浮遊性動物細胞の膜タンパク質を検出する方法、及びそれを用いたスクリーニング方法
【課題】浮遊性動物細胞では導入した遺伝子の組み込まれる場所を指定することができないため、遺伝子の組み込まれた場所によって発現量が著しく異なる。そのため、膜タンパク質遺伝子を導入した細胞において高発現している細胞株を取得するために、その検出系を提供する。
【解決手段】所定のアンカー分子により、浮遊性動物細胞の固定化、膜タンパク質への検出用物質の接触、検出用物質の洗浄、膜タンパク質の検出による、浮遊性動物細胞表層の膜タンパク質の検出方法。および、浮遊性動物細胞への膜タンパク質遺伝子の導入、細胞培養、培養細胞の検出、細胞での膜タンパク質の発現量の比較選択による、導入膜タンパク質遺伝子発現浮遊性動物細胞のスクリーニング方法。
【解決手段】所定のアンカー分子により、浮遊性動物細胞の固定化、膜タンパク質への検出用物質の接触、検出用物質の洗浄、膜タンパク質の検出による、浮遊性動物細胞表層の膜タンパク質の検出方法。および、浮遊性動物細胞への膜タンパク質遺伝子の導入、細胞培養、培養細胞の検出、細胞での膜タンパク質の発現量の比較選択による、導入膜タンパク質遺伝子発現浮遊性動物細胞のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、浮遊動物細胞をプレートに固定化し生細胞の状態で膜タンパク質を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜は脂質二重層からできており、脂質二重層は両側に親水性の領域を内部に疎水性の領域を持っている。そのため親水性の物質は細胞膜の疎水性の部分を通過して細胞内に入ることができないため、細胞は細胞膜上に存在するタンパク質を利用しイオン、親水性物質を取り込んだり外部からのシグナルを細胞内部に伝えたりしている。
【０００３】
このように細胞膜タンパク質は細胞にとって外部情報、物質を取り込む非常に重要なタンパクであるであり、その違いによって細胞群が分けられるため、細胞膜上に存在しているタンパク質を検出することは細胞を同定するためにも重要である。
【０００４】
細胞膜表層上に存在するタンパク質を解析する方法としては、多く用いられている方法として、蛍光抗体染色法により蛍光染色した細胞をフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で解析する方法がある。この方法は、蛍光抗体染色した細胞をフローセル内に流すことで細胞を含んだ液滴とし、そこにレーザ光を照射することで、前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ）から相対的大きさ、側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ）から形状、内部構造を細胞一個単位で測定することができ、蛍光抗体染色による蛍光強度や蛍光の種類を細胞一個単位で測定することができる。この方法は高感度で多量のサンプルを短時間に解析できる点で非常に優れている。
【０００５】
また、多種類のサンプルを一度に測定する方法としてＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）が用いられている。付着細胞でのＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡでは、目的タンパクを検出するため酵素標識された抗体を加え、その後余分な抗体を取り除くために洗浄を行えるが、浮遊細胞の場合、洗浄で行う吸引操作で上清と共に細胞を吸引してしまうため、遠心操作により細胞をペレット上にしてから、上清をアスピレーターなどで吸引し、新たなＢｕｆｆｅｒに懸濁する方法が用いられている（非特許文献１）。
【０００６】
その他には、ポリ−Ｌ−リジンを用いて浮遊細胞をプレートに固定しＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡを行う方法（非特許文献２）も報告されている。また、細胞固定化の技術として、ウシ血清アルブミンでコートしたプレートやシャーレにＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ基、Ｏｌｅｙｌ基の両方持つ分子を加え、ウシ血清アルブミンのリシン残基とＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ基を結合させ、その後、浮遊動物細胞を加えることで細胞膜とＯｌｅｙｌ基が非共有結合で結合し、生細胞のまま固定化する技術（非特許文献３）が報告されている。
【０００７】
【非特許文献１】Ｚｈｅｎｇ Ｌｉｕ、外２名、 「Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡ ｕｓｉｎｇ ｂｅｔａ‐ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、 Ｊｏｕｒａｎｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｎｏｒｔｈ‐Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈ Ｃｏｍｐａｎｙ、 第２３４巻、１−２号、１５３〜１６７頁、 ２０００年２月３日発行
【非特許文献２】Ｈｅｎｒｉ Ｈ．ＶＥＲＳＴＥＥＧ、外７名、 「Ａ ｎｅｗ ｐｈｏｓｐｈｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｌｌ‐ｂａｓｅｄ ＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ｐ４２／ｐ４４ ｍｉｔｏｇｅｎ‐ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ （ＭＡＰＫ），ｐ３８ ＭＡＰＫ、ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ ａｎｄ ｃＡＭＰ‐ｒｅｓｐｏｎｓｅ‐ｅｌｅｍｅｎｔ‐ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ」、 Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ（Ｅｎｇｌａｎｄ）、 Ｐｏｒｔｌａｎｄ Ｐｒｅｓｓ ｏｎ ｂｅｈａｌｆ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、 第３５０巻、 第３号、 ７１７〜７２２頁、 ２０００年９月１５日発行
【非特許文献３】加藤、外５名、 「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｎｏｎａｄｈｅｒｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｏｎ ａｎ ｏｌｅｙｌ ｐｏｌｙ （ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｅｔｈｅｒ‐ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ」、 ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、（Ｅｎｇｌａｎｄ）、 Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＳＡ，Ｉｎｃ、 第３５巻、 第５号、 １０１４〜１０２１頁、 ２００３年１１月発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一般に膜タンパク質の遺伝子をコードしたベクターを作製して動物細胞に遺伝子導入すると、導入遺伝子は動物細胞のゲノムに組み込まれるが、動物細胞では導入した遺伝子の組み込まれる場所を指定することができないため、遺伝子の組み込まれた場所によって導入した遺伝子から作られるタンパク質の発現量が著しく異なる。そのため、膜タンパク質遺伝子を同様に導入した動物細胞でも、細胞１つ１つで膜タンパク質の発現量が異なる。よって膜タンパク質遺伝子を導入した細胞において、膜タンパク質が高発現している細胞株を取得するためには、細胞での検出方法が必要である。
【０００９】
動物細胞の膜タンパク質発現を解析する方法としては、蛍光抗体染色法により蛍光染色した細胞をフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で解析する方法がある。この方法は、高感度で多量のサンプルを短時間に解析できるが、多種類のサンプルを測定する場合には問題がある。
【００１０】
そこで、多種類のサンプルを一度に測定する方法としてＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）があるが、浮遊細胞で行う場合、遠心とアスピレーターによる洗浄方法を用いる必要があるが、アスピレーターによる上清吸引時に起こる細胞吸引を避けようとすると、洗浄が不十分となり、高発現細胞とそうでないものとの区別がつきにくい。
【００１１】
また、ポリ−Ｌ−リジンを用いて浮遊細胞をプレートに固定し、Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡを行う方法も報告されているが、８％のホルムアルデヒド（Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で細胞を処理しているため、膜タンパクの構造が変化している恐れがある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題に関し鋭意検討した結果、所定のアンカー分子により、浮遊性動物細胞をプレートに固定化し、固定化された細胞表層に発現している膜タンパク質に検出用物質を接触させ、検出用物質の過剰分を洗浄し、検出用物質からから得られた信号の強度を測定して膜タンパク質を検出することで、浮遊性動物細胞を生細胞のままプレートに固定化し、浮遊性動物細胞表層の膜タンパク質を検出できること、また、浮遊性動物細胞に膜タンパク質遺伝子を導入し、遺伝子導入された該細胞を培養し、培養した該細胞を請求項１の方法で検出し、その検出強度によって細胞での膜タンパク質の発現量を比較し選択して、導入した膜タンパク質遺伝子を発現した浮遊性動物細胞をスクリーニングできることを見出し、本発明を完成するに至った。以下本発明を詳細に説明する。
【００１３】
すなわち本発明は、浮遊性動物細胞を生細胞のままプレートに固定化する、該浮遊性動物細胞表層の膜タンパク質を検出する方法であって、該方法は、
１）Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ基およびＯｌｅｙｌ基を有するアンカー分子により、浮遊性動物細胞をプレートに固定化する工程；
２）固定化された細胞表層に発現している膜タンパク質に検出用物質を接触させる工程；
３）前記検出用物質の過剰分を洗浄する工程；および、
４）検出用物質からから得られた信号の強度を測定することにより膜タンパク質を検出する工程、を含む方法である。
【００１４】
また本発明は、導入した膜タンパク質遺伝子を発現した浮遊性動物細胞のスクリーニング方法であって、該方法は、
１）浮遊性動物細胞に膜タンパク質遺伝子を導入する工程；
２）遺伝子導入された該細胞を培養する工程；
３）培養した該細胞を請求項１の方法で検出する工程；および、
４）請求項１の方法で得られた検出強度によって該細胞での膜タンパク質の発現量を比較し選択する工程、を含む方法である。
【００１５】
また本発明は、上記の発明において、浮遊性動物細胞がマウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０である方法である。
【００１６】
本発明において固定化する浮遊性動物細胞とは、細胞膜を持っているものであれば固定化されるので特に限定されないが、例えば、ＥＳ細胞、免疫細胞、赤血球、骨髄細胞、骨髄前駆細胞、ミエローマ細胞、ハイブリドーマなどが挙げられる。
【００１７】
動物細胞に遺伝子を導入する方法としてはリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、超音波遺伝子導入法、リポフェクション法、ウイルスベクターを使用する方法などが挙げられるが、導入効率が高ければどの方法を用いてもよい。
【００１８】
本発明における細胞の固定化とは、プレートに吸着させたタンパク質と細胞をアンカー分子ＢＡＭ（Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ａｎｃｈｏｒ ｆｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ）（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＯＥ−０８０ＣＳ：日本油脂社製）によって結合させることであり、そのアンカー分子はＮＨＳ基およびＯｌｅｙｌ基の両基を持っているが、ＮＨＳ基は水中で保存すると反応性が低下することから、Ｏｌｅｙｌ基と細胞膜の反応よりも前にプレートのタンパク質とＮＨＳ基を反応させておく。また、Ｏｌｅｙｌ基と細胞膜との反応は３７℃で２時間反応させているが３０分以上であればよい。さらに、アンカー分子であるＢＡＭは１００μＭを１００μｌ／Ｗｅｌｌで加えているが、この濃度以上であればよい。加える細胞数は９６Ｗｅｌｌプレートであれば０．６〜５×１０５Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌ程度が望ましく、さらに好ましくは２．５×１０５Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌ程度が望ましい。
【００１９】
本発明において細胞を固定化するプレートに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）を吸着させて使用しているが、アンカー分子（ＢＡＭ）（Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ａｎｃｈｏｒ ｆｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ）（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＯＥ−０８０ＣＳ：日本油脂社製）のＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）基が反応するアミノ基が豊富にあり検出用物質と非特異吸着をしないタンパク質であれば何でもよい。ここにおける検出用物質とは、アミノ酸、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、アプタマー、タンパク質などのさまざまな高分子、低分子物質のような物質である。好ましい検出用物質としては、抗原、抗体、レセプター、サイトカインなどの増殖因子が挙げられる。
【００２０】
本発明において固定化した後の細胞膜タンパク質の検出方法は特には限定されないが、吸光、発光、蛍光、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）、時間分解蛍光、放射線などがあげられる。また、これらの検出方法を行うために、上述した検出用物質をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリホスファターゼのような酵素、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＡＰＣ（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、などの蛍光物質、放射性物質、金コロイドなどで標識したものを使用することができる。
【００２１】
本発明において細胞の膜タンパク質に標識化合物を反応させた後にＰＢＳを加え、アスピレーターで上清を吸引洗浄する工程は過剰に加えた標識化合物を取り除く為、細胞が剥がれないよう洗浄できればよく、付着性細胞の洗浄に対応したウォッシャー（ＴＥＣＡＮ社：ＰＷ３８４）で行ってもよい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明による浮遊動物細胞の膜タンパク質の検出方法は、細胞をプレートに固定化することにより、洗浄効果を高めることで、バックグランドを低くし高感度で多種類のサンプルを測定することができる。これにより外来遺伝子を導入した動物細胞で、該外来遺伝子の発現量が高い細胞と、発現量が低いあるいは発現していない細胞を区別することが容易となり、高発現細胞を取得することが容易になる。
【００２３】
また、本発明は目的タンパク質を発現させた生細胞を使用することができるため、膜タンパク質を抗原とした抗体の親和性、特異性の評価を行う場合、本来の立体構造を保持したままの膜タンパク質を抗原とすることができため、立体構造を認識する抗体のスクリーニングに使用することができる。
【実施例】
【００２４】
以下に、発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１） ヒトＦｃγＲＩ遺伝子導入ミエローマ細胞でのヒトＦｃγＲＩ検出
＜１−１．ヒトＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞の作製＞
ヒトＦｃγＲＩのｃＤＮＡ（ＯＲＥＧＥＮＥ社製）（配列番号１）とＰｒｉｍｅｒ（配列番号２）を用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（９８℃／２０秒、６２℃／２０秒、７２℃／１．５分を２５サイクル）により増幅した。増幅したヒトＦｃγＲＩ遺伝子を、ゲル（０．８％ ＳｅａＫｅｍＧＴＧアガロース）の切出し精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ：ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製後、制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ：タカラバイオ社製）で消化しＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。ベクターにはｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を使用した。ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔを制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ：タカラバイオ社製）で消化し、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。その後、ベクターをＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｃ７５：タカラバイオ社製）で３７℃、３０分、脱リン酸化処理をした後、フェノール、クロロホルムで２回洗浄し、エタノール沈殿した。このように調整したヒトＦｃγＲＩ遺伝子とｐＣＭＶ−ＳｃｒｉｐｔをＭｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてＬｉｇａｔｉｏｎし、ｐＣＭＶＳ−ｈＦｃＲを作製した。その後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ産物を大腸菌のＣｏｍｐｅｔｅｍｔ Ｃｅｌｌ（ＪＭ１０９：タカラバイオ社製）へヒートショックにて形質転換を行い、形質転換後の大腸菌からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミド抽出を行い、プラスミド（ｐＣＭＶＳ−ｈＦｃＲ）を調製した。
【００２５】
Ｅ−ＲＤＦ（極東製薬社製）に１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えた培地で培養したミエローマ細胞（ＳＰ２／０）と、プラスミド（ｐＣＭＶＳ−ｈＦｃＲ）をＰＢＳに懸濁し０．４ｃｍのキュベット（Ｂｉｏ−ＲＡＤ社製）に入れ、ＥＣＭ８３０（ＥＣＭ社製）にてＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（７５０５／ｃｍ，１ｍｓ，１回）することによりプラスミド（ｐＣＭＶＳ−ｈＦｃＲ、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ）をミエローマ細胞（ＳＰ２／０）にＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。その後、Ｇ４１８ Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を４００μｇ／ｍｌ加えたＥ−ＲＤＦ（極東製薬社製）に１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えた培地で２週間程度選択を行い、ヒトＦｃγＲＩを発現したミエローマ細胞（ｈＦｃＲ）を作製した（図２参照）。また、同様に陰性コントロールとして遺伝子をクローニングしていないカラベクター（ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ）をＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎしたミエローマ細胞（Ｍｏｃｋ）（非発現）を作製した。
【００２６】
＜１−２．ｈＦｃＲでの細胞膜ヒトＦｃγＲＩの検出＞
１％になるようＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ：ＳＩＧＭＡ社製）を溶かしたＰＢＳを、９６穴イムノプレート（マキシソープ：Ｎｕｎｃ社製）に３５０μｌ／ｗｅｌｌで加え、４℃で一晩放置したものを、ＰＢＳで３回洗浄し、１００μＭとなるようアンカー分子であるＢＡＭ（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＯＥ−０８０ＣＳ：日本油脂社製）を溶かしたＰＢＳを１００μｌ／ｗｅｌｌで９６穴イムノプレートの半分のＷｅｌｌに加え、残りの半分にはＰＢＳを１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、３７℃で２時間放置した。その後、９６穴イムノプレートをＰＢＳで３回洗浄した。次に、培地であるＥ−ＲＤＦ（１０％ＦＢＳ）１０ｍｌでシャーレ（ＳＵＭＩＬＯＮ社製）にて、培養した上述１−１．で作製のｈＦｃＲ（ヒトＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）、Ｍｏｃｋ（非発現ミエローマ細胞）を１５ｍｌの遠心チューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に１０ｍｌ回収後、２００ｇ、５分で遠心を行い、上清を捨て、１０ｍｌのＰＢＳに懸濁する洗浄を２回行い、洗浄後のアンカー分子を結合させた９６穴イムノプレートに１×１０５Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌ、１×１０４Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌ、１×１０３Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌとなるよう加え、３７℃で１時間放置した。その後、２００ｇ、５分で遠心し、上清をアスピレーターで吸引した後、ＰＢＳをゆっくりと３００μｌ／ｗｅｌｌ加え、アスピレーターで吸引する洗浄を２回行った。次にＡｎｔｉ−ＣＤ６４（ｍｏｕｓｅ抗体）（Ｒ＆Ｄ社製）をＰＢＳ（３％ＦＢＳ）に２．５μｇ／ｍｌとなるように希釈し１００μｌ／Ｗｅｌｌとなるよう加え、４℃で１時間静地した。その後、上述したアスピレーターを用いた洗浄を３回行い、Ａｎｔｉ−ＭｏｕｓｅＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（Ｇｏａｔ抗体）（Ｂｅｔｈｙｌ社製）をＰＢＳ（３％ＦＢＳ）に５０μｇ／ｍｌとなるように希釈し１００μｌ／Ｗｅｌｌとなるよう加え、４℃で１時間静地した。次に、上述したアスピレーターを用いた洗浄を４回行い、基質としてＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を１００μｌ／Ｗｅｌｌで加え３７℃で１０分置き、１Ｍのリン酸溶液を５０μｌ／Ｗｅｌｌで加えた後、吸光度（Ｏ．Ｄ．＝４５０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００：ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。その結果を図４に示した。縦軸は吸光度、横軸は細胞数である。アンカー分子であるＢＡＭが無いものは、陰性コントロールであるＭｏｃｋ（非発現ミエローマ細胞）とｈＦｃＲ（ヒトＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）では優位な差は見られなかった。しかし、アンカー分子であるＢＡＭがある場合陰性コントロールであるＭｏｃｋ（非発現ミエローマ細胞）とｈＦｃＲ（ヒトＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）を比較すると、ヒトＦｃγＲＩを発現している細胞では吸光度で優位な差が見られた。このことから、アンカー分子であるＢＡＭにより細胞が９６穴イムノプレートに固定化され、細胞膜上のヒトＦｃγＲＩを検出することができた。
【００２７】
（実施例２） ヒトＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞からの高発現株スクリーニング
本発明の全体の流れを、図１に示した。ヒトＦｃγＲＩの遺伝子を導入されたミエローマ細胞（ＳＰ２／０）を１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで９６穴プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に撒き培養することで、細胞群を分け、これらのミエローマ細胞表層に発現しているヒトＦｃγＲＩの発現量を実施例１の検出方法で検出し、比較することで、ヒトＦｃγＲＩ高発現ミエローマ（ＳＰ２／０）をスクリーニングした。
【００２８】
１％になるようＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ：ＳＩＧＭＡ社製）を溶かしたＰＢＳを、９６穴イムノプレート（マキシソープ：Ｎｕｎｃ社製）に３５０μｌ／ｗｅｌｌで加え、４℃で一晩放置したものを、ＰＢＳで３回洗浄し、１００μＭとなるようアンカー分子であるＢＡＭ（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＯＥ−０８０ＣＳ：日本油脂社製）を溶かしたＰＢＳを１００μｌ／ｗｅｌｌで９６穴イムノプレートに加え、３７℃で２時間放置した。その後、ＰＢＳで３回洗浄した９６穴イムノプレートに、実施例１で作製したｈＦｃＲ（ヒトＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）、Ｍｏｃｋ（非発現ミエローマ細胞）を培地Ｅ−ＲＤＦ（１０％ＦＢＳ）にて２４ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養したものを１．５ｍｌのエッペン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）に１ｍｌ取り、１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した後、各サンプルを１×１０５Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌとなるよう加えた。次に３７℃で１時間放置した後、２００ｇ、５分で遠心し、上清をアスピレーターで吸引し、ＰＢＳをゆっくりと３００μｌ／ｗｅｌｌ加え、アスピレーターで吸引する洗浄を２回行った。次にＡｎｔｉ−ＣＤ６４（Ｇｏａｔ抗体）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）をＰＢＳ（３％ＦＢＳ）に０．５μｇ／ｍｌとなるように希釈し１００μｌ／Ｗｅｌｌとなるよう加え、４℃で１時間静置後、上述したアスピレーターを用いた洗浄を３回行った。また、Ａｎｔｉ−ＧｏａｔＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（Ｒａｂｂｉｔ抗体）（Ｚｙｍｅｄ社製）をＰＢＳ（３％ＦＢＳ）に１／５０００となるように希釈し１００μｌ／Ｗｅｌｌとなるよう加え、４℃で１時間静置した。その後、上述したアスピレーターを用いた洗浄を４回行い、基質としてＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を１００μｌ／Ｗｅｌｌで加え３７℃で１０分置き、１Ｍのリン酸溶液を５０μｌ／Ｗｅｌｌで加えた後、吸光度（Ｏ．Ｄ．＝４５０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００：ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。その結果を図５に示した。縦軸は吸光度、横軸は細胞数を合わせたサンプルであり、陰性コントロールであるＭｏｃｋ（非発現ミエローマ細胞）と比べ、ｈＦｃＲ（ヒトＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）では吸光度で優位な差が見られ細胞膜上のヒトＦｃγＲＩを検出することができた。また、細胞数を合わせ、各細胞間の吸光度差を測定することによりヒトＦｃγＲＩの発現量の違いがわかり高発現している細胞を選択することができた。
【００２９】
（実施例３） マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞での検出
＜３−１．マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞の作製＞
マウスＦｃγＲＩの遺伝子配列は（配列表２−１）に示したものを使用した。この遺伝子はマウスＳｐｌｅｅｎのｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社製）からＰｒｉｍｅｒ（配列表２−２）を用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（９８℃／３０秒、６５℃／３０秒、７２℃／１．５分を２５サイクル）により増幅した。増幅したマウスＦｃγＲＩ遺伝子を、ゲル（０．８％ ＳｅａＫｅｍＧＴＧアガロース）の切出し精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ：ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製後、制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ：タカラバイオ社製）で消化しＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。ベクターにはｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を使用した。ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔを制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ：タカラバイオ社製）で消化し、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。その後、ベクターをＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｃ７５：タカラバイオ社製）で３７℃、３０分、脱リン酸化処理をした後、フェノール、クロロホルムで２回洗浄し、エタノール沈殿した。このように調整したマウスＦｃγＲＩ遺伝子とｐＣＭＶ−ＳｃｒｉｐｔをＭｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてＬｉｇａｔｉｏｎし、ｐＣＭＶＳ−ｍＦｃＲを作製した。その後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ産物を大腸菌のＣｏｍｐｅｔｅｍｔ Ｃｅｌｌ（ＪＭ１０９：タカラバイオ社製）へヒートショックにて形質転換を行い、形質転換後の大腸菌からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミド抽出を行い、プラスミド（ｐＣＭＶＳ−ｍＦｃＲ）の調整を行った。
【００３０】
Ｅ−ＲＤＦ（極東製薬社製）に１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えた培地で培養したミエローマ細胞（ＳＰ２／０）と、プラスミド（ｐＣＭＶＳ−ｍＦｃＲ）をＰＢＳに懸濁し０．４ｃｍのキュベット（Ｂｉｏ−ＲＡＤ社製）に入れ、ＥＣＭ８３０（ＥＣＭ社製）にてＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（７５０Ｖ／ｃｍ、１ｍｓ、１回）することによりプラスミド（ｐＣＭＶＳ−ｍＦｃＲ、ｐＣＭＶＳ）をミエローマ細胞（ＳＰ２／０）にＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。その後、Ｇ４１８ Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を４００μｇ／ｍｌ加えたＥ−ＲＤＦ（極東製薬社製）に１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えた培地で２週間程度選択を行い、マウスＦｃγＲＩを発現したミエローマ細胞（ｍＦｃＲ）を作製した（図３参照）。
【００３１】
＜３−２．マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマでの検出＞
１％になるようＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ：ＳＩＧＭＡ社製）を溶かしたＰＢＳを、９６穴イムノプレート（マキシソープ：Ｎｕｎｃ社製）に３５０μｌ／ｗｅｌｌで加え、４℃で一晩放置したものを、ＰＢＳで３回洗浄し、１００μＭとなるようアンカー分子であるＢＡＭ（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＯＥ−０８０ＣＳ：日本油脂社製）を溶かしたＰＢＳを１００μｌ／ｗｅｌｌで９６穴イムノプレートに加え、３７℃で２時間放置した。その後、ＰＢＳで３回洗浄した９６穴イムノプレートに、３−１．で作製したｍＦｃＲ（マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）、実施例１で作製したＭｏｃｋ（非発現ミエローマ細胞）を培地Ｅ−ＲＤＦ（１０％ＦＢＳ）にて２４ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養したものを１．５ｍｌのエッペン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）に１ｍｌ取り、１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄したのち、各サンプルを１×１０６Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌから順に１／２希釈となるよう加え、最後は０Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌとなるように加えた。次に３７℃で１時間放置した後、２００ｇ、５分で遠心し、上清をアスピレーターで吸引し、ＰＢＳをゆっくりと３００μｌ／ｗｅｌｌ加え、アスピレーターで吸引する洗浄を２回行った。その後、Ａｎｔｉ−ＭｏｕｓｅＣＤ６４（Ｒａｔ抗体）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）をＰＢＳ（３％ＦＢＳ）に０．２μｇ／ｍｌとなるように希釈し１００μｌ／Ｗｅｌｌとなるよう加え、４℃で１時間置き、上述したアスピレーターを用いた洗浄を３回行った。次に、Ａｎｔｉ−ＲａｔＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｇｏａｔ抗体）（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）をＰＢＳ（３％ＦＢＳ）に１／５０００となるように希釈し１００μｌ／Ｗｅｌｌとなるよう加え、４℃で１時間置き、上述したアスピレーターを用いた洗浄を４回行った。基質としてＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を１００μｌ／Ｗｅｌｌで加え３７℃で１０分置き、１Ｍのリン酸溶液を５０μｌ／Ｗｅｌｌで加えた後、吸光度（Ｏ．Ｄ．＝４５０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００：ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。その結果を図６に示した。縦軸は吸光度、横軸はｍＦｃＲ（マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）とＭｏｃｋ（非発現ミエローマの細胞）の１／２希釈列である。ここから、Ｍｏｃｋ（非発現ミエローマの細胞）においては細胞数に比例せず吸光度は一定であったが、ｍＦｃＲ（マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）は細胞数に依存して吸光度が上昇していることがわかる。よって、ｍＦｃＲ（マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）の細胞膜上のマウスＦｃγＲＩを検出することができた。また、ｍＦｃＲ（マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）においては２．５×１０５Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌのときに最も高い値を示した。
【００３２】
（実施例４） 遠心による従来法と固定による検出の比較
３％Ｐｅｒｆｅｃｔｂｌｏｃｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）ｉｎＰＢＳを９６穴イムノプレート（マキシソープ：Ｎｕｎｃ社製）に３５０μｌ／ｗｅｌｌで加え、３７℃で２時間放置後、ＰＢＳで３回洗浄したプレートに、培地であるＥ−ＲＤＦ（極東製薬社製）１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えた培地１０ｍｌでシャーレ（ＳＵＭＩＬＯＮ社製）にて、培養した上述３−１．で作製のｍＦｃＲ（マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）、実施例１で作製のＭｏｃｋ（非発現ミエローマ細胞）を１５ｍｌの遠心チューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に１０ｍｌ回収後、２００ｇ、５分で遠心を行い、上清を捨て、１０ｍｌのＰＢＳに懸濁する洗浄を２回行った。ｍＦｃＲ、Ｍｏｃｋをそれぞれ、１×１０５、１×１０４、１×１０３、０、Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌになるよう加えた。２００ｇ、５分で遠心後、上清をアスピレーターで吸引し、ＰＢＳをゆっくりと３００μｌ／ｗｅｌｌ加える洗浄を３回行い、Ａｎｔｉ−ＭｏｕｓｅＣＤ６４（Ｒａｔ抗体）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）をＰＢＳ（３％ＦＢＳ）に０．２μｇ／ｍｌとなるように希釈し１００μｌ／Ｗｅｌｌとなるよう加え、４℃で１時間置き、上述した２００ｇ、５分で遠心を行いアスピレーターで吸引する洗浄を３回行った。また、Ａｎｔｉ−ＲａｔＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｇｏａｔ抗体）（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）をＰＢＳ（３％ＦＢＳ）に１／５０００となるように希釈し１００μｌ／Ｗｅｌｌとなるよう加え、４℃で１時間置き、上述した２００ｇ、５分で遠心を行いアスピレーターで吸引する洗浄を３回行った。基質としてＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を１００μｌ／Ｗｅｌｌで加え３７℃で３分置き、１Ｍのリン酸溶液を５０μｌ／Ｗｅｌｌで加えた後、吸光度をプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００：ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。その結果を図７に示した。図７の縦軸は、それぞれの値をコントロールである０Ｃｅｌｌ／Ｗｅｌｌの吸光度で除した値である。横軸はｍＦｃＲ（マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）とＭｏｃｋ（非発現ミエローマの細胞）の細胞数の希釈列である。遠心での検出の結果は、最も高い値と０Ｃｅｌｌ／Ｗｅｌｌの値（序してあるため１となる）を比較すると約１．８倍であった。
【００３３】
また、実施例２で示した方法で、図７と同じサンプルを測定した結果を図８に示した。図８の縦軸は、それぞれの値をコントロールである０Ｃｅｌｌ／Ｗｅｌｌの吸光度で除した値である。横軸はｍＦｃＲ（マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）とＭｏｃｋ（非発現ミエローマの細胞）の細胞数の希釈列である。ここから、細胞をプレートに固定化して測定した結果は、最も高い値と０Ｃｅｌｌ／Ｗｅｌｌの値（序してあるため１となる）を比較すると約４．５倍となった。図７と図８を比較すると遠心を用いた測定に比べ細胞をプレートに固定化して測定した結果の方が、陰性コントロールである０Ｃｅｌｌ／Ｗｅｌｌの値を低く抑えることが可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明のスクリーニング方法を示す図である。
【図２】ｈＦｃＲ（ヒトＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）作製の図である。
【図３】ｍＦｃＲ（マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）作製の図である。
【図４】アンカー分子（ＢＡＭ）あり、なしでの検出結果の図であり、Ｘ軸（横軸）はウエル（Ｗｅｌｌ）中の細胞数を、Ｙ軸（縦軸）は４５０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．（吸光度）を示す。
【図５】高発現ヒトＦｃγＲＩミエローマをスクリーニングしている図であり、Ｘ軸（横軸）はウエル（Ｗｅｌｌ）番号を、Ｙ軸（縦軸）は４５０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．（吸光度）を示す。
【図６】マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞での検出結果の図であり、Ｘ軸（横軸）はウエル（Ｗｅｌｌ）中の細胞数及び希釈率を、Ｙ軸（縦軸）は４５０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．（吸光度）を示す。
【図７】マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞での固定化せず遠心洗浄を用いた検出結果の図であり、Ｘ軸（横軸）はウエル（Ｗｅｌｌ）中の細胞数を、Ｙ軸（縦軸）は４５０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．（吸光度）を示す。
【図８】マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞での固定化し検出した結果の図であり、Ｘ軸（横軸）はウエル（Ｗｅｌｌ）中の細胞数を、Ｙ軸（縦軸）は４５０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．（吸光度）を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、浮遊動物細胞をプレートに固定化し生細胞の状態で膜タンパク質を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜は脂質二重層からできており、脂質二重層は両側に親水性の領域を内部に疎水性の領域を持っている。そのため親水性の物質は細胞膜の疎水性の部分を通過して細胞内に入ることができないため、細胞は細胞膜上に存在するタンパク質を利用しイオン、親水性物質を取り込んだり外部からのシグナルを細胞内部に伝えたりしている。
【０００３】
このように細胞膜タンパク質は細胞にとって外部情報、物質を取り込む非常に重要なタンパクであるであり、その違いによって細胞群が分けられるため、細胞膜上に存在しているタンパク質を検出することは細胞を同定するためにも重要である。
【０００４】
細胞膜表層上に存在するタンパク質を解析する方法としては、多く用いられている方法として、蛍光抗体染色法により蛍光染色した細胞をフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で解析する方法がある。この方法は、蛍光抗体染色した細胞をフローセル内に流すことで細胞を含んだ液滴とし、そこにレーザ光を照射することで、前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ）から相対的大きさ、側方散乱光（Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ）から形状、内部構造を細胞一個単位で測定することができ、蛍光抗体染色による蛍光強度や蛍光の種類を細胞一個単位で測定することができる。この方法は高感度で多量のサンプルを短時間に解析できる点で非常に優れている。
【０００５】
また、多種類のサンプルを一度に測定する方法としてＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）が用いられている。付着細胞でのＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡでは、目的タンパクを検出するため酵素標識された抗体を加え、その後余分な抗体を取り除くために洗浄を行えるが、浮遊細胞の場合、洗浄で行う吸引操作で上清と共に細胞を吸引してしまうため、遠心操作により細胞をペレット上にしてから、上清をアスピレーターなどで吸引し、新たなＢｕｆｆｅｒに懸濁する方法が用いられている（非特許文献１）。
【０００６】
その他には、ポリ−Ｌ−リジンを用いて浮遊細胞をプレートに固定しＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡを行う方法（非特許文献２）も報告されている。また、細胞固定化の技術として、ウシ血清アルブミンでコートしたプレートやシャーレにＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ基、Ｏｌｅｙｌ基の両方持つ分子を加え、ウシ血清アルブミンのリシン残基とＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ基を結合させ、その後、浮遊動物細胞を加えることで細胞膜とＯｌｅｙｌ基が非共有結合で結合し、生細胞のまま固定化する技術（非特許文献３）が報告されている。
【０００７】
【非特許文献１】Ｚｈｅｎｇ Ｌｉｕ、外２名、 「Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡ ｕｓｉｎｇ ｂｅｔａ‐ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、 Ｊｏｕｒａｎｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｎｏｒｔｈ‐Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈ Ｃｏｍｐａｎｙ、 第２３４巻、１−２号、１５３〜１６７頁、 ２０００年２月３日発行
【非特許文献２】Ｈｅｎｒｉ Ｈ．ＶＥＲＳＴＥＥＧ、外７名、 「Ａ ｎｅｗ ｐｈｏｓｐｈｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｌｌ‐ｂａｓｅｄ ＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ｐ４２／ｐ４４ ｍｉｔｏｇｅｎ‐ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ （ＭＡＰＫ），ｐ３８ ＭＡＰＫ、ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ ａｎｄ ｃＡＭＰ‐ｒｅｓｐｏｎｓｅ‐ｅｌｅｍｅｎｔ‐ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ」、 Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ（Ｅｎｇｌａｎｄ）、 Ｐｏｒｔｌａｎｄ Ｐｒｅｓｓ ｏｎ ｂｅｈａｌｆ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、 第３５０巻、 第３号、 ７１７〜７２２頁、 ２０００年９月１５日発行
【非特許文献３】加藤、外５名、 「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｎｏｎａｄｈｅｒｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｏｎ ａｎ ｏｌｅｙｌ ｐｏｌｙ （ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｅｔｈｅｒ‐ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ」、 ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、（Ｅｎｇｌａｎｄ）、 Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＳＡ，Ｉｎｃ、 第３５巻、 第５号、 １０１４〜１０２１頁、 ２００３年１１月発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一般に膜タンパク質の遺伝子をコードしたベクターを作製して動物細胞に遺伝子導入すると、導入遺伝子は動物細胞のゲノムに組み込まれるが、動物細胞では導入した遺伝子の組み込まれる場所を指定することができないため、遺伝子の組み込まれた場所によって導入した遺伝子から作られるタンパク質の発現量が著しく異なる。そのため、膜タンパク質遺伝子を同様に導入した動物細胞でも、細胞１つ１つで膜タンパク質の発現量が異なる。よって膜タンパク質遺伝子を導入した細胞において、膜タンパク質が高発現している細胞株を取得するためには、細胞での検出方法が必要である。
【０００９】
動物細胞の膜タンパク質発現を解析する方法としては、蛍光抗体染色法により蛍光染色した細胞をフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で解析する方法がある。この方法は、高感度で多量のサンプルを短時間に解析できるが、多種類のサンプルを測定する場合には問題がある。
【００１０】
そこで、多種類のサンプルを一度に測定する方法としてＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）があるが、浮遊細胞で行う場合、遠心とアスピレーターによる洗浄方法を用いる必要があるが、アスピレーターによる上清吸引時に起こる細胞吸引を避けようとすると、洗浄が不十分となり、高発現細胞とそうでないものとの区別がつきにくい。
【００１１】
また、ポリ−Ｌ−リジンを用いて浮遊細胞をプレートに固定し、Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡを行う方法も報告されているが、８％のホルムアルデヒド（Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で細胞を処理しているため、膜タンパクの構造が変化している恐れがある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題に関し鋭意検討した結果、所定のアンカー分子により、浮遊性動物細胞をプレートに固定化し、固定化された細胞表層に発現している膜タンパク質に検出用物質を接触させ、検出用物質の過剰分を洗浄し、検出用物質からから得られた信号の強度を測定して膜タンパク質を検出することで、浮遊性動物細胞を生細胞のままプレートに固定化し、浮遊性動物細胞表層の膜タンパク質を検出できること、また、浮遊性動物細胞に膜タンパク質遺伝子を導入し、遺伝子導入された該細胞を培養し、培養した該細胞を請求項１の方法で検出し、その検出強度によって細胞での膜タンパク質の発現量を比較し選択して、導入した膜タンパク質遺伝子を発現した浮遊性動物細胞をスクリーニングできることを見出し、本発明を完成するに至った。以下本発明を詳細に説明する。
【００１３】
すなわち本発明は、浮遊性動物細胞を生細胞のままプレートに固定化する、該浮遊性動物細胞表層の膜タンパク質を検出する方法であって、該方法は、
１）Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ基およびＯｌｅｙｌ基を有するアンカー分子により、浮遊性動物細胞をプレートに固定化する工程；
２）固定化された細胞表層に発現している膜タンパク質に検出用物質を接触させる工程；
３）前記検出用物質の過剰分を洗浄する工程；および、
４）検出用物質からから得られた信号の強度を測定することにより膜タンパク質を検出する工程、を含む方法である。
【００１４】
また本発明は、導入した膜タンパク質遺伝子を発現した浮遊性動物細胞のスクリーニング方法であって、該方法は、
１）浮遊性動物細胞に膜タンパク質遺伝子を導入する工程；
２）遺伝子導入された該細胞を培養する工程；
３）培養した該細胞を請求項１の方法で検出する工程；および、
４）請求項１の方法で得られた検出強度によって該細胞での膜タンパク質の発現量を比較し選択する工程、を含む方法である。
【００１５】
また本発明は、上記の発明において、浮遊性動物細胞がマウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０である方法である。
【００１６】
本発明において固定化する浮遊性動物細胞とは、細胞膜を持っているものであれば固定化されるので特に限定されないが、例えば、ＥＳ細胞、免疫細胞、赤血球、骨髄細胞、骨髄前駆細胞、ミエローマ細胞、ハイブリドーマなどが挙げられる。
【００１７】
動物細胞に遺伝子を導入する方法としてはリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、超音波遺伝子導入法、リポフェクション法、ウイルスベクターを使用する方法などが挙げられるが、導入効率が高ければどの方法を用いてもよい。
【００１８】
本発明における細胞の固定化とは、プレートに吸着させたタンパク質と細胞をアンカー分子ＢＡＭ（Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ａｎｃｈｏｒ ｆｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ）（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＯＥ−０８０ＣＳ：日本油脂社製）によって結合させることであり、そのアンカー分子はＮＨＳ基およびＯｌｅｙｌ基の両基を持っているが、ＮＨＳ基は水中で保存すると反応性が低下することから、Ｏｌｅｙｌ基と細胞膜の反応よりも前にプレートのタンパク質とＮＨＳ基を反応させておく。また、Ｏｌｅｙｌ基と細胞膜との反応は３７℃で２時間反応させているが３０分以上であればよい。さらに、アンカー分子であるＢＡＭは１００μＭを１００μｌ／Ｗｅｌｌで加えているが、この濃度以上であればよい。加える細胞数は９６Ｗｅｌｌプレートであれば０．６〜５×１０５Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌ程度が望ましく、さらに好ましくは２．５×１０５Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌ程度が望ましい。
【００１９】
本発明において細胞を固定化するプレートに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）を吸着させて使用しているが、アンカー分子（ＢＡＭ）（Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ａｎｃｈｏｒ ｆｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ）（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＯＥ−０８０ＣＳ：日本油脂社製）のＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）基が反応するアミノ基が豊富にあり検出用物質と非特異吸着をしないタンパク質であれば何でもよい。ここにおける検出用物質とは、アミノ酸、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、アプタマー、タンパク質などのさまざまな高分子、低分子物質のような物質である。好ましい検出用物質としては、抗原、抗体、レセプター、サイトカインなどの増殖因子が挙げられる。
【００２０】
本発明において固定化した後の細胞膜タンパク質の検出方法は特には限定されないが、吸光、発光、蛍光、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）、時間分解蛍光、放射線などがあげられる。また、これらの検出方法を行うために、上述した検出用物質をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリホスファターゼのような酵素、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＡＰＣ（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、などの蛍光物質、放射性物質、金コロイドなどで標識したものを使用することができる。
【００２１】
本発明において細胞の膜タンパク質に標識化合物を反応させた後にＰＢＳを加え、アスピレーターで上清を吸引洗浄する工程は過剰に加えた標識化合物を取り除く為、細胞が剥がれないよう洗浄できればよく、付着性細胞の洗浄に対応したウォッシャー（ＴＥＣＡＮ社：ＰＷ３８４）で行ってもよい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明による浮遊動物細胞の膜タンパク質の検出方法は、細胞をプレートに固定化することにより、洗浄効果を高めることで、バックグランドを低くし高感度で多種類のサンプルを測定することができる。これにより外来遺伝子を導入した動物細胞で、該外来遺伝子の発現量が高い細胞と、発現量が低いあるいは発現していない細胞を区別することが容易となり、高発現細胞を取得することが容易になる。
【００２３】
また、本発明は目的タンパク質を発現させた生細胞を使用することができるため、膜タンパク質を抗原とした抗体の親和性、特異性の評価を行う場合、本来の立体構造を保持したままの膜タンパク質を抗原とすることができため、立体構造を認識する抗体のスクリーニングに使用することができる。
【実施例】
【００２４】
以下に、発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１） ヒトＦｃγＲＩ遺伝子導入ミエローマ細胞でのヒトＦｃγＲＩ検出
＜１−１．ヒトＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞の作製＞
ヒトＦｃγＲＩのｃＤＮＡ（ＯＲＥＧＥＮＥ社製）（配列番号１）とＰｒｉｍｅｒ（配列番号２）を用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（９８℃／２０秒、６２℃／２０秒、７２℃／１．５分を２５サイクル）により増幅した。増幅したヒトＦｃγＲＩ遺伝子を、ゲル（０．８％ ＳｅａＫｅｍＧＴＧアガロース）の切出し精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ：ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製後、制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ：タカラバイオ社製）で消化しＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。ベクターにはｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を使用した。ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔを制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ：タカラバイオ社製）で消化し、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。その後、ベクターをＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｃ７５：タカラバイオ社製）で３７℃、３０分、脱リン酸化処理をした後、フェノール、クロロホルムで２回洗浄し、エタノール沈殿した。このように調整したヒトＦｃγＲＩ遺伝子とｐＣＭＶ−ＳｃｒｉｐｔをＭｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてＬｉｇａｔｉｏｎし、ｐＣＭＶＳ−ｈＦｃＲを作製した。その後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ産物を大腸菌のＣｏｍｐｅｔｅｍｔ Ｃｅｌｌ（ＪＭ１０９：タカラバイオ社製）へヒートショックにて形質転換を行い、形質転換後の大腸菌からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミド抽出を行い、プラスミド（ｐＣＭＶＳ−ｈＦｃＲ）を調製した。
【００２５】
Ｅ−ＲＤＦ（極東製薬社製）に１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えた培地で培養したミエローマ細胞（ＳＰ２／０）と、プラスミド（ｐＣＭＶＳ−ｈＦｃＲ）をＰＢＳに懸濁し０．４ｃｍのキュベット（Ｂｉｏ−ＲＡＤ社製）に入れ、ＥＣＭ８３０（ＥＣＭ社製）にてＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（７５０５／ｃｍ，１ｍｓ，１回）することによりプラスミド（ｐＣＭＶＳ−ｈＦｃＲ、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ）をミエローマ細胞（ＳＰ２／０）にＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。その後、Ｇ４１８ Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を４００μｇ／ｍｌ加えたＥ−ＲＤＦ（極東製薬社製）に１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えた培地で２週間程度選択を行い、ヒトＦｃγＲＩを発現したミエローマ細胞（ｈＦｃＲ）を作製した（図２参照）。また、同様に陰性コントロールとして遺伝子をクローニングしていないカラベクター（ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ）をＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎしたミエローマ細胞（Ｍｏｃｋ）（非発現）を作製した。
【００２６】
＜１−２．ｈＦｃＲでの細胞膜ヒトＦｃγＲＩの検出＞
１％になるようＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ：ＳＩＧＭＡ社製）を溶かしたＰＢＳを、９６穴イムノプレート（マキシソープ：Ｎｕｎｃ社製）に３５０μｌ／ｗｅｌｌで加え、４℃で一晩放置したものを、ＰＢＳで３回洗浄し、１００μＭとなるようアンカー分子であるＢＡＭ（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＯＥ−０８０ＣＳ：日本油脂社製）を溶かしたＰＢＳを１００μｌ／ｗｅｌｌで９６穴イムノプレートの半分のＷｅｌｌに加え、残りの半分にはＰＢＳを１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、３７℃で２時間放置した。その後、９６穴イムノプレートをＰＢＳで３回洗浄した。次に、培地であるＥ−ＲＤＦ（１０％ＦＢＳ）１０ｍｌでシャーレ（ＳＵＭＩＬＯＮ社製）にて、培養した上述１−１．で作製のｈＦｃＲ（ヒトＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）、Ｍｏｃｋ（非発現ミエローマ細胞）を１５ｍｌの遠心チューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に１０ｍｌ回収後、２００ｇ、５分で遠心を行い、上清を捨て、１０ｍｌのＰＢＳに懸濁する洗浄を２回行い、洗浄後のアンカー分子を結合させた９６穴イムノプレートに１×１０５Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌ、１×１０４Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌ、１×１０３Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌとなるよう加え、３７℃で１時間放置した。その後、２００ｇ、５分で遠心し、上清をアスピレーターで吸引した後、ＰＢＳをゆっくりと３００μｌ／ｗｅｌｌ加え、アスピレーターで吸引する洗浄を２回行った。次にＡｎｔｉ−ＣＤ６４（ｍｏｕｓｅ抗体）（Ｒ＆Ｄ社製）をＰＢＳ（３％ＦＢＳ）に２．５μｇ／ｍｌとなるように希釈し１００μｌ／Ｗｅｌｌとなるよう加え、４℃で１時間静地した。その後、上述したアスピレーターを用いた洗浄を３回行い、Ａｎｔｉ−ＭｏｕｓｅＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（Ｇｏａｔ抗体）（Ｂｅｔｈｙｌ社製）をＰＢＳ（３％ＦＢＳ）に５０μｇ／ｍｌとなるように希釈し１００μｌ／Ｗｅｌｌとなるよう加え、４℃で１時間静地した。次に、上述したアスピレーターを用いた洗浄を４回行い、基質としてＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を１００μｌ／Ｗｅｌｌで加え３７℃で１０分置き、１Ｍのリン酸溶液を５０μｌ／Ｗｅｌｌで加えた後、吸光度（Ｏ．Ｄ．＝４５０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００：ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。その結果を図４に示した。縦軸は吸光度、横軸は細胞数である。アンカー分子であるＢＡＭが無いものは、陰性コントロールであるＭｏｃｋ（非発現ミエローマ細胞）とｈＦｃＲ（ヒトＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）では優位な差は見られなかった。しかし、アンカー分子であるＢＡＭがある場合陰性コントロールであるＭｏｃｋ（非発現ミエローマ細胞）とｈＦｃＲ（ヒトＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）を比較すると、ヒトＦｃγＲＩを発現している細胞では吸光度で優位な差が見られた。このことから、アンカー分子であるＢＡＭにより細胞が９６穴イムノプレートに固定化され、細胞膜上のヒトＦｃγＲＩを検出することができた。
【００２７】
（実施例２） ヒトＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞からの高発現株スクリーニング
本発明の全体の流れを、図１に示した。ヒトＦｃγＲＩの遺伝子を導入されたミエローマ細胞（ＳＰ２／０）を１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで９６穴プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に撒き培養することで、細胞群を分け、これらのミエローマ細胞表層に発現しているヒトＦｃγＲＩの発現量を実施例１の検出方法で検出し、比較することで、ヒトＦｃγＲＩ高発現ミエローマ（ＳＰ２／０）をスクリーニングした。
【００２８】
１％になるようＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ：ＳＩＧＭＡ社製）を溶かしたＰＢＳを、９６穴イムノプレート（マキシソープ：Ｎｕｎｃ社製）に３５０μｌ／ｗｅｌｌで加え、４℃で一晩放置したものを、ＰＢＳで３回洗浄し、１００μＭとなるようアンカー分子であるＢＡＭ（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＯＥ−０８０ＣＳ：日本油脂社製）を溶かしたＰＢＳを１００μｌ／ｗｅｌｌで９６穴イムノプレートに加え、３７℃で２時間放置した。その後、ＰＢＳで３回洗浄した９６穴イムノプレートに、実施例１で作製したｈＦｃＲ（ヒトＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）、Ｍｏｃｋ（非発現ミエローマ細胞）を培地Ｅ−ＲＤＦ（１０％ＦＢＳ）にて２４ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養したものを１．５ｍｌのエッペン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）に１ｍｌ取り、１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した後、各サンプルを１×１０５Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌとなるよう加えた。次に３７℃で１時間放置した後、２００ｇ、５分で遠心し、上清をアスピレーターで吸引し、ＰＢＳをゆっくりと３００μｌ／ｗｅｌｌ加え、アスピレーターで吸引する洗浄を２回行った。次にＡｎｔｉ−ＣＤ６４（Ｇｏａｔ抗体）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）をＰＢＳ（３％ＦＢＳ）に０．５μｇ／ｍｌとなるように希釈し１００μｌ／Ｗｅｌｌとなるよう加え、４℃で１時間静置後、上述したアスピレーターを用いた洗浄を３回行った。また、Ａｎｔｉ−ＧｏａｔＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（Ｒａｂｂｉｔ抗体）（Ｚｙｍｅｄ社製）をＰＢＳ（３％ＦＢＳ）に１／５０００となるように希釈し１００μｌ／Ｗｅｌｌとなるよう加え、４℃で１時間静置した。その後、上述したアスピレーターを用いた洗浄を４回行い、基質としてＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を１００μｌ／Ｗｅｌｌで加え３７℃で１０分置き、１Ｍのリン酸溶液を５０μｌ／Ｗｅｌｌで加えた後、吸光度（Ｏ．Ｄ．＝４５０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００：ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。その結果を図５に示した。縦軸は吸光度、横軸は細胞数を合わせたサンプルであり、陰性コントロールであるＭｏｃｋ（非発現ミエローマ細胞）と比べ、ｈＦｃＲ（ヒトＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）では吸光度で優位な差が見られ細胞膜上のヒトＦｃγＲＩを検出することができた。また、細胞数を合わせ、各細胞間の吸光度差を測定することによりヒトＦｃγＲＩの発現量の違いがわかり高発現している細胞を選択することができた。
【００２９】
（実施例３） マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞での検出
＜３−１．マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞の作製＞
マウスＦｃγＲＩの遺伝子配列は（配列表２−１）に示したものを使用した。この遺伝子はマウスＳｐｌｅｅｎのｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社製）からＰｒｉｍｅｒ（配列表２−２）を用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（９８℃／３０秒、６５℃／３０秒、７２℃／１．５分を２５サイクル）により増幅した。増幅したマウスＦｃγＲＩ遺伝子を、ゲル（０．８％ ＳｅａＫｅｍＧＴＧアガロース）の切出し精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ：ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製後、制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ：タカラバイオ社製）で消化しＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。ベクターにはｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を使用した。ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔを制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ：タカラバイオ社製）で消化し、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。その後、ベクターをＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｃ７５：タカラバイオ社製）で３７℃、３０分、脱リン酸化処理をした後、フェノール、クロロホルムで２回洗浄し、エタノール沈殿した。このように調整したマウスＦｃγＲＩ遺伝子とｐＣＭＶ−ＳｃｒｉｐｔをＭｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてＬｉｇａｔｉｏｎし、ｐＣＭＶＳ−ｍＦｃＲを作製した。その後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ産物を大腸菌のＣｏｍｐｅｔｅｍｔ Ｃｅｌｌ（ＪＭ１０９：タカラバイオ社製）へヒートショックにて形質転換を行い、形質転換後の大腸菌からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミド抽出を行い、プラスミド（ｐＣＭＶＳ−ｍＦｃＲ）の調整を行った。
【００３０】
Ｅ−ＲＤＦ（極東製薬社製）に１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えた培地で培養したミエローマ細胞（ＳＰ２／０）と、プラスミド（ｐＣＭＶＳ−ｍＦｃＲ）をＰＢＳに懸濁し０．４ｃｍのキュベット（Ｂｉｏ−ＲＡＤ社製）に入れ、ＥＣＭ８３０（ＥＣＭ社製）にてＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（７５０Ｖ／ｃｍ、１ｍｓ、１回）することによりプラスミド（ｐＣＭＶＳ−ｍＦｃＲ、ｐＣＭＶＳ）をミエローマ細胞（ＳＰ２／０）にＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。その後、Ｇ４１８ Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を４００μｇ／ｍｌ加えたＥ−ＲＤＦ（極東製薬社製）に１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えた培地で２週間程度選択を行い、マウスＦｃγＲＩを発現したミエローマ細胞（ｍＦｃＲ）を作製した（図３参照）。
【００３１】
＜３−２．マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマでの検出＞
１％になるようＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ：ＳＩＧＭＡ社製）を溶かしたＰＢＳを、９６穴イムノプレート（マキシソープ：Ｎｕｎｃ社製）に３５０μｌ／ｗｅｌｌで加え、４℃で一晩放置したものを、ＰＢＳで３回洗浄し、１００μＭとなるようアンカー分子であるＢＡＭ（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ ＯＥ−０８０ＣＳ：日本油脂社製）を溶かしたＰＢＳを１００μｌ／ｗｅｌｌで９６穴イムノプレートに加え、３７℃で２時間放置した。その後、ＰＢＳで３回洗浄した９６穴イムノプレートに、３−１．で作製したｍＦｃＲ（マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）、実施例１で作製したＭｏｃｋ（非発現ミエローマ細胞）を培地Ｅ−ＲＤＦ（１０％ＦＢＳ）にて２４ｗｅｌｌプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）で培養したものを１．５ｍｌのエッペン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）に１ｍｌ取り、１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄したのち、各サンプルを１×１０６Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌから順に１／２希釈となるよう加え、最後は０Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌとなるように加えた。次に３７℃で１時間放置した後、２００ｇ、５分で遠心し、上清をアスピレーターで吸引し、ＰＢＳをゆっくりと３００μｌ／ｗｅｌｌ加え、アスピレーターで吸引する洗浄を２回行った。その後、Ａｎｔｉ−ＭｏｕｓｅＣＤ６４（Ｒａｔ抗体）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）をＰＢＳ（３％ＦＢＳ）に０．２μｇ／ｍｌとなるように希釈し１００μｌ／Ｗｅｌｌとなるよう加え、４℃で１時間置き、上述したアスピレーターを用いた洗浄を３回行った。次に、Ａｎｔｉ−ＲａｔＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｇｏａｔ抗体）（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）をＰＢＳ（３％ＦＢＳ）に１／５０００となるように希釈し１００μｌ／Ｗｅｌｌとなるよう加え、４℃で１時間置き、上述したアスピレーターを用いた洗浄を４回行った。基質としてＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を１００μｌ／Ｗｅｌｌで加え３７℃で１０分置き、１Ｍのリン酸溶液を５０μｌ／Ｗｅｌｌで加えた後、吸光度（Ｏ．Ｄ．＝４５０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００：ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。その結果を図６に示した。縦軸は吸光度、横軸はｍＦｃＲ（マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）とＭｏｃｋ（非発現ミエローマの細胞）の１／２希釈列である。ここから、Ｍｏｃｋ（非発現ミエローマの細胞）においては細胞数に比例せず吸光度は一定であったが、ｍＦｃＲ（マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）は細胞数に依存して吸光度が上昇していることがわかる。よって、ｍＦｃＲ（マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）の細胞膜上のマウスＦｃγＲＩを検出することができた。また、ｍＦｃＲ（マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）においては２．５×１０５Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌのときに最も高い値を示した。
【００３２】
（実施例４） 遠心による従来法と固定による検出の比較
３％Ｐｅｒｆｅｃｔｂｌｏｃｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）ｉｎＰＢＳを９６穴イムノプレート（マキシソープ：Ｎｕｎｃ社製）に３５０μｌ／ｗｅｌｌで加え、３７℃で２時間放置後、ＰＢＳで３回洗浄したプレートに、培地であるＥ−ＲＤＦ（極東製薬社製）１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えた培地１０ｍｌでシャーレ（ＳＵＭＩＬＯＮ社製）にて、培養した上述３−１．で作製のｍＦｃＲ（マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）、実施例１で作製のＭｏｃｋ（非発現ミエローマ細胞）を１５ｍｌの遠心チューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に１０ｍｌ回収後、２００ｇ、５分で遠心を行い、上清を捨て、１０ｍｌのＰＢＳに懸濁する洗浄を２回行った。ｍＦｃＲ、Ｍｏｃｋをそれぞれ、１×１０５、１×１０４、１×１０３、０、Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌになるよう加えた。２００ｇ、５分で遠心後、上清をアスピレーターで吸引し、ＰＢＳをゆっくりと３００μｌ／ｗｅｌｌ加える洗浄を３回行い、Ａｎｔｉ−ＭｏｕｓｅＣＤ６４（Ｒａｔ抗体）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）をＰＢＳ（３％ＦＢＳ）に０．２μｇ／ｍｌとなるように希釈し１００μｌ／Ｗｅｌｌとなるよう加え、４℃で１時間置き、上述した２００ｇ、５分で遠心を行いアスピレーターで吸引する洗浄を３回行った。また、Ａｎｔｉ−ＲａｔＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｇｏａｔ抗体）（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）をＰＢＳ（３％ＦＢＳ）に１／５０００となるように希釈し１００μｌ／Ｗｅｌｌとなるよう加え、４℃で１時間置き、上述した２００ｇ、５分で遠心を行いアスピレーターで吸引する洗浄を３回行った。基質としてＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を１００μｌ／Ｗｅｌｌで加え３７℃で３分置き、１Ｍのリン酸溶液を５０μｌ／Ｗｅｌｌで加えた後、吸光度をプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００：ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。その結果を図７に示した。図７の縦軸は、それぞれの値をコントロールである０Ｃｅｌｌ／Ｗｅｌｌの吸光度で除した値である。横軸はｍＦｃＲ（マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）とＭｏｃｋ（非発現ミエローマの細胞）の細胞数の希釈列である。遠心での検出の結果は、最も高い値と０Ｃｅｌｌ／Ｗｅｌｌの値（序してあるため１となる）を比較すると約１．８倍であった。
【００３３】
また、実施例２で示した方法で、図７と同じサンプルを測定した結果を図８に示した。図８の縦軸は、それぞれの値をコントロールである０Ｃｅｌｌ／Ｗｅｌｌの吸光度で除した値である。横軸はｍＦｃＲ（マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）とＭｏｃｋ（非発現ミエローマの細胞）の細胞数の希釈列である。ここから、細胞をプレートに固定化して測定した結果は、最も高い値と０Ｃｅｌｌ／Ｗｅｌｌの値（序してあるため１となる）を比較すると約４．５倍となった。図７と図８を比較すると遠心を用いた測定に比べ細胞をプレートに固定化して測定した結果の方が、陰性コントロールである０Ｃｅｌｌ／Ｗｅｌｌの値を低く抑えることが可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明のスクリーニング方法を示す図である。
【図２】ｈＦｃＲ（ヒトＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）作製の図である。
【図３】ｍＦｃＲ（マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞）作製の図である。
【図４】アンカー分子（ＢＡＭ）あり、なしでの検出結果の図であり、Ｘ軸（横軸）はウエル（Ｗｅｌｌ）中の細胞数を、Ｙ軸（縦軸）は４５０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．（吸光度）を示す。
【図５】高発現ヒトＦｃγＲＩミエローマをスクリーニングしている図であり、Ｘ軸（横軸）はウエル（Ｗｅｌｌ）番号を、Ｙ軸（縦軸）は４５０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．（吸光度）を示す。
【図６】マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞での検出結果の図であり、Ｘ軸（横軸）はウエル（Ｗｅｌｌ）中の細胞数及び希釈率を、Ｙ軸（縦軸）は４５０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．（吸光度）を示す。
【図７】マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞での固定化せず遠心洗浄を用いた検出結果の図であり、Ｘ軸（横軸）はウエル（Ｗｅｌｌ）中の細胞数を、Ｙ軸（縦軸）は４５０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．（吸光度）を示す。
【図８】マウスＦｃγＲＩ発現ミエローマ細胞での固定化し検出した結果の図であり、Ｘ軸（横軸）はウエル（Ｗｅｌｌ）中の細胞数を、Ｙ軸（縦軸）は４５０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．（吸光度）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
浮遊性動物細胞を生細胞のままプレートに固定化する、該浮遊性動物細胞表層の膜タンパク質を検出する方法であって、該方法は、
１）Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ基およびＯｌｅｙｌ基を有するアンカー分子により、浮遊性動物細胞をプレートに固定化する工程；
２）固定化された細胞表層に発現している膜タンパク質に検出用物質を接触させる工程；
３）前記検出用物質の過剰分を洗浄する工程；および、
４）検出用物質から得られた信号の強度を測定することにより膜タンパク質を検出する工程、を含む方法。
【請求項２】
導入した膜タンパク質遺伝子を発現した浮遊性動物細胞のスクリーニング方法であって、該方法は、
１）浮遊性動物細胞に膜タンパク質遺伝子を導入する工程；
２）遺伝子導入された該細胞を培養する工程；
３）培養した該細胞を請求項１の方法で検出する工程；および、
４）請求項１の方法で得られた検出強度によって該細胞での膜タンパク質の発現量を比較し選択する工程、を含む方法。
【請求項３】
浮遊性動物細胞がマウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１】
浮遊性動物細胞を生細胞のままプレートに固定化する、該浮遊性動物細胞表層の膜タンパク質を検出する方法であって、該方法は、
１）Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ基およびＯｌｅｙｌ基を有するアンカー分子により、浮遊性動物細胞をプレートに固定化する工程；
２）固定化された細胞表層に発現している膜タンパク質に検出用物質を接触させる工程；
３）前記検出用物質の過剰分を洗浄する工程；および、
４）検出用物質から得られた信号の強度を測定することにより膜タンパク質を検出する工程、を含む方法。
【請求項２】
導入した膜タンパク質遺伝子を発現した浮遊性動物細胞のスクリーニング方法であって、該方法は、
１）浮遊性動物細胞に膜タンパク質遺伝子を導入する工程；
２）遺伝子導入された該細胞を培養する工程；
３）培養した該細胞を請求項１の方法で検出する工程；および、
４）請求項１の方法で得られた検出強度によって該細胞での膜タンパク質の発現量を比較し選択する工程、を含む方法。
【請求項３】
浮遊性動物細胞がマウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−２８４７７０（Ｐ２００９−２８４７７０Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１３７８４３（Ｐ２００８−１３７８４３）
【出願日】平成２０年５月２７日（２００８．５．２７）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２７日（２００８．５．２７）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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