水素結合性置換基を有する８−置換グアノシン誘導体及びそれを含むオリゴヌクレオチド
【課題】本発明はグアニンの８位に機能性置換基を有する８−置換グアノシン誘導体及びそれを含むオリゴヌクレオチドを提供することを課題とする。
【解決手段】天然の２’−デオキシグアノシン及びグアノシンを出発物質として、一連の１）ブロモ化、２）Ｐｄ触媒を用いたアルキレン化合物のカップリング反応、３）糖部分の水酸基無保護条件下での接触水添工程、を含む８−置換グアノシン誘導体の合成方法を提供することにより、上記課題を解決する。
【解決手段】天然の２’−デオキシグアノシン及びグアノシンを出発物質として、一連の１）ブロモ化、２）Ｐｄ触媒を用いたアルキレン化合物のカップリング反応、３）糖部分の水酸基無保護条件下での接触水添工程、を含む８−置換グアノシン誘導体の合成方法を提供することにより、上記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グアニンの８位に水素結合性置換基を有する８―置換グアノシン誘導体及びそれを含むオリゴヌクレオチド、ならびにそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＰＣＲ法を用いた核酸の利用法として、In vitro selection法が注目されている。In vitro selection法では、まず、多数のランダム配列領域を持つ多数の一本鎖核酸ライブラリーを、様々なセレクション系により特定機能で選び出す。続いて、選び出された核酸をＰＣＲによって増幅した後、同様のセレクションを行う。このサイクルを繰り返すことで、特定機能を持つ配列に収束させることが可能となる。In vitro selection法は、もともと、ある特定の物質に対して特異的に結合する核酸分子種を選び出す手法として開発されたため、Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment (SELEX)とも呼ばれる。この手法で得られた結合能を有する核酸はアプタマーと呼ばれ、酵素のような触媒能を持ったＤＮＡ、ＲＮＡはそれぞれデオキシリボザイム、リボザイムと呼ばれる。
【０００３】
アプタマーは、特定の二次構造を持つ場合が多い。それらは、ヘアピン（hairpin）、バルジ（bulge）、シュードノット（pseudoknot）、グアニンカルテット（G-quartet）等の構造に分類される。アプタマーは、そのような二次構造をとることで、標的分子を特異的に認識して結合すると考えられており、デオキシリボザイムまたはリボザイムにおいても二次構造が重要な役割を担っていると考えられる。
しかしながら、天然のＤＮＡアプタマー、デオキシリボザイムまたはリボザイムは、抗体または酵素に比べ、その結合能及び触媒能は極めて小さい。その理由は、以下の二つが考えられる。
１）抗体または酵素などの蛋白質は２０種のアミノ酸から構成されるのに対し、ＤＮＡは４種類のヌクレオシドしかない。
２）蛋白質はイミダゾールまたはアミノ基などの活性中心に多く存在する官能基を持つのに対して、核酸にはそのようなものがない。
このため、In vitro selection法では、結合能及び触媒能を高めるための種々の機能性置換基を導入した修飾ＤＮＡの利用が有効になると考えられる。
【０００４】
上記のような修飾ＤＮＡの合成には、機能性置換基を導入した修飾ヌクレオシドが有用である。修飾ヌクレオシドは種々知られているが、グアニン誘導体は、他の核酸塩基の誘導体と比較して少なく、その構造は特定のものに限られている。例えば、特開２００４−２６２７９１号公報（特許文献１）では、グアニンの８位にメチル基を有する８−置換グアノシン誘導体が記載されている。しかしながら、該公報に記載の方法では、グアニンの８位に機能性置換基を導入することはできない。
【特許文献１】特開２００４−２６２７９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような状況下、機能性置換基を導入した修飾ヌクレオシド、特に機能性置換基を導入した８−置換グアノシン誘導体の提供が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、グアニンカルテットなどの様々な二次構造の中でも特に重要な役割を果たしているグアニンに着目し、種々の水素結合性置換基を導入した修飾ヌクレオシドをデザインし、その合成を試みた。なお、水素結合性置換基の導入位置としては、ＤＮＡの二重鎖形成に直接関与しておらず、フレキシブルなアルキル直鎖を介してＤＮＡメジャーグループに置換基を出すことができるようにグアニンの８位とした。
【０００７】
その結果、グアノシンまたは２’−デオキシグアノシンを出発物質として、一連の１）ブロモ化、２）Ｐｄ触媒を用いたカップリング反応、３）糖部分の水酸基無保護条件下での接触水添、により、種々の水素結合性置換基をグアニンの８位に導入することに成功した。
【０００８】
なお、本発明者らは、水素結合性置換基を有する８−置換アデノシン誘導体の合成方法を既に確立している（Y. Saito et al., Tetrahedron Letters 46 (2005) 7605-7608）。この文献に示されるとおり、アデノシン誘導体は、糖部分の水酸基を保護しない状態で反応を十分に進行させることができる。しかしながら、グアノシン誘導体は、アデノシン誘導体と比較して溶解性が非常に低いため、糖部分の水酸基を保護して反応を行うと考えるのが一般的である。本発明はこのような従来の技術常識に反して、糖部分の水酸基を無保護条件下で反応を進行させることにより、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下に示す８−置換グアノシン誘導体及びオリゴヌクレオチド、ならびにそれらの製造方法に係るものである。
［１］下記式（Ｉ）：
【化１２】
（式中、Ｒ1は水素結合性置換基であり、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、ｎは１〜１０の整数である。）で表される８−置換グアノシン誘導体。
［２］Ｒ1は、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｒ）ＮＨ2（Ｒは酸素原子またはイミノ基を表す。）、−ＣＯＯＲ’（Ｒ’は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2、−ＣＳＮＨ2、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＮＨ−ＣＯＣＦ3、−ＯＣＯＣＨ3及び−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3からなる群から選ばれるものである、［１］記載の８−置換グアノシン誘導体。
［３］下記式（ａ）：
【化１３】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基である。）；
下記式（ｂ）：
【化１４】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ3は酸素原子またはイミノ基である。）；
下記式（ｃ）：
【化１５】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ4は−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＣＯＯＲ”（Ｒ”は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2または−ＣＳＮＨ2である。）；あるいは
下記式（ｄ）：
【化１６】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ5は−ＯＣＯＣＨ3または−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3である。）
で表されるものである［１］記載の８−置換グアノシン誘導体。
［４］下記式（ＩＩ）：
【化１７】
（式中、Ｒ6は水素結合性置換基を含む有機基であり、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基であり、ｎは１〜１０の整数である。）で表される８−置換グアノシン誘導体。
［５］Ｒ1は、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｒ）ＮＨ2（Ｒは酸素原子またはイミノ基を表す。）、−ＣＯＯＲ’（Ｒ’は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2、−ＣＳＮＨ2、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＮＨ−ＣＯＣＦ3、−ＯＣＯＣＨ3及び−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3からなる群から選ばれるものである、［４］記載の８−置換グアノシン誘導体。
［６］下記式（ｅ）：
【化１８】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基である。）；
下記式（ｆ）：
【化１９】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ3は酸素原子またはイミノ基であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基である。）；
下記式（ｇ）：
【化２０】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ4は−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＣＯＯＲ”（Ｒ”は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2または−ＣＳＮＨ2であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基である。）；あるいは
下記式（ｈ）：
【化２１】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ5は−ＯＣＯＣＨ3または−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基である。）
で表されるものである、［４］記載の８−置換グアノシン誘導体。
［７］下記式（ＩＩＩ）：
【化２２】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ6は水素結合性置換基を含む有機基であり、ｍは０〜９である。）で表される化合物を、糖部分の水酸基を無保護条件下、接触水添させる工程を含む、［１］から［６］までの何れか記載の８−置換グアノシン誘導体の製造方法。
［８］水素結合性置換基を８位に有するグアニン誘導体を含むオリゴヌクレオチド。
［９］［４］から［６］までの何れかに記載の８−置換グアノシン誘導体を用いることを含む、［８］記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、種々の水素結合性置換基を８位に有するグアノシン誘導体を提供することができる。また、本発明によれば、種々の水素結合性置換基を８位に有するグアニン誘導体を含むオリゴヌクレオチドを提供することができる。
本発明の水素結合性の置換基を有するグアノシン誘導体をグアニンカルテット等の様々な配列に導入することにより、それらの構造の安定化が期待でき、より結合能及び触媒能の高いアプタマー、デオキシリボザイム、及びリボザイム等を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の８−置換グアノシン誘導体及びオリゴヌクレオチド、ならびにそれらの製造方法を詳細に説明する。
【００１２】
Ａ．８−置換グアノシン誘導体
本発明の８−置換グアノシン誘導体は、下記式（Ｉ）：
【化２３】
で表される。
【００１３】
式（Ｉ）で表されるとおり、本発明の８−置換グアノシン誘導体は、グアニンの８位に水素結合性置換基を有している。グアニンの８位は、ＤＮＡの二重鎖形成に直接関与していない。このため、この位置に、フレキシブルなアルキル直鎖を介して、水素結合性置換基を導入することにより、本発明の８−置換グアノシン誘導体をオリゴヌクレオチドに導入した際、ＤＮＡメジャーグループに水素結合性置換基を出すことが可能である。
【００１４】
式（Ｉ）において、Ｒ1は、水素結合性置換基である。水素結合性置換基は、分子間または分子内において水素結合を形成しうる置換基であれば特に限定されない。水素結合性置換基は、好ましくは、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｒ）ＮＨ2（Ｒは酸素原子またはイミノ基を表す。）、−ＣＯＯＲ’（Ｒ’は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2、−ＣＳＮＨ2、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＮＨ−ＣＯＣＦ3、−ＯＣＯＣＨ3及び−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3かからなる群から選ばれる。なお、本明細書において、低級アルキル基は、炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖のアルキル基を意味する。低級アルキル基としては、例えば、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。
【００１５】
Ｒ2は水素原子または水酸基である。Ｒ2が水素原子である場合、糖部分はβ−Ｄ−２’−デオキシリボースであり、Ｒ2が水酸基である場合、糖部分はβ−Ｄ−リボースである。すなわち、本発明の８−置換グアノシン誘導体は、２’−デオキシグアノシン誘導体及びグアノシン誘導体の双方を含む。
【００１６】
ｎは１〜１０の整数である。好ましくは、ｎは１〜６、より好ましくは、ｎは１〜４、さらに好ましくは、ｎは１または２である。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様として、例えば、下記式（ａ）〜（ｄ）で表される化合物が挙げられる。
【化２４】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基である。）；
【化２５】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ3は酸素原子またはイミノ基である。）；
【化２６】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ4は−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＣＯＯＲ”（Ｒ"は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2または−ＣＳＮＨ2である。）；
【化２７】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ5は−ＯＣＯＣＨ3または−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3である。）
【００１８】
なお、上記は一例であり、これらの化合物を中間生成物として、常法に従い、他の水素結合性置換基を有する化合物を誘導することもできる。本発明の式（Ｉ）で表される８−置換グアノシン誘導体には、そのようにして得られる化合物も含まれる。
【００１９】
式（Ｉ）で表される８−置換グアノシン誘導体は、それ自体、抗癌剤、抗ウィルス剤、抗ＨＩＶ等の核酸系医薬品として有用であるが、水素結合性置換基を有する８−置換グアノシン誘導体をオリゴヌクレオチドに導入する際には、式（Ｉ）で表される８−置換グアノシン誘導体の糖部分の水酸基、及び、グアニン部分のアミノ基などの反応性置換基を適切に保護することが望ましい。本発明の８−置換グアノシン誘導体は、そのような反応性置換基を保護基で保護した化合物、すなわち、下記式（ＩＩ）：
【化２８】
で表される化合物をも含む。以下、式（ＩＩ）で表される化合物について説明する。
【００２０】
式（ＩＩ）において、Ｒ6は水素結合性置換基を含む有機基である。ここで、水素結合性置換基を含む有機基は、水素結合性置換基を含む一価の有機基であれば特に限定されない。例えば、水素結合性置換基それ自体または水素結合性置換基が保護基で保護された有機基などが含まれる。具体的には、アミノ基などの水素結合性置換基がトリフルオロアセトアミド基などの保護基によって保護された有機基などが挙げられる。なお、水素結合性置換基は、式（Ｉ）で説明したものと同じであるので、ここでは説明を繰り返さない。
Ｒ2は水素原子または水酸基であり、ｎは１〜１０の整数である。ｎの好ましい範囲は、式（Ｉ）において記載した範囲と同じ範囲である。
【００２１】
式（ＩＩ）で表される８−置換グアノシン誘導体を用いることにより、水素結合性置換基を８位に有するグアニン誘導体を含むオリゴヌクレオチドの簡便な方法で製造することができる。式（ＩＩ）で表される８−置換グアノシン誘導体は、前記式（Ｉ）で表される８−置換グアノシン誘導体から容易に製造することができる。詳しくは、実施例の項において説明する。
【００２２】
本発明の好ましい実施態様として、例えば、下記式（ｅ）〜（ｈ）で表される化合物が挙げられる。
【化２９】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基である。）；
【化３０】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ3は酸素原子またはイミノ基である。）；
【化３１】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ4は−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＣＯＯＲ"（Ｒ"は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2または−ＣＳＮＨ2であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基である。）；または
【化３２】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ5は−ＯＣＯＣＨ3または−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3である。）
【００２３】
なお、上記は一例である。これらの化合物を中間生成物として、常法に従い、他の水素結合性置換基を有する化合物を誘導することもできる。本発明の式（ＩＩ）で表される８−置換グアノシン誘導体には、そのようにして得られる化合物も含まれる。
【００２４】
次に、本発明の８−置換グアノシン誘導体の製造方法について述べる。本発明の８−置換グアノシン誘導体は、いずれも、天然の２’−デオキシグアノシンまたはグアノシンを出発物質とする簡便な方法で製造することができる。
【００２５】
本発明の方法は、糖部分の水酸基を保護しない状態でグアノシンに導入した置換アルキレン基を接触水添する工程を含むものであり、この方法によれば、所望の化合物を高収率かつ短時間で合成することができる。すなわち、本発明の８−置換グアノシン誘導体の製造方法は、下記式（ＩＩＩ）：
【化３３】
で表される化合物を、糖部分の水酸基を無保護条件下、接触水添させる工程を含むことを特徴とする。
【００２６】
式（ＩＩＩ）において、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ6は水素結合性置換基を含む有機基である。なお、水素結合性置換基を含む有機基は、式（ＩＩ）において説明したものと同じであり、好ましい例示も前記のとおりである。ｍは０〜９の整数であり、好ましくは、ｍは０〜５、より好ましくは、ｍは０〜３、さらに好ましくは、ｍは０または１である。
【００２７】
式（ＩＩＩ）で表される化合物は、例えば、天然の２’−デオキシグアノシンまたはグアノシンを出発物質として、常法に従って合成することができる。例えば、２’−デオキシグアノシンまたはグアノシンにおけるグアニンの８位を１）ブロモ化し、２）適切なアセチレン誘導体を、Ｐｄ触媒を用いてカップリング反応することによって合成することができる。詳しくは、実施例におけるスキーム１〜４を参照することができる。
【００２８】
本発明の方法によれば、式（ＩＩＩ）で表される化合物を接触水添することによって、下記式（ＩＶ）：
【化３４】
（式中のＲ2、Ｒ6は前記のとおりであり、ｎは１〜１０である。）で表される化合物を得ることができる。なお、好ましくは、ｎは１〜６、より好ましくは、ｎは１〜４、さらに好ましくは、ｎは１または２である。
【００２９】
上記反応はパラジウム触媒の存在下で行うことが好ましい。例えば、活性炭などの炭素に担持されたパラジウム、いわゆるパラジウムカーボン（Ｐｄ／Ｃ）として市販されているものを用いることができる。反応温度は、例えば、６０℃〜０℃、好ましくは４０℃〜１０℃である。パラジウム触媒の使用量は、式（ＩＩＩ）で表される化合物に対し、好ましくは１００モル％〜１モル％である。
また、反応は酸化白金触媒の存在下で行うこともできる。この場合、反応温度は、例えば、１００℃〜４℃、好ましくは６０℃〜１０℃である。酸化白金触媒の使用量は、式（ＩＩＩ）で表される化合物に対し、好ましくは１００モル％〜１モル％である。
反応溶媒は、式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）で表される化合物、ならびに使用する触媒等に対して不活性なものであれば特に限定されない。例えば、パラジウム触媒を用いる場合には、メタノールなどのアルコール系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルムなどを好ましく使用できる。酸化白金触媒を使用する場合には、酢酸などを使用できる。
なお、本反応に用いられる触媒の種類及びその使用量、反応温度、ならびに反応溶媒は、出発物質等の様々な条件に依存して、適宜、決定することができる。
反応中は、いずれの触媒を用いた場合にも、反応溶液を激しく攪拌することが好ましい。
【００３０】
本発明の方法によれば、糖部分の水酸基を保護基で保護して反応を行った場合に比べて、短時間で効率よく目的の化合物、すなわち、式（ＩＶ）で表される化合物を得ることができる。
【００３１】
式（ＩＶ）で表される化合物は、常法に従って、糖部分の水酸基、及び、グアニン部分のアミノ基を適切な保護基で保護することによって、下記式（ＩＩ）：
【化３５】
（式中のＲ2、Ｒ6、ｎおよびＤＭＴｒＯは、前記のとおりである。）で表される化合物を得ることができる。具体的には、実施例に示したスキーム１〜４を参照することができる。
【００３２】
Ｂ．水素結合性置換基を８位に有するグアニン誘導体を含むオリゴヌクレオチド
次に、本発明のオリゴヌクレオチドについて説明する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、水素結合性置換基を８位に有するグアニン誘導体を含むことを特徴としている。この水素結合性置換基の導入位置は、ＤＮＡの二重鎖形成に直接関与していない。このため、フレキシブルなアルキル直鎖を介して水素結合性置換基を導入することにより、該水素結合性置換基は、分子内または分子間の他の水素結合性置換基と相互作用することができる。このような本発明のオリゴヌクレオチドをグアニンカルテット等の様々な配列に導入することによって、それらの構造の安定化が期待でき、より結合能及び触媒能の高いアプタマー、デオキシリボザイム又はリボザイム等を得ることができる。
【００３３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、前記式（ＩＩ）で表される８−置換グアノシン誘導体、好ましくは前記式（ｅ）〜（ｈ）で表される８−置換グアノシン誘導体を用いることによって製造することができる。例えば、市販のＤＮＡ合成機を使用したＤＮＡオリゴマーの固相合成法を用いることができる（固相合成法については、例えば、文献 F.C. Richardson et al., Nucleic Acid Research 20 (1992) 1763-1768 を参照することができる）。操作手順等は、それぞれのＤＮＡ合成機に添付されているプロトコールに従って行うことができる。
【００３４】
以下、本発明の８−置換グアノシン誘導体及びオリゴヌクレオチドについて、実施例を用いてより具体的に説明する。なお、実施例は一例であり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００３５】
実施例１
２’−デオキシグアノシンを出発物質として用い、下記のスキーム１に従って、本発明の８−置換グアノシン誘導体（化合物（４）及び（７））ならびにオリゴヌクレオチドを製造した。
【化３６】
【００３６】
１）化合物（２）の製造
２’−デオキシグアノシン（１）（５．６８１ｇ， ０．０２１ｍｏｌ）を蒸留水４００ｍｌに懸濁させ、Ｎ−ブロモコハク酸イミド（４．１７ｇ，０．０２３ｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で３０分撹拌し、析出した固体を吸引濾過により集め、蒸留水、アセトンで洗浄し、淡紫色の固体（５．５７ｍｇ，７６％）として得た。
得られた化合物（２）のスペクトルデータは以下のとおりである。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ，４００ＭＨｚ） δ ２．１０（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ＝３．０Ｈｚ，６．６Ｈｚ，１３．２Ｈｚ），δ ３．１６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ＝６．４Ｈｚ，７．８Ｈｚ，１３．６Ｈｚ），δ ３．５０（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５’，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１２Ｈｚ），δ ３．６２（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５’，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１１．２Ｈｚ），δ ３．８０（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’，Ｊ＝３．２Ｈｚ，５．６Ｈｚ，１１．２Ｈｚ），δ ４．４０（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−４’，Ｊ＝３．２Ｈｚ，６．８Ｈｚ，１３．２Ｈｚ），δ ６．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝６．９Ｈｚ，７．７Ｈｚ），δ １０．８１（ｓ，１Ｈ，Ｈ−９）
【００３７】
２）化合物（３）の製造
前記工程１）で得られた化合物（２）（３００ｍｇ，０．８６７ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３０ｍｌに溶解し、アルゴン雰囲気下、Ｎ−プロパギルトリフルオロアセトアミド（３９０ｍｇ，２．５８１ｍｍｏｌ）を加えた。更に、この溶液にヨウ化銅（Ｉ）（３３ｍｇ，０．１７３ｍｍｏｌ
）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（９９ｍｇ，０．０８６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１４８μｌ，１．４６３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を５５℃で２時間撹拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶質溶媒 クロロホルム／メタノール＝７／１）により精製して目的の化合物（３）を茶色の固体（３３１ｍｇ，９２％）として得た。
得られた化合物（３）のスペクトルデータは以下のとおりである。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ，４００ＭＨｚ） δ ２．０９（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ＝２Ｈｚ，６．４Ｈｚ，１３．２Ｈｚ），δ ２．９１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ＝６Ｈｚ，８．４Ｈｚ，１４．６Ｈｚ），δ ３．５９（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５’，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１２．０Ｈｚ），δ ３．７０（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５’，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１２．０Ｈｚ），δ ３．８６（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），δ ４．２５（ｓ，２Ｈ，ＴＦＡＨＮ−ＣＨ2−），δ ４．４４ （ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），δ ６．２６（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝６．８Ｈｚ，８．０Ｈｚ）
【００３８】
３）化合物（４）の製造
前記工程２）で得られた化合物（３）（３００ｍｇ，０．７２１ｍｍｏｌ）を無水エタノール１５ｍｌに溶解した。この溶液にパラジウムカーボン（１０％）を５０ｍｇ加え、水素に置換した後、室温で２時間撹拌させ、ろ過によってパラジウムカーボンを除去し、再度、溶媒メタノール１５ｍｌに溶解し、パラジウムカーボン（１０％）を５０ｍｇ加え、水素に置換した後、室温で１４時間撹拌させた。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶質溶媒 クロロホルム／メタノール＝７／１）により精製し黄色のオイル状（２４５ｍｇ，８１％）として得た。
得られた化合物（４）のスペクトルデータは以下のとおりである。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ，４００ＭＨｚ） δ １．９２（ｑ，２Ｈ，−ＣＨ2−，Ｊ＝７．２Ｈｚ），δ ２．１２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ＝２．２Ｈｚ，６．２Ｈｚ，１３．２Ｈｚ），δ ２．７８（ｔ， ２Ｈ，−ＣＨ2−ＣＨ2−），δ ２．９９（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ＝６Ｈｚ，８．４Ｈｚ，１４．６Ｈｚ），δ ３．２８（ｔ，２Ｈ，ＴＦＡＮＨ−ＣＨ2−），δ ３．６５（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５’，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１２．０Ｈｚ），δ ３．７５（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５’，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１２．０Ｈｚ），δ ３．９２（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’，Ｊ＝３２．Ｈｚ，６．０Ｈｚ），δ ４．５４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），δ ６．１４（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝６．２Ｈｚ，８．６Ｈｚ）
【００３９】
４）化合物（５）の製造
前記工程３）で得られた化合物（４）（１７８ｍｇ，０．４２３ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１０ｍｌに溶解し、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドジエチルアセタール（１ｍｌ，５．８３５ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を５０℃で２時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶質溶媒 クロロホルム／メタノール＝７／１）により精製して目的の化合物（５）を薄黄色の固体（１９９ｍｇ，９９％）として得た。
得られた化合物（５）のスペクトルデータは以下のとおりである。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ，４００ＭＨｚ） δ １．９４（ｑ，２Ｈ，−ＣＨ2−，Ｊ＝７．２Ｈｚ），δ ２．１６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ＝２．８Ｈｚ，６．４Ｈｚ，１３．６Ｈｚ），δ ２８０（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ2−ＣＨ2−），δ ２．９７（ｓ，３Ｈ，Ｎ（ＣＨ3）），δ ３．１４（ｍ，４Ｈ，Ｎ（ＣＨ3），Ｈ−２’），δ ３．２７（ｔ，２Ｈ，ＴＦＡＮＨ−ＣＨ2−），δ ３．６２（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５’，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１２．０Ｈｚ），δ ３．７２（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５’，Ｊ＝３．４Ｈｚ，１２．２Ｈｚ），δ ３．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’，Ｊ＝３．６Ｈｚ，６．８Ｈｚ），δ ４．５４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），δ ６．３８（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝６．４Ｈｚ，８．０Ｈｚ），δ ８．３８（ｓ，１Ｈ，Ｎ＝ＣＨ−Ｎ）
【００４０】
５）化合物（６）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程４）で得られた化合物（５）（１４０ｍｇ， ０．２９４ｍｍｏｌ）を無水ピリジン１０ｍｌに溶解し、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１２０ｍｇ，０．３５４ｍｍｏｌ），Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（７．２ｍｇ，０．０５９ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で１時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝８９／１０／１）により精製して目的の化合物（６）を淡黄色の固体（２２０ｍｇ， ９６％）として得た。
得られた化合物（６）のスペクトルデータは以下のとおりである。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ，４００ＭＨｚ） δ １．８５（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ2−），δ ２．１２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ＝２Ｈｚ，６Ｈｚ，８．０Ｈｚ，１３．６Ｈｚ），δ ２．７７（ｍ，９Ｈ，−ＣＨ2−ＣＨ2−，Ｎ（ＣＨ3，Ｈ−２’），δ ３．２２（ｍ，３Ｈ，Ｈ−５’，ＴＦＡＮＨ−ＣＨ2−），δ ３．４９（ｄ，６Ｈ，−Ｏ−ＣＨ3，Ｊ＝２．８Ｈｚ），δ ３．８２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），δ ４．５８（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），δ ６．０６（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝５．２Ｈｚ，７．６Ｈｚ），δ ６．４０−７．０９（ｍ，１３Ｈ，Ａｒ−Ｈ），δ ８．１４（ｓ，１Ｈ，Ｎ＝ＣＨ−Ｎ）
【００４１】
６）化合物（７）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程５）で得られた化合物（６）（４６ｍｇ， ０．０５９ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン４６０μｌに溶解し、１Ｈ−テトラゾール無水アセトニトリル溶液（０．４５Ｍ，１９６μｌ，０．０８８ｍｍｏｌ）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（２８μｌ，０．０８９ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で２時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応液を分液漏斗に移し、飽和重曹水、蒸留水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、反応溶媒を減圧留去した。残渣を無水アセトニトリル１ｍｌに溶解し、コスモナイスフィルターＳ（溶媒系、ナカライテスク株式会社製）でろ過した。ろ液を減圧留去し、目的の化合物（７）を粗生成物として得た。ＤＮＡ合成には化合物（７）の粗生成物をそのまま用いた。
【００４２】
７）化合物（７）からオリゴヌクレオチドを得る行程
前記工程６）で得られた化合物（７）を用いてＤＮＡ自動合成機（３４００ＤＮＡ／ＲＮＡ シンセサイザ、アプライドバイオシステムズ社）を用いて目的とする配列（５’−ＣＧＣＡＡＴＸＴＡＡＣＧＣ−３’ と５’−ＣＧＣＡＡＣＸＣＡＡＣＧＣ−３’）を合成した。合成終了後、固層担体から切り出された溶液をエッペンドルフチューブに移し替え、３７℃で１８時間加熱し、脱保護を行った。得られたオリゴヌクレオチド鎖を高速液体クロマトグラフィー（ＰＵ−２０８０−ｐｕｌｓ， ＪＡＳＣＯ）で精製した。精製後、凍結乾燥で溶媒を減圧留去することにより目的の配列（５’−ＣＧＣＡＡＴＸＴＡＡＣＧＣ−３’と５’−ＣＧＣＡＡＣＸＣＡＡＣＧＣ−３’）のオリゴヌクレオチド鎖を得た。また、目的物はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ Ｍａｓｓ（ＡＸＩＭＡ−ＬＮＲ，ＳＨＩＭＡＤＺＵ）を使って確認した。
５’−ＣＧＣＡＡＴＸＴＡＡＣＧＣ−３’［Ｍ＋Ｈ］＋：ｃａｃｄ．＝４１９９．９７４４，ｆｏｕｎｄ ＝４２００．１２
５’−ＣＧＣＡＡＣＸＣＡＡＣＧＣ−３’［Ｍ＋Ｈ］＋：ｃａｃｄ．＝４２２９．９９８０，ｆｏｕｎｄ ＝４２３０．２８
【００４３】
なお、上記は、２’−デオキシグアノシンを出発物質として用いた場合であるが、グアノシンを出発物質として用いた場合にも、同様の反応試薬及び反応条件を用いて、本発明の８−置換グアノシン誘導体ならびにオリゴヌクレオチドを製造することができる。また、化合物（４）を常法に従って脱保護することにより、上記式（Ｉ）で表される８−置換グアノシン誘導体に相当する化合物を中間生成物として得ることもできる。
【００４４】
次に、実施例１で示したもの以外の水素結合性置換基を有する８−置換グアノシン誘導体及びこれを用いたオリゴヌクレオチドの製造方法を実施例２〜４に示す。なお、実施例２〜４は、いずれも、２’−デオキシグアノシンの誘導体を出発物質として用いているが、グアノシン誘導体を出発物質とした場合も同様の反応試薬及び反応条件を用いて目的の化合物を製造することができる。
【００４５】
実施例２
前記式（ｂ）または（ｆ）で表される８−置換グアノシン誘導体（それぞれ、スキーム２の化合物（９）、化合物（１２）に相当する。）、及びそれを用いたオリゴヌクレオチドは、下記のスキーム２に従って製造することができる。
【化３７】
【００４６】
１）化合物（８）の製造
前記工程で得られた化合物（４）を過剰量の２８％アンモニア水に溶解させる。この溶液を室温で１日撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去する。これを分液漏斗に移し、クロロホルムで洗浄した後、水層を減圧留去して目的の化合物（８）を得ることができる。
【００４７】
２）化合物（９ａ）の製造
前記工程で得られる化合物（８）を蒸留水に溶解させ、シアン酸カリウムを加える。この溶液を５５℃で１日撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をＨＷ−４０Ｃにより精製して目的の化合物（９ａ）を得ることができる。
【００４８】
３）化合物（９ｂ）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程で得られた化合物（８）を蒸留水に溶解させ、炭酸カリウム、アミノイミノメタンスルホン酸を加える。この溶液を室温で１日撹拌し、逆層薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をＨＷ−４０Ｃにより精製して目的の化合物（９ｂ）を得ることができる。
【００４９】
４）化合物（１０）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程で得られた化合物（９）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジエチルアセタール１ｍｌを加える。この溶液を５５℃で３時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去する。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶質溶媒 クロロホルム／メタノール＝７／１）により精製して目的の化合物（１０）を得ることができる。
【００５０】
５）化合物（１１）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程で得られた化合物（１０）を無水ピリジンに溶解させ、４，４'−ジメトキシトリチルクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを加える。この溶液を室温で８時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去する。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶質溶媒 クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝８９／１０／１）により精製して目的の化合物（１１）を得ることができる。
【００５１】
６）化合物（１２）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程で得られた化合物（１１）を無水ジクロロメタンに溶解させ、１Ｈ−テトラゾール無水アセトニトリル溶液、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを加える。この溶液を室温で２時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、飽和重曹水および蒸留水で洗浄する。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、反応溶媒を減圧留去する。残渣を無水アセトニトリル１ｍｌに溶解し、コスモナイスフィルターＳ（溶媒系、ナカライテスク株式会社製）でろ過し、ろ液を減圧留去することで目的の化合物（１２）を粗生成物として得ることができる。ＤＮＡ合成には化合物（１２）の粗生成物をそのまま用いることができる。
【００５２】
なお、化合物（１２）からオリゴヌクレオチドを得る行程は、実施例１の化合物（７）からオリゴヌクレオチドを得る行程と同様にして行うことができる。実施例３及び４においても同様にして行うことができる。
【００５３】
実施例３
前記式（ｃ）または（ｇ）で表される８−置換グアノシン誘導体（それぞれ、スキーム３の化合物（１５）、化合物（１８）に相当する。）、及びそれを用いたオリゴヌクレオチドは、下記のスキーム３に従って製造することができる。
【化３８】
【００５４】
１）化合物（１３）の製造
８−ブロモ２’−デオキシグアノシン（２）をＤＭＦに溶解し、2-Propynenitrile、パラジウムテトラキストリフェニルホスフィン、ヨウ化銅、トリエチルアミンを加えて室温で一晩撹拌する。反応溶媒を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物（１３）を得ることができる。
【００５５】
２）化合物（１４ａ）の製造
前工程で得られる化合物（１３）を塩化水素ガスを飽和させたエタノールに溶解し０℃で２０時間撹拌する。その後反応溶液を濃縮し残渣にアンモニアガスを溶解させたエタノールを加えて、室温で２０時間撹拌する。反応溶媒を濃縮後、残渣を分取用ＴＬＣにより精製して化合物（１４ａ）を得ることができる。
【００５６】
３）化合物（１４ｂ）の製造
前工程で得られる化合物（１３）を塩化水素ガスを飽和させたエタノールに溶解し０℃で２時間撹拌する。反応溶液を濃縮し残渣に水を加え０℃で１時間撹拌する。その後反応溶液を濃縮し残渣を分取用逆相ＴＬＣにより精製して化合物（１４ｂ）を得ることができる。
【００５７】
４）化合物（１４ｃ）の製造
前工程で得られる化合物（１４ｂ）を封管中でメタノールに溶解し、液体アンモニアを加えて室温で１４時間撹拌する。反応溶液を濃縮し残渣を分取用逆相ＴＬＣにより精製して化合物（１４ｃ）を得ることができる。
【００５８】
５）化合物（１４ｄ）の製造
前工程で得られる化合物（１３）を無水ピリジンに溶解し、トリエチルアミンを加えて０℃で硫化水素ガスを飽和させる。その後栓をして、室温で１４時間撹拌する。反応溶媒を濃縮後、残渣を分取用ＴＬＣにより精製して化合物（１４ｄ）を得ることができる。
【００５９】
６）化合物（１５）の製造
前記工程２）〜５）で得られる化合物（１４ａ〜ｄ）を無水エタノールに溶解する。この溶液にパラジウムカーボン（１０％）を加え、水素に置換した後、室温で２時間撹拌させ、ろ過によってパラジウムカーボンを除去し、再度、溶媒メタノールに溶解し、パラジウムカーボン（１０％）を加え、水素に置換した後、室温で１４時間撹拌させる。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶質溶媒 クロロホルム／メタノール）により精製し化合物（１５）を得ることができる。
【００６０】
７）化合物（１６）の製造
前記工程６）で得られる化合物（１５）をアルゴン雰囲気下、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドジエチルアセタールを加える。この溶液を５０℃で２時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去する。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶質溶媒 クロロホルム／メタノール）により精製して目的の化合物（１６）を得ることができる。
【００６１】
８）化合物（１７）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程７）で得られる化合物（１６）を無水ピリジンに溶解し、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを加える。この溶液を室温で１時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去する。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン）により精製して目的の化合物（１７）を得ることができる。
【００６２】
９）化合物（１８）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程８）で得られる化合物（１７）を無水ジクロロメタンに溶解し、１Ｈ−テトラゾール無水アセトニトリル溶液（０．４５Ｍ）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを加える。この溶液を室温で２時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応液を分液漏斗に移し、飽和重曹水、蒸留水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、反応溶媒を減圧留去する。残渣を無水アセトニトリル１ｍｌに溶解し、コスモナイスフィルターＳ（溶媒系、ナカライテスク株式会社製）でろ過する。ろ液を減圧留去し、目的の化合物（１８）を粗生成物として得ることができる。ＤＮＡ合成には化合物（１８）の粗生成物をそのまま用いることができる。
【００６３】
実施例４
前記式（ｄ）または（ｈ）で表される８−置換グアノシン誘導体（それぞれ、スキーム４の化合物（２０）、化合物（２３）に相当する。）、及びそれを用いたオリゴヌクレオチドは、下記のスキーム４に従って製造することができる。
【化３９】
【００６４】
１）化合物（１９）の製造
８−ブロモ２’−デオキシグアノシン（２）をＤＭＦに溶解し、パラジウムテトラキストリフェニルホスフィン、ヨウ化銅、トリエチルアミン、プロパルギルアセテート（１９ａ）またはtert-butyl propargyl disulfide（１９ｂ）を加えて室温で一晩撹拌する。反応溶媒を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物（１３）を得ることができる。
【００６５】
２）化合物（２０）の製造
前記工程１）で得られる化合物（１９aまたは１９b）を無水エタノールに溶解する。この溶液にパラジウムカーボン（１０％）を加え、水素に置換した後、室温で２時間撹拌させ、ろ過によってパラジウムカーボンを除去し、再度、溶媒メタノールに溶解し、パラジウムカーボン（１０％）を加え、水素に置換した後、室温で１４時間撹拌する。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶質溶媒 クロロホルム／メタノール）により精製し化合物（２０）を得ることができる。
【００６６】
３）化合物（２１）の製造
前記工程２）で得られる化合物（２０）をアルゴン雰囲気下、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドジエチルアセタールを加える。この溶液を５０℃で２時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去する。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶質溶媒 クロロホルム／メタノール）により精製して目的の化合物（２１）を得ることができる。
【００６７】
４）化合物（２２）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程３）で得られる化合物（２１）を無水ピリジンに溶解し、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを加える。この溶液を室温で１時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去する。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン）により精製して目的の化合物（２２）を得ることができる。
【００６８】
５）化合物（２３）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程４）で得られる化合物（２２）を無水ジクロロメタンに溶解し、１Ｈ−テトラゾール無水アセトニトリル溶液（０．４５Ｍ）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを加える。この溶液を室温で２時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応液を分液漏斗に移し、飽和重曹水、蒸留水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、反応溶媒を減圧留去する。残渣を無水アセトニトリル１ｍｌに溶解し、コスモナイスフィルターＳ（溶媒系、ナカライテスク株式会社製）でろ過する。ろ液を減圧留去し、目的の化合物（２３）を粗生成物として得ることができる。ＤＮＡ合成には化合物（２３）の粗生成物をそのまま用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の８−置換グアノシン誘導体及びオリゴヌクレオチドは、抗癌剤、抗ウィルス剤、抗ＨＩＶ等の核酸系医薬品として、また、遺伝子関連産業の試薬またはツールとして広範囲に利用できる可能性がある。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グアニンの８位に水素結合性置換基を有する８―置換グアノシン誘導体及びそれを含むオリゴヌクレオチド、ならびにそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＰＣＲ法を用いた核酸の利用法として、In vitro selection法が注目されている。In vitro selection法では、まず、多数のランダム配列領域を持つ多数の一本鎖核酸ライブラリーを、様々なセレクション系により特定機能で選び出す。続いて、選び出された核酸をＰＣＲによって増幅した後、同様のセレクションを行う。このサイクルを繰り返すことで、特定機能を持つ配列に収束させることが可能となる。In vitro selection法は、もともと、ある特定の物質に対して特異的に結合する核酸分子種を選び出す手法として開発されたため、Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment (SELEX)とも呼ばれる。この手法で得られた結合能を有する核酸はアプタマーと呼ばれ、酵素のような触媒能を持ったＤＮＡ、ＲＮＡはそれぞれデオキシリボザイム、リボザイムと呼ばれる。
【０００３】
アプタマーは、特定の二次構造を持つ場合が多い。それらは、ヘアピン（hairpin）、バルジ（bulge）、シュードノット（pseudoknot）、グアニンカルテット（G-quartet）等の構造に分類される。アプタマーは、そのような二次構造をとることで、標的分子を特異的に認識して結合すると考えられており、デオキシリボザイムまたはリボザイムにおいても二次構造が重要な役割を担っていると考えられる。
しかしながら、天然のＤＮＡアプタマー、デオキシリボザイムまたはリボザイムは、抗体または酵素に比べ、その結合能及び触媒能は極めて小さい。その理由は、以下の二つが考えられる。
１）抗体または酵素などの蛋白質は２０種のアミノ酸から構成されるのに対し、ＤＮＡは４種類のヌクレオシドしかない。
２）蛋白質はイミダゾールまたはアミノ基などの活性中心に多く存在する官能基を持つのに対して、核酸にはそのようなものがない。
このため、In vitro selection法では、結合能及び触媒能を高めるための種々の機能性置換基を導入した修飾ＤＮＡの利用が有効になると考えられる。
【０００４】
上記のような修飾ＤＮＡの合成には、機能性置換基を導入した修飾ヌクレオシドが有用である。修飾ヌクレオシドは種々知られているが、グアニン誘導体は、他の核酸塩基の誘導体と比較して少なく、その構造は特定のものに限られている。例えば、特開２００４−２６２７９１号公報（特許文献１）では、グアニンの８位にメチル基を有する８−置換グアノシン誘導体が記載されている。しかしながら、該公報に記載の方法では、グアニンの８位に機能性置換基を導入することはできない。
【特許文献１】特開２００４−２６２７９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような状況下、機能性置換基を導入した修飾ヌクレオシド、特に機能性置換基を導入した８−置換グアノシン誘導体の提供が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、グアニンカルテットなどの様々な二次構造の中でも特に重要な役割を果たしているグアニンに着目し、種々の水素結合性置換基を導入した修飾ヌクレオシドをデザインし、その合成を試みた。なお、水素結合性置換基の導入位置としては、ＤＮＡの二重鎖形成に直接関与しておらず、フレキシブルなアルキル直鎖を介してＤＮＡメジャーグループに置換基を出すことができるようにグアニンの８位とした。
【０００７】
その結果、グアノシンまたは２’−デオキシグアノシンを出発物質として、一連の１）ブロモ化、２）Ｐｄ触媒を用いたカップリング反応、３）糖部分の水酸基無保護条件下での接触水添、により、種々の水素結合性置換基をグアニンの８位に導入することに成功した。
【０００８】
なお、本発明者らは、水素結合性置換基を有する８−置換アデノシン誘導体の合成方法を既に確立している（Y. Saito et al., Tetrahedron Letters 46 (2005) 7605-7608）。この文献に示されるとおり、アデノシン誘導体は、糖部分の水酸基を保護しない状態で反応を十分に進行させることができる。しかしながら、グアノシン誘導体は、アデノシン誘導体と比較して溶解性が非常に低いため、糖部分の水酸基を保護して反応を行うと考えるのが一般的である。本発明はこのような従来の技術常識に反して、糖部分の水酸基を無保護条件下で反応を進行させることにより、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下に示す８−置換グアノシン誘導体及びオリゴヌクレオチド、ならびにそれらの製造方法に係るものである。
［１］下記式（Ｉ）：
【化１２】
（式中、Ｒ1は水素結合性置換基であり、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、ｎは１〜１０の整数である。）で表される８−置換グアノシン誘導体。
［２］Ｒ1は、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｒ）ＮＨ2（Ｒは酸素原子またはイミノ基を表す。）、−ＣＯＯＲ’（Ｒ’は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2、−ＣＳＮＨ2、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＮＨ−ＣＯＣＦ3、−ＯＣＯＣＨ3及び−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3からなる群から選ばれるものである、［１］記載の８−置換グアノシン誘導体。
［３］下記式（ａ）：
【化１３】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基である。）；
下記式（ｂ）：
【化１４】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ3は酸素原子またはイミノ基である。）；
下記式（ｃ）：
【化１５】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ4は−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＣＯＯＲ”（Ｒ”は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2または−ＣＳＮＨ2である。）；あるいは
下記式（ｄ）：
【化１６】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ5は−ＯＣＯＣＨ3または−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3である。）
で表されるものである［１］記載の８−置換グアノシン誘導体。
［４］下記式（ＩＩ）：
【化１７】
（式中、Ｒ6は水素結合性置換基を含む有機基であり、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基であり、ｎは１〜１０の整数である。）で表される８−置換グアノシン誘導体。
［５］Ｒ1は、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｒ）ＮＨ2（Ｒは酸素原子またはイミノ基を表す。）、−ＣＯＯＲ’（Ｒ’は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2、−ＣＳＮＨ2、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＮＨ−ＣＯＣＦ3、−ＯＣＯＣＨ3及び−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3からなる群から選ばれるものである、［４］記載の８−置換グアノシン誘導体。
［６］下記式（ｅ）：
【化１８】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基である。）；
下記式（ｆ）：
【化１９】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ3は酸素原子またはイミノ基であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基である。）；
下記式（ｇ）：
【化２０】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ4は−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＣＯＯＲ”（Ｒ”は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2または−ＣＳＮＨ2であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基である。）；あるいは
下記式（ｈ）：
【化２１】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ5は−ＯＣＯＣＨ3または−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基である。）
で表されるものである、［４］記載の８−置換グアノシン誘導体。
［７］下記式（ＩＩＩ）：
【化２２】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ6は水素結合性置換基を含む有機基であり、ｍは０〜９である。）で表される化合物を、糖部分の水酸基を無保護条件下、接触水添させる工程を含む、［１］から［６］までの何れか記載の８−置換グアノシン誘導体の製造方法。
［８］水素結合性置換基を８位に有するグアニン誘導体を含むオリゴヌクレオチド。
［９］［４］から［６］までの何れかに記載の８−置換グアノシン誘導体を用いることを含む、［８］記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、種々の水素結合性置換基を８位に有するグアノシン誘導体を提供することができる。また、本発明によれば、種々の水素結合性置換基を８位に有するグアニン誘導体を含むオリゴヌクレオチドを提供することができる。
本発明の水素結合性の置換基を有するグアノシン誘導体をグアニンカルテット等の様々な配列に導入することにより、それらの構造の安定化が期待でき、より結合能及び触媒能の高いアプタマー、デオキシリボザイム、及びリボザイム等を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の８−置換グアノシン誘導体及びオリゴヌクレオチド、ならびにそれらの製造方法を詳細に説明する。
【００１２】
Ａ．８−置換グアノシン誘導体
本発明の８−置換グアノシン誘導体は、下記式（Ｉ）：
【化２３】
で表される。
【００１３】
式（Ｉ）で表されるとおり、本発明の８−置換グアノシン誘導体は、グアニンの８位に水素結合性置換基を有している。グアニンの８位は、ＤＮＡの二重鎖形成に直接関与していない。このため、この位置に、フレキシブルなアルキル直鎖を介して、水素結合性置換基を導入することにより、本発明の８−置換グアノシン誘導体をオリゴヌクレオチドに導入した際、ＤＮＡメジャーグループに水素結合性置換基を出すことが可能である。
【００１４】
式（Ｉ）において、Ｒ1は、水素結合性置換基である。水素結合性置換基は、分子間または分子内において水素結合を形成しうる置換基であれば特に限定されない。水素結合性置換基は、好ましくは、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｒ）ＮＨ2（Ｒは酸素原子またはイミノ基を表す。）、−ＣＯＯＲ’（Ｒ’は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2、−ＣＳＮＨ2、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＮＨ−ＣＯＣＦ3、−ＯＣＯＣＨ3及び−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3かからなる群から選ばれる。なお、本明細書において、低級アルキル基は、炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖のアルキル基を意味する。低級アルキル基としては、例えば、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。
【００１５】
Ｒ2は水素原子または水酸基である。Ｒ2が水素原子である場合、糖部分はβ−Ｄ−２’−デオキシリボースであり、Ｒ2が水酸基である場合、糖部分はβ−Ｄ−リボースである。すなわち、本発明の８−置換グアノシン誘導体は、２’−デオキシグアノシン誘導体及びグアノシン誘導体の双方を含む。
【００１６】
ｎは１〜１０の整数である。好ましくは、ｎは１〜６、より好ましくは、ｎは１〜４、さらに好ましくは、ｎは１または２である。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様として、例えば、下記式（ａ）〜（ｄ）で表される化合物が挙げられる。
【化２４】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基である。）；
【化２５】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ3は酸素原子またはイミノ基である。）；
【化２６】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ4は−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＣＯＯＲ”（Ｒ"は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2または−ＣＳＮＨ2である。）；
【化２７】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ5は−ＯＣＯＣＨ3または−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3である。）
【００１８】
なお、上記は一例であり、これらの化合物を中間生成物として、常法に従い、他の水素結合性置換基を有する化合物を誘導することもできる。本発明の式（Ｉ）で表される８−置換グアノシン誘導体には、そのようにして得られる化合物も含まれる。
【００１９】
式（Ｉ）で表される８−置換グアノシン誘導体は、それ自体、抗癌剤、抗ウィルス剤、抗ＨＩＶ等の核酸系医薬品として有用であるが、水素結合性置換基を有する８−置換グアノシン誘導体をオリゴヌクレオチドに導入する際には、式（Ｉ）で表される８−置換グアノシン誘導体の糖部分の水酸基、及び、グアニン部分のアミノ基などの反応性置換基を適切に保護することが望ましい。本発明の８−置換グアノシン誘導体は、そのような反応性置換基を保護基で保護した化合物、すなわち、下記式（ＩＩ）：
【化２８】
で表される化合物をも含む。以下、式（ＩＩ）で表される化合物について説明する。
【００２０】
式（ＩＩ）において、Ｒ6は水素結合性置換基を含む有機基である。ここで、水素結合性置換基を含む有機基は、水素結合性置換基を含む一価の有機基であれば特に限定されない。例えば、水素結合性置換基それ自体または水素結合性置換基が保護基で保護された有機基などが含まれる。具体的には、アミノ基などの水素結合性置換基がトリフルオロアセトアミド基などの保護基によって保護された有機基などが挙げられる。なお、水素結合性置換基は、式（Ｉ）で説明したものと同じであるので、ここでは説明を繰り返さない。
Ｒ2は水素原子または水酸基であり、ｎは１〜１０の整数である。ｎの好ましい範囲は、式（Ｉ）において記載した範囲と同じ範囲である。
【００２１】
式（ＩＩ）で表される８−置換グアノシン誘導体を用いることにより、水素結合性置換基を８位に有するグアニン誘導体を含むオリゴヌクレオチドの簡便な方法で製造することができる。式（ＩＩ）で表される８−置換グアノシン誘導体は、前記式（Ｉ）で表される８−置換グアノシン誘導体から容易に製造することができる。詳しくは、実施例の項において説明する。
【００２２】
本発明の好ましい実施態様として、例えば、下記式（ｅ）〜（ｈ）で表される化合物が挙げられる。
【化２９】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基である。）；
【化３０】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ3は酸素原子またはイミノ基である。）；
【化３１】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ4は−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＣＯＯＲ"（Ｒ"は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2または−ＣＳＮＨ2であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基である。）；または
【化３２】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ5は−ＯＣＯＣＨ3または−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3である。）
【００２３】
なお、上記は一例である。これらの化合物を中間生成物として、常法に従い、他の水素結合性置換基を有する化合物を誘導することもできる。本発明の式（ＩＩ）で表される８−置換グアノシン誘導体には、そのようにして得られる化合物も含まれる。
【００２４】
次に、本発明の８−置換グアノシン誘導体の製造方法について述べる。本発明の８−置換グアノシン誘導体は、いずれも、天然の２’−デオキシグアノシンまたはグアノシンを出発物質とする簡便な方法で製造することができる。
【００２５】
本発明の方法は、糖部分の水酸基を保護しない状態でグアノシンに導入した置換アルキレン基を接触水添する工程を含むものであり、この方法によれば、所望の化合物を高収率かつ短時間で合成することができる。すなわち、本発明の８−置換グアノシン誘導体の製造方法は、下記式（ＩＩＩ）：
【化３３】
で表される化合物を、糖部分の水酸基を無保護条件下、接触水添させる工程を含むことを特徴とする。
【００２６】
式（ＩＩＩ）において、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ6は水素結合性置換基を含む有機基である。なお、水素結合性置換基を含む有機基は、式（ＩＩ）において説明したものと同じであり、好ましい例示も前記のとおりである。ｍは０〜９の整数であり、好ましくは、ｍは０〜５、より好ましくは、ｍは０〜３、さらに好ましくは、ｍは０または１である。
【００２７】
式（ＩＩＩ）で表される化合物は、例えば、天然の２’−デオキシグアノシンまたはグアノシンを出発物質として、常法に従って合成することができる。例えば、２’−デオキシグアノシンまたはグアノシンにおけるグアニンの８位を１）ブロモ化し、２）適切なアセチレン誘導体を、Ｐｄ触媒を用いてカップリング反応することによって合成することができる。詳しくは、実施例におけるスキーム１〜４を参照することができる。
【００２８】
本発明の方法によれば、式（ＩＩＩ）で表される化合物を接触水添することによって、下記式（ＩＶ）：
【化３４】
（式中のＲ2、Ｒ6は前記のとおりであり、ｎは１〜１０である。）で表される化合物を得ることができる。なお、好ましくは、ｎは１〜６、より好ましくは、ｎは１〜４、さらに好ましくは、ｎは１または２である。
【００２９】
上記反応はパラジウム触媒の存在下で行うことが好ましい。例えば、活性炭などの炭素に担持されたパラジウム、いわゆるパラジウムカーボン（Ｐｄ／Ｃ）として市販されているものを用いることができる。反応温度は、例えば、６０℃〜０℃、好ましくは４０℃〜１０℃である。パラジウム触媒の使用量は、式（ＩＩＩ）で表される化合物に対し、好ましくは１００モル％〜１モル％である。
また、反応は酸化白金触媒の存在下で行うこともできる。この場合、反応温度は、例えば、１００℃〜４℃、好ましくは６０℃〜１０℃である。酸化白金触媒の使用量は、式（ＩＩＩ）で表される化合物に対し、好ましくは１００モル％〜１モル％である。
反応溶媒は、式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）で表される化合物、ならびに使用する触媒等に対して不活性なものであれば特に限定されない。例えば、パラジウム触媒を用いる場合には、メタノールなどのアルコール系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルムなどを好ましく使用できる。酸化白金触媒を使用する場合には、酢酸などを使用できる。
なお、本反応に用いられる触媒の種類及びその使用量、反応温度、ならびに反応溶媒は、出発物質等の様々な条件に依存して、適宜、決定することができる。
反応中は、いずれの触媒を用いた場合にも、反応溶液を激しく攪拌することが好ましい。
【００３０】
本発明の方法によれば、糖部分の水酸基を保護基で保護して反応を行った場合に比べて、短時間で効率よく目的の化合物、すなわち、式（ＩＶ）で表される化合物を得ることができる。
【００３１】
式（ＩＶ）で表される化合物は、常法に従って、糖部分の水酸基、及び、グアニン部分のアミノ基を適切な保護基で保護することによって、下記式（ＩＩ）：
【化３５】
（式中のＲ2、Ｒ6、ｎおよびＤＭＴｒＯは、前記のとおりである。）で表される化合物を得ることができる。具体的には、実施例に示したスキーム１〜４を参照することができる。
【００３２】
Ｂ．水素結合性置換基を８位に有するグアニン誘導体を含むオリゴヌクレオチド
次に、本発明のオリゴヌクレオチドについて説明する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、水素結合性置換基を８位に有するグアニン誘導体を含むことを特徴としている。この水素結合性置換基の導入位置は、ＤＮＡの二重鎖形成に直接関与していない。このため、フレキシブルなアルキル直鎖を介して水素結合性置換基を導入することにより、該水素結合性置換基は、分子内または分子間の他の水素結合性置換基と相互作用することができる。このような本発明のオリゴヌクレオチドをグアニンカルテット等の様々な配列に導入することによって、それらの構造の安定化が期待でき、より結合能及び触媒能の高いアプタマー、デオキシリボザイム又はリボザイム等を得ることができる。
【００３３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、前記式（ＩＩ）で表される８−置換グアノシン誘導体、好ましくは前記式（ｅ）〜（ｈ）で表される８−置換グアノシン誘導体を用いることによって製造することができる。例えば、市販のＤＮＡ合成機を使用したＤＮＡオリゴマーの固相合成法を用いることができる（固相合成法については、例えば、文献 F.C. Richardson et al., Nucleic Acid Research 20 (1992) 1763-1768 を参照することができる）。操作手順等は、それぞれのＤＮＡ合成機に添付されているプロトコールに従って行うことができる。
【００３４】
以下、本発明の８−置換グアノシン誘導体及びオリゴヌクレオチドについて、実施例を用いてより具体的に説明する。なお、実施例は一例であり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００３５】
実施例１
２’−デオキシグアノシンを出発物質として用い、下記のスキーム１に従って、本発明の８−置換グアノシン誘導体（化合物（４）及び（７））ならびにオリゴヌクレオチドを製造した。
【化３６】
【００３６】
１）化合物（２）の製造
２’−デオキシグアノシン（１）（５．６８１ｇ， ０．０２１ｍｏｌ）を蒸留水４００ｍｌに懸濁させ、Ｎ−ブロモコハク酸イミド（４．１７ｇ，０．０２３ｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で３０分撹拌し、析出した固体を吸引濾過により集め、蒸留水、アセトンで洗浄し、淡紫色の固体（５．５７ｍｇ，７６％）として得た。
得られた化合物（２）のスペクトルデータは以下のとおりである。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ，４００ＭＨｚ） δ ２．１０（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ＝３．０Ｈｚ，６．６Ｈｚ，１３．２Ｈｚ），δ ３．１６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ＝６．４Ｈｚ，７．８Ｈｚ，１３．６Ｈｚ），δ ３．５０（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５’，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１２Ｈｚ），δ ３．６２（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５’，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１１．２Ｈｚ），δ ３．８０（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’，Ｊ＝３．２Ｈｚ，５．６Ｈｚ，１１．２Ｈｚ），δ ４．４０（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−４’，Ｊ＝３．２Ｈｚ，６．８Ｈｚ，１３．２Ｈｚ），δ ６．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝６．９Ｈｚ，７．７Ｈｚ），δ １０．８１（ｓ，１Ｈ，Ｈ−９）
【００３７】
２）化合物（３）の製造
前記工程１）で得られた化合物（２）（３００ｍｇ，０．８６７ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３０ｍｌに溶解し、アルゴン雰囲気下、Ｎ−プロパギルトリフルオロアセトアミド（３９０ｍｇ，２．５８１ｍｍｏｌ）を加えた。更に、この溶液にヨウ化銅（Ｉ）（３３ｍｇ，０．１７３ｍｍｏｌ
）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（９９ｍｇ，０．０８６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１４８μｌ，１．４６３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を５５℃で２時間撹拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶質溶媒 クロロホルム／メタノール＝７／１）により精製して目的の化合物（３）を茶色の固体（３３１ｍｇ，９２％）として得た。
得られた化合物（３）のスペクトルデータは以下のとおりである。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ，４００ＭＨｚ） δ ２．０９（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ＝２Ｈｚ，６．４Ｈｚ，１３．２Ｈｚ），δ ２．９１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ＝６Ｈｚ，８．４Ｈｚ，１４．６Ｈｚ），δ ３．５９（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５’，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１２．０Ｈｚ），δ ３．７０（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５’，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１２．０Ｈｚ），δ ３．８６（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），δ ４．２５（ｓ，２Ｈ，ＴＦＡＨＮ−ＣＨ2−），δ ４．４４ （ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），δ ６．２６（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝６．８Ｈｚ，８．０Ｈｚ）
【００３８】
３）化合物（４）の製造
前記工程２）で得られた化合物（３）（３００ｍｇ，０．７２１ｍｍｏｌ）を無水エタノール１５ｍｌに溶解した。この溶液にパラジウムカーボン（１０％）を５０ｍｇ加え、水素に置換した後、室温で２時間撹拌させ、ろ過によってパラジウムカーボンを除去し、再度、溶媒メタノール１５ｍｌに溶解し、パラジウムカーボン（１０％）を５０ｍｇ加え、水素に置換した後、室温で１４時間撹拌させた。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶質溶媒 クロロホルム／メタノール＝７／１）により精製し黄色のオイル状（２４５ｍｇ，８１％）として得た。
得られた化合物（４）のスペクトルデータは以下のとおりである。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ，４００ＭＨｚ） δ １．９２（ｑ，２Ｈ，−ＣＨ2−，Ｊ＝７．２Ｈｚ），δ ２．１２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ＝２．２Ｈｚ，６．２Ｈｚ，１３．２Ｈｚ），δ ２．７８（ｔ， ２Ｈ，−ＣＨ2−ＣＨ2−），δ ２．９９（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ＝６Ｈｚ，８．４Ｈｚ，１４．６Ｈｚ），δ ３．２８（ｔ，２Ｈ，ＴＦＡＮＨ−ＣＨ2−），δ ３．６５（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５’，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１２．０Ｈｚ），δ ３．７５（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５’，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１２．０Ｈｚ），δ ３．９２（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’，Ｊ＝３２．Ｈｚ，６．０Ｈｚ），δ ４．５４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），δ ６．１４（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝６．２Ｈｚ，８．６Ｈｚ）
【００３９】
４）化合物（５）の製造
前記工程３）で得られた化合物（４）（１７８ｍｇ，０．４２３ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１０ｍｌに溶解し、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドジエチルアセタール（１ｍｌ，５．８３５ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を５０℃で２時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶質溶媒 クロロホルム／メタノール＝７／１）により精製して目的の化合物（５）を薄黄色の固体（１９９ｍｇ，９９％）として得た。
得られた化合物（５）のスペクトルデータは以下のとおりである。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ，４００ＭＨｚ） δ １．９４（ｑ，２Ｈ，−ＣＨ2−，Ｊ＝７．２Ｈｚ），δ ２．１６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ＝２．８Ｈｚ，６．４Ｈｚ，１３．６Ｈｚ），δ ２８０（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ2−ＣＨ2−），δ ２．９７（ｓ，３Ｈ，Ｎ（ＣＨ3）），δ ３．１４（ｍ，４Ｈ，Ｎ（ＣＨ3），Ｈ−２’），δ ３．２７（ｔ，２Ｈ，ＴＦＡＮＨ−ＣＨ2−），δ ３．６２（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５’，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１２．０Ｈｚ），δ ３．７２（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５’，Ｊ＝３．４Ｈｚ，１２．２Ｈｚ），δ ３．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’，Ｊ＝３．６Ｈｚ，６．８Ｈｚ），δ ４．５４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），δ ６．３８（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝６．４Ｈｚ，８．０Ｈｚ），δ ８．３８（ｓ，１Ｈ，Ｎ＝ＣＨ−Ｎ）
【００４０】
５）化合物（６）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程４）で得られた化合物（５）（１４０ｍｇ， ０．２９４ｍｍｏｌ）を無水ピリジン１０ｍｌに溶解し、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１２０ｍｇ，０．３５４ｍｍｏｌ），Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（７．２ｍｇ，０．０５９ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で１時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝８９／１０／１）により精製して目的の化合物（６）を淡黄色の固体（２２０ｍｇ， ９６％）として得た。
得られた化合物（６）のスペクトルデータは以下のとおりである。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ，４００ＭＨｚ） δ １．８５（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ2−），δ ２．１２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｈ−２’，Ｊ＝２Ｈｚ，６Ｈｚ，８．０Ｈｚ，１３．６Ｈｚ），δ ２．７７（ｍ，９Ｈ，−ＣＨ2−ＣＨ2−，Ｎ（ＣＨ3，Ｈ−２’），δ ３．２２（ｍ，３Ｈ，Ｈ−５’，ＴＦＡＮＨ−ＣＨ2−），δ ３．４９（ｄ，６Ｈ，−Ｏ−ＣＨ3，Ｊ＝２．８Ｈｚ），δ ３．８２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），δ ４．５８（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），δ ６．０６（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１’，Ｊ＝５．２Ｈｚ，７．６Ｈｚ），δ ６．４０−７．０９（ｍ，１３Ｈ，Ａｒ−Ｈ），δ ８．１４（ｓ，１Ｈ，Ｎ＝ＣＨ−Ｎ）
【００４１】
６）化合物（７）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程５）で得られた化合物（６）（４６ｍｇ， ０．０５９ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン４６０μｌに溶解し、１Ｈ−テトラゾール無水アセトニトリル溶液（０．４５Ｍ，１９６μｌ，０．０８８ｍｍｏｌ）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（２８μｌ，０．０８９ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で２時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応液を分液漏斗に移し、飽和重曹水、蒸留水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、反応溶媒を減圧留去した。残渣を無水アセトニトリル１ｍｌに溶解し、コスモナイスフィルターＳ（溶媒系、ナカライテスク株式会社製）でろ過した。ろ液を減圧留去し、目的の化合物（７）を粗生成物として得た。ＤＮＡ合成には化合物（７）の粗生成物をそのまま用いた。
【００４２】
７）化合物（７）からオリゴヌクレオチドを得る行程
前記工程６）で得られた化合物（７）を用いてＤＮＡ自動合成機（３４００ＤＮＡ／ＲＮＡ シンセサイザ、アプライドバイオシステムズ社）を用いて目的とする配列（５’−ＣＧＣＡＡＴＸＴＡＡＣＧＣ−３’ と５’−ＣＧＣＡＡＣＸＣＡＡＣＧＣ−３’）を合成した。合成終了後、固層担体から切り出された溶液をエッペンドルフチューブに移し替え、３７℃で１８時間加熱し、脱保護を行った。得られたオリゴヌクレオチド鎖を高速液体クロマトグラフィー（ＰＵ−２０８０−ｐｕｌｓ， ＪＡＳＣＯ）で精製した。精製後、凍結乾燥で溶媒を減圧留去することにより目的の配列（５’−ＣＧＣＡＡＴＸＴＡＡＣＧＣ−３’と５’−ＣＧＣＡＡＣＸＣＡＡＣＧＣ−３’）のオリゴヌクレオチド鎖を得た。また、目的物はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ Ｍａｓｓ（ＡＸＩＭＡ−ＬＮＲ，ＳＨＩＭＡＤＺＵ）を使って確認した。
５’−ＣＧＣＡＡＴＸＴＡＡＣＧＣ−３’［Ｍ＋Ｈ］＋：ｃａｃｄ．＝４１９９．９７４４，ｆｏｕｎｄ ＝４２００．１２
５’−ＣＧＣＡＡＣＸＣＡＡＣＧＣ−３’［Ｍ＋Ｈ］＋：ｃａｃｄ．＝４２２９．９９８０，ｆｏｕｎｄ ＝４２３０．２８
【００４３】
なお、上記は、２’−デオキシグアノシンを出発物質として用いた場合であるが、グアノシンを出発物質として用いた場合にも、同様の反応試薬及び反応条件を用いて、本発明の８−置換グアノシン誘導体ならびにオリゴヌクレオチドを製造することができる。また、化合物（４）を常法に従って脱保護することにより、上記式（Ｉ）で表される８−置換グアノシン誘導体に相当する化合物を中間生成物として得ることもできる。
【００４４】
次に、実施例１で示したもの以外の水素結合性置換基を有する８−置換グアノシン誘導体及びこれを用いたオリゴヌクレオチドの製造方法を実施例２〜４に示す。なお、実施例２〜４は、いずれも、２’−デオキシグアノシンの誘導体を出発物質として用いているが、グアノシン誘導体を出発物質とした場合も同様の反応試薬及び反応条件を用いて目的の化合物を製造することができる。
【００４５】
実施例２
前記式（ｂ）または（ｆ）で表される８−置換グアノシン誘導体（それぞれ、スキーム２の化合物（９）、化合物（１２）に相当する。）、及びそれを用いたオリゴヌクレオチドは、下記のスキーム２に従って製造することができる。
【化３７】
【００４６】
１）化合物（８）の製造
前記工程で得られた化合物（４）を過剰量の２８％アンモニア水に溶解させる。この溶液を室温で１日撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去する。これを分液漏斗に移し、クロロホルムで洗浄した後、水層を減圧留去して目的の化合物（８）を得ることができる。
【００４７】
２）化合物（９ａ）の製造
前記工程で得られる化合物（８）を蒸留水に溶解させ、シアン酸カリウムを加える。この溶液を５５℃で１日撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をＨＷ−４０Ｃにより精製して目的の化合物（９ａ）を得ることができる。
【００４８】
３）化合物（９ｂ）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程で得られた化合物（８）を蒸留水に溶解させ、炭酸カリウム、アミノイミノメタンスルホン酸を加える。この溶液を室温で１日撹拌し、逆層薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をＨＷ−４０Ｃにより精製して目的の化合物（９ｂ）を得ることができる。
【００４９】
４）化合物（１０）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程で得られた化合物（９）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジエチルアセタール１ｍｌを加える。この溶液を５５℃で３時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去する。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶質溶媒 クロロホルム／メタノール＝７／１）により精製して目的の化合物（１０）を得ることができる。
【００５０】
５）化合物（１１）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程で得られた化合物（１０）を無水ピリジンに溶解させ、４，４'−ジメトキシトリチルクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを加える。この溶液を室温で８時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去する。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶質溶媒 クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝８９／１０／１）により精製して目的の化合物（１１）を得ることができる。
【００５１】
６）化合物（１２）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程で得られた化合物（１１）を無水ジクロロメタンに溶解させ、１Ｈ−テトラゾール無水アセトニトリル溶液、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを加える。この溶液を室温で２時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、飽和重曹水および蒸留水で洗浄する。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、反応溶媒を減圧留去する。残渣を無水アセトニトリル１ｍｌに溶解し、コスモナイスフィルターＳ（溶媒系、ナカライテスク株式会社製）でろ過し、ろ液を減圧留去することで目的の化合物（１２）を粗生成物として得ることができる。ＤＮＡ合成には化合物（１２）の粗生成物をそのまま用いることができる。
【００５２】
なお、化合物（１２）からオリゴヌクレオチドを得る行程は、実施例１の化合物（７）からオリゴヌクレオチドを得る行程と同様にして行うことができる。実施例３及び４においても同様にして行うことができる。
【００５３】
実施例３
前記式（ｃ）または（ｇ）で表される８−置換グアノシン誘導体（それぞれ、スキーム３の化合物（１５）、化合物（１８）に相当する。）、及びそれを用いたオリゴヌクレオチドは、下記のスキーム３に従って製造することができる。
【化３８】
【００５４】
１）化合物（１３）の製造
８−ブロモ２’−デオキシグアノシン（２）をＤＭＦに溶解し、2-Propynenitrile、パラジウムテトラキストリフェニルホスフィン、ヨウ化銅、トリエチルアミンを加えて室温で一晩撹拌する。反応溶媒を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物（１３）を得ることができる。
【００５５】
２）化合物（１４ａ）の製造
前工程で得られる化合物（１３）を塩化水素ガスを飽和させたエタノールに溶解し０℃で２０時間撹拌する。その後反応溶液を濃縮し残渣にアンモニアガスを溶解させたエタノールを加えて、室温で２０時間撹拌する。反応溶媒を濃縮後、残渣を分取用ＴＬＣにより精製して化合物（１４ａ）を得ることができる。
【００５６】
３）化合物（１４ｂ）の製造
前工程で得られる化合物（１３）を塩化水素ガスを飽和させたエタノールに溶解し０℃で２時間撹拌する。反応溶液を濃縮し残渣に水を加え０℃で１時間撹拌する。その後反応溶液を濃縮し残渣を分取用逆相ＴＬＣにより精製して化合物（１４ｂ）を得ることができる。
【００５７】
４）化合物（１４ｃ）の製造
前工程で得られる化合物（１４ｂ）を封管中でメタノールに溶解し、液体アンモニアを加えて室温で１４時間撹拌する。反応溶液を濃縮し残渣を分取用逆相ＴＬＣにより精製して化合物（１４ｃ）を得ることができる。
【００５８】
５）化合物（１４ｄ）の製造
前工程で得られる化合物（１３）を無水ピリジンに溶解し、トリエチルアミンを加えて０℃で硫化水素ガスを飽和させる。その後栓をして、室温で１４時間撹拌する。反応溶媒を濃縮後、残渣を分取用ＴＬＣにより精製して化合物（１４ｄ）を得ることができる。
【００５９】
６）化合物（１５）の製造
前記工程２）〜５）で得られる化合物（１４ａ〜ｄ）を無水エタノールに溶解する。この溶液にパラジウムカーボン（１０％）を加え、水素に置換した後、室温で２時間撹拌させ、ろ過によってパラジウムカーボンを除去し、再度、溶媒メタノールに溶解し、パラジウムカーボン（１０％）を加え、水素に置換した後、室温で１４時間撹拌させる。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶質溶媒 クロロホルム／メタノール）により精製し化合物（１５）を得ることができる。
【００６０】
７）化合物（１６）の製造
前記工程６）で得られる化合物（１５）をアルゴン雰囲気下、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドジエチルアセタールを加える。この溶液を５０℃で２時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去する。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶質溶媒 クロロホルム／メタノール）により精製して目的の化合物（１６）を得ることができる。
【００６１】
８）化合物（１７）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程７）で得られる化合物（１６）を無水ピリジンに溶解し、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを加える。この溶液を室温で１時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去する。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン）により精製して目的の化合物（１７）を得ることができる。
【００６２】
９）化合物（１８）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程８）で得られる化合物（１７）を無水ジクロロメタンに溶解し、１Ｈ−テトラゾール無水アセトニトリル溶液（０．４５Ｍ）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを加える。この溶液を室温で２時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応液を分液漏斗に移し、飽和重曹水、蒸留水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、反応溶媒を減圧留去する。残渣を無水アセトニトリル１ｍｌに溶解し、コスモナイスフィルターＳ（溶媒系、ナカライテスク株式会社製）でろ過する。ろ液を減圧留去し、目的の化合物（１８）を粗生成物として得ることができる。ＤＮＡ合成には化合物（１８）の粗生成物をそのまま用いることができる。
【００６３】
実施例４
前記式（ｄ）または（ｈ）で表される８−置換グアノシン誘導体（それぞれ、スキーム４の化合物（２０）、化合物（２３）に相当する。）、及びそれを用いたオリゴヌクレオチドは、下記のスキーム４に従って製造することができる。
【化３９】
【００６４】
１）化合物（１９）の製造
８−ブロモ２’−デオキシグアノシン（２）をＤＭＦに溶解し、パラジウムテトラキストリフェニルホスフィン、ヨウ化銅、トリエチルアミン、プロパルギルアセテート（１９ａ）またはtert-butyl propargyl disulfide（１９ｂ）を加えて室温で一晩撹拌する。反応溶媒を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物（１３）を得ることができる。
【００６５】
２）化合物（２０）の製造
前記工程１）で得られる化合物（１９aまたは１９b）を無水エタノールに溶解する。この溶液にパラジウムカーボン（１０％）を加え、水素に置換した後、室温で２時間撹拌させ、ろ過によってパラジウムカーボンを除去し、再度、溶媒メタノールに溶解し、パラジウムカーボン（１０％）を加え、水素に置換した後、室温で１４時間撹拌する。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶質溶媒 クロロホルム／メタノール）により精製し化合物（２０）を得ることができる。
【００６６】
３）化合物（２１）の製造
前記工程２）で得られる化合物（２０）をアルゴン雰囲気下、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドジエチルアセタールを加える。この溶液を５０℃で２時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去する。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶質溶媒 クロロホルム／メタノール）により精製して目的の化合物（２１）を得ることができる。
【００６７】
４）化合物（２２）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程３）で得られる化合物（２１）を無水ピリジンに溶解し、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを加える。この溶液を室温で１時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応溶媒を減圧留去する。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン）により精製して目的の化合物（２２）を得ることができる。
【００６８】
５）化合物（２３）の製造
アルゴン雰囲気下、前記工程４）で得られる化合物（２２）を無水ジクロロメタンに溶解し、１Ｈ−テトラゾール無水アセトニトリル溶液（０．４５Ｍ）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを加える。この溶液を室温で２時間撹拌し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、反応液を分液漏斗に移し、飽和重曹水、蒸留水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、反応溶媒を減圧留去する。残渣を無水アセトニトリル１ｍｌに溶解し、コスモナイスフィルターＳ（溶媒系、ナカライテスク株式会社製）でろ過する。ろ液を減圧留去し、目的の化合物（２３）を粗生成物として得ることができる。ＤＮＡ合成には化合物（２３）の粗生成物をそのまま用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の８−置換グアノシン誘導体及びオリゴヌクレオチドは、抗癌剤、抗ウィルス剤、抗ＨＩＶ等の核酸系医薬品として、また、遺伝子関連産業の試薬またはツールとして広範囲に利用できる可能性がある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒ1は水素結合性置換基であり、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、ｎは１〜１０の整数である。）で表される８−置換グアノシン誘導体。
【請求項２】
Ｒ1は、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｒ）ＮＨ2（Ｒは酸素原子またはイミノ基を表す。）、−ＣＯＯＲ’（Ｒ’は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2、−ＣＳＮＨ2、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＮＨ−ＣＯＣＦ3、−ＯＣＯＣＨ3及び−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3からなる群から選ばれるものである、請求項１記載の８−置換グアノシン誘導体。
【請求項３】
下記式（ａ）：
【化２】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基である。）；
下記式（ｂ）：
【化３】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ3は酸素原子またはイミノ基である。）；
下記式（ｃ）：
【化４】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ4は−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＣＯＯＲ”（Ｒ”は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2または−ＣＳＮＨ2である。）；あるいは
下記式（ｄ）：
【化５】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ5は−ＯＣＯＣＨ3または−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3である。）
で表されるものである請求項１記載の８−置換グアノシン誘導体。
【請求項４】
下記式（ＩＩ）：
【化６】
（式中、Ｒ6は水素結合性置換基を含む有機基であり、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基であり、ｎは１〜１０の整数である。）で表される８−置換グアノシン誘導体。
【請求項５】
Ｒ1は、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｒ）ＮＨ2（Ｒは酸素原子またはイミノ基を表す。）、−ＣＯＯＲ’（Ｒ’は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2、−ＣＳＮＨ2、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＮＨ−ＣＯＣＦ3、−ＯＣＯＣＨ3及び−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3からなる群から選ばれるものである、請求項４記載の８−置換グアノシン誘導体。
【請求項６】
下記式（ｅ）：
【化７】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基である。）；
下記式（ｆ）：
【化８】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ3は酸素原子またはイミノ基であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基である。）；
下記式（ｇ）：
【化９】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ4は−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＣＯＯＲ”（Ｒ”は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2または−ＣＳＮＨ2であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基である。）；あるいは
下記式（ｈ）：
【化１０】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ5は−ＯＣＯＣＨ3または−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基である。）
で表されるものである、請求項４記載の８−置換グアノシン誘導体。
【請求項７】
下記式（ＩＩＩ）：
【化１１】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ6は水素結合性置換基を含む有機基であり、ｍは０〜９である。）で表される化合物を、糖部分の水酸基を無保護条件下、接触水添させる工程を含む、請求項１から６までの何れか記載の８−置換グアノシン誘導体の製造方法。
【請求項８】
水素結合性置換基を８位に有するグアニン誘導体を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項４から６までの何れかに記載の８−置換グアノシン誘導体を用いることを含む、請求項８記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒ1は水素結合性置換基であり、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、ｎは１〜１０の整数である。）で表される８−置換グアノシン誘導体。
【請求項２】
Ｒ1は、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｒ）ＮＨ2（Ｒは酸素原子またはイミノ基を表す。）、−ＣＯＯＲ’（Ｒ’は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2、−ＣＳＮＨ2、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＮＨ−ＣＯＣＦ3、−ＯＣＯＣＨ3及び−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3からなる群から選ばれるものである、請求項１記載の８−置換グアノシン誘導体。
【請求項３】
下記式（ａ）：
【化２】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基である。）；
下記式（ｂ）：
【化３】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ3は酸素原子またはイミノ基である。）；
下記式（ｃ）：
【化４】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ4は−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＣＯＯＲ”（Ｒ”は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2または−ＣＳＮＨ2である。）；あるいは
下記式（ｄ）：
【化５】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ5は−ＯＣＯＣＨ3または−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3である。）
で表されるものである請求項１記載の８−置換グアノシン誘導体。
【請求項４】
下記式（ＩＩ）：
【化６】
（式中、Ｒ6は水素結合性置換基を含む有機基であり、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基であり、ｎは１〜１０の整数である。）で表される８−置換グアノシン誘導体。
【請求項５】
Ｒ1は、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｒ）ＮＨ2（Ｒは酸素原子またはイミノ基を表す。）、−ＣＯＯＲ’（Ｒ’は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2、−ＣＳＮＨ2、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＮＨ−ＣＯＣＦ3、−ＯＣＯＣＨ3及び−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3からなる群から選ばれるものである、請求項４記載の８−置換グアノシン誘導体。
【請求項６】
下記式（ｅ）：
【化７】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基である。）；
下記式（ｆ）：
【化８】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ3は酸素原子またはイミノ基であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基である。）；
下記式（ｇ）：
【化９】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ4は−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、−ＣＯＯＲ”（Ｒ”は水素原子または低級アルキル基を表す。）、−ＣＯＮＨ2または−ＣＳＮＨ2であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基である。）；あるいは
下記式（ｈ）：
【化１０】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ5は−ＯＣＯＣＨ3または−Ｓ−Ｓ（ＣＨ3）3であり、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基である。）
で表されるものである、請求項４記載の８−置換グアノシン誘導体。
【請求項７】
下記式（ＩＩＩ）：
【化１１】
（式中、Ｒ2は水素原子または水酸基であり、Ｒ6は水素結合性置換基を含む有機基であり、ｍは０〜９である。）で表される化合物を、糖部分の水酸基を無保護条件下、接触水添させる工程を含む、請求項１から６までの何れか記載の８−置換グアノシン誘導体の製造方法。
【請求項８】
水素結合性置換基を８位に有するグアニン誘導体を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項４から６までの何れかに記載の８−置換グアノシン誘導体を用いることを含む、請求項８記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
【公開番号】特開２００８−１６２９１６（Ｐ２００８−１６２９１６Ａ）
【公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３５２０１７（Ｐ２００６−３５２０１７）
【出願日】平成１８年１２月２７日（２００６．１２．２７）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２７日（２００６．１２．２７）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]