歯周炎を治療又は予防するための組成物
【課題】 経口投与により、歯周炎を効果的に治療又は予防することができる食品又は医薬組成物を提供する。
【解決手段】 Porphyromonas gingivalisに由来するプロテアーゼ、トリプシン、血球凝集素又はヘモグロビンレセプターで免疫した鳥類が産生した卵又はその処理物を含む、歯周炎を治療又は予防するための食品又は医薬組成物。
【解決手段】 Porphyromonas gingivalisに由来するプロテアーゼ、トリプシン、血球凝集素又はヘモグロビンレセプターで免疫した鳥類が産生した卵又はその処理物を含む、歯周炎を治療又は予防するための食品又は医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周炎を治療又は予防するのに有効な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周炎とはその名のごとく、口腔の内側に炎症が生じる疾患の総称で、歯ぐきから血や膿が出る、歯ぐきが腫れた、歯ぐきが下がって根っこが伸びたようにみえる、歯がぐらぐら動く、又はぐらぐらが大きくなって、歯が抜けた（又は抜かれた）、口臭がするなどの症状があれば歯周病が疑われる。人によって症状は様々で、歯ぐきの炎症が強い人や、一見健康そうにみえるけれども歯と歯肉の境目（歯周ポケット）が深くなっている人もいる。レントゲン写真をとると、骨が吸収してみえることもある。歯周病の原因はプラーク（歯垢）である。プラークは歯を磨かないでいると、ねばねばくっついてくるもので、単なる食べかすではなく、７０％は細菌の塊である。プラーク中には約３００種類の細菌がいるが、そのほとんどは常在菌といって、無害な菌である。プラークが付きっぱなしになっていると無害な菌には住みにくい環境となり、歯ぐきに近いところでは歯周病の原因と考えられている菌の勢力が拡大し、これが歯ぐきの炎症の原因となる。最初に歯ぐきの炎症がおきたときは、歯と歯ぐきをつないでいる部分は壊れていない。これを歯肉炎という。この状態からプラークを取り除けば、また健康な状態に回復する。歯肉炎のまま、プラークが付きっぱなしになっていると、歯と歯ぐきをつないでいる部分が壊され、境目が深くなる（歯周ポケット）。歯ぐきの薄い部分では歯周ポケットになる厚みがないと、歯ぐきが全体的に下がる（歯肉退縮）。また、骨は炎症から逃げるために吸収していく（骨吸収）。これらの状態を歯周炎という。歯周ポケット内の炎症により、ポケットは更に深くなり、その部分にプラークが入り込んでというようにして、歯を支える部分が少なくなる。歯はぐらぐら動くようになり、最終的には支える部分がなくなって、歯が抜ける。
【０００３】
これまで報告された歯周炎の患者では、口腔内フローラに特徴があること、血中の口腔内菌に対する抗体価が高いこと、更に歯周炎に対する抗生剤投与が一定の効果を上げていることから、歯周炎は、特にPorphyromonas gingivalisなどの常在性の口腔内菌が深く関与している病気であるという認識が定着してきた。
【０００４】
特許文献１には、特定のアミノ酸配列を有するPorphyromonas gingivalis由来の抗原に対する抗体を含む洗口剤又は歯磨き剤を患者に適用することにより歯周炎を治療する方法が開示されている。また、特許文献２には、Porphyromonas gingivalisのリポ多糖に結合する抗体を含む口腔洗浄剤、エーロゾル、ペースト又は軟膏を患者に適用することにより歯周炎を治療する方法が開示されている。
【０００５】
しかしながら、Porphyromonas gingivalisに由来するプロテアーゼ、トリプシン、血球凝集素又はヘモグロビンレセプターを抗原として鳥類を免疫し、該鳥類から得られた卵又はその処理物を歯周病を治療又は予防するために使用することについては知られていない。
【特許文献１】特表２００１−５０１８０８号公報
【特許文献２】特表平９−５１１２２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、経口投与により、歯周炎を効果的に治療又は予防することができる食品又は医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Porphyromonas gingivalisに由来するプロテアーゼ、トリプシン、血球凝集素又はヘモグロビンレセプターを抗原とし、これで鳥類を免疫した場合、得られる卵の卵黄中に抗体が蓄積され、この卵黄から分画される水溶性分画物を、歯周炎を治療・予防するための組成物に配合することにより、本発明をなすに至ったものである。
【０００８】
即ち、本発明は、Porphyromonas gingivalisに由来するプロテアーゼ、トリプシン、血球凝集素又はヘモグロビンレセプターで免疫した鳥類が産生した卵又はその処理物、ならびに該卵又はその処理物を含む、歯周炎を治療又は予防するための食品又は医薬組成物である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の食品又は医薬組成物は、歯周炎を誘導する各原因因子を制御し、歯周炎の治療と予防に効果的に使用されると共に、食品又は医薬組成物の調製上安全性に難点がないものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において、Porphyromonas gingivalisに由来するプロテアーゼ、トリプシン、血球凝集素又はヘモグロビンレセプターで免疫する鳥類としては、特に限定されないが、通常、鶏、鶉、アヒル等の家禽が挙げられる。抗体の量産性という観点から、鶏、特に、産卵種を用いるのが好ましい。
【００１１】
本発明に用いるPorphyromonas gingivalisはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から購入し、プロテアーゼ、トリプシン、血球凝集素又はヘモグロビンレセプターを抽出し、免疫抗原に使うことができる。
【００１２】
Porphyromonas gingivalisに由来するプロテアーゼとしては、例えばリジン特異的プロテアーゼ（以下「ＫＧＰ」という。）、アルギニン特異的プロテアーゼ（以下「ＲＧＰ」という。）が挙げられる。これらのプロテアーゼは、例えば、Porphyromonas gingivalisの培養液より菌体を除去した後、硫安精製およびアフィニティークロマトグラフィー等で精製することにより得ることができる。
【００１３】
本発明は、前記抗原を用いて鳥類に免疫することによって得られる抗体を含有する物又は水溶性卵黄分画物等を口腔用組成物に配合するものである。また、鳥類に免疫する方法としては抗原単独又は２種以上を組み合わせて免疫することができ、その際アジュバントと共に皮下、筋肉内、鼻又は目へ免疫する方法、飼料又は水と共に経口的に免疫する方法等、通常の方法が採用できる。鳥類を前記の抗原で免疫する際には、必要に応じてフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、オイルアジュバント又はアルミニウムアジュバント等のアジュバントを用いることもできる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、１〜１０回の免疫を行う。通常、初回免疫から数週間で投与抗原に対して特異的に反応する抗体が卵、特に卵黄中に得られる。接種する抗原量はタンパク質量で、０．０１〜１０ｍｇが好適に用いられる。
【００１４】
卵中の抗体価は、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は中和反応等を用いて測定することができ、免疫後に２週程度の間隔で抗体価を測定することにより抗体価の推移を追跡できる。通常、約４ヶ月間にわたって高い抗体価を得ることができる。なお、免疫後、抗体価の減少が見られた場合、適当な間隔で適宜追加免疫することにより抗体価を高く維持することができる。
【００１５】
本発明において、卵処理物は、鳥類の免疫に使用した各免疫原に対する抗体を含むものであれば特に制限されず、例えば、免疫した卵の全卵、卵黄及び卵白、これらの卵液及び溶液、ならびに卵液をプロパノールやクロロホルムを用いて抽出した抽出物等が含まれる。含まれる抗体の量の観点から、卵黄成分を含むことが好ましい。スプレードライ法や凍結乾燥法などにより粉末化したものも含まれる。また、卵黄に水を加えて脂質成分を除去したり、卵黄からヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸や、プロパノール、エタノール、ヘキサン等の有機溶剤などを用いる方法により卵黄脂質成分を除去したりした後粉末化したものも含まれる。このような粉末をペースト状又は液状にしたものも含まれる。更に、本発明において卵の処理物には、硫酸アンモニウム塩析、硫酸ナトリウム塩析、低温エタノール沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法により卵から精製された抗体自体をも包含される。処理物の保存性を高めるためには、殺菌した全卵液卵又は卵黄液卵をスプレードライ又は凍結乾燥して粉末化するのが好ましい。
【００１６】
本発明の卵及び卵処理物は、抗体価が100倍以上、好ましくは12,800倍以上、更に好ましくは1,280,000倍であることを特徴とする。前記の抗体価は、ELISAによって測定することができる。
【００１７】
前記のようにして得られる卵及び卵処理物は、歯周炎の治療又は予防に有効である。
したがって、本発明の卵又はその処理物を、特定保健用食品等の食品又は医薬組成物に配合することにより、歯周炎を治療又は予防するための組成物を製造することができる。
【００１８】
本発明の卵又はその処理物を使用する食品は、特に制限されないが、通常の製法において卵を含有する食品、例えば、ヨーグルト、プリン、アイスクリーム、キャンディ、ガム及びマヨネーズ等が好ましい。また、医療用食品流動食や、茶飲料、ココア飲料、乳飲料、発酵乳飲料、等の飲料に配合することもできる。一般食品に対して配合する場合は、食品に対して、粉末状の有効成分の場合、0.001〜15重量％、特に0.1〜5重量％配合することが好ましいが、食品の種類によって前記の範囲よりも少なく又は多く配合することができる。
また、本発明の卵又はその処理物は、医薬組成物の製造に使用することができる。
【００１９】
本発明の卵又はその処理物は、通常の製剤化法により、そのままあるいは慣用の添加剤と共に、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、液剤などの経口用製剤とすることができる。添加剤には、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤、矯味剤などがあり、必要に応じて使用する。口腔内で長時間作用できるように徐放化するためには、既知の遅延剤等でコーティングすることもできる。賦形剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、軽質無水ケイ酸、ゼラチン、結晶セルロース、ソルビトール、タルク、デキストリン、デンプン、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム等が使用できる。結合剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、エタノール、エチルセルロース、カゼインナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、精製水、ゼラチン、デンプン、トラガント、乳糖、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類等が挙げられる。抗酸化剤としては、トコフェロール、没食子酸エステル、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸等が挙げられる。更に、必要に応じてその他の添加剤や薬剤、例えば抗生剤、抗ＴＮＦ−α抗体を加えてもよい。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
（実施例１）免疫原の調製及び免疫感作
Porphyromonas gingivalis (Bacteroides gingivalis) ＡＴＣＣ３３２７７株をトリプチケースソイブロース（ＢＢＬ社）で３７℃で４８時間嫌気培養した後、８０００ｒｐｍ、１５分間の遠心で培養上清を集め、４０％硫安塩析法により粗製プロテアーゼを得た。Ｍｏｎｏ−Ｑ高速液体クロマトグラフィー（ファルマシア）を用いて１Ｍ食塩添加緩衝液で溶出を行った。この溶出液からアルギニン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファルマシア）のアフィニティークロマトグラフィーにより精製を行った。ＫＧＰは０．７５Ｍ Ｌ−リジン（ｐＨ７．４）で溶出を行い、ＲＧＰは１Ｍ Ｌ−アルギニン（ｐＨ７．４）で溶出を行った。
【００２１】
精製した各蛋白質は、約０．０１から０．１ｍｇを用いてフロイント完全アジュバントと混合し、１２週齢の雌鶏の左右胸筋に１ｍｌずつ注射することにより１回目の免疫を行った。同様にして、６週間後に２回目の免疫を行った。
【００２２】
（実施例２）卵黄から抗体（ＩｇＹ）の精製
免疫した鶏から卵を採取し、卵黄と卵白に分け、卵黄に等量の水を加え、０．５％のλ−カラギナンの懸濁液を加え、撹拌後８０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を採取した。更に、３０％硫酸アンモニウムによる分画沈殿を３回繰り返し、０．１５Ｍ−ＮａＣｌ水溶液で透析後、０．４５μｍのフィルターで濾過を行い、濾液を採取した。
【００２３】
抗Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼＫＧＰ抗体、抗Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼＲＧＰ抗体の各抗原に対するＥＬＩＳＡ抗体価は、共に１，２８０，０００倍であった。また非免疫鶏より集めた卵より同様に作成したサンプルの抗体価は１００倍以下であった。
【００２４】
（実施例３）細胞に基づく付着阻止試験
Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼＫＧＰ、Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼＲＧＰをそれぞれ抗原として、実施例２に記載の方法で各抗原に対する抗体を含む試料をそれぞれ作成した。これらの各試料またはその混合物をPorphyromonas gingivalisとそれぞれ混合した後、２４穴プレートに培養したヒト歯肉上皮ガン細胞（ＫＢ細胞）に添加した。３７℃で２時間培養した後、ＰＢＳで洗浄し、Porphyromonas gingivalisの残存細胞数を計算した。
【００２５】
結果を表１に示す。表１から明らかなように、抗Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼＫＧＰ抗体および抗Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼＲＧＰ抗体、およびその混合物はPorphyromonas gingivalisの細胞への付着を有意に阻止した。
【００２６】
【表１】
【００２７】
（実施例４）抗Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼ抗体の効果試験
本試験には、抗Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼ抗体（抗ＫＧＰ抗体と抗ＲＧＰ抗体の混合物）を用いてボランティア試験を行った。試験はJ. Clin. Periodontol 2003; 30: 590-594記載の方法に従って行った。０．１％水溶液を用いて、１日３回２週間うがいを行った。試験開始前と試験終了時にプラーク・インデックス、ジンジバール・インデックス及びブレーディング・インデックスを測定して歯周炎の評価を行った。
試験群（１０人／群）
１）抗Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼ抗体（抗ＫＧＰ抗体と抗ＲＧＰ抗体の混合物）
２）無投与（陰性対照群）
結果を表２に示す。表２から明らかなように、抗Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼ抗体投与群は、無投与群（陰性対照群）に比し、歯周炎スコアが低下した。
【００２８】
【表２】
【００２９】
（製造例１）歯周炎予食用ヨーグルト
【００３０】
【表３】
【００３１】
（製造例２）細粒剤
下記の配合にて、湿式造粒法を用いて造粒を行い、細粒剤を得た。
【００３２】
【表４】
【００３３】
（製造例３）医療用流動食
下記の配合にて、医療用流動食を製造した。少量の水にミネラル類、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムを加え攪拌した後、本発明卵黄脱脂粉末、マルトデキストリン、カゼインナトリウム、乳化剤、乳タンパク質、少量の水を加え、５０℃程度まで加温し攪拌した。懸濁後室温まで冷却し、植物油、ビタミン類、香料、安定剤、残りの水を加え、本発明卵黄脱脂粉末入り医療用流動食を得た。
【００３４】
【表５】
【００３５】
（製造例４）錠剤
通常の湿式顆粒圧縮法にて錠剤を得た。
【００３６】
【表６】
【００３７】
（製造例５）茶飲料
以下の配合により、次のようにして茶飲料（緑茶飲料及びウーロン茶飲料）を製造した。水１００ｍｌに対し、緑茶３ｇを８５℃で５分間抽出した緑茶抽出液を調製した。あるいは、水１００ｍｌに対し、ウーロン茶４ｇを９５℃で５分間抽出したウーロン茶抽出液を調製した。本発明卵黄水溶性分画粉末とその５倍量の緑茶抽出液又はウーロン茶抽出液を加え攪拌した。本発明卵黄水溶性分画粉末を懸濁した後、残りの茶抽出液を加え、本発明卵黄水溶性分画粉末入り茶飲料を得た。
【００３８】
【表７】
【００３９】
（製造例６）ココア飲料
下記の配合にてココア飲料を製造した。本発明卵黄水溶性分画粉末にココア（森永乳業製）を加え攪拌した。本発明卵黄水溶性分画粉末の５倍量のお湯（６０℃程度）を加え、攪拌・懸濁した。懸濁後、残りのお湯と牛乳を加え、ココア飲料を得た。
【００４０】
【表８】
【００４１】
（製造例７）発酵乳飲料
本発明卵黄水溶性分画粉末５ｇに乳酸菌入り発酵乳（ヤクルト社製）２５ｇを加え懸濁した。懸濁後、乳酸菌入り発酵乳７０ｇを加え、本発明卵黄水溶性分画粉末入り発酵乳飲料を得た。
【００４２】
（製造例８）乳飲料
本発明卵黄水溶性分画粉末５ｇに牛乳２５ｇを加え、懸濁した。懸濁後、牛乳７０ｇを加え、本発明卵黄水溶性分画粉末入り乳飲料を得た。
【００４３】
（製造例９）アイスクリーム
【００４４】
【表９】
【００４５】
（製造例１０）チューインガム
【００４６】
【表１０】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周炎を治療又は予防するのに有効な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周炎とはその名のごとく、口腔の内側に炎症が生じる疾患の総称で、歯ぐきから血や膿が出る、歯ぐきが腫れた、歯ぐきが下がって根っこが伸びたようにみえる、歯がぐらぐら動く、又はぐらぐらが大きくなって、歯が抜けた（又は抜かれた）、口臭がするなどの症状があれば歯周病が疑われる。人によって症状は様々で、歯ぐきの炎症が強い人や、一見健康そうにみえるけれども歯と歯肉の境目（歯周ポケット）が深くなっている人もいる。レントゲン写真をとると、骨が吸収してみえることもある。歯周病の原因はプラーク（歯垢）である。プラークは歯を磨かないでいると、ねばねばくっついてくるもので、単なる食べかすではなく、７０％は細菌の塊である。プラーク中には約３００種類の細菌がいるが、そのほとんどは常在菌といって、無害な菌である。プラークが付きっぱなしになっていると無害な菌には住みにくい環境となり、歯ぐきに近いところでは歯周病の原因と考えられている菌の勢力が拡大し、これが歯ぐきの炎症の原因となる。最初に歯ぐきの炎症がおきたときは、歯と歯ぐきをつないでいる部分は壊れていない。これを歯肉炎という。この状態からプラークを取り除けば、また健康な状態に回復する。歯肉炎のまま、プラークが付きっぱなしになっていると、歯と歯ぐきをつないでいる部分が壊され、境目が深くなる（歯周ポケット）。歯ぐきの薄い部分では歯周ポケットになる厚みがないと、歯ぐきが全体的に下がる（歯肉退縮）。また、骨は炎症から逃げるために吸収していく（骨吸収）。これらの状態を歯周炎という。歯周ポケット内の炎症により、ポケットは更に深くなり、その部分にプラークが入り込んでというようにして、歯を支える部分が少なくなる。歯はぐらぐら動くようになり、最終的には支える部分がなくなって、歯が抜ける。
【０００３】
これまで報告された歯周炎の患者では、口腔内フローラに特徴があること、血中の口腔内菌に対する抗体価が高いこと、更に歯周炎に対する抗生剤投与が一定の効果を上げていることから、歯周炎は、特にPorphyromonas gingivalisなどの常在性の口腔内菌が深く関与している病気であるという認識が定着してきた。
【０００４】
特許文献１には、特定のアミノ酸配列を有するPorphyromonas gingivalis由来の抗原に対する抗体を含む洗口剤又は歯磨き剤を患者に適用することにより歯周炎を治療する方法が開示されている。また、特許文献２には、Porphyromonas gingivalisのリポ多糖に結合する抗体を含む口腔洗浄剤、エーロゾル、ペースト又は軟膏を患者に適用することにより歯周炎を治療する方法が開示されている。
【０００５】
しかしながら、Porphyromonas gingivalisに由来するプロテアーゼ、トリプシン、血球凝集素又はヘモグロビンレセプターを抗原として鳥類を免疫し、該鳥類から得られた卵又はその処理物を歯周病を治療又は予防するために使用することについては知られていない。
【特許文献１】特表２００１−５０１８０８号公報
【特許文献２】特表平９−５１１２２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、経口投与により、歯周炎を効果的に治療又は予防することができる食品又は医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Porphyromonas gingivalisに由来するプロテアーゼ、トリプシン、血球凝集素又はヘモグロビンレセプターを抗原とし、これで鳥類を免疫した場合、得られる卵の卵黄中に抗体が蓄積され、この卵黄から分画される水溶性分画物を、歯周炎を治療・予防するための組成物に配合することにより、本発明をなすに至ったものである。
【０００８】
即ち、本発明は、Porphyromonas gingivalisに由来するプロテアーゼ、トリプシン、血球凝集素又はヘモグロビンレセプターで免疫した鳥類が産生した卵又はその処理物、ならびに該卵又はその処理物を含む、歯周炎を治療又は予防するための食品又は医薬組成物である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の食品又は医薬組成物は、歯周炎を誘導する各原因因子を制御し、歯周炎の治療と予防に効果的に使用されると共に、食品又は医薬組成物の調製上安全性に難点がないものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において、Porphyromonas gingivalisに由来するプロテアーゼ、トリプシン、血球凝集素又はヘモグロビンレセプターで免疫する鳥類としては、特に限定されないが、通常、鶏、鶉、アヒル等の家禽が挙げられる。抗体の量産性という観点から、鶏、特に、産卵種を用いるのが好ましい。
【００１１】
本発明に用いるPorphyromonas gingivalisはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から購入し、プロテアーゼ、トリプシン、血球凝集素又はヘモグロビンレセプターを抽出し、免疫抗原に使うことができる。
【００１２】
Porphyromonas gingivalisに由来するプロテアーゼとしては、例えばリジン特異的プロテアーゼ（以下「ＫＧＰ」という。）、アルギニン特異的プロテアーゼ（以下「ＲＧＰ」という。）が挙げられる。これらのプロテアーゼは、例えば、Porphyromonas gingivalisの培養液より菌体を除去した後、硫安精製およびアフィニティークロマトグラフィー等で精製することにより得ることができる。
【００１３】
本発明は、前記抗原を用いて鳥類に免疫することによって得られる抗体を含有する物又は水溶性卵黄分画物等を口腔用組成物に配合するものである。また、鳥類に免疫する方法としては抗原単独又は２種以上を組み合わせて免疫することができ、その際アジュバントと共に皮下、筋肉内、鼻又は目へ免疫する方法、飼料又は水と共に経口的に免疫する方法等、通常の方法が採用できる。鳥類を前記の抗原で免疫する際には、必要に応じてフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、オイルアジュバント又はアルミニウムアジュバント等のアジュバントを用いることもできる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、１〜１０回の免疫を行う。通常、初回免疫から数週間で投与抗原に対して特異的に反応する抗体が卵、特に卵黄中に得られる。接種する抗原量はタンパク質量で、０．０１〜１０ｍｇが好適に用いられる。
【００１４】
卵中の抗体価は、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は中和反応等を用いて測定することができ、免疫後に２週程度の間隔で抗体価を測定することにより抗体価の推移を追跡できる。通常、約４ヶ月間にわたって高い抗体価を得ることができる。なお、免疫後、抗体価の減少が見られた場合、適当な間隔で適宜追加免疫することにより抗体価を高く維持することができる。
【００１５】
本発明において、卵処理物は、鳥類の免疫に使用した各免疫原に対する抗体を含むものであれば特に制限されず、例えば、免疫した卵の全卵、卵黄及び卵白、これらの卵液及び溶液、ならびに卵液をプロパノールやクロロホルムを用いて抽出した抽出物等が含まれる。含まれる抗体の量の観点から、卵黄成分を含むことが好ましい。スプレードライ法や凍結乾燥法などにより粉末化したものも含まれる。また、卵黄に水を加えて脂質成分を除去したり、卵黄からヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸や、プロパノール、エタノール、ヘキサン等の有機溶剤などを用いる方法により卵黄脂質成分を除去したりした後粉末化したものも含まれる。このような粉末をペースト状又は液状にしたものも含まれる。更に、本発明において卵の処理物には、硫酸アンモニウム塩析、硫酸ナトリウム塩析、低温エタノール沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法により卵から精製された抗体自体をも包含される。処理物の保存性を高めるためには、殺菌した全卵液卵又は卵黄液卵をスプレードライ又は凍結乾燥して粉末化するのが好ましい。
【００１６】
本発明の卵及び卵処理物は、抗体価が100倍以上、好ましくは12,800倍以上、更に好ましくは1,280,000倍であることを特徴とする。前記の抗体価は、ELISAによって測定することができる。
【００１７】
前記のようにして得られる卵及び卵処理物は、歯周炎の治療又は予防に有効である。
したがって、本発明の卵又はその処理物を、特定保健用食品等の食品又は医薬組成物に配合することにより、歯周炎を治療又は予防するための組成物を製造することができる。
【００１８】
本発明の卵又はその処理物を使用する食品は、特に制限されないが、通常の製法において卵を含有する食品、例えば、ヨーグルト、プリン、アイスクリーム、キャンディ、ガム及びマヨネーズ等が好ましい。また、医療用食品流動食や、茶飲料、ココア飲料、乳飲料、発酵乳飲料、等の飲料に配合することもできる。一般食品に対して配合する場合は、食品に対して、粉末状の有効成分の場合、0.001〜15重量％、特に0.1〜5重量％配合することが好ましいが、食品の種類によって前記の範囲よりも少なく又は多く配合することができる。
また、本発明の卵又はその処理物は、医薬組成物の製造に使用することができる。
【００１９】
本発明の卵又はその処理物は、通常の製剤化法により、そのままあるいは慣用の添加剤と共に、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、液剤などの経口用製剤とすることができる。添加剤には、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤、矯味剤などがあり、必要に応じて使用する。口腔内で長時間作用できるように徐放化するためには、既知の遅延剤等でコーティングすることもできる。賦形剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、軽質無水ケイ酸、ゼラチン、結晶セルロース、ソルビトール、タルク、デキストリン、デンプン、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム等が使用できる。結合剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、エタノール、エチルセルロース、カゼインナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、精製水、ゼラチン、デンプン、トラガント、乳糖、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類等が挙げられる。抗酸化剤としては、トコフェロール、没食子酸エステル、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸等が挙げられる。更に、必要に応じてその他の添加剤や薬剤、例えば抗生剤、抗ＴＮＦ−α抗体を加えてもよい。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
（実施例１）免疫原の調製及び免疫感作
Porphyromonas gingivalis (Bacteroides gingivalis) ＡＴＣＣ３３２７７株をトリプチケースソイブロース（ＢＢＬ社）で３７℃で４８時間嫌気培養した後、８０００ｒｐｍ、１５分間の遠心で培養上清を集め、４０％硫安塩析法により粗製プロテアーゼを得た。Ｍｏｎｏ−Ｑ高速液体クロマトグラフィー（ファルマシア）を用いて１Ｍ食塩添加緩衝液で溶出を行った。この溶出液からアルギニン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ファルマシア）のアフィニティークロマトグラフィーにより精製を行った。ＫＧＰは０．７５Ｍ Ｌ−リジン（ｐＨ７．４）で溶出を行い、ＲＧＰは１Ｍ Ｌ−アルギニン（ｐＨ７．４）で溶出を行った。
【００２１】
精製した各蛋白質は、約０．０１から０．１ｍｇを用いてフロイント完全アジュバントと混合し、１２週齢の雌鶏の左右胸筋に１ｍｌずつ注射することにより１回目の免疫を行った。同様にして、６週間後に２回目の免疫を行った。
【００２２】
（実施例２）卵黄から抗体（ＩｇＹ）の精製
免疫した鶏から卵を採取し、卵黄と卵白に分け、卵黄に等量の水を加え、０．５％のλ−カラギナンの懸濁液を加え、撹拌後８０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を採取した。更に、３０％硫酸アンモニウムによる分画沈殿を３回繰り返し、０．１５Ｍ−ＮａＣｌ水溶液で透析後、０．４５μｍのフィルターで濾過を行い、濾液を採取した。
【００２３】
抗Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼＫＧＰ抗体、抗Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼＲＧＰ抗体の各抗原に対するＥＬＩＳＡ抗体価は、共に１，２８０，０００倍であった。また非免疫鶏より集めた卵より同様に作成したサンプルの抗体価は１００倍以下であった。
【００２４】
（実施例３）細胞に基づく付着阻止試験
Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼＫＧＰ、Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼＲＧＰをそれぞれ抗原として、実施例２に記載の方法で各抗原に対する抗体を含む試料をそれぞれ作成した。これらの各試料またはその混合物をPorphyromonas gingivalisとそれぞれ混合した後、２４穴プレートに培養したヒト歯肉上皮ガン細胞（ＫＢ細胞）に添加した。３７℃で２時間培養した後、ＰＢＳで洗浄し、Porphyromonas gingivalisの残存細胞数を計算した。
【００２５】
結果を表１に示す。表１から明らかなように、抗Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼＫＧＰ抗体および抗Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼＲＧＰ抗体、およびその混合物はPorphyromonas gingivalisの細胞への付着を有意に阻止した。
【００２６】
【表１】
【００２７】
（実施例４）抗Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼ抗体の効果試験
本試験には、抗Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼ抗体（抗ＫＧＰ抗体と抗ＲＧＰ抗体の混合物）を用いてボランティア試験を行った。試験はJ. Clin. Periodontol 2003; 30: 590-594記載の方法に従って行った。０．１％水溶液を用いて、１日３回２週間うがいを行った。試験開始前と試験終了時にプラーク・インデックス、ジンジバール・インデックス及びブレーディング・インデックスを測定して歯周炎の評価を行った。
試験群（１０人／群）
１）抗Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼ抗体（抗ＫＧＰ抗体と抗ＲＧＰ抗体の混合物）
２）無投与（陰性対照群）
結果を表２に示す。表２から明らかなように、抗Porphyromonas gingivalis産生プロテアーゼ抗体投与群は、無投与群（陰性対照群）に比し、歯周炎スコアが低下した。
【００２８】
【表２】
【００２９】
（製造例１）歯周炎予食用ヨーグルト
【００３０】
【表３】
【００３１】
（製造例２）細粒剤
下記の配合にて、湿式造粒法を用いて造粒を行い、細粒剤を得た。
【００３２】
【表４】
【００３３】
（製造例３）医療用流動食
下記の配合にて、医療用流動食を製造した。少量の水にミネラル類、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムを加え攪拌した後、本発明卵黄脱脂粉末、マルトデキストリン、カゼインナトリウム、乳化剤、乳タンパク質、少量の水を加え、５０℃程度まで加温し攪拌した。懸濁後室温まで冷却し、植物油、ビタミン類、香料、安定剤、残りの水を加え、本発明卵黄脱脂粉末入り医療用流動食を得た。
【００３４】
【表５】
【００３５】
（製造例４）錠剤
通常の湿式顆粒圧縮法にて錠剤を得た。
【００３６】
【表６】
【００３７】
（製造例５）茶飲料
以下の配合により、次のようにして茶飲料（緑茶飲料及びウーロン茶飲料）を製造した。水１００ｍｌに対し、緑茶３ｇを８５℃で５分間抽出した緑茶抽出液を調製した。あるいは、水１００ｍｌに対し、ウーロン茶４ｇを９５℃で５分間抽出したウーロン茶抽出液を調製した。本発明卵黄水溶性分画粉末とその５倍量の緑茶抽出液又はウーロン茶抽出液を加え攪拌した。本発明卵黄水溶性分画粉末を懸濁した後、残りの茶抽出液を加え、本発明卵黄水溶性分画粉末入り茶飲料を得た。
【００３８】
【表７】
【００３９】
（製造例６）ココア飲料
下記の配合にてココア飲料を製造した。本発明卵黄水溶性分画粉末にココア（森永乳業製）を加え攪拌した。本発明卵黄水溶性分画粉末の５倍量のお湯（６０℃程度）を加え、攪拌・懸濁した。懸濁後、残りのお湯と牛乳を加え、ココア飲料を得た。
【００４０】
【表８】
【００４１】
（製造例７）発酵乳飲料
本発明卵黄水溶性分画粉末５ｇに乳酸菌入り発酵乳（ヤクルト社製）２５ｇを加え懸濁した。懸濁後、乳酸菌入り発酵乳７０ｇを加え、本発明卵黄水溶性分画粉末入り発酵乳飲料を得た。
【００４２】
（製造例８）乳飲料
本発明卵黄水溶性分画粉末５ｇに牛乳２５ｇを加え、懸濁した。懸濁後、牛乳７０ｇを加え、本発明卵黄水溶性分画粉末入り乳飲料を得た。
【００４３】
（製造例９）アイスクリーム
【００４４】
【表９】
【００４５】
（製造例１０）チューインガム
【００４６】
【表１０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Porphyromonas gingivalisに由来するプロテアーゼ、トリプシン、血球凝集素又はヘモグロビンレセプターで免疫した鳥類が産生した卵又はその処理物。
【請求項２】
請求項１記載の卵又はその処理物を含む、歯周炎を治療又は予防するための食品又は医薬組成物。
【請求項１】
Porphyromonas gingivalisに由来するプロテアーゼ、トリプシン、血球凝集素又はヘモグロビンレセプターで免疫した鳥類が産生した卵又はその処理物。
【請求項２】
請求項１記載の卵又はその処理物を含む、歯周炎を治療又は予防するための食品又は医薬組成物。
【公開番号】特開２００６−３６６６１（Ｐ２００６−３６６６１Ａ）
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２１６０５７（Ｐ２００４−２１６０５７）
【出願日】平成１６年７月２３日（２００４．７．２３）
【出願人】（０００１２９９７６）株式会社ゲン・コーポレーション (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月２３日（２００４．７．２３）
【出願人】（０００１２９９７６）株式会社ゲン・コーポレーション (11)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]