなわちヒト、ウサギまたはラットの補体の存在下で抗ＧＮＡ
３３細菌溶解に耐性である株。このモデルにおいて試験する受動性防御の結果を、表６に
まとめる。
【０１５２】
実験１において、ポリクローナルマウス抗ＧＮＡ３３抗血清の１：５または１：２５希
釈物（１００μｌ）を株８０４７の５．８×１０３ＣＦＵと混合し、そして菌血症に対し
て完全に保護したラットにｉ．ｐ．で与え、チャレンジの１８時間後に測定した。同様の
実験において、株Ｍ９８６（抗ＧＮＡ３３細菌溶解に対して耐性の株）の６．５×１０３
ＣＦＵと混合した抗ＧＮＡ３３抗血清の１：５または１：２５（１００μｌ）を与えた全
ての動物は、細菌血症を発症した。殺菌活性の欠如にかかわらず、抗ＧＮＡ３３抗血清で
処理し、そして株Ｍ９８６でチャレンジした動物血液の幾何平均ＣＦＵ／ｍｌは、Ｅ．ｃ
ｏｌｉタンパク質に対して調製したネガティブコントロール抗血清を用いて試験したコン
トロール動物よりも、１０〜２０培低かった（Ｐ＝０．０２）。同様の結果は、抗ＧＮＡ
３３ｍＡｂ２５を用いた第２の実験（実験２）において観察された。全６匹のラットを、
ｉ．ｐ．によりｍＡｂ２５の２０μｇで前処理し（時点０）、２時間後に株Ｍ９８６の３
．５×１０３ＣＦＵでチャレンジし、チャレンジの１８時間後に採集した血液サンプルに
は細菌が存在した。しかし、幾何平均ＣＦＵ／ｍｌは、無関係のｍＡｂを用いて前処理し
たコントロール動物の幾何平均ＣＦＵ／ｍｌの０．３％よりも少なかった（ｐ＜０．０２
）。同様の実験において、ラット１匹あたり２０μｇの抗Ｐ１．２ｍＡｂは、株Ｍ９８６
に対して完全な防御であり、そしてラット１匹あたり２μｇは部分的防御であった（試験
した６匹のうち１匹のみが菌血症を発症した）。
【０１５３】
第３および第４（実験３および４）において、ラットを株ＢＺ２３２（ヒト補体での抗
ＧＮＡ３３細菌溶解に耐性であるが、ウサギまたはラットの補体に感受性である）でチャ
レンジした。この実験において、この株に対する抗ＧＮＡ３３ｍＡｂの保護活性は、コン
トロールの抗莢膜抗体の防御活性と同じであるか、または高く、そして抗ＰｏｒＡ Ｐ１
．２ｍＡｂの防御活性よりもわずかに少ないだけである。
【０１５４】
上に示すように、ｒＧＮＡ３３を用いた免疫の結果として生じたマウス抗体は、補体の
存在下においてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株の細菌溶解を媒介し得る。なぜなら、抗
ＧＮＡ３３抗体と、ポーリン（ｐｏｒｉｎ）タンパク質（ＰｏｒＡ）のＰ１．２エピトー
プとの交差活性に起因するからである。この結果は、予測した結果ではなかった。なぜな
ら、ＧＮＡ３３およびＰｏｒＡは十分な配列相同性を有しておらず、構造的および機能的
に関連がなく、そして異なる細菌的亜構造に物理的に局在するからである。従って、ＧＮ
Ａ３３はＰｏｒＡの免疫学的模倣物として記載され得る。
【０１５５】
ＧＮＡ３３によって示される分子模倣は例外的である。第１に、ＧＮＡ３３は上記のよ
うな非免疫グロブリンタンパク質であり、ＰｏｒＡとは関連がない。第２に、ｒＧＡＮ３
３は抗体反応を誘発し、これは、（多くの点において）外部膜ビヒクル調製物におけるネ
イティブなＰｏｒＡによって誘発される抗体反応と機能活性が類似する。第３に、本明細
書中に記載されるポリクローナルマウス抗ｒＧＮＡ３３抗血清を、２つの独立した研究室
において調製し、そして殺菌データを独立して繰り返した。
【０１５６】
以前の研究において、ＰｏｒＡ Ｐ１．２のループ４に対応するペプチドを用いた免疫
は、ネイティブタンパク質に結合されたか、または補体の存在下で細菌溶解を媒介する抗
体を惹起することに失敗した（ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ（１９９０
）１７１：１８７１−１８７２）。おそらく、より小さなペプチドフラグメントは、ネイ
ティブポーリンに示される安定なコンフォメーションをとることは出来なかった。同様に
、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｕｓにおいて発現されるｒＰｏｒＡを用いた免疫
は、組換えタンパク質において表面受容可能なＰｏｒＡエピトープのコンフォメーション
がリポソームまたは界面活性剤を用いて再構築される場合を除いては、殺菌抗体を惹起す
ることに失敗した（Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１
９９８）１４４：３０２７−３０３７およびＩｄａｎｐａａｎ−Ｈｅｉｋｋｉｌａら、Ｖ
ａｃｃｉｎｅ（１９９５）１３：１５０１−１５０８）。これらの結果は、殺菌抗体の惹
起を担うＰｏｒＡのエピトープが立体的であることを示唆する。対照的に、本明細書中に
示されるように、ｒＧＮＡ３３模倣物を用いた免疫は、ＰｏｒＡループ４のＰ１．２エピ
トープと交差反応する殺菌抗体を惹起した。ｒＰｏｒＡと違って、免疫源として使用され
る組換えＧＮＡ３３タンパク質が、組換え分子の再生についての必要性を有さず、フロイ
ントのアジュバントと単に混合される場合に、これが生じる。
【０１５７】
従って、ＧＮＡ３３ポリペプチド、エピトープ、ＧＮＡ３３に対して指向された抗体お
よびこれらの分子の使用は、記載されている。上記より、本発明の特定の実施形態が本明
細書中に、例示目的のために記載されているが、種々の改変が、添付の特許請求の範囲に
よって規定される精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【０１５８】
【表１】
【０１５９】
【表２】
【０１６０】
【表３】
【０１６１】
【表４】
【０１６２】
【表５】
【０１６３】
【表６】
Ａ実験１において、細菌を、ｉ．ｐ．によるチャンレンジの直前に、抗血清またはコント
ロールｍＡｂと一緒に混合した。実験２、３および４において、０時間において、動物を
ｍＡｂを用いてｉ．ｐ．で処理した。２時間後、その動物を、細菌を用いてｉ．ｐ．チャ
レンジした。両方の実験において、血液培養物をチャレンジの１８時間後に得た。
Ｂ幾何平均のＣＦＵ／ｍｌの計算のために、滅菌培地を用いた動物に、１ＣＦＵ／ｍｌの
値を割り当てた。実験１において、抗ＧＮＡ３３抗血清の１：５または１．２５希釈を与
えそして、株Ｍ９８６（２８．８×１０３）でチャレンジした動物の組み合わせ群の幾何
平均ＣＦＵ／ｍｌは、無関係なｍＡｂまたはＥ．ｃｏｌｉ抗血清（３５０×１０３、Ｐ＝
０．０２）を与えたコントロールの組み合わせた群のものよりも低かった。実験２、３お
よび４において、抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂで処置された動物の幾何平均ＣＦＵ／ｍｌは、無
関係なｍＡｂを与えたコントロールの物より低かった（Ｐ＜０．０２）。
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般的には、細菌性病原体に関する。特に、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（ＭｅｎＢ）Ｐ１．２血清亜型のＰｏｒＡのループ
４に対する表面に露出したエピトープの分子模倣物およびこの模倣物に対して産生される
抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、細菌性の髄膜炎および敗血症の原
因物質である。髄膜炎菌は、莢膜抗原および細胞壁抗原の免疫学的特徴に基づいて血清学
的な群に分類される。現在認識されている血清型は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ−１３５、Ｘ、Ｙ、
Ｚおよび２９Ｅを含む。血清型特異性の原因である多糖類は、これらの群のいくつかから
精製され、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ−１３５およびＹが挙げられる。
【０００３】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（本明細書中で「ＭｅｎＢ」または「ＮｍＢ」
と呼ばれる）は、アメリカ合衆国およびヨーロッパに居住している未成年者および小児に
おける大部分の細菌性髄膜炎の原因となる。この生物はまた、若年成人における致死的な
敗血症を引き起こす。青年では、外膜タンパク質（ＯＭＰ）小胞からなる実験的なＭｅｎ
Ｂワクチンが、幾分防御性である。しかし、ワクチン接種した未成年者（疾患の危険性が
最大の年齢層）では、防御性は、観察されていない。さらに、ＯＭＰワクチンは、血清型
特異性および亜型特異性であり、そして優性ＭｅｎＢ株は、地理的な変異および時間的な
変異の両方に制約され、このようなワクチンの有用性を制限している。
【０００４】
効果的な莢膜の多糖類に基づくワクチンは、血清型Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ１３５によって
引き起こされる髄膜炎菌性疾患に対して開発されている。しかし、ＭｅｎＢ多糖類ワクチ
ンを開発する同様な試みは、莢膜ＭｅｎＢ多糖類（本明細書中で「ＭｅｎＢ ＰＳ」と呼
ばれる）の乏しい免疫原性に起因して失敗している。ＭｅｎＢ ＰＳは、Ｎ−アセチル（
α２−＞８）ノイラミン酸のホモポリマーである。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｋ１は、同一の莢膜多糖類を有する。ＭｅｎＢ ＰＳにより誘発される抗体は、宿主のポ
リシアル酸（ＰＳＡ）と交差反応する。ＰＳＡは、胎児および新生児の組織、特に、脳組
織に見られる神経細胞接着分子（「ＮＣＡＭ」）上で大量に発現される。ＰＳＡはまた、
腎臓、心臓および嗅神経を含む成人組織で、より少ない程度に見出される。従って、ほと
んどの抗ＭｅｎＢ ＰＳ抗体はまた、自己抗体である。それゆえ、このような抗体は、胎
児の発育に悪影響を与えるか、または自己免疫疾患をもたらす可能性を有する。
【０００５】
ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体は、ＭｅｎＢ ＰＳの乏しい免疫原性を回避する試みにおいて調製されてきた。例えば、Ｃ３〜Ｃ８Ｎ−アシル置換ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体が、記載されている。Ｊｅｎｎｉｎｇｓらに対する特許文献１を参照のこと。同様に、Ｊｅｎｎｉｎｇｓらに対する特許文献２は、本明細書中で「ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ」と呼ばれるＮ−プロピオニル化ＭｅｎＢ ＰＳ分子を記載している。ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ複合糖質で免疫したマウスが、高い力価のＩｇＧ抗体を誘発することが報告された。非特許文献１。ウサギでは、２つの異なる抗体の集団（２つの異なるエピトープと結合されるといわれ、１つは、ネイティブなＭｅｎＢ ＰＳによって共有され、そして１つは共有されていない）を、誘導体を用いて作製した。殺菌活性は、ＭｅｎＢ ＰＳと交差反応しない抗体集団で見出された。非特許文献２。この結合体によって誘発される防御性抗体と反応する、細菌性表面エピトープの同一性は、未知のままである。さらに、このワクチンによって誘発される抗体の部分集合は、宿主のポリシアル酸と自己反応性を有するので（非特許文献３）、ヒトにおけるこのワクチンの安全性は、不確かなままである。
これらの試みにも関わらず、従来のアプローチは、安全かつＭｅｎＢ感染に対して広範な防御性を付与し得る抗原の同定に失敗している。
【０００６】
種々の病原体に対して防御性の免疫応答を誘発するため、ならびに癌および自己免疫疾
患の処置のために、分子模倣性抗原を使用することに、相当な関心が存在する。感染性疾
患の予防のためにワクチンを開発するこのアプローチは、名目上の抗原が毒性であるかも
しくは精製が困難である場合、または限定した数のエピトープに免疫応答を指向すること
が望ましい場合、最大の有用性を有する。それにも関わらず、病原体に対する防御性抗体
を誘発する模倣性ワクチンの成功を報告する研究は、比較的わずかしかない。
【０００７】
ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体に対して指向される多数の機能的に活性な抗体は、特許文献３に記載されている。これらの抗体は、宿主組織と、交差反応しないかまたは最小限に交差反応し、従って、自己免疫疾患を惹起する最小限の危険性をもたらす。特許文献４は、これらの抗体を使用して同定されたＭｅｎＢ ＰＳの固有なエピトープの分子模倣物を記述している。しかし、他のＭｅｎＢ抗原のペプチド模倣物の発見は、相当の関心を残している。
【０００８】
ＭｅｎＢ（ＭＣ５８株）の完全なゲノム配列は、記述されている。非特許文献４。血清殺菌性抗体応答を誘発するいくつかのタンパク質が、全体のゲノム配列決定によって同定されている。これらのタンパク質は、保存された配列を有し、そしてカプセル化されたＭｅｎＢ株上の表面に露出されているようである。非特許文献５．これらのタンパク質の１つは、ＧＮＡ３３（ゲノム由来の抗原）である。ＧＮＡ３３は、リポタンパク質であり、そして推定されたアミノ酸配列は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．由来の膜結合溶解性ムレイントランスグリコシラーゼ（ＭｌｔＡ）と相同性を示す。非特許文献６。ＧＮＡ３３は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの中で高度に保存されている。非特許文献７。組換えＧＮＡ３３で免疫したマウスは、カプセル化ＭｅｎＢ２９９６株に対して測定された場合、高い血清殺菌性抗体力価を発生した。抗体応答の大きさは、２９９６株から調製されたＯＭＰ小胞で免疫したコントロール動物の大きさと同様であった。しかし、ＧＮＡ３３が防御性抗体を誘発する機構は、同定されておらず、異なるＭｅｎＢ株に対する防御性応答の寛容も同定されていなかった。
ＭｅｎＢに対して安全かつ有効なワクチンの産生が、特に望ましいことが容易に理解さ
れる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許発明第５０４，２０２Ｂ号明細書
【特許文献２】米国特許第４，７２７，１３６号明細書
【特許文献３】米国特許第６，０４８，５２７号明細書
【特許文献４】米国特許第６，０３０，６１９号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１７０８
【非特許文献２】Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：１２０７
【非特許文献３】Ｇｒａｎｏｆｆら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５０２８
【非特許文献４】Ｔｅｔｔｅｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８０９
【非特許文献５】Ｐｉｚｚａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８１６
【非特許文献６】Ｌｏｍｍａｔｚｓｃｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９７）１７９：５４６５〜５４７０
【非特許文献７】Ｐｉｚｚａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８１６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、ＧＮＡ３３が、Ｐ１．２血清型亜型を有する株のＰｏｒＡのループ４において
、表面に露出したエピトープを模倣することによってＭｅｎＢに対する保護抗体を誘発す
るという、思いがけない発見に基づく。このような抗体の機能活性は、本明細書中に記載
されるように、ヒトにおける髄膜炎菌性疾患に対して保護する分子因子の能力を予測する
インビトロおよびインビボでの機能アッセイを用いることによって評価されている。
【００１２】
従って、一実施形態において、本発明は、ＭｅｎＢ細菌に対する機能的活性を行う抗体
の産生に有用なエピトープを含む、ＧＮＡ３３ペプチドに関する。このペプチドは、全長
未満のＧＮＡ３３配列を含む。特に好ましい実施形態において、このペプチドは、アミノ
酸配列ＱＴＰおよび、必要に応じて、ＱＴＰ配列に対してＣ末端またはＮ末端のいずれか
に生じる、さらなるＱＴＰ配列の前または後ろのフランキング配列（好ましくは１〜５０
またはそれ以上であるが全長配列ではない（例えば、１〜３、１〜５、もしくは１〜１０
または１〜２５あるいはこれらの範囲間の任意の整数値）アミノ酸）を含む。代表的なＧ
ＮＡ３３配列を図３（配列番号１）に示す。このＱＴＰは、図３の１０６〜１０８位に生
じる。この配列は、種々のＭｅｎＢ株（例えば、本明細書中に記載される）が異なるフラ
ンキング配列を有するように、図３に示されるように、ＱＴＰに隣接する配列に限定され
ないことが理解される。種々の菌株におけるＰｏｒＡ領域の配列は公知であり、そのいく
つかが、表２に示される。
【００１３】
特定の実施形態において、ＧＮＡ３３ペプチドは、以下からなる群より選択されるアミ
ノ酸配列を含む：ＦＱＴＰＶ（配列番号２）、ＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号３）、ＡＦＱＴ
ＰＶＨＳ（配列番号４）、ＱＡＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号５）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨＳ（
配列番号６）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨ（配列番号７）、ＡＱＡＦＱＴＰＶ（配列番号８）、
ＱＡＦＱＴＰＶＨＳＦ（配列番号９）、ＡＦＱＴＰＶＨＳＦＱ（配列番号１０）、ＦＱＴ
ＰＶＨＳＦＱＡ（配列番号１１）、ＱＴＰＶＨＳＦＱＡＫ（配列番号１２）、ＤＶＳＡＱ
ＡＦＱＴＰ（配列番号１２）、ＶＳＡＱＡＦＱＴＰＶ（配列番号１３）およびＳＡＱＡＦ
ＱＴＰＶＨ（配列番号１４）。
【００１４】
他の実施形態において、本発明は、血清学的に異なる外膜タンパク質の他のエピトープ
を挿入するためのキャリア、ならびに一般的なキャリアとしての、ＧＮＡ３３ポリペプチ
ドの使用に関する。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、これらのペプチドをコードするポリヌクレオチドお
よびこのポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、このベクターを含む宿主細胞、なら
びにこのペプチドを組み換え生成する方法に関する。
【００１６】
なお他の実施形態において、本発明は、ＧＮＡ３３エピトープに対する抗体に関し、こ
こで、この抗体は、ＧＮＡ３３エピトープによって結合され得、そして／またはＭｅｎＢ
細菌に対する機能活性を立証する。さらに以下に説明されるように、本明細書中に記載さ
れるアッセイを用いて決定されるように、この抗体分子がＭｅｎＢに対して補体が媒介す
る殺菌活性および／またはオプソニン活性を示す場合、抗体は、ＭｅｎＢ生物に対する機
能活性を示す。代表的なＧＮＡ３３エピトープとしては、ＱＴＰ、ＦＱＴＰＶ（配列番号
２）、ＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号３）、ＡＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号４）、ＱＡＦＱＴＰ
ＶＨＳ（配列番号５）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号６）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨ（配
列番号７）、ＡＱＡＦＱＴＰＶ（配列番号８）、ＱＡＦＱＴＰＶＨＳＦ（配列番号９）、
ＡＦＱＴＰＶＨＳＦＱ（配列番号１０）、ＦＱＴＰＶＨＳＦＱＡ（配列番号１１）、ＱＴ
ＰＶＨＳＦＱＡＫ（配列番号１２）、ＤＶＳＡＱＡＦＱＴＰ（配列番号１２）、ＶＳＡＱ
ＡＦＱＴＰＶ（配列番号１３）およびＳＡＱＡＦＱＴＰＶＨ（配列番号１４）が挙げられ
る。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、ＧＮＡ３３エピトープに対するモノクローナル抗体およびそ
れらのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。好ましくは、このモノク
ローナル抗体は、ＭｅｎＢ生物に対する機能活性を示す。
【００１８】
本発明のなおさらなる実施形態は、ＭｅｎＢのエピトープのさらなる分子模倣物（ｍｉ
ｍｅｔｉｃ）を単離するための方法およびこの方法を用いて同定される分子模倣物に関す
る。この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）ＭｅｎＢのエピトープの推定分子模倣物を含む分子集団を提供する工程；
（ｂ）存在する場合、複合体を提供するために、抗体および分子模倣物の間の免疫学的
結合を可能にする条件下で、この分子集団を、本明細書中に記載される抗体と接触させる
工程；および
（ｃ）非結合分子から複合体を分離する工程。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて、ＧＮＡ
３３、または上記のようなエピトープを含むＧＮＡ３３のペプチドを含む組成物に関する
。
【００２０】
なお別の実施形態において、本発明は、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて、Ｇ
ＮＡ３３ポリペプチドに対する抗体を含む組成物に関する。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物被験体におけるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅ
ｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂに対する免疫応答を誘発する方法に関し、この方法は、被
験体に対し、上記のようなＧＮＡ３３ペプチドを投与する工程を包含する。
【００２２】
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物被験体においてＭｅｎＢ疾患を処置または
予防するための方法に関し、この方法は、有効量の上記組成物を被験体に投与する工程を
包含する。
【００２３】
別の実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎ
ｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ抗体を検出するための方法に関し、この方法は、以下の工程
を包含する：
（ａ）生物学的サンプルを提供する工程；
（ｂ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ抗体を、上記生物学的
サンプル中に存在する場合、ＧＮＡ３３ポリペプチドに結合し得る条件下で、生物学的サ
ンプルをＧＮＡ３３ポリペプチドと反応させ、抗体／ＧＮＡ３３ポリペプチド複合体を形
成する工程；および
（ｃ）この複合体の存在または非存在を検出し、
これによって、サンプル中のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
抗体の存在または非存在を検出する工程。
【００２４】
代表的なＧＮＡ３３ポリペプチドとしては、以下からなる群より選択されるアミノ酸配
列を含む、ＧＮＡ３３ペプチドが挙げられる：ＱＴＰ、ＦＱＴＰＶ（配列番号２）、ＦＱ
ＴＰＶＨＳ（配列番号３）、ＡＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号４）、ＱＡＦＱＴＰＶＨＳ（配
列番号５）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号６）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨ（配列番号７）
、ＡＱＡＦＱＴＰＶ（配列番号８）、ＱＡＦＱＴＰＶＨＳＦ（配列番号９）、ＡＦＱＴＰ
ＶＨＳＦＱ（配列番号１０）、ＦＱＴＰＶＨＳＦＱＡ（配列番号１１）、ＱＴＰＶＨＳＦ
ＱＡＫ（配列番号１２）、ＤＶＳＡＱＡＦＱＴＰ（配列番号１２）、ＶＳＡＱＡＦＱＴＰ
Ｖ（配列番号１３）およびＳＡＱＡＦＱＴＰＶＨ（配列番号１４）。したがって、本発明
は、以下を提供する。
（１）アミノ酸配列ＱＴＰを含むＧＮＡ３３ペプチドであって、該ペプチドが、Ｎｅｉｓ
ｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ細菌に対して、補体媒介性の殺菌活性お
よび／またはオプソニン活性を示す抗体の産生を誘発し得る、ＧＮＡ３３ペプチド。
（２）項目１に記載のＧＮＡ３３ペプチドであって、該ペプチドが、ＦＱＴＰＶ（配列番
号２）、ＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号３）、ＡＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号４）、ＱＡＦＱＴ
ＰＶＨＳ（配列番号５）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号６）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨ（
配列番号７）、ＡＱＡＦＱＴＰＶ（配列番号８）、ＱＡＦＱＴＰＶＨＳＦ（配列番号９）
、ＡＦＱＴＰＶＨＳＦＱ（配列番号１０）、ＦＱＴＰＶＨＳＦＱＡ（配列番号１１）、Ｑ
ＴＰＶＨＳＦＱＡＫ（配列番号１２）、ＤＶＳＡＱＡＦＱＴＰ（配列番号１２）、ＶＳＡ
ＱＡＦＱＴＰＶ（配列番号１３）およびＳＡＱＡＦＱＴＰＶＨ（配列番号１４）からなる
群より選択されるアミノ酸配列を含む、ＧＮＡ３３ペプチド。
（３）前記ペプチドが、アミノ酸配列ＦＱＴＰＶ（配列番号２）を含む、項目２に記載の
ＧＮＡ３３ペプチド。
（４）項目１〜３のいずれか１項に記載のＧＮＡ３３ペプチド、および薬学的に受容可能
な賦形剤を含む、組成物。
（５）哺乳動物被験体において、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型
Ｂ細菌に対する免疫応答を誘発するための方法における、項目４に記載の組成物の使用。
（６）哺乳動物被験体においてＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
細菌に対する免疫応答を誘発するための方法であって、該被験体に有効量の項目４に記載
の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（７）項目１〜３のいずれか１項に記載のＧＮＡ３３ペプチドに対して指向されるモノク
ローナル抗体であって、該抗体が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清
型Ｂ細菌に対して、補体媒介性の殺菌活性および／またはオプソニン活性を示す、モノク
ローナル抗体。
（８）項目７に記載のモノクローナル抗体、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、組
成物。
（９）ＧＮＡ３３ポリペプチドに対する抗体を含む組成物であって、該抗体が、Ｎｅｉｓ
ｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ細菌に対して、補体媒介性の殺菌活性お
よび／またはオプソニン活性を示す、組成物。
（１０）前記抗体が、モノクローナル抗体である、項目９に記載の組成物。
（１１）哺乳動物被験体において、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清
型Ｂ細菌に対する免疫応答を誘発するための方法における、項目８〜１０のいずれか１項
に記載の組成物の使用。
（１２）哺乳動物被験体において、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清
型Ｂ細菌に対する免疫応答を誘発するための方法であって、該被験体に有効量の項目８〜
１０のいずれか１項に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（１３）
項目１〜３のいずれか１項に記載のペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
（１４）組換えベクターであって、以下：
（ａ）項目１３に記載のポリヌクレオチド；および
（ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結される、少なくとも１つの異種制御エレメ
ント、
を含む、組換えベクターであって、該組換えベクターによって、該ポリヌクレオチドが、
宿主細胞中で転写および翻訳され得、そして該制御エレメントの少なくとも１つが、該ポ
リヌクレオチドに対して異種である、組換えベクター。
（１５）項目１４に記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。
（１６）ＧＮＡ３３ペプチドを産生するための方法であって、該方法が、タンパク質を産
生するための条件下で、項目１５に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
（１７）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ細菌のエピトープの分
子模倣物を単離するための方法であって、該方法が、以下：
（ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ細菌のエピトープの推
定上の分子模倣物を含む分子の集団を提供する工程；
（ｂ）該分子の集団を抗ＧＮＡ３３抗体と接触させる工程であって、該抗体と該分子模
倣物（存在する場合）との間の免疫学的結合を可能にして、複合体を提供する条件下で接
触させる工程；および
（ｃ）非結合分子から該複合体を分離する工程、
を包含する、方法。
（１８）生物学的サンプル中でＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
抗体を検出するための方法における、ＧＮＡ３３ポリペプチドの使用。
（１９）生物学的サンプル中でＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
抗体を検出するための方法における、項目１〜３のいずれか１項に記載のＧＮＡ３３ペプ
チドの使用。
（２０）生物学的サンプル中でＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
抗体を検出するための方法であって、該方法が、以下：
（ａ）生物学的サンプルを提供する工程；
（ｂ）該生物学的サンプルをＧＮＡ３３ポリペプチドと反応させる工程であって、該生
物学的サンプル中に存在する場合、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清
型Ｂ抗体を、該ＧＮＡ３３ポリペプチドと結合させて、抗体／ＧＮＡ３３ポリペプチド複
合体を形成する条件下で反応させる工程、および
（ｃ）該複合体の存在または非存在を検出する工程であって、それによって、該サンプ
ル中のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ抗体の存在または非存在
を検出する工程、
を包含する、方法。
（２１）生物学的サンプル中のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
抗体を検出するための方法であって、該方法が、以下：
（ａ）生物学的サンプルを提供する工程；
（ｂ）該生物学的サンプルを項目１〜３に記載のいずれか１項に記載のＧＮＡ３３ペプ
チドと反応させる工程であって、該生物学的サンプル中に存在する場合、Ｎｅｉｓｓｅｒ
ｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ抗体を、該ＧＮＡ３３ポリペプチドと結合さ
せて、抗体／ＧＮＡ３３ポリペプチド複合体を形成する条件下で反応させる工程；および
（ｃ）該複合体の存在または非存在を検出する工程であって、それによって、該サンプ
ル中のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ抗体の存在または非存在
を検出する工程、
を包含する、方法。
本発明のこれらまたは他の実施形態は、本明細書中の開示を考慮して、当業者に容易に
なされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、抗ＧＮＡ３３抗血清（１Ａ）と生存する被包性のＮｍＢ株の表面に対する抗体との結合を示す。図１Ａは、間接性蛍光フローサイトメトリーによって決定された、ポリクローナル抗ＧＮＡ３３抗血清と、生存する被包性のＮｍＢ株２９９６、Ｍ３７３５、Ｍ４２０７、およびＭＣ５８に対するコントロールｍＡｂとの結合を示す。コントロールｍＡｂｓおよび抗血清としては、抗血清型Ｂの被膜特異的マウスｍＡｂ（ＳＥＡＭ １２，Ｇｒａｎｏｆｆら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６０：５０２８−５０３６）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清亜型ｍＡｂ抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２、およびＥ．ｃｏｌｉの外膜小胞によって免役したマウス由来のポリクローナル抗血清が挙げられる。図１Ｂは、抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂ２５とＮｍＢ株Ｍ３７３５、Ｍ４２０７、およびＭＣ５８に対するコントロールｍＡｂとの結合を示す。このマウスコントロールｍＡｂとしては、無関係の特異性を有するｍＡｂ（ＶＩＧ１０）および図１Ａについて上記と同じ抗被包性ｍＡｂおよび抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２ ｍＡｂが挙げられる。
【図２】図２は、異なるＭｅｎＢ菌株から調製され、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された総膜分画のウェスタンブロットを示す。図２Ａは、抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂ ２５との反応性を示す。レーン１、ｒＧＮＡ３３。レーン２、コントロールＥ．ｃｏｌｉ細胞から調製された総タンパク質。レーン３、４および５：それぞれ、ＭｅｎＢ菌株である、ＮＧ３／８８（Ｐｌ．１）、ＭＣ５８（Ｐ１．７，１６）、ＭＣ５８の変異体から調製された総タンパク質、ＭＣ５８変異体において、ＧＮＡ３３をコードする遺伝子が不活化されている（ＭＣ５８ΔＧＮＡ３３）。レーン６、７、８および９：それぞれ、ＭｅｎＢ菌株であるＢＺ２３２、ＢＺ２３２ΔＧＮＡ３３、ＮＭＢおよびＮＭＢΔＧＮＡ３３から調製された総タンパク質。４つの菌株全ては、血清亜型Ｐ１．５，２である。図２Ｂは、図２Ａに記載されるのと同じタンパク質サンプルのウェスタンブロットを示すが、一次検出抗体として抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２ ｍＡｂを用いている。
【図３】図３（配列番号１）は、代表的なＧＮＡ３３ポリペプチドの全長アミノ酸配列を示す。下線を引かれた１〜２１位に存在するアミノ酸は、リーダー配列に一致する。
【図４】図４は、（Ａ）ＧＮＡ３３および（Ｂ）ＰｏｒＡ Ｐ１．２（菌株２９９６）由来のセグメントに対応する連続的小ペプチドへの抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂ ２５の結合を示す。示される個々のペプチドは、各タンパク質から調製された重複する１０マーのペプチドを用いたマッピング研究から同定され、そしてｍＡｂ ２５によって認識されているエピトープを含むことが示された。
【図５】図５は、間接性蛍光フローサイトメトリーによって決定されるように、生存する被包性ＮｍＢへのマウスｍＡｂの結合を示す。試験されるｍＡｂは、図１Ｂに整列して記載されている。図５Ａは、菌株８０４７（ヒト補体を有する、ＢＣ５０＝１５μｇ／ｍｌ）およびＢＺ２３２（ヒト補体を有する、ＢＣ５０＞１５０μｇ／ｍｌ）への抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂ ２５の濃度依存性結合を示す。両方の菌株は、ウサギ（原文参照のこと）を用いて試験した場合、溶菌作用に対して感受性であった。図５Ｂは、菌株８０４７（ＰｏｒＡ ＶＲ２型Ｐ１．２−２）と比較した場合の、菌株Ｍ９８６（ＰｏｒＡ ＶＲ２型Ｐ１．２）および菌株Ｍ５６８２（ＰｏｒＡ ＶＲ２型Ｐ１．２）への抗ＧＮＡ３の濃度依存性の結合を示す。Ｍ９８６は、抗ＧＮＡ３３溶菌作用（ヒトまたはウサギ）に対して耐性であり、Ｍ５６８２は感受性であり（ウサギ補体）、そして菌株８０４７は感受性であった（ヒトまたはウサギ）。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（本発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示されなければ、免疫学、微生物学および分子生物学の慣習的な
技術を使用し、これらは当該分野の技術の範囲内である。このような技術は以下の文献で
十分説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ
およびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ（２００１）；ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＢｏｙｄ、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版、１９７３）；ＣａｒｅｙおよびＳｕｎｄｂｅｒｇ、Ａｄｖａ
ｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第２版、１９８５）；Ｓｍｉｔｈ，Ｍ
．Ｂ．，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９４）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；
およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第
Ｉ巻−第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６，Ｂ
ｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を参照のこと。
【００２７】
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形態「ａ」「ａ
ｎ」および「ｔｈｅ」は、他に指示されなければ、複数の言及を含む。
【００２８】
（Ｉ．定義）
本発明の記載において、以下の用語が使用され、そして以下に示されるように定義され
ることが意図される。
【００２９】
「ＧＮＡ３３ポリペプチド」とは、ＧＮＡ３３タンパク質由来のポリペプチドを意味し
、このポリペプチドは、ＭｅｎＢに対する免疫学的応答（例えば、以下に示すようなＭｅ
ｎＢ細菌に対する機能的活性を実証する抗体の産生）を誘発し得る。この用語は、ＧＮＡ
３３由来の個々の高分子または抗原性高分子の相同性集団もしくは異種集団を示すために
用いられ得る。本発明の目的のために、ＧＮＡ３３ポリペプチドは、種々の公知のＭｅｎ
Ｂ株のいずれかから誘導され得る。２９９６株についてのＧＮＡ３３配列を、図３（配列
番号１）に示す。しかし、他のＭｅｎＢ株由来の多数のＧＮＡ３３配列が知られている。
例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｃ８１２４４、Ｂ８２０２３、ＡＦ２２６３９５、ＡＦ
２２６３９２、ＡＦ２２６３９０、ＡＦ２２６４０３、ＡＦ２２６４１３、ＡＦ２２６４
１２、ＡＦ２２６３８７、ＡＦ２２６４０９、ＡＦ２２６４１、ＡＦ２２６３９７、ＡＦ
２２６３８９、ＡＦ２２６３９３、ＡＦ２２６４１６、ＡＦ２２６４１４、ＡＦ２２６４
０２、ＡＦ２２６４０４、ＡＦ２３５１４５、ＡＦ２３５１４４、ＡＦ２３５１４３、Ｎ
ｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；Ｅ８３４９１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰＡＯ１株）；ＡＦ３００４７１、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏ
ｂｉｌｉｓ；ＡＡＫ８５８３４、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
；ＣＡＣ４１３９６、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ；ＡＡＫ２５７０
２、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ；Ｓ７６３３４、Ｓｙｎｅｃｈｏｃ
ｙｓｔｉｓ ｓｐ．（ＰＣＣ ６８０３株）；ＡＡＫ０３０１２、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌ
ａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ；Ｑ９ＫＰＱ４、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ；ＡＡＢ４０
４６３、ＡＡＣ４５７２３、Ｐ４６８８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；Ｐ５７
５３１、Ｂｕｃｈｎｅｒａ ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ ｐｉ
ｓｕｍ）；ＮＰ１４３７１４、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉを参照のこ
と。
【００３０】
本明細書中に使用される場合、「ＧＮＡ３３ポリペプチド」はまた、シグナル配列（図
３のアミノ酸１〜２１）を有するか、またはそれを有さない、全長ＧＮＡ３３参照配列を
含む、ネイティブのＧＮＡ３３配列由来の分子、および組換え産生または化学合成された
ＧＮＡ３３ポリペプチド、ならびに下記のように免疫原性を保持するＧＮＡ３３ペプチド
を含む。
【００３１】
用語「アナログ」とは、参照分子の誘導体をいう。アナログは、上記のような、生物学
的活性（例えば、ＭｅｎＢに対する機能的活性を有する抗体の形成を誘発する能力）を保
持し得る。一般に、用語「アナログ」とは、改変が活性を損なわない限りにおける、ネイ
ティブの分子に対して１以上のアミノ酸の付加、（一般的には、性質が保存される）置換
、および／または欠失を有するネイティブのポリペプチドの配列および構造を有する化合
物をいう。好ましくは、アナログは、親分子と少なくとも同じ生物学的活性を有し、そし
て親分子よりも増強された活性さえ示し得る。ポリペプチドアナログを作製するための方
法は、当該分野において公知であり、以下にさらに記載される。
【００３２】
例えば、アナログは、一般的には、参照分子に対して少なくとも約５０％のアミノ酸同
一性を有し、より好ましくは、問題のネイティブペプチド配列の関連する部分に対して約
７５〜８５％の同一性、そして最も好ましくはそれに対して約９０〜９５％以上の同一性
を有する。そのアミノ酸配列は、約１０〜７５アミノ酸以下の置換を有するか、約５〜５
０アミノ酸以下の置換を有するか、または１、２、３もしくは５つまでの置換有するのみ
であるか、あるいは上記の範囲の間の任意の置換を有する。特に好ましい置換は、一般に
、性質を保存する（すなわち、これらの置換は、アミノ酸のファミリー内で起こり得る）
。この事について、アミノ酸は、一般的に、以下の４つのファミリーに分類される：（１
）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、
ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、
フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、；ならびに（４）非荷電極性−−グリ
シン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニ
ルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、しばしば、芳香族アミノ酸として分類
される。例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリンとの単発的置換、またはその逆；
アスパラギン酸とグルタミン酸との単発的置換またはその逆；トレオニンとセリンとの単
発的置換またはその逆；あるいは、アミノ酸と、構造的に関連するアミノ酸との類似の保
存的置換が、その活性に対する主要な効果を有さないことは、理論的に予想できる。従っ
て、参照分子と本質的に同じアミノ酸配列を有するが、そのタンパク質の免疫原性に実質
的に影響しない、主要でないアミノ酸置換を有するタンパク質は、ＧＮＡ３３ポリペプチ
ドの定義の範囲内である。当業者は、本明細書中で規定される生物学的活性を保持すると
いう理論的な見こみをもって改変され得る目的の分子の領域を容易に決定し得る。
【００３３】
「ＧＮＡ３３ペプチド」とは、全長に満たない問題の参照ＧＮＡ３３分子を含み、かつ
以下に規定される少なくとも１つのエピトープを含む、本明細書中に記載されるＧＮＡ３
３ポリペプチドである。従って、ＧＮＡ３３ペプチドを含む組成物は、全長分子の一部を
含むが、問題のＧＮＡ３３ペプチドの全ては含まない。ＧＮＡ３３ペプチドの非限定の例
としては、ＱＴＰ、ＦＱＴＰＶ（配列番号２）、ＦＱＴＲＶＨＳ（配列番号３）、ＡＦＱ
ＴＰＶＨＳ（配列番号４）、ＱＡＦＱＴＰＶＨＳ（配列番号５）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨＳ
（配列番号６）、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨ（配列番号７）、ＡＱＡＦＱＴＰＶ（配列番号８）
、ＱＡＦＱＴＰＶＨＳＦ（配列番号９）、ＡＦＱＴＰＶＨＳＦＱ（配列番号１０）、ＦＱ
ＴＰＶＨＳＦＱＡ（配列番号１１）、ＱＴＰＶＨＳＦＱＡＫ（配列番号１２）、ＤＶＳＡ
ＱＡＦＱＴＰ（配列番号１２）、ＶＳＡＱＡＦＱＴＰＶ（配列番号１３）およびＳＡＱＡ
ＦＱＴＰＶＨ（配列番号１４）が挙げられる。
【００３４】
ＭｅｎＢの「分子模倣物」とは、ＭｅｎＢ細菌上で発現される少なくとも１つのエピト
ープを機能的に模倣する分子である。そのような分子模倣物は、ワクチン組成物として、
および以下にさらに記載されるような、診断適用または治療適用のための抗体の誘発に有
用である。分子模倣物としては、以下：低分子有機化合物、核酸および核酸誘導体；多糖
またはオリゴ糖；ペプチド、タンパク質およびそれらの誘導体を含むペプチド模倣物（例
えば、非ペプチド有機部分を含有するペプチド、合成ペプチド（これらはアミノ酸結合お
よび／またはペプチド結合を保有していても、保有してなくてもよいが、ペプチドリガン
ドの構造的特徴および機能的特徴を保持している））；ピロリジン；ペプトイドおよびオ
リゴペプトイド（これらはＮ置換グリシン（例えば、Ｓｉｍｏｎら、（１９９２）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：９３６７により記載されるＮ置換グリシ
ン）を含む分子である）ならびに抗体（抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるが、
これらに限定されない。分子模倣物を同定および産生するための方法が、以下により詳細
に記載される。
【００３５】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体調製物およびモノクローナル抗体調製物、ならび
にハイブリッド抗体、変更された抗体、ヒト化抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（
ａｂ）分子、Ｆｖフラグメント、ファージ上に提示された単鎖フラグメント改変体（ｓｃ
Ｆｖ）、単一ドメイン抗体、キメラ抗体および本発明の抗体分子の免疫学的結合特性を示
すそれらの機能性フラグメントを含む調製物を包含する。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「モノクローナル抗体」とは、相同性抗体集団を有する
抗体組成物をいう。この用語は、それが作製される様式により限定されない。この用語は
、免疫グロブリン分子、ならびにＦａｂ分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグ
メント、ファージ上に提示された単鎖フラグメント改変体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体およ
び本発明のモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示す他の分子を包含する。ポリ
クローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は、当該分野において公知であ
り、そして以下により十分に記載される。
【００３７】
「エピトープ」とは、特異的なＢ細胞およびＴ細胞が応答する抗原上の部位を意味する
。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と互換的に使用され得る。タ
ンパク質、多糖、またはその他の生体ポリマー上のＢ細胞エピトープ部位は、折りたたみ
によって同時に送達される高分子の異なる部分由来の部分で構成され得る。この種のエピ
トープは、コンフォメーショナルエピトープまたは不連続なエピトープとして参照される
。なぜなら、この部位は、そのポリマーが直鎖状配列においては不連続だが、折りたたま
れたコンフォメーションにおいて連続的であるポリマーのセグメントからなるためである
。生体ポリマーまたは他の分子の単一セグメントからなるエピトープは、連続的エピトー
プまたは直鎖状エピトープと呼ばれる。Ｔ細胞エピトープは、一般的に、直鎖状のペプチ
ドに切断される。ペプチドエピトープは、このエピトープに特異的な空間的なコンフォメ
ーションの５以上のアミノ酸を含み得る。一般的に、エピトープは、少なくとも５〜８の
そのようなアミノ酸からなり、より一般には、少なくとも８〜１０以上のそのようなアミ
ノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該分野におい
て公知であり、例えば、Ｘ線結晶解析および二次元核磁気共鳴分光法を含む。
【００３８】
エピトープは、任意の多くの当該分野において周知のエピトープマッピング技術を用い
て同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．６６（Ｇｌｅ
ｎｎ Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ
ｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、直鎖状エピトープは、例えば、固体支持体上
に多数のペプチドを同時に合成し（これらのペプチドは、タンパク質分子の部分に対応す
る）そしてこれらのペプチドがなお、支持体に付着されている状態で、これらのペプチド
と抗体とを反応させることによって決定される。そのような技術は、当該分野において公
知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎ
ら、（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５（これらのすべて
は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載される。同様に、コンフォメ
ーショナルエピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴分光法により、ア
ミノ酸の空間的コンフォメーションを決定することによって容易に同定される。例えば、
Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（前出）を参照のこと。例えば、
Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７：１０５−１３２；ならびにＨ
ｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８１）
７８：３８２４−３８２８に記載されるように、２０のアミノ酸の各々の疎水特性および
親水特性を利用して、タンパク質のアミノ酸配列からヒドロパシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈ
ｙ）スケールを公式化するコンピュータープログラムもまた用いられて、所定の分子の抗
原性部分を決定し得る。例えば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄの技術は、各々のアミノ酸に複
数の親水性値を割り当て、次いでペプチド鎖に沿って、反復的にこれらの値を平均する。
局所的平均親水性の最も高い点は、その分子の抗原性部分を示す。
【００３９】
抗体は、その抗体分子が補体により媒介される細菌活性を示し、そして／または本明細
書中に記載されるアッセイを用いて決定されるようなＭｅｎＢに対するオプソニン活性を
示す場合に、ＭｅｎＢ生物に対する「機能的活性」を示す。
【００４０】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対していう場合、「精製された」または「単離
された」とは、同じ型の他の生体高分子の実質的非存在下で、指示された分子が存在する
ことを意味する。本明細書中で使用される場合、用語「精製された」とは、同じ型の生物
学的高分子が、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％
、なおより好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量
％が存在することを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離された」ポリヌク
レオチドとは、目的のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸
分子をいう；しかし、この分子は、その組成物の塩基特性に有害な影響を与えない幾分か
の追加の塩基または部分を含み得る。
【００４１】
「組換えＧＮＡ３３ポリペプチド」とは、上記の技術を用いて測定される生物学的活性
を有し、本明細書中に記載されるような組換えＤＮＡ技術により調製される、ＧＮＡ３３
ポリペプチドが意図される。一般的に、所望のＧＮＡ３３ポリペプチドをコードする遺伝
子は、以下でさらに記載されるように、クローニングされ、次いで形質転換された生物中
で発現される。宿主生物は、発現条件下で、外来遺伝子を発現してＧＮＡ３３ポリペプチ
ドを産生する。組換え的に調製される場合、本発明のポリペプチドは、通常細胞中に存在
する他の分子の非存在下で産生され得る。例えば、組換え非ＭｅｎＢ宿主細胞により産生
される唯一のＭｅｎＢタンパク質は、組換えＧＮＡ３３ポリペプチドであるので、Ｍｅｎ
Ｂタンパク質汚染のいかなる痕跡もないＧＮＡ３３ポリペプチド組成物は、容易に得るこ
とができる。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、任
意の長さのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、ヌクレオチ
ドの重合体形態をいう。この用語は、この分子の１次構造のみをいい、従って、二本鎖お
よび一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを含む。それはまた、公知の型の改変、例えば、当該分
野において公知の標識、メチル化、「キャップ」、天然に存在する１つ以上のヌクレオチ
ドとアナログとの置換、例えば、非荷電の連結（例えば、メチルホスフェート、ホスホト
リエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）および荷電された連結（例えば、ホス
ホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有する内部ヌクレオチド改変、例えば、タ
ンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリＬリジン等を含
む）のようなペンダント基を有する改変、インターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏ
ｒ）（例えば、アクリジン、ソラレン等）での改変、キレート（例えば、金属、放射性金
属、ホウ素、酸化金属等）を含む改変、アルキル化剤（ａｌｋｙｌａｔｏｒ）を含む改変
、改変された連結（例えば、αアノマー核酸等）での改変、ならびに改変されていない形
態のポリヌクレオチドもまた含む。
【００４３】
本明細書中で使用される用語「組換えＤＮＡ分子」または「組換えポリヌクレオチド」
は、ゲノム起源のポリヌクレオチド、ｃＤＮＡ起源のポリヌクレオチド、半合成起源ポリ
ヌクレオチド、または合成起源のポリヌクレオチドをいい、それらは、その起源または操
作によって、以下：（１）それが天然で会合するポリヌクレオチドの全てまたは一部と会
合していないか、（２）それが天然で連結するポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチド
に連結しているか、（３）天然に存在しないポリヌクレオチドである。従って、この用語
は、「合成により誘導された」核酸分子を包含する。
【００４４】
「コード配列」とは、適切な調節配列の制御下に配置される場合に、通常、ｍＲＮＡを
介して、ポリペプチドへと翻訳される核酸分子である。コード配列の境界は、５’末端の
翻訳開始コドンおよび３’末端の翻訳終結コドンにより決定され得る。コード配列として
は、ｃＤＮＡおよび組換えヌクレオチド配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００４５】
「制御配列」とは、それらが連結しているコード配列の発現をもたらすのに必要な核酸
配列をいう。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なる；原核生物におい
て、そのような制御配列は、一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写
終結配列を含む；真核生物において、そのような制御配列は、プロモーターおよび転写終
結配列を含む。用語「制御配列」とは、最小で、コード配列の発現に必要な全ての成分を
含み、そして追加の成分（例えば、リーダー配列および融合パートナー配列）も含み得る
ことが意図される。
【００４６】
制御エレメント（例えば、プロモーター）は、ＲＮＡポリメラーゼがこのプロモーター
に結合し、そしてコード配列をｍＲＮＡに転写するときに細胞内のコード配列の「転写を
指向し」、次いでこのｍＲＮＡは、そのコード配列によりコードされるポリヌクレオチド
へと翻訳される。
【００４７】
「作動可能に連結される」とは、そのように記載された成分が、それらの意図された様
式にて機能することを可能にする関係にある近位をいう。コード配列に「作動可能に連結
される」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合する条件下で達成されるよう
な方法にて連結される。制御エレメントは、そのコード配列の発現を方向づけるように機
能する限り、コード配列と連続している必要はない。従って、例えば、介在する、翻訳さ
れないが転写される配列は、プロモーターとコード配列との間に存在し得、そのプロモー
ターは、コード配列に「作動可能に連結される」と考えられ得る。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「発現カセット」とは、制御配列（これは、コード
配列のクローニングされたコピーの転写および適切な宿主細胞におけるｍＲＮＡの翻訳に
必要な全てのヌクレオチド配列を含む）に作動可能に連結される少なくとも１つのコード
配列を含む分子をいう。このような発現カセットは、細菌、藍藻類、植物細胞、酵母細胞
、昆虫細胞および動物細胞のような種々の宿主において真核生物遺伝子を発現させるため
に使用され得る。本発明において、発現カセットとしては、クローニングベクター、具体
的に指定されたプラスミド、ウイルスまたはウイルス粒子が挙げられ得るが、これらに限
定されない。このカセットは、宿主細胞中での自律複製のための複製起点、選択マーカー
、種々の制限部位、高コピー数のための能力および強いプロモーターをさらに含み得る。
【００４９】
「ベクター」とは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイ
ルスなどのような任意の遺伝エレメントを意味する。これらは、適切な制御エレメントと
関連づけられた場合に複製し得、細胞間で遺伝子配列を移動させ得る。従って、この用語
は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【００５０】
細胞は、ポリヌクレオチドが細胞膜内部に挿入された場合に外因性ポリヌクレオチドに
より「形質転換される」。この外因性ポリヌクレオチドは、細胞のゲノムを構成する染色
体ＤＮＡに組み込まれても（共有結合されても）よいし、されなくてもよい。原核生物細
胞および酵母において、例えば、外因性ＤＮＡは、エピソームエレメント（例えば、プラ
スミド）上で維持され得る。真核生物細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、外因
性ＤＮＡが染色体複製を通じて娘細胞により遺伝されるように染色体へと組み込まれた細
胞である。この安定性は、真核生物細胞が、この外因性ＤＮＡを含む細胞株または娘細胞
の集団から構成されるクローンを樹立する能力により示される。
【００５１】
「宿主細胞」は、形質転換された細胞または外因性核酸分子により形質転換され得る細
胞である。
【００５２】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチド部分間での同一
性％をいう。２つのＤＮＡ、または２つのポリペプチドの配列が、その分子の規定の長さ
にわたり、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約７５％、より好ましくは、少
なくとも約８０〜８５％、好ましくは、少なくとも約９０％、そしてもっとも好ましくは
、少なくとも約９５〜９８％の配列同一性を示すか、または特定の範囲の間で任意の同一
性％を示す場合、これら２つのＤＮＡ、または２つのポリペプチド配列は、互いに「実質
的に同じ」である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同な、はまた、特定のＤＮ
Ａ配列または特定のポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。
【００５３】
概して、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列
に、それぞれ、正確なヌクレオチド間の対応またはアミノ酸間の対応があることをいう。
同一性％は、２つの分子の配列を整列させ、この２つの整列された配列間の正確なマッチ
数を係数し、短い方の配列の長さで除し、結果に１００をかけることによるこれら分子間
の配列情報の直接比較により決定され得る。整列は、目的の配列と同一数のアミノ酸を有
する配列を用いて行われ得る。
【００５４】
好ましくは、天然に存在するタンパク質改変体または天然に存在しないタンパク質改変
体は、図３（配列番号１）に由来する特定のＧＮＡ３３ポリペプチドと、少なくとも７０
％、８０％、８５％、９０％、９２％または９５％以上同一のアミノ酸配列を有する。よ
り好ましくは、この分子は、９８％または９９％同一である。配列同一性％は、ギャップ
オープンペナルティー１２およびギャップ伸長ペナルティー２、ＢＬＯＳＵＭマトリクス
６２による、アフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索
アルゴリズムを使用して決定される。このＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アル
ゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４
８２−４８９（１９８１）において教示される。
【００５５】
あるいは、相同性は、相同領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でポリヌクレオチド
のハイブリダイゼーション、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、および消化した
フラグメントのサイズ決定により決定され得る。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、
特定の系について規定されるストリンジェントな条件下で、サザンハイブリダイゼーショ
ン実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当
該分野の技術範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ（前出）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（前出）を参照
のこと。
【００５６】
用語「有効量」または「薬学的に有効な量」とは、非毒性であるが、所望の生物学的結
果を提供するに十分な薬剤の量をいう。その結果は、本明細書中のアッセイを使用して決
定される、ＭｅｎＢに対する機能的活性を有する抗体の生成であり得る。さらに、その量
は、髄膜炎菌性疾患の症状、徴候または原因の軽減および／または改善を引き起こすに十
分であり得る。任意の個々の症例における適切な「有効」量は、慣用的な実験法を使用し
て、当業者により決定され得る。
【００５７】
「薬学的に受容可能な」または「薬理学的に受容可能な」とは、生物学的でない、さも
なければ所望でない材料を意味する。すなわち、その材料は、所望でない生物学的効果を
引き起こすことも、含まれる組成物の成分のいずれによっても有害な様式にて相互作用す
ることもなく、個体に投与され得る。
【００５８】
「生理学的ｐＨ」または「生理学的範囲のｐＨ」とは、約７．２〜８．０の範囲のｐＨ
、より代表的には、約７．２〜７．６の範囲のｐＨを意味する。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「哺乳動物」としては、哺乳動物網の任意のメンバ
ー：ヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー）、および他のサル（ａｐｅ）およびサ
ル（ｍｏｎｋｅｙ）種：家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ
、ヤギ、ブタ）；ペット（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）（例えば、ウサギ、イヌ、
およびネコ）；実験動物（ラット、マウスおよびモルモットなどのような齧歯類を含む）
が挙げられるが、これらに限定されない。この用語は、特定の年齢も性別も意味しない。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫学的に結合（する）」および「免疫学的な結
合特性」とは、免疫グロブリン分子と抗原（これに、その免疫グロブリンが特異的である
）との間に生じる、非共有結合的相互作用の型をいう。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された組織
または流体のサンプル（このサンプルとしては、例えば、血液、血漿、血清、糞便、尿、
骨髄、胆汁、髄液、リンパ液、皮膚サンプル、皮膚、呼吸管、腸管および尿生殖管の外分
泌物、涙、唾液、乳汁、血球、器官、生検が挙げられるが、これらに限定されない）そし
てまた、インビトロの細胞培養物の構成成分のサンプル（このサンプルとしては、培養培
地中の細胞および組織（例えば、組換え細胞）および細胞成分の増殖から得られた馴化培
地が挙げられるが、これらに限定されない）をいう。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、用語「標識」および「検出可能な標識」とは、検出し得
る分子をいい、これらとしては、放射活性同位体、蛍光剤（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、化
学発光剤（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素イン
ヒビター、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチンまたはハ
プテン）などが挙げられるが、これらに限定されない。用語「蛍光分子」とは、検出可能
な範囲にて蛍光を示し得る物質またはその部分をいう。本発明において使用され得る標識
の特定の例としては、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキ
サスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨ、およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。
【００６３】
（ＩＩ．本発明を実施する態様）
本発明は、ＧＮＡ３３（Ｅ．ｃｏｌｉ ムレイントランスグリコシラーゼと相同性を有
するリポタンパク質）が、血清型Ｐ１．２の株においてＰｏｒＡのループ４上のエピトー
プを模倣する結果として、防御抗体を惹起するという発見に基づく。ＧＮＡ３３は、生細
菌では表面に露出していないが、細胞質周辺腔に位置する。重複ペプチドを使用した殺菌
性抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂのエピトープマッピングにより、このｍＡｂがＧＮＡ３３由来の
ペプチドおよびＰｏｒＡ（結合に必要なＱＴＰ配列を共有する）由来のペプチドを認識す
ることが示される。フローサイトメトリーにより、抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂは、コントロー
ル抗ＰｏｒＡ（Ｐ１．２）ｍＡｂと同様に、Ｐ１．２血清型の大部分のＭｅｎＢ株の細菌
表面に結合する。抗ＧＮＡ３３抗体は、Ｐ１．２株でチャレンジした新生仔ラットにおい
て受動性防御を付与する。従って、ＧＮＡ３３は、ＰｏｒＡに対する防御抗体を惹起する
新規な模倣物である。ＰｏｒＡとは異なり、ＧＮＡ３３は、投与された場合、タンパク質
を再生する必要性なくして防御抗体を惹起する。本明細書中において本発明者らは、ＧＮ
Ａ３３が今日までに同定されたもっとも強力な模倣抗原のうちの１つであることを発見し
た。
【００６４】
ＧＮＡ３３が、ＰｏｒＡ Ｐ１．２エピトープの免疫学的模倣を示すという発見は、Ｐ
１．２株（これは、米国における血清型Ｂ単離株の約８％を示す（Ｔｏｎｄｅｌｌａら、
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）３８：３３２３−３３２８））により
引き起こされる疾患の予防のためのワクチンにおける使用についてのＧＮＡ３３の有用性
を立証する。さらに、他のＰｏｒＡループをＧＮＡ３３またはＧＮＡ３３のサブドメイン
に弛緩することにより、髄膜炎菌の多価ワクチンにおける抗原として有用な他の血清亜型
ＰｏｒＡエピトープの免疫学的模倣物を生成することが可能である。このようなワクチン
は、組換えＰｏｒＡに基づくワクチンを超える多くの利点を有する。例えば、このような
ワクチンの調製は、界面活性剤による抽出も、再折りたたみも、脂質ビヒクル中での再構
成もする必要なく、従来のように非感染性Ｅ．ｃｏｌｉにおいて大量に発現され得るｒＧ
ＮＡ３３として非常に簡単にされる。また、疾患を引き起こす新たに出現したＮｍＢ株由
来のＰｏｒＡ改変体のエピトープ含有セグメントは、必要に応じて、ＧＮＡ３３に置換さ
れ得る。
【００６５】
従って、ＧＮＡ３３ポリペプチド、ＧＮＡ３３ペプチド、ＧＮＡ３３抗体および他のＭ
ｅｎＢ模倣物は、診断試薬として、および／またはＭｅｎＢ疾患を予防するための組成物
中で使用され得る。ＧＮＡ３３に対して調製される抗体は、ＭｅｎＢ細菌に対する機能的
活性を示し、ここで、機能的活性は、ＭｅｎＢ疾患に対する防御を付与する際に重要であ
る。この抗体は、アイソタイプに関して、抗原的特異性および機能的活性が十分に特徴づ
けられ得る。
【００６６】
本発明での使用のためのＧＮＡ３３ポリペプチドは、当該分野で公知の技術を使用して
、このポリペプチドを生成する細菌から直接単離され得る。あるいは、このポリペプチド
は、ペプチド分野の当業者に公知のいくつかの技術のいずれかにより、化学合成され得る
。例えば、固相ペプチド合成技術については、Ｊ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．Ｄ．Ｙ
ｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃ
ｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，１９８４）ならびにＧ．Ｂａ
ｒａｎｙおよびＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈ
ｏｆｅｒ編，第２巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０），
ｐｐ．３−２５４、ならびに従来の溶液合成については、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅ
ｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ １９８４）ならびにＥ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏ
ｆｅｒ編，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，第１巻を参照のこと。本発明のポリペプチドはまた、同時に複数のペプチドを
合成する方法により化学的に調製され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：５１３１−５１３５；米国特許第４
，６３１，２１１号を参照のこと。
【００６７】
好ましくは、ポリペプチドは、分子生物学の標準的な技術を使用して、このポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドの発現により組換え生成される。例えば、上記の分子を
コードするポリヌクレオチド配列は、例えば、その遺伝子を発現する細菌に由来する、ｃ
ＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーをスクリーニングするか、またはこの遺伝
子を含むことが公知のベクターからこの遺伝子を得ることにより、組換え方法を使用して
得られ得る。さらに所望の遺伝子は、この遺伝子を含む細胞から、標準的な技術（例えば
、フェノール抽出およびｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲ）を使用して、直接単離さ
れ得る。例えば、ＤＮＡを獲得および単離するために使用される技術の記載については、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと。目的の遺伝子はまた、クローニングされるよ
りむしろ、合成により生成され得る。この分子は、特定の配列についての適切なコドンを
使用して設計され得る。次いで、完全な配列は、標準的な方法により調製される重複オリ
ゴヌクレオチドから組み立てられ、完全なコード配列へと組み立てられる。例えば、Ｅｄ
ｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２２３：１２９９；およびＪａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
５９：６３１１を参照のこと。
【００６８】
従って、特定のヌクレオチド配列は、所望の配列を有するベクターから得られ得るか、
または当該分野で公知の種々のオリゴヌクレオチド合成技術（例えば、適切な場合、ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術）を使用して完全にまたは一部合成され得る。例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと。特に、所望の配列をコードするヌクレオチド
配列を得る１つの方法は、従来の自動化ポリヌクレオチド合成機にて生成された重複合成
オリゴヌクレオチドの相補的なセットをアニーリングさせ、続いて、適切なＤＮＡリガー
ゼと連結し、連結したヌクレオチド配列を、ＰＣＲを介して増幅させることによる。例え
ば、Ｊａｙａｒａｍａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８８：４０８４−４０８８を参照のこと。さらに、オリゴヌクレオチド特異的合成（Ｊ
ｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ５４：７５−８２）、すでに存在するヌクレオチ
ド領域のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔ
ｕｒｅ ３３２：３２３−３２７およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２３９：１５３４−１５３６）、およびギャップ形成されたオリゴヌクレオチド（ｇ
ａｐｐｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用した
酵素的充填（Ｑｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：１００２９−１００３３）は、改変された抗原結合能力または増強された抗原結
合能力を有する分子を提供するために、本発明にて使用され得る。
【００６９】
一旦、コード配列が調製または単離されると、このような配列は、任意の適切なベクタ
ーまたはレプリコンにクローン化され得る。多数のクローニングベクターが当業者に公知
であり、そして適切なクローニングベクターの選択が可能である。適切なベクターとして
は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体または適切なコントロー
ルエレメントと会合した場合に複製し得るウイルスが挙げられるが、これらに限定されな
い。
【００７０】
次いで、コード配列は、発現のために使用される系に依存して、適切なコントロールエ
レメントの制御下に置かれる。従って、このコード配列は、プロモータ、リボソーム結合
部位（細菌の発現のため）、および必要に応じて、オペレーターの制御下に置かれ得、そ
の結果、目的のＤＮＡ配列は、適切な形質転換体によってＲＮＡに転写される。このコー
ド配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列をコードする配列（これは後に、翻訳後
プロセシングにおいて、宿主によって除去され得る）を含んでも含まなくても良い。例え
ば、米国特許第４，４３１，７３９号；同第４，４２５，４３７号；同第４，３３８，３
９７号を参照のこと。シグナル配列が存在する場合、ネイティブな配列であり得るか、ま
たは非相同的なシグナル配列のいずれかであり得る。
【００７１】
制御配列に加えて、宿主細胞の増殖に関連した配列の発現の調節を可能にする調節配列
を加えることが所望であり得る。調節配列は、当業者に公知であり、そして例としては、
調節化合物の存在を含む、化学的刺激または物理的刺激に対してオンまたはオフにされる
遺伝子の発現を引き起こすものが挙げられる。他の型の調節エレメントはまた、ベクター
中に存在し得る。例えば、エンハンサーエレメントは、構築物の発現レベルを増加するた
めに本明細書中で使用され得る。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊ
ｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１）、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復
（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６７７７）およびヒトＣＭＶに由来す
るエレメント（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１）（例えば、ＣＭ
ＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント（米国特許第５，６８８，６８８））が挙げら
れる。発現カセットはさらに、適切な宿主細胞において自律的に複製するための複製起点
、１つ以上の選択マーカー、１つ以上の制限部位、高いコピー数についての可能性および
強力なプロモーターを含む。
【００７２】
発現ベクターは、特定のコード配列が適切な制御配列と共にベクター中に位置するよう
に構築され、制御配列に対するコード配列の位置および配向は、コード配列が制御配列の
「制御」下で転写されるように存在する（すなわち、制御配列のＤＮＡ分子に結合するＲ
ＮＡポリメラーゼは、コード配列を転写する）。目的の分子をコードする配列の改変は、
この目的を達成するために所望であり得る。例えば、いくつかの場合において、適切な配
向で配列が制御配列に付着し得るように配列を改変することすなわち、リーディングフレ
ームを維持することが必要であり得る。制御配列および他の調節配列は、ベクターへの挿
入の前にコード配列に連結され得る。あるいは、コード配列は、制御配列および適切な制
限部位をすでに含む発現ベクターに直接クローニングされ得る。
【００７３】
上に説明されるように、参照ＧＮＡ３３ポリペプチドの変異体またはアナログを生成す
ることが所望であり得る。変異体またはアナログは、ＧＮＡ３３ポリペプチドをコードす
る配列の一部の欠損によって、配列の挿入によって、および／または配列内での１つ以上
のヌクレオチドの置換によって、調製され得る。ヌクレオチド配列を改変するための技術
（例えば、部位特異的変異誘発など）は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、前出；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：４４８；Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒら（１９８７）Ｂｉｏ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５：７８６；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ（１９８３）Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８；Ｄａｌｂａｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら
（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７９：６４０９を参照の
こと。
【００７４】
分子は、昆虫発現系、哺乳動物発現系、細菌発現系、ウイルス発現系および酵母発現系
を含む広範な種々の系において発現され得、これらは全て当該分野で公知である。例えば
、昆虫細胞発現系（例えば、バキュロウイルス系）は、当業者に公知であり、そして例え
ば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）にお
いて記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、特
に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ（「ＭａｘＢａｃ」キット）から
キットの形態で市販されている。同様に、細菌および哺乳動物細胞発現系は、当該分野で
周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、において記載されている。酵母
発現系はまた、当該分野で公知であり、そして例えば、Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒら編、１９８９）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄ
ｏｎにおいて記載されている。
【００７５】
上の系を用いる使用のための多数の適切な宿主細胞がまた公知である。例えば、哺乳動
物細胞株は、当該分野で公知であり、そして例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞、ＨｅＬａ細胞、乳児ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒ
ト胚腎細胞、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ
腎（「ＭＤＢＫ」）細胞、およびその他を含むがこれらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死
化細胞株を含む。同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、および
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．のような細菌宿主は、本発明の発現構築物を用い
る用途を見出す。本発明において有用な酵母宿主としては特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍ
ａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｇ
ｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げ
られる。バキュロウイルス発現ベクターを用いる使用のための昆虫細胞としては特に、Ａ
ｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂ
ｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅ
ｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉが挙げられる。
【００７６】
目的のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、当該分野で周知の種々の遺伝子送達技術を
使用して、宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれ得るか、または適切な宿主細胞中の安定な
エピソームエレメント上に維持され得る。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参
照のこと。
【００７７】
選択される発現系および宿主に依存して、分子は、タンパク質が発現される条件下で、
上記の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を増殖することによって生成される
。次いで、発現されたタンパク質は、宿主細胞から単離され、そして精製される。発現系
が、タンパク質を増殖培地中に分泌する場合、生成物は、この培地から直接精製され得る
。生成物が分泌されない場合、この生成物は細胞溶解物から単離され得る。適切な増殖条
件および回収方法の選択は、当該分野内である。
【００７８】
一旦生成されると、ＧＮＡ３３ポリペプチドを使用して抗体を生成し得る。従って、ポ
リペプチドは、哺乳動物の被験体（げっ歯類およびウサギのような標準実験動物を含む）
を免疫するための組成物中に提供される。この組成物は、ポリクローナル血清の生成を誘
発するための適切なアジュバントを含む。動物のグループは、この組成物を用いて、一般
的に免疫され、そして数回追加免疫される。免疫された動物由来の抗血清が、得られ得る
。殺菌性抗血清の形成を誘発し得るＧＮＡ３３ポリペプチドは、モノクローナル抗体の生
成においての使用のために適切である。これらの抗体を、順に使用して、抗ＭｅｎＢワク
チンに対するエピトープを提供するＭｅｎＢ抗原のさらなる模倣物を検索し得る。
【００７９】
従って、本発明の実行において、選択されたＧＮＡ３３ポリペプチドを使用して、モノ
クローナル抗体およびその機能的等価物を提供する。特定のモノクローナル抗体に対して
の用語「機能的等価物」は、本明細書中で使用される場合、以下に記載される標準アッセ
イによって決定されるように、以下のような分子を意味する：（ａ）例証されたモノクロ
ーナル抗体を相互にブロックする；（ｂ）問題のＧＮＡ３３ポリペプチドに選択的に結合
する；（ｃ）そして、必要に応じてに、ＭｅｎＢ細菌細胞に対して機能的活性（例えば、
補体媒介殺菌および／またはオプソニン活性）を示す。さらに、本発明の特定のモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマに関して本明細書中で使用される場合、用語「子孫」は、
世代または核型同一性に関係なく、親によって産生されるモノクローナル抗体を産生する
親ハイブリドーマ全ての誘導体、子孫（ｉｓｓｕｅおよびｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）を含む。
【００８０】
モノクローナル抗体は、当該分野で周知の標準技術（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉ
ｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５の方法、またはその改変、Ｂｕ
ｃｋら（１９８２）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ １８：３７７によって記載される）を用いて調製
される。代表的に、マウスまたはラットは、タンパク質キャリアに結合されたＧＮＡ３３
ポリペプチドを用いて免疫され、追加免疫され、そして脾臓（および必要であれば、いく
つかの大きさのリンパ節）は、除去されそして単一細胞へと分離される。所望である場合
、脾臓細胞は、（非特異性接着細胞の除去後）抗原でコーティングされたプレートまたは
ウェルに細胞懸濁液を適用することによって、スクリーニングされ得る。抗原に対して特
異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、プレートに結合し、そして残りの懸濁
液で洗い流されない。得られたＢ細胞または全ての分離された脾臓細胞は、次いで、骨髄
腫細胞と融合するように誘導され、ハイブリドーマを形成する。ハイブリダイゼーション
での使用のための代表的なマウス骨髄腫株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能なものを含む。
【００８１】
より特定には、体細胞ハイブリッドは、アザグアニン耐性の非分泌マウス骨髄腫細胞株
Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣから入手可能）を用いてＢｕｃｋら（前出）の方
法によって調製され得る。ハイブリドーマ細胞株は、一般に、限界希釈によってクローン
化され、そして免疫化抗原に特異的に結合し、そして無関係な抗原に結合しない抗体の産
生についてアッセイされる。次いで、選択されたモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマ
は、インビトロ（例えば、組織培養ボトルまたは中空繊維リアクター内で）か、またはイ
ンビボ（例えば、マウス中の腹水として）のいずれかで培養される。
【００８２】
ハイブリドーマの上清は、例えば、免疫ＧＮＡ３３ポリペプチドを用いた固相ＥＬＩＳ
Ａか、または標的抗原としてＭｅｎＢ細菌を用いる間接的な免疫蛍光アッセイのいずれか
を使用して抗ＭｅｎＢ反応性抗体についてアッセイされ得る。ハイブリドーマによって分
泌されるモノクローナル抗体の選択性は、競合特異的結合アッセイ（例えば、阻害ＥＬＩ
ＳＡなど）を用いてアッセイされ得る。例えば、緩衝液か、または可溶性ＧＮＡ３３ポリ
ペプチドを含む緩衝液のいずれかに希釈される抗体分子を、結合ＧＮＡ３３ポリペプチド
の存在下、ＥＬＩＳＡ容器中で反応させる。洗浄の後、結合抗体は、二次抗体としての標
識化抗Ｉｇ（抗ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ）によって決定される。可溶性ＧＮＡ３３ポ
リペプチドによって阻害される抗体は、特異的とみなされ得、従って、アイソタイピング
およびＭｅｎＢ結合および機能的活性についてのさらなるスクリーニングを含むさらなる
研究のために選択される。
【００８３】
特に、部分的に精製されたモノクローナル抗体分子は、本明細書中の実施例に記載され
るような標準アッセイを用いて、ＭｅｎＢの表面に結合するそれらの能力について個々に
評価され得る。機能的活性は、補体媒介殺菌活性および／またはオプソニン活性を評価す
ることによって決定され得る。特に、抗体の補体媒介殺菌活性は、Ｇｏｌｄら（１９７０
）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１：４７９，Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋら（１９８８）Ｉｎｆｅ
ｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５６：１１２０，Ｍａｎｄｒｅｌｌら（１９９５）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ
．Ｄｉｓ．１７２：１２７９，およびＧｒａｎｏｆｆら（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇ
ｎ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：５７４によって記載されような標準ア
ッセイを用いて評価され得る。これらのアッセイにおいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉ
ｓは、補体供給源ならびに試験されるべき抗体と反応される。細菌の計数は、種々のサン
プリング時間でなされる。抗体および相補体と共に６０分間インキュベートした後決定さ
れた、時間０でのコロニー数と比較される場合、生存可能な細菌細胞数において最少５０
％の減少によって示されるような補体媒介殺菌活性を示す抗体は、本発明の目的に対する
殺菌活性を示すと考えられ、そしてさらなる使用のために適切である。
【００８４】
補体媒介溶菌は、侵襲性髄膜炎菌性疾患に対する宿主保護を担う主要な機構であると考
えられる。しかし、証拠はまた、オプソニン作用に対する重要な保護的役割を支持する（
例えば、Ｂｊｅｒｋｎｅｓら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：１６０を参
照のこと）。従って、本明細書中で産生される抗体のオプソニン活性は、機能的活性を評
価するために、二次手段かまたは代替の手段として評価され得る。オプソニンアッセイか
らの結果を使用して、殺菌データを追加し、そして保護を与え得る抗体の選択を助ける。
オプソニン活性の評価はまた、ＩｇＧ１アイソタイプを有する本発明のマウスモノクロー
ナル抗体の評価のために本明細書中で特に有用である。マウスＩｇＧ１（ヒトＩｇＧ１と
は著しく異なる）は、補体の活性化において効果がない。従って、マウスＩｇＧ１抗体は
、上記のアッセイにおいてＭｅｎＢの補体媒介溶菌を活性化しない。しかし、ＩｇＧ１抗
ＧＮＡ３３モノクローナル抗体の機能的活性は、補体の非存在下でオプソニン作用によっ
て評価され得る。
【００８５】
種々のオプソニンアッセイ方法は、当該分野で公知であり、そして本発明のモノクロー
ナル抗体の機能的活性を評価するために使用され得る。このような標準アッセイとしては
、Ｓｊｕｒｓｅｎら（１９８７）Ａｃｔａ Ｐａｔｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｓｃａｎｄ．，Ｓｅｃ．Ｃ ９５：２８３，Ｈａｌｓｔｅｎｓｅｎら（１９８９）
Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２１：２６７，Ｌｅｈｍａｎｎら（１９９１）
ＡＰＭＩＳ ９９：７６９，Ｈａｌｓｔｅｎｓｅｎら（１９９１）ＮＩＰＨ Ａｎｎａｌ
ｓ １４：１５７，Ｆｒｅｄｌｕｎｄら（１９９２）ＡＰＭＩＳ １００：４４９，Ｇｕ
ｔｔｏｒｍｓｅｎら（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：２７７７，Ｇｕｔｔ
ｏｒｍｓｅｎら（１９９３）Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１６７：１３１４，Ｂｊｅｒｋｎ
ｅｓら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：１６０，Ｈａｙｒｉｎｅｎら（１
９９５）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７１：１４８１，ｄｅ Ｖｅｌａｓｃｏら（１９
９５）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２：２６２、およびＶｅｒｈｅｕｌ，Ａ．Ｆ．Ｍ
．（１９９１）「Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ＬＰＳ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｏｌｉｇｏｓ
ａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｉｍｍ
ｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ」、Ｔ
ｈｅｓｉｓ，Ｕｔｒｅｃｈｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
，ｐｐ．１１２−１３５によって記載されるものが挙げられる。
【００８６】
目的の選択されたモノクローナル抗体は、慣用的な組織培養方法を用いてインビトロで
、または哺乳動物の被験体を用いてインビボで、拡大され得る。例えば、プリスタンプラ
イム化マウスは、腹水産生のために、ＰＢＳ中のｌｏｇ期のハイブリドーマ細胞を播種さ
れ得る。腹水は、さらなる精製の前に−７０℃で保存され得る。
【００８７】
特に、例えば、ＭｅｎＢに対する受動的保護を提供ための予防的または治療的薬学的調
製物中ならびにＭｅｎＢ診断用調製物において、抗体が使用される場合、キメラ抗体を提
供することが所望され得る。ヒトおよび非ヒトアミノ酸配列から構成されるキメラ抗体は
、マウスモノクローナル抗体分子から形成され得、ヒトにおけるそれらの免疫原性を減少
する（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら
（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４２２０；Ｓｈａｗ
ら（１９８７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４；およびＢｒｏｗｎら（１９８７
）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：３５７７；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕ
ｒｅ ３３２：３２３；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１
５３４；およびＪｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２；１９９２年１
２月２３日に公開された欧州公開番号第５１９，５９６号；および１９９４年９月２１日
に公開された英国特許公開番号第ＧＢ ２，２７６，１６９号）。
【００８８】
親のモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を提示し得る、抗体分子フラグメント
（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｓＦｖの分子）は、公知の技術を使用して産生さ
れ得る（Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９
：２６５９；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ １５：２７０６；Ｅｈｒｌ
ｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１６）：５８７９；ならびにＨｕｓ
ｔｏｎらに対する米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号；お
よびＬａｄｎｅｒらに対する同第４，９４６，７７８号）。
【００８９】
代替的に、ファージディスプレイ系を使用して、インビトロでモノクローナル抗体分子
集団を拡大し得る。Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３；Ｓｃｈａ
ｒｆら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：１０７６；米国特許第４，６８３，１９５
および同第４，６８３，２０２号；Ｙａｎｇら（１９９５）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５
４：３９２；Ｂａｒｂａｓ，ＩＩＩら（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｃｏｍｐ．Ｍｅｔｈ
Ｅｎｚｙｍｏｌ ８：９４；Ｂａｒｂａｓ，ＩＩＩら（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：７９７８。
【００９０】
一旦作製されると、ファージディスプレイライブラリーを使用して、公知の技術を使用
して、Ｆａｂ分子の免疫学的結合アフィニティーを改善し得る。例えば、Ｆｉｇｉｎｉら
（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３９：６８を参照のこと。
【００９１】
ファージディスプレイライブラリーより選択されるＦａｂ分子の重鎖部分および軽鎖部
分のコード配列を、単離または合成し得、そして発現のために任意の適切なベクターまた
はレプリコンの中にクローニングし得る。例えば、細菌、酵母、昆虫、両生類および哺乳
動物の系を含む、任意の適切な発現系を使用し得る。細菌における発現系としては、以下
に記載される系が挙げられる：Ｃｈａｎｇら（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５
、Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４、Ｇｏｅｄｄｅｌら（１
９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７、欧州特許出願第ＥＰ３６
，７７６号、米国特許第４，５５１，４３３号、ｄｅＢｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１〜２５、およびＳｉｅｂｅｎｌｉｓｔ
ら（１９８０）Ｃｅｌｌ ２０：２６９。
【００９２】
酵母における発現系としては、以下に記載される系が挙げられる：Ｈｉｎｎｅｎら（１
９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９、Ｉｔｏら（
１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３、Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ
．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２、Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１、Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．１３２：３４５９、Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．２０２：３０２、Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１
６５、Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：
７３７、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：
１３５、Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１
、Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６、米国特許第４
，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号、Ｂｅａｃｈら（１９８１）Ｎａｔ
ｕｒｅ ３００：７０６、Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：
３８０、Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９、Ｂａ
ｌｌａｎｃｅら（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．
１１２：２８４〜２８９、Ｔｉｌｂｕｒｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ ２６：２０５−２２
１、Ｙｅｌｔｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１
：ｌ４７０〜１４７４、Ｋｅｌｌｙら（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：４７５４７９；欧
州特許出願第ＥＰ２４４，２３４号、ならびに国際公開第ＷＯ９１／００３５７号。
【００９３】
昆虫において異種性遺伝子の発現は、以下に記載されるように達成され得る：米国特許
第４，７４５，０５１号、欧州特許出願第ＥＰ１２７，８３９および同ＥＰ１５５，４７
６号、Ｖｌａｋら（１９８８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５〜７７６、Ｍｉｌ
ｌｅｒら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１７７、Ｃａｒｂｏ
ｎｅｌｌら（１９８８）Ｇｅｎｅ ７３：４０９、Ｍａｅｄａら（１９８５）Ｎａｔｕｒ
ｅ ３１５：５９２〜５９４、Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら（１９８８）Ｍｏｌ
．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９、Ｓｍｉｔｈら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：８４０４、Ｍｉｙａｊｉｍａら（１９８７）Ｇｅｎｅ
５８：２７３、ならびにＭａｒｔｉｎら（１９８８）ＤＮＡ ７：９９。多くのバキュ
ロウイルスの株および改変体、ならびに宿主由来の対応の許容な昆虫宿主細胞は、以下に
記載される：Ｌｕｃｋｏｗら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７〜５
５，Ｍｉｌｌｅｒら（１９８６）ＧＥＮＥＲＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ、Ｓｅｔｌｏ
ｗ，Ｊ．Ｋ．ら編、Ｖｏｌ．８，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２７７〜２７９
頁、およびＭａｅｄａら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５９２〜５９４。
【００９４】
哺乳動物の発現は、以下に記載されるように達成され得る：Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８
５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１、Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６７７７、Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１
：５２１、および米国特許第４，３９９，２１６号。哺乳動物の発現の他の特徴は、以下
に記載されるように容易にされ得る：Ｈａｍら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４
４、Ｂａｒｎｅｓら（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５、米国特許
第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第
４，５６０，６５５号および再登録された米国特許第ＲＥ３０，９８５、ならびに国際公
開第ＷＯ９０／１０３４３０号、同ＷＯ８７／００１９５号。
【００９５】
任意の上記抗体分子を本発明中で使用して、抗ＭｅｎＢ治療剤または抗ＭｅｎＢ予防薬
剤を提供し得る。さらに、例示のマウスモノクローナル抗体由来の抗原結合部位を含む、
「ヒト化」抗体分子を、上記に記載される技術を使用して産生し得る。
【００９６】
上記に記載の本発明のＭｅｎＢ抗体は、米国特許第６，０３０，６１９号、および同第
６，０４８，５２７号（本明細書中で参考としてそれらの全体が援用される）に記載され
るような方法を使用して、レセプターとして便利に使用して、多様な分子ライブラリーを
スクリーニングして、ＭｅｎＢ由来のエピトープの分子模倣物を同定し得る。分子ライブ
ラリーにおいて模倣物を同定する方法は、一般的に、以下の手順のうちの１つ以上の使用
を含む：（１）固定化した標的レセプターを用いたアフィニティー精製；（２）連結され
たリガンドとの可溶性レセプターの結合；および（３）可溶性化合物を直接的に抗原競合
アッセイにおいて、または生物学的活性について試験する行程。分子模倣物についてスク
リーニングされる分子としては、低分子有機化合物、有機化合物のコンビナトリアルライ
ブラリー、核酸、核酸誘導体、サッカライドもしくはオリゴサッカライド、ペプトイド、
可溶性ペプチド、固相上に連結されたペプチド、細菌ファージ表面タンパク質上に提示さ
れるペプチド、細菌表面のタンパク質もしくは抗体、および／または非ペプチド有機部分
を含むペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
例えば、コンビナトリアル有機合成を使用して、多様な分子種のライブラリーを作製し
得る。例えば、Ｇｏｒｄｏｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３３５を参
照のこと。例示としては、ピロリジン；オリゴカルバメート（Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３）；Ｎ置換されたグリシンポリマーのようなペプトイド（
Ｓｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３
６７）；およびビニル基化（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら（１
９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８）が挙げられるが、これらに限
定されない。
【００９８】
当該分野で公知の種々のアプローチを使用して、合成中に付加を受ける基礎単位を探索
して、その結果個々のライブラリーのメンバーの変遷（ｈｉｓｔｏｒｙ）を決定し得る。
これらのアプローチとしては、以下が挙げられる：フォトリトグラフのチップ上のアドレ
ス可能な位置（オリゴカルバメート）、部分的に合成された（ペプトイド、ピロリジン、
ペプチド）ライブラリーおよびヌクレオチドの分離合成によるコードのコンビナトリアル
ライブラリー（Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：９
８１２）または他の有機部分の分離合成によるコードのコンビナトリアルライブラリー（
Ｏｈｌｍｅｙｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０
：１０９２２）（「タグ（ｔａｇ）」）へのモノマーの再帰的な付加により「ヒット」を
同定する脱回旋（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）ストラテジー。次いで、模倣物を選択し
た後、各々のライブラリーのメンバーと結合するコードされるタグを、解読し得る。例え
ば、核酸タグを、ＤＮＡ配列決定法によって解読し得る。
【００９９】
ペプトイドコンビナトリアルライブラリーは、ＭｅｎＢエピトープの分子模倣物を同定
するために特に有用である。ペプトイドは、Ｎ置換されたグリシンのオリゴマーであり（
Ｓｉｍｏｎら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９
３６７）、そしてこれらを使用して、新規分子の多様なライブラリーを化学的に作製し得
る。モノマーは、ｔ−ブチルベースの側鎖保護および９−フルオレニル−メトキシ−カル
ボニルのα−アミン（ａ−ａｍｉｎｅ）保護を含み得る。例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ
ら（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０６４６らの「副モノマー方法
（ｓｕｂｍｏｎｏｍｅｒ ｍｅｔｈｏｄ）」を使用して、固相上でモノマーのペプトイド
オリゴマーへの組み立てを実施し得る。この方法において、Ｒｉｎｋアミドポリスチレン
樹脂（Ｒｉｎｋら（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８：３７８７）と
の化学合成を行い得る。ブロモ酢酸のジイソプロピロカルボジイミドとのインサイチュ活
性化によって、樹脂に結合したアミンをブロモアセチル化する。その後、この樹脂に結合
したブロモアセトアミドをアミンの付加によって置換する。このアミンは、さらなる反応
基のｔ−ブチルベースの保護を含み得る。この２工程のサイクルを、所望の数のモノマー
が付加するまで繰り返す。次いで、このオリゴペプチドを９５％トリフルオロ酢酸／５％
水での処置によって樹脂から切り離す。この合成を、好ましくはロボットの合成機を使用
して実施する。例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９２）Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｒｅｓ．４０：４９８；およびＺｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６７：４３７を参照のこと。代替的には、ベンゾトリア
ゾール−１−イルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはブロモトリス（ピロリジノ）ホスホニ
ウムヘキサフルオロホスフェートのどちらかによるインサイチュ活性化によって、ペプト
イドモノマーのオリゴマー化を実施し得る。この代替の方法において、その他は、ａ−（
９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ酸を使用して従来のペプチド合成と同じで
ある（例えば、Ｓｉｍｏｎら、（１９９２）、上述を参照のこと）。
【０１００】
一旦ペプチドライブラリーを作製すると、これらのライブラリーを、例えば、ＭｅｎＢ
ポリペプトイドまたはＭｅｎＢ細菌でコーティングされたマイクロリッタープレートのウ
ェルに、コンビナトリアルペプトイドの様々なプールと一緒に本発明のモノクローナル抗
体を添加することによって、スクリーニングし得る。インキュベーションの期間および非
結合抗体の除去のための洗浄の後、結合した抗体の存在を、標準的なＥＬＩＳＡアッセイ
によって決定する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，５５３を
参照のこと。結合した抗体を含まないウェルは、抗体に結合するペプトイド模倣物の存在
を示す。プール中のペプトイド模倣物の特定の同定を、モノマー単位をライブラリーの部
分的に合成したメンバーに再帰的に添加することによって決定する。Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ
ｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８。低分子プール中の活性化合物
を同定する他の方法は、そのプールを逆相ＨＰＬＣまたはアフィニティー選択／質量分析
によって分画する工程を包含する（Ｎｅｄｖｅｄ Ｍ．Ｌ．ら（１９９６）Ａｎａｌ．Ｃ
ｈｅｍ．６８：４２２８）。
【０１０１】
一旦、推定の分子模倣物を同定すると、上記のように、機能的に活性な（例えば、殺菌
の、および／またはオプソニンの）抗体を導く能力について、それらを試験する。これら
の特性を有する分子模倣物は、さらなる使用（例えば、ワクチン組成物における使用）に
ついて適切である。
【０１０２】
本発明の機能的に活性な抗ＭｅｎＢ抗体を使用して同定した分子模倣物、およびＧＮＡ
３３抗体をまた使用して、診断アッセイにおける使用のための抗体試薬を作製し得る。例
えば、分子模倣物と反応性のさらなる抗体、および本明細書中に記載されるＧＮＡ３３抗
体を使用して、競合アッセイ、直接反応アッセイまたはサンドイッチ型アッセイのような
免疫診断技術を使用して、生物学的サンプル中の細菌の抗原を検出し得る。このようなア
ッセイとしては、ウエスタンブロット；凝集試験；酵素標識免疫アッセイおよび酵素媒介
免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）；ビオチン／アビジン型アッセイ；放射性免疫アッ
セイ；免疫電気泳動；免疫沈殿などが挙げられる。これらの反応は、一般的に、蛍光、化
学発光、放射性、酵素性の標識分子もしくは色素分子のような標識を検出する工程、また
は模倣物とそれに反応した抗体との間の複合体形成を検出する他の方法を包含する。
【０１０３】
前述のアッセイは、一般的に、抗原−抗体複合体が結合される固体支持体からの、液相
中の非結合抗体の分離を包含する。本発明の実施において使用され得る固体支持体は、ニ
トロセルロース（例えば、膜またはマイクロタイターウェルの形態で）；ポリビニルクロ
ライド（例えば、シートまたはマイクロタイターウェルの形態で）；ポリスチレンラテッ
クス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレートの形態で）；ポリビニリジンフル
オリド；ジアゾ化ペーパー；ナイロン膜；活性化ビーズ；磁気反応ビーズなどのような、
基材を含む。
【０１０４】
代表的に、固体支持体を、最初に、適切な結合条件下で固相の成分（例えば、一つ以上
のＭｅｎＢ抗原またはＭｅｎＢ分子模倣物）と反応させて、その結果、その成分は支持体
に十分に固定化される。時々、支持体への固定化を、最初により良い結合特性を有するタ
ンパク質にカップリングすることによって増強し得る。適切なカップリングタンパク質と
して、血清アルブミン（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、鍵穴吸着（ｋｅｙｈｏｌｅ
ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オブアルブミン、
および当業者に周知の他のタンパク質のような高分子が挙げられるが、これに限定されな
い。その抗原または模倣物を支持体に固定化するために使用され得る他の分子としては、
ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリ
マーなどが挙げられる。これらの分子およびこれらの分子を抗原とカップリングさせるこ
れらの方法は、当業者に周知である。例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（１９９２）３：２−１３；ＨａｓｈｉｄａらＪ．Ａｐｐｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）６：５６−６３；ならびにＡｎｊａｎｅｙｕｌｕおよびＳ
ｔａｒｏｓ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊ．ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｒｅｓ．（１９８７）３０：１１７−１２４を参照のこと。
【０１０５】
固体支持体の固相の成分との反応の後、任意の非固定化固相成分を洗浄によってこの支
持体から除去し、次いで支持体に結合した成分を、適切な結合条件下でリガンド部分（例
えば、ＭｅｎＢ抗体）を含むと推定される生物学的サンプルと接触させる。洗浄して任意
の非結合のリガンドを除去した後、二次的な結合体部分を、適切な結合条件下で添加する
。ここで、二次的結合体は、結合したリガンドと選択的に結合し得る。次いで、二次的結
合体の存在を、当該分野で周知の技術を使用して検出し得る。
【０１０６】
さらに特定すると、ＥＬＩＳＡ方法を使用し得、ここで、マイクロタイタープレートの
ウェルを、本発明に従うＭｅｎＢエピトープまたはＭｅｎＢ模倣物でコーティングする。
次いで、抗ＭｅｎＢ免疫グロブリン分子を含む、またはこれを含むと推定される生物学的
サンプルを、コーティングされたウェルに添加する。抗体が固定化された分子に結合し得
るのに十分な期間のインキュベーションの後、そのプレートを洗浄して、非結合部分を除
去し、そして検出可能に標識された二次的な結合分子を添加する。この二次的結合分子は
、任意の捕捉されたサンプル抗体と反応し得、そのプレートを洗浄し、そして二次的結合
分子の存在を、当該分野で周知の方法を使用して検出する。
【０１０７】
従って、１つの特定の実施形態において、生物学的サンプルからのＭｅｎＢ結合リガン
ドの存在を、抗体リガンドに対して特異的な抗体を含む二次的結合体を使用して、容易に
検出し得る。当業者に公知の方法を使用して、検出可能な酵素標識（例えば、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはウレアーゼ）と容易に結合体化され
得る多くの抗ウシ免疫グロブリン（Ｉｇ）分子が、当該分野で公知である。次いで、適切
な酵素基質を使用して、検出可能なシグナルを生成する。他の関連の実施形態において、
当業者に公知の方法を使用して、競合型ＥＬＩＳＡ技術を実行し得る。
【０１０８】
アッセイはまた、溶液中で行われ得、その結果、ＭｅｎＢエピトープまたは模倣物、お
よびこれらの分子に対して特異的な抗体は、沈殿条件下で複合体を形成する。１つの特定
の実施形態において、これらの分子は、当該分野で公知のカップリング技術を使用して、
例えば、直接的な化学的カップリングまたは間接的なカップリングによって、固相粒子（
例えば、アガロースビーズなど）に結合され得る。次いでコーティングされた粒子を、適
切な結合条件下で、ＭｅｎＢに対する抗体を含むことが予想される生物学的サンプルと接
触させる。結合した抗体の間の架橋は、粒子−エピトープ−抗体または粒子−模倣物−抗
体の複合凝集体の形成を生じ、この凝集体を、洗浄および／または遠心分離を使用して、
サンプルから沈殿させ得、かつ分離させ得る。反応混合物を、任意の多くの標準的な方法
（例えば、上記に記載のそれらの免疫診断方法）を使用して分析して、複合体の存在また
は不在を決定し得る。
【０１０９】
なおさらなる実施形態において、免疫アフィニティーマトリクスを提供し得、ここで、
ＭｅｎＢ抗体を含むことが予想される生物学的サンプルから抗体のポリクローナル集団を
、基材に固定化する。これに関して、サンプルの最初のアフィニティー精製を、固定化さ
れた抗原を使用して実施し得る。従って、生じたサンプル調製物は、アフィニティー支持
中での潜在的な非特異的結合特性を回避しつつ、抗ＭｅｎＢ部分のみを含む。高収量で、
かつ抗原結合活性を良く保存して、免疫グロブリン（完全かまたは特定のフラグメントに
おいて）を固定化する多くの方法は、当該分野で公知である。任意の特定の方法に限定さ
れずに、固定化されたプロテインＡおよびプロテインＧを使用して、免疫グロブリンを固
定化し得る。
【０１１０】
従って、一旦免疫グロブリン分子を免疫アフィニティーマトリクスを提供するために固
定化すると、標識された分子は適切な結合条件下で結合した抗体と接触する。非特異的に
結合された任意のＭｅｎＢエピトープまたはその模倣物を、免疫アフィニティー支持体か
ら洗い落とした後、結合した抗原の存在を、当該分野で公知の方法を使用して、標識に対
してアッセイすることによって決定し得る。
【０１１１】
本発明のＧＮＡ３３ポリペプチドおよび／もしくはその模倣物またはそれらに対する抗
体を含む、上に記載されたアッセイ試薬は、上に記載される免疫アッセイを行うために、
適切な指示書および他の必要な試薬と共に、キットで提供され得る。このキットはまた、
使用される特定の免疫アッセイに依存して、適切な標識ならびに他の包装される試薬およ
び材料（すなわち、洗浄緩衝液など）を含み得る。標準的な免疫アッセイ（例えば、上に
記載されるアッセイ）を、これらのキットを使用して行い得る。
【０１１２】
さらに、このＧＮＡ３３ポリペプチド、分子模倣物および抗体を本明細書中で使用して
、哺乳動物の被験体においてＭｅｎＢを妨げ得る。特に、これらの分子を含むワクチン組
成物を、ワクチン接種された被験体においてＭｅｎＢ疾患の防止のために使用し得る。こ
のワクチンを、他の抗原または免疫調節因子（例えば、ＩＬ−２、改変体ＩＬ−２（ｃｙ
ｓ１２５からｓｅｒ１２５への改変体）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ｇ−インターフェ
ロン、ＩＰ−１０、ＭＩＰ１ｂおよびＲＡＮＴＥＳを含むがこれらに限定されない、免疫
グロブリン、サイトカイン、リンフォカインおよびケモカイン）と組み合わせて投与し得
る。
【０１１３】
これらワクチンは、一般的に、水、生理食塩水、グリセリン、エタノールなどのような
、１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」を含む。さらに、補助物質（
例えば、保湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など）がそのようなビヒクル中に存在し得る。
【０１１４】
また、アジュバントを使用して、ワクチンの有効性を増強し得る。アジュバントをワク
チン組成物に直接添加し得るか、またはワクチン投与の同時もしくはその直後のいずれか
で別々に投与し得る。このようなアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：（１）アルミニウム塩（ａｌｕｍ）（例えば、水酸化アルミニウム、リン
酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、など）；（２）Ｏ／Ｗのエマルジョン処方物（ムラ
ミルペプチド（以下を参照のこと）もしくは細菌細胞壁成分のような他の特異的免疫刺激
因子を含むか、または含まない）（例えば、（ａ）ＭＦ５９（国際出願公報第ＷＯ ９０
／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄ
ｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ １９９５、第１０節）、これは、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフリューダ
イザ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）のようなマイクロフリューダ
イザを使用してサブミクロンの粒子中に処方され、５％ スクアレン、０．５％ ＴＷＥ
ＥＮ ８０ＴＭ、および０．５％ ＳＰＡＮ８５ＴＭ（必要ではないが、随意に種々の量
のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含む）を含む；（ｂ）ＳＡＦ、（これは、サブミ
クロンのエマルジョン中にフリューダイズされるか、またはより大きな粒子サイズのエマ
ルジョンを生成するようボルテックスされるかのいずれかで、１０％ スクアレン、０．
４％ ＴＷＥＥＮ ８０ＴＭ、５％ プルロニックブロック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ−ｂｌｏ
ｃｋｅｄ）ポリマー Ｌ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含む）、ならびに（ｃ）ＲＩＢ
ＩＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉ
ｌｔｏｎ，ＭＴ）、これは、２％ スクアレン、０．２％ ＴＷＥＥＮ ８０ＴＭ、なら
びにモノリン脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および１つ以上の
細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの細菌細胞壁成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（
ＤＥＴＯＸＴＭ））を含む；（３）サポニンアジュバント（例えば、Ｑ２１またはＳＴＩ
ＭＵＬＯＮＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍ
Ａ）を使用し得るか、またはこれらから生成される粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激
複合体））、ここで、ＩＳＣＯＭはさらなる界面活性剤を欠き得る（例えば、国際出願公
開番号ＷＯ ００／０７６２１を参照のこと）；（４）完全フロイントアジュバント（Ｃ
ＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、
インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、Ｉ
Ｌ−１２（国際公開番号第ＷＯ ９９／４４６３６号）など）、インターフェロン（例え
ば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死
因子（ＴＮＦ）、など；（６）細菌のＡＤＰ−リボシル化を行う毒素の無害化変異体（例
えば、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定毒素（ＬＴ
）、具体的にはＬＴ−Ｋ６３（ここで、６３位の野生型アミノ酸がリジンで置換される）
、ＬＴ−Ｒ７２（ここで、７２位の野生型アミノ酸がアルギニンで置換される）、ＣＴ−
Ｓ１０９（ここで、１０９位の野生型アミノ酸がセリンで置換される）、およびＰＴ−Ｋ
９／Ｇ１２９（ここで、９位の野生型アミノ酸がリジンで置換され、そして１２９位の野
生型アミノ酸がグリシンで置換される））（例えば、国際特許公開番号第ＷＯ９３／１３
２０２号および同第ＷＯ９２／１９２６５号を参照のこと）；（７）ＭＰＬまたは３−Ｏ
−脱アセチル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、ＧＢ ２２２０２２１を参照のこと）、
ＥＰ−Ａ−０６８９４５４、肺炎球菌のサッカライドで使用される場合、必要に応じて、
ａｌｕｍの実質的非存在下である、（例えば、国際特許公開第ＷＯ ００／５６３５８号
を参照のこと）；（８）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／またはＯ／Ｗエマルジョ
ンの組み合わせ（例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８、ＥＰ
−Ａ−０７６１２３１を参照こと）；（９）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（
例えば、Ｒｏｍａｎら（１９９７）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：８４９−８５４；Ｗｅｉｎｅｒ
ら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１０８３３−１
０８３７；Ｄａｖｉｓら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：８７０−８７６；Ｃ
ｈｕら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１６２３−１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄ
ら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２３４０−２３４４；Ｍｏｌｄｏｖ
ｅａｎｕら（１９８８）Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１２１６−１２２４；Ｋｒｉｅｇら（１
９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６−５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら（１９９６）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：２８７９−２８８３；Ｂａｌｌａｓら
（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：１８４０−１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら（１
９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４５７０−４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎら（１９９
６）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：７２−７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８８）
Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７９：８６６−８７３；Ｓｔａｃｅｙら（１９９６
）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２１１６−２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら（１９９１）Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７５９−１７６４；Ｙｉら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１５７：４９１８−４９２５；Ｙｉら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：５
３９４−５４０２；Ｙｉら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４７５５−４７６
１；Ｙｉら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５８９８−５９０６；国際公開第
ＷＯ ９６／０２５５５号，同第ＷＯ ９８／１６２４７号，同第ＷＯ ９８／１８８１
０号、同第ＷＯ ９８／４０１００同，同第ＷＯ ９８／５５４９５号，同第ＷＯ ９８
／３７９１９号および同第ＷＯ ９８／５２５８１号）、（例えば、これらを少なくとも
ＣＧジヌクレオチド上に含み、シトシンは必要に応じて５−メチルシトシンで置換される
）；（１０）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えば、
国際公開第ＷＯ ９９／５２５４９号を参照のこと）；（１１）オクトキシノールと組み
合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（例えば、国際公開第ＷＯ
０１／２１２０７号）、または少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば
、オクトキシノール）と組み合わせた、ポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤
もしくはエステル界面活性剤（例えば、国際公開第ＷＯ ０１／２１１５２号）；（１２
）ＣｐＧオリゴヌクレオチドのような、サポニンおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチド（
例えば、国際公開第ＷＯ ００／６２８００号）；（１３）免疫刺激剤および金属塩の粒
子（例えば、国際公開第ＷＯ ００／２３１０５号を参照のこと）；ならびに（１４）組
成物の有効性を増強させるための免疫刺激因子として作用する他の物質。
【０１１５】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグル
タミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグル
タミン（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｅ）（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラ
ニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ
−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＲ）などが
挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
組成物の有効性を増強させるために、活性因子をキャリア分子と結合させることが必要
であり得る。このようなキャリア分子は、それ自体は有害な抗体の産生を誘導しない。適
切なキャリアは、代表的に大きく、代謝の遅い巨大分子（例えば、タンパク質、多糖類、
ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（
例えば、油滴またはリポソーム）、不活性化ウイルス粒子、ＣＲＭ１９７（無毒な変異ジ
フテリア毒素）など）である。このようなキャリアは、当業者に周知である。
【０１１７】
代表的に、ワクチン組成物は注射可能なものとして、液体の溶液または懸濁液のいずれ
かとして調製される；注射前の液体ビヒクル中の溶液または懸濁液に適切な固体形態もま
た調製され得る。これらの調製はまた、上に記載するように、アジュバントの効果を増強
するために、エマルジョン化もしくはリポソーム中でカプセル封入され得るか、または粒
子に吸収され得る。
【０１１８】
ワクチンは、有効量の活性な因子（例えば、ＧＮＡ３３ポリペプチドまたはそれらに対
する抗体）、および必要に応じて他の任意の上述の成分およびインヒビターを含む。「有
効量」によって、ワクチンが投与される個体において免疫学的な応答を誘導する分子の量
を意味する。このような応答は、一般的に、ワクチンに対して、分泌性免疫応答、細胞性
免疫応答および／または抗体媒介性免疫応答の被験体における発達を生じる。通常は、こ
のような応答としては、以下の効果のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定され
ない：任意の免疫学的クラスの抗体の産生（例えば、免疫グロブリンＡ，免疫グロブリン
Ｄ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＭ）；Ｂリンパ球および
Ｔリンパ球の増殖；免疫学的細胞の活性化シグナル、増殖シグナルおよび分化シグナルの
提供；ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞および／もしくは細胞傷害性Ｔ細胞、ならび
に／またはｇｄＴ細胞集団の増殖。
【０１１９】
一旦処方されると、ワクチンは、皮下注射または筋肉内注射のいずれかによって、非経
口で通常通りに投与される。他の投与形態に適切なさらなる処方物としては、経口処方物
または肺の処方物、坐薬、ならびに経皮的適用が挙げられる。投薬処置は、単回投薬スケ
ジュールか、または複数回投薬スケジュールであり得る。
【０１２０】
（ＩＩＩ．実験）
本発明を実施する為の具体的な実施形態の例を以下である。これらの例は、例示目的の
みのために、提供され、そして、いかなる方法においても本発明の範囲を限定することを
意図するものではない。
【０１２１】
使用される数値（例えば、量、温度など）に関する精度を保証するための努力がなされ
ているが、実験誤差および偏差は、当然のこととして、許容されるべきである。
【０１２２】
（材料および方法）
（細菌株）
本研究に含まれるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ株を、異なる国に滞在する、
髄膜炎菌性疾患を有する患者から単離し、３６年の期間にわたって収集した。２１株が、
血清型Ｂ株であり、１株が血清型Ｃ株であった。これらの株を、表１に要約する。電気泳
動分類（ＥＴ）に基づいて、これらの収集物は、疾患を引き起こすＭｅｎＢ株についての
広範な遺伝的多様性を表す。
【０１２３】
ＭＣ５８株、ＢＺ２３２株およびＮＭＢ株の変異体（それぞれ、ＭＣ５８ΔＧＮＡ３３
、ＢＺ２３２ΔＧＮＡ３３およびＮＭＢΔＧＮＡ３３）（これらの株において、ｇｎａ３
３遺伝子が欠失され、そして、抗生物質カセットを用いた対立遺伝子交換によって置きか
えられている）を、プラスミドｐＢＳＵＤ３３ＥＲＭで親株を形質転換することによって
調製した。このプラスミドは、対立遺伝子交換のための上流および下流の隣接遺伝子領域
およびｅｒｍＣ遺伝子（エリスロマイシン耐性）を含む。簡潔には、−８６７から＋７５
の上流隣接領域（開始コドンを含む）、および＋１２６８から＋１７４４の下流隣接領域
（終止コドンを含む）を、以下のプライマーを使用して、ＭＣ５８から増幅した：
【０１２４】
【化１】
。
【０１２５】
これらのフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ，Ｍｉｌａｎ
，Ｉｔａｌｙ）にクローニングし、標準的技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅ
ｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ Ｍａｎｕａｌ
（２００１））を使用してＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５に形質転換した。一旦、全てのサブクロ
ーニングが完遂されると、天然のコンピテントＮｅｉｓｓｅｒｉａ ＭＣ５８株、Ｎｅｉ
ｓｓｅｒｉａ ＢＺ２３２株およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ＮＭＢ株を、チョコレート寒天
プレート（ｃｈｏｃｏｌａｔｅ ａｇａｒ）（Ｒｅｍｅｌ，Ｌａｚｔａｋａｓ，ＫＡ）上
で一晩増殖したいくつかのコロニーを選択し、これらを、１μｇのプラスミドＤＮＡを含
有する２０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）と混合することによって形
質転換した。この混合物をチョコレート寒天プレート上にスポティングし、５％ＣＯ２、
３７℃で、６時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ中に希釈し、そして、７μｇ／ｍｌ
のエリスロマイシンを含有するチョコレート寒天プレートに塗った。これらの３つの株の
各々についてエリスロマイシン耐性コロニーのゲノム中のｇｎａ３３遺伝子の非存在を、
以下のプライマーを使用するＰＣＲによって確認した：
【０１２６】
【化２】
。これらのプライマーは、それぞれ、ｇｎａ３３遺伝子の５’センス鎖およびｇｎａ３３
遺伝子の３’アンチセンス鎖に対応した。ＧＮＡ３３発現の欠失は、以下で説明されるよ
うなウェスタンブロット分析によって確認された。
【０１２７】
（モノクローナル抗体（ｍＡｂ）試薬）
フローサイトメトリー、殺菌剤、およびインビボ保護実験（ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｒｏｔ
ｅｃｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）に使用される抗体としては、以下が挙げられた：
Ｒｉｊｋｓｉｎｓｔｉｔｕｕｔ Ｖｏｏｒ Ｖｏｌｋｓｇｅｚｏｎｄｈｅｉｄ ｅｎ Ｍ
ｉｌｅｕ，Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、またはＷｅｎｄｅｌ
ｌ Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｗａｌｔｅｒ Ｒｅｅｄ Ａｒｍｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏ
ｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣから得られる髄膜炎菌Ｐｏｒ Ａ
Ｐ １．２特異的サブタイプｍＡｂ（ＭＮ １６Ｃ １３Ｆ４、サブクラスＩｇＧ２ａ）
；カプセル化した、血清型Ｂ，ＳＥＡＭ １２およびＳＥＡＭ ３（Ｇｒａｎｏｆｆら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６０：５０２８−５０３６），サブクラスＩｇＧ２
ａ）ならびに、血清型Ｃ（ｍＡｂ １８１．１（Ｇａｒｃｉａ−Ｏｊｅｄａら、Ｉｎｆｅ
ｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（２０００）６８：２３９−２４６，サブクラスＩｇＧ３）に特異的
である抗ポリサッカリドｍＡｂ。ＭＡｂ １８１．１は、Ｋａｔｈｒｙｎ Ｓｔｅｉｎ，
Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって提供され
た。このネガティブコントロールは、関連のない特異性のマウスＩｇＧ ｍＡｂ（ＶＩＧ
１０）、またはｒＧＮＡ３３を発現するのに使用された株由来のＥ．ｃｏｌｉタンパク質
に対して調製されたマウスポリクローナル抗血清からなった。
【０１２８】
（ＧＮＡ３３の発現および精製）
ｇｎａ３３ ＯＲＦを、プライマーとして使用される合成オリゴヌクレオチドを用いて
、２９９６株（Ｐ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｙ ａｎｄ Ｊ．Ｔ．Ｐｏｏｌｍａｎ，Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９２）６０：３１５６，１９９２）由来の染色体ＤＮＡにお
けるＰＣＲによって増幅された。増幅されたＤＮＡフラグメントを、Ｈｉｓタグ化（ＨＴ
−ＧＮＡ３３）されたタンパク質またはシグナル配列または脂質改変配列のない可溶性タ
ンパク質（ｒＧＮＡ３３）として、タンパク質を発現するためにｐＥＴ−２１ｂ＋ベクタ
ー（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローニングした。組換えタンパク質の
発現を、上述のように実施されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価
した。このＨｉｓタグ化タンパク質は、Ｎｉ２＋結合体化キレートファーストフローＳｅ
ｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａ
ｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のアフィニティクロマトグラグフィによって精製し、そして非タグ
化形態を、モノＳイオン交換樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用する
ＦＰＬＣによって精製した。
【０１２９】
（ポリクローナル抗ＧＮＡ３３抗血清の調製）
ＧＮＡ３３に対する抗血清を調製するために、２０μｇの精製した、ＨＴ−ＧＮＡ３３
または非タグ化ｒＧＮＡ３３を、６週齢のＣＤ１雌性マウス（１グループ当たり４〜１０
のマウス）を免疫するために使用された。これらのマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅ
ｒ（Ｉｔａｌｉａ Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｃａｌｃｏ，Ｉｔａｌｙ，またはＨｏｌｌｉｓｔｅｒ
，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手した。組換えタンパク質は、初回投薬について完全フ
ロイントアジュバント（ＣＦＡ）と共にｉ．ｐ．で投与し、第２回追加免疫投薬（第２１
日目）および第３回投薬（第３５日目）について不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ
）と共にｉ．ｐ．で投与した。血液サンプルを第３４日目および第４９日目に採取した。
【０１３０】
（モノクローナル抗体の調製）
４〜６週齢の雌性ＣＤ１マウスを、第３回目の投薬はアジュバントなしで投与した以外
、上述のように免疫した。３日後に、マウスを屠殺し、そして、それらの肝細胞を、１黒
色腫細胞に対して５脾臓細胞の比で黒色腫細胞Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合した。
ＨＡＴ選択培地中での２週間のインキュベーション後に、ハイブリドーマ上清は、ＥＬＩ
ＳＡによって抗体結合活性についてスクリーニングした。このＥＬＩＳＡを、このＮ．ｍ
ｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｍ７株は、０．０２５％パラホルムアルデヒドで処理すること
によって不活性化されているナノカプセル化したＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｍ７株
（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９１）５９：４０９７−４１
０２）でコートされたマイクロタイタープレート上で実施した。ＧＮＡ３３特異的抗体を
分泌するハイブリドーマを、限界希釈によって２回クローン化し、次いで、増殖し、組織
培養における次なる使用またはＢＡＬＢ／ｃマウスにおける腹水産生の為に凍結した。
【０１３１】
これらのモノクローナル抗体のサブクラスを、マウスモノクローナル抗体アイソタイピ
ングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ．）を使用して決定した。選択され
たｍＡｂの中に、１つのＩｇＧ２ａ抗ＧＮＡ３３ｍＡｂ（ｍＡｂ ２５と命名した）を、
以下に説明した、結合研究または機能研究の全てにおいて使用された。このモノクローナ
ル抗体を、Ｈｉ−Ｔｒａｐ親和性カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によ
ってマウス腹水から精製し、ＰＢＳ緩衝液での徹底的な透析の後に、精製したｍＡｂの濃
度は、基準としてＢＳＡを使用する改変Ｌｏｗｒｙ法（ＤＣ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｏｍｅ
，Ｉｔａｌｙ）を使用して決定した。ｍＡｂ ２５結合の特異性を、ＭＣ５８株、ＢＺ２
３２株およびＮＭＢ株ならびにそれぞれのＧＮＡ３３ノックアウト体（ＭＣ５８ΔＧＮＡ
３３，ＢＺ２３２ΔＧＮＡ３３およびＮＭＢΔＧＮＡ３３；以下を参照のこと）から調製
された膜タンパク質を使用するウェスタンブロットによって決定された。
【０１３２】
（生カプセル化髄膜炎菌の表面に対する抗血清の結合）
ポリクローナル抗ＧＮＡ３３抗血清およびｍＡｂ ２５の、生ＮｍＢ株の表面に結合す
る能力は、以前に記載されたように実行される（Ｍｏｅら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．
（１９９９）６７：５６６４−５６７５）、間接蛍光アッセイのフローサイトメトリー検
出を使用して決定された。図１Ａは、代表的な４つのＮｍＢ株、親株２９９６（Ｐ１．５
，２）および他の３つの株である、Ｍ３７３５（Ｐ１．５，２）、Ｍ４２０７（Ｐ１．５
）およびＭＣ５８（Ｐ１．７，１６）に対するポリクローナル抗ｒＧＮＡ３３抗血清の結
合を示す。抗ＧＮＡ３３ポリクローナル抗血清は、２９９６株およびＭ３７３５株とのみ
反応した。この抗カプセルポジティブコントロールｍＡｂは、４つ全ての株に結合した一
方、Ｅ．ｃｏｌｉのタンパク質で免疫された動物から調製されたネガティブコントロール
抗血清は、バックグラウンド結合のみを示した。図ｌＢは、３つの株（Ｍ３７３５［Ｐ１
．５，２］，Ｍ４２０７［Ｐ１．５］およびＭＣ５８［Ｐ１．７，１６］）の細菌細胞表
面への抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂ ２５の結合を測定する類似の実験の結果を示す。このｍＡ
ｂは、Ｍ３７３５（Ｐ１．５，２）株にのみ結合した。
【０１３３】
表Ｉは、２２の遺伝的に多様なカプセル化された髄膜炎菌株（２１の血清型Ｂおよび１
つの血清型Ｃ）由来の生きている細菌の表面に結合する、抗ＧＮＡ３３抗血清またはｍＡ
ｂ ２５の能力を測定するフローサイトメトリの結果をまとめている。この抗ＧＮＡ３３
抗体は、Ｐ１．５，２血清亜型またはＰ１．２血清亜型を有する株にのみ結合した（９の
うち９に対して、他のＰｏｒＡ血清亜型を有する１３株のうち０である；Ｐ＜０．００１
）。９つのポジティブ株のうちの１つである、Ｍ９８６は、他の８つの株よりも弱い結合
を示した（以下を参照のこと）。ＰｏｒＡのループ１上に存在するＰ １．５エピトープ
を発現するが、Ｐ１．２エピトープ（ループ４）を発現しない３つの株（Ｍ４２０７、１
０００およびＢＺ８３）に対して結合はなかった。ＰｏｒＡ（すなわち、Ｐ１−）を発現
しないＭ１３６株に対する結合も存在なかった。これらのデータは、細菌表面に対する抗
ＧＮＡ３３抗体の結合はＰｏｒＡ血清亜型Ｐ１．２の発現と相関することを示している。
【０１３４】
（補体依存的殺菌抗体活性）
殺菌活性を、以前に説明されたように測定された（Ｍｏｅら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕ
ｎ．（２００１）６９：３７６２−３７７１）。述べない限り、この補体供給源は、ＥＬ
ＩＳＡで試験した場合に、血清型Ｂまたは血清型Ｃのポリサッカリドに対して検出可能な
抗カプセル抗体も、２０％または４０％の最終血清濃度で、標的株に対する検出可能な内
因性の殺菌活性を有さない健康な成人（ＭＡＳ）に由来するヒト血清であった。以下のよ
うないくつかの実施形態において、未処置の無ガンマグロブリン血症の患者に由来する血
清（Ｓｔｅｅｌｅら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９８４）４４：４５２−４５８）
、仔ウサギ血清、または成体ラット血清を補体供給源として使用して、殺菌活性は測定し
た。
【０１３５】
（動物防御）
抗ＧＮＡ３３抗体が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ菌血症に対する受動的防
御を付与する能力を、腹腔内チャレンジした乳児ラットにおいて試験した。このアッセイ
を、以前に記載されるように実行した（Ｍｏｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９
９）６７：５６６４−５６７５）。簡潔には、チャレンジの開始時にコロニーを取り、ブ
ロス培養物中に接種し、そして増殖させ、殺菌アッセイについて上記したように調製した
。感受性を最大化するために株Ｍ９８６を用いて、その動物に、０時点で、約５×１０３
のチャレンジＭｅｎＢ試験株と混合した試験抗血清およびコントロール抗血清の異なる希
釈物１００μｌを、腹腔内注射した。他の試験株を用いた実験において、この抗体を、０
時点で腹腔内投与し、そして細菌チャレンジを２時間後に腹腔内で行った。使用したポジ
ティブコントロール抗莢膜ｍＡｂは、ＳＥＡＭ３であった。細菌チャレンジの１８時間後
に、針と約１０μｌのヘパリン（１０００単位／ｍｌ；Ｆｕｊｉｓａｗａ ＵＳＡ、Ｄｅ
ｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）（保存料なし）を含むシリンジとを用いて、心臓穿刺によって血
液試料を獲得した。１μＬ、１０μＬおよび１００μＬの血液アリコートを、チョコレー
ト寒天上に配置した。血液１ｍｌ当たりのＣＦＵを、このプレートを３７℃で５％ＣＯ２
中にて一晩インキュベートした後に決定した。相乗平均ＣＦＲ／ｍｌの計算のために、滅
菌培養物を受けた動物に、１ＣＦＲ／ｍｌという値を割り当てた。
【０１３６】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット）
髄膜炎菌株の総細胞抽出物を、以下のように調製した。シングルコロニーを、０．２５
％グルコースを補充したＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏ
ｉｔ、ＭＩ）７ｍｌ中で、０．５〜０．７のＡ６２０ｎｍまで増殖させた。その細菌を、
５０００×ｇで１５分間遠心分離することによって収集し、そしてＰＢＳ中に再懸濁した
。凍結−解凍後、細菌懸濁物をサンプル緩衝液（０．０６Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６
．８）、１０％（Ｖ/Ｖ）グリセロール、２％（Ｗ/Ｖ）ＳＤＳ、５％（Ｖ/Ｖ）２−メル
カプトエタノール）と混合し、そして１０分間煮沸した。髄膜炎菌株由来の精製タンパク
質（０．５μｇ／レーン）または総細胞抽出物（２５μｇ）を、１２．５％のＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル上（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ．Ｋ、Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）２２７：
６８０−６８５）にロードし、そしてニトロセルロース膜上に移した（Ｔｏｗｂｉｎら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９７９）７６：４３５０−４３５４）。ト
ランスファー緩衝液（０．３％ Ｔｒｉｓ塩基、１．４４％グリシン、２０％（ｖ／ｖ）
メタノール）を使用して、４℃にて１５０ｍＡで２時間トランスファーを実行した。この
ニトロセルロース膜を、飽和緩衝液（ＰＢＳ中１０％スキムミルク、０．１％ Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ１００）中で４℃で一晩インキュベートすることによって飽和した。この膜を洗
浄緩衝液（ＰＢＳ中の３％スキムミルク、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）で２回洗浄
し、洗浄緩衝液で２００倍希釈されたマウス抗血清、最終濃度が６μｇ／ｍｌのｍＡｂ
２５、または抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２ｍＡｂの１００倍希釈希物と共にその後、ホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼで標識された抗マウスＩｇ（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄ
ｅｎｍａｒｋ）の２０００倍希釈物と共に３７℃で２時間インキュベートした。膜を、Ｐ
ＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００で２回洗浄し、Ｏｐｔｉ−４ＣＮ Ｓｕｂｓｔ
ｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて発色させた。水を加えることによって反応
を停止させた。
【０１３７】
（ペプチドスポット合成）
ペプチドスポット合成を、モデルＡＳＰ ２２２自動スポット合成機（ＡＢＩＭＥＤ）
およびジイソプロピルカーボジイミド（ＤＩＣ）／Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（
ＨＯＢｔ）活性化（ＦｒａｎｋおよびＯｖｅｒｗｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．（１９９６）６６：１４９−１６９）を用いて、アミノ−ＰＥＧセルロース膜（ＡＢ
ＩＭＥＤ、Ｌａｎｇｅｒｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で行なった。インサイチュ調製さ
れた、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）−アミノ酸誘導体のＨＯＢｔエステ
ル（０．２Ｍ）をカップリング反応にした。スポット上の遊離アミノ官能基を、ジメチル
ホルムアミド中のブロモフェノールブルーの溶液で処理した。これにより、青色染色を生
じる、この染色により、全ての合成工程を可視的に観察することができた。最終サイクル
の後、全てのペプチドを２％無水酢酸でＮ末端をアセチル化した。合成の最後に、トリフ
ルオロ酢酸／トリイソブチルシラン／水／ジクロロメタン（５０／３／２／４５）の混合
物を用いて、側鎖保護基を取り除いた。
【０１３８】
（ペプチド結合アッセイ）
セルロース結合ペプチドを、ペプチド間の疎水性相互作用を防ぐためにエタノールに浸
した。非特異性結合を、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水
（ＴＢＳ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２７ｍＭ ＫＣｌ、ｐ
Ｈ７．０）（Ｔ−ＴＢＳ）中の２％カゼイン（１０ｍｌ）と共に、４℃で一晩セルロース
シートをインキュベートすることによって、ブロックした。このシートを、Ｔ−ＴＢＳブ
ロッキング緩衝液で１００倍希釈した、抗ＧＮＡ３３ｍＡｂ２５（６μｇ／ｍｌ）または
抗ＰｏｒＡ １．２ｍＡｂと共に３７℃で２時間インキュベートした。次にアルカリホス
フォターゼ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢｉｏＲａｄ）を、３７℃で１時間、Ｔ−ＴＢ
Ｓブロッキング緩衝液中３０００倍希釈で加えた。シートをＴ−ＴＢＳで３回洗浄し、基
質緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．９、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２）中のブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（ＢＣＩＰ）（Ｓｉｇｍ
ａ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および３−（４，５−ジメチルチアゾール−
２−イル）−２，５ジフェニル−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ；Ｓｉｇｍａ）と共に
そのシートをインキュベートすることにより、結合の検出を達成した。シグナルの定量評
価を、Ｕｍａｘ Ｓｐｅｅｄｙ ＩＩ ２２００オプティカルスキャナを用いて行なった
。
【実施例】
【０１３９】
（実施例１）
（間接蛍光フローサイトメトリーにより測定される、細菌細胞表面への抗ＧＮＡ３３抗
体の結合）
ＣＤ１マウスをｒＧＮＡ３３（２９９６株由来の遺伝子によってコードされる）を用い
て免疫化した。得られたポリクローナル抗体含有抗血清を、間接免疫蛍光結合アッセイの
フローサイトメトリー検出により測定される、様々なＭｅｎＢ株の生細菌細胞への結合能
力について試験した。図１Ａは、４つの代表的なＭｅｎＢ株、親２９９６株（Ｐ１．５，
２）および３つの他の株（Ｍ３７３５株（Ｐ１．５，２）、Ｍ４２０７株（Ｐ１．５）お
よびＭＣ５８株（Ｐ１．７，１６））へのポリクローナル抗ｒＧＮＡ３３抗血清の結合を
示す。抗ＧＮＡ３３ポリクロナール抗血清は、２９９６株およびＭ３７３５株のみと反応
した。抗莢膜ポジティブコントロールｍＡｂは４つの株全てと結合したが、Ｅ．ｃｏｌｉ
タンパク質で免疫化された動物から調製されたネガティブコントロール抗血清は、バック
グラウンド結合のみを示した。図１Ｂは、３つの株（Ｍ３７３５株（Ｐ１．５，２）、Ｍ
４２０７株（Ｐ１．５）およびＭＣ５８株（Ｐ１．７，１６）の細菌細胞表面への抗ＧＮ
Ａ３３ｍＡｂ２５の結合を測定する、同様の実験の結果を示す。ｍＡｂはＭ３７３５株（
Ｐ１．５，２）のみと結合した。
【０１４０】
表１は、２２個の遺伝的に多様な莢膜化髄膜炎菌株（２１個の血清型Ｂおよび１つの血
清型Ｃ）からの生細菌の表面に結合する、抗ＧＮＡ３３抗体またはｍＡｂ２５の能力を測
定するフローサイトメトリー実験の結果を要約したものである。抗ＧＮＡ３３抗体は、Ｐ
１．５，２血清亜型またはＰ１．２血清亜型を有する株にのみと結合した（９株中９株；
これに対して、他のＰｏｒ Ａ血清亜型を有する１３株中０株；Ｐ＜０．００１）。９個
のポジティブ株の１つであるＭ９８６株は、他の８個の株より低い結合を示した（下記参
照）。Ｐ１．５エピトープ（ＰｏｒＡのループ１上に存在、Ｓａｃｃｈｉら、Ｉｎｆｅｃ
ｔ．Ｄｉｓ．（２０００）１８２：１１６９−１１７６）を発現するが、Ｐ１．２エピト
ープ（ループ４）を発現しない、３つの株（Ｍ４２０７株、１０００株およびＢＺ８３株
）への結合はなかった。ＰｏｒＡを発現しない（すなわち、Ｐ１−）Ｍ１３６株への結合
もまたなかった。これらのデータは、細菌表面への抗ＧＮＡ−ＧＮＡ３３抗体の結合がＰ
ｏｒＡ血清亜型Ｐ１．２の発現と関連することを示している。
【０１４１】
（実施例２）
（異なるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｂ群株から調製された総膜画分のウェスタン
ブロット）
細菌表面への抗ＧＮＡ３３抗体の結合とＰ１．２血清亜型の明らか関係は、予想外であ
った。この関係を代表的な株から調製した総タンパク質のウェスタンブロットによりさら
に研究し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解決した。４つの血清亜型Ｂ株（フローサイト
メトリーで抗ＧＮＡ３３表面結合についてネガティブであった２つの株（ＮＧ３／８８株
（Ｐ１．７，１）およびＭＣ５８株（Ｐ１．１７，１６）、およびポジティブであった２
つの株（ＢＺ２３２株およびＮＭＢ株（共にＰ１．５，２））からの結果を図２に示す。
データはまた、ＧＮＡ３３をコードする遺伝子が不活性化された３つの株（ＭＣ５８株、
ＢＺ２３２株およびＮＭＢ株）からの総膜調製物について示す。
【０１４２】
図２Ａにおいて、約４８ｋＤａの見かけの質量を有する単一バンドを、２つの非Ｐ１．
２株（ＮＧ３／８８株（レーン３）およびＭＣ５８株（レーン４））からの膜調製物中の
抗ＧＮＡ３３ｍＡｂ２５によって検出した。バンドは、ｒＧＮＡ３３（レーン１）に予想
される見かけの分子量を有し、コントロールＥ．ｃｏｌｉ株（レーン２）から、およびＭ
Ｃ５８株（レーン５）中のＧＮＡ３３ノックアウトから調製された総タンパク質中に存在
しなかった。レーン６およびレーン８は、それぞれＢＺ２３２株およびＮＭＢ株から調製
される総タンパク質を含む。これらの株は共に、ＰｏｒＡ血清亜型Ｐ１．５，２を有する
。それぞれのレーンにおいて、２つの抗ＧＮＡ３３反応性バンドが存在する。より高分子
量である４８ｋＤａバンドはＢＺ２３２株およびＮＭＢ株（それぞれレーン７とレーン９
）から誘導されるＧＮＡ３３ノックアウトに存在せず、この結果はこのタンパク質がＧＮ
Ａ３３であることを確証する。より低分子量である抗ＧＮＡ３３反応性バンドは、Ｐ１．
２と反応性であるｍＡｂとの反応性に基づきＰｏｒＡであるようである（図２Ｂを参照の
こと）。
【０１４３】
図２Ｂは、図２Ａに記載されるものと同じタンパク質試料のウェスタンブロットを示す
が、一次検出抗体として抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２ｍＡｂを使用する。予想されるように、ｒ
ＧＮＡ３３（レーン１）と、ネガティブコントロールＥ．ｃｏｌｉタンパク質（レーン２
）とまたはＰｏｒＡ Ｐ１．２（レーン３，４および５）を発現しない株から調製される
総膜と、抗ＰｏｒＡ ｍＡｂとの反応性はなかった。しかしながら、ＰｏｒＡに期待され
る見かけの質量を有するタンパク質が、ＢＺ２３２株（レーン６）、ＢＺ２３２ΔＧＮＡ
３３（レーン７）、ＮＭＢ（レーン８）およびＮＭＢΔＧＮＡ３３（レーン９）からの膜
調製物中に検出された。それらはＰｏｒＡ Ｐ１．２を発現する。このタンパク質はまた
、それらのそれぞれのＧＮＡ３３ノックアウトからの調製物（それぞれレーン７およびレ
ーン９）中に存在する。これらの結果は、図２Ａの抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂと反応する４１
ｋＤａの見かけの質量を有するタンパク質がＰｏｒＡであったことを確証する。対照的に
、抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２ｍＡｂは、ウェスタンブロットでＧＮＡ３３と反応しなかった。
【０１４４】
（実施例３）
（抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂ２５によって認識される表面露出したＰｏｒＡエピトープのペ
プチドマッピング）
抗Ｐ１．２ ｍＡｂは、ループ４上に存在するＰｏｒＡ上のエピトープを認識すること
が知られている。表２は、本研究に含まれる選択されたＭｅｎＢ株についてのループ４可
変領域（ＶＲ２）アミノ酸配列の比較を示す（最近改訂されたＰｏｒＡ ＶＲ命名の慣例
会議についてＳａｃｃｈｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２０００）１８２：１１６９−
１１７６、またはｈｔｔｐ：／／ｍｌｓｔ．ｚｏｏ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／Ｍｅｎｉｎｇｏ
ｃｏｃｃｕｓを参照のこと）。表２中に、抗ＧＮＡ３３ｍＡｂによる表面結合についてネ
ガティブであった、２つの密接に関連するＶＲ２型（それぞれ、ＢＺ８３株（Ｐ１．１０
）からのＰ１．１０およびＭ４２０７株（Ｐ１．１０−１）からのＰ１．１０−１）の配
列を含む。２つのネガティブ株のループ４配列は、６個のアミノ酸ペプチドで抗ＧＮＡ３
３ポジティブ株と異なる。ポジティブＰ１．２株は、ヘキサペプチドＱＴＰＫＳＱ（配列
番号１６）またはＱＴＰＱＳＱ（配列番号１７）を含むが、ネガティブＰ１．１０株また
はＰ１．１０−１株は、ヘキサペプチドＮＫＱＮＱＲ（配列番号１８）またはＮＫＱＮＱ
Ｐ（配列番号１９）をそれぞれ含む（表２）。
【０１４５】
特に、抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂ２５によって認識される特定のアミノ酸配列を同定するた
めに、ＧＮＡ３３のアミノ酸配列全体（表３）およびＰｏｒＡ（２９９６株からのＰ１．
２−２）のループ４のアミノ酸配列全体に広がるオーバーラップ直鎖デカペプチド、Ｇｅ
ｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５７１８０）を合成した（注釈：Ｘ５７１８０中に与えられる配列
は、配列ＱＴＰＥ（配列番号２０）を有するＶＲ２をコードする）。しかしながら、この
配列はその後間違いであることが見出されている（Ｃ．Ｔ．Ｓａｃｃｈｉ、ＣＤＣ、Ａｔ
ｌａｎｔａ、ＧＡ，私信）。正しい配列はＱＴＰＱ（配列番号２１）である。ｍＡｂ２５
で８色素単位以上ポジティブであったペプチドが表３に詳述される。８個のポジティブＧ
ＮＡ３３ペプチドは全て、トリペプチドＱＴＰを共有する。ＱＴＰ配列はまた、ｍＡｂ２
５と反応した５つの全てのポジティブＰｏｒＡ Ｐ１．２ペプチドの中に存在する。しか
しながら、ＱＴＰを含むがその前のＦＶＱ配列を含まない３つのループ４ペプチドへのｍ
Ａｂ結合が存在しなかったので、ＱＴＰ配列は、抗ＧＮＡ３３結合に十分でない。
【０１４６】
抗ＧＮＡ ｍＡｂ２５結合に十分である、それぞれのタンパク質の最小ペプチド配列を
規定するために、ＡＱＡＦＱＴＰＶＨＳ（図４Ａ；配列番号６）から始めて、次第に小さ
くなるペプチド、およびＴＰＡＨＦＶＱＱＴＰ（図４Ｂ；配列番号２２）で始めてＰｏｒ
Ａ Ｐ１．２ペプチドを合成した。ｍＡｂは、ＦＱＴＰＶ（配列番号２）を含むＧＮＡ３
３ペプチド、およびＦＶＱＱＴＰ（配列番号２３）を含むＰｏｒＡ Ｐ１．２ペプチドと
強く結合したが、より小さいどのペプチドとも結合しなかった。それぞれのタンパク質に
ついて同じ最小エピトープを、ＰｏｒＡのループ４の適切なペプチドおよびＧＮＡ３３内
に含まれる、アミノ酸の体系的なアラニン置換またはグリシン置換により、同定した。Ｐ
ｏｒＡループ４ＶＲ型Ｐ１．２−２についてのアラニン置換のデータの概要について、表
４を参照のこと。
【０１４７】
これらのデータは、ｒＧＮＡ３３によって惹起された抗体が、ＱＴＰ配列を含むＰｏｒ
ＡのＰ１．２エピトープとの交差反応性の結果として、Ｐ１．２エピトープを発現するＮ
ｍ株に対して殺菌作用を有することを示唆している。
【０１４８】
（実施例４）
（抗ＧＮＡ３３抗体および抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２抗体のＰ１．２ ＮｍＢ株への比較結
合）
抗ｒＧＮＡ３３抗体がＰｏｒＡ Ｐ１．２エピトープと交差反応するという予想外の発
見は、ＰｏｒＡ血清亜型Ｐ１．２．によって惹起された抗体の活性とｒＧＮＡ３３によっ
て産出された抗体の活性を比較する機会を与えた。１つの例外を除いて、試験した９個の
Ｐ１．２株について、抗ＧＮＡ３３ｍＡｂの濃度依存結合は、コントロール抗ＰｏｒＡ
Ｐ１．２ｍＡｂの濃度依存結合と類似していた（図５Ａの８０４７株およびＢＺ２３２株
についての代表的なデータを参照のこと）。例外のＭ９８６株は、他のＰ１．２株への結
合と比較した場合に、相対的に弱い抗ＧＮＡ３３抗体結合を示した（表５Ｂ）。対照的に
、抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２ｍＡｂによる結合は、Ｍ９８６を含む全てのＰ１．２株について
同様であった。
【０１４９】
Ｍ９８６株のＶＲ２配列型はＰ１．２であると報告され（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ９
２９１２）、それは、ＦＶＱＱＴＰＫセグメント（配列番号２４）を含むループ４配列に
よって定義され、８０４７株およびＢＺ２３２（ＶＲ２型Ｐ１．２−２；表１）について
のＦＶＱＱＴＰＱ（配列番号２５）と対照的である。このＶＲ２型は、特定のＰ１．２エ
ピトープのアミノ酸配列に基づく。ＶＲ２配列型Ｐ１．２（Ｍ３７３５株およびＭ５６８
２株）を有することが報告されている他の２つの株は、それぞれの株中に、コントロール
抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２ｍＡｂのそれぞれの結合と匹敵した、強い抗ＧＮＡ３３抗体結合を
示した（例えば、Ｍ３７３５株（図１Ａ）およびＭ５６８２（図５Ｂ）を用いた結合のデ
ータ）。Ｍ９８６株、Ｍ３７３５株およびＭ５６８２株中のＰｏｒＡループ４のＶＲ２配
列型は、２回目のヌクレオチド配列決定によってＰ１．２であることが確証された。従っ
て、配列の差異（Ｑに対するＫ）は、Ｍ９８６株との減少した抗ＧＮＡ３３結合活性を説
明するために十分であることが明らかではない。
【０１５０】
（実施例５）
（殺菌活性）
ＰｏｒＡ Ｐ１．２（ｒＧＮＡ３３）に対するマウスｍＡｂ（ｍＡｂ２５）ならびに血清Ｂ型に対するマウスｍＡｂ（ＳＥＡＭ１２）および血清Ｃ型に対するマウスｍＡｂ（ｍＡＢ１８１．１）多糖莢膜に対するマウスｍＡｂの補体依存殺菌活性を比較した。ＮｍＣ株Ｍ５９５４を試験するために使用した血清Ｃ型抗莢膜ｍＡｂ（サブクラスＩｇＧ３）を除いて、他のｍＡｂの全サブクラスはＩｇＧ２ａであった。ヒト補体の存在下において抗ＰｏｒＡ Ｐ１．２ｍＡｂのＢＣ５０は、全ての９株について０．５μｇ／ｍｌ未満であった。血清Ｂ型抗莢膜ｍＡｂの対応するＢＣ５０値は高く（５〜１２μｇ／ｍｌの範囲）、そして血清Ｃ型ｍＡｂ（株Ｍ５９５４）については１μｇ／ｍｌ未満であった。表５にまとめたように、抗ＧＮＡ３３ｍＡｂの殺菌活性は多様であり、そして使用した補体供給源に依存した。３つの株（８０４７、ＮＭＢおよびＭ３７３５）について、ヒト補体の存在下において抗ＧＮＡ３３ｍＡｂのＢＣ５０値は、７〜１５μｇ／ｍｌの範囲であった。これらの株の値は、抗莢膜抗体の値と類似した。残りの６つの株（２９９６、ＢＺ２３２、Ｍ５５４５、Ｍ５６８２、Ｍ５９５４およびＭ９８６）について、ヒト補体の存在下において、抗ＧＮＡ３３ｍＡｂを用いて観察された殺傷は存在しなかった（内在性殺菌活性のない正常成体由来の血清を用いて試験した場合、ＢＣ５０は６０μｇ／ｍｌ未満（表５）であり、そして無γグロブリン血症を有する患者由来の血清を用いて試験した場合、３０μｇ／ｍｌ未満であった）。胎仔ウサギ血清を補体供給源として使用した場合、６株のうち１つを除いて全てが、抗ＧＮＡ３３誘導溶解に対して感受性であった。感受性株のＢＣ５０値は、１μｇ／ｍｌ以上８μｇ／ｍｌの範囲であった（表５）。一方、例外は株Ｍ９８６であり、ここで、ヒトおよびウサギ補体で試験した場合、抗ＧＮＡ３３ｍＡｂを用いて観察された殺傷は存在しなかった（ＢＣ５０値は、それぞれ１５０μｇ／ｍｌ超および３０μｇ／ｍｌ超である）。この株に対する細菌溶解の欠如は、フローサイトメトリーによって測定されるように、ｍＡｂのより低い表面結合に関連し得る（図５Ｂ）。試験した５株に対して、ヒト補体を用いたポリクローナルマウス抗ｒＧＮＡ３３抗血清のそれぞれの殺菌力価は、抗ＧＮＡ３３ｍＡｂ２５を用いて測定した結果と一致した（表５）。
【０１５１】
（実施例６）
（抗ＧＮＡ３３抗血清による受動性防御）
ＭｅｎＢ菌血症に対する受動性防御を与えるポリクローナルマウス抗ＧＮＡ３３抗体の
能力を、胎仔ラットモデルにおいて評価した。３株を使用した：８０４７、ヒトまたはウ
サギの補体の存在下で抗ＧＮＡ３３細菌溶解に感受性である株；ＢＺ２３２、すなわちヒ
ト補体での抗ＧＮＡ３３細菌溶解に耐性であるが、ウサギまたはラットの補体に感受性で
ある株；およびＭ９８６、すなわちヒト、ウサギまたはラットの補体の存在下で抗ＧＮＡ
３３細菌溶解に耐性である株。このモデルにおいて試験する受動性防御の結果を、表６に
まとめる。
【０１５２】
実験１において、ポリクローナルマウス抗ＧＮＡ３３抗血清の１：５または１：２５希
釈物（１００μｌ）を株８０４７の５．８×１０３ＣＦＵと混合し、そして菌血症に対し
て完全に保護したラットにｉ．ｐ．で与え、チャレンジの１８時間後に測定した。同様の
実験において、株Ｍ９８６（抗ＧＮＡ３３細菌溶解に対して耐性の株）の６．５×１０３
ＣＦＵと混合した抗ＧＮＡ３３抗血清の１：５または１：２５（１００μｌ）を与えた全
ての動物は、細菌血症を発症した。殺菌活性の欠如にかかわらず、抗ＧＮＡ３３抗血清で
処理し、そして株Ｍ９８６でチャレンジした動物血液の幾何平均ＣＦＵ／ｍｌは、Ｅ．ｃ
ｏｌｉタンパク質に対して調製したネガティブコントロール抗血清を用いて試験したコン
トロール動物よりも、１０〜２０培低かった（Ｐ＝０．０２）。同様の結果は、抗ＧＮＡ
３３ｍＡｂ２５を用いた第２の実験（実験２）において観察された。全６匹のラットを、
ｉ．ｐ．によりｍＡｂ２５の２０μｇで前処理し（時点０）、２時間後に株Ｍ９８６の３
．５×１０３ＣＦＵでチャレンジし、チャレンジの１８時間後に採集した血液サンプルに
は細菌が存在した。しかし、幾何平均ＣＦＵ／ｍｌは、無関係のｍＡｂを用いて前処理し
たコントロール動物の幾何平均ＣＦＵ／ｍｌの０．３％よりも少なかった（ｐ＜０．０２
）。同様の実験において、ラット１匹あたり２０μｇの抗Ｐ１．２ｍＡｂは、株Ｍ９８６
に対して完全な防御であり、そしてラット１匹あたり２μｇは部分的防御であった（試験
した６匹のうち１匹のみが菌血症を発症した）。
【０１５３】
第３および第４（実験３および４）において、ラットを株ＢＺ２３２（ヒト補体での抗
ＧＮＡ３３細菌溶解に耐性であるが、ウサギまたはラットの補体に感受性である）でチャ
レンジした。この実験において、この株に対する抗ＧＮＡ３３ｍＡｂの保護活性は、コン
トロールの抗莢膜抗体の防御活性と同じであるか、または高く、そして抗ＰｏｒＡ Ｐ１
．２ｍＡｂの防御活性よりもわずかに少ないだけである。
【０１５４】
上に示すように、ｒＧＮＡ３３を用いた免疫の結果として生じたマウス抗体は、補体の
存在下においてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株の細菌溶解を媒介し得る。なぜなら、抗
ＧＮＡ３３抗体と、ポーリン（ｐｏｒｉｎ）タンパク質（ＰｏｒＡ）のＰ１．２エピトー
プとの交差活性に起因するからである。この結果は、予測した結果ではなかった。なぜな
ら、ＧＮＡ３３およびＰｏｒＡは十分な配列相同性を有しておらず、構造的および機能的
に関連がなく、そして異なる細菌的亜構造に物理的に局在するからである。従って、ＧＮ
Ａ３３はＰｏｒＡの免疫学的模倣物として記載され得る。
【０１５５】
ＧＮＡ３３によって示される分子模倣は例外的である。第１に、ＧＮＡ３３は上記のよ
うな非免疫グロブリンタンパク質であり、ＰｏｒＡとは関連がない。第２に、ｒＧＡＮ３
３は抗体反応を誘発し、これは、（多くの点において）外部膜ビヒクル調製物におけるネ
イティブなＰｏｒＡによって誘発される抗体反応と機能活性が類似する。第３に、本明細
書中に記載されるポリクローナルマウス抗ｒＧＮＡ３３抗血清を、２つの独立した研究室
において調製し、そして殺菌データを独立して繰り返した。
【０１５６】
以前の研究において、ＰｏｒＡ Ｐ１．２のループ４に対応するペプチドを用いた免疫
は、ネイティブタンパク質に結合されたか、または補体の存在下で細菌溶解を媒介する抗
体を惹起することに失敗した（ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ（１９９０
）１７１：１８７１−１８７２）。おそらく、より小さなペプチドフラグメントは、ネイ
ティブポーリンに示される安定なコンフォメーションをとることは出来なかった。同様に
、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｕｓにおいて発現されるｒＰｏｒＡを用いた免疫
は、組換えタンパク質において表面受容可能なＰｏｒＡエピトープのコンフォメーション
がリポソームまたは界面活性剤を用いて再構築される場合を除いては、殺菌抗体を惹起す
ることに失敗した（Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１
９９８）１４４：３０２７−３０３７およびＩｄａｎｐａａｎ−Ｈｅｉｋｋｉｌａら、Ｖ
ａｃｃｉｎｅ（１９９５）１３：１５０１−１５０８）。これらの結果は、殺菌抗体の惹
起を担うＰｏｒＡのエピトープが立体的であることを示唆する。対照的に、本明細書中に
示されるように、ｒＧＮＡ３３模倣物を用いた免疫は、ＰｏｒＡループ４のＰ１．２エピ
トープと交差反応する殺菌抗体を惹起した。ｒＰｏｒＡと違って、免疫源として使用され
る組換えＧＮＡ３３タンパク質が、組換え分子の再生についての必要性を有さず、フロイ
ントのアジュバントと単に混合される場合に、これが生じる。
【０１５７】
従って、ＧＮＡ３３ポリペプチド、エピトープ、ＧＮＡ３３に対して指向された抗体お
よびこれらの分子の使用は、記載されている。上記より、本発明の特定の実施形態が本明
細書中に、例示目的のために記載されているが、種々の改変が、添付の特許請求の範囲に
よって規定される精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【０１５８】
【表１】
【０１５９】
【表２】
【０１６０】
【表３】
【０１６１】
【表４】
【０１６２】
【表５】
【０１６３】
【表６】
Ａ実験１において、細菌を、ｉ．ｐ．によるチャンレンジの直前に、抗血清またはコント
ロールｍＡｂと一緒に混合した。実験２、３および４において、０時間において、動物を
ｍＡｂを用いてｉ．ｐ．で処理した。２時間後、その動物を、細菌を用いてｉ．ｐ．チャ
レンジした。両方の実験において、血液培養物をチャレンジの１８時間後に得た。
Ｂ幾何平均のＣＦＵ／ｍｌの計算のために、滅菌培地を用いた動物に、１ＣＦＵ／ｍｌの
値を割り当てた。実験１において、抗ＧＮＡ３３抗血清の１：５または１．２５希釈を与
えそして、株Ｍ９８６（２８．８×１０３）でチャレンジした動物の組み合わせ群の幾何
平均ＣＦＵ／ｍｌは、無関係なｍＡｂまたはＥ．ｃｏｌｉ抗血清（３５０×１０３、Ｐ＝
０．０２）を与えたコントロールの組み合わせた群のものよりも低かった。実験２、３お
よび４において、抗ＧＮＡ３３ ｍＡｂで処置された動物の幾何平均ＣＦＵ／ｍｌは、無
関係なｍＡｂを与えたコントロールの物より低かった（Ｐ＜０．０２）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載のペプチド。
【請求項１】
明細書に記載のペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−１１８６８（Ｐ２０１０−１１８６８Ａ）
【公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３８７８４（Ｐ２００９−２３８７８４）
【出願日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【分割の表示】特願２００８−７４７０８（Ｐ２００８−７４７０８）の分割
【原出願日】平成１４年４月１１日（２００２．４．１１）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【出願人】（５０３３７７４６７）チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター オークランド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【分割の表示】特願２００８−７４７０８（Ｐ２００８−７４７０８）の分割
【原出願日】平成１４年４月１１日（２００２．４．１１）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【出願人】（５０３３７７４６７）チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター オークランド (2)
【Ｆターム（参考）】
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