溶液／ゲル転移と次いでゲル／溶液転移とを連続的に実施可能な生体材料
本発明は、所与の反応速度論によって、溶液／ゲル転移と、次いでゲル／溶液転移とを連続的に実施し得る生体材料に関する。前記生体材料は、ポリマーを形成し得る少なくとも１種のモノマーと、前記ポリマーを分解し得る少なくとも１種の酵素と、任意選択で、前記モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素とを含む。本発明はさらに、前記生体材料を製造する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲル化の分野において、制御された溶液／ゲルの転移と、次いでゲル／溶液の転移とを連続的に実施することが可能である生体材料、およびそのような生体材料を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲルは、その特異性により、多数の分野、特に食品、化粧品、および医薬品において用いられている。ゲルは、少なくとも２つの成分から成り、そのうちの明らかに主成分である成分は液体溶媒に相当し、他方の成分は前記溶媒内に分散された固体に分類できる成分である。液体状態における溶液または分散物に基づいて、ゲルの形成は固体粒子の部分的な凝集に起因する。この変化は溶液／ゲル転移と呼ばれる。
【０００３】
「物理」ゲルを得るための組成は、従来技術においてよく知られている。物理ゲルは、低エネルギーの結合（ファン・デル・ワールス結合、水素結合、極性結合など）によって互いに結合されたモノマーから構成された高分子集合体である。この集合体の安定性は、特定の範囲の物理化学的条件（ｐＨ、モノマー濃度、温度、溶媒の量、イオン力など）に関連している。この範囲の外においては、ゲルは再び溶液になる。そのため、溶液／ゲル転移は、物理ゲルにおいては可逆的である。したがって、物理ゲルの構造は、物理化学的環境に対して非常に敏感であり、溶媒の特性のごくわずかな変化によってこの構造が完全に破壊され、それにより、ゲル−溶液転移を生じ得る。反対に、溶媒の特性のわずかな変化によって、ゲルを生じるポリマーの会合が行なわれ得る。
【０００４】
従来技術においては、「化学」ゲルに分類されるゲルも知られている。化学ゲルもまた高分子集合体であり、その高分子集合体が含んでいるモノマーは高エネルギー結合（共有結合）によって関連付けられている。そのため、この集合体は非常に安定している。しかしながら、結局のところ、これらの化学ゲルは高い安定性を有するが、ゲル／溶液転移を行うことができる唯一の方法としては、ポリマーの共有結合を破壊するしかない。このため、この種類のゲル／溶液転移は不可逆的であると称される。
【０００５】
化学ゲル群は酵素によって触媒されたゲルに相当する。このゲル化様式は、主として、主要な生物学的過程において観察される。血液凝固、瘢痕形成、表皮形成および細胞外基質の会合は、可溶性タンパク質からゲル状態への転移が不可欠である生物学的過程であり、それらは酵素群、すなわち、ゲル化過程において不可欠であるトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を共用する。この群のタンパク質は広く存在し、原核生物および真核生物において等しく見られ得る。ヒトでは、異なる８つのトランスグルタミナーゼが見られる。これらの酵素は、タンパク質のグルタミニル側鎖上にアミン基を含める性質を有する。この活性は、タンパク質の間に共有結合を形成することを可能にする。トランスグルタミナーゼは、このように生物学的にゲル化された網状構造の形成に関与するタンパク質の重合を触媒する。トランスグルタミナーゼは、食品産業において、特にすり身の製造または多数の食肉派生品（ハム、再構成食品など）を硬化させるために、多数のタンパク質からゲルを得ることを可能にする。これらの重合可能なタンパク質の例としては、ゼラチン、フィブリン、グリアジン、ミオシン、グロブリン（７Ｓおよび１１Ｓ）、アクチン、ミオグロビン、乳漿タンパク、特にカゼインおよびラクトグロブリン、大豆タンパクおよび小麦タンパク、特にグルテニン、並びに卵白および卵黄、特に卵アルブミンが挙げられる。
【０００６】
最も一般的に使用されるタンパク質ゲルの１つは、ゼラチンゲルである。ゼラチンは、遍在する構造を有するタンパク質であるコラーゲンから得られる。コラーゲンは、モノマ
ーまたは三重らせん体構造に会合したトリマーの形態にある可溶状態で見られ得る。これらの三重らせん体は細線維として会合し、細線維は線維として会合し得る。コラーゲン三重らせん体は体温では不安定である。ゼラチンはコラーゲンの変性によって得られる。そのため、コラーゲンを含む組織に、コラーゲン三重らせん体を変性させる酸処理またはアルカリ処理を行なう。従って、線維を形成する可能性は完全に失われる。酸処理はＡ型ゼラチンの形成をもたらし、アルカリ処理はＢ型ゼラチンを生成する。従って、ゼラチン溶液は分離されたコラーゲン鎖（コラーゲンモノマー）から成る。ゼラチンは多くの用途を有するので、物理ゲルが存在できない条件下（高温、極端なｐＨ、または特定のイオン力）において、ゼラチンゲルを生成することが必要な場合がある。ゲルに必要な網状構造を形成するために、次に、ゼラチン鎖は、共有結合、特にトランスグルタミナーゼの作用によって絡み合わせられる。このように得られたゲルは化学ゲルである。
【０００７】
現在、それらの改善された安定性により、多数の分野で化学ゲルの使用が必要とされている。しかしながら、化学ゲルの「不可逆性」により、化粧品、食品または医薬品工業などにおけるそれら化学ゲルの潜在的な用途は制限される。従って、様々なゲルの機械的性質をより良好に制御することは、ゲルの可能性を増大させるために不可欠な課題となる。
【０００８】
生体生物の分析は、非常に動的な系の存在を示す。生体組織において、細胞は、タンパク質に富む細胞外基質（ＥＣＭ）と呼ばれる構造と相互作用する。この構造は、主として上皮細胞下、および結合組織の周囲に位置している。細胞は、弾性に影響するコラーゲンまたは接着機構に影響するフィブロネクチンのような細胞外基質の様々な成分を合成することができる。同時に、細胞は、細胞外基質の分解に作用するプロテアーゼも生成する。従って、細胞は細胞外基質の形成および分解に対して同時効果を有する。従って、細胞外基質の構造は、不可逆な静的構造でなく、細胞によって合成されるタンパク質の形成作用と分解作用とのバランスから生じる動的釣り合いに対応する。
【０００９】
同様に、凝集機構に応答して形成されるクロットも動的な系を構成する。したがって、酵素因子のカスケードの合成は、可溶性タンパク質の網状構造の形成に起因する不溶性クロットの形成をもたらす。このクロットは後で瘢痕形成反応の間に除去される。
【００１０】
これらの動的釣り合いにおいて、タンパク質網状構造は会合して不溶性となりゲルを形成する。これは溶液／ゲル転移と同等と見なすことができる。同時に、タンパク質網状構造はまたプロテアーゼの作用によって破壊される。この場合、この種の転移はゲル／溶液転移に類似している。従って、時には、初期にはクロットが形成され、次いでクロットは分解され、よく理解されていない機構による他の反応に移行する、凝集においてのような連続的転移を見ることが可能である。
【００１１】
これらの生物学的過程における溶液／ゲル転移は、最も多くの場合において、上記に記載したトランスグルタミナーゼ群に関連している。一方、反対の転移、すなわち、ゲル／溶液の転移は、タンパク分解酵素の拮抗的活性に関連している。
【００１２】
最も研究された群のうちの１つは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の群である。ＭＭＰは、細胞外基質中のほとんどのタンパク質を分解する亜鉛依存性エンドペプチダーゼの群を形成する。しかしながら、多数の異なるプロテアーゼ群が存在する。プロテアーゼ群の例としては、セリンプロテアーゼ、例えばトリプシン、マトリプターゼ、システインおよびアスパラギン酸プロテアーゼ、例えばカテプシンＢおよびＬならびにカテプシンＤおよびＣ、さらにＡＤＡＭファミリーが挙げられる。
【００１３】
トランスグルタミナーゼまたはメタロプロテアーゼのような、この種の反応を組み合わせる多数の酵素が、生化学者および酵素学者によって特徴付けられている。従って、これ
らの酵素の説明、特にそれらに関連した様々な定数の記述はよく管理されている。さらに、それらの挙動は、溶液中でかつ単独の場合にはよく知られているが、これは、ゲル環境で、かつ拮抗的な活性が存在している事例ではない。
【００１４】
本発明者らおよび他のチームによって行なわれたモデル化の研究により、インビボにおいて存在するこの動的釣り合いに関与するパラメータを理解することが可能になった。本発明者らが行なった最近のモデル化および実験の研究により、この動的釣り合いの新しいモデルを開発することが可能となった。その新しいモデルは動的釣り合いに関与するパラメータをより高い精度で統合する。
【００１５】
驚いたことに、本発明者らによって実施されたモデル化は、そのような動的釣り合いを「インビトロ」で得ることが可能であることを示した。従って、本発明者らは、所与の条件下、および特に以下の所与の反応速度論における溶液／ゲルおよびゲル／溶液の転移を連続的に実施することができるタンパク質ゲルを得ることが可能となった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、溶液／ゲルの転移と、次いでゲル／溶液の転移とを連続的に実施することが可能である生体材料、およびそのような生体材料を調製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
従って、本発明の第１の目的は、好ましくは低エネルギー結合によってポリマーを形成し得る少なくとも１種のモノマーまたは前記モノマーとそれらのポリマーとの混合物と、前記ポリマーを分解し得る第１の種類の酵素とを含む生体材料に関連する。前記生体材料はゲル形態または溶液形態のいずれかを呈し、かつ第１の溶液／ゲル転移と、次いで第１の種類の酵素の作用下において第２のゲル／溶液転移とを連続的に実施することが可能である。
【００１８】
従って、そのような生体材料は、化粧品、食品または医薬品工業において従来未知の特性を有する製品を開発することを可能にする。
よって、化粧品の分野においては、本発明による生体材料を用いて、必要な施用時間の間はゲルのテクスチャを示すことが可能であり、その後、溶液状態に戻って使用者による迅速かつ容易な除去を可能にする美容マスクのような、新規な化粧品を製造することができる。
【００１９】
よって、食品および農業の分野においては、本発明による生体材料を用いて、フィリングがコーティング工程の間にはゲル状であり、その後、一旦コーティング工程が終了すると、程度の差はあるが粘稠な溶液状態に戻るフィリング入りビスケットまたは菓子のような未知の感触を有する新規な製品を製造することができる。
【００２０】
医薬品または化粧品の分野では、本発明による生体材料を用いて、活性成分を含有し、所与の反応速度論で溶液状態に戻ることにより前記活性成分の塩析を行なうことが可能であるゲルを得ることもできる。特定の温度、ｐＨおよびイオン濃度条件（カルシウム、マグネシウムまたは他のもの）、または特定の補助因子の存在下において重合されるタンパク質（ｉ）を分解し得る酵素を使用して、この塩析を特定環境（腸、胃など）に対して適応させることができる。
【００２１】
従って、本発明は、化粧品組成物、医薬組成物または食品組成物に関する。これらの組成物は、化粧品または薬学的組成物に対する活性薬剤、または食品組成物に対する調合剤
のような他の薬剤を含み得る。
【００２２】
生体材料に含まれるモノマーは、有利には、タンパク質または糖類である。それらのタンパク質または糖類は天然物であってもよいし、合成物であってもよい。
第１の種類の酵素は、生体材料中において、不活性化されていない形態で存在する。ポリマーを分解し得る第１の種類の酵素は、生体材料中において活性な形態であってもよいし、あるいは特定の器官（胃、腸、口腔など）内または特定環境下のように、特定の条件下で、ゲル／溶液転移を得られるように、所与のｐＨ、またはイオン種もしくは特定の補因子の存在のような特定の条件下で活性化され得る形態であってもよい。
【００２３】
本発明の生体材料の第１の特定の実施形態によれば、生体材料は、モノマーの重合および形成されたポリマーの第１の種類の酵素による分解を可能にするのに適した溶媒も含む。使用する溶媒は、好ましくは、所望のｐＨを有する水または他の緩衝液（リン酸塩緩衝液またはトリス緩衝液）などの水性溶媒である。
【００２４】
本発明の生体材料の第２の特定の実施形態によれば、ゲル形態の前記生体材料は、当業者に既知の手法を用いて凍結乾燥される。その結果、生体材料はいかなる溶媒も含有しない。その後、前記生体材料は適切な溶媒と接触させられると、第２のゲル／溶液転移のみが生じる。従って、この実施形態は、製造後に、ゲルの有効寿命を、所与の環境または特定の器官（胃、腸、口腔など）にゲルが存在することと関連付けることを可能にする。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態によれば、生体材料は、前記モノマーの間に共有結合を形成し得る少なくとも１種の第２の種類の酵素をさらに含む。その結果、前記生体材料は、第２の種類の酵素の作用下において第１の溶液／ゲル転移と、それに後続して第１の種類の酵素の作用下において第２ゲル／溶液転移とを連続的に実施することができる。
【００２６】
２種類の酵素は、不活性化されていない形態で生体材料中に同時に存在すると有利である。
また、酵素が生体材料中に均一に分布していることも有利である。
【００２７】
本発明の生体材料の第３の特定の実施形態によれば、生体材料はタンパク質モノマーを含む。ほとんどすべてのタンパク質はその高分子電解質特性のために物理ゲルを形成することができる。重合して物理ゲルを形成することが可能であり、本発明による方法に使用可能であるタンパク質の例としては、ゼラチンのようなコラーゲンおよびその誘導体、フィブリン、グリアジン、ミオシン、グロブリン（７Ｓおよび１１Ｓ）、アクチン、ミオグロビン、乳漿タンパク、特にカゼインおよびラクトグロブリン、大豆および小麦タンパク、特にグルテニン、卵白および卵黄、特に卵アルブミンが挙げられる。使用される重合可能なタンパク質は、好ましくは、フィブリンおよびコラーゲン並びにその誘導体、例えばＡ型およびＢ型のゼラチンなどの中から選択される。タンパク質モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の存在下においては、自然には重合しないタンパク質を用いることが可能である。
【００２８】
モノマーまたは前記モノマーとそのポリマーとの混合物の形態にある重合可能なタンパク質の生体材料中における濃度は、用いられるタンパク質の性質に依存する。重合可能なタンパク質の濃度は、好ましくは、生体材料の全重量に対して重量比で０．１〜３０％、好ましくは０．２〜２０％、より好ましくは０．５〜１５％、特に好ましい方法では１〜１０％である。
【００２９】
タンパク質ポリマーを分解し得る多数の酵素（プロテアーゼ）が、当業者には知られている。そのような酵素の例としては、ＭＭＰ群のメタロプロテイナーゼのようなメタロプ
ロテイナーゼ、またはサーモリシンのような同様のメタロプロテイナーゼ、トリプシンおよびマトリプターゼのようなセリンプロテアーゼ、カテプシンＢ, ＬおよびカテプシンＤ，Ｇのようなシステインプロテアーゼおよびアスパラギン酸プロテアーゼ、およびＡＤＡＭファミリーが挙げられる。タンパク質ポリマーを分解し得る酵素は、好ましくはメタロプロテイナーゼであり、好ましくはサーモリシン、特に細菌性サーモリシンであり、および特に好ましい方法では、バチルス・サーモプロテオリティカス・ロッコから単離されたサーモリシンである。
【００３０】
タンパク質ポリマーを分解し得る酵素の濃度は、使用されるタンパク質モノマーおよびそのモノマーの濃度に依存する。この酵素濃度は、以下の実施例に記載する方法に従って、所与のタンパク質モノマーの種類によって、かつ所与の濃度において容易に計算することができる。したがって、バチルス・サーモプロテオリティカス・ロッコのサーモリシンの場合で、５％のＡ型ゼラチンを含有するゲルについては、サーモリシン濃度は、１０−４Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは１０−３Ｕ／ｍｌ以上である。
【００３１】
タンパク質の間に共有結合を形成することが可能な多数のタンパク質も、当業者には知られている。そのようなタンパク質の例としては、リシルオキシダーゼ群、並びに、第ＸＩＩＩ因子のサブユニットＡ、哺乳動物トランスグルタミナーゼ１〜７または細菌性トランスグルタミナーゼなどのトランスグルタミナーゼ群が挙げられる。タンパク質の間に共有結合を生成し得る酵素は、トランスグルタミナーゼであり、好ましくは細菌性トランスグルタミナーゼであり、特に好ましい方法においては、ストレプトバーティシリウム属細菌から単離されたトランスグルタミナーゼである。
【００３２】
タンパク質の間に共有結合を形成し得る酵素およびタンパク質ポリマーを分解し得る酵素の濃度は、一方では、タンパク質ポリマーを分解し得る酵素の濃度に対するタンパク質の間に共有結合を形成し得る酵素の濃度の比率に依存し、他方では、使用される重合可能なタンパク質および同タンパク質の濃度に依存する。これらの酵素濃度は、実施例に記載する方法によって容易に計算することができる。
【００３３】
用いられる酵素濃度比および酵素濃度は、所望のゲル化時間（溶液／ゲル転移）および有効ゲル寿命にも依存する。
有利には、タンパク質ポリマーを分解し得る酵素の濃度に対するタンパク質の間に共有結合を形成し得る酵素の濃度の比率は、１以上であり、好ましくは１０以上であり、特に好ましい方法では、２０以上である。
【００３４】
タンパク質の間に共有結合を形成し得る酵素の濃度は、０．００１Ｕ／ｍｌ超であり、好ましくは０．０１Ｕ／ｍｌ超であり、特に好ましい方法においては、０．１Ｕ／ｍｌ超であるとまた有利である。
【００３５】
さらに有利には、５％のＡ型ゼラチンを含有し、ストレプトバーティシリウム属細菌のトランスグルタミナーゼおよびバチルス・サーモプロテオリティカス・ロッコのサーモリシンが存在する溶液の場合には、サーモリシン濃度（Ｕ／ｍｌ）に対するトランスグルタミナーゼ濃度（Ｕ／ｍｌ）の比率は、７５より大きく、好ましくは８０以上である。加えて、トランスグルタミナーゼ濃度は、０．０１Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは０．１Ｕ／ｍｌ以上、特に好ましい方法では、０．４Ｕ／ｍｌ以上である。
【００３６】
本発明の第４の特定の実施形態によれば、本発明による生体材料は糖類モノマーを含む。本発明による生体材料によって使用可能な糖類の例としては、カラギーナン、アルギナート、ペクチン、キトサン、セルロース、キチン、グリコーゲン、またはデンプンなどが挙げられる。
【００３７】
モノマーまたは前記モノマーとそのポリマーとの混合物の形態にある重合可能な糖類の生体材料中における濃度は、使用される糖類の性質に依存する。重合可能な糖類の濃度は、生体材料の全重量に対して、重量比で、好ましくは０．１〜３０％、好ましくは０．２〜２０％、より好ましくは０．５〜１５％、特に好ましい方法においては１〜１０％である。
【００３８】
多糖類を分解し得る多数の酵素が、当業者には知られている。そのような酵素の例としては、カラギーナン、ペクチンリアーゼ、ペクチンに対するポリガラクツロナーゼおよびペクチンエステラーゼ、アルギナートに対するアルギナートリアーゼ、セルロースに対するセルラーゼまたはグリコーゲンに対するホスホリラーゼなどが挙げられる。
【００３９】
多糖類を分解し得る酵素の濃度は、使用されるモノマーおよびそのモノマーの濃度に依存する。この酵素濃度は、実施例に記載する方法に従って、所与のモノマーの種類により所与の濃度において容易に計算することができる。
【００４０】
糖類の間に共有結合を形成し得る多数の酵素もまた、当業者には知られている。そのような酵素の例としては、アルギナートに対するアルギナートエピメラーゼ、セルロースに対する合成酵素、またはグリコーゲンに対するグリコーゲン合成酵素の各群が挙げられる。
【００４１】
糖類間に共有結合を形成し得る酵素および多糖類を分解し得る酵素の濃度は、一方では、多糖類を分解し得る酵素の濃度に対する糖類間に共有結合を形成し得る酵素の濃度比に依存し、他方では、使用される重合可能な糖類とその濃度に依存する。これらの酵素濃度は、実施例に記載する方法によって容易に計算することができる。
【００４２】
上記のように、用いる酵素濃度の比率および酵素濃度はまた、所望のゲル化時間（溶液／ゲル転移）およびゲルの有効寿命にも依存する。
（糖類の間に共有結合を形成し得る酵素の濃度）／（多糖類を分解し得る酵素の濃度）の比率は、有利には、１以上であり、好ましくは１０以上であり、特に好ましい方法においては２０以上である。
【００４３】
さらに有利には、糖類の間に共有結合を形成し得る酵素の濃度は、０．００１Ｕ／ｍｌ超であり、好ましくは０．０１Ｕ／ｍｌ超であり、特に好ましい方法においては０．１Ｕ／ｍｌ超である。
【００４４】
本発明の第５の特定の実施形態によれば、本発明による生体材料は糖類モノマーおよびタンパク質モノマーを含む。そのような化合物は、特定のレオロジー特性を有するゲル、および可能性として所望のテクスチャを有するゲルを得ることを可能にする。
【００４５】
生体材料はまた、化粧品、製薬または食品産業において現在使用されている１つ以上の追加成分も含んでもよい。
本発明の第２の目的は、本発明による生体材料を調製する方法に関する。前記生体材料は、ゲル形態または溶液の形態を呈し、溶液／ゲル転移と後続する第２のゲル／溶液転移とを連続的に実施することができる。前記方法は、適切な溶媒中に、
（ｉ）好ましくは低エネルギーの結合によりポリマーを形成し得る少なくとも１つのモノマーを混合することと、
（ｉｉ）前記ポリマーを分解し得る第１の種類の酵素を混合することと
を含むことを特徴とする。
【００４６】
所望のゲル化時間および有効ゲル寿命を有する生体材料を得るための、好ましくは低エネルギーの結合によりポリマーを形成し得るモノマーの濃度、および前記ポリマーを分解し得る酵素の濃度は、実施例に記載する方法によって決定される。
【００４７】
一例として、低エネルギーの結合によりポリマーを形成し得るモノマーとして５％のＡ型ゼラチンと、バチルス・サーモプロテオリティカス・ロッコから単離されたサーモリシンとを含み、６８分のゲル化時間および２５４分の有効ゲル寿命を有する生体材料は、２７℃において０．００８５Ｕ／ｍｌのサーモリシンを使用することによって得ることができる。
【００４８】
好ましい実施形態によれば、本発明による方法は、
（ｉｉｉ）モノマーの間に共有結合を形成し得る第２の種類の酵素を混合すること
をさらに含む。
【００４９】
所望のゲル化時間および有効ゲル寿命を有する生体材料を得るための、任意で低エネルギーの結合によりポリマーを形成し得るモノマーの濃度、前記ポリマーを分解し得る酵素の濃度、および前記モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の濃度は、実施例に記載する方法によって決定される。
【００５０】
前記方法は、双方の種類の酵素が活性である温度で実行される。前記方法は、０〜１００℃、好ましくは５〜７５℃、例えば１０〜５０℃または１５〜４５℃、特に好ましい方法においては２０〜４０℃の温度において有利に実施される。
【００５１】
ポリマーを形成し得るモノマーの量は、有利には、生体材料の全重量に対して、重量比で０．１〜３０％、好ましくは０．２〜２０％、好ましくは０．５〜１５％、特に好ましい方法においては１〜１０％である。
【００５２】
また有利には、ポリマーを分解し得る酵素の濃度に対するモノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の濃度の比率は、１以上であり、好ましくは１０以上であり、特に好ましい方法においては２０以上である。
【００５３】
モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の濃度は、好ましくは０．００１Ｕ／ｍｌ超であり、好ましくは０．０１Ｕ／ｍｌ超であり、特に好ましい方法においては、０．１Ｕ／ｍｌ超である。
【００５４】
ポリマーを形成し得るモノマーの濃度、前記ポリマーを分解し得る酵素の濃度、および場合により前記モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の濃度は、以下の方程式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の結果が、所望のゲル化時間および有効ゲル寿命を得ることを可能にするように有利に選択される。
【００５５】
【数１】
上記方程式は、それぞれ、時間（ｄｔ）による、（Ｉ）結合されたモノマー（以下、「結合モノマー」と称する）の数の漸進的変化（ｄｇ）、（ＩＩ）溶液中のモノマーの数の漸進的変化（ｄｓ）、および（ＩＩＩ）分解されたモノマー（以下、「分解モノマー」と称する）の数の漸進的変化（ｄｆ）、並びに（ＩＶ）質量保存方程式を表している。
【００５６】
前記式中において、
− ｇは結合形態にあるモノマーの量に相当し、
− ｔは時間に相当し、
− ＶＰは、単位時間あたりに前記酵素により結合モノマーがその遊離形態に変化した量として表された、ポリマーを分解し得る酵素の速度に相当し、
− ＫＰは、ポリマーを分解し得る酵素のミハエリス定数を表し、
− ｓは、遊離形態にあるモノマーの量を表し、
− ＶＴは、単位時間あたりに前記酵素によって結合された遊離形態にある結合モノマーの量として表された、モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の速度に相当し、
− ＫＴは、モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素のミハエリス定数を表し、
− ＶＨは、低エネルギーの結合により重合し得るモノマーの場合における、単位時間あたりの遊離形態にあるモノマーの低エネルギー結合による結合の速度を表し、
− Ｖ’Ｐは、単位時間あたりの、遊離形態にあるモノマーを分解し得る酵素により生成されるもはや重合不可である分解モノマーの量として表された、前記酵素の速度に相当し、
− ｇｔは、時間ｔにおける結合形態にあるモノマーの量に相当し、
− ｓｔは、時間ｔにおける遊離形態にあるモノマーの量に相当し、
− ｆｔは、時間ｔにおけるもはやポリマーを形成し得ない分解モノマーの量に相当し、
− Ｓ０はモノマーの初期量に相当する。
【００５７】
本発明者らは、異なる種類の酵素を使用して、所与の溶液／ゲルおよびゲル／溶液転移の反応速度論を有する生体材料を得ることが可能であることを証明することができた。
これらの様々な酵素に対する定数は、当業者にはよく知られている。この例は、http://www.brenda.uni-koeln.de/ にあるデータベースである。前記データベースはそのような酵素の定数を記載している。いずれの場合においても、当業者であれば、http://www.brenda.uni-koeln.de/ およびプライス（PRICE ）およびスティーヴン（STEVEN）、「Fundam
entals of Enzymology: The Cell and Molecular Biology of Catalytic Proteins」、オックスフォード大学出版局（Oxford University Press ）に記載のような周知の方法によって、所与の酵素に対するこれらの様々な定数を容易に決定することができる。
【００５８】
従って、これらの方程式において、ＶＰおよびＶＴは以下の式によって計算される。
ＶＰ＝ｋＣＡＴ＿Ｐ［Ｐ］およびＶＴ＝ｋＣＡＴ−Ｔ［Ｔ］
前記式中、［Ｐ］および［Ｔ］は、それぞれ、ポリマーを分解し得る酵素の濃度およびモノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の濃度を表し、ｋＣＡＴ＿ＰおよびｋＣＡＴ−Ｔは、それぞれ、これらの酵素に対する触媒定数を表わす。
【００５９】
いずれの場合においても、当業者であれば、実施例に記載する方法に従って、過度の実験を行なうことなく、所望の溶液／ゲル転移およびゲル／溶液転移の反応速度論を有する生体材料を得るのに必要である様々なモノマーおよび酵素の濃度を容易に決定することができる。
【００６０】
一例として、低エネルギーの結合によりポリマーを形成し得るモノマーとして５％のＡ型ゼラチンと、バチルス・サーモプロテオリティカス・ロッコから単離されたサーモリシンと、ストレプトバーティシリウム属細菌から単離されたトランスグルタミナーゼとを含み、１９分間のゲル化時間および７４３分間の有効ゲル寿命を有する生体材料は、４０℃において、１Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼおよび０．０１２５Ｕ／ｍｌのサーモリシンを使用して得ることができる。
【００６１】
さらなる例として、低エネルギーの結合によりポリマーを形成し得るモノマーとして５％のＡ型ゼラチンと、バチルス・サーモプロテオリティカス・ロッコから単離されたサーモリシンと、ストレプトバーティシリウム属細菌から単離されたトランスグルタミナーゼとを含み、２分間のゲル化時間および５０００分を超える有効ゲル寿命を有する生体材料は、２７℃において、１Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼおよび０．０１２５Ｕ／ｍｌのサーモリシンを使用して得ることができる。
【００６２】
本発明による方法は、ゲル形態の生体材料を凍結乾燥する工程を含むと有利である。
本発明のさらなる特徴は、以下の実施例から明らかになるであろう。それらの実施例は、いかなる点においても本発明を全く制限しない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
実施例１：化学ゲル：
１−１：理論モデルの開発：
細胞外基質に対応する動的釣り合いに関する研究は、そのような動的な系の単純化した数学的モデルであって２つの拮抗する酵素反応が行なわれるモデルを構築することを可能にした。一方の反応は、可溶性モノマー（ｓ）の間に共有結合を形成して結合モノマーの網状構造（ｇ）を生じ得る酵素によって触媒される。他方の反応は、結合モノマーの網状構造（ｇ）を可溶性モノマー（ｓ）に加水分解する酵素（Ｐ）によって触媒される。特定の場合においては、最後に、同様に酵素（Ｐ）によって触媒される第３の反応は、可溶性モノマーを、網状構造に含まれるには小さすぎるか、または共有結合（Ｔ）によって可溶性モノマー（ｓ）を結合させる酵素の基質としてはもはや使用することができない分解モノマー（ｆ）に加水分解することから成る。サイクルから漏出するモノマーを生じるこの最後の反応もモデルに加えられる。モデルは、以下の反応スキームによって簡略に表わすことができる。
【００６４】
スキームＩ：
【００６５】
【化１】
この反応機構は、酵素反応を単純なミハエリアン反応（reactions michaeliennes ）と同等とみなした以下の３つの微分方程式と、第４の質量保存方程式とによって容易に記述することができる。
【００６６】
結合モノマー（ｇ）の鎖の数の時間による漸進的変化を記述する微分方程式は、以下のとおりである。
【００６７】
【数２】
溶液中におけるモノマー（ｓ）の数の時間による漸進的変化を記述する微分方程式は、以下のとおりである。
【００６８】
【数３】
分解モノマー（ｆ）の数の時間による漸進的変化を記述する微分方程式は、以下のとおりである。
【００６９】
【数４】
最後に、質量保存方程式は以下のとおりである。
【００７０】
ｇｔ＋ｓｔ＋ｆｔ＝Ｓ０
これらの微分方程式において、ＶＰおよびＶＴは、それぞれ酵素Ｐおよび酵素Ｔに対する最大速度を表わす。また、ＫＰおよびＫＴは、酵素Ｐおよび酵素Ｔに対するミハエリス定数をそれぞれ表わす。
【００７１】
従って、これらの方程式において、ＶＰおよびＶＴは以下の方程式
ＶＰ＝ｋＣＡＴ−Ｐ［Ｐ］およびＶＴ＝ｋＣＡＴ−Ｔ［Ｔ］
によって計算される。
【００７２】
この方程式をインビトロの系へ置き換える際、［Ｐ］、［Ｔ］、ＶＰ、ＶＴ、ＫＰおよびＫＴの様々な値は、定数である。
基質濃度は、各々の初期の酵素について計算され、次に、様々な微分方程式により反応の間に決定される。
【００７３】
１−２：トランスグルタミナーゼおよびサーモリシンの存在下におけるゼラチンゲル形成のモデル化
この理論モデルは、タンパク質物理ゲルの形成、より詳細には、共有結合によってゼラチンモノマーを結合させる細菌性トランスグルタミナーゼおよびプロテアーゼ：サーモリシンの存在下、４０℃における、ゼラチンのタンパク質物理ゲルの形成に適用された。
【００７４】
使用するゼラチン濃度は５％、すなわち５０ｇ・ｌ−１である。ゼラチンのペプチド配列に基づいて、側鎖の濃度（すなわち０．４５ｍｏｌ・ｌ−１）を決定することは容易に可能である。
【００７５】
使用する酵素：
プロテアーゼおよびトランスグルタミナーゼに対する様々な定数は文献において公知であるか、または当業者によく知られた方法によって容易に決定することができる（シーゲル(SEGEL) 、「Wiley Classics Library、Enzyme Kinetics 」、１９９３年）。
【００７６】
１．プロテアーゼ：
１．１−供給源：
使用するプロテアーゼは、サーモリシン、すなわちシグマ（SIGMA ）(REF:P-1512)によって上市されている細菌性メタロプロテアーゼである。この酵素は、好熱性菌株であるバチルス・サーモプロテオリティカス・ロッコから得られるタイプＸのプロテアーゼである。この酵素は特にイソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）およびアラニン（Ａｌａ）残基を認識する。この酵素は、室温で高度に安定しており、３１６アミノ酸で３４ｋＤａのモル質量を有する。
【００７７】
２．２−活性：
サーモリシンの（解離の）ミハエリス定数は、様々なタンパク質およびペプチド基質に対して文献において公知である（マツバラ（MATSUBARA ）ら、Biochem. Biophys. Res. Commun.、第２１巻、第２４２〜２４７頁、１９６５年）。これらのデータに基づいて、１ｍＭに相当するＫＰの平均値を推定することが可能である。また、様々な基質に対するサーモリシンのｋｃａｔ値も文献に記載されている（リーニュ（LIGNE ）ら、Biochim. Biophys. Acta. 、第１３３７巻、第１４３〜１４８頁、１９９７年）。さらに、これらのデータに基づいて、１０００分−１に相当するＫｃａｔの平均値を決定することが可能である。サーモリシンの特性は知られているので、ゼラチンの配列の分析により、検討中の系において、サーモリシンに対する初期の基質濃度は、従って０．１５×０．４５＝０．６
８ｍｏｌ・ｌ−１＝６８ｍＭ、すなわち６８ＫＰであると決定することができる。この濃度は飽和基質濃度に近く、従って、基質はサーモリシンの反応を制限しない。
【００７８】
また、この酵素の様々な酵素としての制約条件を、基質としてＮ−（３［２−フリル］アクリロイル）−グリシン−ロイシン−アミド( シグマ（SIGMA)）を用いて、フリル−アクロイル−グリシンおよびロイシン−アミドの形成について測定した。加水分解中における基質の消失は、３４５ｎｍで測定される光学濃度の低下をもたらす。
【００７９】
２．トランスグルタミナーゼ：
２．１−供給源：
使用するトランスグルタミナーゼは、ＡＣＴＩＶＡ ＷＭ（登録商標）という名称で味の素株式会社によって製造されている。この細菌酵素はストレプトバーティシリウム属細菌の培地中に産生される。この酵素は、３８，０００Ｄａの分子量を有する、３３１アミノ酸のポリペプチド鎖である。６４位のシステイン残基が活性部位に相当する。
【００８０】
２．２−活性：
この酵素はリジン残基を認識し、リジン残基の側鎖と他の残基の側鎖との間の共有結合の形成を触媒する。この酵素の活性は、５０〜５５℃（４０℃で１００Ｕ・ｇ−１）の温度、および広範なｐＨ領域（４．５〜９で活性であり、６〜７が最適値）において最適である。
【００８１】
この酵素の活性は、Ｎａ−ＣＢＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（シグマ）およびヒドロキシルアミンからの、４０℃で１分間に１マイクロモルのヒドロキサム酸の形成を触媒するのに必要な酵素の量から測定される。この酵素の活性を決定することを可能にする方法は以下のとおりである。
【００８２】
【表１】
次に、活性は以下の方程式：
活性（Ｕ／ｍｌ／分）＝［１００×（ＤＯ ５２５／２３８）］／酵素体積（ｍｌ）
によって計算される。
【００８３】
この基質上における様々な反応により、基質としてゼラチンを使用して、８ｍＭの解離定数Ｋｔおよび１００分−１のｋｃａｔを決定することが可能となった。ゼラチンは、わずか４％のリジンを含んでおり、従って、トランスグルタミナーゼに対する初期の基質濃度は１７ｍＭである。
【００８４】
モデル化：
予め決定された様々な値に基づいて、微分方程式に近似するオイラー法（ブロンソン（BRONSON ）、「Equations Differentielles 」、マグローヒル（McGraw-Hill ）編、１９９４年）を適用することにより、結合した画分の時間による挙動を監視することが可能である。この第１モデルにおいて、トランスグルタミナーゼとプロテアーゼとの間における活性比は、（１Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼ濃度において）１０である。加えて、ｇ０＝０およびｓ０＝６８ｍＭである。文献のデータは、トランスグルタミナーゼの作用によって、理論上の結合の１８％が有効に生成された場合に、ゼラチンゲルが得られることを示している（フックスバウアー（FUCHSBAUER）ら、Biomaterials, 、第１７巻、第１４８１〜１４８８頁、１９９９年）。
【００８５】
様々なモデルは、ＶＰに関するＶ’Ｐの変化はほとんど重要でなく、結合したタンパク質の出現の反応速度論は、ほとんど１００％の値に達する相当な初期増加と、それに続く、小さな断片が出現する速度に依存した非常に遅い減少とを示す。図１には、０．１のＶ’Ｐ／ＶＰ比率で、結合した画分の時間による漸進的変化をモデル化した例が示されている。
【００８６】
１−３：単一のトランスグルタミナーゼの存在下におけるゼラチンゲルの形成：
この理論モデルを検証するために、本発明者らは、まず、様々な量のトランスグルタミナーゼのみが存在する状態におけるゼラチンゲルの形成を監視する最初の一連の実験を行なった。
【００８７】
使用した重合可能なタンパク質：
使用したＡ型ゼラチン（Ｇ２５００）は、酸法（シグマ）を用いて豚皮から抽出される。溶液中におけるゼラチン濃度は％（重量／体積）として表わす。したがって、１％のゼラチンを含有する溶液は、１００ｍｌの溶液中に１ｇのゼラチンを含む溶液に相当する。用いるゼラチン濃度を、各実験において２〜１０％の間で変化させた。また、ゲル化温度は４０℃であった。
【００８８】
使用したトランスグルタミナーゼは上述したトランスグルタミナーゼである（１−２を参照）。これらの実験において用いたトランスグルタミナーゼ濃度は、０．１Ｕ／ｍｌ〜１Ｕ／ｍｌであった。
【００８９】
溶液／ゲル転移およびゲル／溶液転移の監視：
ゲルの形成は、ＡＲ１０００型レオメータ（ティー・エイ・インスツルメント（TA INSTRUMENT)）またはＲＳ１５０型レオメータ（サーモレオ（THERMORHEO））を使用して監視する。これらのレオメータは、２°の角度を有する６０ｍｍのコーン／プレートジオメトリーを備える。ＡＲ１０００では鋼鉄コーンが使用され、ＲＳ１５０においてはチタンコーンが使用される。
【００９０】
これらのレオメータは、試料に所与のパルスωを有する振動せん断力（cisaillement oscillatoire ）を印加することからなる振動解析または動的解析を行うことを可能にする。この運動の間、せん断応力および勾配は、時間とともに、同一のパルスで、しかし互いに対して特定の位相差を有して、正弦波的に進展する。レオメータは、ゲル化工程を監視するための多数のパラメータを測定することを可能にする。せん断弾性係数（Ｇ＊（ω）０）は、試料の粘性成分および弾性成分を表わし、下記式
Ｇ＊（ω）＝Ｇ’（ω）＋ｉＧ”（ω）
に従う複素数である。
【００９１】
Ｇ’は貯蔵弾性係数と呼ばれ、Ｇ”は損失弾性係数と呼ばれる。これらの２つの係数はパスカル（Ｐａ）で表わされる。ニュートン流体においては、貯蔵弾性係数は０であり、
損失弾性係数のみが残る。このため、損失弾性係数は粘性係数とも称される場合がある。一方、弾性固体においては、貯蔵弾性係数のみが存在する。そのため、その貯蔵弾性係数は弾性係数と称される場合がある。以下の式に従って、せん断弾性係数を損失係数および貯蔵係数に関係づけることが可能である。
【００９２】
Ｇ’＝Ｇ＊ｃｏｓδ、およびＧ”＝Ｇ＊ｓｉｎδ
前記式中、δは、応力とせん断変形との間の位相差を表わす。これらの式に基づいて、以下の比を導き出すことができる。
【００９３】
Ｔａｎδ＝Ｇ”／Ｇ’
よって、Ｔａｎδは、試料のゲル化過程の特徴付けを可能にする関連値になる。試料が液体である場合、Ｇ”＞Ｇ’かつＴａｎδ＞１である。反対に、Ｇ”＜Ｇ’かつＴａｎδ＜１であるとき．試料はゲルになる。Ｔａｎδ＝１の値に達するのに要する時間は「ゲル化時間」を表わす。下記の様々な実験において、様々な溶液に対する係数比Ｇ”／Ｇ’が時間に従って表わされ、Ｇ”／Ｇ’＝１の値は「ゲル化点」に対応する。
【００９４】
結果：
図２には、レオメータを用いて監視した、異なる濃度（０．１、０．１５、０．２、０．５および１Ｕ／ｍｌ）のトランスグルタミナーゼ存在下における４０℃の５％ゼラチン含有溶液の粘弾性の漸進的変化が示されている。すべての試験条件下において、試料は実験の開始時には実際に液体であり（Ｇ”／Ｇ’＜１）、その後、ゲルが形成され（Ｇ”／Ｇ’＞１）、時間とともに漸進的に変化する。実験はまた、ゲル化点の後、任意の所与の酵素濃度について、係数Ｇ”は１Ｐａあたりで水平になることも示している。よって、Ｇ’係数の値は酵素濃度に依存する。従って、ゲル化点の後に観察されるＧ”／Ｇ’比の変化は、Ｇ’の変化を示す。
【００９５】
図３は、トランスグルタミナーゼ濃度による、４０℃の５％ゼラチン含有溶液のゲル化速度（ゲル化時間の逆数）を示す。結果は、トランスグルタミナーゼを有する段階のみを含み、かつＧ”／Ｇ’＝１であるゲル化点までのみを含むゲル化曲線は、理論モデルに従うことを示している。
【００９６】
図４は、ゲル化点の後の、４０℃における酵素濃度に依存する酵素反応の速度を示す。結果は、ゲル化点を越えると、ゲル化曲線はもはや理論モデルに従わないことを示している。曲線はもはや線形回帰によって推定することはできず、むしろ式ｙ＝１５ｘ１．８５（図中の点線の曲線）を有する指数法則（Ｒ２は０．９８）の挙動パターンに従い得ることが理解できる。ゲル化点の後では、酵素反応はゲル中における酵素の拡散によって制限される。拡散の影響は、この速度方程式において係数１．８５によって具象化される。この係数はトランスグルタミナーゼ濃度に影響する。
【００９７】
図５は、溶液中１ユニット（黒四角）および０．４ユニット（黒菱形）の酵素の拡散を考慮した、ゲル中における活性トランスグルタミナーゼの量の経時的な漸進的変化を示す。従って、これらの実験により、ゲルの形成後、トランスグルタミナーゼの拡散係数の値は、徐々に漸進的に変化して１．８５の値に達することを示すことができた。拡散係数のこの漸進的変化は、この曲線および時間に従って容易に決定することができる。
【００９８】
従って、ゲル化中の酵素の作用は２つの連続した系に従うように見える。液体状態からほぼゲル化点までの第１の系は、拡散によって制限されず、従来の酵素学の規則が当てはまる。そのとき、反応速度は酵素濃度の線形関数である。ゲル化点の後の第２の系は、酵素の拡散の速度をもはや無視できず、反応の見かけの速度が制限される、非従来的な環境である。
【００９９】
２％および１０％の異なるトランスグルタミナーゼ濃度を有するゼラチンゲル上で行なった実験により、ゲル化中に同様の挙動を確認することができた。これらの条件においては、上記のように容易に決定できる特定の拡散係数が各種類のゲルについて有効である。
【０１００】
１−４：トランスグルタミナーゼおよびサーモリシンの存在下におけるゼラチンゲル形成の新規なモデル化：
前記（１−２を参照）と同一のパラメータを使用して、１０のＶＴ／ＶＰ比および０．０５のＶ’Ｐ／ＶＰ比を用いてゼラチンゲルをモデル化する。しかしながら、酵素の反応速度に対する、５％ゼラチン含有ゲルによる拡散の制限の効果は、先に記載した微分方程式に取り入れられている（１−２を参照）。したがって、トランスグルタミナーゼ濃度には、下記式：
ＶＴ＝ｋＣＡＴ−Ｔ［Ｔ０］１．８５
に従う、ゲル化点が過ぎると直ちに反応平衡を示す式において１．８５の指数が与えられる。
【０１０１】
先に行なわれた研究は、非常に低い酵素濃度、特に１ｎＭ未満の酵素濃度を有する状態においてのみ拡散がゲルの加水分解を制御する（ファーダ(FADDA) ら、Biophys. J. 、第８５巻（５）、２８０８〜２８１７頁、２００３年）が、より高濃度においては制御しないことが示されている（ベリー（BERRY ）ら、Biochim. Biophys. Acta. 、第１５２４巻、１１０〜１１７頁、２０００年；ジロウディア（GIRAUDIER)ら、Biomacromolecules 、第５巻（５）、１６６２〜１６６６頁、２００４年）。従って、方程式中のサーモリシン濃度には係数は適用されなかった。
【０１０２】
図６は、拡散の制限を有し、１０のＶＴ／ＶＰ比（１Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼ濃度）で、結合した画分の時間による漸進的変化をモデル化した結果を表わす。このモデル化の過程から、上記タンパク質環境が、８０分後に最初にゲル化点を通過する溶液／ゲル転移と、続いて３３０分後に２回目のゲル化点通過を行なうゲル／溶液転移とを連続的に行なうことが明らかになる。本発明者らによって確立されたモデルによれば、得られるタンパク質環境は、溶液／ゲル転移、次いでゲル／溶液転移を連続的に行う能力を有するとともに、ゲル状態を２５０分間の期間にわたって保持するといった新規な特性を有する。
【０１０３】
更に、拡散効果は有るか全く無いかのいずれかであって、具体的にはゲル化する転移の前には制限はなく、この転移の後には完全な制限を有するものと考えられる。先に実施した実験（１−３を参照）は、ゲル中で共有結合が網状に展開されるにつれて、拡散に対する制限が増大することを示すことを可能にした。この緩やかな効果は、モデルにおいて、下記式：
ＶＴ＝ｋＣＡＴ−Ｔ［Ｔ０］α
（式中、αは、時間に従って１．１から１．８５まで双曲線状に変化する（図５参照））を用いることにより考慮される。
【０１０４】
図７は、緩やかな拡散の制限および様々なＶＴ／ＶＰ比（１Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼ濃度）を有する、結合した画分の時間による漸進的変化をモデル化した結果を示す。この場合の結果もまた、示した様々なＶＴ／ＶＰ比について、溶液／ゲル転移およびゲル／溶液転移を示す。１０のＶＴ／ＶＰ比については、該タンパク質環境は１５分でゲル化点に達し、次いで、ゲルは１６５分後にゲル／溶液転移を行なう。先述のモデルに関連して、拡散に対する緩やかな制限は、先のモデルでは２５０分であった代わりに、１５０分間にわたってゲルを得ることを可能にする。
【０１０５】
１−５：トランスグルタミナーゼおよびサーモリシンの同時存在下におけるゼラチンゲルの形成：
先に記載した理論モデル（１−４を参照）を検証するために、ゼラチンおよびトランスグルタミナーゼを使用して、先に用いたのと同一の条件下において（１−３を参照）、様々な実験を行なった。加えて、プロテアーゼ、すなわちサーモリシンも初期の溶液に添加する。ゲルの形成は、４０℃において、用いたトランスグルタミナーゼ濃度およびサーモリシン濃度に従って、経時的に監視した。得られた結果を、理論モデルの予測と比較して、下記の表Ｉに示す。
【０１０６】
【表２】
上記結果は、開発した理論モデルに従って、２つの拮抗する酵素活性の存在下において、共有結合によって重合し得るモノマーの溶液（この場合、種々のトランスグルタミナーゼ濃度およびサーモリシン濃度を有する状態下における５％ゼラチン含有溶液）から、溶液／ゲル転移、次いでゲル／溶液転移を連続的に得ることが実験的に可能であることを示している。
【０１０７】
そのようなゲルが、トランスグルタミナーゼ活性のみに依存する時間の後のすべてのシミュレーションにおいて得られる場合、上記の様々な実験は最初の溶液／ゲルの転移に対する閾値を構成するＶＴ／ＶＰ比が存在することを示している。トランスグルタミナーゼおよびサーモリシンの存在下における５％のゼラチン含有溶液の場合には、この最初の溶液／ゲルの転移を得るための臨界ＶＴ／ＶＰ比は、７５〜８０に含まれる。
【０１０８】
上記の様々な実験は、各トランスグルタミナーゼ濃度およびサーモリシン濃度に応じたゲル化時間および有効なゲル寿命も確認する。
図７は、異なる濃度のトランスグルタミナーゼおよびサーモリシンの存在下における５％ゼラチン溶液の４０℃での実験による粘弾性の漸進的変化を示す。
【０１０９】
よって、開発された理論モデルに従って、溶液／ゲル転移およびゲル／溶液転移を連続
的に実施することができる生体材料を得ることが可能である。これについては、使用するモノマーおよび酵素に従って、この最初の溶液／ゲルの転移を得るための、結合モノマーを分解する酵素に対するモノマーを結合させる酵素の臨界比を実験的に決定すれば十分である。次に、理論モデルにより、一方では所望のゲル化時間を有し、他方では所望の有効なゲル寿命を有するゲルを得るために、最低でも様々な酵素濃度について適応させることが可能となる。
【０１１０】
１％のアルギナートまたはオリゴアルギナートを５％ゼラチン含有溶液に添加した追加実験を行なった。この場合においても、溶液／ゲル転移、およびそれに続くゲル／溶液転移が得られた。
【０１１１】
１−６：トランスグルタミナーゼおよび様々なプロテアーゼの同時存在下におけるゼラチンゲルの形成：
様々なプロテアーゼを用いて、開発したモデルを確認した。
【０１１２】
トリプシン（ＥＣ ３−４−２１−４）は、リジンおよびアルギニンの上流のペプチド結合を加水分解するセリンプロテアーゼである。使用したトリプシンは、雌ウシ膵臓由来のものであり、シグマ（Ｓｉｇｍａ、Ｔ−１４２６）によって上市されている。この酵素の活性は、ｐ−トシルアルギニンメチルエステル（シグマ、Ｔ４６２６）の加水分解を触媒するのに必要な酵素量によって測定される。
【０１１３】
コラゲナーゼ（ＥＣ ３．４．２４．３）は、特にコラーゲンを含む鎖に見られるＰｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ配列中のＸ−Ｇｌｙペプチド結合を特異的に加水分解する。使用したコラゲナーゼは、ＩＡ型クロストリジウム・ヒストリチカム由来であり、シグマ（Ｃ−９８９ｌ）によって上市されている。この酵素の活性は、Ｎ−（３−［２−フリル］アクリロイル）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡｌａまたはＦＡＬＧＰＡ（シグマ、Ｆ−５１３５）の加水分解を触媒するのに必要な酵素の量によって測定される。
【０１１４】
これらの酵素活性は、発色団基を有する合成ペプチドの加水分解について測定されるので、サーモリシンの活性は、比較しやすくするために、Ｎ−（３−（２−フリルアクリロイル）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−アミド（シグマ、Ｎ−７３８３）の加水分解において測定した。これは、いくつかのプロテアーゼとともに表中に報告される活性である。
【０１１５】
ゲルについては、ゼラチン濃度は７％であり、ゲル化温度は４０℃であった。使用したトランスグルタミナーゼは、先に記載したトランスグルタミナーゼである。ゲルは、１−５におけるように経時的に監視した。得られた結果を下記の表ＩＩに示す。
【０１１６】
【表３】
従って、上記結果は、モデルを他のプロテアーゼに対して一般化することができることを示している。
【０１１７】
実施例２：物理ゲル：
２−１：理論モデルの開発：
このモデルは、物理ゲルを形成する場合であって、かつ単一の酵素活性の存在下においてのみ観察される動的釣り合いを示す。従って、ゲル化は、溶液中のモノマー（ｓ）間における低エネルギー結合（ファン・デル・ワールス、水素結合、疎水結合など；Ｈ）の形成のみの結果として生じる。例えば、タンパク質の場合には、タンパク質の高分子電解質特性は、ほとんどすべてのタンパク質が物理ゲルを形成することができることを意味している。ゲルの結合モノマー（ｇ）の鎖に相当するポリマーの分解は、それらのポリマーを加水分解して可溶性モノマー（ｓ）とする酵素（Ｐ）によって触媒される。最後に、特定の場合には、酵素（Ｐ）によって触媒される第３の反応も存在する。第３の反応は、可溶性モノマーを分解モノマー（ｆ）に加水分解することから成る。分解モノマー（ｆ）は、小さすぎるので網状構造の一部にはなり得ないか、またはもはや他の可溶性モノマーとの結合を形成し得ない。サイクルから漏出するモノマーを生じるこの最後の反応もモデルに加えられる。モデルは、以下の反応スキームによって簡略に表わすことができる。
【０１１８】
スキームＩＩ：
【０１１９】
【化２】
この第２の場合において、反応機構は、酵素反応を単純なミハエリアン反応と同等と見なす以下の３つの微分方程式と、第４の質量保存方程式とによって容易に記述することができる。
【０１２０】
結合モノマー（ｇ）の鎖の数の時間による漸進的変化を記述する微分方程式は、以下のとおりである。
【０１２１】
【数５】
溶液中のモノマー（ｓ）の数の時間による漸進的変化を記述する微分方程式は、以下のとおりである。
【０１２２】
【数６】
分解モノマー（ｆ）の数の時間による漸進的変化を記述する微分方程式は、以下のとおりである。
【０１２３】
【数７】
最後に、質量保存方程式は不変である。
【０１２４】
ｇｔ＋ｓｔ＋ｆｔ＝Ｓ０
これらの微分方程式において、ＶＰは、モノマーを分解する酵素の最大速度を表わし、ＫＰはその酵素のミハエリス定数を表す。
【０１２５】
これらの微分方程式において、ＶＰは以下の方程式：
ＶＰ＝ｋｃａｔ＿ｐ［Ｐ０］
によって計算される。
【０１２６】
さらに、低エネルギー結合の形成速度を表わすＶＨは、使用されるモノマーに依存する。
この方程式のインビトロの系への置き換えにおいて、［Ｐ］、［Ｔ］、ＶＰ、ＶＨおよびＫＰの様々な値は定数である。
【０１２７】
基質濃度を開始時に計算し、次に、反応の間においては、基質濃度は様々な微分方程式によって決定される。
２−２：サーモリシン存在下における２７℃での物理ゼラチンゲル形成のモデル化：
この理論モデルは、物理タンパク質ゲルの形成、より詳細には、サーモリシン存在下における２７℃でのゼラチンの物理タンパク質ゲルの形成に適用された。この温度において、ゼラチンは、モノマーが部分的に三重らせん体へと会合することによりゲルを形成する。温度を低下させることにより、水素結合によって安定した三重らせん体が出現する。
【０１２８】
ゼラチン：
１−説明：
ゼラチンはコラーゲンから得られる。コラーゲンは、大きな前駆物質すなわちプロα鎖の形で合成される。プロコラーゲンの形成は、水素結合により３本のプロα鎖が集合することと、特定のプロリンおよびリジン残基がヒドロキシル化されてそれぞれヒドロキシプロリンおよびヒドロキシリジンを形成することとを伴う。最後に、細胞外の環境にプロコラーゲンが分泌された後、プロコラーゲンは、プロペプチドが切断されて成熟型となりコラーゲンを形成する。その後、形成されたコラーゲンは、他のコラーゲン分子と会合してコラーゲン細線維を形成し、該コラーゲン細線維は集合してコラーゲン線維を形成する。
【０１２９】
３本のプロα鎖の会合によって形成される三重らせん体の安定性は、得られる生物によって異なる。従って、変性温度（Ｔｍ）は、ある種の哺乳動物における４１．５℃から北極水域に住むある種の魚類における６℃までに及ぶ。Ｔｍの変動は、分子内のヒドロキシプロリンのレベルと関連がある（ペルシコフ（PERSIKOV）ら、Biochemistry、第３９巻、第１４９６０〜１４９６７頁、２０００年）。
【０１３０】
ゼラチンは、コラーゲンを含む組織の酸処理またはアルカリ処理によって得られる。前記処理は、コラーゲンの三重らせん体の変性を生じる（ペズロン(PEZRON)、physical Networks.、Londres Elsevier Applied Science、１９９０年）。本研究では、使用するゼラチンは酸処理によって得られるＡ型ゼラチンである。
【０１３１】
半希釈ゼラチン溶液がコラーゲン鎖の変性温度未満に冷却されると、ゲルが形成される。このとき、鎖が会合して、未変性コラーゲンの三重らせんに類似した三重らせん部分を形成する。この構造遷移は、存在する水分子を捕捉する三次元網状構造の形成を可能にする。従って、形成されたゲルは、三重らせん体が水素結合（弱い結合）によって安定化されただけの物理ゲルである。これらの結合は、温度を増大させることにより不安定になってゲルの溶解をもたらしうる。従って、このゲル化現象は可逆的である。
【０１３２】
従来の研究から、このゲルの弾性は試料中のらせん体の濃度のみに依存することが示されている（ジョリー‐デュアメル（JOLY-DUHAMEL）ら、Langmuir、第１８巻、第７１５８〜７１６６頁、２００２年；ジョリー‐デュアメル（JOL Y-DUHAMEL）ら、Langmuir、第
１８巻、第７２０８〜７２１７頁、２００２年）。
【０１３３】
２−濃度：
使用するゼラチン濃度は、実施例１で説明したゼラチン濃度と同一である。
３−らせん体の形成速度：
三重らせん体の形成速度（ＶＨ）は、偏光分析によって時間または温度に伴うまり構造／らせん構造の変化を監視することによって決定した。実際、三重らせん体の形成に起因するわずかなねじれは、試料を通過する偏光を若干回転させる。この研究は、パーキン・エルマー（PERKIN ELMER）３４１偏光計またはＪＡＳＣＯ１１００偏光計を使用して実施された。測定値は４３６ｎｍで得られた。
【０１３４】
Ａ型ゼラチン（Ａ型またはＡＰ１型）の形成速度論の偏光分析による研究から、各ゼラチンに対して、２７℃におけるらせん体の割合（％）の時間による漸進的変化を測定することが可能となる。図９は、０．５℃／分の割合で４０℃から２７℃まで冷却した場合の、使用した２種のＡ型ゼラチン（Ａ型およびＡＰ１型）の５％含有溶液中のらせん体の割合の時間による漸進的変化を示す。
【０１３５】
らせん体出現の反応速度論の結果は、双方の試料においてほぼ同一である。ゲル化時間では、らせん体の割合（％）は２種のゼラチンにおいて同一（４０分において６．４％）である。
【０１３６】
らせん体の形成速度は、図９から容易に計算することができる。図１０はまた、トランスグルタミナーゼが存在しない物理ゲル（黒四角）、およびトランスグルタミナーゼの存在下で得られた化学ゲル（白丸）における、らせん体の割合（％）の時間および温度による漸進的変化を示す。らせん体の出現速度を様々な時間間隔に対して決定し、本モデルにおいて使用した。したがって、図１０かつ物理ゲルについては、ＶＨは、１０分間に４５×１０−５Ｍ・分−１、１０分間に２１×１０−５Ｍ・分−１、２０分間に９×１０−５Ｍ・分−１、次いで次の９０分間に４．５×１０−５Ｍ・分−１、および最後に２．５×１０−５Ｍ・分−１である。
【０１３７】
同様の実験を２〜１０％のゼラチンを含有するゲルを使用して行なった。
酵素：
使用したプロテアーゼは、実施例１において使用したサーモリシンである。従って、上記と同一のパラメータが用いられる。しかしながら、この温度における２つの酵素の感度の違い：
・ＴＬに対して（Ｖｉ４０℃＝１．６６Ｖｉ２７℃）
・ＴＧに対して（Ｖｉ４０℃＝２．６８Ｖｉ２７℃）
を考慮する。
【０１３８】
モデル化：
予め決定された様々な値に基づいて、上記のように、微分方程式を解くためにオイラー近似法を適用することにより、結合した画分の挙動を時間に従って監視することが可能である。異なるサーモリシン濃度を用いて、いくつかのモデル化実験を行なった。
【０１３９】
図１１は、２７℃での種々の濃度のサーモリシン存在下における結合鎖の割合（％）の漸進的変化をモデル化するいくつかの例を示す（ゲル化閾値はらせん体６．４％である）
。得られた結果から、転移は、ＶＰの特定の値に対して可能であり、すべての場合において、加水分解による小さな断片の漏出は網状構造の分解を生じ、従って形成されたゲルの可溶化をもたらすことが示される。
【０１４０】
２−３：サーモリシンの存在下における物理ゼラチンゲルの形成：
この理論モデルを検証するために、上記に記載した方法（２−２を参照）と同一の方法によって、種々の濃度のサーモリシンを加えて様々な実験を行なった。得られた結果を、理論モデルの予測と比較して、下記の表ＩＩＩに示す。
【０１４１】
【表４】
この場合の結果もまた、開発された理論モデルに従って、溶液／ゲル転移およびその後に続くゲル／溶液転移を実験的に得ることが可能であり、このことは、低エネルギー結合の形成によって重合し得るモノマーの溶液から、結合したポリマー鎖を分解し得る酵素の存在下において（この場合、様々な濃度のサーモリシン存在下の２７℃の５％ゼラチン含有溶液で）可能であることを示している。
【０１４２】
試験したすべてのサーモリシン濃度（０．００１〜０．１Ｕ／ｍｌ）において、ゲルが形成されると、該ゲルは最終的には融解することが観察される。これは開発した理論モデルに合致している。
【０１４３】
サーモリシンが存在する２７℃の５％ゼラチン含有溶液の場合には、最初の溶液／ゲルの転移を得るための臨界サーモリシン濃度は、０．０１ユニットである。
次に、ゲル化時間も使用するサーモリシン濃度に依存する。
【０１４４】
図１２は、２７℃における異なるサーモリシン濃度を有する５％ゼラチン含有溶液の粘弾性の実験上の漸進的変化を示す。
よって開発した理論モデルに従って、溶液／ゲル転移およびゲル／溶液転移を連続的に実施することができる生体材料を得ることが可能である。この目的のためには、低エネルギーの相互作用によって結合したモノマーの鎖を分解し得る酵素の臨界濃度を測定するこ
とで十分である。次に、理論モデルによって、一方では所望のゲル化時間、および他方では所望の有効なゲル寿命を有するゲルを得るために酵素濃度を適応させすることが可能となる。
【０１４５】
実施例３：混合ゲル：
３−１． 理論モデルの開発：
この統合モデルは、２つの拮抗する酵素活性の存在下における混合ゲル（物理ゲルおよび化学ゲル）の形成によって得られる動的釣り合いに対応する。該モデルは、以下の（スキームＩおよびＩＩからのデータを統合する）反応スキームによって簡略に表わすことができる。
【０１４６】
スキームＩＩＩ：
【０１４７】
【化３】
この第３の場合において、反応機構は、酵素反応を単純なミハエリアン反応と同等とみなす以下の３つの微分方程式と、第４の質量保存方程式とによって容易に記述することができる。
【０１４８】
結合モノマー（ｇ）の鎖の数の時間による漸進的変化について記述する微分方程式は、以下のとおりである。
【０１４９】
【数８】
溶液中のモノマー（ｓ）の数の時間による漸進的変化について記述する微分方程式は、以下のとおりである。
【０１５０】
【数９】
分解モノマー（ｆ）の数の時間による漸進的変化について記述する微分方程式は、以下のとおりである。
【０１５１】
【数１０】
最後に、質量保存方程式は以下のとおり：
ｇｔ＋ｓｔ＋ｆｔ＝Ｓ０
である。
【０１５２】
これらの微分方程式では、ＶＨは、低エネルギーの結合の形成速度を表し、使用されるモノマーに依存する。ＶＰおよびＶＴは、酵素Ｐおよび酵素Ｔの最大速度をそれぞれ表す。また、ＫＰおよびＫＴは、酵素Ｐおよび酵素Ｔのミハエリス定数をそれぞれ表す。
【０１５３】
この方程式のインビトロ系への置き換えにおいて、［Ｐ］、［Ｔ］、ＶＰ、ＶＴ、ＫＰおよびＫＴの様々な値は、定数である。
３−２：トランスグルタミナーゼおよびサーモリシン存在下における、２７℃での混合ゼラチンゲル形成のモデル化：
この理論モデルは、混合タンパク質ゲルの形成、より詳細にはトランスグルタミナーゼおよびサーモリシン存在下における２７℃でのゼラチンの、混合タンパク質ゲルの形成に適用された。
【０１５４】
ゼラチン：
実施例１および２と同一のゼラチン濃度を用いる。らせん体形成の速度は実施例２に記述したものと同一である。
【０１５５】
酵素：
使用するプロテアーゼは、実施例１および２において使用したサーモリシンである。
トランスグルタミナーゼは、実施例１で使用したトランスグルタミナーゼと同一のものである。トランスグルタミナーゼの活性に対する拡散の影響を考慮するために、実施例１で説明したように、拡散係数を取り入れた。
【０１５６】
したがって、これらの２つの酵素に使用されたパラメータは前述したパラメータと同一である。
モデル化：
予め決定した様々な値に基づいて、上記のような微分方程式の近似のためのオイラー法を適用することにより、結合した画分の時間による挙動を監視することが可能である。いくつかのモデル化実験を、異なるトランスグルタミナーゼ濃度およびサーモリシン濃度を用いて行なった。実施例１に記載したように、トランスグルタミナーゼに対しては拡散係数を適用した。
【０１５７】
図１３は、異なるＶＴ／ＶＰ比率（１Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼ濃度）に対する結合モノマーの画分の時間による漸進的変化を示す。
上記結果は、一方では、ゲル化が先の実施例の場合よりも速く生じることを示唆しており、他方では、本実施例においては、結合モノマーの画分およびゲルの安定性が物理ゲルまたは化学ゲルの場合より重要であることを示唆している。
【０１５８】
３−３：サーモリシンの存在下における混合ゼラチンゲルの形成：
先に記載した理論モデルを検証するために、５％のゼラチンを含有する４０℃の試料について、トランスグルタミナーゼ／サーモリシン比が８０でトランスグルタミナーゼ濃度が１Ｕ／ｍｌである２つの酵素トランスグルタミナーゼおよびサーモリシン存在下において実験を行った。溶液を毎分０．５℃の割合で４０℃から２７℃まで冷却した。ゼラチン溶液の漸進的変化は、上述したように、レオロジーおよび偏光分析によって同時に監視した。得られた結果を、理論モデルの予測と比較して、下記の表ＩＶに示す。
【０１５９】
【表５】
上記結果は、開発した理論モデルに従って、低エネルギー結合および共有結合によって重合し得るモノマー溶液から、２つの拮抗する酵素活性存在下において（この場合、２７℃の５％ゼラチン含有溶液で異なる濃度のトランスグルタミナーゼおよびサーモリシン存在下において）、溶液／ゲル転移と、それに次いでゲル／溶液転移とを連続的に得ることが実験的に可能であることを示している。
【０１６０】
開発された理論モデルに従い、ゲル生成時間は非常に迅速である。さらに、得られた「混合」ゲルの安定性および有効寿命は、物理ゲルおよび化学ゲルの双方と比較して非常に高い。
【０１６１】
図１４は、トランスグルタミナーゼおよびサーモリシン存在下、２７℃における５％ゼラチン含有溶液の粘弾性およびらせん体の割合（％）の同時進行の漸進的変化を示す。前
記５％ゼラチン含有溶液はトランスグルタミナーゼ／サーモリシン比は８０、トランスグルタミナーゼ濃度は１Ｕ／ｍｌである。
【０１６２】
２つの先の理論モデルに基づいて開発した理論モデルに従って、溶液／ゲル転移およびゲル／溶液転移を連続的に行なうことができる生体材料を得ることが可能である。これについては、使用するモノマーおよび酵素に従って最初の溶液／ゲルの転移を得るために、実施例１におけるように、モノマーを結合させる酵素／結合モノマーを分解する酵素の臨界比を実験的に決定することで十分である。その後、理論モデルにより、一方では所望のゲル化時間、他方では所望の有効なゲル寿命を有するゲルを得るために、様々な酵素濃度を適応することが可能となる。
【０１６３】
３−４：様々なプロテアーゼの存在下におけるゼラチンの物理ゲルの形成：
３−３で得られた結果を確認するために、７％ゼラチン含有試料について、４０℃、１．５Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼ濃度としてトランスグルタミナーゼおよび様々なプロテアーゼの存在下において、実験を行った。溶液を、毎分０．５℃の割合で、４０℃から２７℃まで冷却した。上述したように、ゼラチン溶液の漸進的変化をレオロジーおよび偏光分析によって同時に監視した。得られた結果を、下記の表Ｖに示す。
【０１６４】
【表６】
これらの結果もまた、開発したモデルを他の酵素に対して一般化することができることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】０．１のＶ’Ｐ／ＶＰ比率における、結合した画分の時間による漸進的変化をモデル化した例を示す図。
【図２】レオメータを用いて監視した、異なる濃度（０．１、０．１５、０．２、０．５および１Ｕ／ｍｌ）のトランスグルタミナーゼ存在下における４０℃の５％ゼラチン含有溶液の粘弾性の漸進的変化を示す図。
【図３】トランスグルタミナーゼ濃度による、４０℃の５％ゼラチン含有溶液のゲル化速度（ゲル化時間の逆数）を示す図。
【図４】ゲル化点の後の、４０℃における酵素濃度に依存する酵素反応の速度を示す図。
【図５】溶液中に１ユニット（黒四角）および０．４ユニット（黒菱形）の酵素の拡散を考慮した、ゲル中における活性トランスグルタミナーゼの量の経時的な漸進的変化を示す図。
【図６】拡散の制限を有し、１０のＶＴ／ＶＰ比（１Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼ濃度）で、結合した画分の時間による漸進的変化をモデル化した結果を示す図。
【図７】緩やかな拡散の制限および様々なＶＴ／ＶＰ比（１Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼ濃度）を有する、結合した画分の時間による漸進的変化をモデル化した結果を示す図。
【図８】異なる濃度のトランスグルタミナーゼおよびサーモリシンの存在下における５％ゼラチン溶液の４０℃での実験による粘弾性の漸進的変化を示す図。
【図９】０．５℃／分の割合で４０℃から２７℃まで冷却した場合の、使用した２種のＡ型ゼラチン（Ａ型およびＡＰ１型）の５％含有溶液中のらせん体の割合の時間による漸進的変化を示す図。
【図１０】トランスグルタミナーゼが存在しない物理ゲル（黒四角）、およびトランスグルタミナーゼの存在下で得られた化学ゲル（白丸）における、らせん体の割合（％）の時間および温度による漸進的変化を示す図。
【図１１】２７℃での種々の濃度のサーモリシン存在下における結合鎖の割合（％）の漸進的変化をモデル化するいくつかの例を示す図（ゲル化閾値はらせん体６．４％）。
【図１２】２７℃における異なるサーモリシン濃度を有する５％ゼラチン含有溶液の粘弾性の実験上の漸進的変化を示す図。
【図１３】異なるＶＴ／ＶＰ比率（１Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼ濃度）に対する結合モノマーの画分の時間による漸進的変化を示す図。
【図１４】トランスグルタミナーゼおよびサーモリシン存在下、２７℃における５％ゼラチン含有溶液の粘弾性およびらせん体の割合（％）の同時進行の漸進的変化を示す図。前記５％ゼラチン含有溶液はトランスグルタミナーゼ／サーモリシン比は８０、トランスグルタミナーゼ濃度は１Ｕ／ｍｌである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲル化の分野において、制御された溶液／ゲルの転移と、次いでゲル／溶液の転移とを連続的に実施することが可能である生体材料、およびそのような生体材料を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲルは、その特異性により、多数の分野、特に食品、化粧品、および医薬品において用いられている。ゲルは、少なくとも２つの成分から成り、そのうちの明らかに主成分である成分は液体溶媒に相当し、他方の成分は前記溶媒内に分散された固体に分類できる成分である。液体状態における溶液または分散物に基づいて、ゲルの形成は固体粒子の部分的な凝集に起因する。この変化は溶液／ゲル転移と呼ばれる。
【０００３】
「物理」ゲルを得るための組成は、従来技術においてよく知られている。物理ゲルは、低エネルギーの結合（ファン・デル・ワールス結合、水素結合、極性結合など）によって互いに結合されたモノマーから構成された高分子集合体である。この集合体の安定性は、特定の範囲の物理化学的条件（ｐＨ、モノマー濃度、温度、溶媒の量、イオン力など）に関連している。この範囲の外においては、ゲルは再び溶液になる。そのため、溶液／ゲル転移は、物理ゲルにおいては可逆的である。したがって、物理ゲルの構造は、物理化学的環境に対して非常に敏感であり、溶媒の特性のごくわずかな変化によってこの構造が完全に破壊され、それにより、ゲル−溶液転移を生じ得る。反対に、溶媒の特性のわずかな変化によって、ゲルを生じるポリマーの会合が行なわれ得る。
【０００４】
従来技術においては、「化学」ゲルに分類されるゲルも知られている。化学ゲルもまた高分子集合体であり、その高分子集合体が含んでいるモノマーは高エネルギー結合（共有結合）によって関連付けられている。そのため、この集合体は非常に安定している。しかしながら、結局のところ、これらの化学ゲルは高い安定性を有するが、ゲル／溶液転移を行うことができる唯一の方法としては、ポリマーの共有結合を破壊するしかない。このため、この種類のゲル／溶液転移は不可逆的であると称される。
【０００５】
化学ゲル群は酵素によって触媒されたゲルに相当する。このゲル化様式は、主として、主要な生物学的過程において観察される。血液凝固、瘢痕形成、表皮形成および細胞外基質の会合は、可溶性タンパク質からゲル状態への転移が不可欠である生物学的過程であり、それらは酵素群、すなわち、ゲル化過程において不可欠であるトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を共用する。この群のタンパク質は広く存在し、原核生物および真核生物において等しく見られ得る。ヒトでは、異なる８つのトランスグルタミナーゼが見られる。これらの酵素は、タンパク質のグルタミニル側鎖上にアミン基を含める性質を有する。この活性は、タンパク質の間に共有結合を形成することを可能にする。トランスグルタミナーゼは、このように生物学的にゲル化された網状構造の形成に関与するタンパク質の重合を触媒する。トランスグルタミナーゼは、食品産業において、特にすり身の製造または多数の食肉派生品（ハム、再構成食品など）を硬化させるために、多数のタンパク質からゲルを得ることを可能にする。これらの重合可能なタンパク質の例としては、ゼラチン、フィブリン、グリアジン、ミオシン、グロブリン（７Ｓおよび１１Ｓ）、アクチン、ミオグロビン、乳漿タンパク、特にカゼインおよびラクトグロブリン、大豆タンパクおよび小麦タンパク、特にグルテニン、並びに卵白および卵黄、特に卵アルブミンが挙げられる。
【０００６】
最も一般的に使用されるタンパク質ゲルの１つは、ゼラチンゲルである。ゼラチンは、遍在する構造を有するタンパク質であるコラーゲンから得られる。コラーゲンは、モノマ
ーまたは三重らせん体構造に会合したトリマーの形態にある可溶状態で見られ得る。これらの三重らせん体は細線維として会合し、細線維は線維として会合し得る。コラーゲン三重らせん体は体温では不安定である。ゼラチンはコラーゲンの変性によって得られる。そのため、コラーゲンを含む組織に、コラーゲン三重らせん体を変性させる酸処理またはアルカリ処理を行なう。従って、線維を形成する可能性は完全に失われる。酸処理はＡ型ゼラチンの形成をもたらし、アルカリ処理はＢ型ゼラチンを生成する。従って、ゼラチン溶液は分離されたコラーゲン鎖（コラーゲンモノマー）から成る。ゼラチンは多くの用途を有するので、物理ゲルが存在できない条件下（高温、極端なｐＨ、または特定のイオン力）において、ゼラチンゲルを生成することが必要な場合がある。ゲルに必要な網状構造を形成するために、次に、ゼラチン鎖は、共有結合、特にトランスグルタミナーゼの作用によって絡み合わせられる。このように得られたゲルは化学ゲルである。
【０００７】
現在、それらの改善された安定性により、多数の分野で化学ゲルの使用が必要とされている。しかしながら、化学ゲルの「不可逆性」により、化粧品、食品または医薬品工業などにおけるそれら化学ゲルの潜在的な用途は制限される。従って、様々なゲルの機械的性質をより良好に制御することは、ゲルの可能性を増大させるために不可欠な課題となる。
【０００８】
生体生物の分析は、非常に動的な系の存在を示す。生体組織において、細胞は、タンパク質に富む細胞外基質（ＥＣＭ）と呼ばれる構造と相互作用する。この構造は、主として上皮細胞下、および結合組織の周囲に位置している。細胞は、弾性に影響するコラーゲンまたは接着機構に影響するフィブロネクチンのような細胞外基質の様々な成分を合成することができる。同時に、細胞は、細胞外基質の分解に作用するプロテアーゼも生成する。従って、細胞は細胞外基質の形成および分解に対して同時効果を有する。従って、細胞外基質の構造は、不可逆な静的構造でなく、細胞によって合成されるタンパク質の形成作用と分解作用とのバランスから生じる動的釣り合いに対応する。
【０００９】
同様に、凝集機構に応答して形成されるクロットも動的な系を構成する。したがって、酵素因子のカスケードの合成は、可溶性タンパク質の網状構造の形成に起因する不溶性クロットの形成をもたらす。このクロットは後で瘢痕形成反応の間に除去される。
【００１０】
これらの動的釣り合いにおいて、タンパク質網状構造は会合して不溶性となりゲルを形成する。これは溶液／ゲル転移と同等と見なすことができる。同時に、タンパク質網状構造はまたプロテアーゼの作用によって破壊される。この場合、この種の転移はゲル／溶液転移に類似している。従って、時には、初期にはクロットが形成され、次いでクロットは分解され、よく理解されていない機構による他の反応に移行する、凝集においてのような連続的転移を見ることが可能である。
【００１１】
これらの生物学的過程における溶液／ゲル転移は、最も多くの場合において、上記に記載したトランスグルタミナーゼ群に関連している。一方、反対の転移、すなわち、ゲル／溶液の転移は、タンパク分解酵素の拮抗的活性に関連している。
【００１２】
最も研究された群のうちの１つは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の群である。ＭＭＰは、細胞外基質中のほとんどのタンパク質を分解する亜鉛依存性エンドペプチダーゼの群を形成する。しかしながら、多数の異なるプロテアーゼ群が存在する。プロテアーゼ群の例としては、セリンプロテアーゼ、例えばトリプシン、マトリプターゼ、システインおよびアスパラギン酸プロテアーゼ、例えばカテプシンＢおよびＬならびにカテプシンＤおよびＣ、さらにＡＤＡＭファミリーが挙げられる。
【００１３】
トランスグルタミナーゼまたはメタロプロテアーゼのような、この種の反応を組み合わせる多数の酵素が、生化学者および酵素学者によって特徴付けられている。従って、これ
らの酵素の説明、特にそれらに関連した様々な定数の記述はよく管理されている。さらに、それらの挙動は、溶液中でかつ単独の場合にはよく知られているが、これは、ゲル環境で、かつ拮抗的な活性が存在している事例ではない。
【００１４】
本発明者らおよび他のチームによって行なわれたモデル化の研究により、インビボにおいて存在するこの動的釣り合いに関与するパラメータを理解することが可能になった。本発明者らが行なった最近のモデル化および実験の研究により、この動的釣り合いの新しいモデルを開発することが可能となった。その新しいモデルは動的釣り合いに関与するパラメータをより高い精度で統合する。
【００１５】
驚いたことに、本発明者らによって実施されたモデル化は、そのような動的釣り合いを「インビトロ」で得ることが可能であることを示した。従って、本発明者らは、所与の条件下、および特に以下の所与の反応速度論における溶液／ゲルおよびゲル／溶液の転移を連続的に実施することができるタンパク質ゲルを得ることが可能となった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、溶液／ゲルの転移と、次いでゲル／溶液の転移とを連続的に実施することが可能である生体材料、およびそのような生体材料を調製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
従って、本発明の第１の目的は、好ましくは低エネルギー結合によってポリマーを形成し得る少なくとも１種のモノマーまたは前記モノマーとそれらのポリマーとの混合物と、前記ポリマーを分解し得る第１の種類の酵素とを含む生体材料に関連する。前記生体材料はゲル形態または溶液形態のいずれかを呈し、かつ第１の溶液／ゲル転移と、次いで第１の種類の酵素の作用下において第２のゲル／溶液転移とを連続的に実施することが可能である。
【００１８】
従って、そのような生体材料は、化粧品、食品または医薬品工業において従来未知の特性を有する製品を開発することを可能にする。
よって、化粧品の分野においては、本発明による生体材料を用いて、必要な施用時間の間はゲルのテクスチャを示すことが可能であり、その後、溶液状態に戻って使用者による迅速かつ容易な除去を可能にする美容マスクのような、新規な化粧品を製造することができる。
【００１９】
よって、食品および農業の分野においては、本発明による生体材料を用いて、フィリングがコーティング工程の間にはゲル状であり、その後、一旦コーティング工程が終了すると、程度の差はあるが粘稠な溶液状態に戻るフィリング入りビスケットまたは菓子のような未知の感触を有する新規な製品を製造することができる。
【００２０】
医薬品または化粧品の分野では、本発明による生体材料を用いて、活性成分を含有し、所与の反応速度論で溶液状態に戻ることにより前記活性成分の塩析を行なうことが可能であるゲルを得ることもできる。特定の温度、ｐＨおよびイオン濃度条件（カルシウム、マグネシウムまたは他のもの）、または特定の補助因子の存在下において重合されるタンパク質（ｉ）を分解し得る酵素を使用して、この塩析を特定環境（腸、胃など）に対して適応させることができる。
【００２１】
従って、本発明は、化粧品組成物、医薬組成物または食品組成物に関する。これらの組成物は、化粧品または薬学的組成物に対する活性薬剤、または食品組成物に対する調合剤
のような他の薬剤を含み得る。
【００２２】
生体材料に含まれるモノマーは、有利には、タンパク質または糖類である。それらのタンパク質または糖類は天然物であってもよいし、合成物であってもよい。
第１の種類の酵素は、生体材料中において、不活性化されていない形態で存在する。ポリマーを分解し得る第１の種類の酵素は、生体材料中において活性な形態であってもよいし、あるいは特定の器官（胃、腸、口腔など）内または特定環境下のように、特定の条件下で、ゲル／溶液転移を得られるように、所与のｐＨ、またはイオン種もしくは特定の補因子の存在のような特定の条件下で活性化され得る形態であってもよい。
【００２３】
本発明の生体材料の第１の特定の実施形態によれば、生体材料は、モノマーの重合および形成されたポリマーの第１の種類の酵素による分解を可能にするのに適した溶媒も含む。使用する溶媒は、好ましくは、所望のｐＨを有する水または他の緩衝液（リン酸塩緩衝液またはトリス緩衝液）などの水性溶媒である。
【００２４】
本発明の生体材料の第２の特定の実施形態によれば、ゲル形態の前記生体材料は、当業者に既知の手法を用いて凍結乾燥される。その結果、生体材料はいかなる溶媒も含有しない。その後、前記生体材料は適切な溶媒と接触させられると、第２のゲル／溶液転移のみが生じる。従って、この実施形態は、製造後に、ゲルの有効寿命を、所与の環境または特定の器官（胃、腸、口腔など）にゲルが存在することと関連付けることを可能にする。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態によれば、生体材料は、前記モノマーの間に共有結合を形成し得る少なくとも１種の第２の種類の酵素をさらに含む。その結果、前記生体材料は、第２の種類の酵素の作用下において第１の溶液／ゲル転移と、それに後続して第１の種類の酵素の作用下において第２ゲル／溶液転移とを連続的に実施することができる。
【００２６】
２種類の酵素は、不活性化されていない形態で生体材料中に同時に存在すると有利である。
また、酵素が生体材料中に均一に分布していることも有利である。
【００２７】
本発明の生体材料の第３の特定の実施形態によれば、生体材料はタンパク質モノマーを含む。ほとんどすべてのタンパク質はその高分子電解質特性のために物理ゲルを形成することができる。重合して物理ゲルを形成することが可能であり、本発明による方法に使用可能であるタンパク質の例としては、ゼラチンのようなコラーゲンおよびその誘導体、フィブリン、グリアジン、ミオシン、グロブリン（７Ｓおよび１１Ｓ）、アクチン、ミオグロビン、乳漿タンパク、特にカゼインおよびラクトグロブリン、大豆および小麦タンパク、特にグルテニン、卵白および卵黄、特に卵アルブミンが挙げられる。使用される重合可能なタンパク質は、好ましくは、フィブリンおよびコラーゲン並びにその誘導体、例えばＡ型およびＢ型のゼラチンなどの中から選択される。タンパク質モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の存在下においては、自然には重合しないタンパク質を用いることが可能である。
【００２８】
モノマーまたは前記モノマーとそのポリマーとの混合物の形態にある重合可能なタンパク質の生体材料中における濃度は、用いられるタンパク質の性質に依存する。重合可能なタンパク質の濃度は、好ましくは、生体材料の全重量に対して重量比で０．１〜３０％、好ましくは０．２〜２０％、より好ましくは０．５〜１５％、特に好ましい方法では１〜１０％である。
【００２９】
タンパク質ポリマーを分解し得る多数の酵素（プロテアーゼ）が、当業者には知られている。そのような酵素の例としては、ＭＭＰ群のメタロプロテイナーゼのようなメタロプ
ロテイナーゼ、またはサーモリシンのような同様のメタロプロテイナーゼ、トリプシンおよびマトリプターゼのようなセリンプロテアーゼ、カテプシンＢ, ＬおよびカテプシンＤ，Ｇのようなシステインプロテアーゼおよびアスパラギン酸プロテアーゼ、およびＡＤＡＭファミリーが挙げられる。タンパク質ポリマーを分解し得る酵素は、好ましくはメタロプロテイナーゼであり、好ましくはサーモリシン、特に細菌性サーモリシンであり、および特に好ましい方法では、バチルス・サーモプロテオリティカス・ロッコから単離されたサーモリシンである。
【００３０】
タンパク質ポリマーを分解し得る酵素の濃度は、使用されるタンパク質モノマーおよびそのモノマーの濃度に依存する。この酵素濃度は、以下の実施例に記載する方法に従って、所与のタンパク質モノマーの種類によって、かつ所与の濃度において容易に計算することができる。したがって、バチルス・サーモプロテオリティカス・ロッコのサーモリシンの場合で、５％のＡ型ゼラチンを含有するゲルについては、サーモリシン濃度は、１０−４Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは１０−３Ｕ／ｍｌ以上である。
【００３１】
タンパク質の間に共有結合を形成することが可能な多数のタンパク質も、当業者には知られている。そのようなタンパク質の例としては、リシルオキシダーゼ群、並びに、第ＸＩＩＩ因子のサブユニットＡ、哺乳動物トランスグルタミナーゼ１〜７または細菌性トランスグルタミナーゼなどのトランスグルタミナーゼ群が挙げられる。タンパク質の間に共有結合を生成し得る酵素は、トランスグルタミナーゼであり、好ましくは細菌性トランスグルタミナーゼであり、特に好ましい方法においては、ストレプトバーティシリウム属細菌から単離されたトランスグルタミナーゼである。
【００３２】
タンパク質の間に共有結合を形成し得る酵素およびタンパク質ポリマーを分解し得る酵素の濃度は、一方では、タンパク質ポリマーを分解し得る酵素の濃度に対するタンパク質の間に共有結合を形成し得る酵素の濃度の比率に依存し、他方では、使用される重合可能なタンパク質および同タンパク質の濃度に依存する。これらの酵素濃度は、実施例に記載する方法によって容易に計算することができる。
【００３３】
用いられる酵素濃度比および酵素濃度は、所望のゲル化時間（溶液／ゲル転移）および有効ゲル寿命にも依存する。
有利には、タンパク質ポリマーを分解し得る酵素の濃度に対するタンパク質の間に共有結合を形成し得る酵素の濃度の比率は、１以上であり、好ましくは１０以上であり、特に好ましい方法では、２０以上である。
【００３４】
タンパク質の間に共有結合を形成し得る酵素の濃度は、０．００１Ｕ／ｍｌ超であり、好ましくは０．０１Ｕ／ｍｌ超であり、特に好ましい方法においては、０．１Ｕ／ｍｌ超であるとまた有利である。
【００３５】
さらに有利には、５％のＡ型ゼラチンを含有し、ストレプトバーティシリウム属細菌のトランスグルタミナーゼおよびバチルス・サーモプロテオリティカス・ロッコのサーモリシンが存在する溶液の場合には、サーモリシン濃度（Ｕ／ｍｌ）に対するトランスグルタミナーゼ濃度（Ｕ／ｍｌ）の比率は、７５より大きく、好ましくは８０以上である。加えて、トランスグルタミナーゼ濃度は、０．０１Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは０．１Ｕ／ｍｌ以上、特に好ましい方法では、０．４Ｕ／ｍｌ以上である。
【００３６】
本発明の第４の特定の実施形態によれば、本発明による生体材料は糖類モノマーを含む。本発明による生体材料によって使用可能な糖類の例としては、カラギーナン、アルギナート、ペクチン、キトサン、セルロース、キチン、グリコーゲン、またはデンプンなどが挙げられる。
【００３７】
モノマーまたは前記モノマーとそのポリマーとの混合物の形態にある重合可能な糖類の生体材料中における濃度は、使用される糖類の性質に依存する。重合可能な糖類の濃度は、生体材料の全重量に対して、重量比で、好ましくは０．１〜３０％、好ましくは０．２〜２０％、より好ましくは０．５〜１５％、特に好ましい方法においては１〜１０％である。
【００３８】
多糖類を分解し得る多数の酵素が、当業者には知られている。そのような酵素の例としては、カラギーナン、ペクチンリアーゼ、ペクチンに対するポリガラクツロナーゼおよびペクチンエステラーゼ、アルギナートに対するアルギナートリアーゼ、セルロースに対するセルラーゼまたはグリコーゲンに対するホスホリラーゼなどが挙げられる。
【００３９】
多糖類を分解し得る酵素の濃度は、使用されるモノマーおよびそのモノマーの濃度に依存する。この酵素濃度は、実施例に記載する方法に従って、所与のモノマーの種類により所与の濃度において容易に計算することができる。
【００４０】
糖類の間に共有結合を形成し得る多数の酵素もまた、当業者には知られている。そのような酵素の例としては、アルギナートに対するアルギナートエピメラーゼ、セルロースに対する合成酵素、またはグリコーゲンに対するグリコーゲン合成酵素の各群が挙げられる。
【００４１】
糖類間に共有結合を形成し得る酵素および多糖類を分解し得る酵素の濃度は、一方では、多糖類を分解し得る酵素の濃度に対する糖類間に共有結合を形成し得る酵素の濃度比に依存し、他方では、使用される重合可能な糖類とその濃度に依存する。これらの酵素濃度は、実施例に記載する方法によって容易に計算することができる。
【００４２】
上記のように、用いる酵素濃度の比率および酵素濃度はまた、所望のゲル化時間（溶液／ゲル転移）およびゲルの有効寿命にも依存する。
（糖類の間に共有結合を形成し得る酵素の濃度）／（多糖類を分解し得る酵素の濃度）の比率は、有利には、１以上であり、好ましくは１０以上であり、特に好ましい方法においては２０以上である。
【００４３】
さらに有利には、糖類の間に共有結合を形成し得る酵素の濃度は、０．００１Ｕ／ｍｌ超であり、好ましくは０．０１Ｕ／ｍｌ超であり、特に好ましい方法においては０．１Ｕ／ｍｌ超である。
【００４４】
本発明の第５の特定の実施形態によれば、本発明による生体材料は糖類モノマーおよびタンパク質モノマーを含む。そのような化合物は、特定のレオロジー特性を有するゲル、および可能性として所望のテクスチャを有するゲルを得ることを可能にする。
【００４５】
生体材料はまた、化粧品、製薬または食品産業において現在使用されている１つ以上の追加成分も含んでもよい。
本発明の第２の目的は、本発明による生体材料を調製する方法に関する。前記生体材料は、ゲル形態または溶液の形態を呈し、溶液／ゲル転移と後続する第２のゲル／溶液転移とを連続的に実施することができる。前記方法は、適切な溶媒中に、
（ｉ）好ましくは低エネルギーの結合によりポリマーを形成し得る少なくとも１つのモノマーを混合することと、
（ｉｉ）前記ポリマーを分解し得る第１の種類の酵素を混合することと
を含むことを特徴とする。
【００４６】
所望のゲル化時間および有効ゲル寿命を有する生体材料を得るための、好ましくは低エネルギーの結合によりポリマーを形成し得るモノマーの濃度、および前記ポリマーを分解し得る酵素の濃度は、実施例に記載する方法によって決定される。
【００４７】
一例として、低エネルギーの結合によりポリマーを形成し得るモノマーとして５％のＡ型ゼラチンと、バチルス・サーモプロテオリティカス・ロッコから単離されたサーモリシンとを含み、６８分のゲル化時間および２５４分の有効ゲル寿命を有する生体材料は、２７℃において０．００８５Ｕ／ｍｌのサーモリシンを使用することによって得ることができる。
【００４８】
好ましい実施形態によれば、本発明による方法は、
（ｉｉｉ）モノマーの間に共有結合を形成し得る第２の種類の酵素を混合すること
をさらに含む。
【００４９】
所望のゲル化時間および有効ゲル寿命を有する生体材料を得るための、任意で低エネルギーの結合によりポリマーを形成し得るモノマーの濃度、前記ポリマーを分解し得る酵素の濃度、および前記モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の濃度は、実施例に記載する方法によって決定される。
【００５０】
前記方法は、双方の種類の酵素が活性である温度で実行される。前記方法は、０〜１００℃、好ましくは５〜７５℃、例えば１０〜５０℃または１５〜４５℃、特に好ましい方法においては２０〜４０℃の温度において有利に実施される。
【００５１】
ポリマーを形成し得るモノマーの量は、有利には、生体材料の全重量に対して、重量比で０．１〜３０％、好ましくは０．２〜２０％、好ましくは０．５〜１５％、特に好ましい方法においては１〜１０％である。
【００５２】
また有利には、ポリマーを分解し得る酵素の濃度に対するモノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の濃度の比率は、１以上であり、好ましくは１０以上であり、特に好ましい方法においては２０以上である。
【００５３】
モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の濃度は、好ましくは０．００１Ｕ／ｍｌ超であり、好ましくは０．０１Ｕ／ｍｌ超であり、特に好ましい方法においては、０．１Ｕ／ｍｌ超である。
【００５４】
ポリマーを形成し得るモノマーの濃度、前記ポリマーを分解し得る酵素の濃度、および場合により前記モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の濃度は、以下の方程式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の結果が、所望のゲル化時間および有効ゲル寿命を得ることを可能にするように有利に選択される。
【００５５】
【数１】
上記方程式は、それぞれ、時間（ｄｔ）による、（Ｉ）結合されたモノマー（以下、「結合モノマー」と称する）の数の漸進的変化（ｄｇ）、（ＩＩ）溶液中のモノマーの数の漸進的変化（ｄｓ）、および（ＩＩＩ）分解されたモノマー（以下、「分解モノマー」と称する）の数の漸進的変化（ｄｆ）、並びに（ＩＶ）質量保存方程式を表している。
【００５６】
前記式中において、
− ｇは結合形態にあるモノマーの量に相当し、
− ｔは時間に相当し、
− ＶＰは、単位時間あたりに前記酵素により結合モノマーがその遊離形態に変化した量として表された、ポリマーを分解し得る酵素の速度に相当し、
− ＫＰは、ポリマーを分解し得る酵素のミハエリス定数を表し、
− ｓは、遊離形態にあるモノマーの量を表し、
− ＶＴは、単位時間あたりに前記酵素によって結合された遊離形態にある結合モノマーの量として表された、モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の速度に相当し、
− ＫＴは、モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素のミハエリス定数を表し、
− ＶＨは、低エネルギーの結合により重合し得るモノマーの場合における、単位時間あたりの遊離形態にあるモノマーの低エネルギー結合による結合の速度を表し、
− Ｖ’Ｐは、単位時間あたりの、遊離形態にあるモノマーを分解し得る酵素により生成されるもはや重合不可である分解モノマーの量として表された、前記酵素の速度に相当し、
− ｇｔは、時間ｔにおける結合形態にあるモノマーの量に相当し、
− ｓｔは、時間ｔにおける遊離形態にあるモノマーの量に相当し、
− ｆｔは、時間ｔにおけるもはやポリマーを形成し得ない分解モノマーの量に相当し、
− Ｓ０はモノマーの初期量に相当する。
【００５７】
本発明者らは、異なる種類の酵素を使用して、所与の溶液／ゲルおよびゲル／溶液転移の反応速度論を有する生体材料を得ることが可能であることを証明することができた。
これらの様々な酵素に対する定数は、当業者にはよく知られている。この例は、http://www.brenda.uni-koeln.de/ にあるデータベースである。前記データベースはそのような酵素の定数を記載している。いずれの場合においても、当業者であれば、http://www.brenda.uni-koeln.de/ およびプライス（PRICE ）およびスティーヴン（STEVEN）、「Fundam
entals of Enzymology: The Cell and Molecular Biology of Catalytic Proteins」、オックスフォード大学出版局（Oxford University Press ）に記載のような周知の方法によって、所与の酵素に対するこれらの様々な定数を容易に決定することができる。
【００５８】
従って、これらの方程式において、ＶＰおよびＶＴは以下の式によって計算される。
ＶＰ＝ｋＣＡＴ＿Ｐ［Ｐ］およびＶＴ＝ｋＣＡＴ−Ｔ［Ｔ］
前記式中、［Ｐ］および［Ｔ］は、それぞれ、ポリマーを分解し得る酵素の濃度およびモノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の濃度を表し、ｋＣＡＴ＿ＰおよびｋＣＡＴ−Ｔは、それぞれ、これらの酵素に対する触媒定数を表わす。
【００５９】
いずれの場合においても、当業者であれば、実施例に記載する方法に従って、過度の実験を行なうことなく、所望の溶液／ゲル転移およびゲル／溶液転移の反応速度論を有する生体材料を得るのに必要である様々なモノマーおよび酵素の濃度を容易に決定することができる。
【００６０】
一例として、低エネルギーの結合によりポリマーを形成し得るモノマーとして５％のＡ型ゼラチンと、バチルス・サーモプロテオリティカス・ロッコから単離されたサーモリシンと、ストレプトバーティシリウム属細菌から単離されたトランスグルタミナーゼとを含み、１９分間のゲル化時間および７４３分間の有効ゲル寿命を有する生体材料は、４０℃において、１Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼおよび０．０１２５Ｕ／ｍｌのサーモリシンを使用して得ることができる。
【００６１】
さらなる例として、低エネルギーの結合によりポリマーを形成し得るモノマーとして５％のＡ型ゼラチンと、バチルス・サーモプロテオリティカス・ロッコから単離されたサーモリシンと、ストレプトバーティシリウム属細菌から単離されたトランスグルタミナーゼとを含み、２分間のゲル化時間および５０００分を超える有効ゲル寿命を有する生体材料は、２７℃において、１Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼおよび０．０１２５Ｕ／ｍｌのサーモリシンを使用して得ることができる。
【００６２】
本発明による方法は、ゲル形態の生体材料を凍結乾燥する工程を含むと有利である。
本発明のさらなる特徴は、以下の実施例から明らかになるであろう。それらの実施例は、いかなる点においても本発明を全く制限しない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
実施例１：化学ゲル：
１−１：理論モデルの開発：
細胞外基質に対応する動的釣り合いに関する研究は、そのような動的な系の単純化した数学的モデルであって２つの拮抗する酵素反応が行なわれるモデルを構築することを可能にした。一方の反応は、可溶性モノマー（ｓ）の間に共有結合を形成して結合モノマーの網状構造（ｇ）を生じ得る酵素によって触媒される。他方の反応は、結合モノマーの網状構造（ｇ）を可溶性モノマー（ｓ）に加水分解する酵素（Ｐ）によって触媒される。特定の場合においては、最後に、同様に酵素（Ｐ）によって触媒される第３の反応は、可溶性モノマーを、網状構造に含まれるには小さすぎるか、または共有結合（Ｔ）によって可溶性モノマー（ｓ）を結合させる酵素の基質としてはもはや使用することができない分解モノマー（ｆ）に加水分解することから成る。サイクルから漏出するモノマーを生じるこの最後の反応もモデルに加えられる。モデルは、以下の反応スキームによって簡略に表わすことができる。
【００６４】
スキームＩ：
【００６５】
【化１】
この反応機構は、酵素反応を単純なミハエリアン反応（reactions michaeliennes ）と同等とみなした以下の３つの微分方程式と、第４の質量保存方程式とによって容易に記述することができる。
【００６６】
結合モノマー（ｇ）の鎖の数の時間による漸進的変化を記述する微分方程式は、以下のとおりである。
【００６７】
【数２】
溶液中におけるモノマー（ｓ）の数の時間による漸進的変化を記述する微分方程式は、以下のとおりである。
【００６８】
【数３】
分解モノマー（ｆ）の数の時間による漸進的変化を記述する微分方程式は、以下のとおりである。
【００６９】
【数４】
最後に、質量保存方程式は以下のとおりである。
【００７０】
ｇｔ＋ｓｔ＋ｆｔ＝Ｓ０
これらの微分方程式において、ＶＰおよびＶＴは、それぞれ酵素Ｐおよび酵素Ｔに対する最大速度を表わす。また、ＫＰおよびＫＴは、酵素Ｐおよび酵素Ｔに対するミハエリス定数をそれぞれ表わす。
【００７１】
従って、これらの方程式において、ＶＰおよびＶＴは以下の方程式
ＶＰ＝ｋＣＡＴ−Ｐ［Ｐ］およびＶＴ＝ｋＣＡＴ−Ｔ［Ｔ］
によって計算される。
【００７２】
この方程式をインビトロの系へ置き換える際、［Ｐ］、［Ｔ］、ＶＰ、ＶＴ、ＫＰおよびＫＴの様々な値は、定数である。
基質濃度は、各々の初期の酵素について計算され、次に、様々な微分方程式により反応の間に決定される。
【００７３】
１−２：トランスグルタミナーゼおよびサーモリシンの存在下におけるゼラチンゲル形成のモデル化
この理論モデルは、タンパク質物理ゲルの形成、より詳細には、共有結合によってゼラチンモノマーを結合させる細菌性トランスグルタミナーゼおよびプロテアーゼ：サーモリシンの存在下、４０℃における、ゼラチンのタンパク質物理ゲルの形成に適用された。
【００７４】
使用するゼラチン濃度は５％、すなわち５０ｇ・ｌ−１である。ゼラチンのペプチド配列に基づいて、側鎖の濃度（すなわち０．４５ｍｏｌ・ｌ−１）を決定することは容易に可能である。
【００７５】
使用する酵素：
プロテアーゼおよびトランスグルタミナーゼに対する様々な定数は文献において公知であるか、または当業者によく知られた方法によって容易に決定することができる（シーゲル(SEGEL) 、「Wiley Classics Library、Enzyme Kinetics 」、１９９３年）。
【００７６】
１．プロテアーゼ：
１．１−供給源：
使用するプロテアーゼは、サーモリシン、すなわちシグマ（SIGMA ）(REF:P-1512)によって上市されている細菌性メタロプロテアーゼである。この酵素は、好熱性菌株であるバチルス・サーモプロテオリティカス・ロッコから得られるタイプＸのプロテアーゼである。この酵素は特にイソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）およびアラニン（Ａｌａ）残基を認識する。この酵素は、室温で高度に安定しており、３１６アミノ酸で３４ｋＤａのモル質量を有する。
【００７７】
２．２−活性：
サーモリシンの（解離の）ミハエリス定数は、様々なタンパク質およびペプチド基質に対して文献において公知である（マツバラ（MATSUBARA ）ら、Biochem. Biophys. Res. Commun.、第２１巻、第２４２〜２４７頁、１９６５年）。これらのデータに基づいて、１ｍＭに相当するＫＰの平均値を推定することが可能である。また、様々な基質に対するサーモリシンのｋｃａｔ値も文献に記載されている（リーニュ（LIGNE ）ら、Biochim. Biophys. Acta. 、第１３３７巻、第１４３〜１４８頁、１９９７年）。さらに、これらのデータに基づいて、１０００分−１に相当するＫｃａｔの平均値を決定することが可能である。サーモリシンの特性は知られているので、ゼラチンの配列の分析により、検討中の系において、サーモリシンに対する初期の基質濃度は、従って０．１５×０．４５＝０．６
８ｍｏｌ・ｌ−１＝６８ｍＭ、すなわち６８ＫＰであると決定することができる。この濃度は飽和基質濃度に近く、従って、基質はサーモリシンの反応を制限しない。
【００７８】
また、この酵素の様々な酵素としての制約条件を、基質としてＮ−（３［２−フリル］アクリロイル）−グリシン−ロイシン−アミド( シグマ（SIGMA)）を用いて、フリル−アクロイル−グリシンおよびロイシン−アミドの形成について測定した。加水分解中における基質の消失は、３４５ｎｍで測定される光学濃度の低下をもたらす。
【００７９】
２．トランスグルタミナーゼ：
２．１−供給源：
使用するトランスグルタミナーゼは、ＡＣＴＩＶＡ ＷＭ（登録商標）という名称で味の素株式会社によって製造されている。この細菌酵素はストレプトバーティシリウム属細菌の培地中に産生される。この酵素は、３８，０００Ｄａの分子量を有する、３３１アミノ酸のポリペプチド鎖である。６４位のシステイン残基が活性部位に相当する。
【００８０】
２．２−活性：
この酵素はリジン残基を認識し、リジン残基の側鎖と他の残基の側鎖との間の共有結合の形成を触媒する。この酵素の活性は、５０〜５５℃（４０℃で１００Ｕ・ｇ−１）の温度、および広範なｐＨ領域（４．５〜９で活性であり、６〜７が最適値）において最適である。
【００８１】
この酵素の活性は、Ｎａ−ＣＢＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（シグマ）およびヒドロキシルアミンからの、４０℃で１分間に１マイクロモルのヒドロキサム酸の形成を触媒するのに必要な酵素の量から測定される。この酵素の活性を決定することを可能にする方法は以下のとおりである。
【００８２】
【表１】
次に、活性は以下の方程式：
活性（Ｕ／ｍｌ／分）＝［１００×（ＤＯ ５２５／２３８）］／酵素体積（ｍｌ）
によって計算される。
【００８３】
この基質上における様々な反応により、基質としてゼラチンを使用して、８ｍＭの解離定数Ｋｔおよび１００分−１のｋｃａｔを決定することが可能となった。ゼラチンは、わずか４％のリジンを含んでおり、従って、トランスグルタミナーゼに対する初期の基質濃度は１７ｍＭである。
【００８４】
モデル化：
予め決定された様々な値に基づいて、微分方程式に近似するオイラー法（ブロンソン（BRONSON ）、「Equations Differentielles 」、マグローヒル（McGraw-Hill ）編、１９９４年）を適用することにより、結合した画分の時間による挙動を監視することが可能である。この第１モデルにおいて、トランスグルタミナーゼとプロテアーゼとの間における活性比は、（１Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼ濃度において）１０である。加えて、ｇ０＝０およびｓ０＝６８ｍＭである。文献のデータは、トランスグルタミナーゼの作用によって、理論上の結合の１８％が有効に生成された場合に、ゼラチンゲルが得られることを示している（フックスバウアー（FUCHSBAUER）ら、Biomaterials, 、第１７巻、第１４８１〜１４８８頁、１９９９年）。
【００８５】
様々なモデルは、ＶＰに関するＶ’Ｐの変化はほとんど重要でなく、結合したタンパク質の出現の反応速度論は、ほとんど１００％の値に達する相当な初期増加と、それに続く、小さな断片が出現する速度に依存した非常に遅い減少とを示す。図１には、０．１のＶ’Ｐ／ＶＰ比率で、結合した画分の時間による漸進的変化をモデル化した例が示されている。
【００８６】
１−３：単一のトランスグルタミナーゼの存在下におけるゼラチンゲルの形成：
この理論モデルを検証するために、本発明者らは、まず、様々な量のトランスグルタミナーゼのみが存在する状態におけるゼラチンゲルの形成を監視する最初の一連の実験を行なった。
【００８７】
使用した重合可能なタンパク質：
使用したＡ型ゼラチン（Ｇ２５００）は、酸法（シグマ）を用いて豚皮から抽出される。溶液中におけるゼラチン濃度は％（重量／体積）として表わす。したがって、１％のゼラチンを含有する溶液は、１００ｍｌの溶液中に１ｇのゼラチンを含む溶液に相当する。用いるゼラチン濃度を、各実験において２〜１０％の間で変化させた。また、ゲル化温度は４０℃であった。
【００８８】
使用したトランスグルタミナーゼは上述したトランスグルタミナーゼである（１−２を参照）。これらの実験において用いたトランスグルタミナーゼ濃度は、０．１Ｕ／ｍｌ〜１Ｕ／ｍｌであった。
【００８９】
溶液／ゲル転移およびゲル／溶液転移の監視：
ゲルの形成は、ＡＲ１０００型レオメータ（ティー・エイ・インスツルメント（TA INSTRUMENT)）またはＲＳ１５０型レオメータ（サーモレオ（THERMORHEO））を使用して監視する。これらのレオメータは、２°の角度を有する６０ｍｍのコーン／プレートジオメトリーを備える。ＡＲ１０００では鋼鉄コーンが使用され、ＲＳ１５０においてはチタンコーンが使用される。
【００９０】
これらのレオメータは、試料に所与のパルスωを有する振動せん断力（cisaillement oscillatoire ）を印加することからなる振動解析または動的解析を行うことを可能にする。この運動の間、せん断応力および勾配は、時間とともに、同一のパルスで、しかし互いに対して特定の位相差を有して、正弦波的に進展する。レオメータは、ゲル化工程を監視するための多数のパラメータを測定することを可能にする。せん断弾性係数（Ｇ＊（ω）０）は、試料の粘性成分および弾性成分を表わし、下記式
Ｇ＊（ω）＝Ｇ’（ω）＋ｉＧ”（ω）
に従う複素数である。
【００９１】
Ｇ’は貯蔵弾性係数と呼ばれ、Ｇ”は損失弾性係数と呼ばれる。これらの２つの係数はパスカル（Ｐａ）で表わされる。ニュートン流体においては、貯蔵弾性係数は０であり、
損失弾性係数のみが残る。このため、損失弾性係数は粘性係数とも称される場合がある。一方、弾性固体においては、貯蔵弾性係数のみが存在する。そのため、その貯蔵弾性係数は弾性係数と称される場合がある。以下の式に従って、せん断弾性係数を損失係数および貯蔵係数に関係づけることが可能である。
【００９２】
Ｇ’＝Ｇ＊ｃｏｓδ、およびＧ”＝Ｇ＊ｓｉｎδ
前記式中、δは、応力とせん断変形との間の位相差を表わす。これらの式に基づいて、以下の比を導き出すことができる。
【００９３】
Ｔａｎδ＝Ｇ”／Ｇ’
よって、Ｔａｎδは、試料のゲル化過程の特徴付けを可能にする関連値になる。試料が液体である場合、Ｇ”＞Ｇ’かつＴａｎδ＞１である。反対に、Ｇ”＜Ｇ’かつＴａｎδ＜１であるとき．試料はゲルになる。Ｔａｎδ＝１の値に達するのに要する時間は「ゲル化時間」を表わす。下記の様々な実験において、様々な溶液に対する係数比Ｇ”／Ｇ’が時間に従って表わされ、Ｇ”／Ｇ’＝１の値は「ゲル化点」に対応する。
【００９４】
結果：
図２には、レオメータを用いて監視した、異なる濃度（０．１、０．１５、０．２、０．５および１Ｕ／ｍｌ）のトランスグルタミナーゼ存在下における４０℃の５％ゼラチン含有溶液の粘弾性の漸進的変化が示されている。すべての試験条件下において、試料は実験の開始時には実際に液体であり（Ｇ”／Ｇ’＜１）、その後、ゲルが形成され（Ｇ”／Ｇ’＞１）、時間とともに漸進的に変化する。実験はまた、ゲル化点の後、任意の所与の酵素濃度について、係数Ｇ”は１Ｐａあたりで水平になることも示している。よって、Ｇ’係数の値は酵素濃度に依存する。従って、ゲル化点の後に観察されるＧ”／Ｇ’比の変化は、Ｇ’の変化を示す。
【００９５】
図３は、トランスグルタミナーゼ濃度による、４０℃の５％ゼラチン含有溶液のゲル化速度（ゲル化時間の逆数）を示す。結果は、トランスグルタミナーゼを有する段階のみを含み、かつＧ”／Ｇ’＝１であるゲル化点までのみを含むゲル化曲線は、理論モデルに従うことを示している。
【００９６】
図４は、ゲル化点の後の、４０℃における酵素濃度に依存する酵素反応の速度を示す。結果は、ゲル化点を越えると、ゲル化曲線はもはや理論モデルに従わないことを示している。曲線はもはや線形回帰によって推定することはできず、むしろ式ｙ＝１５ｘ１．８５（図中の点線の曲線）を有する指数法則（Ｒ２は０．９８）の挙動パターンに従い得ることが理解できる。ゲル化点の後では、酵素反応はゲル中における酵素の拡散によって制限される。拡散の影響は、この速度方程式において係数１．８５によって具象化される。この係数はトランスグルタミナーゼ濃度に影響する。
【００９７】
図５は、溶液中１ユニット（黒四角）および０．４ユニット（黒菱形）の酵素の拡散を考慮した、ゲル中における活性トランスグルタミナーゼの量の経時的な漸進的変化を示す。従って、これらの実験により、ゲルの形成後、トランスグルタミナーゼの拡散係数の値は、徐々に漸進的に変化して１．８５の値に達することを示すことができた。拡散係数のこの漸進的変化は、この曲線および時間に従って容易に決定することができる。
【００９８】
従って、ゲル化中の酵素の作用は２つの連続した系に従うように見える。液体状態からほぼゲル化点までの第１の系は、拡散によって制限されず、従来の酵素学の規則が当てはまる。そのとき、反応速度は酵素濃度の線形関数である。ゲル化点の後の第２の系は、酵素の拡散の速度をもはや無視できず、反応の見かけの速度が制限される、非従来的な環境である。
【００９９】
２％および１０％の異なるトランスグルタミナーゼ濃度を有するゼラチンゲル上で行なった実験により、ゲル化中に同様の挙動を確認することができた。これらの条件においては、上記のように容易に決定できる特定の拡散係数が各種類のゲルについて有効である。
【０１００】
１−４：トランスグルタミナーゼおよびサーモリシンの存在下におけるゼラチンゲル形成の新規なモデル化：
前記（１−２を参照）と同一のパラメータを使用して、１０のＶＴ／ＶＰ比および０．０５のＶ’Ｐ／ＶＰ比を用いてゼラチンゲルをモデル化する。しかしながら、酵素の反応速度に対する、５％ゼラチン含有ゲルによる拡散の制限の効果は、先に記載した微分方程式に取り入れられている（１−２を参照）。したがって、トランスグルタミナーゼ濃度には、下記式：
ＶＴ＝ｋＣＡＴ−Ｔ［Ｔ０］１．８５
に従う、ゲル化点が過ぎると直ちに反応平衡を示す式において１．８５の指数が与えられる。
【０１０１】
先に行なわれた研究は、非常に低い酵素濃度、特に１ｎＭ未満の酵素濃度を有する状態においてのみ拡散がゲルの加水分解を制御する（ファーダ(FADDA) ら、Biophys. J. 、第８５巻（５）、２８０８〜２８１７頁、２００３年）が、より高濃度においては制御しないことが示されている（ベリー（BERRY ）ら、Biochim. Biophys. Acta. 、第１５２４巻、１１０〜１１７頁、２０００年；ジロウディア（GIRAUDIER)ら、Biomacromolecules 、第５巻（５）、１６６２〜１６６６頁、２００４年）。従って、方程式中のサーモリシン濃度には係数は適用されなかった。
【０１０２】
図６は、拡散の制限を有し、１０のＶＴ／ＶＰ比（１Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼ濃度）で、結合した画分の時間による漸進的変化をモデル化した結果を表わす。このモデル化の過程から、上記タンパク質環境が、８０分後に最初にゲル化点を通過する溶液／ゲル転移と、続いて３３０分後に２回目のゲル化点通過を行なうゲル／溶液転移とを連続的に行なうことが明らかになる。本発明者らによって確立されたモデルによれば、得られるタンパク質環境は、溶液／ゲル転移、次いでゲル／溶液転移を連続的に行う能力を有するとともに、ゲル状態を２５０分間の期間にわたって保持するといった新規な特性を有する。
【０１０３】
更に、拡散効果は有るか全く無いかのいずれかであって、具体的にはゲル化する転移の前には制限はなく、この転移の後には完全な制限を有するものと考えられる。先に実施した実験（１−３を参照）は、ゲル中で共有結合が網状に展開されるにつれて、拡散に対する制限が増大することを示すことを可能にした。この緩やかな効果は、モデルにおいて、下記式：
ＶＴ＝ｋＣＡＴ−Ｔ［Ｔ０］α
（式中、αは、時間に従って１．１から１．８５まで双曲線状に変化する（図５参照））を用いることにより考慮される。
【０１０４】
図７は、緩やかな拡散の制限および様々なＶＴ／ＶＰ比（１Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼ濃度）を有する、結合した画分の時間による漸進的変化をモデル化した結果を示す。この場合の結果もまた、示した様々なＶＴ／ＶＰ比について、溶液／ゲル転移およびゲル／溶液転移を示す。１０のＶＴ／ＶＰ比については、該タンパク質環境は１５分でゲル化点に達し、次いで、ゲルは１６５分後にゲル／溶液転移を行なう。先述のモデルに関連して、拡散に対する緩やかな制限は、先のモデルでは２５０分であった代わりに、１５０分間にわたってゲルを得ることを可能にする。
【０１０５】
１−５：トランスグルタミナーゼおよびサーモリシンの同時存在下におけるゼラチンゲルの形成：
先に記載した理論モデル（１−４を参照）を検証するために、ゼラチンおよびトランスグルタミナーゼを使用して、先に用いたのと同一の条件下において（１−３を参照）、様々な実験を行なった。加えて、プロテアーゼ、すなわちサーモリシンも初期の溶液に添加する。ゲルの形成は、４０℃において、用いたトランスグルタミナーゼ濃度およびサーモリシン濃度に従って、経時的に監視した。得られた結果を、理論モデルの予測と比較して、下記の表Ｉに示す。
【０１０６】
【表２】
上記結果は、開発した理論モデルに従って、２つの拮抗する酵素活性の存在下において、共有結合によって重合し得るモノマーの溶液（この場合、種々のトランスグルタミナーゼ濃度およびサーモリシン濃度を有する状態下における５％ゼラチン含有溶液）から、溶液／ゲル転移、次いでゲル／溶液転移を連続的に得ることが実験的に可能であることを示している。
【０１０７】
そのようなゲルが、トランスグルタミナーゼ活性のみに依存する時間の後のすべてのシミュレーションにおいて得られる場合、上記の様々な実験は最初の溶液／ゲルの転移に対する閾値を構成するＶＴ／ＶＰ比が存在することを示している。トランスグルタミナーゼおよびサーモリシンの存在下における５％のゼラチン含有溶液の場合には、この最初の溶液／ゲルの転移を得るための臨界ＶＴ／ＶＰ比は、７５〜８０に含まれる。
【０１０８】
上記の様々な実験は、各トランスグルタミナーゼ濃度およびサーモリシン濃度に応じたゲル化時間および有効なゲル寿命も確認する。
図７は、異なる濃度のトランスグルタミナーゼおよびサーモリシンの存在下における５％ゼラチン溶液の４０℃での実験による粘弾性の漸進的変化を示す。
【０１０９】
よって、開発された理論モデルに従って、溶液／ゲル転移およびゲル／溶液転移を連続
的に実施することができる生体材料を得ることが可能である。これについては、使用するモノマーおよび酵素に従って、この最初の溶液／ゲルの転移を得るための、結合モノマーを分解する酵素に対するモノマーを結合させる酵素の臨界比を実験的に決定すれば十分である。次に、理論モデルにより、一方では所望のゲル化時間を有し、他方では所望の有効なゲル寿命を有するゲルを得るために、最低でも様々な酵素濃度について適応させることが可能となる。
【０１１０】
１％のアルギナートまたはオリゴアルギナートを５％ゼラチン含有溶液に添加した追加実験を行なった。この場合においても、溶液／ゲル転移、およびそれに続くゲル／溶液転移が得られた。
【０１１１】
１−６：トランスグルタミナーゼおよび様々なプロテアーゼの同時存在下におけるゼラチンゲルの形成：
様々なプロテアーゼを用いて、開発したモデルを確認した。
【０１１２】
トリプシン（ＥＣ ３−４−２１−４）は、リジンおよびアルギニンの上流のペプチド結合を加水分解するセリンプロテアーゼである。使用したトリプシンは、雌ウシ膵臓由来のものであり、シグマ（Ｓｉｇｍａ、Ｔ−１４２６）によって上市されている。この酵素の活性は、ｐ−トシルアルギニンメチルエステル（シグマ、Ｔ４６２６）の加水分解を触媒するのに必要な酵素量によって測定される。
【０１１３】
コラゲナーゼ（ＥＣ ３．４．２４．３）は、特にコラーゲンを含む鎖に見られるＰｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ配列中のＸ−Ｇｌｙペプチド結合を特異的に加水分解する。使用したコラゲナーゼは、ＩＡ型クロストリジウム・ヒストリチカム由来であり、シグマ（Ｃ−９８９ｌ）によって上市されている。この酵素の活性は、Ｎ−（３−［２−フリル］アクリロイル）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡｌａまたはＦＡＬＧＰＡ（シグマ、Ｆ−５１３５）の加水分解を触媒するのに必要な酵素の量によって測定される。
【０１１４】
これらの酵素活性は、発色団基を有する合成ペプチドの加水分解について測定されるので、サーモリシンの活性は、比較しやすくするために、Ｎ−（３−（２−フリルアクリロイル）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−アミド（シグマ、Ｎ−７３８３）の加水分解において測定した。これは、いくつかのプロテアーゼとともに表中に報告される活性である。
【０１１５】
ゲルについては、ゼラチン濃度は７％であり、ゲル化温度は４０℃であった。使用したトランスグルタミナーゼは、先に記載したトランスグルタミナーゼである。ゲルは、１−５におけるように経時的に監視した。得られた結果を下記の表ＩＩに示す。
【０１１６】
【表３】
従って、上記結果は、モデルを他のプロテアーゼに対して一般化することができることを示している。
【０１１７】
実施例２：物理ゲル：
２−１：理論モデルの開発：
このモデルは、物理ゲルを形成する場合であって、かつ単一の酵素活性の存在下においてのみ観察される動的釣り合いを示す。従って、ゲル化は、溶液中のモノマー（ｓ）間における低エネルギー結合（ファン・デル・ワールス、水素結合、疎水結合など；Ｈ）の形成のみの結果として生じる。例えば、タンパク質の場合には、タンパク質の高分子電解質特性は、ほとんどすべてのタンパク質が物理ゲルを形成することができることを意味している。ゲルの結合モノマー（ｇ）の鎖に相当するポリマーの分解は、それらのポリマーを加水分解して可溶性モノマー（ｓ）とする酵素（Ｐ）によって触媒される。最後に、特定の場合には、酵素（Ｐ）によって触媒される第３の反応も存在する。第３の反応は、可溶性モノマーを分解モノマー（ｆ）に加水分解することから成る。分解モノマー（ｆ）は、小さすぎるので網状構造の一部にはなり得ないか、またはもはや他の可溶性モノマーとの結合を形成し得ない。サイクルから漏出するモノマーを生じるこの最後の反応もモデルに加えられる。モデルは、以下の反応スキームによって簡略に表わすことができる。
【０１１８】
スキームＩＩ：
【０１１９】
【化２】
この第２の場合において、反応機構は、酵素反応を単純なミハエリアン反応と同等と見なす以下の３つの微分方程式と、第４の質量保存方程式とによって容易に記述することができる。
【０１２０】
結合モノマー（ｇ）の鎖の数の時間による漸進的変化を記述する微分方程式は、以下のとおりである。
【０１２１】
【数５】
溶液中のモノマー（ｓ）の数の時間による漸進的変化を記述する微分方程式は、以下のとおりである。
【０１２２】
【数６】
分解モノマー（ｆ）の数の時間による漸進的変化を記述する微分方程式は、以下のとおりである。
【０１２３】
【数７】
最後に、質量保存方程式は不変である。
【０１２４】
ｇｔ＋ｓｔ＋ｆｔ＝Ｓ０
これらの微分方程式において、ＶＰは、モノマーを分解する酵素の最大速度を表わし、ＫＰはその酵素のミハエリス定数を表す。
【０１２５】
これらの微分方程式において、ＶＰは以下の方程式：
ＶＰ＝ｋｃａｔ＿ｐ［Ｐ０］
によって計算される。
【０１２６】
さらに、低エネルギー結合の形成速度を表わすＶＨは、使用されるモノマーに依存する。
この方程式のインビトロの系への置き換えにおいて、［Ｐ］、［Ｔ］、ＶＰ、ＶＨおよびＫＰの様々な値は定数である。
【０１２７】
基質濃度を開始時に計算し、次に、反応の間においては、基質濃度は様々な微分方程式によって決定される。
２−２：サーモリシン存在下における２７℃での物理ゼラチンゲル形成のモデル化：
この理論モデルは、物理タンパク質ゲルの形成、より詳細には、サーモリシン存在下における２７℃でのゼラチンの物理タンパク質ゲルの形成に適用された。この温度において、ゼラチンは、モノマーが部分的に三重らせん体へと会合することによりゲルを形成する。温度を低下させることにより、水素結合によって安定した三重らせん体が出現する。
【０１２８】
ゼラチン：
１−説明：
ゼラチンはコラーゲンから得られる。コラーゲンは、大きな前駆物質すなわちプロα鎖の形で合成される。プロコラーゲンの形成は、水素結合により３本のプロα鎖が集合することと、特定のプロリンおよびリジン残基がヒドロキシル化されてそれぞれヒドロキシプロリンおよびヒドロキシリジンを形成することとを伴う。最後に、細胞外の環境にプロコラーゲンが分泌された後、プロコラーゲンは、プロペプチドが切断されて成熟型となりコラーゲンを形成する。その後、形成されたコラーゲンは、他のコラーゲン分子と会合してコラーゲン細線維を形成し、該コラーゲン細線維は集合してコラーゲン線維を形成する。
【０１２９】
３本のプロα鎖の会合によって形成される三重らせん体の安定性は、得られる生物によって異なる。従って、変性温度（Ｔｍ）は、ある種の哺乳動物における４１．５℃から北極水域に住むある種の魚類における６℃までに及ぶ。Ｔｍの変動は、分子内のヒドロキシプロリンのレベルと関連がある（ペルシコフ（PERSIKOV）ら、Biochemistry、第３９巻、第１４９６０〜１４９６７頁、２０００年）。
【０１３０】
ゼラチンは、コラーゲンを含む組織の酸処理またはアルカリ処理によって得られる。前記処理は、コラーゲンの三重らせん体の変性を生じる（ペズロン(PEZRON)、physical Networks.、Londres Elsevier Applied Science、１９９０年）。本研究では、使用するゼラチンは酸処理によって得られるＡ型ゼラチンである。
【０１３１】
半希釈ゼラチン溶液がコラーゲン鎖の変性温度未満に冷却されると、ゲルが形成される。このとき、鎖が会合して、未変性コラーゲンの三重らせんに類似した三重らせん部分を形成する。この構造遷移は、存在する水分子を捕捉する三次元網状構造の形成を可能にする。従って、形成されたゲルは、三重らせん体が水素結合（弱い結合）によって安定化されただけの物理ゲルである。これらの結合は、温度を増大させることにより不安定になってゲルの溶解をもたらしうる。従って、このゲル化現象は可逆的である。
【０１３２】
従来の研究から、このゲルの弾性は試料中のらせん体の濃度のみに依存することが示されている（ジョリー‐デュアメル（JOLY-DUHAMEL）ら、Langmuir、第１８巻、第７１５８〜７１６６頁、２００２年；ジョリー‐デュアメル（JOL Y-DUHAMEL）ら、Langmuir、第
１８巻、第７２０８〜７２１７頁、２００２年）。
【０１３３】
２−濃度：
使用するゼラチン濃度は、実施例１で説明したゼラチン濃度と同一である。
３−らせん体の形成速度：
三重らせん体の形成速度（ＶＨ）は、偏光分析によって時間または温度に伴うまり構造／らせん構造の変化を監視することによって決定した。実際、三重らせん体の形成に起因するわずかなねじれは、試料を通過する偏光を若干回転させる。この研究は、パーキン・エルマー（PERKIN ELMER）３４１偏光計またはＪＡＳＣＯ１１００偏光計を使用して実施された。測定値は４３６ｎｍで得られた。
【０１３４】
Ａ型ゼラチン（Ａ型またはＡＰ１型）の形成速度論の偏光分析による研究から、各ゼラチンに対して、２７℃におけるらせん体の割合（％）の時間による漸進的変化を測定することが可能となる。図９は、０．５℃／分の割合で４０℃から２７℃まで冷却した場合の、使用した２種のＡ型ゼラチン（Ａ型およびＡＰ１型）の５％含有溶液中のらせん体の割合の時間による漸進的変化を示す。
【０１３５】
らせん体出現の反応速度論の結果は、双方の試料においてほぼ同一である。ゲル化時間では、らせん体の割合（％）は２種のゼラチンにおいて同一（４０分において６．４％）である。
【０１３６】
らせん体の形成速度は、図９から容易に計算することができる。図１０はまた、トランスグルタミナーゼが存在しない物理ゲル（黒四角）、およびトランスグルタミナーゼの存在下で得られた化学ゲル（白丸）における、らせん体の割合（％）の時間および温度による漸進的変化を示す。らせん体の出現速度を様々な時間間隔に対して決定し、本モデルにおいて使用した。したがって、図１０かつ物理ゲルについては、ＶＨは、１０分間に４５×１０−５Ｍ・分−１、１０分間に２１×１０−５Ｍ・分−１、２０分間に９×１０−５Ｍ・分−１、次いで次の９０分間に４．５×１０−５Ｍ・分−１、および最後に２．５×１０−５Ｍ・分−１である。
【０１３７】
同様の実験を２〜１０％のゼラチンを含有するゲルを使用して行なった。
酵素：
使用したプロテアーゼは、実施例１において使用したサーモリシンである。従って、上記と同一のパラメータが用いられる。しかしながら、この温度における２つの酵素の感度の違い：
・ＴＬに対して（Ｖｉ４０℃＝１．６６Ｖｉ２７℃）
・ＴＧに対して（Ｖｉ４０℃＝２．６８Ｖｉ２７℃）
を考慮する。
【０１３８】
モデル化：
予め決定された様々な値に基づいて、上記のように、微分方程式を解くためにオイラー近似法を適用することにより、結合した画分の挙動を時間に従って監視することが可能である。異なるサーモリシン濃度を用いて、いくつかのモデル化実験を行なった。
【０１３９】
図１１は、２７℃での種々の濃度のサーモリシン存在下における結合鎖の割合（％）の漸進的変化をモデル化するいくつかの例を示す（ゲル化閾値はらせん体６．４％である）
。得られた結果から、転移は、ＶＰの特定の値に対して可能であり、すべての場合において、加水分解による小さな断片の漏出は網状構造の分解を生じ、従って形成されたゲルの可溶化をもたらすことが示される。
【０１４０】
２−３：サーモリシンの存在下における物理ゼラチンゲルの形成：
この理論モデルを検証するために、上記に記載した方法（２−２を参照）と同一の方法によって、種々の濃度のサーモリシンを加えて様々な実験を行なった。得られた結果を、理論モデルの予測と比較して、下記の表ＩＩＩに示す。
【０１４１】
【表４】
この場合の結果もまた、開発された理論モデルに従って、溶液／ゲル転移およびその後に続くゲル／溶液転移を実験的に得ることが可能であり、このことは、低エネルギー結合の形成によって重合し得るモノマーの溶液から、結合したポリマー鎖を分解し得る酵素の存在下において（この場合、様々な濃度のサーモリシン存在下の２７℃の５％ゼラチン含有溶液で）可能であることを示している。
【０１４２】
試験したすべてのサーモリシン濃度（０．００１〜０．１Ｕ／ｍｌ）において、ゲルが形成されると、該ゲルは最終的には融解することが観察される。これは開発した理論モデルに合致している。
【０１４３】
サーモリシンが存在する２７℃の５％ゼラチン含有溶液の場合には、最初の溶液／ゲルの転移を得るための臨界サーモリシン濃度は、０．０１ユニットである。
次に、ゲル化時間も使用するサーモリシン濃度に依存する。
【０１４４】
図１２は、２７℃における異なるサーモリシン濃度を有する５％ゼラチン含有溶液の粘弾性の実験上の漸進的変化を示す。
よって開発した理論モデルに従って、溶液／ゲル転移およびゲル／溶液転移を連続的に実施することができる生体材料を得ることが可能である。この目的のためには、低エネルギーの相互作用によって結合したモノマーの鎖を分解し得る酵素の臨界濃度を測定するこ
とで十分である。次に、理論モデルによって、一方では所望のゲル化時間、および他方では所望の有効なゲル寿命を有するゲルを得るために酵素濃度を適応させすることが可能となる。
【０１４５】
実施例３：混合ゲル：
３−１． 理論モデルの開発：
この統合モデルは、２つの拮抗する酵素活性の存在下における混合ゲル（物理ゲルおよび化学ゲル）の形成によって得られる動的釣り合いに対応する。該モデルは、以下の（スキームＩおよびＩＩからのデータを統合する）反応スキームによって簡略に表わすことができる。
【０１４６】
スキームＩＩＩ：
【０１４７】
【化３】
この第３の場合において、反応機構は、酵素反応を単純なミハエリアン反応と同等とみなす以下の３つの微分方程式と、第４の質量保存方程式とによって容易に記述することができる。
【０１４８】
結合モノマー（ｇ）の鎖の数の時間による漸進的変化について記述する微分方程式は、以下のとおりである。
【０１４９】
【数８】
溶液中のモノマー（ｓ）の数の時間による漸進的変化について記述する微分方程式は、以下のとおりである。
【０１５０】
【数９】
分解モノマー（ｆ）の数の時間による漸進的変化について記述する微分方程式は、以下のとおりである。
【０１５１】
【数１０】
最後に、質量保存方程式は以下のとおり：
ｇｔ＋ｓｔ＋ｆｔ＝Ｓ０
である。
【０１５２】
これらの微分方程式では、ＶＨは、低エネルギーの結合の形成速度を表し、使用されるモノマーに依存する。ＶＰおよびＶＴは、酵素Ｐおよび酵素Ｔの最大速度をそれぞれ表す。また、ＫＰおよびＫＴは、酵素Ｐおよび酵素Ｔのミハエリス定数をそれぞれ表す。
【０１５３】
この方程式のインビトロ系への置き換えにおいて、［Ｐ］、［Ｔ］、ＶＰ、ＶＴ、ＫＰおよびＫＴの様々な値は、定数である。
３−２：トランスグルタミナーゼおよびサーモリシン存在下における、２７℃での混合ゼラチンゲル形成のモデル化：
この理論モデルは、混合タンパク質ゲルの形成、より詳細にはトランスグルタミナーゼおよびサーモリシン存在下における２７℃でのゼラチンの、混合タンパク質ゲルの形成に適用された。
【０１５４】
ゼラチン：
実施例１および２と同一のゼラチン濃度を用いる。らせん体形成の速度は実施例２に記述したものと同一である。
【０１５５】
酵素：
使用するプロテアーゼは、実施例１および２において使用したサーモリシンである。
トランスグルタミナーゼは、実施例１で使用したトランスグルタミナーゼと同一のものである。トランスグルタミナーゼの活性に対する拡散の影響を考慮するために、実施例１で説明したように、拡散係数を取り入れた。
【０１５６】
したがって、これらの２つの酵素に使用されたパラメータは前述したパラメータと同一である。
モデル化：
予め決定した様々な値に基づいて、上記のような微分方程式の近似のためのオイラー法を適用することにより、結合した画分の時間による挙動を監視することが可能である。いくつかのモデル化実験を、異なるトランスグルタミナーゼ濃度およびサーモリシン濃度を用いて行なった。実施例１に記載したように、トランスグルタミナーゼに対しては拡散係数を適用した。
【０１５７】
図１３は、異なるＶＴ／ＶＰ比率（１Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼ濃度）に対する結合モノマーの画分の時間による漸進的変化を示す。
上記結果は、一方では、ゲル化が先の実施例の場合よりも速く生じることを示唆しており、他方では、本実施例においては、結合モノマーの画分およびゲルの安定性が物理ゲルまたは化学ゲルの場合より重要であることを示唆している。
【０１５８】
３−３：サーモリシンの存在下における混合ゼラチンゲルの形成：
先に記載した理論モデルを検証するために、５％のゼラチンを含有する４０℃の試料について、トランスグルタミナーゼ／サーモリシン比が８０でトランスグルタミナーゼ濃度が１Ｕ／ｍｌである２つの酵素トランスグルタミナーゼおよびサーモリシン存在下において実験を行った。溶液を毎分０．５℃の割合で４０℃から２７℃まで冷却した。ゼラチン溶液の漸進的変化は、上述したように、レオロジーおよび偏光分析によって同時に監視した。得られた結果を、理論モデルの予測と比較して、下記の表ＩＶに示す。
【０１５９】
【表５】
上記結果は、開発した理論モデルに従って、低エネルギー結合および共有結合によって重合し得るモノマー溶液から、２つの拮抗する酵素活性存在下において（この場合、２７℃の５％ゼラチン含有溶液で異なる濃度のトランスグルタミナーゼおよびサーモリシン存在下において）、溶液／ゲル転移と、それに次いでゲル／溶液転移とを連続的に得ることが実験的に可能であることを示している。
【０１６０】
開発された理論モデルに従い、ゲル生成時間は非常に迅速である。さらに、得られた「混合」ゲルの安定性および有効寿命は、物理ゲルおよび化学ゲルの双方と比較して非常に高い。
【０１６１】
図１４は、トランスグルタミナーゼおよびサーモリシン存在下、２７℃における５％ゼラチン含有溶液の粘弾性およびらせん体の割合（％）の同時進行の漸進的変化を示す。前
記５％ゼラチン含有溶液はトランスグルタミナーゼ／サーモリシン比は８０、トランスグルタミナーゼ濃度は１Ｕ／ｍｌである。
【０１６２】
２つの先の理論モデルに基づいて開発した理論モデルに従って、溶液／ゲル転移およびゲル／溶液転移を連続的に行なうことができる生体材料を得ることが可能である。これについては、使用するモノマーおよび酵素に従って最初の溶液／ゲルの転移を得るために、実施例１におけるように、モノマーを結合させる酵素／結合モノマーを分解する酵素の臨界比を実験的に決定することで十分である。その後、理論モデルにより、一方では所望のゲル化時間、他方では所望の有効なゲル寿命を有するゲルを得るために、様々な酵素濃度を適応することが可能となる。
【０１６３】
３−４：様々なプロテアーゼの存在下におけるゼラチンの物理ゲルの形成：
３−３で得られた結果を確認するために、７％ゼラチン含有試料について、４０℃、１．５Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼ濃度としてトランスグルタミナーゼおよび様々なプロテアーゼの存在下において、実験を行った。溶液を、毎分０．５℃の割合で、４０℃から２７℃まで冷却した。上述したように、ゼラチン溶液の漸進的変化をレオロジーおよび偏光分析によって同時に監視した。得られた結果を、下記の表Ｖに示す。
【０１６４】
【表６】
これらの結果もまた、開発したモデルを他の酵素に対して一般化することができることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】０．１のＶ’Ｐ／ＶＰ比率における、結合した画分の時間による漸進的変化をモデル化した例を示す図。
【図２】レオメータを用いて監視した、異なる濃度（０．１、０．１５、０．２、０．５および１Ｕ／ｍｌ）のトランスグルタミナーゼ存在下における４０℃の５％ゼラチン含有溶液の粘弾性の漸進的変化を示す図。
【図３】トランスグルタミナーゼ濃度による、４０℃の５％ゼラチン含有溶液のゲル化速度（ゲル化時間の逆数）を示す図。
【図４】ゲル化点の後の、４０℃における酵素濃度に依存する酵素反応の速度を示す図。
【図５】溶液中に１ユニット（黒四角）および０．４ユニット（黒菱形）の酵素の拡散を考慮した、ゲル中における活性トランスグルタミナーゼの量の経時的な漸進的変化を示す図。
【図６】拡散の制限を有し、１０のＶＴ／ＶＰ比（１Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼ濃度）で、結合した画分の時間による漸進的変化をモデル化した結果を示す図。
【図７】緩やかな拡散の制限および様々なＶＴ／ＶＰ比（１Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼ濃度）を有する、結合した画分の時間による漸進的変化をモデル化した結果を示す図。
【図８】異なる濃度のトランスグルタミナーゼおよびサーモリシンの存在下における５％ゼラチン溶液の４０℃での実験による粘弾性の漸進的変化を示す図。
【図９】０．５℃／分の割合で４０℃から２７℃まで冷却した場合の、使用した２種のＡ型ゼラチン（Ａ型およびＡＰ１型）の５％含有溶液中のらせん体の割合の時間による漸進的変化を示す図。
【図１０】トランスグルタミナーゼが存在しない物理ゲル（黒四角）、およびトランスグルタミナーゼの存在下で得られた化学ゲル（白丸）における、らせん体の割合（％）の時間および温度による漸進的変化を示す図。
【図１１】２７℃での種々の濃度のサーモリシン存在下における結合鎖の割合（％）の漸進的変化をモデル化するいくつかの例を示す図（ゲル化閾値はらせん体６．４％）。
【図１２】２７℃における異なるサーモリシン濃度を有する５％ゼラチン含有溶液の粘弾性の実験上の漸進的変化を示す図。
【図１３】異なるＶＴ／ＶＰ比率（１Ｕ／ｍｌのトランスグルタミナーゼ濃度）に対する結合モノマーの画分の時間による漸進的変化を示す図。
【図１４】トランスグルタミナーゼおよびサーモリシン存在下、２７℃における５％ゼラチン含有溶液の粘弾性およびらせん体の割合（％）の同時進行の漸進的変化を示す図。前記５％ゼラチン含有溶液はトランスグルタミナーゼ／サーモリシン比は８０、トランスグルタミナーゼ濃度は１Ｕ／ｍｌである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
好ましくは低エネルギーの結合によってポリマーを形成し得る少なくとも１種のモノマーおよび前記モノマーとそのポリマーとの混合物のうちのいずれかと、前記ポリマーを分解し得る第１の種類の酵素とを含む種類の生体材料であって、前記生体材料は、ゲル形態および溶液形態のいずれかを呈し、かつ第１の溶液／ゲル転移と、次いで、第１の種類の酵素の作用下において、第２のゲル／溶液転移とを連続的に行なうことが可能である、生体材料。
【請求項２】
前記生体材料は、前記モノマーの間に共有結合を形成し得る少なくとも１種の第２の種類の酵素をさらに含み、かつ前記生体材料は、第２の種類の酵素の作用下において第１の溶液／ゲル転移と、それに次いで第１の種類の酵素の作用下において第２のゲル／溶液転移とを連続的に行なうことができることを特徴とする、請求項１に記載の生体材料。
【請求項３】
双方の種類の酵素が、不活性化されていない状態で同時に存在することを特徴とする、請求項１または２のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項４】
前記モノマーはタンパク質および糖類のいずれかであることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項５】
ポリマーを形成し得るタンパク質は、フィブリン、グリアジン、ミオシン、グロブリン（７Ｓおよび１１Ｓ）、アクチン、ミオグロビン、コラーゲンおよびその誘導体、乳漿タンパク、大豆および小麦タンパク、並びに卵白および卵黄タンパクのうちから選択される、請求項３に記載の生体材料。
【請求項６】
重合可能な種類のタンパク質およびそのポリマーを分解し得る第１の種類の酵素は、メタロプロテイナーゼ群、セリンプロテアーゼ群、システインおよびアスパラギン酸プロテアーゼ群、並びにＡＤＡＭ群の酵素のうちから選択されることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の生体材料
【請求項７】
重合可能な種類のタンパク質およびそのポリマーを分解し得る酵素はメタロプロテイナーゼであり、好ましくは細菌性サーモリシンであることを特徴とする、請求項６に記載の生体材料。
【請求項８】
タンパク質モノマーの間に共有結合を形成し得る第２の種類の酵素は、リシルオキシダーゼ群およびトランスグルタミナーゼ群のうちから選択されることを特徴とする、請求項２乃至７のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項９】
ポリマーを形成し得る糖類は、カラギーナン、アルギナート、ペクチン、キトサン、セルロース、キチン、グリコーゲンおよびデンプンのうちから選択されることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項１０】
第１の種類の酵素の濃度に対する第２の種類の酵素の濃度の比率は、１以上、好ましくは１０以上であることを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項１１】
適切な溶媒、好ましくは水性溶媒をさらに含むことを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項１２】
前記生体材料は、凍結乾燥されたゲル形態にあることを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項１３】
請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の生体材料を調製する方法であって、該方法は、適切な溶媒中に、
（ｉ）好ましくは低エネルギーの結合によりポリマーを形成し得る少なくとも１種のモノマーを混合することと、
（ｉｉ）前記ポリマーを分解し得る第１の種類の酵素を混合することと
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１４】
前記方法は、適切な溶媒中に、
（ｉｉｉ）前記モノマーの間に共有結合を形成し得る第２の種類の酵素を混合することをさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
適切な溶媒は水溶媒であることを特徴とする、請求項１３または１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ポリマーを形成し得るモノマーの量は、生体材料の全重量に対して０．１〜３０重量％であることを特徴とする、請求項１３乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ポリマーを分解し得る酵素の濃度に対するモノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の濃度の比率は、１以上、好ましくは１０以上であることを特徴とする、請求項１３乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の濃度は、０．００１Ｕ／ｍｌ超、好ましくは０．０１Ｕ／ｍｌ超であることを特徴とする、請求項１３乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ゲル形態の生体材料を凍結乾燥する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１３乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ポリマーを形成し得るモノマーの濃度、前記ポリマーを分解し得る酵素の濃度、および任意選択で前記モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の濃度は、所望のゲル化時間および有効ゲル寿命を有する生体材料が得られるように選択されることを特徴とする、請求項１３乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ポリマーを形成し得るモノマーの濃度、前記ポリマーを分解し得る酵素の濃度、および場合により、前記モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の濃度は、下記方程式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＶ）の結果が所望のゲル化時間および有効ゲル寿命を得ることを可能にするように選択され、
【数１】
上記方程式は、それぞれ、時間（ｄｔ）による、結合したモノマーの数の漸進的変化（ｄｇ）（Ｉ）、溶液中のモノマーの数の漸進的変化（ｄｓ）（ＩＩ）、および分解されたモノマーの数の漸進的変化（ｄｆ）（ＩＩＩ）、並びに質量保存方程式（ＩＶ）を記述しており、
前記式中、
− ｇは結合した形態にあるモノマーの量に相当し、
− ｔは時間に相当し、
− ＶＰは、単位時間あたりに前記酵素により遊離形態に変化した結合モノマーの量として表された、ポリマーを分解し得る酵素の速度に相当し、
− ＫＰは、ポリマーを分解し得る酵素のミハエリス定数を表し、
− ｓは、遊離した形態にあるモノマーの量を表し、
− ＶＴは、単位時間あたりに前記酵素によって結合された遊離形態にある結合モノマーの量として表された、モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の速度に相当し、
− ＫＴは、モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素のミハエリス定数を表し、
− ＶＨは、低エネルギーの結合により重合し得るモノマーの場合における、単位時間あたりの低エネルギー結合による遊離形態にあるモノマーの結合の速度を表し、
− Ｖ’Ｐは、単位時間あたりに前記酵素により生成されたもはや重合不可である分解モノマーの量として表された、遊離形態にあるモノマーを分解し得る酵素の速度に相当し、
− ｇｔは、時間ｔにおける、結合形態にあるモノマーの量に相当し、
− ｓｔは、時間ｔにおける、遊離形態にあるモノマーの量に相当し、
− ｆｔは、時間ｔにおける、もはやポリマーを形成し得ない分解モノマーの量に相当し、
− Ｓ０はモノマーの初期量に相当する
ことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項１】
好ましくは低エネルギーの結合によってポリマーを形成し得る少なくとも１種のモノマーおよび前記モノマーとそのポリマーとの混合物のうちのいずれかと、前記ポリマーを分解し得る第１の種類の酵素とを含む種類の生体材料であって、前記生体材料は、ゲル形態および溶液形態のいずれかを呈し、かつ第１の溶液／ゲル転移と、次いで、第１の種類の酵素の作用下において、第２のゲル／溶液転移とを連続的に行なうことが可能である、生体材料。
【請求項２】
前記生体材料は、前記モノマーの間に共有結合を形成し得る少なくとも１種の第２の種類の酵素をさらに含み、かつ前記生体材料は、第２の種類の酵素の作用下において第１の溶液／ゲル転移と、それに次いで第１の種類の酵素の作用下において第２のゲル／溶液転移とを連続的に行なうことができることを特徴とする、請求項１に記載の生体材料。
【請求項３】
双方の種類の酵素が、不活性化されていない状態で同時に存在することを特徴とする、請求項１または２のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項４】
前記モノマーはタンパク質および糖類のいずれかであることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項５】
ポリマーを形成し得るタンパク質は、フィブリン、グリアジン、ミオシン、グロブリン（７Ｓおよび１１Ｓ）、アクチン、ミオグロビン、コラーゲンおよびその誘導体、乳漿タンパク、大豆および小麦タンパク、並びに卵白および卵黄タンパクのうちから選択される、請求項３に記載の生体材料。
【請求項６】
重合可能な種類のタンパク質およびそのポリマーを分解し得る第１の種類の酵素は、メタロプロテイナーゼ群、セリンプロテアーゼ群、システインおよびアスパラギン酸プロテアーゼ群、並びにＡＤＡＭ群の酵素のうちから選択されることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の生体材料
【請求項７】
重合可能な種類のタンパク質およびそのポリマーを分解し得る酵素はメタロプロテイナーゼであり、好ましくは細菌性サーモリシンであることを特徴とする、請求項６に記載の生体材料。
【請求項８】
タンパク質モノマーの間に共有結合を形成し得る第２の種類の酵素は、リシルオキシダーゼ群およびトランスグルタミナーゼ群のうちから選択されることを特徴とする、請求項２乃至７のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項９】
ポリマーを形成し得る糖類は、カラギーナン、アルギナート、ペクチン、キトサン、セルロース、キチン、グリコーゲンおよびデンプンのうちから選択されることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項１０】
第１の種類の酵素の濃度に対する第２の種類の酵素の濃度の比率は、１以上、好ましくは１０以上であることを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項１１】
適切な溶媒、好ましくは水性溶媒をさらに含むことを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項１２】
前記生体材料は、凍結乾燥されたゲル形態にあることを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項１３】
請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の生体材料を調製する方法であって、該方法は、適切な溶媒中に、
（ｉ）好ましくは低エネルギーの結合によりポリマーを形成し得る少なくとも１種のモノマーを混合することと、
（ｉｉ）前記ポリマーを分解し得る第１の種類の酵素を混合することと
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１４】
前記方法は、適切な溶媒中に、
（ｉｉｉ）前記モノマーの間に共有結合を形成し得る第２の種類の酵素を混合することをさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
適切な溶媒は水溶媒であることを特徴とする、請求項１３または１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ポリマーを形成し得るモノマーの量は、生体材料の全重量に対して０．１〜３０重量％であることを特徴とする、請求項１３乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ポリマーを分解し得る酵素の濃度に対するモノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の濃度の比率は、１以上、好ましくは１０以上であることを特徴とする、請求項１３乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の濃度は、０．００１Ｕ／ｍｌ超、好ましくは０．０１Ｕ／ｍｌ超であることを特徴とする、請求項１３乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ゲル形態の生体材料を凍結乾燥する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１３乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ポリマーを形成し得るモノマーの濃度、前記ポリマーを分解し得る酵素の濃度、および任意選択で前記モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の濃度は、所望のゲル化時間および有効ゲル寿命を有する生体材料が得られるように選択されることを特徴とする、請求項１３乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ポリマーを形成し得るモノマーの濃度、前記ポリマーを分解し得る酵素の濃度、および場合により、前記モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の濃度は、下記方程式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＶ）の結果が所望のゲル化時間および有効ゲル寿命を得ることを可能にするように選択され、
【数１】
上記方程式は、それぞれ、時間（ｄｔ）による、結合したモノマーの数の漸進的変化（ｄｇ）（Ｉ）、溶液中のモノマーの数の漸進的変化（ｄｓ）（ＩＩ）、および分解されたモノマーの数の漸進的変化（ｄｆ）（ＩＩＩ）、並びに質量保存方程式（ＩＶ）を記述しており、
前記式中、
− ｇは結合した形態にあるモノマーの量に相当し、
− ｔは時間に相当し、
− ＶＰは、単位時間あたりに前記酵素により遊離形態に変化した結合モノマーの量として表された、ポリマーを分解し得る酵素の速度に相当し、
− ＫＰは、ポリマーを分解し得る酵素のミハエリス定数を表し、
− ｓは、遊離した形態にあるモノマーの量を表し、
− ＶＴは、単位時間あたりに前記酵素によって結合された遊離形態にある結合モノマーの量として表された、モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素の速度に相当し、
− ＫＴは、モノマーの間に共有結合を形成し得る酵素のミハエリス定数を表し、
− ＶＨは、低エネルギーの結合により重合し得るモノマーの場合における、単位時間あたりの低エネルギー結合による遊離形態にあるモノマーの結合の速度を表し、
− Ｖ’Ｐは、単位時間あたりに前記酵素により生成されたもはや重合不可である分解モノマーの量として表された、遊離形態にあるモノマーを分解し得る酵素の速度に相当し、
− ｇｔは、時間ｔにおける、結合形態にあるモノマーの量に相当し、
− ｓｔは、時間ｔにおける、遊離形態にあるモノマーの量に相当し、
− ｆｔは、時間ｔにおける、もはやポリマーを形成し得ない分解モノマーの量に相当し、
− Ｓ０はモノマーの初期量に相当する
ことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００８−５２１３９３（Ｐ２００８−５２１３９３Ａ）
【公表日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４２０４９（Ｐ２００７−５４２０４９）
【出願日】平成１７年１１月２５日（２００５．１１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００２９３９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５６７００
【国際公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【出願人】（５０７１７３２６３）ユニベルシテ ドゥ セルジー−ポントワーズ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＣＥＲＧＹ−ＰＯＮＴＯＩＳＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月２５日（２００５．１１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００２９３９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５６７００
【国際公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【出願人】（５０７１７３２６３）ユニベルシテ ドゥ セルジー−ポントワーズ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＣＥＲＧＹ−ＰＯＮＴＯＩＳＥ
【Ｆターム（参考）】
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