混合式ミクロ流動方法
相互に連結されたチャンネル・ネットワークを供給する工程であって、該ネットワークは、第一流動ジャンクションで相交わる第一（１２０８）、第二（１２１０）、第三（１２１２）チャンネルセグメントを備え、第二チャンネルセグメントは、第一流動リザーバ（１２０４）に一端で終端し、第一流動ジャンクションに他端で相交わり、該ネットワークは更に第四チャンネルセグメントを備え、第四チャンネルセグメント（１２１４）は、一端で第二流動ジャンクション（１２１５）にて第三チャンネルセグメントと相交わり、他端で第一バッファーを含んだ第二流動リザーバ（１２０６）に終端している工程、等を含むサンプルから帯電した種を抽出し、それを濃縮する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
ミクロ流動工学は、一層の迅速性、正確性、容易に自動化可能な小型化実験を約束することにより、生物学及び化学的研究における次の技術革新として報告されてきた。ミクロ流動実験の利点の多くは、市場で明らかである。例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．から供給されるＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ並びにそのミクロ流動装置及び試薬キットメニューは、生命科学研究者に重要な多数の異なる分析を行うための多目的実験台を提供する。これらのシステムで作られたデータは、デジタル化された高再現性状態で容易に得られる。
【０００２】
高スループット実験もミクロ流動生成物により処理（ａｄｄｒｅｓｓ）されている。Ｃａｌｉｐｅｒ ２５０ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍは、連続流ミクロ流動アッセイフォーマット中の多数の異なるサンプル、例えば薬剤テスト化合物を選別して、これらテスト化合物から可能な治療剤を同定する。このようなシステムは、単独のミクロ流動装置で１日当り数千、数万のアッセイを行い、従来の選別システムに比べて、プロセスのスループットを増大させながら、使用試薬のフットプリント及び量を減少させる能力を有する。
【０００３】
ミクロ流動システムは、その約束を果たしているが、開発されたシステムにおけるミクロ流動チャンネルネットワークの相互連絡した性質は、システムの操作性に幾つかの制限を招いている。例として、初期のミクロ流動システムは、完全に動電的な駆動流システムを採用した。これらのシステムは、装置の相互連絡したチャンネルの全てにおいて、平坦なプラグ流れプロファイルにより材料を移動させる間中、拡散が制限された分散により流体、その他の材料の移動について精密制御性を与えた。しかし、材料の移動を駆動させるため、電場を使用することも、装置のチャンネル内に差別的に（異なるように）帯電した種の電気泳動的分離又は偏りを駆動して、一層複雑なデータの脱繰り込み（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を必要とするデータを生じる。更に、このような動電的流れシステムは、長いチャンネル距離を渡るべき所では、材料の移動が遅くなり、スループットを低下させる恐れがある。ミクロ流動システムに圧力による流れを用いると、差別的に帯電した材料の偏った移動はなくなるが、放物線の流れを持つシステム中で生じるＴａｙｌｏｒ−Ａｒｉｓ分散の増大により、一層高度に分散した流れのプロファイルを作る。
【特許文献１】ＵＳＰ ６，０１２，９０２
【特許文献２】ＵＳＰ ６，１７１，０６７
【特許文献３】ＰＣＴ出願公開Ｎｏ．ＷＯ ０２／１０７３２
【特許文献４】ＵＳＰ ５，９４２，４４３
【特許文献５】ＵＳＰ ６，０４６，０５６
【特許文献６】ＵＳＰ ６，２６７，８５８
【特許文献７】ＵＳＰ ５，８８５，４７０
【特許文献８】ＵＳＰ ６，１５６，１８１
【特許文献９】ＵＳＰ ６，２３８，５３８
【特許文献１０】ＵＳＰ ５，９４８，２２７
【特許文献１１】ＵＳＰ ６，０４２，７１０
【特許文献１２】国際出願公開Ｎｏ．ＷＯ９８／００２３１
【特許文献１３】ＰＣＴ出願公開Ｎｏ．ＷＯ ９９／３９１９０
【特許文献１４】ＵＳＳＮ ６０／３６２，２９１
【特許文献１５】ＵＳＰ ５，８７２，０１０
【特許文献１６】ＰＣＴ出願公開Ｎｏ．ＷＯ ０１／６３２７０
【非特許文献１】Ｔａｙｌｏｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，（１９５３）２１９Ａ：１８６−２０３
【非特許文献２】Ａｒｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，（１９５６）Ａ２３５：６７−７７
【非特許文献３】Ｃｈａｔｗｉｎ等，Ｊ．Ｆｌｕｉｄ ｍｅｃｈ．（１９８２）１２０：３４７−３５８
【非特許文献４】Ｄｏｓｈｉ等，Ｃｈｅｍ，Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．（１９７８）３３：７９５−８０４
【非特許文献５】Ｇｕｅｌｌ等，Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｍ．（１９８７）５８：２３１−２４４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一般に、各タイプの流れプロファイルの有利な面を利用しながら、各プロファイルの魅力の劣る特徴を除去するか又は最小にするように最適化されたミクロ流動システムを提供することが望ましい。本発明は、これら及びその他の各種要求を満足する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明は、一般に、チャンネルネットワーク中で材料の最適移動を行うため、混成流体流れプロファイルを用いる方法及びシステムを提供する。これらのシステムは、各種チャンネルセグメント間の相互連絡を維持しながら、材料を相互連絡したチャンネルネットワーク中で移動させるため、圧力及び動電による混成流れシステムを用いる。特に本発明は、一般に、第一チャンネルセグメントでの流れが、圧力流により駆動され、その結果、放物線状流れプロファイルが得られる場合のチャンネルネットワークに向けたものである。相互連絡したチャンネルセグメントでは、材料の流れは、動電的に駆動され、その結果、プラグ流れプロファイルを生じる。本方法及びシステムは、圧力流をタップオフすると共に、接続部を通る動電的流れに置換するため、異種の流れプロファイルを持つチャンネルの該接続部に、通常、アクセスチャンネル又はタッピングチャンネルを用いる。これは、材料の移動下で流れプロファイルを変えながら、材料を第一チャンネルセグメントから第二チャンネルセグメントに流す競争試験（ｐａｓｓｉｎｇ ｏｆｆ）を保証する。
【０００６】
本発明装置は、加える圧力又は電場を制御するか、或いは加える圧力、電場の両方を制御して、異なる種の流れプロファイルを管理することにより、サンプル混合物から差別的に帯電した種を分離するためにも有用である。多数の圧力及び電圧源を持った流体制御システムを用いて、ミクロ流動チャンネルネットワークのいずれかの部分の流体力学流及び電場が所望値に設定できるように、装置のいずれかの所定のチャンネルセグメント中で圧力及び／又は電圧を制御できる。本発明は、２つの異なる流れプロファイル、即ち、圧力による駆動及び動電的駆動のプロファイルを重複させ、同時に各流れプロファイル下で、流速を制御して、この流体中に、流体で運ばれたサンプル中に含まれる差別的に帯電した種を容易に分離及び単離するのに十分な量で含有する所定種について正味速度を得ることにより、チャンネルネットワークの異なるセグメント中の流体流を独立に制御する装置を提供する。こうして、以下に説明するＴ−交差点のようなチャンネル交差点に送られた、異なる電気泳動移動度を有する２つ以上のサンプル種の混合物（例えば中性基質及び酵素反応の負帯電生成物）は、サンプル種の異なる電気泳動移動度に基づいて、交差点の別々のチャンネル内の分離成分に完全に分離できる。
【０００７】
前述の選択的イオン抽出と同様に、異なる移動度（例えば異なる電荷及び／又は質量）を有するアナライトを分離、抽出する他の新規な技術もここで説明する。この技術では、ミクロ流動チャンネルネットワークは、数を減らした外部圧力源及び電圧源を利用することにより、例えば先に説明した実施態様と比べて、流体制御に必要な流体リザーバーの数を減らして分離を行うことにより、流動駆動力を配分して、流体サンプル中の差別的に帯電した種を分離するように、構成、寸法化される。この方法では、流体輸送に必要な過剰のハードウエアーは、最小化でき、またミクロ流動装置は、先に説明した設計に比べて少数の流体リザーバーで操作できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
図面の簡単な説明
図１は、放物線状の圧力駆動流れプロファイル（図１Ａ）及び動電的駆動プラグ流れプロファイル（図１Ｂ）を示す。
【０００９】
図２は、本発明による混成又は混合式の圧力及び動電的駆動ミクロ流動チャンネルシステムの概略図である。
【００１０】
図３は、図２に示したネットワークでの各チャンネルセグメントの流れプロファイルの概略図である。
【００１１】
図４は、サンプル導入に続いて分離による分析を利用した連続選別アッセイを行う操作での本発明装置の概略図である。
【００１２】
図５は、本発明方法を実施するためのシステムの概略図である。
【００１３】
図６のＡ及びＢは、それぞれ平面的及び一部立体的（ｓｉｐｐｅｒ）なフォーマットミクロ流動装置を示す。
【００１４】
図７のＡ〜Ｄは、選択的イオン抽出を行うためのシステムの概略図である。
【００１５】
図８は、圧力及び電圧処理により中間電荷を有する種を抽出する本発明装置を用いた、混合物からの帯電種の多段選択イオン抽出を示す。
【００１６】
図９は、選択的イオン抽出による混合物からの帯電種の分離に使用される通常のチップ設計を示す。
【００１７】
図１０は、２つの差別的に帯電した種の流束（ｆｌｕｘ）モデルを圧力変化の関数として示す。
【００１８】
図１１のＡ、Ｂ、Ｃは、装置のＴ−交差点における分離前後の多数の帯電種の蛍光強度を示す。
【００１９】
図１２Ａは、一形態の選択的イオン抽出を用いて、サンプル中の２つの差別的に帯電した種を互いに分離、抽出するのに使用されるチップチャンネル設計の他の一実施態様である。図１２Ｂは、図１２Ａの装置の１２Ｂ−１２Ｂ線部分の横断面図である。図１２Ｃは、２つの差別的に帯電した種の分離、抽出を示す図１２Ａのチャンネル配置構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）の拡大図である。
【００２０】
図１３Ａは、一形態の選択的イオン抽出を用いて、サンプル中の複数（例えば２以上）の差別的に帯電した種を互いに分離、抽出するのに使用されるチップチャンネル設計の他の一実施態様である。図１３Ｂは、図１３Ａの装置の１３Ｂ−１３Ｂ線部分の横断面図である。
【００２１】
図１４Ａは、図１２Ａに示したものと同様な縦つなぎの（ａ ｃａｓｃａｄｅ ｏｆ）平行分離チャンネルを用いた一形態の選択的イオン抽出を用いて、サンプル中の２つの差別的に帯電した種を互いに分離、抽出するのに使用されるチップチャンネル設計の他の一実施態様である。図１４Ｂは、２つの差別的に帯電した種を互いに分離する際の分離効率の向上を示す、図１４Ａのチャンネル配置構成の部分拡大図である。
【００２２】
図１５は、ミクロ流動装置に於けるサンプルから以後の分析の為の（ＤＮＡ及びＲＮＡのような）電気泳動の流動種を検出し、前もって濃縮する本発明の教示により使用することの出来るミクロ流動装置チャンネル配置の一概略図である。
【００２３】
図１６Ａは、図１５が装置のさまざまなチャンネルセグメントを通じて、圧力より生じた速度の例示を示しているミクロ流動装置チャンネル配置の一概略図である。図１６Ｂは、図１５が電気分野で装置のリザーバ１２０４及び１２０６との間に適用される際に、装置のさまざまなチャンネルセグメントを通じて、動電学的な速度の例示を示しているミクロ流動装置チャンネル配置の一概略図である。そして、図１６Ｃは、図１５が装置のさまざまなチャンネルセグメントを通じて、包括的な全種の速度をチャンネル配置の一概略図である。
【００２４】
図１７は、図１５に示されているように一チャンネル配置を使用して一サンプル内にＤＮＡをおおよそ７つに折り畳んでスタック（ｓｔａｃｋｉｎｇ）を示している一電子フェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【００２５】
発明の詳細な説明
Ｉ．総論
一般に本発明は、第一のチャンネルセグメント中に主として非動電的圧力駆動流を含み、一方、接続した第二のチャンネルセグメント中に動電的駆動流を含むミクロ流動チャンネルシステムで材料を移動させる方法及びシステムを提供する。ミクロ流動チャンネルネットワークの異なる部分で異なる種類の流れプロファイルを付与することにより、特殊な流れプロファイルにより生じる恐れがある悪影響を最小にしながら、全体の操作により各セグメントを最適化できる。
【００２６】
ここで使用した語句“非動電的圧力流”とは、チャンネルセグメント外部の圧力源により駆動される流れを言い、この流れは、チャンネルセグメントを介して駆動され、問題のチャンネルセグメントに電場を加えることにより、このチャンネルセグメントを介して発生する流れ（ここでは、“動電的駆動流”と言う）とは対照的のものである。圧力源の例としては、動電的圧力ポンプ、例えば問題のチャンネルセグメントとは離れたポンプ作用性チャンネル中で動電的駆動流により圧力を発生するポンプ（但し、このようなポンプは、問題のチャンネルセグメントの外部にある）を含む、問題のチャンネルセグメント外部の負圧及び正圧の供給源又はポンプが挙げられる（ＵＳＰ ６，０１２，９０２及び同６，１７１，０６７参照、これらの各文献は、あらゆる目的のため、全体をここに援用した）。
【００２７】
ここで使用した用語：動電的流れは、一般に、加えた電場下での流体又は流体運搬材料の移動を説明するために使用する。動電的流れは、一般に、電気泳動、例えば帯電種が配置される媒体又は流体を介した帯電種の移動、及び電気浸透、例えば流体の全成分を含む塊状流体の電気駆動移動の一方又は両方を包含する。したがって、動電的流れについて言及する際、予想されるものは、種の主として又はほぼ完全に電気泳動的移動から、例えば非帯電材料の場合、材料の主として電気浸透的な駆動移動までの動電的流れの全範囲、及びこれらの両極端部間に入る２つのタイプの動電的移動の範囲全体及び比率全体であると理解されよう。
【００２８】
ここで使用した用語“流れプロファイル”とは、一般に、通路、導管、チャンネルを通るか、又は表面を横断する流体流又は他の材料流の特徴の全てを言う。このような特徴としては、限定されるものではないが、流速、流量、流れる流体又は他の材料の配座（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）及び同伴する分散プロファイルや、その他、流れの更に一般化した特徴、例えば層流、沿面（ｃｒｅｅｐｉｎｇ）流、乱流等が挙げられる。
【００２９】
ＩＩ．圧力駆動流対動電的駆動流
先に述べたように、微小規模の流動チャンネルでは、圧力駆動流は、動電的駆動流とは異なる特徴を有する。特に、これらシステムでの圧力駆動流は、通路又は導管の中央部の流体が最も速く移動する所では、流体が側壁に接近するのに従って減少する流れ速度勾配により放物線流となり、また壁での流体は、流れ速度が０又は０に近くなる（図１Ａの放物線流の概略図参照）。放物線流の結果の一つは、材料の流速に関連する分散水準の増大であり、チャンネルを流通する際、別の流体又は他の材料の広がりが増大する。分散、特にＴａｙｌｏｒ−Ａｒｉｓ分散についての検討は、例えばＴａｙｌｏｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，（１９５３）２１９Ａ：１８６−２０３；Ａｒｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，（１９５６）Ａ２３５：６７−７７；Ｃｈａｔｗｉｎ等，Ｊ．Ｆｌｕｉｄ ｍｅｃｈ．（１９８２）１２０：３４７−３５８；Ｄｏｓｈｉ等，Ｃｈｅｍ，Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．（１９７８）３３：７９５−８０４；及びＧｕｅｌｌ等，Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｍ．（１９８７）５８：２３１−２４４参照。これらの各文献は、あらゆる目的のため、全体をここに援用した。
【００３０】
この分散の増大は、ミクロ流動規模では分析の解析力（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）低下（別のやり方で解析された種の分散で生じる）や、所定の分析に要する時間の増大（異なる流体又は材料サンプル間に必要な空間の増大で生じる）となる可能性がある。圧力駆動流は、分散の増大という欠点を有するが、高速流であり、また差別的に帯電した種に加えた電場が装置の複数のチャンネルを移行することにより生じる動電的偏り効果がないという利点がある。
【００３１】
圧力駆動流の特徴とは対照的に、動電的駆動流、特に電気浸透駆動流は、流体の大部分が導管を同じ速度で移行する所では、“プラグ”流れプロファイルが生じ、外装層で少量の流体だけが低速で移動するか又は流速０に近づく（図１Ｂのプラグ流参照）。プラグ流は、分散水準を実質的に低下させて、導管内で別の材料領域を一層高分解能輸送すると共に、一層高分解能で種を解析できる。しかし、前述のように、動電的駆動流は、この方法で輸送される差別的に帯電した種を電気泳動的に分離又は偏らせることができる。多数の分析、例えば材料混合物の分離による電荷又は大きさに依存する分析には、電気泳動分離は有利である。しかし、分子の複雑な混合物の塊状移動による分析又は他の操作には、電気泳動偏りは、最適分析条件が少なくなり、及び／又はデータの翻訳が困難となる可能性がある。
【００３２】
分析操作では、所定の操作において、異なる箇所での異なる各流れプロファイルの利点及び欠点をそれぞれ最大化、最小化したいという状況が多数ある。本発明は、これを行う手段を提供する。
【００３３】
ＩＶ．混成流れプロファイル及び混成操作装置／システム
圧力流れプロファイル及び動電的流れプロファイルの異なる特徴にも拘わらず、幾つかの場合には、これらの異なる特徴から、単独の接続したチャンネルネットワークに両方の流れプロファイルを付与できることが望ましい。例えば同時係属ＰＣＴ出願公開Ｎｏ．ＷＯ ０２／１０７３２には、この目的は、一般に、高流れ抵抗性接続チャンネルを用いて、或る領域を他の領域から流れとして実質的に単離することにより達成されると記載されている。特にサンプル導入チャンネルに負圧を加えることにより、サンプルは、装置内に引き込まれる。サンプル材料の一部は、高流れ抵抗性接続チャンネルにより分離チャンネル中に注入される。高流れ抵抗性接続チャンネルを組み入れることにより、圧力駆動サンプル装填用チャンネルから動電的駆動分離チャンネルを効果的に脱結合（ｄｅｃｏｕｐｌｅ）することができる。前記システムの有用性にも拘わらず、一般に、これらの目的は、異なるチャンネルセグメントを、例えば高抵抗性チャンネルセグメントにより、互いに実質的に単離する必要もなく、一層簡単なチャンネルネットワーク内で達成することが望ましい。
【００３４】
高スループット選別操作の場合、動電的注入又は装填に起因するサンプル偏り効果を防止するため、サンプルプラグは、圧力駆動流を用いてサンプル導入チャンネルを通って装置中に引き込まれる。圧力駆動流は、これらのプラグを相互連絡したチャンネルネットワークを通って、真空の廃棄物リザーバーに向けて移動させるのにも使用される。多く利用するため、電場は、チャンネルネットワークの少なくとも一部にも加えて、例えば帯電差により異なる電気泳動移動度を有する種の電気泳動分離を行う。電場は、圧力駆動流の他、電気浸透流を作る。動電的流れは、最小分散のプラグ流れプロファイルを作るという利点を有するが、圧力による流れが存在すると、なおＴａｙｌｏｒ分散の負の効果を与える。したがって、操作、例えば薬剤化合物の高スループット選別を一層高い解析力で達成するには、圧力駆動流の分散的寄与を最小にしなければならない。この目的は、全ての圧力流の除去で達成できるが、高スループット操作の実用性、例えば材料の過度な電気泳動偏りなく、迅速な流れを求める要求には、材料流の少なくとも一部は、圧力系システムによる駆動を必要とすることが多い。
【００３５】
本発明は、一般に第一のチャンネルセグメントでは圧力駆動流を利用しながら、他の１つの接続したチャンネルセグメントでは実質的に動電的な駆動流を付与する混成方法及びシステムを提供する。ミクロ流動チャンネルネットワークの相互連絡性を考慮すると、２つの異なる種類の流れを１つの相互連絡したチャンネル構造中に一緒に組合わせるのは、各局面の制御を他方の制御から完全に分離することが困難なので、望ましくなかった。しかし、意外にも、本発明は、相互連絡したチャンネルネットワークの異なるセグメントが独立に制御可能な流れプロファイル、即ち、一方は圧力で駆動され、他方は動電的に駆動される流れプロファイルを有する相互連絡したチャンネルネットワークを供給する方法及びシステムを提供する。更に本発明は、このように独立に制御された流れプロファイルを巧みに操作して、選択された帯電種の流れを混合物から別のチャンネルセグメント中に誘導し、これにより該選択された帯電種を混合物の中から抽出する装置を提供する。
【００３６】
本発明の方法及び装置は、全操作の一部の操作での圧力による流れの利点及び全操作の他の一部の操作での動電的流れの利点を利用することが望ましい場合、流体又は他の材料の輸送に特に有用である。一例として、本発明の混成システムは、装置のチャンネルに迅速な材料導入を必要とするが、放物線又は圧力による流れ条件下で行うと、分散の増大が生じる可能性がある長時間の分離、反応又は加温を要する分析を行うのに特に有用である。
【００３７】
多くの薬剤目標物選別アッセイでは、ミクロ流動反応での通常の時間−フレーム（ｆｒａｍｅ）が非常に遅いので、満足な検出及び分析に十分な生成物を生じないほど、反応動力学は非常に遅い。特にミクロ流動システム、例えばＵＳＰ ５，９４２，４４３；同６，０４６，０５６；同６，２６７，８５８（これらの各文献は、あらゆる目的のため、全体をここに援用した）に記載の連続流選別システム、反応剤、例えば目標物及び基質、又は配位子等は、反応チャンネル内に入れて流通させ、検出窓を過ぎ、この点で反応生成物が観察される。定期的にテスト化合物、例えば薬剤候補ライブラリー中の候補化合物を流れに導入し、これら化合物の反応への影響を観察する。反応時間量を増大させるため、所定長さのチャンネル中の流速を低下させるか、或いは所定流速下でチャンネルの長さを大きくする。いずれにしても、流れが圧力駆動の場合、移動（ｔｒａｎｓｉｔ）時間量に関連する実質的な分散を生じる可能性がある。分散が増大すると、連続的に導入したテスト化合物プラグ間の間隔を更に大きくする必要があるので、システムのスループットは低下する。
【００３８】
テスト化合物を含む反応混合物を圧力による流れから動電的流れに移行させることにより、テスト化合物プラグの分散を顕著に増大させることなく、動電的流れ条件下で反応時間を一層長くしたチャンネルネットワークを設計することにより、反応時間は実質的に増大できる。詳しくは、Ｔａｙｌｏｒ−Ａｒｉｓ分散は、もはやテスト化合物プラグの広がり要因ではなく、分子拡散が残るだけである。
【００３９】
この混成システムは、例えば分離すべき材料を導入する際、又は分離した種をチャンネルネットワークの検出領域に移動する際、電気泳動分離工程の前後で材料の迅速な移動を必要とする操作にも有用である。特にサンプル材料は、圧力によりチャンネルネットワーク中に導入し、次いで、分離する種に圧力による影響なく、かつ完全に別のチャンネル構造を必要とすることなく、材料のアリコートを別の電気泳動分離チャンネルに注入することができる（例えばＰＣＴ出願公開ＷＯ ０２／１０７３２参照、この文献はあらゆる目的のため、全体をここに援用した）。同様に、検出前に圧力流れ条件下で後電気泳動分離操作を行うことができる。
【００４０】
一例として、通常、材料を圧力による流れ下に分離導管中に導入する際は、この圧力流は、流れる材料に対し電場を加えている間、続ける。この圧力流のため、加えた電場下で電気泳動的に分離されている種束（ｓｐｅｃｉｅｓ ｂａｎｄｓ）を含む、導管中を移動する材料は、分離操作の解析力を低下させる可能性があるＴａｙｌｏｒ−Ａｒｉｓ分散を受ける。この分散を最小にするため、一層高圧下で材料を更に速くチャンネル内を移動させ、滞留時間を低下させるようにすることができる。不幸にも、この方法は、分離時間の減少により、分離の解析力を低下させる。或いは、サンプルを一層低速かつ低圧で移動させ、分離時間を増大させることができるが、この方法は、放物線流れ条件下では対流時間が増大するという逆の結果を生じる上、Ｔａｙｌｏｒ−Ａｒｉｓ分散が増大する。いずれの例でも、一方のパラメーターを変えることにより得られた利益は、他方のパラメーターの犠牲により、実質的に失われる。圧力系と動電的流れプロファイルとを脱結合することにより、本発明により包含されるように、例えば注入のための圧力系流れを増大させて、滞留時間を減少させることができる。更に、この圧力流れは、動電的に駆動した流れ領域又はチャンネルに結合していないので、材料を分離できる時間の長さに影響を与えない。同様に、分離される材料は、いかなる圧力流れによっても駆動されないので、分散の増大を生じることなく、分離時間を延長することができる。
【００４１】
前述のように、後分離方法は、ここで説明したように構成したシステムでも任意に行われる。例えば電気泳動的に分離した蛋白質は、相対分離を変えることなく、抗体で標識できる。これは、蛋白質の電気泳動分離後に標識が起こるからである。動電的駆動の移動下で行った場合、抗体標識は、実質的に蛋白質の電気泳動移動度を変えることができ、これにより分離を大きく無効にしない。抗体標識について説明したが、この方法は、例えば大きさ、電荷又は配座による変性分子の移動度を変える、いかなる後分離改変に対しても特に有益であることが理解されよう。
【００４２】
簡単に討議するため、チャンネルネットワークに材料を圧力により迅速に導入し、次いで材料を動電的に移動させるという点から混成システムを一般的に説明する。しかし、これら混成システムの異なる流れプロファイルは、いずれの順序、例えば圧力の次に動電が続き、又は動電の次に圧力が続いても、或いは異なる流れプロファイル、例えば圧力／動電／圧力を有する３つ以上の領域で生じてよいことは理解されよう。更に、異なるチャンネルセグメントは、例えば主として圧力駆動流れプロファイルから主として動電的駆動流れプロファイルに変えるか、或いはその比率を実質的に逆に変更するなど、単に、他の連結したチャンネルセグメントに比べて、圧力による流れと動電的駆動流との比を考慮して調節するだけでよいことは理解されよう。
【００４３】
一例のチャンネルネットワークを図２に示す。図示のように、ネットワーク２００は、第一及び第二端部を有する第一チャンネルセグメント２０２を有し、該第一チャンネルセグメントは、第一及び第二端部を有する第二チャンネルセグメント２０４と第一流動接続部２０６で連結している。ここでは“端部”と言ったが、チャンネルセグメントの端部は、若干、任意的であり、また任意的であってもよいが、チャンネルの実際の終点を必要としないことは理解されよう。こうしてチャンネルセグメント端部は、１つのチャンネルセグメントから他の１つのチャンネルセグメントまでの遷移部分（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を含むことができる。これらのチャンネルセグメントは、共直線的であり得るし、及び／又は、さもなければ等質であり得る。第三チャンネルセグメント２０８も一端部で流動接続部２０６と接続している。第三チャンネルセグメント２０８は、中間接点（ｔａｐ−ｏｆｆ）への通路を供給するか、或いは圧力又は動電的力を第一及び第二チャンセグメントに加えるためのアクセスチャンネルとして機能する。
【００４４】
操作時、第一チャンネルセグメント２０２の第一端部とアクセスチャンネル２０８間に（実線で示すように）圧力差を加える。第二チャンネル２０４の第二端部とアクセスチャンネル２０８間に電気システム２１８により電圧勾配を加え、圧力駆動流で生じる第一チャンネルセグメント２０２からアクセスチャンネル２０８に入る流れに、少なくとも或る程度逆らうアクセスチャンネル２０８からの流れを生じる。幾つかの場合、動電的流れは、例えばチャンネル２０８に逆流するチャンネル２０４内のいかなる流体力学流にも完全に逆らう。或いは、このチャンネル内のいかなる流体力学流に逆らわせるため、チャンネルセグメント２０４の端部に追加の圧力又は真空源を加えてもよい。特定の好ましい局面では、アクセスチャンネル２０８からの動電的駆動流は、第一チャンネルを移行する材料を、例えばアクセスチャンネル２０８中に移動することなく、接続部２０６を通って第二チャンネルセグメント２０４内に確実に円滑に移動させると共に、第二チャンネルセグメント２０４中の流体に対し、圧力差による影響を確実に受けさせないため、例えばチャンネルセグメント２０２からアクセスチャンネル２０８に入る圧力駆動流にほぼ完全に逆らうように調節される。前述のように、この調節は、任意に又は更にチャンネルセグメント２０４に正又は負の圧力を加えることにより行われる。
【００４５】
チャンネルセグメント２０８及び２０４を通る動電的流れの速度は、チャンネル内に配置された特定流体におけるチャンネル表面上の電荷水準とチャンネルに加えた電場水準の両方により指令される。所定流体での表面電荷は、表面のゼータ電位とも呼ばれる。前述のように、チャンネルネットワークにおける電気浸透流の水準は、圧力による流れの水準を相殺する（ｃａｎｃｅｌ ｏｕｔ）するように構成できる。或いは、チャンネルセグメント２０２からチャンネルセグメント２０４に１つ以上の異なる種を移送するため、電気泳動に依存しながら、電気浸透流を減少できる。電気浸透流の減少は、低ゼータ電位を持つようにチャンネル及び／又は流体材料を選択するか、或いはコーティング用ポリマー等のような表面改質剤をチャンネル中に取り込むことにより達成できる。低ＥＯ流チャンネル組立用の各種の異なる材料は、ＵＳＰ ５，８８５，４７０、同６，１５６，１８１及び同６，２３８，５３８に記載されている。これらの各文献は、あらゆる目的のため、全体をここに援用した。一方、各種の異なる表面改質用ポリマー溶液は、ＵＳＰ ５，９４８，２２７及び同６，０４２，７１０に記載されている。これらの各文献は、あらゆる目的のため、全体をここに援用した。
【００４６】
図３に第一及び第二チャンネルセグメント２０２、２０３の各流れプロファイルを各々概略的に示す。図示のように、第一チャンネルセグメント２０２では、圧力駆動流は、放物線流れを生じ、一方、第二チャンネルセグメント２０４の動電的流れは、プラグ流を生じる。アクセスチャンネル２０８は、該チャンネル２０８内の圧力流及び外の動電的流れが正味０の流速になると仮定すると、正味の流れなしで示される。
【００４７】
流動可能に接続したチャンネル中で圧力及び／又は動電的流れの水準を別々に制御する能力には、相互連絡したチャンネル中での動電的流れプロファイルと圧力駆動流れプロファイルとの完全な分離から、相互連絡したチャンネル内の動電的駆動流と圧力駆動流との相対比の適度な変化に亘る広範な各種の異なる用途がある。
【００４８】
本発明のシステム及び方法の利用例としては、長い分離時間を必要とする分析による分離、例えば最小限に異なる種の分離、分離された種の電気泳動移動度に影響を与える後分離反応、又は材料が電気泳動的に容易に偏る材料、例えば材料中の異なる種の間で広範に変化する電荷を有する材料を含まない場合、長い距離に亘る材料の移動が挙げられる。
【００４９】
本発明により特に利益を受けるシステムの一例は、連続入力ミクロ流動高スループット薬剤選別システム、特に移動度シフトによる検出計画を行う選別システムである。要約すると、これらのシステムは、薬剤テスト化合物の別々のプラグを標的反応剤の流動流中に連続的に導入して、これら反応剤との相互作用に対するテスト化合物の効果（あれば）を決定する。通常、反応剤としては、酵素基質対、受容体配位子対又はその他の相補的結合対、又は細胞等が挙げられる（例えばＵＳＰ ６，０４６，０５６参照）。異なるテスト化合物は、システムの複数のチャンネルを流通するので、これらテスト化合物間で間隔を維持することにより、効果の同定及び効果と特定テスト化合物との相関関係は、通常、促進される。特定反応の場合、反応の進行の唯一の徴候は、標識した反応剤によっても、標識反応剤の電荷水準の変化である。標識反応剤は、その電気泳動移動度に変化を生じる。このような反応例としては、ホスフェート基の付加及び除去により、生成物に比べて基質の電荷を変化させるホスファターゼ及びキナーゼ反応が挙げられる。他の多数の反応は、この配置構成に適合するか、或いはこの配置構成に適合するように容易に構成され、例えばプロテアーゼアッセイ、非帯電標識の同族体、即ち、ＰＮＡを用いた核酸アッセイ等がある。
【００５０】
同様に、長い反応時間を要するシステムでは、長い流動時間と共に分散が増大するので、隣接して導入したプラグ間で分離を維持するのは、一層難しくなる。したがって、テスト化合物間の間隔を増大して、システムのスループット速度を低下させなければならない。しかし、反応剤及びテスト化合物の流動流を動電的又は電気浸透的流れプロファイルに遷移させることにより、これに応じて分散を増大させることなく、流れ時間を増大し、これにより隣接する入力テスト化合物プラグの間隔又はピッチを維持すると共に、スループットを保持することができる。
【００５１】
要するに、テスト化合物は、サンプリングシステム、例えばミクロ流動装置中に一体化したピペッターエレメントでシステムに真空を加えてテスト化合物に引き入れることにより、システム中に取り入れる。チップ中にサンプルプラグを引き入れる上記真空下では、反応成分、例えばチップ上に一体化され、異なるウエルから酵素及び基質を副チャンネル経由で主チャンネルに接続した酵素及び基質も引かれる。これらの試薬は主チャンネル中で混合し、別の反応プラグ中の異なるサンプルプラグと混合される。所定の加温又は反応時間後、反応混合物プラグは、電場を加えた時だけ実質的に移動する場合、検出点を過ぎて移動するまで、本発明による動電的流れプロファイルに遷移させてもよい。伝場を加えると、Ｔａｙｌｏｒ分散により生じる解析力に伴う低下もなく、種の電気泳動分離が可能である。別の局面では、材料の検出又は他の特定の操作前に、材料を圧力による流れプロファイルに戻し遷移させてもよい。
【００５２】
ａ．流れプロファイル跳躍
移動度変化検出計画を利用した連続流アッセイフォーマットの一例を図４に概略的に示す。このアッセイフォーマットでは、アッセイ用試薬、例えば基質及び酵素、又は相補的結合パートナー、即ち、受容体／配位子又は核酸は、通常、反応中、電荷の変化を受ける、例えば標識された反応剤から帯電部分が付加されるか除去される標識反応剤を含む。一例として、通常のキナーゼアッセイでは、標識されたキナーゼ基質は、キナーゼ酵素と接触させる。このキナーゼ酵素は、基質に比べて生成物の電荷にかなりの変化を生じる高帯電のホスフェート基を基質に付加する。この電荷差は、バックグラウンドの基質水準から生成物を分離するのに使用される。これらの試薬は、流動チャンネルと平行に連続的に流れ、これにより反応の定常状態水準は、連続的に反応し分離する試薬の結果である一定の信号を生じる。問題の反応の作動体を例えばスラッグ中の反応に導入すると、作動体は、定常状態の反応／分離を乱し、チャンネルから検出された信号水準に指示的変化又はサインを生じる。連続流移動度変化アッセイの概略は、ＵＳＰ ５，９４２，４４３、同６，０４６，０５６及び同６，２６７，８５８に記載されている。これら文献の全内容は、ここに援用した。
【００５３】
本発明と関連する図４を参照すると、一例のアッセイ装置４００は、第一チャンネルセグメント４０４と流動可能に連絡するサンプリングエレメント４０２、例えばミクロ流動装置に取付けたピペット用毛管を有する。第一チャンネルセグメント４０４は、第一流動接続部４０８で第二チャンネルセグメント４０６と連結している。第一流動接続部４０８には、第三チャンネルセグメント４１０も流動可能に連結している。これらの交差するチャンネルは、図１に示すような基本的制御構造を形成する。移動度変化による薬剤選別アッセイ用の操作では、アッセイ試薬は、それぞれリザーバー／試薬源４１６、４１８に連結した副チャンネル４１２、４１４からチャンネルセグメント４０４内に導入される。
【００５４】
再び図４を参照すると、テスト化合物４５０は、サンプリングエレメント４０２を通って流体スラッグとしてサンプリングされ、圧力駆動流下でチャンネルセグメント４０４中に移動する。チャンネルセグメント４０４では、テスト化合物４５０は、リザーバー４１６、４１８からの試薬と混合し、反応混合物スラッグ４５２中のこれら試薬と相互作用し、その結果、テスト化合物が、関連の反応の作動体、例えば禁止剤であれば、テスト化合物は、反応の水準を変える。前記キナーゼ反応の場合、禁止剤は、低帯電の生成物を生成させる。
【００５５】
関連の反応スラッグ（例えばテスト化合物を含有するスラッグ）は、第一流動接続部４０８中に移動すると、スラッグは、圧力駆動流から動電的駆動流に移行する。特に、チャンネル４０４から出る圧力駆動流の水準に合わせるため、チャンネルセグメント４０６中に移動する動電的流れ水準を調節することにより、チャンネルセグメント４０４から流動接続部４０８を経由してチャンネルセグメント４０６に至る材料の継ぎ目のないハンドオフ（ｈａｎｄ−ｏｆｆ）が保証できる。
【００５６】
いったん反応混合物がチャンネルセグメント４０６中に移動すると、混合物は、例えば電気制御システム４２０により動電的力を受け、この動電的力は、チャンネルセグメントを通る流体を直ちに移動させ、反応混合物中の差別的に帯電した種を、分離された種４５４として示すように、電気泳動的に分離する。このシステムは、連続流動システムなので、電気泳動分離は、定常状態では余目立たない。これは、例えば基質よりも速く移動する生成物は、単に遅い移動を追い越すだけで、所定の場所では、生成物及び基質の水準に正味の効果的変化が生じないからである。しかし、テスト化合物が、この定常状態の反応を乱す場合には、得られる生成物の水準を局部的に増大又は減少させる。定常状態に比べて増大した種、例えば生成物又は基質の電気泳動移動度により、テスト化合物を含む反応混合物スラッグの前又は後に検出可能な標識濃度を生じる。例えばテスト化合物が反応の禁止剤である場合、禁止剤のスラッグは、基質を局部的に増大させる。基質の生成物に対する電気泳動移動度の差により、例えば検出窓４５６での信号の増大又は減少のような、定常状態の標識に偏差が生じる。
【００５７】
任意の場合、チャンネル４１０の中からチャンネル４０６に入る動電的駆動流は、電気浸透流により多かれ少なかれ支配できる。特に、関連の種の電気泳動移動度が圧力流向流を克服するほど十分高いと、分散の水準が一層大きくなるが、一層低い電気浸透速度が使用できる。
【００５８】
同様に、高感度を要するアッセイを行なう場合、生成物よりも低い電荷を有する基質をチャンネルセグメント４０４からセグメント４１０中に優先的にサイホン吸引し、これによりチャンネル４０６への流入を防止するように、異なる流れの水準を調節できる。一方、生成物の電荷及び電気泳動移動度を高くすると、生成物を優先的にチャンネルセグメント４０６に移行させ、ここで標識した基質バックグラウンドの不存在下に生成物を検出し、これによりアッセイの感度を向上できる。例えば２００１年７月３１日出願の同時係属ＵＳ特許出願Ｎｏ．６０／３０９，１１３参照。この文献は、あらゆる目的のため、全体をここに援用した。上記方法は、低速動力学による酵素反応等を使用するアッセイに特に有用である。
【００５９】
ｂ．選択的イオン抽出
本発明装置は、加えた圧力又は電場の制御、或いは加えた圧力、電場の両方の制御で差別的に帯電した種の流れプロファイルを管理することにより、サンプル混合物からこれら各種の種を分離するのにも有用である。多数の圧力及び電圧源を備えた流体制御システムを用いると、ミクロ流動チャンネルネットワークのいずれの部分での流体力学流及び電場も所望値に設定できるように、装置のいずれの所定チャンネルセグメントでの圧力及び／又は電圧も制御できる。本発明は、２つの異なる流れプロファイル、即ち、圧力による及び動電的駆動のプロファイルを重複させ、同時に各流れプロファイル下で、流速を制御して、この流体中に、流体で運ばれたサンプル中に含まれる差別的に帯電した種を容易に分離及び単離するのに十分な量まで含有する所定種について正味速度を得ることにより、チャンネルネットワークの異なるセグメント中の流体流を独立に制御する装置を提供する。こうして、以下に説明するＴ−交差点のようなチャンネル交差点に送られた、異なる電気泳動移動度を有する２つ以上のサンプル種の混合物（例えば中性基質及び以下の実施例１で説明するような酵素反応の負帯電生成物）は、サンプル種の異なる電気泳動移動度に基づいて、交差点の別々のチャンネル内の分離成分に完全に分離できる。
【００６０】
特に、所定種の分離は、圧力駆動又は流体力学流の速度を動電的速度と釣合せてその流れを所定の方向に向け、これにより第一の電気泳動移動度を持った種を分離して装置の第一領域中に流入させながら、第二の電気泳動移動度を持った第二の種を装置の第二領域中に流入させることにより達成される。種の流体力学又は圧力駆動速度は、圧力で誘引された流れによる流速である。種の電気泳動速度は、加えた電場を掛けた電気泳動移動度（μｅｐ）である。所定チャンネルセグメントにおいて、圧力による流れと動電的流れとの重複を用いた実施態様では、このチャンネルセグメントで移行する種又は材料の正味速度は、水田津流の速度と動電的速度との総合計である。以下の例は、チャンネル領域における所定種の正味速度についての計算法を示す。
【００６１】
例えば種Ａに−１ｐｓｉの圧力を加えて流体力学流速度を０．１ｃｍ／ｓとし、２０００Ｖ／ｓの電場（Ｅ）で電気泳動移動度（μｅｐ）を１．４×１０−４ｃｍ２／Ｖ−ｓＶとし、流体力学流と同じ方向にした場合、種の正味流れは、次の通りである。
正味流れ＝流体力学流の速度＋〔電気泳動移動度（μｅｐ）×Ｅ〕
Ａの正味流れ＝０．１ｃｍ／ｓ＋０．２８ｃｍ／ｓ
Ａの正味流れ＝０．３８ｃｍ／ｓ
【００６２】
本発明は、相互連絡したチャンネルネットワークの各種チャンネルセグメントにおいて、加えた圧力及び加えた電場を制御して所定の種を分離することにより、多数の流体で運ばれた種の流速を巧みに操作できる。図７は、帯電した種をマルチポート（ｍｕｌｔｉｐｏｒｔ）圧力及び電圧制御により連続的に制御する酵素アッセイ用の装置及び操作を概略的に示す。装置７００は、サンプル源７０２に接続した第一端部と、廃棄物リザーバー７２８中で終わる第二端部とを有する主チャンネルを備える。主チャンネルは、チャンネルセグメント７０２、７０５、７０６を有する。副チャンネル７１４、７１６は、チャンネルセグメント７０２で主チャンネルと交差する。副チャンネル７０４は、チャンネルセグメント７０５で主チャンネルと交差し、リザーバー７２６内で終わる。操作中、例えば基質と酵素との相互作用の、流体で運ばれた禁止剤用のような一連のサンプルプラグは、リザーバー７２６（又はチャンネルシステム中のリザーバー７２８のような他のリザーバー）に負圧を加えることにより、サンプル源７２０、例えばピペット用毛管又はリザーバーを通って主チャンネル中に引き込まれる。副チャンネル７１４、７１６からチャンネルセグメント７０２中にアッセイ試薬を導入し、セグメント７０２内のサンプルと相互作用させて、差別的に帯電した種を含む混合物を形成する。例えばキナーゼ酵素アッセイのような酵素アッセイでは、アッセイ試薬は、酵素及び基質を含み、これらはテスト化合物の存在下で相互作用して、生成物、酵素及び基質を含む混合物を形成する。これにより、生成物及び基質は、異なる電荷、したがって異なる電気泳動移動度を有する。サンプルプラグのサンプリング及び主チャンネルへのアッセイ試薬の流れは、リザーバー７２６に負圧を加え、この圧力をリザーバー７２２、７２４、７２８で維持することにより達成される。チャンネルセグメント７０２の混合物に含まれる各異なる種の正味速度は、全てのリザーバーに加えた圧力の組合せにより誘引された流体力学速度に等しい。しかし、いったん流体混合物が接続部７０５に入ると、リザーバー７２６、７２８において加えた電圧勾配により作られた電場も受ける。電圧勾配は、チャンネルセグメント７０４、７０５、７０６において電場を作る。接続部７０５では、基質及び生成物分子の電気泳動移動度が同等でないため、分離を起こす生成物、基質の両方の正味速度に有限の差が生じる。分離された種は、リザーバー７２６に加えた圧力を調整することにより、ほぼ即座に更に別々に方向転換され、これにより、所定値未満の電気泳動移動度を有する種は、分離され、チャンネルセグメント７０６中に方向転換され、一方、所定値よりも大きい電気泳動移動度を有する種は全て、チャンネルセグメント７０４中に流入する。或いはリザーバー７２６に加えた電場は、所定値を超える電気泳動移動度を有する種が、分離され、一方、所定値未満の電気泳動移動度を有する種は全て、チャンネルセグメント７０６中に流入するように、調整される。
【００６３】
本発明の教示を一層良く理解するため、流動接続部７０５における差別的に帯電した種の分離について、以下、更に詳細に説明する。図示のように、Ｔ−交差点チャンネルネットワークは、共通の交差点又は流動接続部７０５で出会うセグメント７０２、７０４、７０６を有する。これらの各チャンネルセグメントは、流体出入口又はリザーバー、或いは前述のような、また図７Ａに示すような外部サンプリングエレメントに接続している。マルチポート圧力兼電圧制御器は、各チャンネルセグメントに接続した異なるリザーバー又は流体ポートで加えた圧力及び加えた電場を制御するのに使用される。明確化のため、各チャンネルセグメントに対し加える電圧及び圧力を言うために、下に小さく書いた表記を用いる。例えばV１及びＰ１は、チャンネルセグメント７０２に対し加えた電圧及び圧力を言い、V２及びＰ２は、チャンネルセグメント７０４に対し加えた電圧及び圧力を言う。個々のチャンネルセグメントに対し、独立に制御された圧力及び電圧を付与できるマルチポートモジュールを用いることにより、本発明のシステムは、各チャンネルセグメント内の流れパターンを制御し、これにより特定量を超えた電気泳動移動度（μｅｐ）を有する種は全て、一方向に流れ、また上記特定量未満の電気泳動移動度（μｅｐ）を有する種は全て、第二の方向に流れる。
【００６４】
更に図７のＢ、Ｃ、Ｄは、差別的に帯電した種７０８、７１０の流れに対するマルチポート圧力兼電圧制御の効果を示す。ここで特定の仮定を行う。例えば種７０８は、電荷が０（例えばＺ＝０）で、一方、種７１０は、高度に負帯電した（例えばＺ＝−２）ものと仮定する。これらの仮定は、簡易化及び明確化の目的で行ったが、選択的イオン抽出の原理は、複数の種が、差別的に帯電しているか、或いはこれらの種が同じ電荷を有するが、異なる質量を有する限り、混合物からいずれの種の分離にも利用できることに注目すべきである。異なる電荷は、正電荷対負電荷、高正電荷対低正電荷及び高負電荷対低負電荷を包含する。
【００６５】
更に、塊状流体の電気導電率は、Ｔ−交差チャンネルネットワーク中で均一であると予想される。また電気浸透流は、例えば前述のようなチャンネル壁上への表面電荷の堆積を抑えるように、チャンネル壁に適当な表面コーティングを付与することにより、最小にするか又は中和することが好ましい。しかし、本発明が電気浸透流条件下でも使用できることは、理解すべきである。これらの仮定下では、種７０８、７１０の圧力駆動流は、Ｐ１＝Ｐ、Ｐ２＝０、Ｐ３＝Ｐ／２と設定することにより確定される。この場合、各チャンネルセグメント７０２、７０４、７０６において対応する流速Ｑは、それぞれＱ１＝−Ｑ２、Ｑ３＝０である。換言すれば、チャンネルセグメント７０２を通ってチャンネルネットワークに入る流体は全て、チャンネルセグメント７０４を通って出るし、したがって両種７０８、７１０は、図７Ｂに示すように、チャンネルセグメント７０４に入る。同様に、電場は、例えばチャンネルセグメント７０４、７０６間にＶ２＝Ｖ、Ｖ３＝０、Ｖ１＝Ｖ／２を適用することにより確定できる。電圧Ｖ１は、リザーバー７２２、７２４のいずれか１つ、又はチャンネルセグメント７２０と流動可能に連結したリザーバー（又は毛管エレメント）にこの適当な電圧を加えることにより設定できる。交差点７０５に入ると、流体混合物は、Ｖ２、Ｖ３で作られた電圧勾配により電場を受ける。したがって、ここで流体種は、圧力誘引流と動電的流れとの組合せによる正味流れを経験する。換言すれば、種の平均流体力学速度（Ｖｐ）と平均電気泳動速度（Ｖｅｐ）との比に従って、この種は、チャンネルセグメント７０４又は７０６に完全に移送されるか、或いはチャンネルセグメント７０４、７０６間に分割できる。この説明は、各種チャンネルセグメントでの圧力設定の変化を参照して行ったが、この点で本発明を限定する意図がないことを理解すべきである。同様な分離を達成するため、電圧又は圧力或いは電圧、圧力の両方に変更を行うことは可能である。
【００６６】
本発明の非限定的教示の一例として、図７のＢ〜Ｄは、他のバラメーターを一定に維持しながら、副腕チャンネルセグメント７０４に加えた圧力を変化させた図７Ａに示すチャンネルネットワークのＴ−交差点の概略図である。チャンネルセグメント７０４に加えた圧力が極めて低い場合、図７Ｂに示すように、チャンネルセグメント７０６には逆の流体力学速度が確立する。この速度は、種７１０の正味速度が流体力学速度で支配されて、チャンネルセグメント７０４に入る種７１０の流れを生じるように、帯電種の電気泳動速度よりも大きい。種７０８は、Ｚ＝０の正味電荷を有し、したがって正味速度は、チャンネルセグメント７０４中にも流入させる流体力学速度に等しいと予想される。したがって、両種７０８、７１０はチャンネルセグメント７０４中に流入し、チャンネルセグメント７０６沿いに設けた検出窓では種は殆ど又は全く検出されない。
【００６７】
Ｐ２を徐々にＰ３に向けて増大させると、電気泳動速度は一定に保持しながら、流動接続部７０５及び次にチャンネルセグメント７０６における流体力学速度は低下する。特定の圧力設定では、帯電種７１０の電気泳動速度は、正味速度が、帯電種をチャンネルセグメント７０４中に流入させる電気泳動速度により支配されるように、流動接続部７０５における流体力学速度を超え、一方、非帯電（又は低帯電）の種７０８は、図７Ｃに示すように、チャンネルセグメント７０４中に流入し続ける。図７Ｂ及び図７Ｃに示した流れパターン間の遷移のための正確な圧力設定は、前述のように、流体力学速度と電気泳動速度との合計である各々の種の正味速度に依存し、これにより最高電気泳動移動度を持った種は、まずチャンネルセグメント７０６中に抽出される。
【００６８】
“分離窓”は、副腕チャンネルセグメント７０４に対する圧力が変化し、これにより高帯電の種７１０が検出チャンネルセグメント７０６中に抽出される際に作られ、一方、低帯電の種７０８、したがって低電気泳動移動度は副腕７０４中に流入し続けることに注目すべきである。副チャンネルセグメント７０４への圧力Ｐ２が更に増大すると、流体力学流は、このチャンネルセグメント中で向きを逆転し、また両種７０８、７１０が、図７Ｄに示すように、チャンネルセグメント７０６中に流入するように、流動接続部７０５及びチャンネルセグメント７０６には、正味の前進圧力駆動速度が作られる。
【００６９】
この流体分割技術の原理は、１つ以上の種が帯電するか（単一種について）又は差別的に帯電する（２つ以上の種について）限り、或いは２つ以上の種が同じ電荷を有するが、異なる質量を有する限り、混合物から１つ以上の種を分離又は抽出するために利用できることに注目すべきである。例えば本発明の教示は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその他の帯電ポリマー等の帯電分子のようなサンプル溶液中の単独の帯電種を抽出する（例えば濃縮する）のに使用できる。このような帯電分子は、例えばＴ−チャンネル交差点の一チャンネルセグメント中に抽出（したがって濃縮）でき、次いでここで、例えば更に分析及び／又は検出のために流し、或いはこの装置中で更に濃縮できる。
【００７０】
本発明の教示は、特にペプチド、蛋白質、ヌクレイン酸（例えば、ＤＮＡ或いは、ＲＮＡ）及び多糖類のような帯電した生体分子を含む、帯電した合成ポリマー及び以後の分析等、即ち癌スクリーニングに於いて発生する稀な分子の事象の為のプローブＤＮＡも又同様に、電気泳動技術によって典型的に分離されて抽出し及び、前濃縮している複数のサンプルの為に役立つものである。例えば、２００２年１２月２０日に出願した「ミクロ流動装置に於けるＤＮＡの単一分子増幅と検出」というアメリカ合衆国優先権番号６０／４３６，０９８号の共同特許出願により十分に開示されており、ここに参照されたことによって組み込まれている全含有物の単一分子増幅は、一つのサンプルに於いて、例えば病原診断（例えば、癌診断）、病原体の検出、稀に環境ヌクレイン酸の検出等、稀にヌクレイン酸の利点である検出及び統計的な特徴の為に使用されるはずである。例えば、多くの個体増幅反応は、例えば反応混合物に於けるヌクレイン酸の利点が同定されるまで、各々の反応混合物の殆ど、稀にヌクレイン酸の利点（例えば１で）はなく、或いは稀にヌクレイン酸の利点の複製もなく、稀にヌクレイン酸の利点からなる一つのサンプルから誘導されてきた反応混合物上で機能されるはずである。
そのような応用に於いて、ミュータントＤＮＡ分子への自然タイプの割合については、１００：１となるように期待されている。稀な事象を算出する為、遺伝子タイプシステム（ａ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を使用する際には、該システムの処理量を増加させるのに出来る限り、迅速に外部のミクロ滴定濃度プレート（或いは、他の外部のサンプル・ソース）から吸収されてきた一ＤＮＡサンプルを処理するのが望ましい。
【００７１】
高処理量ミクロ流動システムに於けるこうして組み入れられた、高処理量増幅システムは、例えば該ヌクレイン酸の利点が検出されるまで、多くの低複製数増幅反応を機能する事によって、そして／或いは、依存可能で統計的な有利な点が機能されているヌクレイン酸の利点の十分な複製を検出されるまで、分析される一サンプルに於いて実際極めて低濃縮にあるヌクレイン酸の利点を検出するのに有用とされるこうした方法を機能することが特に良く適用されている。稀にヌクレイン酸を検出するのに有用とされる統合されたミクロ流動遺伝子タイプ・システムの一例として、例えば、２００２年４月１１日に出願した「高処理量遺伝子分析の為のシステム及び方法」というアメリカ合衆国優先権番号１０／１２３，１００号の共同特許出願に記述されており、ここの全ての含有物は、ここに参照されているように組み込まれている。該システムは、試薬アッセンブリー、ヌクレイン酸増幅、そして該’１００アプリケーションの図面第７図及び第８図に図示されているように一つのミクロ流動チップ上に遺伝子を全て読み出す事を統合しています。該チップ上に置かれるＰＣＲに必要な該試薬、そして試験されるべき該ヌクレイン酸（例えば、ＤＮＡ）複数のサンプルは、一つのミクロ滴定濃度プレートから該チップに存在している。該チップは、それに添付されるよう細孔を持ち、緩衝器を交互にする（例えば、自然タイプ及びミュータントＤＮＡの何れをも含んでいる）該ヌクレイン酸の複数サンプルは、該細孔を通じてチップ上にもたらされるのである。ヌクレイン酸の複数サンプル、ポリメラーゼ、そしてプライマー（ｐｒｉｍｅｒｓ）及びプローブ（ｐｒｏｂｅｓ）のような他のＰＣＲ試薬は、メイン・ミクロ流動チャンネルに吸引、圧力、電気浸透或いは、電気連動性流出等により引き寄せられ、そして全ての構成成分を該メイン・チャンネルに流入後、最初の２〜３秒で混合します。これらは、電気の流れの応用によって熱せられたチップ上に於いて、鉄の痕跡を持つ反応部分或いは、チャンネルにそれから移動します。反応チャンネルを通じて反応混合プラグが動くので、反応チャンネルはＤＮＡのようなサンプルに於いてヌクレイン酸を増幅し熱せられ、そして冷却される。チップの複数のチャンネルが、形成されそして、各々のサンプルが特殊な数の増幅サイクルを経験出来るように、流動制御システム（例えば、吸引）が駆動する。増幅によって発生したフッ素の臭気信号は、サンプルにヌクレイン酸分子を検出する為に流動小径の末端にて検出される。
【００７２】
本発明の教示は、ユニット時間（ｕｎｉｔ ｔｉｍｅ）につき遺伝子タイプシステムに於いて、ミクロ滴定濃度プレートに一或いは、それ以上帯電した構成成分を含んでいる一つのサンプルの大きな容積を処理する手段として使用されるのである。’１００アプリケーションと、通常上記に記述した例えば、熱した（熱サイクル化した）反応チャンネルは、およそ４０ｍｍの長さを持つ記述されたチップのチャンネル内に機能された増幅サイクルの望ましい数に基づいて、計算されており、修正を行った長さである。典型的なミクロ流動チャンネル外形にとって、（例えば、およそ２００ミクロン以下のチャンネルの幅、そして／或いは深さを持つチップ、例えばおよそ１００ミクロン以下のもの）これは、熱せられた反応チャンネルを通じて、割合に低流動レートへ置き換えている。相対的に大きなオリジナルＤＮＡサンプル容積に含まれていた単に、２〜３の稀なミュータント分子があるならば、（例えばおよそ５つのミクロ滴定濃度の注文に於いて）ミクロ滴定濃度プレートの床に配列させ、それからこれらの複数の分子に接することは、とても長い時間を費やすことになる。
【００７３】
‘１００アプリケーションに記述されていた遺伝子タイププラットホームにとって、例えば（ＤＮＡのような）サンプル内に一つ、或いは多くの帯電種の抽出及び前濃縮は、サンプルが熱せられた反応チャンネルに流入する前に継続的な流れの下で発生しており、ミクロ流動チップ配置は、前端抽出及び前濃縮として使用される図１５及び図１６に図示されている。図１５に図示されているように、疾病のＤＮＡサンプル（或いは帯電した複数の分子を含んでいる如何なるサンプル）は、相対的に低電気伝導率を持ちながら低イオン強力バッファーに於いて、
（商業的に入手する事が可能な従来型９６，３８４，或いは１５３６床プレートとして）ミクロ滴定濃度プレート１２００の一つ、或いは多くの床に位置している。複数のサンプルは、大きな圧力駆動流れが、チャンネルセグメント１２０２，１２０８，そして１２１０に沿って、そしてリザーバ１２０４方向というようにリザーバ１２０４へ吸引を適用する事によって相対的に高い流れの割合（例えば、約３Ｎｌ／ｓ）で細孔１２０２を通じて吸収されている。二次元チップの配置の為に細孔１２０２は、サンプルが置かれているリザーバの中にサンプルを置き換える事が出来、そしてそれからリザーバ１２０４に適用された吸引は、チャンネルネットワークに流れるようにサンプルリザーバ内にサンプルを生じさせる事が示されている。同時に、大体低い正の圧力或いは、吸引は、反応チャンネル内の圧力流れを作動するように反応チャンネル１２１６に流動的に一対となった装置の一つ、或いは多くのリザーバに応用されるはずである。例えば、以下に記述されているように、かすかな正の圧力は、連続的な流れの状態の下では反応チャンネル内で発生する熱循環運動（例えば、ＰＣＲによる）にとって十分である反応チャンネル１２１６を通じて正の圧力流れを立てるようリザーバ１２０６（そして、反応チャンネル１２１６の下流にある図示されていないリザーバにかすかな吸引が適用され）に応用されるはずである。かくして、図１６Ａに記されているように適用された圧力そして／或いは、吸引（そして、さまざまなチャンネルセグメントの範囲）に基づいて、チップのさまざまなチャンネルセグメントの各々に、圧力駆動速度（Ｖp）が確立されるはずである。即ち、圧力駆動速度とは、装置の反応チャンネル領域にある（例えば、反応チャンネル１２１６内の一秒間に約０．４ｍｍ）よりも装置の前端にある（例えば、チャンネルセグメント１２０８内の一秒間に約３．２ｍｍ）ようにかなり高い水準にあるのである。例えば、適用された圧力そして／或いは吸引は、チャンネルセグメント１２０８内の全流れの割合が、チャンネルセグメント１２１６内の流れの割合の約二倍であり、例えば、チャンネルセグメント１２１６内の流れの割合の約五倍であり、例えば、チャンネルセグメント１２１６内の流れの割合の約十倍かそれ以上であるようにチャンネルの次元が選択され、確立されるはずである。
【００７４】
イオン抽出の選択性は、それからサンプルの他のコンテンツから帯電したＤＮＡを抽出するのに使用される。図１６Ｂに示されているように、電気分野ではＤＮＡの電気泳動速度（Ｖep）が、圧力駆動速度よりも大きいと仮定した場合、サンプル内のＤＮＡを以下のリザーバ１２０４方向へ、かなりの圧力駆動流れ小径から妨げる為に、リザーバ１２０４及び１２０６との間に応用されるのである。
換言すれば、リザーバ１２０４及び１２０６との間で適用された電気分野ではサンプル内の帯電したＤＮＡは、全ての種が電気泳動の可動性を以下の与えられた数値によって、チャンネルセグメント１２１０に流れながら、チャンネルセグメント１２１２に分離され、そして監理されるよう調整されるはずである。かくして、例えば電気分野でリザーバ１２０４及び１２０６の間に確立されたもの、つまりサンプル内の帯電したＤＮＡ電気泳動速度（Ｖep）は、チャンネルセグメント１２１０に於いて一秒間に約４．２ｍｍのようであり、（図１６Ａに示されている一秒間に約３．１ｍｍの圧力駆動速度より優れている）こうして、図１６Ｃに示されているように強いてＤＮＡをチャンネルセグメント１２１２に入れる事により一秒間に約１．１ｍｍもの総合的な全速度（ＶT）を産み出している。
ＤＮＡの電気泳動の可動性は、おおよそサイズの機能（例えば、ベース・ペアーの数）としての連続性であり、自由な区域である為に多種なＤＮＡサイズを含む疾病のサンプルの異質性にも拘わらず、選択的なイオン抽出プロセスのとても
素晴らしい調節を提供する必要はないのである。
【００７５】
チャンネルセグメント１２１２内に抽出されたＤＮＡを濃縮する為に、床１２０６内の流体は、高度な塩バッファーにあって（例えば、その高度なイオン強さに基づく比較的高度な電気伝導性を持ち）二つの目的を供給する。第一には、ボルトの低下及びしかもチャンネルセグメント１２１４に於ける電気分野を最小にすることであり、そして第二にはチャンネル交差１２１５で発生する分野で増幅された積み重ねにとっての高度な塩／低度な塩の境界を確立することである。床１２０６からの高度な塩の流体のかすかな正圧の流れ（例えば、図１６Ａに示されているようにチャンネルセグメント１２１４内に一秒間に約０．３ｍｍのようである圧力駆動速度を産み出している。）は、チャンネル交差１２１５で発生する積み重ねにとって高度な塩／低度な塩の境界が必要とされ、そして更にはＤＮＡをチャンネルセグメント１２１４へ導入するのを妨げている事が持続し、構想されている。こうして、サンプル内のＤＮＡはチャンネル交差での高度な塩／低度な塩の境界の実在によってチャンネル交差１２１５に積み重ねられるのである。
そして、以後処理及び／或いは検出（例えば、癌スクリーニングの目的の為に稀にヌクレイン酸分子の検出）の為に増幅されるチャンネルセクション１２１６に継続的な流れの下に相対的に高度な濃縮にて流れているのである。
【００７６】
かくして、図１５のチャンネル配置は、本質的には反応チャンネル１２１６に於けるそれから圧力駆動流れを細孔１２０２に上げ、分断することである。総合的な流れの確率（或いは速度、さまざまなチャンネルセグメントが、全く同じか、或いは部分的に同じ横断する次元を持っていると仮定した場合）の割合を細孔１２０２にまで上げ、ＤＮＡの全てが選択的なイオン抽出ステップの間に抽出されていると仮定した場合、将来発生するであろう前濃縮の量である熱を帯びたチャンネル領域１２１６に送り込む流れの率（或いは速度）を表示するものである。
総合的な流れの確率（或いは速度、さまざまなチャンネルセグメントが、全く同じか、或いは部分的に同じ横断する次元を持っていると仮定した場合）の割合を細孔１２０２にまで上げ、前濃縮の量である熱を帯びたチャンネル領域１２１６に送り込む流れの率（或いは速度）を好ましくは約二のようであり、例えば約五、例えば約十或いは、それ以上である。例えばもし、流体の３Ｎｌ／ｓが、細孔１２０２を通じて処理されており、一秒間に約０．４ｍｍの熱せられたチャンネル領域の丁度前に全種の速度とを比較してみた処、１２０８が一秒間に約３．２ｍｍである（図１６Ｃに示されている）事を通じて種の全速度（ＶT）にあり、
それから、種の保存がＤＮＡの濃縮（チャンネル領域１２０８及び１２１６が、全く同じチャンネルを横断する次元にあると仮定した場合）におおよそ８つのフォールド（ｆｏｌｄ）を必要とする。もし、チャンネル領域１２０８及び１２１６が、全く同じチャンネルを横断する次元にない場合、それから、こうしたチャンネル領域を通じた流れの率は、チャンネル領域の間で濃縮要素を正確に予言する事を比較される必要があるであろう。図１７は、図１５に示されているような同様のチャンネル配置を使用するＤＮＡのおおよそ７個から８個にフォールド（ｆｏｌｄ）積み重ねて示されたエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。上記で記されているように、本発明の方法によって、濃縮され、抽出された複数のサンプルは、典型的には電気泳動技術によって分離され、こうしたものを含んでおり、帯電した合成ポリマーと同様にペプチド、蛋白質、ヌクレイン酸、そして多糖類のような帯電した生体分子をも含んでいる。
【００７７】
本発明の教示は、２つ（又はそれ以上）の差別的に帯電した、いかなる種も互いに分離及び単離するのにも使用でき、また例えば生成物が基質とは異なる電荷を持つ場合、基質及び生成物を互いに分離するという特定の利用可能性を与える。基質としては、一般に、例えば特異的結合対、即ち、抗体／抗原対、受容体／配位子対、相補的核酸又はそれらの同族体、結合性蛋白質及びそれらの結合性部位、の一部材が挙げられる。或いは、又は更に、該基質は、関連の反応、例えば基質の化学構造への付加、該構造からの減少（ｓｕｂｔｒａｃｔｏｎ）又は該構造の変更により改質した基質を含んでもよい。このような基質の幾つかの具体例としては、例えばホスホリル化可能部分、例えばセリン、スレオニン及びチロシンホスホリル化部位等を含むキナーゼ基質、ホスファターゼ酵素用ホスホリル化基質、アミノトランスフェラーゼ、カルボキキシルに転化されたアルコール（例えばグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼによる）に従属する（ｓｕｂｊｅｃｔ ｔｏ）アミノ又はケト含有基質や、スルファターゼ、ホスホリラーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ（例えばプロテアーゼ）及びオキシダーゼ等用の基質が挙げられる。
【００７８】
基質は、実施するアッセイの性質に従って、正又は負のいずれかに帯電していても、或いは中性であってもよい。基質は、装置の検出窓で検出できるように、検出可能な標識を含むことが好ましい。基質上の蛍光標識は、各種異なる蛍光標識性化合物のいずれからも選んでよい。一般にこのような蛍光標識性材料は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から市販されている。通常、フルオレッセン又はローダミン誘導体が特に好適である。これらの蛍光標識は、基質と、例えば周知のカップリング化学により共有結合している。標識用の基及び化学についての討議は、例えば国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ９８／００２３１参照。この文献は、ここに援用した。
【００７９】
いったん試薬と混合した基質は、一般に試薬と反応するか、相互作用するか、さもなければ会合するか、又は結合して、基質とは実質的に異なる電荷を有する蛍光生成物を生じる。基質と同様（ａｓ ｗｉｔｈ）、試薬は、特異的結合対の一部材、例えば基質に対し相補的な部材を任意に含有する。但し、この場合、結合対の２つの部材の混成物は、基質の電荷とは異なる電荷を有する。多くの場合、これは、試薬は帯電し、一方、基質は中性であるか、或いは基質は、単に中程度に帯電しているのに比べて、試薬は高度に帯電していることを意味する。或いは基質と試薬との会合により、構造変化が起こり、帯電生成物を生じるか、或いは基質に結着して帯電残留物をマスクする。
【００８０】
次に、流体流のマルチポート圧力及び電気制御を利用して、異なる移動度（例えば異なる電化及び／又は質量）を有するアナライトを分離、抽出する、前述の選択的イオン抽出に類似した他の新規な技術を図１２〜１４について説明する。本発明のこの実施態様では、ミクロ流動チャンネルネットワークは、数を減らした外部圧力源及び電圧源を利用することにより、例えば先に説明した実施態様と比べて、流体制御に必要な流体リザーバーの数を減らして分離を行うことにより、流動駆動力を配分して、流体サンプル中の差別的に帯電した種を分離するように、構成、寸法化される。この方法では、流体輸送に必要な過剰のハードウエアーは、最小化でき、またミクロ流動装置は、先に説明した設計に比べて少数の流体リザーバーで操作できる。
【００８１】
まず図１２Ａ及び図１２Ｂに示すように、ミクロ流動装置１０００は、２つの流体リザーバー、例えばサンプルリザーバー１００６（これはサンプル入口チャンネル１００７と流動可能に連結している）及び廃棄物リザーバー１００８に接続した少なくとも２つの平行なチャンネル１００２、１００４のネットワークを有する。これらのリザーバーは、次に圧力（又は真空）源及び電圧（又は電流）源（それぞれ参照文字Ｐ１／Ｐ２で示す）に各々操作可能に連結している。図１２Ａ、１２Ｂでは、便宜上、同じ長さの２つの平行なチャンネル１００２、１００４しか示さないが、ミクロ流動チャンネルネットワークは、以下に説明するように、特定のアッセイシステムの要件及び分離すべき種の数に従って、３つ以上のチャンネルでも、また各種長さのチャンネルでも、構成できることを理解すべきである。更に、これら２つのチャンネルは、図示のような平行の配置構成である必要はなく、互いにいかなる配置構成、例えばｙ形配置構成、チャンネル１００２、１００４を互いに相対して配置したチャンネル“Ｔ”配置構成等で配列でき、これらの配置構成で、種の分離に使用される２つ（又はそれ以上）のチャンネルは、同じ廃棄物リザーバーと流動可能に連結する必要はなく、個々にそれ自身のリザーバー又はチップ上のウエルに連結してもよい。
【００８２】
平行チャンネルネットワークの各チャンネル中で圧力駆動流と動電的駆動流との比を変えることにより、異なる電気泳動移動度又は速度を有するアナライトは、互いに分離、抽出できる。例えばサンプルリザーバー１００６に対し１つの圧力差及び電圧電位を加えると、サンプルリザーバー１００６の流体材料は、平行チャンネル１００２、１００４中に、これらチャンネルの流れ抵抗、及び次に例えばそれぞれのチャンネルの深さ、幅及び／又は長さに関連の比率で流入する。特に所定の電圧勾配に対する電気浸透的流体推進又は方向では、流速（量／時間）は、一般に、１０を超えるアスペクト比（幅：深さ）を有するチャンネルについては、チャンネルの深さと共に変化し、例えばチャンネルの単位長さ当りの電気抵抗は、このチャンネルの断面積（幅×深さ）に比例する。計算上の特定の小さい、取るに足らぬ誤差により、この一般的な比は、更に低いアスペクト比、例えば＞５のアスペクト比についても当てはまる。逆に、同じチャンネルについての流体力学抵抗は、チャンネルの深さの３乗に反比例する（例えばＲｈ＝ｄ３）。こうして、例えばチャンネル１００４の深さ“ｄ”がチャンネル１００２に比べて２倍であれば、チャンネル１００４の幅は、両チャンネル１００２、１００４で同じ電気抵抗を維持するため、半分となり得る。したがって、加える電場は同じであるが、圧力駆動流の量は変化させる平行なセットのチャンネルを作るのは可能である。例えば、図１２Ｂに示すように、チャンネル１００４の幅は７５μで、深さは１０μであり、一方、チャンネル１００２の幅は１５０μで、深さは５μである（図１２Ｂには寸法は引いていない）と仮定する。チャンネル１００２、１００４の断面積は、同じ（例えば７５０μ２）であるから、両チャンネル１００２、１００４は、同じ電気抵抗を有する。しかし、チャンネル１００２の流体力学抵抗は、チャンネル１００４よりも約８のファクター大きい（例えばＲｈ１００２／Ｒｈ１００４＝１０３／５３＝８）。このタイプの幾何学を用いて、以下に更に説明するように、２つ（又はそれ以上）の差別的に帯電した種を互いに分離することが可能である。
【００８３】
例えばサンプルリザーバー１００６から廃棄物リザーバー１００８までの圧力駆動流をＰ１＞Ｐ２に設定し、リザーバー１００６からリザーバー１００８に亘るチャンネル１００２、１００４中の電場をＶ１＞Ｖ２とする。この状況は、図１２Ｃに示すように、２つの差別的に帯電した種１０１０、１０１２を互いに分離するのに適当である。なお、図１２Ｃは、図１２Ａの平行チャンネル配置構成の拡大図である。ここでは、特定の仮定、例えば種１０１０は、電荷が０（例えばＺ＝０）であり、一方、種１０１２は、高度に負帯電している（例えばＺ＝−２）ものと仮定した。これらの仮定は、簡略化及び明確化の目的で行ったが、この流体分割技術は、１つ以上の種が、帯電しているか（単独の種について）又は差別的に帯電している（２つ以上の種について）限り、或いは２つ以上の種が同じ電荷を有するが、異なる質量を有する限り、混合物から１つ以上のいずれの種の分離にも利用できることに注目すべきである。異なる電荷は、正電荷対負電荷、高正電荷対低正電荷及び高負電荷対低負電荷を包含する。
【００８４】
負帯電の種１０１２の電気泳動速度が圧力駆動速度よりも実質的に大きければ、この帯電種１０１２の電気泳動速度は、実質的に圧力駆動速度を超えている上、加えた電場は、これら両チャンネルで同一なので、帯電種１０１２は、チャンネル１００２、１００４中にほぼ均等に駆動される。一方、他の中性の種１０１０は、実質的に圧力駆動流について行き、前記計算したチャンネル中の流体力学抵抗の比により、流体力学抵抗の低い深いチャンネル１００４中に実質的に駆動される（例えば中性種の全量の約８９％は、チャンネル１００４に入り、一方、全量の約１１％だけがチャンネル１００２に入る）。この簡略例では、分離効率は、完全ではないが、システム内で慎重に前記幾何学及び／又は加えた圧力及び／又は電圧を同調させることにより、分離効率は最大化できる。
【００８５】
装置１０００は、更に分析及び／又は検出を行うため、分離された種１０１０及び／又は１０１２の１つ以上を抽出、分離することが必要であるか、望ましい場合は、チャンネルセグメント１００２及び／又は１００４と流動可能に連結した１つ以上の副チャンネルを備えてもよい。また、チャンネルセグメント１００２、１００４の一方又は両方は、関連の分離した種を検出するため、検出システムと感知可能に連絡した検出窓を備えてもよい。検出システムは、蛍光分光分析法（レーザー誘引方法及び非レーザー方法）、紫外線分光分析法、電気化学的検出、熱的検出、キャパシタンスによる検出（ＰＣＴ出願公開Ｎｏ．ＷＯ ９９／３９１９０参照）、質量分光分析法による検出、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及び電子噴霧（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）（これは、材料を直接、毛管又はミクロ流動装置出口から受けるように、容易に構成できる）等、周知の各種検出方法によるものでよい。好ましい局面では、光学的検出方法、特に蛍光による検出方法が使用される。このような検出システムは、一般に検出すべき特定の蛍光種を励起させる適当な波長の光を与える励起光源を備える。この励起光は、次に、レンズ、フィルター（例えば波長及び／又は空間のフィルター）ビームスプリッター等を含む適当な光学系に通し、更に分離導管の半透明部分の所で例えば対物レンズに向ける。サンプル材料の蛍光種、成分又はフラクションが励起光を通過すると、これらは、蛍光を発する。次に、蛍光発光を集め、対物レンズ及び同じ又は代りの光学系に戻し、光センサー、例えば光ダイオード、光電子増倍管又はＣＣＤ等に送る。この装置は、ＵＳＰ Ｎｏ．６，１００，５３１（本発明と同じ譲渡人に譲渡された）に更に十分に記載されるような、装置本体構造中に一体化した１つ以上の光変化性光学エレメント（例えばレンズ又は光学フィルター）も備えてよい。この文献の全内容は、ここに援用した。このような一体化光学エレメント付き装置は、光学的検出計画に使用される光学的操作の少なくとも一部を行う。
【００８６】
このシステムの分離効率は、例えば図１４Ａ及び図１４Ｂに示す通り、分離が複数（例えば２以上）の段階で起こるように、複数の平行チャンネルネットワークを一緒に直列に連結することにより向上できる。図１４Ａに示すように、このチップ設計は、複数の平行チャンネルネットワーク、例えばチャンネルネットワーク１０２０、１０３０、１０４０を備えることができる。これらのチャンネルネットワークは、一緒に直列に連結して、カスケード型チャンネル配置構成を形成している。これらチャンネルの流体力学抵抗は、例えば２つの差別的に帯電した種が、多段で、したがって高い効率で互いに分離できるように、選択（例えばそれぞれの深さ及び幅（及び／又は長さ））、変化できる。これは、例えばチャンネル１０３４、１０４４は、チャンネル１０２４（このチャンネルが、例えば図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃと同様、チャンネル１０２２の半分の深さ及び２倍の幅を有する）と同じか又は類似の配置構成（例えば同じ又は類似の流体力学抵抗）を持ち、一方、チャンネル１０３２、１０４２が、チャンネル１０２２と同じか、類似の配置構成を持つように、チャンネル配置構成を設計することにより達成できる。
【００８７】
例えばチャンネルネットワーク１０２０のチャンネル１０１８中に導入したサンプルが帯電種１０１２及び中性種１０１０をほぼ等量含有する（例えば各々の種を約５０％）と考える。再び、負帯電種１０１２の電気泳動速度は、圧力駆動速度よりも実質的に大きいと仮定すると、帯電種１０１２は、チャンネル１０２２、１０２４中にほぼ均等に駆動され、こうしてチャンネル１０２２、１０２４は、ほぼ等量の帯電種１０１２を含有し、一方、チャンネル１０２４は、チャンネル１０２２に比べて、中性種１０１０全量の約１１％しか含有せず、よって、チャンネル１０２４中の中性種に対するチャンネル１０２２中の中性種の全量は約８対１比となる。次に、チャンネルネットワーク１０４０の次の分離段階を通過した後、チャンネル１０４４は、チャンネル１０４２と等量の帯電種１０１２を含む。しかし、中性種は、更にチャンネル１０４２対チャンネル１０４４では８対１の比で分離され、よって、チャンネル１０４４中に流入するチャンネル１０１８中のもともと存在した中性種の約１／６４が全量となる。こうして、チャンネル１０４４中の帯電種１０１２と中性種１０１０との比は、チャンネル１０２４中の帯電種と中性種との比よりも遥かに大きくなり、システムの分離効率を改善する。勿論、特定の利用に望ましいか、必要ならば、システムの下流に１つ以上の追加の分離段階（例えば平行チャンネルネットワーク）を付加して分離効率を更に改善できる。
【００８８】
一般にチャンネルの深さは、差別的に帯電した種の所望の分離に最適の流れ条件を得るため、チャンネルの深さは、変化させてよい。したがって、所定の平行チャンネルネットワークについてこの利用によると、第一平行チャンネルの深さは、第二チャンネルより約２倍を超え、例えば第二チャンネルより約５倍を超え、例えば第二チャンネルより約１０倍（又はそれ以上）を超える。しかし、チャンネルネットワークの平行な分岐中で相対流速を制御するための変数として、深さを増大させた場合の一つの潜在的な問題は、基質の厚さ及び電位を作る制約が、２つの平行チャンネルの相対深さを例えばファクター２又は３に制限できることである。更に、３つ以上の差別的に帯電した種を互いに分離することを必要とする場合、多数の異なるチャンネルを採用したチャンネル幾何構成は、圧力駆動速度が、チャンネルからチャンネルまで既知の量で異なること（及び電場は、前述のように全てのチャンネルに対し、一定に保持すること）が必要かも知れない。所定の基質配置構成には、チャンネル数は限定されないが、使用可能な異なる深さの数は、製造上の制約から、複数のチャンネルに対し３以下の異なる深さに制限してもよい。
【００８９】
図１３Ａ及び図１３Ｂは、チャンネルネットワークの長さ沿いに２つの異なる深さの組合せを用いて、差別的に帯電した多数の種を分離できる一方法を示す。図１３Ａ及び図１３Ｂに示すように、チャンネルネットワーク１１００は、各々、入力チャンネル１１１０（このチャンネルは、例えばサンプルリザーバー（図示せず）と流動可能に連結している）及び出力チャンネル１１１２（このチャンネルは、例えば廃棄物リザーバー（図示せず）と流動可能に連結している）と流動可能に連結した４つの平行なチャンネル１１０２、１１０４、１１０６、１１０８を有する。例えば図１３Ｂに示すように、４つの各チャンネル１１０２〜１１０８に対し２つのチャンネル深さ（及び相当する２つのチャンネル幅）だけ使用したが、これらのチャンネル深さは、各チャンネルの長さ沿いに変化させて、それぞれの各チャンネルに加えた同じ電流電位を維持しながら（各チャンネルは、該チャンネルの長さ沿いに同じ断面積を有するため）、（例えば各チャンネルの流体力学抵抗を変えることにより）可変量の圧力駆動流を作る。チャンネルそれぞれの流体力学抵抗差は、例えば多数チャンネルに再び、同じ断面積であるが、異なる長さを持たせ、したがって更に互いに流れ抵抗を変えることにより、更に変形することも可能である。また、このシステムは、意図する分離効率を得るため、装置の各種チャンネルネットワークに対し圧力差及び／又は電圧差の１つ以上又は両方を変えるように構成できる。意図する分離を行うため、例えば電場は固定して、圧力流は変化できるし、或いは圧力流は固定して、電場は変化できるし、或いはまた電場及び圧力流の両方を同時に変化できる。更に、種の分離が望まれる２つ以上のチャンネルが、同じ廃棄物リザーバーと流動可能に連結していない場合、異なる電気泳動移動度により２つ以上の種の分離を行うため、電場は、この２つ（又はそれ以上）のチャンネルの少なくとも１つ（例えば深さが浅く、かつ幅が広い方のチャンネル）に対して変化させる（又は固定しておく）だけで済む。
【００９０】
ｃ．多段抽出
他の局面では、本発明は、前述の選択的イオン抽出法を用いて多段抽出を行う方法及び装置を提供する。多段抽出は、少なくとも２つの他の種の電荷の中間にある電荷を有する種を分離するという追加の利益を与える。例えば一段選択的イオン抽出は、最高又は最低のイオン移動度を持った種を分離するには好適であるが、多段抽出は、中間移動度の種や、最低速及び最高速の電気泳動移動度を持った種を分離するのに望ましい。したがって、多段選択的イオン抽出は、混合物中に含まれる流体で運ばれた種の分離を行う際、なお一層の多用性を与え、これにより、これまで実現された利用よりもなお一層広範な各種利用にミクロ流体技術を容易に使用できる。
【００９１】
このような一利用は、外部装置による特定の分析を実施するため、ミクロ流動装置と二次分析機器とを組合せることである。非常に望ましい組合せ装置は、混合物中の成分の分離が、ミクロ流動装置で行われ、分離された材料が電子噴霧（又は他の手段）により更なる分析のため質量分析計中に装填されるように、ミクロ流動装置と質量分析計とを組合せたものである。このような組合せ及び質量分析計インターフェースへの各種チップは、２００２年３月６日出願の共同（ｃｏ−ｏｗｎｅｄ）係属出願ＵＳＳＮ ６０／３６２，２９１及びＵＳＰ ５，８７２，０１０に詳細に記載されている。これらの各文献は、あらゆる目的のため、全体をここに援用した。
【００９２】
従来、このような組合せ装置で作業する際の制限の１つは、ミクロ流動装置で使用する流体の量が極めて少ないため、分離された成分の収量が極めて少ないことであった。本発明の装置及びシステムにより行われる多段選択的イオン抽出は、第二の分析に十分な材料を集めるのに必要な時間の間、材料の連続的分離及び単離を行うことにより、このような障害を克服できる。
【００９３】
図８は、多段抽出に好適なシステムを示す。前述のように、多段抽出は、前記選択的イオン抽出法を用いて一連の分離を行うことにより達成される。装置８００は、主チャンネルと、該主チャンネルと交差する少なくとも２つの副チャンネルを有する。これら２つの副チャンネルは、例えば十字形となる４方向交差点の形成、分派型（ｏｆｆｓｅｔ）T交差点の形成、並列型（ｓｉｄｅ ｂｙ ｓｉｄｅ）Ｔ交差点の形成、分派型Ｔの形成等のいかなるレイアウトで主チャンネルと交差してよい。各チャンネルに加える圧力及び電圧は、電気泳動移動度（μｅｐ）を有する種（Ｂ）を選択的に抽出するように構成される。種（Ｂ）の電気泳動移動度は、流体プラグ中に含まれる少なくとも２つの他の種（Ａ、Ｃ）の電気泳動移動度の中間にある。この装置は、流体プラグを主分離チャンネル８０４中に連続的に導入するため、サンプル源、即ち、図示のようなリザーバー又は外部毛管エレメントを有する。装置の操作を説明するため、図８は、サンプル源経由で主チャンネル中に流入する成分Ａ、Ｂ、Ｃを示す。チャンネルセグメント８１２への流体プラグの流入は、リザーバー８０６に加えた負圧により駆動される。したがって、流体プラグ中に含まれる全ての種の正味速度は、これら種の流体力学速度と同等であり、また、これによりチャンネルセグメント８１２中で同じである。流体プラグがセグメント８１４中に入ると、電場を受ける。電場は、リザーバー８０６に加えた電位で作られたものである。したがって、チャンネルセグメント８１４では、該セグメントに入る全ての種の流れは、流体力学流及び電気泳動流により制御される。各成分の正味速度は、これら成分の流体力学速度と電気泳動速度との総合計である。成分の電気泳動移動度の差により、成分がチャンネルセグメント８１４を流通する際、各種種を分離させるセグメント８１４において、成分の合計速度に限定的な差が生じる。また、リザーバー８０６を介して加える電位は、成分Ａ、Ｂをチャンネルセグメント８１６中に流入させながら、成分Ａ、Ｂよりも電気泳動移動度が遅い成分Ｃをチャンネルセグメント８２４中に引き入れるように、該リザーバーに加える負圧と釣合うのに十分な水準に設定される。しかし、成分Ａ、Ｂは、電気泳動移動度が異なるため、異なる正味速度で流れ続ける。成分Ａ、Ｂは、チャンネルセグメント８１８中に流入すると、リザーバー８０８、８１０を介して加えた負圧及び電位により、加えた圧力差及び電場差を受ける。リザーバー８０８、８１０での圧力及び電位の設定は、成分Ｂをチャンネルセグメント８２２中に流入させるだけとし、一方、成分Ａ及び若干の成分Ｂはチャンネルセグメント８２０中に流入するように、もう一度構成される。
【００９４】
通常、本発明により操作されるミクロ流動チャンネルネットワークは、前述の流れプロファイルを確立するため、必要な力をネットワークのチャンネルセグメントに配送するコントローラー設備とインターフェースされる。このような制御システムは、自給式ミクロ流動装置に、ポンプ、バルブ及び電気動力源の統合体の形態で一体化できるが、このような装置は、極めて高価で、かつ確実に製造することが困難であると思われる。本発明のミクロ流動チャンネルネットワークと共同で使用される設備システムは、通常、チャンネルネットワークの各所に圧力による流れプロファイルを発生させるための正及び／又は負の圧力源及びネットワークの他のセグメントに電気泳動的流れプロファイルを発生させるための電力源を備える。これらのシステムは、通常、圧力エネルギーをネットワークの１つ以上のチャンネルセグメントに配送すると共に、電気エネルギーをネットワーク中の他のチャンネルセグメントに配送するための１つ以上のインターフェース部品も有する。
【００９５】
圧力源及び電圧又は電流源の両方を使用する機器の例としては、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ、Ｃａｌｉｐｅｒ １００及びＣａｌｉｐｅｒ ＡＭＳ ９０ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍが挙げられる。両システムは、ミクロ流動システム装置上のリザーバーとインターフェースする電力源及び圧力源（通常、真空源）を有する。これらのリザーバーは、装置内のチャンネルネットワークと流動可能に連絡し、電気又は圧力エネルギーをこれらのチャンネルに伝達する。一般に、このような機器は、本発明に従って操作するため、ミクロ流動装置と一緒に使用できる。図５に、このようなシステム５００を概略的に示す。説明の簡略化のため、ミクロ流動装置５０２内に、単純なＴチャンネル構造を示す。装置５０２は、コントローラー５０４並びに該コントローラー中に入れた電力源５０６及び圧力源５０８と適当なインターフェース部品と適当なインターフェース部品を介してインターフェースしている。通常、このインターフェース部品は、圧力及び電気接続の両用インターフェースや、可能なその他のインターフェース、例えば温度制御、光学的検出、位置決定又は方位決定用のインターフェース等の適当なインターフェース部品中に収容されている。
【００９６】
Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの場合、インターフェースモジュールは、圧力ポート５１０及び電極、例えば電極５１２、５１４が装置５０２と操作可能にはめ合うように、ミクロ流動装置の上面を閉鎖するクラムシェル（ｃｌａｍｓｈｅｌｌ）を有する。圧力ポート５１０は、圧力ラインにより圧力源５０８と操作可能に接続し、また圧力源５０２の適当なリザーバーとも封止可能に噛み合っている。これは、圧力ポートを関連のリザーバーと封止可能にはめ合せる封止可能な取付け金具、例えばＯ−リングで行う。注入ポンプとして図示したが、コントローラー内には、各種異なる圧力源、例えば、ぜん動ポンプ、又はその他の容積移送式ポンプ、例えばダイアフラムポンプ、スクリューポンプ等を使用してよい。操作的な局面では、装置のチャンネルネットワーク中の圧力系流れを更に精密に調整するため、ミクロ流動装置５０２の他のリザーバーに追加の圧力源及び／又は真空源を連結して供給してもよい。
【００９７】
電極５１２、５１４の場合、例えばＵＳＰ ５，９５５，０２８及び同６，０７１，４７８に記載されるような各種インターフェースが任意に採用される。これらの各文献は、あらゆる目的のため、全体をここに援用した。通常、製造の簡素化のため、インターフェースモジュール上にピン電極を配置し、ミクロ流動装置５０２のリザーバー中に挿入して、この中に含まれる流体と接触させる。リザーバー中の流体と接触することにより、コントローラー５０４内の電力源５０６から電流が、装置のチャンネル内の流体に流れる。
【００９８】
Ｃａｌｉｐｅｒ ＡＭＳ ９０ Ｓｙｓｔｅｍの場合、インターフェースモジュールは、装置の頂部を閉鎖するクラムシェルとしてよりもむしろ、ミクロ流動装置を、インターフェース部品の下から振り上がる丁番式架台上に置いた他は、通常、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒに類似する。このＡＭＳ ９０システムは、高スループット用に利用されるので、インターフェースモジュールは、例えば装置の下面から伸びて、例えば図４及び図６Ｂに示すような、一連のサンプルを分析用の装置中に引き入れる、一体化した毛管エレメントを有するミクロ流動装置を保持するようにも構成される。したがって、インターフェース部品、特に装置を載せる架台は、ピペッター（ｐｉｐｅｔｔｏｒ）を挿入して、インターフェース部品の外側のサンプル源に接近させる開口を有する。低スループットの“平面的な”装置及び高スループット又は“一部立体的な”装置の例を、それぞれ図６Ａ及び図６Ｂに示す。
【００９９】
平面的装置６０２を図６Ａに示す。図示のように、装置６０２は、外部サンプリング用ピペッターを備えない他は、図６Ｂに示す装置に類似する。分析すべきサンプルは、装置全体の本体構造６０４内に収容された１つ以上のリザーバー、例えば装置内のチャンネルネットワーク６５６と連絡するリザーバー６０８〜６３０中に入れる。通常、試薬及び緩衝液が、サンプルとの添加混合物として導入されるか、或いは別のリザーバー、例えばリザーバー６３２〜６３８経由で導入される。再び、これらリザーバーは、コントローラーシステムのインターフェース部品への流体アクセス及び流体アクセスの箇所を与える。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの場合、ＡＭＳ ９０ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔシステムと同様、電気アクセスポイントに対し多数のアクセス点が付与されるが、１つのリザーバーだけが、チャンネルに負圧を加えるのに使用される。商業的利用では、平面的及び一部立体的フォーマットを含むミクロ流動装置は、装置の取扱いを手伝うプラスチックキャディー（ｃａｄｄｉｅ）に取付けること、及び／又は装置の各種リザーバーに大容量を与えることが多い（例えばＣａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．及びＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．から入手できるＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ミクロ流動装置参照）。
【０１００】
図６Ｂに示すように、高スループット装置６５２は、ミクロ流動チャンネルネットワーク６５６を有する概略平面的本体構造６５４を備える。サンプリング毛管又はピペッター６５８は、ピペッター６５８中のチャンネルが、チャンネルネットワーク６５６と流動可能に連絡するように、本体構造６５４に取付ける。ピペッター中に引き込まれた材料は、更なる処理及び／又は分析のため、チャンネルネットワークに移動する。チャンネルの端部には、複数のリザーバー、例えばリザーバー６６０、６６２が用意され、これらチャンネルと流動可能に連絡する。これらのリザーバーは、装置のチャンネルに異なる流体、例えば試薬、緩衝液、染料等を配送し、ピペッターエレメントを介して取り込まれたサンプル材料と混合するためのアクセス点を形成する。他の多数のリザーバー、例えばリザーバー６６６〜６７０も、追加の試薬、例えば希釈剤等のためのアクセスを与え、また圧力、電流等を駆動するためのアクセスを与える。図５については、前述のように、これらのリザーバーは、圧力及び電気的インターフェース部品用のアクセス点を与える。反応結果の検出は、一般に例えば光学的検出窓６７２により、ここで説明し、また当業者に一般に知られている検出システムを用いて任意に行われる。
【０１０１】
本発明を実施するため、適当なミクロ流動装置と一緒に市販のシステムを操作できるが、幾つかの場合、電力源の他に、多数の圧力源を使用したコントローラーシステムは、ここで述べた流れプロファイルを確立するのに使用できる。特にチャンネルネットワークの多数の結節部で相対圧力を制御することにより、装置に発生した流れプロファイルに対し一層精密な制御を得ることができる。図５を参照すると、例えばチャンネルセグメント５１８の両端部、例えばリザーバー５２２、５２４及び任意にリザーバー５２０に加えた圧力を、図５に示すようなやり方で制御することにより、チャンネルセグメント５１８での圧力流を一層精密に制御できる。このような設備の例としては、例えばミクロ流動アッセイ計画の開発及び設計に使用されるＣａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｍｔ．Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から市販のＣａｌｉｐｅｒ ４２ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎがある。これらのシステムは、マルチポート圧力制御、例えば装置の多数のリザーバーでの圧力制御や、マルチポート電気制御を含む。マルチポート圧力制御は、一般にＰＣＴ出願公開Ｎｏ．ＷＯ ０１／６３２７０に記載されている。この文献は、あらゆる目的のため、全体をここに援用した。
【実施例１】
【０１０２】
実施例１：マルチポート制御システム及びオフ−チップアッセイミクロ流動装置
試薬：
酵素：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ａ、ｃａｍｐ−依存Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）
【０１０３】
基質：分子量１１２９．５ｄの５−ＦＡＭ−ＬＲＲＡＳＬＧ−ＣＯＮＨ１
【０１０４】
緩衝液：１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中、５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭ ＤＴＴ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１０μＭ ＡＴＴ（Ｓｉｇｍａ）、２％ＤＭＳＯ（Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍｕｓｋｅｇｏｎ，ＭＩ）
【０１０５】
装置：
全ての実験は、マルチポートカートリッジ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を備えたＣａｌｉｐｅｒ １００開発システム又はＣａｌｉｐｅｒ ２２０高スループット選別システムのいずれかで行った。これらのシステムは、主アッセイ選別用完全一体化溶液を供給するように設計されている。各システムは、自動化サンプリングロボット、アーク灯又はレーザーによる蛍光検出システム、及び制御、分析用完全ソフトウエア包装を有する。カートリッジの内側にはチップが載せてあり、マルチポート圧力及び電圧コントローラーとのインターフェース及びアラインメントを与える。要するに、このマルチポート制御モジュールは、ミクロ流動チップに必要な基本的な制御能力を与える。制御媒体として、周囲の空気を用いた８つの独立ぜん動ポンプは、正又は負（真空）のいずれかの圧力で５ｐｓｉ供給できる。電圧コントローラーは、±３ＫＶに達する８つの別々の高電圧を供給できる。マルチポートモジュールは、通常、圧力設定又は電圧設定のような、各ファンクションの順序、期間及び大きさを含む文字により制御される。
【０１０６】
チップの説明：
本実施例で使用したミクロチップの概略図を図９に示す。図示のように、ミクロ流動チップ装置９００は、酵素リザーバー９１８と流動可能に連結したチャンネルセグメント９０２、基質リザーバー９２０と流動可能に連結したチャンネルセグメント９０４、Ｔ−交差点を有する主チャンネルセグメント９１０、及びそれぞれ廃棄物（及び／又はアナライト）リザーバー９２２、９２４と流動可能に連結したチャンネルセグメント９１２、９１４を備える。こうして、圧力駆動流又は動電的流れ等によりチャンネルセグメント９０２、９０４中に導入されたサンプル及び酵素は、主チャンネルセグメント９１０中で混合、相互作用して、基質、該基質とは異なる電荷を有する生成物、及び酵素を含む反応混合生成物を生成する。次に、この反応混合物は、本発明方法に従ってＴ−交差領域９１６で分離できる。Ｃａｌｉｐｅｒ １００及び２２０分析システムは、蛍光検出領域が、チャンネルセグメント９１２との交差点に近い主チャンネルセグメント９１０の端部に隣接して配置されるように、装置９００を保持する。光学システムに接続されたビデオカメラ及びモニターにより、チップ上の検出器場所を見ることができる。検出器は、まず基準点としてＴ−接続部の内側の隅を用いて、Ｔ−交差接続部９１６の前０．２ｍｍの所に置いた。図１０の流束モデルに基づいて、チップ９００に加える圧力及び電圧は、生成物又は基質がＴ−交差接続部を通るとは予想されないような条件を確定した。検出器での一連のピーク（図１１Ａ〜１１Ｃの“前”ピーク）を集め、前接続ピーク特性を得た。次に、検出器をＴ−接続の内側の隅から下流０．５ｍｍの所に再配置した。基質及び酵素を再び、混合して、反応生成物混合物とし、次いでこれをＴ−交差接続部９１６の下流に位置する検出領域で検出した。
【０１０７】
試薬の調製に使用した脱イオン水（２５℃で１８．２ＭΩ−ｃｍ）を、ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）システムを用いて精製した。遊離酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びナトリウム塩（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の両形態のＵＬＴＲＯＬグレードＨＥＰＥＳを用いて、ｐＨ７．５の１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液を調製した。全ての溶液は、チップに添加する前に、０．２μｍポリプロピレン注入フィルターでろ過した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ａに特異的なペプチド基質及び生成物の水溶液をｐＨ７．５のアッセイ緩衝液中で調製した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ａ（ＰＫＡ）、ｃＡＭＰ−依存Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅｃａｍｐ−依存Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、注文合成した分子量１１２９．５の基質５−ＦＡＭ−ＬＲＲＡＳＬＧ−ＣＯＮＨ２（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）と反応させた。この５−ＦＡＭは、ペプチドのアミノ端部上のロイシンに結合したフルオレッセンＮＨＳエステル部分（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）である。注文ペプチドの純度は、ＨＰＬＣで測定して９８％以上である。ＰＫＡアッセイ緩衝液は、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中、５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．，Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭ ＤＴＴ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１０μＭ ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）、２％ＤＭＳＯ（Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍｕｓｋｅｇｏｎ，ＭＩ）含むものである。電気浸透流を抑えるため、この緩衝液に動的コーティング試薬３（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．）を添加した。ｐＨ７．５で、ＰＫＡ酵素は、中性帯電（Ｚ＝０）の基質を負帯電（Ｚ＝−２）の生成物に転化する。酵素及び基質の原料溶液のアリコートを、必要になるまで、−８０℃で保存した。全溶液は、反応前に氷で保存した。ポリプロピレン遠心管に、基質１００μＭ及び酵素２５ｎＭを含むアッセイ緩衝液１００μＬを室温で９０分間、反応完結させた。アッセイ緩衝液は、酵素及び基質の添加前に０．２μＭでろ過し、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ８０μＬを加えて反応を停止させた。生成物の純度は、毛管電気泳動によりチェックし、また濃度は、５０８ｎｍでの吸収係数（ε）８２，０００Ｍ−１ｃｍ−１を用いた紫外線吸収により確認した。生成物及び基質のアリコートは、個々の実験で必要になるまで−８０℃で保存した。
【０１０８】
基質の酵素反応による２つの帯電種の実際の分離、例えば中性帯電（例えばＺ＝０）のＰＫＡ基質（実線）と負帯電のペプチド生成物（点線）（例えばＺ＝−２）との分離を予測するため、単独種の流束及び流速計算を用いた。図１０は、副チャンネルセグメント９１４の圧力の関数として、検出器領域におけるＰＫＡ生成物（点線）及び基質（実線）の濃度の予測流束モデルである。図１１Ａ〜１１Ｃは、Ｔ−交差分離接続部の前後で記録したＰＫＡ化合物の選択的イオン抽出を用いる３つの操作領域を示すと共に、図１０の流束モデルに基づいて、Ｔ−交差点９１６の“前”、“後”で記録したＰＫＡ基質及び生成物の蛍光強度ピークを示す結果を纏めたものである。図１１Ａ〜１１Ｃの蛍光ピークは、それぞれ緩衝液、基質、並びに生成物及び基質に対応して、Ｂ（バックグラウンド）、Ｓ（基質）、Ｐ（生成物）、並びにＳ＋Ｐ（基質及び生成物）と標識した。図中の小さいピークは、原型機械のロボット移動による光学ノイズである。
【０１０９】
主チャンネルセグメント９１０を流下する生成物及び基質の混合サンプルに対しては、例えばチャンネルセグメント９１４では約−１．０ｐｓｉ未満の圧力（例えばリザーバー９２４、９２２で圧力勾配を制御することにより）は、負帯電ペプチド及び中性基質の両方が、Ｔ−交差点９１６を過ぎて検出器に到達するのを防止し、こうして生成物及び基質はチャンネルセグメント９１４中に流入する。このようにして、図１１Ａに示すように、例えば−１．５ｐｓｉの圧力設定では、Ｔ−交差点９１６を過ぎて検出領域で検出される生成物及び基質はない。チャンネルセグメント９１４での圧力が、図１０に示すように、約−１．０ｐｓｉよりも高い水準に徐々に増大すると、負帯電の生成物だけが検出チャンネルセグメント９１２中に抽出され、一方、中性基質は、チャンネルセグメント９１４中に流入し続ける。こうして、図１１Ｂに示すように、チャンネルセグメント９１４において、−１．０ｐｓｉの圧力設定に対しては、生成物だけが、Ｔ−交差点９１６を過ぎて検出領域で検出される。したがって、副チャンネル９１４への圧力が約−１．０〜−０．６ｐｓｉの範囲で変化すると、異なる電気泳動移動度を持った生成物と基質間には分離の観察機会（ｗｉｎｄｏｗ）がある。副チャンネルセグメント９１４への圧力が、図１０に示すように、約−０．６ｐｓｉを超えて増大すると、流体力学流は、副腕チャンネルセグメント９１４では方向が逆転し、基質及び生成物の両方とも、図１１Ｃに示すように、チャンネルセグメント９１４で−０．５ｐｓｉの圧力が設定された場合、Ｔ−交差点を過ぎて検出される。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１Ａは、放物線状の圧力駆動流れプロファイルを示す。図１Ｂは、動電的駆動プラグ流れプロファイルを示す。
【図２】本発明による混成又は混合式の圧力及び動電的駆動ミクロ流動チャンネルシステムの概略図。
【図３】図２に示したネットワークでの各チャンネルセグメントの流れプロファイルの概略図。
【図４】サンプル導入に続いて分離による分析を利用した連続選別アッセイを行う操作での本発明装置の概略図。
【図５】本発明方法を実施するためのシステムの概略図。
【図６Ａ】平面的なフォーマットミクロ流動装置を示す。
【図６Ｂ】一部立体的なフォーマットミクロ流動装置を示す。
【図７Ａ】選択的イオン抽出を行うためのシステムの概略図。
【図７Ｂ】選択的イオン抽出を行うためのシステムの概略図。
【図７Ｃ】選択的イオン抽出を行うためのシステムの概略図。
【図７Ｄ】選択的イオン抽出を行うためのシステムの概略図。
【図８】圧力及び電圧処理により中間電荷を有する種を抽出する本発明装置を用いた、混合物からの帯電種の多段選択イオン抽出を示す。
【図９】選択的イオン抽出による混合物からの帯電種の分離に使用される通常のチップ設計を示す。
【図１０】２つの差別的に帯電した種の流束モデルを圧力変化の関数として示す。
【図１１Ａ】本発明装置のＴ−交差点における分離前後の多数帯電種の蛍光強度を示す。
【図１１Ｂ】本発明装置のＴ−交差点における分離前後の多数帯電種の蛍光強度を示す。
【図１１Ｃ】本装置のＴ−交差点における分離前後の多数帯電種の蛍光強度を示す。
【図１２】図１２Ａは、一形態の選択的イオン抽出を用いて、サンプル中の２つの差別的に帯電した種を互いに分離、抽出するのに使用されるチップチャンネル設計の他の一実施態様である。図１２Ｂは、図１２Ａの装置の１２Ｂ−１２Ｂ線部分の断面図。図１２Ｃは２つの差別的に帯電した種の分離、抽出を示す図１２Ａのチャンネル配置構成の拡大図である。
【図１３】図１３Ａは、一形態の選択的イオン抽出を用いて、サンプル中の複数（例えば２以上）の差別的に帯電した種を互いに分離、抽出するのに使用されるチップチャンネル設計の他の一実施態様である。図１３Ｂは、図１３Ａの装置の１３Ｂ−１３Ｂ線部分の横断面図。
【図１４】図１４Ａは、図１２Ａに示したものと同様な縦つなぎの平行分離チャンネルを用いた一形態の選択的イオン抽出を用いて、サンプル中の２つの差別的に帯電した種を互いに分離、抽出するのに使用されるチップチャンネル設計の他の一実施態様である。図１４Ｂは、２つの差別的に帯電した種を互いに分離する際の分離効率の向上を示す、図１４Ａのチャンネル配置構成の部分拡大図。
【図１５】図１５は、ミクロ流動装置に於けるサンプルから以後の分析の為の（ＤＮＡ及びＲＮＡのような）電気泳動の流動種を検出し、前もって濃縮する本発明の教示により使用することの出来るミクロ流動装置チャンネル配置の一概略図である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、図１５が装置のさまざまなチャンネルセグメントを通じて、圧力より生じた速度の例示を示しているミクロ流動装置チャンネル配置の一概略図である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、図１５が電気分野で装置のリザーバ１２０４及び１２０６との間に適用される際に、装置のさまざまなチャンネルセグメントを通じて、動電学的な速度の例示を示しているミクロ流動装置チャンネル配置の一概略図である。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、図１５が装置のさまざまなチャンネルセグメントを通じて、包括的な全種の速度をチャンネル配置の一概略図である。
【図１７】図１７は、図１５に示されているように一チャンネル配置を使用して一サンプル内にＤＮＡをおおよそ７つに折り畳んでスタック（ｓｔａｃｋｉｎｇ）を示している一電子フェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【符号の説明】
【０１１１】
２００ チャンネルネットワーク
２０２ 第一チャンネルセグメント
２０４ 第二チャンネルセグメント
２０６ 第一流動接続部
２０８ 第三チャンネルセグメント又はアクセスチャンネル
２１８ 電気システム
４００ アッセイ装置
４０２ サンプリングエレメント
４０４ 第一チャンネルセグメント
４０６ 第二チャンネルセグメント
４０８ 第一流動接続部
４１０ 第三チャンネルセグメント
４１２、４１４ 副チャンネル
４１６、４１８ リザーバー／試薬源
４２０ 電気制御システム
４５０ テスト化合物
４５２ 反応混合物スラッグ
４５４ 分離された種
４５６ 検出窓
５００ ミクロ流動装置と併用される、電力源及び圧力源を有するシステム
５０２ ミクロ流動装置
５０４ コントローラー
５０６ 電力源
５０８ 圧力源
５１０ 圧力ポート
５１２、５１４ 電極
５１８ チャンネルセグメント
５２０、５２２、５２４ リザーバー
６０２ 平面的装置
６０４ 本体構造
６０８〜６３８ リザーバー
６５２ 高スループット装置又は一部立体的装置
６５４ 概略平面的本体構造
６５６ ミクロ流動チャンネルネットワーク
６５８ サンプリング毛管又はピペッター
６６２〜６７０ リザーバー
６７２ 光学的検出窓
７００ 酵素アッセイ用装置
７０２ サンプル源
７０２、７０５、７０６ 主チャンネルのチャンネルセグメント
７０４、７１４、７１６ 副チャンネルのチャンネルセグメント
７０８、７１０ 差別的に帯電した種
７２２、７２４、７２６、７２８ リザーバー
７２８ 廃棄物リザーバー
８００ 多段抽出用システム
８０４ 主分離チャンネル
８０６、８０８、８１０ リザーバー
８１２〜８２４ チャンネルセグメント
９００ ミクロ流動チップ装置
９０２、９０４、９１２、９１４ チャンネルセグメント
９１０ 主チャンネルセグメント
９１６ Ｔ交差領域
９１８ 酵素リザーバー
９２０ 基質リザーバー
９２２、９２４ 廃棄物（及び／又はアナライト）リザーバー
１０００ ミクロ流動装置
１００２、１００４ 平行なチャンネル
１００６ サンプルリザーバー１００６
１００７ サンプル入口チャンネル
１００８ 廃棄物リザーバー
１０１０、１０１２ 差別的に帯電した種
１０１８、１０２２、１０２４ チャンネル
１０２０、１０３０、１０４０ チャンネルネットワーク
１０３２、１０３４、１０４２、１０４４ チャンネル
１１００ チャンネルネットワーク
１１０２、１１０４、１１０６、１１０８ 平行なチャンネル
１１１０ 入力チャンネル
１１１２ 出力チャンネル
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
ミクロ流動工学は、一層の迅速性、正確性、容易に自動化可能な小型化実験を約束することにより、生物学及び化学的研究における次の技術革新として報告されてきた。ミクロ流動実験の利点の多くは、市場で明らかである。例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．から供給されるＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ並びにそのミクロ流動装置及び試薬キットメニューは、生命科学研究者に重要な多数の異なる分析を行うための多目的実験台を提供する。これらのシステムで作られたデータは、デジタル化された高再現性状態で容易に得られる。
【０００２】
高スループット実験もミクロ流動生成物により処理（ａｄｄｒｅｓｓ）されている。Ｃａｌｉｐｅｒ ２５０ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍは、連続流ミクロ流動アッセイフォーマット中の多数の異なるサンプル、例えば薬剤テスト化合物を選別して、これらテスト化合物から可能な治療剤を同定する。このようなシステムは、単独のミクロ流動装置で１日当り数千、数万のアッセイを行い、従来の選別システムに比べて、プロセスのスループットを増大させながら、使用試薬のフットプリント及び量を減少させる能力を有する。
【０００３】
ミクロ流動システムは、その約束を果たしているが、開発されたシステムにおけるミクロ流動チャンネルネットワークの相互連絡した性質は、システムの操作性に幾つかの制限を招いている。例として、初期のミクロ流動システムは、完全に動電的な駆動流システムを採用した。これらのシステムは、装置の相互連絡したチャンネルの全てにおいて、平坦なプラグ流れプロファイルにより材料を移動させる間中、拡散が制限された分散により流体、その他の材料の移動について精密制御性を与えた。しかし、材料の移動を駆動させるため、電場を使用することも、装置のチャンネル内に差別的に（異なるように）帯電した種の電気泳動的分離又は偏りを駆動して、一層複雑なデータの脱繰り込み（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を必要とするデータを生じる。更に、このような動電的流れシステムは、長いチャンネル距離を渡るべき所では、材料の移動が遅くなり、スループットを低下させる恐れがある。ミクロ流動システムに圧力による流れを用いると、差別的に帯電した材料の偏った移動はなくなるが、放物線の流れを持つシステム中で生じるＴａｙｌｏｒ−Ａｒｉｓ分散の増大により、一層高度に分散した流れのプロファイルを作る。
【特許文献１】ＵＳＰ ６，０１２，９０２
【特許文献２】ＵＳＰ ６，１７１，０６７
【特許文献３】ＰＣＴ出願公開Ｎｏ．ＷＯ ０２／１０７３２
【特許文献４】ＵＳＰ ５，９４２，４４３
【特許文献５】ＵＳＰ ６，０４６，０５６
【特許文献６】ＵＳＰ ６，２６７，８５８
【特許文献７】ＵＳＰ ５，８８５，４７０
【特許文献８】ＵＳＰ ６，１５６，１８１
【特許文献９】ＵＳＰ ６，２３８，５３８
【特許文献１０】ＵＳＰ ５，９４８，２２７
【特許文献１１】ＵＳＰ ６，０４２，７１０
【特許文献１２】国際出願公開Ｎｏ．ＷＯ９８／００２３１
【特許文献１３】ＰＣＴ出願公開Ｎｏ．ＷＯ ９９／３９１９０
【特許文献１４】ＵＳＳＮ ６０／３６２，２９１
【特許文献１５】ＵＳＰ ５，８７２，０１０
【特許文献１６】ＰＣＴ出願公開Ｎｏ．ＷＯ ０１／６３２７０
【非特許文献１】Ｔａｙｌｏｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，（１９５３）２１９Ａ：１８６−２０３
【非特許文献２】Ａｒｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，（１９５６）Ａ２３５：６７−７７
【非特許文献３】Ｃｈａｔｗｉｎ等，Ｊ．Ｆｌｕｉｄ ｍｅｃｈ．（１９８２）１２０：３４７−３５８
【非特許文献４】Ｄｏｓｈｉ等，Ｃｈｅｍ，Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．（１９７８）３３：７９５−８０４
【非特許文献５】Ｇｕｅｌｌ等，Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｍ．（１９８７）５８：２３１−２４４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一般に、各タイプの流れプロファイルの有利な面を利用しながら、各プロファイルの魅力の劣る特徴を除去するか又は最小にするように最適化されたミクロ流動システムを提供することが望ましい。本発明は、これら及びその他の各種要求を満足する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明は、一般に、チャンネルネットワーク中で材料の最適移動を行うため、混成流体流れプロファイルを用いる方法及びシステムを提供する。これらのシステムは、各種チャンネルセグメント間の相互連絡を維持しながら、材料を相互連絡したチャンネルネットワーク中で移動させるため、圧力及び動電による混成流れシステムを用いる。特に本発明は、一般に、第一チャンネルセグメントでの流れが、圧力流により駆動され、その結果、放物線状流れプロファイルが得られる場合のチャンネルネットワークに向けたものである。相互連絡したチャンネルセグメントでは、材料の流れは、動電的に駆動され、その結果、プラグ流れプロファイルを生じる。本方法及びシステムは、圧力流をタップオフすると共に、接続部を通る動電的流れに置換するため、異種の流れプロファイルを持つチャンネルの該接続部に、通常、アクセスチャンネル又はタッピングチャンネルを用いる。これは、材料の移動下で流れプロファイルを変えながら、材料を第一チャンネルセグメントから第二チャンネルセグメントに流す競争試験（ｐａｓｓｉｎｇ ｏｆｆ）を保証する。
【０００６】
本発明装置は、加える圧力又は電場を制御するか、或いは加える圧力、電場の両方を制御して、異なる種の流れプロファイルを管理することにより、サンプル混合物から差別的に帯電した種を分離するためにも有用である。多数の圧力及び電圧源を持った流体制御システムを用いて、ミクロ流動チャンネルネットワークのいずれかの部分の流体力学流及び電場が所望値に設定できるように、装置のいずれかの所定のチャンネルセグメント中で圧力及び／又は電圧を制御できる。本発明は、２つの異なる流れプロファイル、即ち、圧力による駆動及び動電的駆動のプロファイルを重複させ、同時に各流れプロファイル下で、流速を制御して、この流体中に、流体で運ばれたサンプル中に含まれる差別的に帯電した種を容易に分離及び単離するのに十分な量で含有する所定種について正味速度を得ることにより、チャンネルネットワークの異なるセグメント中の流体流を独立に制御する装置を提供する。こうして、以下に説明するＴ−交差点のようなチャンネル交差点に送られた、異なる電気泳動移動度を有する２つ以上のサンプル種の混合物（例えば中性基質及び酵素反応の負帯電生成物）は、サンプル種の異なる電気泳動移動度に基づいて、交差点の別々のチャンネル内の分離成分に完全に分離できる。
【０００７】
前述の選択的イオン抽出と同様に、異なる移動度（例えば異なる電荷及び／又は質量）を有するアナライトを分離、抽出する他の新規な技術もここで説明する。この技術では、ミクロ流動チャンネルネットワークは、数を減らした外部圧力源及び電圧源を利用することにより、例えば先に説明した実施態様と比べて、流体制御に必要な流体リザーバーの数を減らして分離を行うことにより、流動駆動力を配分して、流体サンプル中の差別的に帯電した種を分離するように、構成、寸法化される。この方法では、流体輸送に必要な過剰のハードウエアーは、最小化でき、またミクロ流動装置は、先に説明した設計に比べて少数の流体リザーバーで操作できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
図面の簡単な説明
図１は、放物線状の圧力駆動流れプロファイル（図１Ａ）及び動電的駆動プラグ流れプロファイル（図１Ｂ）を示す。
【０００９】
図２は、本発明による混成又は混合式の圧力及び動電的駆動ミクロ流動チャンネルシステムの概略図である。
【００１０】
図３は、図２に示したネットワークでの各チャンネルセグメントの流れプロファイルの概略図である。
【００１１】
図４は、サンプル導入に続いて分離による分析を利用した連続選別アッセイを行う操作での本発明装置の概略図である。
【００１２】
図５は、本発明方法を実施するためのシステムの概略図である。
【００１３】
図６のＡ及びＢは、それぞれ平面的及び一部立体的（ｓｉｐｐｅｒ）なフォーマットミクロ流動装置を示す。
【００１４】
図７のＡ〜Ｄは、選択的イオン抽出を行うためのシステムの概略図である。
【００１５】
図８は、圧力及び電圧処理により中間電荷を有する種を抽出する本発明装置を用いた、混合物からの帯電種の多段選択イオン抽出を示す。
【００１６】
図９は、選択的イオン抽出による混合物からの帯電種の分離に使用される通常のチップ設計を示す。
【００１７】
図１０は、２つの差別的に帯電した種の流束（ｆｌｕｘ）モデルを圧力変化の関数として示す。
【００１８】
図１１のＡ、Ｂ、Ｃは、装置のＴ−交差点における分離前後の多数の帯電種の蛍光強度を示す。
【００１９】
図１２Ａは、一形態の選択的イオン抽出を用いて、サンプル中の２つの差別的に帯電した種を互いに分離、抽出するのに使用されるチップチャンネル設計の他の一実施態様である。図１２Ｂは、図１２Ａの装置の１２Ｂ−１２Ｂ線部分の横断面図である。図１２Ｃは、２つの差別的に帯電した種の分離、抽出を示す図１２Ａのチャンネル配置構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）の拡大図である。
【００２０】
図１３Ａは、一形態の選択的イオン抽出を用いて、サンプル中の複数（例えば２以上）の差別的に帯電した種を互いに分離、抽出するのに使用されるチップチャンネル設計の他の一実施態様である。図１３Ｂは、図１３Ａの装置の１３Ｂ−１３Ｂ線部分の横断面図である。
【００２１】
図１４Ａは、図１２Ａに示したものと同様な縦つなぎの（ａ ｃａｓｃａｄｅ ｏｆ）平行分離チャンネルを用いた一形態の選択的イオン抽出を用いて、サンプル中の２つの差別的に帯電した種を互いに分離、抽出するのに使用されるチップチャンネル設計の他の一実施態様である。図１４Ｂは、２つの差別的に帯電した種を互いに分離する際の分離効率の向上を示す、図１４Ａのチャンネル配置構成の部分拡大図である。
【００２２】
図１５は、ミクロ流動装置に於けるサンプルから以後の分析の為の（ＤＮＡ及びＲＮＡのような）電気泳動の流動種を検出し、前もって濃縮する本発明の教示により使用することの出来るミクロ流動装置チャンネル配置の一概略図である。
【００２３】
図１６Ａは、図１５が装置のさまざまなチャンネルセグメントを通じて、圧力より生じた速度の例示を示しているミクロ流動装置チャンネル配置の一概略図である。図１６Ｂは、図１５が電気分野で装置のリザーバ１２０４及び１２０６との間に適用される際に、装置のさまざまなチャンネルセグメントを通じて、動電学的な速度の例示を示しているミクロ流動装置チャンネル配置の一概略図である。そして、図１６Ｃは、図１５が装置のさまざまなチャンネルセグメントを通じて、包括的な全種の速度をチャンネル配置の一概略図である。
【００２４】
図１７は、図１５に示されているように一チャンネル配置を使用して一サンプル内にＤＮＡをおおよそ７つに折り畳んでスタック（ｓｔａｃｋｉｎｇ）を示している一電子フェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【００２５】
発明の詳細な説明
Ｉ．総論
一般に本発明は、第一のチャンネルセグメント中に主として非動電的圧力駆動流を含み、一方、接続した第二のチャンネルセグメント中に動電的駆動流を含むミクロ流動チャンネルシステムで材料を移動させる方法及びシステムを提供する。ミクロ流動チャンネルネットワークの異なる部分で異なる種類の流れプロファイルを付与することにより、特殊な流れプロファイルにより生じる恐れがある悪影響を最小にしながら、全体の操作により各セグメントを最適化できる。
【００２６】
ここで使用した語句“非動電的圧力流”とは、チャンネルセグメント外部の圧力源により駆動される流れを言い、この流れは、チャンネルセグメントを介して駆動され、問題のチャンネルセグメントに電場を加えることにより、このチャンネルセグメントを介して発生する流れ（ここでは、“動電的駆動流”と言う）とは対照的のものである。圧力源の例としては、動電的圧力ポンプ、例えば問題のチャンネルセグメントとは離れたポンプ作用性チャンネル中で動電的駆動流により圧力を発生するポンプ（但し、このようなポンプは、問題のチャンネルセグメントの外部にある）を含む、問題のチャンネルセグメント外部の負圧及び正圧の供給源又はポンプが挙げられる（ＵＳＰ ６，０１２，９０２及び同６，１７１，０６７参照、これらの各文献は、あらゆる目的のため、全体をここに援用した）。
【００２７】
ここで使用した用語：動電的流れは、一般に、加えた電場下での流体又は流体運搬材料の移動を説明するために使用する。動電的流れは、一般に、電気泳動、例えば帯電種が配置される媒体又は流体を介した帯電種の移動、及び電気浸透、例えば流体の全成分を含む塊状流体の電気駆動移動の一方又は両方を包含する。したがって、動電的流れについて言及する際、予想されるものは、種の主として又はほぼ完全に電気泳動的移動から、例えば非帯電材料の場合、材料の主として電気浸透的な駆動移動までの動電的流れの全範囲、及びこれらの両極端部間に入る２つのタイプの動電的移動の範囲全体及び比率全体であると理解されよう。
【００２８】
ここで使用した用語“流れプロファイル”とは、一般に、通路、導管、チャンネルを通るか、又は表面を横断する流体流又は他の材料流の特徴の全てを言う。このような特徴としては、限定されるものではないが、流速、流量、流れる流体又は他の材料の配座（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）及び同伴する分散プロファイルや、その他、流れの更に一般化した特徴、例えば層流、沿面（ｃｒｅｅｐｉｎｇ）流、乱流等が挙げられる。
【００２９】
ＩＩ．圧力駆動流対動電的駆動流
先に述べたように、微小規模の流動チャンネルでは、圧力駆動流は、動電的駆動流とは異なる特徴を有する。特に、これらシステムでの圧力駆動流は、通路又は導管の中央部の流体が最も速く移動する所では、流体が側壁に接近するのに従って減少する流れ速度勾配により放物線流となり、また壁での流体は、流れ速度が０又は０に近くなる（図１Ａの放物線流の概略図参照）。放物線流の結果の一つは、材料の流速に関連する分散水準の増大であり、チャンネルを流通する際、別の流体又は他の材料の広がりが増大する。分散、特にＴａｙｌｏｒ−Ａｒｉｓ分散についての検討は、例えばＴａｙｌｏｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，（１９５３）２１９Ａ：１８６−２０３；Ａｒｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，（１９５６）Ａ２３５：６７−７７；Ｃｈａｔｗｉｎ等，Ｊ．Ｆｌｕｉｄ ｍｅｃｈ．（１９８２）１２０：３４７−３５８；Ｄｏｓｈｉ等，Ｃｈｅｍ，Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．（１９７８）３３：７９５−８０４；及びＧｕｅｌｌ等，Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｍ．（１９８７）５８：２３１−２４４参照。これらの各文献は、あらゆる目的のため、全体をここに援用した。
【００３０】
この分散の増大は、ミクロ流動規模では分析の解析力（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）低下（別のやり方で解析された種の分散で生じる）や、所定の分析に要する時間の増大（異なる流体又は材料サンプル間に必要な空間の増大で生じる）となる可能性がある。圧力駆動流は、分散の増大という欠点を有するが、高速流であり、また差別的に帯電した種に加えた電場が装置の複数のチャンネルを移行することにより生じる動電的偏り効果がないという利点がある。
【００３１】
圧力駆動流の特徴とは対照的に、動電的駆動流、特に電気浸透駆動流は、流体の大部分が導管を同じ速度で移行する所では、“プラグ”流れプロファイルが生じ、外装層で少量の流体だけが低速で移動するか又は流速０に近づく（図１Ｂのプラグ流参照）。プラグ流は、分散水準を実質的に低下させて、導管内で別の材料領域を一層高分解能輸送すると共に、一層高分解能で種を解析できる。しかし、前述のように、動電的駆動流は、この方法で輸送される差別的に帯電した種を電気泳動的に分離又は偏らせることができる。多数の分析、例えば材料混合物の分離による電荷又は大きさに依存する分析には、電気泳動分離は有利である。しかし、分子の複雑な混合物の塊状移動による分析又は他の操作には、電気泳動偏りは、最適分析条件が少なくなり、及び／又はデータの翻訳が困難となる可能性がある。
【００３２】
分析操作では、所定の操作において、異なる箇所での異なる各流れプロファイルの利点及び欠点をそれぞれ最大化、最小化したいという状況が多数ある。本発明は、これを行う手段を提供する。
【００３３】
ＩＶ．混成流れプロファイル及び混成操作装置／システム
圧力流れプロファイル及び動電的流れプロファイルの異なる特徴にも拘わらず、幾つかの場合には、これらの異なる特徴から、単独の接続したチャンネルネットワークに両方の流れプロファイルを付与できることが望ましい。例えば同時係属ＰＣＴ出願公開Ｎｏ．ＷＯ ０２／１０７３２には、この目的は、一般に、高流れ抵抗性接続チャンネルを用いて、或る領域を他の領域から流れとして実質的に単離することにより達成されると記載されている。特にサンプル導入チャンネルに負圧を加えることにより、サンプルは、装置内に引き込まれる。サンプル材料の一部は、高流れ抵抗性接続チャンネルにより分離チャンネル中に注入される。高流れ抵抗性接続チャンネルを組み入れることにより、圧力駆動サンプル装填用チャンネルから動電的駆動分離チャンネルを効果的に脱結合（ｄｅｃｏｕｐｌｅ）することができる。前記システムの有用性にも拘わらず、一般に、これらの目的は、異なるチャンネルセグメントを、例えば高抵抗性チャンネルセグメントにより、互いに実質的に単離する必要もなく、一層簡単なチャンネルネットワーク内で達成することが望ましい。
【００３４】
高スループット選別操作の場合、動電的注入又は装填に起因するサンプル偏り効果を防止するため、サンプルプラグは、圧力駆動流を用いてサンプル導入チャンネルを通って装置中に引き込まれる。圧力駆動流は、これらのプラグを相互連絡したチャンネルネットワークを通って、真空の廃棄物リザーバーに向けて移動させるのにも使用される。多く利用するため、電場は、チャンネルネットワークの少なくとも一部にも加えて、例えば帯電差により異なる電気泳動移動度を有する種の電気泳動分離を行う。電場は、圧力駆動流の他、電気浸透流を作る。動電的流れは、最小分散のプラグ流れプロファイルを作るという利点を有するが、圧力による流れが存在すると、なおＴａｙｌｏｒ分散の負の効果を与える。したがって、操作、例えば薬剤化合物の高スループット選別を一層高い解析力で達成するには、圧力駆動流の分散的寄与を最小にしなければならない。この目的は、全ての圧力流の除去で達成できるが、高スループット操作の実用性、例えば材料の過度な電気泳動偏りなく、迅速な流れを求める要求には、材料流の少なくとも一部は、圧力系システムによる駆動を必要とすることが多い。
【００３５】
本発明は、一般に第一のチャンネルセグメントでは圧力駆動流を利用しながら、他の１つの接続したチャンネルセグメントでは実質的に動電的な駆動流を付与する混成方法及びシステムを提供する。ミクロ流動チャンネルネットワークの相互連絡性を考慮すると、２つの異なる種類の流れを１つの相互連絡したチャンネル構造中に一緒に組合わせるのは、各局面の制御を他方の制御から完全に分離することが困難なので、望ましくなかった。しかし、意外にも、本発明は、相互連絡したチャンネルネットワークの異なるセグメントが独立に制御可能な流れプロファイル、即ち、一方は圧力で駆動され、他方は動電的に駆動される流れプロファイルを有する相互連絡したチャンネルネットワークを供給する方法及びシステムを提供する。更に本発明は、このように独立に制御された流れプロファイルを巧みに操作して、選択された帯電種の流れを混合物から別のチャンネルセグメント中に誘導し、これにより該選択された帯電種を混合物の中から抽出する装置を提供する。
【００３６】
本発明の方法及び装置は、全操作の一部の操作での圧力による流れの利点及び全操作の他の一部の操作での動電的流れの利点を利用することが望ましい場合、流体又は他の材料の輸送に特に有用である。一例として、本発明の混成システムは、装置のチャンネルに迅速な材料導入を必要とするが、放物線又は圧力による流れ条件下で行うと、分散の増大が生じる可能性がある長時間の分離、反応又は加温を要する分析を行うのに特に有用である。
【００３７】
多くの薬剤目標物選別アッセイでは、ミクロ流動反応での通常の時間−フレーム（ｆｒａｍｅ）が非常に遅いので、満足な検出及び分析に十分な生成物を生じないほど、反応動力学は非常に遅い。特にミクロ流動システム、例えばＵＳＰ ５，９４２，４４３；同６，０４６，０５６；同６，２６７，８５８（これらの各文献は、あらゆる目的のため、全体をここに援用した）に記載の連続流選別システム、反応剤、例えば目標物及び基質、又は配位子等は、反応チャンネル内に入れて流通させ、検出窓を過ぎ、この点で反応生成物が観察される。定期的にテスト化合物、例えば薬剤候補ライブラリー中の候補化合物を流れに導入し、これら化合物の反応への影響を観察する。反応時間量を増大させるため、所定長さのチャンネル中の流速を低下させるか、或いは所定流速下でチャンネルの長さを大きくする。いずれにしても、流れが圧力駆動の場合、移動（ｔｒａｎｓｉｔ）時間量に関連する実質的な分散を生じる可能性がある。分散が増大すると、連続的に導入したテスト化合物プラグ間の間隔を更に大きくする必要があるので、システムのスループットは低下する。
【００３８】
テスト化合物を含む反応混合物を圧力による流れから動電的流れに移行させることにより、テスト化合物プラグの分散を顕著に増大させることなく、動電的流れ条件下で反応時間を一層長くしたチャンネルネットワークを設計することにより、反応時間は実質的に増大できる。詳しくは、Ｔａｙｌｏｒ−Ａｒｉｓ分散は、もはやテスト化合物プラグの広がり要因ではなく、分子拡散が残るだけである。
【００３９】
この混成システムは、例えば分離すべき材料を導入する際、又は分離した種をチャンネルネットワークの検出領域に移動する際、電気泳動分離工程の前後で材料の迅速な移動を必要とする操作にも有用である。特にサンプル材料は、圧力によりチャンネルネットワーク中に導入し、次いで、分離する種に圧力による影響なく、かつ完全に別のチャンネル構造を必要とすることなく、材料のアリコートを別の電気泳動分離チャンネルに注入することができる（例えばＰＣＴ出願公開ＷＯ ０２／１０７３２参照、この文献はあらゆる目的のため、全体をここに援用した）。同様に、検出前に圧力流れ条件下で後電気泳動分離操作を行うことができる。
【００４０】
一例として、通常、材料を圧力による流れ下に分離導管中に導入する際は、この圧力流は、流れる材料に対し電場を加えている間、続ける。この圧力流のため、加えた電場下で電気泳動的に分離されている種束（ｓｐｅｃｉｅｓ ｂａｎｄｓ）を含む、導管中を移動する材料は、分離操作の解析力を低下させる可能性があるＴａｙｌｏｒ−Ａｒｉｓ分散を受ける。この分散を最小にするため、一層高圧下で材料を更に速くチャンネル内を移動させ、滞留時間を低下させるようにすることができる。不幸にも、この方法は、分離時間の減少により、分離の解析力を低下させる。或いは、サンプルを一層低速かつ低圧で移動させ、分離時間を増大させることができるが、この方法は、放物線流れ条件下では対流時間が増大するという逆の結果を生じる上、Ｔａｙｌｏｒ−Ａｒｉｓ分散が増大する。いずれの例でも、一方のパラメーターを変えることにより得られた利益は、他方のパラメーターの犠牲により、実質的に失われる。圧力系と動電的流れプロファイルとを脱結合することにより、本発明により包含されるように、例えば注入のための圧力系流れを増大させて、滞留時間を減少させることができる。更に、この圧力流れは、動電的に駆動した流れ領域又はチャンネルに結合していないので、材料を分離できる時間の長さに影響を与えない。同様に、分離される材料は、いかなる圧力流れによっても駆動されないので、分散の増大を生じることなく、分離時間を延長することができる。
【００４１】
前述のように、後分離方法は、ここで説明したように構成したシステムでも任意に行われる。例えば電気泳動的に分離した蛋白質は、相対分離を変えることなく、抗体で標識できる。これは、蛋白質の電気泳動分離後に標識が起こるからである。動電的駆動の移動下で行った場合、抗体標識は、実質的に蛋白質の電気泳動移動度を変えることができ、これにより分離を大きく無効にしない。抗体標識について説明したが、この方法は、例えば大きさ、電荷又は配座による変性分子の移動度を変える、いかなる後分離改変に対しても特に有益であることが理解されよう。
【００４２】
簡単に討議するため、チャンネルネットワークに材料を圧力により迅速に導入し、次いで材料を動電的に移動させるという点から混成システムを一般的に説明する。しかし、これら混成システムの異なる流れプロファイルは、いずれの順序、例えば圧力の次に動電が続き、又は動電の次に圧力が続いても、或いは異なる流れプロファイル、例えば圧力／動電／圧力を有する３つ以上の領域で生じてよいことは理解されよう。更に、異なるチャンネルセグメントは、例えば主として圧力駆動流れプロファイルから主として動電的駆動流れプロファイルに変えるか、或いはその比率を実質的に逆に変更するなど、単に、他の連結したチャンネルセグメントに比べて、圧力による流れと動電的駆動流との比を考慮して調節するだけでよいことは理解されよう。
【００４３】
一例のチャンネルネットワークを図２に示す。図示のように、ネットワーク２００は、第一及び第二端部を有する第一チャンネルセグメント２０２を有し、該第一チャンネルセグメントは、第一及び第二端部を有する第二チャンネルセグメント２０４と第一流動接続部２０６で連結している。ここでは“端部”と言ったが、チャンネルセグメントの端部は、若干、任意的であり、また任意的であってもよいが、チャンネルの実際の終点を必要としないことは理解されよう。こうしてチャンネルセグメント端部は、１つのチャンネルセグメントから他の１つのチャンネルセグメントまでの遷移部分（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を含むことができる。これらのチャンネルセグメントは、共直線的であり得るし、及び／又は、さもなければ等質であり得る。第三チャンネルセグメント２０８も一端部で流動接続部２０６と接続している。第三チャンネルセグメント２０８は、中間接点（ｔａｐ−ｏｆｆ）への通路を供給するか、或いは圧力又は動電的力を第一及び第二チャンセグメントに加えるためのアクセスチャンネルとして機能する。
【００４４】
操作時、第一チャンネルセグメント２０２の第一端部とアクセスチャンネル２０８間に（実線で示すように）圧力差を加える。第二チャンネル２０４の第二端部とアクセスチャンネル２０８間に電気システム２１８により電圧勾配を加え、圧力駆動流で生じる第一チャンネルセグメント２０２からアクセスチャンネル２０８に入る流れに、少なくとも或る程度逆らうアクセスチャンネル２０８からの流れを生じる。幾つかの場合、動電的流れは、例えばチャンネル２０８に逆流するチャンネル２０４内のいかなる流体力学流にも完全に逆らう。或いは、このチャンネル内のいかなる流体力学流に逆らわせるため、チャンネルセグメント２０４の端部に追加の圧力又は真空源を加えてもよい。特定の好ましい局面では、アクセスチャンネル２０８からの動電的駆動流は、第一チャンネルを移行する材料を、例えばアクセスチャンネル２０８中に移動することなく、接続部２０６を通って第二チャンネルセグメント２０４内に確実に円滑に移動させると共に、第二チャンネルセグメント２０４中の流体に対し、圧力差による影響を確実に受けさせないため、例えばチャンネルセグメント２０２からアクセスチャンネル２０８に入る圧力駆動流にほぼ完全に逆らうように調節される。前述のように、この調節は、任意に又は更にチャンネルセグメント２０４に正又は負の圧力を加えることにより行われる。
【００４５】
チャンネルセグメント２０８及び２０４を通る動電的流れの速度は、チャンネル内に配置された特定流体におけるチャンネル表面上の電荷水準とチャンネルに加えた電場水準の両方により指令される。所定流体での表面電荷は、表面のゼータ電位とも呼ばれる。前述のように、チャンネルネットワークにおける電気浸透流の水準は、圧力による流れの水準を相殺する（ｃａｎｃｅｌ ｏｕｔ）するように構成できる。或いは、チャンネルセグメント２０２からチャンネルセグメント２０４に１つ以上の異なる種を移送するため、電気泳動に依存しながら、電気浸透流を減少できる。電気浸透流の減少は、低ゼータ電位を持つようにチャンネル及び／又は流体材料を選択するか、或いはコーティング用ポリマー等のような表面改質剤をチャンネル中に取り込むことにより達成できる。低ＥＯ流チャンネル組立用の各種の異なる材料は、ＵＳＰ ５，８８５，４７０、同６，１５６，１８１及び同６，２３８，５３８に記載されている。これらの各文献は、あらゆる目的のため、全体をここに援用した。一方、各種の異なる表面改質用ポリマー溶液は、ＵＳＰ ５，９４８，２２７及び同６，０４２，７１０に記載されている。これらの各文献は、あらゆる目的のため、全体をここに援用した。
【００４６】
図３に第一及び第二チャンネルセグメント２０２、２０３の各流れプロファイルを各々概略的に示す。図示のように、第一チャンネルセグメント２０２では、圧力駆動流は、放物線流れを生じ、一方、第二チャンネルセグメント２０４の動電的流れは、プラグ流を生じる。アクセスチャンネル２０８は、該チャンネル２０８内の圧力流及び外の動電的流れが正味０の流速になると仮定すると、正味の流れなしで示される。
【００４７】
流動可能に接続したチャンネル中で圧力及び／又は動電的流れの水準を別々に制御する能力には、相互連絡したチャンネル中での動電的流れプロファイルと圧力駆動流れプロファイルとの完全な分離から、相互連絡したチャンネル内の動電的駆動流と圧力駆動流との相対比の適度な変化に亘る広範な各種の異なる用途がある。
【００４８】
本発明のシステム及び方法の利用例としては、長い分離時間を必要とする分析による分離、例えば最小限に異なる種の分離、分離された種の電気泳動移動度に影響を与える後分離反応、又は材料が電気泳動的に容易に偏る材料、例えば材料中の異なる種の間で広範に変化する電荷を有する材料を含まない場合、長い距離に亘る材料の移動が挙げられる。
【００４９】
本発明により特に利益を受けるシステムの一例は、連続入力ミクロ流動高スループット薬剤選別システム、特に移動度シフトによる検出計画を行う選別システムである。要約すると、これらのシステムは、薬剤テスト化合物の別々のプラグを標的反応剤の流動流中に連続的に導入して、これら反応剤との相互作用に対するテスト化合物の効果（あれば）を決定する。通常、反応剤としては、酵素基質対、受容体配位子対又はその他の相補的結合対、又は細胞等が挙げられる（例えばＵＳＰ ６，０４６，０５６参照）。異なるテスト化合物は、システムの複数のチャンネルを流通するので、これらテスト化合物間で間隔を維持することにより、効果の同定及び効果と特定テスト化合物との相関関係は、通常、促進される。特定反応の場合、反応の進行の唯一の徴候は、標識した反応剤によっても、標識反応剤の電荷水準の変化である。標識反応剤は、その電気泳動移動度に変化を生じる。このような反応例としては、ホスフェート基の付加及び除去により、生成物に比べて基質の電荷を変化させるホスファターゼ及びキナーゼ反応が挙げられる。他の多数の反応は、この配置構成に適合するか、或いはこの配置構成に適合するように容易に構成され、例えばプロテアーゼアッセイ、非帯電標識の同族体、即ち、ＰＮＡを用いた核酸アッセイ等がある。
【００５０】
同様に、長い反応時間を要するシステムでは、長い流動時間と共に分散が増大するので、隣接して導入したプラグ間で分離を維持するのは、一層難しくなる。したがって、テスト化合物間の間隔を増大して、システムのスループット速度を低下させなければならない。しかし、反応剤及びテスト化合物の流動流を動電的又は電気浸透的流れプロファイルに遷移させることにより、これに応じて分散を増大させることなく、流れ時間を増大し、これにより隣接する入力テスト化合物プラグの間隔又はピッチを維持すると共に、スループットを保持することができる。
【００５１】
要するに、テスト化合物は、サンプリングシステム、例えばミクロ流動装置中に一体化したピペッターエレメントでシステムに真空を加えてテスト化合物に引き入れることにより、システム中に取り入れる。チップ中にサンプルプラグを引き入れる上記真空下では、反応成分、例えばチップ上に一体化され、異なるウエルから酵素及び基質を副チャンネル経由で主チャンネルに接続した酵素及び基質も引かれる。これらの試薬は主チャンネル中で混合し、別の反応プラグ中の異なるサンプルプラグと混合される。所定の加温又は反応時間後、反応混合物プラグは、電場を加えた時だけ実質的に移動する場合、検出点を過ぎて移動するまで、本発明による動電的流れプロファイルに遷移させてもよい。伝場を加えると、Ｔａｙｌｏｒ分散により生じる解析力に伴う低下もなく、種の電気泳動分離が可能である。別の局面では、材料の検出又は他の特定の操作前に、材料を圧力による流れプロファイルに戻し遷移させてもよい。
【００５２】
ａ．流れプロファイル跳躍
移動度変化検出計画を利用した連続流アッセイフォーマットの一例を図４に概略的に示す。このアッセイフォーマットでは、アッセイ用試薬、例えば基質及び酵素、又は相補的結合パートナー、即ち、受容体／配位子又は核酸は、通常、反応中、電荷の変化を受ける、例えば標識された反応剤から帯電部分が付加されるか除去される標識反応剤を含む。一例として、通常のキナーゼアッセイでは、標識されたキナーゼ基質は、キナーゼ酵素と接触させる。このキナーゼ酵素は、基質に比べて生成物の電荷にかなりの変化を生じる高帯電のホスフェート基を基質に付加する。この電荷差は、バックグラウンドの基質水準から生成物を分離するのに使用される。これらの試薬は、流動チャンネルと平行に連続的に流れ、これにより反応の定常状態水準は、連続的に反応し分離する試薬の結果である一定の信号を生じる。問題の反応の作動体を例えばスラッグ中の反応に導入すると、作動体は、定常状態の反応／分離を乱し、チャンネルから検出された信号水準に指示的変化又はサインを生じる。連続流移動度変化アッセイの概略は、ＵＳＰ ５，９４２，４４３、同６，０４６，０５６及び同６，２６７，８５８に記載されている。これら文献の全内容は、ここに援用した。
【００５３】
本発明と関連する図４を参照すると、一例のアッセイ装置４００は、第一チャンネルセグメント４０４と流動可能に連絡するサンプリングエレメント４０２、例えばミクロ流動装置に取付けたピペット用毛管を有する。第一チャンネルセグメント４０４は、第一流動接続部４０８で第二チャンネルセグメント４０６と連結している。第一流動接続部４０８には、第三チャンネルセグメント４１０も流動可能に連結している。これらの交差するチャンネルは、図１に示すような基本的制御構造を形成する。移動度変化による薬剤選別アッセイ用の操作では、アッセイ試薬は、それぞれリザーバー／試薬源４１６、４１８に連結した副チャンネル４１２、４１４からチャンネルセグメント４０４内に導入される。
【００５４】
再び図４を参照すると、テスト化合物４５０は、サンプリングエレメント４０２を通って流体スラッグとしてサンプリングされ、圧力駆動流下でチャンネルセグメント４０４中に移動する。チャンネルセグメント４０４では、テスト化合物４５０は、リザーバー４１６、４１８からの試薬と混合し、反応混合物スラッグ４５２中のこれら試薬と相互作用し、その結果、テスト化合物が、関連の反応の作動体、例えば禁止剤であれば、テスト化合物は、反応の水準を変える。前記キナーゼ反応の場合、禁止剤は、低帯電の生成物を生成させる。
【００５５】
関連の反応スラッグ（例えばテスト化合物を含有するスラッグ）は、第一流動接続部４０８中に移動すると、スラッグは、圧力駆動流から動電的駆動流に移行する。特に、チャンネル４０４から出る圧力駆動流の水準に合わせるため、チャンネルセグメント４０６中に移動する動電的流れ水準を調節することにより、チャンネルセグメント４０４から流動接続部４０８を経由してチャンネルセグメント４０６に至る材料の継ぎ目のないハンドオフ（ｈａｎｄ−ｏｆｆ）が保証できる。
【００５６】
いったん反応混合物がチャンネルセグメント４０６中に移動すると、混合物は、例えば電気制御システム４２０により動電的力を受け、この動電的力は、チャンネルセグメントを通る流体を直ちに移動させ、反応混合物中の差別的に帯電した種を、分離された種４５４として示すように、電気泳動的に分離する。このシステムは、連続流動システムなので、電気泳動分離は、定常状態では余目立たない。これは、例えば基質よりも速く移動する生成物は、単に遅い移動を追い越すだけで、所定の場所では、生成物及び基質の水準に正味の効果的変化が生じないからである。しかし、テスト化合物が、この定常状態の反応を乱す場合には、得られる生成物の水準を局部的に増大又は減少させる。定常状態に比べて増大した種、例えば生成物又は基質の電気泳動移動度により、テスト化合物を含む反応混合物スラッグの前又は後に検出可能な標識濃度を生じる。例えばテスト化合物が反応の禁止剤である場合、禁止剤のスラッグは、基質を局部的に増大させる。基質の生成物に対する電気泳動移動度の差により、例えば検出窓４５６での信号の増大又は減少のような、定常状態の標識に偏差が生じる。
【００５７】
任意の場合、チャンネル４１０の中からチャンネル４０６に入る動電的駆動流は、電気浸透流により多かれ少なかれ支配できる。特に、関連の種の電気泳動移動度が圧力流向流を克服するほど十分高いと、分散の水準が一層大きくなるが、一層低い電気浸透速度が使用できる。
【００５８】
同様に、高感度を要するアッセイを行なう場合、生成物よりも低い電荷を有する基質をチャンネルセグメント４０４からセグメント４１０中に優先的にサイホン吸引し、これによりチャンネル４０６への流入を防止するように、異なる流れの水準を調節できる。一方、生成物の電荷及び電気泳動移動度を高くすると、生成物を優先的にチャンネルセグメント４０６に移行させ、ここで標識した基質バックグラウンドの不存在下に生成物を検出し、これによりアッセイの感度を向上できる。例えば２００１年７月３１日出願の同時係属ＵＳ特許出願Ｎｏ．６０／３０９，１１３参照。この文献は、あらゆる目的のため、全体をここに援用した。上記方法は、低速動力学による酵素反応等を使用するアッセイに特に有用である。
【００５９】
ｂ．選択的イオン抽出
本発明装置は、加えた圧力又は電場の制御、或いは加えた圧力、電場の両方の制御で差別的に帯電した種の流れプロファイルを管理することにより、サンプル混合物からこれら各種の種を分離するのにも有用である。多数の圧力及び電圧源を備えた流体制御システムを用いると、ミクロ流動チャンネルネットワークのいずれの部分での流体力学流及び電場も所望値に設定できるように、装置のいずれの所定チャンネルセグメントでの圧力及び／又は電圧も制御できる。本発明は、２つの異なる流れプロファイル、即ち、圧力による及び動電的駆動のプロファイルを重複させ、同時に各流れプロファイル下で、流速を制御して、この流体中に、流体で運ばれたサンプル中に含まれる差別的に帯電した種を容易に分離及び単離するのに十分な量まで含有する所定種について正味速度を得ることにより、チャンネルネットワークの異なるセグメント中の流体流を独立に制御する装置を提供する。こうして、以下に説明するＴ−交差点のようなチャンネル交差点に送られた、異なる電気泳動移動度を有する２つ以上のサンプル種の混合物（例えば中性基質及び以下の実施例１で説明するような酵素反応の負帯電生成物）は、サンプル種の異なる電気泳動移動度に基づいて、交差点の別々のチャンネル内の分離成分に完全に分離できる。
【００６０】
特に、所定種の分離は、圧力駆動又は流体力学流の速度を動電的速度と釣合せてその流れを所定の方向に向け、これにより第一の電気泳動移動度を持った種を分離して装置の第一領域中に流入させながら、第二の電気泳動移動度を持った第二の種を装置の第二領域中に流入させることにより達成される。種の流体力学又は圧力駆動速度は、圧力で誘引された流れによる流速である。種の電気泳動速度は、加えた電場を掛けた電気泳動移動度（μｅｐ）である。所定チャンネルセグメントにおいて、圧力による流れと動電的流れとの重複を用いた実施態様では、このチャンネルセグメントで移行する種又は材料の正味速度は、水田津流の速度と動電的速度との総合計である。以下の例は、チャンネル領域における所定種の正味速度についての計算法を示す。
【００６１】
例えば種Ａに−１ｐｓｉの圧力を加えて流体力学流速度を０．１ｃｍ／ｓとし、２０００Ｖ／ｓの電場（Ｅ）で電気泳動移動度（μｅｐ）を１．４×１０−４ｃｍ２／Ｖ−ｓＶとし、流体力学流と同じ方向にした場合、種の正味流れは、次の通りである。
正味流れ＝流体力学流の速度＋〔電気泳動移動度（μｅｐ）×Ｅ〕
Ａの正味流れ＝０．１ｃｍ／ｓ＋０．２８ｃｍ／ｓ
Ａの正味流れ＝０．３８ｃｍ／ｓ
【００６２】
本発明は、相互連絡したチャンネルネットワークの各種チャンネルセグメントにおいて、加えた圧力及び加えた電場を制御して所定の種を分離することにより、多数の流体で運ばれた種の流速を巧みに操作できる。図７は、帯電した種をマルチポート（ｍｕｌｔｉｐｏｒｔ）圧力及び電圧制御により連続的に制御する酵素アッセイ用の装置及び操作を概略的に示す。装置７００は、サンプル源７０２に接続した第一端部と、廃棄物リザーバー７２８中で終わる第二端部とを有する主チャンネルを備える。主チャンネルは、チャンネルセグメント７０２、７０５、７０６を有する。副チャンネル７１４、７１６は、チャンネルセグメント７０２で主チャンネルと交差する。副チャンネル７０４は、チャンネルセグメント７０５で主チャンネルと交差し、リザーバー７２６内で終わる。操作中、例えば基質と酵素との相互作用の、流体で運ばれた禁止剤用のような一連のサンプルプラグは、リザーバー７２６（又はチャンネルシステム中のリザーバー７２８のような他のリザーバー）に負圧を加えることにより、サンプル源７２０、例えばピペット用毛管又はリザーバーを通って主チャンネル中に引き込まれる。副チャンネル７１４、７１６からチャンネルセグメント７０２中にアッセイ試薬を導入し、セグメント７０２内のサンプルと相互作用させて、差別的に帯電した種を含む混合物を形成する。例えばキナーゼ酵素アッセイのような酵素アッセイでは、アッセイ試薬は、酵素及び基質を含み、これらはテスト化合物の存在下で相互作用して、生成物、酵素及び基質を含む混合物を形成する。これにより、生成物及び基質は、異なる電荷、したがって異なる電気泳動移動度を有する。サンプルプラグのサンプリング及び主チャンネルへのアッセイ試薬の流れは、リザーバー７２６に負圧を加え、この圧力をリザーバー７２２、７２４、７２８で維持することにより達成される。チャンネルセグメント７０２の混合物に含まれる各異なる種の正味速度は、全てのリザーバーに加えた圧力の組合せにより誘引された流体力学速度に等しい。しかし、いったん流体混合物が接続部７０５に入ると、リザーバー７２６、７２８において加えた電圧勾配により作られた電場も受ける。電圧勾配は、チャンネルセグメント７０４、７０５、７０６において電場を作る。接続部７０５では、基質及び生成物分子の電気泳動移動度が同等でないため、分離を起こす生成物、基質の両方の正味速度に有限の差が生じる。分離された種は、リザーバー７２６に加えた圧力を調整することにより、ほぼ即座に更に別々に方向転換され、これにより、所定値未満の電気泳動移動度を有する種は、分離され、チャンネルセグメント７０６中に方向転換され、一方、所定値よりも大きい電気泳動移動度を有する種は全て、チャンネルセグメント７０４中に流入する。或いはリザーバー７２６に加えた電場は、所定値を超える電気泳動移動度を有する種が、分離され、一方、所定値未満の電気泳動移動度を有する種は全て、チャンネルセグメント７０６中に流入するように、調整される。
【００６３】
本発明の教示を一層良く理解するため、流動接続部７０５における差別的に帯電した種の分離について、以下、更に詳細に説明する。図示のように、Ｔ−交差点チャンネルネットワークは、共通の交差点又は流動接続部７０５で出会うセグメント７０２、７０４、７０６を有する。これらの各チャンネルセグメントは、流体出入口又はリザーバー、或いは前述のような、また図７Ａに示すような外部サンプリングエレメントに接続している。マルチポート圧力兼電圧制御器は、各チャンネルセグメントに接続した異なるリザーバー又は流体ポートで加えた圧力及び加えた電場を制御するのに使用される。明確化のため、各チャンネルセグメントに対し加える電圧及び圧力を言うために、下に小さく書いた表記を用いる。例えばV１及びＰ１は、チャンネルセグメント７０２に対し加えた電圧及び圧力を言い、V２及びＰ２は、チャンネルセグメント７０４に対し加えた電圧及び圧力を言う。個々のチャンネルセグメントに対し、独立に制御された圧力及び電圧を付与できるマルチポートモジュールを用いることにより、本発明のシステムは、各チャンネルセグメント内の流れパターンを制御し、これにより特定量を超えた電気泳動移動度（μｅｐ）を有する種は全て、一方向に流れ、また上記特定量未満の電気泳動移動度（μｅｐ）を有する種は全て、第二の方向に流れる。
【００６４】
更に図７のＢ、Ｃ、Ｄは、差別的に帯電した種７０８、７１０の流れに対するマルチポート圧力兼電圧制御の効果を示す。ここで特定の仮定を行う。例えば種７０８は、電荷が０（例えばＺ＝０）で、一方、種７１０は、高度に負帯電した（例えばＺ＝−２）ものと仮定する。これらの仮定は、簡易化及び明確化の目的で行ったが、選択的イオン抽出の原理は、複数の種が、差別的に帯電しているか、或いはこれらの種が同じ電荷を有するが、異なる質量を有する限り、混合物からいずれの種の分離にも利用できることに注目すべきである。異なる電荷は、正電荷対負電荷、高正電荷対低正電荷及び高負電荷対低負電荷を包含する。
【００６５】
更に、塊状流体の電気導電率は、Ｔ−交差チャンネルネットワーク中で均一であると予想される。また電気浸透流は、例えば前述のようなチャンネル壁上への表面電荷の堆積を抑えるように、チャンネル壁に適当な表面コーティングを付与することにより、最小にするか又は中和することが好ましい。しかし、本発明が電気浸透流条件下でも使用できることは、理解すべきである。これらの仮定下では、種７０８、７１０の圧力駆動流は、Ｐ１＝Ｐ、Ｐ２＝０、Ｐ３＝Ｐ／２と設定することにより確定される。この場合、各チャンネルセグメント７０２、７０４、７０６において対応する流速Ｑは、それぞれＱ１＝−Ｑ２、Ｑ３＝０である。換言すれば、チャンネルセグメント７０２を通ってチャンネルネットワークに入る流体は全て、チャンネルセグメント７０４を通って出るし、したがって両種７０８、７１０は、図７Ｂに示すように、チャンネルセグメント７０４に入る。同様に、電場は、例えばチャンネルセグメント７０４、７０６間にＶ２＝Ｖ、Ｖ３＝０、Ｖ１＝Ｖ／２を適用することにより確定できる。電圧Ｖ１は、リザーバー７２２、７２４のいずれか１つ、又はチャンネルセグメント７２０と流動可能に連結したリザーバー（又は毛管エレメント）にこの適当な電圧を加えることにより設定できる。交差点７０５に入ると、流体混合物は、Ｖ２、Ｖ３で作られた電圧勾配により電場を受ける。したがって、ここで流体種は、圧力誘引流と動電的流れとの組合せによる正味流れを経験する。換言すれば、種の平均流体力学速度（Ｖｐ）と平均電気泳動速度（Ｖｅｐ）との比に従って、この種は、チャンネルセグメント７０４又は７０６に完全に移送されるか、或いはチャンネルセグメント７０４、７０６間に分割できる。この説明は、各種チャンネルセグメントでの圧力設定の変化を参照して行ったが、この点で本発明を限定する意図がないことを理解すべきである。同様な分離を達成するため、電圧又は圧力或いは電圧、圧力の両方に変更を行うことは可能である。
【００６６】
本発明の非限定的教示の一例として、図７のＢ〜Ｄは、他のバラメーターを一定に維持しながら、副腕チャンネルセグメント７０４に加えた圧力を変化させた図７Ａに示すチャンネルネットワークのＴ−交差点の概略図である。チャンネルセグメント７０４に加えた圧力が極めて低い場合、図７Ｂに示すように、チャンネルセグメント７０６には逆の流体力学速度が確立する。この速度は、種７１０の正味速度が流体力学速度で支配されて、チャンネルセグメント７０４に入る種７１０の流れを生じるように、帯電種の電気泳動速度よりも大きい。種７０８は、Ｚ＝０の正味電荷を有し、したがって正味速度は、チャンネルセグメント７０４中にも流入させる流体力学速度に等しいと予想される。したがって、両種７０８、７１０はチャンネルセグメント７０４中に流入し、チャンネルセグメント７０６沿いに設けた検出窓では種は殆ど又は全く検出されない。
【００６７】
Ｐ２を徐々にＰ３に向けて増大させると、電気泳動速度は一定に保持しながら、流動接続部７０５及び次にチャンネルセグメント７０６における流体力学速度は低下する。特定の圧力設定では、帯電種７１０の電気泳動速度は、正味速度が、帯電種をチャンネルセグメント７０４中に流入させる電気泳動速度により支配されるように、流動接続部７０５における流体力学速度を超え、一方、非帯電（又は低帯電）の種７０８は、図７Ｃに示すように、チャンネルセグメント７０４中に流入し続ける。図７Ｂ及び図７Ｃに示した流れパターン間の遷移のための正確な圧力設定は、前述のように、流体力学速度と電気泳動速度との合計である各々の種の正味速度に依存し、これにより最高電気泳動移動度を持った種は、まずチャンネルセグメント７０６中に抽出される。
【００６８】
“分離窓”は、副腕チャンネルセグメント７０４に対する圧力が変化し、これにより高帯電の種７１０が検出チャンネルセグメント７０６中に抽出される際に作られ、一方、低帯電の種７０８、したがって低電気泳動移動度は副腕７０４中に流入し続けることに注目すべきである。副チャンネルセグメント７０４への圧力Ｐ２が更に増大すると、流体力学流は、このチャンネルセグメント中で向きを逆転し、また両種７０８、７１０が、図７Ｄに示すように、チャンネルセグメント７０６中に流入するように、流動接続部７０５及びチャンネルセグメント７０６には、正味の前進圧力駆動速度が作られる。
【００６９】
この流体分割技術の原理は、１つ以上の種が帯電するか（単一種について）又は差別的に帯電する（２つ以上の種について）限り、或いは２つ以上の種が同じ電荷を有するが、異なる質量を有する限り、混合物から１つ以上の種を分離又は抽出するために利用できることに注目すべきである。例えば本発明の教示は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその他の帯電ポリマー等の帯電分子のようなサンプル溶液中の単独の帯電種を抽出する（例えば濃縮する）のに使用できる。このような帯電分子は、例えばＴ−チャンネル交差点の一チャンネルセグメント中に抽出（したがって濃縮）でき、次いでここで、例えば更に分析及び／又は検出のために流し、或いはこの装置中で更に濃縮できる。
【００７０】
本発明の教示は、特にペプチド、蛋白質、ヌクレイン酸（例えば、ＤＮＡ或いは、ＲＮＡ）及び多糖類のような帯電した生体分子を含む、帯電した合成ポリマー及び以後の分析等、即ち癌スクリーニングに於いて発生する稀な分子の事象の為のプローブＤＮＡも又同様に、電気泳動技術によって典型的に分離されて抽出し及び、前濃縮している複数のサンプルの為に役立つものである。例えば、２００２年１２月２０日に出願した「ミクロ流動装置に於けるＤＮＡの単一分子増幅と検出」というアメリカ合衆国優先権番号６０／４３６，０９８号の共同特許出願により十分に開示されており、ここに参照されたことによって組み込まれている全含有物の単一分子増幅は、一つのサンプルに於いて、例えば病原診断（例えば、癌診断）、病原体の検出、稀に環境ヌクレイン酸の検出等、稀にヌクレイン酸の利点である検出及び統計的な特徴の為に使用されるはずである。例えば、多くの個体増幅反応は、例えば反応混合物に於けるヌクレイン酸の利点が同定されるまで、各々の反応混合物の殆ど、稀にヌクレイン酸の利点（例えば１で）はなく、或いは稀にヌクレイン酸の利点の複製もなく、稀にヌクレイン酸の利点からなる一つのサンプルから誘導されてきた反応混合物上で機能されるはずである。
そのような応用に於いて、ミュータントＤＮＡ分子への自然タイプの割合については、１００：１となるように期待されている。稀な事象を算出する為、遺伝子タイプシステム（ａ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を使用する際には、該システムの処理量を増加させるのに出来る限り、迅速に外部のミクロ滴定濃度プレート（或いは、他の外部のサンプル・ソース）から吸収されてきた一ＤＮＡサンプルを処理するのが望ましい。
【００７１】
高処理量ミクロ流動システムに於けるこうして組み入れられた、高処理量増幅システムは、例えば該ヌクレイン酸の利点が検出されるまで、多くの低複製数増幅反応を機能する事によって、そして／或いは、依存可能で統計的な有利な点が機能されているヌクレイン酸の利点の十分な複製を検出されるまで、分析される一サンプルに於いて実際極めて低濃縮にあるヌクレイン酸の利点を検出するのに有用とされるこうした方法を機能することが特に良く適用されている。稀にヌクレイン酸を検出するのに有用とされる統合されたミクロ流動遺伝子タイプ・システムの一例として、例えば、２００２年４月１１日に出願した「高処理量遺伝子分析の為のシステム及び方法」というアメリカ合衆国優先権番号１０／１２３，１００号の共同特許出願に記述されており、ここの全ての含有物は、ここに参照されているように組み込まれている。該システムは、試薬アッセンブリー、ヌクレイン酸増幅、そして該’１００アプリケーションの図面第７図及び第８図に図示されているように一つのミクロ流動チップ上に遺伝子を全て読み出す事を統合しています。該チップ上に置かれるＰＣＲに必要な該試薬、そして試験されるべき該ヌクレイン酸（例えば、ＤＮＡ）複数のサンプルは、一つのミクロ滴定濃度プレートから該チップに存在している。該チップは、それに添付されるよう細孔を持ち、緩衝器を交互にする（例えば、自然タイプ及びミュータントＤＮＡの何れをも含んでいる）該ヌクレイン酸の複数サンプルは、該細孔を通じてチップ上にもたらされるのである。ヌクレイン酸の複数サンプル、ポリメラーゼ、そしてプライマー（ｐｒｉｍｅｒｓ）及びプローブ（ｐｒｏｂｅｓ）のような他のＰＣＲ試薬は、メイン・ミクロ流動チャンネルに吸引、圧力、電気浸透或いは、電気連動性流出等により引き寄せられ、そして全ての構成成分を該メイン・チャンネルに流入後、最初の２〜３秒で混合します。これらは、電気の流れの応用によって熱せられたチップ上に於いて、鉄の痕跡を持つ反応部分或いは、チャンネルにそれから移動します。反応チャンネルを通じて反応混合プラグが動くので、反応チャンネルはＤＮＡのようなサンプルに於いてヌクレイン酸を増幅し熱せられ、そして冷却される。チップの複数のチャンネルが、形成されそして、各々のサンプルが特殊な数の増幅サイクルを経験出来るように、流動制御システム（例えば、吸引）が駆動する。増幅によって発生したフッ素の臭気信号は、サンプルにヌクレイン酸分子を検出する為に流動小径の末端にて検出される。
【００７２】
本発明の教示は、ユニット時間（ｕｎｉｔ ｔｉｍｅ）につき遺伝子タイプシステムに於いて、ミクロ滴定濃度プレートに一或いは、それ以上帯電した構成成分を含んでいる一つのサンプルの大きな容積を処理する手段として使用されるのである。’１００アプリケーションと、通常上記に記述した例えば、熱した（熱サイクル化した）反応チャンネルは、およそ４０ｍｍの長さを持つ記述されたチップのチャンネル内に機能された増幅サイクルの望ましい数に基づいて、計算されており、修正を行った長さである。典型的なミクロ流動チャンネル外形にとって、（例えば、およそ２００ミクロン以下のチャンネルの幅、そして／或いは深さを持つチップ、例えばおよそ１００ミクロン以下のもの）これは、熱せられた反応チャンネルを通じて、割合に低流動レートへ置き換えている。相対的に大きなオリジナルＤＮＡサンプル容積に含まれていた単に、２〜３の稀なミュータント分子があるならば、（例えばおよそ５つのミクロ滴定濃度の注文に於いて）ミクロ滴定濃度プレートの床に配列させ、それからこれらの複数の分子に接することは、とても長い時間を費やすことになる。
【００７３】
‘１００アプリケーションに記述されていた遺伝子タイププラットホームにとって、例えば（ＤＮＡのような）サンプル内に一つ、或いは多くの帯電種の抽出及び前濃縮は、サンプルが熱せられた反応チャンネルに流入する前に継続的な流れの下で発生しており、ミクロ流動チップ配置は、前端抽出及び前濃縮として使用される図１５及び図１６に図示されている。図１５に図示されているように、疾病のＤＮＡサンプル（或いは帯電した複数の分子を含んでいる如何なるサンプル）は、相対的に低電気伝導率を持ちながら低イオン強力バッファーに於いて、
（商業的に入手する事が可能な従来型９６，３８４，或いは１５３６床プレートとして）ミクロ滴定濃度プレート１２００の一つ、或いは多くの床に位置している。複数のサンプルは、大きな圧力駆動流れが、チャンネルセグメント１２０２，１２０８，そして１２１０に沿って、そしてリザーバ１２０４方向というようにリザーバ１２０４へ吸引を適用する事によって相対的に高い流れの割合（例えば、約３Ｎｌ／ｓ）で細孔１２０２を通じて吸収されている。二次元チップの配置の為に細孔１２０２は、サンプルが置かれているリザーバの中にサンプルを置き換える事が出来、そしてそれからリザーバ１２０４に適用された吸引は、チャンネルネットワークに流れるようにサンプルリザーバ内にサンプルを生じさせる事が示されている。同時に、大体低い正の圧力或いは、吸引は、反応チャンネル内の圧力流れを作動するように反応チャンネル１２１６に流動的に一対となった装置の一つ、或いは多くのリザーバに応用されるはずである。例えば、以下に記述されているように、かすかな正の圧力は、連続的な流れの状態の下では反応チャンネル内で発生する熱循環運動（例えば、ＰＣＲによる）にとって十分である反応チャンネル１２１６を通じて正の圧力流れを立てるようリザーバ１２０６（そして、反応チャンネル１２１６の下流にある図示されていないリザーバにかすかな吸引が適用され）に応用されるはずである。かくして、図１６Ａに記されているように適用された圧力そして／或いは、吸引（そして、さまざまなチャンネルセグメントの範囲）に基づいて、チップのさまざまなチャンネルセグメントの各々に、圧力駆動速度（Ｖp）が確立されるはずである。即ち、圧力駆動速度とは、装置の反応チャンネル領域にある（例えば、反応チャンネル１２１６内の一秒間に約０．４ｍｍ）よりも装置の前端にある（例えば、チャンネルセグメント１２０８内の一秒間に約３．２ｍｍ）ようにかなり高い水準にあるのである。例えば、適用された圧力そして／或いは吸引は、チャンネルセグメント１２０８内の全流れの割合が、チャンネルセグメント１２１６内の流れの割合の約二倍であり、例えば、チャンネルセグメント１２１６内の流れの割合の約五倍であり、例えば、チャンネルセグメント１２１６内の流れの割合の約十倍かそれ以上であるようにチャンネルの次元が選択され、確立されるはずである。
【００７４】
イオン抽出の選択性は、それからサンプルの他のコンテンツから帯電したＤＮＡを抽出するのに使用される。図１６Ｂに示されているように、電気分野ではＤＮＡの電気泳動速度（Ｖep）が、圧力駆動速度よりも大きいと仮定した場合、サンプル内のＤＮＡを以下のリザーバ１２０４方向へ、かなりの圧力駆動流れ小径から妨げる為に、リザーバ１２０４及び１２０６との間に応用されるのである。
換言すれば、リザーバ１２０４及び１２０６との間で適用された電気分野ではサンプル内の帯電したＤＮＡは、全ての種が電気泳動の可動性を以下の与えられた数値によって、チャンネルセグメント１２１０に流れながら、チャンネルセグメント１２１２に分離され、そして監理されるよう調整されるはずである。かくして、例えば電気分野でリザーバ１２０４及び１２０６の間に確立されたもの、つまりサンプル内の帯電したＤＮＡ電気泳動速度（Ｖep）は、チャンネルセグメント１２１０に於いて一秒間に約４．２ｍｍのようであり、（図１６Ａに示されている一秒間に約３．１ｍｍの圧力駆動速度より優れている）こうして、図１６Ｃに示されているように強いてＤＮＡをチャンネルセグメント１２１２に入れる事により一秒間に約１．１ｍｍもの総合的な全速度（ＶT）を産み出している。
ＤＮＡの電気泳動の可動性は、おおよそサイズの機能（例えば、ベース・ペアーの数）としての連続性であり、自由な区域である為に多種なＤＮＡサイズを含む疾病のサンプルの異質性にも拘わらず、選択的なイオン抽出プロセスのとても
素晴らしい調節を提供する必要はないのである。
【００７５】
チャンネルセグメント１２１２内に抽出されたＤＮＡを濃縮する為に、床１２０６内の流体は、高度な塩バッファーにあって（例えば、その高度なイオン強さに基づく比較的高度な電気伝導性を持ち）二つの目的を供給する。第一には、ボルトの低下及びしかもチャンネルセグメント１２１４に於ける電気分野を最小にすることであり、そして第二にはチャンネル交差１２１５で発生する分野で増幅された積み重ねにとっての高度な塩／低度な塩の境界を確立することである。床１２０６からの高度な塩の流体のかすかな正圧の流れ（例えば、図１６Ａに示されているようにチャンネルセグメント１２１４内に一秒間に約０．３ｍｍのようである圧力駆動速度を産み出している。）は、チャンネル交差１２１５で発生する積み重ねにとって高度な塩／低度な塩の境界が必要とされ、そして更にはＤＮＡをチャンネルセグメント１２１４へ導入するのを妨げている事が持続し、構想されている。こうして、サンプル内のＤＮＡはチャンネル交差での高度な塩／低度な塩の境界の実在によってチャンネル交差１２１５に積み重ねられるのである。
そして、以後処理及び／或いは検出（例えば、癌スクリーニングの目的の為に稀にヌクレイン酸分子の検出）の為に増幅されるチャンネルセクション１２１６に継続的な流れの下に相対的に高度な濃縮にて流れているのである。
【００７６】
かくして、図１５のチャンネル配置は、本質的には反応チャンネル１２１６に於けるそれから圧力駆動流れを細孔１２０２に上げ、分断することである。総合的な流れの確率（或いは速度、さまざまなチャンネルセグメントが、全く同じか、或いは部分的に同じ横断する次元を持っていると仮定した場合）の割合を細孔１２０２にまで上げ、ＤＮＡの全てが選択的なイオン抽出ステップの間に抽出されていると仮定した場合、将来発生するであろう前濃縮の量である熱を帯びたチャンネル領域１２１６に送り込む流れの率（或いは速度）を表示するものである。
総合的な流れの確率（或いは速度、さまざまなチャンネルセグメントが、全く同じか、或いは部分的に同じ横断する次元を持っていると仮定した場合）の割合を細孔１２０２にまで上げ、前濃縮の量である熱を帯びたチャンネル領域１２１６に送り込む流れの率（或いは速度）を好ましくは約二のようであり、例えば約五、例えば約十或いは、それ以上である。例えばもし、流体の３Ｎｌ／ｓが、細孔１２０２を通じて処理されており、一秒間に約０．４ｍｍの熱せられたチャンネル領域の丁度前に全種の速度とを比較してみた処、１２０８が一秒間に約３．２ｍｍである（図１６Ｃに示されている）事を通じて種の全速度（ＶT）にあり、
それから、種の保存がＤＮＡの濃縮（チャンネル領域１２０８及び１２１６が、全く同じチャンネルを横断する次元にあると仮定した場合）におおよそ８つのフォールド（ｆｏｌｄ）を必要とする。もし、チャンネル領域１２０８及び１２１６が、全く同じチャンネルを横断する次元にない場合、それから、こうしたチャンネル領域を通じた流れの率は、チャンネル領域の間で濃縮要素を正確に予言する事を比較される必要があるであろう。図１７は、図１５に示されているような同様のチャンネル配置を使用するＤＮＡのおおよそ７個から８個にフォールド（ｆｏｌｄ）積み重ねて示されたエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。上記で記されているように、本発明の方法によって、濃縮され、抽出された複数のサンプルは、典型的には電気泳動技術によって分離され、こうしたものを含んでおり、帯電した合成ポリマーと同様にペプチド、蛋白質、ヌクレイン酸、そして多糖類のような帯電した生体分子をも含んでいる。
【００７７】
本発明の教示は、２つ（又はそれ以上）の差別的に帯電した、いかなる種も互いに分離及び単離するのにも使用でき、また例えば生成物が基質とは異なる電荷を持つ場合、基質及び生成物を互いに分離するという特定の利用可能性を与える。基質としては、一般に、例えば特異的結合対、即ち、抗体／抗原対、受容体／配位子対、相補的核酸又はそれらの同族体、結合性蛋白質及びそれらの結合性部位、の一部材が挙げられる。或いは、又は更に、該基質は、関連の反応、例えば基質の化学構造への付加、該構造からの減少（ｓｕｂｔｒａｃｔｏｎ）又は該構造の変更により改質した基質を含んでもよい。このような基質の幾つかの具体例としては、例えばホスホリル化可能部分、例えばセリン、スレオニン及びチロシンホスホリル化部位等を含むキナーゼ基質、ホスファターゼ酵素用ホスホリル化基質、アミノトランスフェラーゼ、カルボキキシルに転化されたアルコール（例えばグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼによる）に従属する（ｓｕｂｊｅｃｔ ｔｏ）アミノ又はケト含有基質や、スルファターゼ、ホスホリラーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ（例えばプロテアーゼ）及びオキシダーゼ等用の基質が挙げられる。
【００７８】
基質は、実施するアッセイの性質に従って、正又は負のいずれかに帯電していても、或いは中性であってもよい。基質は、装置の検出窓で検出できるように、検出可能な標識を含むことが好ましい。基質上の蛍光標識は、各種異なる蛍光標識性化合物のいずれからも選んでよい。一般にこのような蛍光標識性材料は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から市販されている。通常、フルオレッセン又はローダミン誘導体が特に好適である。これらの蛍光標識は、基質と、例えば周知のカップリング化学により共有結合している。標識用の基及び化学についての討議は、例えば国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ９８／００２３１参照。この文献は、ここに援用した。
【００７９】
いったん試薬と混合した基質は、一般に試薬と反応するか、相互作用するか、さもなければ会合するか、又は結合して、基質とは実質的に異なる電荷を有する蛍光生成物を生じる。基質と同様（ａｓ ｗｉｔｈ）、試薬は、特異的結合対の一部材、例えば基質に対し相補的な部材を任意に含有する。但し、この場合、結合対の２つの部材の混成物は、基質の電荷とは異なる電荷を有する。多くの場合、これは、試薬は帯電し、一方、基質は中性であるか、或いは基質は、単に中程度に帯電しているのに比べて、試薬は高度に帯電していることを意味する。或いは基質と試薬との会合により、構造変化が起こり、帯電生成物を生じるか、或いは基質に結着して帯電残留物をマスクする。
【００８０】
次に、流体流のマルチポート圧力及び電気制御を利用して、異なる移動度（例えば異なる電化及び／又は質量）を有するアナライトを分離、抽出する、前述の選択的イオン抽出に類似した他の新規な技術を図１２〜１４について説明する。本発明のこの実施態様では、ミクロ流動チャンネルネットワークは、数を減らした外部圧力源及び電圧源を利用することにより、例えば先に説明した実施態様と比べて、流体制御に必要な流体リザーバーの数を減らして分離を行うことにより、流動駆動力を配分して、流体サンプル中の差別的に帯電した種を分離するように、構成、寸法化される。この方法では、流体輸送に必要な過剰のハードウエアーは、最小化でき、またミクロ流動装置は、先に説明した設計に比べて少数の流体リザーバーで操作できる。
【００８１】
まず図１２Ａ及び図１２Ｂに示すように、ミクロ流動装置１０００は、２つの流体リザーバー、例えばサンプルリザーバー１００６（これはサンプル入口チャンネル１００７と流動可能に連結している）及び廃棄物リザーバー１００８に接続した少なくとも２つの平行なチャンネル１００２、１００４のネットワークを有する。これらのリザーバーは、次に圧力（又は真空）源及び電圧（又は電流）源（それぞれ参照文字Ｐ１／Ｐ２で示す）に各々操作可能に連結している。図１２Ａ、１２Ｂでは、便宜上、同じ長さの２つの平行なチャンネル１００２、１００４しか示さないが、ミクロ流動チャンネルネットワークは、以下に説明するように、特定のアッセイシステムの要件及び分離すべき種の数に従って、３つ以上のチャンネルでも、また各種長さのチャンネルでも、構成できることを理解すべきである。更に、これら２つのチャンネルは、図示のような平行の配置構成である必要はなく、互いにいかなる配置構成、例えばｙ形配置構成、チャンネル１００２、１００４を互いに相対して配置したチャンネル“Ｔ”配置構成等で配列でき、これらの配置構成で、種の分離に使用される２つ（又はそれ以上）のチャンネルは、同じ廃棄物リザーバーと流動可能に連結する必要はなく、個々にそれ自身のリザーバー又はチップ上のウエルに連結してもよい。
【００８２】
平行チャンネルネットワークの各チャンネル中で圧力駆動流と動電的駆動流との比を変えることにより、異なる電気泳動移動度又は速度を有するアナライトは、互いに分離、抽出できる。例えばサンプルリザーバー１００６に対し１つの圧力差及び電圧電位を加えると、サンプルリザーバー１００６の流体材料は、平行チャンネル１００２、１００４中に、これらチャンネルの流れ抵抗、及び次に例えばそれぞれのチャンネルの深さ、幅及び／又は長さに関連の比率で流入する。特に所定の電圧勾配に対する電気浸透的流体推進又は方向では、流速（量／時間）は、一般に、１０を超えるアスペクト比（幅：深さ）を有するチャンネルについては、チャンネルの深さと共に変化し、例えばチャンネルの単位長さ当りの電気抵抗は、このチャンネルの断面積（幅×深さ）に比例する。計算上の特定の小さい、取るに足らぬ誤差により、この一般的な比は、更に低いアスペクト比、例えば＞５のアスペクト比についても当てはまる。逆に、同じチャンネルについての流体力学抵抗は、チャンネルの深さの３乗に反比例する（例えばＲｈ＝ｄ３）。こうして、例えばチャンネル１００４の深さ“ｄ”がチャンネル１００２に比べて２倍であれば、チャンネル１００４の幅は、両チャンネル１００２、１００４で同じ電気抵抗を維持するため、半分となり得る。したがって、加える電場は同じであるが、圧力駆動流の量は変化させる平行なセットのチャンネルを作るのは可能である。例えば、図１２Ｂに示すように、チャンネル１００４の幅は７５μで、深さは１０μであり、一方、チャンネル１００２の幅は１５０μで、深さは５μである（図１２Ｂには寸法は引いていない）と仮定する。チャンネル１００２、１００４の断面積は、同じ（例えば７５０μ２）であるから、両チャンネル１００２、１００４は、同じ電気抵抗を有する。しかし、チャンネル１００２の流体力学抵抗は、チャンネル１００４よりも約８のファクター大きい（例えばＲｈ１００２／Ｒｈ１００４＝１０３／５３＝８）。このタイプの幾何学を用いて、以下に更に説明するように、２つ（又はそれ以上）の差別的に帯電した種を互いに分離することが可能である。
【００８３】
例えばサンプルリザーバー１００６から廃棄物リザーバー１００８までの圧力駆動流をＰ１＞Ｐ２に設定し、リザーバー１００６からリザーバー１００８に亘るチャンネル１００２、１００４中の電場をＶ１＞Ｖ２とする。この状況は、図１２Ｃに示すように、２つの差別的に帯電した種１０１０、１０１２を互いに分離するのに適当である。なお、図１２Ｃは、図１２Ａの平行チャンネル配置構成の拡大図である。ここでは、特定の仮定、例えば種１０１０は、電荷が０（例えばＺ＝０）であり、一方、種１０１２は、高度に負帯電している（例えばＺ＝−２）ものと仮定した。これらの仮定は、簡略化及び明確化の目的で行ったが、この流体分割技術は、１つ以上の種が、帯電しているか（単独の種について）又は差別的に帯電している（２つ以上の種について）限り、或いは２つ以上の種が同じ電荷を有するが、異なる質量を有する限り、混合物から１つ以上のいずれの種の分離にも利用できることに注目すべきである。異なる電荷は、正電荷対負電荷、高正電荷対低正電荷及び高負電荷対低負電荷を包含する。
【００８４】
負帯電の種１０１２の電気泳動速度が圧力駆動速度よりも実質的に大きければ、この帯電種１０１２の電気泳動速度は、実質的に圧力駆動速度を超えている上、加えた電場は、これら両チャンネルで同一なので、帯電種１０１２は、チャンネル１００２、１００４中にほぼ均等に駆動される。一方、他の中性の種１０１０は、実質的に圧力駆動流について行き、前記計算したチャンネル中の流体力学抵抗の比により、流体力学抵抗の低い深いチャンネル１００４中に実質的に駆動される（例えば中性種の全量の約８９％は、チャンネル１００４に入り、一方、全量の約１１％だけがチャンネル１００２に入る）。この簡略例では、分離効率は、完全ではないが、システム内で慎重に前記幾何学及び／又は加えた圧力及び／又は電圧を同調させることにより、分離効率は最大化できる。
【００８５】
装置１０００は、更に分析及び／又は検出を行うため、分離された種１０１０及び／又は１０１２の１つ以上を抽出、分離することが必要であるか、望ましい場合は、チャンネルセグメント１００２及び／又は１００４と流動可能に連結した１つ以上の副チャンネルを備えてもよい。また、チャンネルセグメント１００２、１００４の一方又は両方は、関連の分離した種を検出するため、検出システムと感知可能に連絡した検出窓を備えてもよい。検出システムは、蛍光分光分析法（レーザー誘引方法及び非レーザー方法）、紫外線分光分析法、電気化学的検出、熱的検出、キャパシタンスによる検出（ＰＣＴ出願公開Ｎｏ．ＷＯ ９９／３９１９０参照）、質量分光分析法による検出、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及び電子噴霧（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）（これは、材料を直接、毛管又はミクロ流動装置出口から受けるように、容易に構成できる）等、周知の各種検出方法によるものでよい。好ましい局面では、光学的検出方法、特に蛍光による検出方法が使用される。このような検出システムは、一般に検出すべき特定の蛍光種を励起させる適当な波長の光を与える励起光源を備える。この励起光は、次に、レンズ、フィルター（例えば波長及び／又は空間のフィルター）ビームスプリッター等を含む適当な光学系に通し、更に分離導管の半透明部分の所で例えば対物レンズに向ける。サンプル材料の蛍光種、成分又はフラクションが励起光を通過すると、これらは、蛍光を発する。次に、蛍光発光を集め、対物レンズ及び同じ又は代りの光学系に戻し、光センサー、例えば光ダイオード、光電子増倍管又はＣＣＤ等に送る。この装置は、ＵＳＰ Ｎｏ．６，１００，５３１（本発明と同じ譲渡人に譲渡された）に更に十分に記載されるような、装置本体構造中に一体化した１つ以上の光変化性光学エレメント（例えばレンズ又は光学フィルター）も備えてよい。この文献の全内容は、ここに援用した。このような一体化光学エレメント付き装置は、光学的検出計画に使用される光学的操作の少なくとも一部を行う。
【００８６】
このシステムの分離効率は、例えば図１４Ａ及び図１４Ｂに示す通り、分離が複数（例えば２以上）の段階で起こるように、複数の平行チャンネルネットワークを一緒に直列に連結することにより向上できる。図１４Ａに示すように、このチップ設計は、複数の平行チャンネルネットワーク、例えばチャンネルネットワーク１０２０、１０３０、１０４０を備えることができる。これらのチャンネルネットワークは、一緒に直列に連結して、カスケード型チャンネル配置構成を形成している。これらチャンネルの流体力学抵抗は、例えば２つの差別的に帯電した種が、多段で、したがって高い効率で互いに分離できるように、選択（例えばそれぞれの深さ及び幅（及び／又は長さ））、変化できる。これは、例えばチャンネル１０３４、１０４４は、チャンネル１０２４（このチャンネルが、例えば図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃと同様、チャンネル１０２２の半分の深さ及び２倍の幅を有する）と同じか又は類似の配置構成（例えば同じ又は類似の流体力学抵抗）を持ち、一方、チャンネル１０３２、１０４２が、チャンネル１０２２と同じか、類似の配置構成を持つように、チャンネル配置構成を設計することにより達成できる。
【００８７】
例えばチャンネルネットワーク１０２０のチャンネル１０１８中に導入したサンプルが帯電種１０１２及び中性種１０１０をほぼ等量含有する（例えば各々の種を約５０％）と考える。再び、負帯電種１０１２の電気泳動速度は、圧力駆動速度よりも実質的に大きいと仮定すると、帯電種１０１２は、チャンネル１０２２、１０２４中にほぼ均等に駆動され、こうしてチャンネル１０２２、１０２４は、ほぼ等量の帯電種１０１２を含有し、一方、チャンネル１０２４は、チャンネル１０２２に比べて、中性種１０１０全量の約１１％しか含有せず、よって、チャンネル１０２４中の中性種に対するチャンネル１０２２中の中性種の全量は約８対１比となる。次に、チャンネルネットワーク１０４０の次の分離段階を通過した後、チャンネル１０４４は、チャンネル１０４２と等量の帯電種１０１２を含む。しかし、中性種は、更にチャンネル１０４２対チャンネル１０４４では８対１の比で分離され、よって、チャンネル１０４４中に流入するチャンネル１０１８中のもともと存在した中性種の約１／６４が全量となる。こうして、チャンネル１０４４中の帯電種１０１２と中性種１０１０との比は、チャンネル１０２４中の帯電種と中性種との比よりも遥かに大きくなり、システムの分離効率を改善する。勿論、特定の利用に望ましいか、必要ならば、システムの下流に１つ以上の追加の分離段階（例えば平行チャンネルネットワーク）を付加して分離効率を更に改善できる。
【００８８】
一般にチャンネルの深さは、差別的に帯電した種の所望の分離に最適の流れ条件を得るため、チャンネルの深さは、変化させてよい。したがって、所定の平行チャンネルネットワークについてこの利用によると、第一平行チャンネルの深さは、第二チャンネルより約２倍を超え、例えば第二チャンネルより約５倍を超え、例えば第二チャンネルより約１０倍（又はそれ以上）を超える。しかし、チャンネルネットワークの平行な分岐中で相対流速を制御するための変数として、深さを増大させた場合の一つの潜在的な問題は、基質の厚さ及び電位を作る制約が、２つの平行チャンネルの相対深さを例えばファクター２又は３に制限できることである。更に、３つ以上の差別的に帯電した種を互いに分離することを必要とする場合、多数の異なるチャンネルを採用したチャンネル幾何構成は、圧力駆動速度が、チャンネルからチャンネルまで既知の量で異なること（及び電場は、前述のように全てのチャンネルに対し、一定に保持すること）が必要かも知れない。所定の基質配置構成には、チャンネル数は限定されないが、使用可能な異なる深さの数は、製造上の制約から、複数のチャンネルに対し３以下の異なる深さに制限してもよい。
【００８９】
図１３Ａ及び図１３Ｂは、チャンネルネットワークの長さ沿いに２つの異なる深さの組合せを用いて、差別的に帯電した多数の種を分離できる一方法を示す。図１３Ａ及び図１３Ｂに示すように、チャンネルネットワーク１１００は、各々、入力チャンネル１１１０（このチャンネルは、例えばサンプルリザーバー（図示せず）と流動可能に連結している）及び出力チャンネル１１１２（このチャンネルは、例えば廃棄物リザーバー（図示せず）と流動可能に連結している）と流動可能に連結した４つの平行なチャンネル１１０２、１１０４、１１０６、１１０８を有する。例えば図１３Ｂに示すように、４つの各チャンネル１１０２〜１１０８に対し２つのチャンネル深さ（及び相当する２つのチャンネル幅）だけ使用したが、これらのチャンネル深さは、各チャンネルの長さ沿いに変化させて、それぞれの各チャンネルに加えた同じ電流電位を維持しながら（各チャンネルは、該チャンネルの長さ沿いに同じ断面積を有するため）、（例えば各チャンネルの流体力学抵抗を変えることにより）可変量の圧力駆動流を作る。チャンネルそれぞれの流体力学抵抗差は、例えば多数チャンネルに再び、同じ断面積であるが、異なる長さを持たせ、したがって更に互いに流れ抵抗を変えることにより、更に変形することも可能である。また、このシステムは、意図する分離効率を得るため、装置の各種チャンネルネットワークに対し圧力差及び／又は電圧差の１つ以上又は両方を変えるように構成できる。意図する分離を行うため、例えば電場は固定して、圧力流は変化できるし、或いは圧力流は固定して、電場は変化できるし、或いはまた電場及び圧力流の両方を同時に変化できる。更に、種の分離が望まれる２つ以上のチャンネルが、同じ廃棄物リザーバーと流動可能に連結していない場合、異なる電気泳動移動度により２つ以上の種の分離を行うため、電場は、この２つ（又はそれ以上）のチャンネルの少なくとも１つ（例えば深さが浅く、かつ幅が広い方のチャンネル）に対して変化させる（又は固定しておく）だけで済む。
【００９０】
ｃ．多段抽出
他の局面では、本発明は、前述の選択的イオン抽出法を用いて多段抽出を行う方法及び装置を提供する。多段抽出は、少なくとも２つの他の種の電荷の中間にある電荷を有する種を分離するという追加の利益を与える。例えば一段選択的イオン抽出は、最高又は最低のイオン移動度を持った種を分離するには好適であるが、多段抽出は、中間移動度の種や、最低速及び最高速の電気泳動移動度を持った種を分離するのに望ましい。したがって、多段選択的イオン抽出は、混合物中に含まれる流体で運ばれた種の分離を行う際、なお一層の多用性を与え、これにより、これまで実現された利用よりもなお一層広範な各種利用にミクロ流体技術を容易に使用できる。
【００９１】
このような一利用は、外部装置による特定の分析を実施するため、ミクロ流動装置と二次分析機器とを組合せることである。非常に望ましい組合せ装置は、混合物中の成分の分離が、ミクロ流動装置で行われ、分離された材料が電子噴霧（又は他の手段）により更なる分析のため質量分析計中に装填されるように、ミクロ流動装置と質量分析計とを組合せたものである。このような組合せ及び質量分析計インターフェースへの各種チップは、２００２年３月６日出願の共同（ｃｏ−ｏｗｎｅｄ）係属出願ＵＳＳＮ ６０／３６２，２９１及びＵＳＰ ５，８７２，０１０に詳細に記載されている。これらの各文献は、あらゆる目的のため、全体をここに援用した。
【００９２】
従来、このような組合せ装置で作業する際の制限の１つは、ミクロ流動装置で使用する流体の量が極めて少ないため、分離された成分の収量が極めて少ないことであった。本発明の装置及びシステムにより行われる多段選択的イオン抽出は、第二の分析に十分な材料を集めるのに必要な時間の間、材料の連続的分離及び単離を行うことにより、このような障害を克服できる。
【００９３】
図８は、多段抽出に好適なシステムを示す。前述のように、多段抽出は、前記選択的イオン抽出法を用いて一連の分離を行うことにより達成される。装置８００は、主チャンネルと、該主チャンネルと交差する少なくとも２つの副チャンネルを有する。これら２つの副チャンネルは、例えば十字形となる４方向交差点の形成、分派型（ｏｆｆｓｅｔ）T交差点の形成、並列型（ｓｉｄｅ ｂｙ ｓｉｄｅ）Ｔ交差点の形成、分派型Ｔの形成等のいかなるレイアウトで主チャンネルと交差してよい。各チャンネルに加える圧力及び電圧は、電気泳動移動度（μｅｐ）を有する種（Ｂ）を選択的に抽出するように構成される。種（Ｂ）の電気泳動移動度は、流体プラグ中に含まれる少なくとも２つの他の種（Ａ、Ｃ）の電気泳動移動度の中間にある。この装置は、流体プラグを主分離チャンネル８０４中に連続的に導入するため、サンプル源、即ち、図示のようなリザーバー又は外部毛管エレメントを有する。装置の操作を説明するため、図８は、サンプル源経由で主チャンネル中に流入する成分Ａ、Ｂ、Ｃを示す。チャンネルセグメント８１２への流体プラグの流入は、リザーバー８０６に加えた負圧により駆動される。したがって、流体プラグ中に含まれる全ての種の正味速度は、これら種の流体力学速度と同等であり、また、これによりチャンネルセグメント８１２中で同じである。流体プラグがセグメント８１４中に入ると、電場を受ける。電場は、リザーバー８０６に加えた電位で作られたものである。したがって、チャンネルセグメント８１４では、該セグメントに入る全ての種の流れは、流体力学流及び電気泳動流により制御される。各成分の正味速度は、これら成分の流体力学速度と電気泳動速度との総合計である。成分の電気泳動移動度の差により、成分がチャンネルセグメント８１４を流通する際、各種種を分離させるセグメント８１４において、成分の合計速度に限定的な差が生じる。また、リザーバー８０６を介して加える電位は、成分Ａ、Ｂをチャンネルセグメント８１６中に流入させながら、成分Ａ、Ｂよりも電気泳動移動度が遅い成分Ｃをチャンネルセグメント８２４中に引き入れるように、該リザーバーに加える負圧と釣合うのに十分な水準に設定される。しかし、成分Ａ、Ｂは、電気泳動移動度が異なるため、異なる正味速度で流れ続ける。成分Ａ、Ｂは、チャンネルセグメント８１８中に流入すると、リザーバー８０８、８１０を介して加えた負圧及び電位により、加えた圧力差及び電場差を受ける。リザーバー８０８、８１０での圧力及び電位の設定は、成分Ｂをチャンネルセグメント８２２中に流入させるだけとし、一方、成分Ａ及び若干の成分Ｂはチャンネルセグメント８２０中に流入するように、もう一度構成される。
【００９４】
通常、本発明により操作されるミクロ流動チャンネルネットワークは、前述の流れプロファイルを確立するため、必要な力をネットワークのチャンネルセグメントに配送するコントローラー設備とインターフェースされる。このような制御システムは、自給式ミクロ流動装置に、ポンプ、バルブ及び電気動力源の統合体の形態で一体化できるが、このような装置は、極めて高価で、かつ確実に製造することが困難であると思われる。本発明のミクロ流動チャンネルネットワークと共同で使用される設備システムは、通常、チャンネルネットワークの各所に圧力による流れプロファイルを発生させるための正及び／又は負の圧力源及びネットワークの他のセグメントに電気泳動的流れプロファイルを発生させるための電力源を備える。これらのシステムは、通常、圧力エネルギーをネットワークの１つ以上のチャンネルセグメントに配送すると共に、電気エネルギーをネットワーク中の他のチャンネルセグメントに配送するための１つ以上のインターフェース部品も有する。
【００９５】
圧力源及び電圧又は電流源の両方を使用する機器の例としては、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ、Ｃａｌｉｐｅｒ １００及びＣａｌｉｐｅｒ ＡＭＳ ９０ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍが挙げられる。両システムは、ミクロ流動システム装置上のリザーバーとインターフェースする電力源及び圧力源（通常、真空源）を有する。これらのリザーバーは、装置内のチャンネルネットワークと流動可能に連絡し、電気又は圧力エネルギーをこれらのチャンネルに伝達する。一般に、このような機器は、本発明に従って操作するため、ミクロ流動装置と一緒に使用できる。図５に、このようなシステム５００を概略的に示す。説明の簡略化のため、ミクロ流動装置５０２内に、単純なＴチャンネル構造を示す。装置５０２は、コントローラー５０４並びに該コントローラー中に入れた電力源５０６及び圧力源５０８と適当なインターフェース部品と適当なインターフェース部品を介してインターフェースしている。通常、このインターフェース部品は、圧力及び電気接続の両用インターフェースや、可能なその他のインターフェース、例えば温度制御、光学的検出、位置決定又は方位決定用のインターフェース等の適当なインターフェース部品中に収容されている。
【００９６】
Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの場合、インターフェースモジュールは、圧力ポート５１０及び電極、例えば電極５１２、５１４が装置５０２と操作可能にはめ合うように、ミクロ流動装置の上面を閉鎖するクラムシェル（ｃｌａｍｓｈｅｌｌ）を有する。圧力ポート５１０は、圧力ラインにより圧力源５０８と操作可能に接続し、また圧力源５０２の適当なリザーバーとも封止可能に噛み合っている。これは、圧力ポートを関連のリザーバーと封止可能にはめ合せる封止可能な取付け金具、例えばＯ−リングで行う。注入ポンプとして図示したが、コントローラー内には、各種異なる圧力源、例えば、ぜん動ポンプ、又はその他の容積移送式ポンプ、例えばダイアフラムポンプ、スクリューポンプ等を使用してよい。操作的な局面では、装置のチャンネルネットワーク中の圧力系流れを更に精密に調整するため、ミクロ流動装置５０２の他のリザーバーに追加の圧力源及び／又は真空源を連結して供給してもよい。
【００９７】
電極５１２、５１４の場合、例えばＵＳＰ ５，９５５，０２８及び同６，０７１，４７８に記載されるような各種インターフェースが任意に採用される。これらの各文献は、あらゆる目的のため、全体をここに援用した。通常、製造の簡素化のため、インターフェースモジュール上にピン電極を配置し、ミクロ流動装置５０２のリザーバー中に挿入して、この中に含まれる流体と接触させる。リザーバー中の流体と接触することにより、コントローラー５０４内の電力源５０６から電流が、装置のチャンネル内の流体に流れる。
【００９８】
Ｃａｌｉｐｅｒ ＡＭＳ ９０ Ｓｙｓｔｅｍの場合、インターフェースモジュールは、装置の頂部を閉鎖するクラムシェルとしてよりもむしろ、ミクロ流動装置を、インターフェース部品の下から振り上がる丁番式架台上に置いた他は、通常、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒに類似する。このＡＭＳ ９０システムは、高スループット用に利用されるので、インターフェースモジュールは、例えば装置の下面から伸びて、例えば図４及び図６Ｂに示すような、一連のサンプルを分析用の装置中に引き入れる、一体化した毛管エレメントを有するミクロ流動装置を保持するようにも構成される。したがって、インターフェース部品、特に装置を載せる架台は、ピペッター（ｐｉｐｅｔｔｏｒ）を挿入して、インターフェース部品の外側のサンプル源に接近させる開口を有する。低スループットの“平面的な”装置及び高スループット又は“一部立体的な”装置の例を、それぞれ図６Ａ及び図６Ｂに示す。
【００９９】
平面的装置６０２を図６Ａに示す。図示のように、装置６０２は、外部サンプリング用ピペッターを備えない他は、図６Ｂに示す装置に類似する。分析すべきサンプルは、装置全体の本体構造６０４内に収容された１つ以上のリザーバー、例えば装置内のチャンネルネットワーク６５６と連絡するリザーバー６０８〜６３０中に入れる。通常、試薬及び緩衝液が、サンプルとの添加混合物として導入されるか、或いは別のリザーバー、例えばリザーバー６３２〜６３８経由で導入される。再び、これらリザーバーは、コントローラーシステムのインターフェース部品への流体アクセス及び流体アクセスの箇所を与える。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの場合、ＡＭＳ ９０ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔシステムと同様、電気アクセスポイントに対し多数のアクセス点が付与されるが、１つのリザーバーだけが、チャンネルに負圧を加えるのに使用される。商業的利用では、平面的及び一部立体的フォーマットを含むミクロ流動装置は、装置の取扱いを手伝うプラスチックキャディー（ｃａｄｄｉｅ）に取付けること、及び／又は装置の各種リザーバーに大容量を与えることが多い（例えばＣａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．及びＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．から入手できるＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ミクロ流動装置参照）。
【０１００】
図６Ｂに示すように、高スループット装置６５２は、ミクロ流動チャンネルネットワーク６５６を有する概略平面的本体構造６５４を備える。サンプリング毛管又はピペッター６５８は、ピペッター６５８中のチャンネルが、チャンネルネットワーク６５６と流動可能に連絡するように、本体構造６５４に取付ける。ピペッター中に引き込まれた材料は、更なる処理及び／又は分析のため、チャンネルネットワークに移動する。チャンネルの端部には、複数のリザーバー、例えばリザーバー６６０、６６２が用意され、これらチャンネルと流動可能に連絡する。これらのリザーバーは、装置のチャンネルに異なる流体、例えば試薬、緩衝液、染料等を配送し、ピペッターエレメントを介して取り込まれたサンプル材料と混合するためのアクセス点を形成する。他の多数のリザーバー、例えばリザーバー６６６〜６７０も、追加の試薬、例えば希釈剤等のためのアクセスを与え、また圧力、電流等を駆動するためのアクセスを与える。図５については、前述のように、これらのリザーバーは、圧力及び電気的インターフェース部品用のアクセス点を与える。反応結果の検出は、一般に例えば光学的検出窓６７２により、ここで説明し、また当業者に一般に知られている検出システムを用いて任意に行われる。
【０１０１】
本発明を実施するため、適当なミクロ流動装置と一緒に市販のシステムを操作できるが、幾つかの場合、電力源の他に、多数の圧力源を使用したコントローラーシステムは、ここで述べた流れプロファイルを確立するのに使用できる。特にチャンネルネットワークの多数の結節部で相対圧力を制御することにより、装置に発生した流れプロファイルに対し一層精密な制御を得ることができる。図５を参照すると、例えばチャンネルセグメント５１８の両端部、例えばリザーバー５２２、５２４及び任意にリザーバー５２０に加えた圧力を、図５に示すようなやり方で制御することにより、チャンネルセグメント５１８での圧力流を一層精密に制御できる。このような設備の例としては、例えばミクロ流動アッセイ計画の開発及び設計に使用されるＣａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｍｔ．Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から市販のＣａｌｉｐｅｒ ４２ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎがある。これらのシステムは、マルチポート圧力制御、例えば装置の多数のリザーバーでの圧力制御や、マルチポート電気制御を含む。マルチポート圧力制御は、一般にＰＣＴ出願公開Ｎｏ．ＷＯ ０１／６３２７０に記載されている。この文献は、あらゆる目的のため、全体をここに援用した。
【実施例１】
【０１０２】
実施例１：マルチポート制御システム及びオフ−チップアッセイミクロ流動装置
試薬：
酵素：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ａ、ｃａｍｐ−依存Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）
【０１０３】
基質：分子量１１２９．５ｄの５−ＦＡＭ−ＬＲＲＡＳＬＧ−ＣＯＮＨ１
【０１０４】
緩衝液：１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中、５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭ ＤＴＴ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１０μＭ ＡＴＴ（Ｓｉｇｍａ）、２％ＤＭＳＯ（Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍｕｓｋｅｇｏｎ，ＭＩ）
【０１０５】
装置：
全ての実験は、マルチポートカートリッジ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を備えたＣａｌｉｐｅｒ １００開発システム又はＣａｌｉｐｅｒ ２２０高スループット選別システムのいずれかで行った。これらのシステムは、主アッセイ選別用完全一体化溶液を供給するように設計されている。各システムは、自動化サンプリングロボット、アーク灯又はレーザーによる蛍光検出システム、及び制御、分析用完全ソフトウエア包装を有する。カートリッジの内側にはチップが載せてあり、マルチポート圧力及び電圧コントローラーとのインターフェース及びアラインメントを与える。要するに、このマルチポート制御モジュールは、ミクロ流動チップに必要な基本的な制御能力を与える。制御媒体として、周囲の空気を用いた８つの独立ぜん動ポンプは、正又は負（真空）のいずれかの圧力で５ｐｓｉ供給できる。電圧コントローラーは、±３ＫＶに達する８つの別々の高電圧を供給できる。マルチポートモジュールは、通常、圧力設定又は電圧設定のような、各ファンクションの順序、期間及び大きさを含む文字により制御される。
【０１０６】
チップの説明：
本実施例で使用したミクロチップの概略図を図９に示す。図示のように、ミクロ流動チップ装置９００は、酵素リザーバー９１８と流動可能に連結したチャンネルセグメント９０２、基質リザーバー９２０と流動可能に連結したチャンネルセグメント９０４、Ｔ−交差点を有する主チャンネルセグメント９１０、及びそれぞれ廃棄物（及び／又はアナライト）リザーバー９２２、９２４と流動可能に連結したチャンネルセグメント９１２、９１４を備える。こうして、圧力駆動流又は動電的流れ等によりチャンネルセグメント９０２、９０４中に導入されたサンプル及び酵素は、主チャンネルセグメント９１０中で混合、相互作用して、基質、該基質とは異なる電荷を有する生成物、及び酵素を含む反応混合生成物を生成する。次に、この反応混合物は、本発明方法に従ってＴ−交差領域９１６で分離できる。Ｃａｌｉｐｅｒ １００及び２２０分析システムは、蛍光検出領域が、チャンネルセグメント９１２との交差点に近い主チャンネルセグメント９１０の端部に隣接して配置されるように、装置９００を保持する。光学システムに接続されたビデオカメラ及びモニターにより、チップ上の検出器場所を見ることができる。検出器は、まず基準点としてＴ−接続部の内側の隅を用いて、Ｔ−交差接続部９１６の前０．２ｍｍの所に置いた。図１０の流束モデルに基づいて、チップ９００に加える圧力及び電圧は、生成物又は基質がＴ−交差接続部を通るとは予想されないような条件を確定した。検出器での一連のピーク（図１１Ａ〜１１Ｃの“前”ピーク）を集め、前接続ピーク特性を得た。次に、検出器をＴ−接続の内側の隅から下流０．５ｍｍの所に再配置した。基質及び酵素を再び、混合して、反応生成物混合物とし、次いでこれをＴ−交差接続部９１６の下流に位置する検出領域で検出した。
【０１０７】
試薬の調製に使用した脱イオン水（２５℃で１８．２ＭΩ−ｃｍ）を、ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）システムを用いて精製した。遊離酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びナトリウム塩（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の両形態のＵＬＴＲＯＬグレードＨＥＰＥＳを用いて、ｐＨ７．５の１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液を調製した。全ての溶液は、チップに添加する前に、０．２μｍポリプロピレン注入フィルターでろ過した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ａに特異的なペプチド基質及び生成物の水溶液をｐＨ７．５のアッセイ緩衝液中で調製した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ａ（ＰＫＡ）、ｃＡＭＰ−依存Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅｃａｍｐ−依存Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、注文合成した分子量１１２９．５の基質５−ＦＡＭ−ＬＲＲＡＳＬＧ−ＣＯＮＨ２（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）と反応させた。この５−ＦＡＭは、ペプチドのアミノ端部上のロイシンに結合したフルオレッセンＮＨＳエステル部分（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）である。注文ペプチドの純度は、ＨＰＬＣで測定して９８％以上である。ＰＫＡアッセイ緩衝液は、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中、５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．，Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭ ＤＴＴ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１０μＭ ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）、２％ＤＭＳＯ（Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍｕｓｋｅｇｏｎ，ＭＩ）含むものである。電気浸透流を抑えるため、この緩衝液に動的コーティング試薬３（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．）を添加した。ｐＨ７．５で、ＰＫＡ酵素は、中性帯電（Ｚ＝０）の基質を負帯電（Ｚ＝−２）の生成物に転化する。酵素及び基質の原料溶液のアリコートを、必要になるまで、−８０℃で保存した。全溶液は、反応前に氷で保存した。ポリプロピレン遠心管に、基質１００μＭ及び酵素２５ｎＭを含むアッセイ緩衝液１００μＬを室温で９０分間、反応完結させた。アッセイ緩衝液は、酵素及び基質の添加前に０．２μＭでろ過し、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ８０μＬを加えて反応を停止させた。生成物の純度は、毛管電気泳動によりチェックし、また濃度は、５０８ｎｍでの吸収係数（ε）８２，０００Ｍ−１ｃｍ−１を用いた紫外線吸収により確認した。生成物及び基質のアリコートは、個々の実験で必要になるまで−８０℃で保存した。
【０１０８】
基質の酵素反応による２つの帯電種の実際の分離、例えば中性帯電（例えばＺ＝０）のＰＫＡ基質（実線）と負帯電のペプチド生成物（点線）（例えばＺ＝−２）との分離を予測するため、単独種の流束及び流速計算を用いた。図１０は、副チャンネルセグメント９１４の圧力の関数として、検出器領域におけるＰＫＡ生成物（点線）及び基質（実線）の濃度の予測流束モデルである。図１１Ａ〜１１Ｃは、Ｔ−交差分離接続部の前後で記録したＰＫＡ化合物の選択的イオン抽出を用いる３つの操作領域を示すと共に、図１０の流束モデルに基づいて、Ｔ−交差点９１６の“前”、“後”で記録したＰＫＡ基質及び生成物の蛍光強度ピークを示す結果を纏めたものである。図１１Ａ〜１１Ｃの蛍光ピークは、それぞれ緩衝液、基質、並びに生成物及び基質に対応して、Ｂ（バックグラウンド）、Ｓ（基質）、Ｐ（生成物）、並びにＳ＋Ｐ（基質及び生成物）と標識した。図中の小さいピークは、原型機械のロボット移動による光学ノイズである。
【０１０９】
主チャンネルセグメント９１０を流下する生成物及び基質の混合サンプルに対しては、例えばチャンネルセグメント９１４では約−１．０ｐｓｉ未満の圧力（例えばリザーバー９２４、９２２で圧力勾配を制御することにより）は、負帯電ペプチド及び中性基質の両方が、Ｔ−交差点９１６を過ぎて検出器に到達するのを防止し、こうして生成物及び基質はチャンネルセグメント９１４中に流入する。このようにして、図１１Ａに示すように、例えば−１．５ｐｓｉの圧力設定では、Ｔ−交差点９１６を過ぎて検出領域で検出される生成物及び基質はない。チャンネルセグメント９１４での圧力が、図１０に示すように、約−１．０ｐｓｉよりも高い水準に徐々に増大すると、負帯電の生成物だけが検出チャンネルセグメント９１２中に抽出され、一方、中性基質は、チャンネルセグメント９１４中に流入し続ける。こうして、図１１Ｂに示すように、チャンネルセグメント９１４において、−１．０ｐｓｉの圧力設定に対しては、生成物だけが、Ｔ−交差点９１６を過ぎて検出領域で検出される。したがって、副チャンネル９１４への圧力が約−１．０〜−０．６ｐｓｉの範囲で変化すると、異なる電気泳動移動度を持った生成物と基質間には分離の観察機会（ｗｉｎｄｏｗ）がある。副チャンネルセグメント９１４への圧力が、図１０に示すように、約−０．６ｐｓｉを超えて増大すると、流体力学流は、副腕チャンネルセグメント９１４では方向が逆転し、基質及び生成物の両方とも、図１１Ｃに示すように、チャンネルセグメント９１４で−０．５ｐｓｉの圧力が設定された場合、Ｔ−交差点を過ぎて検出される。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１Ａは、放物線状の圧力駆動流れプロファイルを示す。図１Ｂは、動電的駆動プラグ流れプロファイルを示す。
【図２】本発明による混成又は混合式の圧力及び動電的駆動ミクロ流動チャンネルシステムの概略図。
【図３】図２に示したネットワークでの各チャンネルセグメントの流れプロファイルの概略図。
【図４】サンプル導入に続いて分離による分析を利用した連続選別アッセイを行う操作での本発明装置の概略図。
【図５】本発明方法を実施するためのシステムの概略図。
【図６Ａ】平面的なフォーマットミクロ流動装置を示す。
【図６Ｂ】一部立体的なフォーマットミクロ流動装置を示す。
【図７Ａ】選択的イオン抽出を行うためのシステムの概略図。
【図７Ｂ】選択的イオン抽出を行うためのシステムの概略図。
【図７Ｃ】選択的イオン抽出を行うためのシステムの概略図。
【図７Ｄ】選択的イオン抽出を行うためのシステムの概略図。
【図８】圧力及び電圧処理により中間電荷を有する種を抽出する本発明装置を用いた、混合物からの帯電種の多段選択イオン抽出を示す。
【図９】選択的イオン抽出による混合物からの帯電種の分離に使用される通常のチップ設計を示す。
【図１０】２つの差別的に帯電した種の流束モデルを圧力変化の関数として示す。
【図１１Ａ】本発明装置のＴ−交差点における分離前後の多数帯電種の蛍光強度を示す。
【図１１Ｂ】本発明装置のＴ−交差点における分離前後の多数帯電種の蛍光強度を示す。
【図１１Ｃ】本装置のＴ−交差点における分離前後の多数帯電種の蛍光強度を示す。
【図１２】図１２Ａは、一形態の選択的イオン抽出を用いて、サンプル中の２つの差別的に帯電した種を互いに分離、抽出するのに使用されるチップチャンネル設計の他の一実施態様である。図１２Ｂは、図１２Ａの装置の１２Ｂ−１２Ｂ線部分の断面図。図１２Ｃは２つの差別的に帯電した種の分離、抽出を示す図１２Ａのチャンネル配置構成の拡大図である。
【図１３】図１３Ａは、一形態の選択的イオン抽出を用いて、サンプル中の複数（例えば２以上）の差別的に帯電した種を互いに分離、抽出するのに使用されるチップチャンネル設計の他の一実施態様である。図１３Ｂは、図１３Ａの装置の１３Ｂ−１３Ｂ線部分の横断面図。
【図１４】図１４Ａは、図１２Ａに示したものと同様な縦つなぎの平行分離チャンネルを用いた一形態の選択的イオン抽出を用いて、サンプル中の２つの差別的に帯電した種を互いに分離、抽出するのに使用されるチップチャンネル設計の他の一実施態様である。図１４Ｂは、２つの差別的に帯電した種を互いに分離する際の分離効率の向上を示す、図１４Ａのチャンネル配置構成の部分拡大図。
【図１５】図１５は、ミクロ流動装置に於けるサンプルから以後の分析の為の（ＤＮＡ及びＲＮＡのような）電気泳動の流動種を検出し、前もって濃縮する本発明の教示により使用することの出来るミクロ流動装置チャンネル配置の一概略図である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、図１５が装置のさまざまなチャンネルセグメントを通じて、圧力より生じた速度の例示を示しているミクロ流動装置チャンネル配置の一概略図である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、図１５が電気分野で装置のリザーバ１２０４及び１２０６との間に適用される際に、装置のさまざまなチャンネルセグメントを通じて、動電学的な速度の例示を示しているミクロ流動装置チャンネル配置の一概略図である。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、図１５が装置のさまざまなチャンネルセグメントを通じて、包括的な全種の速度をチャンネル配置の一概略図である。
【図１７】図１７は、図１５に示されているように一チャンネル配置を使用して一サンプル内にＤＮＡをおおよそ７つに折り畳んでスタック（ｓｔａｃｋｉｎｇ）を示している一電子フェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。
【符号の説明】
【０１１１】
２００ チャンネルネットワーク
２０２ 第一チャンネルセグメント
２０４ 第二チャンネルセグメント
２０６ 第一流動接続部
２０８ 第三チャンネルセグメント又はアクセスチャンネル
２１８ 電気システム
４００ アッセイ装置
４０２ サンプリングエレメント
４０４ 第一チャンネルセグメント
４０６ 第二チャンネルセグメント
４０８ 第一流動接続部
４１０ 第三チャンネルセグメント
４１２、４１４ 副チャンネル
４１６、４１８ リザーバー／試薬源
４２０ 電気制御システム
４５０ テスト化合物
４５２ 反応混合物スラッグ
４５４ 分離された種
４５６ 検出窓
５００ ミクロ流動装置と併用される、電力源及び圧力源を有するシステム
５０２ ミクロ流動装置
５０４ コントローラー
５０６ 電力源
５０８ 圧力源
５１０ 圧力ポート
５１２、５１４ 電極
５１８ チャンネルセグメント
５２０、５２２、５２４ リザーバー
６０２ 平面的装置
６０４ 本体構造
６０８〜６３８ リザーバー
６５２ 高スループット装置又は一部立体的装置
６５４ 概略平面的本体構造
６５６ ミクロ流動チャンネルネットワーク
６５８ サンプリング毛管又はピペッター
６６２〜６７０ リザーバー
６７２ 光学的検出窓
７００ 酵素アッセイ用装置
７０２ サンプル源
７０２、７０５、７０６ 主チャンネルのチャンネルセグメント
７０４、７１４、７１６ 副チャンネルのチャンネルセグメント
７０８、７１０ 差別的に帯電した種
７２２、７２４、７２６、７２８ リザーバー
７２８ 廃棄物リザーバー
８００ 多段抽出用システム
８０４ 主分離チャンネル
８０６、８０８、８１０ リザーバー
８１２〜８２４ チャンネルセグメント
９００ ミクロ流動チップ装置
９０２、９０４、９１２、９１４ チャンネルセグメント
９１０ 主チャンネルセグメント
９１６ Ｔ交差領域
９１８ 酵素リザーバー
９２０ 基質リザーバー
９２２、９２４ 廃棄物（及び／又はアナライト）リザーバー
１０００ ミクロ流動装置
１００２、１００４ 平行なチャンネル
１００６ サンプルリザーバー１００６
１００７ サンプル入口チャンネル
１００８ 廃棄物リザーバー
１０１０、１０１２ 差別的に帯電した種
１０１８、１０２２、１０２４ チャンネル
１０２０、１０３０、１０４０ チャンネルネットワーク
１０３２、１０３４、１０４２、１０４４ チャンネル
１１００ チャンネルネットワーク
１１０２、１１０４、１１０６、１１０８ 平行なチャンネル
１１１０ 入力チャンネル
１１１２ 出力チャンネル
【特許請求の範囲】
【請求項１】
相互に連結されたチャンネル・ネットワークを供給する工程であって、該ネットワークは、第一流動ジャンクションで相交わる第一、第二、第三チャンネルセグメントを備え、第二チャンネルセグメントは、第一流動リザーバに一端で終端し、第一流動ジャンクションに他端で相交わり、該ネットワークは更に第四チャンネルセグメントを備え、第四チャンネルセグメントは、一端で第二流動ジャンクションにて第三チャンネルセグメントと相交わり、他端で第一バッファーを含んだ第二流動リザーバに終端している工程、
第一チャンネルセグメント及び第二チャンネルセグメントに第一の圧力差、そして第三チャンネルセグメント及び第四チャンネルセグメントに第二の圧力差を加えることにより、第二バッファー中のサンプル中の帯電した種を相互連結されたチャンネル・ネットワークを通して流す工程であって、第一の圧力差は第二の圧力差よりも大きく、第一のバッファーは、第二のバッファーとは異なるイオン強度を持つ工程、及び
第一流動ジャンクションに於けるサンプル内の帯電した種の実質的な部分が第三チャンネルセグメントに流れ込むのに十分な電圧差を第一リザーバ及び第二リザーバに印加する工程、
を含むサンプルから帯電した種を抽出し、それを濃縮する方法。
【請求項２】
第一、第二、第三及び第四チャンネルセグメントが、ミクロ流動装置の本体構造内に配置される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一流動リザーバを減圧することにより第一圧力差を発生させる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第二流動リザーバに正圧を加えることにより第二の圧力差を少なくとも部分的に発生させる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第一バッファーが第二バッファーよりも高いイオン強度を持つ請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第一圧力差と第二圧力差との差は、第一チャンネルセグメント内の圧力によって駆動した流量又は流速が第三チャンネルセグメント内の圧力より駆動した流量又は流速よりも少なくとも約二倍大きくなるように設定される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第一圧力差と第二圧力差との差は、第一チャンネルセグメント内の圧力によって駆動した流量又は流速が第三チャンネルセグメント内の圧力より駆動した流量又は流速よりも少なくとも約五倍大きくなるように設定される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
第一圧力差と第二圧力差との差は、第一チャンネルセグメント内の圧力によって駆動した流量又は流速が第三チャンネルセグメント内の圧力より駆動した流量又は流速よりも少なくとも約十倍大きくなるように設定される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第一圧力差と第二圧力差との差は、第一チャンネルセグメント内の圧力によって駆動した流量又は流速が第三チャンネルセグメント内の圧力より駆動した流量又は流速よりも少なくとも約二十倍大きくなるように設定される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第二チャンネルセグメント内の帯電した種の動電学的速度が、その圧力駆動速度よりも大きい請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第四チャンネルセグメント内の帯電した種の動電学的速度が、その圧力駆動速度よりも小さい請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
第二流動ジャンクションに流動連結された第五チャンネルセグメントを更に備え、第五チャンネルセグメント内の帯電した種の全流量又は流速が第三チャンネルセグメント内の帯電した種の全流量又は流速よりも約五倍小さい請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
第二流動ジャンクションに流動連結された第五チャンネルセグメントを更に備え、第五チャンネルセグメント内の帯電した種の全流量又は流速が第三チャンネルセグメント内の帯電した種の全流量又は流速よりも約十倍小さい請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記帯電した種がＤＮＡ又はＲＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ又はＲＮＡを相互連結されたチャンネル・ネットワークの第五チャンネルセグメント内にて１回以上増幅する工程を更に含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第二流動ジャンクション内又はその付近に帯電した種を十分に濃縮するために、第一バッファーが第二流動ジャンクション内で第二バッファーと流体境界を形成する請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記帯電した種を、第二流動ジャンクション内又はその付近に少なくとも約五倍濃縮させる請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記帯電した種を、第二流動ジャンクション内又はその付近に少なくとも約十倍濃縮させる請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
帯電した種以外の第二バッファー内にあるサンプルの多くの部分を、第二チャンネルセグメントに流す請求項１に記載の方法。
【請求項１】
相互に連結されたチャンネル・ネットワークを供給する工程であって、該ネットワークは、第一流動ジャンクションで相交わる第一、第二、第三チャンネルセグメントを備え、第二チャンネルセグメントは、第一流動リザーバに一端で終端し、第一流動ジャンクションに他端で相交わり、該ネットワークは更に第四チャンネルセグメントを備え、第四チャンネルセグメントは、一端で第二流動ジャンクションにて第三チャンネルセグメントと相交わり、他端で第一バッファーを含んだ第二流動リザーバに終端している工程、
第一チャンネルセグメント及び第二チャンネルセグメントに第一の圧力差、そして第三チャンネルセグメント及び第四チャンネルセグメントに第二の圧力差を加えることにより、第二バッファー中のサンプル中の帯電した種を相互連結されたチャンネル・ネットワークを通して流す工程であって、第一の圧力差は第二の圧力差よりも大きく、第一のバッファーは、第二のバッファーとは異なるイオン強度を持つ工程、及び
第一流動ジャンクションに於けるサンプル内の帯電した種の実質的な部分が第三チャンネルセグメントに流れ込むのに十分な電圧差を第一リザーバ及び第二リザーバに印加する工程、
を含むサンプルから帯電した種を抽出し、それを濃縮する方法。
【請求項２】
第一、第二、第三及び第四チャンネルセグメントが、ミクロ流動装置の本体構造内に配置される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一流動リザーバを減圧することにより第一圧力差を発生させる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第二流動リザーバに正圧を加えることにより第二の圧力差を少なくとも部分的に発生させる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第一バッファーが第二バッファーよりも高いイオン強度を持つ請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第一圧力差と第二圧力差との差は、第一チャンネルセグメント内の圧力によって駆動した流量又は流速が第三チャンネルセグメント内の圧力より駆動した流量又は流速よりも少なくとも約二倍大きくなるように設定される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第一圧力差と第二圧力差との差は、第一チャンネルセグメント内の圧力によって駆動した流量又は流速が第三チャンネルセグメント内の圧力より駆動した流量又は流速よりも少なくとも約五倍大きくなるように設定される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
第一圧力差と第二圧力差との差は、第一チャンネルセグメント内の圧力によって駆動した流量又は流速が第三チャンネルセグメント内の圧力より駆動した流量又は流速よりも少なくとも約十倍大きくなるように設定される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第一圧力差と第二圧力差との差は、第一チャンネルセグメント内の圧力によって駆動した流量又は流速が第三チャンネルセグメント内の圧力より駆動した流量又は流速よりも少なくとも約二十倍大きくなるように設定される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第二チャンネルセグメント内の帯電した種の動電学的速度が、その圧力駆動速度よりも大きい請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第四チャンネルセグメント内の帯電した種の動電学的速度が、その圧力駆動速度よりも小さい請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
第二流動ジャンクションに流動連結された第五チャンネルセグメントを更に備え、第五チャンネルセグメント内の帯電した種の全流量又は流速が第三チャンネルセグメント内の帯電した種の全流量又は流速よりも約五倍小さい請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
第二流動ジャンクションに流動連結された第五チャンネルセグメントを更に備え、第五チャンネルセグメント内の帯電した種の全流量又は流速が第三チャンネルセグメント内の帯電した種の全流量又は流速よりも約十倍小さい請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記帯電した種がＤＮＡ又はＲＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ又はＲＮＡを相互連結されたチャンネル・ネットワークの第五チャンネルセグメント内にて１回以上増幅する工程を更に含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第二流動ジャンクション内又はその付近に帯電した種を十分に濃縮するために、第一バッファーが第二流動ジャンクション内で第二バッファーと流体境界を形成する請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記帯電した種を、第二流動ジャンクション内又はその付近に少なくとも約五倍濃縮させる請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記帯電した種を、第二流動ジャンクション内又はその付近に少なくとも約十倍濃縮させる請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
帯電した種以外の第二バッファー内にあるサンプルの多くの部分を、第二チャンネルセグメントに流す請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１７】
【公表番号】特表２００７−５２４０８６（Ｐ２００７−５２４０８６Ａ）
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４７０４１（Ｐ２００６−５４７０４１）
【出願日】平成１６年１２月６日（２００４．１２．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４０６３５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６６６１９
【国際公開日】平成１７年７月２１日（２００５．７．２１）
【出願人】（５０６０７６７０９）カリパー・ライフ・サイエンシズ・インク． (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月６日（２００４．１２．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４０６３５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６６６１９
【国際公開日】平成１７年７月２１日（２００５．７．２１）
【出願人】（５０６０７６７０９）カリパー・ライフ・サイエンシズ・インク． (11)
【Ｆターム（参考）】
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