無細胞性組織マトリックスに由来する血管移植片
病的であるか、または損傷した血管を処置するための血管移植片について開示する。該移植片は、未変化の基底膜を有する無細胞性組織マトリックスのシートを含んでなる。該移植片は、管内に該シートを巻きつけ、シートの端を一緒に固定することによって形成される。無細胞性組織マトリックスは、移植片の組織の内殖とホスト細胞による再構築を促進する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年９月２日に提出され、その全体が参照により本明細書に取り込まれる米国仮出願第６１／２３９，２３７号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本開示は大まかには血管移植片に関し、さらに詳細には無細胞性組織マトリックスに由来する血管移植片および該移植片の産生方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
生体工学および心血管研究の分野における最近の進歩により、バイパス手術のための血管導管の構築、損傷しているかまたは病的である血管の修復、およびその他の血管手術のための新規技術および材料の開発が導かれた。血管移植片には多種多様な合成および生物学的な構築物が含まれる。
【０００４】
移植技術の発達にもかかわらず、血管構造の修復または置換は、特に、腸瘻形成のような合成移植片の使用からもたらされる合併症、遠位塞栓症、移植片の感染および閉塞、限られた耐久性、ならびに吻合周囲の移植片の伸展性の不足により困難なままであることから、さらなる介入が必要とされている。血管置換術への自家移植の応用は、収集した移植片の次元的な制限、ドナー部位の病的状態、および自己血管の収集に付随する外科的な費用のために妨げられる。加えて、非常に多くの患者は、予め存在する血管疾患、静脈ストリッピング、または事前の血管手術のために、移植に適した静脈を有していない。
【０００５】
本開示は、血管移植片構築のための改良された方法および材料を提供する。
【０００６】
本開示の一態様によれば、病的であるか、または損傷した血管を処置するための血管移植片が提供される。血管移植片は、血液を通さず、かつ血流通過のための管腔の輪郭を示す管状壁を含んでなる、管状導管を含んでなる。管状壁は、基底膜を有する無細胞性組織マトリックスのシートを含んでなる。基底膜は、管状導管の管腔表面を形成する。
【０００７】
本開示の別の態様によれば、血管移植片を形成するための方法が提供される。該方法は、基底膜を有する無細胞性組織マトリックスのシートを提供する工程、及び該シートを管状導管内に形成する工程を含んでなる。基底膜は管状導管の内部の管腔表面を形成する。
【０００８】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、単に典型的かつ説明的なものであり、特許請求される発明を限定するものではないことが理解されなければならない。
【０００９】
取り込まれて本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の方法および実施形態を図示し、明細書と共に本発明の様々な態様の原理を説明するために役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａは、病的であるか、または損傷した血管を処置するための血管移植片の代表的な実施形態を示した図である。図１Ｂは、血管移植片の互い違いの配置を示した図である。
【図２】図２Ａは、病的であるか、または損傷した血管を処置するための血管移植片の、別の代表的な実施形態を示した図である。 図２Ｂは、病的であるか、または損傷した血管を処置するための血管移植片の、さらに別の代表的な実施形態を示した図である。
【図３】図３は、特定の実施形態に従った、血管移植片の形成方法を示した図である。
【図４】図４Ａ〜４Ｈは、実施例１に記載するように、ヘマトキシリンとエオジンで染色した外植血管移植片の組織切片像を示した図である。
【図５】図５Ａ〜５Ｆは、実施例１に記載するように、ヴァーヘフファンギーソン染色で染色した外植血管移植片の組織切片像を示した図である。
【図６】図６Ａ〜６Ｆは、実施例１に記載するように、外植血管移植片の走査型電子顕微鏡写真を示した図である。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、実施例１に記載するように、外植血管移植片およびラット大動脈の透過型電子顕微鏡写真を示した図である。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、実施例１に記載するように、内皮細胞に対する抗体で染色した外植血管移植片の組織切片像を示した図である。図８Ｅ〜８Ｈは、実施例１に記載するように、フォン・ヴィレブランド因子に対する抗体で染色した外植血管移植片の組織切片像を示した図である。
【図９】図９Ａ〜９Ｅは、実施例１に記載するように、平滑筋細胞に対する抗体で染色した外植血管移植片の組織切片像を示した図である。図９Ｆ〜９Ｊは、実施例１に記載するように、線維芽細胞に対する抗体で染色した外植血管移植片の組織切片像を示した図である。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｌは、実施例１に記載するように、ラットＴ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージに対する抗体で染色した外植血管移植片の組織切片像を示した図である。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｅは、実施例１に記載するように、ラットＩｇＧに対する抗体で染色した外植血管移植片の組織切片像を示した図である。図１１Ｆ〜１１Ｇは、実施例１に記載するように、ラットＩｇＭに対する抗体で染色した外植血管移植片の組織切片像を示した図である。
【図１２】図１２は、実施例２に記載するように、接着した無細胞性皮膚マトリックスの耐熱性の結果を示した図である。
【図１３】図１３は、実施例２に記載するように、無細胞性皮膚マトリックス上にコートしたヘパリンの抗血栓性の性質における生物接着剤の影響を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ここで、その例が添付の図面に示される、本開示に一致する特定の実施形態に対する詳細な参照を行う。可能な限り、同一かまたは類似の部分を参照するために、図面を通して同一の参照番号が使用され得る。
【００１２】
本出願では、他に特定の記載がない限り、単数形の使用には複数形が含まれる。本出願では、他に記載がない限り、「または」の使用は「および／または」を意味する。さらに、「含んでいる」の語の使用、ならびに「含む」および「含まれた」のようなその他の形は限定的なものではない。また、他に特定の記載がない限り、「要素」または「構成要素」のような語は、１単位を含んでなる要素および構成要素と、１を超えるサブユニットを含んでなる要素および構成要素の両方を包含する。また、「一部」の語の使用には、成分の部分または成分の全体が含まれてよい。
【００１３】
本明細書で用いられる「無細胞性組織マトリックス」は、一般に細胞およびその他の抗原性物質を実質的に含まない、いずれの組織マトリックスも指す。様々な実施形態によれば、骨格を産生するためにヒトまたは異種源由来の無細胞性組織マトリックスが用いられてよい。本開示の範囲内で、皮膚、皮膚の一部（例えば真皮）、ならびに血管、心臓弁、筋膜、および神経結合組織のようなその他の組織が、組織骨格を産生するための無細胞性マトリックスを作り出すために用いられてよい。
【００１４】
本明細書で用いられる節の見出しは編成目的のみのものであり、記載される主題を限定するものとして解釈されてはならない。特許、特許出願、論文、書籍、および専門書を含むがこれらに限定されない、本出願に引用される全ての文書、または文書の一部は、いずれの目的のためにも、それらの全体が参照によって本明細書に明確に取り込まれる。
【００１５】
様々な実施形態によれば、血管の欠損を処置するための、動脈性または静脈性の移植片を構築するための材料および方法が提供される。様々な実施形態によれば、血管移植片は、病的であるか、または損傷した血管の一部の置換、例えば大動脈の弱くなった部分の置換、外傷により損傷した血管の処置、医学的状態（例えば糖尿病、自己免疫疾患など）により引き起こされる血管疾患の処置に用いられる。幾つかの実施形態によれば、血管移植片は、狭窄しているかまたは部分的に閉塞している血管の区域をバイパスおよび／または置換するため、例えば冠動脈および末梢動脈バイパス移植のために用いられる。
【００１６】
幾つかの実施形態によれば、血管移植片は、管状導管内に形成された材料のシートを含んでなる。移植片の管状壁は、天然の血管によって経験される血行力学的な圧力下では血液を透過しない。様々な実施形態によれば、管状移植片を形成する材料シートは、血管へ応用する使用に対して十分な強度と耐久性を有し、かつ機械的性質（例えば弾性）は隣接するホスト血管のものと同様である。特定の実施形態によれば、移植片の管腔内面は抗血栓性である。幾つかの実施形態によれば、移植片を形成する材料シートは、組織の再構築およびホスト細胞の移植片への再集合を支持する。特定の実施形態によれば、移植片を形成する材料は、管腔表面における内皮細胞の堆積、および移植片の管状壁内への平滑筋細胞の統合を支持する。
【００１７】
基底膜は、上皮細胞の基部側に隣接する細胞外物質の薄いシートである。塊状の上皮細胞のシートにより上皮が形成される。従って、例えば皮膚の上皮は表皮と呼ばれ、皮膚基底膜は表皮と真皮の間に位置する。基底膜は、上皮様細胞に対してバリア機能および接着表面を提供する特殊化された細胞外マトリックスである；しかしながら、これは下にある組織（例えば真皮）に対していずれの有意な構造的または生体力学的な役割も果たしていない。基底膜の構成要素には、例えばラミニン、ＶＩＩ型コラーゲン、およびナイドジェンが含まれる。上皮基底膜の時間的および空間的な組織化は、これを例えば真皮の細胞外マトリックスから区別する。
【００１８】
幾つかの実施形態によれば、材料シートは無細胞性組織マトリックスを含み得る。様々な実施形態によれば、無細胞性組織マトリックスは未変化の基底膜を含んでなる。幾つかの実施形態によれば、基底膜は血管導管の管腔表面を形成する。基底膜は、連続した非多孔性の管腔表面を移植片に与えることによって、移植片の管腔からの血液の漏出を阻止する。加えて、基底膜は内皮細胞の増殖を支持して血栓症を阻止し得る。従って、基底膜は漏出および／または血栓症を阻止する内皮の内面の形成を可能にし得るが、外来性の細胞と共に播種または培養することは必要でない。
【００１９】
無細胞性組織マトリックスは、基底膜を含む幾つかの異なる組織から形成することができる。例えば、無細胞性組織マトリックスは、皮膚、膀胱、腸、心膜組織、腹膜、または組織の組み合わせから形成することができる。無細胞性マトリックスの形成に適した一生体材料は、（ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐ、ブランチバーグ、ニュージャージー州）から市販されているＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）のように、ヒトの皮膚に由来する。ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）は、組織の拒絶および移植片の不全を導き得る表皮ならびに細胞の両方を、真皮タンパク質および基底膜を損傷することなく除去するように処理されたヒトの無細胞性真皮マトリックスである。別の代表的な実施形態によれば、無細胞性組織マトリックスは、基底膜の完全性を維持しながら心膜組織を処理することによって産生された心膜マトリックスを含んでなる。さらに別の実施形態によれば、無細胞性組織マトリックスは、基底膜を未変化のまま維持して細胞を除去するように処理された腹膜由来のものである。以下に、適切な無細胞性組織マトリックスの産生について、さらに詳細に記載する。
【００２０】
様々な実施形態によれば、移植片の管腔表面は、外科手術後の移植片の閉塞を抑制するために抗血栓性および／または抗石灰化剤を用いて修飾される。別の実施形態によれば、血管移植片の管腔表面は、管腔表面に沿った内皮細胞の増殖を増大させる増殖因子によって処理される。
【００２１】
管内に無細胞性組織マトリックスのシートを形成するため、対立するシートの端を互いに付着してよい。様々な実施形態によれば、端は、移植片の長さに沿って長軸方向に伸展する流体密封の閉じ目を形成するため、縫合、生物学的に適合性の接着剤、または両方の組み合わせを用いて互いに付着される。幾つかの実施形態によれば、巻いたシートの端は熱および圧力処理を用いて固定される。適切な縫合には、例えばポリプロピレン縫合（ＰＲＯＬＥＮＥ（登録商標））が含まれ、これは連続的かまたは断続的であってよい。適切な接着剤には、例えばフィブリン糊、シアノアクリレートを基にした組織接着剤（例えばＤＥＲＭＡＢＯＮＤ（登録商標））、およびキトサン組織接着剤が含まれる。幾つかの実施形態によれば、シートの端は、管状の構築物内でシートを巻いた後に端が緩まないことを確実にするために、互いに、または材料の下層へ架橋結合される（例えば化学薬品または照射により誘導される架橋を用いて）。
【００２２】
図１Ａに、本開示に一致する血管移植片１０の代表的な実施形態を示す。血管移植片１０は、管腔１３の輪郭を示す管状構築物内へ巻かれる材料シート１２の、及び管腔表面１７と反管腔側の表面１９を有する管状壁１５を含んでなる。シートの長軸方向の端１４、１６は管状構築物の反管腔側で互いに接触し、外科的な縫合および／または生物接着剤を用いて、移植片の長さに沿って付着される。長軸方向の端１４、１６の付着により、反管腔側の表面１９の上に隆起し、管状移植片の長さに沿って伸展する、長軸方向の堤１８が作り出される。一実施形態によれば、図１Ｂに示すように、長軸方向の堤１８は折り畳まれ、血管移植片１０の反管腔側の表面１９に付着する。長軸方向の堤１８は、縫合、接着剤、または両方の組み合わせを用いて、移植片の長さに沿って管状壁１５に固定される。
【００２３】
図２Ａに、本開示に一致する血管移植片２０の代表的な実施形態を示す。移植片２０は、管腔２３の輪郭を示す管状構造内へ巻かれる材料シート２２を含んでなる。材料シート２２は、管腔表面２７と反管腔側の表面２９を有する管状壁２１を形成する。シート２２は、第１の長軸方向の端２４、およびシート２２の反対の末端の、第２の長軸方向の端２６を含んでなる。シート２２が管内に巻かれる際、第２の長軸方向の端２６は第１の端２４を越えて伸展し、第１の端２４と第２の端２６の間に伸展する多層の重なった領域２５が定義される。重なった領域２５は、縫合および／または接着剤を用いて、移植片の長さに沿って封着される。特定の実施形態によれば、重なった領域は、個別の材料シートの幅の少なくとも１０％である。
【００２４】
適切な血管移植片は、幾つかの技術を用いて形成できる。一般に移植片は、選択されたインプラントの位置に必要とされる、望ましいサイズ、長さ、および生体力学的要件に基づいて産生され得る。例えば大動脈の血管移植片としての使用が意図された移植片は、一般に、より低い圧力と少ない血流の輸送が経験され得るその他の位置に対するよりも大きなサイズ、および高い生体力学的性質（例えば破裂強度）を有し得る。
【００２５】
様々な実施形態によれば、材料シートの厚さは、血管移植片によって置換される血管の壁の厚さに一致する。特定の実施形態によれば、材料シートのサイズは、天然の血管の壁の厚さに対応するように決定される。
【００２６】
幾つかの実施形態によれば、移植片は、材料シートを既定のサイズ（すなわち管腔直径）に巻くことによって形成することができる。幾つかの実施形態によれば、図２に示すように、血管移植片は、円筒型ロッドまたは管３０の外部表面の周囲に生体材料シート３２を巻きつけることによって形成できる。シートの長軸方向の区域３４は、円筒型ロッド３０の周囲に折り畳まれる。一実施形態によれば、ロッキングロッド３５は、区域３４を円筒型ロッドに対してロックするため、図３に示すように円筒型ロッド３０と平衡に位置する。２つのホルダーの間に張られた縫合糸もまた、区域３４を円筒型ロッドに対してロックするために用いることができる。次にロッドを、ロッドの長軸方向の軸３１に対して少なくとも約３６０°回転させて、ロッドの外部表面の周囲に材料シートを巻きつける。一実施形態によれば、シート３２は、多層移植片を形成するため、ロッドの周囲に複数回巻きつけられる。シートが円筒型ロッドの周囲に巻きつけられた後、図２に示すように、シートの外側の端３６をシートの下にある層に固定する。
【００２７】
一実施形態によれば、図３に示すように、粘着性ストリップ３８がシートの幅にわたり、複数の位置においてシート３２に取り付けられる。このような実施形態では、シートが円筒型ロッド３０に巻きつけられるに従って、粘着性ストリップ３８がシート３２を材料の下層へ結合させる。
【００２８】
管状移植片の内径は、円筒型ロッドまたは管３０の外径と実質的に同じである。従ってロッドまたは管の直径は、移植片によって置換される天然の血管の管腔直径に一致するように選択される。一実施形態によれば、ロッドの直径はおおよそ４〜５ｍｍであり、これは小直径（＜６ｍｍ）の血管移植片を構築するために用いられる。別の実施形態によれば、管の壁の厚さは１ｍｍである。シートがロッドの周囲に巻きつけられ、シートの長軸方向の単数または複数の端が固定された後、ロッドは巻いたシートの内部から取り除かれる。別の実施形態によれば、管は、シートを管から滑り落とすために長軸方向に伸展する。円筒型ロッドの材料は、ロッドの外部表面へのシートの付着を阻止するように選択される。代表的な一実施形態によれば、使用される円筒型ロッドはガラスロッドである。別の実施形態によれば、使用される円筒型の管はゴム管である。さらに別の実施形態によれば、使用される管はシリコン管である。
【００２９】
適切な無細胞組織マトリックス
幾つかの実施形態によれば、適切な無細胞性組織マトリックスは、例えば、細胞認識、細胞結合、細胞伸展の支持能、細胞増殖、細胞の内殖、および細胞分化のような、特定の生物学的機能を保持し得る。このような機能は、例えば未変性のコラーゲン性タンパク質（例えばＩ型コラーゲン）および様々な非コラーゲン性分子（例えばインテグリン受容体、グリコサミノグリカン（例えばヒアルロナン）もしくはプロテオグリカンのような高い電荷密度を有する分子、またはその他の付着因子のようないずれかの分子に対するリガンドとして役立つタンパク質）によって提供され得る。幾つかの実施形態によれば、無細胞性組織マトリックスは、組織構造の維持および組織の構成要素の三次元配列の維持を含む、特定の構造的機能を保持し得る。本明細書に記載する無細胞性組織マトリックスはまた、例えば強度、弾性、および耐久性のような望ましい物理的特性、規定の多孔度、ならびに高分子の保持を示し得る。適切な無細胞性組織マトリックスは、架橋され得るかまたは架橋されない。
【００３０】
幾つかの実施形態によれば、移植片材料は、関連するホスト組織の分化細胞、間葉系幹細胞のような幹細胞、または前駆細胞のような浸潤細胞によって再構築されることを受け入れる。これは例えば、移植されたマトリックス材料を周囲のホスト組織に同一の組織から形成することで達成され得るが、このような同一性は必用ではない。
【００３１】
再構築は、上記の無細胞性組織マトリックス構成要素および周囲のホスト組織からのシグナル（例えばサイトカイン、細胞外マトリックス構成要素、生体力学的刺激、および生体電気刺激）によって方向付けられる。例えば、骨髄および末梢循環における間葉系幹細胞の存在が文献中に記載され、様々な筋骨格組織を再生することが示されている［Ｃａｐｌａｎ（１９９１）Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．９：６４１−６５０；Ｃａｐｌａｎ（１９９４）Ｃｌｉｎ．Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．２１：４２９−４３５；およびＣａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ．３４２：２５４−２６９］。加えて移植片は、再構築過程の間に、ある程度の（閾値よりも大きな）張力および生体力学的強度を提供しなければならない。
【００３２】
無細胞性組織マトリックスは、様々な原料組織から製造され得る。例えば無細胞性組織マトリックスは、マトリックスによって上記の性質が保持されている限り、いずれのコラーゲン含有軟部組織および筋骨格（例えば真皮、筋膜、心膜、硬膜、臍帯、胎盤、心臓弁、靭帯、腱、血管組織（動脈および伏在静脈のような静脈）、神経結合組織、膀胱組織、尿管組織、または腸管組織）からも産生され得る。
【００３３】
無細胞性組織マトリックスは、無細胞性組織マトリックス移植片のレシピエントと同じである種の１以上の個体から作られてよいが、必ずしもそうではない。従って例えば、無細胞性組織マトリックスはブタの組織から作られ、ヒト患者へ移植されてもよい。無細胞性組織マトリックスのレシピエントおよび無細胞性組織マトリックス産生のための組織または臓器のドナーとして役立ち得る種には、ヒト、非ヒト霊長類（例えばサル、ヒヒ、チンパンジー）、ブタ、雌ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ラット、またはマウスが含まれるが、これらに限定されない。ドナーとして特に興味深いものは、末端のα−ガラクトース成分が欠如するように、遺伝的に改変された動物（例えばブタ）である。適切な動物についての記載は、それらの開示の全体が参照により本明細書に取り込まれる、同時係属の米国特許出願第１０／８９６，５９４号および米国特許第６，１６６，２８８号を参照されたい。
【００３４】
幾つかの実施形態によれば、凍結乾燥した無細胞性組織マトリックスがＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ブランチバーグ、ニュージャージー州）によってヒトの真皮から産生され、ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）として小さなシートの形で市販されている。ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）の凍結および乾燥に用いられる凍結保護物質は、３５％マルトデキストリンと１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の溶液である。従って、最終乾燥産物は約６０重量％の無細胞性組織マトリックスと約４０重量％のマルトデキストリンを含む。ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎはまた、ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）に同一の無細胞性組織マトリックスおよびマルトデキストリンの比率を有する、ブタの真皮から作られた類似製品（ＸＥＮＯＤＥＲＭと名付けられた）も製造している。
【００３５】
このような遺伝的に改変された動物をドナーとして使用するための別の方法として、適切な組織および臓器は、脱細胞の前または後に、例えば糖タンパク質上の糖鎖から末端のα−ガラクトース（α−ｇａｌ）成分を除去する酵素であるα−ガラクトシダーゼによって処理することができる。これらの成分を除去するために組織をα−ガラクトシダーゼによって処理する方法は、例えば、その開示の全体が参照により本明細書に取り込まれる、米国特許第６，３３１，３１９号に記載されている。
【００３６】
実行時には、無細胞性組織マトリックスにおいて細胞を死滅させる前または後のいずれかに、コラーゲン含有物質は１以上のグリコシダーゼ、特にα−ガラクトシダーゼのようなガラクトシダーゼによるコラーゲン含有物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ消化に供される。α−ガラクトシダーゼを用いた酵素処理によって、特にα−ｇａｌエピトープが除去される。
【００３７】
Ｎ−アセチルラクトサミン残基は、通常ヒトおよび哺乳類細胞に発現するエピトープであり、それ故に免疫原性ではない。グリコシダーゼによるコラーゲン含有物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ消化は、様々な方法によって達成され得る。例えばコラーゲン含有物質は、グリコシダーゼを含む緩衝液中に浸すか、または該緩衝液中でインキュベートすることができる。あるいはグリコシダーゼを含む緩衝液は、パルス洗浄工程により、圧力をかけてコラーゲン含有物質中に通すことができる。
【００３８】
コラーゲン含有物質からのα−ｇａｌエピトープの除去により、コラーゲン含有物質に対する免疫応答は減少し得る。α−ｇａｌエピトープは、非霊長類の哺乳類および新世界ザル（南米のサル）において発現し、かつ細胞外構成要素の、プロテオグリカンのような高分子上に発現する。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１７７５５（１９８８）。しかしながら、このエピトープは旧世界霊長類（アジアおよびアフリカのサルならびに類人猿）およびヒトには存在しない。同文献。抗ｇａｌ抗体は、ヒトおよび霊長類において、胃腸の細菌上のα−ｇａｌエピトープの炭水化物構造に対する免疫応答の結果として産生される。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５６：１７３０（１９８８）；Ｒ．Ｍ．Ｈａｍａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１２２３（１９９２）。
【００３９】
非霊長類の哺乳類（例えばブタ）はα−ｇａｌエピトープを産生することから、これらの哺乳類に由来するコラーゲン含有物質を霊長類へ注入することによる異種移植は、コラーゲン含有物質上のこれらのエピトープへの霊長類抗Ｇａｌの結合によってしばしば拒絶をもたらす。この結合は、補体結合および抗体依存性の細胞傷害性によってコラーゲン含有物質の破壊をもたらす。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １４：４８０（１９９３）；Ｍ．Ｓａｎｄｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１３９１（１９９３）；Ｈ．Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２４：５５９（１９９２）；Ｂ．Ｈ．Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５００（１９９５）。さらに異種移植は、高親和性抗ｇａｌ抗体の産生量を増大させる、免疫系の主要な活性化をもたらす。従って、細胞からの、およびコラーゲン含有物質の細胞外構成要素からのα−ｇａｌエピトープの実質的な除去、ならびに細胞性α−ｇａｌエピトープの再発現の防止によって、α−ｇａｌエピトープへの抗ｇａｌ抗体の結合に関連する、コラーゲン含有物質に対する免疫応答を減少させることができる。
【００４０】
本開示における使用に適した無細胞性組織マトリックスは、それらによる産生が上記の生物学的および構造的性質を備えたマトリックスをもたらす限りにおいて、様々な方法によって産生することができる。一般に、無細胞性組織マトリックスの産生に関わる工程には、ドナー（例えばヒトの死体または上記哺乳類のいずれか）から組織を収集すること、生物学的および構造的機能を同様に保存する条件下での細胞除去と同時に、またはそれに続いて行われる、組織を安定化させ、かつ生化学的および構造的分解を避けるための化学処理が含まれる。最初の安定化溶液は、浸透圧性、低酸素性、自己融解性、およびタンパク質分解性の分解を停止および阻止し、微生物の混入から保護し、かつ、例えば平滑筋の構成要素（例えば血管）を含む組織に起こり得る機械的損傷を減少させる。安定化溶液は、適切な緩衝液、１以上の酸化防止剤、１以上の膠質剤、１以上の抗生物質、１以上のプロテアーゼ阻害剤、および幾つかの場合には平滑筋弛緩剤を含んでよい。幾つかの代表的な実施形態によれば、収集した組織（例えば真皮組織）は、組織サンプルから上皮を除去するために、化学的な脱上皮化溶液によって処理される。例えば幾つかの実施形態によれば、ヒトまたはブタの真皮組織を含んでなるサンプルは、上皮層を除去するため、１Ｍ ＮａＣｌ溶液に室温にて一晩浸される。特定の実施形態によれば、上皮層の完全な除去を確実にするため、ＮａＣｌ溶液の濃度は１．５Ｍに増大される。
【００４１】
次に、基底膜複合体、またはコラーゲンマトリックスの生物学的および構造的完全性を損傷することなく、構造マトリックスから生細胞（例えば上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞）を除去するため、組織を脱細胞溶液中に置く。脱細胞溶液は、適切な緩衝液、塩、抗生物質、１以上の界面活性剤（例えばＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００（商標）、デオキシコール酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（２０）モノオレイン酸ソルビタン）、架橋を阻止するための１以上の薬剤、１以上のプロテアーゼ阻害剤、および／または１以上の酵素を含んでよい。幾つかの実施形態によれば、脱細胞溶液はゲンタマイシンおよび２５ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含むＲＰＭＩ培地中の１％ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００（商標）を含んでなる。幾つかの実施形態によれば、組織は脱細胞溶液中で、３７℃にて９０ｒｐｍで穏やかに振盪しながら一晩インキュベートされる。特定の実施形態によれば、組織サンプルから脂肪を除くために、追加の界面活性剤が用いられてよい。例えば、幾つかの実施形態によると、腹膜を処理するため、脱細胞溶液に２％デオキシコール酸ナトリウムが添加される。
【００４２】
脱細胞工程後、組織サンプルを生理食塩水で十分に洗浄する。幾つかの代表的な実施形態によれば、例えば異種性の材料を用いる際、脱細胞した組織は次にデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）溶液により、室温にて一晩処理される。幾つかの実施形態によれば、組織サンプル（例えば腹膜および心膜組織）は、ＤＮａｓｅ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、および２０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で調製したＤＮａｓｅ溶液によって処理される。ＤＮａｓｅ溶液には、任意に抗生物質溶液（例えばゲンタマイシン）を添加してもよい。
【００４３】
ＤＮａｓｅ溶液を除去するために組織を生理食塩水で十分に洗浄した後、サンプル中に存在する可能性のあるいずれの免疫原性抗原も除去するため、組織サンプルを１以上の酵素による処理に供してよい。先に述べたように、組織に存在する可能性のあるα−ｇａｌエピトープを除去するため、組織サンプルをα−ガラクトシダーゼ酵素によって処理してもよい。幾つかの実施形態によれば、組織は、ｐＨ６．０の１００ｍＭ リン酸緩衝液中で調製された３００Ｕ／Ｌの濃度のα−ガラクトシダーゼによって処理される。別の実施形態によれば、α−ガラクトシダーゼの濃度は、収集した組織からのα−ｇａｌエピトープの十分な除去のため、４００Ｕ／Ｌに増大される（例えばブタ由来の真皮組織の処理において）。
【００４４】
死滅した、および／または溶解した細胞構成要素、ならびに炎症の原因となり得る抗原、同様にいずれの生体不適合性の細胞除去剤も完全に除去した後、マトリックスは、再び、記載したマトリックスの生物学的および構造的性質の維持に必要な条件下で凍結保存剤により処理して凍結保存してよく、任意に凍結乾燥してもよい。凍結保存または凍結乾燥後、無細胞性組織マトリックスはそれぞれ解凍または再水和されてよい。全ての工程は一般に無菌的、好ましくは無菌状態で行われる。
【００４５】
無細胞性組織マトリックスを形成した後、ホストによってさらに再構成され得る移植片を産生するために、組織適合性の生細胞を任意に無細胞性組織マトリックスへ播種してよい。一実施形態によれば、組織適合性の生細胞は、移植前に標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞共培養技術によって、または移植後にｉｎ ｖｉｖｏ再集合によって、マトリックスへ添加されてよい。Ｉｎ ｖｉｖｏ再集合は、無細胞性組織マトリックスへ遊走したレシピエント自身の細胞によるか、またはレシピエントから得た細胞もしくは別のドナーからの組織適合性の細胞の、ｉｎ ｓｉｔｕでの無細胞性組織マトリックス内への点滴または注射によるものであってよい。
【００４６】
再構成のために選択される細胞の型は、無細胞性組織マトリックスが再構成される組織または臓器の性質に依存し得る。例えば、血管導管の再構成には内皮細胞が重要である。このような細胞は組織の内部表面を裏打ちし、培養によって増殖し得る。内皮細胞は、意図されたレシピエント患者に直接由来するか、または臍帯動脈または静脈に由来してよく、無細胞性組織マトリックスおよびレシピエントに移植された結果としての組成物を再構成するために用いることができる。あるいは、無細胞性組織マトリックスには培養した（自己または同種の）細胞を添加することができる。このような細胞は、例えば標準的な組織培養条件で増殖させた後、無細胞性組織マトリックスに添加することができる。別の実施形態によれば、細胞は組織培養により、無細胞性組織マトリックス内で、および／または無細胞性組織マトリックス上で増殖させることができる。組織培養により、無細胞性組織マトリックス内で、および／または無細胞性組織マトリックス上で増殖させる細胞は、適切なドナー（例えば意図されたレシピエントまたは同種のドナー）から直接得られるか、またはそれらは最初に無細胞性組織マトリックスなしで、組織培養により増殖させることができる。
【００４７】
以下の実施例は様々な実施形態をよりよく説明するために提供されるものであり、本開示の範囲を限定するものとしてどのようにも解釈されてはならない。
【実施例１】
【００４８】
真皮マトリックスに由来する血管移植片の機能試験
ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ブランチバーグ、ニュージャージー州）から市販されている、ヒト無細胞真皮マトリックス（ＨＡＤＭ）であるＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）を用いて、血管移植片を形成した。ＨＡＤＭは、厚さ０．３〜０．５ｍｍのシートとして供給された。ＨＡＤＭを生理食塩水に３０分間浸し、０．５×１．５ｃｍの薄片に切り取った。ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）ＨＡＤＭは未変化の基底膜を含んでおり、ＨＡＤＭの薄片を基底膜と共に管内へ、管の管腔表面に沿って巻きこんだ。単層の管構築物が作り出されるように、管を、連結する端に沿って縫合した。
【００４９】
次に血管移植片をラット腹部大動脈置換モデルにおいて試験した。２０匹の成体（９〜１１週齢）雄Ｌｅｗｉｓラットを４０ｍｇ／ｋｇの腹腔内ペントバルビタールによって麻酔した後、各ラットの腹部正中線を切開した。腎動脈の下から大動脈分岐部の直上までの、腹部大動脈の１ｃｍの区域を正中線切開によって切除した。切除した大動脈区域を、ＨＡＤＭ由来の血管移植片によって置換した。移植片は同所性の位置に、９−０ナイロンによる断続縫合を用いた端々吻合術によって移植した。移植片の質および移植部位の治癒の程度を、４つの試験エンドポイント（１、３、６、および１２か月）において記録した。各エンドポイントで５匹の動物を屠殺した。屠殺した動物から、１ｃｍの血管移植片、および吻合を越えて０．５ｃｍのホスト組織材料（外植片の全長は２ｃｍ）を、脾臓およびリンパ節のサンプルと共に切除した。外植切片は、組織学的検査、免疫組織学的検査、ＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）、およびＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）分析に用いた。移植片の中央部、および移植片−ホスト組織の接触面を示す切除したサンプルは、固定およびそれに続く分析のために、１０％ホルマリンまたは８％グルタルアルデヒド中に置いた（ＳＥＭおよびＴＥＭ分析のため）。
【００５０】
臨床所見
血管移植片を受け入れた全ての動物は、外科手術後には正常に回復し、手術されていない動物と同様に、試験期間の間に体重は維持されるかまたは増加した。１４匹の動物は、下肢の動きの制限および下肢の病的変化によって証明される移植不全の臨床的徴候を示すことなく、予定された屠殺日まで生存した。１匹の動物は、内部出血により移植後４日目に死亡した。試験の間に、いずれの動物にも外科手術部位における感染は証明されなかった。外植した血管移植片の全体的な所見では、狭窄、動脈瘤、過形成、縫合の裂開、または血栓形成は証明されなかった。加えて、外植した移植片のほとんどは滑らかな管腔表面を有し、石灰化は観察されなかった。２つの移植片（６および１２か月に外植された）は、正常な血管構造よりもさらに硬い領域を示したことから、血管の石灰化が示唆された。全ての移植片は、吻合部位において、天然のラット大動脈と良好に統合されていた。
【００５１】
組織学的検査
外植した移植片を、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオジン）およびヴァーヘフファンギーソン染色によって処理した。３か月（図４Ａおよび４Ｂ）および１２か月（図４Ｃ〜４Ｇ）の、代表的な移植片断面のＨ＆Ｅ染色により、線維芽細胞が移植片に再集合し、幾つかの内皮細胞が移植片の管腔表面を裏打ちしていることが示された。図４Ａ〜４Ｅは、Ｈ＆Ｅ染色した移植片の中央部断面、図４Ｆおよび４Ｇは、Ｈ＆Ｅ染色した吻合部位の断面、および図４Ｈは、移植せずに試験のコントロールとして使用した移植片をＨ＆Ｅ染色したものである。
【００５２】
外植した吻合部位の組織学的検査により、組織の完全な統合、および移植片のホスト血管へのスムーズな移行が示された。１か月目には炎症性細胞の軽度の浸潤が観察されたが、時間が経つにつれてその程度は減弱し、３か月目には炎症性細胞は観察されなくなったことから、移植した移植片によって慢性炎症は誘導されなかったことが示された。
【００５３】
図５Ａおよび５Ｂは、移植片の中央部断面のヴァーヘフ染色を示し、図５Ｃおよび５Ｄは、吻合部位の断面のヴァーヘフ染色を示し、図５Ｅは正常ラット大動脈のヴァーヘフ染色を示し、図５Ｆはコントロールとして使用した移植前の血管移植片を示す。移植片断面のヴァーヘフ染色により、新媒体（neomedia）はコラーゲンリッチであり、細胞には広くエラスチンが沈着しているように見えることが示された。
【００５４】
ＳＥＭおよびＴＥＭによる分析
図６Ａ〜６Ｆは、上記のように産生された血管移植片のＳＥＭ顕微鏡像である。図６Ａに示すように、移植前の移植片のＳＥＭによって、基底膜の表面には細胞構造が見られないことが示された。外植した血管移植片は、１か月目にその管腔表面に内皮細胞を有し（図６Ｂ）、３か月目に管腔表面は内皮型細胞によって完全に覆われた（図６Ｃ）。図６Ｄに示すように、移植片とラット大動脈の接触面には未変化の吻合が見られた。３か月目の移植片の表面（図６Ｅ）は、細胞で完全に覆われ、ラット大動脈の表面と区別がつかなかった（図６Ｆ）。
【００５５】
同様に、１か月目の代表的な血管移植片のＴＥＭ顕微鏡像（図７Ａ）は、移植片の管腔を裏打ちする基底膜（ＢＭ）を伴う、平坦な内皮細胞を示した。ＴＥＭ像には、微小線維および濃密体を有する平滑筋細胞（ＳＭＣ）もまた明らかに見られた。弾性線維の形成を表す、平滑筋細胞の表面に沿って暗く染色される物質がＴＥＭ顕微鏡像で観察されたが、形成された弾性線維は、正常ラット大動脈のＴＥＭ像に観察される内弾性板（ＩＥＬ）に比較して未熟であった（図７Ｂ）。
【００５６】
免疫染色
移植片の管腔表面の内皮細胞の発生を、内皮細胞の染色およびｖＷＦ（フォン・ヴィレブランド因子）の染色を用いて確認した。管腔表面における内皮細胞の堆積を同定するため、ラット内皮細胞およびｖＷＦに対する特異的な抗体を用いた。図８Ａに示すように、１か月目に内皮細胞が観察されたが、管腔を完全に覆ってはいなかった。図８Ｂ、８Ｃ、および８Ｄそれぞれに示すように、３か月目、６か月目、および１２か月目には内皮細胞の有意な堆積が観察された。図８Ｅ〜８Ｈに示すように、ｖＷＦの免疫組織学的染色によると、移植片の表面全体が内皮細胞により裏打ちされていた。
【００５７】
血管移植片への平滑筋細胞および線維芽細胞の再集合が、それぞれα−平滑筋アクチンおよびビメンチンに対する特異的な抗体を用いた染色によって確認された。コントロールとして使用するため、ラット腹部大動脈の断面もまた、α−平滑筋アクチンおよび線維芽細胞に対する抗体を用いて染色した（それぞれ図９Ａおよび９Ｆ）。１か月目（図９Ｂおよび９Ｇ）、３か月目（図９Ｃおよび９Ｈ）、６か月目（図９Ｄおよび９Ｉ）、および１２か月目（図９Ｅおよび９Ｊ）の移植片により、移植後１か月目から、移植片への平滑筋細胞および線維芽細胞の再集合が始まっていることが示された。
【００５８】
炎症性および免疫応答
移植した移植片に対するホストの炎症性応答を同定するため、外植片を抗ラットＴ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージ抗体によって染色した。図１０Ａ〜１０Ｄはそれぞれ、１か月目、３か月目、６か月目、および１２か月目に抗ラットＴ細胞抗体によって染色した移植片を示す。同様に、図１０Ｅ〜１０ＨはＢ細胞抗体によって染色した移植片を示し、図１０Ｉ〜１０Ｌはマクロファージに対する抗体によって染色した移植片を示す。１か月目に、３つの型の炎症性細胞は全て、外植した移植片に中程度に浸潤していることが見出されたが、新媒体（neomedia）には炎症性細胞の浸潤は検出されなかった。炎症性細胞は３か月目には有意に減少し、観察されるものは主に移植片の周辺部に近いところに見られた。６か月後には炎症性細胞は観察されなかった。
【００５９】
同様に、最初の３か月間、移植片には中程度のレベルのＩｇＧ抗体が見られたが、新媒体（neomedia）には見られなかった。血管移植片に結合したラットＩｇＧ（図１１Ａ〜１１Ｅ）およびＩｇＭ（図１１Ｆ〜１１Ｊ）について、１か月目（図１１Ａおよび１１Ｆ）、３か月目（図１１Ｂおよび１１Ｇ）、６か月目（図１１Ｃおよび１１Ｈ）、および１２か月目（図１１Ｄおよび１１Ｉ）に試験した。正常ラット腹部大動脈（図１１Ｅおよび１１Ｊ）をコントロールとして用いた。図１１Ａ〜１１Ｄに示すように、最初の３か月間、移植片には中程度のレベルのＩｇＧ抗体が見られた。３か月後、ＩｇＧのレベルは有意に減少した。試験の間には、どの移植片にもＩｇＭの体積は見られなかった。
【実施例２】
【００６０】
生物学的接着剤を用いて形成した血管移植片の、力学的強度、耐熱性、および血栓性効果の評価
この試験には、ヒト無細胞性真皮マトリックス（ＨＡＤＭ）由来の血管移植片を用いた。ＨＡＤＭのシートを管状構築物内へ巻き込み、フィブリン糊を用いてシートの端を付着させた。破裂試験（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＡＮＳＩ）コード：ＡＮＳＩ／ＡＡＭＩ／ＩＳＯ７１９８：１９９８／２００１／（登録商標）２００４）を用いて移植片の破裂強度を評価した。最大破裂強度は１６３９±４３２ｍｍＨｇ（ｎ＝２）と算出され、これにより生物接着剤を用いて形成した血管移植片が生理的な血圧を維持するために十分強いことが示された。
【００６１】
真皮マトリックスにおけるコラーゲン変性の開始温度を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって決定した。図１２のグラフに示すように、接着させた血管移植片のコラーゲン変性の温度は、ヒト無細胞性真皮マトリックスのものと比較して遜色がない。グラフには、未処理のＨＡＤＭ、ならびにＨＡＤＭをＤＥＲＭＡＢＯＮＤ（登録商標）、フィブリノーゲン、およびキトサンを基にした接着剤により接着して形成した血管移植片の変性開始温度に対応するデータが含まれる。この実験のデータにより、生物接着剤はマトリックスの生化学的性質を変化させなかったことが示される。
【００６２】
接着させた血管移植片における抗血栓薬（例えばヘパリン）の有効性を、血餅形成法を用いて評価した。血管移植片を、０．４％ヘパリンナトリウム塩溶液中に室温で２４時間浮遊させることにより、ヘパリンコーティングを行った。血管移植片の１ｃｍ２切片の管腔表面に２００μｌの血液および１２．５μｌの１００ｍＭ ＣａＣｌ２を加え、次に移植片切片を３７℃、５％Ｃ０２のインキュベーター内に１時間静置した。鉗子を用いて目に見える血餅を表面から除去し、試験管内に採取し、凍結乾燥後に秤量した。図１３のグラフに示すように、ヘパリンの抗血栓性の性質は、ヘパリンが生物接着剤に接触しても影響を受けなかった。グラフには、未処理のＨＡＤＭ、ヘパリン処理したＨＡＤＭ（ＨＡＤＭ＋Ｈｅｐ）、フィブリノーゲン糊（ＦＧ）、ならびにヘパリンおよびフィブリノーゲン糊の両方で処理したＨＡＤＭ（ＨＡＤＭ＋ＦＧ＋Ｈｅｐ）において形成された血餅の重量に対応するデータが含まれる。グラフに示すように、ヘパリンおよびフィブリノーゲン糊の両方で処理したＨＡＤＭにおいて形成された血餅の量は、ヘパリン処理したＨＡＤＭの血餅のデータと比較して遜色がなかったことから、フィブリノーゲン糊は、真皮マトリックスにおけるヘパリンコーティングの抗血栓作用を妨げないことが示された。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年９月２日に提出され、その全体が参照により本明細書に取り込まれる米国仮出願第６１／２３９，２３７号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本開示は大まかには血管移植片に関し、さらに詳細には無細胞性組織マトリックスに由来する血管移植片および該移植片の産生方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
生体工学および心血管研究の分野における最近の進歩により、バイパス手術のための血管導管の構築、損傷しているかまたは病的である血管の修復、およびその他の血管手術のための新規技術および材料の開発が導かれた。血管移植片には多種多様な合成および生物学的な構築物が含まれる。
【０００４】
移植技術の発達にもかかわらず、血管構造の修復または置換は、特に、腸瘻形成のような合成移植片の使用からもたらされる合併症、遠位塞栓症、移植片の感染および閉塞、限られた耐久性、ならびに吻合周囲の移植片の伸展性の不足により困難なままであることから、さらなる介入が必要とされている。血管置換術への自家移植の応用は、収集した移植片の次元的な制限、ドナー部位の病的状態、および自己血管の収集に付随する外科的な費用のために妨げられる。加えて、非常に多くの患者は、予め存在する血管疾患、静脈ストリッピング、または事前の血管手術のために、移植に適した静脈を有していない。
【０００５】
本開示は、血管移植片構築のための改良された方法および材料を提供する。
【０００６】
本開示の一態様によれば、病的であるか、または損傷した血管を処置するための血管移植片が提供される。血管移植片は、血液を通さず、かつ血流通過のための管腔の輪郭を示す管状壁を含んでなる、管状導管を含んでなる。管状壁は、基底膜を有する無細胞性組織マトリックスのシートを含んでなる。基底膜は、管状導管の管腔表面を形成する。
【０００７】
本開示の別の態様によれば、血管移植片を形成するための方法が提供される。該方法は、基底膜を有する無細胞性組織マトリックスのシートを提供する工程、及び該シートを管状導管内に形成する工程を含んでなる。基底膜は管状導管の内部の管腔表面を形成する。
【０００８】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、単に典型的かつ説明的なものであり、特許請求される発明を限定するものではないことが理解されなければならない。
【０００９】
取り込まれて本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の方法および実施形態を図示し、明細書と共に本発明の様々な態様の原理を説明するために役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａは、病的であるか、または損傷した血管を処置するための血管移植片の代表的な実施形態を示した図である。図１Ｂは、血管移植片の互い違いの配置を示した図である。
【図２】図２Ａは、病的であるか、または損傷した血管を処置するための血管移植片の、別の代表的な実施形態を示した図である。 図２Ｂは、病的であるか、または損傷した血管を処置するための血管移植片の、さらに別の代表的な実施形態を示した図である。
【図３】図３は、特定の実施形態に従った、血管移植片の形成方法を示した図である。
【図４】図４Ａ〜４Ｈは、実施例１に記載するように、ヘマトキシリンとエオジンで染色した外植血管移植片の組織切片像を示した図である。
【図５】図５Ａ〜５Ｆは、実施例１に記載するように、ヴァーヘフファンギーソン染色で染色した外植血管移植片の組織切片像を示した図である。
【図６】図６Ａ〜６Ｆは、実施例１に記載するように、外植血管移植片の走査型電子顕微鏡写真を示した図である。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、実施例１に記載するように、外植血管移植片およびラット大動脈の透過型電子顕微鏡写真を示した図である。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、実施例１に記載するように、内皮細胞に対する抗体で染色した外植血管移植片の組織切片像を示した図である。図８Ｅ〜８Ｈは、実施例１に記載するように、フォン・ヴィレブランド因子に対する抗体で染色した外植血管移植片の組織切片像を示した図である。
【図９】図９Ａ〜９Ｅは、実施例１に記載するように、平滑筋細胞に対する抗体で染色した外植血管移植片の組織切片像を示した図である。図９Ｆ〜９Ｊは、実施例１に記載するように、線維芽細胞に対する抗体で染色した外植血管移植片の組織切片像を示した図である。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｌは、実施例１に記載するように、ラットＴ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージに対する抗体で染色した外植血管移植片の組織切片像を示した図である。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｅは、実施例１に記載するように、ラットＩｇＧに対する抗体で染色した外植血管移植片の組織切片像を示した図である。図１１Ｆ〜１１Ｇは、実施例１に記載するように、ラットＩｇＭに対する抗体で染色した外植血管移植片の組織切片像を示した図である。
【図１２】図１２は、実施例２に記載するように、接着した無細胞性皮膚マトリックスの耐熱性の結果を示した図である。
【図１３】図１３は、実施例２に記載するように、無細胞性皮膚マトリックス上にコートしたヘパリンの抗血栓性の性質における生物接着剤の影響を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ここで、その例が添付の図面に示される、本開示に一致する特定の実施形態に対する詳細な参照を行う。可能な限り、同一かまたは類似の部分を参照するために、図面を通して同一の参照番号が使用され得る。
【００１２】
本出願では、他に特定の記載がない限り、単数形の使用には複数形が含まれる。本出願では、他に記載がない限り、「または」の使用は「および／または」を意味する。さらに、「含んでいる」の語の使用、ならびに「含む」および「含まれた」のようなその他の形は限定的なものではない。また、他に特定の記載がない限り、「要素」または「構成要素」のような語は、１単位を含んでなる要素および構成要素と、１を超えるサブユニットを含んでなる要素および構成要素の両方を包含する。また、「一部」の語の使用には、成分の部分または成分の全体が含まれてよい。
【００１３】
本明細書で用いられる「無細胞性組織マトリックス」は、一般に細胞およびその他の抗原性物質を実質的に含まない、いずれの組織マトリックスも指す。様々な実施形態によれば、骨格を産生するためにヒトまたは異種源由来の無細胞性組織マトリックスが用いられてよい。本開示の範囲内で、皮膚、皮膚の一部（例えば真皮）、ならびに血管、心臓弁、筋膜、および神経結合組織のようなその他の組織が、組織骨格を産生するための無細胞性マトリックスを作り出すために用いられてよい。
【００１４】
本明細書で用いられる節の見出しは編成目的のみのものであり、記載される主題を限定するものとして解釈されてはならない。特許、特許出願、論文、書籍、および専門書を含むがこれらに限定されない、本出願に引用される全ての文書、または文書の一部は、いずれの目的のためにも、それらの全体が参照によって本明細書に明確に取り込まれる。
【００１５】
様々な実施形態によれば、血管の欠損を処置するための、動脈性または静脈性の移植片を構築するための材料および方法が提供される。様々な実施形態によれば、血管移植片は、病的であるか、または損傷した血管の一部の置換、例えば大動脈の弱くなった部分の置換、外傷により損傷した血管の処置、医学的状態（例えば糖尿病、自己免疫疾患など）により引き起こされる血管疾患の処置に用いられる。幾つかの実施形態によれば、血管移植片は、狭窄しているかまたは部分的に閉塞している血管の区域をバイパスおよび／または置換するため、例えば冠動脈および末梢動脈バイパス移植のために用いられる。
【００１６】
幾つかの実施形態によれば、血管移植片は、管状導管内に形成された材料のシートを含んでなる。移植片の管状壁は、天然の血管によって経験される血行力学的な圧力下では血液を透過しない。様々な実施形態によれば、管状移植片を形成する材料シートは、血管へ応用する使用に対して十分な強度と耐久性を有し、かつ機械的性質（例えば弾性）は隣接するホスト血管のものと同様である。特定の実施形態によれば、移植片の管腔内面は抗血栓性である。幾つかの実施形態によれば、移植片を形成する材料シートは、組織の再構築およびホスト細胞の移植片への再集合を支持する。特定の実施形態によれば、移植片を形成する材料は、管腔表面における内皮細胞の堆積、および移植片の管状壁内への平滑筋細胞の統合を支持する。
【００１７】
基底膜は、上皮細胞の基部側に隣接する細胞外物質の薄いシートである。塊状の上皮細胞のシートにより上皮が形成される。従って、例えば皮膚の上皮は表皮と呼ばれ、皮膚基底膜は表皮と真皮の間に位置する。基底膜は、上皮様細胞に対してバリア機能および接着表面を提供する特殊化された細胞外マトリックスである；しかしながら、これは下にある組織（例えば真皮）に対していずれの有意な構造的または生体力学的な役割も果たしていない。基底膜の構成要素には、例えばラミニン、ＶＩＩ型コラーゲン、およびナイドジェンが含まれる。上皮基底膜の時間的および空間的な組織化は、これを例えば真皮の細胞外マトリックスから区別する。
【００１８】
幾つかの実施形態によれば、材料シートは無細胞性組織マトリックスを含み得る。様々な実施形態によれば、無細胞性組織マトリックスは未変化の基底膜を含んでなる。幾つかの実施形態によれば、基底膜は血管導管の管腔表面を形成する。基底膜は、連続した非多孔性の管腔表面を移植片に与えることによって、移植片の管腔からの血液の漏出を阻止する。加えて、基底膜は内皮細胞の増殖を支持して血栓症を阻止し得る。従って、基底膜は漏出および／または血栓症を阻止する内皮の内面の形成を可能にし得るが、外来性の細胞と共に播種または培養することは必要でない。
【００１９】
無細胞性組織マトリックスは、基底膜を含む幾つかの異なる組織から形成することができる。例えば、無細胞性組織マトリックスは、皮膚、膀胱、腸、心膜組織、腹膜、または組織の組み合わせから形成することができる。無細胞性マトリックスの形成に適した一生体材料は、（ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐ、ブランチバーグ、ニュージャージー州）から市販されているＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）のように、ヒトの皮膚に由来する。ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）は、組織の拒絶および移植片の不全を導き得る表皮ならびに細胞の両方を、真皮タンパク質および基底膜を損傷することなく除去するように処理されたヒトの無細胞性真皮マトリックスである。別の代表的な実施形態によれば、無細胞性組織マトリックスは、基底膜の完全性を維持しながら心膜組織を処理することによって産生された心膜マトリックスを含んでなる。さらに別の実施形態によれば、無細胞性組織マトリックスは、基底膜を未変化のまま維持して細胞を除去するように処理された腹膜由来のものである。以下に、適切な無細胞性組織マトリックスの産生について、さらに詳細に記載する。
【００２０】
様々な実施形態によれば、移植片の管腔表面は、外科手術後の移植片の閉塞を抑制するために抗血栓性および／または抗石灰化剤を用いて修飾される。別の実施形態によれば、血管移植片の管腔表面は、管腔表面に沿った内皮細胞の増殖を増大させる増殖因子によって処理される。
【００２１】
管内に無細胞性組織マトリックスのシートを形成するため、対立するシートの端を互いに付着してよい。様々な実施形態によれば、端は、移植片の長さに沿って長軸方向に伸展する流体密封の閉じ目を形成するため、縫合、生物学的に適合性の接着剤、または両方の組み合わせを用いて互いに付着される。幾つかの実施形態によれば、巻いたシートの端は熱および圧力処理を用いて固定される。適切な縫合には、例えばポリプロピレン縫合（ＰＲＯＬＥＮＥ（登録商標））が含まれ、これは連続的かまたは断続的であってよい。適切な接着剤には、例えばフィブリン糊、シアノアクリレートを基にした組織接着剤（例えばＤＥＲＭＡＢＯＮＤ（登録商標））、およびキトサン組織接着剤が含まれる。幾つかの実施形態によれば、シートの端は、管状の構築物内でシートを巻いた後に端が緩まないことを確実にするために、互いに、または材料の下層へ架橋結合される（例えば化学薬品または照射により誘導される架橋を用いて）。
【００２２】
図１Ａに、本開示に一致する血管移植片１０の代表的な実施形態を示す。血管移植片１０は、管腔１３の輪郭を示す管状構築物内へ巻かれる材料シート１２の、及び管腔表面１７と反管腔側の表面１９を有する管状壁１５を含んでなる。シートの長軸方向の端１４、１６は管状構築物の反管腔側で互いに接触し、外科的な縫合および／または生物接着剤を用いて、移植片の長さに沿って付着される。長軸方向の端１４、１６の付着により、反管腔側の表面１９の上に隆起し、管状移植片の長さに沿って伸展する、長軸方向の堤１８が作り出される。一実施形態によれば、図１Ｂに示すように、長軸方向の堤１８は折り畳まれ、血管移植片１０の反管腔側の表面１９に付着する。長軸方向の堤１８は、縫合、接着剤、または両方の組み合わせを用いて、移植片の長さに沿って管状壁１５に固定される。
【００２３】
図２Ａに、本開示に一致する血管移植片２０の代表的な実施形態を示す。移植片２０は、管腔２３の輪郭を示す管状構造内へ巻かれる材料シート２２を含んでなる。材料シート２２は、管腔表面２７と反管腔側の表面２９を有する管状壁２１を形成する。シート２２は、第１の長軸方向の端２４、およびシート２２の反対の末端の、第２の長軸方向の端２６を含んでなる。シート２２が管内に巻かれる際、第２の長軸方向の端２６は第１の端２４を越えて伸展し、第１の端２４と第２の端２６の間に伸展する多層の重なった領域２５が定義される。重なった領域２５は、縫合および／または接着剤を用いて、移植片の長さに沿って封着される。特定の実施形態によれば、重なった領域は、個別の材料シートの幅の少なくとも１０％である。
【００２４】
適切な血管移植片は、幾つかの技術を用いて形成できる。一般に移植片は、選択されたインプラントの位置に必要とされる、望ましいサイズ、長さ、および生体力学的要件に基づいて産生され得る。例えば大動脈の血管移植片としての使用が意図された移植片は、一般に、より低い圧力と少ない血流の輸送が経験され得るその他の位置に対するよりも大きなサイズ、および高い生体力学的性質（例えば破裂強度）を有し得る。
【００２５】
様々な実施形態によれば、材料シートの厚さは、血管移植片によって置換される血管の壁の厚さに一致する。特定の実施形態によれば、材料シートのサイズは、天然の血管の壁の厚さに対応するように決定される。
【００２６】
幾つかの実施形態によれば、移植片は、材料シートを既定のサイズ（すなわち管腔直径）に巻くことによって形成することができる。幾つかの実施形態によれば、図２に示すように、血管移植片は、円筒型ロッドまたは管３０の外部表面の周囲に生体材料シート３２を巻きつけることによって形成できる。シートの長軸方向の区域３４は、円筒型ロッド３０の周囲に折り畳まれる。一実施形態によれば、ロッキングロッド３５は、区域３４を円筒型ロッドに対してロックするため、図３に示すように円筒型ロッド３０と平衡に位置する。２つのホルダーの間に張られた縫合糸もまた、区域３４を円筒型ロッドに対してロックするために用いることができる。次にロッドを、ロッドの長軸方向の軸３１に対して少なくとも約３６０°回転させて、ロッドの外部表面の周囲に材料シートを巻きつける。一実施形態によれば、シート３２は、多層移植片を形成するため、ロッドの周囲に複数回巻きつけられる。シートが円筒型ロッドの周囲に巻きつけられた後、図２に示すように、シートの外側の端３６をシートの下にある層に固定する。
【００２７】
一実施形態によれば、図３に示すように、粘着性ストリップ３８がシートの幅にわたり、複数の位置においてシート３２に取り付けられる。このような実施形態では、シートが円筒型ロッド３０に巻きつけられるに従って、粘着性ストリップ３８がシート３２を材料の下層へ結合させる。
【００２８】
管状移植片の内径は、円筒型ロッドまたは管３０の外径と実質的に同じである。従ってロッドまたは管の直径は、移植片によって置換される天然の血管の管腔直径に一致するように選択される。一実施形態によれば、ロッドの直径はおおよそ４〜５ｍｍであり、これは小直径（＜６ｍｍ）の血管移植片を構築するために用いられる。別の実施形態によれば、管の壁の厚さは１ｍｍである。シートがロッドの周囲に巻きつけられ、シートの長軸方向の単数または複数の端が固定された後、ロッドは巻いたシートの内部から取り除かれる。別の実施形態によれば、管は、シートを管から滑り落とすために長軸方向に伸展する。円筒型ロッドの材料は、ロッドの外部表面へのシートの付着を阻止するように選択される。代表的な一実施形態によれば、使用される円筒型ロッドはガラスロッドである。別の実施形態によれば、使用される円筒型の管はゴム管である。さらに別の実施形態によれば、使用される管はシリコン管である。
【００２９】
適切な無細胞組織マトリックス
幾つかの実施形態によれば、適切な無細胞性組織マトリックスは、例えば、細胞認識、細胞結合、細胞伸展の支持能、細胞増殖、細胞の内殖、および細胞分化のような、特定の生物学的機能を保持し得る。このような機能は、例えば未変性のコラーゲン性タンパク質（例えばＩ型コラーゲン）および様々な非コラーゲン性分子（例えばインテグリン受容体、グリコサミノグリカン（例えばヒアルロナン）もしくはプロテオグリカンのような高い電荷密度を有する分子、またはその他の付着因子のようないずれかの分子に対するリガンドとして役立つタンパク質）によって提供され得る。幾つかの実施形態によれば、無細胞性組織マトリックスは、組織構造の維持および組織の構成要素の三次元配列の維持を含む、特定の構造的機能を保持し得る。本明細書に記載する無細胞性組織マトリックスはまた、例えば強度、弾性、および耐久性のような望ましい物理的特性、規定の多孔度、ならびに高分子の保持を示し得る。適切な無細胞性組織マトリックスは、架橋され得るかまたは架橋されない。
【００３０】
幾つかの実施形態によれば、移植片材料は、関連するホスト組織の分化細胞、間葉系幹細胞のような幹細胞、または前駆細胞のような浸潤細胞によって再構築されることを受け入れる。これは例えば、移植されたマトリックス材料を周囲のホスト組織に同一の組織から形成することで達成され得るが、このような同一性は必用ではない。
【００３１】
再構築は、上記の無細胞性組織マトリックス構成要素および周囲のホスト組織からのシグナル（例えばサイトカイン、細胞外マトリックス構成要素、生体力学的刺激、および生体電気刺激）によって方向付けられる。例えば、骨髄および末梢循環における間葉系幹細胞の存在が文献中に記載され、様々な筋骨格組織を再生することが示されている［Ｃａｐｌａｎ（１９９１）Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．９：６４１−６５０；Ｃａｐｌａｎ（１９９４）Ｃｌｉｎ．Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．２１：４２９−４３５；およびＣａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ．３４２：２５４−２６９］。加えて移植片は、再構築過程の間に、ある程度の（閾値よりも大きな）張力および生体力学的強度を提供しなければならない。
【００３２】
無細胞性組織マトリックスは、様々な原料組織から製造され得る。例えば無細胞性組織マトリックスは、マトリックスによって上記の性質が保持されている限り、いずれのコラーゲン含有軟部組織および筋骨格（例えば真皮、筋膜、心膜、硬膜、臍帯、胎盤、心臓弁、靭帯、腱、血管組織（動脈および伏在静脈のような静脈）、神経結合組織、膀胱組織、尿管組織、または腸管組織）からも産生され得る。
【００３３】
無細胞性組織マトリックスは、無細胞性組織マトリックス移植片のレシピエントと同じである種の１以上の個体から作られてよいが、必ずしもそうではない。従って例えば、無細胞性組織マトリックスはブタの組織から作られ、ヒト患者へ移植されてもよい。無細胞性組織マトリックスのレシピエントおよび無細胞性組織マトリックス産生のための組織または臓器のドナーとして役立ち得る種には、ヒト、非ヒト霊長類（例えばサル、ヒヒ、チンパンジー）、ブタ、雌ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ラット、またはマウスが含まれるが、これらに限定されない。ドナーとして特に興味深いものは、末端のα−ガラクトース成分が欠如するように、遺伝的に改変された動物（例えばブタ）である。適切な動物についての記載は、それらの開示の全体が参照により本明細書に取り込まれる、同時係属の米国特許出願第１０／８９６，５９４号および米国特許第６，１６６，２８８号を参照されたい。
【００３４】
幾つかの実施形態によれば、凍結乾燥した無細胞性組織マトリックスがＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ブランチバーグ、ニュージャージー州）によってヒトの真皮から産生され、ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）として小さなシートの形で市販されている。ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）の凍結および乾燥に用いられる凍結保護物質は、３５％マルトデキストリンと１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の溶液である。従って、最終乾燥産物は約６０重量％の無細胞性組織マトリックスと約４０重量％のマルトデキストリンを含む。ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎはまた、ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）に同一の無細胞性組織マトリックスおよびマルトデキストリンの比率を有する、ブタの真皮から作られた類似製品（ＸＥＮＯＤＥＲＭと名付けられた）も製造している。
【００３５】
このような遺伝的に改変された動物をドナーとして使用するための別の方法として、適切な組織および臓器は、脱細胞の前または後に、例えば糖タンパク質上の糖鎖から末端のα−ガラクトース（α−ｇａｌ）成分を除去する酵素であるα−ガラクトシダーゼによって処理することができる。これらの成分を除去するために組織をα−ガラクトシダーゼによって処理する方法は、例えば、その開示の全体が参照により本明細書に取り込まれる、米国特許第６，３３１，３１９号に記載されている。
【００３６】
実行時には、無細胞性組織マトリックスにおいて細胞を死滅させる前または後のいずれかに、コラーゲン含有物質は１以上のグリコシダーゼ、特にα−ガラクトシダーゼのようなガラクトシダーゼによるコラーゲン含有物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ消化に供される。α−ガラクトシダーゼを用いた酵素処理によって、特にα−ｇａｌエピトープが除去される。
【００３７】
Ｎ−アセチルラクトサミン残基は、通常ヒトおよび哺乳類細胞に発現するエピトープであり、それ故に免疫原性ではない。グリコシダーゼによるコラーゲン含有物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ消化は、様々な方法によって達成され得る。例えばコラーゲン含有物質は、グリコシダーゼを含む緩衝液中に浸すか、または該緩衝液中でインキュベートすることができる。あるいはグリコシダーゼを含む緩衝液は、パルス洗浄工程により、圧力をかけてコラーゲン含有物質中に通すことができる。
【００３８】
コラーゲン含有物質からのα−ｇａｌエピトープの除去により、コラーゲン含有物質に対する免疫応答は減少し得る。α−ｇａｌエピトープは、非霊長類の哺乳類および新世界ザル（南米のサル）において発現し、かつ細胞外構成要素の、プロテオグリカンのような高分子上に発現する。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１７７５５（１９８８）。しかしながら、このエピトープは旧世界霊長類（アジアおよびアフリカのサルならびに類人猿）およびヒトには存在しない。同文献。抗ｇａｌ抗体は、ヒトおよび霊長類において、胃腸の細菌上のα−ｇａｌエピトープの炭水化物構造に対する免疫応答の結果として産生される。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５６：１７３０（１９８８）；Ｒ．Ｍ．Ｈａｍａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１２２３（１９９２）。
【００３９】
非霊長類の哺乳類（例えばブタ）はα−ｇａｌエピトープを産生することから、これらの哺乳類に由来するコラーゲン含有物質を霊長類へ注入することによる異種移植は、コラーゲン含有物質上のこれらのエピトープへの霊長類抗Ｇａｌの結合によってしばしば拒絶をもたらす。この結合は、補体結合および抗体依存性の細胞傷害性によってコラーゲン含有物質の破壊をもたらす。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １４：４８０（１９９３）；Ｍ．Ｓａｎｄｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１３９１（１９９３）；Ｈ．Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２４：５５９（１９９２）；Ｂ．Ｈ．Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５００（１９９５）。さらに異種移植は、高親和性抗ｇａｌ抗体の産生量を増大させる、免疫系の主要な活性化をもたらす。従って、細胞からの、およびコラーゲン含有物質の細胞外構成要素からのα−ｇａｌエピトープの実質的な除去、ならびに細胞性α−ｇａｌエピトープの再発現の防止によって、α−ｇａｌエピトープへの抗ｇａｌ抗体の結合に関連する、コラーゲン含有物質に対する免疫応答を減少させることができる。
【００４０】
本開示における使用に適した無細胞性組織マトリックスは、それらによる産生が上記の生物学的および構造的性質を備えたマトリックスをもたらす限りにおいて、様々な方法によって産生することができる。一般に、無細胞性組織マトリックスの産生に関わる工程には、ドナー（例えばヒトの死体または上記哺乳類のいずれか）から組織を収集すること、生物学的および構造的機能を同様に保存する条件下での細胞除去と同時に、またはそれに続いて行われる、組織を安定化させ、かつ生化学的および構造的分解を避けるための化学処理が含まれる。最初の安定化溶液は、浸透圧性、低酸素性、自己融解性、およびタンパク質分解性の分解を停止および阻止し、微生物の混入から保護し、かつ、例えば平滑筋の構成要素（例えば血管）を含む組織に起こり得る機械的損傷を減少させる。安定化溶液は、適切な緩衝液、１以上の酸化防止剤、１以上の膠質剤、１以上の抗生物質、１以上のプロテアーゼ阻害剤、および幾つかの場合には平滑筋弛緩剤を含んでよい。幾つかの代表的な実施形態によれば、収集した組織（例えば真皮組織）は、組織サンプルから上皮を除去するために、化学的な脱上皮化溶液によって処理される。例えば幾つかの実施形態によれば、ヒトまたはブタの真皮組織を含んでなるサンプルは、上皮層を除去するため、１Ｍ ＮａＣｌ溶液に室温にて一晩浸される。特定の実施形態によれば、上皮層の完全な除去を確実にするため、ＮａＣｌ溶液の濃度は１．５Ｍに増大される。
【００４１】
次に、基底膜複合体、またはコラーゲンマトリックスの生物学的および構造的完全性を損傷することなく、構造マトリックスから生細胞（例えば上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞）を除去するため、組織を脱細胞溶液中に置く。脱細胞溶液は、適切な緩衝液、塩、抗生物質、１以上の界面活性剤（例えばＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００（商標）、デオキシコール酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（２０）モノオレイン酸ソルビタン）、架橋を阻止するための１以上の薬剤、１以上のプロテアーゼ阻害剤、および／または１以上の酵素を含んでよい。幾つかの実施形態によれば、脱細胞溶液はゲンタマイシンおよび２５ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含むＲＰＭＩ培地中の１％ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００（商標）を含んでなる。幾つかの実施形態によれば、組織は脱細胞溶液中で、３７℃にて９０ｒｐｍで穏やかに振盪しながら一晩インキュベートされる。特定の実施形態によれば、組織サンプルから脂肪を除くために、追加の界面活性剤が用いられてよい。例えば、幾つかの実施形態によると、腹膜を処理するため、脱細胞溶液に２％デオキシコール酸ナトリウムが添加される。
【００４２】
脱細胞工程後、組織サンプルを生理食塩水で十分に洗浄する。幾つかの代表的な実施形態によれば、例えば異種性の材料を用いる際、脱細胞した組織は次にデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）溶液により、室温にて一晩処理される。幾つかの実施形態によれば、組織サンプル（例えば腹膜および心膜組織）は、ＤＮａｓｅ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、および２０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で調製したＤＮａｓｅ溶液によって処理される。ＤＮａｓｅ溶液には、任意に抗生物質溶液（例えばゲンタマイシン）を添加してもよい。
【００４３】
ＤＮａｓｅ溶液を除去するために組織を生理食塩水で十分に洗浄した後、サンプル中に存在する可能性のあるいずれの免疫原性抗原も除去するため、組織サンプルを１以上の酵素による処理に供してよい。先に述べたように、組織に存在する可能性のあるα−ｇａｌエピトープを除去するため、組織サンプルをα−ガラクトシダーゼ酵素によって処理してもよい。幾つかの実施形態によれば、組織は、ｐＨ６．０の１００ｍＭ リン酸緩衝液中で調製された３００Ｕ／Ｌの濃度のα−ガラクトシダーゼによって処理される。別の実施形態によれば、α−ガラクトシダーゼの濃度は、収集した組織からのα−ｇａｌエピトープの十分な除去のため、４００Ｕ／Ｌに増大される（例えばブタ由来の真皮組織の処理において）。
【００４４】
死滅した、および／または溶解した細胞構成要素、ならびに炎症の原因となり得る抗原、同様にいずれの生体不適合性の細胞除去剤も完全に除去した後、マトリックスは、再び、記載したマトリックスの生物学的および構造的性質の維持に必要な条件下で凍結保存剤により処理して凍結保存してよく、任意に凍結乾燥してもよい。凍結保存または凍結乾燥後、無細胞性組織マトリックスはそれぞれ解凍または再水和されてよい。全ての工程は一般に無菌的、好ましくは無菌状態で行われる。
【００４５】
無細胞性組織マトリックスを形成した後、ホストによってさらに再構成され得る移植片を産生するために、組織適合性の生細胞を任意に無細胞性組織マトリックスへ播種してよい。一実施形態によれば、組織適合性の生細胞は、移植前に標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞共培養技術によって、または移植後にｉｎ ｖｉｖｏ再集合によって、マトリックスへ添加されてよい。Ｉｎ ｖｉｖｏ再集合は、無細胞性組織マトリックスへ遊走したレシピエント自身の細胞によるか、またはレシピエントから得た細胞もしくは別のドナーからの組織適合性の細胞の、ｉｎ ｓｉｔｕでの無細胞性組織マトリックス内への点滴または注射によるものであってよい。
【００４６】
再構成のために選択される細胞の型は、無細胞性組織マトリックスが再構成される組織または臓器の性質に依存し得る。例えば、血管導管の再構成には内皮細胞が重要である。このような細胞は組織の内部表面を裏打ちし、培養によって増殖し得る。内皮細胞は、意図されたレシピエント患者に直接由来するか、または臍帯動脈または静脈に由来してよく、無細胞性組織マトリックスおよびレシピエントに移植された結果としての組成物を再構成するために用いることができる。あるいは、無細胞性組織マトリックスには培養した（自己または同種の）細胞を添加することができる。このような細胞は、例えば標準的な組織培養条件で増殖させた後、無細胞性組織マトリックスに添加することができる。別の実施形態によれば、細胞は組織培養により、無細胞性組織マトリックス内で、および／または無細胞性組織マトリックス上で増殖させることができる。組織培養により、無細胞性組織マトリックス内で、および／または無細胞性組織マトリックス上で増殖させる細胞は、適切なドナー（例えば意図されたレシピエントまたは同種のドナー）から直接得られるか、またはそれらは最初に無細胞性組織マトリックスなしで、組織培養により増殖させることができる。
【００４７】
以下の実施例は様々な実施形態をよりよく説明するために提供されるものであり、本開示の範囲を限定するものとしてどのようにも解釈されてはならない。
【実施例１】
【００４８】
真皮マトリックスに由来する血管移植片の機能試験
ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ブランチバーグ、ニュージャージー州）から市販されている、ヒト無細胞真皮マトリックス（ＨＡＤＭ）であるＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）を用いて、血管移植片を形成した。ＨＡＤＭは、厚さ０．３〜０．５ｍｍのシートとして供給された。ＨＡＤＭを生理食塩水に３０分間浸し、０．５×１．５ｃｍの薄片に切り取った。ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）ＨＡＤＭは未変化の基底膜を含んでおり、ＨＡＤＭの薄片を基底膜と共に管内へ、管の管腔表面に沿って巻きこんだ。単層の管構築物が作り出されるように、管を、連結する端に沿って縫合した。
【００４９】
次に血管移植片をラット腹部大動脈置換モデルにおいて試験した。２０匹の成体（９〜１１週齢）雄Ｌｅｗｉｓラットを４０ｍｇ／ｋｇの腹腔内ペントバルビタールによって麻酔した後、各ラットの腹部正中線を切開した。腎動脈の下から大動脈分岐部の直上までの、腹部大動脈の１ｃｍの区域を正中線切開によって切除した。切除した大動脈区域を、ＨＡＤＭ由来の血管移植片によって置換した。移植片は同所性の位置に、９−０ナイロンによる断続縫合を用いた端々吻合術によって移植した。移植片の質および移植部位の治癒の程度を、４つの試験エンドポイント（１、３、６、および１２か月）において記録した。各エンドポイントで５匹の動物を屠殺した。屠殺した動物から、１ｃｍの血管移植片、および吻合を越えて０．５ｃｍのホスト組織材料（外植片の全長は２ｃｍ）を、脾臓およびリンパ節のサンプルと共に切除した。外植切片は、組織学的検査、免疫組織学的検査、ＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）、およびＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）分析に用いた。移植片の中央部、および移植片−ホスト組織の接触面を示す切除したサンプルは、固定およびそれに続く分析のために、１０％ホルマリンまたは８％グルタルアルデヒド中に置いた（ＳＥＭおよびＴＥＭ分析のため）。
【００５０】
臨床所見
血管移植片を受け入れた全ての動物は、外科手術後には正常に回復し、手術されていない動物と同様に、試験期間の間に体重は維持されるかまたは増加した。１４匹の動物は、下肢の動きの制限および下肢の病的変化によって証明される移植不全の臨床的徴候を示すことなく、予定された屠殺日まで生存した。１匹の動物は、内部出血により移植後４日目に死亡した。試験の間に、いずれの動物にも外科手術部位における感染は証明されなかった。外植した血管移植片の全体的な所見では、狭窄、動脈瘤、過形成、縫合の裂開、または血栓形成は証明されなかった。加えて、外植した移植片のほとんどは滑らかな管腔表面を有し、石灰化は観察されなかった。２つの移植片（６および１２か月に外植された）は、正常な血管構造よりもさらに硬い領域を示したことから、血管の石灰化が示唆された。全ての移植片は、吻合部位において、天然のラット大動脈と良好に統合されていた。
【００５１】
組織学的検査
外植した移植片を、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオジン）およびヴァーヘフファンギーソン染色によって処理した。３か月（図４Ａおよび４Ｂ）および１２か月（図４Ｃ〜４Ｇ）の、代表的な移植片断面のＨ＆Ｅ染色により、線維芽細胞が移植片に再集合し、幾つかの内皮細胞が移植片の管腔表面を裏打ちしていることが示された。図４Ａ〜４Ｅは、Ｈ＆Ｅ染色した移植片の中央部断面、図４Ｆおよび４Ｇは、Ｈ＆Ｅ染色した吻合部位の断面、および図４Ｈは、移植せずに試験のコントロールとして使用した移植片をＨ＆Ｅ染色したものである。
【００５２】
外植した吻合部位の組織学的検査により、組織の完全な統合、および移植片のホスト血管へのスムーズな移行が示された。１か月目には炎症性細胞の軽度の浸潤が観察されたが、時間が経つにつれてその程度は減弱し、３か月目には炎症性細胞は観察されなくなったことから、移植した移植片によって慢性炎症は誘導されなかったことが示された。
【００５３】
図５Ａおよび５Ｂは、移植片の中央部断面のヴァーヘフ染色を示し、図５Ｃおよび５Ｄは、吻合部位の断面のヴァーヘフ染色を示し、図５Ｅは正常ラット大動脈のヴァーヘフ染色を示し、図５Ｆはコントロールとして使用した移植前の血管移植片を示す。移植片断面のヴァーヘフ染色により、新媒体（neomedia）はコラーゲンリッチであり、細胞には広くエラスチンが沈着しているように見えることが示された。
【００５４】
ＳＥＭおよびＴＥＭによる分析
図６Ａ〜６Ｆは、上記のように産生された血管移植片のＳＥＭ顕微鏡像である。図６Ａに示すように、移植前の移植片のＳＥＭによって、基底膜の表面には細胞構造が見られないことが示された。外植した血管移植片は、１か月目にその管腔表面に内皮細胞を有し（図６Ｂ）、３か月目に管腔表面は内皮型細胞によって完全に覆われた（図６Ｃ）。図６Ｄに示すように、移植片とラット大動脈の接触面には未変化の吻合が見られた。３か月目の移植片の表面（図６Ｅ）は、細胞で完全に覆われ、ラット大動脈の表面と区別がつかなかった（図６Ｆ）。
【００５５】
同様に、１か月目の代表的な血管移植片のＴＥＭ顕微鏡像（図７Ａ）は、移植片の管腔を裏打ちする基底膜（ＢＭ）を伴う、平坦な内皮細胞を示した。ＴＥＭ像には、微小線維および濃密体を有する平滑筋細胞（ＳＭＣ）もまた明らかに見られた。弾性線維の形成を表す、平滑筋細胞の表面に沿って暗く染色される物質がＴＥＭ顕微鏡像で観察されたが、形成された弾性線維は、正常ラット大動脈のＴＥＭ像に観察される内弾性板（ＩＥＬ）に比較して未熟であった（図７Ｂ）。
【００５６】
免疫染色
移植片の管腔表面の内皮細胞の発生を、内皮細胞の染色およびｖＷＦ（フォン・ヴィレブランド因子）の染色を用いて確認した。管腔表面における内皮細胞の堆積を同定するため、ラット内皮細胞およびｖＷＦに対する特異的な抗体を用いた。図８Ａに示すように、１か月目に内皮細胞が観察されたが、管腔を完全に覆ってはいなかった。図８Ｂ、８Ｃ、および８Ｄそれぞれに示すように、３か月目、６か月目、および１２か月目には内皮細胞の有意な堆積が観察された。図８Ｅ〜８Ｈに示すように、ｖＷＦの免疫組織学的染色によると、移植片の表面全体が内皮細胞により裏打ちされていた。
【００５７】
血管移植片への平滑筋細胞および線維芽細胞の再集合が、それぞれα−平滑筋アクチンおよびビメンチンに対する特異的な抗体を用いた染色によって確認された。コントロールとして使用するため、ラット腹部大動脈の断面もまた、α−平滑筋アクチンおよび線維芽細胞に対する抗体を用いて染色した（それぞれ図９Ａおよび９Ｆ）。１か月目（図９Ｂおよび９Ｇ）、３か月目（図９Ｃおよび９Ｈ）、６か月目（図９Ｄおよび９Ｉ）、および１２か月目（図９Ｅおよび９Ｊ）の移植片により、移植後１か月目から、移植片への平滑筋細胞および線維芽細胞の再集合が始まっていることが示された。
【００５８】
炎症性および免疫応答
移植した移植片に対するホストの炎症性応答を同定するため、外植片を抗ラットＴ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージ抗体によって染色した。図１０Ａ〜１０Ｄはそれぞれ、１か月目、３か月目、６か月目、および１２か月目に抗ラットＴ細胞抗体によって染色した移植片を示す。同様に、図１０Ｅ〜１０ＨはＢ細胞抗体によって染色した移植片を示し、図１０Ｉ〜１０Ｌはマクロファージに対する抗体によって染色した移植片を示す。１か月目に、３つの型の炎症性細胞は全て、外植した移植片に中程度に浸潤していることが見出されたが、新媒体（neomedia）には炎症性細胞の浸潤は検出されなかった。炎症性細胞は３か月目には有意に減少し、観察されるものは主に移植片の周辺部に近いところに見られた。６か月後には炎症性細胞は観察されなかった。
【００５９】
同様に、最初の３か月間、移植片には中程度のレベルのＩｇＧ抗体が見られたが、新媒体（neomedia）には見られなかった。血管移植片に結合したラットＩｇＧ（図１１Ａ〜１１Ｅ）およびＩｇＭ（図１１Ｆ〜１１Ｊ）について、１か月目（図１１Ａおよび１１Ｆ）、３か月目（図１１Ｂおよび１１Ｇ）、６か月目（図１１Ｃおよび１１Ｈ）、および１２か月目（図１１Ｄおよび１１Ｉ）に試験した。正常ラット腹部大動脈（図１１Ｅおよび１１Ｊ）をコントロールとして用いた。図１１Ａ〜１１Ｄに示すように、最初の３か月間、移植片には中程度のレベルのＩｇＧ抗体が見られた。３か月後、ＩｇＧのレベルは有意に減少した。試験の間には、どの移植片にもＩｇＭの体積は見られなかった。
【実施例２】
【００６０】
生物学的接着剤を用いて形成した血管移植片の、力学的強度、耐熱性、および血栓性効果の評価
この試験には、ヒト無細胞性真皮マトリックス（ＨＡＤＭ）由来の血管移植片を用いた。ＨＡＤＭのシートを管状構築物内へ巻き込み、フィブリン糊を用いてシートの端を付着させた。破裂試験（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＡＮＳＩ）コード：ＡＮＳＩ／ＡＡＭＩ／ＩＳＯ７１９８：１９９８／２００１／（登録商標）２００４）を用いて移植片の破裂強度を評価した。最大破裂強度は１６３９±４３２ｍｍＨｇ（ｎ＝２）と算出され、これにより生物接着剤を用いて形成した血管移植片が生理的な血圧を維持するために十分強いことが示された。
【００６１】
真皮マトリックスにおけるコラーゲン変性の開始温度を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって決定した。図１２のグラフに示すように、接着させた血管移植片のコラーゲン変性の温度は、ヒト無細胞性真皮マトリックスのものと比較して遜色がない。グラフには、未処理のＨＡＤＭ、ならびにＨＡＤＭをＤＥＲＭＡＢＯＮＤ（登録商標）、フィブリノーゲン、およびキトサンを基にした接着剤により接着して形成した血管移植片の変性開始温度に対応するデータが含まれる。この実験のデータにより、生物接着剤はマトリックスの生化学的性質を変化させなかったことが示される。
【００６２】
接着させた血管移植片における抗血栓薬（例えばヘパリン）の有効性を、血餅形成法を用いて評価した。血管移植片を、０．４％ヘパリンナトリウム塩溶液中に室温で２４時間浮遊させることにより、ヘパリンコーティングを行った。血管移植片の１ｃｍ２切片の管腔表面に２００μｌの血液および１２．５μｌの１００ｍＭ ＣａＣｌ２を加え、次に移植片切片を３７℃、５％Ｃ０２のインキュベーター内に１時間静置した。鉗子を用いて目に見える血餅を表面から除去し、試験管内に採取し、凍結乾燥後に秤量した。図１３のグラフに示すように、ヘパリンの抗血栓性の性質は、ヘパリンが生物接着剤に接触しても影響を受けなかった。グラフには、未処理のＨＡＤＭ、ヘパリン処理したＨＡＤＭ（ＨＡＤＭ＋Ｈｅｐ）、フィブリノーゲン糊（ＦＧ）、ならびにヘパリンおよびフィブリノーゲン糊の両方で処理したＨＡＤＭ（ＨＡＤＭ＋ＦＧ＋Ｈｅｐ）において形成された血餅の重量に対応するデータが含まれる。グラフに示すように、ヘパリンおよびフィブリノーゲン糊の両方で処理したＨＡＤＭにおいて形成された血餅の量は、ヘパリン処理したＨＡＤＭの血餅のデータと比較して遜色がなかったことから、フィブリノーゲン糊は、真皮マトリックスにおけるヘパリンコーティングの抗血栓作用を妨げないことが示された。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
管状壁を含んでなる管状導管を含んでなる血管移植片であって、該管状壁が血流通過のための管腔の輪郭を示し；
該管状壁が、基底膜を有する無細胞性組織マトリックスを含んでなり、該基底膜が管状壁の管腔表面を形成する血管移植片。
【請求項２】
移植片の長さに沿って伸展する流体密封の閉じ目を形成するために、無細胞性組織マトリックスの第１の長軸方向の端が、無細胞性組織マトリックスの第２の長軸方向の端に付着する、請求項１に記載の血管移植片。
【請求項３】
第１および第２の長軸方向の端の付着が、管状壁の反管腔側の表面から隆起する長軸方向の堤を作り出す、請求項２に記載の血管移植片。
【請求項４】
第１および第２の長軸方向の端が、縫合を用いて付着される、請求項２に記載の血管移植片。
【請求項５】
第１および第２の端が、少なくとも１の接着剤を用いて付着される、請求項２に記載の血管移植片。
【請求項６】
第１および第２の端が、縫合と少なくとも１の接着剤の組み合わせを用いて付着される、請求項２に記載の血管移植片。
【請求項７】
シートの第１の長軸方向の端が、シートの第２の長軸方向の端を越えて伸展することで多層の重なった領域が形成される、請求項２に記載の血管移植片。
【請求項８】
重なった領域における層が互いに付着される、請求項７に記載の血管移植片。
【請求項９】
無細胞性組織マトリックスが真皮マトリックスを含んでなる、請求項１に記載の血管移植片。
【請求項１０】
真皮マトリックスがヒトの皮膚に由来する、請求項９に記載の血管移植片。
【請求項１１】
無細胞性組織マトリックスが心膜組織マトリックスを含んでなる、請求項１に記載の血管移植片。
【請求項１２】
無細胞性組織マトリックスが腹膜を含んでなる、請求項１に記載の血管移植片。
【請求項１３】
無細胞性組織マトリックスがヒトレシピエントに対して異種性の組織に由来する、請求項１に記載の血管移植片。
【請求項１４】
組織がα１，３−ガラクトース転移酵素（α１，３ＧＴ）を欠損するブタに由来する、請求項１３に記載の血管移植片。
【請求項１５】
無細胞性組織マトリックスがヒトレシピエントに対して同種の組織に由来する、請求項１に記載の血管移植片。
【請求項１６】
無細胞性組織マトリックスが複数の重ね合わせたシートを含んでなる、請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
血管移植片を形成する方法であって、
基底膜を有する無細胞性組織マトリックスのシートを提供する工程；
該シートを管状導管内に形成する工程を含んでなり、該基底膜が管状導管の内部の管腔表面を形成する方法。
【請求項１８】
無細胞性組織マトリックスがヒト真皮マトリックスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
無細胞性組織マトリックスがブタの心膜組織マトリックスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
シートが組織の再構築を促進する増殖因子によって処理される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
シートの基底膜が内皮細胞の増殖を増大させる増殖因子によって処理される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
シートの基底膜が抗血栓薬によって処理される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
シートの基底膜が抗石灰化剤によって処理される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
基底膜が、管状導管の管腔表面に非多孔性の内面を提供する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
移植片によって置換される血管組織の内径に実質的に等しい外径を有する円筒型ロッドを提供する工程；および
基底膜の少なくとも一部が円筒型ロッドと接触するように、ロッドの外部表面の周囲にシートを巻きつける工程をさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
円筒型ロッドの外部表面の周囲にシートを巻きつける間に、ロッキングロッドまたは張られた縫合糸が、円筒型ロッドに対して実質的に平行に、かつ隣接するように位置決めする工程をさらに含んでなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
縫合を用いて、シートの少なくとも１の長軸方向の端を固定する工程をさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１の接着剤を用いて、シートの少なくとも１の長軸方向の端を固定する工程をさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
縫合と少なくとも１の接着剤の組み合わせを用いて、シートの少なくとも１の長軸方向の端を固定する工程をさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
移植片によって置換される天然の血管構造の壁の厚さに対応するように、無細胞性組織マトリックスのシートのサイズを決定する工程をさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１】
管状壁を含んでなる管状導管を含んでなる血管移植片であって、該管状壁が血流通過のための管腔の輪郭を示し；
該管状壁が、基底膜を有する無細胞性組織マトリックスを含んでなり、該基底膜が管状壁の管腔表面を形成する血管移植片。
【請求項２】
移植片の長さに沿って伸展する流体密封の閉じ目を形成するために、無細胞性組織マトリックスの第１の長軸方向の端が、無細胞性組織マトリックスの第２の長軸方向の端に付着する、請求項１に記載の血管移植片。
【請求項３】
第１および第２の長軸方向の端の付着が、管状壁の反管腔側の表面から隆起する長軸方向の堤を作り出す、請求項２に記載の血管移植片。
【請求項４】
第１および第２の長軸方向の端が、縫合を用いて付着される、請求項２に記載の血管移植片。
【請求項５】
第１および第２の端が、少なくとも１の接着剤を用いて付着される、請求項２に記載の血管移植片。
【請求項６】
第１および第２の端が、縫合と少なくとも１の接着剤の組み合わせを用いて付着される、請求項２に記載の血管移植片。
【請求項７】
シートの第１の長軸方向の端が、シートの第２の長軸方向の端を越えて伸展することで多層の重なった領域が形成される、請求項２に記載の血管移植片。
【請求項８】
重なった領域における層が互いに付着される、請求項７に記載の血管移植片。
【請求項９】
無細胞性組織マトリックスが真皮マトリックスを含んでなる、請求項１に記載の血管移植片。
【請求項１０】
真皮マトリックスがヒトの皮膚に由来する、請求項９に記載の血管移植片。
【請求項１１】
無細胞性組織マトリックスが心膜組織マトリックスを含んでなる、請求項１に記載の血管移植片。
【請求項１２】
無細胞性組織マトリックスが腹膜を含んでなる、請求項１に記載の血管移植片。
【請求項１３】
無細胞性組織マトリックスがヒトレシピエントに対して異種性の組織に由来する、請求項１に記載の血管移植片。
【請求項１４】
組織がα１，３−ガラクトース転移酵素（α１，３ＧＴ）を欠損するブタに由来する、請求項１３に記載の血管移植片。
【請求項１５】
無細胞性組織マトリックスがヒトレシピエントに対して同種の組織に由来する、請求項１に記載の血管移植片。
【請求項１６】
無細胞性組織マトリックスが複数の重ね合わせたシートを含んでなる、請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
血管移植片を形成する方法であって、
基底膜を有する無細胞性組織マトリックスのシートを提供する工程；
該シートを管状導管内に形成する工程を含んでなり、該基底膜が管状導管の内部の管腔表面を形成する方法。
【請求項１８】
無細胞性組織マトリックスがヒト真皮マトリックスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
無細胞性組織マトリックスがブタの心膜組織マトリックスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
シートが組織の再構築を促進する増殖因子によって処理される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
シートの基底膜が内皮細胞の増殖を増大させる増殖因子によって処理される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
シートの基底膜が抗血栓薬によって処理される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
シートの基底膜が抗石灰化剤によって処理される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
基底膜が、管状導管の管腔表面に非多孔性の内面を提供する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
移植片によって置換される血管組織の内径に実質的に等しい外径を有する円筒型ロッドを提供する工程；および
基底膜の少なくとも一部が円筒型ロッドと接触するように、ロッドの外部表面の周囲にシートを巻きつける工程をさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
円筒型ロッドの外部表面の周囲にシートを巻きつける間に、ロッキングロッドまたは張られた縫合糸が、円筒型ロッドに対して実質的に平行に、かつ隣接するように位置決めする工程をさらに含んでなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
縫合を用いて、シートの少なくとも１の長軸方向の端を固定する工程をさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１の接着剤を用いて、シートの少なくとも１の長軸方向の端を固定する工程をさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
縫合と少なくとも１の接着剤の組み合わせを用いて、シートの少なくとも１の長軸方向の端を固定する工程をさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
移植片によって置換される天然の血管構造の壁の厚さに対応するように、無細胞性組織マトリックスのシートのサイズを決定する工程をさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図４Ｈ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図８Ｇ】
【図８Ｈ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図９Ｇ】
【図９Ｈ】
【図９Ｉ】
【図９Ｊ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１０Ｇ】
【図１０Ｈ】
【図１０Ｉ】
【図１０Ｊ】
【図１０Ｋ】
【図１０Ｌ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１１Ｇ】
【図１１Ｈ】
【図１１Ｉ】
【図１１Ｊ】
【図１２】
【図１３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図４Ｈ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図８Ｇ】
【図８Ｈ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図９Ｇ】
【図９Ｈ】
【図９Ｉ】
【図９Ｊ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１０Ｇ】
【図１０Ｈ】
【図１０Ｉ】
【図１０Ｊ】
【図１０Ｋ】
【図１０Ｌ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１１Ｇ】
【図１１Ｈ】
【図１１Ｉ】
【図１１Ｊ】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１３−５０３６９６（Ｐ２０１３−５０３６９６Ａ）
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２７９０５（Ｐ２０１２−５２７９０５）
【出願日】平成２２年８月２４日（２０１０．８．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６４７８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２８５２１
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５０４１５４１４８）ライフセル コーポレーション (13)
【氏名又は名称原語表記】ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２４日（２０１０．８．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６４７８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２８５２１
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５０４１５４１４８）ライフセル コーポレーション (13)
【氏名又は名称原語表記】ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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