無機化合物と細胞との複合体及びその製造方法
【課題】煩雑な操作を行うことなく、細胞の内部及び外部に無機化合物を有する無機化合物と細胞との複合体及びその製造方法を提供する。
【解決手段】無機化合物微粒子で満たされた動物細胞と、その細胞の外部に付着する無機化合物微粒子と、からなる無機化合物と細胞との複合体。この無機化合物と細胞との複合体は、無機化合物微粒子を含む培地中で動物細胞を培養し、固形分を分取することによって製造することができる。
【解決手段】無機化合物微粒子で満たされた動物細胞と、その細胞の外部に付着する無機化合物微粒子と、からなる無機化合物と細胞との複合体。この無機化合物と細胞との複合体は、無機化合物微粒子を含む培地中で動物細胞を培養し、固形分を分取することによって製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無機化合物と細胞との複合体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
整形外科手術において骨の欠損部を補填する方法としては、自家骨あるいは他家からの骨移植、セラミックス、金属、樹脂及びこれらの複合体からなる人工材料を単独あるいは自家骨との混合物などによって補填する方法が主に採用されている。自家骨移植は、自身からの生体骨移植であり、最も安全かつ迅速に骨と結合させることができるものであり、腸骨の一部を移植することが最も頻繁に行われている。しかし、腸骨移植は、採取出来る骨の大きさ及び形状に制限があり、健康な部位を切除することによる患者への負担も大きい。したがって、自家骨移植は、これらの点が問題として認識されている。
【０００３】
新しい骨補填材といては、近年ではコラーゲンと合成リン酸カルシウムからなる骨と類似した組成を有する複合体、骨形成を促進させる生理活性物質を含浸させた人工材料なども検討されている。また、骨髄細胞をあらかじめ足場材料に播種した骨補填材も研究されている。これらの骨補填材は、体内に埋入されるため、体内において無害、安全であることに加えて、埋入後に欠損部周辺の骨と迅速かつ強固に結合する機能を有することを意図して開発されている。
【０００４】
さらに、新しい骨補填材の目標とされる機能としては、自家骨の骨誘導能、骨形成能、初期固定時の機械強度などを有することが重要視されている。これらの機能を有し、生体骨に類似した人工骨を得ることを目的として、例えば、骨芽細胞に分化可能な幹細胞の利用が試みられている。
自身の幹細胞を用いる場合には、骨髄から細胞を採取する方法が多く採用されている。具体的には、骨髄から細胞を採取した後、体外で足場材料に接着、培養した後体内に戻す方法、及び、培養した際に、細胞に分化誘導因子を作用させて骨髄由来細胞を、骨形成能を有する細胞に分化させた後に欠損部に補填する方法が開発されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、骨髄由来細胞（幹細胞）を用いる上記の方法は、次のような問題点がある。第一には、骨髄由来細胞のうち、どの細胞が骨形成能を有する細胞に分化するか明確でない。第二には、分化誘導の調節が困難であり、体外において人為的に分化させた細胞の変異状態を知ることも困難である。第三には、体外での培養に関して骨髄細胞を増殖させる場合、細胞の増殖には少なくとも２週間から４週間を要する。そして、第四には、骨髄由来細胞を、足場となる材料に付着させるための手技は、他の患者の加工環境とは完全に隔離されることが要求されるため、大規模に細胞を播種、加工することには多大な労力と設備を必要とする。素材である骨髄由来細胞や細胞を播種した骨補填材は、唯一の物であり、異なる骨補填材間で品質や仕様を同一にすることは困難である。
【０００６】
大規模生産の観点では、骨補填材として用いる材料が均一であるほうが、効率が良く、品質の確保も可能となる。すなわち、細胞と骨補填材を複合化した骨補填材を多量に供給するには、均一な細胞を用いて、生体からの移植骨と同等の骨形成能を有する材料の開発が求められる。このような骨形成能を有する材料としては、株化細胞を利用することが有効であり、現在、ＭＣ３Ｔ３―Ｅ１などいくつかの株化細胞が知られているが、骨形成能を有する細胞を用いても実用的な骨補填材は未だ開発されていない。
【０００７】
したがって、本発明は、生体材料の性質を併せ持ち、体内で無害、安全で、初期固定時の機械的強度を有する骨補填材及びこのような骨補填材を簡単な方法で多量に効率よく製造する方法を開発することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、細胞自身が本来有する飲食機能を利用すれば、細胞の骨形成能の有無に関係なく、しかも煩雑な操作を行うことなく、容易に有効な骨補填材を得ることができるという知見を得て、完成されたものである。
【０００９】
本発明の無機化合物と細胞との複合体は、無機化合物微粒子で満たされた動物細胞と、その細胞の外部に付着する無機化合物微粒子と、からなることを特徴とする。
【００１０】
無機化合物微粒子は、平均粒子径が１０ｎｍ〜１０μｍのものであることが好ましい。
なお、本明細書において平均粒子径は、サブミクロン粒子アナライザー Ｎ５（ベックマン・コールター株式会社製）を使用し、動的散乱法によって測定したものである。液体中の粒子が拡散する速度を計測することで粒子径を測定する装置で、拡散する速度は液体の温度、粘度、粒子径の３要素で決まるため、温度及び粘度が既知であれば粒子径が得られるというものである。平均粒子径は該分析装置のＳＤＰ(Size Distribution Processor)分析により測定したもので、単分散モードでの測定に比し、複雑分布の際の制約を受けない高精度な粒子径分布を得ることができる。
【００１１】
無機化合物微粒子は、高分子窒素化合物で被覆されたものであることが好適である。
【００１２】
高分子窒素化合物は、数平均分子量が８００〜１０００００のものであることが好ましい。
【００１３】
さらに、高分子窒素化合物は、一級アミノ基、二級アミノ基及び三級アミノ基を繰り返し構造単位内に有するものであることが好ましい。
【００１４】
また、高分子窒素化合物は、直鎖、枝分かれ鎖又は環状のポリアミン化合物の単体又は混合物であることが好ましい。
【００１５】
ポリアミン化合物は、ポリエチレンイミンであることが好適である。
【００１６】
無機化合物微粒子は、リン酸カルシウム系化合物又は金属酸化物であることが好ましい。
【００１７】
リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトであることが好適である。
【００１８】
金属酸化物は、アルミナ、シリカ、酸化マグネシウム、あるいは酸化鉄であることが好適である。
【００１９】
本発明による無機化合物と細胞との複合体の製造方法は、無機化合物微粒子を含む培地中で動物細胞を培養し、固形分を分取することを特徴とする。
【００２０】
無機化合物微粒子の濃度は、上記動物細胞に対して１．０ｐｇ〜１．０ｎｇ／ｃｅｌｌであることが好ましい。
【００２１】
固形分の分取後には、培養した動物細胞を失活処理することが好ましい。
【００２２】
失活処理としては、加熱処理または化学薬品処理が挙げられる。
【００２３】
化学薬品処理は、例えば、アルデヒド化合物又はジマレイミド化合物によるタンパク質固定であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、生体材料の性質を併せ持ち、体内で無害、安全で、初期固定時の機械的強度を有する骨補填材を多量に提供することができる。また、本発明によれば、上記のような特性を有する骨補填材を、素材として用いる細胞の骨形成能の有無に関係なく、細胞自身が本来有する飲食機能を利用するだけで、煩雑な操作を行うことなく、簡単な方法で多量に効率よく製造することができる。
本発明は、前記のように、新規な骨補填材の開発を目的としてなされたものであるが、得られた無機化合物と細胞との複合体は、骨補填材としてばかりでなく、診断剤など、生体材料の性質を有しながら、形状強度も有することが望まれる様々な用途に応用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の無機化合物と細胞との複合体は、無機化合物微粒子で満たされた動物細胞と、この動物細胞の外部に付着する無機化合物微粒子とからなる。
動物細胞は、飲食作用（機能）を保持している細胞であれば、特に制限はなく、例えば、イヌ腎臓由来細胞株（以下、ＭＤＣＫと略称することがある）、骨芽肉腫細胞株（以下、ＨＯＳと略称することがある）などを用いることができる。
【００２６】
無機化合物微粒子としては、リン酸カルシウム系化合物又は金属酸化物が挙げられる。また、これらを単独または混合物として用いることもできる。リン酸カルシウム系化合物は、Ｃａ／Ｐ比１．０〜２．０のものであればよく、例えば、ハイドロキシアパタイト、フッ素アパタイトなどの各種のアパタイト、第一リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸四カルシウムなどが挙げられ、これらは単独または混合物として用いることができる。
また、金属酸化物としては、酸化アルミニウム、二酸化珪素、酸化マグネシウム、酸化チタン、酸化鉄（ヘマタイト）などが挙げられる。
【００２７】
無機化合物微粒子は、平均粒子径が１０ｎｍ〜１０μｍであることが好ましい。平均粒子径が１０ｎｍより小さい微粒子は、産業上利用できる程度に多量に製造するのは困難であり、１０μｍを越えるものは、動物細胞の飲食作用によって細胞内に取り込まれることが困難である。
【００２８】
また、無機化合物微粒子は、粒子状態を問わず、微粒子にナノ粒子（粒子径の大きなものに粒子径の小さなもの）が付着した状態、ナノ粒子が凝集した状態等であってよく、任意の方法で製造されたものであってよい。
本発明の無機化合物微粒子の一例として、本発明者らが開発したリン酸カルシウム系化合物ナノ粒子の製造方法を次に説明する。リン酸カルシウム系化合物ナノ粒子は、リン酸カルシウム系化合物を熱処理し、得られたリン酸カルシウム系化合物粒子を有機溶媒に分散させ、解砕処理し、得られたリン酸カルシウム系化合物分散液を遠心分離し、上清を採取し、必要に応じて乾燥することによって製造することができる。
【００２９】
上記リン酸カルシウム系化合物は、公知の方法で合成し、熱処理する前に乾燥し、必要に応じて造粒することが好ましい。造粒は、公知の方法によって行うことができるが、スプレードライ法によって体積比が７０％以上の多孔体にすることが好ましい。
【００３０】
また、上記方法では、まず、リン酸カルシウム系化合物を公知の加熱手段で熱処理して熱履歴を与える。熱処理温度に制限はないが、４００℃から１０５０℃の温度範囲で熱処理されることが好ましい。４００℃よりも低温であると、十分な強度が得られず、使用強度が低下してしまう。１０５０℃より高温であると、一部または全部が焼結してしまい、ナノ粒子の収率が低下する。
【００３１】
熱処理後、例えば、超音波処理、ホモジナイザー、振とう器、乳鉢などの解砕処理によって有機溶媒に分散させる。有機溶媒としては、極性有機溶媒が好ましく、例えば、アルコール（例えば、エタノール、イソプロパノールなど）、エーテル（例えば、２−エトキシエタノールなど）、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどを用いることができる。
【００３２】
解砕処理前に、リン酸カルシウム系化合物粒子をボールミル装置によって処理することもできる。ボールミル装置は、通常、摺り運動によって試料を解砕するボール（メディア）を用いるが、ボールを用いずに処理を行うと、球状の（アスペクト比が１に近い）ナノ粒子を高い収率で得ることができる。このとき、有機溶媒等を介在させない（ポット内にリン酸カルシウム系化合物粒子のみが入れられた）ドライ状態（以下、ドライミル処理と称する）であることがよい。
【００３３】
以上のようにして得られたリン酸カルシウム系化合物分散液を遠心分離処理によって、有機溶媒相に分散されたリン酸カルシウム系化合物ナノ粒子を含む上清とそれより粒径の大きい粒子の沈殿とに分画する。その後、上清の有機溶媒を蒸発させ、リン酸カルシウム系化合物ナノ粒子を得ることができる。
【００３４】
無機化合物微粒子は、高分子窒素化合物によって被覆されていることが好ましい。具体的には、無機化合物粒子は、固体酸点（電子対受容体）で高分子窒素化合物のアミノ基の少なくとも１個に結合することによって、高分子窒素化合物で被覆されることが好ましい。
【００３５】
高分子窒素化合物で被覆された無機化合物微粒子は、無機化合物微粒子と高分子窒素化合物を溶液中で混合して得られる。この高分子窒素化合物で被覆された無機化合物微粒子分散液を遠心分離し、上清を採取し、乾燥することによって、高分子窒素化合物で被覆された無機化合物微粒子を得ることができる。この微粒子は、分散性が良くなり、粒径が小さいまま存在できるため、被覆されていない無機化合物微粒子に比べて動物細胞内に取り込まれ易い。
【００３６】
高分子窒素化合物は、分子内に一級アミノ基、二級アミノ基、及び三級アミノ基のうち少なくとも２個のアミノ基を有するものであればよく、例えば、ポリアミン化合物を用いることができる。ポリアミン化合物は、直鎖状、枝分れ状、及び環状のいずれであってもよく、分子内に一級アミノ基、二級アミノ基及び三級アミノ基が繰り返し構造単位内により多数存在すると、無機化合物微粒子との結合サイトが増えるため好ましい。
【００３７】
このようなポリアミン化合物としては、例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジンなどを用いることができ、特にポリエチレンイミンであることが好適である。ポリエチレンイミンは、エチレンイミンの重合体であり、重合に関与するアミノ基によって分子構造が異なる。
【００３８】
ポリアミン化合物（高分子窒素化合物）の数平均分子量は、８００〜１０００００であることが好ましい。数平均分子量が８００未満であると、ポリアミン化合物が無機化合物微粒子を良好に覆うことが困難になるため、効率良く無機化合物微粒子を動物細胞に取り込むことができない。また、数平均分子量が１０００００を超えると、ポリアミン化合物同士の結合により、大きな凝集塊を作ってしまうため、動物細胞内に無機化合物微粒子を取り込むことが困難になる。
【００３９】
また、高分子窒素化合物溶液の濃度については、被覆すべき無機化合物微粒子の種類、量、表面積などにより左右され、一義的に定めることはできない。しかし、高分子窒素化合物の濃度が薄すぎると、高分子窒素化合物は粒子と結合するが、完全に被覆することはできないため、粒子同士の結合により凝集が起こってしまい、動物細胞内に十分な取り込みができなくなる傾向がある。高分子窒素化合物の濃度が高すぎると、高分子窒素化合物は無機化合物微粒子以外に、高分子窒素化合物同士でも結合してしまうため、大きなミセルを作ってしまい、動物細胞内への取り込みが困難になる。したがって、高分子窒素化合物溶液の濃度は、被覆すべき無機化合物微粒子の種類、量、表面積などに応じて適宜選定することが好ましい。
【００４０】
続いて、本発明の無機化合物と細胞の複合体の製造方法について説明する。
動物細胞は、予め細胞培養によって所望の細胞数からなる細胞塊に増殖させる。その後、この動物細胞の細胞塊を無機化合物微粒子を含む培地中で培養する。培養は、動物細胞の培養に通常に用いられる条件で行うことができる。無機化合物微粒子は、動物細胞に対して、１．０ｐｇ〜１．０ｎｇ／ｃｅｌｌであることがよい。
培養後、固形分を分取して無機化合物と細胞の複合体とする。なお、複合体は、固形分を分取した後、細胞が生体に適合可能であれば、細胞が生きた状態のまま用いることもできるが、必要に応じて動物細胞の失活処理を行うこともできる。
【００４１】
失活処理は、動物細胞の生命活動、及び細胞中のタンパク質等の機能を停止等させるための処理であり、加熱処理または化学薬品処理などを挙げることができる。化学薬品処理としては、アルデヒド化合物、またはジマレイミド化合物によるタンパク質固定などが挙げられる。
【００４２】
また、得られた複合体は、加熱により成形することも可能であり、さらに乾燥させることにより強固な物とすることもできる。
【００４３】
次に、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４４】
以下の実施例で得られた無機化合物と細胞との複合体は、下記の方法で評価した。
（ａ）複合体観察
本発明の無機化合物と細胞との複合体は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって観察した。透過型電子顕微鏡には、株式会社日立製作所製Ｈ−７６００を使用した。なお、ＴＥＭ観察の前に、無機化合物と細胞との複合体は、グルタルアルデヒドで固定して抱埋した。
（ｂ）構成原子測定
無機化合物と細胞との複合体を１００℃で乾燥処理し、ＥＤＸによって構成原子を分析（測定）した。ＥＤＸには、株式会社日立製作所製Ｓ−４３００を使用した。
【実施例１】
【００４５】
本実施例の無機化合物と細胞との複合体の作製方法について説明する。
動物細胞として、ＭＤＣＫ（イヌ腎臓由来細胞株）を用いた。２２５ｃｍ2 フラスコに培養したＭＤＣＫ細胞及び３ｍｇ／ｍｌのリン酸カルシウム微粒子入り培養液を４ｍｌ与え、さらに培養液を加え６０ｍｌに調整した後、３７℃、５％ＣＯ2 条件下で２９時間培養した。
なお、培養液には、ＭＥＭ培地にＦＢＳ（１０ｖｏｌ％）を混合したものを用いた。
【００４６】
使用したリン酸カルシウムは、下記のようにして製造したハイドロキシアパタイト（以下、ＨＡと記す）ナノ粒子である。湿式法で得たハイドロキシアパタイト含有スラリーをスプレードライ装置を用いて２００℃で乾燥して、造粒した。さらに、分級して平均粒径１０μｍとした。得られたＨＡ粒子を電気炉に入れ、５０℃／ｈで昇温し８５０℃にて４時間保持する昇温を行い、ＨＡ粒子を得た。
【００４７】
こうして得られたＨＡ粒子１．０ｇを内容積４５ｍｌのジルコニア製ポットに入れ、遊星型ボールミル（フリッチュ社製；Ｐ−７）によって、回転数８００ｒｐｍで３時間のドライミル処理を行った。なお、ドライミル処理は遊星型ボールミルのポット内にメディアを入れずに行った。ドライミル処理後のＨＡ粒子を回収し、ドライミルＨＡ粒子を得た。
１０ｍｇ／ｍｌポリエチレンイミン（以下、ＰＥＩと記す）溶液３０ｍｌを加え分散させ、超音波発生装置（ＴＡＩＴＥＣ社製；ＶＰ−３０Ｓ）を用いて超音波処理（出力１８０Ｗ、５分間）した。これによりＨＡ粒子が解砕し、ＨＡ粒子表面をＰＥＩが被覆した。その後、イソプロパノールを加えて、全量を１０ｍｌとし、４１００×ｇにて１０分間、遠心分離を行った。遠心分離後の上清、すなわち、ＰＥＩ被覆ＨＡナノ粒子分散液を採取した。
【００４８】
なお、ＨＡナノ粒子の平均粒径は約１２５ｎｍであった。平均粒径の測定は、サブミクロン粒子アナライザーＮ５（ベックマン・コールター株式会社製）を使用し、動的散乱法によって行った。
【００４９】
培養後、リン酸緩衝液でＭＤＣＫ表面を洗い流して、ＭＤＣＫに吸着していないＨＡナノ粒子を取り除いた。得られたＨＡナノ粒子とＭＤＣＫ細胞との複合体（以下、ＭＤＣＫ−ＨＡと記す）は、スクレイパーを用いてフラスコから取り出し、５０００ｒｐｍで５分間の遠心分離をした。この遠心分離によって沈降した固形分をＨＡナノ粒子と細胞との複合体として得た。
【００５０】
本実施例の無機化合物と細胞との複合体の評価は次の方法で行った。
無機化合物と細胞との複合体を２％グルタルアルデヒド（以下、ＧＡ）で固定し、遠心分離を行った。その後、蒸留水で洗浄して１００℃で乾燥させ、その後、熱分析装置（Ｒｉｇａｋｕ製、ＴＧＳ１２０）にて１３００℃まで加熱し、質量一定後に加熱をやめ、放冷し、加熱前後の質量を測定した。
熱分析装置による加熱後には、エネルギー分散性Ｘ線電子顕微鏡（以下、ＥＤＸと記す。日立製；Ｓ−４３００）を用いて無機化合物と細胞との複合体の構成原子を測定した。
【００５１】
本実施例の無機化合物と細胞との複合体の各種分析結果について以下に示す。
（ａ）複合体観察
図１は、本実施例のＭＤＣＫ−ＨＡの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、撮影倍率；４００倍）写真を示す。ＭＤＣＫの内部及び外部には、ハイドロキシアパタイトナノ粒子（例えば、図中のＡが示す黒い点）が観察された。すなわち、細胞内にはＨＡナノ粒子が十分に取り込まれていることが確認できた。図２は、ＭＤＣＫ−ＨＡの倍率１８００倍のＴＥＭ写真であり、ＨＡ粒子がより鮮明に確認できる。
なお、図３は、ＭＤＣＫ−ＨＡのＳＥＭ写真（倍率４５００倍）であり、ＨＡ粒子がＭＤＣＫ細胞につき、入り込んでいる途中であることが判る。また、図４は、ＭＤＣＫ−ＨＡのＳＥＭ写真（倍率３５００倍）であり、ＭＤＣＫがＨＡを取り込んでいる最中であることを示す。さらに、図５はＨＡナノ粒子単体のＴＥＭ写真（倍率７０００倍）であり、図６はＭＤＣＫ単体のＴＥＭ写真（倍率４００倍）である。
【００５２】
（ｂ）質量変化
表１は、ＨＡナノ粒子と細胞との複合体（ＭＤＣＫ−ＨＡ）の加熱前後の質量変化を示す。
（表１）
加熱前（Ａ）（mg） 加熱後（Ｂ）（mg） 差（Ａ−Ｂ）（mg）
ＭＤＣＫ 18.32 0.30 18.02
ＭＤＣＫ−ＨＡ 27.32 6.40 20.92
ＨＡナノ粒子は加熱によって質量は失われないので、ＨＡの質量を得るためにＭＤＣＫのみに着目し、ＨＡの重量分を差し引くと、加熱前のＭＤＣＫの質量は２１．２２ｍｇとなる。さらにＭＤＣＫ単体での加熱前後の質量差の比から過熱後のＭＤＣＫの質量を計算し、ＨＡの質量を得た。
（表２）
加熱前ＭＤＣＫ(mg) 加熱後ＭＤＣＫ（Ｃ）(mg) ＨＡ重量(mg)
ＭＤＣＫ 18.32 0.30 0.00
ＭＤＣＫ−ＨＡ 21.22＊ 0.35＊＊ 6.05
注＊ ＝２７．３２−６．４０＋０．３０
＊＊＝２１．２２×０．３０／１８．３２
【００５３】
（ｃ）構成原子測定
表３は、ＭＤＣＫ−ＨＡのＥＤＸによる分析結果である（測定倍率；１２００倍）。
（表３）
元素 質量濃度（％） 原子数濃度（％）
Ｏ 38.09 60.52
Ｐ 16.53 13.57
Ｃａ 30.10 19.09
その他 15.28 6.82
【００５４】
また、表４は、比較例として、ＨＡナノ粒子単体のＥＤＸによる分析結果である。
（表４）
元素 質量濃度（％） 原子数濃度（％）
Ｏ 37.76 58.02
Ｐ 20.47 16.25
Ｃａ 41.40 25.40
その他 0.37 0.33
【００５５】
表３のＭＤＣＫ−ＨＡの「その他」に関しては、ＭＤＣＫ−ＨＡ製造時の残渣や微量の炭素、あるいは培養液の残りと考えられる。
表３及び表４は、組成と濃度よりほぼ等しく、ＭＤＣＫ−ＨＡにはＨＡナノ粒子が存在していることが確認できる。また、培養後にＭＤＣＫ−ＨＡの表面を洗浄し、取り込まれなかったＨＡナノ粒子については除去しているため、ＨＡナノ粒子はＭＤＣＫ細胞の中に取り込まれたといえる。
【実施例２】
【００５６】
本実施例では、実施例１のＭＤＣＫに代えて、骨芽肉腫細胞株（以下、ＨＯＳと記す）を用いた。ＨＯＳは、ＭＤＣＫと同様の条件で培養して所望の細胞数とした。２２５ｃｍ2 フラスコに培養したＨＯＳ細胞に１８ｍｇ／ｍｌＨＡナノ粒子（平均粒径約１２５ｎｍ）入り培養液２．２５ｍｌを与え、３７℃、５％ＣＯ2 の条件下で１時間培養した。その後、リン酸緩衝液でＨＯＳ表面を洗い流し、新しい培養液を加えてさらに２０時間培養した。培養後、トリプシンを加えてＨＡナノ粒子−細胞複合体（以下、ＨＯＳ−ＨＡと記す）をフラスコからはがして回収した。
なお、培養液には、ＭＥＭ培地にＦＢＳ（１０ｖｏｌ％）及びＮＥＡＡ（１ｖｏｌ％）を混合したものを用いた。
【００５７】
本実施例のＨＡナノ粒子と細胞との複合体の評価に際し、得られた複合体を５０００ｒｐｍで５分間遠心分離してペレットダウンし、２％グルタルアルデヒド（以下、ＧＡと記す）で固定し、抱埋し、薄切し、ＴＥＭで観察した（図７）。
また、得られた複合体を５０００ｒｐｍで５分間遠心分離してペレットダウンした後、ＧＡで固定し、オーブンにて１００℃で一晩乾燥させ、抱埋し、薄切し、ＴＥＭで観察した（図８）。
【００５８】
本実施例の無機化合物と細胞との複合体の各種分析結果について以下に示す。
（ａ）複合体観察
図７は、ＨＯＳ−ＨＡのＴＥＭ写真（１２００倍）を示す。ＨＯＳの内部及び外部には、ＨＡナノ粒子（例えば、図中のＢが示す黒い点）が取り込まれていることが観察できた。図８は、遠心分離してペレットダウンした後、ＧＡで固定し、１００℃で乾燥させたＨＯＳ−ＨＡのＴＥＭ写真（１５００倍）である。
いずれの図からも細胞に無機化合物が取り込まれていることがはっきり判る。
【００５９】
図７に示した複合体は、細胞−生体適合性粒子が生きた状態で一つの細胞のように働いて有効であるといえる。
図８に示した複合体は、生きた状態ではなく、例えば、乾燥させて使用する場合にも粒子が取り込まれた細胞として存在することを証明する。
上記のように細胞にＨＡ粒子が取り込まれた複合体が骨補填材などの生体材料として用いられるとき、一般に生体適合性が良好でないとされる他家移植等の治療行為で不都合が生じた場合に、乾燥等の加工を施したものを用いることもできる。また、乾燥させることで保存可能な生体適合性材料になる。
【実施例３】
【００６０】
本実施例では、実施例１のＨＡナノ粒子に代えて、シリカ粒子（ＳｉＯ2 ；シーアイ化成株式会社製Nanotek Powder）を用いた。平均粒径は、１００ｎｍであった。
１２well細胞培養用マルチウェルプレート（Becton Dickinson製）で一晩培養したＭＤＣＫ細胞に１００μｇ／ｍｌのシリカ粒子入り培地を与え、３７℃、５％ＣＯ2条件下で２時間培養した。培養後、培地を吸引し、２％ＧＡで固定し、抱埋し、薄切し、ＴＥＭで観察した。
【００６１】
本実施例で得られたシリカと細胞との複合体の各種分析結果について以下に示す。
図９は、本実施例で得られた複合体のＴＥＭ写真（３０００倍）を示す。ＭＤＣＫの内部及び外部には、シリカ粒子（例えば、図中のＣが示す黒い）が取り込まれていることが観察された。
比較のため、図１０にシリカ粒子単体のＴＥＭ写真（７０００倍）を示す。
【実施例４】
【００６２】
本実施例では、実施例１のＨＡナノ粒子に代えて、アルミナ粒子（Ａｌ2Ｏ3；シーアイ化成株式会社製Nanotek Powder）を用いた。平均粒径は、８０ｎｍであった。
実施例３と同様に１２well細胞培養用マルチウェルプレート（Becton Dickinson製）で一晩培養したＭＤＣＫ細胞に２．３ｍｇ／ｍｌのアルミナ粒子入り培地を与え、３７℃、５％ＣＯ2条件下で２０時間培養した。培養したものを２％ＧＡで固定し、抱埋し、薄切し、ＴＥＭで観察した。
【００６３】
図１１は、本実施例で得られた複合体のＴＥＭ写真（７００倍）を示す。ＭＤＣＫの内部及び外部には、アルミナ粒子（例えば、図中のＤが示す黒い点）が取り込まれていることが観察できる。
比較のため、図１２にアルミナ粒子単体のＴＥＭ写真（７０００倍）を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】実施例１で製造したハイドロキシアパタイトナノ粒子と細胞との複合体（ＭＤＣＫ−ＨＡ）のＴＥＭ写真（４００倍）である。
【図２】ＭＤＣＫ−ＨＡの倍率１８００倍のＴＥＭ写真である。
【図３】ＨＡ粒子がＭＤＣＫ細胞につき、入り込んでいる途中である状態で示すＭＤＣＫ−ＨＡのＳＥＭ写真（倍率４５００倍）である。
【図４】ＭＤＣＫがＨＡを取り込んでいる最中であることを示すＭＤＣＫ−ＨＡのＳＥＭ写真（倍率３５００倍）である。
【図５】ＨＡナノ粒子単体のＴＥＭ写真（倍率７０００倍）である。
【図６】ＭＤＣＫ単体のＴＥＭ写真（倍率４００倍）である。
【図７】実施例２で製造した複合体（ＨＯＳ−ＨＡ）のＴＥＭ写真（１２００倍）である。
【図８】実施例２で製造した、乾燥処理後の複合体（ＨＯＳ−ＨＡ）のＴＥＭ写真（１５００倍）である。
【図９】実施例３で製造したシリカ粒子と細胞との複合体のＴＥＭ写真（３０００倍）である。
【図１０】シリカ粒子単体のＴＥＭ写真（７０００倍）である。
【図１１】実施例４で製造したアルミナ粒子と細胞との複合体のＴＥＭ写真（７００倍）である。
【図１２】アルミナ粒子単体のＴＥＭ写真（７０００倍）である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無機化合物と細胞との複合体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
整形外科手術において骨の欠損部を補填する方法としては、自家骨あるいは他家からの骨移植、セラミックス、金属、樹脂及びこれらの複合体からなる人工材料を単独あるいは自家骨との混合物などによって補填する方法が主に採用されている。自家骨移植は、自身からの生体骨移植であり、最も安全かつ迅速に骨と結合させることができるものであり、腸骨の一部を移植することが最も頻繁に行われている。しかし、腸骨移植は、採取出来る骨の大きさ及び形状に制限があり、健康な部位を切除することによる患者への負担も大きい。したがって、自家骨移植は、これらの点が問題として認識されている。
【０００３】
新しい骨補填材といては、近年ではコラーゲンと合成リン酸カルシウムからなる骨と類似した組成を有する複合体、骨形成を促進させる生理活性物質を含浸させた人工材料なども検討されている。また、骨髄細胞をあらかじめ足場材料に播種した骨補填材も研究されている。これらの骨補填材は、体内に埋入されるため、体内において無害、安全であることに加えて、埋入後に欠損部周辺の骨と迅速かつ強固に結合する機能を有することを意図して開発されている。
【０００４】
さらに、新しい骨補填材の目標とされる機能としては、自家骨の骨誘導能、骨形成能、初期固定時の機械強度などを有することが重要視されている。これらの機能を有し、生体骨に類似した人工骨を得ることを目的として、例えば、骨芽細胞に分化可能な幹細胞の利用が試みられている。
自身の幹細胞を用いる場合には、骨髄から細胞を採取する方法が多く採用されている。具体的には、骨髄から細胞を採取した後、体外で足場材料に接着、培養した後体内に戻す方法、及び、培養した際に、細胞に分化誘導因子を作用させて骨髄由来細胞を、骨形成能を有する細胞に分化させた後に欠損部に補填する方法が開発されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、骨髄由来細胞（幹細胞）を用いる上記の方法は、次のような問題点がある。第一には、骨髄由来細胞のうち、どの細胞が骨形成能を有する細胞に分化するか明確でない。第二には、分化誘導の調節が困難であり、体外において人為的に分化させた細胞の変異状態を知ることも困難である。第三には、体外での培養に関して骨髄細胞を増殖させる場合、細胞の増殖には少なくとも２週間から４週間を要する。そして、第四には、骨髄由来細胞を、足場となる材料に付着させるための手技は、他の患者の加工環境とは完全に隔離されることが要求されるため、大規模に細胞を播種、加工することには多大な労力と設備を必要とする。素材である骨髄由来細胞や細胞を播種した骨補填材は、唯一の物であり、異なる骨補填材間で品質や仕様を同一にすることは困難である。
【０００６】
大規模生産の観点では、骨補填材として用いる材料が均一であるほうが、効率が良く、品質の確保も可能となる。すなわち、細胞と骨補填材を複合化した骨補填材を多量に供給するには、均一な細胞を用いて、生体からの移植骨と同等の骨形成能を有する材料の開発が求められる。このような骨形成能を有する材料としては、株化細胞を利用することが有効であり、現在、ＭＣ３Ｔ３―Ｅ１などいくつかの株化細胞が知られているが、骨形成能を有する細胞を用いても実用的な骨補填材は未だ開発されていない。
【０００７】
したがって、本発明は、生体材料の性質を併せ持ち、体内で無害、安全で、初期固定時の機械的強度を有する骨補填材及びこのような骨補填材を簡単な方法で多量に効率よく製造する方法を開発することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、細胞自身が本来有する飲食機能を利用すれば、細胞の骨形成能の有無に関係なく、しかも煩雑な操作を行うことなく、容易に有効な骨補填材を得ることができるという知見を得て、完成されたものである。
【０００９】
本発明の無機化合物と細胞との複合体は、無機化合物微粒子で満たされた動物細胞と、その細胞の外部に付着する無機化合物微粒子と、からなることを特徴とする。
【００１０】
無機化合物微粒子は、平均粒子径が１０ｎｍ〜１０μｍのものであることが好ましい。
なお、本明細書において平均粒子径は、サブミクロン粒子アナライザー Ｎ５（ベックマン・コールター株式会社製）を使用し、動的散乱法によって測定したものである。液体中の粒子が拡散する速度を計測することで粒子径を測定する装置で、拡散する速度は液体の温度、粘度、粒子径の３要素で決まるため、温度及び粘度が既知であれば粒子径が得られるというものである。平均粒子径は該分析装置のＳＤＰ(Size Distribution Processor)分析により測定したもので、単分散モードでの測定に比し、複雑分布の際の制約を受けない高精度な粒子径分布を得ることができる。
【００１１】
無機化合物微粒子は、高分子窒素化合物で被覆されたものであることが好適である。
【００１２】
高分子窒素化合物は、数平均分子量が８００〜１０００００のものであることが好ましい。
【００１３】
さらに、高分子窒素化合物は、一級アミノ基、二級アミノ基及び三級アミノ基を繰り返し構造単位内に有するものであることが好ましい。
【００１４】
また、高分子窒素化合物は、直鎖、枝分かれ鎖又は環状のポリアミン化合物の単体又は混合物であることが好ましい。
【００１５】
ポリアミン化合物は、ポリエチレンイミンであることが好適である。
【００１６】
無機化合物微粒子は、リン酸カルシウム系化合物又は金属酸化物であることが好ましい。
【００１７】
リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトであることが好適である。
【００１８】
金属酸化物は、アルミナ、シリカ、酸化マグネシウム、あるいは酸化鉄であることが好適である。
【００１９】
本発明による無機化合物と細胞との複合体の製造方法は、無機化合物微粒子を含む培地中で動物細胞を培養し、固形分を分取することを特徴とする。
【００２０】
無機化合物微粒子の濃度は、上記動物細胞に対して１．０ｐｇ〜１．０ｎｇ／ｃｅｌｌであることが好ましい。
【００２１】
固形分の分取後には、培養した動物細胞を失活処理することが好ましい。
【００２２】
失活処理としては、加熱処理または化学薬品処理が挙げられる。
【００２３】
化学薬品処理は、例えば、アルデヒド化合物又はジマレイミド化合物によるタンパク質固定であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、生体材料の性質を併せ持ち、体内で無害、安全で、初期固定時の機械的強度を有する骨補填材を多量に提供することができる。また、本発明によれば、上記のような特性を有する骨補填材を、素材として用いる細胞の骨形成能の有無に関係なく、細胞自身が本来有する飲食機能を利用するだけで、煩雑な操作を行うことなく、簡単な方法で多量に効率よく製造することができる。
本発明は、前記のように、新規な骨補填材の開発を目的としてなされたものであるが、得られた無機化合物と細胞との複合体は、骨補填材としてばかりでなく、診断剤など、生体材料の性質を有しながら、形状強度も有することが望まれる様々な用途に応用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の無機化合物と細胞との複合体は、無機化合物微粒子で満たされた動物細胞と、この動物細胞の外部に付着する無機化合物微粒子とからなる。
動物細胞は、飲食作用（機能）を保持している細胞であれば、特に制限はなく、例えば、イヌ腎臓由来細胞株（以下、ＭＤＣＫと略称することがある）、骨芽肉腫細胞株（以下、ＨＯＳと略称することがある）などを用いることができる。
【００２６】
無機化合物微粒子としては、リン酸カルシウム系化合物又は金属酸化物が挙げられる。また、これらを単独または混合物として用いることもできる。リン酸カルシウム系化合物は、Ｃａ／Ｐ比１．０〜２．０のものであればよく、例えば、ハイドロキシアパタイト、フッ素アパタイトなどの各種のアパタイト、第一リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸四カルシウムなどが挙げられ、これらは単独または混合物として用いることができる。
また、金属酸化物としては、酸化アルミニウム、二酸化珪素、酸化マグネシウム、酸化チタン、酸化鉄（ヘマタイト）などが挙げられる。
【００２７】
無機化合物微粒子は、平均粒子径が１０ｎｍ〜１０μｍであることが好ましい。平均粒子径が１０ｎｍより小さい微粒子は、産業上利用できる程度に多量に製造するのは困難であり、１０μｍを越えるものは、動物細胞の飲食作用によって細胞内に取り込まれることが困難である。
【００２８】
また、無機化合物微粒子は、粒子状態を問わず、微粒子にナノ粒子（粒子径の大きなものに粒子径の小さなもの）が付着した状態、ナノ粒子が凝集した状態等であってよく、任意の方法で製造されたものであってよい。
本発明の無機化合物微粒子の一例として、本発明者らが開発したリン酸カルシウム系化合物ナノ粒子の製造方法を次に説明する。リン酸カルシウム系化合物ナノ粒子は、リン酸カルシウム系化合物を熱処理し、得られたリン酸カルシウム系化合物粒子を有機溶媒に分散させ、解砕処理し、得られたリン酸カルシウム系化合物分散液を遠心分離し、上清を採取し、必要に応じて乾燥することによって製造することができる。
【００２９】
上記リン酸カルシウム系化合物は、公知の方法で合成し、熱処理する前に乾燥し、必要に応じて造粒することが好ましい。造粒は、公知の方法によって行うことができるが、スプレードライ法によって体積比が７０％以上の多孔体にすることが好ましい。
【００３０】
また、上記方法では、まず、リン酸カルシウム系化合物を公知の加熱手段で熱処理して熱履歴を与える。熱処理温度に制限はないが、４００℃から１０５０℃の温度範囲で熱処理されることが好ましい。４００℃よりも低温であると、十分な強度が得られず、使用強度が低下してしまう。１０５０℃より高温であると、一部または全部が焼結してしまい、ナノ粒子の収率が低下する。
【００３１】
熱処理後、例えば、超音波処理、ホモジナイザー、振とう器、乳鉢などの解砕処理によって有機溶媒に分散させる。有機溶媒としては、極性有機溶媒が好ましく、例えば、アルコール（例えば、エタノール、イソプロパノールなど）、エーテル（例えば、２−エトキシエタノールなど）、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどを用いることができる。
【００３２】
解砕処理前に、リン酸カルシウム系化合物粒子をボールミル装置によって処理することもできる。ボールミル装置は、通常、摺り運動によって試料を解砕するボール（メディア）を用いるが、ボールを用いずに処理を行うと、球状の（アスペクト比が１に近い）ナノ粒子を高い収率で得ることができる。このとき、有機溶媒等を介在させない（ポット内にリン酸カルシウム系化合物粒子のみが入れられた）ドライ状態（以下、ドライミル処理と称する）であることがよい。
【００３３】
以上のようにして得られたリン酸カルシウム系化合物分散液を遠心分離処理によって、有機溶媒相に分散されたリン酸カルシウム系化合物ナノ粒子を含む上清とそれより粒径の大きい粒子の沈殿とに分画する。その後、上清の有機溶媒を蒸発させ、リン酸カルシウム系化合物ナノ粒子を得ることができる。
【００３４】
無機化合物微粒子は、高分子窒素化合物によって被覆されていることが好ましい。具体的には、無機化合物粒子は、固体酸点（電子対受容体）で高分子窒素化合物のアミノ基の少なくとも１個に結合することによって、高分子窒素化合物で被覆されることが好ましい。
【００３５】
高分子窒素化合物で被覆された無機化合物微粒子は、無機化合物微粒子と高分子窒素化合物を溶液中で混合して得られる。この高分子窒素化合物で被覆された無機化合物微粒子分散液を遠心分離し、上清を採取し、乾燥することによって、高分子窒素化合物で被覆された無機化合物微粒子を得ることができる。この微粒子は、分散性が良くなり、粒径が小さいまま存在できるため、被覆されていない無機化合物微粒子に比べて動物細胞内に取り込まれ易い。
【００３６】
高分子窒素化合物は、分子内に一級アミノ基、二級アミノ基、及び三級アミノ基のうち少なくとも２個のアミノ基を有するものであればよく、例えば、ポリアミン化合物を用いることができる。ポリアミン化合物は、直鎖状、枝分れ状、及び環状のいずれであってもよく、分子内に一級アミノ基、二級アミノ基及び三級アミノ基が繰り返し構造単位内により多数存在すると、無機化合物微粒子との結合サイトが増えるため好ましい。
【００３７】
このようなポリアミン化合物としては、例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジンなどを用いることができ、特にポリエチレンイミンであることが好適である。ポリエチレンイミンは、エチレンイミンの重合体であり、重合に関与するアミノ基によって分子構造が異なる。
【００３８】
ポリアミン化合物（高分子窒素化合物）の数平均分子量は、８００〜１０００００であることが好ましい。数平均分子量が８００未満であると、ポリアミン化合物が無機化合物微粒子を良好に覆うことが困難になるため、効率良く無機化合物微粒子を動物細胞に取り込むことができない。また、数平均分子量が１０００００を超えると、ポリアミン化合物同士の結合により、大きな凝集塊を作ってしまうため、動物細胞内に無機化合物微粒子を取り込むことが困難になる。
【００３９】
また、高分子窒素化合物溶液の濃度については、被覆すべき無機化合物微粒子の種類、量、表面積などにより左右され、一義的に定めることはできない。しかし、高分子窒素化合物の濃度が薄すぎると、高分子窒素化合物は粒子と結合するが、完全に被覆することはできないため、粒子同士の結合により凝集が起こってしまい、動物細胞内に十分な取り込みができなくなる傾向がある。高分子窒素化合物の濃度が高すぎると、高分子窒素化合物は無機化合物微粒子以外に、高分子窒素化合物同士でも結合してしまうため、大きなミセルを作ってしまい、動物細胞内への取り込みが困難になる。したがって、高分子窒素化合物溶液の濃度は、被覆すべき無機化合物微粒子の種類、量、表面積などに応じて適宜選定することが好ましい。
【００４０】
続いて、本発明の無機化合物と細胞の複合体の製造方法について説明する。
動物細胞は、予め細胞培養によって所望の細胞数からなる細胞塊に増殖させる。その後、この動物細胞の細胞塊を無機化合物微粒子を含む培地中で培養する。培養は、動物細胞の培養に通常に用いられる条件で行うことができる。無機化合物微粒子は、動物細胞に対して、１．０ｐｇ〜１．０ｎｇ／ｃｅｌｌであることがよい。
培養後、固形分を分取して無機化合物と細胞の複合体とする。なお、複合体は、固形分を分取した後、細胞が生体に適合可能であれば、細胞が生きた状態のまま用いることもできるが、必要に応じて動物細胞の失活処理を行うこともできる。
【００４１】
失活処理は、動物細胞の生命活動、及び細胞中のタンパク質等の機能を停止等させるための処理であり、加熱処理または化学薬品処理などを挙げることができる。化学薬品処理としては、アルデヒド化合物、またはジマレイミド化合物によるタンパク質固定などが挙げられる。
【００４２】
また、得られた複合体は、加熱により成形することも可能であり、さらに乾燥させることにより強固な物とすることもできる。
【００４３】
次に、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４４】
以下の実施例で得られた無機化合物と細胞との複合体は、下記の方法で評価した。
（ａ）複合体観察
本発明の無機化合物と細胞との複合体は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって観察した。透過型電子顕微鏡には、株式会社日立製作所製Ｈ−７６００を使用した。なお、ＴＥＭ観察の前に、無機化合物と細胞との複合体は、グルタルアルデヒドで固定して抱埋した。
（ｂ）構成原子測定
無機化合物と細胞との複合体を１００℃で乾燥処理し、ＥＤＸによって構成原子を分析（測定）した。ＥＤＸには、株式会社日立製作所製Ｓ−４３００を使用した。
【実施例１】
【００４５】
本実施例の無機化合物と細胞との複合体の作製方法について説明する。
動物細胞として、ＭＤＣＫ（イヌ腎臓由来細胞株）を用いた。２２５ｃｍ2 フラスコに培養したＭＤＣＫ細胞及び３ｍｇ／ｍｌのリン酸カルシウム微粒子入り培養液を４ｍｌ与え、さらに培養液を加え６０ｍｌに調整した後、３７℃、５％ＣＯ2 条件下で２９時間培養した。
なお、培養液には、ＭＥＭ培地にＦＢＳ（１０ｖｏｌ％）を混合したものを用いた。
【００４６】
使用したリン酸カルシウムは、下記のようにして製造したハイドロキシアパタイト（以下、ＨＡと記す）ナノ粒子である。湿式法で得たハイドロキシアパタイト含有スラリーをスプレードライ装置を用いて２００℃で乾燥して、造粒した。さらに、分級して平均粒径１０μｍとした。得られたＨＡ粒子を電気炉に入れ、５０℃／ｈで昇温し８５０℃にて４時間保持する昇温を行い、ＨＡ粒子を得た。
【００４７】
こうして得られたＨＡ粒子１．０ｇを内容積４５ｍｌのジルコニア製ポットに入れ、遊星型ボールミル（フリッチュ社製；Ｐ−７）によって、回転数８００ｒｐｍで３時間のドライミル処理を行った。なお、ドライミル処理は遊星型ボールミルのポット内にメディアを入れずに行った。ドライミル処理後のＨＡ粒子を回収し、ドライミルＨＡ粒子を得た。
１０ｍｇ／ｍｌポリエチレンイミン（以下、ＰＥＩと記す）溶液３０ｍｌを加え分散させ、超音波発生装置（ＴＡＩＴＥＣ社製；ＶＰ−３０Ｓ）を用いて超音波処理（出力１８０Ｗ、５分間）した。これによりＨＡ粒子が解砕し、ＨＡ粒子表面をＰＥＩが被覆した。その後、イソプロパノールを加えて、全量を１０ｍｌとし、４１００×ｇにて１０分間、遠心分離を行った。遠心分離後の上清、すなわち、ＰＥＩ被覆ＨＡナノ粒子分散液を採取した。
【００４８】
なお、ＨＡナノ粒子の平均粒径は約１２５ｎｍであった。平均粒径の測定は、サブミクロン粒子アナライザーＮ５（ベックマン・コールター株式会社製）を使用し、動的散乱法によって行った。
【００４９】
培養後、リン酸緩衝液でＭＤＣＫ表面を洗い流して、ＭＤＣＫに吸着していないＨＡナノ粒子を取り除いた。得られたＨＡナノ粒子とＭＤＣＫ細胞との複合体（以下、ＭＤＣＫ−ＨＡと記す）は、スクレイパーを用いてフラスコから取り出し、５０００ｒｐｍで５分間の遠心分離をした。この遠心分離によって沈降した固形分をＨＡナノ粒子と細胞との複合体として得た。
【００５０】
本実施例の無機化合物と細胞との複合体の評価は次の方法で行った。
無機化合物と細胞との複合体を２％グルタルアルデヒド（以下、ＧＡ）で固定し、遠心分離を行った。その後、蒸留水で洗浄して１００℃で乾燥させ、その後、熱分析装置（Ｒｉｇａｋｕ製、ＴＧＳ１２０）にて１３００℃まで加熱し、質量一定後に加熱をやめ、放冷し、加熱前後の質量を測定した。
熱分析装置による加熱後には、エネルギー分散性Ｘ線電子顕微鏡（以下、ＥＤＸと記す。日立製；Ｓ−４３００）を用いて無機化合物と細胞との複合体の構成原子を測定した。
【００５１】
本実施例の無機化合物と細胞との複合体の各種分析結果について以下に示す。
（ａ）複合体観察
図１は、本実施例のＭＤＣＫ−ＨＡの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、撮影倍率；４００倍）写真を示す。ＭＤＣＫの内部及び外部には、ハイドロキシアパタイトナノ粒子（例えば、図中のＡが示す黒い点）が観察された。すなわち、細胞内にはＨＡナノ粒子が十分に取り込まれていることが確認できた。図２は、ＭＤＣＫ−ＨＡの倍率１８００倍のＴＥＭ写真であり、ＨＡ粒子がより鮮明に確認できる。
なお、図３は、ＭＤＣＫ−ＨＡのＳＥＭ写真（倍率４５００倍）であり、ＨＡ粒子がＭＤＣＫ細胞につき、入り込んでいる途中であることが判る。また、図４は、ＭＤＣＫ−ＨＡのＳＥＭ写真（倍率３５００倍）であり、ＭＤＣＫがＨＡを取り込んでいる最中であることを示す。さらに、図５はＨＡナノ粒子単体のＴＥＭ写真（倍率７０００倍）であり、図６はＭＤＣＫ単体のＴＥＭ写真（倍率４００倍）である。
【００５２】
（ｂ）質量変化
表１は、ＨＡナノ粒子と細胞との複合体（ＭＤＣＫ−ＨＡ）の加熱前後の質量変化を示す。
（表１）
加熱前（Ａ）（mg） 加熱後（Ｂ）（mg） 差（Ａ−Ｂ）（mg）
ＭＤＣＫ 18.32 0.30 18.02
ＭＤＣＫ−ＨＡ 27.32 6.40 20.92
ＨＡナノ粒子は加熱によって質量は失われないので、ＨＡの質量を得るためにＭＤＣＫのみに着目し、ＨＡの重量分を差し引くと、加熱前のＭＤＣＫの質量は２１．２２ｍｇとなる。さらにＭＤＣＫ単体での加熱前後の質量差の比から過熱後のＭＤＣＫの質量を計算し、ＨＡの質量を得た。
（表２）
加熱前ＭＤＣＫ(mg) 加熱後ＭＤＣＫ（Ｃ）(mg) ＨＡ重量(mg)
ＭＤＣＫ 18.32 0.30 0.00
ＭＤＣＫ−ＨＡ 21.22＊ 0.35＊＊ 6.05
注＊ ＝２７．３２−６．４０＋０．３０
＊＊＝２１．２２×０．３０／１８．３２
【００５３】
（ｃ）構成原子測定
表３は、ＭＤＣＫ−ＨＡのＥＤＸによる分析結果である（測定倍率；１２００倍）。
（表３）
元素 質量濃度（％） 原子数濃度（％）
Ｏ 38.09 60.52
Ｐ 16.53 13.57
Ｃａ 30.10 19.09
その他 15.28 6.82
【００５４】
また、表４は、比較例として、ＨＡナノ粒子単体のＥＤＸによる分析結果である。
（表４）
元素 質量濃度（％） 原子数濃度（％）
Ｏ 37.76 58.02
Ｐ 20.47 16.25
Ｃａ 41.40 25.40
その他 0.37 0.33
【００５５】
表３のＭＤＣＫ−ＨＡの「その他」に関しては、ＭＤＣＫ−ＨＡ製造時の残渣や微量の炭素、あるいは培養液の残りと考えられる。
表３及び表４は、組成と濃度よりほぼ等しく、ＭＤＣＫ−ＨＡにはＨＡナノ粒子が存在していることが確認できる。また、培養後にＭＤＣＫ−ＨＡの表面を洗浄し、取り込まれなかったＨＡナノ粒子については除去しているため、ＨＡナノ粒子はＭＤＣＫ細胞の中に取り込まれたといえる。
【実施例２】
【００５６】
本実施例では、実施例１のＭＤＣＫに代えて、骨芽肉腫細胞株（以下、ＨＯＳと記す）を用いた。ＨＯＳは、ＭＤＣＫと同様の条件で培養して所望の細胞数とした。２２５ｃｍ2 フラスコに培養したＨＯＳ細胞に１８ｍｇ／ｍｌＨＡナノ粒子（平均粒径約１２５ｎｍ）入り培養液２．２５ｍｌを与え、３７℃、５％ＣＯ2 の条件下で１時間培養した。その後、リン酸緩衝液でＨＯＳ表面を洗い流し、新しい培養液を加えてさらに２０時間培養した。培養後、トリプシンを加えてＨＡナノ粒子−細胞複合体（以下、ＨＯＳ−ＨＡと記す）をフラスコからはがして回収した。
なお、培養液には、ＭＥＭ培地にＦＢＳ（１０ｖｏｌ％）及びＮＥＡＡ（１ｖｏｌ％）を混合したものを用いた。
【００５７】
本実施例のＨＡナノ粒子と細胞との複合体の評価に際し、得られた複合体を５０００ｒｐｍで５分間遠心分離してペレットダウンし、２％グルタルアルデヒド（以下、ＧＡと記す）で固定し、抱埋し、薄切し、ＴＥＭで観察した（図７）。
また、得られた複合体を５０００ｒｐｍで５分間遠心分離してペレットダウンした後、ＧＡで固定し、オーブンにて１００℃で一晩乾燥させ、抱埋し、薄切し、ＴＥＭで観察した（図８）。
【００５８】
本実施例の無機化合物と細胞との複合体の各種分析結果について以下に示す。
（ａ）複合体観察
図７は、ＨＯＳ−ＨＡのＴＥＭ写真（１２００倍）を示す。ＨＯＳの内部及び外部には、ＨＡナノ粒子（例えば、図中のＢが示す黒い点）が取り込まれていることが観察できた。図８は、遠心分離してペレットダウンした後、ＧＡで固定し、１００℃で乾燥させたＨＯＳ−ＨＡのＴＥＭ写真（１５００倍）である。
いずれの図からも細胞に無機化合物が取り込まれていることがはっきり判る。
【００５９】
図７に示した複合体は、細胞−生体適合性粒子が生きた状態で一つの細胞のように働いて有効であるといえる。
図８に示した複合体は、生きた状態ではなく、例えば、乾燥させて使用する場合にも粒子が取り込まれた細胞として存在することを証明する。
上記のように細胞にＨＡ粒子が取り込まれた複合体が骨補填材などの生体材料として用いられるとき、一般に生体適合性が良好でないとされる他家移植等の治療行為で不都合が生じた場合に、乾燥等の加工を施したものを用いることもできる。また、乾燥させることで保存可能な生体適合性材料になる。
【実施例３】
【００６０】
本実施例では、実施例１のＨＡナノ粒子に代えて、シリカ粒子（ＳｉＯ2 ；シーアイ化成株式会社製Nanotek Powder）を用いた。平均粒径は、１００ｎｍであった。
１２well細胞培養用マルチウェルプレート（Becton Dickinson製）で一晩培養したＭＤＣＫ細胞に１００μｇ／ｍｌのシリカ粒子入り培地を与え、３７℃、５％ＣＯ2条件下で２時間培養した。培養後、培地を吸引し、２％ＧＡで固定し、抱埋し、薄切し、ＴＥＭで観察した。
【００６１】
本実施例で得られたシリカと細胞との複合体の各種分析結果について以下に示す。
図９は、本実施例で得られた複合体のＴＥＭ写真（３０００倍）を示す。ＭＤＣＫの内部及び外部には、シリカ粒子（例えば、図中のＣが示す黒い）が取り込まれていることが観察された。
比較のため、図１０にシリカ粒子単体のＴＥＭ写真（７０００倍）を示す。
【実施例４】
【００６２】
本実施例では、実施例１のＨＡナノ粒子に代えて、アルミナ粒子（Ａｌ2Ｏ3；シーアイ化成株式会社製Nanotek Powder）を用いた。平均粒径は、８０ｎｍであった。
実施例３と同様に１２well細胞培養用マルチウェルプレート（Becton Dickinson製）で一晩培養したＭＤＣＫ細胞に２．３ｍｇ／ｍｌのアルミナ粒子入り培地を与え、３７℃、５％ＣＯ2条件下で２０時間培養した。培養したものを２％ＧＡで固定し、抱埋し、薄切し、ＴＥＭで観察した。
【００６３】
図１１は、本実施例で得られた複合体のＴＥＭ写真（７００倍）を示す。ＭＤＣＫの内部及び外部には、アルミナ粒子（例えば、図中のＤが示す黒い点）が取り込まれていることが観察できる。
比較のため、図１２にアルミナ粒子単体のＴＥＭ写真（７０００倍）を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】実施例１で製造したハイドロキシアパタイトナノ粒子と細胞との複合体（ＭＤＣＫ−ＨＡ）のＴＥＭ写真（４００倍）である。
【図２】ＭＤＣＫ−ＨＡの倍率１８００倍のＴＥＭ写真である。
【図３】ＨＡ粒子がＭＤＣＫ細胞につき、入り込んでいる途中である状態で示すＭＤＣＫ−ＨＡのＳＥＭ写真（倍率４５００倍）である。
【図４】ＭＤＣＫがＨＡを取り込んでいる最中であることを示すＭＤＣＫ−ＨＡのＳＥＭ写真（倍率３５００倍）である。
【図５】ＨＡナノ粒子単体のＴＥＭ写真（倍率７０００倍）である。
【図６】ＭＤＣＫ単体のＴＥＭ写真（倍率４００倍）である。
【図７】実施例２で製造した複合体（ＨＯＳ−ＨＡ）のＴＥＭ写真（１２００倍）である。
【図８】実施例２で製造した、乾燥処理後の複合体（ＨＯＳ−ＨＡ）のＴＥＭ写真（１５００倍）である。
【図９】実施例３で製造したシリカ粒子と細胞との複合体のＴＥＭ写真（３０００倍）である。
【図１０】シリカ粒子単体のＴＥＭ写真（７０００倍）である。
【図１１】実施例４で製造したアルミナ粒子と細胞との複合体のＴＥＭ写真（７００倍）である。
【図１２】アルミナ粒子単体のＴＥＭ写真（７０００倍）である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無機化合物微粒子で満たされた動物細胞と、
その細胞の外部に付着する無機化合物微粒子と、からなることを特徴とする無機化合物と細胞との複合体。
【請求項２】
無機化合物微粒子が平均粒子径１０ｎｍ〜１０μｍのものである請求項１記載の無機化合物と細胞との複合体。
【請求項３】
無機化合物微粒子が高分子窒素化合物で被覆されたものである請求項１又は２記載の無機化合物と細胞との複合体。
【請求項４】
高分子窒素化合物が数平均分子量８００〜１０００００のものである請求項３記載の無機化合物と細胞との複合体。
【請求項５】
高分子窒素化合物が一級アミノ基、二級アミノ基及び三級アミノ基を繰り返し構造単位内に有するものである請求項３又は４記載の無機化合物と細胞との複合体。
【請求項６】
高分子窒素化合物が直鎖、枝分かれ鎖又は環状のポリアミン化合物の単体又は混合物である請求項３〜５のいずれか１項に記載の無機化合物と細胞との複合体。
【請求項７】
ポリアミン化合物がポリエチレンイミンである請求項６記載の無機化合物と細胞との複合体。
【請求項８】
無機化合物微粒子がリン酸カルシウム系化合物又は金属酸化物である請求項１〜３のいずれか１項に記載の無機化合物と細胞との複合体。
【請求項９】
リン酸カルシウム系化合物がハイドロキシアパタイトである請求項８記載の無機化合物と細胞との複合体。
【請求項１０】
金属酸化物がアルミナ、シリカ、酸化マグネシウムあるいは酸化鉄である請求項８記載の無機化合物と細胞との複合体。
【請求項１１】
無機化合物微粒子を含む培地中で動物細胞を培養し、固形分を分取することを特徴とする無機化合物と細胞の複合体の製造方法。
【請求項１２】
無機化合物微粒子の濃度が、上記動物細胞に対して１．０ｐｇ〜１．０ｎｇ／ｃｅｌｌである請求項１１記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項１３】
固形分を分取後に、失活処理する請求項１１又は１２記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項１４】
失活処理が加熱処理または化学薬品処理である請求項１３記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項１５】
化学薬品処理がアルデヒド化合物又はジマレイミド化合物によるタンパク質固定である請求項１４記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項１６】
無機化合物微粒子が高分子窒素化合物で被覆されたものである請求項１１記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項１７】
高分子窒素化合物が数平均分子量８００〜１０００００のものである請求項１６記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項１８】
高分子窒素化合物が一級アミノ基、二級アミノ基及び三級アミノ基を繰り返し構造単位内に有するものである請求項１６又は１７記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項１９】
高分子窒素化合物が直鎖、枝分かれ鎖又は環状のポリアミン化合物の単体又は混合物である請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項２０】
ポリアミン化合物がポリエチレンイミンである請求項１９記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項２１】
無機化合物微粒子がリン酸カルシウム系化合物又は金属酸化物である請求項１１記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項２２】
リン酸カルシウム系化合物がハイドロキシアパタイトである請求項２１記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項２３】
金属酸化物がアルミナ、シリカ、酸化マグネシウムあるいは酸化鉄である請求項２１記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項１】
無機化合物微粒子で満たされた動物細胞と、
その細胞の外部に付着する無機化合物微粒子と、からなることを特徴とする無機化合物と細胞との複合体。
【請求項２】
無機化合物微粒子が平均粒子径１０ｎｍ〜１０μｍのものである請求項１記載の無機化合物と細胞との複合体。
【請求項３】
無機化合物微粒子が高分子窒素化合物で被覆されたものである請求項１又は２記載の無機化合物と細胞との複合体。
【請求項４】
高分子窒素化合物が数平均分子量８００〜１０００００のものである請求項３記載の無機化合物と細胞との複合体。
【請求項５】
高分子窒素化合物が一級アミノ基、二級アミノ基及び三級アミノ基を繰り返し構造単位内に有するものである請求項３又は４記載の無機化合物と細胞との複合体。
【請求項６】
高分子窒素化合物が直鎖、枝分かれ鎖又は環状のポリアミン化合物の単体又は混合物である請求項３〜５のいずれか１項に記載の無機化合物と細胞との複合体。
【請求項７】
ポリアミン化合物がポリエチレンイミンである請求項６記載の無機化合物と細胞との複合体。
【請求項８】
無機化合物微粒子がリン酸カルシウム系化合物又は金属酸化物である請求項１〜３のいずれか１項に記載の無機化合物と細胞との複合体。
【請求項９】
リン酸カルシウム系化合物がハイドロキシアパタイトである請求項８記載の無機化合物と細胞との複合体。
【請求項１０】
金属酸化物がアルミナ、シリカ、酸化マグネシウムあるいは酸化鉄である請求項８記載の無機化合物と細胞との複合体。
【請求項１１】
無機化合物微粒子を含む培地中で動物細胞を培養し、固形分を分取することを特徴とする無機化合物と細胞の複合体の製造方法。
【請求項１２】
無機化合物微粒子の濃度が、上記動物細胞に対して１．０ｐｇ〜１．０ｎｇ／ｃｅｌｌである請求項１１記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項１３】
固形分を分取後に、失活処理する請求項１１又は１２記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項１４】
失活処理が加熱処理または化学薬品処理である請求項１３記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項１５】
化学薬品処理がアルデヒド化合物又はジマレイミド化合物によるタンパク質固定である請求項１４記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項１６】
無機化合物微粒子が高分子窒素化合物で被覆されたものである請求項１１記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項１７】
高分子窒素化合物が数平均分子量８００〜１０００００のものである請求項１６記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項１８】
高分子窒素化合物が一級アミノ基、二級アミノ基及び三級アミノ基を繰り返し構造単位内に有するものである請求項１６又は１７記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項１９】
高分子窒素化合物が直鎖、枝分かれ鎖又は環状のポリアミン化合物の単体又は混合物である請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項２０】
ポリアミン化合物がポリエチレンイミンである請求項１９記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項２１】
無機化合物微粒子がリン酸カルシウム系化合物又は金属酸化物である請求項１１記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項２２】
リン酸カルシウム系化合物がハイドロキシアパタイトである請求項２１記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【請求項２３】
金属酸化物がアルミナ、シリカ、酸化マグネシウムあるいは酸化鉄である請求項２１記載の無機化合物と細胞との複合体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００７−２１５４３４（Ｐ２００７−２１５４３４Ａ）
【公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３７５５４（Ｐ２００６−３７５５４）
【出願日】平成１８年２月１５日（２００６．２．１５）
【出願人】（００００００５２７）ペンタックス株式会社 (1,878)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１５日（２００６．２．１５）
【出願人】（００００００５２７）ペンタックス株式会社 (1,878)
【Ｆターム（参考）】
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