活性薬輸送システム
【課題】細胞膜または脂質二重層を通して生物学的活性薬を送達する方法の提供。
【解決手段】ａ）天然のコンホメーション状態、変性コンホメーション状態、及び、コンホメーション的に天然及び変性状態の中間にあり天然状態に変換可能な中間コンホメーション状態で存在しうる生物学的活性薬を準備し、ｂ）この生物学的活性薬を複合体形成摂動剤に曝露して、該生物学的活性薬を可逆的に中間状態に変換させて送達可能な超分子複合体を形成し、ｃ）膜または二重層を前記超分子複合体に曝露し、生物学的活性薬を膜または二重層を通して送達する工程からなる。この摂動剤は、約１５０から約６００ダルトンの分子量を持ち、少なくとも１つの疎水性部位と少なくとも１つの親水性部位を有する。上記（ａ）及び（ｂ）の工程からなる経口投与可能な生物学的活性薬の調製方法も、経口送達用組成物と同様に提供する。
【解決手段】ａ）天然のコンホメーション状態、変性コンホメーション状態、及び、コンホメーション的に天然及び変性状態の中間にあり天然状態に変換可能な中間コンホメーション状態で存在しうる生物学的活性薬を準備し、ｂ）この生物学的活性薬を複合体形成摂動剤に曝露して、該生物学的活性薬を可逆的に中間状態に変換させて送達可能な超分子複合体を形成し、ｃ）膜または二重層を前記超分子複合体に曝露し、生物学的活性薬を膜または二重層を通して送達する工程からなる。この摂動剤は、約１５０から約６００ダルトンの分子量を持ち、少なくとも１つの疎水性部位と少なくとも１つの親水性部位を有する。上記（ａ）及び（ｂ）の工程からなる経口投与可能な生物学的活性薬の調製方法も、経口送達用組成物と同様に提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性薬、特に生物学的活性薬を、細胞膜または脂質二重層を横切って送達するための方法及び組成物に関する。これらの方法及び組成物は、製薬製剤を不利な環境を通して体内の特定の位置に送達するように、活性薬を標的に送達することができる。
【背景技術】
【０００２】
活性薬を、例えばヒトの器官や腫瘍などの目的とする標的に送達するための従来の手段は、生物学的、化学的、及び物理的障害物の存在によってしばしば制限されることがあった。典型的には、これらの障害物は、送達が通過しなければならない環境、送達する標的の環境、または標的そのものによって与えられていた。
【０００３】
生物学的活性薬は、特にこのような障害物の影響を受けやすい。多くの生物学的活性薬についての循環系への経口送達は、もし、ある種の生物学的活性薬に対して比較的不透過性であるが、経口経路を通して活性薬が循環系に到達するためには横切らなければならない皮膚、脂質二重層、及び種々の生体器官膜などの物理的障害物が無い場合は、動物への投与経路の選択肢である。さらに、経口送達は胃腸（ＧＩ）管のｐＨ変化、並びに、口腔及びＧＩ管に存在する強力な消化酵素といった化学的障害によって邪魔される。
【０００４】
カルシトニン及びインシュリンは、この分野での有効な経口経路送達システムの設計において直面する問題を例示する。カルシトニン及びインシュリンの医学的性質は、多くの技術によって容易に変化させることができるが、それらの物理化学的性質及び酵素消化の受け易さは、商業的に実行可能な送達システムの設計から除外されている。経口投与には典型的に受け入れられない多くの試薬のうちの他のものは、シトキン（例えば、インターフェロン、ＩＬ−２など）といったタンパク質；エリスロポイエチン、多糖類、特に、ムコ多糖であり、ヘパリン、ヘパリノイド、抗生物質、及び他の有機物質を含むがこれらに限定されない。また、これらの試薬は、即座に不活性になる、即ち、ＧＩ管内で酸加水分解、酵素等によって分解される。
【０００５】
バイオテクノロジーは、多くの他の化合物の生成を可能にし、それらの多くは世界中で臨床に使用されている。しかし、これらの化合物の現在の投与形態は、ほとんどが注射によるものである。これらの化合物の経口投与が多くの場合に好ましいにもかかわらず、これらの試薬はＧＩ管内の種々の酵素やｐＨ変化の影響を受けやすく、一般的には、細胞膜が典型的に構成される脂質二重層を十分に透過することができない。従って、この活性薬は、活性薬がその生物学的効果を発揮することが望まれる標的に経口送達することができなかった。
【０００６】
典型的には、薬物設計は、製薬化合物の生化学的性質、及び、特にそれらの治療作用に最初に焦点が当てられる。第２の設計の焦点は、活性薬をその生物学的標的に送達する必要性に向けられる。このことは、ヒト及び他の動物に経口投与するための薬物及び他の生物学的活性薬に当てはまる。しかしながら、投与、特に経口投与後に、該化合物の治療的タイターが適当な解剖学的部位即ち区画に到達することを確実にする送達システムが無かったため、数千の治療的化合物は廃棄された。さらに、現存する治療用化合物の多くは、それらの投与形態の束縛から、許容された徴候に使用されている。また、それら以外の付加的な臨床的徴候にも有効である多くの治療的試薬は、それらを適切な量で適当な生物学的標的に送達する実際の方法論が存在する場合は既に採用されている。
【０００７】
タンパク質などの活性薬の細胞間及び細胞内送達に有効な性質が得られたとしても、この成功は薬物設計に生かされていなかった。現実に、タンパク質などの活性薬の送達可能なコンフォメーションは、天然の状態におけるコンフォメーションとは異なる。さらに、自然な送達システムは、しばしば送達に続くタンパク質の天然状態への帰還に作用する。タンパク質がリボゾームによって合成されると、それらは、例えば信号ペプチド及び／またはチャペロニン(chaperonin)といった種々の機構によって適当な細胞オルガネラに往復運転される。Gething，M-J., Sambrook，J.，Nature，355，1992，33-45。信号ペプチドまたはチャペロニンのいずれかの多くの機能の一つは、タンパク質の天然状態への前成熟折り畳みを阻害することである。天然状態は、通常最も低い自由エネルギーを持つ３次元状態として記述される。タンパク質を部分的に折り畳みしない状態に保持するため、信号ペプチドまたはチャペロニンは、タンパク質が適当なオルガネラに到達するまで、タンパク質が種々の細胞膜を横切ることを可能にする。次いで、チャペロニンはタンパク質から分離され、信号ペプチドはタンパク質から解離され、タンパク質が天然状態に折り畳みすることができるようにされる。タンパク質が細胞膜を通過することができるのは、少なくとも一部は、部分的に折り畳みしない状態にあることの結果であることは良く知られている。
【０００８】
タンパク質折り畳みの今日の概念は、天然状態から完全に変性した状態への変換において、多数の不連続なコンフォメーションが存在することを示唆している。Baker，D.，Agard，D.A.，Biochemistry，33，1994，7505-7509。タンパク質折り畳みの骨格モデルは、折り畳みの初期段階においては、二次構造単位であるタンパク質のドメインが形成され、次いで最終的折り畳みによって天然状態になることを示唆している。Kim，P.S.，Baldwin，R.L.，Annu．Rev．Biochem.，59，1990，631-660。これらの速度論的中間体に加えて、多くの細胞機能にとって平衡中間体が重要であることがわかった。Bychkova，V.E.，Berni，R.，等，Biochemistry，31，1992，7566-7571,及び Sinev，M.A.，Razgulyaev，O.I.，等，Eur．J. Biochem.，1989，180，61-66。チャペロニンについてのデータは、それらが、タンパク質を部分的に天然状態ではないコンフォメーションに保持する作用があることを示している。さらに、部分的に折り畳まれていないタンパク質は、膜を通過できるが、天然状態、特に大きな粒状タンパク質は、膜を通過しにくいか全く通過しないことが示された。Haynie，D.T.，Freire，E.，Proteins: Structure, Function and Genetics，16，1993，115-140。
同様に、上記の平衡中間体を伴ってコンフォメーション変化を受けないインシュリンなどのリガンドは、それらの機能を失う。Hua，Q.X.，Ladbury，J.E.，Weiss，M.A.，Biochemistry，1993，32，1433-1442; Remington，S.，Wiegand，G., Huber，R.，1982，158，111-152; Hua，Q.X.，Shoelson，S.E.，Kochoyan，M., Weiss，M.A.，Nature，1991，354，238-241。
【０００９】
ジフテリア毒素及びこれら毒素の研究は、ジフテリア毒素がその細胞レセプターに結合した後、エンドサイトーシスされるが、このエンドサイトーシス小胞において、酸性ｐＨ環境に曝露されることを示している。酸性ｐＨは、毒素分子に構造変化を誘起し、膜挿入及び細胞質ゾルへの位置変化(translocation)の原動力を与える。Ramsay，G.，Freire，E.，Biochemistry，1990,29，8677-8683,及びSchon，A.，Freire，E.，Biochemistry，1989，28，5019-5024 参照。同様に、コレラ毒素は、エンドサイトーシスに続いてコンフォメーション変化を受け、分子が核膜を透過するのを可能にする。Morin，P.E.，Diggs，D.，Freire，E.，Biochemistry，1990，29，781-788 参照。
【００１０】
先に設計された送達システムは、送達のための間接的または直接的な試みをいずれかを用いる。間接的試みは、薬物を敵対する環境から保護することを目指す。例として、腸被覆(enteric coatings)、リポソーム、微小球、マイクロカプセルがある。colloidal drug systems，1994，ed．Jorg Freuter，Marcel Dekker，Inc.; U.S．Patent No．4,239,754; Patel，等，(1976)，FEBS Letters，Vol．62, pg．60; 及び Hashimoto，等，(1979)，Endocrinology Japan，Vol．26，pg．337 参照。これらの試みは全て間接的であり、その設計原理は薬物には向けられず、例えば、敵対環境の薬物への接触及び破壊を防止するといった、薬物が生物学的活性を発揮する標的までの経路で薬物が通過しなければならない環境に対する保護に向けられている。
【００１１】
直接的な試みは、プロドラッグの製造といった、薬物と修飾物との共有結合に基づいている。Balant，L.P.，Doelker，E.，Buri，P.，Eur．J．Drug Metab．And Pharmacokinetics，1990，15(2)，143-153。結合は、通常は、ｐＨ変化や特定の酵素への曝露などの所定の条件下で開裂するように設計される。薬物と修飾物との共有結合は、本質的に新たな分子を生成するが、それらは、変化したｌｏｇＰ等の新たな性質及び／または新たな螺旋コンフィギュレーションを持つ。この新たな分子は、異なる溶解性を持ち、酵素分解を受けにくい。このタイプの方法の例は、ポリエチレングリコールとタンパク質との共有結合である。Abuchowski, A.，Van Es，T.，Palczuk，N.C.，Davis，F.F.，J．Biol．Chem.，1977，252，3578。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、（１）システムが、毒性となる量のアジュバントまたは阻害剤を必要とすること、（２）好ましく低い分子量のコルゴ(corgos)即ち活性薬が、入手できないこと、（３）システムの安定性が悪く、シェルフライフが不十分であること、（４）システムの調製が困難であること、（５）システムが活性薬（コルゴ）を保護しないこと、（６）システムが活性薬を悪い方向に変化させること、または、（７）システムが活性薬の吸着を推進しないことによって、従来の送達システムの広い範囲の用途は除外されている。
【００１３】
この分野では、簡単で低価格の送達システムであって、調製が容易であり、特に、経口経路で投与すべき製薬製剤の場合に、広い範囲の活性薬を目的とする標的に送達できる送達システムを未だに必要としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、細胞膜または脂質二重層を通して生物学的活性薬を送達する方法を開示する。この方法は、
（ａ）天然のコンホメーション状態、変性コンホメーション状態、及び、コンホメーション的に天然及び変性状態の中間にあり天然状態に変換可能な中間コンホメーション状態で存在しうる生物学的活性薬を準備し、
（ｂ）この生物学的活性薬を複合体形成摂動剤(complexing perturbant)に曝露して、該生物学的活性薬を可逆的に中間状態に変換させて送達可能な超分子複合体(supramolecular complex)を形成し、そして、
（ｃ）前記膜または二重層を、前記超分子複合体に曝露して、前記生物学的活性薬を前記膜または二重層を通して送達する工程を含む。
【００１５】
この摂動剤は、約１５０から約６００ダルトンの分子量を持ち、少なくとも１つの疎水性部位と少なくとも１つの親水性部位を有する。この超分子複合体は、前記生物学的活性薬に非−共有結合で複合体形成した摂動剤を含有する。本発明では、生物学的活性薬は摂動剤と相互作用した後は微小球を形成しない。
【００１６】
また、上記の工程（ａ）及び（ｂ）からなる経口投与可能な生物学的活性薬の調製方法も考慮する。
【００１７】
変形実施態様において、経口送達用組成物が提供される。この組成物は、
（ａ）下記（ｂ）と非共有結合で複合体形成した中間コンホメーション状態の生物学的活性薬、
（ｂ）約１５０から約６００ダルトンの分子量を持ち、少なくとも１つの疎水性部位と少なくとも１つの親水性部位を有する複合体形成摂動剤を含み、
前記中間コンホメーション状態は、天然のコンホメーション状態及び変性コンホメーション状態の中間にあり、前記天然状態に変換可能であって、前記組成物は微小球ではない。
【００１８】
さらに、細胞膜または脂質二重層を通して送達可能であり、前記膜または二重層を通過した後に生物学的に活性となる模倣物(mimetic)を調製する方法も考慮する。天然のコンホメーション状態、変性コンホメーション状態、及び、コンホメーション的に天然及び変性状態の中間にあり天然状態に変換可能な中間コンホメーション状態で存在しうる生物学的活性薬を複合体形成摂動剤に曝露して、該生物学的活性薬を可逆的に中間状態に変換させて送達可能な超分子複合体を形成する。この摂動剤は、約１５０から約６００ダルトンの分子量を持ち、少なくとも１つの疎水性部位と１つの親水性部位を有する。この超分子複合体は、前記生物学的活性薬に非−共有結合で複合体形成した摂動剤を含有し、生物学的活性薬は摂動剤と相互作用した後は微小球を形成しない。超分子複合体の模倣物を調製する。
【００１９】
さらにまた、細胞膜または脂質二重層を通して送達可能であり、前記膜または二重層を通過した後に生物学的に活性となる薬剤を調製する方法を提供する。天然のコンホメーション状態、変性コンホメーション状態、及び、コンホメーション的に天然及び変性状態の中間にあり天然状態に変換可能な中間コンホメーション状態で存在しうる生物学的活性薬を複合体形成摂動剤に曝露して、該生物学的活性薬を可逆的に中間状態に変換させる。薬剤、前記中間状態の模倣物を調製する。
【００２０】
〔発明の詳細な説明〕
生物学的な生物は、細胞膜または脂質二重層で互いに分離された水性区画からなると言うことができる。活性薬、特に製薬または治療用活性薬は、水性環境において１つの溶解度を有し、疎水性環境においては全く異なる溶解度を有する。典型的には、投与部位から病原部位などの標的部位への活性薬の送達は、活性薬の溶解度が変化する細胞膜または脂質二重層を通した活性薬の送達を必要とする。さらに、活性薬の経口送達は、酵素分解、ｐＨ変化などに抗する能力を必要とする。これらの障害は、投与部位と標的との間で、活性薬の生物学的活性の部分的または全体的な低下をもたらす。従って、治療反応のような正当な反応を生ずるのに必要な量の活性薬だけでは、標的に到達しないかもしれない。従って、活性薬は、到達のため、そして膜または脂質二重層を通過するための何らかの助けを必要とする。
【００２１】
本発明は、活性薬と複合体形成摂動剤から可逆的に非共有結合で複合体形成した超分子によって、活性薬送達に有効である。結果として、活性薬の三次元構造またはコンフォメーションが変化するが、活性薬分子の化学組成は変化しない。この（組成ではなく）構造の変化は、活性薬に、膜または脂質二重層を通過し、酵素分解などに抗するのに適当な溶解性（ｌｏｇＰ）を付与する。通過とは、実際に細胞膜または脂質二重層を透過するか否かに係わらず、細胞膜または脂質二重層の一方の側から反対側へ（例えば、細胞の外部から内部へ、またはその逆へ）送達することを意味する。さらに、活性薬の摂動剤中間体状態または超分子自身は、模倣物製造のテンプレートとして用いることができ、この模倣物は細胞膜または脂質二重層を通って送達可能である。細胞膜または脂質二重層を通過した後、活性薬は、天然状態への変換により、または中間状態で得られる生物学的活性または生体適合性を保持することにより、生物学的活性及び生体適合性を有する。模倣物は、細胞膜または脂質二重層を通過した後、同様に作用する。
【００２２】
〔活性薬〕
活性薬の天然コンフォメーション状態は、最も低い自由エネルギー（ΔＧ）を持つ三次元状態として典型的に記述される。それは、生物学的活性薬に帰する生物学的活性の全ての補体のように、活性薬がその薬に帰する活性の完全な補体を有する状態である。
【００２３】
変性コンフォメーション状態は、活性薬が二次または三次構造を持たない状態である。
【００２４】
中間コンフォメーション状態は、天然及び変性状態の間に存在する。特に活性な薬は、１またはそれ以上の中間状態を有する。本発明で達成される中間状態は、構造的かつエネルギー的に、天然状態とも変性状態とも異なっている。本発明で有用な活性薬は、天然コンフォメーション状態から中間コンフォメーション状態に変換可能であり、天然状態に戻すこともできる。即ち、可逆的に変換可能であって、活性薬が標的に到達するとき、例えば、経口送達された薬物が循環系に到達したときに、活性薬は生物学的、製薬的、または治療的に重要な設計された生物学的活性補体を保持し、回復し、または獲得する。好ましくは中間状態の約−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌから約２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲、さらに好ましくは、約−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌから約１０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲である。
【００２５】
例えばタンパク質の場合、中間状態は重要な二次構造、かなり大きな疎水性コアの存在による重要な緻密性(compactness)、及び天然折り畳みを記憶した(reminiscent)三次構造を有するが、天然状態の充填を示す必要はない。天然状態と中間状態との間の自由エネルギーの差（ΔＧ）は比較的小さい。従って、天然状態と、変換可能な可逆的中間状態との平衡定数は１に近い（実験条件による）。中間状態は、例えば、示差熱量分析（ＤＳＣ）、等温的定熱量分析（ＩＴＣ）、天然勾配ゲル、ＮＭＲ、蛍光等によって確認することができる。
【００２６】
如何なる理論にもよらないが、本出願人は、中間状態の物理化学は、タンパク質性活性薬に関する以下の説明で理解されるものと思う。タンパク質は適当な中間コンフォメーション状態で存在でき、それは構造的かつエネルギー的に、天然状態とも変性状態とも異なる。任意のタンパク質の任意のコンフォメーション本来の安定性は、コンフォメーションについてのギブスの自由エネルギーに反映される。単量体のタンパク質の状態のギブスの自由エネルギーは、熱力学的に以下の式で表される。
【数１】
ここで、Ｔは温度、ＴRは参照温度、ΔＨO（ＴR）及びＴΔＳO（ＴR）は参照温度におけるこの状態の相対的エンタルピー及びエントロピー、そして、ΔＣｐOはこの状態の相対的熱容量を示す。全ての相対的熱力学的パラメータを説明するために、天然状態を参照状態として選択するのが好ましい。
【００２７】
そのタンパク質に許容される全ての状態統計的重量の和は、分配関数Ｑで定義される。
【数２】
【００２８】
式（２）は、次のようにも書ける。
【数３】
【００２９】
ここで、第２項は、変換中に集団化した全ての中間体を含む。式（３）の第１項及び第３項は、各々、天然及び変性状態の統計的重量である。ほとんどの条件下で、タンパク質構造は、２状態変換関数で近似できる。
【数４】
【００３０】
Tanford，C.，Advances in Protein Chemistry，1968，23，2-95 参照。天然と変性状態の中間にあるタンパク質のコンフォメーションは、例えば、ＮＭＲ、熱量分析、及び蛍光で検出できる。Dill，K.A.，Shortle，D.，Rev．Biochem.，60, 1991，795-825。
【００３１】
全ての熱力学的パラメータは、分配関数で表される。特に、ｉ状態にある分子の集団は、式（５）で表される。
【数５】
【００３２】
従って、ギブスの自由エネルギーの計算を可能にする式（１）の適当な項の測定は、設定した実験条件において、集団化した任意の中間体がどの程度重要かを決定することができる。これは、中間体が薬物送達で果たすいえくわりを示している。中間体の集団化が多いほど、送達は有効になる。
【００３３】
本発明で用いるのに好適な活性薬は、生物学的活性薬及び化学的活性薬であり、香料及び例えば化粧品のような他の活性薬を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
生物学的活性薬はペストシド(pestcides)、製薬剤、及び治療剤を含むがこれらに限定されない。例えば、本発明で用いるのに好適な生物学的活性薬は、ペプチド、特に小さなペプチド、ホルモン、特にそれ自身は胃腸粘膜を通過しない及び／または胃腸管の酸または酵素による化学的開裂を受けないホルモン、多糖類、特にムコ多糖類の混合物、炭水化物、脂質、またはそれらの組合せを含むがそれらに限定されない。さらなる例は、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、インターフェロン、インターロイキン−１、インシュリン、ヘパリン、特に低分子量ヘパリン、カルシトニン、エリスロポイエチン、心房性ナトリウム排泄増加因子(atrial naturetic factor)、抗原、モノクローナル抗体、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、オキシトシン、バソプレッシン、クロモリンナトリウム（ナトリウムまたは時ナトリウムクロモグリカート）、バンコマイシン、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、抗−微生物、しかし抗菌剤に限られない、またはこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明の方法及び組成物は、１以上の活性薬の組合せでもよい。
【００３６】
〔摂動剤〕
本発明での摂動剤は、２つの目的を持つ。第１の実施態様では、活性薬は摂動剤と接触し、活性薬を天然状態から中間送達可能状態に可逆的に変換する。摂動剤は活性薬と非共有結合で複合体形成し、細胞膜または脂質二重層を透過または横切ることにできる超分子複合体を形成する。この超分子複合体は、模倣物のテンプレートとして用いることが出来、それ自身送達組成物として使用することができる。実際に、摂動剤は、活性薬を送達可能な中間状態に固定する。摂動剤は循環系における希釈等によって超分子複合体から放出され、活性薬は天然状態に戻る。好ましくは、これらの摂動剤は、少なくとも１つの親水性部分（即ち、カロキシラート基のように、容易に水に溶解する部分）、及び、少なくとも１つの疎水性部分（即ち、例えばベンゼン基のように、有機溶媒に容易に溶解する部分）を備え、約１５０から６００ダルトン、最も好ましくは約２００から５００ダルトンの分子量を有する。
【００３７】
複合体形成摂動剤分子は、線状、非線状、及び環状プロテイノイドを含むタンパク質、修飾（アシル化またはスルホン化）アミノ酸、ポリアミノ酸、及びペプチド、修飾アミノ酸、ポリアミノ酸、またはペプチド誘導体（ケトンまたはアルデヒド）、ジケトピペラジン／アミノ酸構造体、カルボン酸、及び下記で議論する種々の他の摂動剤を含むがこれらに限定されない。
【００３８】
また、如何なる理論にもよらないが、出願人は、非共有結合複合体形成は、水素結合、疎水性相互作用、静電相互作用、及びファンデルワールス相互作用を含むがこれらに限られない分子間力に影響されると思量する。任意の与えられた活性薬／摂動剤超分子複合体について、結合を維持するいくつかの上記の力が存在する。
【００３９】
活性薬と摂動剤の間の結合定数Ｋａは、下記の式（６）で定義される。
【数６】
【００４０】
解離定数Ｋdは、Ｋaの逆数である。よって、所定温度での摂動剤と活性薬の間の結合定数の測定は、分子ギブス自由エネルギーを産し、結合によるエンタルピー及びエントロピー効果の決定ができる。これらの実験的測定は、例えば、ＮＭＲ、蛍光、熱量分析を用いて行える。
【００４１】
この仮説は、タンパク質に次いて以下のように説明できる。
折り畳まれていないタンパク質は、種々のコンフォメーション状態の間に存在する平衡に従って記述できる。例えば、
【数７】
ここで、Ｎは天然状態、Ｉは中間状態、Ｄは変性状態、ｋ1及びｋ2は、各々の速度定数である。Ｋ1及びＫ2は各々の平衡定数である。従って、
【数８】
【数９】
これは、中間状態の分配関数の増加が、活性薬送達の能力に正の衝撃を有するべきことを示唆している。
（１０）
【００４２】
複合体形成は可逆的でなければならないので、Ｋaによって測定される摂動剤と活性薬の複合体形成は、薬剤を循環系／または標的まで確実に送達するのに十分強くなくてはならず、摂動剤の脱離が適時に起こらずに、活性薬が天然に戻って所定の効果を生ずることが無いほど強くてはいけない。
【００４３】
第２の実施態様では、摂動剤は活性薬を中間状態に可逆的に変換させ、その状態のコンフォメーショオンを模倣物の調製用のテンプレートとして使用できるようにする。この目的のためには、摂動剤は活性薬と複合体形成する必要はないが、してもよい。従って、上記の複合体形成摂動剤に加えて、例えば、強酸、洗浄剤、といった活性薬または環境のｐＨを変化させる摂動剤、活性薬のイオン強度を変化せる摂動剤、例えば塩素酸グアニジン等の他の試薬、及び温度を、活性薬の変換に用いることができる。超分子複合体または中間状態は、模倣物設計のテンプレートとして使用できる。
【００４４】
〔複合体形成摂動剤〕
アミノ酸は、本発明で有用な複合体形成摂動剤の多くを調製するのに用いられる基本的材料である。アミノ酸は少なくとも１つのフリーなアミノ基を有するカルボン酸であり、天然及び合成アミノ酸を含む。本発明で用いるのに好適なアミノ酸はα−アミノ酸であり、最も好ましいのは天然のα−アミノ酸である。多くのアミノ酸及びアミノ酸エステルが、Aldorich Chemical Co．(Milwaukee，WI，USA); Sigma Chemical Co．(St．Louis，MO，USA); Fluka Chemical Corp．(Ronkonkoma，NY，USA)等の市販元から入手可能である。
【００４５】
本発明で用いるのに好適だがそれらに限定されない代表的アミノ酸は以下の式で表される。
【化１】
ここで、Ｒ1は水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ2−Ｃ4アルケニル；
Ｒ2はＣ1−Ｃ24アルキル、Ｃ2−Ｃ24アルケニル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）フェニル、（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）ナフチル、（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、フェニル（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、またはナフチル（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）であり、Ｒ2はＣ1−Ｃ4アルキル、Ｃ2−Ｃ4アルケニル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ2Ｒ3、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルケニル、３−１０の環原子を有しヘテロ原子がＮ、Ｏ、Ｓまたはそれらの組合せであるヘテロ環、アリール，（Ｃ1−Ｃ10アルキル）アリール、アリール（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、またはこれらの組合わせで任意に置換されていてもよく、Ｒ2は、酸素、窒素、硫黄、またはこれらの組合せで分断されていてもよく、Ｒ3は水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ2−Ｃ4アルケニルである。
【００４６】
本発明でアミノ酸またはペプチドの成分として用いるのに好ましい天然アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シトルリン、システイン、シスチン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタマート、フェニルグリシン、またはＯ−ホスホセリンである。
【００４７】
好ましいアミノ酸は、アルギニン、ロイシン、リシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、バリン、及びフェニルグリシンである。
【００４８】
本発明で用いるのに好ましい非天然アミノ酸は、β−アラニン、α−アミノブチル酸、γ−アミノブチル酸、γ−（アミノフェニル）ブチル酸、α−アミノイソブチル酸、シトルリン、ε−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、β−アスパラギン酸、アミノ安息香酸、アミノフェニル酢酸、アミノフェニルブチル酸、γ−グルタミン酸、システイン（ＡＣＭ）、ε−リシン、ε−リシン（Ａ−Ｆｍｏｃ）、メチオニンスルホン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、ｄ−オルニチン、ｐ−ニトロ−フェニルアラニン、ヒドロキシプロリン、１，２，３，４，−テトラヒドロキノリン−３−カルボン酸、及びチオプロリンである。
【００４９】
ポリアミノ酸は、ペプチド、または、エステル、無水物即ち無水物結合で結合し得る他の基からなる結合で結合した２またはそれ以上のアミノ酸である。特に、非天然ポリアミノ酸、及び非天然ヘテロポリアミノ酸、混合アミノ酸を挙げることができる。
【００５０】
ペプチドは、ペプチド結合で結合した２以上のアミノ酸である。ペプチドは、２つのアミノ酸を持つジペプチドから数百のアミノ酸を持つポリペプチドまで変化できる。Walker，Chambers Biological Dictionary，Cambridge，England: Chambers Cambridge，1898，215 頁参照。特に、非天然ペプチド、特に混合アミノ酸の非天然ペプチドを挙げることができる。特にジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、及びペンタペプチド、中でも好ましいペプチドはジペプチド及びトリペプチドである。ペプチドは、ホモ及びヘテロペプチドを含み、天然アミノ酸、合成アミノ酸、及びそれらの組合せを含むことができる。
【００５１】
〔プロテイノイド複合体形成摂動剤〕
プロテイノイドは、アミノ酸の合成ポリマーである。プロテイノイドは、好ましくはアミノ酸混合物から調製し、最も好ましくは熱縮合ポリマーである。これらのポリマーは、配向性またはランダムポリマーである。プロテイノイドは、線形、分岐、または環状プロテイノイドであり、ある種のプロテイノイドは、他の線形、分岐、または環状プロテイノイドの単位となる。
【００５２】
特に、ジケトピペラジンを挙げることができる。ジケトピペラジンは、６員環化合物である。環は２つの窒素原子を含み、２つの炭素原子において２つの酸素原子で置換されている。好ましくは、カルボニル基は、環の１位と４位にある。
これらの環は、任意に、かつ頻繁にさらに置換されている。
【００５３】
ジケトピペラジン環系は、アミノ酸またはアミノ酸誘導体の熱重合または縮合で生成される。(Gyore，J.; Ecet M．Proceedings Fourth ICTA(Thermal Analysis)，1974，2，387-394(1974))。これらの６員環系は、線形ペプチドから、さらなる鎖成長に先だってまたは直接に主に分子内環形成によって生成する(Reddy, A.V.，Int.J．Peptide Protein Res.，40，472-476(1992); Mazurov，A.A.，Int．J．Peptide Protein Res.，42，14-19(1993))。
【００５４】
ジケトピペラジンは、Katchlski，J.Amer.Chem.Soc.，68，879-880（1946）に記載されたようにアミノ酸エステルの環状二量化によって、ジペプチド誘導体の環化によって、または、Koppel，J．Org．Chem.，33(2)，862-864(1968)に記載されたように、アミノ酸誘導体と高沸点溶媒の熱脱水によって形成される。
【００５５】
ジケトピペラジンの典型的な合成においては、アミノ酸ベンジルエステルのＣＯＯＨ基が第１段階で活性化されて保護エステルを形成する。アミンは脱保護されて第２段階の二量化を介して環化し、ジケトピペラジンのジエステルとなる。
最後に、ＣＯＯＨ基が脱保護されたジケトピペラジンとなる。
【００５６】
ジケトピペラジンは、典型的にはα−アミノ酸から形成される。好ましくは、ジケトピペラジンのα−アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、フェニルアラニン、及びこれらの光学異性体からの誘導体である。
特に挙げられるジケトピペラジンは以下の式で表される。
【化２】
【００５７】
ここで、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は、独立に、水素、Ｃ1−Ｃ24アルキル、Ｃ1−Ｃ24アルケニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、及びナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）であり、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は独立かつ任意に、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4アルケニル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、及びＣＯ2Ｒ8、またはこれらの組合せで置換されていてもよく、Ｒ8は水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ1−Ｃ4アルケニルであり、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、及びＲ7は独立かつ任意に、酸素、窒素、硫黄またはこれらの組合せで分断されていてもよい。
【００５８】
フェニルまたはナフチル基は、任意に置換されていてもよい。好ましくは、置換基の例はＣ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6アルケニル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＣＯ2Ｒ9であって、Ｒ9は水素、Ｃ1−Ｃ6アルキルまたはＣ1−Ｃ6アルケニルであるが、これらに限定されない。
【００５９】
好ましくは、Ｒ6及びＲ7は独立に、水素、Ｃ1−Ｃ4アルキルまたはＣ1−Ｃ4アルケニルである。特に、好ましい複合体形成摂動剤であるジケトピペラジンを挙げることができる。これらのジケトピペラジンは、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7が水素である未置換のジケトピペラジン、及び、環の窒素原子の一方または両方で置換された、モノまたはジ−Ｎ−置換体を含む。特に、窒素原子の一方または両方がメチル基で置換された置換ジケトピペラジンを挙げることができる。
【００６０】
特に、次の式で表されるジケトピペリジンを挙げることができる。
【化３】
ここで、Ｒ10及びＲ11は、独立に、水素、Ｃ1−Ｃ24アルキル、Ｃ1−Ｃ24アルケニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、及びナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）であるが、Ｒ10とＲ11の両方が同時に水素とはならず、Ｒ10及びＲ11は独立かつ任意に、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4アルケニル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、及びＣＯ2Ｒ12、またはこれらの組合せで置換されていてもよく、Ｒ12は水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ1−Ｃ4アルケニルであり、Ｒ10及びＲ11は独立かつ任意に、酸素、窒素、硫黄またはこれらの組合せで分断されていてもよい。
【００６１】
フェニルまたはナフチル基は、任意に置換されていてもよい。好ましくは、置換基の例はＣ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6アルケニル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＣＯ2Ｒ13であって、Ｒ13は水素、Ｃ1−Ｃ6アルキルまたはＣ1−Ｃ6アルケニルであるが、これらに限定されない。Ｒ10とＲ11の一方が水素であるとき、ジケチピペラジンはモノ−炭素−（Ｃ）−置換である。Ｒ10もＲ11も水素でないときは、ジケトピペラジンはジ−炭素−（Ｃ）−置換である。
【００６２】
好ましくは、Ｒ10、Ｒ11、またはＲ10とＲ11の両方が、少なくとも１つの官能基を含み、この官能基は分子の特性反応を負う非炭化水素部分である。単純な官能基はヘテロ原子であり、ハロゲン、酸素、硫黄、窒素等を含むがこれらに限られず、炭素に単結合または多重結合で結合している。他の官能基は、例えば、水酸基、カルボキシル基、アミド基、アミン基、置換アミン基等を含むがこれらに限定されない。
【００６３】
好ましいジケトピペラジンは、環の１または２の炭素が官能基で置換され、少なくとも１つのカルボキシル基を含むものである。
【００６４】
〔アミノ酸／ジケトピペラジン複合体形成摂動剤〕
ジケトピパレジンは、付加的なアミノ酸と重合して少なくとも１つのアミノ酸、そのエステルまたはアミド、及び好ましくは互いに共有結合した少なくとも１つのジケトピペラジンを含む。
【００６５】
ジケトピペラジンが付加的アミノ酸と重合するとき、１以上のＲ基は少なくとも１つの官能基を含み、官能基は分子の特性反応を負う非炭化水素部分である。
【００６６】
単純な官能基はヘテロ原子であり、ハロゲン、酸素、硫黄、窒素等を含むがこれらに限られず、アルキル基の炭素に単結合または多重結合で結合している。他の官能基は、例えば、水酸基、カルボキシル基、アミド基、アミン基、置換アミン基等を含むがこれらに限定されない。
【００６７】
本発明のアミノ酸／ジケトピペラジン複合体形成摂動剤の好ましい成分であるジケトピペラジンを挙げることができる。このような好ましいジケトピペラジンは、環の１または２の炭素が官能基で置換され、少なくとも１つのカルボキシル基を含むものである。
【００６８】
最も好ましいのは、アミノ酸／ジケトピペラジン複合体形成摂動剤のジケトピペラジンが、環化してジケトピペラジンを形成するＬ−グルタミン酸及びＬ−アスパラギン酸のような反応性アミノ酸から調製される。
【００６９】
ジケトピペラジンは、ビス−カルボン酸プラットホームを生成し、それは他のアミノ酸とさらに縮合して摂動剤を形成する。典型的には、ジケトピペラジンは、１以上のアミノ酸と、ジケトピペラジンのＲ基の官能基を介して反応して共有結合する。これらの独特な系は、ジケトピペラジンのキラル成分によって付与されるシス−幾何異性体によって（LAnnom，H.K.，Int．J．Peptide Protein Res.，28，67-78(1986)）、末端アミノ酸の構造を系統的に変換する機会を提供するが、その配向は非環状模倣物に比較して固定される（Fusaoka，Int．J．Peptide Protein Res.，34，104-110(1989)）。Lee，B.H.，J.Org.Chem.，49，2418-2423(1984); Buyle，R．Helv．Chim．Acta，49，1425，1429（1966）も参照。糖業者に知られた他の重合方法を、それ自体、アミノ酸／ジケトピペラジン重合にも使用できる。
【００７０】
アミノ酸／ジケトピペラジン摂動剤は、上記のように、同一または異なる１以上のアミノ酸、並びに同一または異なるジケトピペラジンを含む。
【００７１】
これらのアミノ酸／ジケトピペラジン摂動剤のエステル及びアミド誘導体も本発明では、有用である。
【００７２】
〔修飾アミノ酸複合体形成摂動剤〕
修飾したアミノ酸、ポリアミノ酸、またはペプチドは、アシル化またはスルホン化され、アミノ酸アミド及びスルホンアミドを含む。
【００７３】
〔アシル化アミノ酸複合体形成摂動剤〕
特に以下の式出表されるアシル化アミノ酸を挙げることができる。
【化４】
ここで、Ａｒは置換または非置換フェニルまたはナフチルであり、
【化５】
ここで、Ｒ15は、Ｃ1−Ｃ24アルキル、Ｃ1−Ｃ24アルケニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、及びナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）であり、Ｒ15は任意に、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4アルケニル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、及びＣＯ2Ｒ5、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロ環アルキル、アルカリール、ヘテロアリール、ヘテロアルカリール、またはこれらの組合せで置換されていてもよく、
Ｒ17は水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ1−Ｃ4アルケニルであり、
Ｒ15は任意に、酸素、窒素、硫黄またはこれらの組合せで分断されていてもよく、そして、
Ｒ16は、水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ1−Ｃ4アルケニルである。
【００７４】
特に、下記の式で表されるものを挙げることができる。
【化６】
ここで、Ｒ18は（ｉ）Ｃ3−Ｃ10シクロアルキルであり、任意にＣ1−Ｃ7アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ1−Ｃ7アルコキシ、ヒドロキシ、フェニル、フェノキシ、またはＣＯＲ21で置換されていてもよく、Ｒ1は水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ2−Ｃ4アルケニルであるか、または、
（ｉｉ）Ｃ3−Ｃ10シクロアルキルで置換されたＣ1−Ｃ6アルキルであり、Ｒ20は、Ｃ1−Ｃ24アルキル、Ｃ1−Ｃ24アルケニル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルケニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）フェニル、（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）ナフチル、（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、フェニル（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、またはナフチル（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）であり、
Ｒ20は任意に、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4アルケニル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、及びＣＯ2Ｒ22、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルケニル、３−１０の環原子を有するヘテロ環であって、ヘテロ原子の１以上がＮ、Ｓ、Ｏまたはこれらの組合せ、アリール（Ｃ1−Ｃ10アルキル）アリール、アリール（Ｃ1−Ｃ10アルキル）またはこれらの組合せで置換されていてもよく、Ｒ20は任意に、酸素、窒素、硫黄またはこれらの組合せで分断されていてもよく、Ｒ22は水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ1−Ｃ4アルケニルである。
【００７５】
いくつかの好ましいアミノ酸は、サリチロールフェニルアラニン及び以下の式で表される化合物を含む。
【００７６】
【化７】
【００７７】
【化８】
【００７８】
【化９】
【００７９】
【化１０】
【００８０】
【化１１】
【００８１】
【化１２】
【００８２】
【化１３】
【００８３】
【化１４】
【００８４】
【化１５】
【００８５】
【化１６】
【００８６】
【化１７】
【００８７】
【化１８】
【００８８】
【化１９】
【００８９】
特に、以下の式で表される化合物を挙げることができる。
【化２０】
【００９０】
ここで、Ａは、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、またはＣｉｔであり、
任意に、ＡがＴｙｒ、Ａｒｇ、ＴｒｐまたはＣｉｔであるとき、Ａは２以上の官能基でアシル化されている。
【００９１】
好ましい化合物は、ＡがＴｙｒであるもの、ＡがＴｙｒかつ２官能基でアシル化されたもの、ＡがＴｒｐ、ＡがＴｒｐかつ２官能基でアシル化されたもの、ＡがＣｉｔであるもの、ＡがＣｉｔかつ２官能基でアシル化されたものである。
【００９２】
以下の式で表される化合物を特に挙げることができる。
【化２１】
ここで、ＡはＡｒｇまたはＬｅｕであり、ＡがＡｒｇであるとき、Ａは任意に２以上の官能基でアシル化されており、
【化２２】
ここで、ＡはＬｅｕまたはフェニルグリシンであり、
【化２３】
ここで、Ａはフェニルグリシンであり、そして、
【化２４】
ここで、Ａはフェニルグリシンである。
【００９３】
アシル化アミノ酸は、単一アミノ酸、２以上のアミノ酸の混合物、またはアミノ酸エステルとアミノ酸に存在するフリーアミノ部位と反応してアミドを形成するアミン修飾剤から調製される。
【００９４】
好ましくは、アシル化アミノ酸を調製するために有用なアシル化剤の例は、
【化２５】
で表される酸塩化物アシル化剤を含むがこれらに限定されない。ここで、Ｒ23は、調製される修飾アミノ酸に適当な基であり、例えば、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、または芳香族、特にメチル、エチル、シクロヘキシル、シクロフェニル、フェニル、またはベンジルであるがこれらに限定されず、Ｘは脱離基である。典型的な脱離基は、塩化物、臭化物及びヨウ化物などのハロゲンであるがこれらに限定されない。
【００９５】
アシル化剤の例は、塩化アセチル、塩化プロピル、塩化シクロヘキサノイル、塩化シクロペンタノイル及び塩化シクロヘプタノイル、塩化ベンゾイル、塩化ヒプリル等に限られないハロゲン化アシル、並びに、無水酢酸、無水プロピオン酸、無水シクロヘキサン酸、無水安息香酸、無水ヒプリル酸等の無水物を含む。好ましいアシル化剤は、塩化ベンゾイル、塩化ヒプリル、塩化アセチル、塩化シクロヘキサノイル、塩化シクロペンタノイル、及び塩化シクロヘプタノイルを含む。
【００９６】
アミン基も、アミノ酸、特にフェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン等の親水性アミノ酸のカルボジイミド誘導体を用いたカルボン酸との反応によって修飾することができる。さらなる例は、ジシクロヘキシルカルボジイミド等を含む。
【００９７】
アミノ酸が多官能性であるとき、即ち、−ＯＨ、ＮＨ2または−ＳＨ基を１以上有するとき、その１以上の官能基をアシル化して、例えば、エステル、アミド、またはチオエーテル結合を形成してもよい。
【００９８】
例えば、多数アシル化されたアミノ酸の調製において、アミノ酸は、例えば水酸化ナトリウムまたはカリウム等の金属水酸化物のアルカリ溶液に溶解し、アシル化剤を添加する。反応時間は約１時間から約４時間であり、好ましくは約２から２．５時間である。混合物の温度は、一般的には約５℃から約７０℃、好ましくは約１０℃から約５０℃に維持する。アミノ酸のアミノ基１当量当たりに用いるアルカリの量は、通常は約１．２５ｍｏｌから約３ｍｏｌ、好ましくはＮＨ2基１当量当たり約１．５ｍｏｌから２．２５ｍｏｌである。反応溶液のｐＨは、通常は、約ｐＨ８から約ｐＨ１３、好ましくは約ｐＨ１０から約ｐＨ１２である。アミノ酸の量に応じて用いるアミノ修飾剤の量は、アミノ酸のフリーＮＨ2基もモル数に基づく。一般に、アミノ修飾剤は、アミノ酸の全フリーＮＨ2基の１モル当量当たり、約０．５から約２．５モル当量、好ましくは約０．７５から約１．２５モル当量である。
【００９９】
修飾アミノ酸形成反応は、濃塩酸等の適当な酸で混合物のｐＨを約２から約３まで調製することによって停止する。混合物は室温で分離し、上方の透明層と下方のオフホワイト沈殿物を生成する。上層を廃棄し、濾過及びデカンテーションによって修飾アミノ酸を回収する。残った修飾アミノ酸は、次いで水と混合する。不溶性物質を濾過で取り除き、濾過物を真空乾燥する。修飾アミノ酸の収率は、一般的に約３０％から６０％であり、通常は約４５％である。本発明は、例えばジアシル化、トリアシル化といった多数アシル化されたアミノ酸も考慮する。
【０１００】
アミノ酸エステルまたはアミドが出発物質である場合、ジメチルホルムアミドまたはピリジンなどの適当な溶媒に溶解し、約５℃から約７０℃、好ましくは約２５℃の温度で、約７から約２４時間の間、アミノ修飾剤と反応させる。アミノ酸エステルに対して用いるアミノ修飾剤の量は、アミノ酸について上気したのと同様である。
【０１０１】
その後、反応溶媒を負圧で除去し、任意に、修飾アミノ酸を適当なアルカリで加水分解してエステルまたはアミド官能性を除去してもよい。例えば、１Ｎの水酸化ナトリウムを用い、約５０℃から約８０℃で、好ましくは約７０℃で、エステル基が加水分解されたフリーなカルボキシル基を有する修飾アミノ酸が生成されるのに充分な時間処理する。加水分解混合物は、次いで室温に冷却して、例えば２５％塩酸水溶液でｐＨが約２から約２．５となるまで酸性化する。修飾アミノ酸、溶液から沈降し、濾過、デカンテーションなどの従来の手段で回収する。
【０１０２】
修飾アミノ酸は、酸沈降、再結晶、または固体カラム支持体上での分離によって精製してもよい。分離は、酢酸／ブタノール／水を移動相として用いたシリカゲル、アルミナ等の適当なカラム支持体上、トリフルオロ酢酸／アセトニトリル混合物を移動相とする反転相カラム支持体、及び水を移動相とするイオン交換クロマトグラフィーで行うことができる。修飾アミノ酸は、メタノール、ブタノールまたはイソプロパノールなどの低級アルコール抽出で無機塩を除去して精製してもよい。
【０１０３】
修飾アミノ酸は、一般にアルカリ水溶液（ｐＨ＞９．０）に可溶であり、エタノール、ｎ−ブタノール及びトルエン／エタノールの１：１（ｖ／ｖ）溶液に一部溶解し、中性の水に不溶である。アミノ酸誘導体の例えばナトリウム塩等のアルカリ金属塩は、一般に約ｐＨ６−８の水に可溶である。
【０１０４】
ポリアミノ酸またはペプチドにおいて、１以上のアミノ酸を修飾（アシル化）してもよい。修飾ポリアミノ酸及びペプチドは、１以上のアシル化アミノ酸を含んでよい。線状ポリアミノ酸及びペプチドは、一般的にはただ１つのアシル化アミノ酸を含むが、他のポリアミノ酸及びペプチドのコンフィギュレーションは、１以上のアシル化アミノ酸を含む。ポリアミノ酸及びペプチドは、アシル化アミノ酸と重合可能であり、重合の後アシル化してもよい。
【０１０５】
特に次の化合物を挙げることができる。
【化２６】
【０１０６】
〔スルホン化アミノ酸複合体形成摂動剤〕
スルホン化修飾アミノ酸、ポリアミノ酸、及びペプチドは、少なくとも１つのアミン基を、少なくとも１つのフリーなアミン基と反応するスルホン化剤でスルホン化して修飾する。
【０１０７】
特に、以下の式の化合物を挙げることができる。
【化２７】
Ａｒ−Ｙ−（Ｒ24）n−ＯＨ ＬＶここで、Ａは置換または非置換のフェニルまたはナフチルであり、
【化２８】
ここで、Ｒ25は、Ｃ1−Ｃ24アルキル、Ｃ1−Ｃ24アルケニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、及びナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）であり、
Ｒ25は任意に、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4アルケニル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、及びＣＯ2Ｒ27、またはこれらの組合せで置換されていてもよく、
Ｒ27は水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ1−Ｃ4アルケニルであり、
Ｒ25は任意に、酸素、窒素、硫黄またはこれらの組合せで分断されていてもよく、そして、
Ｒ26は、水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ1−Ｃ4アルケニルである。
【０１０８】
好ましくは、スルホン化アミノ酸を調製するのに有用なスルホン化剤の例は、式Ｒ28−ＳＯ2−Ｘを有するスルホン化剤であり、Ｒ28はアルキル、アルケニル、シクロアルキルまたは芳香族に限られない調製される修飾アミノ酸に適当な基であり、Ｘは上述のような脱離基であるが、これらに限定されない。スルホン化剤の１つの例は塩化ベンゼンスルホニルである。
【０１０９】
修飾ポリアミノ酸及びペプチドは、、１以上のスルホン化アミノ酸を有する。
線状ポリアミノ酸及びペプチドは、一般的にはただ１つのスルホン化アミノ酸を含むが、他のポリアミノ酸及びペプチドのコンフィギュレーションは、１以上のスルホン化アミノ酸を含む。ポリアミノ酸及びペプチドは、スルホン化アミノ酸と重合可能であり、重合の後スルホン化してもよい。
【０１１０】
〔修飾アミノ酸誘導体複合体形成摂動剤〕
修飾アミノ酸、ポリアミノ酸、またはペプチド誘導体は、少なくとも１つのアルデヒドまたはケトンに変換したアシル末端を有し、少なくとも１つのフリーなアミン基が、存在する少なくとも１つのフリーなアミン基と反応するアシル化剤でアシル化されたアミノ酸、ポリアミノ酸、またはペプチドである。
【０１１１】
アミノ酸、ポリアミノ酸、ペプチド誘導体は、アミノ酸エステルまたはペプチドを適当な還元剤で還元することにより容易に調製される。例えば、アミノ酸、ポリアミノ酸、またはペプチドの無水物は、R．Chen，Biochemistry，1979，18, 921-926 に記載されているように調製できる。アミノ酸、ポリアミノ酸、またはペプチドのケトンは、Organic Synthesis，Col．Vol．IV，Wiley，(1963)，5頁に記載された方法によって調製できる。アシル化については既に述べた。
【０１１２】
例えば、誘導体は、単一のアミノ酸、ポリアミノ酸またはペプチド誘導体、または２以上のアミノ酸、ポリアミノ酸またはペプチド誘導体の混合物を、アシル化剤または誘導体に存在するアミノ部分と反応してアミドを形成するアミン修飾剤と反応させて調製される。アミノ酸、ポリアミノ酸、またはペプチドは、修飾してから誘導してもよく、誘導してから修飾しても良く、修飾と誘導を同時にしてもよい。当業者に知られた望まない副反応を避けるために保護基を用いてもよい。
【０１１３】
修飾ポリアミノ酸またはペプチド誘導体では、１以上のアミノ酸が誘導体化（アルデヒドまたはケトン）及び／または修飾（アシル化）されてもよいが、少なくとも１つの誘導体及び少なくとも１つの修飾がなければならない。
【０１１４】
特に、修飾アミノ酸誘導体、Ｎ−シクロヘキサノイル−Ｐｈｅ−アルデヒド、Ｎ−アセチル−Ｐｈｅ−アルデヒド、Ｎ−アセチル−Ｔｙｒ−ケトン、Ｎ−アセチル−Ｌｙｓ−ケトン及びＮ−アセチル−Ｌｅｕ−ケトン、及びＮ−シクロヘキサノイルフェニル−アラニン−アルデヒドを挙げることができる。
【０１１５】
〔カルボン酸複合体形成摂動剤〕
種々のカルボン酸及びコレラのカルボン酸の塩が、複合体形成摂動剤として使用できる。これらのカルボン酸は以下の式で表される。
【化２９】
ここで、Ｒ29は、Ｃ1−Ｃ24アルキル、Ｃ2−Ｃ24アルケニル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルケニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）フェニル、（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）ナフチル、（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、フェニル（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、及びナフチル（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）であり、Ｒ29は任意に、Ｃ1−Ｃ10アルキル、Ｃ2−Ｃ10アルケニル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、及びＣＯ2Ｒ30、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルケニル、３−１０の環原子を持つヘテロ環アルキルであってヘテロ原子がＮ、Ｏ、Ｓ、またはこれらの組合せであるもの、アリール、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）アリール、アリール（Ｃ1−Ｃ10）アルキル、またはこれらの組合せで置換されていてもよく、Ｒ29は任意に、酸素、窒素、硫黄またはこれらの組合せで分断されていてもよく、そして、Ｒ30は、水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ2−Ｃ4アルケニルである。
【０１１６】
好ましいカルボン酸は、シクロヘキサンカルボン酸、シクロペンタンカルボン酸、シクロヘプタンカルボン酸、ヘキサン酸、３−シクロヘキサンプロピオン酸、メチルシクロヘキサンカルボン酸、１，２−シクロヘキサン時カルボン酸、１，３−シクロヘキサン時カルボン酸、１，４−シクロヘキサンジカルボン酸、１−アダマンタンカルボン酸、フェニルプロピオン酸、アジピン酸、シクロヘキサンペンタン酸、シクロヘキサンブタン酸、ペンチルシクロヘキサン酸。２−シクロペンタンヘキサン酸、シクロヘキサンペンタン酸、ヘキサンジオイック酸、シクロヘキサンブタン酸、及び（４−メチルフェニル）シクロヘキサン酢酸である。
【０１１７】
〔複合体形成摂動剤の他の例〕
ここで記載する超分子複合体を形成できる全ての複合体形成摂動剤が本発明の範囲に入り、複合体形成摂動剤の他の例は、２−カルボキシメチル−フェニルアラニン−ロイシン；２−ベンジルケイヒ酸、アクチノニン、フェニルスルホニルアミノフェニルブタン酸を含むが、これらに限定されない。
【化３０】
【０１１８】
〔模倣物〕
本発明の範囲内にある模倣物は、元のものと構造的及び／または機能的に等価な構造体である。超分子複合体及び活性薬の可逆的に送達可能な中間状態の構造的及び／または化学機能的模倣物は、適当な化学的及び／または構造的性質を有する非−ペプチド模倣物が調製できる場合は、ペプチドである必要はない。しかし、好ましい模倣物はペプチドであり、超分子または中間状態とは異なる一次構造を有するが、超分子複合体または中間状態と同じ二次構造及び三次構造を有する。模倣物は、天然状態または中間状態の活性薬または超分子複合体より生物学的活性は小さいが、模倣物は、例えば経口送達の可能性の向上といった天然の状態が有しない他の重要な性質を具備する。
【０１１９】
このような模倣物を調製する方法は、例えば以下の文献に記載されている。
Yamazaki，Chirality，3: 268-276(1991); Wiley，Peptidomimetics Derivered From Natural Products，Medicinal Research Reviews，Vol．13，No.3，327-384(1993)，Gurrath，Eur．J．Biochem，210，991-921(1992)，Yamazaki，Int．J．Peptide Protein Res.，37，364-381(1991)，Bach，Int．J．Peptide Protein Res.，38，314-323(1991)，Clark，J．Med．Chem．32，2026-2038(1989)，Portoghese，L.Med．Chem.，34，(6)1715-1720(1991)，Zhou，J．Immunol.，149，(5)，1763-1769(1992,9,1)，Holzman，J.Protein Chem.，10，(5)，553-563(1991)，Masler，Arch．Insect Biochem．and Physiol.，22，87-111，(1993)，Saragovi，Biotechnology，10，(1992，6)，Olmsteel，J.Med．Chem.，36(1)，179-180(1993)，Malin，Peptides，14，47-51(1993)，及び Kouns，Blood，80(10)，2539-2537(1992)，Tanaka，Biophys．Chem.，50，48-61(1994)，DeGrado，Science，243，(1989，2，3)，Regan，Science，241，976-978(1988，8，19)，Matouscek，Nature，340，120126(1989，7，13)，Parker，Peptide Research，4(6)，347-354(1991)，Parker，Peptide Research，4(6)，355-363(1991)，Federov，J．Mol．Biol.，225，927-931(1992)，Ptitsyn，Biopolymers，22，15-25(1983)，Ptitsyn，Protein Engineering，2(6)，443-447(1989)。
【０１２０】
例えば、タンパク質構造は構成アミノ酸の分子間−及び分子内−相互作用によって決定される。αヘリックスにおいて、ヘリックスの第１及び第４のアミノ酸は、非共有結合で互いに相互作用する。このパターンは、最初の４個及び最後の４個のアミノ酸を除く全てのヘリックスを通じて繰り返される。さらに、アミノ酸の側鎖は、互いに相互作用する。例えば、フェニルアラニンのフェニル側鎖は、そのフェニルアラニンがヘリックス中に存在するときには溶媒に曝されないであろう。
【０１２１】
このフェニルアラニンの相互作用がヘリックスの安定性に寄与するのであれば、フェニルアラニンをアラニンに置換することはヘリックスを乱して、タンパク質のコンフォメーションを変化させる。
【０１２２】
従って、最初に、どのアミノ酸の側鎖が溶媒に曝され、そしてそれにより生来の状態の安定化に寄与することから除外されるかを、例えばスキャンニング突然変異誘発法によって決定することによって、模倣体を作り出すことができる。それらと同じ格好でアミノ酸置換基を有する突然変異体を作り出し、置換されたアミノ酸が生来に近いものよりもより中間体に近いタンパク質コンフォメーションを付与するようにすることができる。適切な構造が合成されたことの確認は、スペクトル法及びその他の分析法によってもたらされる。
【０１２３】
〔送達組成物〕
上述の超分子複合体を含む送達組成物は、典型的には摂動剤を活性薬に混合して調製される。成分は、投与前に調製でき、投与の直前にも調製できる。
【０１２４】
本発明の送達組成物は、１以上の酵素阻害剤を含んでもよい。このような酵素阻害剤はアクチノニンまたはその誘導体を含むがそれらに限定されない。これらの化合物は以下の構造を有する。
【化３１】
【化３２】
【０１２５】
これらの化合物の誘導体は、U.S.Patant No．5,206,384 に開示されている。アクチノニン誘導体は次の構造を有する。
【化３３】
ここで、Ｒ31は、カルボキシアミド、ヒドロキシアミノカルボニル及びアルコキシカルボニル基から選択されるスルホキシメチルまたはカルボキシまたは置換カルボキシ基であり、Ｒ32はヒドロキシ、アルコキシ、ヒドロキシアミノ、またはスルホキシアミノ基である。他の酵素阻害剤は、アプロチニン(Trasylol)及びボーマンーバーク阻害剤を含むが、これらに限定されない。
【０１２６】
本発明の送達組成物は、１以上の賦形剤、希釈剤、崩壊剤、潤滑剤、柔軟剤、着色剤、または投与溶媒(dosing vehicle)を含んでもよい。好ましい投与単位は、経口投与量単位である。最も好ましい投与形態単位は、錠剤、カプセル、または液体であるが、これらに限定されない。投与量単位は、生物学的、製薬的、または治療的に有効量の活性薬を含有し、多数回投与形態単位で、合計が投与されるようにしてもよい。投与形態は、この分野での従来方法によって調製できる。
【０１２７】
本発明は、生物学的活性薬を、トリ等の動物、霊長類、特にヒトなどの哺乳類、及び昆虫に投与するのに有効である。このシステムは、活性薬が標的領域（活性薬が送達されるべき領域）に到達するまでに出会う環境、投与される動物の身体の条件によって破壊または活性低下するような化学的及び生物学的活性薬の送達に特に有利である。特に、本発明は、特に通常は経口送達不可能な活性薬の経口投与に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２８】
〔好ましい実施態様の説明〕
以下の実施例は本発明を例示するが、何ら限定はしない。全ての部及び比率は、特に断らない限り重量％である。
【０１２９】
[実施例１] α-インターフェロン未変性ゲル
未変性勾配ゲル（Pharmacia）に、６４７μｇ／ｍｌのα-インターフェロン（Intron-A-Schering Plough）および増化した量（１０−５００ｍｇ／ｍｌ）の摂動剤(perturbant)（ベンゼンスルホニルクロリドで修飾されたＬ-バリン、Ｌ-ロイシン、Ｌ-フェニルアラニン、Ｌ−リシンおよびＬ-アルギニンの混合物）（バリン−７．４％、ロイシン−１６．５％、フェニルアラニン−４０．３％、リシン−１６．２％およびアルギニン１９．６％）とを流した。充填用６／４コーム(comb)を用いて、ゲルに４μｌの材料を充填した。
【０１３０】
結果は、図１に示されている。
レーン１＝高分子量マーカー（Bio-Rad）−１：２０希釈ｗ／ｄＨ2Ｏ−（５μｌ-＞１００μｌ）。
レーン２＝α-インターフェロンＡ（６４７μｇ／ｍｌ）対照５μｌ＋５μｌブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）−（１．２９μｇ充填）。
レーン３＝α-インターフェロン＋摂動剤（１０ｍｇ／ｍｌ）−５０μｌα-インターフェロン＋５０μｌＢＰＢ＝１００μｌ（１．２９μｇ充填）。
レーン４＝α-インターフェロン＋摂動剤（５０ｍｇ／ｍｌ）−５０μｌα-インターフェロン＋５０μｌＢＰＢ＝１００μｌ（１．２９μｇ充填）。
レーン５＝α-インターフェロン＋摂動剤（１００ｍｇ／ｍｌ）−５０μｌα-インターフェロン＋５０μｌＢＰＢ＝１００μｌ（１．２９μｇ充填）。
レーン６＝α-インターフェロン＋摂動剤（５００ｍｇ／ｍｌ）−５μｌα-インターフェロン＋５μｌＢＰＢ＝１０μｌ（１．２９μｇ充填）。
【０１３１】
[実施例１Ａ] α-インターフェロン未変性勾配ゲル
摂動剤を、３０００分子量遮断フィルターを通して分画された、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシンおよびフェニルアラニン（Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｅ−Ｐｈｅ）の温度凝縮産物に置換して実施例１の方法を行った。
【０１３２】
結果は図２に示されている。
サンプル
レーン１＝高分子量マーカー（Bio-Rad）。
レーン２＝α-インターフェロンＡ（６４７μｇ／ｍｌ）-５μｌ＋５μｌＢＰＢ 対照。
レーン３＝α-インターフェロン＋摂動剤（１０ｍｇ／ｍｌ）−５０μｌ＋５０μｌＢＰＢ＝１００μｌ。
レーン４＝α-インターフェロン＋摂動剤-５０μｌ＋５０μｌＢＰＢ＝１００μｌ。
レーン５＝α-インターフェロン＋摂動剤（１００ｍｇ／ｍｌ）−５０μｌイントロンＡ＋５０μｌＢＰＢ＝１００μｌ。
レーン６＝α-インターフェロン＋摂動剤（５００ｍｇ／ｍｌ）−５μｌイントロンＡ＋５０μｌＢＰＢ＝１００μｌ。
【０１３３】
実施例１および１Ａは、α-インターフェロンのみ（図１および２のレーン２）が、適切な分子量（約１９０００ダルトン）にバンドを提示したことを表している。固定された濃度のα-インターフェロンに対して、添加された摂動剤の量が各レーン毎に増加するにつれ、α-インターフェロンは、高いと言うよりは、より低い分子量へと移動する。実施例１の摂動剤に見られる変化は、実施例１Ａの摂動剤に見られるものより明らかである。これは、α-インターフェロンの構造が二つの異なる摂動剤によって変化したことを示している。これは、もし構造が変化していなかったら、活性剤と摂動剤の複合体としてより高い分子量へとシフトするからである。
【０１３４】
［実施例２］α-インターフェロンと摂動剤のラットへの経口投与
オスのSprague-Dawleyラット（平均体重は約２５０ｍｇ）を、寝具のない金網の上で夜通し絶食させた。投与する前に、皮下にケタミン／トラジン(thorazine)の組み合わせを注入して動物を麻酔した。実施例１に基づいて調製した組成物の投与溶液を、５００μｇ／ｋｇで、投与溶液を含む１ｃｃのシリンジに取り付けられた１０−１２ｃｍのゴム製カテーテルを介して経口栄養摂取的(via oral gavage)に投与した。血液サンプルは、所望の時間に尾の静脈から採取した。血清を調製し、アッセイするまで−７０℃に凍結させた。血清サンプルをＥＬＩＳＡでアッセイした（Biosource International，Camarillo，CA，Cytoscreen Immunoassay KitTM，Catalog #ASY-05 for human IFN-α）。
【０１３５】
結果は図３に示されている。
【０１３６】
［実施例２Ａ］α-インターフェロンと摂動剤のラットへの経口投与
実施例１Ａに基づいて調製した組成物の７８μｇ／ｋｇの投与溶液に置換して、実施例２の方法を行った。結果は図３に示されている。
【０１３７】
［比較例２*］α-インターフェロンのラットへの経口投与
摂動剤を含まない１００μｇ／ｋｇのα-インターフェロンを実施例２の方法に基づいて投与した。
結果は、図３に示されている。
【０１３８】
［実施例３］サケカルシトニンおよび摂動剤のラットへの経口投与
実施例１の摂動剤を蒸留水で戻し、ＨＣｌもしくはＮａＯＨでｐＨを７．２−８．０に調節した。サケカルシトニン（ｓＣｔ(salmon calcitonin)）をクエン酸ストック溶液（０．０８５Ｎ）に溶かし、摂動剤溶液と組み合わせて最終的な投与溶液を得た。摂動剤とＳＣｔの終濃度は、それぞれ４００ｍｇ／ｍｌと５μｇ／ｍｌであった。
【０１３９】
結果は以下の表１に示されている。
【０１４０】
体重が１００−１５０ｇの２４時間絶食したオスのSprague-Dawleyラットを、ケタミンで麻酔した。経口栄養摂取的に、８００ｍｇ／ｋｇの摂動剤と１０μｇ／ｋｇのｓＣｔのビヒクルの投与溶液を投与した。投与溶液を１０ｃｍのゴム製カテーテルを用いて投与した。投与から１時間後に、ラットに、１．５ｍｇ／ｋｇのトラジンと４４ｍｇ／ｋｇのケタミンを筋肉注射した。投与から１、２、３および４時間後に、ラットの尾の動脈から血液サンプルを採取し、シグマ診断キット（Catalog #587-A，Sigma Chemical Co，St．Louis，MO）を用いて血清カルシウム濃度を調べた。結果は図４に示されている。
【０１４１】
［実施例３Ａ］
サケカルシトニンおよび摂動剤のラットへの経口投与 摂動剤として塩化シクロヘキサノイルで修飾されたＬ-チロシンに置換して、実施例３の方法を行った。
結果は図４に示されている。
【０１４２】
［比較例３* ］
摂動剤を含まないサケカルシトニン（１０μｇ／ｋｇ）を、実施例３の方法に基づいてラットに投与した。
結果は図４に示されている。
【０１４３】
［実施例４］等温下の滴定熱量測定
２．４ｍＭの実施例１の摂動剤と０．３ｍＭのｓＣｔの投与組成物を調製し、等温下の滴定熱量測定（isothermal titration calorimetry）をｐＨ６．５とｐＨ４．５で行った。ｐＨ６．５のバッファーは３０ｍＭＨｅｐｅｓ−３０ｍＭＮａＣｌであり、ｐＨ４．５のバッファーは３０ｍＭ酢酸ナトリウム−３０ｍＭＮａＣｌであった。
全ての実験は、滴下シリンジ中の８．０ｍＭ摂動剤と熱量計セル中の１．０ｍＭカルシトニンを用いて３０℃で行った。全ての実験において、摂動剤の１５ｘ１０μｌの増加量を、滴下と滴下の間に２分間の平衡化を行いながら、１０秒ずつ添加した。
結果は、滴下用シリンジに摂動剤（８ｍＭ）を入れ、当量の増量をｐＨ４．５バッファー（ｓＣｔ含まず）に添加した実験と、摂動剤を滴下用シリンジに入れ、１０μｌの増量をｐＨ６．５バッファー（ｓＣｔ含まず）に添加した実験で確認された。滴定曲線はこれらの実験からは得られず、この結果は、摂動剤の混合および／または希釈による熱は無視してよいことを示した。それゆえ、実験的等温式は、バックグラウンドを引くことによって補正されなかった。
【０１４４】
結果は以下の表１に示されている。
【０１４５】
［実施例４Ａ］
実施例１Ａの摂動剤を置換して、実施例４の方法を行った。結果は、摂動剤を滴下用シリンジに入れ、当量の増量をｐＨ４．５バッファー（ｓＣｔ含まず）に添加した実験で確認された。
実施例１Ａの摂動剤を置換して、実施例４の方法を行った。結果は、摂動剤を滴下用シリンジに入れ、当量の増量をｐＨ４．５バッファー（ｓＣｔ含まず）に添加した実験で確認された。
結果は、以下の表１に示されている。
【０１４６】
【表１】
１ 熱量測定実験は、本質的に、You, J.L., Scarsdale, J.N., とHarris, R. B., J. Prot. Chem. 10: 301-311, 1991; You, Junling, Page, Jimmy D., Scarsdale, J. Neel, Colman, Robert W., とHarris, R. B., Peptides 14: 867-876, 1993; Tyler-Cross, R., Sobel, M., Soler, D.F., とHarris, R. B., Arch. Biochem. Biophys. 306: 528-533, 1993; Tyler-Cross, R., Sobel, M., Marques, D., とHarris, R. B., Protein Science 3: 620-627, 1994. に詳説されているようにして行った。
【０１４７】
［実施例５］α-インターフェロンのＧｕＨＣｌ変性
ｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中の９．１ｍｇ／ｍｌのα-インターフェロン（Schering Plough Corp.）のストック溶液を調製した。リン酸ナトリウムバッファーと１０Ｍグアニジンヒドロクロリド（ＧｕＨＣｌ）（Shigma Chemical Co．-St．Louis，MO）ストック溶液でα-インターフェロンを希釈することによって、種々の濃度のＧｕＨＣｌで２００μｇ／ｍｌ濃度のα-インターフェロンとなるようにサンプルを調製した。測定の前に室温で約３０分間インキュベーションすることによって、希釈サンプルを平衡化した。
蛍光の測定は、日立Ｆ−４５００を用いて２５℃で行った。タンパク質トリプトファン蛍光は、２９８ｎｍの励起波長と３４３ｎｍの発光波長で観察された。
ＡＮＳ（１−アニリノナフタレン−８−スルホナート）蛍光は、３５５ｎｍの励起波長と５３０ｎｍの発光波長で観察された。全ての蛍光測定において、５ｎｍ励起および発光の両方のために５ｎｍのスペクトルバンドパス(spectral bandpass)を選択した。
結果は図５に示されている。
【０１４８】
［実施例６］α-インターフェロン形状におけるＧｕＨＣｌの濃度効果
ＧｕＨＣｌの５Ｍストック溶液を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２バッファーを用いて調製した。希釈後、ストック溶液のｐＨをチェックし、濃塩酸で調節した。最終的な溶液の濃度を調べるために、Yasuhiko NozakiによるMethod in Enzymology，Vol.6，第４３頁に記載された屈折率を用いた。
α-インターフェロンストック（９．１ｍｇ／ｍｌ）を十分な量のＧｕＨＣｌと混合して、以下の表１Ａの濃度を得た。
【０１４９】
【表２】
【０１５０】
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）を行い、その結果は図６に示されている。
【０１５１】
［実施例７］内在性トリプトファン蛍光で測定されるイントロンＡのｐＨ滴定
ｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー(Schering Plough Corp.)中に９．１ｍｇ／ｍｌのα-インターフェロンのストック溶液を調製した。以下のバッファー：ｐＨ２および１２のグリシン、ｐＨ３、４、５、７のリン酸ナトリウムおよびｐＨ８のホウ酸を用いて種々のｐＨ値で緩衝化された溶液中に２００μｇ／ｍｌの濃度までα-インターフェロンを希釈することによりサンプルを調製した。これらのバッファーを、Gerald D．Fasman，1990により編集されたPractical Handbook of Biochemistry and Molecular Biologyに記載されている通りに調製した。希釈サンプルを、測定前に室温で約３０分間インキュベートすることによって平衡化した。
蛍光を実施例５の方法に基づいて測定した。結果は図７に示されている。
【０１５２】
[実施例８] ＡＮＳ蛍光によって測定されたインシュリンのｐＨ滴定
１ｍｌの脱イオン水に２ｍｇのインシュリンを溶解することによって、ストック溶液を調製した。１０ｍｌの脱イオン水に１０ｍｇを溶かして１−アニリノナフタレン−８−スルホナート（ＡＮＳ）ストック溶液を調製した。以下のバッファー：ｐＨ２および１２のグリシン、ｐＨ３、４、５、７のリン酸ナトリウムおよびｐＨ８のホウ酸を用いて種々のｐＨ値で緩衝化された溶液中に２００μｇ／ｍｌの濃度までインシュリンを希釈することによりサンプルを調製した。これらのバッファーを、Gerald D．Fasman，1990により編集されたPractical Handbook of Biochemistry and Molecular Biologyに記載されている通りに調製した。最終的なＡＮＳ濃度は９０μｇ／ｍｌであった。希釈サンプルを、測定前に室温で約３０分間インキュベートすることによって平衡化した。
蛍光を実施例５の方法に基づいて測定した。結果は図８に示されている。
【０１５３】
[実施例９] ｐＨ２および７．２におけるα-インターフェロンの円偏光二色性スペクトルの可逆性
α-インターフェロンの円偏光二色性スペクトルをｐＨ７．２で引き起こした。次いで、溶液のｐＨをｐＨ２に再調節し、サンプルを再度スキャンした。次いで、サンプル溶液を７．２に再調節して、再度スキャンした。
α-インターフェロンの濃度は９．２μＭすなわち０．１７８４８ｍｇ／ｍｌであった（［ＩＦＮ］ストック＝９．１ｍｇ／ｍｌ）。使用したバッファーは、ｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸ナトリウムと、ｐＨ２．０の２０ｍＭグリシンであった。
ｐＨ７．２への転換により、天然構造が完全に回復し、中間状態の可逆性を示した。天然の状態と中間の状態との間のエネルギー差が小さいと思われる。
結果は図９Ａと９Ｂに示されている。
【０１５４】
[実施例１０] ７．２におけるα-インターフェロンの円偏光二色性スペクトル −ｐＨ依存性
種々のｐＨにおけるα-インターフェロンの規則的な二次構造の程度を、遠ＵＶレンジにおける円偏光二色性（ＣＤ）測定により調べた。インターフェロンストックの大きな希釈ファクター（〜５０倍）により、サンプルを適切なｐＨにした。α-インターフェロンの濃度は９．２μＭすなわち０．１７８４８ｍｇ／ｍｌであった（［ＩＦＮ］ストック＝９．１ｍｇ／ｍｌ）。使用したバッファーは、ｐＨ６．０および７．２の２０ｍＭリン酸ナトリウム；ｐＨ３．０、４．０、４．５、５．０そして５．５のＮａＡｃ；並びに、ｐＨ２．０の２０ｍＭグリシンであった。
【０１５５】
二次構造の内容を、ＣＤ曲線を４つの主要構造部：すなわちα-ヘリックス、β-シート、ターン、およびランダムコイルに分けるいくつかの適切なプログラムを用いて評価した。これらのプログラムの二つには、分析のためのＣＤ装置が備えられている。第一のプログラムは７つの対照タンパク質：すなわち、ミオグロビン、リゾザイム、パパイン、チトクロムＣ、ヘモグロビン、リオヌクレアーゼＡおよびキモトリプシンを用いている。第二のプログラムは、Yang.REF参照ファイルを用いている。
【０１５６】
第三のプログラムＣＣＡＦＡＳＴは、コンベックス・コンストレイント・アルゴリズム(Convex Constraint Algorithm)を用いており、“コンベックス・コンストレイント・アルゴリズムを用いたタンパク質の円偏光二色性スペクトル分析：実践ガイド(Analysis of Circular Dichroism Spectrum of Proteins Using the Convex Constraint Algorithm: A Practical Guide)”(A．Perczel，K．ParkとG.D.Fasman（1992）Anal．Biochem．203:83-93)。に記載されている。
【０１５７】
ｐＨボリューム（２．０−７．２）の範囲中の遠ＵＶスキャンのデコンボリューションは、ｐＨ３．５における二次構造の顕著な圧縮を示す。近ＵＶスキャンは、３次構造充填の崩壊を示唆し、遠ＵＶスキャンは、このｐＨにおいてまだ重要な二次構造があることを示唆する。
【０１５８】
結果は図１０に示されている。
【０１５９】
[実施例１１] インシュリンと濃度を増加したＧｕＨＣｌのＤＳＣ
ＤＳＣを、５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．５中の６ｍｇ／ｍｌインシュリン（分子量が６０００と仮定すれば０．８３ｍＭ）を用いて行った。各サーモグラムは、０．６Ｍグアニジン−リン酸バッファー溶液のバックグラウンドを引くことによって補正した。
インシュリンを５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．５中に濃縮ストック溶液として新鮮に調製し、適切な分注量をバッファーに希釈し、２ミクロンＰＴＦＥフィルターで濾過し、少なくとも２０分間脱気した。
スキャニング熱量測定(scanning calorimetry)を、５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．５１ミリリットル当たり５ｍｇ０．８３ｍＭブタインシュリンを用いて行った。全てのサーモグラムは、１℃／分のアップスケールモードで操作された（９０℃まで）ＤＡ２データ獲得システムを備えたMicrocal MC-2スキャニング熱量測定計で行われ、データポイントは２０分毎に集められた。全てのスキャンは、活性剤に観察されたトランジションより少なくとも２０度低いところから開始された。全てのサーモグラムは、ベースラインを引いて補正され、高分子の濃度が正常化された。Johns Hopkins Biocalorimetry Centerの方法に基づき、例えばRamsayら．Biochemistry（1990）29: 8677-8693; Schonら．Biochemistry（1989）28: 5019-5024(1990)29: 781-788を参照。ＤＳＣデータ分析ソフトウェアは、熱誘導高分子融解プロファイルの統計力学的デコンボリューションに基づいている。
ＧｕＨＣｌの構造に与える効果は、各溶液を、５Ｍストック溶液から０．５−２Ｍの範囲の濃度に希釈された変性剤を含有する、リン酸バッファー、ｐＨ７．５に調製したＤＳＣ実験で評価された。
結果は以下の表２に示されている。
【０１６０】
【表３】
【０１６１】
[実施例１２] インシュリンのＤＳＣスペクトルに対するイオン強度の効果
６ｍｇ／ｍｌのインシュリン（５０ｍＭリン酸バッファー中に０．８３ｍＭ、ｐＨ７．５、０．２５、０．５もしくは１．０ＭのＮａＣｌを含む）を含有するサンプルを用いた。サーモグラムを実施例１１の方法に従って行い、上述したように０．５ＭのＮａＣｌ−リン酸バッファーブランクを差し引くことによって補正した。
イオン強度の増加が構造に与える効果を、ＮａＣｌを０．２５−３Ｍの範囲の濃度で含むように各溶液を調製したＤＳＣ実験で評価した。
結果は、以下の表３に示されている。
【０１６２】
【表４】
【０１６３】
[実施例１２Ａ] ｒｈＧｈのＤＳＣスペクトルに与えるイオン強度の効果
インシュリンに代えて、０．５もしくは１．０ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸バッファー、ｐＨ７．５中の５ｍｇ／ｍｌの組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧｈ）（ＨＧＨのＭ２２１２８に基づいて２２５μＭ）を用いて実施例１１の方法を行った。サーモグラムは、０．５ＭＮａＣｌ−リン酸バッファーブランクを差し引くことによって補正された。
結果は以下の表４に示されている。
【０１６４】
【表５】
【０１６５】
[実施例１３] ｒｈＧＨのＤＳＣスペクトルに対するｐＨの影響
５ｍｇ／ｍｌのｒｈＧｈをバッファーに溶解した（分子量を２００００と仮定すれば５０ｍＭリン酸バッファー中に０．１７ｍＭ）。溶液のｐＨを所望の値に調節し、全ての曲線を、ベースラインを差し引いて補正した。
ｐＨ値が２．０〜６．０の範囲のリン酸バッファーに各溶液を調製した実施例１１の方法に基づくＤＳＣによって、構造に対するｐＨの効果を評価した。
結果を以下の表５に示す。
【０１６６】
【表６】
【０１６７】
[実施例１４] ｒｈＧｈのＤＳＣスペクトルに与えるＧｕＨＣｌの影響
最初のスキャンをＧｕＨＣｌの非存在下で１０ｍｇ／ｍｌで行った（分子量を２００００と仮定して０．３３ｍＭ）。次いで、ｒｈＧｈの濃度を、種々の濃度のＧｕＨＣｌを含む５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．５中に５ｍｇ／ｍｌ（０．１７ｍＭ）となるまで下げた。サーモグラムを、０．５Ｍのグアニジン−リン酸バッファー溶液のバックグラウンドを差し引くことによって補正した。サーモグラムを０．５ＭのＮａＣｌ−リン酸バッファーブランクを差し引くことによって補正した。スキャンを、実施例１１の方法に従って行った。
結果を以下の表６に示す。
【０１６８】
【表７】
【０１６９】
[実施例１５] α-インターフェロンのコンホメーションのｐＨ依存性
α-インターフェロンストック（９．１ｍｇ／ｍｌ）を０．６ｍｇ／ｍｌの濃度までバッファーで希釈した。サンプルをバッファー（バッファーに対するα-インターフェロンの体積比は１：４０００）で夜通し透析した。吸光計数が与えられていないので、使用したサンプルの濃度を、透析前後のサンプルの吸収スペクトルを比較することによって決定した。それぞれのｐＨに対して、既知の濃度の未透析のα-インターフェロンの吸収を２８０ｎｍで測定した。透析後、タンパク質の欠失、希釈等を説明するために再度吸収を読み取った。バッファーの状態とα-インターフェロンの濃度は以下の通りである。
ｐＨ３．０：バッファー − ２０ｍＭ ＮａＡｃ。 ［ＩＦＮ］＝０．５０ｍｇ／ｍｌ；
ｐＨ４．１：バッファー − ２０ｍＭ ＮａＡｃ。 ［ＩＦＮ］＝０．５３ｍｇ／ｍｌ；
ｐＨ５．０：バッファー − ２０ｍＭ ＮａＡｃ。 ［ＩＦＮ］＝０．３７ｍｇ／ｍｌ；
ｐＨ６．０：バッファー − ２０ｍＭ リン酸ナトリウム。 ［ＩＦＮ］＝０．３７ｍｇ／ｍｌ；
ｐＨ７．２：バッファー − ２０ｍＭ リン酸ナトリウム。 ［ＩＦＮ］＝０．
４８ｍｇ／ｍｌ。
【０１７０】
実施例１１の方法に基づいてＤＳＣスキャンを行った。室温であらゆるｐＨに対して、澄んだ透明なα-インターフェロン溶液が得られたが、温度スキャン後、ｐＨ５．０と６．０において沈殿の顕著な兆候が見られた。
結果を以下の表７に示す。
【０１７１】
【表８】
【０１７２】
[実施例１６] α-インターフェロンのコンホメーションに与えるＧｕＨＣｌの濃度の影響
ＧｕＨＣｌ／α-インターフェロンサンプルを、実施例６の方法に基づいて調製した。ＤＳＣスキャンを、実施例１１の方法に基づいて行った。
結果を以下の表８に示す。
【０１７３】
【表９】
【０１７４】
実施例５−１６は、イオン強度、グアニジンヒドロクロリド濃度、およびｐＨが、活性剤のＴｍに変化をもたらすことを示し、コンホメーションの変化を示唆する。これは、蛍光分光法によって確認された。可逆的中間体のコンホメーション状態は、模倣物（mimetics）を調製するための鋳型として用いることができる。
【０１７５】
[実施例１７] α-インターフェロン中間体状態模倣物の調製
α-インターフェロンの中間体コンホメーション状態を調べた。中間体状態の２次構造および３次構造を備えたペプチド模倣物を調製した。
【０１７６】
[実施例１８] インシュリン中間体状態模倣物の調製
α-インターフェロンをインシュリンに換えて実施例１７の方法を行った。
【０１７７】
[実施例１９] ｒｈＧｈ中間体状態模倣物(Intermediate State Mimetics)の調製
α-インターフェロンを組換えヒト成長ホルモンに換えて実施例１７の方法を行った。
【０１７８】
[実施例２０] α-インターフェロン模倣物のin vivo投与
実施例１７の方法で調製した模倣物を実施例２の方法に基づいてラットに投与した。
【０１７９】
[実施例２１] インシュリン模倣物のin vivo投与
実施例１８の方法に基づいて調製した模倣物に換えて実施例２０の方法を行った。
【０１８０】
[実施例２２] ｒｈＧＨ模倣物のin vivo投与
実施例１９の方法に基づいて調製した模倣物に換えて実施例１９の方法を行った。
【０１８１】
[実施例２４] 内在性トリプトファン蛍光によって測定されたα-インターフェロンの滴定
ｐＨ７．２における２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中の９．１ｍｇ／ｍｌα-インターフェロンのストック溶液を調製した。８００ｍｇの摂動剤（塩化シクロヘキサノイルでアシル化されたＬ-アルギニン）を２ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）に溶かして、摂動剤のストック溶液を調製した。
α-インターフェロンを、リン酸ナトリウムバッファーと種々の摂動剤濃度の摂動剤ストック溶液で希釈することによってサンプルを調製した。希釈されたサンプルを、測定の前に室温で約３０分間インキュベートすることによって平衡化させた。
α-インターフェロンの内在性トリプトファン残基の蛍光を、実施例５の方法に基づいて測定した。摂動剤は蛍光を含んでいなかった。
結果は実施例１１に示されている。
【０１８２】
[実施例２５] ラットへの摂動剤とα-インターフェロンのin vivo投与
α-インターフェロン（１ｍｇ／ｋｇ）と混合された実施例２４の摂動剤（８００ｍｇ／ｋｇ）を含む投与溶液を、実施例２の方法に基づいてラットに投与した。
結果は図１２に示されている。
【０１８３】
[比較例２５*]
実施例２５の方法に基づいて、α-インターフェロン（１ｍｇ／ｋｇ）をラットに投与した。血清サンプルを、実施例２５の方法に基づいて回収およびアッセイした。
結果は図１２に示されている。
【０１８４】
[実施例２６] α-インターフェロンと摂動剤の示差走査熱量測定法
摂動剤結合ＤＳＣをｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーを用いて行った。摂動剤ストック溶液を調製するために乾燥摂動剤を秤量した。α-インターフェロンストックをバッファーに希釈した。全体のセットに対して同じ活性濃度を備えるように、α-インターフェロン溶液は、実験の前に透析しなかった。
ＤＳＣサーモグラムを、０．６４ｍｇ／ｍｌの濃度のα-インターフェロンと５、１０、２５および１００ｍｇ／ｍｌの摂動剤濃度の摂動剤（＞９８％に精製されたフェニルスルホニル-パラ-アミノ安息香酸（スペクトルの作製の前に逆相クロマトグラフィーで調べた））を用いて引き起こした。ＤＳＣを、データの自動収集用のＩＢＭ ＰＣに連結したＤＡＳＭ−４示差走査熱量測定計で行った。スキャン速度は、６０℃／ｈであった。
結果は、以下の表９と実施例１３に示されている。
【０１８５】
[比較例２６*]α-インターフェロンの示差走査熱量測定法
実施例２６の方法を、摂動剤を含まないα-インターフェロンに置き換えて行った。結果は以下の表９と実施例１３示されている。
【０１８６】
【表１０】
【０１８７】
摂動剤の添加濃度が０−１００ｍｇ／ｍｌの範囲をとるＤＳＣスキャンは、濃度に依存して生じるα-インターフェロンの誘導されたコンホメーション変化を示す。１００ｍｇ／ｍｌの摂動剤では、サーモグラムが、α-インターフェロンＣｐ対Ｔｍ曲線が平らな線であることを示唆した。１００ｍｇ／ｍｌの摂動剤で得られた平らなＣｐ対Ｔｍ曲線は、α-インターフェロン分子内の疎水性残基が溶剤に曝されるようになったことを示唆する。摂動剤が、濃度に依存して、α-インターフェロンの構造を変化し得ることは明らかである。
【０１８８】
[実施例２７]透析実験 − 摂動剤と複合体を形成する可逆性
９．１ｍｇ／ｍｌの濃度のα-インターフェロンストック溶液を、α-インターフェロンが０．６ｍｇ／ｍｌの濃度になるまでバッファーで希釈した。実施例２６の方法に従ってＤＳＣを行った。
結果は図１４Ａ示されている。
【０１８９】
α-インターフェロン（０．６ｍｇ／ｍｌ）と実施例２６の摂動剤（１００ｍｇ／ｍｌ）を溶液のＣｐに明らかな変化を示さずに混合した。次いで、この溶液を、リン酸バッファーで夜通し透析し、サーモグラムを行った。結果は図１４Ｂに示されている。
【０１９０】
透析サンプルは、本質的に、摂動剤を添加する前と同じ様なＴｍとＣｐ対Ｔｍ曲線の下側面積を備えていた。このことは、摂動剤がタンパク質にコンホメーション変化を誘導するだけでなく、この過程が可逆的ことを示した。希釈は、活性剤から摂動剤を解離させるに十分な推進力であった。
【０１９１】
[実施例２８] 摂動剤とα-インターフェロンＤＳＣ
ＧｕＨＣｌを実施例２６の摂動剤に換えて実施例６の方法を行った。
結果は図１５に示されている。
α-インターフェロンの平衡変性(equilibrium denaturation)のＤＳＣ実験は、分子の中間体コンホメーションの存在を示唆する。ΔＨ対Ｔｍプロットは、各セットの実験条件におけるα-インターフェロンに占有された中間体コンホメーションのエネルギー学を示す。
【０１９２】
[実施例２９] ラットへの摂動剤およびα-インターフェロンのin vivo投与 実施例４の摂動剤（８００ｍｇ／ｋｇ）とα-インターフェロン（１ｍｇ／ｋｇ）の投与溶液を、実施例２に従ってラットに投与した。血清サンプルを収集し、実施例２の方法に従ってＥＬＩＳＡでアッセイした。
結果は図１６に示されている。
【０１９３】
[比較例２９*]ラットへのα-インターフェロンのin vivo投与
摂動剤を含まないα-インターフェロン（１ｍｇ／ｋｇ）を、実施例２９の方法に従ってラットに投与した。血清サンプルを収集し、実施例２９の方法に従ってアッセイした。
結果は図１６に示されている。
【０１９４】
図１６は、摂動剤と混合した活性剤を動物に経口投与した場合に、α-インターフェロンの顕著な血清力価が全身的な循環において検出できたこと、およびα-インターフェロンが十分に活性を有することを示唆している。誘導されたα-インターフェロンが十分に活性を備えていたという確認データは、イントロンの天然コンホメーションに特異的なエピトープを認識し得るモノクローナル抗体を利用した商業的なＥＬＩＳＡキットによって血清をアッセイしたこと、およびＥＬＩＳＡによって測定された力価と関連したイントロンの力価を決定する細胞変性効果アッセイを用いて血清をさらにアッセイしたこと（データ示さず）を含んでいた。それゆえ、摂動剤を用いた場合の結果として生じたコンホメーション変化は可逆的な変化であった。
【０１９５】
[実施例３０] α-インターフェロンにおける摂動剤濃度依存変化
摂動剤をシクロヘキサノイルフェニルグリシンに換えて、実施例２６の方法を行った。
結果を以下の表１０と図１７に示す。
【０１９６】
【表１１】
【０１９７】
シクロヘキサノイルフェニルグリシンは、濃度依存性のα-インターフェロンにおけるコンホメーション変化を誘導した。
【０１９８】
[実施例３１] ラットへの摂動剤およびα-インターフェロンのin vivo投与
実施例３０の摂動剤（８００ｍｇ／ｋｇ）とα-インターフェロン１（ｍｇ／ｋｇ）を含む投与溶液を、実施例２の方法に基づいてラットに投与した。血清サンプルを回収して、実施例２の方法に従ってＥＬＩＳＡによってアッセイした。
結果は図１８に示されている。
【０１９９】
[比較例３１*]ラットへの摂動剤およびα-インターフェロンのin vivo投与
摂動剤を含まないα-インターフェロン（１ｍｇ／ｋｇ）を、実施例２の方法に基づいてラットに投与した。血清サンプルを回収して、実施例２の方法に従ってＥＬＩＳＡによってアッセイした。
結果は図１８に示されている。
【０２００】
[実施例３２] 摂動剤およびα-インターフェロンＤＳＣ
実施例６の方法を、ＧｕＨＣｌを実施例３０の摂動剤に換えて行った。
結果は図１９に示されている。
【０２０１】
△Ｈ対Ｔｍプロットは、５および２５ｍｇ／ｍｌ以下のシクロヘキサノイルフェニルグリシン摂動剤で安定なα-インターフェロンの平衡中間体コンホメーションの存在を示唆する。
【０２０２】
[実施例３３] 摂動剤を含むα-インターフェロンの等温下の滴定熱量測定
α-インターフェロンと複合体を形成する摂動剤の等温下の滴定熱量測定を、二つの異なるｐＨで２５℃で行った。用いたバッファーは、ｐＨ７．２では２０ｍＭリン酸ナトリウムであり、ｐＨ３．０では２０ｍＭＮａＡｃであった。α-インターフェロン溶液を、適切なｐＨに達するように実験の前に透析した。乾燥摂動剤を秤量し、透析して希釈した。
ＩＴＣをMicroCal OMEGA滴定熱量測定計で行った（MicroCal Inc.-Northampton，MA）。データポイントを２秒ごとに収集したが、濾過はしなかった。１．３６２５ｍｌセルに配されたα-インターフェロン溶液を、濃縮された摂動剤溶液で満たされた２５０μｌのシリンジを用いて滴定した。ある量の滴定剤(titrant)を、５５回までの注入で３−５分毎に注入した。
二つの溶液の混合熱を補正するための対照実験は、反応セルが活性剤を含まないバッファーで満たされていること以外は同様にして行われた。
データの分析は、Johns Hopkins University Biocalorimetry Centerで開発されたソフトウェアを用いて行われた。
ｐＨ７．２における滴定は、実施例３０の摂動剤（５０ｍｇ／ｍｌ＝１９１．６ｍＭ（ＭＷ２６１））とα-インターフェロン（１．３ｍｇ／ｍｌ＝０．０６７ｍＭ（ＭＷ１９４００））の２μｌを５３回注入することを含む。
結果は図２０に示されている。
【０２０３】
曲線適応(curve fitting)は、多重独立部位(multiple independent sites)を示した。
ｎ（１）＝１２１．０３５４ ｎ＝＃完成された摂動剤分子
△Ｈ（１）＝５８．５９３２ｃａｌ／モル摂動剤
ｌｏｇ１０Ｋａ（１）＝２．５２４８３４ Ｋａ＝結合定数
ｘ軸ユニットは、ｍＭ表示されたキャリアーの濃度である。
ｙ軸ユニットは、カロリー表示された熱／注入を示す。
ｐＨ３では、複合が負のエンタルピーをもたらした。
【０２０４】
[比較例３３*]摂動剤の等温下の滴定熱量測定
活性剤を含まない実施例３０の摂動剤（５０ｍｇ／ｍｌ＝１９１．６ｍＭ）［ＩＦＮ］＝０ｍｇの２μｌを５３回注入して行った。
実施例３３と比較例３３は、α-インターフェロンが正のエンタルピーを備え、結合定数（Ｋd １０-3Ｍ）を備えることを示している。
【０２０５】
[実施例３４] α-インターフェロンと摂動剤複合体の等温下の滴定熱量測定
実施例３０の摂動剤を実施例２６の摂動剤に換えて、実施例３３の方法を行った。
ｐＨ７．２における滴定は、摂動剤（５０ｍｇ／ｍｌ＝１８１ｍＭ（ＦＷ２７７））
とα-インターフェロン（２．３１ｍｇ／ｍｌ＝０．１１９ｍＭ（ＭＷ１９４００））の５μｌを５５回注入することを２回繰り返すことを含む。
結果は図２１に示されている。
【０２０６】
曲線適応は、多重独立部位を示した。
ｎ（１）＝５５．１１８４８ ｎ＝＃複合摂動剤分子
△Ｈ（１）＝−１１４．５８７ｃａｌ／モル摂動剤
ｌｏｇ１０Ｋａ（１）＝２．８１９７４８ Ｋａ＝結合定数
ｘ軸ユニットは、ｍＭ表示されたキャリアーの濃度である。
ｙ軸ユニットは、カロリー表示された熱／注入を示す。
【０２０７】
ｐＨ３では、α-インターフェロンに対する摂動剤の複合形成により、溶液から複合体が沈降した。この工程で生じた熱効果のために、複合パラメーターを測定することは不可能であった。
【０２０８】
[比較例３４*]摂動剤の等温下の滴定熱量測定
活性剤を含まないｐＨ７．２のリン酸ナトリウム２０ｍＭリン酸ナトリウム中の実施例２６の摂動剤（５０ｍｇ／ｍｌ＝１８１ｍＭ）の５μｌを５５回注入して実施例３４の方法を行った。
α-インターフェロンと複合した実施例２６の摂動剤は、負のエンタルピーをもたらし、実施例３０の摂動剤とα-インターフェロンとの結合定数と比較可能な結合定数をもたらした。
実施例３３および３４は、活性剤と摂動剤との複合がより強力になり、活性剤の中間状態が熱力学的により安定になれば、活性剤の生物利用能がより良好になることを示している。
それゆえ、活性剤と摂動剤に対して△Ｈ対Ｔｍ曲線をプロットすることによって、Ｔｍの広範囲においてエンタルピーの変化をほとんどあるいは全く示さない摂動剤が、より好ましい摂動剤であろう。より優れた状態に中間状態を安定化する摂動剤が、より効率的な活性剤の送達をもたらすと考えられる。
【０２０９】
[実施例３５] α-インターフェロンを用いた△Ｈ対Ｔｍプロットに対する３種の摂動剤の効果の比較
０．５ｍｇ／ｍｌのα-インターフェロンと（１）ベンゾイル=パラ-アミノフェニル酪酸(benzoyl para-amino phenylbutyric acid)、（２）実施例３０の摂動剤、あるいは（３）実施例２６の摂動剤とを混合したものを用いて、実施例２６の方法に基づいてＤＳＣ実験を行った。
ベンゾイル=パラ-アミノフェニル酪酸は、バッファー状態ではほとんど溶けなかった。室温で溶液が透明を保つ最大濃度は〜８ｍｇ／ｍｌであった。それゆえ、用いられた摂動剤の濃度は、２、４および６ｍｇ／ｍｌであった。結果は図２２および２３に示されている。
図２２の点線は、線最小自乗（the linear least squares）を示し、その回帰式(the regression equation)は図２２の上に記載されている。
【数１０】
図２２および２３は、ベンゾイル=パラ-アミノフェニル酪酸が、実施例３０および２６の摂動剤よりも容易にα-インターフェロンのコンホメーション変化を生じ得ること、並びに、このような変化は、実施例２６の摂動剤よりも実施例３０の摂動剤により容易にもたらされ得ることを示す。
【０２１０】
[実施例３６]α-インターフェロンと複合形成の等温下の滴定熱量測定
摂動剤ベンゾイル=パラ-アミノフェニル酪酸（７．５ｍｇ／ｍｌ＝２４．５９ｍＭ、（ＦＷ３０５））とα-インターフェロン（２．５ｍｇ／ｍｌ＝０．１２９ｍＭ（ＭＷ１９４００））の５μｌを４０回注入して、実施例３３の方法に基づいてＩＴＣを行った。
結果は図２４に示されている。
曲線適応は、多重独立部位を示した。
ｎ（１）＝２３．６９５７８ ｎ＝＃複合摂動剤分子
△Ｈ（１）＝７９１．５７２６ｃａｌ／モル摂動剤
ｌｏｇ１０Ｋａ（１）＝３．３４３２６１ Ｋａ＝結合定数
ｘ軸は、ｍＭ表示されたキャリアーの濃度を示す。
ｙ軸は、カロリー表示された熱／注入を示す。
【０２１１】
[比較例３６*]
活性剤を含まない、ｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中の摂動剤ベンゾイル=パラ-アミノフェニル酪酸（７．５ｍｇ／ｍｌ＝２４．５９ｍＭ）の５μｌを４０回注入して、実施例３６の方法に基づいてＩＴＣを行った。
実施例３５の摂動剤の見かけの解離定数は、ｐＨ７の実施例３０の摂動剤（１０-4Ｍ）より大きい。
それゆえ、ベンゾイル=パラ-アミノフェニル酪酸はα-インターフェロンとより強力に複合体を形成し、未変性の安定な可逆的中間体コンホメーション状態をより低い摂動剤濃度で誘導する。
【０２１２】
[実施例３７−３９] 種々の摂動剤とα-インターフェロンの比較によるin vivoの薬物動態学
実施例２６の摂動剤（８００ｍｇ／ｋｇ）（１）、実施例３０の摂動剤（８００ｍｇ／ｋｇ）（２）、もしくはベンゾイル-パラ-アミノフェニル酪酸（３００ｍｇ／ｋｇ）（３）と１ｍｇ／ｋｇのα-インターフェロンを含む投与溶液を、実施例２の方法に従ってラットに投与した。血清サンプルを収集し、実施例２の方法に従ってＥＬＩＳＡでアッセイした。
結果は図２５に示されている。
【０２１３】
[比較例３７＊] α-インターフェロンのin vivo薬物動態学
摂動剤を含まないα-インターフェロンを実施例３７の方法に従ってラットに投与した。血清サンプルを収集して、実施例２の方法に従ってＥＬＩＳＡでアッセイした。
結果を図２５に示す。
【０２１４】
実施例３５−３９は、in vivoでの効能がin vitroモデルで正確に予想できたことを示している。
【０２１５】
[実施例４０−４２] 下垂体を切除したラットにおけるｒｈＧｈと種々の摂動剤の比較によるin vivo薬物動態学
ｒｈＧｈ（１ｍｇ／ｋｇ）と混合した摂動剤サリチロイル(salicyloyl)クロリド修飾Ｌ−フェニルアラニン（１．２ｇ／ｋｇ）（４０）、フェニルスルホニル=パラ-アミノ安息香酸（１．２ｇ／ｋｇ）（４１）、もしくは塩化シクロヘキサノイル修飾Ｌ−チロシン（１．２ｇ／ｋｇ）（４２）を含む投与溶液を実施例２の方法に従ってラットに投与した。
ラットは、Loughna，P.T.ら，Biochem．Biophys．Res．Comm．Jan．14，1994，198(1)，97-102の方法に基づいて下垂体を切除したした。血清サンプルをＥＬＩＳＡ（Medix Biotech，Inc.，Foster City，CA，HGH Enzyme Immunoassay Kit）でアッセイした。
結果は図２６に示されている。
【０２１６】
[実施例４３−４５] 種々の摂動剤を用いたｐＨ７．５および４．０におけるｒｈＧＨの等温下の滴定熱量測定
種々の摂動剤と複合体を形成するｒｈＧｈの能力を、通常は３０℃で平衡化してMicrocal Omega滴定装置を用いてＩＴＣで評価した。熱量計のサンプルセルを、ｐＨ７．５もしくは４．０の５０ｍＭリン酸バッファー中に調製された脱気したｒｈＧＨ（通常は０．２５ｍＭ）で満たした。摂動剤（塩化シクロヘキサノイル修飾Ｌ−チロシン（ａ）、サリチロイル修飾Ｌ−フェニルアラニン（ｂ）、もしくはフェニルスルホニルパラアミノ安息香酸（ｃ））を１ｍＭ（ｐＨ７．５用）と２．５ｍＭ（ｐＨ４．０用）に滴下シリンジに移した。２０〜２５回の１０μｌの注入を、注入の間隔を２分として、急速混合（４００ｒｐｍ）溶液に調製した。
熱量計サンプルセルに配された摂動剤の初濃度は、各摂動剤に対して２００の式量を仮定した。各溶液のｐＨを、溶解した後にチェックしたが、ｐＨの調節は必要なかった。全ての実験を３０℃で行った。滴下シリンジに配されたｒｈＧｈの初濃度は、ｒｈＧｈについて分子量２００００と仮定した。各溶液のｐＨを溶解後にチェックしたが、ｐＨの調節は必要なかった。
反応熱を、観察されたピークの積分によって決定した。混合および希釈の熱を補正するために、試験摂動剤もしくはｒｈＧｈの一定分量をバッファー溶液のみに添加して同じ条件下で対照実験も行った。放出された熱の合計量を、等温式を作製するために全体の摂動剤濃度に対してプロットした。等温式から、一セットの独立摂動剤複合部位を有する超分子複合体において複合した摂動剤について記載された結合等式に対して結合等温式を曲線適合させることによって、結合定数（ＫA，Ｍ）、エンタルピー変化（△Ｈ、ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、エントロピー変化（△Ｓ(eu)、およびＮ、並びに複合体を形成した超分子複合体の当量当たりに複合した摂動剤分子の化学量論が決定された。製造者のソフトウェアに供給されている非線形最小自乗アルゴリズムを用いて、データをデコンボリュート(deconvoluted)した。
結果は以下の表１１に示す。
【０２１７】
【表１２】
【０２１８】
ｐＨ７．５における正の△Ｓ値は、このｐＨにおける複合体形成が構造変化を引き起こすことを示している。
【０２１９】
[実施例４６および４７] α-インターフェロンと摂動剤を用いたパンクレアチン阻害アッセイ
パンクレアチン活性のアッセイを、以下のようにして準備した：α-インターフェロンの０．１ｍｌのストック溶液（９．１ｍｇ／ｍｌ、２０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．２）（Schering-Plough Corp.）を、２．５ｍｌの、ｐＨ７．０の５ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4中のフェニルスルホニル−パラ−アミノ安息香酸摂動剤（４６）もしくはシクロヘキサノイルフェニルグリシン摂動剤（４７）（２００ｍｇ／ｍｌ）に添加した。３７℃で３０および６０分間インキュベーションし、０．１ｍｌのＵＳＰパンクレアチン（２０ｍｇ／ｍｌ）（Sigma Chemical Co.）を添加した。その時点において、０．１ｍｌの一定分量を取りだした。酵素反応を、プロテアーゼインヒビター（アプロチニン(Aprotinin)とBowman-Birkインヒビター（ＢＢＩ）、各々２ｍｇ／ｍｌ）を添加して停止させ、完全なままのα-インターフェロンを定量するために５倍に希釈した。Butyl C-4カートリッジ（３．０ｘ０．４６ｃｍ、Rainin）を使用し、かつ２２０ｎｍにおけるＵＶ検出を組み合わせた０．１％ＴＦＡ／水と０．１％ＴＦＡ中の９０％ＡＣＮとの間の勾配溶出を用いた逆相ＨＰＬＣを用いて、α-インターフェロンを分離および定量した。０分におけるα-インターフェロンを、パンクレアチンの添加の前の一定分量から定量し、１００％とした。
結果は図２７に示されている。
【０２２０】
実施例４６および４７は、両方の超分子複合体が酵素分解に対抗したことを示す。しかしながら、さらなる試験においては、酵素インヒビターの能力と薬物送達能力との間に何の関係も示さなかった。
【０２２１】
[実施例４８] ｐＨ５．０におけるヘパリンのＤＳＣ
ｐＨ５．０におけるヘパリンのＤＳＣサーモグラムを、摂動剤としてｐＨ、ＧｕＨＣｌ、およびイオン強度を用いた実施例１１の方法に基づいて行った。
サーモグラムをヘパリン．０５Ｍ ＮａＣｌ−リン酸バッファーブランクを引くことによって補正したが、各ブランクは、各ＮａＣｌ濃度について使用しなかった。
結果は以下の表１２−１４と図２８に示されている。
【０２２２】
【表１３】
【０２２３】
【表１４】
【０２２４】
【表１５】
【０２２５】
これらのデータは、非タンパク質性活性剤が摂動剤に応じてコンホメーションを変化させ得ることを示している。
【０２２６】
[実施例４９] ヘパリンと摂動剤のカラムクロマトグラフィー
以下の材料を用いた：
カラム： １０ｍｍｘ３０ｃｍ、低圧、ガラスカラム Pharmacia ｗ／調節可能なベッドボリューム。使用したベッドボリュームは、０．８Ｍｐａの圧力で２２ｃｍであった。
パッキング： リンカー分子を具備しないセファロース(Sepharose)ＣＬ−６Ｂに共有結合したヘパリン。
セファロース分画レンジ：１００００−４００００００。
ヘパリン密度は、Pharmacia Q.C．Departmentに従って２ｍｇ／ｃｃであった。
【０２２７】
条件： 移動相はｐＨ７．４の６７ｍＭリン酸バッファー。
流速は１．５ｍｌ／分アイソクラティック(isocratic)。
流動時間は４５分。
サンプル検出は、Perkin Elmer屈折率検出装置を用いた。
【０２２８】
カラムが完全であることをプロタミンを注入し、かつ１時間以上の保持時間を観察することによって確認した。空いた容量を、水を注入し、溶出時間を測定することによって調べた。
【０２２９】
以下の表１５の各摂動剤（５ｍｇ）を、１ｍｌの移動相に個別に溶解し、カラムに注入した（１００μｌ）。溶出時間を測定した。Ｋ’値を以下の式を用いて決定した：
【数１１】
結果を、各摂動剤間、および図２９における各in ivo性能で比較した。この図のＫ’値（遅延度）は、ヘパリン−セファロースカラムから得られたＫ’値からセファロースカラムから得られたＫ’値を差し引くことによって補正されている。
【０２３０】
【表１６】
【０２３１】
[実施例５０] ラットへのヘパリンの経口投与
実施例２の方法に従って、以下の表１６の投与溶液をラットに投与した。血液を採取し、活性化部分トロンボプラスチン時間(activated partial thromboplastin time)（ＡＰＴＴ）をHenry，J.B.，Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods，W.B．Saunders，1979の記載に従って行った。
結果は図２９および３０に示されている。
【０２３２】
図２９は、モデルに予想されるように、ヘパリンへの結合が強くなればなるほど、ＡＰＴＴが上昇することを示している。このデータは、Ｋ’値が０．２以下では活性がほとんどないことを示唆している。Ｋ’値＞０．２では、活性は顕著である。
このデータは、セファロースカラムそのものに対するヘパリンセファロースカラムの遅延と、ＡＰＴＴの上昇として測定されるin vivo活性の増大との間の関係を示唆している。特に、最も強力にヘパリンに結合するプロタミンは経口的な生物利用能を全く持たない（Ｋ’＝３．６８）。このことは、結合強度と解離能力を備えたコンホメーション変化とのバランスを取ることにより、薬物の生物学的活性の完全な補足を最適化することを示している。
【０２３３】
【表１７】
【０２３４】
全ての特許、出願、試験方法、およびここに言及した刊行物は、参照としてここに援用する。
本願発明の多くの変更は、上記の詳細な開示を考慮して当業者に示唆されるであろう。例えば、経口薬剤送達は、血液に胃腸管のルーメンを横切ることを必要とする。これは、これらの解剖学上の区画を分けるいくつかの細胞性脂質二重層を横切る結果として起こる。
活性剤と摂動剤の複合体化および活性剤のコンホメーションの変化が、摂動剤もしくは活性剤のみのものとは異なる可溶性および空間におけるコンホメーション等の物理化学的特性を備えた超分子複合体を作製する。これは、血液脳関門、および目、膣、直腸等の膜等の別の膜を横切るこの特性の利点を得ることができることを示唆する。このような修飾の全ては、クレームの範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】図１は、α−インターフェロン（ＩＦＮ）及び修飾アミノ酸複合体形成摂動剤の天然の勾配ゲルを示す図である。
【図２】図２は、α−インターフェロン及び熱凝縮複合体形成摂動剤の天然の勾配ゲルを示す図である。
【図３】図３は、複合体形成摂動剤有りまたは無しでα−インターフェロンを経口投与した後の血清α−インターフェロンレベルを示すグラフである。
【図４】図４は、複合体形成摂動剤有りまたは無しでサケ(salmon)カルシトニンを経口投与したラットにおけるカルシウムレベルを示すグラフである。
【図５】図５は、α−インターフェロンの塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）誘発変性を示すグラフである。
【図６】図６は、α−インターフェロンのコンフォメーションに対するＧｕＨＣｌの濃度効果を示すグラフである。
【図７】図７は、α−インターフェロンのｐＨ変性を示すグラフである。
【図８】図８は、インシュリンのｐＨ変性を示すグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは、α−インターフェロンの円二色性スペクトルの可逆性を示すグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、α−インターフェロンの円二色性スペクトルの可逆性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、α−インターフェロンの円二色性スペクトルを示すグラフである。
【図１１】図１１は、α−インターフェロンと複合体形成摂動剤の固有トリプトファン蛍光を示すグラフである。
【図１２】図１２は、複合体形成摂動剤有りまたは無しでα−インターフェロンを経口投与した後の血清α−インターフェロンレベルを示すグラフである。
【図１３】図１３は、α−インターフェロン及び複合体形成摂動剤の示差熱量分析を示すグラフである。
【図１４Ａ】図１４Ａ及び１４Ｂは、複合体形成摂動剤による変形の可逆性を示すグラフである。
【図１４Ｂ】図１４Ａ及び１４Ｂは、複合体形成摂動剤による変形の可逆性を示すグラフである。
【図１５】図１５は、α−インターフェロンに対する複合体形成摂動剤の影響を示すグラフである。
【図１６】図１６は、複合体形成摂動剤有りまたは無しでα−インターフェロンを経口投与した後の血清α−インターフェロンレベルを示すグラフである。
【図１７】図１７は、α−インターフェロンのコンフィギュレーションに対する複合体形成摂動剤の濃度効果を示すグラフである。
【図１８】図１８は、複合体形成摂動剤有りまたは無しで経口投与した後の血清α−インターフェロンレベルを示すグラフである。
【図１９】図１９は、α−インターフェロンに対する複合体形成摂動剤の影響を示すグラフである。
【図２０】図２０は、α−インターフェロン及び複合体形成摂動剤の等温滴定熱量分析を示すグラフである。
【図２１】図２１は、α−インターフェロン及び複合体形成摂動剤の等温滴定熱量分析を示すグラフである。
【図２２】図２２は、α−インターフェロンに対する複合体形成摂動剤の影響を示すグラフである。
【図２３】図２３は、α−インターフェロンに対する複合体形成摂動剤の濃度効果を示すグラフである。
【図２４】図２４は、α−インターフェロン及び複合体形成摂動剤の等温滴定熱量分析を示すグラフである。
【図２５】図２５は、複合体形成摂動剤とともに経口投与した後の血清α−インターフェロンレベルを示すグラフである。
【図２６】図２６は、複合体形成摂動剤と混合した組み換えヒト成長ホルモンのインビボの薬物速度論を示すグラフである。
【図２７】図２７は、α−インターフェロン及び複合体形成摂動剤での膵臓阻害アッセイを示すグラフである。
【図２８】図２８は、ｐＨ５．０におけるヘパリンのＤＳＣの影響を示すグラフである。
【図２９】図２９は、ヘパリンでのインビボ投与実験からのＡＰＴＴピーク値に対する発育不全の程度を示すグラフである。
【図３０】図３０は、複合体形成摂動剤有り及び無しでのヘパリンの経口投与の後のラットにおける凝固時間を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性薬、特に生物学的活性薬を、細胞膜または脂質二重層を横切って送達するための方法及び組成物に関する。これらの方法及び組成物は、製薬製剤を不利な環境を通して体内の特定の位置に送達するように、活性薬を標的に送達することができる。
【背景技術】
【０００２】
活性薬を、例えばヒトの器官や腫瘍などの目的とする標的に送達するための従来の手段は、生物学的、化学的、及び物理的障害物の存在によってしばしば制限されることがあった。典型的には、これらの障害物は、送達が通過しなければならない環境、送達する標的の環境、または標的そのものによって与えられていた。
【０００３】
生物学的活性薬は、特にこのような障害物の影響を受けやすい。多くの生物学的活性薬についての循環系への経口送達は、もし、ある種の生物学的活性薬に対して比較的不透過性であるが、経口経路を通して活性薬が循環系に到達するためには横切らなければならない皮膚、脂質二重層、及び種々の生体器官膜などの物理的障害物が無い場合は、動物への投与経路の選択肢である。さらに、経口送達は胃腸（ＧＩ）管のｐＨ変化、並びに、口腔及びＧＩ管に存在する強力な消化酵素といった化学的障害によって邪魔される。
【０００４】
カルシトニン及びインシュリンは、この分野での有効な経口経路送達システムの設計において直面する問題を例示する。カルシトニン及びインシュリンの医学的性質は、多くの技術によって容易に変化させることができるが、それらの物理化学的性質及び酵素消化の受け易さは、商業的に実行可能な送達システムの設計から除外されている。経口投与には典型的に受け入れられない多くの試薬のうちの他のものは、シトキン（例えば、インターフェロン、ＩＬ−２など）といったタンパク質；エリスロポイエチン、多糖類、特に、ムコ多糖であり、ヘパリン、ヘパリノイド、抗生物質、及び他の有機物質を含むがこれらに限定されない。また、これらの試薬は、即座に不活性になる、即ち、ＧＩ管内で酸加水分解、酵素等によって分解される。
【０００５】
バイオテクノロジーは、多くの他の化合物の生成を可能にし、それらの多くは世界中で臨床に使用されている。しかし、これらの化合物の現在の投与形態は、ほとんどが注射によるものである。これらの化合物の経口投与が多くの場合に好ましいにもかかわらず、これらの試薬はＧＩ管内の種々の酵素やｐＨ変化の影響を受けやすく、一般的には、細胞膜が典型的に構成される脂質二重層を十分に透過することができない。従って、この活性薬は、活性薬がその生物学的効果を発揮することが望まれる標的に経口送達することができなかった。
【０００６】
典型的には、薬物設計は、製薬化合物の生化学的性質、及び、特にそれらの治療作用に最初に焦点が当てられる。第２の設計の焦点は、活性薬をその生物学的標的に送達する必要性に向けられる。このことは、ヒト及び他の動物に経口投与するための薬物及び他の生物学的活性薬に当てはまる。しかしながら、投与、特に経口投与後に、該化合物の治療的タイターが適当な解剖学的部位即ち区画に到達することを確実にする送達システムが無かったため、数千の治療的化合物は廃棄された。さらに、現存する治療用化合物の多くは、それらの投与形態の束縛から、許容された徴候に使用されている。また、それら以外の付加的な臨床的徴候にも有効である多くの治療的試薬は、それらを適切な量で適当な生物学的標的に送達する実際の方法論が存在する場合は既に採用されている。
【０００７】
タンパク質などの活性薬の細胞間及び細胞内送達に有効な性質が得られたとしても、この成功は薬物設計に生かされていなかった。現実に、タンパク質などの活性薬の送達可能なコンフォメーションは、天然の状態におけるコンフォメーションとは異なる。さらに、自然な送達システムは、しばしば送達に続くタンパク質の天然状態への帰還に作用する。タンパク質がリボゾームによって合成されると、それらは、例えば信号ペプチド及び／またはチャペロニン(chaperonin)といった種々の機構によって適当な細胞オルガネラに往復運転される。Gething，M-J., Sambrook，J.，Nature，355，1992，33-45。信号ペプチドまたはチャペロニンのいずれかの多くの機能の一つは、タンパク質の天然状態への前成熟折り畳みを阻害することである。天然状態は、通常最も低い自由エネルギーを持つ３次元状態として記述される。タンパク質を部分的に折り畳みしない状態に保持するため、信号ペプチドまたはチャペロニンは、タンパク質が適当なオルガネラに到達するまで、タンパク質が種々の細胞膜を横切ることを可能にする。次いで、チャペロニンはタンパク質から分離され、信号ペプチドはタンパク質から解離され、タンパク質が天然状態に折り畳みすることができるようにされる。タンパク質が細胞膜を通過することができるのは、少なくとも一部は、部分的に折り畳みしない状態にあることの結果であることは良く知られている。
【０００８】
タンパク質折り畳みの今日の概念は、天然状態から完全に変性した状態への変換において、多数の不連続なコンフォメーションが存在することを示唆している。Baker，D.，Agard，D.A.，Biochemistry，33，1994，7505-7509。タンパク質折り畳みの骨格モデルは、折り畳みの初期段階においては、二次構造単位であるタンパク質のドメインが形成され、次いで最終的折り畳みによって天然状態になることを示唆している。Kim，P.S.，Baldwin，R.L.，Annu．Rev．Biochem.，59，1990，631-660。これらの速度論的中間体に加えて、多くの細胞機能にとって平衡中間体が重要であることがわかった。Bychkova，V.E.，Berni，R.，等，Biochemistry，31，1992，7566-7571,及び Sinev，M.A.，Razgulyaev，O.I.，等，Eur．J. Biochem.，1989，180，61-66。チャペロニンについてのデータは、それらが、タンパク質を部分的に天然状態ではないコンフォメーションに保持する作用があることを示している。さらに、部分的に折り畳まれていないタンパク質は、膜を通過できるが、天然状態、特に大きな粒状タンパク質は、膜を通過しにくいか全く通過しないことが示された。Haynie，D.T.，Freire，E.，Proteins: Structure, Function and Genetics，16，1993，115-140。
同様に、上記の平衡中間体を伴ってコンフォメーション変化を受けないインシュリンなどのリガンドは、それらの機能を失う。Hua，Q.X.，Ladbury，J.E.，Weiss，M.A.，Biochemistry，1993，32，1433-1442; Remington，S.，Wiegand，G., Huber，R.，1982，158，111-152; Hua，Q.X.，Shoelson，S.E.，Kochoyan，M., Weiss，M.A.，Nature，1991，354，238-241。
【０００９】
ジフテリア毒素及びこれら毒素の研究は、ジフテリア毒素がその細胞レセプターに結合した後、エンドサイトーシスされるが、このエンドサイトーシス小胞において、酸性ｐＨ環境に曝露されることを示している。酸性ｐＨは、毒素分子に構造変化を誘起し、膜挿入及び細胞質ゾルへの位置変化(translocation)の原動力を与える。Ramsay，G.，Freire，E.，Biochemistry，1990,29，8677-8683,及びSchon，A.，Freire，E.，Biochemistry，1989，28，5019-5024 参照。同様に、コレラ毒素は、エンドサイトーシスに続いてコンフォメーション変化を受け、分子が核膜を透過するのを可能にする。Morin，P.E.，Diggs，D.，Freire，E.，Biochemistry，1990，29，781-788 参照。
【００１０】
先に設計された送達システムは、送達のための間接的または直接的な試みをいずれかを用いる。間接的試みは、薬物を敵対する環境から保護することを目指す。例として、腸被覆(enteric coatings)、リポソーム、微小球、マイクロカプセルがある。colloidal drug systems，1994，ed．Jorg Freuter，Marcel Dekker，Inc.; U.S．Patent No．4,239,754; Patel，等，(1976)，FEBS Letters，Vol．62, pg．60; 及び Hashimoto，等，(1979)，Endocrinology Japan，Vol．26，pg．337 参照。これらの試みは全て間接的であり、その設計原理は薬物には向けられず、例えば、敵対環境の薬物への接触及び破壊を防止するといった、薬物が生物学的活性を発揮する標的までの経路で薬物が通過しなければならない環境に対する保護に向けられている。
【００１１】
直接的な試みは、プロドラッグの製造といった、薬物と修飾物との共有結合に基づいている。Balant，L.P.，Doelker，E.，Buri，P.，Eur．J．Drug Metab．And Pharmacokinetics，1990，15(2)，143-153。結合は、通常は、ｐＨ変化や特定の酵素への曝露などの所定の条件下で開裂するように設計される。薬物と修飾物との共有結合は、本質的に新たな分子を生成するが、それらは、変化したｌｏｇＰ等の新たな性質及び／または新たな螺旋コンフィギュレーションを持つ。この新たな分子は、異なる溶解性を持ち、酵素分解を受けにくい。このタイプの方法の例は、ポリエチレングリコールとタンパク質との共有結合である。Abuchowski, A.，Van Es，T.，Palczuk，N.C.，Davis，F.F.，J．Biol．Chem.，1977，252，3578。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、（１）システムが、毒性となる量のアジュバントまたは阻害剤を必要とすること、（２）好ましく低い分子量のコルゴ(corgos)即ち活性薬が、入手できないこと、（３）システムの安定性が悪く、シェルフライフが不十分であること、（４）システムの調製が困難であること、（５）システムが活性薬（コルゴ）を保護しないこと、（６）システムが活性薬を悪い方向に変化させること、または、（７）システムが活性薬の吸着を推進しないことによって、従来の送達システムの広い範囲の用途は除外されている。
【００１３】
この分野では、簡単で低価格の送達システムであって、調製が容易であり、特に、経口経路で投与すべき製薬製剤の場合に、広い範囲の活性薬を目的とする標的に送達できる送達システムを未だに必要としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、細胞膜または脂質二重層を通して生物学的活性薬を送達する方法を開示する。この方法は、
（ａ）天然のコンホメーション状態、変性コンホメーション状態、及び、コンホメーション的に天然及び変性状態の中間にあり天然状態に変換可能な中間コンホメーション状態で存在しうる生物学的活性薬を準備し、
（ｂ）この生物学的活性薬を複合体形成摂動剤(complexing perturbant)に曝露して、該生物学的活性薬を可逆的に中間状態に変換させて送達可能な超分子複合体(supramolecular complex)を形成し、そして、
（ｃ）前記膜または二重層を、前記超分子複合体に曝露して、前記生物学的活性薬を前記膜または二重層を通して送達する工程を含む。
【００１５】
この摂動剤は、約１５０から約６００ダルトンの分子量を持ち、少なくとも１つの疎水性部位と少なくとも１つの親水性部位を有する。この超分子複合体は、前記生物学的活性薬に非−共有結合で複合体形成した摂動剤を含有する。本発明では、生物学的活性薬は摂動剤と相互作用した後は微小球を形成しない。
【００１６】
また、上記の工程（ａ）及び（ｂ）からなる経口投与可能な生物学的活性薬の調製方法も考慮する。
【００１７】
変形実施態様において、経口送達用組成物が提供される。この組成物は、
（ａ）下記（ｂ）と非共有結合で複合体形成した中間コンホメーション状態の生物学的活性薬、
（ｂ）約１５０から約６００ダルトンの分子量を持ち、少なくとも１つの疎水性部位と少なくとも１つの親水性部位を有する複合体形成摂動剤を含み、
前記中間コンホメーション状態は、天然のコンホメーション状態及び変性コンホメーション状態の中間にあり、前記天然状態に変換可能であって、前記組成物は微小球ではない。
【００１８】
さらに、細胞膜または脂質二重層を通して送達可能であり、前記膜または二重層を通過した後に生物学的に活性となる模倣物(mimetic)を調製する方法も考慮する。天然のコンホメーション状態、変性コンホメーション状態、及び、コンホメーション的に天然及び変性状態の中間にあり天然状態に変換可能な中間コンホメーション状態で存在しうる生物学的活性薬を複合体形成摂動剤に曝露して、該生物学的活性薬を可逆的に中間状態に変換させて送達可能な超分子複合体を形成する。この摂動剤は、約１５０から約６００ダルトンの分子量を持ち、少なくとも１つの疎水性部位と１つの親水性部位を有する。この超分子複合体は、前記生物学的活性薬に非−共有結合で複合体形成した摂動剤を含有し、生物学的活性薬は摂動剤と相互作用した後は微小球を形成しない。超分子複合体の模倣物を調製する。
【００１９】
さらにまた、細胞膜または脂質二重層を通して送達可能であり、前記膜または二重層を通過した後に生物学的に活性となる薬剤を調製する方法を提供する。天然のコンホメーション状態、変性コンホメーション状態、及び、コンホメーション的に天然及び変性状態の中間にあり天然状態に変換可能な中間コンホメーション状態で存在しうる生物学的活性薬を複合体形成摂動剤に曝露して、該生物学的活性薬を可逆的に中間状態に変換させる。薬剤、前記中間状態の模倣物を調製する。
【００２０】
〔発明の詳細な説明〕
生物学的な生物は、細胞膜または脂質二重層で互いに分離された水性区画からなると言うことができる。活性薬、特に製薬または治療用活性薬は、水性環境において１つの溶解度を有し、疎水性環境においては全く異なる溶解度を有する。典型的には、投与部位から病原部位などの標的部位への活性薬の送達は、活性薬の溶解度が変化する細胞膜または脂質二重層を通した活性薬の送達を必要とする。さらに、活性薬の経口送達は、酵素分解、ｐＨ変化などに抗する能力を必要とする。これらの障害は、投与部位と標的との間で、活性薬の生物学的活性の部分的または全体的な低下をもたらす。従って、治療反応のような正当な反応を生ずるのに必要な量の活性薬だけでは、標的に到達しないかもしれない。従って、活性薬は、到達のため、そして膜または脂質二重層を通過するための何らかの助けを必要とする。
【００２１】
本発明は、活性薬と複合体形成摂動剤から可逆的に非共有結合で複合体形成した超分子によって、活性薬送達に有効である。結果として、活性薬の三次元構造またはコンフォメーションが変化するが、活性薬分子の化学組成は変化しない。この（組成ではなく）構造の変化は、活性薬に、膜または脂質二重層を通過し、酵素分解などに抗するのに適当な溶解性（ｌｏｇＰ）を付与する。通過とは、実際に細胞膜または脂質二重層を透過するか否かに係わらず、細胞膜または脂質二重層の一方の側から反対側へ（例えば、細胞の外部から内部へ、またはその逆へ）送達することを意味する。さらに、活性薬の摂動剤中間体状態または超分子自身は、模倣物製造のテンプレートとして用いることができ、この模倣物は細胞膜または脂質二重層を通って送達可能である。細胞膜または脂質二重層を通過した後、活性薬は、天然状態への変換により、または中間状態で得られる生物学的活性または生体適合性を保持することにより、生物学的活性及び生体適合性を有する。模倣物は、細胞膜または脂質二重層を通過した後、同様に作用する。
【００２２】
〔活性薬〕
活性薬の天然コンフォメーション状態は、最も低い自由エネルギー（ΔＧ）を持つ三次元状態として典型的に記述される。それは、生物学的活性薬に帰する生物学的活性の全ての補体のように、活性薬がその薬に帰する活性の完全な補体を有する状態である。
【００２３】
変性コンフォメーション状態は、活性薬が二次または三次構造を持たない状態である。
【００２４】
中間コンフォメーション状態は、天然及び変性状態の間に存在する。特に活性な薬は、１またはそれ以上の中間状態を有する。本発明で達成される中間状態は、構造的かつエネルギー的に、天然状態とも変性状態とも異なっている。本発明で有用な活性薬は、天然コンフォメーション状態から中間コンフォメーション状態に変換可能であり、天然状態に戻すこともできる。即ち、可逆的に変換可能であって、活性薬が標的に到達するとき、例えば、経口送達された薬物が循環系に到達したときに、活性薬は生物学的、製薬的、または治療的に重要な設計された生物学的活性補体を保持し、回復し、または獲得する。好ましくは中間状態の約−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌから約２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲、さらに好ましくは、約−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌから約１０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲である。
【００２５】
例えばタンパク質の場合、中間状態は重要な二次構造、かなり大きな疎水性コアの存在による重要な緻密性(compactness)、及び天然折り畳みを記憶した(reminiscent)三次構造を有するが、天然状態の充填を示す必要はない。天然状態と中間状態との間の自由エネルギーの差（ΔＧ）は比較的小さい。従って、天然状態と、変換可能な可逆的中間状態との平衡定数は１に近い（実験条件による）。中間状態は、例えば、示差熱量分析（ＤＳＣ）、等温的定熱量分析（ＩＴＣ）、天然勾配ゲル、ＮＭＲ、蛍光等によって確認することができる。
【００２６】
如何なる理論にもよらないが、本出願人は、中間状態の物理化学は、タンパク質性活性薬に関する以下の説明で理解されるものと思う。タンパク質は適当な中間コンフォメーション状態で存在でき、それは構造的かつエネルギー的に、天然状態とも変性状態とも異なる。任意のタンパク質の任意のコンフォメーション本来の安定性は、コンフォメーションについてのギブスの自由エネルギーに反映される。単量体のタンパク質の状態のギブスの自由エネルギーは、熱力学的に以下の式で表される。
【数１】
ここで、Ｔは温度、ＴRは参照温度、ΔＨO（ＴR）及びＴΔＳO（ＴR）は参照温度におけるこの状態の相対的エンタルピー及びエントロピー、そして、ΔＣｐOはこの状態の相対的熱容量を示す。全ての相対的熱力学的パラメータを説明するために、天然状態を参照状態として選択するのが好ましい。
【００２７】
そのタンパク質に許容される全ての状態統計的重量の和は、分配関数Ｑで定義される。
【数２】
【００２８】
式（２）は、次のようにも書ける。
【数３】
【００２９】
ここで、第２項は、変換中に集団化した全ての中間体を含む。式（３）の第１項及び第３項は、各々、天然及び変性状態の統計的重量である。ほとんどの条件下で、タンパク質構造は、２状態変換関数で近似できる。
【数４】
【００３０】
Tanford，C.，Advances in Protein Chemistry，1968，23，2-95 参照。天然と変性状態の中間にあるタンパク質のコンフォメーションは、例えば、ＮＭＲ、熱量分析、及び蛍光で検出できる。Dill，K.A.，Shortle，D.，Rev．Biochem.，60, 1991，795-825。
【００３１】
全ての熱力学的パラメータは、分配関数で表される。特に、ｉ状態にある分子の集団は、式（５）で表される。
【数５】
【００３２】
従って、ギブスの自由エネルギーの計算を可能にする式（１）の適当な項の測定は、設定した実験条件において、集団化した任意の中間体がどの程度重要かを決定することができる。これは、中間体が薬物送達で果たすいえくわりを示している。中間体の集団化が多いほど、送達は有効になる。
【００３３】
本発明で用いるのに好適な活性薬は、生物学的活性薬及び化学的活性薬であり、香料及び例えば化粧品のような他の活性薬を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
生物学的活性薬はペストシド(pestcides)、製薬剤、及び治療剤を含むがこれらに限定されない。例えば、本発明で用いるのに好適な生物学的活性薬は、ペプチド、特に小さなペプチド、ホルモン、特にそれ自身は胃腸粘膜を通過しない及び／または胃腸管の酸または酵素による化学的開裂を受けないホルモン、多糖類、特にムコ多糖類の混合物、炭水化物、脂質、またはそれらの組合せを含むがそれらに限定されない。さらなる例は、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、インターフェロン、インターロイキン−１、インシュリン、ヘパリン、特に低分子量ヘパリン、カルシトニン、エリスロポイエチン、心房性ナトリウム排泄増加因子(atrial naturetic factor)、抗原、モノクローナル抗体、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、オキシトシン、バソプレッシン、クロモリンナトリウム（ナトリウムまたは時ナトリウムクロモグリカート）、バンコマイシン、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、抗−微生物、しかし抗菌剤に限られない、またはこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明の方法及び組成物は、１以上の活性薬の組合せでもよい。
【００３６】
〔摂動剤〕
本発明での摂動剤は、２つの目的を持つ。第１の実施態様では、活性薬は摂動剤と接触し、活性薬を天然状態から中間送達可能状態に可逆的に変換する。摂動剤は活性薬と非共有結合で複合体形成し、細胞膜または脂質二重層を透過または横切ることにできる超分子複合体を形成する。この超分子複合体は、模倣物のテンプレートとして用いることが出来、それ自身送達組成物として使用することができる。実際に、摂動剤は、活性薬を送達可能な中間状態に固定する。摂動剤は循環系における希釈等によって超分子複合体から放出され、活性薬は天然状態に戻る。好ましくは、これらの摂動剤は、少なくとも１つの親水性部分（即ち、カロキシラート基のように、容易に水に溶解する部分）、及び、少なくとも１つの疎水性部分（即ち、例えばベンゼン基のように、有機溶媒に容易に溶解する部分）を備え、約１５０から６００ダルトン、最も好ましくは約２００から５００ダルトンの分子量を有する。
【００３７】
複合体形成摂動剤分子は、線状、非線状、及び環状プロテイノイドを含むタンパク質、修飾（アシル化またはスルホン化）アミノ酸、ポリアミノ酸、及びペプチド、修飾アミノ酸、ポリアミノ酸、またはペプチド誘導体（ケトンまたはアルデヒド）、ジケトピペラジン／アミノ酸構造体、カルボン酸、及び下記で議論する種々の他の摂動剤を含むがこれらに限定されない。
【００３８】
また、如何なる理論にもよらないが、出願人は、非共有結合複合体形成は、水素結合、疎水性相互作用、静電相互作用、及びファンデルワールス相互作用を含むがこれらに限られない分子間力に影響されると思量する。任意の与えられた活性薬／摂動剤超分子複合体について、結合を維持するいくつかの上記の力が存在する。
【００３９】
活性薬と摂動剤の間の結合定数Ｋａは、下記の式（６）で定義される。
【数６】
【００４０】
解離定数Ｋdは、Ｋaの逆数である。よって、所定温度での摂動剤と活性薬の間の結合定数の測定は、分子ギブス自由エネルギーを産し、結合によるエンタルピー及びエントロピー効果の決定ができる。これらの実験的測定は、例えば、ＮＭＲ、蛍光、熱量分析を用いて行える。
【００４１】
この仮説は、タンパク質に次いて以下のように説明できる。
折り畳まれていないタンパク質は、種々のコンフォメーション状態の間に存在する平衡に従って記述できる。例えば、
【数７】
ここで、Ｎは天然状態、Ｉは中間状態、Ｄは変性状態、ｋ1及びｋ2は、各々の速度定数である。Ｋ1及びＫ2は各々の平衡定数である。従って、
【数８】
【数９】
これは、中間状態の分配関数の増加が、活性薬送達の能力に正の衝撃を有するべきことを示唆している。
（１０）
【００４２】
複合体形成は可逆的でなければならないので、Ｋaによって測定される摂動剤と活性薬の複合体形成は、薬剤を循環系／または標的まで確実に送達するのに十分強くなくてはならず、摂動剤の脱離が適時に起こらずに、活性薬が天然に戻って所定の効果を生ずることが無いほど強くてはいけない。
【００４３】
第２の実施態様では、摂動剤は活性薬を中間状態に可逆的に変換させ、その状態のコンフォメーショオンを模倣物の調製用のテンプレートとして使用できるようにする。この目的のためには、摂動剤は活性薬と複合体形成する必要はないが、してもよい。従って、上記の複合体形成摂動剤に加えて、例えば、強酸、洗浄剤、といった活性薬または環境のｐＨを変化させる摂動剤、活性薬のイオン強度を変化せる摂動剤、例えば塩素酸グアニジン等の他の試薬、及び温度を、活性薬の変換に用いることができる。超分子複合体または中間状態は、模倣物設計のテンプレートとして使用できる。
【００４４】
〔複合体形成摂動剤〕
アミノ酸は、本発明で有用な複合体形成摂動剤の多くを調製するのに用いられる基本的材料である。アミノ酸は少なくとも１つのフリーなアミノ基を有するカルボン酸であり、天然及び合成アミノ酸を含む。本発明で用いるのに好適なアミノ酸はα−アミノ酸であり、最も好ましいのは天然のα−アミノ酸である。多くのアミノ酸及びアミノ酸エステルが、Aldorich Chemical Co．(Milwaukee，WI，USA); Sigma Chemical Co．(St．Louis，MO，USA); Fluka Chemical Corp．(Ronkonkoma，NY，USA)等の市販元から入手可能である。
【００４５】
本発明で用いるのに好適だがそれらに限定されない代表的アミノ酸は以下の式で表される。
【化１】
ここで、Ｒ1は水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ2−Ｃ4アルケニル；
Ｒ2はＣ1−Ｃ24アルキル、Ｃ2−Ｃ24アルケニル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）フェニル、（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）ナフチル、（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、フェニル（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、またはナフチル（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）であり、Ｒ2はＣ1−Ｃ4アルキル、Ｃ2−Ｃ4アルケニル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ2Ｒ3、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルケニル、３−１０の環原子を有しヘテロ原子がＮ、Ｏ、Ｓまたはそれらの組合せであるヘテロ環、アリール，（Ｃ1−Ｃ10アルキル）アリール、アリール（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、またはこれらの組合わせで任意に置換されていてもよく、Ｒ2は、酸素、窒素、硫黄、またはこれらの組合せで分断されていてもよく、Ｒ3は水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ2−Ｃ4アルケニルである。
【００４６】
本発明でアミノ酸またはペプチドの成分として用いるのに好ましい天然アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シトルリン、システイン、シスチン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタマート、フェニルグリシン、またはＯ−ホスホセリンである。
【００４７】
好ましいアミノ酸は、アルギニン、ロイシン、リシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、バリン、及びフェニルグリシンである。
【００４８】
本発明で用いるのに好ましい非天然アミノ酸は、β−アラニン、α−アミノブチル酸、γ−アミノブチル酸、γ−（アミノフェニル）ブチル酸、α−アミノイソブチル酸、シトルリン、ε−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、β−アスパラギン酸、アミノ安息香酸、アミノフェニル酢酸、アミノフェニルブチル酸、γ−グルタミン酸、システイン（ＡＣＭ）、ε−リシン、ε−リシン（Ａ−Ｆｍｏｃ）、メチオニンスルホン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、ｄ−オルニチン、ｐ−ニトロ−フェニルアラニン、ヒドロキシプロリン、１，２，３，４，−テトラヒドロキノリン−３−カルボン酸、及びチオプロリンである。
【００４９】
ポリアミノ酸は、ペプチド、または、エステル、無水物即ち無水物結合で結合し得る他の基からなる結合で結合した２またはそれ以上のアミノ酸である。特に、非天然ポリアミノ酸、及び非天然ヘテロポリアミノ酸、混合アミノ酸を挙げることができる。
【００５０】
ペプチドは、ペプチド結合で結合した２以上のアミノ酸である。ペプチドは、２つのアミノ酸を持つジペプチドから数百のアミノ酸を持つポリペプチドまで変化できる。Walker，Chambers Biological Dictionary，Cambridge，England: Chambers Cambridge，1898，215 頁参照。特に、非天然ペプチド、特に混合アミノ酸の非天然ペプチドを挙げることができる。特にジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、及びペンタペプチド、中でも好ましいペプチドはジペプチド及びトリペプチドである。ペプチドは、ホモ及びヘテロペプチドを含み、天然アミノ酸、合成アミノ酸、及びそれらの組合せを含むことができる。
【００５１】
〔プロテイノイド複合体形成摂動剤〕
プロテイノイドは、アミノ酸の合成ポリマーである。プロテイノイドは、好ましくはアミノ酸混合物から調製し、最も好ましくは熱縮合ポリマーである。これらのポリマーは、配向性またはランダムポリマーである。プロテイノイドは、線形、分岐、または環状プロテイノイドであり、ある種のプロテイノイドは、他の線形、分岐、または環状プロテイノイドの単位となる。
【００５２】
特に、ジケトピペラジンを挙げることができる。ジケトピペラジンは、６員環化合物である。環は２つの窒素原子を含み、２つの炭素原子において２つの酸素原子で置換されている。好ましくは、カルボニル基は、環の１位と４位にある。
これらの環は、任意に、かつ頻繁にさらに置換されている。
【００５３】
ジケトピペラジン環系は、アミノ酸またはアミノ酸誘導体の熱重合または縮合で生成される。(Gyore，J.; Ecet M．Proceedings Fourth ICTA(Thermal Analysis)，1974，2，387-394(1974))。これらの６員環系は、線形ペプチドから、さらなる鎖成長に先だってまたは直接に主に分子内環形成によって生成する(Reddy, A.V.，Int.J．Peptide Protein Res.，40，472-476(1992); Mazurov，A.A.，Int．J．Peptide Protein Res.，42，14-19(1993))。
【００５４】
ジケトピペラジンは、Katchlski，J.Amer.Chem.Soc.，68，879-880（1946）に記載されたようにアミノ酸エステルの環状二量化によって、ジペプチド誘導体の環化によって、または、Koppel，J．Org．Chem.，33(2)，862-864(1968)に記載されたように、アミノ酸誘導体と高沸点溶媒の熱脱水によって形成される。
【００５５】
ジケトピペラジンの典型的な合成においては、アミノ酸ベンジルエステルのＣＯＯＨ基が第１段階で活性化されて保護エステルを形成する。アミンは脱保護されて第２段階の二量化を介して環化し、ジケトピペラジンのジエステルとなる。
最後に、ＣＯＯＨ基が脱保護されたジケトピペラジンとなる。
【００５６】
ジケトピペラジンは、典型的にはα−アミノ酸から形成される。好ましくは、ジケトピペラジンのα−アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、フェニルアラニン、及びこれらの光学異性体からの誘導体である。
特に挙げられるジケトピペラジンは以下の式で表される。
【化２】
【００５７】
ここで、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は、独立に、水素、Ｃ1−Ｃ24アルキル、Ｃ1−Ｃ24アルケニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、及びナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）であり、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は独立かつ任意に、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4アルケニル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、及びＣＯ2Ｒ8、またはこれらの組合せで置換されていてもよく、Ｒ8は水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ1−Ｃ4アルケニルであり、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、及びＲ7は独立かつ任意に、酸素、窒素、硫黄またはこれらの組合せで分断されていてもよい。
【００５８】
フェニルまたはナフチル基は、任意に置換されていてもよい。好ましくは、置換基の例はＣ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6アルケニル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＣＯ2Ｒ9であって、Ｒ9は水素、Ｃ1−Ｃ6アルキルまたはＣ1−Ｃ6アルケニルであるが、これらに限定されない。
【００５９】
好ましくは、Ｒ6及びＲ7は独立に、水素、Ｃ1−Ｃ4アルキルまたはＣ1−Ｃ4アルケニルである。特に、好ましい複合体形成摂動剤であるジケトピペラジンを挙げることができる。これらのジケトピペラジンは、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7が水素である未置換のジケトピペラジン、及び、環の窒素原子の一方または両方で置換された、モノまたはジ−Ｎ−置換体を含む。特に、窒素原子の一方または両方がメチル基で置換された置換ジケトピペラジンを挙げることができる。
【００６０】
特に、次の式で表されるジケトピペリジンを挙げることができる。
【化３】
ここで、Ｒ10及びＲ11は、独立に、水素、Ｃ1−Ｃ24アルキル、Ｃ1−Ｃ24アルケニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、及びナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）であるが、Ｒ10とＲ11の両方が同時に水素とはならず、Ｒ10及びＲ11は独立かつ任意に、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4アルケニル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、及びＣＯ2Ｒ12、またはこれらの組合せで置換されていてもよく、Ｒ12は水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ1−Ｃ4アルケニルであり、Ｒ10及びＲ11は独立かつ任意に、酸素、窒素、硫黄またはこれらの組合せで分断されていてもよい。
【００６１】
フェニルまたはナフチル基は、任意に置換されていてもよい。好ましくは、置換基の例はＣ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6アルケニル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＣＯ2Ｒ13であって、Ｒ13は水素、Ｃ1−Ｃ6アルキルまたはＣ1−Ｃ6アルケニルであるが、これらに限定されない。Ｒ10とＲ11の一方が水素であるとき、ジケチピペラジンはモノ−炭素−（Ｃ）−置換である。Ｒ10もＲ11も水素でないときは、ジケトピペラジンはジ−炭素−（Ｃ）−置換である。
【００６２】
好ましくは、Ｒ10、Ｒ11、またはＲ10とＲ11の両方が、少なくとも１つの官能基を含み、この官能基は分子の特性反応を負う非炭化水素部分である。単純な官能基はヘテロ原子であり、ハロゲン、酸素、硫黄、窒素等を含むがこれらに限られず、炭素に単結合または多重結合で結合している。他の官能基は、例えば、水酸基、カルボキシル基、アミド基、アミン基、置換アミン基等を含むがこれらに限定されない。
【００６３】
好ましいジケトピペラジンは、環の１または２の炭素が官能基で置換され、少なくとも１つのカルボキシル基を含むものである。
【００６４】
〔アミノ酸／ジケトピペラジン複合体形成摂動剤〕
ジケトピパレジンは、付加的なアミノ酸と重合して少なくとも１つのアミノ酸、そのエステルまたはアミド、及び好ましくは互いに共有結合した少なくとも１つのジケトピペラジンを含む。
【００６５】
ジケトピペラジンが付加的アミノ酸と重合するとき、１以上のＲ基は少なくとも１つの官能基を含み、官能基は分子の特性反応を負う非炭化水素部分である。
【００６６】
単純な官能基はヘテロ原子であり、ハロゲン、酸素、硫黄、窒素等を含むがこれらに限られず、アルキル基の炭素に単結合または多重結合で結合している。他の官能基は、例えば、水酸基、カルボキシル基、アミド基、アミン基、置換アミン基等を含むがこれらに限定されない。
【００６７】
本発明のアミノ酸／ジケトピペラジン複合体形成摂動剤の好ましい成分であるジケトピペラジンを挙げることができる。このような好ましいジケトピペラジンは、環の１または２の炭素が官能基で置換され、少なくとも１つのカルボキシル基を含むものである。
【００６８】
最も好ましいのは、アミノ酸／ジケトピペラジン複合体形成摂動剤のジケトピペラジンが、環化してジケトピペラジンを形成するＬ−グルタミン酸及びＬ−アスパラギン酸のような反応性アミノ酸から調製される。
【００６９】
ジケトピペラジンは、ビス−カルボン酸プラットホームを生成し、それは他のアミノ酸とさらに縮合して摂動剤を形成する。典型的には、ジケトピペラジンは、１以上のアミノ酸と、ジケトピペラジンのＲ基の官能基を介して反応して共有結合する。これらの独特な系は、ジケトピペラジンのキラル成分によって付与されるシス−幾何異性体によって（LAnnom，H.K.，Int．J．Peptide Protein Res.，28，67-78(1986)）、末端アミノ酸の構造を系統的に変換する機会を提供するが、その配向は非環状模倣物に比較して固定される（Fusaoka，Int．J．Peptide Protein Res.，34，104-110(1989)）。Lee，B.H.，J.Org.Chem.，49，2418-2423(1984); Buyle，R．Helv．Chim．Acta，49，1425，1429（1966）も参照。糖業者に知られた他の重合方法を、それ自体、アミノ酸／ジケトピペラジン重合にも使用できる。
【００７０】
アミノ酸／ジケトピペラジン摂動剤は、上記のように、同一または異なる１以上のアミノ酸、並びに同一または異なるジケトピペラジンを含む。
【００７１】
これらのアミノ酸／ジケトピペラジン摂動剤のエステル及びアミド誘導体も本発明では、有用である。
【００７２】
〔修飾アミノ酸複合体形成摂動剤〕
修飾したアミノ酸、ポリアミノ酸、またはペプチドは、アシル化またはスルホン化され、アミノ酸アミド及びスルホンアミドを含む。
【００７３】
〔アシル化アミノ酸複合体形成摂動剤〕
特に以下の式出表されるアシル化アミノ酸を挙げることができる。
【化４】
ここで、Ａｒは置換または非置換フェニルまたはナフチルであり、
【化５】
ここで、Ｒ15は、Ｃ1−Ｃ24アルキル、Ｃ1−Ｃ24アルケニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、及びナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）であり、Ｒ15は任意に、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4アルケニル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、及びＣＯ2Ｒ5、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロ環アルキル、アルカリール、ヘテロアリール、ヘテロアルカリール、またはこれらの組合せで置換されていてもよく、
Ｒ17は水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ1−Ｃ4アルケニルであり、
Ｒ15は任意に、酸素、窒素、硫黄またはこれらの組合せで分断されていてもよく、そして、
Ｒ16は、水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ1−Ｃ4アルケニルである。
【００７４】
特に、下記の式で表されるものを挙げることができる。
【化６】
ここで、Ｒ18は（ｉ）Ｃ3−Ｃ10シクロアルキルであり、任意にＣ1−Ｃ7アルキル、Ｃ2−Ｃ7アルケニル、Ｃ1−Ｃ7アルコキシ、ヒドロキシ、フェニル、フェノキシ、またはＣＯＲ21で置換されていてもよく、Ｒ1は水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ2−Ｃ4アルケニルであるか、または、
（ｉｉ）Ｃ3−Ｃ10シクロアルキルで置換されたＣ1−Ｃ6アルキルであり、Ｒ20は、Ｃ1−Ｃ24アルキル、Ｃ1−Ｃ24アルケニル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルケニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）フェニル、（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）ナフチル、（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、フェニル（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、またはナフチル（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）であり、
Ｒ20は任意に、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4アルケニル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、及びＣＯ2Ｒ22、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルケニル、３−１０の環原子を有するヘテロ環であって、ヘテロ原子の１以上がＮ、Ｓ、Ｏまたはこれらの組合せ、アリール（Ｃ1−Ｃ10アルキル）アリール、アリール（Ｃ1−Ｃ10アルキル）またはこれらの組合せで置換されていてもよく、Ｒ20は任意に、酸素、窒素、硫黄またはこれらの組合せで分断されていてもよく、Ｒ22は水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ1−Ｃ4アルケニルである。
【００７５】
いくつかの好ましいアミノ酸は、サリチロールフェニルアラニン及び以下の式で表される化合物を含む。
【００７６】
【化７】
【００７７】
【化８】
【００７８】
【化９】
【００７９】
【化１０】
【００８０】
【化１１】
【００８１】
【化１２】
【００８２】
【化１３】
【００８３】
【化１４】
【００８４】
【化１５】
【００８５】
【化１６】
【００８６】
【化１７】
【００８７】
【化１８】
【００８８】
【化１９】
【００８９】
特に、以下の式で表される化合物を挙げることができる。
【化２０】
【００９０】
ここで、Ａは、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、またはＣｉｔであり、
任意に、ＡがＴｙｒ、Ａｒｇ、ＴｒｐまたはＣｉｔであるとき、Ａは２以上の官能基でアシル化されている。
【００９１】
好ましい化合物は、ＡがＴｙｒであるもの、ＡがＴｙｒかつ２官能基でアシル化されたもの、ＡがＴｒｐ、ＡがＴｒｐかつ２官能基でアシル化されたもの、ＡがＣｉｔであるもの、ＡがＣｉｔかつ２官能基でアシル化されたものである。
【００９２】
以下の式で表される化合物を特に挙げることができる。
【化２１】
ここで、ＡはＡｒｇまたはＬｅｕであり、ＡがＡｒｇであるとき、Ａは任意に２以上の官能基でアシル化されており、
【化２２】
ここで、ＡはＬｅｕまたはフェニルグリシンであり、
【化２３】
ここで、Ａはフェニルグリシンであり、そして、
【化２４】
ここで、Ａはフェニルグリシンである。
【００９３】
アシル化アミノ酸は、単一アミノ酸、２以上のアミノ酸の混合物、またはアミノ酸エステルとアミノ酸に存在するフリーアミノ部位と反応してアミドを形成するアミン修飾剤から調製される。
【００９４】
好ましくは、アシル化アミノ酸を調製するために有用なアシル化剤の例は、
【化２５】
で表される酸塩化物アシル化剤を含むがこれらに限定されない。ここで、Ｒ23は、調製される修飾アミノ酸に適当な基であり、例えば、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、または芳香族、特にメチル、エチル、シクロヘキシル、シクロフェニル、フェニル、またはベンジルであるがこれらに限定されず、Ｘは脱離基である。典型的な脱離基は、塩化物、臭化物及びヨウ化物などのハロゲンであるがこれらに限定されない。
【００９５】
アシル化剤の例は、塩化アセチル、塩化プロピル、塩化シクロヘキサノイル、塩化シクロペンタノイル及び塩化シクロヘプタノイル、塩化ベンゾイル、塩化ヒプリル等に限られないハロゲン化アシル、並びに、無水酢酸、無水プロピオン酸、無水シクロヘキサン酸、無水安息香酸、無水ヒプリル酸等の無水物を含む。好ましいアシル化剤は、塩化ベンゾイル、塩化ヒプリル、塩化アセチル、塩化シクロヘキサノイル、塩化シクロペンタノイル、及び塩化シクロヘプタノイルを含む。
【００９６】
アミン基も、アミノ酸、特にフェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン等の親水性アミノ酸のカルボジイミド誘導体を用いたカルボン酸との反応によって修飾することができる。さらなる例は、ジシクロヘキシルカルボジイミド等を含む。
【００９７】
アミノ酸が多官能性であるとき、即ち、−ＯＨ、ＮＨ2または−ＳＨ基を１以上有するとき、その１以上の官能基をアシル化して、例えば、エステル、アミド、またはチオエーテル結合を形成してもよい。
【００９８】
例えば、多数アシル化されたアミノ酸の調製において、アミノ酸は、例えば水酸化ナトリウムまたはカリウム等の金属水酸化物のアルカリ溶液に溶解し、アシル化剤を添加する。反応時間は約１時間から約４時間であり、好ましくは約２から２．５時間である。混合物の温度は、一般的には約５℃から約７０℃、好ましくは約１０℃から約５０℃に維持する。アミノ酸のアミノ基１当量当たりに用いるアルカリの量は、通常は約１．２５ｍｏｌから約３ｍｏｌ、好ましくはＮＨ2基１当量当たり約１．５ｍｏｌから２．２５ｍｏｌである。反応溶液のｐＨは、通常は、約ｐＨ８から約ｐＨ１３、好ましくは約ｐＨ１０から約ｐＨ１２である。アミノ酸の量に応じて用いるアミノ修飾剤の量は、アミノ酸のフリーＮＨ2基もモル数に基づく。一般に、アミノ修飾剤は、アミノ酸の全フリーＮＨ2基の１モル当量当たり、約０．５から約２．５モル当量、好ましくは約０．７５から約１．２５モル当量である。
【００９９】
修飾アミノ酸形成反応は、濃塩酸等の適当な酸で混合物のｐＨを約２から約３まで調製することによって停止する。混合物は室温で分離し、上方の透明層と下方のオフホワイト沈殿物を生成する。上層を廃棄し、濾過及びデカンテーションによって修飾アミノ酸を回収する。残った修飾アミノ酸は、次いで水と混合する。不溶性物質を濾過で取り除き、濾過物を真空乾燥する。修飾アミノ酸の収率は、一般的に約３０％から６０％であり、通常は約４５％である。本発明は、例えばジアシル化、トリアシル化といった多数アシル化されたアミノ酸も考慮する。
【０１００】
アミノ酸エステルまたはアミドが出発物質である場合、ジメチルホルムアミドまたはピリジンなどの適当な溶媒に溶解し、約５℃から約７０℃、好ましくは約２５℃の温度で、約７から約２４時間の間、アミノ修飾剤と反応させる。アミノ酸エステルに対して用いるアミノ修飾剤の量は、アミノ酸について上気したのと同様である。
【０１０１】
その後、反応溶媒を負圧で除去し、任意に、修飾アミノ酸を適当なアルカリで加水分解してエステルまたはアミド官能性を除去してもよい。例えば、１Ｎの水酸化ナトリウムを用い、約５０℃から約８０℃で、好ましくは約７０℃で、エステル基が加水分解されたフリーなカルボキシル基を有する修飾アミノ酸が生成されるのに充分な時間処理する。加水分解混合物は、次いで室温に冷却して、例えば２５％塩酸水溶液でｐＨが約２から約２．５となるまで酸性化する。修飾アミノ酸、溶液から沈降し、濾過、デカンテーションなどの従来の手段で回収する。
【０１０２】
修飾アミノ酸は、酸沈降、再結晶、または固体カラム支持体上での分離によって精製してもよい。分離は、酢酸／ブタノール／水を移動相として用いたシリカゲル、アルミナ等の適当なカラム支持体上、トリフルオロ酢酸／アセトニトリル混合物を移動相とする反転相カラム支持体、及び水を移動相とするイオン交換クロマトグラフィーで行うことができる。修飾アミノ酸は、メタノール、ブタノールまたはイソプロパノールなどの低級アルコール抽出で無機塩を除去して精製してもよい。
【０１０３】
修飾アミノ酸は、一般にアルカリ水溶液（ｐＨ＞９．０）に可溶であり、エタノール、ｎ−ブタノール及びトルエン／エタノールの１：１（ｖ／ｖ）溶液に一部溶解し、中性の水に不溶である。アミノ酸誘導体の例えばナトリウム塩等のアルカリ金属塩は、一般に約ｐＨ６−８の水に可溶である。
【０１０４】
ポリアミノ酸またはペプチドにおいて、１以上のアミノ酸を修飾（アシル化）してもよい。修飾ポリアミノ酸及びペプチドは、１以上のアシル化アミノ酸を含んでよい。線状ポリアミノ酸及びペプチドは、一般的にはただ１つのアシル化アミノ酸を含むが、他のポリアミノ酸及びペプチドのコンフィギュレーションは、１以上のアシル化アミノ酸を含む。ポリアミノ酸及びペプチドは、アシル化アミノ酸と重合可能であり、重合の後アシル化してもよい。
【０１０５】
特に次の化合物を挙げることができる。
【化２６】
【０１０６】
〔スルホン化アミノ酸複合体形成摂動剤〕
スルホン化修飾アミノ酸、ポリアミノ酸、及びペプチドは、少なくとも１つのアミン基を、少なくとも１つのフリーなアミン基と反応するスルホン化剤でスルホン化して修飾する。
【０１０７】
特に、以下の式の化合物を挙げることができる。
【化２７】
Ａｒ−Ｙ−（Ｒ24）n−ＯＨ ＬＶここで、Ａは置換または非置換のフェニルまたはナフチルであり、
【化２８】
ここで、Ｒ25は、Ｃ1−Ｃ24アルキル、Ｃ1−Ｃ24アルケニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、及びナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルケニル）であり、
Ｒ25は任意に、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4アルケニル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、及びＣＯ2Ｒ27、またはこれらの組合せで置換されていてもよく、
Ｒ27は水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ1−Ｃ4アルケニルであり、
Ｒ25は任意に、酸素、窒素、硫黄またはこれらの組合せで分断されていてもよく、そして、
Ｒ26は、水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ1−Ｃ4アルケニルである。
【０１０８】
好ましくは、スルホン化アミノ酸を調製するのに有用なスルホン化剤の例は、式Ｒ28−ＳＯ2−Ｘを有するスルホン化剤であり、Ｒ28はアルキル、アルケニル、シクロアルキルまたは芳香族に限られない調製される修飾アミノ酸に適当な基であり、Ｘは上述のような脱離基であるが、これらに限定されない。スルホン化剤の１つの例は塩化ベンゼンスルホニルである。
【０１０９】
修飾ポリアミノ酸及びペプチドは、、１以上のスルホン化アミノ酸を有する。
線状ポリアミノ酸及びペプチドは、一般的にはただ１つのスルホン化アミノ酸を含むが、他のポリアミノ酸及びペプチドのコンフィギュレーションは、１以上のスルホン化アミノ酸を含む。ポリアミノ酸及びペプチドは、スルホン化アミノ酸と重合可能であり、重合の後スルホン化してもよい。
【０１１０】
〔修飾アミノ酸誘導体複合体形成摂動剤〕
修飾アミノ酸、ポリアミノ酸、またはペプチド誘導体は、少なくとも１つのアルデヒドまたはケトンに変換したアシル末端を有し、少なくとも１つのフリーなアミン基が、存在する少なくとも１つのフリーなアミン基と反応するアシル化剤でアシル化されたアミノ酸、ポリアミノ酸、またはペプチドである。
【０１１１】
アミノ酸、ポリアミノ酸、ペプチド誘導体は、アミノ酸エステルまたはペプチドを適当な還元剤で還元することにより容易に調製される。例えば、アミノ酸、ポリアミノ酸、またはペプチドの無水物は、R．Chen，Biochemistry，1979，18, 921-926 に記載されているように調製できる。アミノ酸、ポリアミノ酸、またはペプチドのケトンは、Organic Synthesis，Col．Vol．IV，Wiley，(1963)，5頁に記載された方法によって調製できる。アシル化については既に述べた。
【０１１２】
例えば、誘導体は、単一のアミノ酸、ポリアミノ酸またはペプチド誘導体、または２以上のアミノ酸、ポリアミノ酸またはペプチド誘導体の混合物を、アシル化剤または誘導体に存在するアミノ部分と反応してアミドを形成するアミン修飾剤と反応させて調製される。アミノ酸、ポリアミノ酸、またはペプチドは、修飾してから誘導してもよく、誘導してから修飾しても良く、修飾と誘導を同時にしてもよい。当業者に知られた望まない副反応を避けるために保護基を用いてもよい。
【０１１３】
修飾ポリアミノ酸またはペプチド誘導体では、１以上のアミノ酸が誘導体化（アルデヒドまたはケトン）及び／または修飾（アシル化）されてもよいが、少なくとも１つの誘導体及び少なくとも１つの修飾がなければならない。
【０１１４】
特に、修飾アミノ酸誘導体、Ｎ−シクロヘキサノイル−Ｐｈｅ−アルデヒド、Ｎ−アセチル−Ｐｈｅ−アルデヒド、Ｎ−アセチル−Ｔｙｒ−ケトン、Ｎ−アセチル−Ｌｙｓ−ケトン及びＮ−アセチル−Ｌｅｕ−ケトン、及びＮ−シクロヘキサノイルフェニル−アラニン−アルデヒドを挙げることができる。
【０１１５】
〔カルボン酸複合体形成摂動剤〕
種々のカルボン酸及びコレラのカルボン酸の塩が、複合体形成摂動剤として使用できる。これらのカルボン酸は以下の式で表される。
【化２９】
ここで、Ｒ29は、Ｃ1−Ｃ24アルキル、Ｃ2−Ｃ24アルケニル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルケニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）フェニル、（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）ナフチル、（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、フェニル（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1−Ｃ10アルキル）、及びナフチル（Ｃ2−Ｃ10アルケニル）であり、Ｒ29は任意に、Ｃ1−Ｃ10アルキル、Ｃ2−Ｃ10アルケニル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、及びＣＯ2Ｒ30、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルケニル、３−１０の環原子を持つヘテロ環アルキルであってヘテロ原子がＮ、Ｏ、Ｓ、またはこれらの組合せであるもの、アリール、（Ｃ1−Ｃ10アルキル）アリール、アリール（Ｃ1−Ｃ10）アルキル、またはこれらの組合せで置換されていてもよく、Ｒ29は任意に、酸素、窒素、硫黄またはこれらの組合せで分断されていてもよく、そして、Ｒ30は、水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、またはＣ2−Ｃ4アルケニルである。
【０１１６】
好ましいカルボン酸は、シクロヘキサンカルボン酸、シクロペンタンカルボン酸、シクロヘプタンカルボン酸、ヘキサン酸、３−シクロヘキサンプロピオン酸、メチルシクロヘキサンカルボン酸、１，２−シクロヘキサン時カルボン酸、１，３−シクロヘキサン時カルボン酸、１，４−シクロヘキサンジカルボン酸、１−アダマンタンカルボン酸、フェニルプロピオン酸、アジピン酸、シクロヘキサンペンタン酸、シクロヘキサンブタン酸、ペンチルシクロヘキサン酸。２−シクロペンタンヘキサン酸、シクロヘキサンペンタン酸、ヘキサンジオイック酸、シクロヘキサンブタン酸、及び（４−メチルフェニル）シクロヘキサン酢酸である。
【０１１７】
〔複合体形成摂動剤の他の例〕
ここで記載する超分子複合体を形成できる全ての複合体形成摂動剤が本発明の範囲に入り、複合体形成摂動剤の他の例は、２−カルボキシメチル−フェニルアラニン−ロイシン；２−ベンジルケイヒ酸、アクチノニン、フェニルスルホニルアミノフェニルブタン酸を含むが、これらに限定されない。
【化３０】
【０１１８】
〔模倣物〕
本発明の範囲内にある模倣物は、元のものと構造的及び／または機能的に等価な構造体である。超分子複合体及び活性薬の可逆的に送達可能な中間状態の構造的及び／または化学機能的模倣物は、適当な化学的及び／または構造的性質を有する非−ペプチド模倣物が調製できる場合は、ペプチドである必要はない。しかし、好ましい模倣物はペプチドであり、超分子または中間状態とは異なる一次構造を有するが、超分子複合体または中間状態と同じ二次構造及び三次構造を有する。模倣物は、天然状態または中間状態の活性薬または超分子複合体より生物学的活性は小さいが、模倣物は、例えば経口送達の可能性の向上といった天然の状態が有しない他の重要な性質を具備する。
【０１１９】
このような模倣物を調製する方法は、例えば以下の文献に記載されている。
Yamazaki，Chirality，3: 268-276(1991); Wiley，Peptidomimetics Derivered From Natural Products，Medicinal Research Reviews，Vol．13，No.3，327-384(1993)，Gurrath，Eur．J．Biochem，210，991-921(1992)，Yamazaki，Int．J．Peptide Protein Res.，37，364-381(1991)，Bach，Int．J．Peptide Protein Res.，38，314-323(1991)，Clark，J．Med．Chem．32，2026-2038(1989)，Portoghese，L.Med．Chem.，34，(6)1715-1720(1991)，Zhou，J．Immunol.，149，(5)，1763-1769(1992,9,1)，Holzman，J.Protein Chem.，10，(5)，553-563(1991)，Masler，Arch．Insect Biochem．and Physiol.，22，87-111，(1993)，Saragovi，Biotechnology，10，(1992，6)，Olmsteel，J.Med．Chem.，36(1)，179-180(1993)，Malin，Peptides，14，47-51(1993)，及び Kouns，Blood，80(10)，2539-2537(1992)，Tanaka，Biophys．Chem.，50，48-61(1994)，DeGrado，Science，243，(1989，2，3)，Regan，Science，241，976-978(1988，8，19)，Matouscek，Nature，340，120126(1989，7，13)，Parker，Peptide Research，4(6)，347-354(1991)，Parker，Peptide Research，4(6)，355-363(1991)，Federov，J．Mol．Biol.，225，927-931(1992)，Ptitsyn，Biopolymers，22，15-25(1983)，Ptitsyn，Protein Engineering，2(6)，443-447(1989)。
【０１２０】
例えば、タンパク質構造は構成アミノ酸の分子間−及び分子内−相互作用によって決定される。αヘリックスにおいて、ヘリックスの第１及び第４のアミノ酸は、非共有結合で互いに相互作用する。このパターンは、最初の４個及び最後の４個のアミノ酸を除く全てのヘリックスを通じて繰り返される。さらに、アミノ酸の側鎖は、互いに相互作用する。例えば、フェニルアラニンのフェニル側鎖は、そのフェニルアラニンがヘリックス中に存在するときには溶媒に曝されないであろう。
【０１２１】
このフェニルアラニンの相互作用がヘリックスの安定性に寄与するのであれば、フェニルアラニンをアラニンに置換することはヘリックスを乱して、タンパク質のコンフォメーションを変化させる。
【０１２２】
従って、最初に、どのアミノ酸の側鎖が溶媒に曝され、そしてそれにより生来の状態の安定化に寄与することから除外されるかを、例えばスキャンニング突然変異誘発法によって決定することによって、模倣体を作り出すことができる。それらと同じ格好でアミノ酸置換基を有する突然変異体を作り出し、置換されたアミノ酸が生来に近いものよりもより中間体に近いタンパク質コンフォメーションを付与するようにすることができる。適切な構造が合成されたことの確認は、スペクトル法及びその他の分析法によってもたらされる。
【０１２３】
〔送達組成物〕
上述の超分子複合体を含む送達組成物は、典型的には摂動剤を活性薬に混合して調製される。成分は、投与前に調製でき、投与の直前にも調製できる。
【０１２４】
本発明の送達組成物は、１以上の酵素阻害剤を含んでもよい。このような酵素阻害剤はアクチノニンまたはその誘導体を含むがそれらに限定されない。これらの化合物は以下の構造を有する。
【化３１】
【化３２】
【０１２５】
これらの化合物の誘導体は、U.S.Patant No．5,206,384 に開示されている。アクチノニン誘導体は次の構造を有する。
【化３３】
ここで、Ｒ31は、カルボキシアミド、ヒドロキシアミノカルボニル及びアルコキシカルボニル基から選択されるスルホキシメチルまたはカルボキシまたは置換カルボキシ基であり、Ｒ32はヒドロキシ、アルコキシ、ヒドロキシアミノ、またはスルホキシアミノ基である。他の酵素阻害剤は、アプロチニン(Trasylol)及びボーマンーバーク阻害剤を含むが、これらに限定されない。
【０１２６】
本発明の送達組成物は、１以上の賦形剤、希釈剤、崩壊剤、潤滑剤、柔軟剤、着色剤、または投与溶媒(dosing vehicle)を含んでもよい。好ましい投与単位は、経口投与量単位である。最も好ましい投与形態単位は、錠剤、カプセル、または液体であるが、これらに限定されない。投与量単位は、生物学的、製薬的、または治療的に有効量の活性薬を含有し、多数回投与形態単位で、合計が投与されるようにしてもよい。投与形態は、この分野での従来方法によって調製できる。
【０１２７】
本発明は、生物学的活性薬を、トリ等の動物、霊長類、特にヒトなどの哺乳類、及び昆虫に投与するのに有効である。このシステムは、活性薬が標的領域（活性薬が送達されるべき領域）に到達するまでに出会う環境、投与される動物の身体の条件によって破壊または活性低下するような化学的及び生物学的活性薬の送達に特に有利である。特に、本発明は、特に通常は経口送達不可能な活性薬の経口投与に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２８】
〔好ましい実施態様の説明〕
以下の実施例は本発明を例示するが、何ら限定はしない。全ての部及び比率は、特に断らない限り重量％である。
【０１２９】
[実施例１] α-インターフェロン未変性ゲル
未変性勾配ゲル（Pharmacia）に、６４７μｇ／ｍｌのα-インターフェロン（Intron-A-Schering Plough）および増化した量（１０−５００ｍｇ／ｍｌ）の摂動剤(perturbant)（ベンゼンスルホニルクロリドで修飾されたＬ-バリン、Ｌ-ロイシン、Ｌ-フェニルアラニン、Ｌ−リシンおよびＬ-アルギニンの混合物）（バリン−７．４％、ロイシン−１６．５％、フェニルアラニン−４０．３％、リシン−１６．２％およびアルギニン１９．６％）とを流した。充填用６／４コーム(comb)を用いて、ゲルに４μｌの材料を充填した。
【０１３０】
結果は、図１に示されている。
レーン１＝高分子量マーカー（Bio-Rad）−１：２０希釈ｗ／ｄＨ2Ｏ−（５μｌ-＞１００μｌ）。
レーン２＝α-インターフェロンＡ（６４７μｇ／ｍｌ）対照５μｌ＋５μｌブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）−（１．２９μｇ充填）。
レーン３＝α-インターフェロン＋摂動剤（１０ｍｇ／ｍｌ）−５０μｌα-インターフェロン＋５０μｌＢＰＢ＝１００μｌ（１．２９μｇ充填）。
レーン４＝α-インターフェロン＋摂動剤（５０ｍｇ／ｍｌ）−５０μｌα-インターフェロン＋５０μｌＢＰＢ＝１００μｌ（１．２９μｇ充填）。
レーン５＝α-インターフェロン＋摂動剤（１００ｍｇ／ｍｌ）−５０μｌα-インターフェロン＋５０μｌＢＰＢ＝１００μｌ（１．２９μｇ充填）。
レーン６＝α-インターフェロン＋摂動剤（５００ｍｇ／ｍｌ）−５μｌα-インターフェロン＋５μｌＢＰＢ＝１０μｌ（１．２９μｇ充填）。
【０１３１】
[実施例１Ａ] α-インターフェロン未変性勾配ゲル
摂動剤を、３０００分子量遮断フィルターを通して分画された、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシンおよびフェニルアラニン（Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｅ−Ｐｈｅ）の温度凝縮産物に置換して実施例１の方法を行った。
【０１３２】
結果は図２に示されている。
サンプル
レーン１＝高分子量マーカー（Bio-Rad）。
レーン２＝α-インターフェロンＡ（６４７μｇ／ｍｌ）-５μｌ＋５μｌＢＰＢ 対照。
レーン３＝α-インターフェロン＋摂動剤（１０ｍｇ／ｍｌ）−５０μｌ＋５０μｌＢＰＢ＝１００μｌ。
レーン４＝α-インターフェロン＋摂動剤-５０μｌ＋５０μｌＢＰＢ＝１００μｌ。
レーン５＝α-インターフェロン＋摂動剤（１００ｍｇ／ｍｌ）−５０μｌイントロンＡ＋５０μｌＢＰＢ＝１００μｌ。
レーン６＝α-インターフェロン＋摂動剤（５００ｍｇ／ｍｌ）−５μｌイントロンＡ＋５０μｌＢＰＢ＝１００μｌ。
【０１３３】
実施例１および１Ａは、α-インターフェロンのみ（図１および２のレーン２）が、適切な分子量（約１９０００ダルトン）にバンドを提示したことを表している。固定された濃度のα-インターフェロンに対して、添加された摂動剤の量が各レーン毎に増加するにつれ、α-インターフェロンは、高いと言うよりは、より低い分子量へと移動する。実施例１の摂動剤に見られる変化は、実施例１Ａの摂動剤に見られるものより明らかである。これは、α-インターフェロンの構造が二つの異なる摂動剤によって変化したことを示している。これは、もし構造が変化していなかったら、活性剤と摂動剤の複合体としてより高い分子量へとシフトするからである。
【０１３４】
［実施例２］α-インターフェロンと摂動剤のラットへの経口投与
オスのSprague-Dawleyラット（平均体重は約２５０ｍｇ）を、寝具のない金網の上で夜通し絶食させた。投与する前に、皮下にケタミン／トラジン(thorazine)の組み合わせを注入して動物を麻酔した。実施例１に基づいて調製した組成物の投与溶液を、５００μｇ／ｋｇで、投与溶液を含む１ｃｃのシリンジに取り付けられた１０−１２ｃｍのゴム製カテーテルを介して経口栄養摂取的(via oral gavage)に投与した。血液サンプルは、所望の時間に尾の静脈から採取した。血清を調製し、アッセイするまで−７０℃に凍結させた。血清サンプルをＥＬＩＳＡでアッセイした（Biosource International，Camarillo，CA，Cytoscreen Immunoassay KitTM，Catalog #ASY-05 for human IFN-α）。
【０１３５】
結果は図３に示されている。
【０１３６】
［実施例２Ａ］α-インターフェロンと摂動剤のラットへの経口投与
実施例１Ａに基づいて調製した組成物の７８μｇ／ｋｇの投与溶液に置換して、実施例２の方法を行った。結果は図３に示されている。
【０１３７】
［比較例２*］α-インターフェロンのラットへの経口投与
摂動剤を含まない１００μｇ／ｋｇのα-インターフェロンを実施例２の方法に基づいて投与した。
結果は、図３に示されている。
【０１３８】
［実施例３］サケカルシトニンおよび摂動剤のラットへの経口投与
実施例１の摂動剤を蒸留水で戻し、ＨＣｌもしくはＮａＯＨでｐＨを７．２−８．０に調節した。サケカルシトニン（ｓＣｔ(salmon calcitonin)）をクエン酸ストック溶液（０．０８５Ｎ）に溶かし、摂動剤溶液と組み合わせて最終的な投与溶液を得た。摂動剤とＳＣｔの終濃度は、それぞれ４００ｍｇ／ｍｌと５μｇ／ｍｌであった。
【０１３９】
結果は以下の表１に示されている。
【０１４０】
体重が１００−１５０ｇの２４時間絶食したオスのSprague-Dawleyラットを、ケタミンで麻酔した。経口栄養摂取的に、８００ｍｇ／ｋｇの摂動剤と１０μｇ／ｋｇのｓＣｔのビヒクルの投与溶液を投与した。投与溶液を１０ｃｍのゴム製カテーテルを用いて投与した。投与から１時間後に、ラットに、１．５ｍｇ／ｋｇのトラジンと４４ｍｇ／ｋｇのケタミンを筋肉注射した。投与から１、２、３および４時間後に、ラットの尾の動脈から血液サンプルを採取し、シグマ診断キット（Catalog #587-A，Sigma Chemical Co，St．Louis，MO）を用いて血清カルシウム濃度を調べた。結果は図４に示されている。
【０１４１】
［実施例３Ａ］
サケカルシトニンおよび摂動剤のラットへの経口投与 摂動剤として塩化シクロヘキサノイルで修飾されたＬ-チロシンに置換して、実施例３の方法を行った。
結果は図４に示されている。
【０１４２】
［比較例３* ］
摂動剤を含まないサケカルシトニン（１０μｇ／ｋｇ）を、実施例３の方法に基づいてラットに投与した。
結果は図４に示されている。
【０１４３】
［実施例４］等温下の滴定熱量測定
２．４ｍＭの実施例１の摂動剤と０．３ｍＭのｓＣｔの投与組成物を調製し、等温下の滴定熱量測定（isothermal titration calorimetry）をｐＨ６．５とｐＨ４．５で行った。ｐＨ６．５のバッファーは３０ｍＭＨｅｐｅｓ−３０ｍＭＮａＣｌであり、ｐＨ４．５のバッファーは３０ｍＭ酢酸ナトリウム−３０ｍＭＮａＣｌであった。
全ての実験は、滴下シリンジ中の８．０ｍＭ摂動剤と熱量計セル中の１．０ｍＭカルシトニンを用いて３０℃で行った。全ての実験において、摂動剤の１５ｘ１０μｌの増加量を、滴下と滴下の間に２分間の平衡化を行いながら、１０秒ずつ添加した。
結果は、滴下用シリンジに摂動剤（８ｍＭ）を入れ、当量の増量をｐＨ４．５バッファー（ｓＣｔ含まず）に添加した実験と、摂動剤を滴下用シリンジに入れ、１０μｌの増量をｐＨ６．５バッファー（ｓＣｔ含まず）に添加した実験で確認された。滴定曲線はこれらの実験からは得られず、この結果は、摂動剤の混合および／または希釈による熱は無視してよいことを示した。それゆえ、実験的等温式は、バックグラウンドを引くことによって補正されなかった。
【０１４４】
結果は以下の表１に示されている。
【０１４５】
［実施例４Ａ］
実施例１Ａの摂動剤を置換して、実施例４の方法を行った。結果は、摂動剤を滴下用シリンジに入れ、当量の増量をｐＨ４．５バッファー（ｓＣｔ含まず）に添加した実験で確認された。
実施例１Ａの摂動剤を置換して、実施例４の方法を行った。結果は、摂動剤を滴下用シリンジに入れ、当量の増量をｐＨ４．５バッファー（ｓＣｔ含まず）に添加した実験で確認された。
結果は、以下の表１に示されている。
【０１４６】
【表１】
１ 熱量測定実験は、本質的に、You, J.L., Scarsdale, J.N., とHarris, R. B., J. Prot. Chem. 10: 301-311, 1991; You, Junling, Page, Jimmy D., Scarsdale, J. Neel, Colman, Robert W., とHarris, R. B., Peptides 14: 867-876, 1993; Tyler-Cross, R., Sobel, M., Soler, D.F., とHarris, R. B., Arch. Biochem. Biophys. 306: 528-533, 1993; Tyler-Cross, R., Sobel, M., Marques, D., とHarris, R. B., Protein Science 3: 620-627, 1994. に詳説されているようにして行った。
【０１４７】
［実施例５］α-インターフェロンのＧｕＨＣｌ変性
ｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中の９．１ｍｇ／ｍｌのα-インターフェロン（Schering Plough Corp.）のストック溶液を調製した。リン酸ナトリウムバッファーと１０Ｍグアニジンヒドロクロリド（ＧｕＨＣｌ）（Shigma Chemical Co．-St．Louis，MO）ストック溶液でα-インターフェロンを希釈することによって、種々の濃度のＧｕＨＣｌで２００μｇ／ｍｌ濃度のα-インターフェロンとなるようにサンプルを調製した。測定の前に室温で約３０分間インキュベーションすることによって、希釈サンプルを平衡化した。
蛍光の測定は、日立Ｆ−４５００を用いて２５℃で行った。タンパク質トリプトファン蛍光は、２９８ｎｍの励起波長と３４３ｎｍの発光波長で観察された。
ＡＮＳ（１−アニリノナフタレン−８−スルホナート）蛍光は、３５５ｎｍの励起波長と５３０ｎｍの発光波長で観察された。全ての蛍光測定において、５ｎｍ励起および発光の両方のために５ｎｍのスペクトルバンドパス(spectral bandpass)を選択した。
結果は図５に示されている。
【０１４８】
［実施例６］α-インターフェロン形状におけるＧｕＨＣｌの濃度効果
ＧｕＨＣｌの５Ｍストック溶液を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２バッファーを用いて調製した。希釈後、ストック溶液のｐＨをチェックし、濃塩酸で調節した。最終的な溶液の濃度を調べるために、Yasuhiko NozakiによるMethod in Enzymology，Vol.6，第４３頁に記載された屈折率を用いた。
α-インターフェロンストック（９．１ｍｇ／ｍｌ）を十分な量のＧｕＨＣｌと混合して、以下の表１Ａの濃度を得た。
【０１４９】
【表２】
【０１５０】
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）を行い、その結果は図６に示されている。
【０１５１】
［実施例７］内在性トリプトファン蛍光で測定されるイントロンＡのｐＨ滴定
ｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー(Schering Plough Corp.)中に９．１ｍｇ／ｍｌのα-インターフェロンのストック溶液を調製した。以下のバッファー：ｐＨ２および１２のグリシン、ｐＨ３、４、５、７のリン酸ナトリウムおよびｐＨ８のホウ酸を用いて種々のｐＨ値で緩衝化された溶液中に２００μｇ／ｍｌの濃度までα-インターフェロンを希釈することによりサンプルを調製した。これらのバッファーを、Gerald D．Fasman，1990により編集されたPractical Handbook of Biochemistry and Molecular Biologyに記載されている通りに調製した。希釈サンプルを、測定前に室温で約３０分間インキュベートすることによって平衡化した。
蛍光を実施例５の方法に基づいて測定した。結果は図７に示されている。
【０１５２】
[実施例８] ＡＮＳ蛍光によって測定されたインシュリンのｐＨ滴定
１ｍｌの脱イオン水に２ｍｇのインシュリンを溶解することによって、ストック溶液を調製した。１０ｍｌの脱イオン水に１０ｍｇを溶かして１−アニリノナフタレン−８−スルホナート（ＡＮＳ）ストック溶液を調製した。以下のバッファー：ｐＨ２および１２のグリシン、ｐＨ３、４、５、７のリン酸ナトリウムおよびｐＨ８のホウ酸を用いて種々のｐＨ値で緩衝化された溶液中に２００μｇ／ｍｌの濃度までインシュリンを希釈することによりサンプルを調製した。これらのバッファーを、Gerald D．Fasman，1990により編集されたPractical Handbook of Biochemistry and Molecular Biologyに記載されている通りに調製した。最終的なＡＮＳ濃度は９０μｇ／ｍｌであった。希釈サンプルを、測定前に室温で約３０分間インキュベートすることによって平衡化した。
蛍光を実施例５の方法に基づいて測定した。結果は図８に示されている。
【０１５３】
[実施例９] ｐＨ２および７．２におけるα-インターフェロンの円偏光二色性スペクトルの可逆性
α-インターフェロンの円偏光二色性スペクトルをｐＨ７．２で引き起こした。次いで、溶液のｐＨをｐＨ２に再調節し、サンプルを再度スキャンした。次いで、サンプル溶液を７．２に再調節して、再度スキャンした。
α-インターフェロンの濃度は９．２μＭすなわち０．１７８４８ｍｇ／ｍｌであった（［ＩＦＮ］ストック＝９．１ｍｇ／ｍｌ）。使用したバッファーは、ｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸ナトリウムと、ｐＨ２．０の２０ｍＭグリシンであった。
ｐＨ７．２への転換により、天然構造が完全に回復し、中間状態の可逆性を示した。天然の状態と中間の状態との間のエネルギー差が小さいと思われる。
結果は図９Ａと９Ｂに示されている。
【０１５４】
[実施例１０] ７．２におけるα-インターフェロンの円偏光二色性スペクトル −ｐＨ依存性
種々のｐＨにおけるα-インターフェロンの規則的な二次構造の程度を、遠ＵＶレンジにおける円偏光二色性（ＣＤ）測定により調べた。インターフェロンストックの大きな希釈ファクター（〜５０倍）により、サンプルを適切なｐＨにした。α-インターフェロンの濃度は９．２μＭすなわち０．１７８４８ｍｇ／ｍｌであった（［ＩＦＮ］ストック＝９．１ｍｇ／ｍｌ）。使用したバッファーは、ｐＨ６．０および７．２の２０ｍＭリン酸ナトリウム；ｐＨ３．０、４．０、４．５、５．０そして５．５のＮａＡｃ；並びに、ｐＨ２．０の２０ｍＭグリシンであった。
【０１５５】
二次構造の内容を、ＣＤ曲線を４つの主要構造部：すなわちα-ヘリックス、β-シート、ターン、およびランダムコイルに分けるいくつかの適切なプログラムを用いて評価した。これらのプログラムの二つには、分析のためのＣＤ装置が備えられている。第一のプログラムは７つの対照タンパク質：すなわち、ミオグロビン、リゾザイム、パパイン、チトクロムＣ、ヘモグロビン、リオヌクレアーゼＡおよびキモトリプシンを用いている。第二のプログラムは、Yang.REF参照ファイルを用いている。
【０１５６】
第三のプログラムＣＣＡＦＡＳＴは、コンベックス・コンストレイント・アルゴリズム(Convex Constraint Algorithm)を用いており、“コンベックス・コンストレイント・アルゴリズムを用いたタンパク質の円偏光二色性スペクトル分析：実践ガイド(Analysis of Circular Dichroism Spectrum of Proteins Using the Convex Constraint Algorithm: A Practical Guide)”(A．Perczel，K．ParkとG.D.Fasman（1992）Anal．Biochem．203:83-93)。に記載されている。
【０１５７】
ｐＨボリューム（２．０−７．２）の範囲中の遠ＵＶスキャンのデコンボリューションは、ｐＨ３．５における二次構造の顕著な圧縮を示す。近ＵＶスキャンは、３次構造充填の崩壊を示唆し、遠ＵＶスキャンは、このｐＨにおいてまだ重要な二次構造があることを示唆する。
【０１５８】
結果は図１０に示されている。
【０１５９】
[実施例１１] インシュリンと濃度を増加したＧｕＨＣｌのＤＳＣ
ＤＳＣを、５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．５中の６ｍｇ／ｍｌインシュリン（分子量が６０００と仮定すれば０．８３ｍＭ）を用いて行った。各サーモグラムは、０．６Ｍグアニジン−リン酸バッファー溶液のバックグラウンドを引くことによって補正した。
インシュリンを５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．５中に濃縮ストック溶液として新鮮に調製し、適切な分注量をバッファーに希釈し、２ミクロンＰＴＦＥフィルターで濾過し、少なくとも２０分間脱気した。
スキャニング熱量測定(scanning calorimetry)を、５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．５１ミリリットル当たり５ｍｇ０．８３ｍＭブタインシュリンを用いて行った。全てのサーモグラムは、１℃／分のアップスケールモードで操作された（９０℃まで）ＤＡ２データ獲得システムを備えたMicrocal MC-2スキャニング熱量測定計で行われ、データポイントは２０分毎に集められた。全てのスキャンは、活性剤に観察されたトランジションより少なくとも２０度低いところから開始された。全てのサーモグラムは、ベースラインを引いて補正され、高分子の濃度が正常化された。Johns Hopkins Biocalorimetry Centerの方法に基づき、例えばRamsayら．Biochemistry（1990）29: 8677-8693; Schonら．Biochemistry（1989）28: 5019-5024(1990)29: 781-788を参照。ＤＳＣデータ分析ソフトウェアは、熱誘導高分子融解プロファイルの統計力学的デコンボリューションに基づいている。
ＧｕＨＣｌの構造に与える効果は、各溶液を、５Ｍストック溶液から０．５−２Ｍの範囲の濃度に希釈された変性剤を含有する、リン酸バッファー、ｐＨ７．５に調製したＤＳＣ実験で評価された。
結果は以下の表２に示されている。
【０１６０】
【表３】
【０１６１】
[実施例１２] インシュリンのＤＳＣスペクトルに対するイオン強度の効果
６ｍｇ／ｍｌのインシュリン（５０ｍＭリン酸バッファー中に０．８３ｍＭ、ｐＨ７．５、０．２５、０．５もしくは１．０ＭのＮａＣｌを含む）を含有するサンプルを用いた。サーモグラムを実施例１１の方法に従って行い、上述したように０．５ＭのＮａＣｌ−リン酸バッファーブランクを差し引くことによって補正した。
イオン強度の増加が構造に与える効果を、ＮａＣｌを０．２５−３Ｍの範囲の濃度で含むように各溶液を調製したＤＳＣ実験で評価した。
結果は、以下の表３に示されている。
【０１６２】
【表４】
【０１６３】
[実施例１２Ａ] ｒｈＧｈのＤＳＣスペクトルに与えるイオン強度の効果
インシュリンに代えて、０．５もしくは１．０ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸バッファー、ｐＨ７．５中の５ｍｇ／ｍｌの組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧｈ）（ＨＧＨのＭ２２１２８に基づいて２２５μＭ）を用いて実施例１１の方法を行った。サーモグラムは、０．５ＭＮａＣｌ−リン酸バッファーブランクを差し引くことによって補正された。
結果は以下の表４に示されている。
【０１６４】
【表５】
【０１６５】
[実施例１３] ｒｈＧＨのＤＳＣスペクトルに対するｐＨの影響
５ｍｇ／ｍｌのｒｈＧｈをバッファーに溶解した（分子量を２００００と仮定すれば５０ｍＭリン酸バッファー中に０．１７ｍＭ）。溶液のｐＨを所望の値に調節し、全ての曲線を、ベースラインを差し引いて補正した。
ｐＨ値が２．０〜６．０の範囲のリン酸バッファーに各溶液を調製した実施例１１の方法に基づくＤＳＣによって、構造に対するｐＨの効果を評価した。
結果を以下の表５に示す。
【０１６６】
【表６】
【０１６７】
[実施例１４] ｒｈＧｈのＤＳＣスペクトルに与えるＧｕＨＣｌの影響
最初のスキャンをＧｕＨＣｌの非存在下で１０ｍｇ／ｍｌで行った（分子量を２００００と仮定して０．３３ｍＭ）。次いで、ｒｈＧｈの濃度を、種々の濃度のＧｕＨＣｌを含む５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．５中に５ｍｇ／ｍｌ（０．１７ｍＭ）となるまで下げた。サーモグラムを、０．５Ｍのグアニジン−リン酸バッファー溶液のバックグラウンドを差し引くことによって補正した。サーモグラムを０．５ＭのＮａＣｌ−リン酸バッファーブランクを差し引くことによって補正した。スキャンを、実施例１１の方法に従って行った。
結果を以下の表６に示す。
【０１６８】
【表７】
【０１６９】
[実施例１５] α-インターフェロンのコンホメーションのｐＨ依存性
α-インターフェロンストック（９．１ｍｇ／ｍｌ）を０．６ｍｇ／ｍｌの濃度までバッファーで希釈した。サンプルをバッファー（バッファーに対するα-インターフェロンの体積比は１：４０００）で夜通し透析した。吸光計数が与えられていないので、使用したサンプルの濃度を、透析前後のサンプルの吸収スペクトルを比較することによって決定した。それぞれのｐＨに対して、既知の濃度の未透析のα-インターフェロンの吸収を２８０ｎｍで測定した。透析後、タンパク質の欠失、希釈等を説明するために再度吸収を読み取った。バッファーの状態とα-インターフェロンの濃度は以下の通りである。
ｐＨ３．０：バッファー − ２０ｍＭ ＮａＡｃ。 ［ＩＦＮ］＝０．５０ｍｇ／ｍｌ；
ｐＨ４．１：バッファー − ２０ｍＭ ＮａＡｃ。 ［ＩＦＮ］＝０．５３ｍｇ／ｍｌ；
ｐＨ５．０：バッファー − ２０ｍＭ ＮａＡｃ。 ［ＩＦＮ］＝０．３７ｍｇ／ｍｌ；
ｐＨ６．０：バッファー − ２０ｍＭ リン酸ナトリウム。 ［ＩＦＮ］＝０．３７ｍｇ／ｍｌ；
ｐＨ７．２：バッファー − ２０ｍＭ リン酸ナトリウム。 ［ＩＦＮ］＝０．
４８ｍｇ／ｍｌ。
【０１７０】
実施例１１の方法に基づいてＤＳＣスキャンを行った。室温であらゆるｐＨに対して、澄んだ透明なα-インターフェロン溶液が得られたが、温度スキャン後、ｐＨ５．０と６．０において沈殿の顕著な兆候が見られた。
結果を以下の表７に示す。
【０１７１】
【表８】
【０１７２】
[実施例１６] α-インターフェロンのコンホメーションに与えるＧｕＨＣｌの濃度の影響
ＧｕＨＣｌ／α-インターフェロンサンプルを、実施例６の方法に基づいて調製した。ＤＳＣスキャンを、実施例１１の方法に基づいて行った。
結果を以下の表８に示す。
【０１７３】
【表９】
【０１７４】
実施例５−１６は、イオン強度、グアニジンヒドロクロリド濃度、およびｐＨが、活性剤のＴｍに変化をもたらすことを示し、コンホメーションの変化を示唆する。これは、蛍光分光法によって確認された。可逆的中間体のコンホメーション状態は、模倣物（mimetics）を調製するための鋳型として用いることができる。
【０１７５】
[実施例１７] α-インターフェロン中間体状態模倣物の調製
α-インターフェロンの中間体コンホメーション状態を調べた。中間体状態の２次構造および３次構造を備えたペプチド模倣物を調製した。
【０１７６】
[実施例１８] インシュリン中間体状態模倣物の調製
α-インターフェロンをインシュリンに換えて実施例１７の方法を行った。
【０１７７】
[実施例１９] ｒｈＧｈ中間体状態模倣物(Intermediate State Mimetics)の調製
α-インターフェロンを組換えヒト成長ホルモンに換えて実施例１７の方法を行った。
【０１７８】
[実施例２０] α-インターフェロン模倣物のin vivo投与
実施例１７の方法で調製した模倣物を実施例２の方法に基づいてラットに投与した。
【０１７９】
[実施例２１] インシュリン模倣物のin vivo投与
実施例１８の方法に基づいて調製した模倣物に換えて実施例２０の方法を行った。
【０１８０】
[実施例２２] ｒｈＧＨ模倣物のin vivo投与
実施例１９の方法に基づいて調製した模倣物に換えて実施例１９の方法を行った。
【０１８１】
[実施例２４] 内在性トリプトファン蛍光によって測定されたα-インターフェロンの滴定
ｐＨ７．２における２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中の９．１ｍｇ／ｍｌα-インターフェロンのストック溶液を調製した。８００ｍｇの摂動剤（塩化シクロヘキサノイルでアシル化されたＬ-アルギニン）を２ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）に溶かして、摂動剤のストック溶液を調製した。
α-インターフェロンを、リン酸ナトリウムバッファーと種々の摂動剤濃度の摂動剤ストック溶液で希釈することによってサンプルを調製した。希釈されたサンプルを、測定の前に室温で約３０分間インキュベートすることによって平衡化させた。
α-インターフェロンの内在性トリプトファン残基の蛍光を、実施例５の方法に基づいて測定した。摂動剤は蛍光を含んでいなかった。
結果は実施例１１に示されている。
【０１８２】
[実施例２５] ラットへの摂動剤とα-インターフェロンのin vivo投与
α-インターフェロン（１ｍｇ／ｋｇ）と混合された実施例２４の摂動剤（８００ｍｇ／ｋｇ）を含む投与溶液を、実施例２の方法に基づいてラットに投与した。
結果は図１２に示されている。
【０１８３】
[比較例２５*]
実施例２５の方法に基づいて、α-インターフェロン（１ｍｇ／ｋｇ）をラットに投与した。血清サンプルを、実施例２５の方法に基づいて回収およびアッセイした。
結果は図１２に示されている。
【０１８４】
[実施例２６] α-インターフェロンと摂動剤の示差走査熱量測定法
摂動剤結合ＤＳＣをｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーを用いて行った。摂動剤ストック溶液を調製するために乾燥摂動剤を秤量した。α-インターフェロンストックをバッファーに希釈した。全体のセットに対して同じ活性濃度を備えるように、α-インターフェロン溶液は、実験の前に透析しなかった。
ＤＳＣサーモグラムを、０．６４ｍｇ／ｍｌの濃度のα-インターフェロンと５、１０、２５および１００ｍｇ／ｍｌの摂動剤濃度の摂動剤（＞９８％に精製されたフェニルスルホニル-パラ-アミノ安息香酸（スペクトルの作製の前に逆相クロマトグラフィーで調べた））を用いて引き起こした。ＤＳＣを、データの自動収集用のＩＢＭ ＰＣに連結したＤＡＳＭ−４示差走査熱量測定計で行った。スキャン速度は、６０℃／ｈであった。
結果は、以下の表９と実施例１３に示されている。
【０１８５】
[比較例２６*]α-インターフェロンの示差走査熱量測定法
実施例２６の方法を、摂動剤を含まないα-インターフェロンに置き換えて行った。結果は以下の表９と実施例１３示されている。
【０１８６】
【表１０】
【０１８７】
摂動剤の添加濃度が０−１００ｍｇ／ｍｌの範囲をとるＤＳＣスキャンは、濃度に依存して生じるα-インターフェロンの誘導されたコンホメーション変化を示す。１００ｍｇ／ｍｌの摂動剤では、サーモグラムが、α-インターフェロンＣｐ対Ｔｍ曲線が平らな線であることを示唆した。１００ｍｇ／ｍｌの摂動剤で得られた平らなＣｐ対Ｔｍ曲線は、α-インターフェロン分子内の疎水性残基が溶剤に曝されるようになったことを示唆する。摂動剤が、濃度に依存して、α-インターフェロンの構造を変化し得ることは明らかである。
【０１８８】
[実施例２７]透析実験 − 摂動剤と複合体を形成する可逆性
９．１ｍｇ／ｍｌの濃度のα-インターフェロンストック溶液を、α-インターフェロンが０．６ｍｇ／ｍｌの濃度になるまでバッファーで希釈した。実施例２６の方法に従ってＤＳＣを行った。
結果は図１４Ａ示されている。
【０１８９】
α-インターフェロン（０．６ｍｇ／ｍｌ）と実施例２６の摂動剤（１００ｍｇ／ｍｌ）を溶液のＣｐに明らかな変化を示さずに混合した。次いで、この溶液を、リン酸バッファーで夜通し透析し、サーモグラムを行った。結果は図１４Ｂに示されている。
【０１９０】
透析サンプルは、本質的に、摂動剤を添加する前と同じ様なＴｍとＣｐ対Ｔｍ曲線の下側面積を備えていた。このことは、摂動剤がタンパク質にコンホメーション変化を誘導するだけでなく、この過程が可逆的ことを示した。希釈は、活性剤から摂動剤を解離させるに十分な推進力であった。
【０１９１】
[実施例２８] 摂動剤とα-インターフェロンＤＳＣ
ＧｕＨＣｌを実施例２６の摂動剤に換えて実施例６の方法を行った。
結果は図１５に示されている。
α-インターフェロンの平衡変性(equilibrium denaturation)のＤＳＣ実験は、分子の中間体コンホメーションの存在を示唆する。ΔＨ対Ｔｍプロットは、各セットの実験条件におけるα-インターフェロンに占有された中間体コンホメーションのエネルギー学を示す。
【０１９２】
[実施例２９] ラットへの摂動剤およびα-インターフェロンのin vivo投与 実施例４の摂動剤（８００ｍｇ／ｋｇ）とα-インターフェロン（１ｍｇ／ｋｇ）の投与溶液を、実施例２に従ってラットに投与した。血清サンプルを収集し、実施例２の方法に従ってＥＬＩＳＡでアッセイした。
結果は図１６に示されている。
【０１９３】
[比較例２９*]ラットへのα-インターフェロンのin vivo投与
摂動剤を含まないα-インターフェロン（１ｍｇ／ｋｇ）を、実施例２９の方法に従ってラットに投与した。血清サンプルを収集し、実施例２９の方法に従ってアッセイした。
結果は図１６に示されている。
【０１９４】
図１６は、摂動剤と混合した活性剤を動物に経口投与した場合に、α-インターフェロンの顕著な血清力価が全身的な循環において検出できたこと、およびα-インターフェロンが十分に活性を有することを示唆している。誘導されたα-インターフェロンが十分に活性を備えていたという確認データは、イントロンの天然コンホメーションに特異的なエピトープを認識し得るモノクローナル抗体を利用した商業的なＥＬＩＳＡキットによって血清をアッセイしたこと、およびＥＬＩＳＡによって測定された力価と関連したイントロンの力価を決定する細胞変性効果アッセイを用いて血清をさらにアッセイしたこと（データ示さず）を含んでいた。それゆえ、摂動剤を用いた場合の結果として生じたコンホメーション変化は可逆的な変化であった。
【０１９５】
[実施例３０] α-インターフェロンにおける摂動剤濃度依存変化
摂動剤をシクロヘキサノイルフェニルグリシンに換えて、実施例２６の方法を行った。
結果を以下の表１０と図１７に示す。
【０１９６】
【表１１】
【０１９７】
シクロヘキサノイルフェニルグリシンは、濃度依存性のα-インターフェロンにおけるコンホメーション変化を誘導した。
【０１９８】
[実施例３１] ラットへの摂動剤およびα-インターフェロンのin vivo投与
実施例３０の摂動剤（８００ｍｇ／ｋｇ）とα-インターフェロン１（ｍｇ／ｋｇ）を含む投与溶液を、実施例２の方法に基づいてラットに投与した。血清サンプルを回収して、実施例２の方法に従ってＥＬＩＳＡによってアッセイした。
結果は図１８に示されている。
【０１９９】
[比較例３１*]ラットへの摂動剤およびα-インターフェロンのin vivo投与
摂動剤を含まないα-インターフェロン（１ｍｇ／ｋｇ）を、実施例２の方法に基づいてラットに投与した。血清サンプルを回収して、実施例２の方法に従ってＥＬＩＳＡによってアッセイした。
結果は図１８に示されている。
【０２００】
[実施例３２] 摂動剤およびα-インターフェロンＤＳＣ
実施例６の方法を、ＧｕＨＣｌを実施例３０の摂動剤に換えて行った。
結果は図１９に示されている。
【０２０１】
△Ｈ対Ｔｍプロットは、５および２５ｍｇ／ｍｌ以下のシクロヘキサノイルフェニルグリシン摂動剤で安定なα-インターフェロンの平衡中間体コンホメーションの存在を示唆する。
【０２０２】
[実施例３３] 摂動剤を含むα-インターフェロンの等温下の滴定熱量測定
α-インターフェロンと複合体を形成する摂動剤の等温下の滴定熱量測定を、二つの異なるｐＨで２５℃で行った。用いたバッファーは、ｐＨ７．２では２０ｍＭリン酸ナトリウムであり、ｐＨ３．０では２０ｍＭＮａＡｃであった。α-インターフェロン溶液を、適切なｐＨに達するように実験の前に透析した。乾燥摂動剤を秤量し、透析して希釈した。
ＩＴＣをMicroCal OMEGA滴定熱量測定計で行った（MicroCal Inc.-Northampton，MA）。データポイントを２秒ごとに収集したが、濾過はしなかった。１．３６２５ｍｌセルに配されたα-インターフェロン溶液を、濃縮された摂動剤溶液で満たされた２５０μｌのシリンジを用いて滴定した。ある量の滴定剤(titrant)を、５５回までの注入で３−５分毎に注入した。
二つの溶液の混合熱を補正するための対照実験は、反応セルが活性剤を含まないバッファーで満たされていること以外は同様にして行われた。
データの分析は、Johns Hopkins University Biocalorimetry Centerで開発されたソフトウェアを用いて行われた。
ｐＨ７．２における滴定は、実施例３０の摂動剤（５０ｍｇ／ｍｌ＝１９１．６ｍＭ（ＭＷ２６１））とα-インターフェロン（１．３ｍｇ／ｍｌ＝０．０６７ｍＭ（ＭＷ１９４００））の２μｌを５３回注入することを含む。
結果は図２０に示されている。
【０２０３】
曲線適応(curve fitting)は、多重独立部位(multiple independent sites)を示した。
ｎ（１）＝１２１．０３５４ ｎ＝＃完成された摂動剤分子
△Ｈ（１）＝５８．５９３２ｃａｌ／モル摂動剤
ｌｏｇ１０Ｋａ（１）＝２．５２４８３４ Ｋａ＝結合定数
ｘ軸ユニットは、ｍＭ表示されたキャリアーの濃度である。
ｙ軸ユニットは、カロリー表示された熱／注入を示す。
ｐＨ３では、複合が負のエンタルピーをもたらした。
【０２０４】
[比較例３３*]摂動剤の等温下の滴定熱量測定
活性剤を含まない実施例３０の摂動剤（５０ｍｇ／ｍｌ＝１９１．６ｍＭ）［ＩＦＮ］＝０ｍｇの２μｌを５３回注入して行った。
実施例３３と比較例３３は、α-インターフェロンが正のエンタルピーを備え、結合定数（Ｋd １０-3Ｍ）を備えることを示している。
【０２０５】
[実施例３４] α-インターフェロンと摂動剤複合体の等温下の滴定熱量測定
実施例３０の摂動剤を実施例２６の摂動剤に換えて、実施例３３の方法を行った。
ｐＨ７．２における滴定は、摂動剤（５０ｍｇ／ｍｌ＝１８１ｍＭ（ＦＷ２７７））
とα-インターフェロン（２．３１ｍｇ／ｍｌ＝０．１１９ｍＭ（ＭＷ１９４００））の５μｌを５５回注入することを２回繰り返すことを含む。
結果は図２１に示されている。
【０２０６】
曲線適応は、多重独立部位を示した。
ｎ（１）＝５５．１１８４８ ｎ＝＃複合摂動剤分子
△Ｈ（１）＝−１１４．５８７ｃａｌ／モル摂動剤
ｌｏｇ１０Ｋａ（１）＝２．８１９７４８ Ｋａ＝結合定数
ｘ軸ユニットは、ｍＭ表示されたキャリアーの濃度である。
ｙ軸ユニットは、カロリー表示された熱／注入を示す。
【０２０７】
ｐＨ３では、α-インターフェロンに対する摂動剤の複合形成により、溶液から複合体が沈降した。この工程で生じた熱効果のために、複合パラメーターを測定することは不可能であった。
【０２０８】
[比較例３４*]摂動剤の等温下の滴定熱量測定
活性剤を含まないｐＨ７．２のリン酸ナトリウム２０ｍＭリン酸ナトリウム中の実施例２６の摂動剤（５０ｍｇ／ｍｌ＝１８１ｍＭ）の５μｌを５５回注入して実施例３４の方法を行った。
α-インターフェロンと複合した実施例２６の摂動剤は、負のエンタルピーをもたらし、実施例３０の摂動剤とα-インターフェロンとの結合定数と比較可能な結合定数をもたらした。
実施例３３および３４は、活性剤と摂動剤との複合がより強力になり、活性剤の中間状態が熱力学的により安定になれば、活性剤の生物利用能がより良好になることを示している。
それゆえ、活性剤と摂動剤に対して△Ｈ対Ｔｍ曲線をプロットすることによって、Ｔｍの広範囲においてエンタルピーの変化をほとんどあるいは全く示さない摂動剤が、より好ましい摂動剤であろう。より優れた状態に中間状態を安定化する摂動剤が、より効率的な活性剤の送達をもたらすと考えられる。
【０２０９】
[実施例３５] α-インターフェロンを用いた△Ｈ対Ｔｍプロットに対する３種の摂動剤の効果の比較
０．５ｍｇ／ｍｌのα-インターフェロンと（１）ベンゾイル=パラ-アミノフェニル酪酸(benzoyl para-amino phenylbutyric acid)、（２）実施例３０の摂動剤、あるいは（３）実施例２６の摂動剤とを混合したものを用いて、実施例２６の方法に基づいてＤＳＣ実験を行った。
ベンゾイル=パラ-アミノフェニル酪酸は、バッファー状態ではほとんど溶けなかった。室温で溶液が透明を保つ最大濃度は〜８ｍｇ／ｍｌであった。それゆえ、用いられた摂動剤の濃度は、２、４および６ｍｇ／ｍｌであった。結果は図２２および２３に示されている。
図２２の点線は、線最小自乗（the linear least squares）を示し、その回帰式(the regression equation)は図２２の上に記載されている。
【数１０】
図２２および２３は、ベンゾイル=パラ-アミノフェニル酪酸が、実施例３０および２６の摂動剤よりも容易にα-インターフェロンのコンホメーション変化を生じ得ること、並びに、このような変化は、実施例２６の摂動剤よりも実施例３０の摂動剤により容易にもたらされ得ることを示す。
【０２１０】
[実施例３６]α-インターフェロンと複合形成の等温下の滴定熱量測定
摂動剤ベンゾイル=パラ-アミノフェニル酪酸（７．５ｍｇ／ｍｌ＝２４．５９ｍＭ、（ＦＷ３０５））とα-インターフェロン（２．５ｍｇ／ｍｌ＝０．１２９ｍＭ（ＭＷ１９４００））の５μｌを４０回注入して、実施例３３の方法に基づいてＩＴＣを行った。
結果は図２４に示されている。
曲線適応は、多重独立部位を示した。
ｎ（１）＝２３．６９５７８ ｎ＝＃複合摂動剤分子
△Ｈ（１）＝７９１．５７２６ｃａｌ／モル摂動剤
ｌｏｇ１０Ｋａ（１）＝３．３４３２６１ Ｋａ＝結合定数
ｘ軸は、ｍＭ表示されたキャリアーの濃度を示す。
ｙ軸は、カロリー表示された熱／注入を示す。
【０２１１】
[比較例３６*]
活性剤を含まない、ｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中の摂動剤ベンゾイル=パラ-アミノフェニル酪酸（７．５ｍｇ／ｍｌ＝２４．５９ｍＭ）の５μｌを４０回注入して、実施例３６の方法に基づいてＩＴＣを行った。
実施例３５の摂動剤の見かけの解離定数は、ｐＨ７の実施例３０の摂動剤（１０-4Ｍ）より大きい。
それゆえ、ベンゾイル=パラ-アミノフェニル酪酸はα-インターフェロンとより強力に複合体を形成し、未変性の安定な可逆的中間体コンホメーション状態をより低い摂動剤濃度で誘導する。
【０２１２】
[実施例３７−３９] 種々の摂動剤とα-インターフェロンの比較によるin vivoの薬物動態学
実施例２６の摂動剤（８００ｍｇ／ｋｇ）（１）、実施例３０の摂動剤（８００ｍｇ／ｋｇ）（２）、もしくはベンゾイル-パラ-アミノフェニル酪酸（３００ｍｇ／ｋｇ）（３）と１ｍｇ／ｋｇのα-インターフェロンを含む投与溶液を、実施例２の方法に従ってラットに投与した。血清サンプルを収集し、実施例２の方法に従ってＥＬＩＳＡでアッセイした。
結果は図２５に示されている。
【０２１３】
[比較例３７＊] α-インターフェロンのin vivo薬物動態学
摂動剤を含まないα-インターフェロンを実施例３７の方法に従ってラットに投与した。血清サンプルを収集して、実施例２の方法に従ってＥＬＩＳＡでアッセイした。
結果を図２５に示す。
【０２１４】
実施例３５−３９は、in vivoでの効能がin vitroモデルで正確に予想できたことを示している。
【０２１５】
[実施例４０−４２] 下垂体を切除したラットにおけるｒｈＧｈと種々の摂動剤の比較によるin vivo薬物動態学
ｒｈＧｈ（１ｍｇ／ｋｇ）と混合した摂動剤サリチロイル(salicyloyl)クロリド修飾Ｌ−フェニルアラニン（１．２ｇ／ｋｇ）（４０）、フェニルスルホニル=パラ-アミノ安息香酸（１．２ｇ／ｋｇ）（４１）、もしくは塩化シクロヘキサノイル修飾Ｌ−チロシン（１．２ｇ／ｋｇ）（４２）を含む投与溶液を実施例２の方法に従ってラットに投与した。
ラットは、Loughna，P.T.ら，Biochem．Biophys．Res．Comm．Jan．14，1994，198(1)，97-102の方法に基づいて下垂体を切除したした。血清サンプルをＥＬＩＳＡ（Medix Biotech，Inc.，Foster City，CA，HGH Enzyme Immunoassay Kit）でアッセイした。
結果は図２６に示されている。
【０２１６】
[実施例４３−４５] 種々の摂動剤を用いたｐＨ７．５および４．０におけるｒｈＧＨの等温下の滴定熱量測定
種々の摂動剤と複合体を形成するｒｈＧｈの能力を、通常は３０℃で平衡化してMicrocal Omega滴定装置を用いてＩＴＣで評価した。熱量計のサンプルセルを、ｐＨ７．５もしくは４．０の５０ｍＭリン酸バッファー中に調製された脱気したｒｈＧＨ（通常は０．２５ｍＭ）で満たした。摂動剤（塩化シクロヘキサノイル修飾Ｌ−チロシン（ａ）、サリチロイル修飾Ｌ−フェニルアラニン（ｂ）、もしくはフェニルスルホニルパラアミノ安息香酸（ｃ））を１ｍＭ（ｐＨ７．５用）と２．５ｍＭ（ｐＨ４．０用）に滴下シリンジに移した。２０〜２５回の１０μｌの注入を、注入の間隔を２分として、急速混合（４００ｒｐｍ）溶液に調製した。
熱量計サンプルセルに配された摂動剤の初濃度は、各摂動剤に対して２００の式量を仮定した。各溶液のｐＨを、溶解した後にチェックしたが、ｐＨの調節は必要なかった。全ての実験を３０℃で行った。滴下シリンジに配されたｒｈＧｈの初濃度は、ｒｈＧｈについて分子量２００００と仮定した。各溶液のｐＨを溶解後にチェックしたが、ｐＨの調節は必要なかった。
反応熱を、観察されたピークの積分によって決定した。混合および希釈の熱を補正するために、試験摂動剤もしくはｒｈＧｈの一定分量をバッファー溶液のみに添加して同じ条件下で対照実験も行った。放出された熱の合計量を、等温式を作製するために全体の摂動剤濃度に対してプロットした。等温式から、一セットの独立摂動剤複合部位を有する超分子複合体において複合した摂動剤について記載された結合等式に対して結合等温式を曲線適合させることによって、結合定数（ＫA，Ｍ）、エンタルピー変化（△Ｈ、ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、エントロピー変化（△Ｓ(eu)、およびＮ、並びに複合体を形成した超分子複合体の当量当たりに複合した摂動剤分子の化学量論が決定された。製造者のソフトウェアに供給されている非線形最小自乗アルゴリズムを用いて、データをデコンボリュート(deconvoluted)した。
結果は以下の表１１に示す。
【０２１７】
【表１２】
【０２１８】
ｐＨ７．５における正の△Ｓ値は、このｐＨにおける複合体形成が構造変化を引き起こすことを示している。
【０２１９】
[実施例４６および４７] α-インターフェロンと摂動剤を用いたパンクレアチン阻害アッセイ
パンクレアチン活性のアッセイを、以下のようにして準備した：α-インターフェロンの０．１ｍｌのストック溶液（９．１ｍｇ／ｍｌ、２０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．２）（Schering-Plough Corp.）を、２．５ｍｌの、ｐＨ７．０の５ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4中のフェニルスルホニル−パラ−アミノ安息香酸摂動剤（４６）もしくはシクロヘキサノイルフェニルグリシン摂動剤（４７）（２００ｍｇ／ｍｌ）に添加した。３７℃で３０および６０分間インキュベーションし、０．１ｍｌのＵＳＰパンクレアチン（２０ｍｇ／ｍｌ）（Sigma Chemical Co.）を添加した。その時点において、０．１ｍｌの一定分量を取りだした。酵素反応を、プロテアーゼインヒビター（アプロチニン(Aprotinin)とBowman-Birkインヒビター（ＢＢＩ）、各々２ｍｇ／ｍｌ）を添加して停止させ、完全なままのα-インターフェロンを定量するために５倍に希釈した。Butyl C-4カートリッジ（３．０ｘ０．４６ｃｍ、Rainin）を使用し、かつ２２０ｎｍにおけるＵＶ検出を組み合わせた０．１％ＴＦＡ／水と０．１％ＴＦＡ中の９０％ＡＣＮとの間の勾配溶出を用いた逆相ＨＰＬＣを用いて、α-インターフェロンを分離および定量した。０分におけるα-インターフェロンを、パンクレアチンの添加の前の一定分量から定量し、１００％とした。
結果は図２７に示されている。
【０２２０】
実施例４６および４７は、両方の超分子複合体が酵素分解に対抗したことを示す。しかしながら、さらなる試験においては、酵素インヒビターの能力と薬物送達能力との間に何の関係も示さなかった。
【０２２１】
[実施例４８] ｐＨ５．０におけるヘパリンのＤＳＣ
ｐＨ５．０におけるヘパリンのＤＳＣサーモグラムを、摂動剤としてｐＨ、ＧｕＨＣｌ、およびイオン強度を用いた実施例１１の方法に基づいて行った。
サーモグラムをヘパリン．０５Ｍ ＮａＣｌ−リン酸バッファーブランクを引くことによって補正したが、各ブランクは、各ＮａＣｌ濃度について使用しなかった。
結果は以下の表１２−１４と図２８に示されている。
【０２２２】
【表１３】
【０２２３】
【表１４】
【０２２４】
【表１５】
【０２２５】
これらのデータは、非タンパク質性活性剤が摂動剤に応じてコンホメーションを変化させ得ることを示している。
【０２２６】
[実施例４９] ヘパリンと摂動剤のカラムクロマトグラフィー
以下の材料を用いた：
カラム： １０ｍｍｘ３０ｃｍ、低圧、ガラスカラム Pharmacia ｗ／調節可能なベッドボリューム。使用したベッドボリュームは、０．８Ｍｐａの圧力で２２ｃｍであった。
パッキング： リンカー分子を具備しないセファロース(Sepharose)ＣＬ−６Ｂに共有結合したヘパリン。
セファロース分画レンジ：１００００−４００００００。
ヘパリン密度は、Pharmacia Q.C．Departmentに従って２ｍｇ／ｃｃであった。
【０２２７】
条件： 移動相はｐＨ７．４の６７ｍＭリン酸バッファー。
流速は１．５ｍｌ／分アイソクラティック(isocratic)。
流動時間は４５分。
サンプル検出は、Perkin Elmer屈折率検出装置を用いた。
【０２２８】
カラムが完全であることをプロタミンを注入し、かつ１時間以上の保持時間を観察することによって確認した。空いた容量を、水を注入し、溶出時間を測定することによって調べた。
【０２２９】
以下の表１５の各摂動剤（５ｍｇ）を、１ｍｌの移動相に個別に溶解し、カラムに注入した（１００μｌ）。溶出時間を測定した。Ｋ’値を以下の式を用いて決定した：
【数１１】
結果を、各摂動剤間、および図２９における各in ivo性能で比較した。この図のＫ’値（遅延度）は、ヘパリン−セファロースカラムから得られたＫ’値からセファロースカラムから得られたＫ’値を差し引くことによって補正されている。
【０２３０】
【表１６】
【０２３１】
[実施例５０] ラットへのヘパリンの経口投与
実施例２の方法に従って、以下の表１６の投与溶液をラットに投与した。血液を採取し、活性化部分トロンボプラスチン時間(activated partial thromboplastin time)（ＡＰＴＴ）をHenry，J.B.，Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods，W.B．Saunders，1979の記載に従って行った。
結果は図２９および３０に示されている。
【０２３２】
図２９は、モデルに予想されるように、ヘパリンへの結合が強くなればなるほど、ＡＰＴＴが上昇することを示している。このデータは、Ｋ’値が０．２以下では活性がほとんどないことを示唆している。Ｋ’値＞０．２では、活性は顕著である。
このデータは、セファロースカラムそのものに対するヘパリンセファロースカラムの遅延と、ＡＰＴＴの上昇として測定されるin vivo活性の増大との間の関係を示唆している。特に、最も強力にヘパリンに結合するプロタミンは経口的な生物利用能を全く持たない（Ｋ’＝３．６８）。このことは、結合強度と解離能力を備えたコンホメーション変化とのバランスを取ることにより、薬物の生物学的活性の完全な補足を最適化することを示している。
【０２３３】
【表１７】
【０２３４】
全ての特許、出願、試験方法、およびここに言及した刊行物は、参照としてここに援用する。
本願発明の多くの変更は、上記の詳細な開示を考慮して当業者に示唆されるであろう。例えば、経口薬剤送達は、血液に胃腸管のルーメンを横切ることを必要とする。これは、これらの解剖学上の区画を分けるいくつかの細胞性脂質二重層を横切る結果として起こる。
活性剤と摂動剤の複合体化および活性剤のコンホメーションの変化が、摂動剤もしくは活性剤のみのものとは異なる可溶性および空間におけるコンホメーション等の物理化学的特性を備えた超分子複合体を作製する。これは、血液脳関門、および目、膣、直腸等の膜等の別の膜を横切るこの特性の利点を得ることができることを示唆する。このような修飾の全ては、クレームの範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】図１は、α−インターフェロン（ＩＦＮ）及び修飾アミノ酸複合体形成摂動剤の天然の勾配ゲルを示す図である。
【図２】図２は、α−インターフェロン及び熱凝縮複合体形成摂動剤の天然の勾配ゲルを示す図である。
【図３】図３は、複合体形成摂動剤有りまたは無しでα−インターフェロンを経口投与した後の血清α−インターフェロンレベルを示すグラフである。
【図４】図４は、複合体形成摂動剤有りまたは無しでサケ(salmon)カルシトニンを経口投与したラットにおけるカルシウムレベルを示すグラフである。
【図５】図５は、α−インターフェロンの塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）誘発変性を示すグラフである。
【図６】図６は、α−インターフェロンのコンフォメーションに対するＧｕＨＣｌの濃度効果を示すグラフである。
【図７】図７は、α−インターフェロンのｐＨ変性を示すグラフである。
【図８】図８は、インシュリンのｐＨ変性を示すグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは、α−インターフェロンの円二色性スペクトルの可逆性を示すグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、α−インターフェロンの円二色性スペクトルの可逆性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、α−インターフェロンの円二色性スペクトルを示すグラフである。
【図１１】図１１は、α−インターフェロンと複合体形成摂動剤の固有トリプトファン蛍光を示すグラフである。
【図１２】図１２は、複合体形成摂動剤有りまたは無しでα−インターフェロンを経口投与した後の血清α−インターフェロンレベルを示すグラフである。
【図１３】図１３は、α−インターフェロン及び複合体形成摂動剤の示差熱量分析を示すグラフである。
【図１４Ａ】図１４Ａ及び１４Ｂは、複合体形成摂動剤による変形の可逆性を示すグラフである。
【図１４Ｂ】図１４Ａ及び１４Ｂは、複合体形成摂動剤による変形の可逆性を示すグラフである。
【図１５】図１５は、α−インターフェロンに対する複合体形成摂動剤の影響を示すグラフである。
【図１６】図１６は、複合体形成摂動剤有りまたは無しでα−インターフェロンを経口投与した後の血清α−インターフェロンレベルを示すグラフである。
【図１７】図１７は、α−インターフェロンのコンフィギュレーションに対する複合体形成摂動剤の濃度効果を示すグラフである。
【図１８】図１８は、複合体形成摂動剤有りまたは無しで経口投与した後の血清α−インターフェロンレベルを示すグラフである。
【図１９】図１９は、α−インターフェロンに対する複合体形成摂動剤の影響を示すグラフである。
【図２０】図２０は、α−インターフェロン及び複合体形成摂動剤の等温滴定熱量分析を示すグラフである。
【図２１】図２１は、α−インターフェロン及び複合体形成摂動剤の等温滴定熱量分析を示すグラフである。
【図２２】図２２は、α−インターフェロンに対する複合体形成摂動剤の影響を示すグラフである。
【図２３】図２３は、α−インターフェロンに対する複合体形成摂動剤の濃度効果を示すグラフである。
【図２４】図２４は、α−インターフェロン及び複合体形成摂動剤の等温滴定熱量分析を示すグラフである。
【図２５】図２５は、複合体形成摂動剤とともに経口投与した後の血清α−インターフェロンレベルを示すグラフである。
【図２６】図２６は、複合体形成摂動剤と混合した組み換えヒト成長ホルモンのインビボの薬物速度論を示すグラフである。
【図２７】図２７は、α−インターフェロン及び複合体形成摂動剤での膵臓阻害アッセイを示すグラフである。
【図２８】図２８は、ｐＨ５．０におけるヘパリンのＤＳＣの影響を示すグラフである。
【図２９】図２９は、ヘパリンでのインビボ投与実験からのＡＰＴＴピーク値に対する発育不全の程度を示すグラフである。
【図３０】図３０は、複合体形成摂動剤有り及び無しでのヘパリンの経口投与の後のラットにおける凝固時間を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜または脂質二重層を通して生物学的活性薬を輸送する方法であって、
（ａ）天然のコンホメーション状態、変性コンホメーション状態、及び、コンホメーション的に天然及び変性状態の中間にあり天然状態に変換可能な中間コンホメーション状態で存在しうる生物学的活性薬を準備し、
（ｂ）この生物学的活性薬を複合体形成摂動剤(complexing perturbant)に曝露して、該生物学的活性薬を可逆的に中間状態に変換させて輸送可能な超分子複合体(supramolecular complex)を形成し、 前記摂動剤は、約１５０から約６００ダルトンの分子量を持ち、少なくとも１つの疎水性部位と少なくとも１つの親水性部位を有し、 前記超分子複合体は、前記生物学的活性薬に非−共有結合で複合体形成した摂動剤を含有し、 前記生物学的活性薬は摂動剤と相互作用した後は微小球を形成せず、
（ｃ）前記膜または二重層を、前記超分子複合体に曝露して、前記生物学的活性薬を前記膜または二重層を通して輸送することからなる方法。
【請求項２】
（ｄ）前記摂動剤を前記超分子複合体から除去して、前記生物学的活性薬を天然状態に変換することをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｄ）が、前記超分子複合体を希釈することからなる請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記中間状態が、約−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌから約２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲のΔＧを有する請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的活性薬が、ペプチド、ムコ多糖、炭水化物、脂質、殺虫殺そ剤、またはこれらの組合せからなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的活性薬が、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、インターフェロン、インターロイキンＩＩ、インシュリン、ヘパリン、カルシトニン、エリスロポイエチン、心房性ナトリウム排泄増加因子(atrial naturetic factor)、抗原、モノクローナル抗体、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、オキシトシン、バソプレッシン、クロモリンナトリウム、バンコマイシン、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、またはこれらの組合せからなる群から選択される請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記摂動剤が、
（ａ）プロテイノイド；
（ｂ）アシル化アミノ酸；
（ｃ）アシル化ポリアミノ酸；
（ｄ）スルホン化アミノ酸；
（ｅ）スルホン化ポリアミノ酸；
（ｆ）アミノ酸のアシル化アルデヒド；
（ｇ）アミノ酸のアシル化ケトン；
（ｈ）ポリアミノ酸のアシル化アルデヒド；
（ｉ）ポリアミノ酸のアシル化ケトン；
（ｊ）Ｒ−ＣＯ2Ｈの構造を有するカルボン酸であり、
式中、ＲはＣ1からＣ24のアルキル、Ｃ2からＣ24のアルケニル、Ｃ3からＣ10のシクロアルキル、Ｃ3からＣ10のシクロアルケニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1からＣ10アルキル）フェニル、（Ｃ2からＣ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1からＣ10アルキル）ナフチル、（Ｃ2からＣ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1からＣ10アルキル）、フェニル（Ｃ2からＣ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1からＣ10アルキル）、及びナフチル（Ｃ2からＣ10）アルケニルであり；
Ｒは、Ｃ1からＣ10のアルキル、Ｃ2からＣ10のアルケニル、Ｃ1からＣ4のアルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ2Ｒ1、Ｃ3からＣ10シクロアルキル、Ｃ3からＣ10のシクロアルケニル、３−１０の環原子を有するヘテロ環であってヘテロ原子が１以上のＮ、Ｏ、Ｓまたはこれらの組合せであるヘテロ環、アリール、（Ｃ1からＣ10アルキル）アリール、アリール（Ｃ1からＣ10アルキル）、またはこれらの組合せで任意に置換されていてもよく、
Ｒは酸素、窒素、イオウ、またはこれらの組合せで中断されていてもよく、
Ｒ1は水素、Ｃ1からＣ4アルキル、またはＣ2からＣ4アルケニルである；
またはこれらの塩、
からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項８】
経口投与可能な生物学的活性薬の調製方法であって、
（ａ）天然のコンホメーション状態、変性コンホメーション状態、及び、コンホメーション的に天然及び変性状態の中間にあり天然状態に変換可能な中間コンホメーション状態で存在しうる生物学的活性薬を準備し、そして、
（ｂ）この生物学的活性薬を複合体形成摂動剤に曝露して、該生物学的活性薬を可逆的に中間状態に変換させて輸送可能な超分子複合体を形成し、
前記摂動剤は、約１５０から約６００ダルトンの分子量を持ち、少なくとも１つの疎水性部位と少なくとも１つの親水性部位を有し、
前記超分子複合体は、前記生物学的活性薬に非−共有結合で複合体形成した摂動剤を含有し、
前記生物学的活性薬は摂動剤と相互作用した後は微小球を形成しない調製方法。
【請求項９】
前記中間状態が、約−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌから約２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲のΔＧを有する請求項８記載の調製方法。
【請求項１０】
前記生物学的活性薬が、ペプチド、ムコ多糖、炭水化物、脂質、殺虫殺そ剤、またはこれらの組合せからなる群から選択される請求項８記載の調製方法。
【請求項１１】
前記生物学的活性薬が、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、インターフェロン、インターロイキンＩＩ、インシュリン、ヘパリン、カルシトニン、エリスロポイエチン、心房性ナトリウム排泄増加因子、抗原、モノクローナル抗体、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、オキシトシン、バソプレッシン、クロモリンナトリウム、バンコマイシン、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、またはこれらの組合せからなる群から選択される請求項１０記載の調製方法。
【請求項１２】
前記摂動剤が、
（ａ）プロテイノイド；
（ｂ）アシル化アミノ酸；
（ｃ）アシル化ポリアミノ酸；
（ｄ）スルホン化アミノ酸；
（ｅ）スルホン化ポリアミノ酸；
（ｆ）アミノ酸のアシル化アルデヒド；
（ｇ）アミノ酸のアシル化ケトン；
（ｈ）ポリアミノ酸のアシル化アルデヒド；
（ｉ）ポリアミノ酸のアシル化ケトン；
（ｊ）Ｒ−ＣＯ2Ｈの構造を有するカルボン酸であり、
式中、ＲはＣ1からＣ24のアルキル、Ｃ2からＣ24のアルケニル、Ｃ3からＣ10のシクロアルキル、Ｃ3からＣ10のシクロアルケニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1からＣ10アルキル）フェニル、（Ｃ2からＣ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1からＣ10アルキル）ナフチル、（Ｃ2からＣ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1からＣ10アルキル）、フェニル（Ｃ2からＣ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1からＣ10アルキル）、及びナフチル（Ｃ2からＣ10）アルケニルであり；
Ｒは、Ｃ1からＣ10のアルキル、Ｃ2からＣ10のアルケニル、Ｃ1からＣ4のアルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ2Ｒ1、Ｃ3からＣ10シクロアルキル、Ｃ3からＣ10のシクロアルケニル、３−１０の環原子を有するヘテロ環であってヘテロ原子が１以上のＮ、Ｏ、Ｓまたはこれらの組合せであるヘテロ環、アリール、（Ｃ1からＣ10アルキル）アリール、アリール（Ｃ1からＣ10アルキル）、またはこれらの組合せで任意に置換されていてもよく、
Ｒは酸素、窒素、イオウ、またはこれらの組合せで中断されていてもよく、
Ｒ1は水素、Ｃ1からＣ4アルキル、またはＣ2からＣ4アルケニル、またはこれらの塩である；
からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項１３】
経口送達用組成物であって、 （ａ）下記（ｂ）と非共有結合で複合体形成した中間コンホメーション状態の生物学的活性薬、 （ｂ）約１５０から約６００ダルトンの分子量を持ち、少なくとも１つの疎水性部位と少なくとも１つの親水性部位を有する複合体形成摂動剤を含み、 前記中間コンホメーション状態は、天然のコンホメーション状態及び変性コンホメーション状態の中間にあり、前記天然状態に変換可能であって、前記組成物は微小球ではない経口送達用組成物。
【請求項１４】
前記生物学的活性薬が、ペプチド、ムコ多糖、炭水化物、脂質、殺虫殺そ剤、またはこれらの組合せからなる群から選択される請求項１３記載の経口送達用組成物。
【請求項１５】
前記生物学的活性薬が、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、インターフェロン、インターロイキンＩＩ、インシュリン、ヘパリン、カルシトニン、エリスロポイエチン、心房性ナトリウム排泄増加因子、抗原、モノクローナル抗体、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、オキシトシン、バソプレッシン、クロモリンナトリウム、バンコマイシン、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、またはこれらの組合せからなる群から選択される請求項１４記載の経口送達用組成物。
【請求項１６】
前記摂動剤が、
（ａ）プロテイノイド；
（ｂ）アシル化アミノ酸；
（ｃ）アシル化ポリアミノ酸；
（ｄ）スルホン化アミノ酸；
（ｅ）スルホン化ポリアミノ酸；
（ｆ）アミノ酸のアシル化アルデヒド；
（ｇ）アミノ酸のアシル化ケトン；
（ｈ）ポリアミノ酸のアシル化アルデヒド；
（ｉ）ポリアミノ酸のアシル化ケトン；
（ｊ）Ｒ−ＣＯ2Ｈの構造を有するカルボン酸であり、
式中、ＲはＣ1からＣ24のアルキル、Ｃ2からＣ24のアルケニル、Ｃ3からＣ10のシクロアルキル、Ｃ3からＣ10のシクロアルケニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1からＣ10アルキル）フェニル、（Ｃ2からＣ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1からＣ10アルキル）ナフチル、（Ｃ2からＣ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1からＣ10アルキル）、フェニル（Ｃ2からＣ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1からＣ10アルキル）、及びナフチル（Ｃ2からＣ10）アルケニルであり；
Ｒは、Ｃ1からＣ10のアルキル、Ｃ2からＣ10のアルケニル、Ｃ1からＣ4のアルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ2Ｒ1、Ｃ3からＣ10シクロアルキル、Ｃ3からＣ10のシクロアルケニル、３−１０の環原子を有するヘテロ環であってヘテロ原子が１以上のＮ、Ｏ、Ｓまたはこれらの組合せであるヘテロ環、アリール、（Ｃ1からＣ10アルキル）アリール、アリール（Ｃ1からＣ10アルキル）、またはこれらの組合せで任意に置換されていてもよく、
Ｒは酸素、窒素、イオウ、またはこれらの組合せで中断されていてもよく、
Ｒ1は水素、Ｃ1からＣ4アルキル、またはＣ2からＣ4アルケニル、またはこれらの塩である；
からなる群から選択される請求項１３記載の経口送達用組成物。
【請求項１７】
投与単位製剤であって、
（Ａ） 請求項１３記載の組成物、及び、
（Ｂ） （ａ）賦形剤 （ｂ）希釈剤 （ｃ）崩壊剤 （ｄ）潤滑剤 （ｅ）柔軟剤 （ｆ）着色剤 （ｇ）投与溶媒 （ｈ）上記の組合せ
を含有する製剤。
【請求項１８】
細胞膜または脂質二重層を通して生物学的活性薬を輸送可能であり、前記膜または二重層を通過した後に生物学的に活性となる薬剤を調製する方法であって、
（ａ）天然のコンホメーション状態、変性コンホメーション状態、及び、コンホメーション的に天然及び変性状態の中間にあり天然状態に変換可能な中間コンホメーション状態で存在しうる生物学的活性薬を準備し、
（ｂ）この生物学的活性薬を複合体形成摂動剤に曝露して、該生物学的活性薬を可逆的に中間状態に変換させて輸送可能な超分子複合体を形成し、
前記摂動剤は、約１５０から約６００ダルトンの分子量を持ち、少なくとも１つの疎水性部位と少なくとも１つの親水性部位を有し、
前記超分子複合体は、前記生物学的活性薬に非−共有結合で複合体形成した摂動剤を含有し、
前記生物学的活性薬は摂動剤と相互作用した後は微小球を形成せず、
（ｃ）前記超分子複合体の模倣物(mimetic)を調製することからなる方法。
【請求項１９】
前記生物学的活性薬がペプチドであり、前記模倣物がペプチド模倣物である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
細胞膜または脂質二重層を通して生物学的活性薬を輸送可能であり、前記膜または二重層を通過した後に生物学的に活性となる薬剤を調製する方法であって、
（ａ）天然のコンホメーション状態、変性コンホメーション状態、及び、コンホメーション的に天然及び変性状態の中間にあり天然状態に変換可能な中間コンホメーション状態で存在しうる生物学的活性薬を準備し、
（ｂ）この生物学的活性薬を複合体形成摂動剤に曝露して、該生物学的活性薬を可逆的に中間状態に変換させ、
（ｃ）前記中間状態の模倣物を調製することからなる方法。
【請求項２１】
前記摂動剤が、ｐＨ変動剤、イオン強度変動剤、または塩酸グアニジンである請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項８記載の方法で調製した経口投与可能な生物学的活性薬の模倣物（mimetic）を含む経口送達組成物。
【請求項２３】
天然のコンホメーション状態、変性コンホメーション状態、及び、コンホメーション的に天然及び変性状態の中間にあり天然状態に変換可能な中間コンホメーション状態を有するペプチド性生物学的活性薬の中間コンホメーション状態のペプチド模倣物を含有する経口送達組成物。
【請求項１】
細胞膜または脂質二重層を通して生物学的活性薬を輸送する方法であって、
（ａ）天然のコンホメーション状態、変性コンホメーション状態、及び、コンホメーション的に天然及び変性状態の中間にあり天然状態に変換可能な中間コンホメーション状態で存在しうる生物学的活性薬を準備し、
（ｂ）この生物学的活性薬を複合体形成摂動剤(complexing perturbant)に曝露して、該生物学的活性薬を可逆的に中間状態に変換させて輸送可能な超分子複合体(supramolecular complex)を形成し、 前記摂動剤は、約１５０から約６００ダルトンの分子量を持ち、少なくとも１つの疎水性部位と少なくとも１つの親水性部位を有し、 前記超分子複合体は、前記生物学的活性薬に非−共有結合で複合体形成した摂動剤を含有し、 前記生物学的活性薬は摂動剤と相互作用した後は微小球を形成せず、
（ｃ）前記膜または二重層を、前記超分子複合体に曝露して、前記生物学的活性薬を前記膜または二重層を通して輸送することからなる方法。
【請求項２】
（ｄ）前記摂動剤を前記超分子複合体から除去して、前記生物学的活性薬を天然状態に変換することをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｄ）が、前記超分子複合体を希釈することからなる請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記中間状態が、約−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌから約２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲のΔＧを有する請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的活性薬が、ペプチド、ムコ多糖、炭水化物、脂質、殺虫殺そ剤、またはこれらの組合せからなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的活性薬が、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、インターフェロン、インターロイキンＩＩ、インシュリン、ヘパリン、カルシトニン、エリスロポイエチン、心房性ナトリウム排泄増加因子(atrial naturetic factor)、抗原、モノクローナル抗体、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、オキシトシン、バソプレッシン、クロモリンナトリウム、バンコマイシン、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、またはこれらの組合せからなる群から選択される請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記摂動剤が、
（ａ）プロテイノイド；
（ｂ）アシル化アミノ酸；
（ｃ）アシル化ポリアミノ酸；
（ｄ）スルホン化アミノ酸；
（ｅ）スルホン化ポリアミノ酸；
（ｆ）アミノ酸のアシル化アルデヒド；
（ｇ）アミノ酸のアシル化ケトン；
（ｈ）ポリアミノ酸のアシル化アルデヒド；
（ｉ）ポリアミノ酸のアシル化ケトン；
（ｊ）Ｒ−ＣＯ2Ｈの構造を有するカルボン酸であり、
式中、ＲはＣ1からＣ24のアルキル、Ｃ2からＣ24のアルケニル、Ｃ3からＣ10のシクロアルキル、Ｃ3からＣ10のシクロアルケニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1からＣ10アルキル）フェニル、（Ｃ2からＣ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1からＣ10アルキル）ナフチル、（Ｃ2からＣ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1からＣ10アルキル）、フェニル（Ｃ2からＣ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1からＣ10アルキル）、及びナフチル（Ｃ2からＣ10）アルケニルであり；
Ｒは、Ｃ1からＣ10のアルキル、Ｃ2からＣ10のアルケニル、Ｃ1からＣ4のアルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ2Ｒ1、Ｃ3からＣ10シクロアルキル、Ｃ3からＣ10のシクロアルケニル、３−１０の環原子を有するヘテロ環であってヘテロ原子が１以上のＮ、Ｏ、Ｓまたはこれらの組合せであるヘテロ環、アリール、（Ｃ1からＣ10アルキル）アリール、アリール（Ｃ1からＣ10アルキル）、またはこれらの組合せで任意に置換されていてもよく、
Ｒは酸素、窒素、イオウ、またはこれらの組合せで中断されていてもよく、
Ｒ1は水素、Ｃ1からＣ4アルキル、またはＣ2からＣ4アルケニルである；
またはこれらの塩、
からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項８】
経口投与可能な生物学的活性薬の調製方法であって、
（ａ）天然のコンホメーション状態、変性コンホメーション状態、及び、コンホメーション的に天然及び変性状態の中間にあり天然状態に変換可能な中間コンホメーション状態で存在しうる生物学的活性薬を準備し、そして、
（ｂ）この生物学的活性薬を複合体形成摂動剤に曝露して、該生物学的活性薬を可逆的に中間状態に変換させて輸送可能な超分子複合体を形成し、
前記摂動剤は、約１５０から約６００ダルトンの分子量を持ち、少なくとも１つの疎水性部位と少なくとも１つの親水性部位を有し、
前記超分子複合体は、前記生物学的活性薬に非−共有結合で複合体形成した摂動剤を含有し、
前記生物学的活性薬は摂動剤と相互作用した後は微小球を形成しない調製方法。
【請求項９】
前記中間状態が、約−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌから約２０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲のΔＧを有する請求項８記載の調製方法。
【請求項１０】
前記生物学的活性薬が、ペプチド、ムコ多糖、炭水化物、脂質、殺虫殺そ剤、またはこれらの組合せからなる群から選択される請求項８記載の調製方法。
【請求項１１】
前記生物学的活性薬が、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、インターフェロン、インターロイキンＩＩ、インシュリン、ヘパリン、カルシトニン、エリスロポイエチン、心房性ナトリウム排泄増加因子、抗原、モノクローナル抗体、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、オキシトシン、バソプレッシン、クロモリンナトリウム、バンコマイシン、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、またはこれらの組合せからなる群から選択される請求項１０記載の調製方法。
【請求項１２】
前記摂動剤が、
（ａ）プロテイノイド；
（ｂ）アシル化アミノ酸；
（ｃ）アシル化ポリアミノ酸；
（ｄ）スルホン化アミノ酸；
（ｅ）スルホン化ポリアミノ酸；
（ｆ）アミノ酸のアシル化アルデヒド；
（ｇ）アミノ酸のアシル化ケトン；
（ｈ）ポリアミノ酸のアシル化アルデヒド；
（ｉ）ポリアミノ酸のアシル化ケトン；
（ｊ）Ｒ−ＣＯ2Ｈの構造を有するカルボン酸であり、
式中、ＲはＣ1からＣ24のアルキル、Ｃ2からＣ24のアルケニル、Ｃ3からＣ10のシクロアルキル、Ｃ3からＣ10のシクロアルケニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1からＣ10アルキル）フェニル、（Ｃ2からＣ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1からＣ10アルキル）ナフチル、（Ｃ2からＣ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1からＣ10アルキル）、フェニル（Ｃ2からＣ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1からＣ10アルキル）、及びナフチル（Ｃ2からＣ10）アルケニルであり；
Ｒは、Ｃ1からＣ10のアルキル、Ｃ2からＣ10のアルケニル、Ｃ1からＣ4のアルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ2Ｒ1、Ｃ3からＣ10シクロアルキル、Ｃ3からＣ10のシクロアルケニル、３−１０の環原子を有するヘテロ環であってヘテロ原子が１以上のＮ、Ｏ、Ｓまたはこれらの組合せであるヘテロ環、アリール、（Ｃ1からＣ10アルキル）アリール、アリール（Ｃ1からＣ10アルキル）、またはこれらの組合せで任意に置換されていてもよく、
Ｒは酸素、窒素、イオウ、またはこれらの組合せで中断されていてもよく、
Ｒ1は水素、Ｃ1からＣ4アルキル、またはＣ2からＣ4アルケニル、またはこれらの塩である；
からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項１３】
経口送達用組成物であって、 （ａ）下記（ｂ）と非共有結合で複合体形成した中間コンホメーション状態の生物学的活性薬、 （ｂ）約１５０から約６００ダルトンの分子量を持ち、少なくとも１つの疎水性部位と少なくとも１つの親水性部位を有する複合体形成摂動剤を含み、 前記中間コンホメーション状態は、天然のコンホメーション状態及び変性コンホメーション状態の中間にあり、前記天然状態に変換可能であって、前記組成物は微小球ではない経口送達用組成物。
【請求項１４】
前記生物学的活性薬が、ペプチド、ムコ多糖、炭水化物、脂質、殺虫殺そ剤、またはこれらの組合せからなる群から選択される請求項１３記載の経口送達用組成物。
【請求項１５】
前記生物学的活性薬が、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、インターフェロン、インターロイキンＩＩ、インシュリン、ヘパリン、カルシトニン、エリスロポイエチン、心房性ナトリウム排泄増加因子、抗原、モノクローナル抗体、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、オキシトシン、バソプレッシン、クロモリンナトリウム、バンコマイシン、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、またはこれらの組合せからなる群から選択される請求項１４記載の経口送達用組成物。
【請求項１６】
前記摂動剤が、
（ａ）プロテイノイド；
（ｂ）アシル化アミノ酸；
（ｃ）アシル化ポリアミノ酸；
（ｄ）スルホン化アミノ酸；
（ｅ）スルホン化ポリアミノ酸；
（ｆ）アミノ酸のアシル化アルデヒド；
（ｇ）アミノ酸のアシル化ケトン；
（ｈ）ポリアミノ酸のアシル化アルデヒド；
（ｉ）ポリアミノ酸のアシル化ケトン；
（ｊ）Ｒ−ＣＯ2Ｈの構造を有するカルボン酸であり、
式中、ＲはＣ1からＣ24のアルキル、Ｃ2からＣ24のアルケニル、Ｃ3からＣ10のシクロアルキル、Ｃ3からＣ10のシクロアルケニル、フェニル、ナフチル、（Ｃ1からＣ10アルキル）フェニル、（Ｃ2からＣ10アルケニル）フェニル、（Ｃ1からＣ10アルキル）ナフチル、（Ｃ2からＣ10アルケニル）ナフチル、フェニル（Ｃ1からＣ10アルキル）、フェニル（Ｃ2からＣ10アルケニル）、ナフチル（Ｃ1からＣ10アルキル）、及びナフチル（Ｃ2からＣ10）アルケニルであり；
Ｒは、Ｃ1からＣ10のアルキル、Ｃ2からＣ10のアルケニル、Ｃ1からＣ4のアルコキシ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ2Ｒ1、Ｃ3からＣ10シクロアルキル、Ｃ3からＣ10のシクロアルケニル、３−１０の環原子を有するヘテロ環であってヘテロ原子が１以上のＮ、Ｏ、Ｓまたはこれらの組合せであるヘテロ環、アリール、（Ｃ1からＣ10アルキル）アリール、アリール（Ｃ1からＣ10アルキル）、またはこれらの組合せで任意に置換されていてもよく、
Ｒは酸素、窒素、イオウ、またはこれらの組合せで中断されていてもよく、
Ｒ1は水素、Ｃ1からＣ4アルキル、またはＣ2からＣ4アルケニル、またはこれらの塩である；
からなる群から選択される請求項１３記載の経口送達用組成物。
【請求項１７】
投与単位製剤であって、
（Ａ） 請求項１３記載の組成物、及び、
（Ｂ） （ａ）賦形剤 （ｂ）希釈剤 （ｃ）崩壊剤 （ｄ）潤滑剤 （ｅ）柔軟剤 （ｆ）着色剤 （ｇ）投与溶媒 （ｈ）上記の組合せ
を含有する製剤。
【請求項１８】
細胞膜または脂質二重層を通して生物学的活性薬を輸送可能であり、前記膜または二重層を通過した後に生物学的に活性となる薬剤を調製する方法であって、
（ａ）天然のコンホメーション状態、変性コンホメーション状態、及び、コンホメーション的に天然及び変性状態の中間にあり天然状態に変換可能な中間コンホメーション状態で存在しうる生物学的活性薬を準備し、
（ｂ）この生物学的活性薬を複合体形成摂動剤に曝露して、該生物学的活性薬を可逆的に中間状態に変換させて輸送可能な超分子複合体を形成し、
前記摂動剤は、約１５０から約６００ダルトンの分子量を持ち、少なくとも１つの疎水性部位と少なくとも１つの親水性部位を有し、
前記超分子複合体は、前記生物学的活性薬に非−共有結合で複合体形成した摂動剤を含有し、
前記生物学的活性薬は摂動剤と相互作用した後は微小球を形成せず、
（ｃ）前記超分子複合体の模倣物(mimetic)を調製することからなる方法。
【請求項１９】
前記生物学的活性薬がペプチドであり、前記模倣物がペプチド模倣物である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
細胞膜または脂質二重層を通して生物学的活性薬を輸送可能であり、前記膜または二重層を通過した後に生物学的に活性となる薬剤を調製する方法であって、
（ａ）天然のコンホメーション状態、変性コンホメーション状態、及び、コンホメーション的に天然及び変性状態の中間にあり天然状態に変換可能な中間コンホメーション状態で存在しうる生物学的活性薬を準備し、
（ｂ）この生物学的活性薬を複合体形成摂動剤に曝露して、該生物学的活性薬を可逆的に中間状態に変換させ、
（ｃ）前記中間状態の模倣物を調製することからなる方法。
【請求項２１】
前記摂動剤が、ｐＨ変動剤、イオン強度変動剤、または塩酸グアニジンである請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項８記載の方法で調製した経口投与可能な生物学的活性薬の模倣物（mimetic）を含む経口送達組成物。
【請求項２３】
天然のコンホメーション状態、変性コンホメーション状態、及び、コンホメーション的に天然及び変性状態の中間にあり天然状態に変換可能な中間コンホメーション状態を有するペプチド性生物学的活性薬の中間コンホメーション状態のペプチド模倣物を含有する経口送達組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【公開番号】特開２００７−１５３９０７（Ｐ２００７−１５３９０７Ａ）
【公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２９７５２（Ｐ２００７−２９７５２）
【出願日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【分割の表示】特願平８−５１４１５９の分割
【原出願日】平成７年１０月２４日（１９９５．１０．２４）
【出願人】（５０３１７９９０８）エミスフェアー・テクノロジーズ・インク (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【分割の表示】特願平８−５１４１５９の分割
【原出願日】平成７年１０月２４日（１９９５．１０．２４）
【出願人】（５０３１７９９０８）エミスフェアー・テクノロジーズ・インク (3)
【Ｆターム（参考）】
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