毒素結合性オリゴ糖および重合体粒子を含有する医薬組成物
本明細書では毒素媒介性疾患の治療における方法および組成物が提供される。本発明の一態様は、毒素と相互作用するオリゴ糖をベースとする治療薬およびその使用方法である。一実施形態では、本発明のオリゴ糖をベースとする治療薬には、オリゴ糖結合部分が付着した状態の重合体粒子が含まれる。クロストリジウム・ディフィシル関連性下痢を含む、抗生物質関連性下痢および偽膜性大腸炎などの毒素媒介性疾患の治療において本発明の組成物を使用することが可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
細菌外毒素は、多数の機序を進行させることで高感受性を示す真核生物の標的細胞内部の重要な代謝過程を改変している、広範囲の分泌細菌タンパク質を表す。一般に、これらの毒素は、宿主細胞膜を損傷させるかまたは細胞内の正常な生理学的過程の維持にとって重要なタンパク質を修飾することによって作用を発揮する。
【０００２】
偽膜性大腸炎（ＰＭＣ）は、重篤でかつ致死性を示す場合がある胃腸疾患として理解されている。グラム陽性の胞子形成細菌であるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、ＰＭＣおよび抗生物質関連性大腸炎（ＡＡＣ）の主要な原因菌として既知のものである。
【０００３】
ＰＭＣまたはＣＤＡＤ患者に対する現行の治療には、関連の抗菌剤または化学療法剤の中止、非特異的な支援策、およびクロストリジウム・ディフィシルに特異的な抗生物質による治療が含まれる。最も一般的な抗菌治療の選択肢として、バンコマイシン、メトロニダゾール、テイコプラニン、フシジン酸、およびバシトラシンが挙げられる。抗生物質によるＣＤＡＤの治療は疾患の臨床上の再発に関連する。再発の頻度は５〜５０％であり、再発率の２０〜３０％は最も一般的に引用される数字であることが報告されている。再発はほぼ等しい頻度で起き、これは上に挙げた抗生物質のいずれかを用いる主な治療における薬剤、用量、または期間とは無関係である。対照の抗生物質が問題を提起する場合、治療上の主な課題は複数回にわたって再発した患者の管理において認められる。
【０００４】
腸管でのクロストリジウム・ディフィシル毒素活性の直接中和におけるいくつかのアプローチが報告されている。第１に、数グラムの量のコレスチラミンおよびコレスチポールなどのアニオン交換樹脂が抗生物質と組み合わせて経口投与されている。このアプローチを用い、軽度から中程度の疾患患者、ならびにＣＤＡＤの再発をした個人の治療が行われている。テデスコ，Ｆ．Ｊ．（Ｔｅｄｅｓｃｏ，Ｆ．Ｊ．）（１９８２年）「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｃｏｌｉｔｉｓ」Ａｍ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ７７（４）：２２０−１頁；モグ、Ｇ．Ａ．（Ｍｏｇｇ，Ｇ．Ａ．）、Ｙ．アラビ（Ｙ．Ａｒａｂｉ）ら（１９８０年）「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒｉａｌｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｌｉｔｉｓ」Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｓｕｐｐｌ（Ｓｕｐｐｌ２２）：４１−５頁を参照のこと。イオン交換樹脂による治療では、毒素Ａの特異的除去がもたらされることなく、対照のＣＤＡＤに対し樹脂と相乗的に作用することが意図された抗生物質が除去されうる。さらに、毒素Ａを除去するのに必要な大量の樹脂をそれらの不快な味と組み合わせることで、上記アプローチの使用が抑えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記を考慮すると、クロストリジウム・ディフィシルに起因するＰＭＣ症候群および毒素に起因する他の疾患を治療する化合物または化合物の組み合わせに対して需要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、毒素媒介性疾患（ｔｏｘｉｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の治療に対する組成物および方法に関する。
【０００７】
本発明の一態様は、毒素結合性オリゴ糖などの毒素結合性部分、ならびに疎水性ブロックおよび１種もしくは複数種の付加的重合体ブロックを含むブロック共重合体（例えば、ブロック共重合体粒子を例として含む重合体粒子）を含む毒素結合性組成物である。好ましくは、毒素結合性部分は、ブロック共重合体の１種もしくは複数種の付加的重合体ブロックに付着するかまたは連結される（すなわち連結部分によって直接的もしくは間接的に共有結合される）。
【０００８】
本発明のこの態様の範囲内の好ましい実施形態では、毒素結合性組成物は毒素結合性オリゴ糖およびブロック共重合体（例えば、ブロック共重合体粒子を例として含む重合体粒子として）を含む。ブロック共重合体（または共重合体粒子）は疎水性ブロックおよび親水性ブロックを含み、毒素結合性オリゴ糖はブロック共重合体の親水性ブロックに付加されているかまたは連結されている状態にある。
【０００９】
本発明のこの態様の範囲内の別の好ましい実施形態では、毒素結合性組成物は毒素結合性部分およびブロック共重合体（ブロック共重合体粒子を例として含む重合体粒子など）を含む。ブロック共重合体は、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含みうる。ブロック共重合体が水性媒体内でミセルを形成しうるように、疎水性ブロックは化学的に架橋されるかまたは物理的に包まれる。毒素結合性部分は、親水性ブロックに付着されているかまたは連結されている。
【００１０】
本発明の別の態様は、毒素結合性部分およびポリマーナノ粒子を含む毒素結合性組成物であり、毒素結合性部分はナノ粒子に連結されかつナノ粒子は実質的に胃腸内腔（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｌｕｍｅｎ）から胃腸粘膜細胞内に吸収されない。
【００１１】
本発明のさらに別の態様は、クロストリジウム・ディフィシル毒素結合性部分および重合体粒子を含有する毒素結合性組成物であり、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａが約５％ウシ胎児血清を含有するリン酸塩緩衝溶液中の毒素結合性組成物で処理され、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の同組成物により、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａの少なくとも約９０％が結合される。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、重合体粒子などの粒子に付着されているかまたは連結されているクロストリジウム・ディフィシル毒素結合性オリゴ糖を有する毒素結合性組成物であり、粒子の単位表面積当たりのオリゴ糖のモル含量は約０．３μ当量／ｍ２もしくは約１μｍｏｌ／ｍ２よりも大きい。
【００１３】
本発明の第３の態様は、重合体粒子などの粒子に付着されているか連結されているオリゴ糖を含むタンパク質結合組成物であり、粒子の単位表面積当たりのオリゴ糖のモル含量は約０．３μ当量／ｍ２もしくは約１μｍｏｌ／ｍ２よりも大きい。オリゴ糖は水可溶性タンパク質に結合しうる。好ましくは、粒子はタンパク質ではなく、デンドリマーまたはリポソームの形態ではなく、かつ分子として水溶性を示さない。これらの組成物は、好ましくは約０．５ｍ２／ｇｍ〜約６００ｍ２／ｇｍの表面積を有し、それに加えまたはその代わりとして、単位重量当たりのオリゴ糖のモル含量は粒子の１グラム当たり約１００μｍｏｌよりも大きい。
【００１４】
本発明の第１、第２または第３の態様のいずれかの範囲内に含まれた実施形態を含む一部の実施形態では、毒素結合性部分（例えばオリゴ糖）が親水性ブロックに付着されるかまたは連結される場合、粒子は疎水性および親水性ブロックを有する共重合体粒子でありうる。ブロック共重合体は、コアを形成する疎水性ブロックおよびシェルを形成する親水性ブロックを有するミセルの形態であってもよい。例えば付加的単量体から形成された付加的重合体または重合体ブロックを含めることで、例えば疎水性コアが形成されるかまたは安定化される。特に好ましいアプローチでは、ミセルは、ブロック共重合体の疎水性ブロックに化学的に架橋するかまたは物理的に包むかまたはそうでなければ安定化させる付加的重合体または重合体ブロックを含んでもよい。適切な付加的単量体（付加的なコアを安定化させる重合体の形成に適する）の例として、これらに限定されないが、スチレン、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリレート、アクリル酸のＣ１〜Ｃ１２アルコールエステル、メタクリル酸のＣ１〜Ｃ１２アルコールエステル、ビニルトルエン、およびＣ２〜Ｃ１２カルボン酸のビニルエステルが挙げられる。好ましくは、親水性ブロックはジメチルアクリルアミドの重合体であり、かつ疎水性ブロックは、アクリル酸のＣ１〜Ｃ１２アルコールエステル、メタクリル酸のＣ１〜Ｃ１２アルコールエステル、スチレン、ビニルトルエン、およびＣ２〜Ｃ１２カルボン酸のビニルエステルの重合体または共重合体である。好ましくは、オリゴ糖は８−メトキシカルボニルオクチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１，４）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドである。本発明の実施形態のいずれ場合でも、本発明の粒子を微粒子と称することが可能である。しかし、特定の実施形態が微粒子と称される場合でさえ、かかる実施形態が必ずしも特定の大きさの範囲の粒子に限定されることはない。それゆえ、微粒子の言及においては、一般に、例えば全直径が約１ｍｍ未満の小型粒子に言及する。しかし特に、微粒子の言及においては、ミクロン規模もしくはナノ規模の寸法（例えば直径）を有することを含む、実質的により小さい粒子を除外するつもりはない。本明細書では、毒素結合性オリゴ糖などのオリゴ糖を含む粒子を糖粒子と称してもよい。
【００１５】
一般に、本発明の第１、第２または第３の態様の実施形態では、毒素結合性部分は細菌外毒素などの細菌毒素に対して結合親和性を示しうる。それゆえ、毒素結合性部分は、ヒト細胞を含む哺乳類細胞などの真核細胞内の代謝過程を改変する分泌細菌タンパク質に対して結合親和性を示しうる。毒素結合性部分は、宿主の粘膜表面上で作用可能な毒素に結合するかそれを中和させることが可能である。特に粘膜表面は、口、鼻、呼吸器、胃腸、泌尿器、生殖器および耳の粘膜表面からなる群から選択可能である。
【００１６】
毒素媒介性疾患の治療において本明細書に記載の組成物を使用してもよい。一部の実施形態では、組成物は下痢、偽膜性腸炎、または抗生物質関連性大腸炎などのクロストリジウム・ディフィシル毒素媒介性疾患の治療において使用される。
【００１７】
本明細書において記述されたすべての出版物、特許、および特許出願は、あたかも各個々の出版物もしくは特許出願が参照により援用されるものとして具体的かつ個別に示される場合と同程度に、本明細書において参照により援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本明細書において毒素と結合しかつ毒素媒介性疾患を治療するための方法および組成物が提供される。好ましい実施形態では、組成物は、毒素結合性部分で機能的にされる粒子、および好ましくは特定のオリゴ糖配列など、単位重量または単位表面積当たりで高密度な毒素結合性部分を含む。オリゴ糖などの毒素結合性部分は細菌毒素などの毒素に結合可能である。好ましい組成物は、毒素Ａおよび／または毒素Ｂなどのクロストリジウム・ディフィシル毒素に結合する組成物である。クロストリジウム・ディフィシル毒素に照らして本明細書に記載の多数の実施形態が説明されかつ検討されるが、本発明はそれらに限定されることはない。
【００１９】
特定の好ましい実施形態では、本来ならクロストリジウム・ディフィシル毒素に対して中程度の親和性を示す、本明細書で用いられるオリゴ糖配列は、粒子表面上に高密度に提示されると極めて高い結合速度を示した。特定の理論に拘束されたくないが、表面に付着される高密度のオリゴ糖部分は多価効果をもたらし、毒素への結合が増強される結果になると考えられる。すなわち、オリゴ糖を有する粒子の広範囲の親和性は個々のオリゴ糖の親和性の合計分よりも高い。第１の結合事象が生じていると、第２の毒素部分が、エンタルピー的および／またはエントロピー的に結合に親和性を示すように第２のオリゴ糖に提示されると考えられる。好ましくは、本発明の毒素結合性粒子は、粒子表面での表面単位および／または限られたコンフォメーションの程度（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｄｅｇｒｅｅ）につき高密度のオリゴ糖を含有する。これらの特徴は、ＣＤＡＤなどの状態における毒素中和にとってより高い毒素結合能および／またはより大きな効力を可能にすると考えられる。
【００２０】
クロストリジウム・ディフィシル関連性下痢などの毒素媒介性疾患の治療および／または予防において本明細書に記載の粒子を使用することが可能である。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態は、クロストリジウム・ディフィシル毒素で汚染された腸管から毒素を除去するための組成物である。好ましくは、毒素を除去するためのこの組成物は、表面が約０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５またはこれらを超えるμ当量／ｍ２よりも大きい密度で共有結合されたオリゴ糖に提示された粒子を含有する。好ましい密度範囲は約１μ当量／ｍ２〜約１５μ当量／ｍ２であり、さらにより好ましい密度範囲は約３μ当量／ｍ２〜約８μ当量／ｍ２である。使用されるオリゴ糖配列は、単糖類、二糖類、三糖類、四糖類およびこれらより大きい分子量のオリゴ糖であり、かつ細菌毒素に対して適度の親和性を示しうる。適切なオリゴ糖は、分岐状、線状、または樹状でありうる。
【００２２】
粒子
粒子は、好ましくはシリカ、二酸化チタン、珪藻岩、ゼオライト、ベントナイト、および他の金属ケイ酸塩などの無機物質、またはスチレン、オレフィン、アクリル、メタクリルおよびビニル単量体、重縮合物、エポキシ樹脂、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ホルムアルデヒドをベースとする樹脂、ポリアミンおよびポリオールをベースとする架橋ヒドロゲル、セルロースエーテルおよびセルロースエステルなどの半天然高分子から調製された有機高分子から選択される。好ましくは、選択された高分子は非毒性、非生体分解性および非吸収性を示す。本明細書で用いられる「重合体」という用語は共重合体を含む。粒径は、直径で好ましくは約５ｎｍ〜約１０００ミクロン、より好ましくは約５０ｎｍ〜約１００ミクロン、さらにより好ましくは約７５ｎｍ〜約１０ミクロン、さらにより好ましくは約７５ｎｍ〜約１ミクロン、および最も好ましくは約１００ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲である。
【００２３】
様々な実施形態の一部には、重合体粒子が含まれる。好ましくは、重合体粒子は共重合体である。これらの一実施形態は、毒素結合性部分およびポリマーナノ粒子を含有する毒素結合性組成物であり、毒素結合性部分はナノ粒子に連結されかつ実質的にナノ粒子は胃腸内腔から胃腸粘膜細胞内に吸収されない。これに照らすと、ナノ粒子は約１ミクロン未満の平均粒径を有する粒子である。好ましい実施形態では、ナノ粒子の粒径は約５０ｎｍ〜約８００ｎｍ、好ましくは約１００ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲である。さらにこれらの実施形態については、毒素結合性組成物は、対象への投与時に動物および好ましくは、例えばヒトならびに他の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ネコ、イヌ、ブタ、ニワトリ、ウシおよびウマ）を含む哺乳動物などの対象の胃腸内腔内に局在化される。「胃腸内腔」という用語は、本明細書において動物の腸管と呼びうる胃腸管内の空間または空洞を示す「内腔」という用語と同義的に用いられる。一部の実施形態では、毒素結合性組成物は胃腸粘膜を介して吸収されない。「胃腸粘膜」は、胃腸内腔を身体の他の部分から区別する細胞の層を示し、小腸粘膜などの胃腸粘膜を含む。一部の実施形態では、胃腸粘膜細胞による毒素結合性組成物の取り込み時に、胃腸内腔内に流出することによって内腔での局在化がなされる。本明細書において用いられる「胃腸粘膜細胞」は、例えば腸細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ）、結腸細胞（ｃｏｌｏｎｉｃ ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ）、腸細胞先端（ａｐｉｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ）などの腸管上皮細胞を含む任意の胃腸粘膜細胞を示す。本明細書において用語、関連用語および文法上のバリエーションが用いられる際、かかる流出によって非吸収性に関する正味の効果が得られる。
【００２４】
好ましいアプローチでは、毒素結合性組成物は実質的に胃腸内腔から胃腸粘膜細胞内に吸収されない組成物でありうる。そのようなものとして本明細書において用いられる「吸収されない」とは、毒素結合性組成物の有意な量、好ましくは統計学的に有意な量、より好ましくは本質的に全部が胃腸内腔内に残存するように調節された組成物を示しうる。例えば、毒素結合性組成物の少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％が（統計学的に関連性があるデータセットに基づくいずれの場合にも）胃腸内腔内に残存する。
【００２５】
血清バイオアベイラビリティの観点で相互に述べると、対象への投与後に毒素結合性組成物の生理学的に有意でない量が対象の血清内に吸収される。例えば、対象への毒素結合性組成物の投与時、（例えば投与後に検出可能な血清バイオアベイラビリティに基づき）毒素結合性組成物の約２０％以下の投与量が対象の血清内にあり、好ましくは毒素結合性組成物の約１５％以下、および最も好ましくは毒素結合性組成物の約１０％以下が対象の血清内にある。一部の実施形態では、約５％以下、約２％以下、好ましくは約１％以下、およびより好ましくは約０．５％以下が（統計学的に関連性があるデータセットに基づくいずれの場合にも）対象の血清内にある。
【００２６】
「吸収されない」という用語は、本明細書において「非吸収性の（ｎｏｎ−ａｂｓｏｒｂｅｄ）」、「非吸収性（ｎｏｎ−ａｂｓｏｒｂｅｄｎｅｓｓ）」、「非吸収（ｎｏｎ−ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）」という用語およびその他の文法的なバリエーションとともに交互に用いられる。
【００２７】
様々な好ましい実施形態には、クロストリジウム・ディフィシル毒素結合性部分および重合体粒子を含有する毒素結合性組成物が含まれる。約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａと結合するのに必要な毒素結合性組成物の濃度は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬであり、毒素結合性組成物およびクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａは約５％ウシ胎児血清を含有するリン酸塩緩衝溶液中でインキュベートされる。好ましくは、約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａと結合するのに必要な毒素結合性組成物の濃度は約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ；より好ましくは約０．８ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ；さらにより好ましくは約１ｍｇ／ｍＬ〜約３ｍｇ／ｍＬである。他の好ましい実施形態では、約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂと結合するのに必要な毒素結合性組成物の濃度は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬであり、毒素結合性組成物およびクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂは約５％ウシ胎児血清を含有するリン酸塩緩衝溶液中でインキュベートされる。好ましくは、約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂと結合するのに必要な毒素結合性組成物の濃度は約０．８ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ；より好ましくは約１ｍｇ／ｍＬ〜約６ｍｇ／ｍＬである。
【００２８】
これらの様々な実施形態の一部では、クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢは精製される。毒素結合性組成物とのクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａおよび／またはＢのインキュベーションを約２時間〜約３６時間；好ましくは約４時間〜約２４時間；より好ましくは約１２時間〜約１８時間実施してもよい。インキュベーションは通常、約３０℃〜約４０℃；好ましくは約３７℃の範囲の温度で実施される。重合体粒子に結合される毒素の量は、クロストリジウム・ディフィシル毒素のＥＬＩＳＡによって上清中の遊離毒素の量を測定しかつ混合物に添加されたクロストリジウム・ディフィシル毒素の量から差し引くことから算出された。試験から得られた値は、表８に一覧されかつ実施例８ではより詳細に述べられる。
【００２９】
粒子は任意の適切な形状、好ましくは球形、層状、または不規則であってもよい。最も好ましい形状は球形である。粒子自体は、微孔性、マクロ孔質性（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）、メソ細孔性、または非多孔性を示しうる。もし大きな粒子が使用される場合、毒素結合に使用可能な表面が高くなるようにこれらの粒子が多孔性であることが好ましい。孔サイズの分布は、好ましくは毒素が粒子の内部表面を横切ることを可能にするように選択される。例えば、クロストリジウム・ディフィシルによって分泌された毒素ＡおよびＢなどの高分子量の毒素に対して要求される孔サイズは毒素の直径よりも少なくとも２倍大きい。球形ビーズなどの非多孔性粒子における表面は外面に限られることから、好ましくは特定の用量でＧＩ内に存在する毒素負荷を中和させるのに十分な表面が利用可能であるようにビーズの大きさが調節される。
【００３０】
好ましい実施形態では、毒素結合性部分（例えばオリゴ糖）の表面密度は、約０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５もしくはこれら以上のμｍｏｌ／ｍ２より大きくてもよい。例えば、粒子における毒素結合性部分（例えばオリゴ糖）の単位表面密度当たりのモル含量は約１μｍｏｌ／ｍ２より大きくてもよく、例えば約１μｍｏｌ／ｍ２〜約１０μｍｏｌ／ｍ２、好ましくは約１μｍｏｌ／ｍ２〜約５μｍｏｌ／ｍ２および一部の実施形態では約１μｍｏｌ／ｍ２〜約３μｍｏｌ／ｍ２の範囲であってもよい。特定の実施形態では、表面密度は約２もしくは約３μｍｏｌ／ｍ２であってもよい。他の好ましい実施形態では、毒素結合性部分（例えばオリゴ糖）の表面密度は、約０．５、０．１もしくは１．５μｍｏｌ／ｍ２より大きくてもよい。それに加えまたはその代わりとして、粒子における毒素結合性部分（例えばオリゴ糖）の単位重量当たりのモル含量は、好ましくは約１０μｍｏｌ／ｇｍ〜約１０００μｍｏｌ／ｇｍの範囲であってもよい。粒子における好ましい毒素結合（例えばオリゴ糖）の単位重量当たりのモル含量は、約１０μｍｏｌ／ｇｍ〜約５００μｍｏｌ／ｇｍ、または約１０μｍｏｌ／ｇｍ〜約２００μｍｏｌ／ｇｍ、または約１０μｍｏｌ／ｇｍ〜約１００μｍｏｌ／ｇｍの範囲であってもよい。一部の実施形態では、単位重量当たりのモル含量は約７０μｍｏｌ／ｇｍであってもよい。
【００３１】
表１中の情報は、所定のオリゴ糖含量に対する粒径および有孔性の選択上の指針として使用されうる。
【００３２】
【表１】
【００３３】
一部の実施形態では、粒子は、リン脂質の会合から形成されるリポソームまたは小胞、ならびにブロック共重合体ミセルなどの他の同様のタイプの高分子集合体である。他の実施形態では、粒子は当該分野で公知の樹状構造をとり、例えば、本明細書において参照により援用される、グレイソン Ｓ．Ｍ．（Ｇｒａｙｓｏｎ Ｓ．Ｍ．）ら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００１年、１０１：３８１９−３８６７頁；およびボズマン Ａ．Ｗ．（Ｂｏｓｍａｎ Ａ．Ｗ．）ら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１９９９年、９９；１６６５−１６８８頁を参照のこと。
【００３４】
一実施形態では、毒素結合性組成物は互いに付着し合う少なくとも２種類の粒子から構成され、オリゴ糖が粒子の一方に付着される。好ましくは、粒子の一方は共重合体である。特定の実施形態では、第２の粒子はラテックス粒子、シリカ粒子、メチルオキシドナノ粒子、疎水性重合体、コロイドポリマーであるかまたは本明細書に記載の他の適切な物質からなる。
【００３５】
粒子の形成
オリゴ糖担体として選択される粒径および形態に依存し、様々な合成手順を用いることが可能である。例えばゾル−ゲルプロセス、特にＳｔｏｂｅｒプロセスを用いると、非多孔性の球形形状を有するシリカ粒子が簡便に調製され、Ｓｔｏｂｅｒプロセスにより、ケイ素アルコキシドがアンモニアと共加水分解される（ストーバー（Ｓｔｏｂｅｒ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９６８年、２６、６２頁）。有機金属かまたは金属塩を使用する他のゾル−ゲルプロセスもまた、金属酸化物のナノ粒子を生成することで周知である。エアロゾルおよびジェッティングプロセスもまた、本発明に適する大きさおよび有孔性についての特性を有する制御性に優れた無機および有機材料粉末を調製することで周知である。懸濁液、マイクロサスペンション、エマルジョン、ミニエマルジョン、マイクロエマルジョンの重合方法など、分散媒体中での重合により、有機ポリマービーズを調製することが可能である。多孔性粒子が使用される場合、懸濁液重合プロセスが好ましく、多官能性単量体（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｏｎｏｍｅｒ）を含むフリーラジカル重合可能な単量体の混合物が分散剤を含む水相中で乳化され、該単量体相は種々の希釈剤およびポロゲン溶媒も含む。後者の溶媒は、形成された粒子の微小／巨大／中程度な有孔性を制御する。多段階で播種される懸濁液重合によるかあるいは膜乳化またはジェッティングプロセスを用いて、モノ−サイズの粒子が調製される。一般に、かかる重合体粒子を調製するのに共重合体化されうる単量体には、スチレン、ジビニルベンゼン（全異性体）で置換されたスチレン、アルキルアクリレート、置換されたアルキルアクリレート、アルキルメタクリレート、置換されたアルキルメタクリレート、アクリロニトリル、エチレングリコールジメタクリレート、メタクリロニトリル、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アルキルアクリルアミド、Ｎ−アルキルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルメタクリルアミド、イソプレン、ブタジエン、エチレン、酢酸ビニル、Ｎ−ビニルアミド、マレイン酸誘導体、ビニルエーテル、アリル、メタリル単量体およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１種類の単量体が含まれる。これらの単量体の官能化された種類も使用可能である。本発明にて使用可能な特定の単量体または共単量体には、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、プロピルメタクリレート（全異性体）、ブチルメタクリレート（全異性体）、２−エチルヘキシルメタクリレート、イソボルニルメタクリレート、メタクリル酸、ベンジルメタクリレート、フェニルメタクリレート、メタクリロニトリル、α−メチルスチレン、メチルアクリレート、エチルアクリレート、プロピルアクリレート（全異性体）、ブチルアクリレート（全異性体）、２−エチルヘキシルアクリレート、イソボルニルアクリレート、アクリル酸、ベンジルアクリレート、フェニルアクリレート、アクリロニトリル、スチレン、グリシジルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート（全異性体）、ヒドロキシブチルメタクリレート（全異性体）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、トリエチレングリコールメタクリレート、無水イタコン酸、イタコン酸、グリシジルアクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート（全異性体）、ヒドロキシブチルアクリレート（全異性体）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアクリレート、トリエチレングリコールアクリレート、メタクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルメタクリルアミド、Ｎ−ｎ−ブチルメタクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、Ｎ−エチロールメタクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−エチロールアクリルアミド、４−アクリロイルモルホリン、ビニル安息香酸（全異性体）、ジエチルアミノスチレン（全異性体）、α−メチルビニル安息香酸（全異性体）、ジエチルアミノα−メチルスチレン（全異性体）、ｐ−ビニルベンゼンスルホン酸、ｐ−ビニルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩、トリメトキシシリルプロピルメタクリレート、トリエトキシシリルプロピルメタクリレート、トリブトキシシリルプロピルメタクリレート、ジメトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジエトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジブトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジイソプロポキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジメトキシシリルプロピルメタクリレート、ジエトキシシリルプロピルメタクリレート、ジブトキシシリルプロピルメタクリレート、ジイソプロポキシシリルプロピルメタクリレート、トリメトキシシリルプロピルアクリレート、トリエトキシシリルプロピルアクリレート、トリブトキシシリルプロピルアクリレート、ジメトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジエトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジブトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジイソプロポキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジメトキシシリルプロピルアクリレート、ジエトキシシリルプロピルアクリレート、ジブトキシシリルプロピルアクリレート、ジイソプロポキシシリルプロピルアクリレート、無水マレイン酸、Ｎ−フェニルマレイミド、Ｎ−ブチルマレイミド、Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−ビニルアセトアミド、アリルアミン、メタリルアミン、アリルアルコール、メチル−ビニルエーテル、エチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、ブタジエン、イソプレン、クロロプレン、エチレン、酢酸ビニルおよびこれらの組み合わせが含まれる。
【００３６】
様々な経路に従い、例えばまず、好ましくは糖類の還元末端上に位置付けられるアミン反応性末端基を有するオリゴ糖配列を官能化し、さらにアミン反応性の官能性糖をチオイソシアナート基などのアミンで官能化された粒子に反応させることにより、粒子表面上にオリゴ糖部分を付着させてもよい。このアプローチの変形として、アミン官能基をオリゴ糖上に付着させ、それをエポキシド基などの求電子物質で官能化された粒子と反応させる。
【００３７】
別の方法では、まず重合可能な部分がオリゴ糖に付着され、エマルジョン重合プロセスにおいてこのオリゴ糖官能性単量体を粒子を形成する単量体と共重合させる。この一般的プロセスの変形および好ましい実施形態は、第１にリビング重合技術を用いてオリゴ糖官能性単量体を第２の共単量体と重合して第１の親水性ブロックを形成し；第２にこの親水性ブロックを用いて第２の疎水性ブロックをさらに成長させ、ジブロック共重合体を形成し；第３に水性媒体中でブロック共重合体を分散させることである。ブロック共重合体の合成については、陰イオン重合、陽イオン重合、グループトランスファー重合および制御されるフリーラジカル重合などの多数のリビング重合技術によって実施可能である。後者の技術には、ニトロキシドに媒介される重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、および可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）が含まれ、この後者の技術は好ましい。ＲＡＦＴ技術では、ジチオエステル、ジチオカルバメート、ジチオカーボネート、またはジチオカルバゼートから選択される連鎖移動剤（ＣＴＡ）が用いられる。同アプローチの概略図は図１Ａおよび図１Ｂに示される。両親媒性ブロック共重合体は、崩壊した疎水性ブロックのコアとオリゴ糖官能性親水性ブロックのシェルを含むミセル内部に自発的に集合する。別の好ましい実施形態では、ブロック共重合体ミセルの疎水性コアは、さらなる第３の単量体または「コア充填（ｃｏｒｅ−ｆｉｌｌｉｎｇ）」単量体を重合することによってさらに架橋される。このコア充填単量体は、好ましくは疎水性単量体、多官能性単量体、またはこれらの組み合わせである。コア充填単量体のブロック共重合体に対する重量比は、典型的には約０．１〜約１００、好ましくは約０．５〜約１０からなる。
【００３８】
ブロック共重合体における分子量は約２０００〜約２００，０００、好ましくは約５００〜約２００，０００、より好ましくは約１０，０００〜約１００，０００、最も好ましくは約２０，０００〜約５０，０００の範囲内にあり；親水性の疎水性に対する比には約９：１〜約１：９、好ましくは約３：１〜約１：３、より好ましくは約２：１〜約１：２、さらにより好ましくは約１．１：１、および最も好ましくは約１．５：１が含まれ；かつ親水性ブロック中のオリゴ糖のモルパーセントは約２モルパーセント〜約１００モルパーセント、好ましくは約５モルパーセント〜約５０モルパーセントの範囲内にある。
【００３９】
樹状スペーサ（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｓｐａｃｅｒ）の使用により、オリゴ糖は様々な方法を介して重合体粒子に付着されうる。例えば、樹状スペーサの使用方法については、ランドクイスト（Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ）およびトゥーン（Ｔｏｏｎｅ）、「Ｔｈｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ Ｅｆｆｅｃｔ」、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、２００２年、１０２、５５５−５７８頁に記載されている。
【００４０】
特定の好ましい実施形態では、オリゴ糖は高い局所密度で固体表面上に強力に固定される。糖密度の制御については、上記の合成手順によって行ってもよい。プロセス変数には、ブロック共重合体中の糖含量、糖含有ブロックの疎水性ブロックに対する比、およびブロック共重合体のコア充填単量体に対する比が含まれる。糖の表面密度は、第一に粒子表面および配合中の糖含量から見積もることが可能である。粒子表面については、電子顕微鏡、動的光散乱またはフラウンホッファー光回折法（Ｆｒａｕｎｈｏｆｆｅｒ ｌｉｇｈｔ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ）によって測定された粒径から算出することが可能である。あるいは、オリゴ糖のモル含量は初期の糖濃度を知ることによって判定することが可能である。好ましくは、オリゴ糖の表面密度は約１μｍｏｌ／ｍ２より大きく、好ましくは約５μｍｏｌ／ｍ２より大きく、および最も好ましくは約１０μｍｏｌ／ｍ２より大きい。光学密度範囲は、下記の如く生化学および細胞生物学の標準的手順によって測定された毒素の結合能によって決定される。
【００４１】
本発明の別の態様では、リンカー修飾のためにメチルエステルハンドルを有する三糖Ｇａｌ（α１−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃを合成することを目的とした方法が提供される。かかる修飾の例として、種々の重合体のバックボーン構造の付加におけるリンカーとして機能するジアミン基の導入が挙げられる。本発明の別の態様では、フリーラジカル重合技術に基づく重合体のバックボーンおよび三糖−リンカー−重合体組成物の生成のための方法が記載される。かかる技術には糖に由来するアクリレート、メタクリレート、スチレン、およびビニル単量体を用いる重合可能な糖単量体の直接重合が含まれ；付加的な技術には、求核アミン糖を使用した糖部分での完全な重合体の後修飾によるエポキシドもしくは活性化エステル基を含有する共重合体との反応が含まれる。改変によって高親和性の毒素Ａ結合剤を生成可能な三糖−リンカー−重合体の特性には、重合体の大きさ、重合体内部のオリゴ糖密度、完成した重合体における疎水性／親水性のバランス、および単量体サブユニットの構造／形態（すなわち、線状、ブロック、スター、グラフト、およびゲル）が含まれる。
【００４２】
毒素結合性オリゴ糖
本明細書に記載の組成物中に使用可能な適切なオリゴ糖の例として、毒素Ａおよび／または毒素Ｂに結合するオリゴ糖が挙げられる。適切なオリゴ糖として、βＧｌｃ；αＧｌｃ（１−２）βＧａｌ；αＧｌｃ（１−４）βＧｌｃ（麦芽糖）；βＧｌｃ（１−４）βＧｌｃ（セロビオース）；αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ（１−６）βＧｌｃ（ソマルトース）；αＧｌｃ（１−６）βＧｌｃ（イソマルトース）；βＧｌｃＮＡｃ（１−４）βＧｌｃＮＡｃ（キトビオース）などのクロストリジウム・ディフィシル毒素結合性オリゴ糖が挙げられる。他の適切なクロストリジウム・ディフィシル毒素結合性オリゴ糖として以下のものが挙げられる。
【００４３】
【表２】
【００４４】
コレラ毒素に適するオリゴ糖として、Ｇａｌ（β１，３）ＧａｌＮＡｃ（β１，４）（ＮｅｕＡｃ（α２，３））Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド；ＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，３）ＧａｌＮＡｃ（β）（ＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド、Ｇａｌ（β）ＧａｌＮＡｃ（β１，４）（ＮｅｕＡｃ（α２，８）ＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド、ＧａｌＮＡｃ（β１，４）−Ｇａｌ（β１，３）ＧａｌＮＡｃ（β１，４）（（ＮｅｕＡｃ（α２，３））Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド、およびＦｕｃ（αｌ，２）Ｇａｌ（β，３）−ＧａｌＮＡｃ（β１，４）（（ＮｅｕＡｃ（α２，３））Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミドが挙げられる。
【００４５】
熱不安定性毒素に対するオリゴ糖の例としてＧＭ１が挙げられる。破傷風毒素に適するオリゴ糖は、Ｇａｌ（β１，３）ＧａｌＮＡｃ（β１，４）（（ＮｅｕＡｃ（α２，８））ＮｅｕＡｃ（２，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド；ＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，３）ＧａｌＮＡｃ（β１，４）（（ＮｅｕＡｃ（α２，８））ＮｅｕＡｃ（α２，３）−Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド、およびＮｅｕＡｃ（α２，８）ＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，３）ＧａｌＮＡｃ（β１，４）（ＮｅｕＡｃ（α２，８）−ＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミドである。
【００４６】
ボツリヌス毒素ＡおよびＥに適するオリゴ糖はＮｅｕＡｃ（α２，８）ＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，３）ＧａｌＮＡｃ（β１，４）（ＮｅｕＡｃ（α２，８））ＮｅｕＡｃ（α２，３）−Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド；ボツリヌス毒素Ｂ、Ｃ、およびＦの場合にはＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，３）ＧａｌＮＡｃ（β１，４）（ＮｅｕＡｃ（α２，８））ＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド；ならびにボツリヌス毒素Ｂの場合にはＧａｌ（β）−セラミドである。
【００４７】
デルタ毒素に適するオリゴ糖はＧａｌＮＡｃ（β１，４）（ＮｅｕＡｃ（α２，３））Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド；毒素Ａの場合にはＧａｌ（αｌ，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド；シガ様毒素（ＳＬＴ）−ＩおよびＳＬＴ−ＩＩ／ＩＩｃの場合にはＧａｌ（αｌ，４）Ｇａｌ（β）（Ｐ１二糖類）、Ｇａｌ（αｌ，４）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ（β）（Ｐ１三糖）、またはＧａｌ（αｌ，４）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）（Ｐｋ三糖）；シガトキシンの場合にはＧａｌ（αｌ，４）Ｇａｌ（β）−セラミド；ベロ毒素の場合にはＧａｌ（αｌ，４）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド；百日咳毒素の場合にはＮｅｕＡｃ（α２，６）Ｇａｌ；ならびに赤痢菌毒素の場合にはＧｌｃＮＡｃ（β１）である。
【００４８】
本発明の一態様は、粒子に付着したオリゴ糖を含むタンパク質結合組成物であり、ここで粒子の表面積当たりのオリゴ糖のモル含量は約０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１もしくはこれらを超えるμ当量／ｍ２よりも大きく、オリゴ糖は可溶性タンパク質に結合し、かつ粒子はタンパク質ではなく、デンドリマーまたはリポソームの形態ではなく、分子として水溶性を示さない。本発明の別の態様は、粒子に付着したオリゴ糖を含むタンパク質結合組成物であり、ここで粒子の表面積当たりのオリゴ糖のモル含量は約０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１もしくはこれらを超えるμ当量／ｍ２よりも大きく、オリゴ糖は可溶性タンパク質に結合し、かつ粒子はタンパク質またはカーボンナノチューブではなく、デンドリマーまたはリポソームの形態ではなく、分子として水溶性を示さない。かかる粒子の例として、脂質、リン脂質および本明細書に記載の他の粒子が挙げられる。
【００４９】
処理方法
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、毒素に結合しかつそれを中和させるのに用いる。本明細書に記載の組成物は、毒素の全体もしくは一部に結合しかつ／またはそれらを中和させることが可能である。例えば、毒素は、経口粘膜および胃腸管、鼻道および気道、尿管および生殖器官、ならびに耳道を含む宿主の粘膜表面上で作用しうる。さらに外傷における使用として、本発明の組成物および方法が含まれる。細胞表面の標的の機能を不活化するかまたは破壊する作用モードを有する毒素が含まれ、その例が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）によって産生される超抗原毒素のファミリー、ストレプトリシン、パーフリンゴリジン、α毒素、ロイコトキシン、アエロリジン、デルタヘモリシン、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）病原型（ｐａｔｈｏｖａｒｓ）によってコードされる様々な溶血素などの細胞浸透性毒素、ならびにバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）のエンテロトキシン（非−ＬＰＳ）などの付着因子機能を遮断する毒素において見出される。本発明を標的細胞表面に結合する毒素に対して用いることも可能であり、それを細胞質内に転位させ、細胞内標的を破壊するかまたは不活化する。この群の中には、（ｉ）ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ、およびシガトキシンなどのタンパク質合成阻害剤と；（ｉｉ）炭疽菌毒素、百日咳毒素および百日咳アデニル酸シクラーゼ毒素、コレラ毒素、ならびに大腸菌のＬＴ毒素、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）、大腸菌、シゲラ、およびカンピロバクターによって産生される細胞致死性膨張毒素、ウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のα毒素、クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢ、ならびに大腸菌およびボルデテラ種の細胞毒性壊死性因子などの関連する熱不安定毒素を含むシグナル伝達阻害剤と；（ｉｉｉ）ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）の空胞化毒素、破傷風毒素、ボツリヌス毒素の粘膜輸送、およびＣ２ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）毒素を含む、細胞内輸送ならびに細胞骨格の毒素とが含まれる。
【００５０】
毒素媒介性疾患の治療および／または予防に対し、本明細書において提供される組成物および方法が用いられる。かかる毒素は、細菌毒素およびウイルス粒子、プリオン、抗体、付着因子、レクチン、セレクチン、シグナル伝達ペプチド、ホルモン、特に免疫系応答および／または自己免疫疾患に関与するホルモン、ならびにＧＩ管において副作用を有する他の分子などの他の毒性ポリペプチドを含みうるがこれらに限定されない。
【００５１】
本明細書に記載の組成物および方法は、標的細胞表面にて作用する細菌毒素および感受性細胞の細胞内標的上で作用する毒素に対して用いることが可能である。第１の群の一般的な例として、黄色ブドウ球菌およびストレプトコッカス・ピオゲネスの毒素、ならびに黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ウェルシュ菌、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、大腸菌、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）およびその他を含む多数のグラム陽性菌およびグラム陰性菌によって分泌される、孔を形成する毒素が挙げられる。細胞内で作用する毒素の中で受容体媒介性機構によって標的細胞に入る毒素の例として、多数の他の例とともに、緑膿菌の外毒素Ａ、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）のシガトキシン、コレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）のコレラ毒素、大腸菌の不安定毒素、ヘリコバクター・ピロリの空胞化毒素、ボツリヌス菌の神経毒素、ならびにクロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢが挙げられる。細胞内作用性毒素（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ−ａｃｔｉｎｇ ｔｏｘｉｎ）の第２の群は毒素の標的細胞内への直接注射によって移入されるが、かかるタイプＩＩＩおよびタイプＩＶで分泌される毒素の周知の例として、エルシニア症（Ｙ．ｓｐｐ．）のＹｏｐタンパク質、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の百日咳毒素、およびヘリコバクター・ピロリのＣａｇＡタンパク質が挙げられる。数種類の細菌毒素は、宿主の粘膜表面の細胞に作用する。これらの例として、コレラ菌毒素、大腸菌の熱不安定毒素、志賀赤痢菌の（ＥＨＥＣおよびＥＰＥＣ変異体を含む）シガトキシン、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ、百日咳菌の百日咳毒素、ならびに黄色ブドウ球菌およびストレプトコッカス・ピオゲネスによってコードされる超抗原毒素が挙げられる。
【００５２】
クロストリジウム・ディフィシル毒素産生株は、ＣＤＡＤおよびＰＭＣ症候群に関与する２種類の外毒素を産生する（リアーリ，Ｄ．Ｍ．（Ｌｙｅｒｌｙ，Ｄ．Ｍ．）、Ｈ．Ｃ．クリバン（Ｈ．Ｃ．Ｋｒｉｖａｎ）ら（１９８８年）「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ：ｉｔｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｔｏｘｉｎｓ」Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ１（１）：１−１８頁）。毒素Ａ（ＣｄｔＡ、３０８ｋＤａ）は、動物モデルおよび回腸移植片において流体分泌を誘発するエンテロトキシンであり、臨床症状の発生に関与する一次毒素として一般に認められる（トリアダフィロプロス，Ｇ．（Ｔｒｉａｄａｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．）、Ｃ．ポソウラキス（Ｃ．Ｐｏｔｈｏｕｌａｋｉｓ）ら、（１９８７年）「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｏｎ ｒａｂｂｉｔ ｉｌｅｕｍ」 Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９３（２）：２７３−９頁）。毒素Ｂ（ＣｄｔＢ、２７９ｋＤａ）は、毒素の培養細胞に対する著しい細胞変性作用および動物モデルにおけるその腸毒性の相対的損失によって規定される細胞毒素である。細胞変性作用のみの測定により、毒素Ｂは毒素Ａよりも１００倍以下〜１０００倍高い毒性を示す（トリアダフィロプロス，Ｇ．（Ｔｒｉａｄａｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．）、Ｃ．ポソウラキス（Ｃ．Ｐｏｔｈｏｕｌａｋｉｓ）ら、（１９８７年）「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｏｎ ｒａｂｂｉｔ ｉｌｅｕｍ」 Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９３（２）：２７３−９頁；リマ，Ａ．Ａ．（Ｌｉｍａ，Ａ．Ａ．）、Ｄ．Ｍ．リアーリ（Ｄ．Ｍ．Ｌｙｅｒｌｙ）ら、（１９８８年） 「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ｓｍａｌｌ ａｎｄ ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ」 Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５６（３）：５８２−８頁；リーグラー，Ｍ．（Ｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．）、Ｒ．セディヴィ（Ｒ．Ｓｅｄｉｖｙ）ら（１９９５年）「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｉｓ ｍｏｒｅ ｐｏｔｅｎｔ ｔｈａｎ ｔｏｘｉｎ Ａ ｉｎ ｄａｍａｇｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎｉｃ ｅｐｉｔｈｅｒｉｕｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ」 Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９５（５）：２００４−１１頁；シャベス−オラルテ，Ｅ．（Ｃｈａｖｅｓ−Ｏｌａｒｔｅ，Ｅ．）、Ｍ．ワイドマン（Ｍ．Ｗｅｉｄｍａｎｎ）ら（１９９７年） 「Ｔｏｘｉｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｆｒｏｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｄｉｆｆｅｒ ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｅｃｔ ｔｏ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｏｔｅｎｃｉｅｓ，ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ」 Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １００（７）：１７３４−４１頁；ストゥッベ，Ｈ．（Ｓｔｕｂｂｅ，Ｈ．）、Ｊ．ベルドズ（Ｊ．Ｂｅｒｄｏｚ）ら（２０００年）「Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ＩｇＡ ｉｓ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ＩｇＡ ａｎｄ ＩｇＧ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎ Ａ ｄａｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｔ８４ ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ」 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４（４）：１９５２−６０頁）。
【００５３】
本明細書に記載の組成物および方法によると、ＧＴＰの結合に関与するトレオニン残基のモノグルコシル化によるＲｈｏ ＧＴＰアーゼの毒素不活化への作用により、クロストリジウム・ディフィシル毒素媒介性状態に対する治療および／または予防が可能である。Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼのグルコシル化により、アクチン細胞骨格を調節するエフェクタータンパク質を有するこれらのシグナル伝達分子間の相互作用が遮断される。さらに、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼの不活化により、細胞における分泌過程、エンドサイトーシス、タンパク質合成、細胞周期進行、および多数の他の基本的な細胞「ハウスキーピング」機能の制御が破壊される可能性がある。好ましくは、毒素結合性組成物は宿主の細胞表面受容体へのクロストリジウム・ディフィシル毒素の結合を阻害する。
【００５４】
毒素Ａは、Ｇａｌ（α１−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃおよび／またはタイプ２のコアを含む最小の二糖単位Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃを含有する複合糖質（Ｏと連結、Ｎと連結、またはグリコスフィンゴリピド）に結合する（カスタグリウオロ，Ｉ．（Ｃａｓｔａｇｌｉｕｏｌｏ，Ｉ．）、Ｊ．Ｔ．ラモン（Ｊ．Ｔ．ＬａＭｏｎｔ）ら（１９９６年）「Ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｄｅｃｏｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ Ｔｏｘｉｎ Ａ ｉｎ Ｒａｔ Ｉｌｅｕｍ」Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１１：４３３−８頁；米国特許第５，４８４，７７３号明細書；および米国特許第５，６３５，６０６号明細書）。毒素Ａに対して合意が得られた受容体構造は種々の非ヒト哺乳類細胞において同定されているが、ヒト組織内でＧａｌ（α１−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ構造が自然に見出されることはない。好ましくは、本発明の粒子において使用されるオリゴ糖配列は、毒素Ａのこれらの複合糖質への結合を妨げるか阻害する。
【００５５】
細菌毒素によって媒介される疾患の治療に加え、細菌、ウイルス、マイコプラズマ、および寄生虫の感染サイクルなどのタンパク質−炭水化物の認識事象を含む他の病理学的相互作用において本明細書に記載の組成物を使用してもよい。
【００５６】
本発明のさらなる態様では、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂによって媒介される下痢の治療に対する方法が提供され、同方法はＣＤＡＤに罹患した対象に重合体支持体に連結される三糖Ｇａｌ（α１−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃを含む組成物の有効量を投与するステップを含み、該オリゴ糖配列は毒素Ａに結合し、感染した胃腸管の内腔から毒素Ａを除去する。同様に、組成物は毒素Ｂに結合してそれを除去することで、タンパク質の腸上皮細胞に対する細胞毒性作用を防止することが可能である。重合体組成物は許容可能な医薬品担体中で調合され、胃腸管から除去される能力を有する。
【００５７】
本発明の別の態様では、典型的にはメトロニダゾール（フラジール（Ｆｌａｇｙｌ））または経口バンコマイシンからなる、ＣＤＡＤに対する抗生物質療法に伴い、重合体支持体に連結される三糖Ｇａｌ（α１−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃからなる組成物が送達される。すなわち、別々の製剤としてまたは薬剤の決まった組み合わせにおいて併用療法の提供が可能である。
【００５８】
本発明では、組成物を他の活性医薬品とともに同時投与してもよい。この同時投与は、２種類の薬剤の同一の剤形での同時投与、別々の剤形での同時投与、および分離投与を含みうる。例えばＣＤＡＤの治療においては、特定の抗生物質などのＣＤＡＤを誘発する薬剤とともに組成物を同時投与してもよい。同時投与される薬剤を同一の剤形で共に調合し、同時投与してもよい。あるいは、両方の薬剤が別々の製剤中に存在する場合、それらを同時投与してもよい。もう一つの代替案では薬剤は別々に投与される。分離投与プロトコルでは、数分または数時間または数日置いて薬剤を投与することが可能である。
【００５９】
さらに別の方法では、本発明の毒素結合性組成物は、有効量の抗生物質とともに同時投与される。毒素結合性組成物の投与は、有効量の抗生物質の投与より前、それと同時、またはその後であってもよい。様々な抗生物質の用量および治療法は、当該技術で周知である。一実施形態では、抗生物質は、メトロニダゾール、バンコマイシン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。あるいは、抗生物質は、テイコプラニン、フシジン酸、バシトラシン、カルベンシリム、アンピシリン、クロキサシリン、オキサシリン、ピペラシリン、セファクロール、セファマンドール、セファゾリン、セフォペラゾン、セフタキシム、セフォキシチン、セフタジジム、セフトリアゾン、イミペネム、メロペネム、ナリジクス酸、テトラサイクリン、ゲンタマイシン、パロモマイシン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されうる。さらなる方法では、対象は、毒素結合性組成物と、メトロニダゾール、バンコマイシン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質とで治療され、その後に必要に応じて、毒素結合性組成物と、カルベンシリム、アンピシリン、クロキサシリン、オキサシリン、ピペラシリン、セファクロール、セファマンドール、セファゾリン、セフォペラゾン、セフタキシム、セフォキシチン、セフタジジム、セフトリアゾン、イミペネム、メロペネム、ナリジクス酸、テトラサイクリン、ゲンタマイシン、パロモマイシン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質とで治療される。
【００６０】
本明細書で用いられる「治療する」という用語は、治療効果および／または予防的な利益を得ることを含む。治療効果とは、治療される基礎疾患の撲滅、改善、または予防を意味する。例えば偽膜性大腸炎（ＰＭＣ）患者では、治療効果には腸管の粘膜表面に付着した内在する偽膜性で滲出性のプラークの撲滅または改善が含まれる。さらに、患者は依然として基礎疾患に悩まされる場合があるにもかかわらず、患者において改善が認められるような基礎疾患に関連する１つもしくは複数の生理的な兆候の撲滅、改善、または予防によって治療効果が得られる。例えば、クロストリジウム・ディフィシル毒素結合性組成物のＰＭＣを患う患者への投与により、患者の下痢が減少する場合だけではなく、患者においてＰＭＣを併発する他の疾患と比べて改善が認められる場合にも治療効果が得られる。予防的な利益の例として、たとえＰＭＣの診断がなされていなくても、本明細書に記載の組成物がＰＭＣを発症するリスクがある患者またはＰＭＣに関する１つもしくは複数の生理的な兆候を報告する患者に投与される場合が挙げられる。組成物は毒素媒介性疾患の再発の予防における使用にも適する。
【００６１】
本発明の医薬組成物には、重合体が有効量すなわち治療的または予防的な利益を得るための有効量で存在する場合の組成物が含まれる。特定の用途に対する実際の有効量は、患者（例えば、年齢、体重など）、治療がなされる状態、および投与経路に依存するであろう。当業者の能力の範囲内で、特に本明細書における開示内容を考慮すれば、有効量の判定は十分になされる。
【００６２】
ヒト使用における有効量は、動物モデルから決定されうる。例えば、動物において有効であることが判明している胃腸濃度を得ることで、ヒトに対する用量の調製が可能である。
【００６３】
動物における重合体の用量は、治療がなされる疾患、投与経路、および治療される患者の身体特性に依存するであろう。重合体の治療的および／または予防的使用における用量レベルは約０．５ｇｍ／日〜約３０ｇｍ／日でありうる。これらの重合体は食事とともに投与されることが好ましい。組成物は、１日１回、１日２回、または１日３回投与されうる。最も好ましい用量は約１５ｇｍ以下／日である。好ましい用量範囲は、約５ｇｍ／日〜約２０ｇｍ／日、より好ましくは約５ｇｍ／日〜約１５ｇｍ／日、さらにより好ましくは約１０ｇｍ／日〜約２０ｇｍ／日、および最も好ましくは約１０ｇｍ／日〜約１５ｇｍ／日である。別の好ましい用量は約１ｇｍ／日〜約５ｇｍ／日である。
【００６４】
本明細書に記載の重合体組成物を他の適切な活性剤と組み合わせて使用してもよい。例えば、ＰＭＣまたはＣＤＡＤの治療において、重合体組成物はバンコマイシン、メトロニダゾール、テイコプラニン、フシジン酸、およびバシトラシンなどの抗生物質と組み合わせて使用されうる。他の併用療法には、抗−毒素Ａ免疫グロブリンまたは経口投与されるウシ抗−毒素Ａ免疫グロブリン、毒素Ａトキソイドワクチン、および可溶性のスルホン酸ポリスチレン樹脂をベースとする経口の非吸収性高分子の毒素結合剤を用いる受動免疫療法が含まれうる。
【００６５】
本明細書に記載の組成物をコレスチラミンおよびコレスチポールなどのイオン交換樹脂と組み合わせて使用してもよい。併用可能な他の適切な重合体は、陽性基と疎水基を有する適切な重合体について記載する、米国特許第６，００７，８０３号明細書；米国特許第６，０３４，１２９号明細書；および米国特許第６，２９０，９４７号明細書、ならびに陰イオン基を有する重合体に関する、米国特許第６，２７０，７５５号明細書；米国特許第６，４１９，９１４号明細書；米国特許第６，５１７，８２７号明細書；米国特許第６，８９０，５２３号明細書；および米国特許出願公開第２００５／０２１４２４６号明細書に記載されている。
【００６６】
別の方法では、線状の毒素Ａに結合するエピトープＧａｌ（α１−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ、および様々な誘導体を固体の不活性支持体に付着させると、毒素Ａ（ＳＹＮＳＯＲＢ）に対する結合能および中和能を有する不溶性物質が生成された（ヒーアツェ（Ｈｅｅｒｚｅ）、アームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）１９９６年）。オリゴ糖配列は、毒素Ａの除去に特異的な結合部位をもたらし、この受容体模倣体は、非ペプチジルのリンカーアームを通って不活性支持体にカップリングされる。米国特許第５４８４７７３号明細書では、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに結合する、固体医薬品に共有結合したオリゴ糖配列についての記載がある一方、米国特許第６，０１３，６３５号明細書では、同じ概念についての記載があるが、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂが対象である。
【００６７】
クロストリジウム・ディフィシル毒素媒介性疾患を治療する別の方法には、それを必要とする対象への毒素結合性部分および重合体粒子を含有する有効量の毒素結合性組成物の投与が含まれる。少なくとも約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａは約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の組成物によって結合され、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａは約５％ウシ胎児血清を含有するリン酸塩緩衝溶液中の毒素結合性組成物で処理される。好ましくは、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａの約９０％に結合するのに必要な毒素結合性組成物の濃度は約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ；より好ましくは約０．８ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ；さらにより好ましくは約１ｍｇ／ｍＬ〜約３ｍｇ／ｍＬである。クロストリジウム・ディフィシル毒素媒介性疾患を治療する別の方法には、クロストリジウム・ディフィシル毒素結合性部分および重合体粒子を含有する毒素結合性組成物の有効量の必要としている対象への投与が含まれる。少なくとも約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａは約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の組成物によって結合され、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａは約５％ウシ胎児血清を含有するリン酸塩緩衝溶液中の毒素結合性組成物で処理される。好ましくは、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａの約９０％に結合するのに必要な毒素結合性組成物の濃度は約０．８ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ；より好ましくは約１ｍｇ／ｍＬ〜約６ｍｇ／ｍＬである。
【００６８】
様々な実施形態の一部では、クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢは精製される。約２時間〜約３６時間；好ましくは約４時間〜約２４時間；より好ましくは約１２時間〜約１８時間かけて、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａと毒素結合性組成物のインキュベーションを行いうる。インキュベーションは通常、約３０℃〜約４０℃；好ましくは約３７℃の範囲の温度で行われる。上清中の遊離毒素の量をクロストリジウム・ディフィシル毒素におけるＥＬＩＳＡによって測定し、遊離毒素の量を混合物に添加されたクロストリジウム・ディフィシル毒素の量から差し引くことから、重合体粒子に結合される毒素の量が算出された。試験から得られた値は、表８に一覧され、実施例８ではより詳細に記載される。
【００６９】
製剤、投与経路、用量
本明細書に記載の組成物またはそれらの医薬的に許容できる塩を多種多様な経路または投与様式を用いて患者に送達することが可能である。投与のための最も好ましい経路は、口、腸または直腸である。
【００７０】
必要に応じ、組成物を他の治療薬と併用して投与することが可能である。本発明の化合物とともに同時投与可能な治療薬の選択は、一つには治療される条件に依存するであろう。
【００７１】
重合体（またはそれらの医薬的に許容できる塩）は、それ単独で、あるいは活性化合物が１種もしくは複数種の医薬的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤との混合剤または混合物の中に存在する医薬組成物の形態で投与されうる。活性化合物の医薬品として使用可能な製剤に至るまでの処理を促進する賦形剤および補助剤を含む１種もしくは複数種の生理学的に許容できる担体を使用する従来の方法で、本発明による使用を意図した医薬組成物を調合することが可能である。適切な製剤は、選択される投与経路に依存している。
【００７２】
これらの組成物が好ましい経口投与用に使用される場合、種々の方法で同組成物を調合することが可能である。好ましくは、それは凍結乾燥、液体、固体、または半固体の形態であろう。水またはヒマシ油などの医薬品として不活性な液体担体を含有する組成物は経口投与に適すると考えうる。他の医薬品として適合する液体または半固体も使用可能である。かかる液体および半固体の使用は、当業者にとっては周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、１９９０年を参照のこと。
【００７３】
アップルソース、アイスクリームまたはプディングなどの半固体状食品と混合可能な組成物が好ましい場合がある。不快な味もしくは後味のない製剤が好ましい。組成物を直接に胃に送達するのに経鼻胃チューブも使用可能である。
【００７４】
固体組成物も使用可能であり、場合によって都合よく、好ましくは錠剤またはカプセル形態で提示される乳糖、澱粉、デキストリンまたはステアリン酸マグネシウムなどの従来の固体担体を含む、医薬品として不活性な担体を含有する製剤において使用可能である。カプセルはまた、カプセルを含有する液体またはゲルであってもよい。特にカプセル形態で使用する場合、不活性な医薬担体を加えずに組成物を単独で使用することも可能である。
【００７５】
通常、感染した患者の消化管に見出される毒素の中和および除去をもたらすように用量を選択する。有用な用量は、約１〜１００μｍｏｌのオリゴ糖／ｋｇ体重／日、好ましくは約１０〜５０μｍｏｌのオリゴ糖／ｋｇ体重／日である。用量レベルおよび投与スケジュールは、使用される特定のオリゴ糖の構造ならびに対象の年齢および状態などの因子に依存して変化する可能性がある。
【００７６】
先に検討したように経口投与は好ましいが、経直腸などの他の投与手段として製剤を検討することも可能である。これらの製剤の有用性は、使用される特定の組成物および同治療を受ける特定の対象に依存する場合がある。これらの製剤は、油性、水性、乳状でありうる液体担体を含有するかまたは投与様式に適する特定の溶媒を含有する。組成物は、単位用量形態かまたは複数回用量もしくはサブユニット用量で調合されうる。
【実施例】
【００７７】
実施例１：毒素結合性組成物の合成
以前に報告したように、ＳＭ１前駆体１を合成した。国際公開第０２／０４４１９０号パンフレットを参照のこと。
【化１】
【００７８】
ＳＭ１の合成：
エチレンジアミン（３７０ｍｍｏｌ）２５ｍＬおよびジメチルホルムアミド３０ｍＬの溶液に、１０ｇｍのＳＭ１前駆体１（１４．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を８５℃で１８時間撹拌した。ＴＬＣ（ジクロロメタン：メタノール：水＝６：４：０．１５）によって反応の進行を監視した。反応完了時に，ロータリーエバポレーターを用いて混合物を２０ｍＬに濃縮し、濃縮物をイソプロパノール１．５Ｌに注ぐことによってＳＭ１前駆体２を白沈として得た。濾過した沈殿物を真空下で１０時間乾燥させ、後のアクリロイル化に対して直接使用した。
【００７９】
粗ＳＭ１前駆体２をＭｅＯＨ／水混合物（容量比１：１）８０ｍＬ中に懸濁し、氷槽内で撹拌した。４．６ｇｍの炭酸ナトリウム（４４ｍｍｏｌ）の添加後、塩化アクリロイル（４４ｍｍｏｌ）３．６ｍＬを滴下漏斗で１０分かけて添加した。混合物を０℃から室温になるまで４時間撹拌した。ＴＬＣ（ジクロロメタン：メタノール：水＝６：４：０．３）によって反応の進行を監視した。反応完了時に無機塩を濾過して取り除き、４５℃未満でロータリーエバポレーターを用いて濾過物を濃縮した。カラムクロマトグラフィー精製（５：１〜２：１のジクロロメタン：メタノール混合物で溶出）によってアクリロイル化された生成物ＳＭ１（７．５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を得た。
【００８０】
ブロック共重合体の合成
０．２５ｇｍのＳＭ１、０．０５ｇｍのジメチルアクリルアミドおよび７ｍｇのジチオエステルＲＡＦＴ剤に、水／ジメチルホルムアミド混合物（容量比１：１）１．３６ｍＬを添加し、それを５０℃に加熱した。水３０μｌ中で０．９８ｍｇの開始剤、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジヒドロクロリド（ワコ（Ｗａｋｏ）製ＶＡ−０４４）を添加した。プロトンＮＭＲによって単量体変換を追跡し、ＧＰＣ分析によって重合体の分子量を得た。２〜３時間後に第１のブロック単量体の９０％を超える変換とともに、０．２７ｇｍのｎ−ブチルアクリレートを半連続的に３時間かけて添加した。ブチルアクリレート添加の完了時に、反応混合物をさらに３時間撹拌し、次いで水８ｍＬを混合物に添加し、それをラテックスの調製に直接に使用するかまたはエマルジョン重合に先立ち水で透析した。
【００８１】
ラテックスの調製
【００８２】
【表３】
【００８３】
ＫＰＳストック：
脱イオン水２ｍＬ中、５０ｍｇのＫＰＳ
【００８４】
ＳＭ１ブロック共重合体溶液１０ｍＬ、水３０ｍＬおよびスチレン０．３３ｍＬを１００ｍＬの三首モルトンフラスコに添加した。反応混合物をアルゴンで軽く洗浄し、マグネットバーを用いて７００ｒｐｍ、室温で２時間撹拌した。ＫＰＳストック溶液１０８μｌの添加によって重合を誘起し、温度を６０℃に上昇させた。ＫＰＳの添加の１．５〜３時間後、残存するスチレン（２×０．３３ｍＬ）を添加した。６時間重合後、温度を室温にし、グラスウールおよび０．４５μｍのＧＭＦフィルタによってラテックス溶液を濾過した。１０日にわたる脱イオン水での透析によって残存単量体の除去を行った。
【００８５】
このプロトコルを用いて様々な単量体組成物を除いた同ブロック共重合体を含む数種類の粒子懸濁液を生成した。表２を参照のこと。
【００８６】
【表４】
【００８７】
粒子表面に存在する糖の表面密度を以下のように算出した。
表面密度（μ当量／ｍ２）＝糖のμ当量／固体のｇｍ＊（６／（ｄ＊Ｄ））−１（式中、ｄは重合体粒子の密度、Ｄはミクロン単位の粒子直径である。）
【００８８】
ラテックスの調製−非イオン性開始剤
【００８９】
【表５】
【００９０】
Ｈ２Ｏ２ストック溶液の配合：３０重量％の過酸化水素３３μｌを脱イオン水１６７μｌに添加した。
【００９１】
アスコルビン酸ストック溶液の配合：１０ｍｇのアスコルビン酸を脱イオン水２ｍＬに添加した。
【００９２】
反応手順：ＳＭ１ブロック共重合体溶液７ｍＬ、水３５ｍＬおよびスチレン０．３ｍＬを、窒素下、１００ｍＬの三首モルトンフラスコ内で７００ｒｐｍ、室温で２時間撹拌した。それに続き、反応混合物を２時間かけて６０℃に加熱した。次いで、Ｈ２Ｏ２ストック溶液１１６ｍＬおよびアスコルビン酸ストック溶液１１２ｍＬを混合物に添加した。６０℃で６０分間攪拌後、残存スチレン（０．７〜０．９ｍＬ）を４０分ごとに２４０分かけて半連続的に添加した。スチレン添加サイクルの完了時に反応混合物をさらに２時間撹拌し、次いで温度を室温にし、ラテックス溶液を２５μｍの孔サイズの濾紙によって濾過した。脱イオン水での１０日にわたる透析によって残存単量体の除去を行った。
【００９３】
メソ細孔性ヒドロゲルを含有するＳＭ１の合成
【００９４】
【表６】
【００９５】
グローブボックス内で１０ｐｐｍ未満の酸素濃度でヒドロゲルの調製を行った。０．３２５ｇｍもしくは０．３５ｇｍの単量体（ＳＭ１、ビニルホルムアミド、ベンジルアクリルアミドおよびＮ，Ｎ’−エチレンビスアクリルアミド）、１．３ｍＬのポロゲンおよび１．５ｍｇのＶＡ−０４４を添加した。混合物を５０℃で一晩撹拌し、白い不透明なゴム状固体を得て、これを水８ｍＬ中の微粒子懸濁液中に３分間の超音波処理によって粉末化した。懸濁液をＤＩ水で２日間透析し、凍結乾燥機で乾燥させた（２日）。
【００９６】
実施例２：インビトロでの（ＥＬＩＳＡおよび細胞培養）アッセイ
２つのインビトロアッセイを用い、実施例１で合成した微粒子の毒素結合性特性および中和特性について測定した。図２は、微粒子で処理した毒素分子の生物活性の測定に用いたＥＬＩＳＡおよび組織培養アッセイの概要を表す。毒素のＥＬＩＳＡアッセイにおいて微粒子（１〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲の試験濃度）を毒素（濃度１ｎｇ／ｍＬ〜１６０μｇ／ｍＬ）とともに混合物を振動させることなく３７℃でインキュベートした。１８時間のインキュベーション後、微粒子／毒素混合物を遠心分離し、微粒子と結合された毒素の複合体を表すペレット状物質を除去した。この遠心分離ステップから得られる上清は、結合されていない毒素分子と、固定化毒素分子を検出するのに使用される、西洋わさびペルオキシターゼと共役されたポリクローナル抗体とを「捕捉する」ための、ＰＣＧ−４モノクローナル抗体からなる標準的なＥＬＩＳＡアッセイによって定量される結合されていない毒素分子を含有する。リアーリ，Ｄ．Ｍ．（Ｌｙｅｒｌｙ，Ｄ．Ｍ．）、Ｃ．Ｊ．フェルプス（Ｃ．Ｊ．Ｐｈｅｌｐｓ），Ｊ．トス（Ｊ．Ｔｏｔｈ）、およびＴ．Ｄ．ウィルキンズ（Ｔ．Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓ）、１９８６年、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｘｉｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」 Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．５４：７０−６頁を参照のこと。４つの異なる微粒子組成物に対する代表的なＥＬＩＳＡ特性を図３に示す。ＴＭ４７３Ｂ、ＴＭ４７３Ａ、およびＴＭ４６６Ｄの物質は、試験微粒子の最低濃度（１ｍｇ／ｍＬ）でインキュベーション混合物中の遊離毒素Ａ（開始濃度１ｎｇ／ｍＬ）を５０％よりも大きく低下させた。クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂの開始濃度での異なる微粒子のＩＣ９０（毒素の９０％が上清から除去される場合の微粒子の濃度）を表２に示す。
【００９７】
哺乳類上皮細胞での細胞培養アッセイは、試験微粒子とのインキュベーション後に結合されていない毒素分子の生物活性を評価するのに用いられる第２の方法を表す。このアッセイでは、標準の９６−ウェル組織培養形式でベロ細胞系（アフリカグリーンモンキーの腎臓上皮細胞）を培養し、（上記の如く）これに微粒子／毒素混合物とそれに続いて遠心分離ステップから得られた上清の希釈物を重ね合わせた。このアッセイを結合されていない遊離毒素を定量するためのＥＬＩＳＡ測定と組み合わせることで、結合されていない毒素に対する生物活性の測定が可能になる。いかなる場合でも、微粒子での予備処理により、細胞培養アッセイによる測定の如く、残存する結合されていない毒素が不活化されることはなかった。
【００９８】
細胞培養アッセイを用いることで、毒素との混合時に微粒子によってもたらされる中和の度合いも定量される。このアッセイでは、様々な濃度の微粒子（１〜２０ｍｇ／ｍＬ）を、「細胞の円形化」（すなわち細胞の塑性表面への正常な付着を破壊する細胞毒性作用であり、通常、細胞死または細胞内糸状構造の損失を示す）を誘発することで知られる固定量の毒素（０．３ｐｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ）と混合させる。一部の場合では、半透性膜（すなわち毒素に浸透可能）を有するトランスウェルを使用することにより、微粒子を細胞と直接接触した状態にならないようにした。これは微粒子−細胞の接触が細胞の毒素作用からの保護にとって不要であることを示すためであった。複数の細胞フィールド（＞１０）の顕微鏡検査によって毒素中和の相対範囲を比較し、コンフルエントな細胞成長のバックグラウンドにおける円形化された細胞の百分率を定量する。細胞の円形化からの９５％を超える保護をもたらす最小有効用量の微粒子を使用することで微粒子活性の測定が可能になる。表３にデータを示す。
【００９９】
【表７】
【０１００】
ＳＭ１含有微粒子は毒素Ｂの活性を中和させることも可能であった。上記の方法を用いることで、微粒子が１０ｍｇ／ｍＬの用量で使用される場合、負荷用量０．３ｐｇ／ｍＬの毒素Ｂに対する９５％を超える保護が得られた（図４参照）。
【０１０１】
図７は、微粒子ｔｍ４７３ｂにおける濃度範囲による結合された毒素ＡおよびＢの百分率を示す。
【０１０２】
実施例３：微粒子（ＴＭ４７３Ｂ）の結合能
ブロッキング用緩衝液（５％ウシ胎児血清を含有する１倍のリン酸塩で緩衝化した生理食塩水）で微粒子を希釈することにより、実施例１の微粒子試料の１種であるＴＭ４７３Ｂを２０、１０、５、および２．５ｍｇ／ｍＬの濃度の２倍溶液中に作製した。精製したクロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢ（テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ）のＴ３００１およびＴ３００２）を、ブロッキング用緩衝液で３６０〜２μｇ／ｍＬの範囲の２倍溶液に希釈した。チェッカーボード法で両希釈物を混合し微粒子に対する毒素の最終的な比率を１：１にした。
【０１０３】
微粒子を平衡結合に至らせるために、試料を３７℃で１８時間インキュベートした。１０，０００ｒｐｍで１時間の遠心分離により、結合された毒素ＡまたはＢを微粒子とともにペレット化した。遊離／平衡状態の毒素を含有する上清を回収し、毒素Ａ用または毒素ＡおよびＢ用ＥＬＩＳＡキット（テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ）のＣ．Ｄｉｆｆ Ｔｏｘ−Ａ Ｔｅｓｔ Ｔ５００１またはＣ．Ｄｉｆｆ Ｔｏｘ−Ａ／ＢＩＩ Ｔｅｓｔ Ｔ５０１５）によって濃度を測定した。
【０１０４】
結合された毒素の濃度を判定するため、平衡濃度を開始量から差し引いた。次いで、μｇ／ｍＬの結合された毒素の濃度をｍｇ／ｍＬの微粒子濃度で除することによって結合能を算出した。図５および図６に結果を示す。
【０１０５】
実施例４：インビボにおける微粒子の有効性試験：ウサギ回腸ループの毒性試験
ウサギ回腸ループのモデル試験にて実施例１における２種類の微粒子試料のＴＭ４７３ＡおよびＴＭ４７３Ｂをインビトロにおいて試験した。ウサギ回腸ループのモデルは、細菌タンパク質毒素の腸毒性を明らかにするためのモデルである（ダンカン（Ｄｕｎｃａｎ）およびストロング（Ｓｔｒｏｎｇ）、１９６９年）。同モデルを使用することで、コレラ毒素、大腸菌の不安定毒素、シガトキシン、ならびにウェルシュ菌のエンテロトキシンおよびクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａを含む様々なクロストリジウム毒素の腸管毒性活性を特徴付ける。
【０１０６】
クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａのウサギ回腸ループ試験用プロトコルは以下の通りである。
・ウサギ（雌雄いずれか、１２週齢超）を一晩絶食させ、次いで周縁耳静脈（ｍａｒｇｉｎａｌ ｅａｒ ｖｅｉｎ）にて静脈内注射したジアゼパム（５ｍｇ／ｍＬ）０．２５ｍＬと混合した塩酸ケタミン（１００ｍｇ／ｍＬ）０．２５ｍＬで麻酔した。
・ガス麻酔機を介して送達するハロタン（１．５〜２．５％で作用）、亜酸化窒素（２ｌ／分の流れ）および酸素（１ｌ／分）を使用して麻酔状態を維持した。
・麻酔をかけた各ウサギの腹部中央部の毛を剃り、一連のベタジンとイソプロピルアルコールの洗浄を交互に用いて無菌で調製し、５ｃｍの腹部切開を行った。
・回腸を慎重に引き抜き、最大６つの回腸ループ（長さ〜７〜１０ｃｍ以内）を、回腸部の各末端の１ｃｍまでを無菌の綿による結紮により密封することによって構成した。
・試験微粒子（最大２０ｍｇ／ｍＬ）と毒素Ａ（１０μｇ／ｍＬ）の混合物を含有する流体（０．５ｍＬ／ループ）を、各試験ループにおける近位の単結紮の約０．５ｃｍ直下位置に２６−ゲージ針によって注射した。
・注射部位を隔離し、穿刺部位の約０．５ｃｍ遠位でのさらなる結紮による漏れを防止した。
・ループにおける接種後、回腸を温かい生理食塩水に再び湿らし、ゆっくりと腹腔に戻した。筋肉壁を縫合し皮膚切開を閉じた後、麻酔回復期間に動物を保温し監視した。オキシモルホン（０．２５ｍＬ 筋肉内／ウサギ；１．５ｍｇ／ｍＬ）を麻酔回復前と手術の６〜８時間後に再度投与した。手術後、食物と水を控えた。
・手術の約８〜１２時間後、ビューサネージアＤ（Ｂｅｕｔｈａｎａｓｉａ Ｄ）（３９０ｍｇ／ｍＬのペントバルビタール、５０ｍｇ／ｍＬのフェニトイン）の０．５〜１．０ｍＬの静脈内注射によってウサギを安楽死させた。
・回腸を取り除き、個々のループ内に蓄積した流体を視覚的に評価した。次いで、陽性の各ループの長さおよび重量を測定し、グラム単位のループ含量の重量に対するセンチメートル単位のループ長さの比であるＶ／Ｌ（容量−長さ）比を算出するのにその含量を秤量した。
・Ｖ／Ｌ比＞０．３を有しかつ無圧で水の一貫性を有する漿液血液状流体を含有するものとして、陽性ループ（流体を蓄積させるもの）を定義した。陰性ループは、回復可能な内容物、すなわちＶ／Ｌ比＜０．１を有するそれらのループを有しなかった。
【０１０７】
このプロトコルを用いて、微粒子の試験試料であるＴＭ４７３ＢおよびＴＭ４７３Ａは、２．５ｍｇ／ｍＬで投与される場合、毒素Ａ（１０μｇｍ／ｍＬ）の腸毒性に対する保護を可能にした。表４を参照のこと。
【０１０８】
【表８】
【０１０９】
実施例５：炭水化物単量体の含量が低下したジブロックミセルおよび微粒子の調製および試験
さらなる実験セットでは、ジブロック共重合体ミセルと、炭水化物単量体（ＳＭ１）の含量が低下した、対応する微粒子との製剤をさらに調製し、インビトロにおいて評価した。特に、約３３重量％の炭水化物単量体ＳＭ１（本明細書において「ジブロック共重合体Ａ」として示される）を含み、かつそれとは別に約２１重量％の炭水化物単量体ＳＭ１（本明細書において「ジブロック共重合体Ｂ」として示される）を含むジブロック共重合体を調製した。ジブロック共重合体に含有される炭水化物単量体の含量は、実施例１に記載の如く調製されたジブロック共重合体に含有される約４４重量％をなす炭水化物単量体ＳＭ１と比べて実質的に低下した。ジブロック共重合体Ｂから形成されるミセル溶液を細胞培養アッセイでインビトロにおいて実質的に評価した。さらに、ジブロック共重合体Ａとジブロック共重合体Ｂの各々からラテックス微粒子を合成し、さらにインビトロにおいて評価した。
【０１１０】
ジブロック共重合体ＡおよびＢの調製
炭水化物単量体ＳＭ１を、実質的に実施例１に記載のごとく調製した。炭水化物単量体（ＳＭ１）の含量が相対的に低下した、ジブロック共重合体の２種類の製剤を表５に記載の試薬および量を用いて以下のように調製した。
【０１１１】
【表９】
【０１１２】
ジブロック共重合体ＡおよびＢの各々については、ＴＨＭＡ、ＤＭＡ、炭水化物単量体（ＳＭ１）およびＣＴＡの混合物に水／ＤＭＦ混合物３．４ｍＬを添加し、グローブボックス内で５０℃に加熱した。ＶＡ−０４４ストック溶液（ＤＩ水０．２ｍＬ中２０ｍｇ）２０μＬを添加し、混合物を３時間撹拌した。ｎ−ブチルアクリレートを次の３時間にわたり半連続的に添加し、その後で混合物を室温まで冷却する前に３時間重合した。ＤＩ水１０ｍＬを混合物に添加し、その後でジブロック共重合体をＤＩ水で２４時間透析し、ジブロックミセル溶液を形成した。
【０１１３】
インビトロでのジブロック共重合体Ｂミセルの細胞培養アッセイ
インビトロにおける細胞培養アッセイで、ジブロック共重合体Ｂから形成したミセル溶液を評価した。このアッセイでは、様々な濃度のジブロック共重合体Ｂミセル（０．７８ｍｇ／ｍＬ、１．５６ｍｇ／ｍＬおよび３．１２５ｍｇ／ｍＬ）を有する溶液でベロ細胞を処理した。ここで各場合においては、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａの固定量（１ｎｇ／ｍＬ）と混合した。固定量の毒素は、それ単独で使用される場合、「細胞の円形化」（すなわち、細胞の塑性表面への正常な付着を破壊する細胞毒性作用であり、通常は細胞死または細胞内糸状構造の損失を示す）を誘発することがわかった。一対照として、処理していない（すなわち毒素またはジブロック共重合体Ｂミセルで処理していない）単層のベロ細胞を使用した。別の対照として、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ（１ｎｇ／ｍＬ）単独で処理したベロ細胞を使用した。複数の細胞領域（＞１０）の顕微鏡検査によって毒素中和における相対的な範囲を比較し、コンフルエントな細胞成長のバックグラウンドにおける円形化された細胞の百分率を定量した。図８に結果を示す。
【０１１４】
ジブロック共重合体ＡおよびＢを使用する微粒子の調製
表６に記載の試薬および量を使用し、ジブロック共重合体Ａとジブロック共重合体Ｂの各々からラテックス微粒子を合成した。本明細書では生成された微粒子の各々を糖粒子ＡおよびＢと称し、それぞれｔｉｌｍ２０９Ａおよびｔｉｌｍ２０９Ｂとも称する。
【０１１５】
【表１０】
【０１１６】
以下に示すように、微粒子Ａ（ｔｉｌｍ２０９Ａ）およびＢ（ｔｉｌｍ２０９Ｂ）をジブロック共重合体ＡおよびＢの各溶液から別々に合成した。２５０ｍＬの三首モルトンフラスコに、ジブロック溶液、スチレン０．８ｍＬおよびＤＩ水７０ｍＬを添加し、窒素下、室温で一晩撹拌した。温度を６０℃に上昇させ、ＫＰＳストック溶液（ＤＩ水１ｍＬ中２５ｍｇ）２４０μＬの添加前にさらに４時間撹拌した。次の５時間の間にスチレン１．６ｍＬを添加した。スチレンの添加完了の２時間後に、ｔ−ブチルペルオキシベンゾエート１０μＬおよびアスコルビン酸２５ｍｇを添加した。次の１０時間の間に重合体混合物を連続撹拌し、孔サイズが２５μｍの濾紙（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）製）によって濾過した。生成される糖粒子懸濁液をＤＩ水で１０日間透析した。
【０１１７】
微粒子ＡおよびＢのインビトロでのＥＬＩＳＡアッセイ
インビトロでのＥＬＩＳＡアッセイを用い、微粒子Ａ（ｔｉｌｍ２０９Ａ）およびＢ（ｔｉｌｍ２０９Ｂ）によって結合された毒素ＡおよびＢの百分率を測定した。微粒子ＡおよびＢの各々に対する別々の実験において、５％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中での５〜０．２５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の微粒子を、１０μｇ／ｍＬの精製したクロストリジウム・ディフィシル毒素ＡまたはＢ（テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ））とともに３７℃で１２〜１８時間インキュベートした。混合物を１０，５００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、結合された毒素と微粒子の複合体を沈殿させた。毒素Ａに特異的なＥＬＩＳＡ（テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ） ＃Ｔ５００１ クロストリジウム・ディフィシル Ｔｏｘ−Ａ試験）または毒素ＡおよびＢに特異的なＥＬＩＳＡ（テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ） ＃Ｔ５０１５ クロストリジウム・ディフィシル Ｔｏｘ−Ａ／ＢＩＩ試験）により、上清中に残存する遊離毒素の量を測定した。図９Ａおよび図９Ｂに結果を示す。
【０１１８】
微粒子Ｂのインビトロでの細胞培養アッセイ
インビトロでの細胞培養による細胞毒性アッセイにて、微粒子Ｂ（ｔｉｌｍ２０９Ｂ）を評価した。このアッセイでは、１０％ウシ胎児血清を加えたＭＥＭ（メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ））を有する９６−ウェルプレートでベロ細胞（ＡＴＣＣ）のコンフルエントな単層を成長させた。最終濃度１ｎｇ／ｍＬの精製したクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ（テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ））を、成長培地内で５ｍｇ／ｍＬのｔｉｌｍ２０９Ｂ微粒子と混合し、３７℃、５％ ＣＯ２／９５％空気で１８時間かけて単層に適用した。インキュベーション後、細胞の毒素媒介性形態変化に対して顕微鏡検査を行い、単層の破壊および細胞の円形化によって細胞を同定した。図１０Ａ〜１０Ｃに示す結果は、１ｎｇ／ｍＬの毒素Ａのベロ細胞に対する作用が５ｍｇ／ｍＬのｔｉｌｍ２０９Ｂによって中和させることを明らかにしている。
【０１１９】
実施例６：インビトロでの競合結合実験−Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃの特異性
この実施例では、インビトロでの競合結合アッセイを含む一連の実験を行い、実質的に実施例１に記載の如く調製したクロストリジウム・ディフィシル毒素結合性微粒子の特異性を明らかにした。
【０１２０】
別々の実験で、三糖Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃ、その異性体のグロボトリオース（Ｇａｌα（１，４）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃ）、乳糖（Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃ）、およびセロビオース（Ｇｌｃβ（１，４）Ｇｌｃ）を含む４種類の各遊離オリゴ糖における、毒素Ａおよび毒素Ｂの結合に対するクロストリジウム・ディフィシル毒素結合性微粒子との競合能についてアッセイした。１０μｇ／ｍＬの毒素Ａまたは毒素Ｂへの結合における２ｍｇ／ｍＬの毒素結合性微粒子に対する各場合において、６．２５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲の濃度で遊離オリゴ糖の試験を行った。混合物を３７℃で１６時間インキュベートした。遠心分離によって結合された毒素を含む微粒子を沈殿させ、ＥＬＩＳＡ（テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ））によって上清中の遊離毒素量を測定した。
【０１２１】
図１１Ａおよび図１１Ｂに、これらの競合結合実験から得られた結果を示す。図１１Ａについては、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａは、上記オリゴ糖において濃度が相対的に高くても、遊離オリゴ糖であるグロボトリオース（Ｇａｌα（１，４）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃ）、乳糖（Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃ）、およびセロビオース（Ｇｌｃβ（１，４）Ｇｌｃ）の全体に存在する毒素結合性微粒子に特異的に結合する。それに対し、毒素結合性微粒子によるクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａの結合範囲は、遊離した三糖Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃの濃度に依存して変化した。これらのデータは、毒素結合性微粒子と毒素Ａの相互作用における特異的な性質を明らかにし、かつ微粒子による毒素Ａの結合はＧａｌα（１，３）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃリガンドによって特異的に媒介されることを裏付けている。それに対し、図１１Ｂは、毒素Ｂが、上記オリゴ糖において濃度が相対的に高くても、試験対象の三糖Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃ、グロボトリオース、乳糖およびセロビオースといった４種類の各遊離オリゴ糖の全体に存在する毒素結合性微粒子に特異的に結合することを示す。それゆえ、毒素Ｂは毒素結合性微粒子によって結合されるが（図７および実施例２でのそれに関する考察を参照）、遊離した三糖Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃ（他の３種類のオリゴ糖のいずれでもない）が毒素Ｂへの結合のために微粒子とうまく競合することから、毒素Ｂの結合は毒素結合性微粒子のＧａｌα（１，３）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃリガンドによって直接的に媒介されるようには見られない。
【０１２２】
さらなる実験では、炭水化物単量体のＳＭ１（αＧａｌ−Ｃ８−リンカー；実質的に実施例１に記載の如く調製されたもの）における、毒素Ａの結合および毒素Ｂの結合に対するクロストリジウム・ディフィシル毒素結合性微粒子との競合能について同様にアッセイした。１０μｇ／ｍＬの毒素Ａまたは毒素Ｂへの結合における２ｍｇ／ｍＬの毒素結合性微粒子に対し、１２．５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲の濃度でＳＭ１単量体の試験を行った。混合物を３７℃で１６時間インキュベートした。遠心分離によって結合された毒素を含む微粒子を沈殿させ、ＥＬＩＳＡ（テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ））によって上清中の遊離毒素量を測定した。
【０１２３】
図１１Ｃに結果を示す。予想どおり図１１Ａに関連して上で検討した結果に基づき、微粒子による毒素Ａの結合は、微粒子上および炭水化物単量体ＳＭ１上の両方に存在するＧａｌα（１，３）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃリガンドによって競合的に媒介される。毒素Ｂの結合については、図１１Ｃは、炭水化物単量体ＳＭ１がより高い濃度で毒素結合性微粒子と競合することで毒素Ｂと結合可能であることを示す。これは理論に縛られることなく、（遊離オリゴ糖を含む図１１Ｂのデータには媒介が全く認められないことから）毒素結合性糖粒子とクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂの間の相互作用が、（例えば炭水化物単量体ＳＭ１の）疎水部分または三糖リガンドと（例えば炭水化物単量体ＳＭ１の）疎水部分の組み合わせにより、少なくとも部分的に媒介されるといういくつかの証拠をもたらす。
【０１２４】
実施例７：インビボにおけるハムスターのクロストリジウム・ディフィシル負荷試験
この実施例では、クロストリジウム・ディフィシル関連性下痢の治療のために、インビボでハムスターモデルを使用し、実質的に実施例１（本明細書ではＹ１０３Ａ２と指定）に記載の如く調製された毒素結合性微粒子について試験した。
【０１２５】
ハムスターモデル
一般に、クロストリジウム・ディフィシルへの暴露に先立ち抗生物質をハムスターに投与すると、３〜５日後、下痢や大腸炎に加え、死さえも招くことが知られている。ハムスターにおいてクロストリジウム・ディフィシルによって誘発される全腸炎は盲腸および末端回腸で発症し、粘膜出血を伴う粘膜上皮細胞の増殖および細胞上での変性性の表面変化を特徴とする。それに対し、ヒト疾患は滲出および炎症状態での巣状腺窩壊死として結腸内に見られる（プライス（Ｐｒｉｃｅ）ら、１９７９年）（以下に十分に記載）。これらの組織学的な違いにもかかわらず、クロストリジウム・ディフィシル関連性下痢の細菌由来およびその活性疾患における毒素ＡおよびＢの分泌への依存性により、ハムスターモデルがヒト疾患の適切な模倣となる（バートレット（Ｂａｒｔｌｅｔｔ）ら、１９７８ａ；バートレット（Ｂａｒｔｌｅｔｔ）ら、１９７８ｂ；チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、１９７８年）。
バートレット，Ｊ．（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．）、Ｃ．ＴＷ、およびＧ．Ｍ．１９７８ａ．「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｃｏｌｉｔｉｓ ｄｕｅ ｔｏ ｔｏｘｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ」Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ２９８：５３１−５３４頁
バートレット，Ｊ．Ｇ．（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｇ．）、Ｔ．Ｗ．チャン（Ｔ．Ｗ．Ｃｈａｎｇ）、Ｎ．ムーン（Ｎ．Ｍｏｏｎ）、およびＡ．Ｂ．オンダードンク（Ａ．Ｂ．Ｏｎｄｅｒｄｏｎｋ）１９７８ｂ．「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｅｔｈａｌ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｈａｍｓｔｅｒｓ：ｓｔｕｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｅｌｅｖｅｎ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｏ ｓｕｐｐｏｒｔ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｏｘｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ」Ａｍ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ．３９：１５２５−３０頁
チャン，Ｔ．Ｗ．（Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｗ．）、Ｊ．Ｇ．バートレット（Ｊ．Ｇ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ）、Ｓ．Ｌ．ゴルバッハ（Ｓ．Ｌ．Ｇｏｒｂａｃｈ）、およびＡ．Ｂ．オンダードンク（Ａ．Ｂ．Ｏｎｄｅｒｄｏｎｋ）１９７８年「Ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｈａｍｓｔｅｒｓ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ」Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２０：５２６−９頁
プライス，Ａ．Ｂ．（Ｐｒｉｃｅ，Ａ．Ｂ．）、Ｈ．Ｅ．ラルソン（Ｈ．Ｅ．Ｌａｒｓｏｎ）、およびＪ．クロウ（Ｊ．Ｃｒｏｗ．）１９７９年「Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈａｍｓｔｅｒ：ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｃｏｌｉｔｉｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｉａｒｒｈｏｅａ」 Ｇｕｔ．２０：４６７−７５頁
を参照のこと。
【０１２６】
ハムスターの株および数
これらの実験では、ハーラン・ラボラトリーズ（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からハムスターを入手し、治療開始前に７日間隔離状態で保持した。隔離後、ハムスターの体重を測り、無作為に４群に割り付けた。下記の表７にまとめたように、群１は６匹の動物を含む対照群であった。群２〜４はそれぞれ８匹の動物を含む治療群であった。
【０１２７】
収容
ハムスターを、水および食物への接近を自由にした状態で陽圧のケージ内に個別に収容した（マイクロベント・エンバイロンメンタル・システム（Ｍｉｃｒｏ−Ｖｅｎｔ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｙｓｔｅｍ）、アレンタウン・ケージング・アンド・イクイップメント（Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ Ｃａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏ．）、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、ニュージャージー州）（Ｐｕｒｉｎａ ５０００）。
【０１２８】
治療モデル
２日前、下記の表７に示すレジメンに従い、予防的栄養を開始した。１日前、すべての群内の動物に、経口栄養によりクロストリジウム・ディフィシル（ＶＰＩ１０４６３）の一晩培養液由来の洗浄した細胞１０６個で感染させた。全４群中の動物に、０日目（１日前の翌日）に１ｋｇ当たり１０ｍｇのリン酸クリンダマイシンを皮下注射し、疾患を誘発した。以下のレジメンに従い、２日前〜６日目にハムスターに３通りの等しい１日用量で栄養した。
【０１２９】
【表１１】
【０１３０】
リン酸塩で緩衝化した生理食塩水中に毒素結合性微粒子を２０ｍｇ／ｍＬで投与した。栄養前に動物における罹患率および死亡率ならびにクリンダマイシン治療後の１４日間、少なくとも１日２回を基本に動物における下痢の有無について観察した。
【０１３１】
図１２に示す結果は、毒素結合性微粒子がクロストリジウム・ディフィシルで負荷されたハムスターを保護することを明示している。対照群１（対照；毒素結合性微粒子を含まない）において、動物７匹が１４日間試験のうちの２日目の試験で死亡した。治療群２〜４において、これらのデータは、生存が用量に依存し、再発を全く観察しなかったことを示す。特に群２では、ハムスターは試験を通して１匹も死亡しなかった。群３では、１日目に動物１匹が死亡し、２種類の動物の尾が湿っている（下痢の証拠）ことが観察されたが、動物は完全に回復しなかった。群４では、動物５匹が死亡し、これらのうちの１匹の動物の尾が湿っていることが観察され、動物はこの観察の４８時間以内に死亡した。すべての他の死亡は一般に急性であった（すなわち湿った尾を事前に観察することがなかった）。
【０１３２】
実施例８：Ｙ１０３Ａ２ナノ粒子による毒素結合性の測定
５％ウシ胎児血清を含有するリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）中で０．２５〜５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度のＹ１０３Ａ２ナノ粒子（メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、Ｈｅｒｎｄｏｎ、バージニア州）を、１０μｇ／ｍＬの精製したクロストリジウム・ディフィシル毒素ＡまたはＢ（テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ）、Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ、バージニア州）とともに３７℃で１２〜１８時間インキュベートした。混合物を１０，５００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し（ソーバル（Ｓｏｒｖａｌｌ））、結合された毒素とナノ粒子の複合体を沈殿させた。テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ）製クロストリジウム・ディフィシル毒素用ＥＬＩＳＡキットを使用して上清中に残存する遊離毒素の量を定量し、結合された毒素の百分率を算出した。このデータから９０％の毒素に結合したナノ粒子の濃度を算出した。表８は、Ｙ１０３Ａ２のバッチから得られたスクリーニングデータを列挙する。
【０１３３】
【表１２】
【０１３４】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示されかつ記載されている一方、かかる実施形態があくまでも例として提供されることは当業者には明らかであろう。ここで当業者であれば、本発明から逸脱することなく、極めて多数の変形、変化、および置換えについて着想するであろう。本発明の実施に際し、本明細書に記載の発明の実施形態に対する様々な選択肢を利用可能であることが理解される必要がある。添付の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、かつそれによりこれらの特許請求の範囲の中の方法および構造ならびにそれらの等価物が網羅されるように意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１Ａ】毒素結合性粒子を合成する方法（図１Ａ）およびかかる方法から得られる毒素結合性粒子を表す概略図（図１Ｂ）である。
【図１Ｂ】毒素結合性粒子を合成する方法（図１Ａ）およびかかる方法から得られる毒素結合性粒子を表す概略図（図１Ｂ）である。
【図２】微粒子で処理される毒素分子の生物活性を測定するのに用いられるＥＬＩＳＡおよび組織培養アッセイの概要を表す概略図である。
【図３】４つの相異なる毒素結合微粒子組成物に対するＥＬＩＳＡの特性データを図示するグラフである。
【図４】細胞を図示しかつベロ細胞用アッセイでＳＭ１含有微粒子によって可能になる毒素Ｂの保護を示す４つの画像を含む。
【図５】微粒子のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに対する結合能を表すグラフである。
【図６】微粒子のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂに対する結合能を表すグラフである。
【図７】異なる濃度の微粒子によってクロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢが除去される割合（％）を表すグラフである。
【図８】細胞を図示しかつベロ細胞用アッセイでジブロック共重合体Ｂを含有するミセル溶液によって可能になる毒素Ａの保護を示す５つの画像を含む。
【図９Ａ】クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ（図９Ａ）および毒素Ｂ（図９Ｂ）に対する２つの異なる毒素結合微粒子についてのＥＬＩＳＡの特性データを図示するグラフである。
【図９Ｂ】クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ（図９Ａ）および毒素Ｂ（図９Ｂ）に対する２つの異なる毒素結合微粒子についてのＥＬＩＳＡの特性データを図示するグラフである。
【図１０Ａ】細胞を図示し、かつ処理されていないベロ細胞の単層（図１０Ａ）、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａで処理されたベロ細胞（図１０Ｂ）、およびクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａと毒素結合性微粒子の両方で処理されたベロ細胞（図１０Ｃ）を示す画像である。
【図１０Ｂ】細胞を図示し、かつ処理されていないベロ細胞の単層（図１０Ａ）、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａで処理されたベロ細胞（図１０Ｂ）、およびクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａと毒素結合性微粒子の両方で処理されたベロ細胞（図１０Ｃ）を示す画像である。
【図１０Ｃ】細胞を図示し、かつ処理されていないベロ細胞の単層（図１０Ａ）、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａで処理されたベロ細胞（図１０Ｂ）、およびクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａと毒素結合性微粒子の両方で処理されたベロ細胞（図１０Ｃ）を示す画像である。
【図１１Ａ】遊離オリゴ糖に対して測定された毒素Ａ（図１１Ａ）；遊離オリゴ糖に対して測定された毒素Ｂ（図１１Ｂ）；および遊離炭水化物単量体ＳＭ１に対して測定された毒素Ａと毒素Ｂの両方（図１１Ｃ）を含むインビトロでの競合アッセイにおいて、本発明の毒素結合性微粒子によって結合されたクロストリジウム・ディフィシル毒素の百分率を図示するグラフである。
【図１１Ｂ】遊離オリゴ糖に対して測定された毒素Ａ（図１１Ａ）；遊離オリゴ糖に対して測定された毒素Ｂ（図１１Ｂ）；および遊離炭水化物単量体ＳＭ１に対して測定された毒素Ａと毒素Ｂの両方（図１１Ｃ）を含むインビトロでの競合アッセイにおいて、本発明の毒素結合性微粒子によって結合されたクロストリジウム・ディフィシル毒素の百分率を図示するグラフである。
【図１１Ｃ】遊離オリゴ糖に対して測定された毒素Ａ（図１１Ａ）；遊離オリゴ糖に対して測定された毒素Ｂ（図１１Ｂ）；および遊離炭水化物単量体ＳＭ１に対して測定された毒素Ａと毒素Ｂの両方（図１１Ｃ）を含むインビトロでの競合アッセイにおいて、本発明の毒素結合性微粒子によって結合されたクロストリジウム・ディフィシル毒素の百分率を図示するグラフである。
【図１２】インビボにおけるハムスターのクロストリジウム・ディフィシル負荷試験の結果を要約するデータを図示するグラフである。
【技術分野】
【０００１】
細菌外毒素は、多数の機序を進行させることで高感受性を示す真核生物の標的細胞内部の重要な代謝過程を改変している、広範囲の分泌細菌タンパク質を表す。一般に、これらの毒素は、宿主細胞膜を損傷させるかまたは細胞内の正常な生理学的過程の維持にとって重要なタンパク質を修飾することによって作用を発揮する。
【０００２】
偽膜性大腸炎（ＰＭＣ）は、重篤でかつ致死性を示す場合がある胃腸疾患として理解されている。グラム陽性の胞子形成細菌であるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、ＰＭＣおよび抗生物質関連性大腸炎（ＡＡＣ）の主要な原因菌として既知のものである。
【０００３】
ＰＭＣまたはＣＤＡＤ患者に対する現行の治療には、関連の抗菌剤または化学療法剤の中止、非特異的な支援策、およびクロストリジウム・ディフィシルに特異的な抗生物質による治療が含まれる。最も一般的な抗菌治療の選択肢として、バンコマイシン、メトロニダゾール、テイコプラニン、フシジン酸、およびバシトラシンが挙げられる。抗生物質によるＣＤＡＤの治療は疾患の臨床上の再発に関連する。再発の頻度は５〜５０％であり、再発率の２０〜３０％は最も一般的に引用される数字であることが報告されている。再発はほぼ等しい頻度で起き、これは上に挙げた抗生物質のいずれかを用いる主な治療における薬剤、用量、または期間とは無関係である。対照の抗生物質が問題を提起する場合、治療上の主な課題は複数回にわたって再発した患者の管理において認められる。
【０００４】
腸管でのクロストリジウム・ディフィシル毒素活性の直接中和におけるいくつかのアプローチが報告されている。第１に、数グラムの量のコレスチラミンおよびコレスチポールなどのアニオン交換樹脂が抗生物質と組み合わせて経口投与されている。このアプローチを用い、軽度から中程度の疾患患者、ならびにＣＤＡＤの再発をした個人の治療が行われている。テデスコ，Ｆ．Ｊ．（Ｔｅｄｅｓｃｏ，Ｆ．Ｊ．）（１９８２年）「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｃｏｌｉｔｉｓ」Ａｍ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ７７（４）：２２０−１頁；モグ、Ｇ．Ａ．（Ｍｏｇｇ，Ｇ．Ａ．）、Ｙ．アラビ（Ｙ．Ａｒａｂｉ）ら（１９８０年）「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒｉａｌｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｌｉｔｉｓ」Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｓｕｐｐｌ（Ｓｕｐｐｌ２２）：４１−５頁を参照のこと。イオン交換樹脂による治療では、毒素Ａの特異的除去がもたらされることなく、対照のＣＤＡＤに対し樹脂と相乗的に作用することが意図された抗生物質が除去されうる。さらに、毒素Ａを除去するのに必要な大量の樹脂をそれらの不快な味と組み合わせることで、上記アプローチの使用が抑えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記を考慮すると、クロストリジウム・ディフィシルに起因するＰＭＣ症候群および毒素に起因する他の疾患を治療する化合物または化合物の組み合わせに対して需要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、毒素媒介性疾患（ｔｏｘｉｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の治療に対する組成物および方法に関する。
【０００７】
本発明の一態様は、毒素結合性オリゴ糖などの毒素結合性部分、ならびに疎水性ブロックおよび１種もしくは複数種の付加的重合体ブロックを含むブロック共重合体（例えば、ブロック共重合体粒子を例として含む重合体粒子）を含む毒素結合性組成物である。好ましくは、毒素結合性部分は、ブロック共重合体の１種もしくは複数種の付加的重合体ブロックに付着するかまたは連結される（すなわち連結部分によって直接的もしくは間接的に共有結合される）。
【０００８】
本発明のこの態様の範囲内の好ましい実施形態では、毒素結合性組成物は毒素結合性オリゴ糖およびブロック共重合体（例えば、ブロック共重合体粒子を例として含む重合体粒子として）を含む。ブロック共重合体（または共重合体粒子）は疎水性ブロックおよび親水性ブロックを含み、毒素結合性オリゴ糖はブロック共重合体の親水性ブロックに付加されているかまたは連結されている状態にある。
【０００９】
本発明のこの態様の範囲内の別の好ましい実施形態では、毒素結合性組成物は毒素結合性部分およびブロック共重合体（ブロック共重合体粒子を例として含む重合体粒子など）を含む。ブロック共重合体は、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含みうる。ブロック共重合体が水性媒体内でミセルを形成しうるように、疎水性ブロックは化学的に架橋されるかまたは物理的に包まれる。毒素結合性部分は、親水性ブロックに付着されているかまたは連結されている。
【００１０】
本発明の別の態様は、毒素結合性部分およびポリマーナノ粒子を含む毒素結合性組成物であり、毒素結合性部分はナノ粒子に連結されかつナノ粒子は実質的に胃腸内腔（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｌｕｍｅｎ）から胃腸粘膜細胞内に吸収されない。
【００１１】
本発明のさらに別の態様は、クロストリジウム・ディフィシル毒素結合性部分および重合体粒子を含有する毒素結合性組成物であり、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａが約５％ウシ胎児血清を含有するリン酸塩緩衝溶液中の毒素結合性組成物で処理され、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の同組成物により、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａの少なくとも約９０％が結合される。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、重合体粒子などの粒子に付着されているかまたは連結されているクロストリジウム・ディフィシル毒素結合性オリゴ糖を有する毒素結合性組成物であり、粒子の単位表面積当たりのオリゴ糖のモル含量は約０．３μ当量／ｍ２もしくは約１μｍｏｌ／ｍ２よりも大きい。
【００１３】
本発明の第３の態様は、重合体粒子などの粒子に付着されているか連結されているオリゴ糖を含むタンパク質結合組成物であり、粒子の単位表面積当たりのオリゴ糖のモル含量は約０．３μ当量／ｍ２もしくは約１μｍｏｌ／ｍ２よりも大きい。オリゴ糖は水可溶性タンパク質に結合しうる。好ましくは、粒子はタンパク質ではなく、デンドリマーまたはリポソームの形態ではなく、かつ分子として水溶性を示さない。これらの組成物は、好ましくは約０．５ｍ２／ｇｍ〜約６００ｍ２／ｇｍの表面積を有し、それに加えまたはその代わりとして、単位重量当たりのオリゴ糖のモル含量は粒子の１グラム当たり約１００μｍｏｌよりも大きい。
【００１４】
本発明の第１、第２または第３の態様のいずれかの範囲内に含まれた実施形態を含む一部の実施形態では、毒素結合性部分（例えばオリゴ糖）が親水性ブロックに付着されるかまたは連結される場合、粒子は疎水性および親水性ブロックを有する共重合体粒子でありうる。ブロック共重合体は、コアを形成する疎水性ブロックおよびシェルを形成する親水性ブロックを有するミセルの形態であってもよい。例えば付加的単量体から形成された付加的重合体または重合体ブロックを含めることで、例えば疎水性コアが形成されるかまたは安定化される。特に好ましいアプローチでは、ミセルは、ブロック共重合体の疎水性ブロックに化学的に架橋するかまたは物理的に包むかまたはそうでなければ安定化させる付加的重合体または重合体ブロックを含んでもよい。適切な付加的単量体（付加的なコアを安定化させる重合体の形成に適する）の例として、これらに限定されないが、スチレン、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリレート、アクリル酸のＣ１〜Ｃ１２アルコールエステル、メタクリル酸のＣ１〜Ｃ１２アルコールエステル、ビニルトルエン、およびＣ２〜Ｃ１２カルボン酸のビニルエステルが挙げられる。好ましくは、親水性ブロックはジメチルアクリルアミドの重合体であり、かつ疎水性ブロックは、アクリル酸のＣ１〜Ｃ１２アルコールエステル、メタクリル酸のＣ１〜Ｃ１２アルコールエステル、スチレン、ビニルトルエン、およびＣ２〜Ｃ１２カルボン酸のビニルエステルの重合体または共重合体である。好ましくは、オリゴ糖は８−メトキシカルボニルオクチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１，４）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドである。本発明の実施形態のいずれ場合でも、本発明の粒子を微粒子と称することが可能である。しかし、特定の実施形態が微粒子と称される場合でさえ、かかる実施形態が必ずしも特定の大きさの範囲の粒子に限定されることはない。それゆえ、微粒子の言及においては、一般に、例えば全直径が約１ｍｍ未満の小型粒子に言及する。しかし特に、微粒子の言及においては、ミクロン規模もしくはナノ規模の寸法（例えば直径）を有することを含む、実質的により小さい粒子を除外するつもりはない。本明細書では、毒素結合性オリゴ糖などのオリゴ糖を含む粒子を糖粒子と称してもよい。
【００１５】
一般に、本発明の第１、第２または第３の態様の実施形態では、毒素結合性部分は細菌外毒素などの細菌毒素に対して結合親和性を示しうる。それゆえ、毒素結合性部分は、ヒト細胞を含む哺乳類細胞などの真核細胞内の代謝過程を改変する分泌細菌タンパク質に対して結合親和性を示しうる。毒素結合性部分は、宿主の粘膜表面上で作用可能な毒素に結合するかそれを中和させることが可能である。特に粘膜表面は、口、鼻、呼吸器、胃腸、泌尿器、生殖器および耳の粘膜表面からなる群から選択可能である。
【００１６】
毒素媒介性疾患の治療において本明細書に記載の組成物を使用してもよい。一部の実施形態では、組成物は下痢、偽膜性腸炎、または抗生物質関連性大腸炎などのクロストリジウム・ディフィシル毒素媒介性疾患の治療において使用される。
【００１７】
本明細書において記述されたすべての出版物、特許、および特許出願は、あたかも各個々の出版物もしくは特許出願が参照により援用されるものとして具体的かつ個別に示される場合と同程度に、本明細書において参照により援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本明細書において毒素と結合しかつ毒素媒介性疾患を治療するための方法および組成物が提供される。好ましい実施形態では、組成物は、毒素結合性部分で機能的にされる粒子、および好ましくは特定のオリゴ糖配列など、単位重量または単位表面積当たりで高密度な毒素結合性部分を含む。オリゴ糖などの毒素結合性部分は細菌毒素などの毒素に結合可能である。好ましい組成物は、毒素Ａおよび／または毒素Ｂなどのクロストリジウム・ディフィシル毒素に結合する組成物である。クロストリジウム・ディフィシル毒素に照らして本明細書に記載の多数の実施形態が説明されかつ検討されるが、本発明はそれらに限定されることはない。
【００１９】
特定の好ましい実施形態では、本来ならクロストリジウム・ディフィシル毒素に対して中程度の親和性を示す、本明細書で用いられるオリゴ糖配列は、粒子表面上に高密度に提示されると極めて高い結合速度を示した。特定の理論に拘束されたくないが、表面に付着される高密度のオリゴ糖部分は多価効果をもたらし、毒素への結合が増強される結果になると考えられる。すなわち、オリゴ糖を有する粒子の広範囲の親和性は個々のオリゴ糖の親和性の合計分よりも高い。第１の結合事象が生じていると、第２の毒素部分が、エンタルピー的および／またはエントロピー的に結合に親和性を示すように第２のオリゴ糖に提示されると考えられる。好ましくは、本発明の毒素結合性粒子は、粒子表面での表面単位および／または限られたコンフォメーションの程度（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｄｅｇｒｅｅ）につき高密度のオリゴ糖を含有する。これらの特徴は、ＣＤＡＤなどの状態における毒素中和にとってより高い毒素結合能および／またはより大きな効力を可能にすると考えられる。
【００２０】
クロストリジウム・ディフィシル関連性下痢などの毒素媒介性疾患の治療および／または予防において本明細書に記載の粒子を使用することが可能である。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態は、クロストリジウム・ディフィシル毒素で汚染された腸管から毒素を除去するための組成物である。好ましくは、毒素を除去するためのこの組成物は、表面が約０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５またはこれらを超えるμ当量／ｍ２よりも大きい密度で共有結合されたオリゴ糖に提示された粒子を含有する。好ましい密度範囲は約１μ当量／ｍ２〜約１５μ当量／ｍ２であり、さらにより好ましい密度範囲は約３μ当量／ｍ２〜約８μ当量／ｍ２である。使用されるオリゴ糖配列は、単糖類、二糖類、三糖類、四糖類およびこれらより大きい分子量のオリゴ糖であり、かつ細菌毒素に対して適度の親和性を示しうる。適切なオリゴ糖は、分岐状、線状、または樹状でありうる。
【００２２】
粒子
粒子は、好ましくはシリカ、二酸化チタン、珪藻岩、ゼオライト、ベントナイト、および他の金属ケイ酸塩などの無機物質、またはスチレン、オレフィン、アクリル、メタクリルおよびビニル単量体、重縮合物、エポキシ樹脂、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ホルムアルデヒドをベースとする樹脂、ポリアミンおよびポリオールをベースとする架橋ヒドロゲル、セルロースエーテルおよびセルロースエステルなどの半天然高分子から調製された有機高分子から選択される。好ましくは、選択された高分子は非毒性、非生体分解性および非吸収性を示す。本明細書で用いられる「重合体」という用語は共重合体を含む。粒径は、直径で好ましくは約５ｎｍ〜約１０００ミクロン、より好ましくは約５０ｎｍ〜約１００ミクロン、さらにより好ましくは約７５ｎｍ〜約１０ミクロン、さらにより好ましくは約７５ｎｍ〜約１ミクロン、および最も好ましくは約１００ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲である。
【００２３】
様々な実施形態の一部には、重合体粒子が含まれる。好ましくは、重合体粒子は共重合体である。これらの一実施形態は、毒素結合性部分およびポリマーナノ粒子を含有する毒素結合性組成物であり、毒素結合性部分はナノ粒子に連結されかつ実質的にナノ粒子は胃腸内腔から胃腸粘膜細胞内に吸収されない。これに照らすと、ナノ粒子は約１ミクロン未満の平均粒径を有する粒子である。好ましい実施形態では、ナノ粒子の粒径は約５０ｎｍ〜約８００ｎｍ、好ましくは約１００ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲である。さらにこれらの実施形態については、毒素結合性組成物は、対象への投与時に動物および好ましくは、例えばヒトならびに他の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ネコ、イヌ、ブタ、ニワトリ、ウシおよびウマ）を含む哺乳動物などの対象の胃腸内腔内に局在化される。「胃腸内腔」という用語は、本明細書において動物の腸管と呼びうる胃腸管内の空間または空洞を示す「内腔」という用語と同義的に用いられる。一部の実施形態では、毒素結合性組成物は胃腸粘膜を介して吸収されない。「胃腸粘膜」は、胃腸内腔を身体の他の部分から区別する細胞の層を示し、小腸粘膜などの胃腸粘膜を含む。一部の実施形態では、胃腸粘膜細胞による毒素結合性組成物の取り込み時に、胃腸内腔内に流出することによって内腔での局在化がなされる。本明細書において用いられる「胃腸粘膜細胞」は、例えば腸細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ）、結腸細胞（ｃｏｌｏｎｉｃ ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ）、腸細胞先端（ａｐｉｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ）などの腸管上皮細胞を含む任意の胃腸粘膜細胞を示す。本明細書において用語、関連用語および文法上のバリエーションが用いられる際、かかる流出によって非吸収性に関する正味の効果が得られる。
【００２４】
好ましいアプローチでは、毒素結合性組成物は実質的に胃腸内腔から胃腸粘膜細胞内に吸収されない組成物でありうる。そのようなものとして本明細書において用いられる「吸収されない」とは、毒素結合性組成物の有意な量、好ましくは統計学的に有意な量、より好ましくは本質的に全部が胃腸内腔内に残存するように調節された組成物を示しうる。例えば、毒素結合性組成物の少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％が（統計学的に関連性があるデータセットに基づくいずれの場合にも）胃腸内腔内に残存する。
【００２５】
血清バイオアベイラビリティの観点で相互に述べると、対象への投与後に毒素結合性組成物の生理学的に有意でない量が対象の血清内に吸収される。例えば、対象への毒素結合性組成物の投与時、（例えば投与後に検出可能な血清バイオアベイラビリティに基づき）毒素結合性組成物の約２０％以下の投与量が対象の血清内にあり、好ましくは毒素結合性組成物の約１５％以下、および最も好ましくは毒素結合性組成物の約１０％以下が対象の血清内にある。一部の実施形態では、約５％以下、約２％以下、好ましくは約１％以下、およびより好ましくは約０．５％以下が（統計学的に関連性があるデータセットに基づくいずれの場合にも）対象の血清内にある。
【００２６】
「吸収されない」という用語は、本明細書において「非吸収性の（ｎｏｎ−ａｂｓｏｒｂｅｄ）」、「非吸収性（ｎｏｎ−ａｂｓｏｒｂｅｄｎｅｓｓ）」、「非吸収（ｎｏｎ−ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）」という用語およびその他の文法的なバリエーションとともに交互に用いられる。
【００２７】
様々な好ましい実施形態には、クロストリジウム・ディフィシル毒素結合性部分および重合体粒子を含有する毒素結合性組成物が含まれる。約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａと結合するのに必要な毒素結合性組成物の濃度は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬであり、毒素結合性組成物およびクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａは約５％ウシ胎児血清を含有するリン酸塩緩衝溶液中でインキュベートされる。好ましくは、約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａと結合するのに必要な毒素結合性組成物の濃度は約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ；より好ましくは約０．８ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ；さらにより好ましくは約１ｍｇ／ｍＬ〜約３ｍｇ／ｍＬである。他の好ましい実施形態では、約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂと結合するのに必要な毒素結合性組成物の濃度は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬであり、毒素結合性組成物およびクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂは約５％ウシ胎児血清を含有するリン酸塩緩衝溶液中でインキュベートされる。好ましくは、約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂと結合するのに必要な毒素結合性組成物の濃度は約０．８ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ；より好ましくは約１ｍｇ／ｍＬ〜約６ｍｇ／ｍＬである。
【００２８】
これらの様々な実施形態の一部では、クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢは精製される。毒素結合性組成物とのクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａおよび／またはＢのインキュベーションを約２時間〜約３６時間；好ましくは約４時間〜約２４時間；より好ましくは約１２時間〜約１８時間実施してもよい。インキュベーションは通常、約３０℃〜約４０℃；好ましくは約３７℃の範囲の温度で実施される。重合体粒子に結合される毒素の量は、クロストリジウム・ディフィシル毒素のＥＬＩＳＡによって上清中の遊離毒素の量を測定しかつ混合物に添加されたクロストリジウム・ディフィシル毒素の量から差し引くことから算出された。試験から得られた値は、表８に一覧されかつ実施例８ではより詳細に述べられる。
【００２９】
粒子は任意の適切な形状、好ましくは球形、層状、または不規則であってもよい。最も好ましい形状は球形である。粒子自体は、微孔性、マクロ孔質性（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）、メソ細孔性、または非多孔性を示しうる。もし大きな粒子が使用される場合、毒素結合に使用可能な表面が高くなるようにこれらの粒子が多孔性であることが好ましい。孔サイズの分布は、好ましくは毒素が粒子の内部表面を横切ることを可能にするように選択される。例えば、クロストリジウム・ディフィシルによって分泌された毒素ＡおよびＢなどの高分子量の毒素に対して要求される孔サイズは毒素の直径よりも少なくとも２倍大きい。球形ビーズなどの非多孔性粒子における表面は外面に限られることから、好ましくは特定の用量でＧＩ内に存在する毒素負荷を中和させるのに十分な表面が利用可能であるようにビーズの大きさが調節される。
【００３０】
好ましい実施形態では、毒素結合性部分（例えばオリゴ糖）の表面密度は、約０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５もしくはこれら以上のμｍｏｌ／ｍ２より大きくてもよい。例えば、粒子における毒素結合性部分（例えばオリゴ糖）の単位表面密度当たりのモル含量は約１μｍｏｌ／ｍ２より大きくてもよく、例えば約１μｍｏｌ／ｍ２〜約１０μｍｏｌ／ｍ２、好ましくは約１μｍｏｌ／ｍ２〜約５μｍｏｌ／ｍ２および一部の実施形態では約１μｍｏｌ／ｍ２〜約３μｍｏｌ／ｍ２の範囲であってもよい。特定の実施形態では、表面密度は約２もしくは約３μｍｏｌ／ｍ２であってもよい。他の好ましい実施形態では、毒素結合性部分（例えばオリゴ糖）の表面密度は、約０．５、０．１もしくは１．５μｍｏｌ／ｍ２より大きくてもよい。それに加えまたはその代わりとして、粒子における毒素結合性部分（例えばオリゴ糖）の単位重量当たりのモル含量は、好ましくは約１０μｍｏｌ／ｇｍ〜約１０００μｍｏｌ／ｇｍの範囲であってもよい。粒子における好ましい毒素結合（例えばオリゴ糖）の単位重量当たりのモル含量は、約１０μｍｏｌ／ｇｍ〜約５００μｍｏｌ／ｇｍ、または約１０μｍｏｌ／ｇｍ〜約２００μｍｏｌ／ｇｍ、または約１０μｍｏｌ／ｇｍ〜約１００μｍｏｌ／ｇｍの範囲であってもよい。一部の実施形態では、単位重量当たりのモル含量は約７０μｍｏｌ／ｇｍであってもよい。
【００３１】
表１中の情報は、所定のオリゴ糖含量に対する粒径および有孔性の選択上の指針として使用されうる。
【００３２】
【表１】
【００３３】
一部の実施形態では、粒子は、リン脂質の会合から形成されるリポソームまたは小胞、ならびにブロック共重合体ミセルなどの他の同様のタイプの高分子集合体である。他の実施形態では、粒子は当該分野で公知の樹状構造をとり、例えば、本明細書において参照により援用される、グレイソン Ｓ．Ｍ．（Ｇｒａｙｓｏｎ Ｓ．Ｍ．）ら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００１年、１０１：３８１９−３８６７頁；およびボズマン Ａ．Ｗ．（Ｂｏｓｍａｎ Ａ．Ｗ．）ら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１９９９年、９９；１６６５−１６８８頁を参照のこと。
【００３４】
一実施形態では、毒素結合性組成物は互いに付着し合う少なくとも２種類の粒子から構成され、オリゴ糖が粒子の一方に付着される。好ましくは、粒子の一方は共重合体である。特定の実施形態では、第２の粒子はラテックス粒子、シリカ粒子、メチルオキシドナノ粒子、疎水性重合体、コロイドポリマーであるかまたは本明細書に記載の他の適切な物質からなる。
【００３５】
粒子の形成
オリゴ糖担体として選択される粒径および形態に依存し、様々な合成手順を用いることが可能である。例えばゾル−ゲルプロセス、特にＳｔｏｂｅｒプロセスを用いると、非多孔性の球形形状を有するシリカ粒子が簡便に調製され、Ｓｔｏｂｅｒプロセスにより、ケイ素アルコキシドがアンモニアと共加水分解される（ストーバー（Ｓｔｏｂｅｒ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９６８年、２６、６２頁）。有機金属かまたは金属塩を使用する他のゾル−ゲルプロセスもまた、金属酸化物のナノ粒子を生成することで周知である。エアロゾルおよびジェッティングプロセスもまた、本発明に適する大きさおよび有孔性についての特性を有する制御性に優れた無機および有機材料粉末を調製することで周知である。懸濁液、マイクロサスペンション、エマルジョン、ミニエマルジョン、マイクロエマルジョンの重合方法など、分散媒体中での重合により、有機ポリマービーズを調製することが可能である。多孔性粒子が使用される場合、懸濁液重合プロセスが好ましく、多官能性単量体（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｏｎｏｍｅｒ）を含むフリーラジカル重合可能な単量体の混合物が分散剤を含む水相中で乳化され、該単量体相は種々の希釈剤およびポロゲン溶媒も含む。後者の溶媒は、形成された粒子の微小／巨大／中程度な有孔性を制御する。多段階で播種される懸濁液重合によるかあるいは膜乳化またはジェッティングプロセスを用いて、モノ−サイズの粒子が調製される。一般に、かかる重合体粒子を調製するのに共重合体化されうる単量体には、スチレン、ジビニルベンゼン（全異性体）で置換されたスチレン、アルキルアクリレート、置換されたアルキルアクリレート、アルキルメタクリレート、置換されたアルキルメタクリレート、アクリロニトリル、エチレングリコールジメタクリレート、メタクリロニトリル、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アルキルアクリルアミド、Ｎ−アルキルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルメタクリルアミド、イソプレン、ブタジエン、エチレン、酢酸ビニル、Ｎ−ビニルアミド、マレイン酸誘導体、ビニルエーテル、アリル、メタリル単量体およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１種類の単量体が含まれる。これらの単量体の官能化された種類も使用可能である。本発明にて使用可能な特定の単量体または共単量体には、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、プロピルメタクリレート（全異性体）、ブチルメタクリレート（全異性体）、２−エチルヘキシルメタクリレート、イソボルニルメタクリレート、メタクリル酸、ベンジルメタクリレート、フェニルメタクリレート、メタクリロニトリル、α−メチルスチレン、メチルアクリレート、エチルアクリレート、プロピルアクリレート（全異性体）、ブチルアクリレート（全異性体）、２−エチルヘキシルアクリレート、イソボルニルアクリレート、アクリル酸、ベンジルアクリレート、フェニルアクリレート、アクリロニトリル、スチレン、グリシジルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート（全異性体）、ヒドロキシブチルメタクリレート（全異性体）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、トリエチレングリコールメタクリレート、無水イタコン酸、イタコン酸、グリシジルアクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート（全異性体）、ヒドロキシブチルアクリレート（全異性体）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアクリレート、トリエチレングリコールアクリレート、メタクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルメタクリルアミド、Ｎ−ｎ−ブチルメタクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、Ｎ−エチロールメタクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−エチロールアクリルアミド、４−アクリロイルモルホリン、ビニル安息香酸（全異性体）、ジエチルアミノスチレン（全異性体）、α−メチルビニル安息香酸（全異性体）、ジエチルアミノα−メチルスチレン（全異性体）、ｐ−ビニルベンゼンスルホン酸、ｐ−ビニルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩、トリメトキシシリルプロピルメタクリレート、トリエトキシシリルプロピルメタクリレート、トリブトキシシリルプロピルメタクリレート、ジメトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジエトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジブトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジイソプロポキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジメトキシシリルプロピルメタクリレート、ジエトキシシリルプロピルメタクリレート、ジブトキシシリルプロピルメタクリレート、ジイソプロポキシシリルプロピルメタクリレート、トリメトキシシリルプロピルアクリレート、トリエトキシシリルプロピルアクリレート、トリブトキシシリルプロピルアクリレート、ジメトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジエトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジブトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジイソプロポキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジメトキシシリルプロピルアクリレート、ジエトキシシリルプロピルアクリレート、ジブトキシシリルプロピルアクリレート、ジイソプロポキシシリルプロピルアクリレート、無水マレイン酸、Ｎ−フェニルマレイミド、Ｎ−ブチルマレイミド、Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−ビニルアセトアミド、アリルアミン、メタリルアミン、アリルアルコール、メチル−ビニルエーテル、エチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、ブタジエン、イソプレン、クロロプレン、エチレン、酢酸ビニルおよびこれらの組み合わせが含まれる。
【００３６】
様々な経路に従い、例えばまず、好ましくは糖類の還元末端上に位置付けられるアミン反応性末端基を有するオリゴ糖配列を官能化し、さらにアミン反応性の官能性糖をチオイソシアナート基などのアミンで官能化された粒子に反応させることにより、粒子表面上にオリゴ糖部分を付着させてもよい。このアプローチの変形として、アミン官能基をオリゴ糖上に付着させ、それをエポキシド基などの求電子物質で官能化された粒子と反応させる。
【００３７】
別の方法では、まず重合可能な部分がオリゴ糖に付着され、エマルジョン重合プロセスにおいてこのオリゴ糖官能性単量体を粒子を形成する単量体と共重合させる。この一般的プロセスの変形および好ましい実施形態は、第１にリビング重合技術を用いてオリゴ糖官能性単量体を第２の共単量体と重合して第１の親水性ブロックを形成し；第２にこの親水性ブロックを用いて第２の疎水性ブロックをさらに成長させ、ジブロック共重合体を形成し；第３に水性媒体中でブロック共重合体を分散させることである。ブロック共重合体の合成については、陰イオン重合、陽イオン重合、グループトランスファー重合および制御されるフリーラジカル重合などの多数のリビング重合技術によって実施可能である。後者の技術には、ニトロキシドに媒介される重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、および可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）が含まれ、この後者の技術は好ましい。ＲＡＦＴ技術では、ジチオエステル、ジチオカルバメート、ジチオカーボネート、またはジチオカルバゼートから選択される連鎖移動剤（ＣＴＡ）が用いられる。同アプローチの概略図は図１Ａおよび図１Ｂに示される。両親媒性ブロック共重合体は、崩壊した疎水性ブロックのコアとオリゴ糖官能性親水性ブロックのシェルを含むミセル内部に自発的に集合する。別の好ましい実施形態では、ブロック共重合体ミセルの疎水性コアは、さらなる第３の単量体または「コア充填（ｃｏｒｅ−ｆｉｌｌｉｎｇ）」単量体を重合することによってさらに架橋される。このコア充填単量体は、好ましくは疎水性単量体、多官能性単量体、またはこれらの組み合わせである。コア充填単量体のブロック共重合体に対する重量比は、典型的には約０．１〜約１００、好ましくは約０．５〜約１０からなる。
【００３８】
ブロック共重合体における分子量は約２０００〜約２００，０００、好ましくは約５００〜約２００，０００、より好ましくは約１０，０００〜約１００，０００、最も好ましくは約２０，０００〜約５０，０００の範囲内にあり；親水性の疎水性に対する比には約９：１〜約１：９、好ましくは約３：１〜約１：３、より好ましくは約２：１〜約１：２、さらにより好ましくは約１．１：１、および最も好ましくは約１．５：１が含まれ；かつ親水性ブロック中のオリゴ糖のモルパーセントは約２モルパーセント〜約１００モルパーセント、好ましくは約５モルパーセント〜約５０モルパーセントの範囲内にある。
【００３９】
樹状スペーサ（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｓｐａｃｅｒ）の使用により、オリゴ糖は様々な方法を介して重合体粒子に付着されうる。例えば、樹状スペーサの使用方法については、ランドクイスト（Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ）およびトゥーン（Ｔｏｏｎｅ）、「Ｔｈｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ Ｅｆｆｅｃｔ」、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、２００２年、１０２、５５５−５７８頁に記載されている。
【００４０】
特定の好ましい実施形態では、オリゴ糖は高い局所密度で固体表面上に強力に固定される。糖密度の制御については、上記の合成手順によって行ってもよい。プロセス変数には、ブロック共重合体中の糖含量、糖含有ブロックの疎水性ブロックに対する比、およびブロック共重合体のコア充填単量体に対する比が含まれる。糖の表面密度は、第一に粒子表面および配合中の糖含量から見積もることが可能である。粒子表面については、電子顕微鏡、動的光散乱またはフラウンホッファー光回折法（Ｆｒａｕｎｈｏｆｆｅｒ ｌｉｇｈｔ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ）によって測定された粒径から算出することが可能である。あるいは、オリゴ糖のモル含量は初期の糖濃度を知ることによって判定することが可能である。好ましくは、オリゴ糖の表面密度は約１μｍｏｌ／ｍ２より大きく、好ましくは約５μｍｏｌ／ｍ２より大きく、および最も好ましくは約１０μｍｏｌ／ｍ２より大きい。光学密度範囲は、下記の如く生化学および細胞生物学の標準的手順によって測定された毒素の結合能によって決定される。
【００４１】
本発明の別の態様では、リンカー修飾のためにメチルエステルハンドルを有する三糖Ｇａｌ（α１−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃを合成することを目的とした方法が提供される。かかる修飾の例として、種々の重合体のバックボーン構造の付加におけるリンカーとして機能するジアミン基の導入が挙げられる。本発明の別の態様では、フリーラジカル重合技術に基づく重合体のバックボーンおよび三糖−リンカー−重合体組成物の生成のための方法が記載される。かかる技術には糖に由来するアクリレート、メタクリレート、スチレン、およびビニル単量体を用いる重合可能な糖単量体の直接重合が含まれ；付加的な技術には、求核アミン糖を使用した糖部分での完全な重合体の後修飾によるエポキシドもしくは活性化エステル基を含有する共重合体との反応が含まれる。改変によって高親和性の毒素Ａ結合剤を生成可能な三糖−リンカー−重合体の特性には、重合体の大きさ、重合体内部のオリゴ糖密度、完成した重合体における疎水性／親水性のバランス、および単量体サブユニットの構造／形態（すなわち、線状、ブロック、スター、グラフト、およびゲル）が含まれる。
【００４２】
毒素結合性オリゴ糖
本明細書に記載の組成物中に使用可能な適切なオリゴ糖の例として、毒素Ａおよび／または毒素Ｂに結合するオリゴ糖が挙げられる。適切なオリゴ糖として、βＧｌｃ；αＧｌｃ（１−２）βＧａｌ；αＧｌｃ（１−４）βＧｌｃ（麦芽糖）；βＧｌｃ（１−４）βＧｌｃ（セロビオース）；αＧｌｃ（１−６）αＧｌｃ（１−６）βＧｌｃ（ソマルトース）；αＧｌｃ（１−６）βＧｌｃ（イソマルトース）；βＧｌｃＮＡｃ（１−４）βＧｌｃＮＡｃ（キトビオース）などのクロストリジウム・ディフィシル毒素結合性オリゴ糖が挙げられる。他の適切なクロストリジウム・ディフィシル毒素結合性オリゴ糖として以下のものが挙げられる。
【００４３】
【表２】
【００４４】
コレラ毒素に適するオリゴ糖として、Ｇａｌ（β１，３）ＧａｌＮＡｃ（β１，４）（ＮｅｕＡｃ（α２，３））Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド；ＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，３）ＧａｌＮＡｃ（β）（ＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド、Ｇａｌ（β）ＧａｌＮＡｃ（β１，４）（ＮｅｕＡｃ（α２，８）ＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド、ＧａｌＮＡｃ（β１，４）−Ｇａｌ（β１，３）ＧａｌＮＡｃ（β１，４）（（ＮｅｕＡｃ（α２，３））Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド、およびＦｕｃ（αｌ，２）Ｇａｌ（β，３）−ＧａｌＮＡｃ（β１，４）（（ＮｅｕＡｃ（α２，３））Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミドが挙げられる。
【００４５】
熱不安定性毒素に対するオリゴ糖の例としてＧＭ１が挙げられる。破傷風毒素に適するオリゴ糖は、Ｇａｌ（β１，３）ＧａｌＮＡｃ（β１，４）（（ＮｅｕＡｃ（α２，８））ＮｅｕＡｃ（２，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド；ＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，３）ＧａｌＮＡｃ（β１，４）（（ＮｅｕＡｃ（α２，８））ＮｅｕＡｃ（α２，３）−Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド、およびＮｅｕＡｃ（α２，８）ＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，３）ＧａｌＮＡｃ（β１，４）（ＮｅｕＡｃ（α２，８）−ＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミドである。
【００４６】
ボツリヌス毒素ＡおよびＥに適するオリゴ糖はＮｅｕＡｃ（α２，８）ＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，３）ＧａｌＮＡｃ（β１，４）（ＮｅｕＡｃ（α２，８））ＮｅｕＡｃ（α２，３）−Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド；ボツリヌス毒素Ｂ、Ｃ、およびＦの場合にはＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，３）ＧａｌＮＡｃ（β１，４）（ＮｅｕＡｃ（α２，８））ＮｅｕＡｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド；ならびにボツリヌス毒素Ｂの場合にはＧａｌ（β）−セラミドである。
【００４７】
デルタ毒素に適するオリゴ糖はＧａｌＮＡｃ（β１，４）（ＮｅｕＡｃ（α２，３））Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド；毒素Ａの場合にはＧａｌ（αｌ，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド；シガ様毒素（ＳＬＴ）−ＩおよびＳＬＴ−ＩＩ／ＩＩｃの場合にはＧａｌ（αｌ，４）Ｇａｌ（β）（Ｐ１二糖類）、Ｇａｌ（αｌ，４）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ（β）（Ｐ１三糖）、またはＧａｌ（αｌ，４）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）（Ｐｋ三糖）；シガトキシンの場合にはＧａｌ（αｌ，４）Ｇａｌ（β）−セラミド；ベロ毒素の場合にはＧａｌ（αｌ，４）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ（β）−セラミド；百日咳毒素の場合にはＮｅｕＡｃ（α２，６）Ｇａｌ；ならびに赤痢菌毒素の場合にはＧｌｃＮＡｃ（β１）である。
【００４８】
本発明の一態様は、粒子に付着したオリゴ糖を含むタンパク質結合組成物であり、ここで粒子の表面積当たりのオリゴ糖のモル含量は約０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１もしくはこれらを超えるμ当量／ｍ２よりも大きく、オリゴ糖は可溶性タンパク質に結合し、かつ粒子はタンパク質ではなく、デンドリマーまたはリポソームの形態ではなく、分子として水溶性を示さない。本発明の別の態様は、粒子に付着したオリゴ糖を含むタンパク質結合組成物であり、ここで粒子の表面積当たりのオリゴ糖のモル含量は約０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１もしくはこれらを超えるμ当量／ｍ２よりも大きく、オリゴ糖は可溶性タンパク質に結合し、かつ粒子はタンパク質またはカーボンナノチューブではなく、デンドリマーまたはリポソームの形態ではなく、分子として水溶性を示さない。かかる粒子の例として、脂質、リン脂質および本明細書に記載の他の粒子が挙げられる。
【００４９】
処理方法
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、毒素に結合しかつそれを中和させるのに用いる。本明細書に記載の組成物は、毒素の全体もしくは一部に結合しかつ／またはそれらを中和させることが可能である。例えば、毒素は、経口粘膜および胃腸管、鼻道および気道、尿管および生殖器官、ならびに耳道を含む宿主の粘膜表面上で作用しうる。さらに外傷における使用として、本発明の組成物および方法が含まれる。細胞表面の標的の機能を不活化するかまたは破壊する作用モードを有する毒素が含まれ、その例が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）によって産生される超抗原毒素のファミリー、ストレプトリシン、パーフリンゴリジン、α毒素、ロイコトキシン、アエロリジン、デルタヘモリシン、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）病原型（ｐａｔｈｏｖａｒｓ）によってコードされる様々な溶血素などの細胞浸透性毒素、ならびにバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）のエンテロトキシン（非−ＬＰＳ）などの付着因子機能を遮断する毒素において見出される。本発明を標的細胞表面に結合する毒素に対して用いることも可能であり、それを細胞質内に転位させ、細胞内標的を破壊するかまたは不活化する。この群の中には、（ｉ）ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ、およびシガトキシンなどのタンパク質合成阻害剤と；（ｉｉ）炭疽菌毒素、百日咳毒素および百日咳アデニル酸シクラーゼ毒素、コレラ毒素、ならびに大腸菌のＬＴ毒素、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）、大腸菌、シゲラ、およびカンピロバクターによって産生される細胞致死性膨張毒素、ウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のα毒素、クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢ、ならびに大腸菌およびボルデテラ種の細胞毒性壊死性因子などの関連する熱不安定毒素を含むシグナル伝達阻害剤と；（ｉｉｉ）ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）の空胞化毒素、破傷風毒素、ボツリヌス毒素の粘膜輸送、およびＣ２ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）毒素を含む、細胞内輸送ならびに細胞骨格の毒素とが含まれる。
【００５０】
毒素媒介性疾患の治療および／または予防に対し、本明細書において提供される組成物および方法が用いられる。かかる毒素は、細菌毒素およびウイルス粒子、プリオン、抗体、付着因子、レクチン、セレクチン、シグナル伝達ペプチド、ホルモン、特に免疫系応答および／または自己免疫疾患に関与するホルモン、ならびにＧＩ管において副作用を有する他の分子などの他の毒性ポリペプチドを含みうるがこれらに限定されない。
【００５１】
本明細書に記載の組成物および方法は、標的細胞表面にて作用する細菌毒素および感受性細胞の細胞内標的上で作用する毒素に対して用いることが可能である。第１の群の一般的な例として、黄色ブドウ球菌およびストレプトコッカス・ピオゲネスの毒素、ならびに黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ウェルシュ菌、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、大腸菌、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）およびその他を含む多数のグラム陽性菌およびグラム陰性菌によって分泌される、孔を形成する毒素が挙げられる。細胞内で作用する毒素の中で受容体媒介性機構によって標的細胞に入る毒素の例として、多数の他の例とともに、緑膿菌の外毒素Ａ、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）のシガトキシン、コレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）のコレラ毒素、大腸菌の不安定毒素、ヘリコバクター・ピロリの空胞化毒素、ボツリヌス菌の神経毒素、ならびにクロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢが挙げられる。細胞内作用性毒素（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ−ａｃｔｉｎｇ ｔｏｘｉｎ）の第２の群は毒素の標的細胞内への直接注射によって移入されるが、かかるタイプＩＩＩおよびタイプＩＶで分泌される毒素の周知の例として、エルシニア症（Ｙ．ｓｐｐ．）のＹｏｐタンパク質、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の百日咳毒素、およびヘリコバクター・ピロリのＣａｇＡタンパク質が挙げられる。数種類の細菌毒素は、宿主の粘膜表面の細胞に作用する。これらの例として、コレラ菌毒素、大腸菌の熱不安定毒素、志賀赤痢菌の（ＥＨＥＣおよびＥＰＥＣ変異体を含む）シガトキシン、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ、百日咳菌の百日咳毒素、ならびに黄色ブドウ球菌およびストレプトコッカス・ピオゲネスによってコードされる超抗原毒素が挙げられる。
【００５２】
クロストリジウム・ディフィシル毒素産生株は、ＣＤＡＤおよびＰＭＣ症候群に関与する２種類の外毒素を産生する（リアーリ，Ｄ．Ｍ．（Ｌｙｅｒｌｙ，Ｄ．Ｍ．）、Ｈ．Ｃ．クリバン（Ｈ．Ｃ．Ｋｒｉｖａｎ）ら（１９８８年）「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ：ｉｔｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｔｏｘｉｎｓ」Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ１（１）：１−１８頁）。毒素Ａ（ＣｄｔＡ、３０８ｋＤａ）は、動物モデルおよび回腸移植片において流体分泌を誘発するエンテロトキシンであり、臨床症状の発生に関与する一次毒素として一般に認められる（トリアダフィロプロス，Ｇ．（Ｔｒｉａｄａｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．）、Ｃ．ポソウラキス（Ｃ．Ｐｏｔｈｏｕｌａｋｉｓ）ら、（１９８７年）「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｏｎ ｒａｂｂｉｔ ｉｌｅｕｍ」 Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９３（２）：２７３−９頁）。毒素Ｂ（ＣｄｔＢ、２７９ｋＤａ）は、毒素の培養細胞に対する著しい細胞変性作用および動物モデルにおけるその腸毒性の相対的損失によって規定される細胞毒素である。細胞変性作用のみの測定により、毒素Ｂは毒素Ａよりも１００倍以下〜１０００倍高い毒性を示す（トリアダフィロプロス，Ｇ．（Ｔｒｉａｄａｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．）、Ｃ．ポソウラキス（Ｃ．Ｐｏｔｈｏｕｌａｋｉｓ）ら、（１９８７年）「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｏｎ ｒａｂｂｉｔ ｉｌｅｕｍ」 Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９３（２）：２７３−９頁；リマ，Ａ．Ａ．（Ｌｉｍａ，Ａ．Ａ．）、Ｄ．Ｍ．リアーリ（Ｄ．Ｍ．Ｌｙｅｒｌｙ）ら、（１９８８年） 「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ｓｍａｌｌ ａｎｄ ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ」 Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５６（３）：５８２−８頁；リーグラー，Ｍ．（Ｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．）、Ｒ．セディヴィ（Ｒ．Ｓｅｄｉｖｙ）ら（１９９５年）「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｉｓ ｍｏｒｅ ｐｏｔｅｎｔ ｔｈａｎ ｔｏｘｉｎ Ａ ｉｎ ｄａｍａｇｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎｉｃ ｅｐｉｔｈｅｒｉｕｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ」 Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９５（５）：２００４−１１頁；シャベス−オラルテ，Ｅ．（Ｃｈａｖｅｓ−Ｏｌａｒｔｅ，Ｅ．）、Ｍ．ワイドマン（Ｍ．Ｗｅｉｄｍａｎｎ）ら（１９９７年） 「Ｔｏｘｉｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｆｒｏｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｄｉｆｆｅｒ ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｅｃｔ ｔｏ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｏｔｅｎｃｉｅｓ，ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ」 Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １００（７）：１７３４−４１頁；ストゥッベ，Ｈ．（Ｓｔｕｂｂｅ，Ｈ．）、Ｊ．ベルドズ（Ｊ．Ｂｅｒｄｏｚ）ら（２０００年）「Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ＩｇＡ ｉｓ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ＩｇＡ ａｎｄ ＩｇＧ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｔｏｘｉｎ Ａ ｄａｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｔ８４ ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ」 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４（４）：１９５２−６０頁）。
【００５３】
本明細書に記載の組成物および方法によると、ＧＴＰの結合に関与するトレオニン残基のモノグルコシル化によるＲｈｏ ＧＴＰアーゼの毒素不活化への作用により、クロストリジウム・ディフィシル毒素媒介性状態に対する治療および／または予防が可能である。Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼのグルコシル化により、アクチン細胞骨格を調節するエフェクタータンパク質を有するこれらのシグナル伝達分子間の相互作用が遮断される。さらに、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼの不活化により、細胞における分泌過程、エンドサイトーシス、タンパク質合成、細胞周期進行、および多数の他の基本的な細胞「ハウスキーピング」機能の制御が破壊される可能性がある。好ましくは、毒素結合性組成物は宿主の細胞表面受容体へのクロストリジウム・ディフィシル毒素の結合を阻害する。
【００５４】
毒素Ａは、Ｇａｌ（α１−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃおよび／またはタイプ２のコアを含む最小の二糖単位Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃを含有する複合糖質（Ｏと連結、Ｎと連結、またはグリコスフィンゴリピド）に結合する（カスタグリウオロ，Ｉ．（Ｃａｓｔａｇｌｉｕｏｌｏ，Ｉ．）、Ｊ．Ｔ．ラモン（Ｊ．Ｔ．ＬａＭｏｎｔ）ら（１９９６年）「Ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｄｅｃｏｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ Ｔｏｘｉｎ Ａ ｉｎ Ｒａｔ Ｉｌｅｕｍ」Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１１：４３３−８頁；米国特許第５，４８４，７７３号明細書；および米国特許第５，６３５，６０６号明細書）。毒素Ａに対して合意が得られた受容体構造は種々の非ヒト哺乳類細胞において同定されているが、ヒト組織内でＧａｌ（α１−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ構造が自然に見出されることはない。好ましくは、本発明の粒子において使用されるオリゴ糖配列は、毒素Ａのこれらの複合糖質への結合を妨げるか阻害する。
【００５５】
細菌毒素によって媒介される疾患の治療に加え、細菌、ウイルス、マイコプラズマ、および寄生虫の感染サイクルなどのタンパク質−炭水化物の認識事象を含む他の病理学的相互作用において本明細書に記載の組成物を使用してもよい。
【００５６】
本発明のさらなる態様では、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂによって媒介される下痢の治療に対する方法が提供され、同方法はＣＤＡＤに罹患した対象に重合体支持体に連結される三糖Ｇａｌ（α１−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃを含む組成物の有効量を投与するステップを含み、該オリゴ糖配列は毒素Ａに結合し、感染した胃腸管の内腔から毒素Ａを除去する。同様に、組成物は毒素Ｂに結合してそれを除去することで、タンパク質の腸上皮細胞に対する細胞毒性作用を防止することが可能である。重合体組成物は許容可能な医薬品担体中で調合され、胃腸管から除去される能力を有する。
【００５７】
本発明の別の態様では、典型的にはメトロニダゾール（フラジール（Ｆｌａｇｙｌ））または経口バンコマイシンからなる、ＣＤＡＤに対する抗生物質療法に伴い、重合体支持体に連結される三糖Ｇａｌ（α１−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃからなる組成物が送達される。すなわち、別々の製剤としてまたは薬剤の決まった組み合わせにおいて併用療法の提供が可能である。
【００５８】
本発明では、組成物を他の活性医薬品とともに同時投与してもよい。この同時投与は、２種類の薬剤の同一の剤形での同時投与、別々の剤形での同時投与、および分離投与を含みうる。例えばＣＤＡＤの治療においては、特定の抗生物質などのＣＤＡＤを誘発する薬剤とともに組成物を同時投与してもよい。同時投与される薬剤を同一の剤形で共に調合し、同時投与してもよい。あるいは、両方の薬剤が別々の製剤中に存在する場合、それらを同時投与してもよい。もう一つの代替案では薬剤は別々に投与される。分離投与プロトコルでは、数分または数時間または数日置いて薬剤を投与することが可能である。
【００５９】
さらに別の方法では、本発明の毒素結合性組成物は、有効量の抗生物質とともに同時投与される。毒素結合性組成物の投与は、有効量の抗生物質の投与より前、それと同時、またはその後であってもよい。様々な抗生物質の用量および治療法は、当該技術で周知である。一実施形態では、抗生物質は、メトロニダゾール、バンコマイシン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。あるいは、抗生物質は、テイコプラニン、フシジン酸、バシトラシン、カルベンシリム、アンピシリン、クロキサシリン、オキサシリン、ピペラシリン、セファクロール、セファマンドール、セファゾリン、セフォペラゾン、セフタキシム、セフォキシチン、セフタジジム、セフトリアゾン、イミペネム、メロペネム、ナリジクス酸、テトラサイクリン、ゲンタマイシン、パロモマイシン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されうる。さらなる方法では、対象は、毒素結合性組成物と、メトロニダゾール、バンコマイシン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質とで治療され、その後に必要に応じて、毒素結合性組成物と、カルベンシリム、アンピシリン、クロキサシリン、オキサシリン、ピペラシリン、セファクロール、セファマンドール、セファゾリン、セフォペラゾン、セフタキシム、セフォキシチン、セフタジジム、セフトリアゾン、イミペネム、メロペネム、ナリジクス酸、テトラサイクリン、ゲンタマイシン、パロモマイシン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される抗生物質とで治療される。
【００６０】
本明細書で用いられる「治療する」という用語は、治療効果および／または予防的な利益を得ることを含む。治療効果とは、治療される基礎疾患の撲滅、改善、または予防を意味する。例えば偽膜性大腸炎（ＰＭＣ）患者では、治療効果には腸管の粘膜表面に付着した内在する偽膜性で滲出性のプラークの撲滅または改善が含まれる。さらに、患者は依然として基礎疾患に悩まされる場合があるにもかかわらず、患者において改善が認められるような基礎疾患に関連する１つもしくは複数の生理的な兆候の撲滅、改善、または予防によって治療効果が得られる。例えば、クロストリジウム・ディフィシル毒素結合性組成物のＰＭＣを患う患者への投与により、患者の下痢が減少する場合だけではなく、患者においてＰＭＣを併発する他の疾患と比べて改善が認められる場合にも治療効果が得られる。予防的な利益の例として、たとえＰＭＣの診断がなされていなくても、本明細書に記載の組成物がＰＭＣを発症するリスクがある患者またはＰＭＣに関する１つもしくは複数の生理的な兆候を報告する患者に投与される場合が挙げられる。組成物は毒素媒介性疾患の再発の予防における使用にも適する。
【００６１】
本発明の医薬組成物には、重合体が有効量すなわち治療的または予防的な利益を得るための有効量で存在する場合の組成物が含まれる。特定の用途に対する実際の有効量は、患者（例えば、年齢、体重など）、治療がなされる状態、および投与経路に依存するであろう。当業者の能力の範囲内で、特に本明細書における開示内容を考慮すれば、有効量の判定は十分になされる。
【００６２】
ヒト使用における有効量は、動物モデルから決定されうる。例えば、動物において有効であることが判明している胃腸濃度を得ることで、ヒトに対する用量の調製が可能である。
【００６３】
動物における重合体の用量は、治療がなされる疾患、投与経路、および治療される患者の身体特性に依存するであろう。重合体の治療的および／または予防的使用における用量レベルは約０．５ｇｍ／日〜約３０ｇｍ／日でありうる。これらの重合体は食事とともに投与されることが好ましい。組成物は、１日１回、１日２回、または１日３回投与されうる。最も好ましい用量は約１５ｇｍ以下／日である。好ましい用量範囲は、約５ｇｍ／日〜約２０ｇｍ／日、より好ましくは約５ｇｍ／日〜約１５ｇｍ／日、さらにより好ましくは約１０ｇｍ／日〜約２０ｇｍ／日、および最も好ましくは約１０ｇｍ／日〜約１５ｇｍ／日である。別の好ましい用量は約１ｇｍ／日〜約５ｇｍ／日である。
【００６４】
本明細書に記載の重合体組成物を他の適切な活性剤と組み合わせて使用してもよい。例えば、ＰＭＣまたはＣＤＡＤの治療において、重合体組成物はバンコマイシン、メトロニダゾール、テイコプラニン、フシジン酸、およびバシトラシンなどの抗生物質と組み合わせて使用されうる。他の併用療法には、抗−毒素Ａ免疫グロブリンまたは経口投与されるウシ抗−毒素Ａ免疫グロブリン、毒素Ａトキソイドワクチン、および可溶性のスルホン酸ポリスチレン樹脂をベースとする経口の非吸収性高分子の毒素結合剤を用いる受動免疫療法が含まれうる。
【００６５】
本明細書に記載の組成物をコレスチラミンおよびコレスチポールなどのイオン交換樹脂と組み合わせて使用してもよい。併用可能な他の適切な重合体は、陽性基と疎水基を有する適切な重合体について記載する、米国特許第６，００７，８０３号明細書；米国特許第６，０３４，１２９号明細書；および米国特許第６，２９０，９４７号明細書、ならびに陰イオン基を有する重合体に関する、米国特許第６，２７０，７５５号明細書；米国特許第６，４１９，９１４号明細書；米国特許第６，５１７，８２７号明細書；米国特許第６，８９０，５２３号明細書；および米国特許出願公開第２００５／０２１４２４６号明細書に記載されている。
【００６６】
別の方法では、線状の毒素Ａに結合するエピトープＧａｌ（α１−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ、および様々な誘導体を固体の不活性支持体に付着させると、毒素Ａ（ＳＹＮＳＯＲＢ）に対する結合能および中和能を有する不溶性物質が生成された（ヒーアツェ（Ｈｅｅｒｚｅ）、アームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）１９９６年）。オリゴ糖配列は、毒素Ａの除去に特異的な結合部位をもたらし、この受容体模倣体は、非ペプチジルのリンカーアームを通って不活性支持体にカップリングされる。米国特許第５４８４７７３号明細書では、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに結合する、固体医薬品に共有結合したオリゴ糖配列についての記載がある一方、米国特許第６，０１３，６３５号明細書では、同じ概念についての記載があるが、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂが対象である。
【００６７】
クロストリジウム・ディフィシル毒素媒介性疾患を治療する別の方法には、それを必要とする対象への毒素結合性部分および重合体粒子を含有する有効量の毒素結合性組成物の投与が含まれる。少なくとも約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａは約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の組成物によって結合され、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａは約５％ウシ胎児血清を含有するリン酸塩緩衝溶液中の毒素結合性組成物で処理される。好ましくは、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａの約９０％に結合するのに必要な毒素結合性組成物の濃度は約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ；より好ましくは約０．８ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ；さらにより好ましくは約１ｍｇ／ｍＬ〜約３ｍｇ／ｍＬである。クロストリジウム・ディフィシル毒素媒介性疾患を治療する別の方法には、クロストリジウム・ディフィシル毒素結合性部分および重合体粒子を含有する毒素結合性組成物の有効量の必要としている対象への投与が含まれる。少なくとも約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａは約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の組成物によって結合され、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａは約５％ウシ胎児血清を含有するリン酸塩緩衝溶液中の毒素結合性組成物で処理される。好ましくは、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａの約９０％に結合するのに必要な毒素結合性組成物の濃度は約０．８ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ；より好ましくは約１ｍｇ／ｍＬ〜約６ｍｇ／ｍＬである。
【００６８】
様々な実施形態の一部では、クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢは精製される。約２時間〜約３６時間；好ましくは約４時間〜約２４時間；より好ましくは約１２時間〜約１８時間かけて、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａと毒素結合性組成物のインキュベーションを行いうる。インキュベーションは通常、約３０℃〜約４０℃；好ましくは約３７℃の範囲の温度で行われる。上清中の遊離毒素の量をクロストリジウム・ディフィシル毒素におけるＥＬＩＳＡによって測定し、遊離毒素の量を混合物に添加されたクロストリジウム・ディフィシル毒素の量から差し引くことから、重合体粒子に結合される毒素の量が算出された。試験から得られた値は、表８に一覧され、実施例８ではより詳細に記載される。
【００６９】
製剤、投与経路、用量
本明細書に記載の組成物またはそれらの医薬的に許容できる塩を多種多様な経路または投与様式を用いて患者に送達することが可能である。投与のための最も好ましい経路は、口、腸または直腸である。
【００７０】
必要に応じ、組成物を他の治療薬と併用して投与することが可能である。本発明の化合物とともに同時投与可能な治療薬の選択は、一つには治療される条件に依存するであろう。
【００７１】
重合体（またはそれらの医薬的に許容できる塩）は、それ単独で、あるいは活性化合物が１種もしくは複数種の医薬的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤との混合剤または混合物の中に存在する医薬組成物の形態で投与されうる。活性化合物の医薬品として使用可能な製剤に至るまでの処理を促進する賦形剤および補助剤を含む１種もしくは複数種の生理学的に許容できる担体を使用する従来の方法で、本発明による使用を意図した医薬組成物を調合することが可能である。適切な製剤は、選択される投与経路に依存している。
【００７２】
これらの組成物が好ましい経口投与用に使用される場合、種々の方法で同組成物を調合することが可能である。好ましくは、それは凍結乾燥、液体、固体、または半固体の形態であろう。水またはヒマシ油などの医薬品として不活性な液体担体を含有する組成物は経口投与に適すると考えうる。他の医薬品として適合する液体または半固体も使用可能である。かかる液体および半固体の使用は、当業者にとっては周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、１９９０年を参照のこと。
【００７３】
アップルソース、アイスクリームまたはプディングなどの半固体状食品と混合可能な組成物が好ましい場合がある。不快な味もしくは後味のない製剤が好ましい。組成物を直接に胃に送達するのに経鼻胃チューブも使用可能である。
【００７４】
固体組成物も使用可能であり、場合によって都合よく、好ましくは錠剤またはカプセル形態で提示される乳糖、澱粉、デキストリンまたはステアリン酸マグネシウムなどの従来の固体担体を含む、医薬品として不活性な担体を含有する製剤において使用可能である。カプセルはまた、カプセルを含有する液体またはゲルであってもよい。特にカプセル形態で使用する場合、不活性な医薬担体を加えずに組成物を単独で使用することも可能である。
【００７５】
通常、感染した患者の消化管に見出される毒素の中和および除去をもたらすように用量を選択する。有用な用量は、約１〜１００μｍｏｌのオリゴ糖／ｋｇ体重／日、好ましくは約１０〜５０μｍｏｌのオリゴ糖／ｋｇ体重／日である。用量レベルおよび投与スケジュールは、使用される特定のオリゴ糖の構造ならびに対象の年齢および状態などの因子に依存して変化する可能性がある。
【００７６】
先に検討したように経口投与は好ましいが、経直腸などの他の投与手段として製剤を検討することも可能である。これらの製剤の有用性は、使用される特定の組成物および同治療を受ける特定の対象に依存する場合がある。これらの製剤は、油性、水性、乳状でありうる液体担体を含有するかまたは投与様式に適する特定の溶媒を含有する。組成物は、単位用量形態かまたは複数回用量もしくはサブユニット用量で調合されうる。
【実施例】
【００７７】
実施例１：毒素結合性組成物の合成
以前に報告したように、ＳＭ１前駆体１を合成した。国際公開第０２／０４４１９０号パンフレットを参照のこと。
【化１】
【００７８】
ＳＭ１の合成：
エチレンジアミン（３７０ｍｍｏｌ）２５ｍＬおよびジメチルホルムアミド３０ｍＬの溶液に、１０ｇｍのＳＭ１前駆体１（１４．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を８５℃で１８時間撹拌した。ＴＬＣ（ジクロロメタン：メタノール：水＝６：４：０．１５）によって反応の進行を監視した。反応完了時に，ロータリーエバポレーターを用いて混合物を２０ｍＬに濃縮し、濃縮物をイソプロパノール１．５Ｌに注ぐことによってＳＭ１前駆体２を白沈として得た。濾過した沈殿物を真空下で１０時間乾燥させ、後のアクリロイル化に対して直接使用した。
【００７９】
粗ＳＭ１前駆体２をＭｅＯＨ／水混合物（容量比１：１）８０ｍＬ中に懸濁し、氷槽内で撹拌した。４．６ｇｍの炭酸ナトリウム（４４ｍｍｏｌ）の添加後、塩化アクリロイル（４４ｍｍｏｌ）３．６ｍＬを滴下漏斗で１０分かけて添加した。混合物を０℃から室温になるまで４時間撹拌した。ＴＬＣ（ジクロロメタン：メタノール：水＝６：４：０．３）によって反応の進行を監視した。反応完了時に無機塩を濾過して取り除き、４５℃未満でロータリーエバポレーターを用いて濾過物を濃縮した。カラムクロマトグラフィー精製（５：１〜２：１のジクロロメタン：メタノール混合物で溶出）によってアクリロイル化された生成物ＳＭ１（７．５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を得た。
【００８０】
ブロック共重合体の合成
０．２５ｇｍのＳＭ１、０．０５ｇｍのジメチルアクリルアミドおよび７ｍｇのジチオエステルＲＡＦＴ剤に、水／ジメチルホルムアミド混合物（容量比１：１）１．３６ｍＬを添加し、それを５０℃に加熱した。水３０μｌ中で０．９８ｍｇの開始剤、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジヒドロクロリド（ワコ（Ｗａｋｏ）製ＶＡ−０４４）を添加した。プロトンＮＭＲによって単量体変換を追跡し、ＧＰＣ分析によって重合体の分子量を得た。２〜３時間後に第１のブロック単量体の９０％を超える変換とともに、０．２７ｇｍのｎ−ブチルアクリレートを半連続的に３時間かけて添加した。ブチルアクリレート添加の完了時に、反応混合物をさらに３時間撹拌し、次いで水８ｍＬを混合物に添加し、それをラテックスの調製に直接に使用するかまたはエマルジョン重合に先立ち水で透析した。
【００８１】
ラテックスの調製
【００８２】
【表３】
【００８３】
ＫＰＳストック：
脱イオン水２ｍＬ中、５０ｍｇのＫＰＳ
【００８４】
ＳＭ１ブロック共重合体溶液１０ｍＬ、水３０ｍＬおよびスチレン０．３３ｍＬを１００ｍＬの三首モルトンフラスコに添加した。反応混合物をアルゴンで軽く洗浄し、マグネットバーを用いて７００ｒｐｍ、室温で２時間撹拌した。ＫＰＳストック溶液１０８μｌの添加によって重合を誘起し、温度を６０℃に上昇させた。ＫＰＳの添加の１．５〜３時間後、残存するスチレン（２×０．３３ｍＬ）を添加した。６時間重合後、温度を室温にし、グラスウールおよび０．４５μｍのＧＭＦフィルタによってラテックス溶液を濾過した。１０日にわたる脱イオン水での透析によって残存単量体の除去を行った。
【００８５】
このプロトコルを用いて様々な単量体組成物を除いた同ブロック共重合体を含む数種類の粒子懸濁液を生成した。表２を参照のこと。
【００８６】
【表４】
【００８７】
粒子表面に存在する糖の表面密度を以下のように算出した。
表面密度（μ当量／ｍ２）＝糖のμ当量／固体のｇｍ＊（６／（ｄ＊Ｄ））−１（式中、ｄは重合体粒子の密度、Ｄはミクロン単位の粒子直径である。）
【００８８】
ラテックスの調製−非イオン性開始剤
【００８９】
【表５】
【００９０】
Ｈ２Ｏ２ストック溶液の配合：３０重量％の過酸化水素３３μｌを脱イオン水１６７μｌに添加した。
【００９１】
アスコルビン酸ストック溶液の配合：１０ｍｇのアスコルビン酸を脱イオン水２ｍＬに添加した。
【００９２】
反応手順：ＳＭ１ブロック共重合体溶液７ｍＬ、水３５ｍＬおよびスチレン０．３ｍＬを、窒素下、１００ｍＬの三首モルトンフラスコ内で７００ｒｐｍ、室温で２時間撹拌した。それに続き、反応混合物を２時間かけて６０℃に加熱した。次いで、Ｈ２Ｏ２ストック溶液１１６ｍＬおよびアスコルビン酸ストック溶液１１２ｍＬを混合物に添加した。６０℃で６０分間攪拌後、残存スチレン（０．７〜０．９ｍＬ）を４０分ごとに２４０分かけて半連続的に添加した。スチレン添加サイクルの完了時に反応混合物をさらに２時間撹拌し、次いで温度を室温にし、ラテックス溶液を２５μｍの孔サイズの濾紙によって濾過した。脱イオン水での１０日にわたる透析によって残存単量体の除去を行った。
【００９３】
メソ細孔性ヒドロゲルを含有するＳＭ１の合成
【００９４】
【表６】
【００９５】
グローブボックス内で１０ｐｐｍ未満の酸素濃度でヒドロゲルの調製を行った。０．３２５ｇｍもしくは０．３５ｇｍの単量体（ＳＭ１、ビニルホルムアミド、ベンジルアクリルアミドおよびＮ，Ｎ’−エチレンビスアクリルアミド）、１．３ｍＬのポロゲンおよび１．５ｍｇのＶＡ−０４４を添加した。混合物を５０℃で一晩撹拌し、白い不透明なゴム状固体を得て、これを水８ｍＬ中の微粒子懸濁液中に３分間の超音波処理によって粉末化した。懸濁液をＤＩ水で２日間透析し、凍結乾燥機で乾燥させた（２日）。
【００９６】
実施例２：インビトロでの（ＥＬＩＳＡおよび細胞培養）アッセイ
２つのインビトロアッセイを用い、実施例１で合成した微粒子の毒素結合性特性および中和特性について測定した。図２は、微粒子で処理した毒素分子の生物活性の測定に用いたＥＬＩＳＡおよび組織培養アッセイの概要を表す。毒素のＥＬＩＳＡアッセイにおいて微粒子（１〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲の試験濃度）を毒素（濃度１ｎｇ／ｍＬ〜１６０μｇ／ｍＬ）とともに混合物を振動させることなく３７℃でインキュベートした。１８時間のインキュベーション後、微粒子／毒素混合物を遠心分離し、微粒子と結合された毒素の複合体を表すペレット状物質を除去した。この遠心分離ステップから得られる上清は、結合されていない毒素分子と、固定化毒素分子を検出するのに使用される、西洋わさびペルオキシターゼと共役されたポリクローナル抗体とを「捕捉する」ための、ＰＣＧ−４モノクローナル抗体からなる標準的なＥＬＩＳＡアッセイによって定量される結合されていない毒素分子を含有する。リアーリ，Ｄ．Ｍ．（Ｌｙｅｒｌｙ，Ｄ．Ｍ．）、Ｃ．Ｊ．フェルプス（Ｃ．Ｊ．Ｐｈｅｌｐｓ），Ｊ．トス（Ｊ．Ｔｏｔｈ）、およびＴ．Ｄ．ウィルキンズ（Ｔ．Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓ）、１９８６年、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｘｉｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」 Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．５４：７０−６頁を参照のこと。４つの異なる微粒子組成物に対する代表的なＥＬＩＳＡ特性を図３に示す。ＴＭ４７３Ｂ、ＴＭ４７３Ａ、およびＴＭ４６６Ｄの物質は、試験微粒子の最低濃度（１ｍｇ／ｍＬ）でインキュベーション混合物中の遊離毒素Ａ（開始濃度１ｎｇ／ｍＬ）を５０％よりも大きく低下させた。クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂの開始濃度での異なる微粒子のＩＣ９０（毒素の９０％が上清から除去される場合の微粒子の濃度）を表２に示す。
【００９７】
哺乳類上皮細胞での細胞培養アッセイは、試験微粒子とのインキュベーション後に結合されていない毒素分子の生物活性を評価するのに用いられる第２の方法を表す。このアッセイでは、標準の９６−ウェル組織培養形式でベロ細胞系（アフリカグリーンモンキーの腎臓上皮細胞）を培養し、（上記の如く）これに微粒子／毒素混合物とそれに続いて遠心分離ステップから得られた上清の希釈物を重ね合わせた。このアッセイを結合されていない遊離毒素を定量するためのＥＬＩＳＡ測定と組み合わせることで、結合されていない毒素に対する生物活性の測定が可能になる。いかなる場合でも、微粒子での予備処理により、細胞培養アッセイによる測定の如く、残存する結合されていない毒素が不活化されることはなかった。
【００９８】
細胞培養アッセイを用いることで、毒素との混合時に微粒子によってもたらされる中和の度合いも定量される。このアッセイでは、様々な濃度の微粒子（１〜２０ｍｇ／ｍＬ）を、「細胞の円形化」（すなわち細胞の塑性表面への正常な付着を破壊する細胞毒性作用であり、通常、細胞死または細胞内糸状構造の損失を示す）を誘発することで知られる固定量の毒素（０．３ｐｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ）と混合させる。一部の場合では、半透性膜（すなわち毒素に浸透可能）を有するトランスウェルを使用することにより、微粒子を細胞と直接接触した状態にならないようにした。これは微粒子−細胞の接触が細胞の毒素作用からの保護にとって不要であることを示すためであった。複数の細胞フィールド（＞１０）の顕微鏡検査によって毒素中和の相対範囲を比較し、コンフルエントな細胞成長のバックグラウンドにおける円形化された細胞の百分率を定量する。細胞の円形化からの９５％を超える保護をもたらす最小有効用量の微粒子を使用することで微粒子活性の測定が可能になる。表３にデータを示す。
【００９９】
【表７】
【０１００】
ＳＭ１含有微粒子は毒素Ｂの活性を中和させることも可能であった。上記の方法を用いることで、微粒子が１０ｍｇ／ｍＬの用量で使用される場合、負荷用量０．３ｐｇ／ｍＬの毒素Ｂに対する９５％を超える保護が得られた（図４参照）。
【０１０１】
図７は、微粒子ｔｍ４７３ｂにおける濃度範囲による結合された毒素ＡおよびＢの百分率を示す。
【０１０２】
実施例３：微粒子（ＴＭ４７３Ｂ）の結合能
ブロッキング用緩衝液（５％ウシ胎児血清を含有する１倍のリン酸塩で緩衝化した生理食塩水）で微粒子を希釈することにより、実施例１の微粒子試料の１種であるＴＭ４７３Ｂを２０、１０、５、および２．５ｍｇ／ｍＬの濃度の２倍溶液中に作製した。精製したクロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢ（テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ）のＴ３００１およびＴ３００２）を、ブロッキング用緩衝液で３６０〜２μｇ／ｍＬの範囲の２倍溶液に希釈した。チェッカーボード法で両希釈物を混合し微粒子に対する毒素の最終的な比率を１：１にした。
【０１０３】
微粒子を平衡結合に至らせるために、試料を３７℃で１８時間インキュベートした。１０，０００ｒｐｍで１時間の遠心分離により、結合された毒素ＡまたはＢを微粒子とともにペレット化した。遊離／平衡状態の毒素を含有する上清を回収し、毒素Ａ用または毒素ＡおよびＢ用ＥＬＩＳＡキット（テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ）のＣ．Ｄｉｆｆ Ｔｏｘ−Ａ Ｔｅｓｔ Ｔ５００１またはＣ．Ｄｉｆｆ Ｔｏｘ−Ａ／ＢＩＩ Ｔｅｓｔ Ｔ５０１５）によって濃度を測定した。
【０１０４】
結合された毒素の濃度を判定するため、平衡濃度を開始量から差し引いた。次いで、μｇ／ｍＬの結合された毒素の濃度をｍｇ／ｍＬの微粒子濃度で除することによって結合能を算出した。図５および図６に結果を示す。
【０１０５】
実施例４：インビボにおける微粒子の有効性試験：ウサギ回腸ループの毒性試験
ウサギ回腸ループのモデル試験にて実施例１における２種類の微粒子試料のＴＭ４７３ＡおよびＴＭ４７３Ｂをインビトロにおいて試験した。ウサギ回腸ループのモデルは、細菌タンパク質毒素の腸毒性を明らかにするためのモデルである（ダンカン（Ｄｕｎｃａｎ）およびストロング（Ｓｔｒｏｎｇ）、１９６９年）。同モデルを使用することで、コレラ毒素、大腸菌の不安定毒素、シガトキシン、ならびにウェルシュ菌のエンテロトキシンおよびクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａを含む様々なクロストリジウム毒素の腸管毒性活性を特徴付ける。
【０１０６】
クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａのウサギ回腸ループ試験用プロトコルは以下の通りである。
・ウサギ（雌雄いずれか、１２週齢超）を一晩絶食させ、次いで周縁耳静脈（ｍａｒｇｉｎａｌ ｅａｒ ｖｅｉｎ）にて静脈内注射したジアゼパム（５ｍｇ／ｍＬ）０．２５ｍＬと混合した塩酸ケタミン（１００ｍｇ／ｍＬ）０．２５ｍＬで麻酔した。
・ガス麻酔機を介して送達するハロタン（１．５〜２．５％で作用）、亜酸化窒素（２ｌ／分の流れ）および酸素（１ｌ／分）を使用して麻酔状態を維持した。
・麻酔をかけた各ウサギの腹部中央部の毛を剃り、一連のベタジンとイソプロピルアルコールの洗浄を交互に用いて無菌で調製し、５ｃｍの腹部切開を行った。
・回腸を慎重に引き抜き、最大６つの回腸ループ（長さ〜７〜１０ｃｍ以内）を、回腸部の各末端の１ｃｍまでを無菌の綿による結紮により密封することによって構成した。
・試験微粒子（最大２０ｍｇ／ｍＬ）と毒素Ａ（１０μｇ／ｍＬ）の混合物を含有する流体（０．５ｍＬ／ループ）を、各試験ループにおける近位の単結紮の約０．５ｃｍ直下位置に２６−ゲージ針によって注射した。
・注射部位を隔離し、穿刺部位の約０．５ｃｍ遠位でのさらなる結紮による漏れを防止した。
・ループにおける接種後、回腸を温かい生理食塩水に再び湿らし、ゆっくりと腹腔に戻した。筋肉壁を縫合し皮膚切開を閉じた後、麻酔回復期間に動物を保温し監視した。オキシモルホン（０．２５ｍＬ 筋肉内／ウサギ；１．５ｍｇ／ｍＬ）を麻酔回復前と手術の６〜８時間後に再度投与した。手術後、食物と水を控えた。
・手術の約８〜１２時間後、ビューサネージアＤ（Ｂｅｕｔｈａｎａｓｉａ Ｄ）（３９０ｍｇ／ｍＬのペントバルビタール、５０ｍｇ／ｍＬのフェニトイン）の０．５〜１．０ｍＬの静脈内注射によってウサギを安楽死させた。
・回腸を取り除き、個々のループ内に蓄積した流体を視覚的に評価した。次いで、陽性の各ループの長さおよび重量を測定し、グラム単位のループ含量の重量に対するセンチメートル単位のループ長さの比であるＶ／Ｌ（容量−長さ）比を算出するのにその含量を秤量した。
・Ｖ／Ｌ比＞０．３を有しかつ無圧で水の一貫性を有する漿液血液状流体を含有するものとして、陽性ループ（流体を蓄積させるもの）を定義した。陰性ループは、回復可能な内容物、すなわちＶ／Ｌ比＜０．１を有するそれらのループを有しなかった。
【０１０７】
このプロトコルを用いて、微粒子の試験試料であるＴＭ４７３ＢおよびＴＭ４７３Ａは、２．５ｍｇ／ｍＬで投与される場合、毒素Ａ（１０μｇｍ／ｍＬ）の腸毒性に対する保護を可能にした。表４を参照のこと。
【０１０８】
【表８】
【０１０９】
実施例５：炭水化物単量体の含量が低下したジブロックミセルおよび微粒子の調製および試験
さらなる実験セットでは、ジブロック共重合体ミセルと、炭水化物単量体（ＳＭ１）の含量が低下した、対応する微粒子との製剤をさらに調製し、インビトロにおいて評価した。特に、約３３重量％の炭水化物単量体ＳＭ１（本明細書において「ジブロック共重合体Ａ」として示される）を含み、かつそれとは別に約２１重量％の炭水化物単量体ＳＭ１（本明細書において「ジブロック共重合体Ｂ」として示される）を含むジブロック共重合体を調製した。ジブロック共重合体に含有される炭水化物単量体の含量は、実施例１に記載の如く調製されたジブロック共重合体に含有される約４４重量％をなす炭水化物単量体ＳＭ１と比べて実質的に低下した。ジブロック共重合体Ｂから形成されるミセル溶液を細胞培養アッセイでインビトロにおいて実質的に評価した。さらに、ジブロック共重合体Ａとジブロック共重合体Ｂの各々からラテックス微粒子を合成し、さらにインビトロにおいて評価した。
【０１１０】
ジブロック共重合体ＡおよびＢの調製
炭水化物単量体ＳＭ１を、実質的に実施例１に記載のごとく調製した。炭水化物単量体（ＳＭ１）の含量が相対的に低下した、ジブロック共重合体の２種類の製剤を表５に記載の試薬および量を用いて以下のように調製した。
【０１１１】
【表９】
【０１１２】
ジブロック共重合体ＡおよびＢの各々については、ＴＨＭＡ、ＤＭＡ、炭水化物単量体（ＳＭ１）およびＣＴＡの混合物に水／ＤＭＦ混合物３．４ｍＬを添加し、グローブボックス内で５０℃に加熱した。ＶＡ−０４４ストック溶液（ＤＩ水０．２ｍＬ中２０ｍｇ）２０μＬを添加し、混合物を３時間撹拌した。ｎ−ブチルアクリレートを次の３時間にわたり半連続的に添加し、その後で混合物を室温まで冷却する前に３時間重合した。ＤＩ水１０ｍＬを混合物に添加し、その後でジブロック共重合体をＤＩ水で２４時間透析し、ジブロックミセル溶液を形成した。
【０１１３】
インビトロでのジブロック共重合体Ｂミセルの細胞培養アッセイ
インビトロにおける細胞培養アッセイで、ジブロック共重合体Ｂから形成したミセル溶液を評価した。このアッセイでは、様々な濃度のジブロック共重合体Ｂミセル（０．７８ｍｇ／ｍＬ、１．５６ｍｇ／ｍＬおよび３．１２５ｍｇ／ｍＬ）を有する溶液でベロ細胞を処理した。ここで各場合においては、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａの固定量（１ｎｇ／ｍＬ）と混合した。固定量の毒素は、それ単独で使用される場合、「細胞の円形化」（すなわち、細胞の塑性表面への正常な付着を破壊する細胞毒性作用であり、通常は細胞死または細胞内糸状構造の損失を示す）を誘発することがわかった。一対照として、処理していない（すなわち毒素またはジブロック共重合体Ｂミセルで処理していない）単層のベロ細胞を使用した。別の対照として、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ（１ｎｇ／ｍＬ）単独で処理したベロ細胞を使用した。複数の細胞領域（＞１０）の顕微鏡検査によって毒素中和における相対的な範囲を比較し、コンフルエントな細胞成長のバックグラウンドにおける円形化された細胞の百分率を定量した。図８に結果を示す。
【０１１４】
ジブロック共重合体ＡおよびＢを使用する微粒子の調製
表６に記載の試薬および量を使用し、ジブロック共重合体Ａとジブロック共重合体Ｂの各々からラテックス微粒子を合成した。本明細書では生成された微粒子の各々を糖粒子ＡおよびＢと称し、それぞれｔｉｌｍ２０９Ａおよびｔｉｌｍ２０９Ｂとも称する。
【０１１５】
【表１０】
【０１１６】
以下に示すように、微粒子Ａ（ｔｉｌｍ２０９Ａ）およびＢ（ｔｉｌｍ２０９Ｂ）をジブロック共重合体ＡおよびＢの各溶液から別々に合成した。２５０ｍＬの三首モルトンフラスコに、ジブロック溶液、スチレン０．８ｍＬおよびＤＩ水７０ｍＬを添加し、窒素下、室温で一晩撹拌した。温度を６０℃に上昇させ、ＫＰＳストック溶液（ＤＩ水１ｍＬ中２５ｍｇ）２４０μＬの添加前にさらに４時間撹拌した。次の５時間の間にスチレン１．６ｍＬを添加した。スチレンの添加完了の２時間後に、ｔ−ブチルペルオキシベンゾエート１０μＬおよびアスコルビン酸２５ｍｇを添加した。次の１０時間の間に重合体混合物を連続撹拌し、孔サイズが２５μｍの濾紙（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）製）によって濾過した。生成される糖粒子懸濁液をＤＩ水で１０日間透析した。
【０１１７】
微粒子ＡおよびＢのインビトロでのＥＬＩＳＡアッセイ
インビトロでのＥＬＩＳＡアッセイを用い、微粒子Ａ（ｔｉｌｍ２０９Ａ）およびＢ（ｔｉｌｍ２０９Ｂ）によって結合された毒素ＡおよびＢの百分率を測定した。微粒子ＡおよびＢの各々に対する別々の実験において、５％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中での５〜０．２５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の微粒子を、１０μｇ／ｍＬの精製したクロストリジウム・ディフィシル毒素ＡまたはＢ（テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ））とともに３７℃で１２〜１８時間インキュベートした。混合物を１０，５００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、結合された毒素と微粒子の複合体を沈殿させた。毒素Ａに特異的なＥＬＩＳＡ（テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ） ＃Ｔ５００１ クロストリジウム・ディフィシル Ｔｏｘ−Ａ試験）または毒素ＡおよびＢに特異的なＥＬＩＳＡ（テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ） ＃Ｔ５０１５ クロストリジウム・ディフィシル Ｔｏｘ−Ａ／ＢＩＩ試験）により、上清中に残存する遊離毒素の量を測定した。図９Ａおよび図９Ｂに結果を示す。
【０１１８】
微粒子Ｂのインビトロでの細胞培養アッセイ
インビトロでの細胞培養による細胞毒性アッセイにて、微粒子Ｂ（ｔｉｌｍ２０９Ｂ）を評価した。このアッセイでは、１０％ウシ胎児血清を加えたＭＥＭ（メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ））を有する９６−ウェルプレートでベロ細胞（ＡＴＣＣ）のコンフルエントな単層を成長させた。最終濃度１ｎｇ／ｍＬの精製したクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ（テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ））を、成長培地内で５ｍｇ／ｍＬのｔｉｌｍ２０９Ｂ微粒子と混合し、３７℃、５％ ＣＯ２／９５％空気で１８時間かけて単層に適用した。インキュベーション後、細胞の毒素媒介性形態変化に対して顕微鏡検査を行い、単層の破壊および細胞の円形化によって細胞を同定した。図１０Ａ〜１０Ｃに示す結果は、１ｎｇ／ｍＬの毒素Ａのベロ細胞に対する作用が５ｍｇ／ｍＬのｔｉｌｍ２０９Ｂによって中和させることを明らかにしている。
【０１１９】
実施例６：インビトロでの競合結合実験−Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃの特異性
この実施例では、インビトロでの競合結合アッセイを含む一連の実験を行い、実質的に実施例１に記載の如く調製したクロストリジウム・ディフィシル毒素結合性微粒子の特異性を明らかにした。
【０１２０】
別々の実験で、三糖Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃ、その異性体のグロボトリオース（Ｇａｌα（１，４）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃ）、乳糖（Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃ）、およびセロビオース（Ｇｌｃβ（１，４）Ｇｌｃ）を含む４種類の各遊離オリゴ糖における、毒素Ａおよび毒素Ｂの結合に対するクロストリジウム・ディフィシル毒素結合性微粒子との競合能についてアッセイした。１０μｇ／ｍＬの毒素Ａまたは毒素Ｂへの結合における２ｍｇ／ｍＬの毒素結合性微粒子に対する各場合において、６．２５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲の濃度で遊離オリゴ糖の試験を行った。混合物を３７℃で１６時間インキュベートした。遠心分離によって結合された毒素を含む微粒子を沈殿させ、ＥＬＩＳＡ（テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ））によって上清中の遊離毒素量を測定した。
【０１２１】
図１１Ａおよび図１１Ｂに、これらの競合結合実験から得られた結果を示す。図１１Ａについては、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａは、上記オリゴ糖において濃度が相対的に高くても、遊離オリゴ糖であるグロボトリオース（Ｇａｌα（１，４）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃ）、乳糖（Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃ）、およびセロビオース（Ｇｌｃβ（１，４）Ｇｌｃ）の全体に存在する毒素結合性微粒子に特異的に結合する。それに対し、毒素結合性微粒子によるクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａの結合範囲は、遊離した三糖Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃの濃度に依存して変化した。これらのデータは、毒素結合性微粒子と毒素Ａの相互作用における特異的な性質を明らかにし、かつ微粒子による毒素Ａの結合はＧａｌα（１，３）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃリガンドによって特異的に媒介されることを裏付けている。それに対し、図１１Ｂは、毒素Ｂが、上記オリゴ糖において濃度が相対的に高くても、試験対象の三糖Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃ、グロボトリオース、乳糖およびセロビオースといった４種類の各遊離オリゴ糖の全体に存在する毒素結合性微粒子に特異的に結合することを示す。それゆえ、毒素Ｂは毒素結合性微粒子によって結合されるが（図７および実施例２でのそれに関する考察を参照）、遊離した三糖Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃ（他の３種類のオリゴ糖のいずれでもない）が毒素Ｂへの結合のために微粒子とうまく競合することから、毒素Ｂの結合は毒素結合性微粒子のＧａｌα（１，３）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃリガンドによって直接的に媒介されるようには見られない。
【０１２２】
さらなる実験では、炭水化物単量体のＳＭ１（αＧａｌ−Ｃ８−リンカー；実質的に実施例１に記載の如く調製されたもの）における、毒素Ａの結合および毒素Ｂの結合に対するクロストリジウム・ディフィシル毒素結合性微粒子との競合能について同様にアッセイした。１０μｇ／ｍＬの毒素Ａまたは毒素Ｂへの結合における２ｍｇ／ｍＬの毒素結合性微粒子に対し、１２．５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲の濃度でＳＭ１単量体の試験を行った。混合物を３７℃で１６時間インキュベートした。遠心分離によって結合された毒素を含む微粒子を沈殿させ、ＥＬＩＳＡ（テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ））によって上清中の遊離毒素量を測定した。
【０１２３】
図１１Ｃに結果を示す。予想どおり図１１Ａに関連して上で検討した結果に基づき、微粒子による毒素Ａの結合は、微粒子上および炭水化物単量体ＳＭ１上の両方に存在するＧａｌα（１，３）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃリガンドによって競合的に媒介される。毒素Ｂの結合については、図１１Ｃは、炭水化物単量体ＳＭ１がより高い濃度で毒素結合性微粒子と競合することで毒素Ｂと結合可能であることを示す。これは理論に縛られることなく、（遊離オリゴ糖を含む図１１Ｂのデータには媒介が全く認められないことから）毒素結合性糖粒子とクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂの間の相互作用が、（例えば炭水化物単量体ＳＭ１の）疎水部分または三糖リガンドと（例えば炭水化物単量体ＳＭ１の）疎水部分の組み合わせにより、少なくとも部分的に媒介されるといういくつかの証拠をもたらす。
【０１２４】
実施例７：インビボにおけるハムスターのクロストリジウム・ディフィシル負荷試験
この実施例では、クロストリジウム・ディフィシル関連性下痢の治療のために、インビボでハムスターモデルを使用し、実質的に実施例１（本明細書ではＹ１０３Ａ２と指定）に記載の如く調製された毒素結合性微粒子について試験した。
【０１２５】
ハムスターモデル
一般に、クロストリジウム・ディフィシルへの暴露に先立ち抗生物質をハムスターに投与すると、３〜５日後、下痢や大腸炎に加え、死さえも招くことが知られている。ハムスターにおいてクロストリジウム・ディフィシルによって誘発される全腸炎は盲腸および末端回腸で発症し、粘膜出血を伴う粘膜上皮細胞の増殖および細胞上での変性性の表面変化を特徴とする。それに対し、ヒト疾患は滲出および炎症状態での巣状腺窩壊死として結腸内に見られる（プライス（Ｐｒｉｃｅ）ら、１９７９年）（以下に十分に記載）。これらの組織学的な違いにもかかわらず、クロストリジウム・ディフィシル関連性下痢の細菌由来およびその活性疾患における毒素ＡおよびＢの分泌への依存性により、ハムスターモデルがヒト疾患の適切な模倣となる（バートレット（Ｂａｒｔｌｅｔｔ）ら、１９７８ａ；バートレット（Ｂａｒｔｌｅｔｔ）ら、１９７８ｂ；チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、１９７８年）。
バートレット，Ｊ．（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．）、Ｃ．ＴＷ、およびＧ．Ｍ．１９７８ａ．「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｃｏｌｉｔｉｓ ｄｕｅ ｔｏ ｔｏｘｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ」Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ２９８：５３１−５３４頁
バートレット，Ｊ．Ｇ．（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｇ．）、Ｔ．Ｗ．チャン（Ｔ．Ｗ．Ｃｈａｎｇ）、Ｎ．ムーン（Ｎ．Ｍｏｏｎ）、およびＡ．Ｂ．オンダードンク（Ａ．Ｂ．Ｏｎｄｅｒｄｏｎｋ）１９７８ｂ．「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｅｔｈａｌ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｈａｍｓｔｅｒｓ：ｓｔｕｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｅｌｅｖｅｎ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｏ ｓｕｐｐｏｒｔ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｏｘｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ」Ａｍ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ．３９：１５２５−３０頁
チャン，Ｔ．Ｗ．（Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｗ．）、Ｊ．Ｇ．バートレット（Ｊ．Ｇ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ）、Ｓ．Ｌ．ゴルバッハ（Ｓ．Ｌ．Ｇｏｒｂａｃｈ）、およびＡ．Ｂ．オンダードンク（Ａ．Ｂ．Ｏｎｄｅｒｄｏｎｋ）１９７８年「Ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｈａｍｓｔｅｒｓ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ」Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２０：５２６−９頁
プライス，Ａ．Ｂ．（Ｐｒｉｃｅ，Ａ．Ｂ．）、Ｈ．Ｅ．ラルソン（Ｈ．Ｅ．Ｌａｒｓｏｎ）、およびＪ．クロウ（Ｊ．Ｃｒｏｗ．）１９７９年「Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈａｍｓｔｅｒ：ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｃｏｌｉｔｉｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｉａｒｒｈｏｅａ」 Ｇｕｔ．２０：４６７−７５頁
を参照のこと。
【０１２６】
ハムスターの株および数
これらの実験では、ハーラン・ラボラトリーズ（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からハムスターを入手し、治療開始前に７日間隔離状態で保持した。隔離後、ハムスターの体重を測り、無作為に４群に割り付けた。下記の表７にまとめたように、群１は６匹の動物を含む対照群であった。群２〜４はそれぞれ８匹の動物を含む治療群であった。
【０１２７】
収容
ハムスターを、水および食物への接近を自由にした状態で陽圧のケージ内に個別に収容した（マイクロベント・エンバイロンメンタル・システム（Ｍｉｃｒｏ−Ｖｅｎｔ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｙｓｔｅｍ）、アレンタウン・ケージング・アンド・イクイップメント（Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ Ｃａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏ．）、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、ニュージャージー州）（Ｐｕｒｉｎａ ５０００）。
【０１２８】
治療モデル
２日前、下記の表７に示すレジメンに従い、予防的栄養を開始した。１日前、すべての群内の動物に、経口栄養によりクロストリジウム・ディフィシル（ＶＰＩ１０４６３）の一晩培養液由来の洗浄した細胞１０６個で感染させた。全４群中の動物に、０日目（１日前の翌日）に１ｋｇ当たり１０ｍｇのリン酸クリンダマイシンを皮下注射し、疾患を誘発した。以下のレジメンに従い、２日前〜６日目にハムスターに３通りの等しい１日用量で栄養した。
【０１２９】
【表１１】
【０１３０】
リン酸塩で緩衝化した生理食塩水中に毒素結合性微粒子を２０ｍｇ／ｍＬで投与した。栄養前に動物における罹患率および死亡率ならびにクリンダマイシン治療後の１４日間、少なくとも１日２回を基本に動物における下痢の有無について観察した。
【０１３１】
図１２に示す結果は、毒素結合性微粒子がクロストリジウム・ディフィシルで負荷されたハムスターを保護することを明示している。対照群１（対照；毒素結合性微粒子を含まない）において、動物７匹が１４日間試験のうちの２日目の試験で死亡した。治療群２〜４において、これらのデータは、生存が用量に依存し、再発を全く観察しなかったことを示す。特に群２では、ハムスターは試験を通して１匹も死亡しなかった。群３では、１日目に動物１匹が死亡し、２種類の動物の尾が湿っている（下痢の証拠）ことが観察されたが、動物は完全に回復しなかった。群４では、動物５匹が死亡し、これらのうちの１匹の動物の尾が湿っていることが観察され、動物はこの観察の４８時間以内に死亡した。すべての他の死亡は一般に急性であった（すなわち湿った尾を事前に観察することがなかった）。
【０１３２】
実施例８：Ｙ１０３Ａ２ナノ粒子による毒素結合性の測定
５％ウシ胎児血清を含有するリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）中で０．２５〜５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度のＹ１０３Ａ２ナノ粒子（メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、Ｈｅｒｎｄｏｎ、バージニア州）を、１０μｇ／ｍＬの精製したクロストリジウム・ディフィシル毒素ＡまたはＢ（テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ）、Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ、バージニア州）とともに３７℃で１２〜１８時間インキュベートした。混合物を１０，５００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し（ソーバル（Ｓｏｒｖａｌｌ））、結合された毒素とナノ粒子の複合体を沈殿させた。テックラブ（ＴｅｃｈＬａｂ）製クロストリジウム・ディフィシル毒素用ＥＬＩＳＡキットを使用して上清中に残存する遊離毒素の量を定量し、結合された毒素の百分率を算出した。このデータから９０％の毒素に結合したナノ粒子の濃度を算出した。表８は、Ｙ１０３Ａ２のバッチから得られたスクリーニングデータを列挙する。
【０１３３】
【表１２】
【０１３４】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示されかつ記載されている一方、かかる実施形態があくまでも例として提供されることは当業者には明らかであろう。ここで当業者であれば、本発明から逸脱することなく、極めて多数の変形、変化、および置換えについて着想するであろう。本発明の実施に際し、本明細書に記載の発明の実施形態に対する様々な選択肢を利用可能であることが理解される必要がある。添付の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、かつそれによりこれらの特許請求の範囲の中の方法および構造ならびにそれらの等価物が網羅されるように意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１Ａ】毒素結合性粒子を合成する方法（図１Ａ）およびかかる方法から得られる毒素結合性粒子を表す概略図（図１Ｂ）である。
【図１Ｂ】毒素結合性粒子を合成する方法（図１Ａ）およびかかる方法から得られる毒素結合性粒子を表す概略図（図１Ｂ）である。
【図２】微粒子で処理される毒素分子の生物活性を測定するのに用いられるＥＬＩＳＡおよび組織培養アッセイの概要を表す概略図である。
【図３】４つの相異なる毒素結合微粒子組成物に対するＥＬＩＳＡの特性データを図示するグラフである。
【図４】細胞を図示しかつベロ細胞用アッセイでＳＭ１含有微粒子によって可能になる毒素Ｂの保護を示す４つの画像を含む。
【図５】微粒子のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに対する結合能を表すグラフである。
【図６】微粒子のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂに対する結合能を表すグラフである。
【図７】異なる濃度の微粒子によってクロストリジウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢが除去される割合（％）を表すグラフである。
【図８】細胞を図示しかつベロ細胞用アッセイでジブロック共重合体Ｂを含有するミセル溶液によって可能になる毒素Ａの保護を示す５つの画像を含む。
【図９Ａ】クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ（図９Ａ）および毒素Ｂ（図９Ｂ）に対する２つの異なる毒素結合微粒子についてのＥＬＩＳＡの特性データを図示するグラフである。
【図９Ｂ】クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ（図９Ａ）および毒素Ｂ（図９Ｂ）に対する２つの異なる毒素結合微粒子についてのＥＬＩＳＡの特性データを図示するグラフである。
【図１０Ａ】細胞を図示し、かつ処理されていないベロ細胞の単層（図１０Ａ）、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａで処理されたベロ細胞（図１０Ｂ）、およびクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａと毒素結合性微粒子の両方で処理されたベロ細胞（図１０Ｃ）を示す画像である。
【図１０Ｂ】細胞を図示し、かつ処理されていないベロ細胞の単層（図１０Ａ）、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａで処理されたベロ細胞（図１０Ｂ）、およびクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａと毒素結合性微粒子の両方で処理されたベロ細胞（図１０Ｃ）を示す画像である。
【図１０Ｃ】細胞を図示し、かつ処理されていないベロ細胞の単層（図１０Ａ）、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａで処理されたベロ細胞（図１０Ｂ）、およびクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａと毒素結合性微粒子の両方で処理されたベロ細胞（図１０Ｃ）を示す画像である。
【図１１Ａ】遊離オリゴ糖に対して測定された毒素Ａ（図１１Ａ）；遊離オリゴ糖に対して測定された毒素Ｂ（図１１Ｂ）；および遊離炭水化物単量体ＳＭ１に対して測定された毒素Ａと毒素Ｂの両方（図１１Ｃ）を含むインビトロでの競合アッセイにおいて、本発明の毒素結合性微粒子によって結合されたクロストリジウム・ディフィシル毒素の百分率を図示するグラフである。
【図１１Ｂ】遊離オリゴ糖に対して測定された毒素Ａ（図１１Ａ）；遊離オリゴ糖に対して測定された毒素Ｂ（図１１Ｂ）；および遊離炭水化物単量体ＳＭ１に対して測定された毒素Ａと毒素Ｂの両方（図１１Ｃ）を含むインビトロでの競合アッセイにおいて、本発明の毒素結合性微粒子によって結合されたクロストリジウム・ディフィシル毒素の百分率を図示するグラフである。
【図１１Ｃ】遊離オリゴ糖に対して測定された毒素Ａ（図１１Ａ）；遊離オリゴ糖に対して測定された毒素Ｂ（図１１Ｂ）；および遊離炭水化物単量体ＳＭ１に対して測定された毒素Ａと毒素Ｂの両方（図１１Ｃ）を含むインビトロでの競合アッセイにおいて、本発明の毒素結合性微粒子によって結合されたクロストリジウム・ディフィシル毒素の百分率を図示するグラフである。
【図１２】インビボにおけるハムスターのクロストリジウム・ディフィシル負荷試験の結果を要約するデータを図示するグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
毒素結合性オリゴ糖および重合体粒子を含有する毒素結合性組成物であって、該重合体粒子が共重合体を含有し、該共重合体が第１の重合体および第２の重合体を含有し、該毒素結合性オリゴ糖が該第１の重合体に連結されている、毒素結合性組成物。
【請求項２】
前記共重合体が、第１の重合体ブロックおよび疎水性ブロックである第２の重合体ブロックを含むブロック共重合体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１の重合体ブロックが親水性ブロックである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
粒子に連結されたオリゴ糖を含有する毒素結合性組成物であって、該粒子の単位表面積当たりの該オリゴ糖のモル含量が約０．５μ当量／ｍ２よりも大きく、該オリゴ糖がクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素結合性オリゴ糖である、毒素結合性組成物。
【請求項５】
粒子に連結されたオリゴ糖を含有するタンパク質結合組成物であって、該オリゴ糖が水可溶性タンパク質に結合し、該粒子がタンパク質ではなく、デンドリマーまたはリポソームの形態ではなく、かつ分子として水溶性を示さず、該粒子の単位表面積当たりの該オリゴ糖のモル含量が約０．５μ当量／ｍ２よりも大きい、タンパク質結合組成物。
【請求項６】
前記粒子の単位表面積当たりの前記オリゴ糖のモル含量が約１μ当量／ｍ２よりも大きい、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
前記粒子が重合体粒子である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記粒子の表面積が約０．５ｍ２／ｇｍ〜約６００ｍ２／ｇｍである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
単位重量当たりの前記オリゴ糖のモル含量が前記粒子の１グラム当たりで約１００μｍｏｌよりも大きい、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
単位重量当たりの前記オリゴ糖のモル含量が前記粒子の１グラム当たりで約２００μｍｏｌよりも大きい、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記粒子が親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体を含有し、前記オリゴ糖が該親水性ブロックに連結されている、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記共重合体が水性媒体内でミセルを形成可能である、請求項２、３または１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
毒素結合性部分および重合体粒子を含有する毒素結合性組成物であって、該重合体粒子が親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体を含有し、該疎水性ブロックが、該ブロック共重合体が水性媒体内でミセルを形成するように化学的に架橋されているかまたは物理的に包まれ、該毒素結合性部分が該親水性ブロックに連結されている、毒素結合性組成物。
【請求項１４】
前記水可溶性タンパク質が毒素であり、それによって前記オリゴ糖が毒素結合性部分である、請求項５に記載の組成物。
【請求項１５】
前記毒素結合性オリゴ糖または毒素結合性部分が細菌毒素に対して結合親和性を有する、請求項１〜３および８〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記毒素結合性オリゴ糖または毒素結合性部分が細菌外毒素に対して結合親和性を有する、請求項１〜３および８〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記毒素結合性オリゴ糖または毒素結合性部分が真核細胞内の代謝過程を改変する分泌細菌タンパク質に対して結合親和性を有する、請求項１〜３および８〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記毒素結合性オリゴ糖または毒素結合性部分が哺乳類細胞内の代謝過程を改変する分泌細菌タンパク質に対して結合親和性を有する、請求項１〜３および８〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記毒素結合性オリゴ糖または毒素結合性部分がヒト細胞内の代謝過程を改変する分泌細菌タンパク質に対して結合親和性を有する、請求項１〜３および８〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記毒素結合性オリゴ糖または毒素結合性部分が宿主の粘膜表面上で作用する毒素と結合するかまたはそれを中和させる、請求項１〜３および８〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記粘膜表面が口、鼻、呼吸器、胃腸、泌尿器、生殖器および耳の粘膜表面からなる群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記毒素結合性オリゴ糖または毒素結合性部分が毒素中和部分である、請求項１〜３および８〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ミセルが前記疎水性ブロックを含むコアと前記親水性ブロックを含むシェルを含む、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項２４】
前記重合体粒子が第２の粒子上に吸着される、請求項１〜３、１１〜１３、または２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ミセルが、付加的単量体から形成される付加的重合体ブロックを含有し、該付加的重合体ブロックが、前記共重合体の前記疎水性ブロックを化学的に架橋するかまたはそれを物理的に包む、請求項１２、１３、または２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記付加的重合体ブロックが、前記ブロック共重合体の前記疎水性ブロックの間の単量体を重合させることによって架橋するかまたは包む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記付加的単量体が疎水性単量体、多官能性単量体、またはこれらの組み合わせである、請求項２５または２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記付加的単量体が、スチレン、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリレート、アクリル酸のＣ１〜Ｃ１２アルコールエステル、メタクリル酸のＣ１〜Ｃ１２アルコールエステル、ビニルトルエン、およびＣ２〜Ｃ１２カルボン酸のビニルエステルから選択される少なくとも１種類の単量体である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記第２の重合体または疎水性ブロックが、アクリル酸のＣ１〜Ｃ１２アルコールエステル、メタクリル酸のＣ１〜Ｃ１２アルコールエステル、スチレン、ビニルトルエン、およびＣ２〜Ｃ１２カルボン酸のビニルエステルから選択される少なくとも１つの反復単位を含む重合体である、請求項１〜３、１１〜１３、２３、または２５〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記第１の重合体または第１の重合体ブロックがジメチルアクリルアミドの重合体である、請求項１〜３、１１〜１３、２３、または２５〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記オリゴ糖または前記毒素結合性部分が８−メトキシカルボニルオクチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１，４）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項１〜１２および１４〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記組成物における粒子半径が約７５ｎｍ〜約１μｍである、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
毒素媒介性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に請求項１〜３２のいずれか一項に記載の有効量の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項３４】
前記毒素媒介性疾患がクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａまたはクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂの一方または両方によって媒介される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記毒素媒介性疾患がクロストリジウム・ディフィシル関連性下痢、偽膜性腸炎、または抗生物質関連性大腸炎である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
有効量の抗生物質を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗生物質が、メトロニダゾール、バンコマイシン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗生物質が、テイコプラニン、フシジン酸、バシトラシン、カルベンシリム、アンピシリン、クロキサシリン、オキサシリン、ピペラシリン、セファクロール、セファマンドール、セファゾリン、セフォペラゾン、セフタキシム、セフォキシチン、セフタジジム、セフトリアゾン、イミペネム、メロペネム、ナリジクス酸、テトラサイクリン、ゲンタマイシン、パロモマイシン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
毒素結合性部分およびポリマーナノ粒子を含有する毒素結合性組成物であって、該毒素結合性部分が該ナノ粒子に連結されかつ該ナノ粒子が実質的に胃腸内腔から胃腸粘膜細胞内に吸収されない、毒素結合性組成物。
【請求項４０】
前記毒素結合性部分がクロストリジウム・ディフィシル毒素に結合する、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ナノ粒子が共重合体である、請求項３９または４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ナノ粒子がリポソームではない、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
クロストリジウム・ディフィシル毒素結合性部分および重合体粒子を含有する毒素結合性組成物であって、少なくとも約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａが約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の該組成物によって結合され、該クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａが約５％のウシ胎児血清を含有するリン酸塩緩衝溶液中の該毒素結合性組成物で処理される、毒素結合性組成物。
【請求項４４】
約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに結合するのに必要な前記組成物の濃度が約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに結合するのに必要な前記組成物の濃度が約０．８ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに結合するのに必要な前記組成物の濃度が約１ｍｇ／ｍＬ〜約３ｍｇ／ｍＬである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項１】
毒素結合性オリゴ糖および重合体粒子を含有する毒素結合性組成物であって、該重合体粒子が共重合体を含有し、該共重合体が第１の重合体および第２の重合体を含有し、該毒素結合性オリゴ糖が該第１の重合体に連結されている、毒素結合性組成物。
【請求項２】
前記共重合体が、第１の重合体ブロックおよび疎水性ブロックである第２の重合体ブロックを含むブロック共重合体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１の重合体ブロックが親水性ブロックである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
粒子に連結されたオリゴ糖を含有する毒素結合性組成物であって、該粒子の単位表面積当たりの該オリゴ糖のモル含量が約０．５μ当量／ｍ２よりも大きく、該オリゴ糖がクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素結合性オリゴ糖である、毒素結合性組成物。
【請求項５】
粒子に連結されたオリゴ糖を含有するタンパク質結合組成物であって、該オリゴ糖が水可溶性タンパク質に結合し、該粒子がタンパク質ではなく、デンドリマーまたはリポソームの形態ではなく、かつ分子として水溶性を示さず、該粒子の単位表面積当たりの該オリゴ糖のモル含量が約０．５μ当量／ｍ２よりも大きい、タンパク質結合組成物。
【請求項６】
前記粒子の単位表面積当たりの前記オリゴ糖のモル含量が約１μ当量／ｍ２よりも大きい、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
前記粒子が重合体粒子である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記粒子の表面積が約０．５ｍ２／ｇｍ〜約６００ｍ２／ｇｍである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
単位重量当たりの前記オリゴ糖のモル含量が前記粒子の１グラム当たりで約１００μｍｏｌよりも大きい、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
単位重量当たりの前記オリゴ糖のモル含量が前記粒子の１グラム当たりで約２００μｍｏｌよりも大きい、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記粒子が親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体を含有し、前記オリゴ糖が該親水性ブロックに連結されている、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記共重合体が水性媒体内でミセルを形成可能である、請求項２、３または１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
毒素結合性部分および重合体粒子を含有する毒素結合性組成物であって、該重合体粒子が親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体を含有し、該疎水性ブロックが、該ブロック共重合体が水性媒体内でミセルを形成するように化学的に架橋されているかまたは物理的に包まれ、該毒素結合性部分が該親水性ブロックに連結されている、毒素結合性組成物。
【請求項１４】
前記水可溶性タンパク質が毒素であり、それによって前記オリゴ糖が毒素結合性部分である、請求項５に記載の組成物。
【請求項１５】
前記毒素結合性オリゴ糖または毒素結合性部分が細菌毒素に対して結合親和性を有する、請求項１〜３および８〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記毒素結合性オリゴ糖または毒素結合性部分が細菌外毒素に対して結合親和性を有する、請求項１〜３および８〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記毒素結合性オリゴ糖または毒素結合性部分が真核細胞内の代謝過程を改変する分泌細菌タンパク質に対して結合親和性を有する、請求項１〜３および８〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記毒素結合性オリゴ糖または毒素結合性部分が哺乳類細胞内の代謝過程を改変する分泌細菌タンパク質に対して結合親和性を有する、請求項１〜３および８〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記毒素結合性オリゴ糖または毒素結合性部分がヒト細胞内の代謝過程を改変する分泌細菌タンパク質に対して結合親和性を有する、請求項１〜３および８〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記毒素結合性オリゴ糖または毒素結合性部分が宿主の粘膜表面上で作用する毒素と結合するかまたはそれを中和させる、請求項１〜３および８〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記粘膜表面が口、鼻、呼吸器、胃腸、泌尿器、生殖器および耳の粘膜表面からなる群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記毒素結合性オリゴ糖または毒素結合性部分が毒素中和部分である、請求項１〜３および８〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ミセルが前記疎水性ブロックを含むコアと前記親水性ブロックを含むシェルを含む、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項２４】
前記重合体粒子が第２の粒子上に吸着される、請求項１〜３、１１〜１３、または２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ミセルが、付加的単量体から形成される付加的重合体ブロックを含有し、該付加的重合体ブロックが、前記共重合体の前記疎水性ブロックを化学的に架橋するかまたはそれを物理的に包む、請求項１２、１３、または２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記付加的重合体ブロックが、前記ブロック共重合体の前記疎水性ブロックの間の単量体を重合させることによって架橋するかまたは包む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記付加的単量体が疎水性単量体、多官能性単量体、またはこれらの組み合わせである、請求項２５または２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記付加的単量体が、スチレン、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリレート、アクリル酸のＣ１〜Ｃ１２アルコールエステル、メタクリル酸のＣ１〜Ｃ１２アルコールエステル、ビニルトルエン、およびＣ２〜Ｃ１２カルボン酸のビニルエステルから選択される少なくとも１種類の単量体である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記第２の重合体または疎水性ブロックが、アクリル酸のＣ１〜Ｃ１２アルコールエステル、メタクリル酸のＣ１〜Ｃ１２アルコールエステル、スチレン、ビニルトルエン、およびＣ２〜Ｃ１２カルボン酸のビニルエステルから選択される少なくとも１つの反復単位を含む重合体である、請求項１〜３、１１〜１３、２３、または２５〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記第１の重合体または第１の重合体ブロックがジメチルアクリルアミドの重合体である、請求項１〜３、１１〜１３、２３、または２５〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記オリゴ糖または前記毒素結合性部分が８−メトキシカルボニルオクチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１，３）−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１，４）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項１〜１２および１４〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記組成物における粒子半径が約７５ｎｍ〜約１μｍである、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
毒素媒介性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に請求項１〜３２のいずれか一項に記載の有効量の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項３４】
前記毒素媒介性疾患がクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａまたはクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂの一方または両方によって媒介される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記毒素媒介性疾患がクロストリジウム・ディフィシル関連性下痢、偽膜性腸炎、または抗生物質関連性大腸炎である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
有効量の抗生物質を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗生物質が、メトロニダゾール、バンコマイシン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗生物質が、テイコプラニン、フシジン酸、バシトラシン、カルベンシリム、アンピシリン、クロキサシリン、オキサシリン、ピペラシリン、セファクロール、セファマンドール、セファゾリン、セフォペラゾン、セフタキシム、セフォキシチン、セフタジジム、セフトリアゾン、イミペネム、メロペネム、ナリジクス酸、テトラサイクリン、ゲンタマイシン、パロモマイシン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
毒素結合性部分およびポリマーナノ粒子を含有する毒素結合性組成物であって、該毒素結合性部分が該ナノ粒子に連結されかつ該ナノ粒子が実質的に胃腸内腔から胃腸粘膜細胞内に吸収されない、毒素結合性組成物。
【請求項４０】
前記毒素結合性部分がクロストリジウム・ディフィシル毒素に結合する、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ナノ粒子が共重合体である、請求項３９または４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ナノ粒子がリポソームではない、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
クロストリジウム・ディフィシル毒素結合性部分および重合体粒子を含有する毒素結合性組成物であって、少なくとも約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａが約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の該組成物によって結合され、該クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａが約５％のウシ胎児血清を含有するリン酸塩緩衝溶液中の該毒素結合性組成物で処理される、毒素結合性組成物。
【請求項４４】
約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに結合するのに必要な前記組成物の濃度が約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに結合するのに必要な前記組成物の濃度が約０．８ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
約９０％のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに結合するのに必要な前記組成物の濃度が約１ｍｇ／ｍＬ〜約３ｍｇ／ｍＬである、請求項４３に記載の組成物。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【公表番号】特表２００８−５１５９９６（Ｐ２００８−５１５９９６Ａ）
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３６９０２（Ｐ２００７−５３６９０２）
【出願日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３６９０１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４４５７７
【国際公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（５０７１２３５１２）イリプサ， インコーポレイテッド (6)
【出願人】（５０７１２３１０９）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３６９０１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４４５７７
【国際公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（５０７１２３５１２）イリプサ， インコーポレイテッド (6)
【出願人】（５０７１２３１０９）
【Ｆターム（参考）】
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